CZ259897A3

CZ259897A3 - Použití plynného oxidu dusnatého pro přípravu léčiva pro léčení, inhibici nebo prevenci vaskulární trombózy nebo arteriální restenózy

Info

Publication number: CZ259897A3
Application number: CZ972598A
Authority: CZ
Inventors: Warren M. Zapol; Kenneth D. Bloch
Original assignee: The General Hospital Corporation
Priority date: 1995-02-16
Filing date: 1996-02-08
Publication date: 1998-05-13
Also published as: FI119912B; NO973768D0; FI973357A; NO973768L; US5904938A; EP0810884B1; DE69636096T2; JPH11500125A; WO1996025184A1; JP3956055B2; EP0810884A4; CN1327826C; ATE324866T1; US6063407A; BR9607616A; MX9706257A; EP0810884A1; PT810884E; ES2263159T3; FI973357A0

Description

Použití plynného oxidu léčení, inhibicí nebo arteriální restenózy.

dusnatého pro přípravu léčiva pro prevenci vaskulárnl trombózy nebo

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použiti plynného oxidu dusnatého pro přípravu léčiva pro léčení, inhibicí nebo prevenci vaskulárnl trombózy nebo arteriální restenózy vyplývající z nadměrné hýpérplazie intiray.

Dosavadní- stav techniky

Trombóza, t j . tvorba nebo přítomnost Krevní sraženiny v krevní cévě, je následkem fyzického poraněni arteriální stěny vaskulářním intervenčním výkonem jako je perkutánnl transluminální koronární angioplastika (PTCA, druh balónkové angioplastiky) nebo chirurgický výkon - koronární bypass. Trombóza může být také důsledkem přirozené progrese nemoci, jako je ateroskleróza. jako antitrombotika byly používány různé přípravky, včetně aspirinu, prostaglandinu Ei, selektivních inhibitorů tromboxanu Aá, selektivních inhibitorů trombinu, blokátorů trombocytového receptoru

GPIIb/IIIa, tkáňového aktivátoru plazminogenu, streptokinázy, hepárinu a kistrinu. Viz např. Yasuda a kol. (Circulation 83-1038 (1991), a Góld a kol., Circulation (Supplěment IV) 83:IV26 (1991)). Běžně dostupné přípravky » · · · * • · ♦ * · * » * · · » » ·· ·· · · « ·«·* působící proti trombocytům zahrnují aspirin, tiklopidln, monoklonální protilátky, nitroglycerin a nitřoprusid sodný.

Jiný nežádoucí výsledek arteriálního poranění při váskulárhich intervenčnich výkonech je arteriálňí reštenóza. Například PTCA je rozsáhle používána při zprůchodnění uzavřených arteri i jak v koronárním, tak v periferním

Vaskulárním systému. Ačkoliv je původně úspěšná ve vlče jak 95 procentech případů, během šesti měsíců se u 30 až 50 procent·* pac i entů*· ob j e v í»·* buď·, post upné_ opě tné_B zúžen í _ nebo reoklúzní proces, známý jako reštenóza.

Vaskulární intervenčnl výkony mají tendencí k poškození cévní stěny. Takové poranění spouští prolifěraci buněk hladkých svalů ve štěně cévy, což má za následek hyperplazii int1my. Tato proliferace může být částečně způsobena účinky růstových faktorů pocházejících z trombocýtů (platelet-derived grovth factor), které uvolni trombocyty adherující k místu arteriálního poranění. Nadměrná hyperplazíe lntimy vede k restenóze, tj. k opětnému zúžení průsvitu artérle. Tak může arteriálňí reštenóza vážně omezit dlouhodobou účinnost vaskulárních intervenčnich výkonů.

Podstata vynálezu

Bylo zjištěno, že inhalovaňý plyn oxid dusnátý (NO) zvyšuje průchodnost krevních cév po lýzi trombu v místě kritické stenózy, aniž by způsobil jakýkoliv systémový hemodynamický účinek. Antitrombotické účinky inhalováného NO přetrvávají po ukončení inhalace NO. Bylo také objeveno, že

Λ » 9 9 «9 · 9 « 99 • 9 9 9 9 * «φ 999 9 · • • 9 9 9 9 999 • 999 · ·· ···♦ 99 99 inhalovený NO inhibuje vznik arteriální restenózy plynoucí z nadměrné hyperplažie intimy.

Ve shodě s tím vynález uvádí použití plynného oxidu dusňatého pro přípravu léčiva pro léčbu, inhibici nebo prevenci trombózy u savce. Trombóza může být spojena s nemoci nebo poraněním.

„' Dále vynález uvádí použití plynného oxidu dusňatého pro | přípravu léčiva pro léčbu, inhibici nebo prevenci arteriální

X fc restenózy u savce. Arteřiální restenóza může být spojena s nemoci nebo poraněním.

Dále vynález popisuje použiti oxidu dusňatého v kombinaci se sloučeninou, která potencuje blahodárné účinky inhalovaného NO pro přípravu léčiva. Jeden způsob, kterým druhá sloučenina potencuje blahodárné účinky inhalace

NO, je prodloužení účinku inhalovaného NO v cílových tkáních nebo buňkách, které intěraguji s cílovými tkáněmi, aniž bý se způsobila nežádoucí systémová vazodllatace a průvodně snížení systémového krevního tlaku. Konkrétněji může být prodloužení antitrombotického a/nebo inhlbujícího účinku na hyperplasii intimy inhalovaným NO dosaženo kombinací přípravku inhibujÍcího fosfódlest©rázu (tj. před, během nebo ihned po) s inhalovaným NO. Preferovaně inhibitory fosfódiesterázy jsou ty, které selektivně inhibují f cGMP-spécifické fosfodiesterázý, zatímco mají minimální vliv ( na odbouráváni cykl ického adenosin-3’,5'-monofosfátu (cAHP) dalšími fosfodiesterázami. Preferovaný inhibitor fosfodiesterázy, který projevuje výše zmíněnou specifičnost, je Zaprinášt™ (M&B 22948, 2-o-propyloxy-

•	v v	• * · · * v· · ·
•	v	• · « ♦ ·
v	• *	• · · · * v *
•	«	• · ve

fenyl-8-azapUri.n-6.-on, Řhone-Poulene Rorer, .Dagenham Essex.

IÍK>. Jsou známy další - cGMP-specifické inhibitory fosfodiesterázy a Zaprinast™ jimi může být nahrázen.

Další zpQšób, kterým druhá sloučenina potencuje blahodárně účinky inhalace NO, je prodloužení poločasu rozpadu NO in vivo- Toho může být dosaženo například podáváním superoxid-dismutázy. Superoxid-dismutáza odstraňuje superoxidové radikály, které reagují s NO.

V dalším preferovaném ztělesnění mflže být v kombinaci s inhalovaným NO podán další antitrombotický přípravek, který zvyšuje blahodárné antitrombotickě účinky inhalovaňého NO. Příklady zahrnují . aspirin, tiklópidin, monoklonální protilátky, nitroglycerin a nitřoprušid sodný.

V tomto textu používaný termín akutní isčhemický koronární syndrom znamená akutní uzávěr koronární arterie, např. akutní infarkt myokardu, nestabilní angínu, stupňující se angínu, angínu pectoris, koronární intěrmediární syndrom, angina pectoris status post thrombolysis a angína pectoris status post PTCft.?

1.

V tomto textu používaný termín antitrombotický přípravek” znamená přípravek, který inhibujě tvorbu trombu nebo stimuluje trombolýzu, tj- rozpouštění trombu, nebo Činí obé.

V tomto textu používaný termín hyperplázie intimy <nebo něóintiraální hyperplázie) znamená proliferaci buněk hladkého svalstva v intimě arterií jako odpověď na obnažení arteriálního endotelu.

V tomto textu používaný termín ”řevaskularizace • ·· · ·* • · « * «· * znamená znovunastolení zásobování krví v tělesných částech savce.

V tomto textu používaný termín cílové buňky znamená buňky jiné než plicní. které po inhalaci NO interagují přímo s NO, a zprostředkovávají blahodárný účinek inhibici, prevencí nebo léčbou trombózy nebo arteriální restenózy.

V tomto textu používány termín terapeuticky účinná koncentrace plynného NO je koncentrace, která u pacienta vyvolává jednu nebo více z následujících událostí- úlevu odbolesti na hrudníku. úlevu od dusnosti, vymizení ise henu ckých elektrokardiografických změn a zl epšený průtok koronárními arteriemi (což afiže být prokázáno, ang i ograf i í ) V tomto textu používaný termín terapeuticky účinné množství inhibitoru fosfodiesterázy je množství, které zvyšuje trvání ítj- poločas rozpadu) nebG mohutnost terapeutického účinku plynného N0V tomto textu používaný termín trombóza Znamená tvorbu nebo přítomnost krevní sraženiny v krevní cévě, tato sraženina iaůže způsobit infarkt nebo išchémii tkání zásobovaných touto cévou.

V tomto textu používaný termín arteriální restenóza znamená abnormální zúžení průsvitu arterie jako výsledeknadraěrné hyperplazie <neo)intimy.

V tomto textu používaný termín “vaskulární intervenční výkon znamená jakýkoliv chirurgický výkon, který zahrnuje anatomické otevření nebo mechanické porušení krevní cévy. Neúplný seznam vaskulárních intervenčníCh výkonů zahrnuje balónkovou angioplastiku, laserovou angioplastiku.

·· ·· ·· ·« ·· ·· ···· ··· ··· ·«· · * · · · ·· «· · · » · · k · · k · k • k k · · · k k k ««· ·· ♦· ·»»· kk <k .·?

chirurgický ateromového arter 1 í .

výkon na koronárních plátu (aterektonie) a arteriích, vynětí stenty koronárních

Použití samotného plynného NO nebo v kombinaci pro přípravu léčiva pro léčbu, inhibici nebo prevenci trombózy, která může vyplývat z přirozeně se vyskytující nemoci, např.

áteroskleřózy, nebo z vas.kulárního intervenčniho výkonu, např. angiopiastiky nebo chirurgického výkonu na koronárních arterilch. -Léčivo je použitelně pro léčbu, inhibici nebo prevenci arteriálnl restenózy plynoucí z nadměrné hyperplazle iňtimy. Tato arteriálnl restenóza je častá komplikace spojená s Váskulárnimi intervenčními výkony, jako je PŤCA nebo koronární bypass.

Podle předkládaného vynálezu může být plynný HO použit:

(a) kontinuálně nebo intermitentně, (b) v nepř í tomnost i tabákového kouře, (c) v koncentraci mezi 0,1 á 300 ppm (milióntin), výhodně mezi 1,0 a 200 ppm, a nejvýhodněji mezi 20 a 100 ppm, (d) jako směs obsahující NO, kyslík (Ož) a dusík (Hz) nebo jiné inertní plyny, mající výhodně Fi02 (tj. objemovou frakci 0ž) od 0,20 do 0,99, přičemž frakce 0a ve vzduchu je

0,21, a kde plynný HO je smis.en s plynem obsahujícím O2 krátce před inhalaci (tj. méně něž 5 minut před inhalaci a výhodně méně než jednu minutu před inhalaci a (e) to tak, že koncentrace NÚz je sledována á udržována v bezpečném rozmezí (např. méně než 1 ppm).

Důležitá výhoda předkládaného vynálezu je, že ·· ·· Μ ♦· ·· ·· • · · · ·' · · · · »

Λ «·«»·*··*· ·*«♦·· · * ··« » « ··«*·« · « · φ*·φ »· ·· *··· ·· »» inhalovaný NO nenavozuje systémovou važódilataci a průvodní akutní systémovou hypotenzi, Systémová vazodilatace j© nežádoucí, potenciálně nebezpečný vedlejší účinek spojený s nepřerušovaným systematickým uvolňováním NO z perorálních nebo intravenózně podávaných sloučenin uvolňujících NO, které jsou používány ke zpomaleni vzniku trombózy nebo , nadměrné hyperplazie intimy.

Další charakteristické rysy a výhody vynálezu budou zjevné z následujícího popisu preferovaných ztělesnění a z patentových nároků.

Podrobný;; pop is vynálezu

Trombóza

Trombóza, která má být léčena, inhibována nebo jí má být zabráněno, může být důsledkem jakékoliv různorodé příčiny trombóz. Například trombóza může být posttraumatleká arteriálni trombóza. Trombóza může být v jakékoliv rozmanité lokalizaci v těle savce. Napřiklad lokalizace trombózy může být arteriálni, venózní, koronární, cerebrálnl, femorální, renálnl nebo placentářnl. Výhodně lokalizace léčené, inhibované nebo předcházené trombózy není v. plicích.

Koronární trombóza je často spojena s akutním ischemickým koronárním syndromem. Jakýkoliv akutní ischemický koronární syndrom spojený s trombózou může být léčen, inhibován nebo se mu dá předcházet inhalovaným NO podle předkládaného vynálezu. Akutní ischemický koronární syndrom spojený s trombózou může být doprovázen např. nemocí

Μ·»

V 9 99 »

9

9999 »·

9 9 9

9 ·

9*9 9 9

9 9

99 uzavírající tepny nebo vaskulárním intervenčnlm výkonem.

Akutní ischemický koronární syndrom Spojeny s trombózou zahrnuje, ale není omezen na, infarkt myokardu, nestabilní angínu pečtorls, trombózu po koronární révaskulárizaci a reokluzí po koronární trombolýze. Koronární revaskularizace může byt dosaženo různými známými vaskulárnlmi intervenčními výkony, jako je např. PTCA, laserová ángioplastiká, přemostění koronární arterie-Štěpem (koronární bypass), vynětí ateromóvého plátu (aterektomie) z koronární arterie nebo stenty koronární arterie.

Podlé předkládaného vynálezu může byt inhalovaný NO použit k léčbě savce, u kterého byla rozpoznána existující trombóza. Je známo, že savci, obzvláště lidé, projevuji různé známky a příznaky trombózy, která může být takto rozpoznána. Poznáni těchto známek a příznaků je v moci lékařů. Známky a příznaky trombózy u lidi zahrnují, ale nejsou omezeny na, následující události'- bolest na hrudníku, dušňost, paralýza, bolest v končetině, infarkt myokardu, angína pečtorls, nestabilní angína pectoris,. zesilující šě angína pectoris, městnavé srdeční selháni ischemlckého původu, kardiogennl šok, onemocněni periferních cév a postiženi končetin ischemlckého původu. V jednom ztělesněni předkládaného vynálezu je identifikovaným savcem člověk, který má trombózu a trombóza, která má být léčena inhalaci NO, se projevuje jako infarkt myokardu.

Inhalovaňý NO může být také použit k inhibici nebo prevenci vývoje trombózy u savce, který nemá existujíc!

trombózu, ale považuje se za rizikového z hlediska rozvoje ·· ·* • · ♦ · •« · · * • · ♦ · · • · · · · ··«· ·* ♦· >4 4« • · · · • ·- · ·· • · · · · « · • · · ♦ • ••· ·· ·· trombózy. Je známo, Se při určitých existujících patologických stavech, jako je např. ateroskleróza, je jediriěc ohrožen rizikem rozvoje trombózy. Navíc určité vaskulární intervenčni výkony, např. balónková angioplastika a koronární arteriální bypašs, kladou na jedince riziko vývoje trombózy. Proto mohou být podle předkládaného vynálezu výhodně léčeni jedinci, u nichž jsou diagnostikovány patologické stavy spojené se zvýšeným rizikem vzniku trombózy, jedinci, kteří prodělali jeden nebo více vaskulárnleh intervenčňich výkonů a jedinci, kterých se bezprostředně týká provedeni jednoho nebo více vaskulárn1ch intervenčních výkonů.

Podobně může být identifikovaný savec člověk v riziku vývoje trombózy, kdy je riziko spojeno s nemoci uzavírající tepny, jako je ateroskleróza. Jednotlivci s takovými patologickými stavy jsou rozpoznáváni způsoby známými lékařům zkušeným V příslušných oblastech lékařské praxe.

V dalším ztělesnění předkládaného vynálézu je riziko spojeno s váskůlárním intervenčním výkonem jako je angioplastika. V konkrétně preferovaném ztělesněni je identifikovaný savec člověk v riziku rozvoje trombózy jako výsledek PTČÁ.

Arteriální reštenóza

Vynález poskytuje jednoduché, rychlé, Selektivní a účinné použití NO pro přípravu léčiva pro léčbu, inhibici nebo prevenci arteriální restenózy plynoucí z nadměrné hyperplazie intlmy. Nadměrná hyperplazie intimy a arteriální reštenóza se často výskytují po vaskulárních intervenčních ·« a* »· ·· ·# ěě • ·φ a ·>«* · · aa a a«a «a a a a aa • a a a a · a a a a a a a • a a a a aaa ·· aa aaa> aa aa výkonech jako je ang.ioplastika jakékoliv cévy (např.

karotidy, femorální, koronární apod.) nebo jakýkoliv koronární revaskularizační výkon, včetně balónkově angioplastiky, laserové angioplastIký, bypassu koronární arterie, aterektomle nebo stentů koronární arterie.

Podle předkládaného vynálezu může být použit plynný NO pro přípravu léčiva k íéčbé savce, u kterého byla rozpoznána existující arteriální restenóza. Je známo, že savci projevují různé známky a příznaky árteriální restenózy, která může být takto rozpoznána. Poznání těchto známek a příznaků je v moci lékařů. Známky a příznaky arteriální restenózy u savce zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, následující události: bolest na hrudníku, dušnost, elektrokardiografické změny a nálezy při koronární angiografii. Čilém léčby existující arteriální restenózy inhalováným NO je redukce tloušťky intimy opětně zúžené arterie tak, aby se zvětšil průměr průsvitu arterie, tj. aby se redukovala patologická striktura.

Podle překládaného vynálezu může být plynný NO použit pro přípravu léčiva k inhibici nebo prevenci arteriální restenózy u savce (např. člověka)* který nemá existující arteriální restenóžu, ale je shledán rizikovým z hlediska rozvoje arteriální restenózy. Určité vaskulárni intervenČní výkony, např, PTCA a koronární bypass, mohou způsobit arteriální poranění. Je známo, že arteriální poraněni vede k nadměrné • φ φφφφ

♦ φ · · « * ·«· φ • φ φ *·· φφ φ restenóžy plynoucí z nadměrné hypeřplazie intimy. Nadměrná hyperplazie i-ntimý a arteriální restenóza se často vyskytují po vaskulárních intervenčních výkonech jako je angioplaštika jakékoliv cévy (např. karotidý, femorální, koronární apod.) nebo jakýkoliv koronární řevaskularizační výkon, včetně balónkové angioplastiky, laserové angioplastiky. bypassu koronární arterie, áterektómie nebo stentfl koronární arterie.

Podle předkládaného vynálezu mflže být inhalovaný NO použit k léčbě savce, u kterého byla rozpoznána existující arteriální .restenóza. Je. známo, že savci projevují různé známky a příznaky arteriální résteňózý. která může být takto rozpoznána.. Poznání těchto známek a příznaků je v moci

Známky a příznaky arteriální restenóžy u savce , ale nejsou na ně. omezeny, následující události:

na hrudníku, dušriost, elektrokardiografické změny lékařů.

ifc zahrnu j í bolest

a.nálezy při koronární angiografii- Cílem léčby existující arteriální restenóžy inhalováným NO je redukce tlouštky intimy opětně zúžené arterie tak., aby se zvětši 1 průměr průsvitu arterie, tj. aby se redukovala patologická striktura.

Nebo mflže být inhalovaný NO použit, podle předkládaného vynálezu, k inhibici nebo prevenci arteriální restenóžy u savce (např. člověka), který nemá existující arteriální restenózu, ale je shledán rizikovým z hlediska rozvoje arteriální restenóžy. Určité vaskulární intérvenční výkony, např- PTCA a koronární bypass., mohou způsobit arteriální poranění. Je známo, že arteriální poranění vede k nadměrné

···· • · · • » ««· · • · ·* · hypérplázii intimy a arteriální restenóze. Tudíž tyto výkony kladou na jedince riziko vývode arteriální restenózy. Proto mohou být výhodně léčeni podle předkládaného vynálezu jedinci, kteří prodělali jeden nebo více vaskulárních intervenčních výkonů á jedinci, kterých se bezprostředně týká provedení jednoho nebo více vaskulárních iritervéhČních výkonů.

Inhalovaný NO jé například podáván pacientovi, ύ kterého se plánuje provedení vasku1árního intervenčního výkonu. Inhalovaný NO může být podáván před vaskulárním intervenčním výkonem, aby se minimalizoval stupeň zesílení intimy, které nastane po arteriáiním poranění normálně spojeném s vaskulárním i intervenčním i výkony- Pácient., který dostává inhalovaný NO jako preventivní opatření před vaskulárním intervenčním výkonem, může nebo nemusí mít již existující arteriální resteňózu. Nebo může být inhalovaný NO podáván pacientovi, který již prodělal vaskulární intervenČní výkon. V této situaci podávání inhalovaného NO výhodně začíná během doby vaskulárního intervenčního výkonu.

Ovšem Odborník zná, že inhalovaný ŇO může být podáván před, během a po vaskulárním intervenčním výkonu. Bez ohledu na to, zda inhalovaný NO je podáván před, během nebo po výkonu, či platí všechny tři možnosti, může být inhalovaný NO podáván kontinuálně nebo interiai tentně.

Podávání inhalovaného NO

Inhalovaný NO je výhodně podáván ze zdroje uskladněného stlačeného plynu NO. Stlačený plyn NO může být získán od komerčního dodavatele jako je Airco CMurray Híll, NJ), *· ♦

»· ···* typicky jako směs 200-800 ppm NO v čistém plynu Ň2 - Zdroj. NO mflže být 100¾ NO, nebo zředěný N2 či jakýmkoliv jiným inertním plynem (např. heliem). Je absolutně nutné, aby NO byl získaný a uskladněný jako směs prostá jakéhokoliv kontaminujícího O2 nebo oxidů dusíku vyššího stupně, protože takové vyšší oxidy dusíku (které se mohou tvořit reakcí O2 s NO) jsou potenciálně škodlivé plicním tkáním. Je-li požadováno, může být Čistota NO před podáváním pacientovi prokázána chemi luminiscenční analýzou za použití Známých metod. .Jsou komerčně dostupné chemi luminiscenční analyzátory N0-N0x (např- Model 14A, Thermo Énvironmental Instruments, Franklin, MA). Směs NO-N2 může být míchána se vzduchem nebo □2 např. kalibrovaným rotamétrem, který byl předem ověřen spirometrem. konečnou koncentraci NO v dýchací směsi je možno ověřit Chemickou nebo cliemiluminiscenční technikou odborníkům dobře Známou (např - Fonti iin a kol., Anal- Chero.

42-575 <1970)). Nebo mohou být koncentrace NO a NQ2 sledovány pomocí elektrochemického analyzátoru^ Jakékoliv nečistoty, jako NO2 , mohou být vyčištěny působením· roztoků

NaOH, Baralymem nebo natronovým Vápnem. Jako přídatná kontrola může být také stanoven F1O2 konečné směsi plynů. Je-li žádoucí, může mít ventilátor k dýchacímu výstupu přidány plynový čistič, aby se zajistilo, žé do okolního ' - “I. í - ' prostředí neuniknou významná množství NO.

V nemocnici nebo v případě náhlé příhody může být podávání plynu NO provedeno například připojením tlakové lahve se stlačeným plynem NO v N2 a druhé lahve s kyslíkem nebo směsí kyslíku/N2 k inhalátoru určenému mísit plyn ze • · · * · · • · · ·«»·· dvou?zdrojů: řízením toku plynu z každého zdroje může být koncentrace NG inhalovaného pacientem udržována na optimální hladině. Plyn NO může být také míšen sé vzduchem v místnosti zá použití standardního nízkotlakého mísícího přístroje (např. Bírd Blender, Palm Springs, CA). NO může být vyvíjen z N2 a O2 (tj. vzduch) za použití elektrického generátoru NO- Takový generátor je popsán v patentové žádosti Spojených Států Zápol 07/850 383 (vyrozumění o povolení podáno), zahrnuto zde v odkazech- Navíc může. být NO poskytnut intermitentně z inhalátoru. Použití inhalátoru může být

Obzvláště výhodně, je-li v kombinaci s NO podáván inhibitor fosfodiesterázy perorálně nebo inhalací.

NO může být podáván savci, u kterého byla rozpoznána trombóza nebo arteríální restenóza, nebo savci, který je v riziku rozvoje trombózy nebo arteriálňí' restěnózy, v koncentraci od 0,1 ppm do 300 ppm ve vzduC.hu, čistém kyslíku nebo jiném vhodném plynu nebo plynné směsi, dokud je vyžadován- Výhodně je koncentrace 1,0 až 200 ppm a výhodněji až 100 ppm (např..30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm. nebo 80 ppm). Koncentrace může být přechodně na krátkou dobu zvýšena; např. 5 miň. na 300 ppm NO, když je žádoucí okamžitý dramatický účinek. Z důvodů popsaných níže může průvodní léčení inhibitorem fosfodiesterázy snížit celkovou dávku vyžadovaného Ň0 (nebo umožnit intermitentní dávkování) za tvorby uspokojivého anti-trombotického nebo antí-restenoti.ckěho účinku.

Pro léčbu, inhibici nebo prevenci arteríální réštenózy může být nezbytné podávat inhalóvaný NO nazální Vidlicí,

•	»»
•	«	• ·	• · ·
•	» ·	• ·	• **· ·
•	•	• 9	9 9
			99 9

maskou, ve stanu, intratracheálním katetrem nebo endotračheální kanylou, po delší dobu, tj- dny nebo týdny. Podávání může být kontinuální během delší doby. Nebo může být podávání během delší doby intermitentní. Podávání plynného NO může být. spontánní nebo mechanickou ventilací.

Stanovení účinků inhalovaného NO

Když jě inhalovaňý NO podáván k léčbě, inhibici nebo prevenci trombózy nebo arteriální restenózy, je žádoucí sledovat účinky - inhalace NO- Takové sledování, může být použito u konkrétního jedince, aby se ověřily žádoucí účinky a rozpoznaly nežádoucí vedlejší účinky, které by móhlý nastat. Takové sledování je také užitečné při nastavení dávky, trvání a četnosti podávání inhalovaného NO danému jedinciVýhodriě by měly být účinky inhalovaného NO na pacienta určeny dle jedné či více z následujících událostí: klinická manifestace jako je bolest na hrudníku, elektrokardiografie, pravidelné analýzy vaskulární průchodnosti ultrazvukovým vyšetřením, koronární arteriografií . nebo jinými prostředky a zvýšení hladin cGMP v plazmě nebo trombocytečh.

Inhibitory fosfodiesterázy

NO se rychle rozkládá reakcí s molekulárním kyslíkem za vzniku nitritů a nitrátů. Navíc NO, který se dostane do krve, je rychle inaktivován těsnou vazbou na hemoglobin.

Z těchto důvodů má NO v arteriální krvi pouze krátký poločas rozpadu- To znamená, že inhalOváný NO se výhodně vyhne vazodilataci, nežádoucímu, potenciálně nebezpečnému vedlejšímu účinku spojenému nepřerušovaným systémové «V »»»

V V»

•	« ·	« · ·	•
•	♦ ·· ·	• · · · ·	•
«	• ·	9 9	•
			•

systematickým uvolňováním NO ze sloučenin uvolňujících NO,

Může být žádoucí prodloužit blahodárné účinky inhalováného NO v cílových buňkách nebo buňkách interagujících s cílovými buňkami v plicích- V souvislosti s inhibici trombózy, její prevencí a léčbou, jsou cílovými buňkami cirkulující ·trombocyty. V souvislosti s inhibici arteriální restenózy. její prevencí a léčbou., jšou cirkulující: trombocyty Ca možná bílé krvinky) buňkami, které interagují s cílovými buňkami v cévní tkáni.

Při určování, jak prodloužit blahodárné účinky inhalováného NO, je užitečné uvážit, že jeden z účinků NO in vivo je aktivace rozpustné guanylátcyklázy, která stimuluje produkci cyklyckého guanosin-3’,5'-mónofosfátu CcGMP).

Alespoň některý z blahodárných účinků NG vyplývá ze· stimulace biosyntézy cGMP plynem NO, Proto tedy je v prěferdvaném ztělesnění předkládaného vynálezu inhibitor fosfodiesterázy podáván v kombinaci s inhalací NO, aby se inhibovalo odbourávání cGMP endogenními fosfodiesterázami.

Inhibitor fosfodiesterázy může být do savce vpraven jakýmkoliv vhodným způsobem, včetně perorálního.

transmukózního, intravenózního, intramuskulárrtího, subkutánního nebo intraperitoneálního způsobu. Nebo může být inhibitor savcem iňhalován. Pro inhalaci je inhibitor fosfodiesterázy výhodně ve formě suchého prášků nebo aerosol izovaného roztoku, který má Částice nebo kapky o Velikosti menší než 10 pro, aby byl optimálně zanesen do alveolů a může být volitelně inhalován v plynu obsahujícím

NO.

♦	»	i> ·»»’
•	• ·	« * * »
•	• · «	» · ♦·· ·
•	« ·	0 · ·

Preferovaným inhibitorem fosfodiesterázy je Zaprinast™ (M&B 22948, 2-o-propyloxyfeny1-8-azapurin-6-on, RhonePouleno Rorer. Dagenham Ešsex, UK). Zaprinast™ selektivně inhibuje hyďrolýzu cGMP s minimálním účinkem na odbourávání

čAMP v	buňkách	. hladkých svalů	cév	(Trapani a	kol -, J.
Pharmacol	Exp -	Thér. 258269	(1991),	Harris a	kol., J-.
Pharmacol.	Exp.	Theř. 249=394	(1989)	, Lugnier	a kol.,

Biochem. Pharmačol - 35:.1743 (1986), Souness á kol-, Br J.

Pharmacol. 98:725 (1989)). Když se používá Zaprinast™ podle předkládaného vynálezu, jsou preferovaně cesty podávání intravenózní nebo perorální- Vhodné rozmezí dávkování je určeno odborníkem. Zásobní roztok Zaprinastu™ může být připraven v 0,05 N NaOH- Zásobní roztok může být pak ředěn Ringerovým laktátovým roztokem na požadovanou konečnou koncentraci Zaprinastu™ bezprostředně před použitím.

V praxi může být vynález provozován s dalšími inhibitory fosfodiesterázy. V oboru jsou známy různé inhibitory fosfodiesterázy, včetně dipyridámolu a teofylinu. Jako u Zaprinastu™ může . být způsob podávání a vhodné dávkování určeno odborníkem.

Další ántitrombotické přípravky v kombinaci s inhalovaným NO Trombóza může být léčena přípravky, které inhibují tvorbu trombu, přípravky, které stimulují trombolýžu, tjrozpouštění trombu, nebo oběma! Příklady antitrombotických přípravků jsou aspirin, streptokináza, urókináza, tkáňový aktivátor plažminogenu (t-PA), met-t-PA, (tj. t-PA s méthionovým zbytkem na N koncové Části), FE1X (analog t-PA), heparin, hirudin a Hirulog™ (analog hirudinu)-

• ··	•	·· ·♦ «««V
4	• ·	• ·	• ♦ · « ·
«	«	•	• · · ·
*	• *		• · ··· ·
	•	•	» 4 ·

V praxi předkládaného vynálezu mohou byt použitý také datsí antitrambotické přípravky. Jeden nebo více takových antitrombotických přípravků může být podáván savci před, během nebo po léčbě ínhalovaným NO, takže jejich samostatná antitrombotleká aktivita je výhodně použita ke zvýšení antitrombotického účinku (účinků) inhalóvaného NO.

Například v jednom ztělesnění předkládaného vynálezu pro léčbu trombózy je podána vhodná dávka t-PA před, během nebo okamžitě po inhalaci NO- Zatímco inhalovaný NO irthibuje ňébo zabraňuje tvorbě nových trómbů, t-PA bude stimulovat rozpouštění - (1) trombů již přítomných v období, kdy byl podáván inhalovaný NO nebo (2) trombů tvořených (třebaže ve snížené míre) během nebo těsně po inhalaci NO. Výběr vhodných antitrombotických přípravků podávaných v kombinaci s ínhalovaným NO a výběr vhodné dávky a způsobu podávání těchto antitrombotických přípravků jsou v oboru Známé.

V preferovaném ztělesnění předkládaného vynálezu je pro léčbu trombózy před, během nebo těsně po inhalaci NO podáván aspirin? Preferované rozmezí dávkování aspirinu je od 81 do 325 mg (perorálně) denně.

Zatímco byly dva aspekty předkládaného vynálezu popsány odděleně (tji trombóza a arteriální restenóza), je nutné si uvědomit, že jedinec již může mít. obě (či být v riziku jejich vývoje) Onemocnění, trombózu i arteriální restenózu) Za takovýchto okolností mohou být obě stránky vynálezu v praxi uskutečňovány současně, u stejného jedince, pouze jednoduchým podáváním inhalóvaného NOtt ···» • · * · 9 **· · • * · · · · ·»·«« ·· ··· ·* ·

Popis obrázků

Obr. 1A je graf srovnávající čas, po který byla otevřena arterie <jako procento celkového času), u kontrolní skupiny, před, běhen a pa inhalaci 0 ppm NO, v modelu trombózy koronárních arterií u psflObr. IB je graf srovnávající čas, po který byla otevřena arterie (jako procento celkového času), u skupiny, která iňhalovala 20 ppm NO, před, během a po inhalaci NO, v modelu trombózy koronárních arterií u psfl. Hvězdička označuje hodnotu významně se lišící od základních hodnot

Cp < 0,05)Obr. IC je graf srovnávající řas, po který byla otevřena arterie Cjako procento celkového času), u skupiny, která iňhalovala 80 ppm NO, před, během a po inhalaci NO, v modelu trombózy koronárních arterií u psS. Hvězdička označuje hodnotu významně se lišící od základních hodnot

Cp < 0,05)Obr. ID je graf srovnávající Čas, po který. byla_ otevřena arterie íjako procento celkového času), u skupiny, která iňhalovala 200 ppm NO, před, během a po inhalaci NO, v modelu trombózy koronárních arterií u pshObr. 2 je graf ukazující křivky agregace tromboeytfi indukované ADP u psů pro Vzorky vystavené 0 ppin nebo 400 ppm

NO.

Obr. 3 je graf, který shrnuje údaje o účinku iobalovaného NO na agregaci trombocýtfl :u psfi v závislosti na dávce.

«Λ · · ·* · · » * • · · · · · · • · * · « · 999 9

9 · · · « ··« ···· ·· *··· *» »

Obr- 4 je graf srovnávající poměr i ntima/médle u kontrolních krys, krysy vystavené 20 ppm NO po dobu dvou týdnů, krysy vystavené 80 ppm NO po dobu dvou týdnů, a krysy vystavené 80 ppm NO po dobu jednoho týdne, následováno jedním týdnem inhalací vzduchu. Hvězdička označuje hodnotu významně še odlišující od základních hodnot (p < 0,05).

Priklady provedení vynálezu

Pokusy s trombózou

Účinky NO namířené proti trcrmbocytflm byly hodnoceny v uznávaném psím modelu akutní koronární trombolýzy pa vytvoření trarabu. Používaný psí rocidel byl v podstatě týž, jaký byl popsán autory Yasuda a kol- <J. Am. Coli. Cardiol13:1409 <19891) a Gold a kol. CGirculation (suppl- IV) 83:

IV26 ¢1991)).

U dvaceti pěti dospělých psích kříženců <20-25 kg) obého pohlaví byla provedena anestézie pentoharbitalem C30 mg/kg tělesné váhy); Doplňující pentobarbital byl podáván pró udržování celkové anestézie. Trachey psů byly intubovány a jejich plíce byly mechanicky ventilovány, 15 dechfi/min a 10-15 ml/kg. ventilátorem na F1Q2 21 aš 35% ÍHudšoú

Ventronics, Tenecula, CA), nastaveným pro udržování Q2 arteriálni krve mezi 80 a-'100 torry. Kyslíková saturace byla hěhem pokusu kontinuálně sledována za použití pulzního oximetru CNel.lcor, lne., Haywood, CA).

Femorální arterie a polyvinylehloridovým katetrera véna byly kaný1ovány za účelem kontinuálního • ·« ·· · * ·· *· »·*>

sledování arteriálního tlaku, pra krevní odhěry a infuze.

Při výskytu arytmií byl podáván Lidokain 0,1 mg/kg/min i. v.

V levém pátém mezižeberním prostoru byla provedena torakotomie- Pěrikard byl otevřen á zavěšen, čímž se vytvořilo pěrikardiálni lůžko. Levá přední sestupná arteríe hýla uvolněna disekcí a hyl izolován segment dlouhý 2,5 cm distálně k první diagonální větvi. Byl odebrán jeden mililitr krve pro vytvoření trombu. Katetr i.d. o průměru

0,7 mm byl zaveden dó postranní větve izolovaného segmentu levé přední sestupné koronární.arteríe a do proximální Části arteríe byla umístěna ultrazvuková průtoková sonda (T101 Transonic System, . Inc., Ithaca, NY) ke kontinuálnímu Sledování krevního průtoku. Levá přední Sestupná arterie, těsně distálně od místa plánované tvorby trombu. byla postupně zaskrcena plastickým vláknem O šířce 2 mm (Mass Gas and Electric Šupply, Vatertown, MA) tak. aby se omezil' průtok krve na 50 i 10¾ základní hodnoty. Předcházející angiografická studie prokázala, že toto zaškrčení zmenší průměr průsvitu Cévy o více než 90¾.

Izolovaná levá přední sestupná koronární arteríe byla traumatizavána čtyřmi po sobě jdoucími vnějšími kompresemi tupými kleštěmi po dobu 3 až 5 sekund, aby se poškodil endotel a podporovalo přichycení trombu. Byly provedeny smyčkové okluze distálně k sondě á proximálhě k místu zaškrčení. Aby se indukovala tvorba trombu, byl katetrem

Z postranní větve do vyprázdněného segmentu koronární arteríe injikován trombin (0,1 ml Z roztoku 100 jednótek/ml. Thrombinar, Armour Pharmaceutical, Kankakee, • · 9 9 9 9 *· · 9*999«

9 9 9 *

999 999 9999 99 ·

IL) smíšený s 0,3 ml krve. Po deseti minutách byla uvolněna praximální smyčka. Dvě minuty později byla uvolněna distální smyčka. Deset minut po vytvoření trorabu. byl intravenózně podán holus heparinu (75 m.j./kg) a byl následován kontinuální infuzí heparinu <50 m.j-/kgZh). Po 30 minutách stabilního uzávěru byly podávány v patnácti minutových intervalech bolušy rekombinantního t-PA (0,45 ng/kg,

Activase™, Genentech lne., South San Franeisco, CA), dokud nebylo dosažena rekanalizaee trombózovane koronární arter.ie nebo do maxima čtyř podaných bolušů.

Tento postup navodil střídavá období rekanalizaee a reokluze (definovaná jako méně než 25¾ průtoku Za stenozou) po počátečním obnovení průtoku v levé sestupné koronární arterii- Poměr času otevření arterie k celkovému času byl zaznamenáván jako primární výstupní proměnná.

Kontinuálně se zaznamenávalo EKG, systémový arteriální tlak, tlak v levé předsíní srdeční a koronární průtok krve.

Z další studie byla vyloučena zvířata, u nichž nastala' (1) žádná reperfiize, (2)· reperfuze bez okluže, (3) méně než tři .

cykly hěhem první 45-ti minutové doby sledování nebo (4) smrt před koncem prvn í doby ε1edován í.

Plyn NO (BOOppm NO v dusíku, Airco, Murray Hill, NJ) byl smíšen se vzduchem V místnosti za použití standardního nízkotlakého mísicíhO přístroje (např. Bird Blendeř, Palm Springs, CA), a poté byl titrován různým množstvím NO těsně před. dodáním do ventilátoru t.ak, aby se udržela konstantní

FiQ2- Hladina vdechovaného NO hýla kontinuálně sledována chemiluminiscenčním analyzátorem NO-NOx (Model 14A, Theřmo

Environiaental Instruments, Frank! in, MA. Fontijin a kol., výše). FIO2 se měřila íoximetr ě. 5590, Hudson, Témecula,

Kalif.) distálně od rezervoáru poté, 00 byly smíšeny plyny obsahující NO. Vydechované plyny, stejně jako plyny vypouštěné z chemi luminiscenčního analyzátoru, byly odsávány za použití difuzérového výdechového jímače udržovaného v negativním atmosférickém tlaku lahoratorním centrálním vakuovým systémem. Hladiny NO/NO2 v okolí se během pokusu nezvyšovaly.

jak bylo měřeno periodicky chemiluminiscencí.

Vždy, když se odebíraly methemog1obi hu. Kontinuá1ně hodnoty srdeční frekvence, vzorky, se měřily hladiny se sledovaly a zaznamenávaly krevního tlaku a koronárního průtokuPo 45-ti minutovém období základní studie tohdobí před léčbou) byla zvířata rozdělena do čtyř skupin- skupině A <η=®6) se podávalo 0 ppm inhalovaného NO Ctj- vzduch) po dobu 45 minut, skupině B Cn=6) se podávalo 20 ppm inhalovaného NO po dobu 45 minut, skupině C ín=6) se podávalo BO ppm inhalovaného NO po dobu 45 minut a skupině D ,<n-6) se podávalo 200 ppm pa dobu 45 minut. Všechny Skupiny zvířat byly poté sledovány ve třetím období studie, které začalo po ukončení podávání NO a trvalo 45 minut < obdob í po léč bě).

Měření agregace trombocytů in vitro

Krev osmi psů byla odebrána do 0,0 ÍM citrátu a stočena při teplotě místnosti v 370 x g pa dobu 5 minut pro přípravu plazmy bohaté na trombocýty (platelet-rich plasma - PRP) a v 1200 x g po dobu 10 minut pro přípravu plazmy chudé na

• ·	*		•
• · ·	*	• « · » »	♦
• ·	•	• *	9
			9

trombocyty (platelet-poor plasma - PPP). PRP byla přechovávána pouze v plastických nádobkách nebo, během testování, v si l ikonizaváném sklu. Počet trombocytů v PRP (Thromboeounter C™ platelet counter, Coulter Electronics, lne., Hialeh, FL) hyl upraven zředěním plazmou PPP tak, aby se získalo 300 0QÓ/mm³±lQ%. PRP byla poté rozdělena do kyvet inkubovaných ve 37 °C s magnetickými míchadélky ¢1 000 rpm) v agregoroettu s dvojitým kanálem (Model 440, Chrono-Log Corp., Havertown, PA). Propustnost světla byla kontinuálně zaznamenávána na zapisovači (Model 707, Chrono-Log Corp.,

Havertown, PA). Zkumavka se vzorkem, u kterého se stanovovala agregace, byla uzavřena gumovou zátkou a do ní byly zapíchnuty dvě jehly kalibru 19 (Sherwood Medical, St. Louis, MG), což umožňovalo dodávku směsi plynu NO a kyslíku nad PRP. Vstupní jehla byla spojena přes měřič průtoku š rezervoárem plynu, do kterého se dodávala směs plynu NO,.

vzduchu a kyslíku, titraváná jak popsáno výše. Koncentrace

NO byla kontinuálně sledována chemiluminiscenčním analyzátorem NG-NQx. Jehlový ventil umožňoval regulaci průtoku vzorkem na přibližně 40 ml/min- Pozitivní tlak se v systému udržoval tak, že výstupní jehla byla spojena s vodním maňostatem s 5 cm vody, ve kterém se udržovalo konstantní probublávání.

Studie měřící agregaci trombocytů indukovanou ADP byly provedeny po expozici testovací kyvety obsahující 450 pl upraveně PRP plynné směsi NO po dobu 10 minut.-Během měření agregace indukované ADP se pokračovalo s podáváním plynu. Agregace trombocytů se studovala za použití různých • * · « · · » « · · · ····*« • · ♦ · · * poměrných částí PRP vystavěné 20, 80, 200 a 400 ppm NO, v náhodném pořadí. Aby se stanovila stabilita preparátů PRP, byly před a po podávání NO provedeny kontrolní studie agregace trombocytů indukované ADP bez NO. Všechny pokusy byly dokončeny během 4-hodin po odběru krevních vzorků.

Analýza dát

Arteriální průchodnost byla definována jako část celkově doby pozorování, během které byl průtok větší než 25% Základního průtoku poté, co byla vytvořena počáteční stenóza. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr x SEM, není-li uvedeno jinak. Významnost rozdílu mezi skupinami byla určována příslušným Studentovým t-testem, párovým či nepárovým. Významnost odpovědi na dávku při stanovení účinku NQ na agregaci trombocytů indukovanou ADP byla stanovena dvoufaktorovou analýzou rozptylu. 2a statisticky významnou se považovala hodnota p < 0.05.

Výsledky trombolýzy a reperfuze u modelu psů

V každé pokusné skupině vnější zaškrcení snížilo krévní průtok levou přední sestupnou- árter i í na 54 x 2% základních hodnot, Z 22 ± 2 na 10 x 1 ml/roin. Průměrný počet bolusů tPA nezbytný pro reperfuzi hyl dva, s rozmezím od 1 do 4 (tahulka 1). Cyklus obnovení, průtoku a reokluze doprovázený elektrokardiografickým důkazem myokardiálního poškození nastal u všech zvířat kromě jednoho, ύ kterého še neobjevila reókluzě, toto zvíře bylo vyloučeno z další studie.

• · « · » * «· · *·«··« • · · · »

Tabulka i

Základní hodnoty fyziologických parametrů

Měřený	Skupina A	Skupina B	Skupina C	Skupina D
parametr	0 ppm NO	20 ppm NO	80 ppm NO	200 ppm NO
	(n=6)	< n=6 )	(n=6)	(n=6)
Průtok za	51,7+3,5	55,2±3,7	51,6+4,7	54.6+1,9
stenózou
(% před stenózou)
Počet bolusů tPA	2,0+0,4	1,7+0,2	1,8+0,3	2,0+0,4
ACT (sék)	219+16	219+14	236+5,3	196+12,8
Fi0₂ (%)	29,0+1,1	27,S±l,0	32,'2±1,5	31,6±3,0
Poměr (%)	55,7+8,5	50,6±6,9	48,8+2,9	45,2+5,6
Hb (mg/dl)	13,26+1,35	14,28+0,85 14,08+0,85 12,95+0,64
Počet trombocýtů	301+55	292±25	277±35	237±35
(xlO³/mm³)
MetHb C£)	0,25+0,17	0,10+0,06	0,18+0,09	0,26+0,09
V tabulce	1: Počet bolusů	tPA se	týká počtu

indikovaných bolusů, ACT se týká aktivovaného Času srážení krve, FiOa se týká vdechované frakce O2 , Poměr še týká neuzavřené/uzavřené koronární arterie v základním stavu,

Počet trombočytů se týká počtu trombocýtů a MetHb se týká methemoglobinu (procento celkového hemoglobinu). Není žádný statisticky významný rozdíl mezi základními hodnotami poměrů průtoku při 0.ppm (kontroly), 20 ppm, 80 ppm a 200 ppm inhálovaného NO (n=6 pro každou skupinu)26 • · · · 94··«« • 9 · 9 « ·

9999·· 999·«·9 « 9 ·

Účinky inhalovaněho NO na průchodnost arterií

Zvířatům·, která dostávala 0 ppm inhalovaného NO (Skupina ft), se průchodnost arterií během tří období léčby nezměnila (Obr. IR). U zvířat, která dostávala 20 ppm inhalovaného NO (Skupina B), se průchodnost arterií zvýšila •ž 50,6 + 6,9% běhen základního období před inhalací na 63,8 ± 7,9% během období inhalace (p < 0,01) (Obr. IB). I) zvířat, která dostávala 80 ppm inhalovaného NO (Skupina C), se průchodnost arterií zvýšila z 48^8 ± 2,9% během základního období před inhalací na 75,1 ± 6,7% během období inhalace (p < 0,01) (Obr. ÍC). U zvířat, která dostávala 200 ppm inhalovaného NO (Skupina D), se průchodnost arterií zvýšila ze 45,27 ± 5,6% během základního období před inhalací na

54,8 ± i0,4% během období inhalace (p = NS) (Obr. ID). Ve skupině C zvýšená průchodnost arterií pozorovaná během inhalačního období NO přetrvávala během 45-ti minutového

období po P < 0,05).	inhalaci (70,1	± 7,1% proti základním	hodnotám,
Když	byly výsledký	průchodnosti	arterií z	inhalačního
období ze	skupin B, C a	D sloučeny.	zjistil še	statisticky
významný	rozdíl mezi	sloučenými	léčenými	skupinami
a skupinou	i kóntrolní (p	< 0,005).	Když byly výsledky

průchodnosti arterií ze 45-ti minutového období po inhalaci

ze skupin	B, C a	D s1oučeny, také	se zjistil	statisticky
významný	roždí 1	mezi S1bučenými	léčenými	skupinami

a skupinou kontrolní (p < 0,005).

Během nébo po podávání NO se v žádné skupině zvířat • · * a » ι · a a· * ·«··«· a · · a a a nezměnil počet trombocytů ani krevní hemoglobin (tabulka 3). U psů, kteří dýchali 200 ppm inhalovaného NO, še hladiny methemoglobinu zvýšily z .0,2 ± 0,1% na 1,1 ±

0,4% (tabulka 3). Toto zvýšení přetrvávalo i poté, co bylo podávání NO zastaveno, a nebylo pozorováno u psů. kteří dostávali nižší dávky NO.

Systémový arteriální tlak se u všech skupin psů během této studie snížil a nelišil se mezi psy, kteří dostávali NO a těmi, kteří NO nedostávali (tabulka 2A>. Během trvání studie byl tlak v levé předsíni ve všech skupinách zvířat nezměněn (tabulka 2B).

Tabulka 2Λ

Průměrný systémový arteriální tlak (SAP) (mmHg) před, během a po Inhalaci NO

Léčba NO	Před	Během	Po
0 ppm NO (N=6) Skupina A	89+8	82±6	80+7
20 ppm NO (N=6) Skupina B	105+6	96±6	82+6
80 ppm NO (N~6) Skupina C	91+5	81±9	78+7
200 ppm NO (N=6)	94+3	95+4 .	. 93+4

Skupina D

Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměry + SEM.

Tabulka 2B

Průměrný tlak v levé předsíni (LAPÍ (mmHg) před, během a po inhalaci NO

Léčba NO	Před	Během	Po
0 ppm NO <N=6) Skupina A	5,5+0,6	5,4+0.7	5,4+0.7
20 ppm NO (N=6) Skupina B	5.2+1,6	4,7±1,4	4,6±1,1
80 ppm NO ( N=6) Skupina C	5.3±0,6	5,2±0,6	4,9+0.6
200 ppm NO (N=6) Skupiha D	4,6+1,1	4,2+0,9	3,7±0,8

Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměry ±

SEM.

Účinky NO ha agregaci destiček in vitro indukovanou ADP

Přídavek 20, 80, 200 a 400 ppm NO k plynové směsi nád

PRP vedlo ke sníženi (v závislosti ná dávcej maximální změny v propustnosti světla způsobeném ADP (obr. - 3.) ·. Ve snížení propustnosti světla indukovaném ADP u dvou kontrolních agregačních křivek provedených na začátku a na konci každé studie nebyla žádná změna (30,57+5,57¾ proti 31,1+4,31¾).

• · · * · · * · * ··»··· ♦ · · · · ··· ··· ···· »« ·

Tabulka 3

Hematologické hodnoty před, během a po inhalaci NO

Léčba NO	Měření	Před	Během	Po
0 ppm NO	Hb (mg/dl)	13,2+1,3	13,7+0,8	12,2+0.7
Skupina A	Počet trorob.	301+55	284+53	276+35
Cn=6)	(xlO³/mm³) MetHb (¾)	0,22+0,2	0,2+0,1	0,2+0,2
20 ppm NO	Hb (mg/dl)	14,3+0,85	12,7+0.7	2+1
Skupina B	Počet tromb..	292±25	269+22	253+16
(n=6)	(xlO³ /mm³ ) MetHb (*)	0,1+0,1	0,4+0,2	0,1+0.02
80 ppm NO	Hb (mg/dl)	14,0+0,8	JI,9+0 i 3	11,1+0,6
Skupina C	Počet tromb.	277±35	238+32	209+37
<n=6)	(xí O³ /min³ ) MetHb (£)	0,2+0,1	0,4+0,1	0.3+0,1

Výše uvedené výsledky prokazují, že inhalovaný NO zvyšuje průchodnost koronárních arterií po lýze troinbu v místě kritické stenózy bez . vytvoření jakéhokoliv systémového hemodynámického účinku. Ukazují také, že antltrombotické účinky inhalováného NO přetrvávají nejméně minut po ukončení inhalace NO- Při koncentrácích NO podobným koncentracím získaným in vivo, plynný NO výrazně inhiboval agregaci trombocyth indukovanou ADP in vitro. Pokusy týkající se hyperplazie intimy

Při restenóze arterií u lidí je hlavní patologický proces hyperplazie buněk hladkých svaífl v intimě (neóintimáln.í hyperplazie). Proto, aby se objasnil účinek inhalováného NO na proces restenózy po vaškulárním intervenčním postupu jako je PTCA, byl studován účinek inhalovaného NO na hyperplazii intimy, za použití modelu arteřiálního poranění karotidy krys CCloves a kol., *· · »w V» *«** • · « 9 • · · · · · » • · · · · * «·· « • · · · * « ·· ·♦·· ··· *·*« ·* *

Laboratory Invest. 49-· 327 (1983), což je standardní Zvířecí model pro studium hyperplazié buněk hladkých svalů u lidí.

Arteriální poranění

Dospělí samci krys Sprague-Datíléy (Charles River Laboratories, Wilmongton, MA) prodělali poranění společné karotidy balónkem způsobem, u kterého bylo již dříve ukázáno, že je schopný vývolat něointimální hyperplazii (Clowes a kol-. výše)- Krysám vážícím 300 až 350g byla podána anestézie intraperitoneální injekcí kétaminu (60-80 mg/kg) a aceprómazinu (0.1 mg/kg)- Jakmile bylo dosaženo uspokojivé anestézie, býl proveden podélný řez ve střední čáře a tupou disekcí byla izolována levá karotida- Po další opatrně disekcí bifurkace interní a externí karotidy byl podvázán distální segment externí karotidy švem ze 4-0 hedvábí. V externí károtidě byla provedena malá artériotomie za použití mikrodisekčních nůžek a otvorem byl vložen francouzský Fogartyhó balónkový katetr 6. 2 (Baxter Edwards

LIS) a byl posunut vpřed přibližně dva centimetry pod bifuřkaci karotid- Balónek byl naplněn fyziologickým roztokem taki aby se způsobila viditelná distenze společné karotidy, a jemně vytažen zpět na úroveň bifurkace. Balónkový katetr byl poté vytažen a po krátkém.krvácení arteriotOmiί, aby - se vyloučil možiiý trombus a vzduchové bubliny, byla externí karotida podvázána proximálně od místa arteriotomie za použití hedvábného šití 4-0: Po vizuálním ohledání adekvátní pulZace společné karotidy byla chirurgická léze uzavřena a zvířata se nechala zotavit z anestézie.

• ♦ · I • * ·«· · » ♦ · >·* ·* ·

Chronická inhalace NO

Chronická inhalace NO - se prováděla ve speciálně připravených akrylových inhalacních komorách s objemem 40 1. Plynné směsi se míchaly za použití samostatně regulovaných a kalibrovaných měřičů ‘ průtoku pro kyslík, stlačený vzduch a zásobní plyny NO <800 ppm a 10 000 ppm NO v Nž. Airco, Murray Hill, NJ). Aby se zajistily stabilní hladiny FIO2 a NO, byl plyn vycházející z komory během experimentálního období periodicky analyzován- FiOa byla měřena polarograf ickou elektrodou CHudson Oxygen Meter 5590, Teroecula, CA), koncentrace NO še měřila Cheroiluminiscencí (Model 14A, Thermo Énvironmental Instruments, lne -, Franklin, MÁ) a oxid dusi.čitý a dusík s vyšším stupněm oxidace (ΝΟχ) byly měřeny chemoluminiscencí následující přeměnu ΝΟχ na NO v zahřívané peci z nerezavějící oceli (85Ó °C) s účinností 98¾ (Model 100B ΝΟχ generátor, Thermo Enviroňmental Instruments, InC-, Franklin, MÁ). V komorách bylo udržováno čerstvé natronové vápno, aby redukovalo ΝΟχ.

Koncentrace NO se udržovala na 20 až 80 ppm., v závislosti na pokuse. Pravidelná měření ukázala, že F1Q2 je 21¾ a N0x 3 až ppm. Plyny odcházející z éxpozíčních komor, Stejně jako plyny vypouštěné z cheroiluminiscenčního přístroje, byly odsávány za použití difuzérového jímače udržovaného v negativním atmosférickém tlaku laboratorním centrálním vakuovým systémem.

Kontrolní zvířata byla chována ve filtrovaných klecích ve stejné místnosti jako zvířata ošetřovaná NO. Expozice NO začínala 30 až: 120 minut před chirurgickým výkonem. Během

• »	«	«ν ·ν ww
• a	Φ	• · · ·
* · ·	•	• a ··· a
• a	Φ	• · «

chirurgického výkonu byla skupina léčená NO vyňata z komory a exponována NO Za použití iaodif i kované. obličejové masky plněné přítokovými trubicemi z komor. Analýza inhalovaného plynu prokázala hladiny NO 50 až .80 ppm během pokusů s 80 ppm a 10 áž 20 ppm během chirurgických pokusů s 20 ppm. Celková doba, po kterou bylo zvíře venku z komory a pod obličejovou maskou, kolísala od 20 do 40 minut.

MorfóréetriCká analýza

Za 1, 3 a 14 dnů po balónkovém poranění byly krysy usmrceny létálni intraperitoneální injekcí pentobarbitalu sodného nebo ketaminu. Do vzestupné aorty býl zaveden katétr o kalibru 16 cestou levého ventrikulárního apexu. Hrudní sestupná aorta byla podvázána. Zvíře bylo poté perfundováno za tlaku 100 mm Hg 100 ml normálního fyziologického roztoku, poté následovala perfuze 50 ml 2¾ paraformaldehydu ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS). Po fixaci in vivo 15 áž 30 minut byly izolovány obě Společné karotidý a prodělaly další fixaci přes noc ponořením do 1¾ paraformaldehydu v PBS. Tkáň byla dehydratována v postupně se zvyšujících koncentracích etanolu následovaného xyleriem, a poté zalita do parafinu. Byly řezány příčné řezy (6 nm) a barveny hematoxylinem a eosinem a/nebo elastinem pro analýzu. U každého zvířete byl k analýze použit jeden reZ 7 až 8 mm proximálně od bifurkace karotid. Analyzovaný řez se fotografoval ve lOOx zvětšení- Obraz býl digitalizován za použití snímače Kodak 2135™. Analýzy Oblasti intimy a médie se prováděly na počítači Power Macintosh 8100/80™ veřejně přístupným programem NIH Imáge (vytvořeného Waynem Rasbandem

9 • 9» v 9« • · · 9 9

9 9 « 99 • 9 9 9 9 9 • 9 99·· ··· 9999 99 9 v U.S. National Institutes Of Health a dostupného na

Internetu anonymním ftp od zippy.nimh.nih.gov nebo na floppy disku od NTIS, 5285 Port Eoyál Rd . , Springfield, VA 22161, číslo PB93-504868). Morfometrická analýza byla provedena badatelem, který nevěděl, která skupina je experimentální.

Statistická analýza

Statistická analýza sé prováděla komerčně dostupným software Statview™ (Abacus Concepts) pro počítače Macintosh™. Experimentální skupina byla srovnávána s kontrolní skupinou nepárovým oboustranným t-testem. Za statisticky významnou se považovala hodnota P < 0,05.

Všechna data jsou uvedena jako průměr ± SEM. Hodnota n se týká počtu zvířat ve Skupině Výsledky restenózy na modelu hlodavců

Celkem 62 krys prodělalo výkon poranění karotid. Pět krys zemřelo v důsledku cévních komplikací během arteriotomie nebo balónkového poranění, což dává míru úmrtnosti při výkonu 8¾. Nebylo nalezeno statisticky významné nerovnoměrné rozložení úmrtí mezi rozdílnými experimentálními skupinami. Nebyla žádná úmrtí po výkonu mezi 57 krysami, které přežily· úvodní proceduru. Všechny krysy, bez ohledu na experimentální skupinu, projevovaly normální umývači pohyby a normální úroveň aktivity v průběhu studie. Kromě příležitostné ptózy na stráně poranění karotidy neprojevovala žádná krysa velký neurologický deficit. Analýza menšího souboru z experimentálních skupin prokázala během expozice vzduchu, NO při 20 ppm a NO při 80 ppm přírůstek na váze bez statistického rozdílu.

4» ·

V prvních sériích pokusů krysy, které prodělávaly balónkové poranění karotidy/ byly vystaveny buď okolnímu vzduchu (n=12) nebo 80 ppm NO (n=l3) ve vzduchu, během trvání studie. Zvířata byla usmrcena 14 dní po poranění pro morfornětrickou analýzu. poraněné karotidy. Vyšetření Světelným mikroskopem odhalilo, že tři krysy ze skupiny dýchající vzduch (kontrolní) a jedna krysa ze skupiny vystaveně NO měly trombotický uzávěr průsvitu poraněné karotidy. Tato zvířata byla vyloučena z další analýzy. Jak se očekávalo, krevní cévy obou skupin projevovaly ztrátu.

enďotelu a vývoj . neointimální hyperplazie. Vyšetření Světelným mikroskopem neprokázalo kvalitativní rozdíl v buněčné morfologii neointimy (data neukázána). Avšak kvantitativní analýza prokázala, že léčba 80 ppm inhalóvaného NO měla za následek 38% inhibici neointimální hyperplazie, tj. poměr intima/médíe u zvířat z 80 ppm byl

0,932 ± 0,13, ve srovnání s 1,512 ± 0,147 u zvířat z 0 ppm

NO (kontrolních) (P=0,008) (obr. 4).

V další sérii pokusů byl testován účinek expozice NO po dobu jednoho týdne. Experimentální skupina (ň=7) byla vystavena 80 ppm. NO po dobu 7 dnů. a potě přenesena na vzduch po dalších šedin dnů před usmrcením. Kontrolní, skupina (n-5) byla vystavena vzduchu po celé období 14 dnů- MeZi skupinami nebyl kvalitativní morfologický rozdíl. Navíc kvantitativní analýza poměru intima/médie (obr. 4) neprokázala hyperplazi i vystavených statisticky významný rozdíl v mezi skupinami, tj. 1^059 ± 0

NO, ve srovnání s 1,217 ± 0,309 u neoi iit imá lni

239 u zvířat kontrol (P = ··

I · · · «*«» nevýznamná).

Ve třetí sérii pokusů byla studována nízká dávka inhalovaného N0 = krysy dýchaly buď 20 ppm NO (n=8) nebo vzduch (n^c8). Opět nebyl naležen žádný kvantitativní nebo kvalitativní rozdíl ve stupni neolntimální hyperplazie mezi skupinami, tj. poměr intima/médie byl 0,917 ±0,233 pro zvířata vystavená 20 ppm NO, ve srovnání s 0,985 ± 0,149 pro kontroly dýchající vzduch (P = nevýznamná) (Obr. 4),

Výše uvedené výsledky dokazují, že inhalace 80 ppm NO po dobu dvou týdnů významně inhibuje neolntimální hyperplazii následující po poranění karotld vyvolaném balónkem v modelu hlodavců.

Další ztělesnění	vynálezu	jsou v	nás1edu j1c ích
patentových nárocích.
Průmyslová využitelnost
Předkládaný vynález	se týká	použití	plynného oxidu
dusnatého pro přípravu	léčiva pro . léčbu,	Inhibici. nebo

prevenci vaskulární trombózy a arteriální restenózy, která plyne ž nadměrné hyperplazie intlmy. Trombóza nebo arteriální restonóza sě ovlivňuje inhalaci terapeuticky účinného množství oxidu dusnatého . Oxid dusnatého je možno kombinovat s další sloučeninou, která doplňuje nebo zvyšuje jeho léčebný účinek.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY:

1. Použití plynného oxidu dusnatého pro přípravu léčiva pro léčení nebo prevenci vaskulárnl trombózy a arteriální restenózy vyplývající z nadměrné hyperplazie intimy u savce.
2. Použití plynného oxidu dusnatého podlé nároků 1 v kombinaci S druhou sloučeninou, která potencuje léčebný účinek plynného oxidu dusnatého.
3. Použití podle nároku 2, kde druhá sloučenina je vybrána ze skupiny obsahující inhibitor fosfodiesterázy a superoxid disroutážu.
4. Použití podle nároků 3, kde inhibitor fosfodiesterázy je vybrán ze skupiny obsahující

2-o-propyloxyfenyl-8-azapurin-6-on, dipyridámo1 a teofylín.
6. Použití podle nároku 1 nebo 4, kde savec prodělal nebo se připravuje podstoupit vaskulárnl intervenčnl výkon.
7. Použití podle nároku 6, kde vaskulárnl intervenčnl výkon je vybrán ze skupiny skládající se z angioplastiky, chirurgického výkonu na koronárních arteriícb a stentů koronární arter i.e.

··» · · « · * • · ·· • * t · « »··» *·
8. Použití podle nároku 7, kde výkon je perkutánní trans1umínální koronární anglóplastika .