FI113540B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten biskonjugaattien valmistamiseksi, jotka sisältävät kaksi sakkaridia ja spacer-osan - Google Patents

Description

11354C

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten biskonjugaat-tien valmistamiseksi, jotka sisältävät kaksi sakkaridia ja spacer-osan 5 Keksintö koskee terapeuttisesti käyttökelpoisten säädeltävien biskonjugaattien valmistusta, jotka sisältävät kaksi sakkaridia ja välikkeen.

Antitromboottisia biskonjugaatteja, jotka sisältävät kaksi sakkaridia ja välikkeen, tunnetaan EP-patentti-10 hakemuksesta 312 086. Näiden yhdisteiden sakkaridiosat sisältävät sulfatoituja galaktopyranosyyli-, mannopyrano-syyli- tai glukopyranosyyliyksikköjä. Nämä sakkaridit eivät kuulu glykosaminoglykaanien eikä glykosaminoglykanoidien ryhmään, joita yhdisteitä on kuvattu esimerkiksi EP-pa-15 tenttihakemuksessa 529 715 ja jotka sisältävät uronihap-poja. Ei ole ilmoitettu, onko näillä sakkarideilla itsessään antitromboottista aktiivisuutta. Lisäksi esitetään vain välike, jolla on hyvin spesifinen rakenne ja jonka ketjun pituus voi olla niinkin pieni kuin 8 atomia, kun 20 taas on todettu, että tämän keksinnön mukaisesti valmis tetut biskonjugaatit eivät ole aktiivisia, kun niiden välikkeen ketjun pituus on alle 20 atomia. Lisäksi jul-. kaisussa EP 312 086 esitetyissä biskonjugaateissa sakkari- • · t · · dit ovat kiinnittyneinä välikkeeseen molempien pelkistä- • · 25 vien päidensä kautta.

·’,,,· Tämän keksinnön kohteena on menetelmä terapeut- *·· tisesti käyttökelpoisen säädeltävän biskonjugaatin valmis- »tr· tamiseksi, joka käsittää kaksi sakkaridia ja välikkeen, j·^ jolloin kumpikin sakkaridi on sama tai erilainen ja 30 käsittää 2-6 monosakkaridiyksikköä, jolloin ainakin yksi yksikkö on uronihappo, ainakin toisella sakkaridilla on itsessään antitromboottinen aktiivisuus, välike liittää ίΐ4ΐ·’ ainakin yhden sakkaridin toiseen sen ei-pelkistävän pään f·* · kautta, ja välikkeen ketjun pituus on 20 - 120 atomia.

35 On tunnettua, että glykosaminoglykaanityyppiset *···' pienet hiilihydraattimolekyylit ovat tehokkaita anti-Xa- ;*·,· inhibiittoreita. Katso esimerkiksi EP-patentti 84 999.

.··*. Myöhemmin tehdyissä patenttihakemuksissa osoitettiin, että • · · 2

11354C

näiden perusmolekyylien monilla muunnelmilla on samankaltaisia aktiivisuuksia. Nykyään on selvää, että nämä suhteellisen pienet molekyylit (pentasakkaridit ovat tyypillisiä esimerkkejä) ovat vuorovaikutuksessa vain yhden 5 seriiniproteaasi-inhibiittorin kanssa, tavallisesti anti-trombiini-III:n (AT-III:n) kanssa. Aktivoitu sakkaridi-AT-

Ill-kompleksi inhiboi sitten selektiivisesti tekijää Xa. Tutkimuksista luonnossa esiintyvällä hepariinilla ja sen fragmenteilla tiedetään, että tekijän Ha (trombiini) AT-10 III-välitteiseen inaktivoitumiseen tarvitaan pidempiä gly-kosaminoglykaaneja. Pidemmillä glykosaminoglykaaneilla, joissa on ainakin 16 sakkaridiyksikköä, on anti-Xa- sekä anti-IIa-aktiivisuus.

Käytännössä ei ole kiinnostavaa syntetisoida gly-15 kosaminoglykaaneja, joissa on 16 tai useampia sakkaridiyk-sikköjä, kun taas hepariinin tai muiden luonnossa esiintyvien glykosaminoglykaanien fragmentoinnilla saadaan yhdisteiden seoksia, joissa on useimmiten epäpuhtauksina muun tyyppisiä yhdisteitä, kuten proteiineja, DNA:ta, 20 viruksia ja niiden kaltaisia. Lääketieteellisestä näkökulmasta tällaiset seokset ovat vähemmän houkuttelevia kuin puhtaat ja hyvin määritellyt synteettiset yhdisteet, esi-t merkiksi yleisesti esiintyvien verenvuotovaarojen vuoksi.

Nyt on todettu, että näiden suurien glykosami- • · ’··' 25 noglykaanien ominaisuuksia voidaan jäljitellä kahdella » » * pienellä sakkaridimolekyylillä (jotka käsittävät 2 - 6 ’·* monosakkaridiyksikköä) , jolloin ainakin toinen sakkaridi pystyy olemaan vuorovaikutuksessa proteaasi-inhibiittorien, kuten AT-III:n tai HC-II:n, kanssa ja ne ovat liittyneet • · 30 toisiinsa välikkeen avulla. Jotta aikaansaataisiin mahdollisimman pieni vaadittu etäisyys kahden sakkaridin välille, « · · vaaditaan vähintään 20 atomin välikkeen pituus. Yli 120 * « · atomin välikkeet eivät ole niin sopivia synteettisistä : syistä. On edelleen todettu, että välikkeen kemiallisella • * · 35 rakenteella on vähäinen tai olematon merkitys. Tämän ’·;·* keksinnön mukaisten biskonjugaattien antitromboottinen aktiivisuus ja aXa/alla-aktiivisuussuhde riippuu sakkari- * ♦ dien luonteesta, niiden liittymiskohdasta välikkeeseen ja • ·

11354C

3 välikkeiden pituudesta. Sakkaridit, jotka ovat liittyneet välikkeeseen molempien pelkistävien päidensä kautta, eivät esimerkiksi ole aktiivisia.

Ainakin toisella sakkaridilla itsessään, edul-5 lisesti molemmilla sakkarideilla itsessään on affiniteetti AT-III:a ja/tai HC-II:a kohtaan ja/tai tekijän Ha ja/tai tekijän Xa vastainen aktiivisuus.

Sopivia biskonjugaatteja ovat biskonjugaatit, joissa ainakin toisella sakkaridilla on kaava: 10 Πο il Π" tl y O^R ^^ a;kyyIi R R R' R »1 jossa kukin R on valittu toisista riippumatta ryhmästä, jonka muodostavat H, OH, OSC>3~ ja alkoksi; Ri on valittu 15 toisista riippumatta ryhmästä, jonka muodostavat OSCb- ja NHS03-; ja aaltoviivat tarkoittavat sidosta joko ylöspäin tai alaspäin ja negatiiviset varaukset on kompensoitu vedyllä tai alkalimetallikationilla.

Termi alkyyli on tässä kaavassa käytettynä alkyy- • · t... 20 liryhmä, jossa on 1 - 8 ja edullisesti 1-4 hiiliatomia.

Edullisin alkyyliryhmä on metyyliryhmä.

• t ’···' Termi alkoksi tarkoittaa alkoksiryhmää, jossa on 1 - 8 ja edullisesti 1 - 4 hiiliatomia. Edullisin on i* metoksiryhmä.

25 Natrium on edullinen alkalimetalli.

• · ·

Edullisimmissa biskonjugaateissa ainakin toisella . sakkaridilla on kaava: <oso^ coo- coo- 0sö3 NT* / X 3 yj nz 0SO3 Tl OS0{ • ^ λ • · I · I • » · jossa R2 on toisista riippumatta OSO3" tai OCH3.

• · » ·

11354C

4

Kuten edellä on painotettu, välikkeen kemiallisella rakenteella on toissijainen merkitys. Synteettisen helppouden vuoksi toiset välikkeet ovat kuitenkin sopivampia kuin toiset. Yksinkertaisia välikkeitä, jotka voidaan hel-5 posti lisätä, ovat esimerkiksi välikkeet, joilla on kaava: ={Q-NT-CO-[ (CH2)n-NT-CO-(CH2)m]p-S-}2 tai = {Q-0- [ (CH2)n-0]p-(CH2)m-S-}2 10 jolloin toinen kahdesta Q-ryhmästä on kiinnittynyt toisen sakkaridin ei-pelkistävään päähän ja toinen Q-ryhmä on kiinnittynyt toisen sakkaridin pelkistävään tai ei-pelkistävään päähän ja kumpikin Q-ryhmä on fenyleeni- (C6H4-) ryhmä tai - [ (CH20) q- (CH2) r-0] s- [ (CH2) t-NT-CO] u- (CH2) v ja T on 15 toisista riippumatta vety tai alkyyli, kuten edellä on määritelty; q on 0 tai 1; r ja t on valittu toisistaan riippumatta väliltä 2-4; ja s on toisista riippumatta 1 -12, edullisesti 1 - 6; u ja v on valittu toisistaan riippumatta väliltä 1-6; n on 1-8, m on 1-8, p on 1 -20 12 ja atomien kokonaismäärä on 20 - 120.

Eräällä sopivalla välikkeellä on kaava: = {Φ-ΝΗ-CO- (CH2) n-NH-CO- (CH2) m-S~^^N-CH2-^ ^-CO-NH-(CH2 ) Q- ) 20 o * · * > 1 ···; 25 jossa toinen kahdesta Φ-ryhmästä on kiinnittynyt toisen sakkaridin ei-pelkistävään päähän ja toinen Φ-ryhmä on I I · !,·' ·’ kiinnittynyt toisen sakkaridin pelkistävään tai ei-pelkis tävään päähän ja Φ tarkoittaa fenyleeni- (C6H4-) ryhmää; n, m ja o on valittu toisistaan riippumatta väliltä 1 - 8 ja ··’ 30 atomien kokonaismäärä on 20 - 120.

« · • ·

Muilla yhtä sopivilla välikkeillä on kaava: • · • · · • · • · · • · • · • · » • · • · · f » · • · · »

11354C

5 -((CH2)r-0]s-(CH2)m-NT-CO-(CH2)m-0-[(CH2)r-0]s-(CH2)m-S-^ x-[ (CH2)m-CO-NT-)y-^^-(CH2)w-CO-NT-^ ^CH2)m't°'(CH2)rJs- jossa toinen välikkeen kahdesta vapaasta valenssista on 5 kiinnittynyt toisen sakkaridin ei-pelkistävään päähän ja välikkeen toinen vapaa valenssi on kiinnittynyt toisen sakkaridin pelkistävään tai ei-pelkistävään päähän ja T on toisista riippumatta H tai alkyyli, kuten edellä on määritelty; m on toisista riippumatta 1 - 8; r on toisista 10 riippumatta 2-4; s on toisista riippumatta 1-12, edullisesti 1-6; w on 0 - 10, edullisesti 0-7; x on 0 tai 1; y on 0 tai 1; z on 0 tai 1 ja atomien kokonaismäärä on 20 - 120.

Nämä toteutusmuodot ovat edullisia niiden helpon 15 saavutettavuuden vuoksi, mutta välikkeet eivät suinkaan ra-joitu edellä mainittuihin.

Keksinnön mukaisia biskonjugaatteja kutsutaan sym-metrisiksi, kun molemmat sakkaridit ovat samoja. Biskonju- * » gaatteja kutsutaan asymmetrisiksi, kun molemmat sakkaridit 20 eroavat toisistaan. Edulliset asymmetriset biskon jugaatit ·;· sisältävät yhden sakkaridin, jossa ei ole uronihappoyksik- köä ja joka siten eroaa glykosaminoglykaaneista ja glykos- aminoglykanoideista, esimerkiksi sakkaridi, joka koostuu . glukoosiyksiköistä, esim. sellobioosi, maltotrioosi tai ··;; 25 maltopentaoosi tai niiden johdannaiset.

• · ’···* Keksinnön mukaisia biskonjugaatteja valmistetaan ·'· : keksinnön mukaisesti siten, että « M ' • « .···, (A) halutut kaksi sakkaridia ja välike liitetään » · T yhteen halutussa järjestyksessä toivotuksi biskongugaatik- ·.*·: 30 si, mahdollisesti sopivia väliaikaisia suojaryhmiä tai so- pivia liitäntäosia käyttäen, tai IM 1

6 11354C

(B) haluttu sakkaridi liitetään osaan, joka vastaa halutun välikkeen puolikasta ja jonka toinen pää on suojattu suojaryhmällä, joka on altis dimeroitumiselle ilman mainittua suojaryhmää, suojaryhmä poistetaan ja näin saatu 5 molekyyli dimeroidaan halutuksi biskonjugaatiksi, tai (C) halutun välikkeen osa liitetään halutun sakka-ridin osaan, minkä jälkeen mainittua välikkeen osaa kehitetään edelleen kemiallisella kondensaatiolla, ja suoritetaan dimerointi kuten kohdassa (B) halutuksi biskonjugaa- 10 tiksi, tai (D) haluttu välike tai välikkeen puolikas liitetään halutun sakkaridin osaan, mainittu sakkaridin osa liitetään sakkaridiosan loppuosaan toivotuksi biskonjugaatiksi tai biskonjugaatin puolikkaaksi, minkä jälkeen tar- 15 vittaessa poistetaan suojaryhmät tai suoritetaan dimeroin-I ti kuten kohdassa (B).

Keksinnön mukaiset biskonjugaatit voidaan valmistaa analogisten yhdisteiden valmistukselle tunnetuilla menetelmillä. Tavallisesti hiilihydraattiosat valmistetaan 20 käyttäen kirjallisuudessa tunnettuja menetelmiä (esimerkiksi käyttäen julkaisujen EP 84 999, EP 301 618, EP 454 220, EP 529 715 ja EP-hakemuksen 9 304 769 menetelmiä). Väliaikaisia suojaryhmiä käyttämällä haluttu hydroksiryhmä voidaan vapauttaa kytkennästä välikkeeseen. Edullisempaa on *...· 25 kuitenkin kiinnittää haluttuun hydroksiryhmään sopiva lii- : täntäosa, esimerkiksi nitrofenyyliryhmä, joka tavallisen ··· pelkistysvaiheen (bentsyylisuojaryhmien lohkeamisen) aikana • « · · muuttuu vastaavaksi aniliiniryhmäksi, jonka aminoryhmä voi-daan käyttää välikkeen loppuosan (jonka päässä on esimer- • ♦ ♦ * 30 kiksi halgoeeni tai karboksyyliryhmän aktiivinen esteri) kanssa liittämiseen tai joka voidaan mahdollisesti tila-päisesti suojata ja liittää välikkeen loppuosaan • · · i ϊ myöhemmässä vaiheessa. Aniliiniryhmästä tulee tällöin osa . välikettä.

i * t • » · 35 Toinen menetelmä, joka on erityisen käyttökel- • · *···’ poinen, kun hiilihydraattiryhmät ovat samoja, on hiilihyd- raattiosan liittäminen osaan, joka vastaa välikkeen puoli- • · ,·**. kasta ja jonka pää, joka ei sitoudu sakkaridiin, on suo- * · · ·

11354C

7 jattu suojaryhmällä, joka osa on altis dimeroitumiselle ilman mainittua suojaryhmää. Suojauksen poiston jälkeen molekyyli dimeroidaan sopivissa reaktio-olosuhteissa keksinnön mukaiseksi biskonjugaatiksi.

5 Muunnelma edellä mainitusta menetelmästä käsittää välikkeen osan liittämisen hiilihydraattiosaan, minkä jälkeen välikkeen osaa kehitetään edelleen kemiallisella kon-densaatiolla. Tämä menetelmä on erityisen käyttökelpoinen eri välikkeen pituudet omaavien biskonjugaattien valmistuk-10 sessa, kun käytetään lähtöaineina samoja hiilihydraatti-osia.

Vielä eräs menetelmä on välikkeen tai välikkeen puolikkaan liittäminen hiilihydraattiryhmän osaan, joka liitetään tavanomaisilla hiilihydraattikytkentämenetelmillä 15 hiilihydraattiryhmän loppuosan kanssa vaadittuun biskonju-gaattiin tai biskonjugaatin puolikkaaseen, minkä jälkeen välikkeelle voidaan tarvittaessa suorittaa suojauksen poisto ja dimerointi, kuten edellä on kuvattu.

Keksinnön mukaisia biskonjugaatteja voidaan käyt-20 tää tromboottisten häiriöiden tai sileän lihaksen solujen jakautumisen hoitamiseen tai ennalta ehkäisemiseen. Keksinnön mukaiset biskonjugaatit voidaan antaa enteraalisesti . parenteraalisesti ja ihmisille edullisesti vuorokausi- « · » * · annostuksena, joka on 0,001 - 10 mg kg: aa kohti kehon pai-25 nosta. Biskonjugaatit, kun ne ovat oraalisesti, poskeen tai * # · ϊ#ιιί kielen alle annettuina aktiivisia, voidaan puristaa sekoi- ··· tettuina farmaseuttisesti sopivien apuaineiden kanssa, • · · · esim. kuten on kuvattu standardiviitteessä Gennaro et ai., Remington's Pharmaceutical Sciences (18. painos, Mack i t t ’ 30 Publishing Company, 1990, katso erityisesti osa 8:

Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture), kiinteiksi annostusyksiköiksi, kuten pillereiksi ja table- • · · teiksi, tai ne voidaan prosessoida kapseleiksi tai peräpui- t·] · koiksi. Kun biskonjugaatit ovat parenteraalisesti aktiivi- • · 35 siä, niitä voidaan käyttää myös injektio- tai infuusioval- * » *···* misteena farmaseuttisesti sopivien nesteiden avulla liuok- sen, suspension, emulsion tai suihkeen, esim. nenäsuihkeen, » · muodossa.

• » • · ·

11354C

8

Annostusyksikköjen, esim. tablettien, valmistuksessa tavanomaisten lisäaineiden, kuten täyteaineiden, väriaineiden, polymeeristen sideaineiden ja niiden kaltaisten, käyttö on mahdollista. Yleisesti voidaan käyttää mitä ta-5 hansa farmaseuttisesti hyväksyttävää lisäainetta, joka ei häiritse aktiivisten yhdisteiden toimintaa.

Sopivia kantajia, joiden kanssa koostumukset voidaan antaa, ovat mm. laktoosi, tärkkelys, selluloosajohdan-naiset ja niiden kaltaiset tai niiden seokset sopivina mää- 10 rinä käytettyinä.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden säädeltävyys osoitetaan taulukoissa I, II ja III. Niistä ilmenee, että sak-karideilla, välikkeen pituudella ja niiden yhdistelmillä voidaan säädellä aXa/alla-aktiivisuussuhdetta.

15 Välikkeen pituus on välikkeen atomien määrä lasket tuna kahden sakkaridin välisestä lyhyimmästä ketjusta, ei välikkeeseen liittyneiden sakkaridien happiatomeista laskettuna.

Taulukko I

20 Biskonjugaatit, joissa on erilaisia sakkaridiosia ja sama välikkeen pituus biskonj. välikepit. cxXa-akt.a oUIa-akt*3 aXa/arlla ·;· (atomeja) ti:; VII 54 767 14 54,8 ·;· V 54 638 ' 36 17,7 • · · * _ VI 54 278 156 1,78 • · · VIII 54 49 __91 [ 0,54 x 52 isi 71 2,56 : XI 52 163 161 1,01 : .’ IX 52 79 108 0, 73 • » * :,'j IV 52 17 31 0,54

9 11354C

biskonj. = biskonjugaatti välikepit. = välikkeen pituus * anti-Xa-aktiivisuus (yksikköä/mg) määritettiin julkaisun A.N. Teien ja M. Lee, Thrombosis Research, 10, 399 -5 410 (1977) menetelmän mukaisesti.

b anti-IIa-aktiivisuus (yksikköä/mg) määritettiin julkaisun M. L. Larson et ai., Thrombosis Research, 13, 285 - 288 (1978) menetelmän mukaisesti.

Johtopäätös: Taulukossa I osoitetaan, että biskon-10 jugaattien aXa/alla-aktiivisuussuhdetta voidaan säädellä vaihtelemalla sakkarideja.

Taulukko 11

Biskonjugaatit, joissa on samat sakkaridiosat ja erilaiset välikkeen pituudet 15 ,_______-T--- biskonj. välikepit. «xXa-akt. oslla-akt. _ aXa/alla (atomeja) I 32 704 15 46,9 20 III 46 419 21 20,0 : II 571 628 120 5,23 : : 1 välikkeen pituus määritettynä syklopentyyliryhmien me- '· 25 tyleeniryhmän kautta (lyhyin ketju).

··· Johtopäätös: Taulukossa II valaistaan sitä, että biskonj ugaattien aXa/alla-aktiivisuussuhdetta voidaan säädellä vaihtelemalla välikkeen pituutta.

• » , * s »

10 11354C

Taulukko 111

Biskonjugaatit, joissa on sekalaisia sakkarideja ja/tai välikkeen pituuksia 5 biskonj. välikepit. <*Xa-akt. cx^LIa-akt. aXa/alla (atomeja) XIV 53 493 64 7,7 XIII 56* 281 327 0,86 10------— XII 56* 41 279 0,15 * välikkeen pituus määritettynä syklopentyyliryhmien mety-leeniryhmän kautta (lyhyin ketju).

15 Johtopäätös: Taulukossa III osoitetaan biskonju- gaattien aXa/alla-aktiivisuussuhteen säätely vaihtelemalla sakkarideja ja välikkeen pituuksia.

Tätä keksintöä valaistaan edelleen seuraavilla esimerkeillä.

20 Esimerkki 1

Monosakkaridi 5 '·Yhdiste 1 (3,5 g) (katso Carb. Res. 1989, 186(2).

• 189 - 205) liuotettiin dimetyyliformamidiin (30 ml) ja : lisättiin natriumhydridiä (560 mg) typpiatmosfäärissä.

25 Seos jäähdytettiin 0 °C:seen ja lisättiin l-fluori-4-nit-,robentseeniä (1,63 ml) 2 minuutin aikana. Sekoitettiin 30 • i I t minuuttia, minkä jälkeen seos väkevöitiin, laimennettiin • * · dikloorimetaanilla ja vedellä ja uutettiin. Tavanomaisen käsittelyn jälkeen jäännös puhdistettiin pylväskromatogra- * * · *;;; 30 fialla, jolloin saatiin 4 g yhdistettä 2. Yhdiste 2 muu- • · tettiin yhdisteeksi 3 asetolyysillä, minkä jälkeen saip-puoitiin, jolloin saatiin yhdiste 4, joka saatettiin rea- • · goimaan triklooriasetonitriilin kanssa, jolloin saatiin . , yhdiste 5. Yhdisteiden 3, 4 ja 5 synteesiin käytettiin » · · 35 menetelmiä, jotka on kuvattu yhdisteiden 9 (katso jäljem- * »

J

11

11354C

pänä), 41 ja vastaavasti 42 (katso esimerkki 4) valmistukselle.

--O

--0 5 _O l-fluori-4-nitrobentseeni ) °\ fc_/ -" _ fc-/

hoN L r^Y

1 o2n^ a 10 asetolyysx f

r\A ^,0AC

OAc 15 saippuointi J_q \w OH (\OBn OAc K-/ Jm / I /y OBn 20 l\j 1|

CCljCN

25 ▼ *.·’ * o\< ί ” ((TV..^ ,··. OBn

' 35 °?N

i2 11354C

Tetrasakkaridi 14

Yhdiste 7 valmistettiin yhdisteestä 6 (katso Bio-organic and Medicinal Letters 1992, 2(9), 905) yhdisteelle 39 (katso esimerkki 4) kuvatun menetelmän mukaisesti.

5 Yhdiste 7 (14,6 g) liuotettiin asetoniin (260 ml) ja jäähdytettiin 0 °C:seen. Tässä lämpötilassa lisättiin tipoittain liuos, jonka muodosti kromi(VIJoksidi (10,8 g) veden (53 ml) ja väkevän rikkihapon (10,5 ml) seoksessa. Seosta sekoitettiin 16 tuntia 2 °C:ssa. Kromi(VI)oksidiy-10 liraäärä tuhottiin metanolilla ja seos neutraloitiin nat-riumvetykarbonaatilla, minkä jälkeen lisättiin vettä. Uutettiin dikloorimetaanilla, minkä jälkeen orgaaninen kerros kuivattiin ja väkevöitiin. Jäljelle jäänyt öljy liuotettiin kuivaan dimetyyliformamidiin (174 ml). Lisät-15 tiin kaliumvetykarbonaattia (7 g) ja jodimetaania (7 ml) ja seosta sekoitettiin 3 tuntia huoneenlämpötilassa. Jäännös väkevöitiin, minkä jälkeen se puhdistettin silikagee-likromatografialla, jolloin saatiin 9,1 g yhdistettä 8.

Yhdiste 8 (2,8 g) liuotettiin etikkahappoanhydridin 20 (50 ml), etikkahapon (0,3 ml) ja trifluorietikkahapon (3,0 ml) seokseen. Sekoitettiin 3 tuntia, minkä jälkeen ’· seos väkevöitiin ja haihdutettiin yhdessä tolueenin kans- sa, jolloin saatiin 3,1 g yhdistettä 9.

Yhdiste 10 valmistettiin saippuoimalla yhdiste 9, 25 joka seuraavaksi muutettiin imidaatiksi 11. Käytettiin ^ menetelmiä, jotka on kuvattu yhdisteiden 41 ja 42 valmis tukselle (katso esimerkki 4).

V * OTBDMS

OTBDMS S' -O

I-o J-0 levuliinihappo ) O ) o 3 30 * °Ch3 OBn 00,3 °Bn r! k . ϊ · ‘ ’· 35 hapetus/metylointi ^

11354C

13

COOCHj I OAc COOCH3 I-O

/ °\Λ / °\ asetolyysi ) °\Λ / °v (\OCH3 / °JvOBn V0*' *- kpCHj /°JspBn /

LcvO \·.ιι. / N...../ LevO f > f OCHi OBn OCH3 OBn 5 9 8 saippuointi ▼ 10 COOCH3 pOAc COOCH3 pOAc OCH, OBn OCH3 OBn 15 w> ii

Yhdisteelle 11 suoritettiin kytkentäreaktio yhdisteen 12 kanssa (katso Jaurand G., et ali., Bioorganic and Medicinal Chem. Lett., 2(9), 897 - 900 (1992), yhdiste 20 12), jolloin muodostui yhdiste 13, josta poistettiin Lev- ryhmä, minkä tuloksena saatiin tetrasakkaridi 14. Nouda-*;··: tettiin menetelmiä, jotka on kuvattu yhdisteiden 43 ja 44 valmistukselle (katso esimerkki 4).

Liuokseen, jonka muodostivat 79 mg tetrasakkaridia 25 14 ja 70 mg monosakkaridia 5 2,5 ml:ssa dikloorimetaania, lisättiin 4 A:n mooliseulaa (70 mg). Seos jäähdytettiin -20 eC:seen ja lisättiin 6,8 pmol trimetyylisilyylitri-‘ fluorimetaanisulfonaattia. Seosta sekoitettiin 30 minuut tia ja lisättiin natriumvetykarbonaattia. Seos suodatet-··- 30 tiin, liuotin haihdutettiin ja jäännös puhdistettiin si- ·...· likakromatogr af iällä, jolloin saatiin 88 mg pentasakkari- dia 15, joka liuotettiin 7,3 ml:aan tetrahydrofuraania ja .*·*. jäähdytettiin -5 °C:seen. Tässä lämpötilassa lisättiin . 2,6 ml 30-%:ista vesipitoista vetyperoksidia, ja 10 minuu- • · · · 35 tin kuluttua lisättiin 1,2 ml 1,25 M litiumhydroksidi- * »

11354C

14 liuosta. Seosta sekoitettiin yön yli 0 °C:ssa, lisättiin 4,8 ml metanolia ja 1,3 ml 4 M natriumhydroksidiliuosta, ja kun oli sekoitettu 1 tunti, lämpötila nostettiin 20 °C:seen ja seosta sekoitettiin vielä 20 tuntia. Reak-5 tioseos tehtiin happamaksi pH-arvoon 3 käyttäen 6 N vety-kloridihappoa 0 °C:ssa, ja saippuoitu tuote uutettiin etyyliasetaatilla. Vetyperoksidiylimäärä hajotettiin uuttamalla 5-%:isella natriumsulfiittiliuoksella ja orgaaninen seos kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin, 10 jolloin saatiin raakatuotteena 89 mg pentasakkaridia 16.

Pentasakkaridi 16 liuotettiin 10,2 ml:aan dimetyy-liformamidia ja lisättiin 55 mg 10-%:ista Pd:a puuhiilellä. Suoritettiin hydrogenolyysi yön aikana, minkä jälkeen saatiin raakatuotteena 64 mg pentasakkaridia 17.

15 COOCH3 r—OAc --OAc OCH3 OBn OAc OAc 20 - I__1 - TMSOTf ·. 25 • t · * coocH, j-0Al·' <OAc |\°CH·' / °v/\0Bn yjoJ\pCH3 /'°J\0^ ACHi Uv° OCH3 OBn OAc OAc ::: 3o > · » » * · • («

Lev-ryhmän poisto • > · • · ... v % · • * : COOCH3 --0AC -OAc ' 3 5 )-o >-o a-o )-o ‘1 hClL/ °J\0Bn yXoi^OCHj / °v/\^__/0CH3 H0 OCHj OBn OAc OAc

11354C

15 j OAe COOCHj fOKc r'0^ /-O NH )-°v Λ /-°\ A-°\ /-°v (T JJ OBn OCHj OBn OA< OAc

5 TMS-triflaatti IH

1 ^ 1 I—"®Ac COOCH, |^OAc rOA‘ J-o J—o J-ό λ—o )—0 15 /oBn \ /\OCHj Vo/θΒη \ /V^nf”3/ °Χ°Ac Λ ysi γο\ / v/\i°n /vNgc»? / υν!γ«Η,

10 jfjf °Bn ^ OB" 0Ac L

I Saippuointi

pOH COOH rOH r0H

J-°v ) 0 / ° A °v Λ / \ £ f\OBn \ /0CH3 Vo/oBn \ /w^Hj" / °vA°H Λ

15 O \__Y ^ N / O \_i / N-/OCHJ

JTJ OBn OCHj OBn OH iH

NOV^

I Hydrogenolyysi pOH COOH |-0H

*: ·: £r 0H oh oh ]>H

.*··. NHV^ • · . · · ·. Z-kloridi 25 *

• nu -OH OH

;· r-°H COOH f— Γ - Xla*.

fT OH OCHj iH OH j,H

·;;;* 30 * · • φ tat • ;’· j Pentasakkaridl 17 (49 mg) liuotettiin 2 ml:aan etanolin ja veden seosta (1:1), ja tähän seokseen lisät-/ . tiin 16 mg natriumvetykarbonaattia ja 10,4 μΐ bentsyyli- 35 oksikarbonyylikloridia (Z-Cl). Sekoitettiin 4 tuntia huo- » a

11354C

16 neenlämpötilassa, minkä jälkeen liuotin haihdutettiin ja jäännökseen lisättiin metanolia. Suolat suodatettiin ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin raakatuotteena 67 mg pentasakkaridia 18, joka liuotettiin 2,5 ml:aan kuivaa 5 dimetyyliformamidia. Lisättiin 442 mg trietyyliamiinirik- kitrioksidia käyttäen typpeä suojakaasuna ja seosta sekoitettiin yön yli 50 °C:ssa, minkä jälkeen lisättiin nat-riumvetykarbonaatin vesiliuosta jäähdyttäen jäällä. Seosta sekoitettiin 1 tunti huoneenlämpötilassa, väkevöitiin pie-10 neen tilavuuteen ja poistettiin suolat Sephadex G-25 -kolonnissa. Eristetty tuote eluoitiin vedellä Dowex 50WX8 Na+ -kolonnissa, jolloin saatiin 104 mg pentasakkaridia 19. 100 mg pentasakkaridia 19 liuotettiin 8 ml:aan vettä, lisättiin 10-%:ista Pd:a puuhiilellä ja seokselle suoritet-15 tiin hydrogenolyysi yön aikana, jolloin saatiin 83 mg pentasakkaridia 20, [a]10 = +58,1° (c = 1; vesi).

9,6 mg pentasakkaridia 20 ja 4,8 mg sulfo-LCSPDP:tä liuotettiin seokseen, jonka muodostivat 0,1 ml etanolia ja 0,35 ml dinatriumvetyfosfaatin 0,05 M vesiliuosta, jonka 20 pH oli 7,8. Seosta sekoitettiin 3 tuntia ja poistettiin suolat Sephadex G-25 -kolonnissa, jolloin saatiin 9,0 mg "· monokonjugaattia 21.

Monokonjugaatti 21 (8,9 mg) liuotettiin 1,5 ml:aan j·": natriumdivetyfosfaatin 0,05 M vesiliuosta, jonka pH oli • « » 25 8,0. Lisättiin 157 μΐ tributyylifosfiinin 0,05 M liuosta • · t t isopropanolissa huoneenlämpötilassa, seosta sekoitettiin 1 tunti ja reaktioseoksen läpi johdettiin ilmaa. Kun seoksesta oli poistettu suolat Sephadex G-25 -kolonnissa, raakatuotebiskonjugaatti puhdistettiin HPLC:llä käyttäen 30 mono-Q-anioninvaihtokolonnia, jolloin saatiin 4,0 mg bis- *··'1 konjugaattia I, [α]£° = +45,7° (c = 0,35; vesi).

* 1 * 1 · ·

11354C

17 r t

jS

Sulfatointi 5 pOSOj. coo. p-oso,. r°“v OSOy °°Ηί OSOj· OSO3- isoj-

ZKH

Z-ryhm&n poisto 15 _ ▼_____ I ^ F55 Ö Fp - °x4^ °/°Χγ>· )/gx° Γ OSOy OCHj OSO3- OS°3· OSOj.

20 H -NH____________—- i i f *

o ^ 0 0 V

25 ^n-A.S-s-(Ch2>2'^'n-<ch2)5'^'o-n ν^Νθ3·Ν«+ ,. Γ 0

Sulfo-LC-SPDP

0 ::i 30 * ·

11354C

18 ° 0 _ -S-(CH2)2 N- (CH2)j'^^'

2A

1) tributyylifosfiini

5 2) ilman O

f 0 O O 0 Λ (CH2)5 .A (CH2)2 _S — S-(CH2)2

- H H

Biskonjugaatti I

Esimerkki 2

Monokonjugaatti 21 (14,7 mg) liuotettiin seokseen, jonka muodostivat 1 ml metanolia ja 2 ml natriumdivetyfos-15 faatin 0,1 M vesiliuosta, pH 8. Lisättiin 247 μΐ tributyy-lifosfiinin 0,05 M liuosta isopropanolissa käyttäen typpeä suojakaasuna huoneenlämpötilassa. Seosta sekoitettiin 1 tunti ja lisättiin liuos, jonka muodosti 1,68 g yhdistettä 23 0,5 ml:ssa dimetyyliformamidissa, ja seosta sekoitet-20 tiin vielä 3 tuntia. Kun seoksesta oli poistettu suolat Sephadex G-25 -kolonnissa, raakatuotetta puhdistettiin ’ edelleen eluoimalla natriumkloridin 0,05 M vesiliuoksel- : la, joka sisälsi 10 % asetonitriiliä, Sephadex G-50 -ko- : lonnissa. Yhdistetyistä fraktioista poistettiin suolat :· 25 Sephadex G-25:llä, jolloin saatiin 5,5 mg biskonjugaattia II, [a]p° = +7,0° (c = 0,34; vesi).

* * · • * t t • » * * * · · » I I • · * · » * · » ! ·

11354C

19

O- „ X X-\—I

-S (CH2)2 '^•N-(CH2)5^ [__

H

21 c tributyyii£osfiini .

5 - o o A A-1 H - S (CH2)2 N — (CH2)5

H

11 10 “ . pcoV^cCq ° 15 ,0 ··: v- o=\ ·, , ,· N _/ 25 ^ / t I I • · · * * ·

biskonjugaatti II

< · · 30 Esimerkki 3 * } > \,. · Metyyli-2,3,6-tri-O-bentsyyli-a-D-glukopyranosidi I (2,1 g) 24 liuotettiin 75 ml:aan dimetyyliformamidia ja .·· , lisättiin 5,5 ml tetraetyleeniglykolidi-p-tosylaattia huo- , neenlämpötilassa. Lisättiin natriumhydridiä (162 mg) ja * » t 35 seosta kuumennettiin 2 tuntia 50 eC:ssa. Lisättiin litium- 20

11354C

atsidia (4,5 g) ja reaktioseosta sekoitettiin 70 °C:ssa vielä 5 tuntia. Sen jälkeen seos väkevöitiin ja puhdistettiin pylväskromatografiällä, jolloin saatiin 1,52 g yhdistettä 25.

5 Liuokseen, jonka muodosti yhdiste 25 (768 mg) 40 ml:ssa etikkahappoanhydridiä -20 °C:ssa, lisättiin 10 ml 5-%:ista (tilavuus/tilavuus) rikkihapon liuosta etikkahappoanhydridissä (jäähdytetty -20 °C:seen). Seosta sekoitettiin 10 minuuttia tässä lämpötilassa ja sen jäl-10 keen lisättiin natriumasetaattia (3,5 g) reaktio pysäyttämiseksi. 10 minuutin kuluttua seosta uutettiin etyyliasetaatilla, yhdistetyt uutteet pestiin 10-%:isella natrium-vetykarbonaatin vesiliuoksella, kuivattiin ja väkevöitiin. Raakatuote kromatografoitiin kolonnissa, jolloin saatiin 15 573 mg yhdistettä 26.

Yhdiste 26 (269 mg) liuotettiin seokseen, jonka muodostivat 5,5 ml dimetyyliformamidia, 31 μΐ etikkahap-poa ja 28 μΐ hydratsiinimonohydraattia. Seosta sekoitettiin 3 tuntia huoneenlämpötilassa, laimennettiin dikloori-20 metaanilla ja vedellä ja uutettiin. Tuotteelle suoritettiin tavanomainen käsittely ja pylväskromatografointi, 'li jolloin saatiin 158 mg yhdistettä 27.

Yhdiste 27 (158 mg) liuotettiin 2 ml:aan dikloori-metaania. Lisättiin triklooriasetonitriiliä (0,13 ml) ja 25 cesiumkarbonaattia (17,8 mg) typpiatmosfäärissä. Seosta sekoitettiin 1 tunti huoneenlämpötilassa, suodatettiin ja haihdutettiin. Tuote kromatografoitiin kolonnissa, jolloin * » * saatiin 182 mg yhdistettä 28.

» ·

11354C

21 OBn __OBn I I) tetraetyleeniglykolidi-p-tosylaatti f

(\ OBn Λ l\ OBn A

HO \ / OCHj Nj (CH2>2-0 (CH2)2-0 (CH2)2-0-(CH2)2-0 \ / OCHj 5 OBn OBn 2M 25 asetolyysi 10 r°Ae \w V*0*·

Nv(CH,hO.(CHThO^CH->bO(CHThJj\| / OBn 2b 15 saippuointi

'' ^OAC

J-0 / \λλ.ΟΗ *\ OBn / 20 Nj(CH2)2-0(CH2)20-(CH2)20-(CH2)2-0\j / OBn ^ . , triklooriasetonitriili • · ·

• I

.:, 25 r^0Ac

)-O NH

/ Vo-/' ,.. \OBn / \ : : ; N3(CH2)20(CH2>20-(CH2)20(CH2)20\___/ CCI3 OBn 2Ö ;:! 30 *·;*’ Yhdiste 31 valmistettiin suorittamalla yhdisteelle 11 kytkentäreaktio yhdisteen 29 kanssa (katso H. Lucas et ai., Angew. Chem. 1993, 105, 462 - 464), jolloin muodostui I I « .* , yhdiste 30, josta poistettiin Lev-ryhmä. Noudatettiin me-

11354C

22 netelmiä, jotka on kuvattu yhdisteiden 43 ja 44 valmistukselle (katso esimerkki 4).

rOBn

5 y-O J-O

/cooch\/» / \ yhälSteil + Koch, 7°Λοβπ > v\_Yochj OBn OBn TMSOTf 10 f 15 COOCH, |-OBn OCH3 OBn OBn OBn 20 22 , Lev-ryhmän poisto i · i * • 9 ▼ I » cooch, --oac· r-0Bn .. :· Xh.

** * OCH3 OBn OBn OBn li 30 ·,,,· Yhdisteet 32, 33 ja 34 valmistettiin samalla ta- : valla kuin yhdisteille 15, 16 ja vastaavasti 17 on kuvat- , · . tu (katso esimerkki 1).

Yhdiste 34 (35 mg) liuotettiin 0,35 ml:aan varas-’ : 35 toliuosta, jonka muodosti 280 μΐ trietyyliamiinia

11354C

23 20 ml:ssa dimetyyliformamidia. Lisättiin N-(bentsyyliok-sikarbonyylioksi)sukkinimidiä (10,6 mg) pH-arvolla 7,5 ja sekoitettiin 30 minuuttia, minkä jälkeen liuotin osittain poistettiin haihduttamalla. Jäännös puhdistettiin ensin 5 Sephadex LH-20 -kolonnissa, minkä jälkeen puhdistettiin edelleen Rp-18-kolonnissa (asetonitriili:vesi:ammoniakki = 95:5:2, tilavuus/tilavuus), jolloin saatiin 29,4 mg yhdistettä 35.

Yhdiste 36 valmistettiin samalla tavalla kuin yh-10 disteelle 19 on kuvattu (katso esimerkki 1), [a]j;0 = 22,8° (c = 0,3; vesi).

Yhdiste 36 (51,4 mg) liuotettiin 4 ml:aan vettä ja lisättiin katalyyttiä (10-%:ista Pd/C:tä). Seosta sekoitettiin vetykaasuatmosfäärissä 5 tuntia huoneenlämpötilas-15 sa. Suodattamisen jälkeen haihdutettiin liuotin, jolloin saatiin 47 mg yhdistettä 37.

Yhdiste 37 (15,1 mg) liuotettiin 450 pl:aan liuosta, jonka muodosti N,N-di-isopropyylietyyliamiini dimetyy-liformamidin ja veden seoksessa (7:3) (pH 9,0), ja lisät-20 tiin ylimäärä sulfosukkinimidyyli-6-[3'-(2-pyridyylidi-tio)propioamido]heksanoaattia vakio-pH-arvossa 9,0. Sekoi-: tettiin 20 minuuttia, minkä jälkeen seoksesta poistettiin : : suolat Sephadex G-25 -kolonnissa käyttäen veden ja aseto- nitriilin seosta (8:2, tilavuus/tilavuus), jolloin saatiin 25 raakatuotteena 16 mg yhdistettä 38.

,:, Biskonjugaatti III valmistettiin yhdisteestä 38 samalla tavalla kuin esimerkissä 1 on kuvattu yhdisteen 21 muuttamiselle biskonjugaatiksi I, [a]p° = +29,6° (c = 0,125; vesi).

• » » » ·

I

24

11354C

I coochj rOAc r~OBn - 1 Xu.

OCHj OBn OBn OBn 3[ j 5 TimOTf * rOA‘ coocHj r-OAc f°Bn )—° }—° )—° A—°\0 / °\ f(°8» Y°^Bn °Α^Βη A,u

Nj-(CHI>2-0-<CHi)iO-(CH2>i-0 (CH2>2-0N-{ ° ^-( N-/ ° N-—f f 3 10 OBn OCHj OBn OBn iBn 32 saippuointi

T

,e rOH «»η rOH rOB" 15 > J-O I—O J-0 Λ-O /~\ /oBn \ /oCHj Voj^OBn \ A^Ch” / °vA^Bn N3-(CH2h-0 (CH2>2 O <CH2h O (CHOvcN-—-j' °N-f ^{ ° ^--^ ^ /(>CH3 I OBn OCHj OBn OBn of)r hydrogenolyys i 20 'r

’ ' 1 nu OH OH

Γ OH COOH Γ [ :¾ KH2-iCH2(2-0-(CH232-0-iCH2i2-0 >CH2i2-0 ^-{ U N-( N-f U V-( I 3

"J 25 OH OCHj OH OH ,')M

3H

• r

11354C

25 * - o' 5

OH __OH r-0H

(—OH COOH r-~ Γ

J-O J-O J-O A-O )-O

/ \ / \Λ/ \ /cooH yo/oh > N?" //^OCHj /O/^OH / \0CH, /

Z-NH.(CH2)2 O^CHz^-O (CH2>2 O (CH2)2-0 ^-f u N-( N-f -( I

OH OCH3 OH «H 0H

10 3S- sulfatointi "______ 0SO3. coo. roso3- roso 3· J-O L_o J-o >1-o y-°v / \ / \β / \ /COO- yo /ncrv. > K?** Avr"3 / A0S03 AV> / A!A4Hi c Z-NH'(CH2>2-0-(CH2>2-0-(CH2)2-0-(CH2>2 o >-f u N-f N-f u -f 13 OSOj. OCH3 OSOJ. OSöj* oSOj- 3fc

H2 Pd/C

” H2N-(CH2>2 O (CHj)2 0-(CH2>2 0-(CH2)2 20 n

'> "· Sulfo-LC-SPDP

: fA o o _ , " . S (CH2)A^N.(CH2)5xWs'N.(CH2)2 0-(CH2>2.0.(CH2)2.0-(CH2>2-_

·...* h H

25 38

26 113 5 4C

38 ir 5 · “ o o

li U

H-S-KCHjh '^^N-<CH2)5^>"N-(CH2)20.(CH2>2-0-(CHj)2Jo.(ch2)2J- H H - 10 ilman o 2

V

O

15 -r ' N-

N ,N

k "S r1 : \ / N) o S: S r1 • ti· !____ *·* * Biskonjugaatti lii 30 Esimerkki 4 ·...’ Biskonjugaatti IV ([a]j;0 = +50,8° (c = 0,32; vesi) j valmistettiin esimerkin 3 menetelmän mukaisesti, paitsi .··. että käytettiin tetrasakkaridia 44 yhdisteen 31 sijasta ja ·’ käytettiin sukkinimido-N-(bentsyylioksikarbonyylioksi )gly-

11354C

27 siiniä N-(bentsyylioks±karbonyylioksi)sukkinimidin sijasta.

I-OSO3- r—OSO3- |-OSO3- / \ /coo- \A/ \ /zoo- \/o fnr.n \ ^S°3 A^A^ocHj )oj^osoj' A/\)ch3 / \JS°s°y Λ " OS°5 OS°J- Lr OSOJ' OSOj.

(CH2)2

10 I

0 1 000

(CH2)2 O (CH2)2 0-(CH2)2-N-C.CH2N C-(CH2)5-N-6-(CH2)2 S-II H H

_ Biskonjugaatti IV —λ 15 ^

Tetrasakkaridin 44 valmistus

Disakkaridi 29 (0,8 g) liuotettiin dioksaaniin (5,3 ml), minkä jälkeen lisättiin levuliinihappoa (278 mg), 1,3-disykloheksyylikarbodi-imidiä (494 mg) ja 20 4-dimetyyliaminopyridiiniä (25 mg). Sekoitettiin 2 tuntia, minkä jälkeen lisättiin dietyylieetteriä ja seos jäähdy-·: : tettiin 0 °C:seen. Kiteet suodatettiin ja suodos väkevöi- ; tiin. Jäljelle jäänyt öljy puhdistettiin pylväskromatogra- fiällä, jolloin saatiin 900 mg yhdistettä 39.

25 Yhdisteen 39 (1 g) liuos etikkahappoanhydridissä (50 ml) jäähdytettiin -20 °C:seen. Tässä lämpötilassa li-]!!! sättiin typpiatmosfäärissä 10 ml liuosta A, joka oli val- * mistettu lisäämällä 1 ml rikkihappoa, 98 %, 20 ml:aan etikkahappoanhydridiä -20 °C:ssa. Sekoitettiin 2,5 tuntia, •;;j 30 minkä jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä natriuraase- *·«·" taattia. Kylmään reaktioseokseen lisättiin etyyliasetaat- tia ja kylläistä natriumvetykarbonaattiliuosta ja uuttami-sen jälkeen orgaaninen kerros pestiin vedellä, kuivattiin t I t ,· ja väkevöitiin. Raakatuote puhdistettiin pylväskromatogra- * · · ; 35 fialla, jolloin saatiin 800 mg yhdistettä 40.

* * » ·

11354C

28

Yhdiste 40 (800 mg) liuotettiin kuivaan tetrahydro-furaaniin (10 ml) ja lisättiin piperidiiniä (1,3 ml) typ-piatmosfäärissä. Seosta sekoitettiin 20 tuntia 20 °C:ssa ja seuraavaksi laimennettiin etyyliasetaatilla. Orgaaninen 5 kerros pestiin 0,3 N vetykloridihapolla ja vedellä ja kuivattiin. Orgaaninen kerros väkevöitiin, minkä jälkeen jäännös puhdistettiin pylväskromatografiällä, jolloin saatiin 430 mg yhdistettä 41.

Yhdisteen 41 (490 mg) liuokseen dikloorimetaanissa 10 (5,4 ml) lisättiin cesiumkarbonaattia (43 mg) ja trikloo- riasetonitriiliä (0,52 ml). Seoksen annettiin olla 1 tunti 20 °C:ssa. Suodatettiin, minkä jälkeen suodos väkevöitiin ja jäännös puhdistettiin pylväskromatografialla, jolloin saatiin 417 mg yhdistettä 42.

15 Yhdiste 42 (317 mg) ja yhdiste 29 (243 mg) haihdu tettiin yhdessä kaksi kertaa tolueenin kanssa. Lisättiin dikloorimetaania (7,1 ml) ja jauhemaista 4 A:n mooliseulaa (235 mg) ja seos jäähdytettiin -20 °C:seen. Tässä lämpötilassa lisättiin tipoittain trimetyylisilyylitrifluorime-20 taanisulfonaatin (8,75 μΐ) liuos dikloorimetaanissa (2,8 ml). Sekoitettiin 1 tunti, minkä jälkeen reaktio py-i säytettiin lisäämällä kiinteää natriumvetykarbonaattia.

Seosta sekoitettiin vielä 15 minuuttia, suodatettiin ja väkevöitiin. Puhdistettiin pylväskromatografialla, minkä 25 jälkeen saatiin 372 mg yhdistettä 43.

Yhdiste 43 (370 mg) liuotettiin pyridiiniin '!!! (1,2 ml). Lisättiin 20 °C:ssa seos, jonka muodostivat py- * ridiini (1,2 ml), etikkahappo (1,56 ml) ja hydratsiinihyd- raatti (0,18 ml), ja seosta sekoitettiin 7 minuuttia. Lai- • i » • ••ί 30 mennettiin vedellä ja uutettiin etyyliasetaatilla, minkä ·...· jälkeen orgaaninen kerros pestiin natriumvetykarbonaatti- | liuoksella ja vedellä, kuivattiin ja puhdistettiin pylväs- .··1. kromatografiällä, jolloin saatiin 324 mg yhdistettä 44.

* « · • · • · i a i » t · ·

11354C

29 ^OBn ^OBn /coochV / \ levuliinihappo! /to^h\A 7 °\

Koch, / ‘v/vOBn Λ -► Koch, / °Λ°Βη A

Ho\~i/ υ \__γοοΗ, \—_/och, OBn OBn OBn OBn 5 *9 ^ asetolyysi ^OAc ^OAc _ Γ saippuointi „ Γ

/1-° λ )-o x-O J-O

/coochX/» / \ /coochX/'' / \ 10 uoK™L/°'Kl_/ °H "- Μ:η//°Λ°α. >~0<t OBn OBn OBn OBn it} ko triklooriasetonitriili

V

15 rOAc /—° /—°

/γποτηΧ ^ / \ NH

Koch, /°Aoac + disakkaridi 23

LevO K,....,,\-^ ΓΠ3 OBn OBn •λί.

20 I__I

▼ TMSOTf ^0 V ^OBn *''* /coochXA / \ /cooc»\p / \

' * / y/^)Ac AoJ\0CH, 7 \J\0Bn /qCH

OBn OBn OBn OBn

1’ 4_S

; Lev-ryhmän poisto *.’ * f OAc OBn 30 λ-o J-0 a-o J-o /coochNA/ \ /COOCHKP / \

(S^H, / VSffAc ^ΛοΛ^Η·, / v\°Bn SOCH

; ‘ *,; OBn OBn OBn OBn 30 113540

Esimerkki 5

Aktiivisen esterin 52 valmistus

Tetraetyleeniglykoli 45 (10 g) liuotettiin kuivaan tetrahydrofuraaniin (150 ml) ja lisättiin natriumhydridiä 5 (60-%:inen dispersio mineraaliöljyssä, 1,64 g) pieninä annoksina 0 °C:ssa. Sekoitettiin 1 tunti, minkä jälkeen lisättiin tert-butyylidimetyylisilyylikloridin (6,18 g) liuos tetrahydrofuraanissa (20 ml) ja seosta sekoitettiin 15 minuuttia. Kun oli sekoitettu 10 minuuttia, seos lai-10 mennettiin vedellä ja uutettiin etyyliasetaatilla. Orgaaninen uute kuivattiin ja väkevöitiin. Raakatuotteelle suoritettiin pylväskromatografointi, jolloin saatiin 6 g yhdistettä 46.

Yhdiste 46 (5,0 g) liuotettiin tetrahydrofuraaniin 15 (80 ml) ja lisättiin tert-butyylibromiasetaattia (26,2 ml). Seosta sekoitettiin 50 °C:ssa ja lisättiin natriumhydridiä (1,16 g) pieninä annoksina typpiatmosfääris-sä. Kun oli sekoitettu yksi tunti, seos käsiteltiin samalla tavalla kuin yhdisteelle 46 on kuvattu. Jäännökselle 20 suoritettiin pylväkromatografointi, jolloin saatiin yhdiste 47 (5 g).

: Liuosta, jonka muodosti yhdiste 47 (3,1 g) etikka- : hapon (25 ml), veden (8,3 ml) ja tetrahydrof uraanin (8,3 ml) seoksessa, sekoitettiin 24 tuntia 20 °C:ssa. Seos ·> 25 neutraloitiin natriumhydroksidiliuoksella, laimennettiin • · t · vedellä ja uutettiin etyyliasetaatilla. Yhdistetyt uutteet kuivattiin ja väkevöitiin. Raakatuote suodatettiin silika-geelikolonnissa, jolloin saatiin 1,52 g yhdistettä 48.

, Yhdiste 48 (1,4 g) liuotettiin dikloorimetaaniin *;;; 30 (12,7 ml). Lisättiin pyridiiniä (7,7 ml) ja p-tolueenisul- * » *·;·“ fonyylikloridia (1,3 g) ja seosta sekoitettiin 20 tuntia :’,* 20 °C:ssa. Laimennettiin vedellä, minkä jälkeen seosta uutettiin dikloorimetaanilla.

* i i 31

11354C

H0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0H

ks

— TBDMS-CI

5 TBDMS- 0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0H

t-butyylibromiasetaatti y 10 o TBDMS-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2 in 0tBu TBDMS-ryhmän poisto 15 1' 10 o ho-ch2-ch2-o-ch2-ch2-o-ch2-ch2-o-ch2-ch2-o-ch2

OtBu tosylointi 20 ,r o . ; Tos-0-CH2-CH2-0-CH2-CH:-0-CH;-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2 .* , OtBu 25 • * kalxumtioasetaatti ·;· f

O

AcS-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2

So OtBu .;.T 30 *,,, · happokäsittely » » ’· : v

t t I

o ; AcS-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH:-CH:-0-CH:-CH2-0-CH2 35 oh * »

32 113 5 4C

Raakatuotteelle suoritettiin tavanomainen käsittely ja pylväskromatografointi, jolloin saatiin 1,5 g yhdistettä 49.

Yhdisteen 49 (570 mg) liuokseen asetonissa (20 ml) 5 lisättiin kaliumtioasetaattia (350 mg). Liuoksen annettiin olla 20 °C:ssa 1 tunti. Seos laimennettiin vedellä ja uutettiin etyyliasetaatilla. Orgaaninen kerros haihdutettiin ja suodatettiin silikageelikolonnissa, minkä jälkeen saatiin erotettua 440 mg yhdistettä 50.

10 Yhdiste 50 (120 mg) liuotettiin dikloorimetaaniin (1,5 ml) ja lisättiin trifluorietikkahappoa (0,20 ml) huoneenlämpötilassa. Sekoitettiin 4 tuntia, minkä jälkeen seos laimennettiin tolueenilla ja haihdutettiin. Jäännös haihdutettiin yhdessä kolme kertaa tolueenin kanssa. Raa-15 katuotteelle suoritettiin pylväskromatografointi, jolloin saatiin 91 mg yhdistettä 51.

Yhdiste 51 (29,1 mg) liuotettiin kuivaan dimetyyli-formamidiin (1,5 ml) ja lisättiin N,N-di-isopropyylietyy-liamiinia (12,8 μΐ). Lisättiin 0-(N-sukkinimidyyli)-N,N,-20 N',N'-tetrametyyliuroniumtetrafluoriboraattia (22,3 mg) typpiatmosfäärissä ja seosta sekoitettiin 1,5 tuntia. Tämä ': aktiivisen esterin 52 varastoliuos käytettiin yhdisteen 54 välikkeen pidentämiseen.

i * t

Yhdisteen 54 valmistuksessa noudatettiin esimerkin 25 3 menetelmää yhdisteen 34 valmistukselle sillä ainoalla poikkeuksella, että käytettiin tetrasakkaridia 53 yhdisti* teen 31 sijasta: • · * COOCH3 i-* °AC r^OBn

/—O J-O λ-O J-O

30 / NV* / \ /coochMI / \ 53 koen, /°ΛοΑο /ioXoCH, / °v\OBn / — OCH3 OBn OCH3 OBn

• I

,· Yhdiste 53 valmistettiin analogisesti menetelmien • « / 35 kanssa, jotka on kuvattu julkaisussa H. Lucas et ai., An- 33

11354C

gew. Chem. 1993, 32(3), 434 - 436. Tässä viittauksessa tetrasakkaridin (12) valmistus on kuvattu kaaviossa 2. Kaavion 2 vaihetta d) sovellettiin yhdisteen 53 valmistusta varten seuraavasti: bentsyyliryhmän sijasta lisättiin 5 metyyliryhmä käyttäen BnBrin sijasta CH3I:a. Jatkoreaktio-vaiheet yhdisteen 53 valmistamiseksi olivat samanlaisia kuin mainitun viittauksen tetrasakkaridin 12 valmistuksessa.

Yhdiste 54 (52 mg) liuotettiin dimetyyliformamidin 10 (150 μΐ) ja veden (150 μΐ) seokseen. Lisättiin 4-metyyli- morfoliinia (50 μΐ) ja sekoitettiin 5 minuuttia, minkä jälkeen lisättiin aktiivisen esterin 52 varastoliuosta. Sekoitettiin 1 tunti, minkä jälkeen seos haihdutettiin ja jäännös puhdistettiin Rp-18-kolonnissa (vesi:metanoii = 15 7:3, tilavuus/tilavuus), jolloin saatiin 48 mg yhdistettä 55.

Yhdiste 55 (48 mg) haihdutettiin yhdessä kaksi kertaa dimetyyliformamidin kanssa, kuivattiin ja liuotettiin kuivaan dimetyyliformamidiin (2,1 ml). Lisättiin trietyy-20 liamiinirikkitrioksidia (312 mg) typpiatmosfäärissä ja seosta sekoitettiin yön yli 50 °C:ssa, minkä jälkeen li-·;· · sättiin natriumvetykarbonaatin vesiliuosta. Seosta sekoi- ; tettiin 1 tunti huoneenlämpötilassa, väkevöitiin pieneen • · · .*· , tilavuuteen ja poistettiin suolat Sephadex G-25 -kolon- 25 nissa. Eristetty tuote eluoitiin vedellä Dowex WX8 Na+ -ko-***! lonnissa, jolloin saatiin 73 mg sulfatoitua pentasakkari- *;;; dijohdannaista. Tätä yhdistettä käsiteltiin 0,2 N vetyklo-

• » I

’*’ ‘ ridihappoliuoksella (2,0 ml). Seos neutraloitiin, minkä jälkeen siitä poistettiin suolat Sephadex G-25 -kolon-... 30 nissa, jolloin saatiin 57 mg yhdistettä 56.

·', · Yhdiste 56 (50 mg) liuotettiin 10,7 ml:aan hydrok- ,* : syyliamiiniliuosta puskurissa. (Tämä liuoksen saamiseksi , liuotettiin hydroksyyliamiinin vetykloridihapposuolaa (174 mg) 100 ml:aan 0,1 M natriumdivetyfosfaattiliuosta ja : 35 pH säädettiin arvoon 7,5 käyttäen 4 N natriumhydroksidi- i

11354C

34 liuosta). Reaktioseosta sekoitettiin 90 minuuttia 20 °C:ssa, sitten pH säädettiin arvoon 8,5 ja seosta sekoitettiin vielä 24 tuntia. Seoksesta poistettiin suolat ja se puhdistettiin Sephadex G-50 -kolonnissa, minkä jäl-5 keen saatiin erotettua 40 mg puhdasta biskonjugaattia V, [α]ρ° = +42,9° (c = 1; vesi).

/\ii ^ Oli rOH coo- r f__ n / \ / \ /0»V A \ 10 N0H /ο^ΗΥ°Λ?Η ΛΚ0Π γΛ°Η ι^ΟΓΗι Χ 0CH, "" ΟΠ''' °Η 5·14 (0-CH;-CH:i vO rH2 - <Ύ° tr\ ^ O '^M^^^\(0-Cll2-CH2l.VOCH2C,12SAc 0 20 * Oli /10-^7^ /^nl:

oil OCIh O·· ΟΓΙ1'' °H

7. 25 ,o-ch-ch> .οπί' ΐΉνΜΚ.Ο'Πΐ- Όΐ h:<h: :<t( sx — • · · * » · 1 t » »

35 11354C

I sulfatointi i mov C0(). ^^0,- r(,s^- os°v yl 0 11; y( (j\o s °; - y[ p J\of t h y °\Ps£so-~ y^)CHl OSO:· OOH; OSO;· OCII; OSO;- 10 ,ρ-ΟΗ-ΠΟ ;-() ril-.CH-AHC O < u:- OOIM'IO :ui ll;i 'll- N \. — hydroksyylikäsittely ▼ 15 oso3- coo- oso3- -oso3- NS°3'y^-oKx:H3 yhkysoy / °yht>sor ΑΗ< 20 OSO3- och3 oso3- och3 oso3- (O CH2<:H2)3 O CH2 CH2 NH C(0) CH2 (O CH2 CH2)3 O CH2-CH2 S- =:: l J2

.* Biskonjugaatti V

:: 25 '!!! Esimerkki 6 • · * Biskonjugaatti VI valmistettiin analogisella ta valla biskonjugaatille V kuvatun tavan kanssa sillä ai- 30 noalla poikkeuksella, että yhdisteen 53 sijasta käytettiin • ’·;* tetrasakkaridia 57 (joka on julkaisun H. Lucas et ai., :· Angew. Chem. 1993, 32(3), 434 - 436, tetrasakkaridi 12), [α]ρ° = +31,6° (c = 0,82; vesi).

36 113 5 4C

il \ I )Hn I'lMX'll: ^ / \Λ / \ /το<κ μ / \ 5-7 \n< H; y{\j\OV AoJv**<' y 'jV,lin /Vk H ' 5 OBn πΚη OH;·. * ^ r—OSO3- COO- 1-OSO3- I OS°3~ /oso3. \ /0CH3 Vo/osoj. \ /S, /vA?so3-y* v x o y v N··.^ och3 OSO3 OSO3- (jS()j oso3- OSO3 15 (0 CH2-CH2)3 ο CH2 cn2 NH C(0) CH2 (0-CH2 CH2>3 O CH2 CH2-S- — 2

Biskonjugaatti VI

Esimerkki 7 20 Biskonjugaatin VII valmistamiseksi noudatettiin esimerkin 5 menettelyä, paitsi että monokonjugaatin 54 sijasta käytettiin yhdistettä 89. Yhdiste 89 valmistet-.·**. tiin yhdisteen 34 valmistusmenetelmän mukaisesti (kuten .···. esimerkissä 3 on kuvattu) käyttäen yhdistettä 60 monosak- 25 karidin 24 sijasta, [u]d° “ +66,6° (c = 0,5, vesi).

• · « » r0S03 COO- f-0550! ^,0S03- KT”3 y°Js°s°y Äof^c»3 /°JsSs°y . och3 0CH3 0SO3- 0CH3 OSO3- ; (O CH2-CH2)3 o CH2 CH2 NH-C(0) CH2-(0-CH2 CH2>3-0-CH2-CH2-S.

— 2

Biskonjugaatti VII

’ 35 113540 37

Yhdisteen 60 valmistus:

Yhdiste 58 (29 g) ja jodimetaani (15,5 ml) liuotettiin dimetyyliformamidiin (50 ml). Liuos lisättiin tipoit-tain natriumhydridin (10,5 g) suspensioon dimetyyliforma-5 midissa 20 °C:ssa. Seosta sekoitettiin 16 tuntia ja ylimääräinen natriumhydridi tuhottiin metanolilla. Lisättiin vettä ja seosta uutettiin etyyliasetaatilla. Väkevöimisen jälkeen saatiin erotettua 25 g yhdistettä 59. Yhdiste 59 (44 g) liuotettiin dikloorimetaaniin (90 ml) ja lisättiin 10 trietyylisilaania (92 ml). Lisättiin tipoittain trifluori-etikkahapon (44 ml) ja trifluorietikkahappoanhydridin (0,9 ml) seos ja seosta sekoitettiin 1 tunti 20 eC:ssa. Reaktio pysäytettiin kylmällä natriumvetykarbonaattiliuok-sella, uutettiin etyyliasetaatilla, kuivattiin ja väkevöi-15 tiin. Jäännökselle suoritettiin silikageelikromatografoin-ti, jolloin saatiin 31 g yhdistettä 60.

H / J-O metylointi H / /-O

20 OH OCH, 58 •,,t 4,6-bentsyli- t · ·* deenin *.,. avaaminen

25 V

’ OBn ^OH COO- OH I ^ / -° )-° / —° /-°v Λ /-°\ / °\ . Nq0"3 yl οΙ^η3 y°^OI. ^OCH3 ···’ 30 OCHj OCHj OH OCHj OH HO ' n^OCH3 (O-CHj-CHjJj-O-CHj-CHj-NHj 8g ^

11354C

38

Esimerkki 8

Monosakkaridi 69 valmistettiin seuraavasti: Liuokseen, jonka muodosti 1,6-anhydromannoosi 61 (19,1 g) asetonissa (75 ml) ja 2,2-dimetoksipropaanissa (75 ml), 5 lisättiin kamferisulfonihappoa (200 mg). Reaktioseosta sekoitettiin yön yli. Lisättiin trietyyliamiinia ja liuotin haihdutettiin. Jäännökseen lisättiin dikloorimetaania, suolat suodatettiin ja suodos haihdutettiin kuiviin. Raa-katuotteelle suoritettiin pylväskromatografointi, jolloin 10 saatiin 15 g yhdistettä 62.

Yhdiste 62 (3,0 g) ja tetraetyleeniglykolidi-p-to-sylaatti liuotettiin kuivaan tetrahydrofuraaniin (250 ml). Seos kuumennettiin 60 °C:seen ja lisättiin natriumhydridiä (900 mg) typpiatmosfäärissä. Sekoitettiin 30 minuuttia, 15 minkä jälkeen seos väkevöitiin ja puhdistettiin pylväskro-matografialla, jolloin saatiin raakatuotteena 3,9 g yhdistettä 63.

Yhdiste 63 (3,9 g) liuotettiin tetrahydrofuraaniin (25 ml) ja lisättiin N-metyylibentsyyliamiinia (1,95 ml). 20 Seosta kuumennettiin refluksointilämpötilassa 30 minuuttia ja väkevöitiin, jolloin saatiin raakatuotteena 5,0 g yh-·: ·.· distettä 64.

Raakatuotteena oleva yhdiste 64 (5,1 g) liuotettiin » · · .··. 30 ml: aan metanolin ja IN vetykloridihapon seosta (9:1,

• I

25 tilavuus/tilavuus) ja seosta sekoitettiin 5 tuntia 85 °C:ssa. Jäähdyttämisen jälkeen lisättiin pyridiiniä (50 ml) ja liuos väkevöitiin, jolloin saatiin raakatuot-* ’ teenä yhdiste 65.

Raakatuotteena oleva yhdiste 65 liuotettiin : 30 75 ml:aan pyridiinin ja etikkahappoanhydridin seosta (2:1, v.: tilavuus/tilavuus), lisättiin 4-dimetyyliaminopyridiiniä : (25 mg) ja seosta sekoitettiin 4 tuntia huoneenlämpötilas- ·, sa. Seos laimennettiin tolueenilla ja haihdutettiin. Jään nös liuotettiin etyyliasetaattiin ja lisättiin laimeaa i 35 vetykloridihappoa. Uuttamisen jälkeen happaman vesipitoi- 39

11354C

sen kerroksen pH säädettiin arvoon 10 natriumhydroksidi-liuoksella ja uutettiin jälleen etyyliasetaatilla. Orgaaninen kerros kuivattiin ja väkevöitiin. Raakatuote puhdistettiin pylväskromatografiällä, jolloin saatiin 1,86 g 5 yhdistettä 66.

Yhdiste 66 (1,86 g) liuotettiin etikkahappoanhyd-ridin (45 ml) ja trifluorietikkahapon (3,8 ml) seokseen. Liuosta sekoitettiin 60 tuntia 20 °C:ssa ja sitten se laimennettiin tolueenilla. Väkevöitiin, minkä jälkeen 10 jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja pestiin natrium-vetykarbonaatilla. Orgaaninen kerros kuivattiin ja väkevöitiin. Raakatuotteelle suoritettiin pylväskromatogra-fointi, jolloin saatiin 0,5 g yhdistettä 67.

Yhdisteet 68 ja 69 valmistettiin yhdisteille 27 ja 15 vastaavasti 28 esimerkissä 3 kuvatun tavan mukaisesti.

* • · « · I ·

» * I

• · · » » » 1 » 40

11354C

__q — 0 tetraetyleeni- __Q

J n 2,2-dimetoksi- -O glykolidi-p- | ~

/ \ propaani /v/ \ tosylaatti J-O

" NLJ/ -- (¾)

HO - HO N-v N_V

g (O-CHj-CHiljO-CHvCHyOTos bl bl bi N-metyyli- bentsyyli- amlini 10 I ~? etikkahappo- ·| ° J_o I-o anhydridi )-0 H+ \ (C7o>i - - K_J/ (0-CH2.CH2l3-0CHvCHvN(CH,lBn lO-CH2-CH2.vO-CH2.CH2-N,CH,)Bn (OCH2-CH2)vO-CH2-CH2-N.CH,lBn

1J

ob bs- by, etikkahappoanhydridi trifluorietikkahappo 20 ___.OAc ___.-. OAc _-OAc

. trikloori- J_Q

'I “·* )-°v saippuointi )-O asetonitriili / \ ,NH

.··. f(oAc o/^wv-OAc -► /oAc OA^^OH -► K OAc OA/'w'°-\ \l 1/ V 1/ \L_J/ Vc,-.

*··>’ -lO CHvCHil,-O CHvCHvNiCH,iHn iOCHvfH,u O-ClIvCHvS'iCHjiBn lO-CH-i-CH-dvO-CH-.-CH-.-NiCIMin ;, 25 ..... -- -- .....

·; 'n ^ b I · ‘ t

11354C

41 ^9+-^7 1) kytkentäreaktio 2) saippuointi 3) hydrogenolyysi 5 ▼

r°H coo OH OH

/-° —° Λ /-° /-° - )-O

OH OH OH OH

f0-CH2-CH2'3-0-CHvCHvN(CH,)H ^2 1) välikkeen pidennys aktiivisella ^tj esterillä 52 2) sulfatointi f ^OSOv coo OSOv -OSOr /^°r Λο^] /°J^sor /nrH, ^ J OSOy OSOy OSO y OSOy (OCH2-CH2»vO-CH2-CH2-NiCH,iCiO(-CH2-iO-CH2-CH2)vO-CH2-CH2-SAc i ^ 25 ,;' hydroksyyliamiinikäsittely ’ f 30 j—OSO3- coo- j—OSO3- I—OSO3- (oso3OsbyX^)CH3 y°j(oso3. /\och3 V'°X?S03Λ„..

OS°3‘ OSOj- OS03- 0S03- > t 1 : 35 (0-CH2-CH2)3-0-CH2-CH2-N(CH3)-C(0)-CH2-(0-CH2-CH2)3-0-CH2-CH2-S- ,,,* _ Biskonjugaatti VIII ^ 42 113540

Yhdisteelle 69 suoritettiin kytkentäreaktio tetra-sakkaridin 57 kanssa, minkä jälkeen suoritettiin saip-puointi ja hydrogenolyysi (kuten esimerkissä 3 on kuvattu yhdisteille 32, 33 ja vastaavasti 34), minkä jälkeen saa-5 tiin yhdiste 70.

Yhdistettä 70 käsiteltiin aktiivisella esterillä 52, minkä jälkeen sulfatoitiin (yhdisteiden 55 ja 56, esimerkki 5, valmistusten mukaisesti), jolloin saatiin yhdiste 71.

10 Yhdistettä 71 käsiteltiin hydroksyyliamiinilla (biskonjugaatin V yhdisteestä 56 valmistuksen mukaisesti, esimerkki 5), jolloin muodostui biskonjugaatti VIII, [a]j;0= +27,3° (c = 1; vesi).

Esimerkki 9 15 Biskonjugaatti IX valmistettiin esimerkin 4 mene telmän mukaisesti yhdellä poikkeuksella: glukopyranosyy-li-imidaatin 28 sijasta käytettiin mannopyranosyyli-imi-daatin 69 analogia, jonka tetraetyleeniglykolisivuketjun päässä oli -N3 ryhmän -N(CH3)Bn sijasta. -N3:n sisältävä 20 yhdiste valmistettiin saattamalla yhdiste 63 reagoimaan litiumatsidin kanssa N-metyylibentsyyliamiinin sijasta. Kaikki muut reaktiovaiheet mannopyranosyyli-imidaatin si-sältävään atsidiin saakka olivat samanlaisia kuin yhdis-teen 69 synteesissä, [a]p° = +33,2° (c = 0,25; vesi).

·;· 25 • * » · roso3. coo. osoy osor o^nj °la3q^^ ^ ··* ^ OS Oy OSOy OSO3- OSO3- • · · » ♦ · a 1 : (O CH2 CH2)3 o CH2 CU2-NHC(0)CH2-NHC(0HCH2)5-NHC(0)-(CH2)2-S- • « · f » • · · : ’ v ^ 2

|i( 35 Biskonjugaatti IX

43 113540

Esimerkki 10

Diskonjugaatin X valmistuksessa noudatettiin esimerkin 9 menettelyä sillä poikkeuksella, että tetrasakka-ridin 57 sijasta käytettiin tetrasakkaridia 53 pentasakka-5 ridiosan valmistuksessa, [a]£° = +26,5“ (c = 1; vesi).

^osov coo oso3- roso3- J—o Ϊ—o J—o 4—o J—o 10 °ίΛ]οίΜ» och3 oso3- och3 oso3- <0CH2-CH2)3O -CH2CH2 NHC(0)CH2NHC(0)(CH2)5-NHC(0MCH2)2-S-15 - Biskonjugaatti X - 2

Esimerkki 11

Biskonjugaatti XI valmistettiin yhdisteestä 75 yhdisteen 32 konversion mukaisesti biskonjugaatiksi III 20 (esimerkki 3) sillä poikkeuksella, että N-(bentsyylioksi-karbonyylioksi)sukkinimidin sijasta käytettiin sukkinimi-do-N-(bentsyylioksikarbonyylioksi)glysiiniä, [a]*0 = +25,7® (c = 0,49; vesi).

< f l • · · * > » _ - 25 ··’’ | OS03- COO- I—OSO3- I—OSO3- ·;· 1 o 1—O J-O λ—o ~ >—o 0CH3 ; (0SO3·/\°° / °\fosor/ 0S03 OSO3- OS03- OS03- OSO3- ;; 30 * · ' ‘' (O cn2 CH2)3 O (CH2)2 NHQOJCHjNHQO) (CH2)5 NHC(O) ch2ch2 s- I · ί L- 2

Biskonjugaatti XI

t * : 35 » 44 113540

Yhdisteen 75 valmistus 214 mmol yhdistettä 28 ja 178 mmol yhdistettä 72 (katso EP 529 715, valmistus V) liuotettiin 4 ml:aan di-kloorimetaania huoneenlämpötilassa ja lisättiin 160 mg 5 4 A:n molekyyliseulaa. Tätä seosta sekoitettiin 1 tunti.

Sen jälkeen seos jäähdytettiin -20 °C:seen ja lisättiin 21,4 mmol trimetyylisilyylitrifluorimetaanisulfonaatin 40 mM liuosta dikloorimetaanissa. Reaktioseosta sekoitettiin 15 minuuttia ja sitten suodatettiin celiten läpi, 10 seuraavaksi pestiin natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella ja vedellä ja haihdutettiin kuiviin. Jäännökselle suoritettiin asetolyysi liuottamalla se trifluorietikkahapon ja etikkahappoanhydridin seokseen. Reaktiotuotetta käsiteltiin bentsyyliamiinilla dietyylieetterissä ja sen jälkeen 15 triklooriasetonitriilillä dikloorimetaanissa kaliumkarbo naatin läsnäollessa, jolloin saatiin yhdiste 73 (saanto: 50 %).

0,121 mmol yhdistettä 73 ja 0,093 mmol yhdistettä 74 (katso EP 529 715, valmistus IX) liuotettiin 3,2 ml:aan 20 dikloorimetaania. Molekyyliseulan läsnäollessa ja argonat- mosfäärissä seos jäähdytettiin -20 °C:seen ja sitten li-: sättiin 0,470 ml trimetyylisilyylitrifluorimetaanisulfo- naatin liuosta dikloorimetaanissa. Reaktioseosta sekoitet- » 1 . tiin -20 °C:ssa 1 tunti, minkä jälkeen se suodatettiin, • · 25 pestiin vedellä, haihdutettiin ja puhdistettiin Sephadex LH-20 -kolonnissa ja sitten silikakolonnissa, jolloin saa- 'i,·; tiin yhdiste 75 (62 %).

• » · * 1 · • · i 1 t · 1 • · * · * « > • « * · » • 1 · • · « « ·

* I I

t t · • » I · •

! I

I ( t

11354C

45 COOBn . o

J O J O

- , + jL/^γ 5 OAc OBn p y 10 y f 0Ae fOOB" r OAc /-°\ /-° /-°

kOBn X / / O /oAe W °\^NH

N3-(CH2)2-0-(CH2>2-0-(CH2>2-0-(CH2)2-0 1'f ° \— / ^ \-/ | 15 OB" U 0ΒΠ CC,3

3A

Γ OAc + fipJzf OAc OBn Y ^ 25 fOAC COO E>*» I—OAc I—OAc- / °\ J ° / ° A ° Λ / °. OCHj κ°Βη x X y°iCotKt- X /Cooa-Vo/ot^ n N3-(CH2)2-0-(CH2)20-(CH2>20-(CH2)20^ f ° V f Ill/ ° V ./ >—/ 0Bn °*c Οβ>„ 0ftc OR** ;;; 30

Esimerkki 12

Maltopentaoosi 76 (500 mg) liuotettiin 15 ml:aan , pyridiinin ja etikkahappoanhydridin seosta (2:1, tila- 35 vuus/tilavuus), sekoitettiin yön yli ja väkevöitiin.

46

11354C

Haihdutettiin yhdessä tolueenin kanssa, minkä jälkeen saatiin 930 mg yhdistettä 77.

Reaktiot 77 -> 78 -+ 79 suoritettiin noudattaen menetelmiä, jotka on kuvattu konversiolle 26 -» 27 -> 28, ja 5 seuraava kytkentäreaktio, jolla saatiin yhdiste 80, toteutettiin yhdisteiden 28 ja 31 kytkentäreaktiolle kuvatun menetelmän mukaisesti (katso esimerkki 3).

Yhdiste 80 (300 mg) liuotettiin kuivaan metanoliin ja lisättiin pieni määrä kalium-tert-butoksidia. Seosta 10 sekoitettiin yön yli. Lisättiin Dowex H+:a seoksen neutra-loimiseksi ja suodattamisen jälkeen suodos väkevöitiin, jolloin saatiin 180 mg yhdistettä 81.

Yhdiste 81 sulfatoitiin yhdisteelle 35 kuvatun menetelmän mukaisesti (esimerkki 3), jolloin muodostui yh-15 diste 82. Yhdisteelle 82 suoritettiin hydrogenolyysi yhdisteen 16 konversiolle yhdisteeksi 17 kuvatun menetelmän mukaisesti (katso esimerkki 1), minkä jälkeen saatiin yhdiste 83.

Asymmetrisen biskonjugaatin XII valmistus 20 Liuos A

Yhdiste 83 (42 mg) liuotettiin seokseen, jonka muodostivat 0,1 M natriumdivetyfosfaattipuskuri, pH 7,5, . : (1,3 ml) ja dime tyyli f ormamidi (0,5 ml), ja lisättiin sulfosukkinimidyyli-4-(p-maleimidofenyyli Jbutyraattia 25 (7 mg). Seosta sekoitettiin 15 minuuttia.

Reaktioseos B

Monokonjugaatti 71 (17,5 mg) liuotettiin 1,7 ml:aan * » · 50 mM hydroksyyliamiiniliuosta 0,1 M natriumdivetyfosfaattipuskurissa, pH 7,5, argonatmosfäärissä. Seosta sekoitet-·*;; 30 tiin 1 tunti, jolloin saatiin yhdisteen 84 liuos. Tähän · ·' liuokseen lisättiin 1 ekvivalentti liuosta A argonatmos- f äärissä. Seosta sekoitettiin vielä 2 tuntia. Tämän prosessin aikana muodostui myös symmetrinen biskonjugaatti, joka poistettiin ditiotreitolikäsittelyllä. Sekoitettiin 35 30 minuuttia, minkä jälkeen seos puhdistettiin Sephadex i

11354C

47 G-50 -kolonnissa, jolloin saatiin 4,7 mg asymmetrista bis-konjugaattia XII, [a]*0 = +40,3° (c = 0,38; vesi). Sulfatoidun maltopentaosidin valmisus

5 OH OH ^OH

OoQoQ-™ *

OH OH OH

10 3 etikkahappoanhydridi/pyridiini OAc OAc __OAc jQuQwQ- » OAc OAc OAc L ^ 3 hydratsiinihydraatti

20 I

,: OAc OAc OAc !. ^5 OAc OAc OAc ;· L J 3 • * triklooriasetonitriili

T

30 h- • i i ..OAc OAc ^OAc » OAc OAc OAc : 35 • 48

11354C

B

kytkentäreaktio H0-CH2-CH2-0(CH2-CH2-0)4-CH2-CH2-N3 ' Ha, 5 f"OAC r0Kc r"0Ac 0-CH2-CH2-0(CH2-CH2-0)4-CH2-CH2-N3 (XT yXoi\Q^ OAc OAc OAc 10 * 3 saippuointi f p-OH j-OH r-^OH 0-CH2-CH 2-0(CH2-CH 2-0)4-CH2-CH2-N 3 15 f\T >o4 >o4 / HO X-f X-Γ -f

OH OH OH

li 3 sulfatointi 20 * OSO,- ^OSO.V p-oso.v 0-CH2-CH2-0(CH2-CH2-0)4-CH2 CH2-N3 : 1 ·: f^?S03" y\o IV^0?· Xo / ‘ OSOv OSO3- OSO3- 25 ···. L _l 3 ,, ; 9z ,,. —> hydrogenolyysi 'f 3Q r°SO.v ^OS03- |^oso.v 0-CH2-CH2-OiCH2-CH2-0)4-CH2-CH2-NH2 ... I-g J—o J-o : n3' /lolCOSOv /io\os°3- /

-O3SO [ I I

OS03- OSO;- OS03- dh *- —*3 35

49 11354C

J-OSO3- COO- -.OSO3- ^oso^- /osoyosoy/nrM yo/ \ /co°' Yo/ \ \[ |/U3jsffCH3 / VYOSo.vyaoh^QCHj y \J\°soy yj)rfl OSOy so 3- OSOy OSO3- 5 (0-CH2-CH2)vO-CH2-C!l2-N(CH3)C(0)CH2-(0-CH2-CH2).vO-CH2-CH2-SAc ^ asetyylin poisto 10 ▼ rOS°3- coo- r0S03- rOS°3· )-O )-0 Λ /-O /1-0 )-0 ^°\Ks°r/!*-», 15 OSO3- so3- OSO3- OSO3-

(0-CH-)-CH-,)3-0-CH-,-CH-,-N(CH3)C(0)Cil-,-(0-CH2-CHi)3-0-CH2-CH2-SH

----- - Qq 20 0 o = ; J + yhdiste 83 .Xv

25 ^ 0 \=/yJ

···; 0 0' I > « f , 30

: : asymmetrinen biskonjugaatti XII

*

Asymmetrinen biskonjugaatti XII

50

11354C

j— OSO3- COO- I-OSO3- J-QSO3- 5 ^s°3-OS^ /\och3 / 1^0S03·^ l °S°3- OSO3- OSO3- OSO3- 10 CH3 r-ο^γ

O —j O

1K o o

20 S

o-^ γ(/ν0^\Γ' 25 ’"'""γ

.*:· 1—OSO3- p-osoj- 1—OSO3- J

)-°\ /-° /-°\/ KOSO3- \ \0SO1· X AOSOi- / 30 [SlZ/ \_IA 1 xZ/ OSO3 oso3- OSO3- L J 3

11354C

51

Esimerkki 13

Asymmetrinen biskonjugaatti XIII valmistettiin biskonjugaatin XII valmistukselle kuvatun menetelmän mukaisesti. Pentasakkaridin 71 sijasta käytettiin analogis-5 ta yhdistettä 85. Yhdiste 85 saatiin yhdisteen 89 konversiolla pidentämällä välikettä aktiivisella esterillä 52 ja sulfatoinnilla, kuten yhdisteen 54 konversiolle yhdisteeksi 56 on kuvattu (katso esimerkki 5). Yhdiste 89 mainittiin esimerkissä 7. [α]ρ° 1 +65,4° (c = 0,09; vesi).

10 ^OSOj- coo- ^0503 _,OS031 (Γ3 / A0503X/\OCH3 y°Js°S°1· Ar„, 15 OCH3 0CH3 OSO3. 0CH3 OSO3- (O CH;-CH2)j-0-CH2 CH2-NHC(0)CH2-(0CH2CH2)j0CH2CH2 SAc 85 m • · 1 · * • « · • 1 · 1

• I

• · · · • » · • · • 1 1 a > » » t » a »

52 11354C

Asymmetrinen biskonjugaatti XIII

r0S03- COO- ^OSOy ^oso^- 5 (SP >oi^H3 /°J\OSP3- )loJ\0^3 /0J^S^-Acu, \ OCH3 OCH3 OSO3- OCH3 OSO3- 10 H \ Γ-(/γ o—^ o 15 o \XK>^

20 O

„4 5fvv-vVNT1 :. 25 N.

• I-OSO3- I—OSO3- f OSO3- J

\-O \-o J-o / 30 (^s°3- yK( /\qsq3- ys q/\qso3- y °3SO 0SO3 oso: · OSO3- • » · L- J 3 * » I ( 1 » · t 53 113540

Esimerkki 14

Sulfatoitu maltotriosidi 87 valmistettiin yhdisteestä 86 maltopentaosidin 83 valmistukselle yhdisteestä 76 kuvatun menetelmän mukaisesti (katso esimerkki 12).

5 Reaktio A: Yhdiste 87 (25 mg) liuotettiin 1,0 ml:aan 0,1 M natriumdivetyfosfaattipuskuria, pH 7,5, ja lisättiin sulfosukkinimidyyli-(4-jodiasetyyli)amino-bentsoaattia (21 mg). Seosta sekoitettiin 30 minuuttia 20 °C:ssa ja puhdistettiin Sephadex G-15 -kolonnissa, jol-10 loin saatiin 30 mg tuotetta.

Reaktio B: Yhdiste 85 (15 mg) liuotettiin 1,7 ml:aan 50 mM hydroksyyliamiiniliuosta 0,1 M natrium-divetyfosfaattipuskurissa, pH 7,5, argonatmosfäärissä. Seosta sekoitettiin 1 tunti 20 °C:ssa ja puhdistettiin 15 Sephadex G-25 -kolonnissa, jolloin saatiin 14 mg yhdistettä 88.

Reaktiosta A saatu tuote ja yhdiste 88 liuotettiin 1 ml:aan 0,1 M natriumvetyfosfaattipuskuria ja sekoitettiin 60 tuntia argonatmosfäärissä 4 °C:ssa. Symmetrinen 20 biskonjugaatti poistettiin ditiotreitolikäsittelyllä. Sekoitettiin 30 minuuttia, minkä jälkeen seos puhdistettiin Sephadex G-50 -kolonnissa, jolloin saatiin 13 mg biskonju-: gaattia XIV, [a]„° = +55,7° (c = 0,46; vesi).

Il· I t I t • · f • · » 1 · · • · · · I · · • · • · » » • 1 • · · · I · | • · » • ·

54 11354C

Maltotriosidi

^OH OH OH

HO | [ [

OH OH OH

8G

10 '' >' 15 °sOy ^OSO.V ^OSOy o.CH2-CH2-O<CH2-CH2-0)4-CH2-CH2-NH2 20 /—°\ /—°\ /—°\ / OSOv \ / \ / ) \l /loJvos°3- AoS\osoyy -03SO ' [ \ \ ( ; osov OSOv OSOv o B-1 25 * I · • · · % • · ( · • » * » • * · • « * « * t » ·

11354C

55 .0S0V coo OSOv -OSO3-

J- O j— O J- 0 y,- O J-O

\TH3 /joi\ocH' y°J\os°.v /lrH

5 icHj OCH3 so3- 0CH3 OSO3- (0-CH2-CH2)3-0-CH2-CH2-NH-C(0)CH2-(0-CH2-CH2)3-0-CH2-CH2-SAc Q5 hydroksyyliamiini 10 ^OSO 3- COO- J-OS03-

J O ,ί—O J O y, O J-O

15 Ν.Γ3 /W"1 ien OCHj SO3- OCH3 OSO3-

(0-CH2-CH2)3-0-CH2-CH2-NH-C(0)CH2-(0-CM2-CH2)3-0-CH2-CH2-SH

20 + yhdiste 87 0 25 r, X. SO^

;s ·ΛΌΐ P

H

▼

,:. Sulfo- SIAB

30 • ·

: biskonjugaatti XIV

* 1 1 • · • t · • 1

Asymmetrinen biskonjugaatti XIV

56

11354C

osov coo OSOv -0S0 3- J-O 3—— O J-O λ-o J o 5 ίν"1 /Ιθ4αΐ) /°\0S0' ^ΠΓΗ.

I OCH^ OCH3 SO3- OCH3 OSO-r 10 „ 4 " <- 20 I \ 3 O Λ

3 ” iv^N

OSO3- OSO.V ^OSOv \ fC?S°3" y\0jV?S03' Aoj\°S03' / 0350 0SO3- OSOv osov » t * I 1 » 57 113540

Esimerkki 15

Asymmetrinen biskonjugaatti XV valmistettiin asymmetrisen biskonjugaatin XIV valmistukselle kuvatun menetelmän mukaisesti- Maltotriosidin 87 sijasta käytettiin 5 yhdistettä 91.

Sulfatoitu sellobioosijohdannainen 91 valmistettiin sellobioosiokta-asetaatista 90 yhdisteen 83 valmistukselle yhdisteestä 77 kuvatun menetelmän mukaisesti (esimerkki 12), [a]*° = +51,2° (c = 0,83; vesi).

10 OAc O Ac 15 OAc OAc 1 r ' f 20 ’ * * < t A 1

• I

25 : rOS°3~ r"°S°V O-CHj-CHj-OiCf^-O^-O^-CHi-CJ^-NHj 30 "q5oiyso^· / ^/\Qs°3· / ’ osoy oso3- ’! i! t »

Asymmetrinen biskonjugaatti XV

58 11354C

-OSO3- coo OSO3- 5 KT"3 y°Jsss0>- /^C05^· A.„, l Λτή OCH3 SO3- 0CH3 OSO3- vT _

10 —X

I "

20 I X- N

ö .1 ··; 25 i N/ o N/ V/ o .-0S03- roso,- λ 30 /~°\ )—°\/ ~yoJ\^sc>3' /Us£s°y y ·. '; 0SO3- 0SO3- • »

Claims (9)

59 11354C

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen säädeltävän biskonjugaatin valmistamiseksi, joka käsittää 5 kaksi sakkaridia ja välikkeen, jolloin kumpikin sakkaridi on sama tai erilainen ja käsittää 2-6 monosakkaridiyk-sikköä, jolloin ainakin yksi yksikkö on uronihappo, ainakin toisella sakkaridilla on itsessään antitromboottinen aktiivisuus, välike liittää ainakin yhden sakkaridin toi-10 seen sen ei-pelkistävän pään kautta, ja välikkeen ketjun pituus on 20 - 120 atomia, tunnettu siitä, että (A) halutut kaksi sakkaridia ja välike liitetään yhteen halutussa järjestyksessä toivotuksi biskongugaatik-si, mahdollisesti sopivia väliaikaisia suojaryhmiä tai so- 15 pivia liitäntäosia käyttäen, tai (B) haluttu sakkaridi liitetään osaan, joka vastaa halutun välikkeen puolikasta ja jonka toinen pää on suojattu suojaryhmällä, joka on altis dimeroitumiselle ilman mainittua suojaryhmää, suojaryhmä poistetaan ja näin saatu 20 molekyyli dimeroidaan halutuksi biskonjugaatiksi, tai (C) halutun välikkeen osa liitetään halutun sakkaridin osaan, minkä jälkeen mainittua välikkeen osaa kehi- tetään edelleen kemiallisella kondensaatiolla, ja suorite- ·,.taan dimerointi kuten kohdassa (B) halutuksi biskonjugaa-;· 25 tiksi, tai M I i ··· (D) haluttu välike tai välikkeen puolikas liite- tään halutun sakkaridin osaan, mainittu sakkaridin osa liitetään sakkaridiosan loppuosaan toivotuksi biskonjugaa-tiksi tai biskonjugaatin puolikkaaksi, minkä jälkeen tar-30 vittaessa poistetaan suojaryhmät tai suoritetaan dimeroin-·;*’ ti kuten kohdassa (B) .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan biskonjugaatti, jos-, sa ainakin toisella sakkaridilla on itsessään affiniteetti I | » 60 11354C AT-III:a ja/tai HC-II:a kohtaan ja/tai tekijän Ila ja/tai tekijän Xa vastainen aktiivisuus.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan biskonjugaatti, jos- 5 sa molemmilla sakkarideilla on itsessään affiniteetti AT-III:a ja/tai HC-II:a kohtaan ja/tai tekijän Ila ja/tai tekijän Xa vastainen aktiivisuus.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan biskonju- 10 gaatti, jossa ainakin toisella sakkaridilla on kaava rR *°° R s00' rR (f Χ/Γ YoJ^ VV 0-alkyyli R 1 1 jossa kukin R on valittu toisista riippumatta ryhmästä, jonka muodostavat H, OH, 0S03' ja Ci_8-alkoksi; Ri on valit-15 tu toisista riippumatta ryhmästä, jonka muodostavat 0S03~ ja NHS03'; ja aaltoviivat tarkoittavat sidosta joko ylös-: päin tai alaspäin ja negatiiviset varaukset on kompensoitu vedyllä tai alkalimetallikationilla.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen me-20 netelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan biskonju- gaatti, jossa ainakin toisella sakkaridilla on kaava: t * * · • * * ✓0S03 COO _0S03“ COO" OSO3- fö2 λ/ζ0^3Y r2 r2 oso3 r2 0S03 *...* jossa R2 on toisista riippumatta 0S03' tai OCH3. * ♦ » · » II· 61 11354C

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan biskonju-gaatti, jossa välikkeellä on kaava: 5 ={Q-NT-CO-[ (CH2)n-NT-CO-(CH2)m]p-S-}2 tai = {Q-0- [ (CH2)n-0]p- (CH2) m-S - }2 jolloin toinen kahdesta Q-ryhmästä on kiinnittynyt toisen sakkaridin ei-pelkistävään päähän ja toinen Q-ryhmä on 10 kiinnittynyt toisen sakkaridin pelkistävään tai ei-pelkis-tävään päähän ja kumpikin Q-ryhmä on fenyleeni- (C6H4-) ryhmä tai - [ (CH20) q- (CH2) r-0] s- [ (CH2) t-NT-CO] u- (CH2) v ja T on toisista riippumatta vety tai Ci_8-alkyyli; g on 0 tai 1; r ja t on valittu toisistaan riippumatta väliltä 2 - 4; ja 15 s on toisista riippumatta 1 - 12; u ja v on valittu toisistaan riippumatta väliltä 1 - 6; nonl - 8, moni - 8, p on 1 - 12 ja atomien kokonaismäärä on 20 - 120.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan biskonju- 20 gaatti, jossa välikkeellä on kaava: * , ·' ·, ={$-NH-CO- (CH2 ) n-NH-CO- (CH2) m-S-/^N-CH2-^^-CO-NH- (CH2) o_>20 I I * *::: jossa toinen kahdesta Φ-ryhmästä on kiinnittynyt toisen • · · * * sakkaridin ei-pelkistävään päähän ja toinen Φ-ryhmä on 25 kiinnittynyt toisen sakkaridin pelkistävään tai ei-pelkis- tävään päähän ja Φ tarkoittaa fenyleeni- (C6H4-) ryhmää; n, • * · m ja o on valittu toisistaan riippumatta väliltä 1 - 8 ja : atomien kokonaismäärä on 20 - 120.

,···, 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen me- 30 netelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan biskonju- *: gaatti, jossa välikkeellä on kaava: I i · 62 11354C ~ [ (ch2) r~Q] s~ (ch2 ) η,-ντ-co- (CH2) m~o~ [ (ch2 ) r~Q] s~ (ch2 ) m-s—^ (CH2} W-CO-NT-^

0- J ^(CH2)m-[0-{CH2)r)s- jossa toinen välikkeen kahdesta vapaasta valenssista on kiinnittynyt toisen sakkaridin ei-pelkistävään päähän ja 5 välikkeen toinen vapaa valenssi on kiinnittynyt toisen sakkaridin pelkistävään tai ei-pelkistävään päähän ja T on toisista riippumatta H tai Ci-8-alkyyli; m on toisista riippumatta 1 - 8; r on toisista riippumatta 2 - 4; s on toisista riippumatta 1 - 12; w on 0 - 10; x on 0 tai 1; y 10 on 0 tai 1; z on 0 tai 1 ja atomien kokonaismäärä on 20 - 120.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan biskonjugaatti, jol-la on seuraava kaava, jossa negatiiviset varaukset on kom-15 pensoitu vedyllä tai alkalimetallikationilla: • ♦ » » * 1 I I I » » 1 • · · * I I * · * · I · 1 · * 1 a * · 63 11354C ^.OSOj- COO- ^0S03- f1OSO3- ΚΓ"3 Α°Κ°η> ./0Α?”>·Λ°0™> /vss^i- Λ™, I OCH; “«3 3Ο3- OCHj OSOj. 0w^ <> A £ , ' I »II .-0S03- - OSOj- λ )-° /-° / -o,SnKos°3· /Kos°3- y ; , osoj- osoj- • » 11354C 64