PT649854E

PT649854E - Bisconjugados compreendendo dois sacaridos e um espacador

Info

Publication number: PT649854E
Application number: PT94202470T
Authority: PT
Inventors: Maurice Petitou; Constant Van Boeckel; Peter Grootenhuis; Pieter Westerduin
Original assignee: Akzo Nobel Nv; Sanofi Synthelabo
Priority date: 1993-09-01
Filing date: 1994-08-30
Publication date: 2000-07-31
Also published as: NO943222L; FI944001A0; GR3033410T3; HU227279B1; FI113540B; HUT69163A; TW349951B; NO301984B1; AU7161094A; JPH07304787A; EP0649854A1; NO943222D0; FI944001A; HU9402514D0; ATE190619T1; EP0649854B1; DK0649854T3; NZ264340A; CA2131229C; JP3918953B2

Description

I

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DESCRICÀO “Bisconjugados compreendendo dois sacárídos e um espaçador” O invento refere-se a bisconjugados sintonizáveis, compreendendo dois sacáridos e um espaçador, a um processo para a sua preparação, a uma composição farmacêutica compreendendo os mesmos, e a uma utilização dos referidos bisconjugados para o fabrico de um medicamento.

Bisconjugados anti-trombóticos compreendendo dois sacáridos são conhecidos a partir do pedido de Patente Europeia 312086. As porções sacárido destes compostos contêm unidades de galactopiranosilo sulfurado, manopiranosilo ou glucopiranosilo. Estes sacáridos não pertencem à classe dos glicosaminoglicanos ou glicosaminoglicanóides, tal como revelado no pedido de Patente Europeia 529715, que contêm ácidos urónicos. Não se revela se estes sacáridos mostram actividade anti-trombótica per se. Além disso, apenas é divulgado um espaçador, que possui uma estrutura muito específica, e que pode ter um comprimento de cadeia tão pequeno quanto 8 átomos, ao passo que se verifica que os bisconjugados do presente invento não são activos quando têm uma cadeia de espaçador menor que 20 átomos. Além disso, nos bisconjugados divulgados em EP 312086, os sacáridos são ligados ao espaçador através de ambas as suas extremidades redutoras. O presente invento refere-se a um bisconjugado sintonizável, compreendendo dois sacáridos e um espaçador, sendo cada sacárido o mesmo ou diferentes e compreendendo duas a seis unidades monossacárido, sendo pelo menos uma unidade ácido urónico, caracterizado por pelo menos um dos sacáridos possuir per se actividade anti-trombótica, e por o espaçador ligar pelo menos um sacárido ao outro através da sua extremidade não-redutora, tendo o comprimento da cadeia do espaçador 20-120 átomos. E conhecido que pequenas moléculas de hidrato de carbono do tipo glicosaminoglicano são potentes inibidores anti-Xa. Ver por exemplo a Patente Europeia 84999. Pedidos de patente posteriores mostraram que muitas variantes destas moléculas básicas têm actividades similares. É actualmente claro que estas moléculas relativamente pequenas (pentassacáridos são exemplos típicos) interactuam com apenas um dos inibidores de serina-protease, normalmente com anti-trombina III (ΑΤ-ΙΠ). O complexo activado sacárido AT-ΠΙ inibe então selectivamente o factor Xa. A partir de investigações com heparina de ocorrência natural e seus fragmentos, sabe-se que glicosaminoglicanos maiores são necessários para a inactivação do factor lia (trombina) mediada por ΑΤ-ΕΠ. Glicosaminoglicanos mais compridos, tendo pelo menos 16 unidades sacárido mostram

84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ actividade anti-Xa, bem como actividade anti-IIa.

Na prática, não é interessante sintetizar glicosaminoglicanos tendo 16 ou mais unidades sacárido, visto que a fragmentação de heparina ou outros glicosaminoglicanos de ocorrência natural conduz a misturas de compostos, a maior parte contaminada com outros tipos de compostos, tais como proteínas, ADN, vírus e semelhantes. De um ponto de vista médico, tais misturas são menos atractivas que compostos sintéticos puros e bem definidos, por exemplo devido aos riscos comuns de sangria.

Foi agora verificado que as propriedades destes glicosaminoglicanos maiores podem ser mimetizados por duas pequenas moléculas de sacárido (compreendendo duas a seis unidades monossacárido), sendo pelo menos um dos sacáridos capaz de interactuar com inibidores de protease tais como AT-ΠΙ ou HC-II, ligados um ao outro por um espaçador. Para obter a distância mínima requerida entre os dois sacáridos, é requerido um comprimento mínimo de espaçador de 20 átomos. Espaçadores maiores do que 120 átomos são menos adequados devido a razões de síntese. Verificou-se adicionalmente que a estrutura química do espaçador é de pouca ou nenhuma importância. A actividade anti-trombótica e a razão de actividade aXa/alIa dos bisconjugados deste invento dependem da natureza dos sacáridos, do local da sua ligação ao espaçador e do comprimento dos espaçadores. Por exemplo, sacáridos ligados a um espaçador através de ambas as suas extremidades redutoras, não são activos.

Pelo menos um dos sacáridos per se, preferivelmente ambos os sacáridos per se, tem (têm) afinidade para AT-ΠΙ e/ou HC-II, e/ou tem (têm) actividade anti-factor lia e/ou anti-factor Xa.

Bisconjugados adequados são bisconjugados em que pelo menos um dos sacáridos possui a fórmula

em que cada R é independentemente selecciónado de H, OH, 0S03" e alcoxi; Rj é independentemente seleccionado' de 0S03~ e NHS03~; e as linhas onduladas denotam quer uma ligação para 3 84 829

ΕΡ Ο 649 854/PT cima quer uma ligação para baixo, e as cargas negativas são compensadas por hidrogénio ou por um catião de metal alcalino. O termo alquilo, tal como utilizado nesta fórmula, é um grupo alquilo tendo 1-8, e preferivelmente 1-4 átomos de carbono. O grupo alquilo mais preferido é o grupo metilo. O termo alcoxi significa um grupo alcoxi tendo 1-8, e preferivelmente 1-4 átomos de carbono. O mais preferido é o grupo metoxi. O metal alcalino preferido é o sódio.

Nos bisconjugados mais preferidos, pelo menos um dos sacáridos possui a fórmula:

em que R2 é independentemente 0S03 ou OCH3.

Como anteriormente salientado, a estrutura química do espaçador é de importância secundária. Contudo, por conveniência de síntese, alguns espaçadores são mais apropriados que outros. Espaçadores simples e que podem ser facilmente introduzidos, são por exemplo espaçadores possuindo a fórmula: ={Q-NT-CO-[(CH2)n-NT-CO-(CH2)m]p-S-} 2 ou ={Q-0-[(CH2)n-0]p-(CH2)m-S-}2 em que um dos dois grupos Q está ligado à extremidade não-redutora de um dos sacáridos e o outro grupo Q está ligado à extremidade redutora ou não-redutora do outro sacárido, e cada um dos grupos Q é um grupo fenileno (C6H4) ou -[(CH20)q-(CH2)r-0]s-[(CH2)t-NT-C0]u-(CH2)v, e T é independentemente hidrogénio ou um alquilo, como anteriormente definido; sendo q 0 ou 1; sendo r e t independentemente 2-4; e sendo s independentemente 1-12, preferivelmente 1-6; sendo u e v independentemente 1-6; n é 1-8, m é 1-8, p é 1-12, e o número total de 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 4

átomos é de 20-120.

Outro espaçador adequado possui a fórmula

={O-NH-C0-{CH2)n-NH-C0-(CH2)m em que um dos dois grupos Φ está ligado à extremidade não-redutora de um dos sacáridos e o outro grupo Φ está ligado à extremidade redutora ou não-redutora do outro sacárido, e Φ denota um grupo fenileno (C6H4); n, m e o são independentemente 1-8, e o número total de átomos é de 20-120.

Outros espaçadores igualmente adequados têm a fórmula:

em que uma das duas valências livres do espaçador está ligada à extremidade não-redutora de um dos sacáridos e a outra valência livre do espaçador está ligada à extremidade redutora ou não-redutora do outro sacárido, e T é independentemente H ou alquilo, como anteriormente definido; m é independentemente 1-8; r é independentemente 2-4; s é independentemente 1-12, preferivelmente 1-6; w é 0-10, preferivelmente 0-7; xé0oul;yé0oul;zé0oul, eo número total de átomos é de 20-120.

Estas concretizações são preferidas devido à sua fácil acessibilidade, porém os espaçadores não estão, de modo algum, limitados aos anteriormente mencionados.

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Os bisconjugados do invento são chamados simétricos quando ambos os sacáridos são o mesmo. Os bisconjugados são chamados assimétricos quando ambos os sacáridos são diferentes entre si. De preferência, os bisconjugados assimétricos compreendem um sacárido não possuindo unidades de ácido urónico, sendo assim diferente dos glicosaminoglicanos e glicosaminoglicanóides, por exemplo um sacárido consistindo em unidades de glucose, e.g. celobiose, maltotriose ou maltopentaose ou seus derivados.

Os bisconjugados do invento podem ser preparados por meio de métodos conhecidos para a preparação de compostos análogos. Normalmente, as porções de hidrato de carbono são preparadas utilizando métodos conhecidos na literatura (por exemplo utilizando métodos de EP 84999, EP 301618, EP 454220, EP 529715). Por aplicação de grupos protectores temporários, o desejado grupo hidroxi pode ser liberto para ligação ao espaçador. Contudo, é mais preferida a ligação de um grupo de ligação adequado ao desejado grupo hidroxi, por exemplo um grupo nitrofenilo, o qual durante o habitual passo de redução (a clivagem dos grupos protectores de benzilo) se converte no correspondente grupo anilina, cujo grupo amino pode ser utilizado para ligação com o remanescente do espaçador (tendo por exemplo um halogéneo ou um éster activo de um grupo carboxílico na sua extremidade), e pode opcionalmente ser temporariamente protegido e ligado ao remanescente do espaçador num passo posterior. O grupo anilina toma-se assim parte do espaçador.

Outro método, especialmente útil quando as porções de hidrato de carbono são a mesma, é a ligação da porção de hidrato de carbono a uma porção que corresponde a metade do espaçador e cuja extremidade a não ser ligada ao sacárido é protegida com um grupo protector, cuja porção é propensa a dimerização sem o referido grupo protector. Após desprotecção, a molécula dimeriza-se sob condições reaccionais adequadas no bisconjugado do invento.

Uma variante do método anteriormente referido é a ligação de uma parte do espaçador à porção de hidrato de carbono, após o que a parte do espaçador é adicionalmente bipartida por condensação química. Este método é particularmente útil para a preparação de bisconjugados com vários comprimentos de espaçador, partindo das mesmas porções de hidrato de carbono.

Ainda um outro método é a ligação do espaçador, ou de metade do espaçador, a uma parte da porção de hidrato de carbono, o qual é ligado por técnicas padrão de ligação de hidratos de carbono com a parte remanescente de hidrato de carbono para o bisconjugado requerido, ou metade do bisconjugado, após o que, quando necessário, podem ser realizadas desprotecção e dimerização do espaçador, tal como anteriormente descrito. 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 6

Os bisconjugados do invento podem ser utilizados para o tratamento ou prevenção de desordens trombóticas ou proliferação de células de músculo liso. Os bisconjugados do invento podem ser administrados entérica ou parentericamente, e para pessoas de preferência numa dosagem diária de 0,001-10 mg por kg de peso corporal. Misturados com auxiliares farmaceuticamente adequados, e.g. tal como descritos na referência padrão, Gennaro et ai, "Remington's Pharmaceutical Sciences" (18a ed., Mack Publishing Company, 1990, ver em especial "Part 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture"), os bisconjugados, quando activos oral, bucal ou sublingualmente, podem ser comprimidos em unidades sólidas de dosagem, tais como pílulas ou comprimidos, ou podem ser processados em cápsulas ou supositórios. Quando activos parentericamente, os bisconjugados podem ser também aplicados como uma injecção ou preparado para infusão, por meio de líquidos farmaceuticamente adequados, sob a forma de uma solução, suspensão, emulsão, ou como uma pulverização, e.g. uma pulverização nasal. Para fabricar unidades de dosagem, e.g. comprimidos, está contemplada a utilização de aditivos convencionais, tais como cargas, corantes, aglutinantes poliméricos e semelhantes. Em geral, pode ser utilizado qualquer aditivo aceitável farmaceuticamente e que não interfira com a função dos compostos activos. Transportadores adequados com os quais as composições podem ser administradas incluem lactose, amido, derivados de celulose e equivalentes, ou suas misturas, utilizadas em quantidades adequadas. A sintonizabilidade dos compostos do invento é demonstrada nas Tabelas I, II e ΠΙ. Parece que os sacáridos, o comprimento do espaçador e suas combinações podem sintonizar a razão de actividade aXa/alIa. O comprimento do espaçador é o número de átomos do espaçador, contado ao longo da cadeia mais curta entre os dois sacáridos, não contabilizando os átomos de oxigénio dos sacáridos que estão ligados ao espaçador.

Os seguintes termos nesta descrição são marcas registadas: Sephadex G-25, Sephadex G-50, Sephadex LH-20 e Dowex WX8. (Segue Tabela I)

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Tabela I

Bisconjugados tendo diferentes porções sacárido e o mesmo comprimento de espaçador bisconj. comp. esp. (átomos) act. aXa a act. alia b aXa/alIa VII 54 767 14 54,8 V 54 638 36 17,7 VI 54 278 156 1,78 VIII 54 49 91 0,54 X 52 181 71 2,56 XI 52 163 161 1,01 IX 52 79 108 0,73 IV 52 17 31 0,54 bisconj. = bisconjugado comp. esp. = comprimento do espaçador a = a actividade anti-Xa (unidades/mg) foi determinada de acordo com o método de A. N. Teien e M. Lee, Thrombosis Research, 10, 399-410 (1977). b = a actividade anti-IIa (unidades/mg) foi determinada de acordo com o método de M. L. Larson et al., Thrombosis Research, 13, 285-288 (1978).

Conclusão: na Tabela I mostra-se que a razão de actividade aXa/alIa dos bisconjugados pode ser sintonizada por meio de variação dos sacáridos.

Tabela II

Bisconjugados com as mesmas porções sacárido e diferentes comprimentos de espaçador bisconj. comp. esp. (átomos) act. aXa a act. alia b aXa/alIa I 32 704 15 46,9 III 46 419 21 20,0 II 57* 628 120 5,23 * o comprimento do espaçador foi determinado via grupo metileno dos grupos ciclopentilo (cadeia mais curta)

Conclusão: A Tabela II ilustra que a razão de actividade aXa/alIa dos bisconjugados pode ser sintonizada por variação do comprimento do espaçador. 8 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

TabelalII

Bisconjugados tendo diversos sacáridos e/ou comprimentos de espaçador bisconj. comp. esp. (átomos) act. aXa a act. alia b aXa/alIa XIV 53 493 64 7,7 ΧΠΙ 56* 281 327 0,86 XII 56* 41 279 0,15 * o comprimento do espaçador foi determinado via grupo metileno dos grupos ciclopentilo (cadeia mais curta)

Conclusão: A Tabela III mostra a sintonização da razão de actividade aXa/alIa dos bisconjugados por variação dos sacáridos e comprimentos do espaçador. O invento é adicionalmente ilustrado por meio dos seguintes exemplos:

Exemplo 1

Monossacárido 5 O composto 1 (3,5 g) (ver Carb. Res., 1989, 186(2), 189-205) foi dissolvido em dimetilformamida (30 ml) e foi adicionado hidreto de sódio (560 mg) sob atmosfera de azoto. A mistura foi arrefecida a 0°C e foi adicionado l-fluoro-4-nitrobenzeno (1,63 ml) durante 2 min. Após 30 min de agitação, a mistura foi concentrada, diluída com diclorometano e água e extractada. Após procedimento convencional, o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna para dar origem a 4 g do composto 2. O composto 2 foi convertido no composto 3 por meio de acetólise, seguida de saponificação, que deu o composto 4, o qual após reacção com tricloroacetonitrilo proporcionou o composto 5. Para a síntese dos compostos 3, 4 e 5, foram utilizados procedimentos tal como descritos para a preparação de compostos 9 (ver infra), 41 e 42 (ver Exemplo 4), respectivamente. 9 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

10 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Tetrassacárido 14 Ο composto 7 foi preparado a partir do composto 6 (ver Bioorganic and Medicinal Letters 1992, 2(9), 905), de acordo com o procedimento descrito para o composto 39 (ver Exemplo 4). O composto 7 foi dissolvido em acetona (260 ml) e arrefecido a 0°C. A esta temperatura foi adicionada gota a gota uma solução de óxido de crómio (VI) (10,8 g), numa mistura de água (53 ml) e ácido sulfurico concentrado (10,5 ml). A mistura foi agitada durante 16 horas a 2°C. O excesso de óxido de crómio (VI) foi destruído com metanol e, após neutralização da mistura com hidrogenocarbonato de sódio, foi adicionada água. Após extracção com diclorometano, a fase orgânica foi seca e concentrada. O óleo residual foi dissolvido em dimetilformamida (174 ml). Foram adicionados hidrogenocarbonato de potássio (7 g) e iodometano (7 ml) e a mistura foi agitada durante 3 horas a temperatura ambiente. Após concentração, o resíduo foi purificado por cromatografia de sílica gel, para proporcionar 9,1 g do composto 8. O composto 8 (2,8 g) foi dissolvido numa mistura de anidrido acético (50 ml), ácido acético (0,3 ml) e ácido trifluoroacético (3,0 ml). Após 3 horas de agitação, a mistura foi concentrada e co-evaporada com tolueno para dar 3,1 g do composto 9. O composto 10 foi preparado por saponificação do composto 9, o qual foi convertido subsequentemente no imidato 11. Foram utilizados os procedimentos descritos para a preparação dos compostos 41 e 42 (ver Exemplo 4). 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 11

' oxidação/metilação

12 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ Ο composto li foi ligado com o composto 12 (ver Jaurand G., et al., Bioorganic and Medicinal Chem. Lett., 2(9), 897-900 (1992), composto 12) para formar o composto 13, a partir do qual o grupo Lev foi removido, com o resultado da obtenção do tetrassacárido 14. Foram seguidos os procedimentos descritos para a preparação dos compostos 43 e 44 (ver Exemplo 4).

Foram adicionados peneiros moleculares de 4 Â (70 mg) a uma solução de 79 mg de tetrassacárido 14 e 70 mg do monossacárido 5, em 2,5 ml de diclorometano. A mistura foi arrefecida a -20°C e foram adicionados 6,8 pmol de trifluorometanossulfonato de trimetilsililo. A mistura foi agitada durante 30 min e foi adicionado hidrogenocarbonato de sódio. A mistura foi filtrada, o solvente evaporado, e o resíduo purificado por cromatografia em sílica, para dar 88 mg do pentassacárido 15, os quais foram dissolvidos em 7,3 ml de tetra-hidrofiirano e arrefecidos a -5°C. A esta temperatura foram adicionados 2,6 ml de peróxido de hidrogénio aquoso a 30% e, após 10 min, foram adicionados 1,2 ml de uma solução de hidróxido de lítio 1,25M. A mistura foi agitada de um dia para o outro a 0°C, foram adicionados 4,8 ml de metanol e 1,3 ml de uma solução de hidróxido de sódio 4M, e após agitação durante 1 hora, a temperatura foi elevada para 20°C e a mistura foi agitada durante mais 20 horas. A mistura reaccional foi acidificada a pH3 com ácido clorídrico 6N a 0°C, e o produto saponificado foi extractado com acetato de etilo. O excesso de peróxido de hidrogénio foi decomposto por extracção com uma solução de sulfito de sódio a 5%, e a mistura orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio e evaporada para dar 89 mg do pentassacárido 16 em bruto. O pentassacárido 16 foi dissolvido em 10,2 ml de dimetilformamida e foram adicionados 55 mg de Pd em carvão a 10%. Após hidrogenólise de um dia para o outro, foram obtidos 64 mg do pentassacárido 17 em bruto. 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 13

IS

i saponificação

z-cloreto

84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 15 Ο pentassacárido 17 (49 mg) foi dissolvido em 2 ml de uma mistura de etanol-água (1:1), e a esta mistura foram adicionados 16 mg de hidrogenocarbonato de sódio e 10,4 μΐ de cloreto de benziloxicarbonilo (Z-Cl). Após agitação durante 4 horas a temperatura ambiente, o solvente foi evaporado e foi adicionado metanol ao resíduo. Os sais foram removidos por filtração e o filtrado foi evaporado para proporcionar 67 mg do pentassacárido 18 em bruto, os quais foram dissolvidos em 2,5 ml de dimetilformamida seca. Sob azoto, foram adicionados 442 mg de sulfotrióxido de trietilamina e a mistura foi agitada de um dia para o outro a 50°C, após o que foi adicionada uma solução de hidrogenocarbonato de sódio, sob arrefecimento gelado. A mistura foi agitada durante 1 hora a temperatura ambiente, concentrada a um pequeno volume e dessalinizada numa coluna Sephadex G-25. O produto isolado foi eluído com água numa coluna Dowex 50WX8 Na+, para proporcionar 104 mg do pentassacárido 19. 100 mg do pentassacárido 19 foram dissolvidos em 8 ml de água, foi adicionado Pd em carvão a 10%, e a mistura foi hidrogenolisada de um dia para o outro, para dar 83 mg do 20 pentassacárido 20. [ct]D = +58,1° (c=l; água). 9,6 mg do pentassacárido 20 e 4,8 mg de sulfo-LC-SPDP foram dissolvidos numa mistura de 0,1 ml de etanol e 0,35 ml de uma solução aquosa de hidrogenofosfato dissódico 0,05M tendo um pH de 7,8.A mistura foi agitada durante 3 horas e dessalinizada numa coluna Sephadex G-25 para dar 9,0 mg do monoconjugado 21. O monoconjugado 21 (8,9 mg) foi dissolvido em 1,5 ml de uma solução aquosa de hidrogenofosfato de sódio tendo um pH 8,0. Foram adicionados a temperatura ambiente 157 μΐ de uma solução de tributilfosfína 0,05M, a mistura foi agitada durante 1 hora e foi passado ar através da mistura reaccional. Após dessalinização da mistura numa coluna Sephadex G-25, o bisconjugado em bruto foi purificado por HPLC utilizando uma coluna de permuta aniónica mono Q, para dar 4,0 mg do bisconjugado I. [a]D20 = +45,7° (c=0,35; água). sulfuração

remoção do grupo Z ' f

17 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Ν S - S-(CH^2 1) tributilfosfina 2) Ο; ar Λ ο <ch2*5 -Ν i

(CH2>2 — S — S - (CH2>2

O

N - <CH2>5 Aí

H

Bisconjugado I

Exemplo 2 O monoconjugado 21 (14,7 mg) foi dissolvido numa mistura de 1 ml de metanol e 2 ml de uma solução aquosa de hidrogenofosfato de sódio 0,1M de pH8. Sob azoto, foram adicionados 247 μΐ de uma solução de tributilfosfina 0,05M em isopropanol, a temperatura ambiente. A mistura foi agitada durante 1 hora e foi adicionada uma solução de 1,68 mg de 23 em 0,5 ml de dimetilformamida, e a mistura foi agitada durante mais 3 horas. Após dessalinização da mistura numa coluna Sephadex G-25, o produto em bruto foi purificado posteriormente por eluição com uma solução aquosa de cloreto de sódio 0,05M contendo 10% de acetonitrilo, numa coluna Sephadex G-50. As fracções reunidas foram dessalinizadas numa coluna Sephadex G-25, para dar 5,5 mg do bisconjugado II. [a]D2° ='+7,0° (c=0,34; água). 18 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ S - S · iCH2>221 0 οA,-, ch, 2 eq tributilfosfina

“N — (CH2)5 H H - S · (CH2)2 — (CH->)< — 22

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Exemplo 3 2,3,6-tri-O-benzil-a-D-glucopiranosido de metilo 24 (2,1 g) foi dissolvido em 75 ml de dimetilformamida e foram adicionados 5,5 ml de di-p-tosilato de tetraetilenoglicol a temperatura ambiente. Foi adicionado hidreto de sódio (162 mg) e a mistura foi aquecida durante 2 horas a 50°C. Foi adicionada azida de lítio (4,5 g) e mistura reaccional foi agitada a 70°C durante outras 5 horas. A mistura foi então concentrada e purificada por cromatografia em coluna, para dar 1,52 g do composto 25. A uma solução do composto 25 (768 mg) em 40 ml de anidrido acético a -20°C, foram adicionados 10 ml de uma solução a 5% (v/v) de ácido sulfurico em anidrido acético (arrefecido a -20°C). A mistura foi agitada durante 10 min a esta temperatura e foi então adicionado acetato de sódio (3,5 g) para parar a reacção. Após 10 min a mistura foi extractada com acetato de etilo, os extractos combinados foram lavados com uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio a 10%, secos e concentrados. Cromatografia em coluna do produto em bruto proporcionou 573 mg do composto 26. O composto 26 (269 mg) foi dissolvido numa mistura de 5,5 ml de dimetilformamida, 31 μΐ de ácido acético, e 28 μΐ de mono-hidrato de hidrazina. A mistura foi agitada durante 3 horas a temperatura ambiente, diluída com diclorometano e água e extractada. O procedimento convencional e cromatografia em coluna do produto renderam 158 mg do composto 27. O composto 27 (158 mg) foi dissolvido em 2 ml de diclorometano. Foram adicionados tricloroacetonitrilo (0,13 ml) e carbonato de césio (17,8 mg) sob atmosfera de azoto. A mistura foi agitada durante 1 hora a temperatura ambiente, filtrada e evaporada. Cromatografia em coluna do produto proporcionou 182 mg do composto 28. 20 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

ΟΒη m

saponificação ν Ο Ac N3-iCH2>2-0-<CH;V2-(J-‘CH2i;-0-<CH2)2-0

ΟΒη

OH ΟΒηi3 tricloroacetonitrilo •QAc í-o

NH OBn // \ ccu OBn 29 84 829 ΕΡ Ο 649 854/ΡΤ 21

Ο composto 31 foi preparado ligando o composto 11 com o composto 29 (ver H. Lucas et ai, Angew. Che., 1993,105, 462-464), para formar o composto 30, a partir do qual o grupo Lev foi removido. Foram seguidos os procedimentos tal como descritos para a preparação dos compostos 43 e 44 (ver Exemplo 4).

84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 22

Os compostos 32, 33 e 34 foram preparados de um modo similar ao descrito para os compostos 15,16 e 17, respectivamente (ver Exemplo 1). O composto 34 (35 mg) foi dissolvido em 0,35 ml de uma solução-mãe de 280 μΐ de trietilamina em 20 ml de dimetilformamida. Foi adicionada N-(benziloxicarboniloxi)-succinimida (10,6 mg) a pH 7,5 e após 30 min de agitação o solvente foi parcialmente removido por evaporação. O resíduo foi primeiro purificado numa coluna Sephadex LH-20, seguido de purificação adicional numa coluna Rp-18 (acetonitrilo:água:amónia = 95:5:2 v/v) para dar 29,4 mg do composto 35. O composto 36 foi preparado de um modo similar ao descrito para o composto 19 (ver Exemplo 1). [a]D20 = 22,8° (c=0,3; água). O composto 36 (51,4 mg) foi dissolvido em 4 ml de água e foi adicionado catalisador (Pd/C 10%). A mistura foi agitada sob uma atmosfera de hidrogénio gás durante 5 horas a temperatura ambiente. Após filtração, o solvente foi evaporado para dar 47 mg do composto 37. O composto 37 (15,1 mg) foi dissolvido em 450 μΐ de uma solução de N,N-diisopropiletilamina em dimetilformamida:água =7:3 (pH 9,0) e foi adicionado um excesso de 6-[3'(2-piridilditio)propioamido]hexanoato de sulfosuccinimidilo a um valor constante de pH de 9,0. Após 20 min de agitação, a mistura foi dessalinizada numa coluna Sephadex G-25 com água:acetonitrilo = 8:2 (v/v), para dar 16 mg do composto 38 em bruto. O bisconjugado III foi preparado a partir do composto 38 de um modo similar ao descrito no Exemplo 1 para a conversão do composto 21 no bisconjugado I. [a]D20 = +29,6° (c=0,125; água). 23 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

TmiOTr

31 τ

a hidrogenólise▼

24 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

53

▼ Sulfo-LC-SPDP

ο ο S-S-íCHj)2 - N-{CH2)2-O-tCH2>2-O‘tCH2)2-0-(CH2)2— 3â

25 84 829 ΕΡ Ο 649 854/PT 38 H-S—<CH2>2 w Ο11 tí

N-(CH2)5. H N -(CH2)2-0-{CH2>2-0-<CH2)2-0-<CH2>2·

H 0-. ar o ir

Bisconjugado ΠΙ 26 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Exemplo 4 20 Ο bisconjugado IV ([α]ο = +50,8° (c-0,32; água)) foi preparado de acordo com o procedimento do Exemplo 3, sendo a diferença o uso de tetrassacárido 44 em vez de 31. e a aplicação de N-(benziloxicarboniloxi)-succinimidoglicina em vez de N-(benziloxicarboniloxi)-succinimida.

o | o o O (CH2)2-0 <CH2)2-0-lCH2)2-N.C.CH2N C-(CH2)5-N.Ò-<CH2)2-S- H Η H

Bisconjugado IV 2

Preparação do tetrassacárido 44 O dissacárido 29 (0,8 g) foi dissolvido em dioxano (5,3 ml), após o que foram adicionados ácido levulínico (278 mg), 1,3-diciclo-hexilcarbodiimida (494 mg) e 4-dimetil-aminopiridina (25 mg). Após 2 horas de agitação, foi adicionado éter dietílico e a mistura foi arrefecida a 0°C. Os cristais foram filtrados e o filtrado foi concentrado. O óleo residual foi purificado por cromatografia em coluna, para dar 900 mg do composto 39.

Uma solução do composto 39 (1 g) em anidrido acético (50 ml) foi arrefecida até aos -20°C. A esta temperatura e sob atmosfera de azoto, foram adicionados 10 ml de solução A, a qual tinha sido preparada por adição de 1 ml de ácido sulfurico a 98% a 20 ml de anidrido acético a -20°C. Após 2,5 horas de agitação, a reacção foi parada pela adição de acetato de sódio. Foram adicionados acetato de etilo e uma solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio à mistura reaccional fria e, após extracção, a fase orgânica foi lavada com água, seca e concentrada. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna para dar 800 mg do composto 40. O composto 40 (800 mg) foi dissolvido em tetra-hidrofurano seco (10 ml) e foi adicionada piperidina (1,3 ml) sob atmosfera de azoto. A mistura foi agitada durante 20 horas a 20°C e subsequentemente diluída com acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada

84 829 ΕΡ Ο 649 854 /ΡΤ 27 com ácido clorídrico 0,3Ν e água e seca. Após concentração da fase orgânica, o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna, para proporcionar 430 mg do composto 41. A uma solução do composto 41 (490 mg) em diclorometano (5,4 ml) foram adicionados carbonato de césio (43 mg) e tricloroacetonitrilo (0,52 ml). A mistura foi deixada durante 1 hora a 20°C. Após filtração, o filtrado foi concentrado e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna, dando 417 mg do composto 42. O composto 42 (317 mg) e o composto 29 (243 mg) foram co-evaporados duas vezes com tolueno. Foram adicionados diclorometano (7,1 ml) e peneiras moleculares pulverizados de 4À (235 mg) e a mistura foi arrefecida a -20°C. A esta temperatura foi adicionada gota a gota uma solução de trifluorometanossulfonato de trimetilsililo (8,75 μΐ) em diclorometano (2,8 ml). Após agitação durante 1 hora, a reacção foi parada pela adição de hidrogenocarbonato de sódio sólido. A mistura foi agitada durante mais 15 min, filtrada e concentrada. Após purificação por cromatografia em coluna, foram obtidos 372 mg do composto 43. O composto 43 (370 mg) foi dissolvido em piridina (1,2 ml). Uma mistura de piridina (1,2 ml), ácido acético (1,56 ml) e hidrato de hidrazina (0,18 ml) foi adicionada a 20°C e a mistura foi agitada durante 7 min. Após diluição com água e extracção com acetato de etilo, a fase orgânica foi lavada com uma solução de hidrogenocarbonato de sódio e água, seca e purificada por cromatografia em coluna, para dar 324 mg do composto 44. 28 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

2-9

Τ

*♦1

tricloro ac etonitrilo

dissacárido 29 ▼ TMSOTf

84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 29

Exemplo 5

Preparação do éster activo 52

Tetraetilenoglicol 45 (10 g) foi dissolvido em tetra-hidrofurano seco (150 ml) e foi adicionado hidreto de sódio (dispersão a 60% em óleo mineral, 1,64 g) em pequenas porções a 0°C. Após 1 hora de agitação, foi adicionada uma solução de cloreto de terc-butildimetilsililo (6,18 g) em tetra-hidrofurano (20 ml) e a mistura foi agitada durante 15 min. Após 10 min de agitação, a mistura foi diluída com água e extractada com acetato de etilo. O extracto orgânico foi seco e concentrado. Cromatografia em coluna do produto em bruto proporcionou 6 g do composto 46. O composto 46 (5,0 g) foi dissolvido em tetra-hidrofurano (80 ml) e foi adicionado bromoacetato de fórc-butilo (26,2 ml). A mistura foi agitada a 50°C e, sob atmosfera de azoto, foi adicionado hidreto de sódio (1,16 g) em pequenas porções. Após uma hora de agitação, a mistura foi tratada do modo tal como descrito para o composto 46. Cromatografia em coluna do resíduo proporcionou o composto 47 (5 g).

Uma solução do composto 47 (3,1 g) numa mistura de ácido acético (25 ml), água (8,3 ml) e tetra-hidrofurano (8,3 ml) foi agitada durante 24 horas a 20°C. A mistura foi neutralizada com uma solução de hidróxido de sódio, diluída com água e extractada com acetato de etilo. Os extractos combinados foram secos e concentrados. O produto em bruto foi filtrado numa coluna de sílica gel, para proporcionar 1,52 g do composto 48. O composto 48 (1,4 g) foi dissolvido em diclorometano (12,7 ml). Foram adicionados piridina (7,7 ml) e cloreto de /j-toluenossulfonilo (1,3 g) e a mistura foi agitada durante 20 horas a 20°C. Após diluição com água, a mistura foi extractada com diclorometano. O procedimento convencional e cromatografia em coluna do produto em bruto proporcionaram 1,5 g do composto 49. 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 30

HO-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-OH

AS TBDMS-C!

TBDMS- 0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0H bromoacetato de í-butilo

O TBDMS-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2 i^ OtBu

I

remoção do grupo TBDMS

O ho-ch2-ch2-o-ch2-ch2-o-ch2-ch2-o-ch2-ch2-o-ch2

OtBu tosilacão

Tos-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH;-CH2-0-CH2-CH2-0-CH

O

OtBu tioacetato de potássio

O

AcS-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2

So OtBu tratamento ácido

O

AcS-CH2-CH2-0-CH:-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2

OH 31 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ A uma solução do composto 49 (570 mg) em acetona (20 ml) foi adicionado tioacetato de potássio (350 mg). A solução foi deixada a 20°C durante 1 hora. A mistura foi diluída com água e extractada com acetato de etilo. Após evaporação da fase orgânica e filtração numa coluna de sílica gel, foram isolados 440 mg do composto 50. O composto 50 (120 mg) foi dissolvido em diclorometano (1,5 ml) e foi adicionado ácido trifluoroacético (0,20 ml) a temperatura ambiente. Após 4 horas de agitação, a mistura foi diluída com tolueno e evaporada. O resíduo foi co-evaporado três vezes com tolueno. Cromatografia em coluna do produto em bruto proporcionou 91 mg do composto 51. O composto 51 (29,1 mg) foi dissolvido em dimetilformamida seca (1,5 ml) e foi adicionada N,N-diisopropiletilamina (12,8 μΐ). Foi adicionado tetrafluoroborato de 0-(N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametilurónio (22,3 mg) sob uma atmosfera de azoto e a mistura foi agitada durante 1,5 horas. Esta solução-mãe do éster activo 52 foi utilizada para alongamento do espaçador do composto 54·

Para a preparação do composto 54, foi seguido o procedimento do Exemplo 3 para a preparação do composto 34, sendo a única diferença a utilização do tetrassacárido 53 em vez do composto 31:

O composto 53 foi preparado de modo análogo aos procedimentos descritos por H. Lucas et al., Angew. Chem., 1993, 32(3), 434-436. Nesta referência, a preparação de um tetrassacárido (12) é mostrada no Esquema 2. Para a preparação do composto 53, o passo d) do Esquema 2 foi adaptado: foi introduzido um grupo metilo em vez de um grupo benzilo, através do uso de CH3I em vez de BnBr. Passos reaccionais posteriores para a preparação de 53 foram similares aos da preparação do tetrassacárido (12) da referida referência. O composto 54 (52 mg) foi dissolvido numa mistura de dimetilformamida (150 μΐ) e água (150 μΐ). Foi adicionada 4-metilmorfólina (50 μΐ) e após 5 min de agitação, foi adicionada a solução-mãe do éster activo 52. Após 1 hora de agitação, a mistura foi evaporada e o resíduo foi purificado numa coluna Rp-18 (água:metanol = 7:3 v/v), para dar 48 mg do composto 55. 32 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ Ο composto 55 (48 mg) foi co-evaporado duas vezes com dimetilformamida, seco e dissolvido em dimetilformamida seca (2,1 ml). Foi adicionado sulfotrióxido de trietilamina (312 mg) sob atmosfera de azoto e a mistura foi agitada de um dia para o outro a 50°C, após o que foi adicionada uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio. A mistura foi agitada durante 1 hora a temperatura ambiente, concentrada até um pequeno volume e dessalinizada numa coluna Sephadex G-25. O produto isolado foi eluído com água numa coluna Dowex WX8 Na+, para dar 73 mg de um derivado de pentassacárido sulfurado. Este composto foi tratado com uma solução de ácido clorídrico 0,2N (2,0 ml). Após neutralização, a mistura foi dessalinizada numa coluna Sephadex G-25, para dar 57 mg do composto 56. O composto 56 (50 mg) foi dissolvido em 10,7 ml de uma solução de hidroxilamina em tampão, (para obter esta solução, o sal de hidroxilamina.ácido clorídrico (174 mg) foi dissolvido em 100 ml de uma solução de di-hidrogenofosfato de sódio 0,1M, e o pH foi ajustado a 7,5 com uma solução de hidróxido de sódio 4N). A mistura reaccional foi agitada durante 90 min a 20°C, depois o pH foi levado a 8,5 e a mistura foi agitada durante outras 24 horas. Após dessalinização e purificação da mistura numa coluna Sephadex G-50, foram isolados 40 mg de bisconjugado V puro. [a]D20 = +42,9° (c=l; água).

ío-ch2-ch1)3-o-ch2ch1-nh2 5j4

▼

| sulfuração j t

I

tratamento com hidroxilamina 1

bisconjugado V 34 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Exemplo 6 Ο bisconjugado VI foi preparado de um modo análogo ao descrito para o bisconjugado V, sendo a única diferença o uso de tetrassacárido 57 (que é o tetrassacárido (12) de H. Lucas et al., Angew. Chem., 1993, 32(3), 434-436) em vez do composto 53. [a]D20 = +31,6° (c=0,82; água).

(0-CH2-CH2)3-0-CH2-CH2-NH.C(0)-CH2-<0-CH2-CH2>3-(X:H2-CH2-S.

Bisconjugado VI 2 35 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Exemplo 7

Para a preparação do bisconjugado VII, foi seguido o procedimento do Exemplo 5, sendo a diferença ter sido utilizado o composto 89 em vez do monoconjugado 54. O composto 89 foi preparado de acordo com os procedimentos para a preparação do composto 34 (tal como descrito no Exemplo 3), usando o composto 60 em vez do monossacárido 24. [a]D20 = +66,6° (c=0,5; água).

2

Bisconjugado VII

Preparação do composto 60

Composto 58 (29 g) e iodometano (15,5 ml) foram dissolvidos em dimetilformamida (50 ml). A solução foi adicionada gota a gota a uma suspensão de hidreto de sódio (10,5 g) em dimetilformamida a 20°C. A mistura foi agitada durante 16 horas e o excesso de hidreto de sódio foi eliminado com metanol. Foi adicionada água e a mistura foi extractada com acetato de etilo. Após concentração, foram isolados 25 g do composto 59. O composto 59 (44 g) foi dissolvido em diclorometano (90 ml) e foi adicionado trietilsilano (92 ml). Foi adicionada gota a gota uma mistura de ácido trifluoroacético (44 ml) e anidrido trifluoroacético (0,9 ml) e a mistura foi agitada durante 1 hora a 20°C. A reacção foi éxtinta com uma solução fria de hidrogenocarbonato de sódio, extractada com acetato de etilo, seca e concentrada. C.romatografia em sílica gel do produto proporcionou 31 g do composto 60. 36 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

I 2g abertura de 4,6-benzilideno

(x>

Exemplo 8 O monossacárido 69 foi preparado como segue: A uma solução de 1,6-anidromanose 61 (19,1 g) em acetona (75 ml) e 2,2-dimetoxipropano (75 ml), foi adicionado ácido canforsulfónico (200 mg). A mistura reaccional foi agitada de um dia para o outro. Foi adicionada trietilamina e o solvente foi evaporado. Foi adicionado diclorometano ao resíduo, os sais foram removidos por filtração e o filtrado foi evaporado até à secura. Cromatografia em coluna do produto em bruto proporcionou 15 g do composto 62. O composto 62 (3,0 g) e di-p-tosilato de tetraetilenoglicol foram dissolvidos em tetra-hidrofurano (250 ml). A mistura foi aquecida a 60°C e foi adicionado hidreto de sódio (900 mg) sob atmosfera de azoto. Após 30 min de agitação, a mistura foi concentrada e purificada por cromatografia em coluna, para dar 3,9 g do composto 63 em bruto.

84 829 ΕΡ Ο 649 854 /ΡΤ 37 Ο composto 63 (3,9 g) foi dissolvido em tetra-hidrofurano (25 ml) e foi adicionada N-metilbenzilamina (1,95 ml). A mistura foi aquecida a temperatura de refluxo durante 30 min e concentrada para proporcionar 5,0 g do composto 64 em bruto. O composto 64 em bruto (5,1 g) foi dissolvido em 30 ml de metanol:ácido clorídrico IN 9:1 v/v, e a mistura foi agitada durante 5 horas a 85°C. Após arrefecimento, foi adicionada piridina (50 ml) e a solução foi concentrada para dar o composto 65 em bruto. O composto 65 em bruto foi dissolvido em 75 ml de piridina:anidrido acético 2:1 (v/v); foi adicionado 4-dimetilaminopiridina (25 mg) e a mistura foi agitada durante 4 horas a temperatura ambiente. A mistura foi diluída com tolueno e evaporada. O resíduo foi dissolvido em acetato de etilo e foi adicionado ácido clorídrico diluído. Após extracção a fase aquosa ácida foi levada a pHIO com uma solução de hidróxido de sódio e extractada outra vez com acetato de etilo. A fase orgânica foi seca e concentrada. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna, para proporcionar 1,86 g do composto 66. O composto 66 (1,86 g) foi dissolvido numa mistura de anidrido acético (45 ml) e ácido trifluoroacético (3,8 ml). A solução foi agitada durante 60 horas a 20°C e foi então diluída com tolueno. Após concentração, o resíduo foi dissolvido em acetato de etilo e lavado com hidrogenocarbonato de sódio. A fase orgânica foi seca e concentrada. Cromatografia em coluna do produto em bruto deu 0,5 g do composto 67.

Os compostos 68 e 69 foram preparados de acordo com a maneira descrita no Exemplo 3 para os compostos 27 e 28, respectivamente. 38 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

N-metilbenzilainina

(Ò-OHi-CH-i)vO-CH->-CH-i-N(CHi)Bn anidrido acético •4-

anidrido acético ácido Iriíluoroacético

OV . saponincação OAc OaV^0^ -► V

OH CO-CH;-CH:)yO-CH;-CH;-N.Otj»iBn (O-a^-CHj^-O-CHj-ÇHj-HfCH ,jBn tricloroacetonitrilo

1) reacção de ligação . 2) saponificação 3) hidrogenólise ▼

1) alongamento do espaçador com éster activo 52 2) sulfuração 'f

tratamento com hidroxilamina

Bisconjugado VIII 1 40 84 829 ΕΡ0649 854/ΡΤ O composto 69 foi ligado com o tetrassacárido 57, seguido de saponificação e hidrogenólise (tal como descrito no Exemplo 3 para os compostos 32, 33 e 34. respectivamente), após o que foi obtido o composto 70. O composto 70 foi tratado com éster activo 52, seguido de sulfuração (de acordo com as preparações dos compostos 55 e 56, Exemplo 5), dando o composto 71. O composto 71 foi tratado com hidroxilamina (de acordo com a preparação do bisconjugado V a partir do composto 56, Exemplo 5), para formar o bisconjugado VIII. Nd2° = +27,3° (c=l; água).

Exemplo 9 O bisconjugado IX foi preparado de acordo com o procedimento do Exemplo 4, diferindo num ponto: em vez do imidato de glucopiranosilo 28, foi usado um análogo de imidato de manopiranosilo 69, possuindo -N3 em vez de -N(CH3)Bn na extremidade da cadeia lateral de tetraetilenoglicol. O composto contendo -N3 foi preparado por reacção do composto 63 com azida de lítio em vez de N-metilbenzilamina. Todos os outros passos reaccionais na direcção do imidato de manopiranosilo contendo azida foram similares aos da síntese de 69. [ct]D20 = +33,2° (c=0,25; água).

Bisconjugado IX

84 829 ΕΡ Ο 649 854 /ΡΤ 41

Exemplo 10

Para a preparação do bisconjugado X foi seguido o procedimento do Exemplo 9, sendo a diferença a utilização do tetrassacárido 53 em vez do tetrassacárido 57 na preparação da porção de pentassacárido. [a]D20 = +26,5° (c=l; água).

Exemplo 11 O bisconjugado XI foi preparado a partir do composto 75, de acordo com a conversão do composto 32 no bisconjugado III (Exemplo 3), sendo a diferença a aplicação de N-(benziloxicarboniloxi)sucinimidoglicina em vez de N-(benziloxicarboniloxi)succinimida. [a]D20 = +25,7° (c=0,49; água).

(O CH2 CH2>3 O <CH2)2-N11C(0)CH2NHC<0) <CH2)5 NHC(0)-CH2-CH2-S-

Bisconjugado XI 2 42 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Preparação do composto 75 214 mmol do composto 28 e 178 mmol do composto 72 (ver EP 529715, Preparação V) foram dissolvidos em 4 ml de diclorometano a temperatura ambiente, e foram adicionados 160 mg de peneiros moleculares de 4Á. Esta mistura foi agitada durante 1 hora. mistura foi então arrefecida a -20°C e foram adicionados 21,4 mmol de uma solução 40mM de trifluorometanossulfonato de trimetilsililo em diclorometano. A mistura reaccional foi agitada durante 15 minutos e depois filtrada sobre celite, subsequentemente lavada com uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio e água, e evaporada até à secura. O resíduo foi sujeito a acetólise por dissolução numa mistura de ácido trifluoroacético e anidrido acético. O produto da reacção foi tratado com benzilamina em éter dietílico e depois com tricloroacetonitrilo em diclorometano, na presença de carbonato de potássio, para se obter o composto 73 (rendimento: 50%). 0,121 mmol do composto 73 e 0,093 mmol do composto 74 (ver EP 529715, Preparação IX) foram dissolvidos em 3,2 ml de diclorometano. Na presença de peneiros moleculares e sob atmosfera de árgon, a mistura foi arrefecida a -20°C, e depois foram adicionados 0,470 ml de uma solução de trifluorometanossulfonato de trimetilsililo em diclorometano. A mistura reaccional foi agitada a -20°C durante 1 hora, após o que foi filtrada, lavada com água, evaporada e purificada numa coluna Sephadex LH-20 e depois numa coluna de sílica, para se obter o composto 75 (62%). 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 43

84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 44

Exemplo 12

Maltopentaose 76 (500 mg) foi dissolvida em 15 ml de piridinaranidrido acético = 2:1 (v/v), agitada de um dia para o outro e concentrada. Após co-evaporação com tolueno, foram obtidos 930 mg do composto 77.

As reacções 77 -» 78 -» 79 foram realizadas seguindo os procedimentos tal como descritos para a conversão de 26 —> 27 -> 28, e a subsequente reacção de ligação resultando no composto 80 foi realizada de acordo com o procedimento tal como descrito para a reacção de ligação dos compostos 28 e 31 (ver Exemplo 3). O composto 80 (300 mg) foi dissolvido em metanol seco e foi adicionada uma pequena quantidade de terc-butóxido de potássio. A mistura foi agitada de um dia para o outro. Foi adicionado Dowex H+ para neutralizar a mistura e, após filtração, o filtrado foi concentrado para dar 180 mg do composto 81. O composto 81 foi sulfurado de acordo com o procedimento tal como descrito para o composto 35 (Exemplo 3), formando o composto 82. Após hidrogenólise do composto 82, de acordo com o procedimento tal como descrito para a conversão do composto 16 em 17 (ver Exemplo 1), foi obtido o composto 83.

Preparação do bisconiugado assimétrico XII

Solução A O composto 83 (42 mg) foi dissolvido numa mistura de tampão de pH7,5 de di-hidrogenofosfato de sódio 0,1M (1,3 ml) e dimetilformamida (0,5 ml) e for adicionado 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo (7 mg). A mistura foi agitada durante 15 min.

Mistura reaccional B O monoconjugado 71 (17,5 mg) foi dissolvido em 1,7 ml de uma solução de hidroxilamina 50 mMol em tampão de pH7,5 de di-hidrogenofosfato de sódio 0,1M, sob atmosfera de árgon. A mistura foi agitada durante 1 hora, dando uma solução do composto 84. A esta solução foi adicionado 1 equivalente da solução A, sob atmosfera de árgon. A mistura foi agitada durante mais 2 horas. Durante este processo também se formou bisconjugado simétrico, o qual foi removido por tratamento com ditiotreitol. Após 30 min de agitação, a mistura foi purificada numa coluna Sephadex G-50, para dar 4,7 mg do bisconjugado assimétrico XII. [a]D20 = +40,3° (c=0,38; água). 45 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Preparação de maltopentaósido sulfurado

T

79 46 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

47 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Bisconjugado assimétrico ΧΠ 48 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Bisconjugado assimétrico XII

49 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Exemplo 13 Ο bisconjugado assimétrico XIII foi preparado de acordo com o procedimento tal como descrito para a preparação do bisconjugado XII. Em vez do pentassacárido TI, foi usado o composto análogo 85- O composto 85 foi obtido a partir da conversão do composto 89 por alongamento do espaçador com éster activo 52 e sulfuração, tal como descrito para a conversão de 54 em 56 (ver Exemplo 5). O composto 89 foi mencionado no Exemplo 7. [a]D20 = +65,4° (c=0,09; água).

50 84 829 ΕΡ Ο 649 854/ΡΤ

Bisconjugado assimétrico ΧΕΠ

84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 51

Exemplo 14 Ο maltotriósido 87 sulfurado foi preparado a partir do composto 86, de acordo com o procedimento tal como descrito para a preparação do maltopentaósido 83 a partir do composto 76 (ver Exemplo 12).

Reacção A: O composto 87 (25 mg) foi dissolvido em 1,0 ml de tampão de pH7,5 de di-hidrogenofosfato de sódio 0,1M e foi adicionado (4-iodoacetil)aminobenzoato de sulfosuccinimidilo (21 mg). A mistura foi agitada durante 30 min a 20°C e purificada numa coluna Sephadex G-15, dando 30 mg de produto.

Reacção B: O composto 85 (15 mg) foi dissolvido em 1,7 ml de uma solução de hidroxilamina 50 mMol em tampão de pH7,5 de di-hidrogenofosfato de sódio 0,1M, sob uma atmosfera de árgon. A mistura foi agitada durante 1 hora a 20°C e purificada numa coluna Sephadex G-25, dando 14 mg do composto 88. O produto obtido na reacção A e o composto 88 foram dissolvidos em 1 ml de tampão de di-hidrogenofosfato de sódio 0,1M, e agitados durante 60 horas sob uma atmosfera de árgon a 4°C. O bisconjugado simétrico foi removido por tratamento com ditiotreitol. Após 30 min de agitação, a mistura foi purificada numa coluna Sephadex G-50 para dar 13 mg do bisconjugado XIV. [a]D20 = +55,7° (c=0,46; água).

'' ' t ' t

T

53 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

{0-CH2-CH3)3-0-CH2-CH2.NH-C{0)CH2-(0-CH2-CH2)3-0-CH2-CH2-SAc

Sulfo-SIAB Bisconjugado XIV 54 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Bisconjugado assimétrico XIV

55 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Exemplo 15 Ο bisconjugado assimétrico XV foi preparado de acordo com o procedimento tal como descrito para a preparação do bisconjugado assimétrico XIV. Em vez do maltotriósido 87 foi utilizado o composto 91. O derivado de celobiose sulfurado 91 foi preparado a partir de octaacetato de celobiose 90, de acordo com o procedimento tal como descrito para a preparação do composto 83 a partir do composto 77 (Exemplo 12). [a]D20 = +51,2° (c=0,83; água).

84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Bisconjugado assimétrico XV

oso3' oso3' 57 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ

Lisboa, -5. ΜΑΙ 2000

Por ΑΚΖΟ NOBEL N.V. e SANOFI-SYNTHÉLABO - Ο AGENTE OFICIAL -

Claims

84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Bisconjugado sintonizável compreendendo dois sacáridos e um espaçador, sendo cada sacárido o mesmo ou diferentes e compreendendo duas a seis unidades monossacárido, sendo pelo menos uma unidade ácido urónico, caracterizado por pelo menos um dos sacáridos possuir actividade anti-trombótica per se, e por o espaçador ligar pelo menos um sacárido ao outro através da sua extremidade não-redutora, tendo o comprimento da cadeia do espaçador 20-120 átomos.
2. Bisconjugado de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um dos sacáridos possui per se afinidade para AT-ΠΙ e/ou HC-II e/ou possui actividade anti-factor Ha e/ou anti-factor Xa.
3. Bisconjugado de acordo com a reivindicação 2, em que ambos os sacáridos per se têm afinidade para AT-ΠΙ e/ou HC-II, e/ou têm actividade anti-factor lia e/ou anti-factor Xa.
4. Bisconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que pelo menos um dos sacáridos possui a fórmula

em que cada R é independentemente seleccionado de H, OH, 0S03.e alcoxi (C(_8); R] é independentemente seleccionado de 0S03_ e NHS03~; e as linhas onduladas denotam quer uma ligação para cima quer uma ligação para baixo, e as cargas negativas são compensadas por hidrogénio ou por um catião de metal alcalino.
5. Bisconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que pelo menos um dos sacáridos possui a fórmula ,0S03* ,0S03* COO" ,oso3* r2 oso3* 84 829 ΕΡ Ο 649 854 / ΡΤ 2/4 em que R2 é independentemente 0S03~ ou OCH3.
6. Bisconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o espaçador possui a fórmula: ={Q-NT-CO-[(CH2)n-NT-CO-(CH2)m]p-S-}2 ou ={Q-0-[(CH2)n-0]p-(CH2)m-S-}2 em que um dos dois grupos Q está ligado à extremidade não-redutora de um dos sacárídos e o outro grupo Q está ligado à extremidade redutora ou não-redutora do outro sacárido, e cada um dos grupos Q é um grupo fenileno (C6H4) ou -[(CH20)q-(CH2)r-0]s-[(CH2)t-NT-C0]u-(CH2)v, e T é independentemente hidrogénio ou alquilo (Cj.8); sendo q 0 ou 1; sendo r e t independentemente 2-4; e sendo s independentemente 1-12; sendo u e v independentemente 1-6; n é 1-8, m é 1-8, p é 1-12, e o número total de átomos é de 20-120.
7. Bisconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o espaçador possui a fórmula: ^0-NH-CO-(CH2)n^H<:0-(CH2)m^-Cli-CH2--^)-CO^lHCttí0.),o em que um dos dois grupos Φ está ligado à extremidade não-redutora de um dos sacáridos e o outro grupo Φ está ligado à extremidade redutora ou não-redutora do outro sacárido, e Φ denota um grupo fenileno (C6H4); n, m e o são independentemente 1-8, e o número total de átomos é de 20-120.
8. Bisconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o espaçador possui a fórmula:

84 829 ΕΡ Ο 649 854 /ΡΤ 3/4 em que uma das duas valências livres do espaçador está ligada à extremidade não-redutora de um dos sacáridos e a outra valência livre do espaçador está ligada à extremidade redutora ou não-redutora do outro sacárido, e T é independentemente H ou alquilo (C^g); m é independentemente 1-8; r é independentemente 2-4; s é independentemente 1-12; w é 0-10; x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; z é 0 ou 1, e o número total de átomos é de 20-120.
9. Bisconjugado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o bisconjugado possuir a fórmula seguinte, em que as cargas negativas são compensadas por hidrogénio ou um catião de metal alcalino:
10. Bisconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9 para utilização em terapia e/ou na prevenção de doenças.
11. Composição farmacêutica compreendendo como composto activo o bisconjugado de 84 829 ΕΡ Ο 649 854/ΡΤ 4/4 acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9 e auxiliares farmaceuticamente aceitáveis.
12. Utilização do bisconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9 para o fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção de desordens trombóticas e proliferação de células de músculo liso. f Lisboa, _5 m 2000 Por AKZO NOBEL N.V. e SANOFI-SYNTHÉLABO - O AGENTE OFICIAL -