FI104983B - Koivun siitepölyallergeeni P14 allergisten sairauksien diagnoosiin - Google Patents

Description

, 104983

Koivun siitepölyallergeeni P14 allergisten sairauksien diagnoosiin 1. Keksinnön ala 5 Keksintö koskee yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka koodittavat sellaisia polypeptidejä, joissa on ainakin yksi epitooppi lahkon Fagales puun P14-siitepölyallergee-nista, erityisesti koivun (Betula verrucosa), tai koko P14-allergeeniproteiinia, ja joilla nähdään sama tai salo mankaltainen antigeenisyys kuin P14-allergeenilla. Keksintö koskee myös replikoituvia mikrobiekspressiovehikkeleitä ja yksisoluisia prokaryootti- tai eukaryootti-isäntäor-ganismeja, joita voidaan käyttää tällaisten allergeenisten polypeptidien tuottomenetelmissä. Keksintö koskee edelleen 15 menetelmää sellaisen polypeptidin tuottamiseksi, jossa on ainakin yksi epitooppi P14-allergeenista. Lisäksi keksintö koskee peptidejä sisältäviä koostumuksia sekä menetelmää vasta-aineiden havaitsemiseksi.

2. Keksinnön tausta 20 Kevätaikaan suuret osat väestöstä Keski-, Itä- ja

Pohjois-Euroopassa, Amerikassa ja Australiassa kärsivät allergiaoireista (nuha, sidekalvontulehdus, dermatiitti ja siitepölyastma). Proteiinit, joita voidaan eristää lahkon Fagales puiden siitepölystä, erityisesti koivun, lepän, 25 pähkinäpensaan, valkopyökin ja tammen siitepölystä, ovat vastuussa suurimmasta osasta näitä allergiaoireita (1).

Ainakin 10 % väestöstä kärsii siitepölyallergioista eri aikoina ja eri asteisesti. Näiden allergioiden välittäjiä ovat IgE-vasta-aineet, jotka reagoivat siitepölypro-30 teiinien kanssa. Siitepölyallergioita on mahdollista hoitaa hyposensitisaatiolla, ts. allergiaa tuottavien proteiinien säännöllisellä ja hitaasti lisääntyvällä antamisel-* la.

Allergisten sairauksien diagnoosimenetelmät, kuten 3 5 RIA (radioimmunologinen määritys) , IRMA (immunoradiometri- • · t 2 104983 nen määritys), RAST (radioallergosorbenttitesti) , ELISA (entsyymiin liitetty immunosorbenttimääritys), magneettinen allergoabsorbenttitesti, immunoblottaukset, LIA (lumi-nesenssi-immunologinen määritys) , histamiinin vapautumisen 5 määritykset ja muut riippuvat suuresti puhtaiden allergeenien saatavuudesta. Luonnollisista lähteistä eristetyn siitepölyn proteiiniuutoksia on vaikea standardoida, koska preparaatit vaihtelevat valmistuserästä toiseen. Esimerkiksi ne voivat sisältää ei-toivottuja ainesosia, ja/tai 10 tiettyjä proteiineja voi kadota uuttomenettelyssä ja puuttua lopullisesta preparaatista (2). Diagnostiset testit, joissa käytetään hyvin määriteltyjä allergeeneja, joita voidaan valmistaa toistettavasti, selvästi olisivat parempia kuin testit, joissa käytetään siitepölyn raakauutok-15 siä, joissa on riittämättömästi määritelty seos allergeeneja ja muita komponentteja. Allergeenisten polypeptidien tai niiden allergeenisten fragmenttien yhdistelmä-DNA-tuotanto mahdollistaisi sellaisten allergeenipreparaattien toistettavamman valmistuksen, joiden sisältö on määritel-20 ty, standardoituihin diagnoosimenetelmiin.

Allergeeneja voidaan puhdistaa homogeenisiksi tunnetuilla proteiinikemiallisilla menetelmillä, esimerkiksi affiniteettikromatografiällä (3) . Nämä menetelmät ovat suhteellisen kalliita, ja vaativat siitepölyä huonosti 25 määriteltynä lähteenä, jota ei voi standardoida. Siksi olisi halvempaa ja tehokkaampaa käyttää yhdistelmä-DNA-menetelmiä allergeenisen proteiinin tai sen proteiinin fragmenttien tuottamiseksi.

3. Keksinnön yhteenveto 30 Tämä keksintö liittyy siitepölyallergeeneihin, esi- .. merkiksi rauduskoivun (Betula verrucosa), joita kutsutaan P14:ksi. Nämä siitepölyallergeenit ovat immunologisesti läheistä sukua allergeeneille, joita esiintyy kaukaista sukua olevien kasvilajien siitepölyssä, erityisesti lahkon 35 Fagales puissa (koivu, leppä, pähkinäpensas, valkopyökki • · · * i 3 104983 ja tammi), heinissä ja rikkaruohoissa. Potilaiden IgE-vas-ta-aineiden ristireaktiivisuutta näille siitepölyallergee-neille havainnollistetaan kuvioissa IA ja IB.

Tämä keksintö tuo käytettäviksi yhdistelmä-DNA-mo-5 lekyylejä, joille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Ne sisältävät nukleotidisekvens-sin, joka koodittaa polypeptidiä, jolla nähdään samat tai samankaltaiset antigeeniset ominaisuudet kuin luonnollisella allergeenilla P14, joka esiintyy lahkon Fagales 10 puissa ja muissa siitepölyä tuottavissa kasveissa, tai polypeptidiä, joka käsittää ainakin yhden epitoopin tällaisista allergeeneista. Tässä esitetään P14-allergeenin täydellinen cDNA-sekvenssi ja siten täydellinen päätetty aminohapposekvenssi. Mainittu nukleotidisekvenssi sisältää 15 (a) nukleotidisekvenssit, jotka hybridisoituvat tällaisen DNA-sekvenssin kanssa vaativissa olosuhteissa ja kooditta-vat polypeptidiä, jossa on ainakin yksi P14-allergeenin epitooppi, ja (b) nukleotidisekvenssit, jotka voidaan johtaa tällaisista allergeenisista polypeptideistä geneetti-20 sen koodin degeneroituneisuuden perusteella. Tämä nukleotidisekvenssi voidaan ekspressoida P14-allergeenina tai polypeptidinä, joka käsittää ainakin yhden epitoopin siitä. Edullisessa suoritusmuodossa tämä cDNA-sekvenssi sisältää koko sekvenssin tai osia sekvenssistä, joka esite-*. 25 tään sekvenssiluettelossa SEQ ID nro 2:na.

Mitä niiden IgE:n sitomiseen tulee, koivun, lepän, pähkinäpensaan, valkopyökin, tammen, heinien ja rikkaruohojen siitepölyissä on samankaltaisia allergeeneja kuin P14-allergeeni. Siksi tämä keksintö ei liity vain koivun 30 P14-allergeeneihin, vaan myös muiden lajien P14-siitepöly- 1 allergeeneihin, joita koodattavat sellaiset DNA-sekvens- • « sit, jotka pystyvät hybridisoitumaan koivun P14-allergee-nin nukleotidisekvenssin kanssa vaativissa olosuhteissa tai jotka voidaan johtaa tällaisesta polypeptidiallergee-35 nista geneettisen koodin degeneroituneisuuden perusteella.

4 104983

Polynukleotidin hybridisaatio toisen polynukleotidin kanssa vaativissa olosuhteissa vaatii ainakin 60 % identtisyyttä nukleiinihappotasolla tällaisten polynukleotidien välillä.

5 Tällaisiin vaativiin olosuhteisiin kuuluu, että hybridisoidut nitroselluloosasuodattimet pestään seuraavasti:

(a) DNA/DNA- ja DNA/RNA-hybridisaatioille: 55 °C

lämpötila, suolakonsentraatio 150 mM NaCl ja 15 mM Na3-sit- 10 raatti x 2H20, pH:ssa 7,0, ja SDS-detergenttiä (natriumdo-dekyylisulfaattia) pitoisuutena 0,1 % (w/v).

(b) Oligodeoksinukleotidi/DNA-hybridisaatioille: 55 °C lämpötila, suolakonsentraatio 1 M NaCl ja 10 mM Na3-sitraatti x 2H20, pH:ssa 7,0, ja SDS-detergenttiä (natrium- 15 dodekyylisulfaattia) pitoisuutena 0,5 % (w/v). Tässä yhteydessä "oligodeoksinukleotidi" viittaa yksijuosteisen DNA:n oligomeeriin, joka on pituudeltaan enintään 100 nukleotidia .

Lisäksi tämä keksintö tuo käytettäväksi ekspressio-20 plasmideja, joille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 3 esitetään ja jotka sisältävät edellä kuvatun mukaisen nukleotidisekvenssin. Keksinnön mukaisille isän-täorganismeille, jotka pitävät sisällään näitä ekspres-sioplasmideja, on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuk-25 sessa 4 esitetään.

Tämä keksintö tuo myös käytettäviksi koostumuksia, joille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa 7 ja 8 esitetään. Koostumukset sisältävät sellaisia synteettisiä polypeptidejä, joilla nähdään koivun P14-allergeenin 30 osien tai koko allergeenin tai muiden kasvien sellaisten allergeenien osien tai koko allergeenin antigeenisyys, * · joilla johtuen korkea-asteisesta (ainakin 50 %) aminohap-' pohomologiasta nähdään antigeeninen ristireagoivuus osan koivun P14-allergeenia tai koko allergeenin kanssa, ts. 35 vasta-aineet tai solun antigeeninsitomiskohdat, jotka ovat , 104983 varsinaisesti koivun P14-allergeenia kohtaan suunnattuja, kykenevät yhtä lailla sitoutumaan näihin molekyyleihin. Näihin synteettisiin polypeptideihin kuuluvat fuusio- ja ei-fuusiopolypeptidit, jotka sisältävät sellaisen polypep-5 tidiosan, jolla on osan P14-allergeenia tai koko allergeenin antigeenisyys. Menetelmälle tällaisten synteettisten polypeptidien tuottamiseksi on ominaista se, mitä patenttivaatimuksessa 6 esitetään. Tällöin viljellään prokary-ootti- tai eukaryootti-isäntäorganismeja, jotka sisältävät 10 edellä kuvatun ekspressioplasmidin, ja puhdistetaan synteettinen polypeptidi(t) viljelmästä.

Termi "synteettinen" sisältää tässä vaihtoehtoisesti polypeptidit, jotka on valmistettu kloonaamalla ja eks-pressoimalla tässä kuvattuja nukleotidisekvenssejä tai 15 näiden nukleotidisekvenssien koodittamien polypeptidisek-venssien kemiallisella synteesillä.

Synteettisillä polypeptideillä, jotka on tuotettu tämän keksinnön mukaisesti, nähdään sama tai samankaltainen antigeenisyys kuin natiivilla allergeenilla. Kuten 20 edempänä näytetään, koivun P14:ä koodittavaa cDNA-kloonia voidaan käyttää tuotettaessa ei-fuusiopolypeptidi, joka reagoi IgE:n kanssa allergisten henkilöiden seerumissa. Siksi on mahdollista käyttää tätä polypeptidiä antigeeninä diagnostisissa testeissä (kuten RAST, ELISA, immunoblot- ·. 25 taukset ja muut, jotka tunnetaan alalla ja joihin on edel lä viitattu). Keksinnön mukaiselle menetelmälle vasta-aineen valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 9 esitetään.

Erityisesti synteettisiä allergeenejä voidaan käyt-30 tää diagnostisina reagensseina in vitro ja in vivo, koska niiden antigeenisyys vastaa natiivien P14-siitepölyaller- • * geenien antigeenisyyttä, ja siksi ne pystyvät sitomaan P14-siitepölyallergiasta kärsivien henkilöiden seerumin IgE:tä.

♦ 6 104983

Siksi eräs tämän keksinnön tarkoituksista on tuoda käytettäväksi menetelmä siitepölyallergeenien valmistamiseksi, erityisesti koivun P14-allergeenien, jotta tämä allergeeniperhe olisi saatavilla diagnostisiin testeihin 5 vastaavan allergian havaitsemiseksi.

Lisäksi, kuten edempänä näytetään, koivun P14:n cDNA:ta ekspressoitiin kahdessa prokaryoottiekspressiosys-teemissä Escherichia colissa. ja ekspressoitujen polypep-tidien, fuusioproteiinin ja ei-fuusioproteiinin, kyky si-10 toa IgE:tä osoitettiin. Tämä ekspressio voidaan saada aikaan myös missä tahansa muussa mikro-organismissa (esim. eukaryoottisoluissa) . IgE:n sitomiskyky osoitettiin myös osittaiselle sekvenssille, joka ekspressoitiin lambda gtll:tä käyttäen β-galaktosidaasifuusioproteiinina. Tällä 15 tavoin osoitettiin, että tämä osittainen sekvenssi vastaa ainakin yhtä IgE:tä sitovaa epitooppia. Lisäksi IgE-im-munoblottausten, risti-inhibitiokokeiden, kliinisten kokeiden ja "Northern"-blottausten (RNA-blottausten) tuloksista (4-9) (kuviot IA, IB ja 3) voidaan päätellä, että 20 homologisia IgE:tä sitovia proteiineja esiintyy toisilleen läheistä sukua olevien lahkon Fagales puiden siitepölyssä ja kaukaista sukua olevissa siitepölyä tuottavissa kasveissa. Tästä syystä tämä keksintö tuo käytettäviksi poly-peptidejä, joilla nähdään sama tai samankaltainen anti-25 geenisyys kuin niille sukua olevilla koivun, lepän, päh-kinäpensaan, valkopyökin, tammen, heinien ja rikkaruohojen P14-siitepölyallergeeneilla.

Sellaisten proteiinien, joiden sekvensseillä on homologiaa koivun P14:n kanssa, tietokonehaussa saatavana 30 olevista sekvenssitietopankeista (EMBL, MIPSX, Swissprot) paljastui merkitsevä homologia P14:n ja erään sellaisen solun tukirangan proteiinin (profiliinin) välillä, joka esiintyy joukossa eukaryootteja (10-14) (kuvio 5) . Tämä homologia tuo esille mahdollisuuden, että potilaiden IgE- 7 104983 vasta-aineet ristireagoivat ihmisen profiliinin kanssa. Tämä autoreaktiivisuus on osoitettu (kuvio 12).

' Tällä tavoin on tuotu käytettäväksi molekyylisys- teemi, jossa voidaan testata hypoteesia: onko autoimmuuni-5 mekanismeilla osuutta allergisissa ja atooppisissa sairauksissa. Ensimmäiset tulokset osoittavat, että potilaat, joiden IgE-vasta-aineet reagoivat P14:n kanssa, edustavat ryhmää, jotka kärsivät allergiaoireista suuren osaa vuotta ja joilla ei ole tyydyttävää vastetta immunoterapialle tai 10 tavanomaiselle hoidolle. Tästä seuraa, että P14:ä tai sellaisia rekombinantteja tai kemiallisesti syntetisoituja IgE:tä sitovia polypeptidejä, joiden sekvenssit vastaavat P14:n cDNA:sta pääteltyä sekvenssiä, voidaan käyttää tietyn multivalenttien allergikkojen ryhmän karakterisointiin 15 sekä myös arvioitaessa ennustetta hyposensitisointihoidol-le.

Lisäksi tässä tuodaan esille tehokas menetelmä sii-tepölyproteiinin sekä myös rekombinantin tai synteettisen P14-polypeptidin tai sen allergeenisten fragmenttien tuot-20 tamiseksi ja puhdistamiseksi. Puhdistusmenetelmä perustuu profiliinipolypeptidien affiniteettiin poly(L-proliinia) kohtaan (15, 16) ja siihen, että tämän keksinnön keksijät ovat osoittaneet homologian profiliinien ja P14-allergee-nien välillä. Koska siitepölyproteiinien ja rekombinantin 25 P14:n sitoutuminen poly(L-proliiniin) on osoitettu tässä (kuviot 8, 9 ja 10), siten on tuotu käytettäväksi menetelmä tämän allergeenin immobilisoimiseen (ja affiniteet-tierotukseen). Niinpä tiettyjä diagnostisia testejä voidaan pystyttää (esimerkiksi poly(L-proliinia) voidaan 30 käyttää vasta-aineen sijasta profiliinin sitomiseen ELISA- määrityksissä). Koska on olemassa viitteitä siihen, että • « potilaat, jotka kärsivät autoimmuunitaudeista, muodostavat vasta-aineita P14:ä vastaan, tätä polypeptidiä tai homologisia polypeptidejä voidaan käyttää näiden tautien diag-35 noosiin.

* 8 104983 4. Kuvioiden lyhyt kuvaus

Seuraavat kuviot ja kuvaus auttavat ymmärtämään keksinnön alaa ja kattavuutta.

Kuvio IA: IgE-immunoblottaus: Siitepölyproteiineja 5 koivusta (B), valkopyökistä (CA), lepästä (A) ja pähkinä-pensaasta (C) erotettiin 12,5 %:isella polyakryyliamidi-elektroforeesilla ja blotattiin nitroselluloosalle. Nit-roselluloosa leikattiin liuskoiksi (1-5), joita inkuboi-tiin valitun potilaan, jonka IgE-vasta-aineet tunnistivat 10 tärkeimmät koivun siitepölyallergeenit, seerumin laimennosten (vastaavasti 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80) kanssa.

Nuolet ja tähdet osoittavat molekyylipainoja. Sitoutunut seerumin IgE havaittiin siihen sitoutuneen 125I-leimatun, kanissa tuotetun ihmisen IgE:n vastaisen vasta-aineen au-15 toradiografiän avulla. Koivun, lepän, pähkinäpensaan ja valkopyökin IgE:tä sitovat proteiinit vastasivat toisiaan, mikä osoittaa antigeenien samankaltaisuuden.

Kuvio IB: IgE:n immunoblottauksen inhibitio: pujon profiilini, joka oli puhdistettu poly(L-proliini)-affini-20 teettikromatografiällä, oli blotattu nitroselluloosalle polyakryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen. 1:10 laimennosta koivun profiliinille allergisen potilaan seerumista esi-inkuboitiin kaistalla 1 E. colin kontrolliproteiinien kanssa, kaistalla 2 rekombinantin koivun profiliinin kans-25 sa, kaistalla 3 Phleum oratensen (heinäkasvi) puhdistetun profiliinin kanssa ja kaistalla 4 puskurin kanssa (negatiivinen kontrolli), ja sitä käytettiin pujon profiliinin detektioon. Potilaan IgE:n sitoutuminen pujon profiliiniin voitiin estää rekombinantilla koivun profiliinilla ja puh-30 distetulla heinäkasvin profiliinilla, mikä osoittaa yhteisiä IgE: n sitomisominaisuuksia näiden toisilleen sukua olevien proteiinien kesken. Kontrollikaistoilla 1 ja 4 tapahtuu potilaiden IgE:n sitoutumista pujon profiliiniin.

Kuvio 2: IgE-immunoblottaus: Proteiinit erotettiin 35 7,5 %:sen polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla ja t Ϊ 9 104983 blotattiin nitroselluloosalle. Kaista B: koivun siitepölyn proteiinit; kaista 1: proteiinit E. coli Y1089:stä (lyso-geeninen isäntä); kaista 2: proteiinit E. coli Y1089:stä, joka on inokuloitu lambda gtll-faagilla, jossa ei ole in-5 serttiä; kaista 3: proteiinit E. coli Y1089:stä, joka on inokuloitu rekombinanttifaagilla, joka sisältää koivun siitepölystä peräisin olevan cDNA:n, joka koodittaa IgE:tä sitovaa polypeptidiä (positiivinen kontrolli); kaista 4: proteiinit E. coli Y1089:stä, joka on inokuloitu rekom-10 binanttifaageilla, jotka sisältävät P14 cDNA:n 3'-pään osuuden, joka koodittaa IgE:tä sitovaa epitooppia (kuviossa 4 alleviivatun mukaisesti); kaista 5: proteiinit hiivasta (Saccharomvces cerevisiae). Rekombinantit β-galak-tosidaasifuusioproteiinit, joilla oli IgE:n sitomiskykyä, 15 ja joiden molekyylipainot olivat välillä 115 - 130 kDa (kaistat 3 ja 4) havaittiin 125I-leimatun, kanissa tuotetun ihmisen IgE:n vastaisen vasta-aineen avulla. Vastaavaa IgE:n sitoutumista ei tapahdu kaistoilla 1, 2 ja 5, kun taas kaistalla B nähdään potilaan IgE:n sitoutumisprofiili 20 koivun siitepölyproteiinien kanssa.

Kuvio 3: "Northern"-blottaus (RNA-blottaus): 10 μg lepän (kaista A) , koivun (kaista B) ja pähkinäpensaan (kaista C) siitepölyn RNA:ta ja markkerina E. colin RNA:ta (kaista M) blotattiin nitroselluloosalle. Kuviossa 4 alle- ·. 25 viivattu osa P14:n cDNA-.sta hybridisoituu lepän, koivun ja pähkinäpensaan siitepölyn mRNA.-n kanssa, ja vaativissa olosuhteissa (0,75 x SSC, 0,1 % SDS, 50 °C) tuottaa signaalin 800 emäksen kohdalla (osoitettu nuolella). Ribo-somaalisten vyöhykkeiden paikat on osoitettu "28S":llä ja 30 "18 S":11ä.

Kuvio 4: koivun P14:n cDNA-sekvenssi. Koodittava • · alue alkaa ATG:llä (nukleotidit 80-82) ja loppuu pysäytys-kodoniin TAG (nukleotidit 479-481) . Päätelty aminohappo-sekvenssi esitetään DNA-sekvenssin alla. P14:n sekvenssi, 35 joka fuusioproteiinissa pystyy sitomaan potilaiden IgE:tä, % 10 104983 ja joka siksi edustaa ainakin yhtä epitooppia, näytetään alleviivattuna (ks. kappale 5.4).

Kuvio 5: Koivun P14:n johdetun aminohapposekvenssin vertailu ihmisen (13), vasikan (14) , hiiren (12), hiivan 5 (11) ja Acanthamoeban (10) profiliinien aminohapposekvens sien kanssa. Identtiset aminohappotähteet on merkitty. Identtisten aminohappotähteiden prosenttiosuus koivun P14-proteiinin ja homologien välillä on 30 % ihmisen proteiinin kohdalla, 28 % vasikan ja hiiren homologisisten pro-10 teiinien kohdalla, 26 % hiivan proteiinin kohdalla ja 25 % Acanthamoeban proteiinin kohdalla.

Kuvio 6: Polyakryyliamidigeelin "Western"-blottaus (proteiiniblottaus), jossa on käytetty koettimina IgE-vas-ta-aineita potilaista, joilla on puiden siitepölyallergia. 15 Kaista 1: proteiinit E. coli JM105:stä, jossa ei ole mitään plasmidia; kaista 2: proteiinit E. coli JM105:stä, jossa on plasmidi pKK223-3 ilman inserttiä; kaistat 3 ja 4: proteiinit E. coli JMl05:stä, jossa on se pKK223-3:sta johdettu plasmidi, joka ekspressoi insertoidun cDNA:n P14-20 proteiinia ei-fuusioproteiinina; kaista 5: E. coli AR58:n proteiinit; kaista 6: E. coli AR58, jossa on plasmidi pEXB ilman inserttiä; kaistat 7 ja 8: uutokset E. coli AR58:sta, joka on transformoitu sellaisella pEXB:stä johdetulla plasmidilla, joka ekspressoi P14:n cDNA:ta fuusio-25 proteiinina; kaista 9: koivun siitepölyproteiiniuutos (positiivinen kontrolli).

Kuvio 7: Useiden allergisten potilaiden seerumeista testattiin niiden IgE-reaktiivisuus pKK233-3:ssa ekspres-soidun rekombinantin P14:n suhteen. Potilailla (kaistat) 30 D, E, F, I, JjaP nähdään IgE:n sitoutuminen rekombinant-tiin P14:ään. Kaista R on yhdistetty seerumi ei-allergi-sista yksilöistä. Rekombinantti-P14:ää ei puhdistettu, ja siksi nähtiin potilaiden IgE:n reaktiivisuus E. colin proteiinien kanssa.

j . .

11 104983

Kuvio 8: Coomassie-värjätty polyakryyliamidigeeli. Kaista M: molekyylipainomarkkeri; kaista 1: koivun siitepölyn kokonaisproteiinit; kaista 2: koivun siitepölyn proteiinit, joista P14 oli poistettu affinitteettimenetelmäl-5 lä (pidättymätön fraktio); kaistat 3, 4 ja 5: eluoitu P14. Proteiinit pantiin geelille ja värjättiin liikkuvuuden ilmaisemiseksi. Kuten voidaan nähdä kaistoilta 3, 4 ja 5, P14 voidaan puhdistaa affiniteettikromatografiällä poly (L-proliini) -sepharosella.

10 Kuvio 9: IgE-immunoblottaus: Proteiinikoetin, joka oli saatu samalla tavalla kuin kuviossa 8, siirrettiin nitroselluloosalle ja inkuboitiin sellaisen potilaan seerumin IgE:llä, joka tunnistaa useimmat koivun siitepölyal-lergeenit. Kaistat 1-5 sisältävät saman materiaalin kuin 15 kuviossa 8; kaista 6 sisältää molekyylipainomarkkerin. Tämä immunoblottaus osoittaa, että koivun profiilini voidaan puhdistaa näennäisen homogeeniseksi muista allergeeneista .

Kuvio 10: Coomassie-vär jätty polyakryyliamidigeeli . 20 Kaista M: molekyylipainomarkkeri; kaista 1: kokonaisproteiinit E. coli JM105:stä, jossa on pKK233-3:sta johdettu plasmidi, joka ekspressoi P14:n cDNA:ta; kaista 2: proteiinifraktio rekombinantti-P14:n affiniteettikromatogra-fialla poly(L-proliini)-sepharosella poistamisen jälkeen; ·. 25 kaistat 3 ja 4: puhdistettu rekombinantti-P14 - eluoidut fraktiot.

Kuvio 11: Coomassie-värjätty polyakryyliamidigeeli . Kaista M: molekyylipainomarkkeri; kaista 1: kokonaisproteiinit E. coli JM105:stä, jossa on plasmidi pKK233-3 ilman 30 inserttiä; kaista 2: proteiinifraktio poly(L-proliini)- puhdistuksen jälkeen; kaistat 3, 4 ja 5: eluoidut fraktiot. Nämä tulokset osoittavat, että ekspressiosysteemistä, jossa ei ole inserttiä, ei voida eristää proteiinia, jolla on P14:n kanssa samankaltaiset ominaisuudet.

12 104983

Kuvio 12: IgE-immunoblottaus: Puhdistettua ihmisen profiliinia ladattiin 12 %:iselle polyakryyliamidigeelille ja blotattiin nitroselluloosalle. Nitroselluloosasta leikattiin liuskoja, ja niitä inkuboitiin seuraavasti: Liuska 5 1 inkuboitiin sellaisen potilaan seerumin IgE:n kanssa, joka tunnisti paitsi P14:n ja koivun pääallergeenin, Bet v I:n, allergeeneja molekyylipainovälillä 30 - 90 kDa. Liuska 2 inkuboitiin sellaisen potilaan seerumin IgE:n kanssa, joka tunnisti vain P14:n koivun siitepölyuutoksissa,· lius-10 ka 3 inkuboitiin sellaisen potilaan seerumin IgE:n kanssa, jonka seerumin IgE kohdistui vain Bet v I:tä vastaan; liuska 4 inkuboitiin punkeille allergisen potilaan seerumin kanssa; liuska 5 ei-allergisten luovuttajien ryhmän seerumin kanssa, ja liuskassa 6 nähdään puskurikontrolli. 15 IgE:n sitoutuminen havaittiin 125I-leimatun, kanissa tuote tun ihmisen IgE:n vastaisen vasta-aineen avulla. Risti-reaktiivisuus nähtiin liuskoissa 1 ja 2. Nämä koetulokset osoittavat, että seerumin IgE, joka reagoi koivun siitepölyn kanssa, ristireagoi myös ihmisen profiliinin kanssa. 20 Kuvio 13: IgE-inhibitio:

Puhdistettua sellerin profiliinia pantiin SDS-PAGE:en, blotattiin nitroselluloosalle (1 μg/cm). Nitro-selluloosaliuskoja inkuboitiin 1:10 laimennosten kanssa seerumeista, jotka olivat koivun profiliinille allergisis-25 ta potilaista (kaistat 1-3), koivun pääallergeenille Bet v I mutta ei profiliinille allergisista potilaista, ei-allergisen henkilöiden yhdistetyn seerumin (kaista 4) ja puskurin kanssa seerumia lisäämättä (kaista 5). Seeru-milaimennoksia esi-inkuboitiin 5 Mg:n rekombinanttia koi-30 vun profiliinia (rP) , 5 jng:n BSA:ta (BSA) ja seerumilai-mennuspuskurin (P) kanssa. Potilaiden 1-3 IgE:n sitoutuminen sellerin profiliiniin voidaan estää puhdistetulla re-kombinantilla koivun profiliinilla, mikä viittaa yhteisiin IgE-epitooppeihin koivun ja sellerin profiliinissa.

35 » « i .j 13 104983

Kuvio 14: Immunoblottaukset:

Kanin sellerin profiliinin vastainen vasta-aine (R: kaista 1) tunnistaa puhdistetun sellerin profiliinin (C) ja rekombinantin koivun profiliinin (rP) . Rekombinantti 5 koivun profiilini sitoo myös potilaiden IgE:tä (IgE: kaista 1) . Sitoutumista ei nähdä kaistalla 2 (puskurikontrol-li, johon ei ole lisätty vasta-ainetta tai seerumia).

Kuvio 15: Immunoblottaukset:

Puhdistettu profiilini rukiista (Secale cereale S) 10 ja pujosta (Artemisia vulgaris M) sitoo kanin sellerin profiliinin vastaista vasta-ainetta (kaistat 1) kun taas puskurikontrollissa (kaista 2) sitoutumista ei havaittu.

Sitoutunut kanin vasta-aine kuvioissa 14 ja 15 havaittiin 125I-leimatun, aasissa tuotetun, kanin vastaisen, 15 Amershamilta Yhdistyneestä kuningaskunnasta olevan vasta-aineen avulla. Sitoutunut seerumin IgE kuvioissa 13 ja 14 havaittiin 125I-leimatun, kanissa tuotetun, ihmisen IgE:n vastaisen, Pharmacialta Ruotsista olevan vasta-aineen avulla.

20 Kuvio 16: Timotein (Phleum pratense) siitepölyn profiliinin cDNA- ja päätelty aminohapposekvenssi.

Kuvio 17: Potilaiden IgE:n sitoutuminen sellaisten lambda gtll-faagien plakkikopioihin, jotka sisältävät timotein profiliinia koodittavan cDNA-insertin.

25 30:stä heinän siitepölylle allergisesta potilaasta testattiin IgE:n sitoutuminen sellaisiin lambda gtll-faa-geihin, jotka ekspressoivat timotein profiliinia, joka sidottiin nitroselluloosasektoreihin. Sektorissa 31 nähdään yhdistetty seerumi ei-allergisista yksilöistä ja sek-30 torissa 32 puskurikontrollli seerumia lisäämättä. Potilaiden 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 17, 18, 21, 23, 26, 27, • « 28, 29 ja 30 seerumin IgE sitoutui lambda gtll:n ekspres-soimaan rekombinanttiin timotein profiliiniin. Kaikilla näillä potilailla nähtiin myös IgE-reaktiivisuus koivun 35 profiliinia kohtaan. Potilailla 1, 3, 4, 5, 13, 14, 16, 1 « k · 14 104983 19, 20, 22, 24 ja 25, jotka olivat allergisia muille heinien siitepölyallergeeneille, ei nähty IgE-reaktiivisuutta timotein profiliinia kohtaan. Sitoutunut seerumin IgE havaittiin kuten kuviossa 13 on kuvattu.

5 5. Esimerkit

Keksintö voidaan ymmärtää seuraaviin esimerkkeihin viitaten: 5.1. cDNA-geenikirjaston muodostaminen

Siitepölyä (Allergon AB Engelholm, Ruotsi), jonka 10 puhtautta tutkittiin valo- ja elektronimikroskopialla, käytettiin polyadenyloidun RNA:n eristykseen (17, 18) .

cDNA:n synteesi suoritettiin oligo-dT:llä ja satunnais-alukkeilla (19, 20), cDNA:n päät digestoitiin tasaisiksi T4:n polymeraasilla ja varustettiin EcoRI-linkkereillä. 15 Linkkerit sisältävä cDNA ligatoitiin ja pakattiin defosfo-ryloituihin lambda gtll:n käsivarsiin (21). 800 000:n itsenäisen kloonin geenikirjasto tuotettiin.

5.2. cDNA-geenikirjaston seulonta

Koivun siitepölyn cDNA-geenikirjaston IgE-seulonta 20 suoritettiin kuvatun mukaisesti (22) . IgE:tä sitovia klooneja rikastettiin, ja niistä valmistettiin faagi-DNA:ta (23). Insertit leikattiin irti EcoRI:llä. ja fragmentit alikloonattiin plasmidiin pUC18 (24). Saatiin kloonin DNA-sekvenssi (25). Vaikka se oli täydellinen 31-päässä (poly-25 A-häntä), siitä puuttui osa 5'-päätä, mukaan luettuna myös t aloituskodoni. Tämä osittainen sekvenssi on alleviivattu kuviossa 4. Siksi alkuperäinen geenikirjasto seulottiin uudestaan oligodeoksinukleotideilla, jotka olivat komplementaarisia koodittavalle alueelle (26), ja kaksi toisis-30 taan riippumatonta kloonia saatiin.

5.3. RNA-blottaukset ("Northern"-blottaukset) 10 μg kokonais-RNA:ta lepän, koivun ja pähkinäpen-saan siitepölystä eroteltiin denaturoivan geelielektrofo-reesin avulla ja blotattiin nitroselluloosalle (27, 28) .

35 P14:n cDNA-koetin, kuviossa 4 alleviivatun mukainen, 2 2 > * ) * · 15 104983 32P leimattiin satunnaisalukkeiden käytön avulla (29) . Esi-hybridisaatio ja hybridisaatio suoritettiin standardi-menetelmin (23). Blotteja pestiin liuoksella 0;75x SSC (20x SSC = 3 M NaCl, 0,3 M Na-sitraatti, pH 7,0), 0,1 % 5 SDS (natriumdodekyylisulfaatti) , 50 °C:ssa ja tehtiin au-toradiografia (Hyperfilm MP, Amersham, Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta).

5.4. Koivun P14:n cDNA:n ekspressio 5.4.1. cDNA:n 3'-pään ekspressio lambda gtll-faa- 10 geissa (kuvio 2)

Epätäydellinen cDNA-klooni, joka koodittaa osaa P14:stä saatiin IgE-seulonnan avulla (22) kappaleessa 5.2 kuvatun mukaisesti. Lysogeeninen E. coli -kanta Y1089 ino-kuloitiin rekombinanteilla lambda gtll-faageilla, jotka 15 sisälsivät kuviossa 4 alleviivatun mukaisen insertin, ja β-galaktosidaasifuusioproteiini otettiin talteen seoksesta (19) . Konstruktiosta voisi ennakoida, että molekyylipai-noltaan 116 kDa fuusioproteiini tuotettaisiin. Seos pantiin elektroforeesiin 7,5 %:sella polyakryyliamidigeelillä 20 ja blotattiin nitroselluloosalle. Fuusioproteiini havaittiin potilasseerumin IgE-vasta-aineiden ja jodileimatun kanissa tuotetun ihmisen IgE:n vastaisen vasta-aineen (Pharmacia, Upsala, Ruotsi) avulla (kuvio 2) . Kuten kuviosta 2 nähdään, havaittiin fuusioproteiini, jolla oli ·. 25 molekyylipaino välillä 115 kDa ja joka kykeni sitomaan

IgE-vasta-aineita.

5.4.2. P14:n täydellisen cDNA:n ekspressio fuusio- ja ei-fuusioproteiinina P14 : ä koodittava täydellinen cDNA sisältää prokary-30 oottien ribosomin sitoutumiskohdan (Shine-Dalgarno -sekvenssi (30)), ja se sijoitettiin plasmidien pKK233-3 (31) ja pEXB (32) EcoRI-kohtiin P14:n saamiseksi ei-fuusioproteiinina tai P14:n ja lambda eli-proteiinin välisenä fuu-sioproteiinina. IgE:tä sitovat kloonit saatiin seerumin 35 IgE:n ja pesäkkeiden seulontamenetelmän (33) avulla, ja 16 104983 niitä tutkittiin DNA:n restriktioanalyysin avulla. Rekom-binanttiproteiineista tutkittiin niiden sitoutumiskyky suhteessa potilaiden IgE-vasta-aineisiin kuten on kuvattu (22) (kuvio 6).

5 5.5. Koivun siitepölyn P14:n ja rekombinantti-P14:n puhdistus P14 koivun siitepölystä ja rekombinantti-P14 puhdistettiin affiniteettimenetelmän avulla eräkäsittelyllä (vrt. 15, 16), joka on sopiva Acanthamoeban (10), hiivan 10 (11) ja ihmisen (13) profiliineille. Koivun siitepölyä ja sellaisia E. coli -soluja, jotka sisältävät P14:ä koodit-tavan plasmidin, hajotettiin PHEM-TX-puskurissa (2x PHEM-TX: 120 mM PIPES (piperatsiini-1,4-bis(2-etaanisulfonihap-po) ) , 50 mM HEPES (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2- 15 etaanisulfonihappo), 20 mM EGTA (etyleeniglykoli-bis(β-

aminoetyylieetteri)-N,N,N',N'-tetraetikkahappo), 4 mM

MgCl2, 10 mM glukoosi, 20 μg/ml leupeptiini, 156 μg/ml bentsamidiini, 80 μg/ml aprotiniini, 1 mM PMSF (fenyylime-tyylisulfonyylifluoridi), 1,5 % Triton-X100, pH 7,2), 20 ja lysaattia sentrifugoitiin tunnin ajan 65 000 x g:ssä 4 °C:ssa. Supernatanttia inkuboitiin yön yli BrCN-aktivoi-tuun Sepharose 4 B:hen (Pharmacia, Upsala, Ruotsi) liitetyn poly(L-proliinin) kanssa. Sitten affiniteettimatriisi pestiin kolmesti joka kerta kaksinkertaisella tilavuudella 25 TBS-ATP: tä (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5 mM ATP (adenosii-nitrifosfaatti), pH 7,6) ja sitten eluoitiin viiden minuutin ajan huoneenlämmössä kaksinkertaisella tilavuudella eluutiopuskuri I:tä (TBS-ATP, jossa on 2 M urea). Superna-tantti kerättiin talteen. Menettely toistettiin kahdesti 30 eluutiopuskuri II:lla (TBS-ATP, jossa on 6 M urea), ja supernatantteja dialysoitiin tislattua vettä vastaan 4 · - 4 °C:ssa. Proteiinit sisältävät dialysaatit lyofilisoitiin ja analysoitiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja IgE-immunoblottauksella (kuviot 8, 9, 10 ja 11).

« · · 17 104983 5.6. Pl4:n cDNA:n fragmentista, joka sisältää

IgE:tä sitovan epitoopin, ekspressoidun proteiinin

IgE:n sitomiskyky P14:n cDNA:n 3'-alue (emäsparit 419-478) kloonat-5 tiin lambda gtll:n EcoRI-kohtaan ja ekspressoitiin IgE:tä sitovana polypeptidinä (21) kuten kuviossa 2 esitetään. β-galaktosidaasifuusioproteiini sitoutui voimakkaasti potilaan IgErhen, kun taas kontrollikaistoilla 1 ja 2 ei nähty IgE:n sitoutumista E, coli Y1089:n proteiineihin 10 eikä sellaisen E. coli Y1089:n proteiineihin, joka oli inokuloitu lambda gtll-faageilla, joissa ei ole inserttiä. Tämä esimerkki osoittaa, että saatiin osittainen cDNA-klooni, joka koodittaa proteiinia, jolla on ainakin yksi P14-molekyylin epitooppi. Tästä seuraa, että osittaiset 15 cDNA-kloonit, jotka koodittavat tällaisia epätäydellisiä P14-polypeptidejä, voivat olla hyödyllisiä hoidossa tai diagnoosissa samaan tapaan kuin täydellinen P14-molekyyli tai homologiset proteiinit.

5.7. Pl4:lle homologisten polynukleotidien ja poly- 20 peptidien osoittaminen lahkon Fagales sisällä "Northern"-blottauksessa (RNA-blottauksessa) (kuvio 3) nähdään, että P14:n cDNA-sekvenssi (kuviossa 4 alleviivattu polynukleotidi) pystyy ristihybridisoitumaan lepän ja pähkinäpensaan siitepölyn kanssa vaativissa olo-" 25 suhteissa (vaativuuden edellytykset on määritelty kappa leessa 3, Keksinnön yhteenveto). Siksi lahkon Fagales puiden vastaavien allergeenien sekvenssihomologia voidaan osoittaa jo nukleiinihappotasolla. Jo kuviossa IA nähtiin lepän, pähkinäpensaan ja valkopyökin P14:lle homologisten 30 proteiinien samankaltainen IgE:n sitomiskyky. Tästä seu-' #i raa, että P14:n cDNA koodittaa polypeptidejä, joilla on samankaltainen IgE:n sitomiskyky ja antigeenisyys kuin läheistä sukua olevien puiden allergeeneilla.

• · 18 104983 5.8. Sekvenssianalyysi

Kuviosta 4 nähdään koivun P14:ä koodittavan cDNA:n sekvenssi ja koodittavan alueen päätelty aminohapposekvenssi. Se sisältää koko proteiinia koodittavan alueen.

5 Sen peptidin sekvenssi, joka β-galaktosidaasiin liitettynä edustaa IgE:tä sitovaa epitooppia, on alleviivattu kuviossa (ks. esimerkki 5.4).

Kuvio 5 havainnollistaa sekvenssihomologiaa koivun P14-proteiinin ja ihmisen, hiiren, vasikan, hiivan ja 10 Acanthamoeban profiliinien (13, 12, 14, 11, 10) välillä.

Potilaiden IgE:n ristireagoivuus koivun P14:n ja ihmisen profiliinin välillä esitetään kuviossa 12. Näiden toisilleen sukua olevien proteiinien samankaltaisia kemiallisia ominaisuuksia osoitti myös niiden yhteinen poly-15 (L-proliinia) kohtaan suuntautuva affiniteetti (kuviot 8 ja 10). Nämä tulokset viittaavat siihen, että niin kaukana toisistaan evolutiivisesti olevien lajien kuin ihmisen ja koivun profiliinit pystyvät toimimaan ristireagoivina pan-allergeeneina, jotka voivat johtaa autoimmuuniin IgE-re-20 aktiivisuuteen potilaissa.

5.9. Pl4:ä koodittavan cDNA:n ekspressio E. colissa fuusio- tai ei-fuusioproteiinina ja näiden polypep-tidien IgE:n sitorniskyvyn havaitseminen Kuviossa 4 esitetty polynukleotidi (nukleotidit 1- ” 25 710), joka koodittaa koivun P14:ä, sijoitettiin plasmidiin * pKK223-3 siten, että rekombinanttia ei-fuusioproteiinia (31) voitiin tuottaa, kun taas rekombinantti fuusioprote-iini tuotettiin plasmidissa pEXB (32) . Näiden polypeptidi-en reaktiivisuus potilas-IgE:n kanssa esitetään kuviossa 30 6. E. colin kontrolliproteiiniuutokset kaistoilla 1, 2, 5 ja 6 eivät sido IgE:tä, kun taas ei-fuusioproteiinina • · - (kaistat 3 ja 4) ja fuusioproteiinina (kaistat 7 ja 8) ekspressoitu rekombinantti koivun P14 sitoo IgE:tä.

Kuviossa 7 koivun siitepölylle (A-K), heinän siite-35 pölylle (L-N) ja pujolle (0-Q) allergisten henkilöiden • I · 19 104983 seerumeista ja yhdistelmästä ei-allergisten yksilöiden seerumeita (R), jotka kaikki oli valittu potilaskertomuksensa sekä RAST- ja ihokokeen mukaisesti, testattiin niiden IgE:n sitoutumiskyky rekombinantin koivun P14:n kans-5 sa. Seerumien D, E, F, I, J ja P IgE:t sitoutuivat pKK233-3:ssa ekspressoituun P14:ään.

Tästä seuraa, että tämä keksintö tuo käytettäväksi polynykleotidin, joka koodittaa polypeptidejä, joilla on koivun P14-proteiinin kanssa samankaltainen antigeenisyys 10 ja samankaltainen IgE:n sitomiskyky, kun polynukleotidi sijoitetaan oikeassa lukuvaiheistuksessa moniin erilaisiin ekspressiosysteemeihin. Näiden polypeptidien IgE:n sito-misominaisuudet osoitettiin sellaisten potilaiden seerumeille, joilla nähdään allergisia reaktioita eri siitepö-15 lyille (kuvio 7).

5.10. P14:n puhdistus siitepölystä ja rekombinantin P14:n puhdistus E. colista

Kuten edellä on kuvattu, tässä tarjotaan käytettäväksi yksinkertainen menetelmä luonnossa esiintyvän yhtä 20 hyvin kuin rekombinantin P14:n puhdistamiseen. Coomassie-värjätty polyakryyliamidigeeli kuviossa 8 näyttää, että puhdas P14 (kaistat 3, 4 ja 5) voidaan saada eroon siitepölyn kokonaisproteiinista (kaista 1) . Proteiinit, jotka eivät sitoudu poly(L-proliini)-Sepharoseen näytetään myös ” 25 (kaista 2) . Tämän puhdistusmenetelmän tehokkuutta tark kailtiin IgE-immunoblottauksen avulla (kuvio 9), ja tähän tarkoitukseen käytettiin seerumia potilaasta, joka tunnistaa IgE-vasta-aineilla useimmat koivun allergeenit (kaista 1). Affiniteettimenetelmän käytön jälkeen P14:ä ei voida 3 0 havaita lähes lainkaan (kaista 2) , kun taas puhdistettu ’ " P14 saatiin kaistoilla 3, 4 ja 5.

Kuviossa 10 nähdään polyakryyliamidigeeli, joka esittää rekombinantti-P14:n puhdistamisen E. coli JM105:stä, joka on transformoitu plasmidilla pKK233-3, 35 jossa on P14:ä koodittava sekvenssi. Rekombinantti-P14 i · · 20 1 0 4 9 8 3 (kaistat 3 ja 4) puhdistettiin kokonaisproteiineista af-finiteettikromatografiällä poly(L-proliini)-Sepharosella (kaista 1), ja jäljelle jääneet proteiinit näytetään kaistalla 2. Kuviosta 11 nähdään, että käytetyllä menetelmällä • 5 ei saada mitään homologista proteiinia E. coli JM105:stä, joka on transformoitu pKK233-3:llä, jossa ei ole insert-tiä.

Kuten kuvioista 9, 6 ja 7 nähdään, puhdistetulla proteiinilla (koivusta ja E. colista) säilyy IgE:n sito-10 miskyky. Siten tämä esimerkki esittää yksinkertaisen ja nopean puhdistusmenetelmän P14:lle sekä luonnollisena että rekombinanttina polypeptidinä. Poly(L-proliinia) puhdistukseen käytettäessä sekä luonnollinen että rekombinantti P14 säilyttävät antigeenisyytensä ja IgE:n sitomiskykynsä. 15 Lisäksi menetelmä tarjoaa mahdollisuuden immobilisoida (ja erottaa affiniteettikeinoin) immunologisesti aktiivinen polypeptidi.

5.11. Allergisten ja atooppisten potilaiden IgE-reaktiivisuus ihmisen profiliinin kanssa 20 Eri potilaiden seerumeita valittiin seuraavasti (kuvio 12): potilaalla 1 nähdään IgE-vasta-aineita, jotka suuntautuvat useimpia koivun siitepölyallergeeneja kohtaan, mukaan luettuina BetvI ja P14, potilaalla 2 nähdään IgE:n sitoutuminen vain P14:ään ja potilaalla 3 vain Bet-25 vl:een. Potilas 4 on pölypunkille allerginen henkilö, ja yhdistetty seerumi 5 koottiin ei-allergisista yksilöistä. Liuska 6 on puskurikontrolli. Kaikista näistä seerumeista testattiin niiden IgE:n sitomiskyky ei-rekombinantin ja rekombinantin P14:n ja ihmisen profiliinin kanssa. Niillä 30 potilailla (kuvio 12), jotka tunnistivat koivusta olevan ei-rekombinantin P14:n sekä myös E. colista olevan rekombinantin P14:n, oli myös IgE-vasta-aineita ihmisen profi-liinia vastaan. Tästä syystä tämä keksintö antaa ' ensimmäistä kertaa viitteitä molekyylitasolla siitä, että au-35 toimmuunimekanismeilla saattaisi olla osuutta atooppisissa i 21 104983 ja allergisissa sairauksissa. Koska potilaat, joilla on muita autoimmuunitauteja, muodostavat vasta-aineita P14:ä vastaan, tämän keksinnön pitäisi tarjota käytettäväksi merkki näiden tautien diagnoosiin.

5 5.12. Atooppisten ja allergisten potilaiden sai rauskertomusten korrelaatio IgE-vasta-aineiden P14:ään sitoutumiseen

Potilaiden, jotka muodostavat IgE-vasta-aineita P14:ä vastaan, sairauskertomuksista nähdään, että he kaik-10 ki kärsivät vakavista allergiaoireista, joita aiheuttaa suuri joukko erilaisia allergeeneja (puiden ja heinän siitepöly, punkin, kissan ja koiran allergeenit), että heillä on kohonnut IgE:n kokonaistaso, ja heillä nähdään epätyydyttävä hyposensitisaatiohoidon kulku. Tästä seuraa, että 15 potilaiden seerumin IgE:n positiivinen reaktio P14:n kanssa on käyttökelpoinen hyvänä merkkiominaisuutena tiettyjen atooppisten ja allergisten potilaiden ryhmien erottamiseen .

5.13. Yhteisten IgE-epitooppien osoittaminen profi-20 liinien välillä ruoan (selleri) ja siitepölyn (koi vu) P14-allergeenissa

Kuviossa 13 näkyvä IgE:n inhibitiokoe osoittaa, että siitepölyissä ja ruoissa oleville P14-allergeenille homologisille proteiineille on yhteistä IgE:n sitomisky-" 25 kyä. Puhdistettu rekombinantti koivun profiilini, kun se lisätään potilasseerumiin nestefaasiin ennen kuin seerumia inkuboidaan nitroselluloosaan sidotun profiliinin kanssa, pystyy estämään täydellisesti potilaiden IgE:n sitoutumisen sellerin profiliiniin. Tämä viittaa siihen, että koi-30 vun P14-allergeeni (koivun profiilini) sisältää kaikki epitoopit, jotka voidaan havaita sellerin profiliinissa. Siksi rekombinantti koivun P14-allergeeni ei ole sopiva vain siitepölyallergioiden diagnoosiin, vaan myös ruoka-allergioiden.

> · · 22 104983

Koivun P14-allergeenin ja ruoan profiliinien yhteistä antigeenisyyttä osoittaa myös kanissa tuotetun sellerin profiliinin vastaisen vasta-aineen ristireagoivuus koivun P14-allergeenien kanssa (kuviot 14 ja 15).

5 5.14. Rauduskoivun (Betula verrucosa) P14-siitepö- lyallergeenin ja timotein (Phleum pratense) homologisen P14(T)-allergeenin sekvenssien samankaltaisuus ja yhteinen IgE:n sitomiskapasiteetti Koivun P14-allergeenin ja timotein P14(T)-allergee-10 nin välinen aminohapposekvenssi-identtisyys on 77 %. Timotein P14(T)-allergeenia koodittava cDNA saatiin seulomalla cDNA-kirjasto, joka oli muodostettu timotein siitepölystä samalla tavalla kuin on kuvattu koivun siitepölyn cDNA-kirjaston kohdalla, potilaiden IgE:llä kuten on koivun 15 P14-allergeenin kohdalla on kuvattu. Timotein P14(T)-allergeenia koodittavan kloonin cDNA-sekvenssi esitetään kuviossa 16 ja sekvenssiluettelon sekvensseinä 9 - 11.

Kaikki potilasseerumit, jotka sitoutuivat IgErllään koivun profiliiniin, sitoutuivat IgE:llään myös nitroselluloosa-20 suodattimien sektoreihin, jotka sisälsivät plakkikopioita sellaisista immunopositiivisista lambda gtll-faageista, joihin oli sijoitettu timotein P14(T)-allergeenia koodittava cDNA (kuvio 17) . Tämä osoittaa, että P14-allergeeneille korkean homologian perusteella sukua olevat prote- " 25 iinit ovat myös immunologisesti ristireagoivia potilaiden

IgE-vasta-aineiden kanssa.

6. Kirjallisuusviitteet

Edeltävässä patenttijulkaisussa siteeratut kirjallisuusviitteet ovat: 30 1. L. Yman, Botanical relations and immunological cross-reactions in pollen allergy, toinen laitos, Upsala, • · ·

Ruotsi; Pharmacia AB, 1982.

2. W. R. Thomas, K. Y. Chua, W. K. Greene ja G. A. Stewart. Recombinant mite allergens. Teoksessa: Epitopes • · · 104983 23 of atopic allergens. A. H. Sehon, D. Kraft ja G. Kunkel . (toim.). UCB Institute of Allergy, Brysseli 1990.

3. E. Jarolim, M. Tejkl, M. Rohac, G. Schlerka, M. Breitenbach, O. Scheiner, D. Kraft, H. Rumpold. Monoclonal 5 antibodies against birch pollen allergens; characterizati on by immunoblotting and use for single step affinity purification of the major allergen Setvi. Int. Arch. Allergy Appi. Immunol. 90.: 54-60. (1989).

4. H. Ipsen, H. Bowadt, H. Janniche, B. Niichel Pe- 10 tersen, E. P. Munch, J. A. Wihl ja H. Lowenstein. Immunochemical characterization of reference alder (Alnus glu-tinosa) and hazel (Corylus avellana) pollen extracts and the partial immunochemical identity between the major allergens of alder, birch, and hazel pollen. Allery 4.0, 510- 15 518 (1985).

5. H. Rumpold, M. Rohac, B. Bohle, M. Breitenbach, 0. Scheiner ja D. Kraft. The relationship of Betvl epitopes recognized by patients' IgE and monoclonal anti-BetvI antibodies. Teoksessa: Epitopes of atopic allergens. A.

20 Sehon, D. Kraft ja G. Kunkel (toim.). The UCB Institute of Allergy, Brysseli 1990.

6. R. Valenta, H. Breitenender, K. Pettenburger, M. Breitenbach, H. Rumpold, D. Kraft ja 0. Scheiner. Homology of the major pollen allergens of alder, hazel and hornbeam 25 at the nucleic acid level as determined by cross-hybridization. J. Allergy Clin. Immunol., painossa.

7. B. Niichel Petersen, H. Janniche, E. P. Munch, J. A. Wihl, H. Bowadt, H. Ipsen ja H. Lowenstein. Immunotherapy with partially purified and standardized tree pol- 30 len extracts. Allery 43., 353-362 (1988) .

* " 8. J. A. Wihl, H. Ipsen, B. Niichel Petersen, E. P.

Munch, H. Janniche ja H. Lowenstein. Immunotherapy with partially purified tree pollen extracts. Allery 43., 363-369 (1988) .

»· I

24 104983 9. H. Ipsen, B. Schwartz, J. A. Wihl, B. Nuchel Petersen, E. P. Munch, H. Janniche ja H. Lowenstein. Immunotherapy with partially purified and standardized tree pollen extracts. Allery 43., 370-377 (1988) .

5 10. C. Ampe, J. Vanderkerckhove, S. L. Brenner, L.

Tobacman ja E. D. Korn. The amino acid sequence of Acanth-amoeba profilin. J. Biol. Chem. 260. 834-840 (1985).

11. V. Magdolen, U. Oeschner, G. Muller ja W. Band-low. The intron-containing gene for yeast profilin (PFY) 10 encodes a vital function. Mol. Cell. Biol. 8., 5108-5115 (1988).

12. J. S. Widada, C. Ferraz ja J.-P. Liautard. Total coding sequence of profilin cDNA from Mus musculus macrophage. Nucl. Acids Res. 17., 2855 (1989).

15 13. D. J. Kwiatkowski ja G. A. P. Bruns. Human pro filin. Molecular cloning, sequece comparison, and chromosomal analysis. J. Biol. Chem. 263. 5910-5915 (1988).

14. C. Ampe, F. Markey, U. Lindberg ja J. Vanderkerckhove. The primary structure of human platelet profi- 20 lin: reinvestigation of the calf spleen profilin sequence. FEBS Lett. 228, 17-21 (1988).

15. Lindberg, C. E. Schutt, E. Hellsten, A.-C. Tjä-der ja T. Hult. The use of poly (L-proline)-Sepharose in the isolation of profilin and profilactin complexes. Bio- 25 chim. Biophys. Acta 967, 391-400 (1988).

* * 16. M. Tanaka ja H. Shibata. Poly(L-proline)-binding proteins from chick embryos are a profilin and a profilactin. Eur. J. Biochem. 151. 291-297 (1985) .

17. H. Breitenender, W. Hassfeld, K. Pettenburger, 30 E. Jarolim, M. Breitenbach, H. Rumpold, D. Kraft ja O.

Scheiner. Isolation and characterization of messenger RNA from male inflorescences and pollen of white birch (Betula verrucosa) Int. Arch. Allergy Appi. Immunol. 87., 19-24 (1988).

« « j 25 104983 18. H. Aviv ja P. Leder. Purification of biologically active globin messenger RNA by chromatography on oligothymidylic acid-cellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408-1412 (1972).

5 19. T. V. Hyunh, R. A. Young, R. W. Davis, teokses sa DNA cloning - a practical approach, nide 1, D. M. Glover (toim.), IRL Press, Oxford 1985.

20. H. Haymerle. Nucl. Acids Res. 14., 8615 (1986).

21. R. A. Young ja R. W. Davis. Efficient isolation 10 of genes by using antibody probes. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 80, 1184-1198 (1983) .

22. H. Breitenender, K. Pettenburger, A. Bito, R. Valenta, D. Kraft, H. Rumpold, O. Scheiner ja M. Breiten-bach. The gene coding for the major birch pollen allergen 15 Betvl is highly homologous to a pea resistance response gene. EMBO J., £: 1935-1938 (1989).

23. F. M. Ausubel. Current protocols in molecular biology. Green Publishing Associates ja Wiley-Interscien-ce, New York, 1987.

20 24. C. Yanisch-Perron, J. Vieira ja J. Messing.

Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 jan pUC19 vectors. Gene 33, 103-119 (1985) .

25. F. Sanger, S. Nicklen ja A. R. Coulson. DNA

” 25 sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977).

26. R. B. Wallace, J. Shaffer, R. F. Murphy, J. Bonner, T. Hirose ja K. Itakura. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to φχ 174 DNA: the effect of 30 a single base pair mismatch. Nucleic Acids Res. 6., 3543- ' ” 3557 (1979) .

» · 27. P. S. Thomas. Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77. 5201-5205 (1980).

·· 26 1 0 4 9 8 3 28. H. Lehrach. RNA molecular weight determinations by gel electrophoresis under denaturing conditions: a critical reexamination. Biochemistry 16, 4743-4751 (1977).

29. A. P. Feinberg ja B. Vogelstein. A technique 5 for radiolabeling DNA restriction fragments to high specific activity. Anal. Biochem. 132. 6-13 (1983).

30. J. Shine ja L. Dalgarno. The 3'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites.

10 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 1342-1346 (1974).

31. E. Amann, J. Brosius ja M. Ptashne. Vectors bearing a hybrid tro-lac promoter useful for regulated expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene 25. 167-178 (1983).

15 32. N. Kiyoshi, H. C. Th(|)rgesen. Generation of β- globin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in Escherichia coli. Nature 309: 810-812.

(1984) .

33. D. M. Helfman, J. R. Feramisco, J. C. Fiddes, 20 G. P. Thomas ja S. H. Hughes. Identification of clones that encode chicken tropomyosin by direct immunological screening of a cDNA expression library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80., 31-35 (1983).

Sekvenssiluettelo " 25 (1) Yleistiedot f (i) Hakijat:

Dr. Rudolf Valenta Dr. Michael Duchene Rouva Dr. Karin Pettenburger 30 Dr. Michael Breitenbach

Dr. Dietrich Kraft Dr. Helmut Rumpold Dr. Otto Scheiner (ii) Keksinnön otsikkko: Koivun siitepölyallergeeni P14 35 allergisten sairauksien diagnoosiin ja hoitoon • « 27 104983 (iii) Sekvenssien lukumäärä: 8 (iv) Kirjeenvaihto-osoite: (A) Vastaanottaja: Pennie & Edmonds (B) Katuosoite: 1155 Avenue of the Americas 5 (C) Kaupunki: New York (D) Osavaltio: New York

(E) Valtio: USA

(F) Postinumero: 10036 (v) Tietokoneella luettava muoto: 10 (A) Tallennetyyppi: Levyke, 3,50 tuumaa (B) Tietokone: Hewlett Packard (IBM-PC-yhteensopi-va)

(C) Käyttöjärjestelmä: MS-DOS

(D) Ohjelmisto: WordPerfect 5.1 15 (vi) Tiedot tästä patenttihakemuksesta: (A) Hakemusnumero: 8 (B) Jättöpäivä: (C) Luokitus: (vi) Tiedot aikaisemmasta patenttihakemuksesta: 20 (A) Hakemusnumero: 07/353 844 (B) Jättöpäivä: 18. toukokuuta 1989 (viii) Asianajajan/asiamiehen tiedot:

(A) Nimi: Harry C. Jones, III

(B) Rekisterinumero: 20 280 " 25 (C) Referenssi/merkintänumero (docket number) : 6530-008 (ix) Televiestintäyhteystiedot: (A) Puhelin: (212) 790-9090 (B) Telefax: (212) 869-9741/8864 30 (2) Tiedot SEQ ID nro 1:stä * « (i) Sekvenssin ominaispiirteet: (A) Pituus: 700 nukleotidia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteet: yksijuosteinen 35 (D) Topologia: lineaarinen 1 · 28 104983 (ii) Molekyylin tyyppi: cDNA mRNA:sta (iii) Hypoteettinen: ei (iv) Vastakkaisen juosteen: ei (v) Fragmentin tyyppi: ei voida soveltaa 5 (vi) Alkuperäinen lähde: (A) Eliö: Betula verrucosa (vii) Välitön lähde: (A) Siitepöly Allergon Ab:lta, Engelholm, Ruotsi (viii) Asema genomissa: ei voida soveltaa 10 (ix) Erikoispiirteet: ei voida soveltaa (x) Julkaisutiedot: ei voida soveltaa (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID nro l: CAGAGAAAGC GAAAGCTCTC CGCCACAACA AAACGAAGTA CAAGAAGAAO AGTCACCAAG 60 15 AGACAGAGGO AAGAGGAAAA TCTCGTGGCA AACGTACGTO GATGAACATT TGATGTGCGA 120 TATCGACCGG CAAGCCAGCA ACTCGCTGGC ATCTCCCATC GTCGGTCACG ATGGCTCTGT 180 GTGCGCCCAO AGCTCTTCCT TCCCACAGTT TAAGCCTCAG1 GAAATCACTC GTATCATGAA 240 GCACTTTGAO GAGCCGGGTC ATCTTGCTCC GACCGCCTTA CACCTTGGGO GCATAAAATA 300 CATGGTCATC CACCCAGACG CTGGTGCTGT CATCCCTCCA AAGAACCGAT CTCCACGTAT 360 TACTATAAAO AACACTGGTC AAGCTCTCGT TTTTGGCATC TATGAAGACC CTGTGACACC 420 ACGACAGTGC AACATCGTTG TTCAGAGGTT GCGGGATTAC CTTATTGACC ACCGCCTGTA 480 CGCAAACGTC TATCATCATT TGGOGCTTAA TTGTTTTTTT TTTTTTTTTG CTCTTATTCC 540 CTXTCATTTC GCTTCCAAGT CTCCATCGAT CTTCATTTGA AACCCITAAA TTGCCAGTCA 600 ACTTGTTGCA CACAATAACC ATGTGAGAAC TAAAACATTT GTCTTGTGTT TGGTTCTTTG 660 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ΑλλλλλλλλΑ 700 *· O r- 2o (3) Tiedot SEQ ID nro 2:sta (i) Sekvenssin ominaispiirteet: (A) Pituus: 399 nukleotidia 30 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteet: yksijuosteinen « · (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: cDNA mRNA:sta (iii) Hypoteettinen: ei j 35 (iv) Vastakkaisen juosteen: ei « · 29 104983 (v) Fragmentin tyyppi: ei voida soveltaa (vi) Alkuperäinen lähde: (A) Eliö: Betula verrucosa (vii) Välitön lähde: 5 (A) Siitepöly Allergon Ab:lta, Engelholm, Ruotsi (viii) Asema genomissa: ei voida soveltaa (ix) Erikoispiirteet: ei voida soveltaa (x) Julkaisutiedot: ei voida soveltaa (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID nro 2: 10 ATGTCGTGGC AAACGTACOT CCATGAACAT TTCATCTCCO ATATCGACCG GCAAGCCAGC 60 AACTCGCTGG CATCTCCCAT CGTCGGTCAC CATGCCTCIO TGTCGGCCCA GACCTCTTCC 120 TTCCCACAGT TTAAGCCTCA GGAAATCACT CCTATCATGA AGGACTTTGA GGAGCCGGGT 160 CATCTTGCTC CGACGGGCTT ACACCTTCGC CGCATAAAAT ACATGGTCAT CCAGGCAGAG 240 CCXGCTGCTO TCATCCGTGO AAAGAAGCGA TCTGGACCTA TTACTATAAA GAAGACTCCT 300 15 CAAGCTCTCG TTTTTGGCAT CTATCAAGAG CCTGTCACAC CACCACACTG CAACATGGTT 360 GTTGAGAGGT TGCGGGATTA CCTTATTGAC CAGGGCTO 399 (4) Tiedot SEQ ID nro 3:sta 20 (i) Sekvenssin ominaispiirteet: (A) Pituus: 133 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (C) Juosteet: ei voida soveltaa (D) Topologia: lineaarinen * 25 (ii) Molekyylin tyyppi: peptidi (iii) Hypoteettinen: ei (iv) Vastakkaisen juosteen: ei voida soveltaa (v) Fragmentin tyyppi: ei voida soveltaa (vi) Alkuperäinen lähde: 30 (A) Eliö: Betula verrucosa • " (vii) Välitön lähde: ei voida soveltaa • · (viii) Asema genomissa: ei voida soveltaa (ix) Erikoispiirteet: (D) Muut tiedot: Aminohapposekvenssi-identiteetti 35 muiden eliöiden profiliinin kanssa seuraavasti: 30 % ihmi- « * 30 104983 sen profiliinin kanssa, 28 % vasikan ja hiiren, 26 % hiivan ja 25 % Acanthamoeban kanssa.

(x) Julkaisutiedot: ei voida soveltaa (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID nro 3: 5

Het Ser Trp Gin Thr Tyr Vai Asp Clu Hl· Lau Hat Cya Aap Ile Asp 15 10 15

Gly Gin Ala Ser Aan Ser Leu Ala Ser Ala Ile Vai Gly Hla Asp Gly 20 25 30

Ser Vai Trp Ala Gin Ser Ser Ser Phe Pro Gin Phe Lys Pro Gin Glu 10 35 40 45 lie Thr Gly Ile Het Lys Asp Phe Glu Glu Pro Gly His Leu Ala Pro 50 55 60

Thr Gly Leu Hl· Leu Gly Gly Ile Ly· Tyr Het Vai Ile Gin Gly Glu 65 70 75 60

Ala Gly Ala Vai Ile Arg Gly Ly· Lys Gly Ser Gly Gly Ile Thr Ile lb 85 90 95

Lys Lys Thr Gly Gin Ala Leu Vai Phe Gly Ile Tyr Glu Glu Pro Vai 100 105 110

Thr Pro Gly Gin Cys Am Het Vai Vai Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu 115 120 125 lie Asp Gin Gly Leu 130 (5) Tiedot SEQ ID nro 4:stä (i) Sekvenssin ominaispiirteet: ; 25 (A) Pituus: 140 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: peptidi (iii) Hypoteettinen: ei 30 (iv) Vastakkaisen juosteen: ei voida soveltaa (v) Fragmentin tyyppi: ei voida soveltaa (vi) Alkuperäinen lähde: ' (A) Eliö: Hiiri (vii) Välitön lähde: ei voida soveltaa 35 (viii) Asema genomissa: ei voida soveltaa 31 104983 (ix) Erikoispiirteet: (D) Muut tiedot: 28 % identtinen koivun (Betula verrucosa) P14-allergeenin kanssa.

(x) Julkaisutiedot: viite 12 5 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID nro 4:

Ket Ala Gly Trp Aan Ala Tyr Ile Asp Ser Leu Het Ala Asp Gly Thr 1 5 10 15

Cys Gin Asp Ala Ala lie Vai Gly Tyr Lya Asp ser Pro Ser Vai Trp 20 2S 30

Ala Ala Vai Pro Gly Lya Thr Phe Vai Ser Ile Thr Pro Ala Glu Vai 35 40 45 ,0 Gly Vai Leu Vai Gly Lye Asp Arg Ser Ser Phe Phe Vai Aan Gly Leu 50 55 60

Thr Leu Gly Gly Gin Lya Cya Ser Vai Ile Arg Asp Ser Leu Leu Gin 65 70 75 80

Aap Gly Glu Phe Thr Ket Aap Leu Arg Thr Lya ser Thr Gly Gly Ala 85 90 95

Pro Thr Phe Aan Vai Thr Vai Thr Het Thr Ala Lya Thr Leu Vai Leu 100 105 110

Leu Ket Cly Lya Glu Gly Vai Kla Gly Gly Leu Ile Aen Lya Lya Cya 15 HS 120 125

Tyr Glu Het Ala Ser Hia Leu Arg Arg Ser Gin Tyr 130 135 140 (6) Tiedot SEQ ID nro 5:stä (i) Sekvenssin ominaispiirteet: 20 (A) Pituus: 139 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: peptidi (iii) Hypoteettinen: ei 25 (iv) Vastakkaisen juosteen: ei voida soveltaa (v) Fragmentin tyyppi: ei voida soveltaa (vi) Alkuperäinen lähde: (A) Eliö: Vasikka (naudan) (vii) Välitön lähde: ei voida soveltaa 30 (viii) Asema genomissa: ei voida soveltaa (ix) Erikoispiirteet: (D) Muut tiedot: 28 % identtinen koivun (Betula verrucosa) P14-allergeenin kanssa.

(x) Julkaisutiedot: viite 14 9 9 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID nro 5: 32 104983

Ala Gly Trp Asn Ala Tyr Ile Aap Aan Leu Ket Ala Asp Gly Thr Cya 1 5 10 15

Cln Aap Ala Ala Ile Vai Gly Tyr Lys Asp Ser Pro Ser Vai Trp Ala 5 20 25 30

Ala Vai Pro Cly Lys Thr Phe Vai Asn Ile Thr Pro Ala Glu Vai Gly 35 40 45

Ile Leu Vai Gly Lys Asp Arg Ser Ser Phe Phe Vai Asn Cly Leu Thr 50 55 60

Leu Gly Gly Gin Lys Cys Ser Vai Ile Arg Asp Ser Leu Leu Cln Asp 10 65 70 75 80

Cly Glu Phe Thr Het Asp Leu Arg Thr Lys Ser Thr Gly Cly Ala Pro 85 90 95

Thr Phe Asn Ile Thr Vai Thr Het Thr Ala Lys Thr Leu Vai Leu Leu 100 105 110

Het Gly Lye Gin Gly Vai Hls Gly Gly Het Ile Asn Lys Lys Cys Tyr 15 115 120 125

Glu Het Ala Ser Hls Leu Arg Arg Ser Cln Tyr 130 135 (7) Tiedot SEQ ID nro 6:sta 20 (i) Sekvenssin ominaispiirteet: (A) Pituus: 140 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: peptidi 25 (iii) Hypoteettinen: ei (iv) Vastakkaisen juosteen: ei voida soveltaa (v) Fragmentin tyyppi: ei voida soveltaa (vi) Alkuperäinen lähde: (A) Eliö: Ihminen (Homo sapiens) 30 (vii) Välitön lähde: ei voida soveltaa (viii) Asema genomissa: ei voida soveltaa (ix) Erikoispiirteet: (D) Muut tiedot: 30 % identtinen koivun (Betula verrucosa) P14-allergeenin kanssa.

35 (x) Julkaisutiedot: viite 13 i j j (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID nro 6: 33 104983

Met Ala Gly Trp Aen Ala Tyc lie Asp Asn Leu Met Ala Asp Gly Thr 15 10 15

Cye Gin Asp Ala Ala Ile Val Gly Tyr Lys Asp Ser Pro Ser Val Trp 5 20 25 30

Ala Ala Val Pro Gly Lye Thr Phe Val Asn He Thr Pro Ala Glu Val 35 40 45

Gly Val Leu Val Oly Lye Asp Arg Ser Ser Phe Tyr Val Asn Gly Leu 50 55 60

Thr Leu Gly Gly Gin Lys Cys Ser Val lie Arg Asp Ser Leu Leu Gin 10 6S 70 75 80

Aep Cly Glu Phe Ser Met Asp Leu Arg Thr Lys Ser Thr Gly Gly Ala 85 90 95

Pro Thr Phe Asn Val Thr Val Thr Lys Thr Aep Lys Thr Leu Val Leu 100 105 110

Leu Met Cly Lys Glu Gly Val His Gly Gly Leu lie Asn Lys Lye Cye 15 115 120 125

Tyr Glu Met Ala Ser Hie Leu Arg Arg Ser Gin Tyr 130 135 140 (8) Tiedot SEQ ID nro 7:stä 20 (i) Sekvenssin ominaispiirteet: (A) Pituus: 126 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: peptidi 25 (iii) Hypoteettinen: ei (iv) Vastakkaisen juosteen: ei voida soveltaa (v) Fragmentin tyyppi: ei voida soveltaa (vi) Alkuperäinen lähde: (A) Eliö: Hiiva 30 (vii) Välitön lähde: ei voida soveltaa (viii) Asema genomissa: ei voida soveltaa (ix) Erikoispiirteet: (D) Muut tiedot: 26 % identtinen koivun (Betula verrucosa) P14-allergeenin kanssa.

35 (x) Julkaisutiedot: viite 11 « (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID nro 7: 34 104983

Met Ser Trp Gin Ala Tyr Thr Asp Asn Leu lie Cly Thr Gly Lye Val 15 10 15

Asp Lye Ala Val lie Tyr Ser Arg Ala Gly Asp Ala Val Trp Ala Thr 5 20 25 30

Ser Gly Gly Leu Ser Leu Gin Pro Asn Glu lie Gly Glu lie Val Gin 35 40 45

Gly Phe Asp Asn Pro Ala Gly Leu Gin Ser Asn Gly Leu His lie Gin 50 55 60 , n Gly Gin Lys Phe Met Leu Leu Arg Ala Asp Asp Arg Ser lie Tyr Gly xu 65 70 75 80

Arg His Asp Ala Glu Gly Val Val Cys Val Arg Thr Lys Gin Thr Val 85 90 95 lie lie Ala His Tyr Pro Pro Thr Val Gin Ala Gly Glu Ala Thr Lys 100 105 110 η c lie Val Glu Gin Leu Ala Asp Tyr Leu lie Cly Val Gin Tyr 115 120 125 (9) Tiedot SEQ ID nro 8:sta 20 (i) Sekvenssin ominaispiirteet: (A) Pituus: 125 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: peptidi • ·. 25 (iii) Hypoteettinen: ei (iv) Vastakkaisen juosteen: ei voida soveltaa (v) Fragmentin tyyppi: ei voida soveltaa (vi) Alkuperäinen lähde: (A) Eliö: Acanthamoeba 30 (vii) Välitön lähde: ei voida soveltaa (viii) Asema genomissa: ei voida soveltaa (ix) Erikoispiirteet: (D) Muut tiedot: 25 % identtinen koivun (Betula verrucosa) P14-allergeenin kanssa.

35 (x) Julkaisutiedot: viite 10 Ϊ 3S 104983 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID nro 8:

Thr Trp oln sir Tyr Vai Asp Thr Ain Hu Vai Gly Thr Gly Ala Val 15 10 15

Thr Oln Ala Ala lie Leu Gly Leu Aip Cly Ain Thr Trp Ala Ser Phe 5 20 25 30

Ala Gly Phe Ala Val Thr Pro Ala Gin Gly Thr Thr Leu Ala Cly Ala 35 40 45

Phe Aen Asn Ala Asp Ala lie Arg Ala Gly Gl . Phe Asp Leu Ala Gly 50 55 60 10 Vai Tyr Val Thr Leu Arg Ala Aip Aap Arg Ser lie Tyr Gly Lye 55 70 75 80

Lyi Gly Ala Ser Gly Val lie Thr Val Lye Thr Ser Lye Ser lie Leu 85 90 95

Val Cly Val Tyr Aen Clu Lye lie Gin Pro Gly Thr Ala Ala Asn Val 100 105 110 15 Val Glu LY* Lau Ala Α·Ρ Tyr Leu lie Gly Oln Gly Phe US 120 125 (10) Tiedot SEQ ID nro 9:stä (i) Sekvenssin ominaispiirteet: 20 (A) Pituus: 641 nukleotidia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteet: yksijuosteinen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: cDNA mRNA:sta 25 (iii) Hypoteettinen: ei (iv) Vastakkaisen juosteen: ei (v) Fragmentin tyyppi: ei voida soveltaa (vi) Alkuperäinen lähde: (A) Eliö: Phleum pratense 30 (vii) Välitön lähde: (A) Siitepöly Allergon Ab:lta, Engelholm, Ruotsi (viii) Asema genomissa: ei voida soveltaa (ix) Erikoispiirteet: ei voida soveltaa (x) Julkaisutiedot: ei voida soveltaa (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID nro 9: 36 1 0 4 9 8 3 GAAAGCAAACTTGCAGGACCGAAGATGTCGTGGCAGACGTACGTGGACGAGCACCTGATG 60 TGCGAGATCGAGGGCCACCACCTCGCCTCGGCGGCCATCCTCGGCCACGACGGCACCGTC 120 TGGGCCCAGAGCGCCGACTTCCCCCAGTTCAAGCCTGAGGAGATCACCGGCATCATGAAG 180 GATTTCGACGAGCCGGGGCACCTCGCCCCCACCGGCATGTTCGTCGCAGGTGCCAAGTAC 240 ATGGTCATCCÄGGGTGAÄSGGGGTCGCGTCATCCGTGGCAAGAAGGGAGCAGGAGGCATC 300 ACCATAAAGAAGACCGGGCAGGCGCTGGTCGTCGGCATCTATGACGAGCCCATGACCCCT 360 GGGCAGTGCAACATGGTGGTGGAGAGGCTTGGCGACTACCTCGTTGAACAAGGCATGTAG 420 ACTGGCTGATCCATGGCTTCCACGTCTCCACGATCGATGATGATCATACAGTTTTTCACG 480 TTCTTTTAAACATCTATTGGAATATATATGGGGCTTCTCCTCTTTTACCGGCTCTGGTCA 54 0 TGGATCACTGATGACCAGTTGCTCTGGAAGTTTCATTTGTAATGCCATCTTGGCTTTCTA 600 TCTTCTTCAATGTTTTTTTTTTCTTTTCGGTTAAAAAAAAA 641 10 (11) Tiedot SEQ ID nro 10:stä (i) Sekvenssin ominaispiirteet: (A) Pituus: 393 nukleotidia 15 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteet: yksijuosteinen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: cDNA mRNA:sta, koodittava alue (iii) Hypoteettinen: ei 20 (iv) Vastakkaisen juosteen: ei (v) Fragmentin tyyppi: ei voida soveltaa (vi) Alkuperäinen lähde: (A) Eliö: Phleum pratense (vii) Välitön lähde: 25 (A) Siitepöly Allergon Ab:lta, Engelholm, Ruotsi (viii) Asema genomissa: ei voida soveltaa (ix) Erikoispiirteet: ei voida soveltaa (x) Julkaisutiedot: ei voida soveltaa (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID nro 10: 30 ATGTCGTGGCAGACGTACGTGGACGAGCACCTGATGTGCGAGATCGAGGGCCACCACCTC 60 GCCTCGGCGGCCATCCTCGGCCACGACGGCACCGTCTGGGCCCAGAGCGCCGACTTCCCC 120 CAGTTCAAGCCTGAGGAGATCACCGGCATCATGAAGGATTTCGACGAGCCGGGGCACCTC 180 GCCCCCACCGGCATGTTCGTCGCAGGTGCCAAGTACATGGTCATCCAGGGTGAACCCGG T 2 4 0 CGCGTCATCCGTGGCAAGAAGGGAGCAGGAGGCATCACCATAAAGAAGACCGGGCAGGCG 300 CTGGTCGTCGGCATCTATGACGAGCCCATGACCCCTGGGCAGTGCAACATGGTGGTGGAG 360 35 AGGCTTGGCGACTACCTCGTTGAACAAGGCATG . 393 _ · t (12) Tiedot SEQ ID nro llrsta 37 104983 (i) Sekvenssin ominaispiirteet: (A) Pituus: 131 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo 5 (C) Juosteet: ei voida soveltaa (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylin tyyppi: peptidi, P14(T)-allergeeni (iii) Hypoteettinen: ei (iv) Vastakkaisen juosteen: ei voida soveltaa 10 (v) Fragmentin tyyppi: ei voida soveltaa (vi) Alkuperäinen lähde: (A) Eliö: Phleum pratense (vii) Välitön lähde: ei voida soveltaa (viii) Asema genomissa: ei voida soveltaa 15 (ix) Erikoispiirteet: (D) Muut tiedot: Aminohappoidentiteetti Betula vpy-rucosan P14-allergeenin kanssa on 77 %.

(x) Julkaisutiedot: ei voida soveltaa (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID nro 11: 20 15 10 15

Met Ser Trp Gin Thr Tyr Vai Asp Glu His Leu Met Cys Glu lie 20 25 30

Glu Gly Hls His Leu Ala Ser Ala Ala Ile Leu Gly His Asp Gly 35 40 45

Thr Vai Trp Ala Gin Ser Ala Asp Phe Pro Gin Phe Lys Pro Glu 50 55 60 *·. yc Glu Ile Thr Gly Ile Met Lys Asp Phe Asp Glu Pro Gly His Leu 65 70 75

Ala Pro Thr Gly Met Phe Vai Ala Gly Ala Lys Tyr Met Vai Ile 80 85 90

Gin Gly Glu Pro Gly Arg Vai Ile Arg Gly Lys Lys Gly Ala Gly 95 100 105

Gly Ile Thr Ile Lys Lys Thr Gly Gin Ala Leu Vai Vai Gly Ile 110 115 120

Tyr Asp Glu Pro Met Thr Pro Gly Gin Cys Asn Met Vai Vai Glu 125 130

Arg Leu Gly Asp Tyr Leu Vai Glu Gin Gly Met

Claims (10)

1. 38 104983
2. 1. Yhdistelmä-DNA-raolekyyli, tunnettu siitä, että se käsittää DNA:n, joka koodittaa sellaista po-5 lypeptidiä, jolla on kokonaan tai osittain sekvenssiluet- telossa SEQ ID nro 3:n määrittelemän mukainen aminohapposekvenssi ja joka on ainakin yksi epitooppi kasvin, etenkin heinän, rikkaruohojen tai lahkon Fagales puiden, P14-allergeenista.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA- molekyyli, tunnettu siitä, että allergeeni valitaan P14-allergeeneista ryhmästä, jonka muodostavat koivu, leppä, pähkinäpensas, valkopyökki ja tammi.
4. 3. Replikoitavissa oleva mikrobiekspressiovehikke- 15 li, tunnettu siitä, että se kykenee, transfor moidussa yksisoluisessa isäntäorganismissa, repiikoitumaan ja ohjaamaan patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen DNA:n ekspressiota kyseisen polypeptidin tuottamiseksi.
5. 4. Yksisoluinen prokaryootti- tai eukaryootti-isän- 20 täorganismi, tunnettu siitä, että se on transfor moitu patenttivaatimuksen 3 mukaisella mikrobiekspres-siovehikkelillä, joka kykenee kyseisessä organismissa replikoituinaan ja ohjaamaan patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen DNA:n ekspressiota kyseisen polypeptidin tuottami- 25 seksi. : 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen isäntäorganismi, tunnettu siitä, että se on Escherichia coli.
6. 6. Menetelmä sellaisen polypeptidin tuottamiseksi, jossa on ainakin yksi epitooppi P14-allergeenista, 30 tunnettu siitä, että viljellään sellaista yk sisoluista isäntäorganismia, joka sisältää mikrobiekspres-siovehikkelin, joka kykenee kyseisessä isäntäorganismissa replikoitumaan ja ohjaamaan patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen yhdistelmä-DNA:n ekspressiota kyseisen polypepti-35 din tuottamiseksi. « 39 104983
7. 7. Koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää sellaisen polypeptidin, jossa on ainakin yksi epi-tooppi P14-allergeenista, ja joka on tuotettu patenttivaatimuksen 6 mukaisella menetelmällä.
8. 8. Koostumus, tunnettu siitä, että se kä sittää sellaisen polypeptidin, jossa on ainakin yksi epi-tooppi P14-allergeenista, ja joka on tuotettu kemiallisella synteesillä kokonaan tai osaksi sekvenssiluettelon SEQ ID nro 3:n mukaisesti.
9. 9. Menetelmä vasta-aineiden havaitsemiseksi, tunnettu siitä, että saatetaan nisäkkään seerumi yhteyteen patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisen koostumuksen kanssa ja havaitaan mahdollinen immunologinen reaktio seerumissa olevien vasta-aineiden ja kyseisen polypepti- 15 din, jossa on ainakin yksi P14-allergeenin epitooppi, vä lillä.
10. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että havaittu vasta-aine on IgE-vasta-aine. 20 « . * * 40 104983