NO304189B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid som har minst en epitop fra P14-allergenet fra planter, rekombinant DNA-molekyl, replikerbar mikrobiell ekspresjonsvektor, vertsorganisme, samt anvendelse av polypeptidet - Google Patents

Description

1. O ppfinnelsens område

Oppfinnelsen angår fremgangsmåte til fremstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid som er definert i sekvensidentifikasjon nummer 3 eller et i høy grad homologt polypeptid med tilsvarende biologisk aktivitet, som har minst en epitop til et P14-allergen fra planter, særlig gress, ugress og trær fra orden Fagales, rekombinant DNA-molekyl som koder for polypeptidet, replikerbar ekspresjonsvektor, vertsorganisme og anvendelse av det angitte polypeptid til å detektere antistoffer.

2. Oppfinnelsens bakgrunn

Om våren lider store deler av befolkningen i sentrale, østlige og nordlige Europa, Amerika og Australia av allergiske symptomer (rinitt, konjunktivitt, dermatitt og pollenastma). Proteiner som kan isoleres fra pollen fra trær tilhørende orden Fagales, særlig fra bjerkepollen, svartorpollen, hasselpollen, agnbøkpollen og eikepollen, er ansvarlig for de fleste av disse allergiske symptomer (1).

Minst 10% av befolkningen lider av pollenallergier på forskjellige tidspunkt og i variererende grad. Disse allergier medieres av IgE antistoffer som reagerer med pollenproteiner. Det eksisterer en mulighet for behandling av pollenallergier ved hyposensibilisering, dvs. ved regelmessig og langsomt økende administrering av proteinene som frembringer allergien.

Diagnostiske fremgangsmåter ved allergiske sykdommer, såsom RIA (radio-immunoanalyse), IRMA (immuno-radiometrisk analyse), RAST (radio-allergosorbent undersøkelse), ELISA (enzymbundet immunosorbentanalyse), magnetisk allergoabsorbent test, immunoblot, LIA (luminisens immuno-analyse), histaminfrigjøringsanalyser og andre, avhenger i stor grad av til-gjengeligheten av rene allergener. Proteinekstrakter fra pollen, isolert fra naturlige kilder, er vanskelig å standardisere fordi preparatene varierer fra porsjon til porsjon. For eksempel kan de inneholde uønskede bestanddeler, og/eller visse proteiner kan tapes i ekstraksjonsfremgangsmåten og mangle i den endelige separering (2). Det er klart at diagnostiske tester som anvender vel definerte allergener, som kan fremstilles reproduserbart, ville være bedre enn tester som anvender rå pollenekstrakter med en utilstrekkelig definert blanding av allergener og andre komponenter. Rekombinant DNA fremstilling av allergene polypeptider, eller allergene fragmenter derav, ville gi mer reproduserbare preparater av allergener med definert innhold for standardiser-te diagnostiske og terapeutiske fremgangsmåter.

Allergener kan renses til homogenitet fra pollen ved kjente protein/kjemiske fremgangsmåter, f.eks. ved hjelp av affinitetskromatografi (3). Disse fremgangsmåter er relativt kostbare og krever pollen, som er en dårlig definert kilde som ikke kan standardiseres. Det ville derfor være billigere og mer effektivt å anvende rekombinant DNA-fremgangsmåter for å fremstille et allergent protein og fragmenter av dette protein.

Hyposensibilisering har vist seg å være en effektiv terapi ved allergiske sykdommer. Denne terapi består av parenteral eller oral administrering av allergener i økende doser over en relativt lang tidsperiode. I likhet med diagnostiske fremgangsmåter krever den rene og veldefinerte allergener. Anvendelse av rensede rekombinante allergener eller syntetiske peptider ville i stor grad redusere risikoen for å sensibilisere pasienter til uønskede komponenter.

3. Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse angår pollenallergener, f.eks. fra hengebjerk ( Betula verrucosa). benevnt P14. Disse pollenallergener er immunologisk nær beslektet med allergener som finnes i pollen hos fjernt beslektede plante-sorter, særlig i trær tilhørende orden Fagales (bjerk, svartor, hassel, agnbøk og eik), i gressorter og ugressorter. Kryssreaktiviteten til IGE antistoff fra pasienter på disse pollenallergener er illustrert i fig. IA og IB.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåte til fremstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid, rekombinante DNA-molekyler som inneholder en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid, som utviser den samme eller lignende antigen-egenskaper som et naturlig allergen, Pl4, som finnes i trær tilhørende orden Fagales og andre pollenproduserende planter, eller et polypeptid som omfatter minst én epitop til slike allergener. Oppfinnelsen tilveiebringer den fullstendige cDNA-sekvens til et P14-allergen og følgelig den fullstendig deduserte aminosyresekvens. I tillegg inkluderer oppfinnelsen (a) nukleotidsekvenser som hybridiserer med en slik cDNA-sekvens under høy stringens og koder et polypeptid som har minst én epitop til et Pl 4-allergen og (b) nukleotidsekvenser som kan avledes fra slike allergene polypeptider ved degenerasjon av den genetiske kode. Denne nukleotid sekvens kan uttrykkes som et P14-allergen, eller som et polypeptid som omfatter minst én epitop derav. En foretrukket utforming inneholder denne cDNA sekvens, hele sekvensen eller deler av sekvensen oppført i sekvenslisten som sekvensidentifiseringsnummer 2.

Når det gjelder deres IgE binding, har pollen fra bjerk, svartor, hassel,

agnbøk, eik, gressorter og ugressorter lignende allergener som P14-allergenet. Den foreliggende oppfinnelse angår derfor ikke bare et P14 allergen fra bjerk, men likeså P14 pollenallergener fra andre sorter som kodes ved DNA-sekvenser, som er istand til å hybridisere med nukleotidsekvensen til et bjørke-P14-allergen under stringente betingelser, eller kan avledes fra et slikt polypeptid ved degenerasjon av den genetiske kode. Hybridisering av et polynukleotid med et annet polynukleotid under stringente betingelser krever minst 60% identitet mellom slike polynukleotider på nukleinsyrenivå.

Slike stringente betingelser omfatter vasking av hybridiserte nitrocellulose-filtre som følger: a) For DNA/DNA og DNA/RNA hybridiseringer: En temperatur på 55°C, en saltkonsentrasjon på 150 mM NaCl og 15 mM Na3citrat x 2 H20, ved pH-verdi 7,0 og SDS (natrium dodecylsulfat) detergent ved en konsentrasjon på 0,1% (vekt/volum). b) For oligodeoksynukleotider/DNA-hybridiseringer: En temperatur på 55°C, en saltkonsentrasjon på IM NaCl og 10 mM Na3citrat x 2 H20, ved pH-verdi

7,0 og SDS (natriumdodecylsulfat) detergent på en konsentrasjon på 0,5%

(vekt/volum). I denne sammenheng betegner "oligodeoksynukleotid" et oligomer av en enkelttrådet DNA med en lengde på opptil 100 nukleotider.

I tillegg tilveiebringer denne oppfinnelse ekspresjonsplasmider som inneholder en nukleotidsekvens som beskrevet ovenfor og vertsceller som inneholder disse ekspresjonsplasmider.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også sammensetninger som inneholder syntetiske polypeptider, som utviser antigenisitet til deler av eller hele bjørke-P14-allergen eller av allergener fra andre planter som, pga. en stor grad av aminosyrehomologi utviser antigenkryssreaktivitet til deler av eller til hele bjerke-P14-allergen, dvs. antistoffer eller cellulære antigen-bindende seter, som virkelig er rettet mot bjørk-P14-allergen er på samme måte istand til å bindes til disse molekyler. Disse syntetiske polypeptider omfatter fusjons- og ikke-fusjonspolypeptider, som inneholder en poly-peptiddel som har antigenisiteten til en del av eller hele P14-allergenet. Fremgangsmåten for fremstilling av slike syntetiske polypeptider omfatter følgende trinn;

dyrking av prokaryote eller eukaryote vertsceller, som inneholder et ekspre-sjonsplasmid beskrevet ovenfor, og,

rensing av det (de) syntetiske polypeptid (er) fra kulturen.

Betegnelsen "syntetisk" inkluderer her alternativt polypeptider som er fremstilt ved kloning og ekspresjon av nukleotidsekvensene beskrevet her, eller ved kjemisk syntese av polypeptider kodet av disse nukleotidsekvenser.

De syntetiske polypeptider, som fremstilles i henhold til den foreliggende oppfinnelse, utviser den samme eller liknende antigenisitet som det native allergen. Som vist nedenfor kan en cDNA-klon, som koder for et bjerk P14, anvendes til å fremstille et ikke-fusjonspolypeptid som reagerer med IgE i sera fra allergiske personer. Det er derfor mulig å anvende dette polypeptid som et antigen i diagnostiske tester (såsom RAST, ELISA, Immunoblot og andre kjent i fagområdet og referert til ovenfor) og som en komponent i terapeutiske midler i hyposensibiliseringsterapi.

Spesielt kan de syntetiske allergener anvendes som diagnostiske reagenser in vitro og in vivo, siden deres antigenisitet tilsvarer den til de native Pl 4-pollenallergener og de er derfor istand til å binde IgE i sera fra personer som lider av P14 pollenallergi.

Det er derfor en av hensiktene med den foreliggende oppfinnelse å tilveie-bringe en fremgangsmåte for fremstilling av pollenallergener, spesielt for bjerk P14 allergener, slik at denne familie av allergener er tilgjengelige for diagnostiske tester for deteksjon av tilsvarende allergi og, alternativt for hyposensibiliseringsterapi.

I tillegg, som vist nedenfor, ble bjerk-P14-cDNA uttrykt i to prokaryote

ekspresjonssystemer i Escherichia coli, og den IgE-bindende kapasitet til de uttrykte polypeptider, et fusjonsprotein og et ikke-fusjonsprotein, ble demonstrert. Denne ekspresjon kan også oppnås i hvilken som helst annen mikroor-ganisme (dvs. eukaryote celler). Den IgE-bindende kapasitet ble også demonstrert for en delsekvens som ble uttrykt, ved å anvende lambda gtl 1, som et

B-galaktosidase fusjonsprotein. På denne måte ble det demonstrert at denne partielle sekvens representerer minst én IgE-bindende epitop. I tillegg kan det konkluderes fra resultatene i IgE immunoblots, kryssinhibisjonstester, kliniske tester og Northern (RNA) blots (4-9) (fig. IA, IB og 3) at homologe IgE-bindende polypeptider eksisterer i pollen fra nær beslektede trær, tilhørende ordenen Fagales, og for fjernt beslektede pollenproduserende planter. Av denne grunn tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse polypeptider som utviser den samme eller lignende antigenisitet som de beslektede P14-pollenallergener fra bjerk, svartor, hassel, agnbøk, eik, gressorter og ugressorter.

Et datamaskinsøk i de tilgjengelige sekvens databanker (EMBL, MIPSX, Swissprot) for proteiner hvis sekvenser deler homologi med bjerk-P14, ga signifikant homologi mellom P14 og et cytoskjelettprotein (profilin), som er tilstede et utvalg av eukaryote celler (10-14) (fig. 5). Denne homologi skaper muligheten til kryssreaktivitet av IgE antistoff fra pasienter med humant profilin. Denne autoreaktivitet er blitt vist (fig. 12).

På denne måte kan det undersøkes om et molekylært system tillater testing av hypotesen: om autoimmune mekanismer spiller en rolle i allergiske og atopiske sykdommer. Initielle data viser at pasienter hvis IgE-antistoffer reagerer med P14 representerer en gruppe som lider av allergiske symptomer i storparten av året og som ikke reagerer tilfredsstillende på immunterapi eller konvensjonell terapi. Det følger av dette at P14, eller rekombinante eller kjemisk syntetiserte IgE-bindende polypeptider med sekvenser som passer til sekvensen dedusert fra P14-cDNA, kan anvendes til å karakterisere en viss gruppe av multivalente allergier, såvel som en prognostisk markør for hyposensibiliseringsterapi.

I tillegg presenterer den foreliggende oppfinnelse en effektiv metode for fremstilling og rensing av pollenprotein såvel som rekombinante eller syntetiske P14-polypeptider eller allergene fragmenter derav. Rensefremgangs-måten er basert på affiniteten av profilin polypeptider for poly(L-prolin), (15,16), og i den foreliggende søknad er det vist homologi mellom profiliner og P14-allergener. Siden bindingen av pollenprotein og av rekombinant P14 til poly(L-prolin) er blitt vist her (fig. 8, 9 og 10), er derved en fremgangsmåte tilveiebragt for immobilisering (og affinitets separasjon) av dette allergen. Således kan visse diagnostiske tester settes opp (f.eks., poly(L-prolin) og kan anvendes istedet for et antistoff for binding av profilin i ELISA). Likeledes er terapiformer mulig som ved hjelp av poly(L-prolin) binder P14 og analoge polypeptidallergener. Siden det er indikasjoner på at pasienter, som lider av autoimmunsykdommer, danner antistoffer mot Pl4, kunne dette polypeptid eller homologe polypeptider anvendes til diagnose eller terapi av disse sykdommer.

4. Kort beskrivelse av figurer

De følgende figurer og beskrivelse fremmer forståelsen av området og rekkevidden av oppfinnelsen.

Fig. IA: IgE immunblot: Pollenproteiner fra bjerk (B), agnbøk (CA), svartor

(A) og hassel (C) ble separert ved hjelp av en 12,5% polyakrylamid-elektroforese og blottet på nitrocellulose. Nitrocellulosen ble skåret i

strimler (1-5) som ble inkubert med oppløsninger av et serum (hen-holdsvis 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80) fra en utvalgt pasient, hvis IgE-antistoffer gjenkjente de viktigste bjerkepollenallergener. Piler og

stjerner angir molekylvekter. Bundet serum IgE ble detektert ved hjelp av autoradiografi av<125>I-merket antihumane IgE-antistoffer fra kanin, bundet til seg. De IgE-bindende proteiner fra bjerk, svartor, hassel og agnbøk passer til hverandre, hvilket demonstrerer likheten av antigenene.

Fig. IB: IgE immunblot inhibisjon: Burotprofilin, som var blitt renset ved poly(L-prolin) affinitetskromatografi, ble blottet på nitrocellulose etter polyakrylamidgelelektroforese. En 1:10 oppløsning av serum fra en pasient, allergisk mot bjerkeprofilin, ble preinkubert i felt 1 med kontrollproteiner fra E. coli, i felt 2 med rekombinant bjerkeprofilin, i felt 3 med renset profilin fra Phleum pratense (gress) og i felt 4 med buffer (negativ kontroll) og brukt til deteksjon av burotprofilin. Binding av pasienters IgE til burotprofilin kan blokkeres med rekombinant bjerkeprofilin og renset gressprofilin, som demonstrerer felles IgE-bindende egenskaper til disse beslektede proteiner. I kontrollfeltene 1 og 4 skjer binding av pasienters IgE til burotprofilin. Fig. 2: IgE immunblot: Proteiner ble separert ved hjelp av en 7,5% polyakrylamidgelelektroforese og blottet på nitrocellulose. Felt B: Bjerkepollenproteiner; felt 1: proteiner fra E. coli Y1089 (lysogen vert); felt 2: proteiner fra E. coli Y1089 inokulert med lambda gtll fag uten innskudd: felt 3: proteiner fra E. coli Yl089 inokulert med en rekombinant fag som inneholder et bjerkepollen-avledet cDNA som koder et IgE-bindende polypeptid (positiv kontroll); felt 4: proteiner fra E. coli Yl089 inokulert med rekombinante fager som inneholder 3'-porsjonen av P14-cDNA, som koder for en IgE-bindende epitop (som understreket i fig. 4); felt 5: proteiner fra gjær ( Saccharomyces cerevisiae). Rekombinant B-galaktosidase fusjons-proteiner med IgE-bindende kapasitet hvis molekylvekter var mellom 115 og 130 kD (felt 3 og 4) ble detektert med<125>I-merket antihumant IgE antiserum fra kanin. Ingen sammenlignbar IgE-binding finner sted i felt 1, 2 og 5, mens felt B viser pasientens IgE-bindende profil med bjerkepollenproteiner. Fig. 3: Northern (RNA) blot: 10 ug pollen-RNA fra svartor (felt A), bjerk (felt B) og hassel (felt C) og som et markør-RNA fra E. coli (felt M) ble blottet på ny på cellulose. En del av P14 cDNA understreket i fig. 4 hybridiserer med pollen mRNA fra svartor, bjerk og hassel og under stringente betingelser (0,75 x SSC, 0,1% SDS, 50°C) produseres et signal på 800 baser (angitt ved en pil). Posisjonen til ribosomale bånd er angitt ved "28S" og "18S". Fig. 4: cDNA sekvens fra bjerk P14. Den kodende region begynner med ATG (nukleotid 80-82) og slutter med stoppkodonet TAG (nukleotider 479-481). Den deduserte aminosyresekvens er illustrert under DNA-sekvensen. P14-sekvensen, som i et fusjonsprotein er istand til å binde IgE hos pasienter og derfor representerer minst en epitop, er vist understreket (se seksjon 5.4). Fig. 5: Sammenligning av den avledede aminosyresekvens til bjerk P14 med aminosyresekvenser i profiliner fra mennesker (13), kalv (14), mus (12), gjær (11) og Acanthamoeba (10). Identiske aminosyrerester er

merket. Prosenten av identiske aminosyrerester mellom P14-protein fra bjerk og homologer beløper seg til 30% for humant protein, 28% for homologe proteiner fra kalv og mus, 26% for gjærprotein og 25% for Acanthamoeba-protein.

Fig. 6: Western (protein) blot av en polyakrylamidgel probet med IgE

antistoffer fra pasienter med trepollenallergi. Felt 1: Proteiner fra R coli JM105 uten noe plasmid; felt 2: proteiner fra E. coli JM105 med plasmidet pKK223-3 uten et innskudd; felt 3 og 4: proteiner fra E. coli JM105 med det plasmidet, avledet fra pKK223-3, som uttrykker P14-proteinet fra det innskutte cDNA som ikke-fusjonsprotein; felt 5: E. coli AR58 proteiner; felt 6: E. coli AR58 med

plasmidet pEXB uten et innskudd; felt 7 og 8 ekstrakter fra E. coli AR58 transformert med plasmidet derivert fra pEXB som uttrykker P14 cDNA som fusjonsprotein; felt 9: bjerkepollenproteinekstrakt (positiv kontroll). Fig. 7: Sera fra forskjellige allergiske pasienter ble testet for sin IgE-reaktivitet med hensyn på rekombinant P14 som ble uttrykt i pKK223-3. Pasienter (felt) D, E, F, I, J, og P viser IgE-binding til det rekombinante Pl4. Felt R er sammenslått serum fra ikke-allergiske individer. Det rekombinante P14 ble ikke renset og, derfor ble reaktivitet av pasienters IgE med proteiner fra E. coli observert. Fig. 8: Coomassie-farget polyakrylamidgel. Felt M: molekylvektmarkør; felt 1: totale pollenproteiner fra bjerk; felt 2: bjerkepollenproteiner hvorfra P14 ble fjernet ved affinitetsfremgangsmåten (gjennom-strømning); felt 3, 4 og 5: eluert Pl4. Proteiner ble applisert på gelen og farget for å angi migrasjon. Som sees fra felt 3, 4 og 5 kan P14 renses ved affinitetskromatografi til poly(L-prolin) Sepharose. Fig. 9: IgE immunblot: En probe av proteiner oppnådd på samme måte som i fig. 8 ble overført til nitrocellulose og inkubert med et serum IgE fra en pasient som gjenkjenner de fleste bjerkepollenallergener. Felt 1-5 inneholder det samme materiale som i fig. 8; felt 6 inneholder molekylvektmarkør. Dette immunblot viser at bjerkeprofilin kan renses til tilsynelatende homogenitet fra andre allergener. Fig. 10: Coomassie-farget polyakrylamidgel. Felt M: molekylvektmarkør; felt 1: totale proteiner fra E. coli JM105 med plasmidet avledet fra pKK223-3 som uttrykker P14 cDNA; felt 2: proteinfraksjon etter fjerning av den rekombinante P14 ved affinitetskomatografi til poly(L-prolin) Sepharose; felt 3 og 4: renset rekombinant Pl 4-eluerte fraksjoner. Fig. 11: Commassie-farget polyakrylamidgel. Felt M: molekylvektmarkør; felt 1: total protein fra E. coli JM105 med plasmidet pKK223-3 uten innskudd; del 2: proteinfraksjon etter poly(L-profilin)-rensing; felt 3, 4 og 5: eluerte fraksjoner. Disse resultater viser at intet protein med lignende egenskaper som P14 kan isoleres fra ekspresjonssystemet uten innskudd. Fig. 12: IGE-immunblot: renset humant profilin ble fylt på en 12% polyakrylamidgel og blottet på nitrocellulose. Strimler av nitrocellulosen ble skåret ut og inkubert som følger: strimmel 1 ble inkubert med serum IgE fra en pasient som gjenkjenner, ved siden av P14 og de viktigste bjerkepollenallergener, Bet v I allergener i molekylområdet mellom 30 og 90 kD. Strimmel 2 ble inkubert med serum IgE fra en pasient som gjenkjenner bare P14 i bjerkepollenekstrakter; strimmel 3 ble inkubert med serum fra en pasient hvis serum IgE var rettet bare mot Bet v I; strimmel 4 ble inkubert med serumet fra en pasient som var allergisk for midd; strimmel 5 med serum fra en gruppe av ikke-allergiske donorer og strimmel 6 viser bufferkontrollen. IgE-binding ble detektert med et<125>I-merket antihumant IgE antiserum fra kanin. Kryssreaktivitet ble vist for strimmel 1 og 2. Disse data demonstrerer at serum IgE som reagerer med bjerkepollen også kryssreagerer med humant profilin. Fig. 13: IgE-inhibisjon: Renset selleriprofilin ble utsatt for SDS-page, blottet med nitrocellulose (1 ug/cm). Nitrocellulosestrimler ble inkubert med 1:10 oppløsninger av sera fra pasienter, allergiske for bjerkepollen-profilin (felt 1-3), fra pasienter allergiske for det viktige bjerkepollenallergen Bet v L men ikke til profilin, sammenslått serum fra ikke-allergiske individer (felt 4) og med buffer uten tilsetting av serum (felt 5). Serumoppløsningene ble hver preinkubert med 5 ug renset, rekombinant bjerkeprofilin (rP), 5 ug BSA (BSA) og med serumfortynnende buffer (P). Binding av IgE fra pasientene 1-3 til selleriprofilin kan blokkeres med renset rekombinant bjerkeprofilin, som angir felles IgE epitoper for bjerk og selleriprofilin. Fig. 14: Immunblots: Renset selleriprofilin (C) og rekombinant bjerkeprofilin (rP) blir gjenkjent av kanin antiselleriprofilinantistoff (R: felt 1). Rekombinant bjerkeprofilin binder også pasienters IgE (IgE: felt 1). Ingen binding observeres i felt 2 (buffer kontroll uten tilsetting av antistoff eller serum). Fig. 15: Immunblots: Renset profilin fra rug ( Secale cereale S) og fra burot ( Artemisia vulgaris M) binder kanin antiselleriprofilin antistoff (felt 1) mens ingen binding ble funnet for bufferkontrollen (felt 2).

Bundet kaninantistoff i fig. 14 og 15 ble detektert med<125>I-esel-antikaninantistoff fra Amersham, UK. Bundet serum IgE i fig. 13 og 14 ble detektert med<125>I-esel-antikaninantistoff fra Amersham, UK. Bundet serum IgE i fig. 13 og 14 ble detektert med<125>I-kanin-anti-humant IgE fra Pharmacia, Sverige. Fig. 16: cDNA og dedusert aminosyresekvens til profilin fra pollen av timotei ( Phleum pratense). Fig. 17: IgE-binding av pasienters IgE til plakkavtryksfiltere (plaquelifts) av lambda gtl 1 fag, som inneholder cDNA-innskudd, som koder timoteiprofilin. 30 gresspollenallergiske pasienter testet for IgE-binding til lambda gt 11 fager, som uttrykker profilin fra timotei, som var bundet til nitrocellulosesektorer. Sektor 31 viser sammenslått serum fra ikke-allergiske individer og sektor 32 bufferkontroll uten tilsetting av serum. Serum IgE fra pasienter 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 17, 18, 21, 23, 26, 27, 28, 29 og 30 bundet til rekombinant timoteiprofilin uttrykt i lambda gtll. Alle disse pasienter viste også IgE-reaktivitet til bjerkeprofilin. Pasient 1, 3, 4, 5, 13, 14, 16, 19, 20, 22, 24 og 25, som var allergiske for andre gresspollenallergener viste ingen IgE-reaktivitet til timoteiprofilin. Bundet serum IgE ble detektert som beskrevet i fig. 13.

5. Eksempler

Oppfinnelsen kan forstås med referanse til de følgende eksempler:

5.1 Konstruksjon av cDNA genbank

Pollen (Allergon AB, Engelholm, Sverige) som ble undersøkt med hensyn på renhet ved hjelp av lys- og elektronmikroskopi, ble anvendt til isolering av polyadenylert RNA (17, 18). cDNA-syntese ble utført med oligo-dT og tilfeldige primere (19, 20). Endene av cDNA ble rent fordøyd med T4-poly-merase og forsynt med EcoRI-linkere. cDNA med linkere ble ligert og pakket inn i defosforylerte lamda gtll armer (21). cDNA genbank på 800 000 uavhengige kloner ble fremstilt.

5.2 Screening av cDNA genbanken

IgE-screening av bjerkepollen cDNA genbank ble utført som beskrevet (22). IgE-bindende kloner ble anriket og fag DNA ble fremstilt derfra (23). Inn-skuddene ble kappet med EcoRI og fragmentene ble subklonet i plasmidet pUC18 (24). DNA-sekvensen til en klon ble oppnådd (25). Skjønt den var fullstendig i 3'-enden (poly-A hale), manglet den en del av 5'-enden, også inkludert startkodonet. Denne delsekvens er understreket i fig. 4. Derfor ble den originale genbank igjen sortert med oligodeoksynukleotider, som var komplementære til den kodende regionen (26), og to uavhengige kloner ble oppnådd.

5.3 RNA ( Northern) blot

10 ug av total RNA fra pollen av svartor, bjerk og hassel ble separert ved hjelp av en denaturerende gelelektroforese og blottet på nitrocellulose (27, 28). En P14 cDNA probe, som understreket i fig. 4, ble<32>P-merket ved hjelp av tilfeldig priming (29). Prehybridisering og hybridisering ble utført ved standard fremgangsmåter (23). Blottene ble vasket med 0,75 x SSC (20xSSC = 3M NaCl, 0,3M Na3-sitrat, pH-verdi 7,0), 0,1% SDS (natriumdodecylsulfat) ved 50°C og autoradiografert (Hyperfilm MP, Amersham, London, UK).

5.4 Ekspresjon av bjerk P14 cDNA

5.4.1 Ekspresjon av 3'- enden av cDNA i lamda gtll fager ( fig. 2)

En ufullstendig DNA-klon som koder for en del av P14 ble oppnådd ved hjelp av IgE-screening (22), som beskrevet i seksjon 5.2. Den lysogene R coli stamme Y1089 ble inokulert med rekombinant lamda gtll fag, som inneholder et innskudd som understreket i fig. 4, og 6-galaktosidase fusjonsprotein ble gjenvunnet fra blandingen (19). Konstruksjonen ville forutsi at et fusjonsprotein, som har en molekylvekt på 116 kD, ville bli fremstilt. Blandingen ble utsatt for elektroforese på en 7,5 polyakrylamidgel og ble blottet på nitrocellulose. Fusjonsproteinet ble detektert ved hjelp av IgE-antistoffer i pasientserum og et J-merket kanin anti-humant IgE antistoff (Pharmacia, Uppsala, Sverige) (fig. 2). Som vist i fig. 2 ble det observert et fusjonsprotein som har en molekylvekt omkring 115 kD og som er istand til å bindes til IgE antistoffer.

5.4.2. Ekspresjon av fullstendig P14 cDNA som fusjons- og ikke- fusions-protein

Det cDNA som koder for P14 inneholder et prokaryot ribosombindende sete (Shine-Dalgarno sekvens (30)) og ble innskutt i EcoRI setene til plasmidene pKK223-3 (31) eller pEXB (32) for å oppnå P14 som et ikke-fusjonsprotein eller et fusjonsprotein av P14 med lambda ell protein. IgE-bindende kloner ble oppnådd ved hjelp av serum IgE og en koloni-sorteringsfremgangsmåte (33), og de ble undersøkt ved hjelp av DNA restriksjonsanalyse. Rekombinante proteiner ble testet for sin bindingskapasitet med hensyn på pasient IgE antistoffer, som beskrevet (22) (fig. 6).

5.5 Rensing av bjerkepollen P14 og rekombinant P14

P14 fra bjerkepollen og rekombinant P14 ble renset ved hjelp av en affinitets-metode med en porsjonsfremgangsmåte (jfr. 15, 16) som er egnet for profi linene fra Acanthamoeba (10), gjær (11) og mennesker (13). Bjerkepollen og E. coli celler, som inneholder plasmider som koder for Pl 4, ble ly sert i PHEM-TX buffer (2 x PHEM-TX: 120 mM PIPES (piperazin-l,4-bis(2-etansulfonsyre)), 50 mM HEPES (N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfon-syre), 20 mM EGTA (etylenglykol-bis(B-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetraeddik-syre), 4 mM MgCl2, 10 mM glukose, 20 ug/ml leupeptin, 156 ug/ml benza-midin, 80 ug/ml aprotinin, 1 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid), 1,5% Triton-X100, pH 7,2) og lysatene ble sentrifugert i en time ved 65000 x g på 4°C. Supernatanten ble inkubert natten over ved 4°C med poly(L-prolin) koblet til BrCN-aktivert Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala, Sverige).Deretter ble affinitetmatriksen vasket tre ganger med et dobbelt volum hver gang av TBS-ATP (20 nM TRIS, 150 nM NaCl, 0,5 mM ATP (adenosin trifosfat), pH-verdi 7,6) og deretter eluert i 5 minutter ved værelsestemperatur med et dobbelt volum elueringsbuffer I (TBS-ATP med 2M urea). Supernatanten ble oppsamlet. Fremgangsmåten ble gjentatt to ganger med elueringsbuffer II (TBS-ATP med 6 M urea) og supernatantene ble dialysert mot destillert vann ved 4°C. Dialysatene, som inneholdt proteinene, ble lyofilisert og analysert ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese og IgE immunblot (fig. 8, 9, 10 og 11).

5.6 IgE - bindende kapasitet hos et protein uttrykt fra et fragment av P14

cDNA som inneholder en IgE - bindende epitop

3'-regionen av P14 cDNA (bp 419-478) ble klonet inn i EcoRJ setet til lambda gtll og uttrykt som et IgE-bindende polypeptid (21) som vist i fig. 2. B-galaktosidase fusjonsproteinet (felt 4) bandt seg sterkt til IgE fra pasienten, mens kontrollfeltene 1 og 2 utviste ingen IgE-binding for proteinene fra E. coli Yl089 og proteinene fra E. coli Yl089 som ble inokulert med lambda gtll fag uten et innskudd. Dette eksempelet viser at en partiell cDNA-klon, som koder for et protein som har minst én epitop fra P14-molekylet, ble oppnådd. Det følger av dette at partielle cDNA-kloner som koder for slike

ufullstendige P14 polypeptider kan være nyttig for en terapi eller diagnose på en lignende måte som det fullstendige P14-molekyl eller homologe proteiner.

5.7. Demonstrasjon av polvnukleotider og polypeptider som er homologe

til Pl4, tilhørende orden Fagales

Northern (RNA) blot (fig. 3) viser at P14 cDNA-sekvensen (polynukleotidet understreket i fig. 4) er istand til å krysshybridisere med pollen mRNA fra svartor og hassel under stringente betingelser (stringenskrav er definert i 3. Oppsummering av oppfinnelsen). Derfor kan sekvenshomologien til de tilsvarende allergener fra trær tilhørende orden Fagales allerede bli demonstrert på nukleinsyrenivå. Fig. IA viste allerede en lignende IgE-bindende kapasitet for proteiner fra svartor, hassel og agnbøk, homologe til Pl4. Det følger fra dette at P14 cDNA koder for polypeptider med lignende IgE-bindende kapasitet og antigenisitet til nært beslektede trepollenallergener.

5.8. Sekvensanalvse

Fig. 4 viser sekvensen til cDNA som koder for bjerke-P14, og den deduserte aminosyresekvens til den kodende region. Den inneholder den fullstendige proteinkodende region. Sekvensen til peptidet som, koblet til B-galaktosidase, representerer en IgE-bindende epitop er understreket i figuren (se eksempel 5.4). Fig. 5 illustrerer sekvenshomologien mellom P14-protein til bjerk og til mennesker, mus, kalv, gjær og Acanthamoeba profiliner (13, 12, 14, 11, 10).

Kryssreaktiviteten til pasient IgE med bjørke-P14 og humant profilin er vist i fig. 12. Lignende kjemiske egenskaper for disse relaterte proteiner ble på samme måte vist ved deres felles affinitet til poly(L-prolin) (fig. 8 og 10). Disse data angir at profilinene til arter som er så langt fra hverandre, evolu-sjonsmessig betraktet, som mennesker og bjerk, er istand til å virke som kryssreaktive panallergener som kan føre til en IgE autoimmun reaktivitet hos pasienter.

5.9. Ekspresjon av P14 som koder cDNA i E. coli som fusjons- eller ikke- fusjonsprotein og deteksjon av IgE- bindende kapasitet til disse pol<y>peptider

Polynukleotidet gitt i fig. 4 (nukleotid 1-710) som koder for bjerke-P14 ble innskutt i plasmidet pKK223-3 slik at et rekombinant ikke-fusjonsprotein (31) kunne fremstilles, mens et rekombinant fusjonsprotein ble fremstilt i plasmidet pEXB (32). Reaktiviteten til disse polypeptider med pasient IgE er vist i fig. 6. Kontrollproteinekstrakter av E. coli i felt 1, 2, 5 og 6 binder ikke IgE, mens rekombinant bjerke-P14 uttrykt som et ikke-fusjonsprotein (felt 3 og 4) og som et fusjonsprotein (felt 7 og 8) binder IgE.

I fig. 7, ble sera fra personer som er allergiske til bjerkepollen (A-K), til gresspollen (L-N) og til burot (O-Q) og sammenslått serum fra ikke-allergiske individer (R), hvor alle pasientene hadde blitt selektert med hensyn på sin sykehistorie, RAST og hustest, testet for sin IgE-bindende kapasitet med rekombinant bjerke-P14. IgE fra sera D, E, F, I, J og P bandt seg til P14 uttrykt i pKK223-3.

Det følger av dette at den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et polynukleotid som koder for polypeptider som har lignende antigenisitet og lignende IgE-bindende kapasitet til P14-proteinet fra bjørk når polynukleotidet innskytes i den korrekte leseramme i et utvalg av ekspresjonssystemer. De IgE-bindende egenskaper til disse polypeptider ble vist for sera fra pasienter som utviser allergiske reaksjoner til forskjellige pollen og peker følgelig på den store kliniske betydning av disse polypeptider (fig. 7).

5.10 Rensin<g>av P14 fra pollen og av rekombinant P14 fra E. coli Som beskrevet ovenfor tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en enkel fremgangsmåte for rensing av naturlig såvel som rekombinant Pl4. Den Coomassie-fargede polyakrylamidgel i fig. 8 viser at rent P14 (felt 3, 4 og 5) kan separeres fra totalt pollenprotein (felt 1). Proteinene som ikke bindes til poly(L-prolin)-Sepharose er også kjent (felt 2). Effektiviteten av denne rensefremgangsmåte ble overvåket ved hjelp av IgE immunblotting (fig. 9), og for dette formål ble det anvendt serum fra en pasient som gjenkjenner de fleste bjerkepollenallergener med IgE antistoffer (felt 1 ble anvendt). Etter anvendelse av affinitetsfremgangsmåten, kan nesten intet P14 finnes (felt 2), mens renset P14 ble oppnådd i felt 3, 4 og 5.

Fig. 10 viser en polyakrylamidgel som demonstrerer rensing av rekombinant P14 fra E. coli JM105, som er transformert med plasmid pKK223-3, som bærer den P14-kodende sekvens. Rekombinant P14 (felt 3 og 4) ble renset fra totalproteinene ved affinitetskromatografi til poly(L-prolin) Sepharose (felt 1), de gjenværende proteinene er vist i felt 2. Fig. 11 viser at ingen homologe proteiner fra E. coli JM105, transformert med pKK223-3 uten innskudd, oppnås ved hjelp av den anvendte fremgangsmåte.

Som fig. 9, 6 og 7 viser, beholder det rensede protein (fra bjerk og E. coli) sin IgE-bindende kapasitet. Dette eksempelet viser således at den foreliggende oppfinnelse likeledes tilveiebringer en enkel og hurtig rensefremgangsmåte for P14, både som naturlig og rekombinant polypeptid. Ved å anvende poly(L-prolifm) for å rense, beholder både det naturlige og rekombinante P14 sin antigenisitet og IgE-bindende kapasitet. I tillegg gir fremgangsmåten anledning til å immobilisere (og separere ved affinitetsmidler) de immunologisk aktive polypeptider.

5.11. Allergiske og atopiske pasienters IgE- reaktivitet med humant profilin Forskjellige pasientsera ble selektert som følger (fig. 12): Pasient 1 viser IgE antistoffer som er rettet mot de fleste bjerkepollenallergener, inkludert Bet v I og Pl4, pasient 2 viser IgE-binding bare med P14 og pasient 3 bare med Bet y_I. Pasient 4 er en person som er allergisk for husstøvmidd og det sam-menslåtte serum 5 ble tatt fra ikke-allergiske individer. Strimmel 6 er kon-trollbufferen. Alle disse sera ble testet for sin IgE-bindende kapasitet med ikke rekombinant og rekombinant P14 og humant profilin. De pasienter (fig. 12), som gjenkjente det ikke rekombinante P14 fra bjerk, såvel som det rekombinante P14 fra E. coli, hadde også IgE-antistoffer mot humant profilin. Av denne grunn vises det for første gang indikasjoner på molekylnivå at autoimmunemekanismer kan spille en rolle ved atopiske og allergiske sykdommer. Siden pasienter med andre autoimmune sykdommer danner antistoffer mot Pl4, skulle det tilveiebringes en diagnostisk markør for disse sykdommer.

5.12. Korrelasjon av s<y>kehistorier fra atopiske og allergiske pasienter med

binding av IgE- antistoffer til P14

Sykehistoriene til pasienter som danner IgE-antistoffer mot P14 viser at alle lider av alvorlige allergiske symptomer, som er forårsaket av en stor variasjon av allergener (tre og gresspollen, midd, katt og hundeallergener), og at de har et elevert totalt IgE-nivå og viser et utilfredsstillende forløp i hyposensibiliseringsterapi. Det følger av dette at en positiv reaksjon på serum IgE fra pasienter med P14 er anvendbar som en god markør for differensiering av visse grupper av atopiske og allergiske pasienter.

5.13. Demonstrasjon av felles IgE- epitoper hos profiliner i mat ( selleri) og

pollen P14- allergen ( bjerk)

IgE-inhibisjonseksperimentene vist i fig. 13 angir at det er en felles IgE-bindende kapasitet hos proteiner som er homologe til P14-allergenet i pollen og matvarer. Renset rekombinant bjerkeprofilin, er, når det tilsettes pasientserum i væskefase før serum inkuberes med nitrocellulosebundet selleriprofilin, istand til fullstendig å blokkere bindingen av pasienters IgE til selleriprofilin. Dette angir at P14-allergenet hos bjerk (bjerkeprofilin) inneholder alle IgE-epitoper som kan finnes i selleriprofilin. Rekombinant bjerk P14 allergen er derfor egnet, ikke bare for diagnose og terapi av pollenallergier, men også for næringsmiddelallergier. Felles antigenisitet av bjerkepollen Pl 4-allergen og næringsmiddelprofiliner er også vist ved kryssreaktivitet av et kanin anti-selleriprofilin-antistoff med pollen P14 allergen (fig. 14 og 15).

5.14. Sekvenslikhet og felles IgE- bindende kapasitet for pollen P14

allergen fra hengebjerk (Bemla verrucosa) og det homologe P14( T) allergen fra timotei ( Phleum pratense)

Aminosyresekvensidentitet mellom bjerk P14 allergen og timotei P14(T) allergen er 77%. cDNA som koder P14(T) allergen fra timotei ble oppnådd ved sortering av et cDNA-bibliotek, som ble konstruert fra pollen av timotei på samme måte som beskrevet for cDNA-biblioteket fra bjerkepollen, med pasient IgE som beskrevet for P14 allergener til bjerk. cDNA-sekvensen til klonen som koder P14(T) allergenet hos timotei er vist i fig. 16, og som sekvensidentifiseringsnummer 9-11 i sekvenslisten. Alt pasientsera som bindes med sitt IgE til bjerkeprofilin er også bundet med sin IgE til sektorer av nitrocellulosefilter som inneholder plakkløftere (plaquelifts) av immun-positive lambda gtll fager, i hvilke cDNA-kodende timotei P14(T) allergen var blitt innskutt (fig. 17). Dette viser at proteinene beslektet med P14 allergenene med høy homologi også er immunologisk kryssreaktive med pasient IgE antistoffer.

6. Administrerin gs frem gan gsmåter

Den foreliggende oppfinnelse dekker anvendelse av P14 syntetiske polypeptidallergener til hyposensibilisering eller desensibilisering av et pattedyr. Slike polypeptider kan administreres til et menneske enten alene eller i kombinasjon med farmasøytisk akseptable bærere eller diluenter, overens-stemmende med standard farmasøytisk praksis.

Hyposensibiliseringsmetoden inkluderer, eller kan inkludere, følgende paren-terale, orale, nasale, inhalasjon eller rektal administrering av økende doser av P14 allergenet. Betegnelsen parenteral som anvendt her inkluderer subkutan, intravenøs eller intramuskulære injeksjoner. Et område fra 1 picogram til 10 milligram pr. applikasjon kan anvendes. Diluentene og bærerne kan velges av fagfolk på området i henhold til vanlig aksepterte galeniske fremgangsmåter.

7. Litteratur

Litteraturen sitert i ovenstående beskrivelse er:

1. L. Yman, Botanical relations and immunological cross-reactions in pollen allergy, 2nd ed. Uppsala, Sverige: Pharmacia AB, 1982. 2. W. R. Thomas, K. Y. Chua, W. K. Greene og G. A. Stewart. Recombinant mite allergens. In: Epitopes of atopic allergens. A. H. Sehon, D. Kraft, and G. Kunkel (red). UCB Institute of Allergy, Brussels 1990. 3. E. Jarolim, M. Tejkl, M. Rohac, G. Schlerka, M. Breitenbach, O. Scheiner, D. Kraft, H. Rumpold. Monoclonal antibodies against birch pollen allergens; characterization by immunoblotting and use for single step affinity purification of the major allergen Betvl. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 90, 54-60 (1989). 4. H. Ipsen, H. Bowadt, H. Janniche, B. Niichel Petersen, E. P. Munch, J.A. Wihl og H. Lowenstein. Immunochemical characterization of reference alder (Alnus glutinosa) and hazel (Corylus avellana) pollen extracts and the partial immunochemical identity between the major allergens of alder, birch, and hazel pollen. Allergy 40, 510-518 (1985). 5. H. Rumpold, M. Rohac, B. Bohle, M. Breitenbach, O. Scheiner og D. Kraft. The relationship of Betvl epitopes recognized by patients' IgE and monoclonal anti-BetvI antibodies. I: Epitopes of atopic allergens. A. Sehon, D. Kraft and G. Kunkel (red). The UCB Institute of Allergy, Brussels 1990. 6. R. Valenta, H. Breiteneder, K. Pettenburger, M. Breitenbach, H. Rumpold, D. Kraft and O. Scheiner. Homology of the major pollen allergens of alder, hazel, and hornbeam at the nucleic acid level as determined by cross-hybridization. J. Allergy Clin. Immunol., in press. 7. B. Nuchel Petersen, H. Janniche, E. P. Munch, J. A. Wihl, H. Bowadt, H. Ipsen and H. Lowenstein. Immunotherapy with partially purified and standardized tree pollen extracts. Allergy 43, 353-362 (1988). 8. J. A. Wihl, H. Ipsen, B. Nuchel Petersen, E. P. Munch, H. Janniche and H. Lowenstein. Immunotherapy with partially purified tree pollen extracts. Allergy 43, 363-369 (1988). 9. H. Ipsen, B. Schwartz, J. A. Wihl, B. Nuchel Petersen, E. P. Munch, H. Janniche and H. Lowenstein. Immunotherapy with partially purified and standardized tree pollen extracts. Allergy 43, 370-377 (1988). 10. C. Ampe, J. Vandekerckhove, S. L. Brenner, L. Tobacman and E. D. Korn. The amino acid sequence of Acantamoeba profilin. J. Biol. Chem. 260, 834-840 (1985). 11. V. Magdolen, U. Oechsner, G. Muller and W. Bandlow. The intron-containing gene for yeast profilin (PFY) encodes a vital function. Mol. Cell. Biol. 8, 5108-5115 (1988). 12. J. S. Widada, C. Ferraz and J.-P. Liautard. Total coding sequence of profilin cDNA from Mus musculus macrophage. Nucl. Acids Res. 17, 2855

(1989). 13. D. J. Kwiatkowski and G. A. P. Bruns. Human profilin. Molecular cloning, sequence comparison, and chromosomal analysis. J. Biol. Chem. 263. 5910-5915 (1988). 14. C. Ampe, F. Markey, U. Lindberg and J. Vandekerckhove. The primary structure of human platelet profilin: reinvestigation of the calf spleen profilin sequence. FEBS Lett. 228, 17-21 (1988). 15. Lindberg, C. E. Schutt, E. Hellsten, A.-C. Tjader and T. Hult. The use of poly(L-proline).Sepharose in the isolation of profilin and profilactin complexes. Biochim. Biophys. Acta 967, 391-400 (1988). 16. M. Tanaka and H. Shibata. Poly(L-proline)-binding proteins from chick embryos are a profilin and a profilactin. Eur. J. Biochem. 151, 291-297

(1985). 17. H. Breiteneder, W. Hassfeld, K. Pettenburger, E. Jarolim, M. Breitenbach, H. Rumpold, D. Kraft and O. Scheiner. Isolation and characterization of messenger RNA from male inflorescences and pollen of white birch (Betula verrucosa). Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 87, 19-24 (1988). 18. H. Aviv and P. Leder. Purification of biologically active globin messenger RNA by chromatography on oligothymidylic acid-cellulose. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69, 1408-1412 (1972). 19. T. V. Huynh, R. A. Young, R. W. Davis, I:DNA cloning - a practical approach, Band 1, D. M. Glover (red), IRL Press, Oxford 1985.

20. H. Haymerle. Nucl. Acids Res. 14, 8615 (1986).

21. R. A. Young and R. W. Davis. Efficient isolation of genes by using antibody probes. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80, 1184-1198 (1983). 22. H. Breiteneder, K. Pettenburger, A. Bito, R. Valenta, D. Kraft, H. Rumpold, O. Scheiner and M. Breitenbach. The gene coding for the major birch pollen allergen Betvl is highly homologous to a pea disease resistance response gene. EMBO J. 8, 1935-1938 (1989). 23. F. M. Ausubel. Current protocols in molecular biology. Green Pub-lishing Associates and Wiley Interscience, New York, 1987. 24. C. Yanisch-Perron, J. Vieira and J. Messing. Improved Ml3 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the Ml3mp 18 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-119 (1985). 25. F. Sanger, S. Nicklen and A. R. Coulson. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467

(1977). 26. R. B. Wallace, J. Shaffer, R. F. Murphy, J. Bonner, T. Hirose and K. Itakura. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to OX 174 DNA: the effect of a single base pair mismatch. Nucleic Acids Res. 6, 3543-3557 (1979). 27. P. S. Thomas. Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, 5201-5205 (1980). 28. H. Lehrach. RNA molecular weight determinations by gel electrophoresis under denaturing conditions: a critical reexamination. Biochemistry 16, 4743-4751 (1977). 29. A. P. Feinberg and B. Vogelstein. A technique for radiolabeling DNA restriction fragments to hich specific activity. Anal. Biochem. 132. 6- 13 ( 1983). 30. J. Shine and L. Dalgarno. The 3'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 7J_, 1342-1346 (1974). 31. E. Amann, J. Brosius and M. Ptashne. Vectors bearing a hybrid trp-lac promoter useful for regulated expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene 25, 167-178 (1983). 32. N. Kiyoshi, H. C. Thøgersen. Generations of B-globin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in Escherichia coli. Nature 309. 810-812 (1984). 33. D. M. Helfman, J. R. Feramisco, J. C. Fiddes, G. P. Thomas and S.H. Hughes. Identification of clones that encode chicken tropomyosin by direct immunological screening of a cDNA expression library. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80, 31-35 (1983).

8. SEKVENSLISTE

(1) GENERELL INFORMASJON

(i) Søker: Dr. Rudolf Valenta

Dr. Michael Duchene

Mrs. Dr. Karin Pettenburger

Dr. Michael Breitenbach

Dr. Dietrich Kraft

Dr. Helmut Rumpold

Dr. Otto Scheiner

(ii) Oppfinnelsens tittel: Bjerkepollenallergen P14 for diagnose og terapi av allergiske sykdommer.

(iii) Antall seksvenser: 8

(iv) Adresse for korrespondanse:

(A) Adressat: Pennie & Edmonds

(B) Gate: 1155 Avenue of the Americas

(C) By: New York

(D) Stat: New York

(E) Land: USA

(F) ZIP: 10036

(v) Datamaskin lesbar form:

(A) Type medium: Diskette, 3,5 tommer

(B) Datamaskin: Hewlett Packard (IBM-PC compatible)

(C) Operativ system: MS-DOS

(D) Programvare: WordPerfect 5.1

(vi) (A) Søkernummer: 8

(B) Innsendelsesdato:

(C) Klassifikasjon:

(vii) Tidligere søkerdato:

(A) Søker nummer: 07/353,844

(B) Innsendelsesdato: 18. mai 1989.

(viii) Fullmektig/agentinformasjon:

(A) Navn: Harry C. Jones, III

(B) Registreringsnummer 20 280

(C) Referansenummer: 6530-008

(ix) Telekommunikasjonsinformasjon:

(A) Telefon: (212) 790-9090 (B) Telefax: (212) 869-9741/8864

Claims (8)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid som er definert i sekvensidentifikasjon nummer 3 eller et i høy grad homologt polypeptid med tilsvarende biologisk aktivitet, som har minst en epitop til et P14-allergen fra planter, særlig gress, ugress og trær fra orden Fagales,karakterisert vedat det omfatter å dyrke en vertsorganisme som inneholder en mikrobiell ekspresjonsvektor som er i stand til, i nevnte vertsorganisme, å bli replikert og til å styre ekspresjon av et rekombinant DNA som koder for et polypeptid som definert i sekvensidentifikasjon nummer 3.

2. Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert vedat det omfatter DNA som koder for et polypeptid som angitt i krav 1, eller en DNA-sekvens som hybridiserer med en DNA-sekvens som angitt i sek.id. nr. 3 og koder for et polypeptid med samme biologiske aktivitet, samt degenererte varianter derav.

3. Rekombinant DNA som angitt i krav 2, karakterisert vedat allergenet er valgt fra P14-allergener i gruppen som består av bjerk, svartor, hassel, agnbøk og eik.

4. Replikerbar mikrobiell ekspresjonsvektor, karakterisert vedat den inneholder DNA-sekvens som koder for P14-allergen fra planter med sekvensen illustrert i sekvensidentifikasjon nummer 3, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som er i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA-sekvens, samt å inneholde sekvenser som koder for seleksjonsmarkører, for fremstilling av nevnte allergen.

5. Prokaryot eller eukaryot vertsorganisme, karakterisert vedat den er transformert med en mikrobiell ekspresjonsvektor som angitt i krav 4, at den er istand til, i nevnte organisme, å bli replikert og å dirigere ekspresjon av DNA som angitt i krav 2 eller 3 for å fremstille nevnte polypeptid.

6. Vertsorganisme som angitt i krav 5, karakterisert vedat vertsorganismen er Escherichia coli.

7. Anvendelse av et polypeptid som angitt i krav 1 til å detektere antistoffer, hvori serum fra et pattedyr bringes i kontakt med nevnte polypeptid, og hvor immunologisk reaksjon mellom antistoffene i serum og nevnte polypeptid, som har i det minste en epitop til et P14-allergen, detekteres.

8. Anvendelse som angitt i krav 7, hvori det detekterte antistoff er et IgE-antistoff.