FI104168B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten retinoidiyhdisteiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

j 104168

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten retinoidiyhdis-teiden valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää retinoidijohdan-5 naisten valmistamiseksi. Näillä yhdisteillä on fosfolipaa-si-A2:ta (PLA2:ta) inhiboiva aktiivisuus.

Fosfolipaasit ovat entsyymejä, jotka katalysoivat vapaita rasvahappoja vapauttavien membraanifosfolipidien hydrolyysiä. Nisäkäskudoksissa fosfolipaasi-A2 (PLA2) on 10 kalsiumista riippuvainen entsyymi, joka spesifisesti lohkaisee fosfolipidien sn-2-asyylisidoksen, jolloin saadaan vapaa arakidonihappo ja lysofosfolipidi. [Van den Bosch H., Biochem Biophys Acta 604 (1980) 191 - 246]. Tämän reaktion molemmat tuotteet voivat toimia inflammatoristen 15 välittäj ien biosynteesin lähtökohtina. Arakidonihappo voidaan muuttaa syklo-oksigenaasi- ja lipoksigenaasireaktio-teillä proinflammatorisiksi prostraglandiineiksi ja leuko-trieeneiksi. [Higgs G. A. and Vane J.R., Br Med Bull 39 (1983) 265]. Lysofosfolipidejä voidaan käyttää tietyillä 20 solutyypeillä, jolloin muodostuu verihiutaleita aktivoiva tekijä (PAF), tehokas inflammatorinen välittäjä. [Chilton F. H. et ai., J Biol Chem, 257, (1982) 5402].

: Monet ei-steroidiset, anti-inflammatoriset aineet, kuten indometasiini, inhiboivat syklo-oksigenaasireaktiota . 25 ja siten estävät prostaglandiinien muodostumisen arakido- ··· nihaposta. On löydetty myös joukko yhdisteitä, jotka ovat « · · · lipoksigenaasi-inhibiittoreita. [Gordon Jones et ai., J. Med Chem 29 (1986) 1504 - 1511]. [Mardin M. ja Busse W.D.

• · · julkaisussa Leukotrienes and other Lipoxygenase Products, ... 30 P. J. Piper (toim.), Prostaglandin Series, s. 3, 263 - 274, Chichester Research Studies Press] . Nämä yhdisteet « · · ’ estävät leukotrieenien muodostumisen, ja niillä on myös : todettu olevan anti-inflammatorisia vaikutuksia. Lisäksi » I » useiden yhdisteiden on raportoitu olevan sekä lipoksi-,/.t 35 genaasi- että syklo-oksigenaasi-inhibiittoreita. [Salmon 2 104168 J. A., Simmons P. M. ja Moncada S. H., J Phar Pharmac 35 (1983) 808]. [Bonney R. J. et al., Biochem Pharmacol, 36(22) (1987) 2885 - 2891]. On ajateltu, että nämä yhdisteet olisivat tehokkaampia anti-inflammatorisia aineita 5 niiden täydellisemmän arakidonihappokaskadin salpaamisen vuoksi. Fosfolipaasi-A2:n inhibiittorin odotettaisiin vähentävän samojen välittäjien muodostumista kuin sekä li-poksigenaasi- että syklo-oksigenaasi-inhibiittorin. Tämä väheneminen saavutettaisiin kuitenkin arakidonihappovapau-10 tumisen inhibition kautta. Lisäksi PLA2:n inhibitio johtaisi PAF:n muodostumisen vähenemiseen. Tämän seurauksena PLÄ2-aktiivisuuden inhibitio edustaa houkuttelevaa lähestymistapaa inflammatoristen sairauksien hoitoon tarkoitettujen uusien aineiden kehitykselle.

15 Alalla tunnetaan paljon erilaisia retinoideja ja niille läheisiä A-vitamiinihappo eli retinolihappojohdannaisia. Siten US-patentissa 4 568 757, Carroll et ai., esitetään konfigurationaalisesti lukittuja retinoideja. US-patenteissa 4 126 693 ja 4 055 659, Gander et ai., sekä 20 US-patentissa 4 194 007 kuvataan erilaisia retinoideja, jotka ovat yleensä trans-A-vitamiinihapon estereitä ja amideja sekä niiden johdannaisia. Näissä patenteissa kuva-: taan yleisesti "A-vitamiinityypin aktiivisuutta" erilai- sille siinä kuvatuille retinoideille, ja erityisesti kuva-25 taan näiden yhdisteiden käyttö ihotautien tai poikkeavien tilojen, poikkeavan sarveistumisen, aknen jne. hoidossa, ·;··· sekä niiden käyttö aurinkosuoja-aineina.

Saatavissa on lisää alan viitteitä, joissa kuvataan erilaisten retinoidien ja retinoidivälituotteiden valmis- t.;·, 30 tuksia. US-patentissa 2 662 914 kuvataan A-vitamiinihappo-

III

1..^ johdannainen, jonka 14-asemassa on karboksyylihapposubsti- *. tuentti, kun taas Lewin et ai.'in julkaisuissa [Journal of

Organic Chemistry 48 (1983) 222 ja Journal of American

Chemical Society 103 (1981) 2527] kuvataan erilaisten re-35 tinoidien synteesi. Muita retinoideja ja PLA2-inhibiitto- • i « « 3 104168 reita ovat esittäneet C. Fiedler [Nagy et ai., Agents and Actions 46 (1985) 620 - 621 ja 27 (1989) 313 - 315]; A. A. Fawzy et al. [Agents and Actions 25 (1988) 394 - 400]; A.

C. Hanglow et al. [Agents and Actions, 27 (1989) 347 - 5 350] ja C. Marcelo et al. [Clin. Res. 34 (1986) 766A].

Tämän keksinnön tavoitteena on sen vuoksi tarjota retinoidiyhdisteitä, joilla on PLA2-inhibiittoriominai-suuksia. Näitä yhdisteitä voidaan käyttää koostumuksissa, jotka ovat käyttökelpoisia hoidettaessa inflammatorisia 10 sairauksia, kuten niveltulehdusta, suoliston inflammatorista häiriötilaa ja useita niiden kaltaisia tiloja, joille on luonteenomaista selvä tulehdus.

Keksintö koskee menetelmää yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on rakennekaava A

20 jossa R3 on CH=CY-C (CH3) =CHX, jossa X ja Y ovat erilaisia ja kummallakin on kaava C02R' tai .... 25 '“~^-C02R" • · ·

Ml· :·1: jossa R' ja R" merkitsevät toisistaan riippumatta vetyä .1·1; tai Ci.g-alkyyliä, ja Rx käsittää kaikki mahdolliset geo- metriset isomeerit. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on 30 tunnusomaista, että yhdiste, jolla on kaava • · ·

• M

s, • · • « • i · · 4 104168 saatetaan reagoimaan sopivan katalyytin läsnä ollessa yhdisteen kanssa, jolla on kaava 5 (\ /)-CH=C(CH3)CH2C02R' 2? 121 jossa R' ja R" merkitsevät samaa kuin edellä.

10 Keksintö perustuu havaintoon, että rakennekaavan A

mukaisilla yhdisteillä on selvä PLA2-aktiivisuutta inhiboiva vaikutus ja niillä on merkittäviä anti-inflammatori-sia vaikutuksia.

Tämä ryhmä rakenteellisia isomeerejä ja niiden far-15 maseuttisesti hyväksyttäviä suoloja voidaan yhdistää far maseuttisesti hyväksyttävien kantajien kanssa liuokseksi, voiteeksi tai geeliksi paikallista antamista varten tai vaihtoehtoisesti haluttaessa valmistaa tablettimuotoon tai eliksiiriksi sisäistä antamista varten.

20 Kuviossa 1 on graafisesti esitetty keksinnön mu kaisesti valmistetun yhdisteen anti-inf lammatorinen vaikutus annostuspitoisuuden funktiona esitettynä graafisesti I i « : korvan painon lisäystä vastaan.

Kuvio. 2 on käyrä, joka osoittaa keksinnön mu-25 kaisesti valmistetun yhdisteen vaikutusta myeloperoksi- ..1·1 daasiaktiivisuuteen pitoisuuden prosentuaalisen osuuden *:2: funktiona.

Keksinnön mukaisten rakenteellisten isomeerien ryhmä käsittää kahdeksan erilaista yhdistettä, jotka on 30 esitetty taulukossa 1 alla.

« « 1 • * · · i » · » I « • f i · « I « · « « ·

4 I

2 • · · 5 104168

Taulukko I

l 1 -ciJ.l J-Cii 10

kaikki trans C0,H

4 * U-cu *· !>. 1 30

... I 1 -ClJ

• · 4 • · - »

Mt • # * · * * · · 4 * · 1 * • · 4 · 6 104168 Näitä isomeerejä voidaan käyttää oleellisesti puhdistetussa muodossa tai useiden isomeerien seoksina. On odotettavissa, että aktiivisuus vaihtelee sovellutuksesta ja isomeerisestä muodosta riippuen. Kaikki isomeerit ovat 5 kuitenkin aktiivisia, ja niillä on anti-inflammatorisia luonteenpiirteitä, jotka ovat tässä kiinnostavia, ja siten niitä voidaan käyttää yksittäin tai yhdistelmänä.

Keksinnön mukaista menetelmää selostetaan seuraa-vassa yksityiskohtaisemmin (vrt. US-patentti 4 568 757, 10 jonka koko sisältö sisällytetään tähän viitteenä). Muut synteesikaaviot ovat ilmeisiä tavallisille alan ammatti-miehille. Esimerkinomainen synteesitie sisältyy tähän.

15 0 + ^2^"CH-C(CH3)CH2C02CH2CH3 C02CH3 20 : 2

1. K0t9u/THF

2. KOH/MeOH

( i i < I · 14 1 < , ' ' ' , Ψ 25 *««· ·· Isomeeriseos (Taulukko 1) • · · • · · 4 » 4

Isomeeriseoksen valmistaminen ... 30 Seuraava reaktio ja sitä seuraavat käsittelyt to- » · · 7 104168 raania (350 ml), ja seos jäähdytettiin 0 °C:seen 10 minuutiksi. Lisättiin tipoittain liuos, jonka muodosti yhdiste 2 (11,7 g, 0,045 mol) 200 ml:ssa vedetöntä tetrahydrofu-raania. Saatua punaista liuosta sekoitettiin 0 °C:ssa 15 5 minuuttia. Lisättiin tipoittain liuos, jonka muodosti yhdiste 1 (9,74 g, 0,045 mol) 200 ml:ssa vedetöntä tetrahyd-rofuraania. Tätä hyvin tummaa liuosta sekoitettiin 0 °C:ssa 1,5 h, sen jälkeen tetrahydrofuraani poistettiin kiertohaihduttimella 30 °C:ssa. Jäännös liuotettiin 10 350 ml:aan 3 H kaliumhydroksidia/metanolia, ja saatua li uosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 2 h. Liuoksen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan, sitten se laimennettiin vedellä ja uutettiin dietyylieetterillä. Vesipitoinen kerros tehtiin happamaksi 3 N HCl:lla ja uutettiin dietyy-15 lieetterillä. Orgaaninen kerros erotettiin vesipitoisesta kerroksesta ja kuivattiin Na2S04:lla. Suodatettiin ja liuotin poistettiin kiertohaihduttimella, jolloin saatiin iso-meeriseos 14,5 g:na vaahtomaista kiinteää ainetta.

13-cis-12-(3'-karboksifenyyli)retinolihapon valmis-20 tus (yhdiste 1)

Kiinteä aine puhdistettiin preparatiivisella HPLC:llä (Waters PrepPak 500 C-18-pylväs; 37,5 % CH3CN : ·,· : 62,5 % 1 % NH40Ac) . Sopivat fraktiot (tarkistettiin ana- lyyttisellä ftPLC:llä) haihdutettiin kiertohaihduttimella 25 CH3CN:n poistamiseksi, ja saatu vesipitoinen liuos tehtiin ··· happamaksi väk. HCl:lla ja uutettiin dietyylieetterillä.

• * · · ...·: Suodatettiin ja eetteri haihdutettiin kiertohaihduttimel- la, jolloin saatiin 3,21 g lievästi epäpuhdasta tuotetta. Uudelleenkiteytettiin etyyliasetaatista/heksaanista, jol-30 loin saatiin 2,0 g puhdasta tuotetta, sp. 117 - 118 °C. ^-NMR (250 MHz, dioksaani-dB) δ (ppm) 7,93 - 7,90 (m, 2H, 1', 6'-ArH), 7,54 - 7,50 (m, 2H, 4', 5'-ArH), 6,63 (d, J = 12 Hz, 1H, H-ll), 6,19 (d, J = 16 Hz, 1H, H-7), 6,10 (d, J = 12 Hz, 1H, H-10), 5,91 (d, J = 16 Hz, 1H, H-8), 5,85 35 (app s, 1H, H-14), 1,96 (s, 3H, 9a tai 13a-CH3) , 1,90 (s, * · • • · * · »

• ·- I

8 104168 3H, 9a tai 13a-CH3), 1,63 (s, 3H, 5a-CH3), 1,60 - 1,19 (m, 6H, H-2-4), 0,99 (s, 6H, 2(la)-CH3).

Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet voidaan valmistaa muotoon, joka sopii annettavaksi paikal-5 lisesti, erityisesti voiteeksi tai geeliksi, paikallisen tulehduksen hoitoa varten, mukaan lukien silmille tarkoitetut valmisteet, kuten silmätipat tai niiden kaltaiset silmäkudosten tulehduksen hoitoa varten. Vaihtoehtoisesti otetaan huomioon'yhdisteet, jotka on erityisesti valmis-10 tettu tablettimuotoon tai sekoitettu laimentimen ja kantajan kanssa sekä mahdollisesti muiden aktiivisten aineiden kanssa eliksiiriksi sisäistä antamista varten. Edelleen keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan sisällyttää formulaa-tioihin, jotka vapauttavat tehoainetta hidastetusti, kuten 15 biologisesti hajoaviin polymeerimatriiseihin, jotka vapauttavat yhdistettä ajan mittaan tasaisena pitoisuutena, kun tehoainetta hidastetusti vapauttava materiaali on im-plantoitu. Esimerkkejä polymeereistä, joilla vapautumista hidastetaan, ovat mm. polykaprolaktoneihin, laktideihin, 20 glykoleihin ja niiden kaltaisiin perustuvat polymeerit.

Pitoisuudet tehokkailla annostusalueilla vaihtele-vat yhdisteestä, potilaasta ja hoidettavasta oireyhtymästä I I « !·' ! tai sairaustilasta riippuen. Yleensä paikallista antamista

Ml ' varten yhdisteiden anti-inflammatorinen määrä vaihtelee 25 0, 005 %:sta 10 %:iin (paino/tilavuus) sopivassa paikalli- '!1 sessa annostusmuodossa. Sisäiseen antamiseen tarkoitetut

«IM

*:·: annostusarvot pitäisi rajoittaa alueelle, joka on 1:1: 0,1 mg/kg:sta 50 mg/kg:aan vuorokaudessa. Kun yhdiste on « seostettu jatkuvasti vapauttavan välineen muotoon tai vii-30 vytetysti annostavan välineen muotoon, pitoisuusarvot • · · vaihtelevat riippuen käytetyn polymeerimatriisin luontees-

I I I

ta tai materiaalista, joka rajaa säiliön. Yleensä viivyte- ·,·/ tysti annostavat välineet pitäisi valmistaa niin, että * » 1 saadaan vakioannostus edellä mainittujen arvojen alueella. :v, 35 Siirtymis- ja diffuusionopeudet tietylle polymeerille voi-

• I

• 1 · • ψ « • · · • 1 104168 9 daan säätää noudattaen alalla tunnettua käytäntöä, joka ei muodosta keksinnön aspektia.

Tämä keksintö ja sen tehokkuus voidaan paremmin ymmärtää viittaamalla seuraaviin in vitro ja in vivo -kokei-5 siin.

Esimerkit: ΡΙ1Ά2 - i nh ib i ti okoe Tätä koetta käytetään ihmisen verihiutaleiden PLA2:n inhibition mittaamiseen koeyhdisteillä. Käytetty 10 menetelmä oli samanlainen kuin Franson et ai. ovat raportoineet. [Jesse R. L. ja Franson R. C., Biochem Biophys Acta 575 (1979) 467 - 470]. [Franson R. C., Patriarca P. ja Elsback P., J Lipid Res 15 (1974) 380 - 388]. Entsyymi eristettiin ihmisen verihiutaleista. Käytetty substraatti 15 koostui 14C-oleaatti-merkityistä E. coli -membraaneista. E.

coli -solut kasvatettiin 14C-öljyhapon läsnä ollessa ja sitten autoklavoitiin membraanien valmistamiseksi. Kokeessa inkuboidaan etukäteen erilaisia koeyhdisteiden pitoisuuksia PLA2:n (7,5 pg/ml) kanssa puskurissa, joka koostui 20 25 mM:sta HEPESiä (pH 7), 150 mM:sta NaCl:a, 5,0 mM:sta

CaCl2:a ja 10 %:sta DMSO:a (koeyhdisteliuotin), 37 °C:ssa 7 minuuttia. Sen jälkeen lisätään E. coli -membraanisub- i.i straatti (0,1 mM fosfolipidiä, 0,5 pCi/pmol), ja reak- 1 t t tioseosta inkuboidaan 37 °C:ssa 30 minuuttia. Lopullinen 25 reaktiotilavuus on 0,1 ml. Reaktio pysäytetään tetrahydro-furaanilla (1,9 ml), ja koko liuos laitetaan kiinteäfaasi-·;··· uuttopylvääseen (aminopropyylihartsi, Analytichem) . Pylväs huuhdotaan vielä 1 ml :11a tetrahydrofuraania. Vapaa ras- « vahappo eluoidaan pylväästä 1,0 ml :11a 2-%:ista etikkahap-30 poa tetrahydrofuraanissa ja otetaan talteen tuikepulloon.

• · · I.. Vapaan rasvahappotuotteen määrä määritetään nestetuikelas- • * · kennalla. Koeyhdisteen aikaansaaman inhibition määrä las- :,i,: ketään vertaamalla yhdisteen läsnä ollessa saatua lukemaa !fj>: lukemaan, joka saatiin vertailureaktioissa (ainoastaan «·'«. 35 koeyhdisteliuotin) . Inhibitioprosenttiarvot määritetään • « • t • « 1 « 1 • 1 1 • · 10 104168 yhtälöllä: (lukema näytteestä) - (tausta) % inhibitio = _ x 100 5 (lukema vertailussa) - (tausta) IC50-arvot (inhibiittorin pitoisuus, joka vaaditaan 50 %:n inhibition aikaansaamiseen) määritetään interpoloimalla graafisesta esityksestä, jossa inhibitio-% on esitetty 10 funktiona arvosta log-pitoisuus.

Taulukon 2 tuloksissa esitetään ihmisen verihiutaleiden PLA2:n inhibition IC50-arvot valituilla yhdisteillä. Tulokset osoittavat, että nämä yhdisteet inhiboivat fos-folipaasi-A2:ta annoksesta riippuen.

15 Taulukko 2

Ihmisen verihiutaleiden fosfolipaasi-Aj: n inhibitio

Yhdiste 1 Ic50 ij n 20 i^ji^ JL !o 0 < t. t

Isomeeriseos 39 " 25

Vertailuyhdiste: kaikki-transsi1 A-vitamiinihappo • · V : C02H >500

30 L L

• · · \ \ • · · N/ N.

· · • · · \ Koeyhdisteiden anti-inflammatorinen aktiivisuus « : : : määritettiin forboliesteri-indusoidulla hiiren korvatuleh- I I f dusmallilla. [Young J. M., Wagner B. M. ja Spires D. A., 35 J Invest Dermatol 80 (1983) 48 - 52]. Tässä kokeessa in- I «

I I

« · • « f « I · il 104168 flammatorinen reaktio indusoidaan antamalla paikallisesti 0,01 % (paino/tilavuus) tetradekanoyyliforboli-13-asetaat-tia (TPArta) CD-l-hiirten korviin. Seuraa akuutti inflammatorinen reaktio, jossa korvat turpoavat ja inflammatori-5 set solut tunkeutuvat korvakudokseen. TPA:ta käytettiin koeyhdisteen erilaisten pitoisuuksien kanssa ja niitä ilman korvien sisä- ja ulkopuolille (10 μΐ/pinta). Kuuden tunnin kuluttua hiiret tapettiin, ja korvat poistettiin. Kummastakin korvasta otettiin korvakudospalat [7,9 mm 10 (5/16")], ja ne punnittiin ödeeman mittaamiseksi. Sen jäl keen korvapalat käsiteltiin neutrofiilikasaantumisen määrittämistä varten mittaamalla myeloperoksidaasi- (MPO-) aktiivisuus Bradley et ai.'n menetelmällä. [Bradley P. P. et ai., J Invest Dermatol 78 (1982) 206 - 209]. MPO on 15 spesifinen leima neutrofiilien läsnäololle kudoksessa.

Koeyhdisteen tuottama anti-inflammatorinen aktiivisuus lasketaan vertaamalla ödeemaa tai MPO-arvoja, jotka saatiin lääkkeellä käsitellyille korville, niihin, jotka saatiin korville, joita ei oltu käsitelty lääkkeellä. In-20 hibitioprosenttiarvot määritettiin yhtälöllä: inhibitio-% = « i I i 1 i « i t » (TP1- ja lääkekä.sitelty ryhmä) - (käsittelemätön vertailuryhmä) 25 x 100 (vain TPl-käsitelty ryhmä) - (käsittelemätön vertailuryhmä) • · ·

MM

' Tulokset yhdisteelle I on esitetty kuviossa 1. Yh- • · · ·.· · diste I estää annoksesta riippuen TPA-indusoidun hiiren 30 korvaödeeman. ED50:n arvioidaan olevan 0,8 %. Annosvaste-- tulokset solutunkeutumisen inhibitiolle on esitetty ku- viossa 2. ED50:n tälle parametrille todettiin olevan t <0,1 %. Tämä yhdiste estää tehokkaasti ödeeman ja solutun-;;; keutumisen tässä mallissa.

I I · « · 12 104168 Tämän hakemuksen keksintö on kuvattu viittauksella spesifisiin toteutusmuotoihin ja yleisellä kuvauksella. Siinä esitettyjen toteutusmuotojen muunnelmat ovat ilmeisiä tavallisille alan ammattimiehille ilman keksinnöllistä 5 toimintaa. Tällaiset muunnelmat, jotka käsittävät erityisesti muiden aktiivisten aineiden lisäyksen, lisäkanta-jien, laimentimien, adjuvanttien ja niiden kaltaisten käytön, sekä muunnelma antojaksosta, joka on tasapainotettu annostusarvoa vastaavasti, sisältyvät keksinnön piiriin 10 lukuunottamatta jäljempänä esitetyissä patenttivaatimuksissa nimenomaisesti esitettyjä rajoituksia.

t · · • · · • · · « <1111 • » · · a · · • · · 9 9 Φ 9 • · · • · · •

III

• I I

• · ·

III

« < I «

Claims (3)

104168

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten re-tinoidiyhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava 5 10 jossa R-l on CH=CY-C (CH3) =CHX, jossa X ja Y ovat erilaisia ja kummallakin on kaava C02R' tai (O) 15 ' ^COaR" jossa R' ja R" merkitsevät toisistaan riippumatta vetyä tai Ci.g-alkyyliä, ja R2 käsittää kaikki mahdolliset geometriset isomeerit, tunnettu siitä, että yhdiste, 20 jolla on kaava 25 m • · · IMI ·:*: saatetaan reagoimaan sopivan katalyytin läsnä ollessa yh- ;*·*: disteen kanssa, jolla on kaava ··· 30 • · · «Il • · · / \ : U Λ-CH=C(CH3)CH2C02R' (2) .···. co2r" 35 : jossa R' ja R" merkitsevät samaa kuin edellä. 104168

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että katalyytti käsittää kalium-butoksidin ja tetrahydrofuraanin yhdistelmän.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että tuote eristetään kuumentamal la reaktiotuotetta kaiiumhydroksidin ja metanolin läsnä ollessa. ··«· «· ··»· • V • « · • I « • · · • · · • « · • · · • ♦ · • · · • · · 1 I · I I · « · * I f I « I I i · l I · · • 104168