ES3075153T3 - Continuous purification of therapeutic proteins - Google Patents

Continuous purification of therapeutic proteins

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ES3075153T3
ES3075153T3 ES14714835T ES14714835T ES3075153T3 ES 3075153 T3 ES3075153 T3 ES 3075153T3 ES 14714835 T ES14714835 T ES 14714835T ES 14714835 T ES14714835 T ES 14714835T ES 3075153 T3 ES3075153 T3 ES 3075153T3
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Konstantin Konstantinov
Rahul Godawat
Veena Warikoo
Sujit Jain
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Genzyme Corp
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Abstract

En este documento se describen procesos integrados de biofabricación continua para la producción de una sustancia farmacológica proteica terapéutica. Asimismo, se proporcionan sistemas capaces de producir de forma continua dicha sustancia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Purificación continua de proteínas terapéuticas
[0005] CAMPO TÉCNICO
[0007] Esta invención se refiere a métodos de biotecnología y la biofabricación de proteínas recombinantes.
[0009] ANTECEDENTES
[0011] Las células de mamífero que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante se usan a menudo para producir proteínas terapéutica o comercialmente importantes. En el entorno actual de diversas carteras de productos, las empresas biotecnológicas están cada vez más impulsadas a desarrollar soluciones innovadoras para la fabricación altamente flexible y rentable de sustancias farmacéuticas proteicas terapéuticas. El documento de patente WO 2008/12787 divulga un método y sistema para producir productos biofarmacéuticos que implican un proceso de separación cromatográfica y cartuchos absorbentes. El documento de patente WO 2008/073620 divulga un método de fabricación para polipéptidos que se producen en células de insectos usando un sistema de expresión en baculovirus. El documento de patente WO 2012/078677 divulga una tecnología de procesamiento continuo para la purificación de productos biofarmacéuticos y biológicos. El documento de patente WO 2006/039588 divulga un aparato que incluye un sistema de fermentación de perfusión continua, un sistema de eliminación de partículas continuo integrado con el sistema de fermentación de perfusión y un sistema de purificación continuo integrado con el sistema de eliminación de partículas, que se mantiene en condiciones estériles. Warikoo V et al., Biotech Bioeng, 2012, 109(12), 3018-3029, divulga la producción continua integrada de proteínas terapéuticas recombinantes.
[0013] SUMARIO
[0015] La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que se pueden usar sistemas integrados y continuos que incluyen dos sistemas de cromatografía multicolumna para producir continuamente sustancias farmacéuticas proteicas terapéuticas. En vista de este descubrimiento, en el presente documento se proporcionan procesos integrados y continuos para fabricar una sustancia farmacéutica proteica terapéutica que incluyen proporcionar un medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante que está sustancialmente libre de células, donde el medio de cultivo líquido se alimenta en un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS1); capturar la proteína terapéutica recombinante en el medio de cultivo líquido usando el PCCS 1, donde el eluido del PCCS 1 que contiene la proteína terapéutica recombinante se alimenta continuamente en un segundo sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS2) y realizar al menos dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante usando el PCCS2, en donde la purificación se realiza usando una resina que es diferente de la resina usada para realizar el pulido, donde el eluido del PCCS2 es una sustancia farmacéutica proteica terapéutica; y donde el proceso se integra y se ejecuta continuamente desde el medio de cultivo líquido hasta el eluido del PCCS2 que es la sustancia farmacéutica proteica terapéutica. También se proporcionan sistemas diseñados específicamente para realizar cualquiera de los procesos descritos en el presente documento. Por ejemplo, en el presente documento se proporcionan sistemas de fabricación biológica que incluyen: un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS1) que contiene una entrada; y un segundo sistema de cromatografía en contracorriente periódica PCCS (PCCS2) que incluye una salida, donde el primer y segundo PCCS están en comunicación fluida entre sí, y donde el sistema de fabricación está configurado de modo que el fluido se puede pasar a la entrada, a través del primer y segundo PCCS, y salir del sistema de fabricación a través de la salida, en donde el PCCS1 está configurado para realizar la operación unitaria de captura de una proteína terapéutica recombinante, y el PCCS2 está configurado para realizar al menos las dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante, en donde la purificación se realiza usando una resina en PCCS2 que es diferente de la resina usada en PCCS2 para realizar el pulido.
[0017] En el presente documento se proporcionan procesos integrados y continuos para fabricar una sustancia farmacéutica proteica terapéutica que incluyen: (i) proporcionar un medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante que está sustancialmente libre de células, donde el medio de cultivo líquido se alimenta en un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS 1); (ii) capturar la proteína terapéutica recombinante en el medio de cultivo líquido usando el PCCS 1, donde el eluido del PCCS1 que contiene la proteína terapéutica recombinante se alimenta continuamente en un segundo sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS2); y (iii) realizar al menos dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante usando el PCCS2, en donde la purificación se realiza usando una resina que es diferente de la resina usada para realizar el pulido, y donde el eluido del PCCS2 es una sustancia farmacéutica proteica terapéutica; y donde el proceso se integra y se ejecuta continuamente desde el medio de cultivo líquido hasta el eluido del PCCS2 que es la sustancia farmacéutica proteica terapéutica. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el medio de cultivo líquido se selecciona del grupo de: medio de cultivo líquido extraído de un biorreactor de perfusión que contiene un cultivo de células de mamífero que secretan la proteína terapéutica recombinante, medio de cultivo líquido extraído de un biorreactor semicontinuo que contiene un cultivo de células de mamífero que secretan la proteína terapéutica recombinante, y un medio de cultivo líquido clarificado de un cultivo de bacterias o células de levadura que secretan la proteína terapéutica recombinante.
[0019] En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS1 y/o el PCCS2 realiza al menos dos operaciones unitarias diferentes. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el uso del PCCS1 o el PCCS2, o ambos, implica el cambio de columna. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS1 realiza las operaciones unitarias de captura de la proteína terapéutica recombinante e inactivación de virus. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS2 realiza las operaciones unitarias de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS1 y/o el PCCS2 utiliza al menos dos columnas cromatográficas. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS1 y/o el PCCS2 utiliza al menos dos membranas cromatográficas. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS1 y/o el PCCS2 utiliza al menos una columna cromatográfica y al menos una membrana cromatográfica. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el medio de cultivo líquido es un medio de cultivo líquido extraído de un biorreactor de perfusión que contiene un cultivo de células de mamífero que secretan la proteína terapéutica recombinante.
[0021] En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS1 incluye un PCCS de cuatro columnas. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, tres de las cuatro columnas en el PCCS de cuatro columnas realizan la operación unitaria de captura de la proteína terapéutica recombinante a partir del medio de cultivo líquido. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la captura se realiza usando cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de tamices moleculares. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la cromatografía de afinidad se realiza con un mecanismo de captura seleccionado del grupo de: mecanismo de captura de unión a proteína A, mecanismo de captura de unión a sustrato, mecanismo de captura de unión a anticuerpo o fragmento de anticuerpo, mecanismo de captura de unión a aptámero y mecanismo de captura de unión a cofactor. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la cromatografía de afinidad se realiza con un mecanismo de captura de unión a proteína A y la proteína terapéutica recombinante es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el eluido que contiene la proteína terapéutica recombinante de tres de las cuatro columnas en el PCCS de cuatro columnas se alimenta a la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas realiza la operación unitaria de inactivación de virus manteniendo el eluido que contiene proteína terapéutica recombinante a un pH bajo para la inactivación vírica. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas mantiene el eluido que contiene la proteína terapéutica recombinante a un pH bajo para la inactivación vírica durante un periodo de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,5 horas.
[0023] Algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento incluyen además ajustar el pH del eluido desde la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas usando un depósito de ajuste de tampón en línea antes de que el eluido de la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas se alimente al PCCS2. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el sistema de cromatografía PCCS2 incluye tres columnas cromatográficas y una membrana cromatográfica. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 realizan la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante a partir del eluido del PCCS1 a través de cromatografía de intercambio catiónico o aniónico. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el eluido de las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 se alimenta a la membrana cromatográfica en el PCCS2. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la membrana cromatográfica en el PCCS2 realiza la función unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante presente en el eluido de las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 a través de cromatografía de intercambio catiónico o aniónico. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la membrana cromatográfica en el PCCS2 realiza la función unitaria de pulido a través de cromatografía de intercambio catiónico. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el flujo continuo y el lavado de la membrana cromatográfica es la sustancia farmacéutica proteica terapéutica. Algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento incluyen además formular la sustancia farmacéutica proteica terapéutica en una composición farmacéutica.
[0025] En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la proteína terapéutica recombinante es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una enzima, una proteína genomanipulada o una proteína inmunogénica o fragmento de proteína. Algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento incluyen además ajustar la concentración iónica del eluido de las tres columnas en el PCCS2 usando un ajuste del tampón en línea antes de que el eluido de las tres columnas en el PCCS2 se alimente a la membrana cromatográfica en el PCCS2. Algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento incluyen además el uso de un tanque de ruptura (por ejemplo, cualquier tanque de ruptura descrito en el presente documento) entre el PCCS1 y el PCCS2. Algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento incluyen además filtrar el eluido del PCCS1 antes de que se alimente en el PCCS2. Algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento incluyen además filtrar el medio de cultivo líquido antes de que se alimente en el PCCS1.
[0027] También se proporcionan procesos integrados y continuos para fabricar una sustancia farmacéutica proteica terapéutica que incluyen: (i) cultivar células de mamífero que secretan una proteína terapéutica recombinante en un biorreactor de perfusión que contiene un medio de cultivo líquido, donde un volumen del medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células se extrae de manera continua o periódica del biorreactor de perfusión y se alimenta en un primer sistema de cromatografía multicolumna (PCCS1) sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS 1); (ii) capturar la proteína terapéutica recombinante en el medio de cultivo líquido extraído usando el PCCS1, donde el eluido del PCCS1 que contiene la proteína terapéutica recombinante se alimenta continuamente en un segundo sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS2); y (iii) realizar al menos dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína recombinante terapéutica en el eluido del PCCS1 usando el PCCS2, en donde la purificación se realiza usando una resina que es diferente de la resina usada para realizar el pulido, y donde el eluido del PCCS2 es una sustancia farmacéutica proteica terapéutica; donde el proceso se integra y se ejecuta continuamente desde el medio de cultivo líquido extraído hasta el eluido del PCCS2 que es la sustancia farmacéutica proteica terapéutica.
[0029] En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS 1 y/o el PCCS2 realiza al menos dos operaciones unitarias diferentes. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el uso del PCCS1 o el PCCS2, o ambos, implica el cambio de columna. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS1 realiza las operaciones unitarias de captura de la proteína terapéutica recombinante e inactivación de virus. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS2 realiza las operaciones unitarias de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS1 y/o el PCCS2 utiliza al menos dos columnas cromatográficas. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS1 y/o el PCCS2 utiliza al menos dos membranas cromatográficas. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS1 y/o el PCCS2 utiliza al menos una columna cromatográfica y al menos una membrana cromatográfica.
[0031] En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el PCCS 1 incluye un PCCS de cuatro columnas. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, tres de las cuatro columnas en el PCCS de cuatro columnas realizan la operación unitaria de captura de la proteína terapéutica recombinante a partir del medio de cultivo líquido. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la captura se realiza usando cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de tamices moleculares. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la cromatografía de afinidad se realiza con un mecanismo de captura seleccionado del grupo de: mecanismo de captura de unión a proteína A, mecanismo de captura de unión a sustrato, mecanismo de captura de unión a anticuerpo o fragmento de anticuerpo, mecanismo de captura de unión a aptámero y mecanismo de captura de unión a cofactor. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la cromatografía de afinidad se realiza con un mecanismo de captura de unión a proteína A y la proteína terapéutica recombinante es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el eluido que contiene la proteína terapéutica recombinante de tres de las cuatro columnas en el PCCS de cuatro columnas se alimenta a la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas realiza la operación unitaria de inactivación de virus manteniendo el eluido que contiene proteína terapéutica recombinante a un pH bajo para la inactivación vírica. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas mantiene el eluido que contiene la proteína terapéutica recombinante a un pH bajo para la inactivación vírica durante un periodo de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,5 horas.
[0033] Algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento incluyen además ajustar el pH del eluido desde la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas usando un depósito de ajuste de tampón en línea antes de que el eluido de la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas se alimente al PCCS2. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el sistema de cromatografía PCCS2 incluye tres columnas cromatográficas y una membrana cromatográfica. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 realizan la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante a partir del eluido del PCCS1 a través de cromatografía de intercambio catiónico o aniónico. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el eluido de las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 se alimenta a la membrana cromatográfica en el PCCS2. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la membrana cromatográfica en el PCCS2 realiza la función unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante presente en el eluido de las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 a través de cromatografía de intercambio catiónico o aniónico. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la membrana cromatográfica en el PCCS2 realiza la función unitaria de pulido a través de cromatografía de intercambio catiónico. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, el flujo continuo y el lavado de la membrana cromatográfica es la sustancia farmacéutica proteica terapéutica. Algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento incluyen además formular la sustancia farmacéutica proteica terapéutica en una composición farmacéutica. En algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, la proteína terapéutica recombinante es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una enzima, una proteína genomanipulada o una proteína inmunogénica o fragmento de proteína.
[0035] Algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento incluyen además ajustar la concentración iónica del eluido de las tres columnas en el PCCS2 usando un ajuste del tampón en línea antes de que el eluido de las tres columnas en el PCCS2 se alimente a la membrana cromatográfica en el PCCS2. Algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento incluyen además el uso de un tanque de ruptura (por ejemplo, cualquier tanque de ruptura descrito en el presente documento) entre el PCCS1 y el PCCS2. Algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento incluyen además filtrar el eluido del PCCS1 antes de que se alimente en el PCCS2. Algunas realizaciones de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento incluyen además filtrar el medio de cultivo líquido antes de que se alimente en el PCCS1.
[0037] También se proporcionan un sistema de fabricación biológica que incluye: un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS 1) que incluye una entrada; y un segundo sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS2) que incluye una salida, donde el primer y segundo PCCS están en comunicación fluida entre sí, y donde el sistema de fabricación está configurado de modo que el fluido se puede pasar a la entrada, a través del primer y segundo PCCS, y salir del sistema de fabricación a través de la salida, donde el PCCS1 está configurado para realizar la operación unitaria de captura de una proteína terapéutica recombinante, y el PCCS2 está configurado para realizar al menos las dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante, en donde la purificación se realiza usando una resina en PCCS2 que es diferente de la resina usada en PCCS2 para realizar el pulido. Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento incluyen además un biorreactor, donde el biorreactor y la entrada están en comunicación fluida entre sí, y donde el sistema de fabricación está configurado de modo que el fluido presente en el biorreactor pueda introducirse en la entrada. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el primer PCCS o el segundo PCCS, o ambos, está/están configurados para realizar al menos dos operaciones unitarias separadas. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el uso del PCCS1 o del PCCS2, o ambos, implica el cambio de columna.
[0039] En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el primer PCCS está configurado para realizar las operaciones unitarias de captura de la proteína terapéutica recombinante e inactivación de virus. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el segundo PCCS está configurado para realizar las operaciones unitarias de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el primer PCCS o el segundo PCCS, o ambos, contienen al menos dos columnas cromatográficas. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el primer PCCS o el segundo PCCS, o ambos, contienen al menos dos membranas cromatográficas. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el primer PCCS o el segundo PCCS, o ambos, contienen al menos una columna cromatográfica y al menos una membrana cromatográfica.
[0041] En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el PCCS 1 incluye un PCCS de cuatro columnas. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, tres de las cuatro columnas en el PCCS de cuatro columnas son capaces de capturar la proteína terapéutica recombinante a partir del medio de cultivo líquido. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, las tres de las cuatro columnas en el PCCS de cuatro columnas incluyen una o más de una columna de cromatografía de afinidad, una columna de cromatografía catiónica, una columna de cromatografía aniónica y una columna de cromatografía de tamices moleculares. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, las tres de las cuatro columnas en el PCCS de cuatro columnas incluyen una o más de una columna de cromatografía de afinidad que utiliza un mecanismo de captura seleccionado del grupo de: mecanismo de captura de unión a proteína A, mecanismo de captura de unión a sustrato, mecanismo de captura de unión a anticuerpo o fragmento de anticuerpo, mecanismo de captura de unión a aptámero y mecanismo de captura de unión a cofactor. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas es un depósito o una columna que es capaz de contener el eluido de las tres de las cuatro columnas del PCCS de cuatro columnas que contienen la proteína terapéutica recombinante a bajo pH para la inactivación vírica. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas es capaz de mantener el eluido que contiene proteína terapéutica recombinante de las tres de las cuatro columnas del PCCS de cuatro columnas a pH bajo para la inactivación vírica durante un periodo de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,5 horas.
[0043] Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento incluyen además un conducto de fluido dispuesto entre el primer PCCS y el segundo PCCS. Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento incluyen además un depósito de ajuste de tampón en línea en comunicación fluida con el conducto de fluido dispuesto entre el primer PCCS y el segundo PCCS, y configurado de modo que el tampón contenido dentro del depósito de ajuste de tampón en línea se introduzca en el fluido presente en el conducto de fluido dispuesto entre el primer PCCS y el segundo PCCS. Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento incluyen además un filtro dispuesto en el conducto de fluido entre el primer PCCS y el segundo PCCS, y configurado de modo que el filtro sea capaz de eliminar la materia particulada del fluido presente en el conducto de fluido entre el primer PCCS y el segundo PCCS.
[0045] En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el PCCS2 incluye tres columnas cromatográficas y una membrana cromatográfica. Algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento incluyen además un conducto de fluido dispuesto entre las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 y la membrana cromatográfica en el PCCS2. Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en la presente incluyen además un depósito de ajuste de tampón en línea en comunicación fluida con el conducto de fluido dispuesto entre las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 y la membrana cromatográfica en el PCCS2, y configurado de modo que el tampón contenido dentro del depósito de ajuste de tampón en línea se introduzca en el fluido presente en el conducto de fluido dispuesto entre las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 y la membrana cromatográfica en el PCCS2.
[0047] En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 son capaces de purificar la proteína terapéutica recombinante a través de una cromatografía de intercambio catiónico o aniónico. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, la membrana cromatográfica en el PCCS2 es una membrana cromatográfica de intercambio catiónico.
[0049] Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento incluyen además un conducto de fluido entre la membrana cromatográfica en el PCCS2 y la salida. Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento incluyen además un filtro dispuesto en el conducto de fluido entre la membrana cromatográfica en el PCCS2 y la salida, y configurado de modo que el filtro sea capaz de eliminar la materia particulada del fluido presente en el conducto de fluido entre la membrana cromatográfica en el PCCS2 y la salida. Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento incluyen además un sistema de bomba que está en comunicación fluida con la entrada. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el sistema de bomba incluye una bomba que es capaz de empujar el fluido hacia la entrada. Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento incluyen además un conducto de fluido dispuesto entre la bomba y la entrada. Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento incluyen además un filtro dispuesto en el conducto de fluido entre la bomba y la entrada, y configurado de modo que el filtro sea capaz de eliminar la materia particulada del fluido presente en el conducto de fluido entre la bomba y la entrada. Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento incluyen además un tanque de ruptura (por ejemplo, un tanque de ruptura descrito en el presente documento) dispuesto en el conducto de fluido entre la bomba y la entrada que está configurado de modo que el tanque de ruptura esté en comunicación fluida con el conducto de fluido entre la bomba y la entrada, y es capaz de almacenar cualquier fluido presente en el conducto de fluido que no sea capaz de entrar en la entrada.
[0051] En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el primer PCCS y el segundo PCCS están dispuestos sobre un patín (por ejemplo, un patín que incluye una o más estructuras que permiten el movimiento). En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el primer PCCS está dispuesto sobre un primer patín. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el segundo PCCS está dispuesto sobre un segundo patín. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, cada uno del primer y segundo patín incluye una o más estructuras que permiten el movimiento. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, todo el sistema está dispuesto sobre un patín (por ejemplo, un patín que incluye una o más estructuras que permiten el movimiento).
[0053] También se proporcionan sistemas de fabricación biológica que incluyen dos o más subsistemas, donde los dos o más subsistemas incluyen cada uno: (i) un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS 1) que comprende una entrada; y (ii) un segundo sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS2) que comprende una salida, donde el primer y segundo PCCS están en comunicación fluida entre sí, y donde el sistema de fabricación está configurado de modo que el fluido se puede pasar a la entrada, a través del primer y segundo PCCS, y salir del sistema de fabricación a través de la salida, donde el PCCS1 está configurado para realizar la operación unitaria de captura de una proteína terapéutica recombinante, y el PCCS2 está configurado para realizar al menos las dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante, en donde la purificación se realiza usando una resina en PCCS2 que es diferente de la resina usada en PCCS2 para realizar el pulido; y donde los dos o más subsistemas están configurados de modo que estén cada uno en comunicación fluida con un único depósito que contiene un fluido, y el fluido del único depósito pasa a la entrada de los dos o más subsistemas. En algunas de las realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, cada uno de los dos o más subsistemas está dispuesto sobre su propio patín. En algunas de las realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el patín incluye una o más estructuras que permiten el movimiento. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, todo el sistema está dispuesto sobre un patín (por ejemplo, un patín que incluye una o más estructuras que permiten el movimiento).
[0054] Como se usa en el presente documento, la palabra "un/a" antes de un sustantivo representa uno o más del sustantivo en particular. Por ejemplo, la expresión "una célula de mamífero" representa "una o más células de mamífero".
[0055] La expresión "célula de mamífero" significa cualquier célula de o derivada de cualquier mamífero (por ejemplo, un ser humano, un hámster, un ratón, un mono verde, una rata, un cerdo, una vaca o un conejo). Por ejemplo, una célula de mamífero puede ser una célula inmortalizada. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula diferenciada. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula indiferenciada. Se describen en el presente documento ejemplos no limitativos de células de mamífero. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de células de mamífero.
[0056] El término "sustancialmente libre" significa una composición (por ejemplo, un medio de cultivo líquido) que está al menos o aproximadamente 90 % libre (por ejemplo, al menos o aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o al menos o aproximadamente 99 % libre, o aproximadamente 100 % libre) de una sustancia especificada (por ejemplo, una célula de mamífero).
[0057] El término "volumen 0,5x" significa aproximadamente el 50 % del volumen. El término "volumen 0,6x" significa aproximadamente el 60 % del volumen. Del mismo modo, 0,7x, 0,8x, 0,9x y 1,0x significan aproximadamente el 70 %, 80 %, 90 % o 100 % del volumen, respectivamente.
[0058] El término "cultivo" o "cultivo celular" significa el mantenimiento o proliferación de una célula de mamífero en un conjunto controlado de condiciones físicas.
[0059] La expresión "cultivo de células de mamífero" significa un medio de cultivo líquido que contiene una pluralidad de células de mamífero que se mantiene o prolifera en un conjunto controlado de condiciones físicas.
[0060] El término "medio de cultivo líquido" significa un fluido que contiene nutrientes suficientes para permitir que una célula (por ejemplo, una célula de mamífero) crezca o proliferein vitro. Por ejemplo, un medio de cultivo líquido puede contener uno o más de: aminoácidos (por ejemplo, 20 aminoácidos), una purina (por ejemplo, hipoxantina), una pirimidina (por ejemplo, timidina), colina, inositol, tiamina, ácido fólico, biotina, calcio, niacinamida, piridoxina, riboflavina, timidina, cianocobalamina, piruvato, ácido lipoico, magnesio, glucosa, sodio, potasio, hierro, cobre, zinc y bicarbonato sódico. En algunas realizaciones, un medio de cultivo líquido puede contener suero de un mamífero. En algunas realizaciones, un medio de cultivo líquido no contiene suero ni otro extracto de un mamífero (un medio de cultivo líquido definido). En algunas realizaciones, un medio de cultivo líquido puede contener oligoelementos metálicos, una hormona de crecimiento de mamífero y/o un factor de crecimiento de mamífero. Otro ejemplo de medio de cultivo líquido es medio mínimo (por ejemplo, un medio que contiene únicamente sales inorgánicas, una fuente de carbono y agua). En el presente documento se describen ejemplos no limitativos de medio de cultivo líquido. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de medio de cultivo líquido, y están disponibles comercialmente. Un medio de cultivo líquido puede contener cualquier densidad de células de mamífero. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, un volumen de medio de cultivo líquido extraído de un biorreactor puede estar sustancialmente libre de células de mamífero.
[0061] La expresión "medio de cultivo líquido libre de componentes derivados de animal" significa un medio de cultivo líquido que no contiene ningún componente (por ejemplo, proteínas o suero) derivado de un mamífero.
[0062] La expresión "medio de cultivo líquido libre de suero" significa un medio de cultivo líquido que no contiene un suero de mamífero.
[0063] La expresión "medio de cultivo líquido que contiene suero" significa un medio de cultivo líquido que contiene un suero de mamífero.
[0064] La expresión "medio de cultivo líquido definido químicamente" es un término de la técnica y significa un medio de cultivo líquido en el que se conocen todos los componentes químicos. Por ejemplo, un medio de cultivo líquido químicamente definido no contiene suero bovino fetal, seroalbúmina bovina o seroalbúmina humana, ya que estos preparados normalmente contienen una mezcla compleja de albúminas y lípidos.
[0065] La expresión "medio de cultivo líquido libre de proteínas" significa un medio de cultivo líquido que no contiene ninguna proteína (por ejemplo, ninguna proteína detectable).
[0067] El término "agitación" significa agitar o mover de otro modo una parte del medio de cultivo líquido en un biorreactor. Esto se realiza con el fin de, por ejemplo, aumentar la concentración de O<2>disuelto en el medio de cultivo líquido en un biorreactor. La agitación se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, un instrumento o propulsor. En la técnica se conocen dispositivos y métodos ejemplares que pueden usarse para realizar la agitación de una parte del medio de cultivo líquido en un biorreactor.
[0069] La expresión "sustancia farmacéutica proteica terapéutica" significa una proteína recombinante (por ejemplo, una inmunoglobulina, fragmento proteico, proteína genomanipulada o enzima) que se ha purificado o aislado suficientemente de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos contaminantes (por ejemplo, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos contaminantes presentes en un medio de cultivo líquido o de una célula hospedadora (por ejemplo, de una célula hospedadora de mamífero, levadura o bacteriana)) y contaminantes biológicos (por ejemplo, contaminantes víricos y bacterianos), y se puede formular en un agente farmacéutico sin ninguna etapa adicional de purificación y/o descontaminación sustancial.
[0071] La expresión "proceso integrado" significa un proceso que se realiza usando elementos estructurales que funcionan de manera cooperativa para conseguir un resultado específico (por ejemplo, la generación de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica a partir de un medio de cultivo líquido).
[0073] La expresión "proceso continuo" significa un proceso que alimenta continuamente fluido a través de al menos una parte del sistema. Por ejemplo, en cualquiera de los sistemas de fabricación biológica continua ejemplares descritos en el presente documento, un medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante se alimenta continuamente en el sistema mientras está en funcionamiento y una sustancia farmacéutica proteica terapéutica se extrae del sistema. En otro ejemplo, un proceso continuo es un proceso que alimenta continuamente un medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante de un biorreactor a través de un primer PCCS. Otro ejemplo de un proceso continuo es un proceso que alimenta continuamente un medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante de un biorreactor a través de un primer PCCS. Ejemplos adicionales incluyen un proceso que alimenta continuamente un medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante a través de un primer PCCS, un proceso que alimenta continuamente un medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante a través de un primer y segundo PCCS, o un proceso que alimenta continuamente un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante a través de un segundo PCCS.
[0075] El término "inmunoglobulina" significa un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 15 aminoácidos (por ejemplo, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoácidos) de una proteína de inmunoglobulina (por ejemplo, una secuencia de dominio variable, una secuencia de armazón, o una secuencia de dominio constante). La inmunoglobulina puede incluir, por ejemplo, al menos 15 aminoácidos de una inmunoglobulina de cadena ligera, por ejemplo al menos 15 aminoácidos de una inmunoglobulina de cadena pesada. La inmunoglobulina puede ser un anticuerpo aislado (por ejemplo, una IgG, IgE, IgD, IgA o IgM). La inmunoglobulina puede ser una subclase de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). La inmunoglobulina puede ser un fragmento de anticuerpos, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')<2>o un fragmento scFv. La inmunoglobulina también puede ser un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico, o un anticuerpo dímero, trímero o multímero, o un diacuerpo, un Affibody<®>o un Nanobody<®>. La inmunoglobulina también puede ser una proteína genomanipulada que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina (por ejemplo, una proteína de fusión). Se describen en este documento ejemplos no limitativos de inmunoglobulinas, y se conocen en la técnica ejemplos adicionales de inmunoglobulinas.
[0077] La expresión "fragmento de proteína" o "fragmento de polipéptido" significa una parte de una secuencia polipeptídica que tiene al menos o aproximadamente 4 aminoácidos, al menos o aproximadamente 5 aminoácidos, al menos o aproximadamente 6 aminoácidos, al menos o aproximadamente 7 aminoácidos, al menos o aproximadamente 8 aminoácidos, al menos o aproximadamente 9 aminoácidos, al menos o aproximadamente 10 aminoácidos, al menos o aproximadamente 11 aminoácidos, al menos o aproximadamente 12 aminoácidos, al menos o aproximadamente 13 aminoácidos, al menos o aproximadamente 14 aminoácidos, al menos o aproximadamente 15 aminoácidos, al menos o aproximadamente 16 aminoácidos, al menos o aproximadamente 17 aminoácidos, al menos o aproximadamente 18 aminoácidos, al menos o aproximadamente 19 aminoácidos, o al menos o aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, o más de 20 aminoácidos de longitud. Se puede producir un fragmento de proteína recombinante usando cualquiera de los procesos descritos en el presente documento.
[0078] El término "proteína genomanipulada" significa un polipéptido que no está codificado naturalmente por un ácido nucleico endógeno presente dentro de un organismo (por ejemplo, un mamífero). Los ejemplos de proteínas genomanipuladas incluyen enzimas (por ejemplo, con una o más sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de aminoácidos que dan como resultado un aumento en la estabilidad y/o actividad catalítica de la enzima genomanipulada), proteínas de fusión, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos divalentes, anticuerpos trivalentes, o un diacuerpo), y proteínas de unión a antígeno que contienen al menos una secuencia de armazón recombinante.
[0079] Un sistema cromatográfico multicolumna es un sistema cromatográfico a contracorriente periódico (PCCS) que contiene un total de dos o más columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas interconectadas o de sustitución. En el presente documento se describen ejemplos adicionales de sistemas cromatográficos multicolumna y estos se conocen en la técnica.
[0081] El término "captura" significa una etapa realizada para purificar o aislar parcialmente (por ejemplo, al menos o aproximadamente un 5 %, por ejemplo, al menos o aproximadamente un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o al menos o aproximadamente un 95 % puro en peso), concentrar y estabilizar una proteína terapéutica recombinante a partir de uno o más componentes diferentes presentes en un medio de cultivo líquido o un medio de cultivo líquido diluido (por ejemplo, proteínas del medio de cultivo o uno o más componentes diferentes (por ejemplo, ADN, ARN u otras proteínas) presentes en o secretadas a partir de una célula de mamífero). Normalmente, la captura se realiza usando una resina que se une a una proteína terapéutica recombinante (por ejemplo, mediante el uso de cromatografía de afinidad). En el presente documento se describen métodos no limitativos para capturar una proteína terapéutica recombinante de un medio de cultivo líquido o de un medio de cultivo líquido diluido, y se conocen otros en la técnica. Una proteína terapéutica recombinante puede capturarse a partir de un medio de cultivo líquido usando al menos una columna cromatográfica y/o membrana cromatográfica (por ejemplo, cualquiera de las columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas descritas en el presente documento).
[0083] El término "purificación" significa una etapa realizada para aislar una proteína terapéutica recombinante de una o más impurezas diferentes (por ejemplo, impurezas a granel) o componentes presentes en un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante (por ejemplo, proteínas del medio de cultivo líquido o uno o más componentes diferentes (por ejemplo, ADN, ARN, otras proteínas, endotoxinas, virus, etc.) presentes en o secretados a partir de una célula de mamífero). Por ejemplo, la purificación se puede realizar durante o después de una etapa de captura inicial. La purificación se puede realizar usando una resina, membrana o cualquier otro soporte sólido que se une a una proteína terapéutica recombinante o a contaminantes (por ejemplo, mediante el uso de cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico o cromatografía de tamices moleculares). Una proteína terapéutica recombinante puede purificarse a partir de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante usando al menos una columna cromatográfica y/o membrana cromatográfica (por ejemplo, cualquiera de las columnas cromatográficas o membranas cromatográficas descritas en el presente documento).
[0085] El término "pulido" es un término de la técnica y significa una etapa realizada para eliminar las trazas restantes o pequeñas cantidades de contaminantes o impurezas de un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante que está cerca de una pureza deseada final. Por ejemplo, el pulido se puede realizar haciendo pasar un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante a través de una columna o columnas cromatográficas o absorbente o absorbentes de membrana que se unen selectivamente a la proteína terapéutica recombinante diana o a pequeñas cantidades de contaminantes o impurezas presentes en un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante. En dicho ejemplo, el eluido/filtrado de la columna o columnas cromatográficas o absorbente o absorbentes de membrana contiene la proteína terapéutica recombinante.
[0087] El término "eluido/filtrado" es un término de la técnica y significa un fluido que se emite desde una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que contiene una cantidad detectable de una proteína terapéutica recombinante.
[0089] El término "filtrado" significa la eliminación de al menos parte de (por ejemplo, al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % o 99 %) contaminantes biológicos no deseados (por ejemplo, una célula de mamífero, bacterias, células de levadura, virus o micobacterias) y/o materia particulada (por ejemplo, proteínas precipitadas) de un líquido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido o fluido presente en cualquiera de los sistemas o procesos descritos en el presente documento).
[0091] La expresión "proteína secretada" o "proteína recombinante secretada" significa una proteína (por ejemplo, una proteína recombinante) que contenía originalmente al menos una secuencia señalizadora de secreción cuando se traduce dentro de una célula de mamífero, y a través, al menos en parte, de la escisión enzimática de la secuencia señalizadora de secreción en la célula de mamífero, se secreta al espacio extracelular (por ejemplo, un medio de cultivo líquido). Los expertos apreciarán que una proteína "secretada" no necesita disociarse completamente de la célula para ser considerada una proteína secretada.
[0093] La expresión "biorreactor de perfusión" significa un biorreactor que contiene una pluralidad de células (por ejemplo, células de mamífero) en un primer medio de cultivo líquido, en donde el cultivo de las células presentes en el biorreactor incluye la extracción periódica o continua del primer medio de cultivo líquido y al mismo tiempo o poco después la adición de sustancialmente el mismo volumen de un segundo medio de cultivo líquido al biorreactor. En algunos ejemplos, se produce un cambio incremental (por ejemplo, aumento o disminución) en el volumen del primer medio de cultivo líquido extraído y añadido durante periodos incrementales (por ejemplo, un periodo de aproximadamente 24 horas, un periodo de entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 horas, o un periodo de más de 24 horas) durante el periodo de cultivo (por ejemplo, la tasa de realimentación del medio de cultivo diariamente). La fracción de medio extraído y reemplazado cada día puede variar dependiendo de las células particulares que se cultivan, la densidad de siembra inicial y la densidad celular en un momento particular. "RV" o "volumen del reactor" significa el volumen del medio de cultivo presente al inicio del procedimiento de cultivo (por ejemplo, el volumen total del medio de cultivo presente después de la siembra).
[0094] La expresión "biorreactor semicontinuo" es un término de la técnica y significa un biorreactor que contiene una pluralidad de células (por ejemplo, células de mamífero) en un primer medio de cultivo líquido, en donde el cultivo de las células presentes en el biorreactor incluye la adición periódica o continua de un segundo medio de cultivo líquido al primer medio de cultivo líquido sin una extracción sustancial o significativa del primer medio de cultivo líquido o el segundo medio de cultivo líquido del cultivo celular. El segundo medio de cultivo líquido puede ser el mismo que el primer medio de cultivo líquido. En algunos ejemplos del cultivo semicontinuo, el segundo medio de cultivo líquido es una forma concentrada del primer medio de cultivo líquido. En algunos ejemplos del cultivo semicontinuo, el segundo medio de cultivo líquido se añade como un polvo seco.
[0095] La expresión "medio de cultivo líquido clarificado" se refiere a un medio de cultivo líquido obtenido a partir de un cultivo de células de mamífero, bacterianas o de levaduras que esta sustancialmente libre (por ejemplo, libre en al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 % o 99 %) de células de mamífero, bacterias o levaduras. La expresión "operación unitaria" es un término de la técnica y significa una etapa funcional que se puede realizar en un proceso de fabricación de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica a partir de un medio de cultivo líquido. Por ejemplo, una unidad de operación puede ser la filtración (por ejemplo, eliminación de bacterias contaminantes, virus de levadura o micobacterias, y/o materia particular de un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante), captura, eliminación de marcadores de epítopos, purificación, retención o almacenamiento, pulido, inactivación vírica, ajuste de la concentración iónica y/o pH de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante y eliminación de sales no deseadas.
[0096] La "tasa de productividad específica" o "SPR" es un término de la técnica y, como se usa en el presente documento, se refiere a la masa o actividad enzimática de una proteína terapéutica recombinante producida por célula de mamífero al día. La SPR para un anticuerpo terapéutico recombinante generalmente se mide como masa/célula/día. La SPR para una enzima terapéutica recombinante generalmente se mide como unidades/célula/día o (unidades/masa)/célula/día.
[0097] La "tasa de productividad volumétrica" o "VPR" es un término de la técnica y, como se usa en el presente documento, se refiere a la masa o actividad enzimática de la proteína terapéutica recombinante producida por volumen de cultivo (por ejemplo, por l de volumen de biorreactor, recipiente o tubo) por día. La VPR para un anticuerpo terapéutico recombinante generalmente se mide como masa/l/día. La VPR para una enzima terapéutica recombinante generalmente se mide como unidades/l/día o masa/l/día.
[0098] "Patín" es un término de la técnica y, como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura sólida tridimensional que puede actuar como una plataforma o soporte para un sistema descrito en el presente documento. Un patín puede, si comprende una o más estructuras que permiten el movimiento (por ejemplo, ruedas, rodillos o similares), conferir movilidad al sistema o una parte del mismo. Se describen en el presente documento ejemplos no limitativos de patines. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de patines.
[0099] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. En el presente documento se describen métodos y materiales para uso en la presente invención; también se pueden usar otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones.
[0100] Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y figuras, y de las reivindicaciones.
[0101] DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0102] La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un sistema integrado ilustrativo que puede usarse para producir continuamente una sustancia farmacéutica proteica recombinante.
[0103] La Figura 2 es un diagrama del sistema de PCC única conectado a un biorreactor de perfusión de cultivo celular que puede usarse para capturar una proteína terapéutica recombinante presente en el medio de cultivo celular obtenido del biorreactor.
[0104] La Figura 3 es un diagrama de un ciclo del sistema de PCC que contiene tres columnas cromatográficas. Al comienzo de un ciclo, la disolución de alimentación se carga en la columna 1, y el flujo continuo se desecha hasta que se produce el avance del producto (etapa 1). En este punto, el flujo continuo de la columna 1 se dirige a la columna 2 para capturar la proteína terapéutica recombinante no unida de la columna 1 (etapa 2). Una vez que la columna 1 está completamente cargada, la alimentación ahora se dirige a la columna 2, mientras que la columna 1 se lava, eluye, regenera y reequilibra para el siguiente ciclo (etapas 3 y 4). La columna 2 pasa ahora por las etapas 3-5, que son idénticas a las etapas 1-3 para la columna 1. Finalmente, la columna 3 pasa por las etapas 5-6, lo mismo que las columnas 1 y 2. Una vez que las tres columnas han completado estas etapas, el ciclo se reinicia con la columna 1.
[0105] La Figura 4 es un diagrama esquemático que demuestra el principio de sustitución de columna basado en -UV. T1 designa el tiempo en que -UV ha alcanzado un nivel umbral predeterminado. Una vez que se alcanza este nivel umbral, el flujo continuo de la columna 1 se dirige a la columna 2 en lugar de a desechos. T2 designa el tiempo en que la columna ha estado saturada con el producto. El valor -UV tanto para T1 como para T2 son específicos del proceso.
[0106] La Figura 5A es un gráfico del perfil de densidad celular a lo largo del tiempo en el cultivo de biorreactor que produce el anticuerpo terapéutico recombinante. La densidad celular promedio en el cultivo de biorreactor fue de 50-60 × 10<6>células/ml.
[0107] La Figura 5B es un gráfico de la tasa de productividad volumétrica con el tiempo del cultivo de biorreactor que produce el anticuerpo terapéutico recombinante.
[0108] La Figura 6 es un conjunto de gráficos que muestran el porcentaje de recuperación, el porcentaje de agregación, la potencia (en comparación con el control), la concentración residual de proteína A (ng/mg) y la concentración de proteína de la célula hospedadora (ng/mg) en la proteína terapéutica recombinante eluida del único sistema de PCC durante un total de 30 días, 38 ciclos del único sistema de PCC y 110 operaciones en columna. La variabilidad asociada con los tres ensayos ELISA (recuperación, proteína A residual y proteína de la célula hospedadora) fue de ± 20 %. Todos los datos mostrados están dentro de la variabilidad del ensayo.
[0109] La Figura 7A es un gráfico del perfil de densidad celular a lo largo del tiempo en el cultivo de biorreactor que produce la enzima humana terapéutica recombinante. La densidad celular promedio en el cultivo de biorreactor después del día 19 fue de 50-60 × 10<6>células/ml.
[0110] La Figura 7B es un gráfico de la tasa de productividad volumétrica con el tiempo del cultivo de biorreactor que produce la enzima humana terapéutica recombinante. Se cree que los dos valores de titulación bajos determinados aproximadamente el día 48-49 se deben a la variabilidad del ensayo, ya que no hubo cambios en la densidad celular, la tasa de perfusión o el metabolismo durante este periodo.
[0111] La Figura 8 es un conjunto de gráficos que muestran el porcentaje de recuperación, la actividad específica (unidades/mg), el porcentaje de agregación, la potencia (en comparación con el control), el atributo de calidad crítica (CQA) n.º 1, CQA n.º 2, CQA n.º 3 y CQA n.º 4 en la enzima humana terapéutica recombinante eluida del único sistema de PCC durante un total de 9 días, 41 ciclos del único sistema de PCC y 164 operaciones en columna. Los CQA n.º 3 y n.º 4 tienen puntos de datos limitados, pero representan toda la duración operativa. La desviación estándar de los CQA está en el intervalo de 1 - 9 %.
[0112] La Figura 9 es un esquema que muestra el sistema de fabricación de dos PCCS conectado con un biorreactor de cultivo de perfusión que da como resultado la fabricación continua de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica.
[0113] La Figura 10 es un gráfico del perfil de densidad celular viable con el tiempo en el cultivo de biorreactor que produce el anticuerpo monoclonal terapéutico recombinante. La densidad celular promedio en el cultivo de biorreactor fue de 50-60 × 10<6>células/ml.
[0114] La Figura 11 es un gráfico de la tasa de productividad volumétrica a lo largo del tiempo del cultivo de biorreactor que produce el anticuerpo monoclonal terapéutico recombinante.
[0115] La Figura 12 es un gráfico del perfil UV en tiempo real de las columnas de captura de proteína A en una ventana de tiempo limitado. Cada tercer pico de cada tres picos representa la absorbancia UV de salida de la columna 1, cada segundo pico de cada tres picos representa la absorbancia de salida UV de la columna 2, cada primer pico de cada tres picos representa la absorbancia UV de la columna 3.
[0116] La Figura 13 es un gráfico del perfil UV en tiempo real de las columnas Capto-S en una ventana de tiempo limitado. La línea negra discontinua representa la absorbancia UV de alimentación, cada tercer pico de cada tres picos representa la absorbancia UV de salida de la columna 1, cada segundo pico de cada tres picos representa la absorbancia de salida UV de la columna 2 y cada primer pico de cada tres picos representa la absorbancia UV de la columna 3.
[0118] La Figura 14 es un gráfico del perfil UV en tiempo real de la membrana Q de Sartobind en una ventana de tiempo limitado.
[0120] La Figura 15 es un gel de electroforesis de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio de una cantidad de referencia del anticuerpo monoclonal recombinante (carril 1), y el eluido del sistema de dos PCC obtenido los días 1, 10, 15, 20, 25, 30 o 31 de producción (carriles 3-9, respectivamente).
[0122] La Figura 16 es un conjunto de gráficos que muestran la concentración de proteína (mg/ml), el porcentaje de agregación, la potencia (en comparación con el control), la concentración residual de proteína A (ng/mg) y la concentración de proteína de la célula hospedadora (ng/mg) en el producto eluido del sistema de dos PCC durante un total de 31 días y 25 lotes de sistema dual. La variabilidad asociada con las mediciones de agregación y proteína A residual se debió a la operación de membrana Q no optimizada. Sin embargo, las tendencias fueron comparables entre la operación discontinua y la continua. Todos los resultados anteriores están dentro de la variabilidad del ensayo.
[0124] DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0126] En el presente documento se proporcionan procesos integrados y completamente continuos para fabricar una sustancia farmacéutica proteica terapéutica. Estos procesos incluyen, por ejemplo, proporcionar un medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante que está sustancialmente libre de células, después alimentar el medio de cultivo líquido en un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS1). La siguiente etapa implica capturar la proteína terapéutica recombinante en el medio de cultivo líquido usando el PCCS1. Las siguientes etapas implican alimentar continuamente el eluido del PCCS1 que contiene la proteína terapéutica recombinante en un segundo sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS2), y realizar al menos dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína usando el PCCS2, donde la purificación se realiza usando una resina que es diferente de la resina usada para realizar el pulido. El eluido resultante del PCCS2 se considera una sustancia farmacéutica proteica terapéutica. Los procesos se integran y pueden ejecutarse continuamente desde el medio de cultivo líquido hasta el eluido del PCCS2 que es la sustancia farmacéutica proteica terapéutica. También se proporcionan en el presente documento sistemas de fabricación biológica ejemplares que pueden usarse para realizar estos métodos.
[0128] Sistemas de fabricación biológica
[0130] La presente memoria descriptiva proporciona sistemas de fabricación biológica ejemplares útiles para realizar los procesos descritos en el presente documento. Los sistemas incluyen un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS 1) que incluye una entrada y un segundo PCCS que incluye una salida. En estos sistemas, el primer y segundo PCCS están en comunicación fluida entre sí. Los sistemas también están configurados de modo que el fluido se puede pasar a la entrada, a través del primer y segundo PCCS, y salir del sistema de fabricación a través de la salida, donde el PCCS1 está configurado para realizar la operación unitaria de captura de una proteína terapéutica recombinante, y el PCCS2 está configurado para realizar al menos las dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante, en donde la purificación se realiza usando una resina en PCCS2 que es diferente de la resina usada en PCCS2 para realizar el pulido.
[0132] Los sistemas descritos en el presente documento proporcionan la producción continua y eficiente en el tiempo de una sustancia farmacéutica terapéutica a partir de un medio de cultivo líquido. Por ejemplo, el tiempo transcurrido entre la alimentación de un fluido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido) que contiene una proteína terapéutica en el primer PCCS y la elución de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica (que contiene la proteína terapéutica) desde la salida del segundo PCCS puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 48 horas, inclusive, por ejemplo, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 28 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 26 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 24 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 22 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 20 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 16 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 20 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 16 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 10 horas y 20 horas, entre aproximadamente 10 horas y 18 horas, entre aproximadamente 10 horas y 16 horas, entre aproximadamente 10 horas y 14 horas, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 25 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 35 horas, o entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 30 horas, inclusive. En otros ejemplos, el tiempo transcurrido entre la alimentación del fluido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido) que contiene una proteína terapéutica en el primer PCCS y la elución de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica (que contiene la proteína terapéutica) desde la salida del segundo PCCS es, por ejemplo, mayor de aproximadamente 4 horas y es menor de aproximadamente 40 horas, inclusive, por ejemplo, mayor de aproximadamente 4 horas y menor de aproximadamente 39 horas, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 37 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 5 horas, o aproximadamente 4,5 horas, inclusive.
[0134] Algunos sistemas ejemplares no contienen un tanque de ruptura. En otros, el sistema puede contener un máximo de 1, 2, 3, 4 o 5 tanques de ruptura en todo el sistema. Cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento puede contener, por ejemplo, un máximo de 1, 2, 3, 4 o 5 tanques de ruptura en todo el sistema, donde cada tanque de ruptura solo contiene una proteína terapéutica durante un periodo de tiempo total de, por ejemplo, entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 6 horas, inclusive, por ejemplo, entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 1 hora, o aproximadamente 30 minutos, inclusive. El o los tanques de ruptura descritos en la presente pueden tener una capacidad que está entre 1 ml y aproximadamente 300 ml, inclusive, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 280 ml, aproximadamente 260 ml, aproximadamente 240 ml, aproximadamente 220 ml, aproximadamente 200 ml, aproximadamente 180 ml, aproximadamente 160 ml, aproximadamente 140 ml, aproximadamente 120 ml, aproximadamente 100 ml, aproximadamente 80 ml, aproximadamente 60 ml, aproximadamente 40 ml, aproximadamente 20 ml o aproximadamente 10 ml, inclusive. Cualquier tanque o tanques de ruptura dispuestos en el sistema de modo que el fluido entre en el o los tanques de ruptura antes de entrar en PCCS1 puede tener una capacidad que está entre 1 ml y aproximadamente 100 %, inclusive, por ejemplo, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 10 % o aproximadamente un 5 %, incluido, del volumen de carga de la primera columna del PCCS1. Cualquier tanque o tanques de ruptura dispuestos en el sistema de modo que el fluido entre en el o los tanques de ruptura antes de entrar en el PCCS2 (y después de salir del PCCS1) puede tener una capacidad que está, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente el 100 %, inclusive, por ejemplo, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 5 %, incluido, del volumen de carga de la primera columna del PCCS2.
[0136] Sistema ejemplar
[0138] En la FIG. 1 se proporciona un ejemplo no limitativo de un sistema1útil en la presente invención. El sistema1incluye un primer PCCS, es decir, un PCCS de cuatro columnas2, donde tres de las cuatro columnas3, 4y5en el PCCS de cuatro columnas2realizan la operación unitaria de captura de la proteína terapéutica recombinante a partir de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante (por ejemplo, medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células de mamífero), y una de las columnas6en PCCS2realiza la operación unitaria de inactivación de virus presentes en el eluido de las columnas3, 4,y5en PCCS2que contiene la proteína terapéutica recombinante. Las columnas3, 4y5pueden contener una resina que utiliza un mecanismo de captura de unión a proteína A. La columna6es capaz de mantener un fluido a un pH de aproximadamente 3,75 durante aproximadamente 1 hora. El PCCS1también tiene una entrada7. La entrada7puede ser, por ejemplo, un orificio que acepta la entrada de un fluido en PCCS1.
[0140] El sistema1también incluye un segundo PCCS que es un PPCS8que incluye tres columnas cromatográficas9, 10y11y una membrana cromatográfica12. Las columnas9, 10y11en PCCS8pueden contener una resina de intercambio catiónico. La membrana cromatográfica12en PCCS8puede contener una resina de intercambio catiónico. El PCCS8también tiene un conducto de fluido13dispuesto entre las columnas9, 10,y11en el PCCS8y la membrana cromatográfica12en el PCCS8. El PCCS8también tiene un depósito de ajuste de tampón en línea14que está en comunicación fluida con el conducto de fluido13, y está configurado de modo que el tampón contenido dentro del depósito de ajuste de tampón en línea14se introduzca en el fluido presente en el conducto de fluido13. El PCCS8también incluye una salida15. La salida15puede ser, por ejemplo, un orificio que permite la salida del fluido del PCCS8.
[0141] El sistema1puede incluir además un conducto de fluido16dispuesto entre la PCC12y la PCC28.El sistema1también puede incluir un depósito de ajuste de tampón en línea17en comunicación fluida con el conducto de fluido16configurado de modo que el tampón contenido dentro del depósito de ajuste de tampón en línea17se pueda introducir en el fluido presente en el conducto de fluido16. El sistema1también puede incluir un filtro18dispuesto en el conducto de fluido16para filtrar el fluido presente en el conducto de fluido16. El sistema1también puede incluir un segundo primer tanque de ruptura19dispuesto en el conducto de fluido16y configurado para contener cualquier fluido en el conducto de fluido11que no se pueda alimentar fácilmente al PCCS8.
[0142] El sistema1puede incluir además un sistema de bomba20que está en comunicación fluida con la entrada7. El sistema de bomba20puede incluir una bomba21para empujar fluido hacia la entrada7. El sistema1también puede incluir un conducto de fluido22dispuesto entre la bomba21y la entrada7. El sistema1también puede incluir un filtro23dispuesto en el conducto de fluido22para filtrar el fluido (por ejemplo, medio de cultivo líquido) presente en el conducto de fluido22. El sistema1también puede incluir un tanque de ruptura24dispuesto en el conducto de fluido22configurado de modo que el tanque de ruptura24esté en comunicación fluida con el conducto de fluido22y sea capaz de almacenar cualquier fluido presente en el conducto de fluido22que no sea capaz de entrar en la entrada7.
[0143] El sistema1también puede incluir un biorreactor25y un conducto de fluido26dispuesto entre el biorreactor25y la bomba21. Se puede disponer un sistema de filtración27en el conducto de fluido26para filtrar (por ejemplo, eliminar las células) de un medio de cultivo líquido presente en el conducto de fluido26.
[0144] Estructuras y características del sistema ejemplares adicionales
[0145] El primer PCCS incluye una entrada a través de la cual se puede introducir fluido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células) en el primer PCCS. La entrada puede ser cualquier estructura conocida en la técnica para dichos objetivos. Puede incluir, por ejemplo, un roscado, nervado o sellado que permita que se inserte un conducto de fluido, de modo que, tras la inserción del conducto de fluido en la entrada, el fluido entrará en el primer PCCS a través de la entrada sin un escape significativo de fluido fuera de la entrada. Las entradas no limitativas que se pueden usar en los presentes sistemas son conocidas en la técnica y serían entendidas por los expertos en la técnica.
[0146] Primer PCCS
[0147] El primer PCCS incluye al menos dos columnas cromatográficas, al menos dos membranas cromatográficas, o al menos una columna cromatográfica y al menos una membrana cromatográfica, y una entrada. Por ejemplo, el primer PCCS puede incluir un total de cuatro columnas cromatográficas, o tres columnas cromatográficas y una membrana cromatográfica, o cualquiera de los otros PCCS ejemplares descritos en el presente documento, o tener una o más de cualquiera de las características ejemplares de un PCCS (en cualquier combinación) descrito en el presente documento. La columna o columnas cromatográficas y/o la membrana o membranas cromatográficas presentes en el primer PCCS pueden tener uno o más de cualquiera de las formas, tamaños, volúmenes (volúmenes de lecho) y/u operación u operaciones unitarias ejemplares descritos en el presente documento. La columna o columnas cromatográficas y/o la membrana o membranas cromatográficas presentes en el primer PCCS pueden contener una o más de cualquiera de las resinas ejemplares descritas en el presente documento o conocidas en la técnica. Por ejemplo, la resina contenida en una o más de la columna o columnas cromatográficas y/o la membrana o membranas cromatográficas presentes en el primer PCCS puede ser una resina que utiliza un mecanismo de captura (por ejemplo, mecanismo de captura de unión a la proteína A, mecanismo de captura de unión a la proteína G, mecanismo de captura de unión al anticuerpo o un fragmento del anticuerpo, mecanismo de captura de unión al sustrato, mecanismo de captura de unión al cofactor, mecanismo de captura de unión a un aptámero y/o mecanismo de captura de unión a una etiqueta). La resina contenida en una o más de la columna o columnas cromatográficas y/o membrana o membranas cromatográficas del primer PCCS puede ser una resina de intercambio catiónico, una resina de intercambio aniónico, una resina de tamices moleculares o una resina de interacción hidrófoba, o cualquier combinación de las mismas. En la técnica se conocen ejemplos adicionales de resinas que se pueden usar para purificar una proteína terapéutica recombinante, y pueden estar contenidas en una o más de la columna o columnas cromatográficas y/o membrana o membranas cromatográficas presentes en el primer PCCS. La columna o columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas presentes en el primer PCCS pueden contener las mismas resinas y/o resinas diferentes (por ejemplo, cualquiera de las resinas descritas en el presente documento o conocidas en la técnica para su uso en la purificación de proteínas recombinantes). Las dos o más columnas cromatográficas y/o resinas cromatográficas presentes en el primer PCCS pueden realizar una o más operaciones unitarias (por ejemplo, captura de una proteína terapéutica recombinante, purificación de una proteína terapéutica recombinante, pulido de una proteína terapéutica recombinante, inactivación de virus, ajuste de la concentración iónica y/o pH de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante, o filtración de un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante). En los ejemplos no limitativos, el primer PCCS puede realizar las operaciones unitarias de captura de una proteína terapéutica recombinante a partir de un fluido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido) e inactivación de virus presentes en el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante. El primer PCCS puede realizar cualesquiera combinaciones de dos o más operaciones unitarias descritas en el presente documento o conocidas en la técnica.
[0149] La columna o columnas cromatográficas y/o la membrana o membranas cromatográficas presentes en el primer PCCS se pueden conectar o mover unas respecto a las otras mediante un mecanismo de cambio (por ejemplo, un mecanismo de cambio de columna). El primer PCCS también puede incluir una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) bombas (por ejemplo, automáticas, por ejemplo, bombas peristálticas automáticas). Los eventos de cambio de columna pueden verse iniciados por la detección de un nivel de proteína terapéutica recombinante detectado por absorbancia UV que corresponde a un cierto nivel de proteína terapéutica recombinante en el fluido que pasa a través del primer PCCS (por ejemplo, la entrada en y/o el eluido de una o más de la columna o columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas en el primer PCCS), un volumen específico del líquido (por ejemplo, tampón) o un tiempo transcurrido específico. Por lo general, cambio de columna significa un mecanismo por el cual se permite que al menos dos columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas diferentes en un primer PCCS (por ejemplo, dos o más columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas diferentes presentes en un PCCS (por ejemplo, el primer o segundo PCCS) pasen a través de una etapa diferente (por ejemplo, equilibrado, carga, elución o lavado) a sustancialmente el mismo tiempo durante al menos parte del proceso.
[0151] Por ejemplo, el PCCS que es el primer PCCS puede incluir cuatro columnas cromatográficas, donde las tres primeras columnas realizan la operación unitaria de captura de una proteína terapéutica recombinante a partir de un fluido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido), y la cuarta columna del PCCS realiza la operación unitaria de inactivación de virus en el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante. Un primer PCCS puede utilizar un mecanismo de cambio de columna. El sistema PCC puede utilizar un sistema ÄKTA modificado (GE Healthcare, Piscataway, NJ) capaz de hacer funcionar hasta, por ejemplo, cuatro, cinco, seis, siete u ocho columnas, o más.
[0152] El primer PCCS se puede equipar con: uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) monitores UV, una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) válvulas, uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) pH-metros y/o uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) medidores de la conductividad. El primer PCCS también puede estar equipado con un sistema operativo que utiliza software (por ejemplo, un software basado en Unicorn, GE Healthcare, Piscataway, NJ) para detectar cuándo debería producirse un cambio de columna (por ejemplo, en función de la absorbancia UV, volumen del líquido o tiempo transcurrido) y que afecta (inicia) los eventos de cambio de columna. En los ejemplos en los que el PCCS incluye uno o más detectores UV, los detectores UV se pueden colocar opcionalmente en la entrada de dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) de la columna o columnas cromatográficas y/o membrana o membranas cromatográficas en el primer PCCS, y/o en la salida de una o más de la columna o columnas cromatográficas y/o membrana o membranas cromatográficas en el primer PCCS.
[0154] El primer PCCS puede incluir además uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés o veinticuatro) depósito o depósitos de ajuste de tampón y/o depósitos de tampón en línea. En otros ejemplos, el primer PCCS puede incluir uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis) tanques de ruptura que pueden contener fluido que no puede pasar con facilidad al interior de una o más de las columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas en el primer PCCS. Los sistemas descritos en el presente documento pueden contener uno o más tanques de ruptura (por ejemplo, un tanque de ruptura descrito en el presente documento) en el primer y/o segundo PCCS. Otros ejemplos de los sistemas descritos en el presente documento no incluyen un tanque de ruptura en el primer PCCS o el segundo PCCS, o no incluyen un tanque de ruptura en todo el sistema. Otros ejemplos de los sistemas descritos en el presente documento contienen un máximo de uno, dos, tres, cuatro o cinco tanques de ruptura (por ejemplo, cualquier tanque o tanques de ruptura descritos en el presente documento) en todo el sistema.
[0156] Segundo PCCS
[0158] El segundo PCCS incluye al menos dos columnas cromatográficas, al menos dos membranas cromatográficas, o al menos una columna cromatográfica y al menos una membrana cromatográfica, y una salida. Por ejemplo, el segundo PCCS puede incluir un total de cuatro columnas cromatográficas, tres columnas cromatográficas y una membrana cromatográfica, o cualquiera de los otros PCCS ejemplares descritos en el presente documento, o puede tener una o más de cualquiera de las características ejemplares de un PCCS (en cualquier combinación) descrito en el presente documento. La columna o columnas cromatográficas y/o la membrana o membranas cromatográficas presentes en el segundo PCCS pueden tener uno o más de: cualquiera de las formas, tamaños, volúmenes (volúmenes de lecho) y/u operaciones unitarias descritos en el presente documento. La columna o columnas cromatográficas y/o la membrana o membranas cromatográficas pueden contener cualquiera de las resinas ejemplares descritas en el presente documento o conocidas en la técnica. Por ejemplo, la resina contenida en una o más de la columna o columnas cromatográficas y/o la membrana o membranas cromatográficas presentes en el segundo PCCS puede ser una resina que utiliza un mecanismo de captura (por ejemplo, mecanismo de captura de unión a la proteína A, mecanismo de captura de unión a la proteína G, mecanismo de captura de unión al anticuerpo o un fragmento del anticuerpo, mecanismo de captura de unión al sustrato, mecanismo de captura de unión al cofactor, mecanismo de captura de unión a una etiqueta y/o mecanismo de captura de unión a un aptámero). Las resinas útiles incluyen, por ejemplo, una resina de intercambio catiónico, una resina de intercambio aniónico, una resina de tamices moleculares y una resina de interacción hidrófoba. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de resinas. La columna o columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas presentes en el segundo PCCS pueden contener las mismas resinas y/o resinas diferentes (por ejemplo, cualquiera de las resinas descritas en el presente documento o conocidas en la técnica para su uso en la purificación de proteínas recombinantes).
[0160] La columna o columnas cromatográficas y/o membrana o membranas cromatográficas presentes en el segundo PCCS pueden realizar una o más operaciones unitarias (por ejemplo, cualquiera de las operaciones unitarias descritas en el presente documento o cualquier combinación de las operaciones unitarias descritas en el presente documento). En ejemplos no limitativos, el segundo PCCS puede realizar las operaciones unitarias de purificación de una proteína terapéutica recombinante a partir de un fluido y pulido de la proteína terapéutica recombinante presente en el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante. En otros ejemplos no limitativos, el segundo PCCS puede realizar las operaciones unitarias de purificación de una proteína terapéutica recombinante presente en un fluido, pulido de una proteína terapéutica recombinante presente en un fluido y filtrado de un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante. En otro ejemplo, el segundo PCCS puede realizar las operaciones unitarias de purificación de una proteína terapéutica recombinante presente en un fluido, pulido de una proteína terapéutica recombinante presente en un fluido, filtrado de un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante y ajuste de la concentración iónica y/o el pH de un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante. El segundo PCCS puede realizar cualquier combinación de dos o más operaciones unitarias descritas en el presente documento o conocidas en la técnica.
[0162] La columna o columnas cromatográficas y/o la membrana o membranas cromatográficas presentes en el segundo PCCS se pueden conectar o mover unas respecto a las otras mediante un mecanismo de cambio (por ejemplo, un mecanismo de cambio de columna). El segundo PCCS también puede incluir una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) bombas (por ejemplo, automáticas, por ejemplo, bombas peristálticas automáticas). Los eventos de cambio de columna pueden verse iniciados por la detección de un nivel de proteína terapéutica recombinante detectado por absorbancia UV que corresponde a un cierto nivel de proteína terapéutica recombinante en el fluido que pasa a través del segundo PCCS (por ejemplo, la entrada en y/o el eluido de una o más de la columna o columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas en el segundo PCCS), un volumen específico del líquido (por ejemplo, tampón) o un tiempo transcurrido específico.
[0164] Por ejemplo, el PCCS que es el segundo PCCS puede contener tres columnas que realizan la operación unitaria de purificación de una proteína terapéutica recombinante a partir de un fluido, y una membrana cromatográfica que realiza la operación unitaria de pulido de una proteína terapéutica recombinante presente en un fluido. Por ejemplo, las tres columnas que realizan la operación unitaria de purificación de una proteína terapéutica recombinante a partir de un fluido pueden contener, por ejemplo, una resina de intercambio catiónico, y la membrana cromatográfica que realiza la operación unitaria de pulido puede contener una resina de intercambio catiónico. Un segundo PCCS puede utilizar un mecanismo de cambio de columna. El sistema PCCS puede utilizar un sistema ÄKTA modificado (GE Healthcare, Piscataway, NJ) capaz de hacer funcionar hasta, por ejemplo, cuatro, cinco, seis, siete u ocho columnas, o más.
[0166] El segundo PCCS se puede equipar con: uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) monitores UV, una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) válvulas, uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) pH-metros y/o uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) medidores de la conductividad. El segundo PCCS también puede estar equipado con un sistema operativo que utiliza software (por ejemplo, un software basado en Unicorn, GE Healthcare, Piscataway, NJ) para detectar cuándo debería producirse un evento de cambio de columna (por ejemplo, en función de la absorbancia UV, volumen del líquido o tiempo transcurrido) y que afecta los eventos de cambio de columna. En los ejemplos en los que el segundo PCCS incluye uno o más detectores UV, los detectores UV se pueden colocar opcionalmente en la entrada de dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) de la columna o columnas cromatográficas y/o membrana o membranas cromatográficas en el segundo PCCS, y/o en la salida de una o más de la columna o columnas cromatográficas y/o membrana o membranas cromatográficas en el segundo PCCS.
[0168] El segundo PCCS puede incluir además uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés o veinticuatro) depósito o depósitos de ajuste de tampón y/o depósitos de tampón en línea. En otros ejemplos, el segundo PCCS puede incluir uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis) tanques de ruptura (por ejemplo, cualquiera de los tanques de ruptura descritos en el presente documento) que pueden contener fluido que no puede pasar con facilidad al interior de una o más de las columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas en el segundo PCCS.
[0170] El segundo PCCS incluye una salida a través de la cual la sustancia farmacéutica proteica terapéutica puede salir del sistema. La salida puede incluir, por ejemplo, un roscado, nervado o un sellado que permita que se inserte un conducto de fluido o un vial diseñado para contener o almacenar la sustancia farmacéutica proteica terapéutica. Una salida puede contener una superficie que se puede usar para cerrar un vial estéril u otro envase de almacenamiento de este tipo en la salida con el fin de permitir que la sustancia farmacéutica proteica terapéutica fluya directamente en el vial o envase de almacenamiento estéril. Las salidas no limitativas que se pueden usar en los presentes sistemas son conocidas en la técnica y serían entendidas por los expertos en la técnica.
[0172] Los sistemas descritos en el presente documento también pueden incluir un conducto de fluido que está dispuesto entre el primer PCCS y el segundo PCCS. Cualquiera de los conductos de fluido descritos en el presente documento puede ser, por ejemplo, un tubo que está hecho de, por ejemplo, polietileno, policarbonato o plástico. El conducto de fluido dispuesto entre el primer PCCS y el segundo PCCS puede incluir además uno o más de los siguientes en cualquier combinación: uno o más depósitos de ajuste de tampón en línea que están en comunicación fluida con el conducto de fluido y están situados de modo que el tampón almacenado dentro del depósito o de los depósitos de ajuste de tampón en línea se añada al fluido presente en el conducto de fluido; un tanque de ruptura (por ejemplo, cualquiera del o de los tanques de ruptura descritos en el presente documento) que está en comunicación fluida con el conducto de fluido y está situado de modo que pueda contener cualquier exceso de fluido presente en el conducto de fluido que sea incapaz de alimentarse fácilmente al segundo PCCS; y uno o más filtros que están dispuestos en el conducto de fluido de modo que sean capaces de filtrar (por ejemplo, eliminar bacterias) el fluido presente en el conducto de fluido. Cualquiera de los depósitos de ajuste de tampón en línea puede contener, por ejemplo, un volumen de entre aproximadamente 0,5 l y 50 l de tampón (por ejemplo, a una temperatura de o inferior a 25 °C, 15 °C o 10 °C).
[0174] Los sistemas escritos en el presente documento pueden incluir opcionalmente un conducto de fluido dispuesto entre la columna cromatográfica o membrana cromatográfica final en el segundo PCCS y la salida. Los sistemas descritos en el presente documento pueden incluir además uno o más filtros en conexión fluida con el conducto de fluido dispuesto entre la columna cromatográfica o membrana cromatográfica final en el segundo PCCS y la salida, de modo que el filtro pueda eliminar, por ejemplo, material precipitado, materia particulada o bacterias del fluido presente en el conducto de fluido dispuesto entre la columna cromatográfica o membrana cromatográfica final en el segundo PCCS y la salida.
[0176] Algunos ejemplos de los sistemas que se proporcionan en el presente documento también incluyen un biorreactor que está en conectividad fluida con la entrada del primer PCCS. Cualquiera de los biorreactores ejemplares descritos en el presente documento o conocidos en la técnica se puede usar en los presentes sistemas.
[0178] Algunos ejemplos de los sistemas que se proporcionan en el presente documento también incluyen un sistema de bombas. Un sistema de bombas puede incluir uno o más de los siguientes: una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) bombas (por ejemplo, cualquiera de las bombas descritas en el presente documento o conocidas en la técnica), uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) filtros (por ejemplo, cualquiera de los filtros descritos en el presente documento o conocidos en la técnica), uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) detectores UV y uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) tanques de ruptura (por ejemplo, cualquiera de los tanques de ruptura descritos en el presente documento). Algunos ejemplos de los sistemas proporcionados en el presente documento incluyen además un conducto de fluido dispuesto entre la bomba y la entrada del primer PCCS (por ejemplo, cualquiera de los conductos de fluido ejemplares descritos en el presente documento o conocidos en la técnica). En algunos ejemplos, este conducto de fluido particular puede incluir una o más (por ejemplo, dos, tres o cuatro) bombas (por ejemplo, cualquiera de las bombas descritas en el presente documento o conocidas en la técnica) y/o uno o más (por ejemplo, dos, tres o cuatro) tanques de ruptura (por ejemplo, cualquiera de los tanques de ruptura ejemplares descritos en el presente documento), donde esta bomba o bombas y/o tanque o tanques de ruptura están en conexión fluida con el fluido presente en el conducto de fluido.
[0180] Algunos ejemplos de los sistemas descritos en el presente documento incluyen además un conducto de fluido adicional conectado al conducto de fluido entre la bomba y la entrada, donde se conecta de manera fluida un extremo del conducto de fluido adicional con un biorreactor y el otro extremo se conecta de manera fluida con el conducto de fluido entre la bomba y la entrada. Este conducto de fluido adicional puede incluir un filtro que es capaz de eliminar las células del medio de cultivo líquido extraído del biorreactor (por ejemplo, sistema de retención de células ATF).
[0182] Los sistemas proporcionados en el presente documento permiten la producción continua de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica. Por ejemplo, los sistemas proporcionados en el presente documento permiten un rendimiento porcentual de proteína terapéutica recombinante (a partir de un material de partida, por ejemplo, un medio de cultivo líquido de partida) de más de aproximadamente un 70 %, más de aproximadamente un 80 %, más de aproximadamente un 82 %, más de aproximadamente un 84 %, más de aproximadamente un 86 %, más de aproximadamente un 88 %, más de aproximadamente un 90 %, más de aproximadamente un 92 %, más de aproximadamente un 94 %, más de aproximadamente un 96 % o más de aproximadamente un 98 %. Los sistemas descritos en el presente documento también pueden dar como resultado un rendimiento porcentual de proteína terapéutica recombinante (a partir de un material de partida, por ejemplo, un medio de cultivo líquido de partida) de entre aproximadamente un 80 % y aproximadamente un 90 %, entre aproximadamente un 82 % y aproximadamente un 90 %, entre aproximadamente un 84 % y aproximadamente un 90 %, entre aproximadamente un 84 % y aproximadamente un 88 %, entre aproximadamente un 84 % y aproximadamente un 94 %, entre aproximadamente un 82 % y aproximadamente un 92 %, o entre aproximadamente un 85 % y aproximadamente un 95 %.
[0184] Los sistemas descritos en el presente documento también pueden dar como resultado la producción de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica que contiene una concentración de proteína terapéutica recombinante que es mayor de aproximadamente 1,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 1,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 2,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 2,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 3,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 3,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 4,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 4,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 5,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 5,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 6,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 6,5 mg/ml, más de aproximadamente 7,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 7,5 mg/ml, más de aproximadamente 8,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 8,5 mg/ml, más de aproximadamente 9,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 10,0 mg/ml, más de aproximadamente 12,5 mg/ml o mayor de aproximadamente 15,0 mg/ml. Como se conoce en la técnica, los sistemas pueden proporcionar la elución periódica de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica. La sustancia farmacéutica proteica terapéutica puede eluirse de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento durante una duración de, por ejemplo, entre aproximadamente 30 segundos y aproximadamente 5 horas (por ejemplo, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 4 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 3 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 2 horas, entre aproximadamente 1 minuto o aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 1 hora, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 30 minutos) a una frecuencia de, por ejemplo, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 6 horas (por ejemplo, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 5 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 4 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 3 horas, entre aproximadamente 1 minuto y 2 horas, entre aproximadamente 1 minuto y 1 hora, o entre aproximadamente 1 minuto y 30 minutos), dependiendo de, por ejemplo, la columna o columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas usadas en el primer y segundo PCCS.
[0186] Los sistemas descritos en el presente documento también pueden dar como resultado un rendimiento neto de proteína terapéutica recombinante en la sustancia farmacéutica proteica terapéutica de al menos aproximadamente 5 g/día, al menos aproximadamente 6 g/día, al menos aproximadamente 7 g/día, al menos aproximadamente 8 g/día, al menos aproximadamente 9 g/día, al menos aproximadamente 10 g/día, al menos aproximadamente 11 g/día, al menos aproximadamente 12 g/día, al menos aproximadamente 13 g/día, al menos aproximadamente 14 g/día, al menos aproximadamente 15 g/día, al menos aproximadamente 16 g/día, al menos aproximadamente 17 g/día, al menos aproximadamente 18 g/día, al menos aproximadamente 19 g/día, al menos aproximadamente 20 g/día, al menos aproximadamente 25 g/día, al menos aproximadamente 30 g/día, al menos aproximadamente 35 g/día, o al menos aproximadamente 40 g/día durante un periodo continuo de al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 10 días, al menos aproximadamente 15 días, al menos aproximadamente 20 días, al menos aproximadamente 25 días, al menos aproximadamente 30 días, al menos aproximadamente 35 días, al menos aproximadamente 40 días, al menos aproximadamente 45 días, al menos aproximadamente 50 días, al menos aproximadamente 55 días, al menos aproximadamente 60 días, al menos aproximadamente 65 días, al menos aproximadamente 70 días, al menos aproximadamente 75 días, al menos aproximadamente 80 días, al menos aproximadamente 85 días, al menos aproximadamente 90 días, al menos aproximadamente 95 días, al menos aproximadamente 100 días, al menos aproximadamente 110 días, al menos aproximadamente 120 días, al menos aproximadamente 130 días, al menos aproximadamente 140 días, al menos aproximadamente 150 días, al menos aproximadamente 160 días, al menos aproximadamente 170 días, al menos aproximadamente 180 días, al menos aproximadamente 190 días, al menos aproximadamente 200 días, al menos aproximadamente 210 días, al menos aproximadamente 220 días, al menos aproximadamente 230 días, al menos aproximadamente 240 días, al menos aproximadamente 250 días, al menos aproximadamente 260 días, al menos aproximadamente 270 días, al menos aproximadamente 280 días, al menos aproximadamente 290 días, al menos aproximadamente 300 días, al menos aproximadamente 310 días, al menos aproximadamente 320 días, al menos aproximadamente 330 días, al menos aproximadamente 340 días, al menos aproximadamente 350 días, o al menos aproximadamente 365 días.
[0188] Los sistemas descritos en el presente documento también pueden producir continuamente una sustancia farmacéutica proteica recombinante que contiene proteína terapéutica recombinante que tiene una tasa de productividad específica significativamente mejorada (en comparación con otras sustancias farmacéuticas proteicas recombinantes preparadas por un proceso o sistema diferente). Por ejemplo, los presentes sistemas pueden lograr una tasa de productividad específica (en la sustancia farmacéutica proteica recombinante) que es al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 110 veces, 120 veces, 130 veces, 140 veces, 150 veces, 160 veces, 170 veces, 180 veces, 190 veces o 200 veces mayor que la tasa de productividad específica en una sustancia farmacéutica proteica recombinante producida usando un proceso o sistema diferente (por ejemplo, un proceso de purificación discontinuo o un proceso que no está integrado y/o no es continuo). La productividad en la sustancia farmacéutica proteica recombinante lograda mediante los presentes sistemas puede ser de al menos 10.000 unidades/l, al menos 15.000 unidades/l, al menos aproximadamente 20.000 unidades/l, al menos aproximadamente 25.000 unidades/l, al menos aproximadamente 30.000 unidades/l, al menos aproximadamente 35.000 unidades/l o al menos aproximadamente 40.000 unidades/l (en el primer y/o segundo medio de cultivo líquido). La productividad en la sustancia farmacéutica proteica recombinante lograda mediante los presentes métodos puede ser de al menos 1 g/l, al menos 1,5 g/l, al menos 2,0 g/l, al menos 2,5 g/l, al menos 3,0 g/l, al menos 4,0 g/l, al menos 4,5 g/l, o al menos 5,0 g/l.
[0190] Sistemas de fabricación biológica con dos o más subsistemas
[0192] También se proporcionan sistemas de fabricación biológica que incluyen dos o más subsistemas que incluyen cada uno: (i) un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS1) que contiene una entrada (por ejemplo, cualquiera de los primeros PCCS ejemplares descritos en el presente documento); y (ii) un segundo PCCS que contiene una salida (por ejemplo, cualquiera de los segundos PCCS ejemplares descritos en el presente documento), donde el primer y segundo PCCS están en comunicación fluida entre sí, y en donde el sistema de fabricación está configurado de modo que el fluido se puede pasar a la entrada, a través del primer y segundo PCCS, y salir del sistema de fabricación a través de la salida; el PCCS1 está configurado para realizar la operación unitaria de captura de una proteína terapéutica recombinante, y el PCCS2 está configurado para realizar al menos las dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante, en donde la purificación se realiza usando una resina en PCCS2 que es diferente de la resina usada en PCCS2 para realizar el pulido; donde los dos o más subsistemas están configurados de modo que estén cada uno en comunicación fluida con un único depósito que contiene un fluido (por ejemplo, un biorreactor), y el fluido del único depósito pasa a la entrada de los dos o más subsistemas.
[0194] Cada uno de los subsistemas puede proporcionar la producción continua y eficiente en el tiempo de una sustancia farmacéutica terapéutica a partir de un medio de cultivo líquido. Por ejemplo, el tiempo transcurrido para cada subsistema entre la alimentación de un fluido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido) que contiene una proteína terapéutica en el primer PCCS (del subsistema) y la elución de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica (que contiene la proteína terapéutica) desde la salida del segundo PCCS (del subsistema) puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 48 horas, inclusive, por ejemplo, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 28 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 26 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 24 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 22 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 20 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 16 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 20 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 16 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 10 horas y 20 horas, entre aproximadamente 10 horas y 18 horas, entre aproximadamente 10 horas y 16 horas, entre aproximadamente 10 horas y 14 horas, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 25 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 35 horas, o entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 30 horas, inclusive. En otros ejemplos, para cada subsistema, el tiempo transcurrido entre la alimentación del fluido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido) que contiene una proteína terapéutica en el primer PCCS (del subsistema) y la elución de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica (que contiene la proteína terapéutica) desde la salida del segundo PCCS (del subsistema) es, por ejemplo, mayor de aproximadamente 4 horas y es menor de aproximadamente 40 horas, inclusive, por ejemplo, mayor de aproximadamente 4 horas y menor de aproximadamente 39 horas, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 37 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 5 horas, o aproximadamente 4,5 horas, inclusive.
[0196] Algún subsistema o algunos subsistemas de sistemas ejemplares no incluyen un tanque de ruptura. Otros incluyen un máximo de 1, 2, 3, 4 o 5 tanques de ruptura en todo el subsistema. Cualquiera del subsistema o de los subsistemas puede incluir un máximo de 1, 2, 3, 4 o 5 tanques de ruptura en todo el subsistema, donde cada tanque de ruptura solo contiene una proteína terapéutica durante un periodo de tiempo total de, por ejemplo, entre aproximadamente 5 minutos y menos de aproximadamente 6 horas, inclusive, por ejemplo, entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 1 hora, o aproximadamente 30 minutos, inclusive. El o los tanques de ruptura descritos en la presente pueden tener una capacidad que está, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente 300 ml, inclusive, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente 280 ml, aproximadamente 260 ml, aproximadamente 240 ml, aproximadamente 220 ml, aproximadamente 200 ml, aproximadamente 180 ml, aproximadamente 160 ml, aproximadamente 140 ml, aproximadamente 120 ml, aproximadamente 100 ml, aproximadamente 80 ml, aproximadamente 60 ml, aproximadamente 40 ml, aproximadamente 20 ml o aproximadamente 10 ml, inclusive. Cualquier tanque o tanques de ruptura dispuestos en el subsistema de modo que el fluido entre en el tanque o los tanques de ruptura antes de entrar en el PCCS1 (del subsistema) puede tener una capacidad que está, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente el 100 %, inclusive, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 5 %, inclusive, del volumen de carga de la primera columna del primer PCCS (del subsistema). Cualquier tanque o tanques de ruptura dispuestos en el subsistema de modo que el fluido entre en el tanque o los tanques de ruptura antes de entrar en el PCCS2 (en cualquiera del subsistema o de los subsistemas) (y después de que el fluido salga del PCCS1 del subsistema) puede tener una capacidad que es, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente el 100 %, inclusive, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 5 %, inclusive, del volumen de carga de la primera columna del segundo PCCS (del subsistema).
[0198] Cualquier combinación de las características (por ejemplo, tipo y número de columnas cromatográficas, tipo y número de membranas cromatográficas, volumen, tamaño, resina y operación u operaciones unitarias, caudales, bombas, ajustes de tampón en línea, detectores UV, uno o más filtros y mecanismos de cambio de columna) del primer PCCS y del segundo sistema de PCCS descritos anteriormente pueden usarse en el primer PCCS y el segundo PCCS en los dos o más subsistemas. Por ejemplo, el primer PCCS y el segundo PCCS en los dos o más subsistemas pueden ser sustancialmente iguales. En otros ejemplos, los dos o más subsistemas son sustancialmente los mismos que se describen en los sistemas descritos en los Ejemplos.
[0200] Patines
[0202] Cualquiera de los sistemas de fabricación biológica descritos en el presente documento se puede disponer sobre un patín. Por ejemplo, un sistema que incluye al menos un biorreactor, un primer PCCS y un segundo PCCS se puede disponer sobre un solo patín. En otros ejemplos de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el primer PCCS se puede disponer sobre un primer patín y el segundo PCCS se puede disponer sobre un segundo patín. Los ejemplos adicionales de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento incluyen un primer PCCS y un segundo PCCS dispuestos sobre un solo patín, o todo el sistema dispuesto sobre un solo patín.
[0204] Algunos ejemplos de los sistemas de fabricación biológica descritos en el presente documento incluyen dos o más subsistemas que incluyen cada uno: (i) un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS1) que contiene una entrada (por ejemplo, cualquiera de los primeros PCCS ejemplares descritos en el presente documento); y (ii) un segundo PCCS que contiene una salida (por ejemplo, cualquiera de los segundos PCCS ejemplares descritos en el presente documento), donde el primer y segundo PCCS están en comunicación fluida entre sí, y en donde el sistema de fabricación está configurado de modo que el fluido se puede pasar a la entrada, a través del primer y segundo PCCS, y salir del sistema de fabricación a través de la salida; donde el PCCS1 está configurado para realizar la operación unitaria de captura de una proteína terapéutica recombinante, y el PCCS2 está configurado para realizar al menos las dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante, en donde la purificación se realiza usando una resina en PCCS2 que es diferente de la resina usada en PCCS2 para realizar el pulido; donde los dos o más subsistemas están configurados de modo que estén cada uno en comunicación fluida con un único depósito que contiene un fluido (por ejemplo, un biorreactor), y el fluido del único depósito pasa a la entrada de los dos o más subsistemas. En dichos sistemas, todo el sistema se puede disponer sobre un patín; el depósito y el uno o más subsistemas pueden estar sobre un solo patín; cada uno de los dos o más subsistemas está dispuesto cada uno sobre su propio patín; o los dos o más subsistemas se pueden disponer sobre un solo patín. En cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, un depósito (por ejemplo, una bolsa de plástico), un tanque de ruptura (por ejemplo, cualquiera de los tanques de ruptura descritos en la presente) o un biorreactor que contiene un medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante se pueden disponer sobre su propio patín.
[0206] Los ejemplos no limitativos de patines incluyen dos o más ruedas, un rodillo, un trineo o un esquí, así como una o más estructuras que permiten el movimiento. Como aprecian los expertos en la técnica, los patines pueden estar compuestos de cualquier material sólido (por ejemplo, madera, metal o plástico). Se pueden obtener patines adecuados de Wunderlich-Malec (Minnetonka, MN) y Renfrow Brothers (Spartenburg, SC). En sistemas que utilizan más de un patín, los patines pueden diseñarse para encajar juntos (por ejemplo, encajar juntos a través de un pestillo, llave de giro, tornillo o abrazadera).
[0208] Procesos integrados y continuos para la fabricación de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica
[0209] En el presente documento se proporcionan procesos integrados y continuos para fabricar una sustancia farmacéutica proteica terapéutica. Estos procesos incluyen proporcionar un medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante que está sustancialmente libre de células, donde el medio de cultivo líquido se alimenta en un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS1); capturar la proteína terapéutica recombinante en el medio de cultivo líquido usando el PCCS 1, donde el eluido del PCCS 1 que contiene la proteína terapéutica recombinante se alimenta continuamente en un segundo sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS2); y realizar al menos dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante usando el PCCS2, en donde la purificación se realiza usando una resina que es diferente de la resina usada para realizar el pulido, y donde el eluido del PCCS2 es una sustancia farmacéutica proteica terapéutica; y el proceso se integra y se ejecuta continuamente desde el medio de cultivo líquido hasta el eluido del PCCS2 que es la sustancia farmacéutica proteica terapéutica.
[0211] Los procesos descritos en el presente documento proporcionan una producción continua y eficiente en el tiempo de una sustancia farmacéutica terapéutica a partir de un medio de cultivo líquido. Por ejemplo, el tiempo transcurrido entre la alimentación de un fluido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido) que contiene una proteína terapéutica en el primer PCCS y la elución de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica (que contiene la proteína terapéutica) desde el segundo PCCS puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 48 horas, inclusive, por ejemplo, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 28 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 26 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 24 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 22 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 20 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 16 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 20 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 16 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 10 horas y 12 horas, entre aproximadamente 10 horas y 20 horas, entre aproximadamente 10 horas y 18 horas, entre aproximadamente 10 horas y 16 horas, entre aproximadamente 10 horas y 14 horas, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 25 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 35 horas, o entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 30 horas, inclusive. En otros ejemplos, el tiempo transcurrido entre la alimentación del fluido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido) que contiene una proteína terapéutica en el PCCS1 y la elución de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica (que contiene la proteína terapéutica) desde el PCCS2 es, por ejemplo, mayor de aproximadamente 4 horas y es menor de aproximadamente 40 horas, inclusive, por ejemplo, mayor de aproximadamente 4 horas y menor de aproximadamente 39 horas, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 37 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 5 horas, o aproximadamente 4,5 horas, inclusive.
[0212] Algunos procesos ejemplares no utilizan una etapa de retención (por ejemplo, no usan un depósito (por ejemplo, un tanque de ruptura) en todo el proceso). Otros pueden usar un máximo de 1, 2, 3, 4 o 5 depósitos (por ejemplo, tanque o tanques de ruptura) en todo el proceso. Cualquiera de los procesos descritos en el presente documento puede utilizar un máximo de 1, 2, 3, 4 o 5 depósitos (por ejemplo, tanque o tanques de ruptura) en todo el proceso, donde cada tanque de ruptura solo contiene una proteína terapéutica durante un periodo de tiempo total de, por ejemplo, entre aproximadamente 5 minutos y menos de aproximadamente 6 horas, inclusive, por ejemplo, entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 1 hora, o unos 30 minutos, inclusive. Cualquiera del o de los depósitos (por ejemplo, tanque o tanques de ruptura) usados en los procesos descritos en el presente documento puede tener una capacidad que está, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente 300 ml, inclusive, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente 280 ml, aproximadamente 260 ml, aproximadamente 240 ml, aproximadamente 220 ml, aproximadamente 200 ml, aproximadamente 180 ml, aproximadamente 160 ml, aproximadamente 140 ml, aproximadamente 120 ml, aproximadamente 100 ml, aproximadamente 80 ml, aproximadamente 60 ml, aproximadamente 40 ml, aproximadamente 20 ml o aproximadamente 10 ml (inclusive). Cualquier depósito(s) (por ejemplo, tanque(s) de ruptura) usado (en cualquiera de los procesos descritos en el presente documento) para contener fluido antes de que entre en el primer PCCS puede tener una capacidad que está, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente el 100 %, inclusive, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 5 %, inclusive, del volumen de carga de la primera columna del primer PCCS. Cualquiera de los depósitos (por ejemplo, tanque o tanques de ruptura) usados (en cualquiera de los procesos descritos en el presente documento) para contener el fluido antes de que entre en el segundo PCCS (y después de que el fluido salga del primer PCCS) pueden tener una capacidad que está, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente el 100 %, inclusive, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 5 %, inclusive, del volumen de carga de la primera columna del segundo PCCS.
[0214] Varios aspectos adicionales de estos procesos se describen en detalle a continuación y se pueden usar en cualquier combinación en los procesos proporcionados en el presente documento sin limitación. A continuación se describen aspectos ejemplares de los procesos proporcionados; sin embargo, un experto en la técnica apreciará que se pueden añadir etapas adicionales a los procesos descritos en el presente documento y se pueden usar otros materiales para realizar cualquiera de las etapas de los procesos descritos en el presente documento.
[0215] Medio de cultivo líquido
[0217] El medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante que está sustancialmente libre de células puede proceder de cualquier fuente. Por ejemplo, el medio de cultivo líquido se puede obtener a partir de un cultivo de células recombinantes (por ejemplo, un cultivo de células bacterianas, de levadura o de mamífero recombinante). El medio de cultivo líquido se puede obtener a partir de un cultivo semicontinuo de células (por ejemplo, células de mamífero) (por ejemplo, un biorreactor semicontinuo que contiene un cultivo de células de mamífero que secretan la proteína terapéutica recombinante) o un cultivo de células de perfusión (por ejemplo, células de mamífero) (por ejemplo, un biorreactor de perfusión que contiene un cultivo de células de mamífero que secretan la proteína terapéutica recombinante). El medio de cultivo líquido también puede ser un medio de cultivo líquido clarificado de un cultivo de células bacterianas o de levadura que secretan la proteína terapéutica recombinante.
[0219] El medio de cultivo líquido obtenido a partir de un cultivo de células recombinantes puede filtrarse o clarificarse para obtener un medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células y/o virus. En la técnica se conocen métodos para filtrar o clarificar un medio de cultivo líquido con el fin de extraer las células (por ejemplo, filtración de 0,2 µm y filtración usando un sistema de flujo tangencial alternativo (ATF<™>)). Las células recombinantes también se pueden extraer del medio de cultivo líquido usando centrifugación y extrayendo el sobrenadante que es medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células, o permitiendo que las células se depositen en el fondo de un recipiente por gravitación (por ejemplo, biorreactor) que contiene el medio de cultivo líquido, y extrayendo el medio de cultivo líquido (el medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células) que está distante de las células recombinantes depositadas.
[0221] El medio de cultivo líquido se puede obtener a partir de un cultivo de células recombinantes (por ejemplo, bacterias recombinantes, levaduras o células de mamífero) que producen cualquiera de las proteínas terapéuticas recombinantes descritas en el presente documento. Algunos ejemplos de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento pueden incluir además una etapa de cultivo de células recombinantes (por ejemplo, bacterias recombinantes, levadura o células de mamífero) que producen la proteína terapéutica recombinante.
[0222] El medio de cultivo líquido puede ser cualquiera de los tipos de medio de cultivo líquido descritos en el presente documento o conocidos en la técnica. Por ejemplo, el medio de cultivo líquido se puede seleccionar del grupo de: medio de cultivo líquido libre de componentes derivados de animal, medio de cultivo líquido libre de suero, medio de cultivo líquido que contiene suero, medio de cultivo líquido definido químicamente y medio de cultivo líquido libre de proteínas. En cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, un medio de cultivo líquido obtenido a partir de un cultivo puede diluirse mediante la adición de un segundo fluido (por ejemplo, un tampón) antes de que se alimente al primer PCCS.
[0224] El medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante que está sustancialmente libre de células se puede almacenar (por ejemplo, a una temperatura inferior a aproximadamente 15 °C (por ejemplo, inferior a aproximadamente 10 °C, inferior a aproximadamente 4 °C, inferior a aproximadamente 0 °C, inferior a aproximadamente -20 °C, inferior a aproximadamente -50 °C, inferior a aproximadamente -70 °C, o por inferior a aproximadamente -80 °C) durante al menos 1 día (por ejemplo, al menos aproximadamente 2 días, al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 10 días, al menos aproximadamente 15 días, al menos aproximadamente 20 días o al menos aproximadamente 30 días) antes de alimentar el medio de cultivo líquido al primer PCCS. Como alternativa, en algunos ejemplos, el medio de cultivo líquido se alimenta al primer PCCS directamente desde un biorreactor (por ejemplo, se alimenta al primer PCCS directamente desde el biorreactor después de una etapa de filtración o clarificación).
[0226] Proteínas terapéuticas recombinantes
[0228] Los ejemplos no limitativos de proteínas terapéuticas recombinantes que pueden producirse mediante los métodos proporcionados en el presente documento incluyen inmunoglobulinas (incluidas inmunoglobulinas de cadena ligera y pesada, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, cualquiera de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento), enzimas (por ejemplo, una galactosidasa (por ejemplo, una alfagalactosidasa), Myozyme o Cerezyme), proteínas (por ejemplo, eritropoyetina humana, factor de necrosis tumoral (TNF) o un interferón alfa o beta), o proteínas inmunogénicas o antigénicas o fragmentos de proteínas (por ejemplo, proteínas para su uso en una vacuna). La proteína terapéutica recombinante puede ser un polipéptido de unión a antígeno genomanipulado que contiene al menos un armazón de proteína recombinante multifuncional (véase, por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno recombinantes descritas en Gebauer et al., Current Opin. Chem. Biol.
[0229] 13:245-255, 2009; y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.º 2012/0164066). Los ejemplos no limitativos de proteínas terapéuticas recombinantes que son anticuerpos incluyen: panitumumab, omalizumab, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, alacizumab, alemtuzumab, alirocumab, altumomab, amatuximab, amatuximab, anatumomab, anrukinzumab, apolizumab, arcitumomab, atinumab, tocilizumab, basilizimab, bectumomab, belimumab, bevacizumab, besilesomab, bezlotoxumab, biciromab, canakinumab, certolizumab, cetuximab, cixutumumab, daclizumab, denosumab, densumab, eculizumab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, epratuzumab, ertumaxomab, etaracizumab, figitumumab, golimumab, ibritumomab tiuxetan, igovomab, imgatuzumab, infliximab, inolimomab, inotuzumab, labetuzumab, lebrikizumab, moxetumomab, natalizumab, obinutuzumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, tocilizumab, tositumomab, tralokinumab, tucotuzumab, trastuzumab, veltuzumab, zalutumumab y zatuximab. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de anticuerpos terapéuticos recombinantes que pueden producirse mediante los métodos descritos en el presente documento. Los ejemplos no limitativos adicionales de proteínas terapéuticas recombinantes que pueden producirse mediante los presentes métodos incluyen: alglucosidasa alfa, laronidasa, abatacept, galsulfasa, lutropina alfa, factor antihemofílico, agalsidasa beta, interferón beta-1a, darbepoyetina alfa, tenecteplasa, etanercept, factor de coagulación IX, hormona foliculoestimulante, interferón beta-1a, imiglucerasa, dornasa alfa, epoyetina alfa, insulina o análogos de insulina, mecasermina, factov VIII, factor VIIa, antitrombina III, proteína C, albúmina humana, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, interleucina-11, laronidasa, idursufasa, galsulfasa, inhibidor de la α-1-proteinasa, lactasa, adenosina desaminasa, activador del plasminógeno tisular, tirotropina alfa (por ejemplo, Thyrogen<®>) y alteplasa. Los ejemplos adicionales de proteínas recombinantes que pueden producirse mediante los presentes métodos incluyen α-glucosidasa ácida, alglucosidasa alfa (por ejemplo, Myozyme<®>y Lumizyme<®>), α-L-iduronidasa (por ejemplo, Aldurazyme<®>), iduronato sulfatasa, heparán N-sulfatasa, galactosa-6-sulfatasa, β-galactosidasa ácida, β-glucoronidasa, N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa, α-N-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, ceramidasa ácida lisosómica, esfingomielinasa ácida, β-glucosidasa (por ejemplo, Cerezyme<®>y Ceredase<®>), galactosilceramidasa, α-galactosidasa-A (por ejemplo, Fabrazyme<®>), β-galactosidasa ácida, β-galactosidasa, neuraminidasa, hexosaminidasa A y hexosaminidasa B.
[0231] Se puede recuperar una proteína recombinante soluble secretada del medio de cultivo líquido (por ejemplo, el primer y/o segundo medio de cultivo líquido) extrayendo o separando físicamente de otro modo el medio de cultivo líquido de las células (por ejemplo, células de mamífero). En la técnica se conoce una variedad de métodos diferentes para extraer medio de cultivo líquido de células (por ejemplo, células de mamífero), incluidos, por ejemplo, centrifugación, filtración, pipeteo y/o aspiración. La proteína recombinante secretada puede luego recuperarse y purificarse aún más del medio de cultivo líquido usando una variedad de técnicas bioquímicas que incluyen diversos tipos de cromatografía (por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de intercambio catiónico, o cromatografía de intercambio aniónico) y/o filtración (por ejemplo, filtración de corte de peso molecular).
[0233] Sistemas de cromatografía multicolumna
[0234] Los procesos descritos en el presente documento incluyen el uso de dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, o seis) sistemas de cromatografía multicolumna (PCCS). Un PCCS puede incluir dos o más columnas cromatográficas, dos o más membranas cromatográficas, o una combinación de al menos una columna cromatográfica y al menos una membrana cromatográfica. En ejemplos no limitativos, un PCCS (por ejemplo, el primer y/o segundo PCCS descritos en cualquiera de los procesos del presente documento) puede incluir cuatro columnas cromatográficas, tres columnas cromatográficas y una membrana cromatográfica, tres columnas cromatográficas, dos columnas cromatográficas, dos membranas cromatográficas y dos columnas cromatográficas y una membrana cromatográfica. Los expertos en la técnica pueden prever ejemplos adicionales de combinaciones de columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas para su uso en un PCCS (por ejemplo, un primer y/o segundo PCCS) sin limitación. Las columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas individuales presentes en un PCCS pueden ser idénticas (por ejemplo, tener la misma forma, volumen, resina, mecanismo de captura y operación unitaria), o pueden ser diferente (por ejemplo, tener una o más de una forma, volumen, resina, mecanismo de captura y operación unitaria diferentes). La columna o columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas individuales presentes en un PCCS (por ejemplo, el primer y/o segundo PCCS) pueden realizar la misma operación unitaria (por ejemplo, la operación unitaria de captura, purificación o pulido) u operaciones unitarias diferentes (por ejemplo, diferentes operaciones unitarias seleccionadas de, por ejemplo, el grupo de captura, purificación, pulido, inactivación de virus, ajuste de la concentración iónica y/o pH de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante y filtración).
[0236] La una o más columnas cromatográficas que pueden estar presentes en un PCCS (por ejemplo, presentes en el primer y/o segundo PCCS) pueden tener un volumen de resina de, por ejemplo, al menos aproximadamente 2 ml, al menos aproximadamente 5 ml, al menos aproximadamente 10 ml, al menos aproximadamente 15 ml, al menos aproximadamente 20 ml, al menos aproximadamente 25 ml, al menos aproximadamente 30 ml, al menos aproximadamente 35 ml, al menos aproximadamente 40 ml, al menos aproximadamente 45 ml, al menos aproximadamente 50 ml, al menos aproximadamente 55 ml, al menos aproximadamente 60 ml, al menos aproximadamente 65 ml, al menos aproximadamente 70 ml, al menos aproximadamente 75 ml, al menos aproximadamente 80 ml, al menos aproximadamente 85 ml, al menos aproximadamente 90 ml, al menos aproximadamente 95 ml o al menos aproximadamente 100 ml. La una o más columnas cromatográficas que pueden estar presentes en un PCCS (por ejemplo, presentes en el primer y/o segundo PCCS) pueden tener un volumen de resina de entre aproximadamente 2 ml a aproximadamente 100 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 90 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 80 ml. Entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 70 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 60 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 50 ml, entre aproximadamente 5 ml y aproximadamente 50 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 45 ml, entre aproximadamente 5 ml y aproximadamente 45 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 40 ml, entre aproximadamente 5 ml y aproximadamente 40 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 35 ml, entre aproximadamente 5 ml y aproximadamente 35 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 30 ml, entre aproximadamente 5 ml y aproximadamente 30 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 25 ml, entre aproximadamente 5 ml y aproximadamente 25 ml, entre aproximadamente 15 ml y aproximadamente 60 ml, entre aproximadamente 10 ml y aproximadamente 60 ml, entre aproximadamente 10 ml y aproximadamente 50 ml, y entre aproximadamente 15 ml y aproximadamente 50 ml. La una o más columnas cromatográficas en un PCCS (por ejemplo, el primer y/o segundo PCCS) usado en cualquiera de los procesos descritos en la presente pueden tener sustancialmente el mismo volumen de resina o pueden tener diferentes volúmenes de resina. El caudal usado para la una o más columnas cromatográficas en un PCCS (por ejemplo, el primer y/o segundo PCCS) puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 25 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 10 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml minuto y aproximadamente 14 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 25,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto).
[0238] La una o más columnas cromatográficas en un PCCS (por ejemplo, el primer y/o segundo PCCS) pueden tener sustancialmente la misma forma o pueden tener formas sustancialmente diferentes. Por ejemplo, la una o más columnas cromatográficas en un PCCS (por ejemplo, en el primer y/o segundo PCCS) pueden tener sustancialmente la forma de un cilindro circular o pueden tener sustancialmente la misma forma de un cilindro ovalado.
[0240] La una o más membranas cromatográficas que pueden estar presentes en un PCCS (por ejemplo, presentes en el primer y/o segundo PCCS) pueden tener un volumen de lecho de, por ejemplo, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 500 ml (por ejemplo, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 475 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 450 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 425 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 400 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 375 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 350 ml, entre aproximadamente 1 ml a aproximadamente 325 ml, entre aproximadamente 1 ml a aproximadamente 300 ml, entre aproximadamente 1 ml a aproximadamente 275 ml, entre aproximadamente 1 ml a aproximadamente 250 ml, entre aproximadamente 1 ml a aproximadamente 225 ml, entre aproximadamente 1 ml a aproximadamente 200 ml, entre aproximadamente 1 ml a aproximadamente 175 ml, entre aproximadamente 1 ml a aproximadamente 150 ml, entre aproximadamente 1 ml a aproximadamente 125 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 100 ml, entre aproximadamente 2 ml a aproximadamente 100 ml, entre aproximadamente 5 ml a aproximadamente 100 ml, entre aproximadamente 1 ml a aproximadamente 80 ml, entre aproximadamente 2 ml a aproximadamente 80 ml, entre aproximadamente 5 ml a aproximadamente 80 ml, entre aproximadamente 1 ml a aproximadamente 60 ml, entre aproximadamente 2 ml a aproximadamente 60 ml, entre aproximadamente 5 ml a aproximadamente 60 ml, entre aproximadamente 1 ml a aproximadamente 40 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 40 ml, entre aproximadamente 5 ml y aproximadamente 40 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 30 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 30 ml, entre aproximadamente 5 ml y aproximadamente 30 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 25 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 25 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 20 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 20 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 15 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 15 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 10 ml, o entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 10 ml.
[0242] Pueden emplearse uno o más (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés o veinticuatro) tipos diferentes de tampón durante el uso de los dos o más PCCS en cualquiera de los procesos descritos en el presente documento. Como se conoce en la técnica, el uno o más tipos de tampón usados en los dos o más PCCS usados en los procesos descritos en el presente documento dependerán de la resina presente en la columna o columnas cromatográficas y/o la membrana o membranas cromatográficas de los dos o más PCCS (por ejemplo, el primer y segundo PCCS), la proteína terapéutica recombinante y la operación unitaria (por ejemplo, cualquiera de las operaciones unitarias ejemplares descritas en el presente documento) realizada por la columna o columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas específicas de los dos o más PCCS. El volumen y el tipo de tampón empleados durante el uso de los dos o más PCCS en cualquiera de los procesos descritos en el presente documento también pueden ser determinados por un experto en la técnica (por ejemplo, analizado con más detalle a continuación). Por ejemplo, el volumen y tipo o tipos de tampón empleados durante el uso de los dos o más PCCS en cualquiera de los procesos descritos en el presente documento se pueden elegir con el fin de optimizar uno o más de los siguientes en el producto farmacéutico proteico recombinante: el rendimiento global de la proteína terapéutica recombinante, la actividad de la proteína terapéutica recombinante, el nivel de pureza de la proteína terapéutica recombinante y la eliminación de contaminantes biológicos de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante (por ejemplo, ausencia de virus activos, micobacterias, levaduras, bacterias o células de mamífero).
[0244] Un PCCS puede incluir, por ejemplo, dos o más columnas cromatográficas (por ejemplo, tres columnas o cuatro columnas) que se cambian con el fin de permitir la elución continua de la proteína terapéutica recombinante de las dos o más columnas cromatográficas. Un PCCS puede incluir dos o más columnas cromatográficas, dos o más membranas cromatográficas, o al menos una columna cromatográfica y al menos una membrana cromatográfica. Una operación de columna consiste generalmente en las etapas de carga, lavado, elución y regeneración. En PCCS, se usan múltiples columnas para ejecutar las mismas etapas discreta y continuamente de una manera cíclica. Dado que las columnas funcionan en serie, el flujo continuo y el lavado de una columna es capturado por otra columna. Esta característica única del PCCS permite la carga de la resina cerca de su capacidad de unión estática en lugar de la capacidad de unión dinámica, como es típico durante la cromatografía en modo discontinuo. En la FIG. 3 se muestra un ejemplo de la técnica de cambio de tres columnas usada en un PCCS que contiene tres columnas. Un ciclo se define como operaciones de tres columnas completas que dan como resultado un conjunto de elución de cada una de las tres columnas usadas en la técnica de cambio de columna. Una vez completadas todas las etapas del ciclo, se reinicia el ciclo. Como resultado del ciclo continuo y la elución, el fluido que entra en un PCCS se procesa continuamente y el eluido que contiene proteína terapéutica recombinante se produce continuamente.
[0246] Para avanzar de una etapa a otra en un ciclo de PCCS, tal como el ciclo ejemplar mostrado en la FIG.3, se emplea una estrategia de cambio de columna. El método de cambio de columna emplea dos operaciones de cambio automatizadas por columna en las tres columnas en el sistema PCCS ejemplar mostrado en la FIG.3, el primero de los cuales está relacionado con el avance inicial del producto, mientras que el segundo coincide con la saturación de la columna. La determinación de cuándo deben tener lugar las operaciones de cambio de columna se determina monitorizando la concentración de proteína terapéutica recombinante (por ejemplo, monitorización realizada mediante monitorización UV) en el eluido de cada columna cromatográfica presente en un PCCS. Por ejemplo, el cambio de columna puede determinarse mediante cualquier herramienta PAT capaz de medir en línea la concentración del producto con control de retroalimentación. La herramienta PAT es capaz de medir en línea en tiempo real la concentración del producto con control de retroalimentación.
[0248] La FIG. 4 representa un ejemplo de cambio de columna en un PCCS ejemplar basado en la diferencia de absorbancia UV (-UV) entre la entrada de alimentación y la salida de la columna. Por ejemplo, durante la carga de la columna (etapa 1; FIG. 3), el sistema de control de PCC determina el nivel basal de impurezas cuando la absorbancia se estabiliza. A medida que el producto se rompe (etapa 2; FIG.3), hay un aumento en la señal UV de salida por encima de la línea basal de impureza. En el punto en el que -UV ha alcanzado un umbral predeterminado (por ejemplo, un 3 % de avance del producto), el flujo continuo desde la columna 1 se dirige a la columna 2 en lugar de a desechos (t1; FIG.4). Cuando la columna 1 está casi saturada con el producto y el -UV ha alcanzado un valor predeterminado (t2; FIG. 4), la alimentación se cambia a la columna 2. La estrategia de cambio de columna usada en el PCCS permite la carga uniforme de las columnas, independientemente de la concentración del producto de alimentación y la capacidad. Se pueden diseñar cambios similares de las columnas basándose en el nivel de proteína recombinante detectada en el eluido de cada columna. Como se conoce en la técnica, los cambios de columna también se pueden diseñar basándose en el tiempo o la cantidad de fluido (por ejemplo, tampón) que pasa a través de la una o más columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas en el primer o segundo PCCS.
[0250] En los PCCS, el tiempo de residencia (RT) de la proteína terapéutica recombinante en cada columna cromatográfica y/o membrana cromatográfica presente en el PCCS puede disminuirse sin aumentar el tamaño de la columna/membrana debido a que el avance desde la primera columna/membrana puede capturarse en otra columna/membrana en el PCCS. Se puede diseñar un sistema de proceso continuo para procesar medio de cultivo líquido a cualquier velocidad de perfusión (D) variando el volumen de columna/membrana (V) y RT usando la ecuación de: V = D * RT.
[0252] La una o más operaciones unitarias que pueden realizarse por los al menos dos PCCS (por ejemplo, el primer y/o segundo PCCS) usados en los procesos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, captura de la proteína terapéutica recombinante, inactivación de virus presentes en un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante, purificación de la proteína terapéutica recombinante, pulido de la proteína terapéutica recombinante, mantenimiento de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante (por ejemplo, usando cualquiera del tanque o de los tanques de ruptura ejemplares descritos en el presente documento), filtrado o eliminación de material particulado y/o células de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante, y ajuste de la concentración iónica y/o el pH de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante.
[0254] La operación unitaria de captura se puede realizar usando uno o más PCCS (por ejemplo, un primer y/o segundo PCCS) que incluye al menos una columna cromatográfica y/o resina cromatográfica, por ejemplo, que utiliza un mecanismo de captura. Los ejemplos no limitativos de mecanismos de captura incluyen un mecanismo de captura de unión a proteína A, un mecanismo de captura de unión a anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un mecanismo de captura de unión a sustrato, un mecanismo de captura de unión a aptámero, un mecanismo de captura de unión a etiqueta (por ejemplo, mecanismo de captura basado en una etiqueta de poli-His) y un mecanismo de captura de unión a cofactor. La captura también se puede realizar usando una resina que se puede usar para realizar cromatografía de intercambio catiónico o de intercambio aniónico, o cromatografía de tamices moleculares. En el presente documento se describen resinas no limitativas que pueden usarse para capturar una proteína terapéutica recombinante. En la técnica se conocen ejemplos adicionales de resinas que pueden usarse para capturar una proteína terapéutica recombinante.
[0256] La operación unitaria de inactivación de virus presentes en un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante puede realizarse usando uno o más PCCS (por ejemplo, un primer y/o segundo PCCS) que incluyen, por ejemplo, una columna cromatográfica, una membrana cromatográfica, o un tanque de contención que es capaz de incubar un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante a un pH de entre aproximadamente 3,0 y 5,0 (por ejemplo, entre aproximadamente 3,5 y aproximadamente 4,5, entre aproximadamente 3,5 y aproximadamente 4,25, entre aproximadamente 3,5 y aproximadamente 4,0, entre aproximadamente 3,5 y aproximadamente 3,8, o aproximadamente 3,75) durante un periodo de al menos 30 minutos (por ejemplo, un periodo de entre aproximadamente 30 minutos y 1,5 horas, un periodo de entre aproximadamente 30 minutos y 1,25 horas, un periodo de entre aproximadamente 0,75 horas y 1,25 horas o un periodo de aproximadamente 1 hora).
[0258] La operación unitaria de purificación de una proteína recombinante puede realizarse usando uno o más PCCS (por ejemplo, un primer y/o segundo PCCS) que incluyen, por ejemplo, una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que contiene una resina, por ejemplo, que utiliza un sistema de captura. Los ejemplos no limitativos de mecanismos de captura incluyen un mecanismo de captura de unión a proteína A, un mecanismo de captura de unión a anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un mecanismo de captura de unión a sustrato, un mecanismo de captura de unión a aptámero, un mecanismo de captura de unión a etiqueta (por ejemplo, mecanismo de captura basado en una etiqueta de poli-His) y un mecanismo de captura de unión a cofactor. La purificación también se puede realizar usando una resina que se puede usar para realizar cromatografía de intercambio catiónico o de intercambio aniónico, o cromatografía de tamices moleculares. En el presente documento se describen resinas no limitativas que pueden usarse para purificar una proteína terapéutica recombinante. En la técnica se conocen ejemplos adicionales de resinas que pueden usarse para purificar una proteína terapéutica recombinante.
[0260] La operación unitaria de pulido de una proteína recombinante puede realizarse usando uno o más PCCS (por ejemplo, un primer y/o segundo PCCS) que incluyen, por ejemplo, una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que contiene una resina, por ejemplo, que puede usarse para realizar intercambio catiónico, intercambio aniónico o cromatografía de tamices moleculares. En el presente documento se describen resinas no limitativas que pueden usarse para pulir una proteína terapéutica recombinante. En la técnica se conocen ejemplos adicionales de resinas que pueden usarse para pulir una proteína terapéutica recombinante.
[0262] La operación unitaria de contener un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante se puede realizar usando un PCCS (por ejemplo, un primer y/o segundo PCCS) que incluye al menos un depósito (por ejemplo, un tanque de ruptura) o un máximo de 1, 2, 3, 4 o 5 depósitos (por ejemplo, tanque o tanques de ruptura) en el primer y segundo PCCS combinados. Por ejemplo, el depósito o los depósitos (por ejemplo, tanque o tanques de ruptura) que se pueden usar para lograr esta operación unitaria pueden tener cada uno un volumen de entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 1 l (por ejemplo, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 800 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 600 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 500 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 400 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 350 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 300 ml, entre aproximadamente 10 ml y aproximadamente 250 ml, entre aproximadamente 10 ml y aproximadamente 200 ml, entre aproximadamente 10 ml y aproximadamente 150 ml, y entre aproximadamente 10 ml y aproximadamente 100 ml). El depósito o los depósitos (por ejemplo, tanque o tanques de ruptura) usados en los procesos descritos en el presente documento puede tener una capacidad que está, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente 300 ml, inclusive, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente 280 ml, aproximadamente 260 ml, aproximadamente 240 ml, aproximadamente 220 ml, aproximadamente 200 ml, aproximadamente 180 ml, aproximadamente 160 ml, aproximadamente 140 ml, aproximadamente 120 ml, aproximadamente 100 ml, aproximadamente 80 ml, aproximadamente 60 ml, aproximadamente 40 ml, aproximadamente 20 ml o aproximadamente 10 ml, inclusive. Cualquiera del depósito o de los depósitos (por ejemplo, tanque o tanques de ruptura) usados (en cualquiera de los procesos descritos en el presente documento) para contener el fluido antes de que entre en el primer PCCS puede tener una capacidad que está, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente el 100 %, inclusive, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 5 %, inclusive, del volumen de carga de la primera columna del primer PCCS. Cualquiera del depósito o de los depósitos (por ejemplo, tanque o tanques de ruptura) usados para contener un fluido antes de que entre en el segundo PCCS (y después de que el fluido salga del primer PCCS) pueden tener una capacidad que está, por ejemplo, entre 1 ml y aproximadamente el 100 %, inclusive, por ejemplo, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 5 %, inclusive, del volumen de carga de la primera columna del segundo PCCS.
[0264] El depósito o los depósitos (por ejemplo, tanque o tanques de ruptura) pueden contener cada uno el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante durante al menos 10 minutos (por ejemplo, al menos 20 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 4 horas o al menos 6 horas). En otros ejemplos, el depósito o los depósitos (por ejemplo, tanque o tanques de ruptura) solo contienen una proteína terapéutica durante un periodo de tiempo total de, por ejemplo, entre aproximadamente 5 minutos y menos de aproximadamente 6 horas, inclusive, por ejemplo, entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 1 hora, o aproximadamente 30 minutos, inclusive. El depósito o los depósitos (por ejemplo, tanque o tanques de ruptura) se pueden usar tanto para contener como para refrigerar (por ejemplo, a una temperatura de menos de 25 °C, menos de 15 °C o menos de 10 °C) el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante. El depósito puede tener cualquier forma, incluyendo un cilindro circular, un cilindro ovalado o una bolsa sellada y no permeable aproximadamente rectangular.
[0266] Las operaciones unitarias de filtración de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante pueden realizarse usando un PCCS (por ejemplo, el primer y/o segundo PCCS) que incluye, por ejemplo, un filtro, o una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que contiene una resina de tamiz molecular. Como se conoce en la técnica, una amplia variedad de filtros submicrónicos (por ejemplo, un filtro con un tamaño de poro de menos de 1 µm, menos de 0,5 µm, menos de 0,3 µm, aproximadamente 0,2 µm, menos de 0,2 µm, menos de 100 nm, menos de 80 nm, menos de 60 nm, menos de 40 nm, menos de 20 nm, o menos de 10 nm) están disponibles en la técnica que son capaces de eliminar cualquier material y/o células precipitadas (por ejemplo, proteína precipitada y desplegada; proteínas de células hospedadoras precipitadas, no deseadas; lípidos precipitados; bacterias; células de levadura; células fúngicas; micobacterias; y/o células de mamífero). Se sabe que los filtros que tienen un tamaño de poro de aproximadamente 0,2 µm o menos de 0,2 µm eliminan eficazmente las bacterias del fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante. Como se conoce en la técnica, también se puede usar una columna cromatográfica o una membrana cromatográfica que contiene una resina de tamiz molecular en un PCCS (por ejemplo, el primer y/o segundo PCCS) para realizar la operación unitaria de filtración de un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante.
[0268] Las operaciones unitarias de ajuste de la concentración iónica y/o el pH de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante pueden realizarse usando un PCCS (por ejemplo, el primer y/o segundo PCCS) que incluye y utiliza un depósito de ajuste de tampón (por ejemplo, un depósito de ajuste de tampón en línea) que añade una nueva disolución de tampón a un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante (por ejemplo, entre columnas dentro de un único PCCS, o después de la última columna en un penúltimo PCCS (por ejemplo, el primer PCCS) y antes de que el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante se alimente en la primera columna del siguiente PCCS (por ejemplo, el segundo PCCS). Como se puede apreciar en la técnica, el depósito de ajuste de tampón en línea puede tener cualquier tamaño (por ejemplo, mayor de 100 ml) y puede contener cualquier disolución tamponada (por ejemplo, una disolución tamponada que tiene uno o más de: un pH aumentado o disminuido en comparación con el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante, una concentración iónica aumentada o reducida (por ejemplo, sal) en comparación con el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante, y/o una concentración aumentada o reducida de un agente que compite con la proteína terapéutica recombinante por la unión a resina presente en al menos una columna cromatográfica o al menos una membrana cromatográfica en un PCCS (por ejemplo, el primer o el segundo PCCS)).
[0270] El primer y/o segundo PCCS pueden realizar dos o más operaciones unitarias. Por ejemplo, el primer y/o segundo PCCS pueden realizar cada uno al menos las siguientes operaciones unitarias: captura de la proteína terapéutica recombinante e inactivación de virus presentes en el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante; captura de la proteína terapéutica recombinante, inactivación de virus presentes en el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante y ajuste de la concentración iónica y/o el pH de un líquido que contiene la proteína terapéutica recombinante; purificación de la proteína terapéutica recombinante y pulido de la proteína terapéutica recombinante; purificación de la proteína terapéutica recombinante, pulido de la proteína terapéutica recombinante y filtración de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante o eliminación de precipitados y/o materia particular de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante; y purificación de la proteína terapéutica recombinante, pulido de la proteína terapéutica recombinante, filtración de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante o eliminación de precipitados y/o materia particular de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante, y ajuste de la concentración iónica y/o el pH de un líquido que contiene la proteína terapéutica recombinante.
[0272] Captura de la proteína terapéutica recombinante
[0274] Los presentes procesos incluyen una etapa de captura de la proteína terapéutica recombinante usando un primer PCCS. Como se puede apreciar en la técnica, el medio de cultivo líquido que contiene la proteína terapéutica recombinante se puede alimentar continuamente sobre el primer PCCS usando una variedad de medios diferentes. Por ejemplo, el medio de cultivo líquido se puede bombear activamente en el primer PCCS o el medio de cultivo líquido se puede alimentar en el primer PCCS usando fuerza gravitacional. El medio de cultivo líquido se puede almacenar en un depósito (por ejemplo, un tanque de contención) antes de que se introduzca en el primer PCCS, o el medio de cultivo líquido se puede bombear activamente desde un biorreactor que contiene un cultivo de células (por ejemplo, células de mamífero que secretan la proteína terapéutica recombinante en el medio de cultivo) en el primer PCCS.
[0276] El medio de cultivo líquido se puede alimentar (cargar) en el primer PCCS a un caudal de entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 25 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 10 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 14 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 25,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto). El medio de cultivo líquido que contiene la proteína terapéutica recombinante puede proceder de cualquiera de las fuentes ejemplares descritas en el presente documento o conocidas en la técnica
[0278] Algunos ejemplos incluyen además la etapa opcional de filtrar el medio de cultivo líquido antes de que se alimente sobre el primer PCCS. Cualquiera de los medios ejemplares de filtración de un medio de cultivo líquido o un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante descrita en el presente documento, o cualquier medio de filtración conocido en la técnica, puede usarse para filtrar el medio de cultivo líquido que contiene la proteína terapéutica recombinante antes de que se alimente en el primer PCCS.
[0280] En los métodos descritos en el presente documento, la captura de la proteína terapéutica recombinante a partir del medio de cultivo líquido se realiza usando un primer PCCS. Como se puede apreciar en la técnica, para lograr la captura de la proteína terapéutica recombinante, al menos una columna cromatográfica o al menos una membrana cromatográfica en el primer PCCS debe contener una resina que utilice un mecanismo de captura (por ejemplo, cualquiera de los mecanismos de captura ejemplares descritos en el presente documento), o contiene una resina capaz de realizar intercambio catiónico, intercambio aniónico o cromatografía de tamices moleculares. Por ejemplo, si la proteína terapéutica recombinante es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, el sistema de captura puede ser un mecanismo de captura de unión a proteína A o un mecanismo de captura de unión a antígeno (donde el antígeno de captura es reconocido específicamente por el anticuerpo terapéutico recombinante o fragmento de anticuerpo). Si la proteína terapéutica recombinante es una enzima, el mecanismo de captura puede usar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la enzima para capturar la enzima terapéutica recombinante, un sustrato de la enzima para capturar la enzima terapéutica recombinante, un cofactor de la enzima para capturar la enzima terapéutica recombinante o, si la enzima terapéutica recombinante contiene una etiqueta, una proteína, quelato metálico o anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) que se une específicamente a la etiqueta presente en la enzima terapéutica recombinante. En el presente documento se describen resinas no limitativas que pueden usarse para capturar una proteína terapéutica recombinante y en la técnica se conocen resinas adicionales que pueden usarse para capturar una proteína terapéutica recombinante. Un ejemplo no limitativo de resina que utiliza un mecanismo de captura de unión a proteína A es la resina MabSelect SuRe (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
[0282] En el presente documento se describen tamaños y formas no limitativos ejemplares de la columna o columnas cromatográficas o membrana o membranas cromatográficas presentes en el primer PCCS que se pueden usar para capturar la proteína terapéutica recombinante. El medio de cultivo líquido alimentado (cargado) en el primer PCCS puede contener, por ejemplo, entre aproximadamente 0,05 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml de proteína terapéutica recombinante (por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 90 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 80 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 70 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 60 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 40 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 30 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 20 mg/ml, entre 0,5 mg/ml y aproximadamente 20 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 15 mg/ml, entre aproximadamente 0,5 mg/ml y aproximadamente 15 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml, o entre aproximadamente 0,5 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml de proteína terapéutica recombinante). El tiempo medio requerido para que la proteína terapéutica recombinante se una a la resina usada para realizar la operación unitaria de captura puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 5 segundos y aproximadamente 10 minutos (por ejemplo, entre aproximadamente 10 segundos y aproximadamente 8 minutos, entre aproximadamente 10 segundos y aproximadamente 7 minutos, entre aproximadamente 10 segundos y aproximadamente 6 minutos, entre aproximadamente 10 segundos y aproximadamente 5 minutos, entre aproximadamente 30 segundos y aproximadamente 5 minutos, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 5 minutos, entre aproximadamente 10 segundos y aproximadamente 4 minutos, entre aproximadamente 30 segundos y aproximadamente 4 minutos, o entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 4 minutos).
[0284] Como se puede apreciar en la técnica, para capturar la proteína terapéutica recombinante usando la columna o columnas cromatográficas o la membrana o membranas cromatográficas presentes en el primer PCCS, se deben realizar las etapas cromatográficas secuenciales de cargar, lavar, eluir y regenerar la columna o columnas cromatográficas o membrana o membranas cromatográficas presentes en el primer PCCS. Cualquiera de los caudales, volúmenes de tampón y/o duraciones de tiempo ejemplares asignados para cada etapa cromatográfica secuencial descrita en el presente documento se puede usar en la una o más de estas etapas cromatográficas secuenciales diferentes (por ejemplo, una o más de las etapas cromatográficas secuenciales de cargar, lavar, eluir y regenerar la columna o columnas cromatográficas o membrana o membranas cromatográficas presentes en el primer PCCS que se usan para capturar la proteína terapéutica recombinante). A continuación se proporcionan caudales, volúmenes de tampón y/o duraciones de tiempo no limitativos asignados para cada etapa cromatográfica secuencial que se puede usar para capturar la columna o columnas cromatográficas y/o la membrana o membranas cromatográficas en el primer PCCS (por ejemplo, un primer sistema de PCC). Además, a continuación se describen tampones de elución ejemplares que se pueden usar en el primer PCCS.
[0286] El primer PCCS que contiene al menos una columna cromatográfica y/o membrana cromatográfica que contiene una resina que puede realizar la operación unitaria de captura (por ejemplo, cualquiera de las resinas ejemplares que se pueden usar para la captura descritas en el presente documento) se puede cargar con el medio de cultivo líquido que contiene una proteína terapéutica recombinante que usa cualquiera de los caudales de carga (tasas de alimentación) descritos anteriormente. En algunos ejemplos, una sola columna cromatográfica o una sola membrana cromatográfica que contiene una resina que es capaz de realizar la operación unitaria de captura se carga, por ejemplo, entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 90 minutos (por ejemplo, entre aproximadamente 15 minutos y aproximadamente 90 minutos, entre aproximadamente 20 minutos y 80 minutos, entre aproximadamente 30 minutos y 80 minutos, entre aproximadamente 40 minutos y aproximadamente 80 minutos, entre aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 80 minutos, y entre aproximadamente 60 minutos y 80 minutos). En algunos ejemplos, en donde el primer PCCS incluye al menos dos columnas cromatográficas que contienen una resina que es capaz de realizar la operación unitaria de captura en serie, el tiempo requerido para cargar dos de las columnas cromatográficas en serie es, por ejemplo, entre aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 180 minutos (por ejemplo, entre aproximadamente 60 minutos y aproximadamente 180 minutos, entre aproximadamente 70 minutos y aproximadamente 180 minutos, entre aproximadamente 80 minutos y aproximadamente 180 minutos, entre aproximadamente 90 minutos y aproximadamente 180 minutos, entre aproximadamente 100 minutos y aproximadamente 180 minutos, entre aproximadamente 110 minutos y 150 minutos, y entre aproximadamente 125 minutos y aproximadamente 145 minutos).
[0288] Después de la carga de la proteína terapéutica recombinante en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica en el primer PCCS que contiene una resina que es capaz de realizar la operación unitaria de captura, la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica se lava con al menos un tampón de lavado. Como se puede apreciar en la técnica, el al menos un solo (por ejemplo, dos, tres o cuatro) tampón de lavado pretende eluir todas las proteínas que no son la proteína terapéutica recombinante de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica, sin alterar la interacción de la proteína terapéutica recombinante con la resina.
[0290] El tampón de lavado se puede hacer pasar a través de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica a un caudal de entre aproximadamente 0,2 ml/minuto a aproximadamente 25 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 10 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 14 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 25,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto). El volumen de tampón de lavado usado (por ejemplo, volumen total combinado de tampón de lavado usado cuando se usa más de un tampón de lavado) puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 1X volumen de columna (CV) y aproximadamente 15X CV (por ejemplo, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 4X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 5X CV y aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV y aproximadamente 10X CV). El tiempo total del lavado puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 3 horas (por ejemplo, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 2,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 2,0 horas, entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 20 minutos y aproximadamente 1,25 horas o entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 1 hora).
[0292] Después del lavado de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica en el primer PCCS que contiene una resina que es capaz de realizar la operación unitaria de captura, la proteína terapéutica recombinante se eluye de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica pasando un tampón de elución a través de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica en el primer PCCS que contiene una resina que es capaz de realizar la operación unitaria de captura. El tampón de elución se puede hacer pasar a través de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que contiene una resina que es capaz de realizar la operación unitaria de captura a un caudal de entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 25 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 10 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 6,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 5,0 mg/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 14 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 25,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto). El volumen de tampón de elución usado para eluir la proteína terapéutica recombinante de cada una de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que contiene una resina que es capaz de realizar la operación unitaria de purificación puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 1X volumen de columna (CV) y aproximadamente 15X CV (por ejemplo, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 4X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 5X CV y aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV y aproximadamente 10X CV). El tiempo total de la elución puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 3 horas (por ejemplo, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 2,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 2,0 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 1 hora, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 40 minutos, entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 40 minutos, entre aproximadamente 20 minutos y aproximadamente 40 minutos). Los ejemplos no limitativos de tampones de elución que se pueden usar en estos métodos dependerán del mecanismo de captura y/o la proteína terapéutica. Por ejemplo, un tampón de elución puede contener una concentración diferente de sal (por ejemplo, concentración de sal aumentada), un pH diferente (por ejemplo, una concentración de sal aumentada o reducida) o una molécula que competirá con la proteína terapéutica recombinante por la unión a la resina que es capaz de realizar la operación unitaria de captura. Los ejemplos de dichos tampones de elución para cada mecanismo de captura ejemplar descrito en el presente documento son bien conocidos en la técnica.
[0294] Después de la elución de la proteína terapéutica recombinante de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica en el primer PCCS que contiene una resina que es capaz de realizar la operación unitaria de captura, y antes de que el siguiente volumen de medio de cultivo líquido pueda cargarse en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica, la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica debe equilibrarse usando un tampón de regeneración. El tampón de regeneración se puede hacer pasar a través de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que contiene una resina que es capaz de realizar la operación unitaria de captura a un caudal de, por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 25 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 10 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 6,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 5,0 mg/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 14 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 25,0 ml/minuto, entre aproximadamente 5,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto, o entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto). El volumen de tampón de regeneración usado para equilibrar la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que contiene una resina que es capaz de realizar la operación unitaria de captura puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 1X volumen de columna (CV) y aproximadamente 15X CV (por ejemplo, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV y aproximadamente 5X CV, aproximadamente 4X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 5X CV y aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV y aproximadamente 10X CV).
[0295] En algunos de los procesos descritos en el presente documento, el primer PCCS incluye un depósito que contiene un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante a pH bajo (por ejemplo, un pH inferior a 4,6, inferior a 4,4, inferior a 4,2, inferior a 4,0, inferior a 3,8, inferior a 3,6, inferior a 3,4, inferior a 3,2 o inferior a 3,0) durante, por ejemplo, de aproximadamente 1 minuto a 1,5 horas (por ejemplo, aproximadamente 1 hora), e inactiva los virus presentes en un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante. Un ejemplo de un depósito que se puede usar para realizar la operación unitaria de inactivación de virus es un matraz agitador (por ejemplo, matraz agitador de 500 ml, por ejemplo, un matraz agitador de 500 ml con una placa agitadora programada) que es capaz de contener un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante durante, por ejemplo, aproximadamente 1 minuto a 1,5 horas, antes de que el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante se alimente en el segundo PCCS. El depósito que se usa para realizar la operación unitaria de inactivación de virus puede ser un matraz agitador de 500 ml con una placa agitadora programada (por ejemplo, una placa agitadora programada para mezclar (por ejemplo, mezclar periódicamente) el fluido dentro del depósito, por ejemplo, cada 4 horas). Otro ejemplo de un depósito que se puede usar para realizar la operación unitaria de inactivación de virus es una bolsa de plástico (por ejemplo, bolsa de plástico de 500 ml) que es capaz de contener un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante durante, por ejemplo, de aproximadamente 1 minuto a 1,5 horas, antes de que el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante se alimente en el segundo PCCS. En algunos ejemplos, el fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante ya puede tener un pH bajo (por ejemplo, un pH inferior a 4,6, inferior a 4,4, inferior a 4,2, inferior a 4,0, inferior a 3,8, inferior a 3,6, inferior a 3,4, inferior a 3,2 o inferior a 3,0) cuando se alimenta en el depósito que se usa para realizar la operación unitaria de inactivación vírica. Como pueden apreciar los expertos en la técnica, se puede usar una variedad de medios diferentes para realizar la operación unitaria de inactivación de virus. Por ejemplo, la irradiación UV de un fluido que contiene proteína terapéutica recombinante también se puede usar para realizar la operación unitaria de inactivación de virus. En el presente documento se describen ejemplos no limitativos de depósitos que pueden usarse para realizar la operación unitaria de inactivación de virus presentes en un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante.
[0296] El primer PCCS puede incluir un PCCS que contiene cuatro columnas cromatográficas, donde al menos tres de las cuatro columnas cromatográficas realizan la operación unitaria de captura de la proteína terapéutica recombinante del medio de cultivo líquido (por ejemplo, usando un primer PCCS que incluye cualquiera de la al menos una columna cromatográfica que contiene una resina que es capaz de realizar la operación unitaria de captura (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento)). En estos ejemplos, la cuarta columna de la PCC puede realizar la operación unitaria de inactivación de virus en un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante (por ejemplo, cualquiera de las columnas ejemplares descritas en el presente documento que se pueden usar para lograr la inactivación vírica de un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante).
[0297] Un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante se eluye continuamente del primer PCCS (por ejemplo, el primer sistema de PCC), y se alimenta continuamente en el segundo PCCS. El porcentaje de la proteína terapéutica recombinante recuperada en el eluido del primer PCCS (por ejemplo, el primer sistema de PCC) puede ser, por ejemplo, al menos un 70 %, al menos un 72 %, al menos un 74 %, al menos un 76 %, al menos un 78 %, al menos un 80 %, al menos un 82 %, al menos un 84 %, al menos un 86 %, al menos un 88 %, al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 %, al menos un 96 % o al menos un 98 %). El eluido del primer PCCS (por ejemplo, el primer sistema de PCC) se puede alimentar en el segundo PCCS (por ejemplo, segundo sistema de PCC) usando una variedad de medios conocidos en la técnica (por ejemplo, tubos). El eluido del primer PCCS (por ejemplo, primer sistema de PCC) se puede alimentar en el segundo PCCS (por ejemplo, segundo sistema de PCC) a un caudal de, por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 25 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 10 ml/minuto entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 6,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 5,0 mg/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 14 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 25,0 ml/minuto, entre aproximadamente 5,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto, entre aproximadamente 15 ml/minuto y aproximadamente 25 ml/minuto, o entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto).
[0298] Algunos procesos descritos en el presente documento pueden incluir además una etapa de ajuste de la concentración iónica y/o el pH del eluido a partir del primer PCCS (por ejemplo, primer sistema de PCC) antes de que se alimente en el segundo PCCS (por ejemplo, segundo sistema de PCC). Como se describe en el presente documento, la concentración iónica y/o el pH del eluido del primer PCCS (por ejemplo, primer sistema de PCC) se puede ajustar (antes de que se alimente en el segundo PCCS) añadiendo un tampón al eluido (por ejemplo, mediante el uso de un depósito de ajuste de tampón en línea). El tampón se puede añadir al eluido del primer PCCS a un caudal de, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 12,5 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 10,0 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 8,0 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 6 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y 4 ml/minuto, o entre aproximadamente 0,5 ml/minuto a aproximadamente 5 ml/minuto).
[0300] Los procesos descritos en la presente pueden incluir además una etapa de contener o almacenar (y opcionalmente también refrigerar) el eluido del primer PCCS antes de alimentar el eluido del primer PCCS en el segundo PCCS. Como se describe en el presente documento, esta etapa de contener o almacenar se puede realizar usando cualquiera de los depósitos (por ejemplo, tanques de reserva) descritos en el presente documento.
[0302] Los procesos descritos en el presente documento también pueden incluir una etapa de filtrar el eluido del primer PCCS antes de que el eluido se alimente en el segundo PCCS. Puede usarse cualquiera de los filtros ejemplares o métodos de filtración descritos en el presente documento para filtrar el eluido del primer PCCS antes de que el eluido se alimente en el segundo PCCS.
[0304] Pulido y purificación de la proteína terapéutica recombinante
[0306] Los procesos descritos en el presente documento incluyen una etapa de purificar y pulir la proteína terapéutica recombinante usando un segundo PCCS, donde el eluido de la PCC2 es una sustancia farmacéutica proteica terapéutica. El segundo PCCS puede incluir al menos una (por ejemplo, dos, tres o cuatro) columna cromatográfica o membrana cromatográfica que puede usarse para realizar la operación unitaria de purificación de una proteína terapéutica recombinante, y al menos una (por ejemplo, dos, tres o cuatro) columna cromatográfica o membrana cromatográfica que puede usarse para realizar la operación unitaria de pulir la proteína terapéutica recombinante.
[0307] La al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante puede contener una resina que utiliza un mecanismo de captura (por ejemplo, cualquiera de los mecanismos de captura descritos en el presente documento o conocidos en la técnica), o una resina que se puede usar para realizar intercambio aniónico, intercambio catiónico o cromatografía de tamices moleculares. La al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la unidad de operación de pulido de la proteína terapéutica recombinante puede contener una resina que puede usarse para realizar intercambio aniónico, intercambio catiónico o cromatografía de tamices moleculares (por ejemplo, cualquiera de las resinas ejemplares para realizar intercambio aniónico, intercambio catiónico o cromatografía de tamices moleculares descritas en el presente documento o conocidas en la técnica).
[0309] El tamaño, la forma y el volumen de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la unidad de operación de purificación de la proteína terapéutica recombinante, y/o el tamaño y la forma de la al menos una membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la unidad de operación de pulido de la membrana recombinante puede ser cualquiera de la combinación de los tamaños, formas y volúmenes ejemplares de columnas cromatográficas o membranas cromatográficas descritas en el presente documento. Como puede apreciar un experto en la técnica, la etapa de purificar o pulir una proteína terapéutica recombinante puede incluir, por ejemplo, las etapas de cargar, lavar, eluir y equilibrar la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica usada para realizar la unidad de operación de purificación o pulido de la proteína terapéutica recombinante. Normalmente, el tampón de elución que sale de una columna cromatográfica o membrana cromatográfica usada para realizar la operación unitaria de purificación contiene la proteína terapéutica recombinante. Normalmente, el tampón de carga y/o lavado que sale de una columna cromatográfica o membrana cromatográfica usada para realizar la operación unitaria de pulido contiene la proteína terapéutica recombinante.
[0310] Por ejemplo, el tamaño de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar una operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante puede tener un volumen de, por ejemplo, entre aproximadamente 2,0 ml y aproximadamente 200 ml (por ejemplo, entre aproximadamente 2,0 ml y aproximadamente 180 ml, entre aproximadamente 2,0 ml y aproximadamente 160 ml, entre aproximadamente 2,0 ml y aproximadamente 140 ml, entre aproximadamente 2,0 ml y aproximadamente 120 ml, entre aproximadamente 2,0 ml y aproximadamente 100 ml, entre aproximadamente 2,0 ml y aproximadamente 80 ml, entre aproximadamente 2,0 ml y aproximadamente 60 ml, entre aproximadamente 2,0 ml y aproximadamente 40 ml, entre aproximadamente 5,0 ml y aproximadamente 40 ml, entre aproximadamente 2,0 ml y aproximadamente 30 ml, entre aproximadamente 5,0 ml y aproximadamente 30 ml, o entre aproximadamente 2,0 ml y aproximadamente 25 ml). El caudal del fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante tal y como se carga en la al menos una columna cromatográfica o al menos una cromatografía que se puede usar para realizar la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 25 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 12,5 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 10,0 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 8,0 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 6 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y 4 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 3 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 2 ml/minuto, o aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 4 ml/minuto). La concentración de la proteína terapéutica recombinante en el fluido cargado en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 0,05 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml de proteína recombinante (por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 90 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 80 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 70 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 60 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 40 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 30 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 20 mg/ml, entre 0,5 mg/ml y aproximadamente 20 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 15 mg/ml, entre aproximadamente 0,5 mg/ml y aproximadamente 15 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml, o entre aproximadamente 0,5 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml de proteína terapéutica recombinante). La resina en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica usada para realizar una operación unitaria de purificación puede ser una resina que se puede usar para realizar cromatografía de intercambio aniónico o de intercambio catiónico. La resina en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se usa para realizar la operación unitaria de purificación puede ser una resina de intercambio catiónico (por ejemplo, resina Capto-S, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ).
[0312] Después de la carga de la proteína terapéutica recombinante en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica en el segundo PCCS que se puede usar para realizar la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante, la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica se lava con al menos un tampón de lavado. Como se puede apreciar en la técnica, el al menos un solo (por ejemplo, dos, tres o cuatro) tampón de lavado pretende eluir todas las proteínas que no son la proteína terapéutica recombinante de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica, sin alterar la interacción de la proteína terapéutica recombinante con la resina, o eluir de otro modo la proteína terapéutica recombinante.
[0314] El tampón de lavado se puede hacer pasar a través de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica a un caudal de entre aproximadamente 0,2 ml/minuto a aproximadamente 25 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 10 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 14 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 25,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto). El volumen de tampón de lavado usado (por ejemplo, volumen total combinado de tampón de lavado usado cuando se usa más de un tampón de lavado) puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 1X volumen de columna (CV) y aproximadamente 15X CV (por ejemplo, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 4X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2,5X CV y aproximadamente 5,0 CV, aproximadamente 5X CV y aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV y aproximadamente 10X CV). El tiempo total del lavado puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 3 horas (por ejemplo, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 2,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 2,0 horas, entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 20 minutos y aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 1 hora, entre aproximadamente 2 minutos y 10 minutos, entre aproximadamente 2 minutos y 15 minutos, o entre aproximadamente 2 minutos y 30 minutos).
[0316] Después del lavado de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica en el segundo PCCS que se puede usar para realizar la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante, la proteína terapéutica recombinante se eluye de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica pasando un tampón de elución a través de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica en la segunda PCCS que se puede usar para realizar la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante. El tampón de elución se puede hacer pasar a través de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante a un caudal de entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 25 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 10 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 6,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 5,0 mg/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 14 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 25,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto). El volumen de tampón de elución usado para eluir la proteína terapéutica recombinante de cada una de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 1X volumen de columna (CV) y aproximadamente 25X CV (por ejemplo, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 20X CV, entre aproximadamente 15X CV y aproximadamente 25X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 4X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 5X CV y aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV y aproximadamente 10X CV). El tiempo total de la elución puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 3 horas (por ejemplo, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 2,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 2,0 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 1 hora, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 40 minutos, entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 40 minutos, entre aproximadamente 20 minutos y aproximadamente 40 minutos, o entre aproximadamente 30 minutos y 1,0 hora). Los ejemplos no limitativos de tampones de elución que se pueden usar en estos métodos dependerán de la resina y/o la proteína terapéutica. Por ejemplo, un tampón de elución puede contener una concentración diferente de sal (por ejemplo, concentración de sal aumentada), un pH diferente (por ejemplo, una concentración de sal aumentada o reducida) o una molécula que competirá con la proteína terapéutica recombinante por la unión a la resina. Los ejemplos de dichos tampones de elución para cada uno de los mecanismos de captura ejemplares descritos en el presente documento son bien conocidos en la técnica.
[0317] Después de la elución de la proteína terapéutica recombinante de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica en el segundo PCCS que se puede usar para realizar la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante, y antes de que el siguiente volumen de fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante pueda cargarse en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica, la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica debe equilibrarse usando un tampón de regeneración. El tampón de regeneración se puede hacer pasar a través de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante a un caudal de, por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 25 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 10 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 6,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 5,0 mg/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 14 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 25,0 ml/minuto, entre aproximadamente 5,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/min, o entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto). El volumen de tampón de regeneración usado para equilibrar la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que contiene una resina que puede usarse para realizar la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 1X volumen de columna (CV) y aproximadamente 15X CV (por ejemplo, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 14X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 13X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 12X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 11X CV, entre aproximadamente 2X CV y aproximadamente 11X CV entre aproximadamente 3X CV y aproximadamente 11X CV, entre aproximadamente 2X CV y aproximadamente 5X CV, entre aproximadamente 2,5X CV y aproximadamente 7,5X CV, entre aproximadamente 4X CV y aproximadamente 11X CV, entre aproximadamente 5X CV y aproximadamente 11X CV, o entre aproximadamente 5X CV y aproximadamente 10X CV). La concentración de proteína terapéutica recombinante en el eluido de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 0,05 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml de proteína terapéutica recombinante (por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 90 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 80 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 70 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 60 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 40 mg/ml, entre aproximadamente 2,5 mg/ml y aproximadamente 7,5 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 30 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 20 mg/ml, entre aproximadamente 0,5 mg/ml y aproximadamente 20 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 15 mg/ml, entre aproximadamente 0,5 mg/ml y aproximadamente 15 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml, o entre aproximadamente 0,5 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml de proteína terapéutica recombinante).
[0319] La al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante puede contener una resina que se puede usar para realizar intercambio catiónico, intercambio aniónico o cromatografía de tamices moleculares. Como se puede apreciar en la técnica, pulir una proteína terapéutica recombinante usando la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de pulir la proteína terapéutica recombinante en el segundo PCCS puede incluir, por ejemplo, las etapas de carga, arrastre y regeneración de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante. Por ejemplo, cuando las etapas de carga, arrastre y regeneración se usan para realizar el pulido, la proteína terapéutica recombinante no se une a la resina en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica en el segundo PCCS que se usa para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante, y la proteína terapéutica recombinante se eluye de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica en las etapas de carga y arrastre, y la etapa de regeneración se usa para eliminar cualquier impurezas de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica antes de que se pueda cargar un fluido adicional que contiene la proteína terapéutica recombinante en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica. Se describen a continuación caudales y volúmenes de tampón ejemplares que se usarán en cada una de las etapas de carga, arrastre y regeneración.
[0321] El tamaño, la forma y el volumen de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante, y/o el tamaño y la forma de la al menos una membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante puede ser cualquiera de la combinación de los tamaños, formas y volúmenes ejemplares de columnas cromatográficas o membranas cromatográficas descritas en el presente documento. Por ejemplo, el tamaño de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante puede tener un volumen de, por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 200 ml (por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 180 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 160 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 140 ml, entre aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 120 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 100 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 80 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 60 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 40 ml, entre aproximadamente 5,0 ml y aproximadamente 40 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 30 ml, entre aproximadamente 5,0 ml y aproximadamente 30 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 25 ml, entre aproximadamente 0,2 ml y aproximadamente 10 ml, o entre aproximadamente 0,2 ml y aproximadamente 5 ml). El caudal del fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante tal y como se carga en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 25 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 12,5 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 10,0 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 8,0 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 6 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 4 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 3 ml/minuto, entre aproximadamente 2 ml/minuto y aproximadamente 6 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 2 ml/minuto, o aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 4 ml/minuto). El volumen total de fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante cargada en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 1,0 ml y aproximadamente 250 ml (por ejemplo, entre aproximadamente 1,0 ml y aproximadamente 225 ml, entre aproximadamente 1,0 ml y aproximadamente 200 ml, entre aproximadamente 1,0 ml y aproximadamente 175 ml, entre aproximadamente 1,0 ml y aproximadamente 150 ml, entre aproximadamente 100 ml y aproximadamente 125 ml, entre aproximadamente 100 ml y aproximadamente 150 ml, entre aproximadamente 1,0 ml y aproximadamente 150 ml, entre aproximadamente 1,0 ml y aproximadamente 125 ml, entre aproximadamente 1,0 ml y aproximadamente 100 ml, entre aproximadamente 1,0 ml y aproximadamente 75 ml, entre aproximadamente 1,0 ml y aproximadamente 50 ml, o entre aproximadamente 1,0 ml y aproximadamente 25 ml). La resina en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica usada para realizar el pulido puede ser una resina de intercambio aniónico o de intercambio catiónico. La resina en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se usa para realizar la operación unitaria de pulido puede ser una resina de intercambio catiónico (por ejemplo, resina Sartobind<®>Q, Sartorius, Goettingen, Alemania).
[0323] Después de la etapa de carga, la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica en el segundo PCCS que se puede usar para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante, se realiza una etapa de persecución (por ejemplo, se hace pasar un tampón de persecución a través de la al menos una membrana cromatográfica o membrana cromatográfica para recoger la proteína terapéutica recombinante que no se une sustancialmente a la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica). En estos ejemplos, el tampón de arrastre se puede hacer pasar a través de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica a un caudal de entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 50 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 1 ml/minuto y aproximadamente 40 ml/minuto, entre aproximadamente 1 ml/minuto y aproximadamente 30 ml/minuto, entre aproximadamente 5 ml/minuto y aproximadamente 45 ml/minuto, entre aproximadamente 10 ml/minuto y aproximadamente 40 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 10 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 14 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 25,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto). El volumen de tampón de arrastre usado puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 1X volumen de columna (CV) y aproximadamente 100X CV (por ejemplo, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 90X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 80X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 70X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 60X CV, entre aproximadamente 1X y aproximadamente 50X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 40X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 30X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 20X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 15X CV, entre aproximadamente 5X CV y aproximadamente 20X CV, entre aproximadamente 5 X CV y aproximadamente 30X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 4X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2,5X CV y aproximadamente 5.0X CV, aproximadamente 5X CV y aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV y aproximadamente 10X CV). El tiempo total del arrastre puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 3 horas (por ejemplo, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 2,5 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 2,0 horas, entre aproximadamente 1 minutos y aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 1 minutos y aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 5 minutos, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 10 minutos, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 4 minutos, entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 1 hora, entre aproximadamente 2 minutos y 10 minutos, entre aproximadamente 2 minutos y 15 minutos, o entre aproximadamente 2 minutos y 30 minutos). La concentración combinada de proteína recombinante terapéutica presente en el eluido que pasa a través de la columna en la etapa de carga y la etapa de arrastre puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml de proteína recombinante (por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 90 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 80 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 70 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 60 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 40 mg/ml, entre aproximadamente 2,5 mg/ml y aproximadamente 7.5 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 30 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 20 mg/ml, entre 0,5 mg/ml y aproximadamente 20 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 15 mg/ml, entre aproximadamente 0.5 mg/ml y aproximadamente 15 mg/ml, entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml, entre aproximadamente 0.5 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml, o entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 5 mg/ml de proteína terapéutica recombinante).
[0325] Después de la etapa de arrastre y antes de que el siguiente volumen de fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante pueda cargarse en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que puede usarse para realizar la operación unitaria de pulido, la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica debe regenerarse usando un tampón de regeneración. El tampón de regeneración se puede hacer pasar a través de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de pulir la proteína terapéutica recombinante a un caudal de, por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 50 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 1 ml/minuto y aproximadamente 40 ml/minuto, entre aproximadamente 1 ml/minuto y aproximadamente 30 ml/minuto, entre aproximadamente 5 ml/minuto y aproximadamente 45 ml/minuto, entre aproximadamente 10 ml/minuto y aproximadamente 40 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 20 ml/minuto, entre aproximadamente 0,2 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 10 ml/minuto, entre aproximadamente 0,5 ml/minuto y aproximadamente 14 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 25,0 ml/minuto, entre aproximadamente 1,0 ml/minuto y aproximadamente 15,0 ml/minuto). El volumen de tampón de regeneración usado para regenerar la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para realizar la operación unitaria de pulido puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 1X volumen de columna (CV) y aproximadamente 500X CV (por ejemplo, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 450X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 400X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 350X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 300X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 250X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 200X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 150X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 100 X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 90X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 80X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 70X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 60X CV, entre aproximadamente 1X y aproximadamente 50X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 40X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 30X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 20X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 15X CV, entre aproximadamente 5X CV y aproximadamente 20X CV, entre aproximadamente 5 X CV y aproximadamente 30X CV, entre aproximadamente 1X CV y aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 4X CV y aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2.5X CV y aproximadamente 5.0X CV, aproximadamente 5X CV y aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV y aproximadamente 10X CV).
[0327] En otros ejemplos, la una o más columnas cromatográficas y/o membranas cromatográficas usadas para realizar la operación unitaria de pulido contienen una resina que se une o retiene selectivamente las impurezas presentes en un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante, y en lugar de regenerar la una o más columnas y/o membranas, la una o más columnas y/o membranas se reemplazan (por ejemplo, se reemplazan con una o más columnas y/o membranas sustancialmente similares) una vez que se ha alcanzado o está sustancialmente cerca de alcanzarse la capacidad de unión de la resina en la una o más columnas y/o membranas.
[0329] En algunos ejemplos de estos procesos, el segundo PCCS incluye un PCCS que contiene tres columnas cromatográficas y una membrana cromatográfica, por ejemplo, donde las tres columnas cromatográficas en el PCCS realizan la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante (por ejemplo, usando al menos una columna o columnas cromatográficas que se pueden usar para realizar la unidad de operación de purificación de la proteína) y la membrana cromatográfica en el PCCS realiza la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante. En estos ejemplos, la membrana cromatográfica en el PCCS que se puede usar para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante puede ser cualquiera de las membranas cromatográficas ejemplares descritas en el presente documento que se pueden usar para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante. Cualquiera de los métodos de cambio de columna descritos en el presente documento se puede usar para determinar cuándo se pueden cambiar las tres primeras columnas cromatográficas y la membrana cromatográfica en el PCCS en este ejemplo.
[0331] Algunas realizaciones de este ejemplo pueden incluir además una etapa de ajuste de la concentración iónica y/o el pH del eluido a partir de las tres columnas cromatográficas en el PCCS antes de que el eluido se alimente en la membrana cromatográfica en el PCCS. Como se describe en el presente documento, la concentración iónica y/o el pH del eluido de las tres columnas cromatográficas en PCCS se pueden ajustar (antes de que se alimente en la membrana cromatográfica en el PCCS en este ejemplo)) añadiendo un tampón al eluido de las tres columnas cromatográficas en el PCCS (por ejemplo, mediante el uso de un depósito de ajuste de tampón en línea). El tampón se puede añadir al eluido a un caudal de, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 15 ml/minuto (por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 12,5 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 10,0 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 8,0 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y aproximadamente 6 ml/minuto, entre aproximadamente 0,1 ml/minuto y 4 ml/minuto, o entre aproximadamente 0,5 ml/minuto a aproximadamente 5 ml/minuto).
[0333] Estos ejemplos pueden incluir además una etapa de contención o almacenamiento del eluido de las tres columnas cromatográficas en el PCCS en este ejemplo antes de alimentar el eluido en la membrana cromatográfica (membrana cromatográfica que puede usarse para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante). Como se describe en el presente documento, esta etapa de contener o almacenar se puede realizar usando cualquiera de los depósitos (por ejemplo, tanques de reserva) descritos en el presente documento.
[0334] Estos ejemplos también pueden incluir una etapa de filtración del eluido de la membrana cromatográfica en el sistema PCCS ilustrativo (eluido de la membrana cromatográfica que puede usarse para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante). Cualquiera de los filtros o métodos ejemplares para la filtración descritos en la presente puede usarse para filtrar el eluido de la membrana cromatográfica en este PCCS ejemplar (eluido de la membrana cromatográfica que puede usarse para realizar la operación unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante).
[0336] Como pueden apreciar los expertos en la técnica, la sustancia farmacéutica proteica terapéutica puede eluirse periódicamente del segundo PCCS usando cualquiera de los procesos descritos en el presente documento. Por ejemplo, cualquiera de los procesos descritos en el presente documento puede eluir la sustancia farmacéutica proteica terapéutica durante un periodo de, por ejemplo, entre aproximadamente 30 segundos y aproximadamente 5 horas (por ejemplo, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 4 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 3 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 2 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 1 hora, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 30 minutos) a una frecuencia de, por ejemplo, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 6 horas (por ejemplo, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 5 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 4 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 3 horas, entre aproximadamente 1 minuto y 2 horas, entre aproximadamente 1 minuto y 1 hora o entre aproximadamente 1 minuto y 30 minutos), dependiendo de, por ejemplo, la columna o columnas cromatográficas y/o la membrana o membranas cromatográficas usadas en el primer y segundo PCCS.
[0338] Métodos de cultivo
[0340] Algunos de los procesos descritos en el presente documento incluyen además una etapa de cultivo de células (por ejemplo, células de mamífero recombinantes) que secretan una proteína terapéutica recombinante en un biorreactor (por ejemplo, un biorreactor de perfusión o semicontinuo) que contiene un medio de cultivo líquido, en donde un volumen del medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células (por ejemplo, células de mamífero) se extrae continua o periódicamente del biorreactor de perfusión y se alimenta en el primer sistema de cromatografía multicolumna (PCC1). El biorreactor puede tener un volumen de, por ejemplo, entre aproximadamente 1 l y aproximadamente 10.000 L (por ejemplo, entre aproximadamente 1 l y aproximadamente 50 l, entre aproximadamente 50 l y aproximadamente 500 l, entre aproximadamente 500 l y aproximadamente 1000 l, entre 500 l y aproximadamente 5000 l, entre aproximadamente 500 l y aproximadamente 10.000 l, entre aproximadamente 5000 l y aproximadamente 10.000 l, entre aproximadamente 1 l y aproximadamente 10.000 l, entre aproximadamente 1 l y aproximadamente 8.000 l, entre aproximadamente 1 l y aproximadamente 6.000 l, entre aproximadamente 1 l y aproximadamente 5.000 l, entre aproximadamente 100 l y aproximadamente 5.000 l, entre aproximadamente 10 l y aproximadamente 100 l, entre aproximadamente 10 l y aproximadamente 4.000 l, entre aproximadamente 10 l y aproximadamente 3.000 l, entre aproximadamente 10 l y aproximadamente 2.000 l, o entre aproximadamente 10 l y aproximadamente 1.000 l). La cantidad de medio de cultivo líquido presente en un biorreactor puede estar, por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 l y aproximadamente 5.000 l (por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 l y aproximadamente 25 l, entre aproximadamente 25 l y aproximadamente 250 l, entre aproximadamente 250 l y aproximadamente 500 l, entre 250 l y aproximadamente 2500 l, entre aproximadamente 250 l y aproximadamente 5.000 l, entre aproximadamente 2500 l y aproximadamente 5.000 l, entre aproximadamente 0,5 l y aproximadamente 5.000 l, entre aproximadamente 0,5 l y aproximadamente 4.000 l, entre aproximadamente 0,5 l y aproximadamente 3.000 l, entre aproximadamente 0,5 l y aproximadamente 2.500 l, entre aproximadamente 50 l y aproximadamente 2.500 l, entre aproximadamente 5 l y aproximadamente 50 l, entre aproximadamente 5 l y aproximadamente 2.000 l, entre aproximadamente 5 l y aproximadamente 1.500 l, entre aproximadamente 5 l y aproximadamente 1.000 l, o entre aproximadamente 5 l y aproximadamente 500 l). Las células de cultivo se pueden realizar, por ejemplo, usando un biorreactor semicontinuo o un biorreactor de perfusión. A continuación se describen ejemplos no limitativos y diferentes aspectos de cultivo de células (por ejemplo, cultivo de células de mamífero) y se pueden usar en cualquier combinación.
[0342] Células
[0344] Las células que se cultivan en algunos de los procesos descritos en el presente documento pueden ser bacterias (por ejemplo, bacterias gramnegativas), levadura (por ejemplo,Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolyticaoArxula adeninivorans), o células de mamífero. La célula de mamífero puede ser una célula que crece en suspensión o una célula adherente. Los ejemplos no limitativos de células de mamífero que pueden cultivarse en cualquiera de los procesos descritos en el presente documento incluyen: células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, células CHO DG44 o células CHO-K1s), Sp2.0, células de mieloma (por ejemplo, NS/0), linfocitos B, células de hibridoma, linfocitos T, células de riñón embrionario humano (HEK) (por ejemplo, HEK 293E y HEK 293F), células epiteliales de riñón verde africano (Vero) y células epiteliales de riñón de Madin-Darby Canine (cocker spaniel) (MDCK). En algunos ejemplos donde se cultiva una célula adherente, el cultivo también puede contener una pluralidad de microportadores (por ejemplo, microportadores que contienen uno o más poros). En la técnica se conocen células de mamífero adicionales que se pueden cultivar en cualquiera de los procesos descritos en el presente documento.
[0345] La célula de mamífero puede contener un ácido nucleico recombinante (por ejemplo, un ácido nucleico integrado de forma estable en el genoma de la célula de mamífero) que codifica una proteína terapéutica recombinante. A continuación se describen ejemplos no limitativos de ácidos nucleicos recombinantes que codifican proteínas terapéuticas recombinantes ejemplares, ya que son proteínas terapéuticas recombinantes que se pueden producir usando los métodos descritos en el presente documento. En algunos casos, la célula de mamífero que se cultiva en un biorreactor (por ejemplo, cualquiera de los biorreactores descritos en el presente documento) procedió de un cultivo más grande.
[0346] Un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante se puede introducir en una célula de mamífero usando una amplia variedad de métodos conocidos en la biología molecular y la genética molecular. Los ejemplos no limitativos incluyen transfección (por ejemplo, lipofección), transducción (por ejemplo, infección por lentivirus, adenovirus o retrovirus) y electroporación. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica recombinante no está integrado de forma estable en un cromosoma de la célula de mamífero (transfección transitoria); mientras que en otros, el ácido nucleico está integrado. Alternativamente o además, el ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica recombinante puede estar presente en un plásmido y/o en un cromosoma artificial de mamífero (por ejemplo, un cromosoma artificial humano). Alternativamente o además, el ácido nucleico se puede introducir en la célula usando un vector vírico (por ejemplo, un vector de lentivirus, retrovirus o adenovirus). El ácido nucleico puede estar unido operativamente a una secuencia promotora (por ejemplo, un promotor fuerte, tal como un promotor de β-actina y un promotor de CMV, o un promotor inducible). Un vector que contiene el ácido nucleico puede, si se desea, contener también un marcador de selección (por ejemplo, un gen que confiere resistencia a higromicina, puromicina o neomicina a la célula de mamífero).
[0347] En algunos casos, la proteína terapéutica recombinante es una proteína segregada y es liberada por la célula de mamífero en el medio extracelular (por ejemplo, el primer y/o segundo medio de cultivo líquido). Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica recombinante soluble puede contener una secuencia que codifica un péptido señalizador de la secreción en el extremo amino o carboxi de la proteína terapéutica recombinante, que es escindido por una enzima presente en la célula de mamífero y posteriormente liberado en el medio extracelular (por ejemplo, el primer y/o segundo medio de cultivo líquido).
[0348] Medios de cultivo
[0349] Los medios de cultivo líquidos son conocidos en la técnica. Los medios de cultivo líquidos (por ejemplo, un primer y/o segundo medio de cultivo de tejidos) se pueden complementar con un suero de mamífero (por ejemplo, suero bovino fetal y suero bovino) y/o una hormona de crecimiento o un factor de crecimiento (por ejemplo, insulina, transferrina y factor de crecimiento epidérmico). Los medios de cultivo líquidos (por ejemplo, un primer y/o segundo medio de cultivo líquido) pueden ser un medio de cultivo líquido químicamente definido, un medio de cultivo líquido libre de componentes derivados de animales, un medio de cultivo líquido libre de suero o un medio de cultivo líquido que contiene suero. Se encuentran disponibles comercialmente ejemplos no limitativos de medios de cultivo líquidos químicamente definidos, medios de cultivo líquidos libres de componentes derivados de animal, medios de cultivo líquidos sin suero y medios de cultivo líquidos que contienen suero.
[0350] Un medio de cultivo líquido normalmente contiene una fuente de energía (por ejemplo, un hidrato de carbono, tal como la glucosa), aminoácidos esenciales (por ejemplo, el conjunto básico de veinte aminoácidos más cisteína), vitaminas y/u otros compuestos orgánicos requeridos en concentraciones bajas, ácidos grasos libres y/u oligoelementos. Los medios de cultivo líquidos (por ejemplo, un primer y/o segundo medio de cultivo líquido) pueden, si se desea, complementarse con, por ejemplo, una hormona o factor de crecimiento de mamífero (por ejemplo, insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales y tampones (por ejemplo, sales de calcio, magnesio y fosfato), nucleósidos y bases (por ejemplo, adenosina, timidina e hipoxantina), hidrolizados de proteínas y tisulares, y/o cualquier combinación de estos aditivos.
[0351] En la técnica se conoce una amplia variedad de medios de cultivo líquidos diferentes que se pueden usar para cultivar células (por ejemplo, células de mamífero) en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Los componentes del medio que también pueden ser útiles en los presentes procesos incluyen, pero no se limitan a, hidrolizados químicamente definidos (CD), por ejemplo, peptona CD, polipéptidos CD (dos o más aminoácidos) y factores de crecimiento CD. En la técnica se conocen ejemplos adicionales de medios de cultivo de tejidos líquidos y de componentes de medios.
[0352] Los expertos apreciarán que el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido descritos en el presente documento pueden ser el mismo tipo de medio o medios diferentes.
[0353] Características adicionales de biorreactores ejemplares
[0354] La superficie interior de cualquiera de los biorreactores descritos en el presente documento puede tener al menos un recubrimiento (por ejemplo, al menos un recubrimiento de gelatina, colágeno, poli-L-ornitina, poliestireno y laminina), y como se conoce en la técnica, uno o más puertos para el rociado de O<2>, CO<2>y N<2>en el medio de cultivo líquido, y un mecanismo de agitación para agitar el medio de cultivo líquido. El biorreactor puede incubar el cultivo celular en una atmósfera humidificada controlada (por ejemplo, a una humedad de más de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, o una humedad del 100 %). El biorreactor también puede estar equipado con un dispositivo mecánico que es capaz de extraer un volumen de medio de cultivo líquido del biorreactor y opcionalmente, un filtro dentro del dispositivo mecánico que retira las células del medio de cultivo líquido durante el proceso de transferencia del medio de cultivo líquido fuera del biorreactor (por ejemplo, un sistema ATF).
[0356] Temperatura
[0358] La etapa de cultivo de células de mamífero puede realizarse a una temperatura de aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C. Los expertos apreciarán que la temperatura puede modificarse en momentos específicos durante la etapa de cultivo, por ejemplo, cada hora o cada día. Por ejemplo, la temperatura se puede cambiar o desplazar (por ejemplo, aumentar o disminuir) aproximadamente un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, siete días, ocho días, nueve días, diez días, once días, doce días, catorce días, quince días, dieciséis días, diecisiete días, dieciocho días, diecinueve días o aproximadamente veinte días o más después de la siembra inicial del biorreactor con la célula (por ejemplo, célula de mamífero). Por ejemplo, la temperatura puede desplazarse hacia arriba (por ejemplo, un cambio de hasta o aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o hasta o aproximadamente 20 °C). Por ejemplo, la temperatura puede desplazarse hacia abajo (por ejemplo, un cambio de hasta o aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o hasta o aproximadamente 20 °C).
[0360] CO2
[0362] La etapa de cultivo descrita en el presente documento pueden incluir además la exposición del medio de cultivo líquido en el biorreactor a una atmósfera que contenga como máximo o aproximadamente 15 % de CO<2>(por ejemplo, como máximo o aproximadamente 14 % de CO<2>, 12 % de CO<2>, 10 % de CO<2>, 8 % de CO<2>, 6 % de CO<2>, 5 % de CO<2>, 4 % de CO<2>, 3 % de CO<2>, 2 % de CO<2>, o como máximo o aproximadamente 1 % de CO<2>).
[0364] Biorreactor de perfusión
[0366] La etapa de cultivo descrita en el presente documento se puede realizar usando un biorreactor de perfusión. El cultivo de una célula (por ejemplo, una célula de mamífero) en un biorreactor de perfusión incluye la extracción del biorreactor de un primer volumen de un primer medio de cultivo líquido (por ejemplo, que contenga cualquier concentración de células de mamífero, por ejemplo, un primer volumen de un primer medio de cultivo líquido que esté sustancialmente libre de células) y añadir al primer medio de cultivo líquido un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido. La extracción y la adición se pueden realizar de forma simultánea o secuencial, o una combinación de las dos. Además, la extracción y la adición se pueden realizar continuamente (por ejemplo, a una tasa que extrae y reemplaza un volumen de entre el 0,1 % y el 800 % (por ejemplo, entre el 1 % y el 700 %, entre el 1 % y el 600 %, entre el 1 % y el 500 %, entre el 1 % y el 400 %, entre el 1 % y el 350 %, entre el 1 % y el 300 %, entre el 1 % y el 250 %, entre el 1 % y el 100 %, entre el 100 % y el 200 %, entre el 5 % y el 150 %, entre el 10 % y el 50 %, entre el 15 % y el 40 %, entre el 8 % y el 80 %, y entre el 4 % y el 30 %) del volumen del biorreactor o del primer volumen de medio de cultivo líquido durante cualquier periodo de tiempo determinado (por ejemplo, durante un periodo de 24 horas, durante un periodo de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas, o durante un periodo de tiempo incremental de más de 24 horas)) o periódicamente (por ejemplo, una vez cada tres días, una vez cada dos días, una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día o cinco veces al día), o cualquier combinación de las mismas. Cuando se realice periódicamente, el volumen que se extrae o reemplaza (por ejemplo, en un periodo de 24 horas aproximadamente, en un periodo de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas, o en un periodo de tiempo incremental de más de 24 horas) puede estar, por ejemplo, entre 0,1 % y 800 % (por ejemplo, entre 1 % y 700 %, entre 1 % y 600 %, entre 1 % y 500 %, entre 1 % y 400 %, entre 1 % y 300 %, entre 1 % y 200 %, entre 1 % y 100 %, entre 100 % y 200 %, entre 5 % y 150 %, entre 10 % y 50 %, entre 15 % y 40 %, entre 8 % y 80 %, y entre 4 % y 30 %) del volumen del biorreactor o del primer volumen del medio de cultivo líquido. El primer volumen del primer medio de cultivo líquido extraído y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido pueden, en algunos casos, mantenerse aproximadamente iguales durante cada periodo de 24 horas (o, como alternativa, un periodo de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas o un periodo de tiempo incremental de más de 24 horas) durante todo o parte del periodo de cultivo. Como se conoce en la técnica, se pueden variar la tasa a la que se extrae el primer volumen del primer medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) y la tasa a la que se añade el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo). La tasa a la que se extrae el primer volumen del primer medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) y la tasa a la que se añade el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) pueden ser aproximadamente la misma o pueden ser diferentes.
[0368] Alternativamente, el volumen extraído y añadido pueden cambiar (por ejemplo, aumentar gradualmente) durante cada periodo de 24 horas (o alternativamente, un periodo de tiempo incremental de entre 1 hora y aproximadamente 24 horas o un periodo de tiempo incremental de más de 24 horas) durante el periodo de cultivo. Por ejemplo, el volumen del primer medio de cultivo líquido extraído y el volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido en cada periodo de 24 horas (o alternativamente, un periodo de tiempo incremental de entre aproximadamente 1 hora y más de 24 horas o un periodo de tiempo incremental de más de 24 horas) durante el periodo de cultivo se puede aumentar (por ejemplo, gradualmente o mediante incrementos escalonados) durante el periodo de cultivo desde un volumen que está entre el 0,5 % y aproximadamente el 30 % del volumen del biorreactor o el volumen del primer medio de cultivo líquido hasta aproximadamente del 25 % a aproximadamente el 150% del volumen del biorreactor o el volumen del primer medio de cultivo líquido.
[0370] Los expertos apreciarán que el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido pueden ser el mismo tipo de medio. En otros casos, el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido pueden ser diferentes.
[0372] El primer volumen del primer medio de cultivo líquido se puede extraer, por ejemplo, mediante un sistema mecánico que puede extraer el primer volumen del primer medio de cultivo líquido del biorreactor (por ejemplo, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células del biorreactor). Alternativamente o además, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido se puede eliminar mediante filtración o flujo por gravedad del primer volumen del primer medio de cultivo líquido a través de una membrana estéril con un corte de peso molecular que excluye la célula (por ejemplo, célula de mamífero).
[0374] El segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido se puede añadir al primer medio de cultivo líquido de forma automática, por ejemplo, mediante una bomba de perfusión.
[0376] En algunos casos, la extracción del primer volumen del primer medio de cultivo líquido (por ejemplo, un primer volumen del primer medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células de mamífero) y la adición al primer medio de cultivo líquido de un segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido no se produce en al menos 1 hora (por ejemplo, en 2 horas, en 3 horas, en 4 horas, en 5 horas, en 6 horas, en 7 horas, en 8 horas, en 9 horas, en 10 horas, en 12 horas, en 14 horas, en 16 horas, en 18 horas, en 24 horas, en 36 horas, en 48 horas, en 72 horas, en 96 horas o después de 96 horas) de la siembra del biorreactor con una célula de mamífero.
[0377] Biorreactor semicontinuo
[0379] La etapa de cultivo descrita en el presente documento se puede realizar usando un biorreactor semicontinuo. El cultivo de una célula en un biorreactor semicontinuo incluye, durante la mayor parte del periodo de cultivo, la adición (por ejemplo, adición periódica o continua) al primer medio de cultivo líquido de un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido. La adición del segundo medio de cultivo líquido se pueden realizar continuamente (por ejemplo, a una tasa que añade un volumen de entre el 0,1 % y el 300 % (por ejemplo, entre el 1 % y el 250 %, entre el 1 % y el 100 %, entre el 100 % y el 200 %, entre el 5 % y el 150 %, entre el 10 % y el 50 %, entre el 15 % y el 40 %, entre el 8 % y el 80 %, y entre el 4 % y el 30 %) del volumen del biorreactor o del primer volumen de medio de cultivo líquido durante cualquier periodo de tiempo determinado (por ejemplo, durante un periodo de 24 horas, durante un periodo de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas, o durante un periodo de tiempo incremental de más de 24 horas)) o periódicamente (por ejemplo, una vez cada tres días, una vez cada dos días, una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día o cinco veces al día), o cualquier combinación de las mismas. Cuando se realiza periódicamente, el volumen que se añade (por ejemplo, en un periodo de 24 horas aproximadamente, en un periodo de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas, o en un periodo de tiempo incremental de más de 24 horas) puede estar, por ejemplo, entre 0,1 % y 300 % (por ejemplo, entre 1 % y 200 %, entre 1 % y 100 %, entre 100 % y 200 %, entre 5 % y 150 %, entre 10 % y 50 %, entre 15 % y 40 %, entre 8 % y 80 %, y entre 4 % y 30 %) del volumen del biorreactor o del primer volumen del medio de cultivo líquido. El segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido se puede mantener, en algunos casos, aproximadamente el mismo durante cada periodo de 24 horas (o, alternativamente, un periodo de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas o un periodo de tiempo incremental de más de 24 horas) durante la totalidad o parte del periodo de cultivo. Como se sabe en la técnica, la tasa a la que se añade el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) puede variarse durante la totalidad o parte del periodo de cultivo. Por ejemplo, el volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido puede cambiar (por ejemplo, aumentar gradualmente) durante cada periodo de 24 horas (o alternativamente, un periodo de tiempo incremental de entre 1 hora y aproximadamente 24 horas o un periodo de tiempo incremental de más de 24 horas) durante el periodo de cultivo. Por ejemplo, el volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido en cada periodo de 24 horas (o alternativamente, un periodo de tiempo incremental de entre aproximadamente 1 hora y más de 24 horas o un periodo de tiempo incremental de más de 24 horas) durante el periodo de cultivo se puede aumentar (por ejemplo, gradualmente o mediante incrementos escalonados) durante el periodo de cultivo desde un volumen que está entre el 0,5 % y aproximadamente el 30 % del volumen del biorreactor o el volumen del primer medio de cultivo líquido hasta aproximadamente del 25 % a aproximadamente el 150 % del volumen del biorreactor o el volumen del primer medio de cultivo líquido. La tasa a la que se añade el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) puede ser aproximadamente la misma durante la totalidad o parte del periodo de cultivo.
[0380] Los expertos apreciarán que el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido pueden ser el mismo tipo de medio. En otros casos, el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido pueden ser diferentes. El volumen del segundo medio de cultivo líquido se puede añadir al primer medio de cultivo líquido de forma automática, por ejemplo, mediante una bomba de perfusión.
[0382] En algunos casos, la adición al primer medio de cultivo líquido de un segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido no se produce en al menos 1 hora (por ejemplo, en 2 horas, en 3 horas, en 4 horas, en 5 horas, en 6 horas, en 7 horas, en 8 horas, en 9 horas, en 10 horas, en 12 horas, en 14 horas, en 16 horas, en 18 horas, en 24 horas, en 36 horas, en 48 horas, en 72 horas, en 96 horas o después de 96 horas) de la siembra del biorreactor con una célula de mamífero. El medio de cultivo celular en cultivos semicontinuos se recolecta normalmente al final del periodo de cultivo y se usa en cualquiera de los procesos descritos en el presente documento, sin embargo, el medio de cultivo celular en cultivos discontinuos también se puede cosechar en uno o más puntos de tiempo durante el periodo de cultivo y usar en cualquiera de los procesos descritos en el presente documento.
[0384] Los expertos apreciarán que cualquiera de los diversos parámetros de cultivo (por ejemplo, recipientes, volúmenes, tasas o frecuencias de reemplazo de volúmenes de cultivo, frecuencias de agitación, temperaturas, medios y concentraciones de CO<2>) se pueden usar en cualquier combinación para realizar estos métodos. Además, cualquiera de las células de mamífero descritas en el presente documento o conocidas en la técnica se puede usar para producir una proteína recombinante.
[0386] Ventajas ejemplares
[0388] Los procesos descritos en el presente documento pueden dar como resultado un aumento sustancial en la productividad volumétrica de la proteína terapéutica recombinante presente en la sustancia farmacéutica proteica terapéutica. Por ejemplo, los procesos descritos en el presente documento pueden dar como resultado un aumento de al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, aumento de 7 veces, aumento de 8 veces, aumento de 9 veces y aumento de 10 veces en la productividad volumétrica de la proteína terapéutica recombinante presente en la sustancia farmacéutica proteica terapéutica. La actividad biológica de una proteína terapéutica recombinante se puede evaluar usando una variedad de métodos conocidos en la técnica, y dependerá de la actividad de la proteína terapéutica recombinante específica. Por ejemplo, la actividad biológica de una proteína terapéutica recombinante que es una inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) se puede determinar midiendo la afinidad del anticuerpo terapéutico recombinante por unirse a su epítopo específico (por ejemplo, usando Biacore o enzimoinmunoanálisis de adsorción competitivos). La proteína terapéutica recombinante puede ser una enzima (por ejemplo, una galactosidasa recombinante, por ejemplo, una alfagalactosidasa recombinante), y la actividad biológica puede determinarse midiendo la actividad de la enzima terapéutica recombinante (por ejemplo, determinando la constante de velocidad catalítica de la enzima terapéutica recombinante midiendo una disminución en la concentración de un sustrato detectable o un aumento en la concentración de un producto detectable (por ejemplo, usando espectrofotometría o emisión de luz). Por ejemplo, la actividad biológica de una galactosidasa terapéutica recombinante se puede detectar midiendo una disminución en el nivel de globotriasilceramida (GL-3) o galabiosilceramida, o un aumento en el nivel de ceramida dihexósido o galactosa.
[0390] Los procesos descritos en el presente documento pueden dar como resultado un porcentaje aumentado de recuperación de la proteína terapéutica recombinante (por ejemplo, porcentaje aumentado de rendimiento de la proteína terapéutica recombinante presente en el medio de cultivo líquido en la sustancia farmacéutica proteica terapéutica). Por ejemplo, los presentes procesos pueden dar como resultado un rendimiento porcentual de proteína terapéutica recombinante de más de aproximadamente un 70 %, más de aproximadamente un 80 %, más de aproximadamente un 82 %, más de aproximadamente un 84 %, más de aproximadamente un 86 %, más de aproximadamente un 88 %, más de aproximadamente un 90 %, más de aproximadamente un 92 %, más de aproximadamente un 94 %, más de aproximadamente un 96 % o más de aproximadamente un 98 %. Los presentes procesos pueden dar como resultado un rendimiento porcentual de entre aproximadamente un 80 % y aproximadamente un 90 %, entre aproximadamente un 82 % y aproximadamente un 90 %, entre aproximadamente un 84 % y aproximadamente un 90 %, entre aproximadamente un 84 % y aproximadamente un 88 %, entre aproximadamente un 84 % y aproximadamente un 94 %, entre aproximadamente un 82 % y aproximadamente un 92 % o entre aproximadamente un 85 % y aproximadamente un 95 %.
[0392] La concentración de proteína terapéutica recombinante presente en la sustancia farmacéutica proteica terapéutica puede ser superior a aproximadamente 1,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 1,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 2,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 2,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 3,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 3,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 4,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 4,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 5,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 5,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 6,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 6,5 mg/ml, más de aproximadamente 7,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 7,5 mg/ml, más de aproximadamente 8,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 8,5 mg/ml, más de aproximadamente 9,0 mg/ml, mayor de aproximadamente 10,0 mg/ml, más de aproximadamente 12,5 mg/ml o mayor de aproximadamente 15,0 mg/ml.
[0393] Los procesos descritos en el presente documento pueden dar como resultado un rendimiento neto de proteína terapéutica recombinante en la sustancia farmacéutica proteica terapéutica de al menos aproximadamente 5 g/día, al menos aproximadamente 6 g/día, al menos aproximadamente 7 g/día, al menos aproximadamente 8 g/día, al menos aproximadamente 9 g/día, al menos aproximadamente 10 g/día, al menos aproximadamente 11 g/día, al menos aproximadamente 12 g/día, al menos aproximadamente 13 g/día, al menos aproximadamente 14 g/día, al menos aproximadamente 15 g/día, al menos aproximadamente 16 g/día, al menos aproximadamente 17 g/día, al menos aproximadamente 18 g/día, al menos aproximadamente 19 g/día, al menos aproximadamente 20 g/día, al menos aproximadamente 25 g/día, al menos aproximadamente 30 g/día, al menos aproximadamente 35 g/día, o al menos aproximadamente 40 g/día durante un periodo continuo de al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 10 días, al menos aproximadamente 15 días, al menos aproximadamente 20 días, al menos aproximadamente 25 días, al menos aproximadamente 30 días, al menos aproximadamente 35 días, al menos aproximadamente 40 días, al menos aproximadamente 45 días, al menos aproximadamente 50 días, al menos aproximadamente 55 días, al menos aproximadamente 60 días, al menos aproximadamente 65 días, al menos aproximadamente 70 días, al menos aproximadamente 75 días, al menos aproximadamente 80 días, al menos aproximadamente 85 días, al menos aproximadamente 90 días, al menos aproximadamente 95 días, al menos aproximadamente 100 días, al menos aproximadamente 110 días, al menos aproximadamente 120 días, al menos aproximadamente 130 días, al menos aproximadamente 140 días, al menos aproximadamente 150 días, al menos aproximadamente 160 días, al menos aproximadamente 170 días, al menos aproximadamente 180 días, al menos aproximadamente 190 días, al menos aproximadamente 200 días, al menos aproximadamente 210 días, al menos aproximadamente 220 días, al menos aproximadamente 230 días, al menos aproximadamente 240 días, al menos aproximadamente 250 días, al menos aproximadamente 260 días, al menos aproximadamente 270 días, al menos aproximadamente 280 días, al menos aproximadamente 290 días, al menos aproximadamente 300 días, al menos aproximadamente 310 días, al menos aproximadamente 320 días, al menos aproximadamente 330 días, al menos aproximadamente 340 días, al menos aproximadamente 350 días, o al menos aproximadamente 365 días.
[0394] Los procesos proporcionados en el presente documento pueden dar como resultado una tasa de productividad específica significativamente mejorada. Por ejemplo, la tasa de productividad específica alcanzada en la sustancia farmacéutica proteica recombinante que es al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 110 veces, 120 veces, 130 veces, 140 veces, 150 veces, 160 veces, 170 veces, 180 veces, 190 veces o 200 veces mayor que la tasa de productividad específica alcanzada usando un proceso diferente (por ejemplo, un proceso de purificación discontinuo o un proceso que no está integrado y/o no es continuo). La productividad en la sustancia farmacéutica proteica recombinante alcanzada mediante los presentes procesos puede ser de al menos 10.000 unidades/l, al menos 15.000 unidades/l, al menos aproximadamente 20.000 unidades/l, al menos aproximadamente 25.000 unidades/l, al menos aproximadamente 30.000 unidades/l, al menos aproximadamente 35.000 unidades/l o al menos aproximadamente 40.000 unidades/l (en el primer y/o segundo medio de cultivo líquido). La productividad en la sustancia farmacéutica proteica recombinante alcanzada mediante los presentes métodos puede ser de al menos 1 g/l, al menos 1,5 g/l, al menos 2,0 g/l, al menos 2,5 g/l, al menos 3,0 g/l, al menos 4,0 g/l, al menos 4,5 g/l, o al menos 5,0 g/l.
[0396] Los procesos descritos en el presente documento también proporcionan una producción eficaz en el tiempo de una sustancia farmacéutica terapéutica a partir de un medio de cultivo líquido. Por ejemplo, el tiempo transcurrido entre la alimentación de un fluido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido) que contiene una proteína terapéutica en el primer PCCS y la elución de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica (que contiene la proteína terapéutica) desde la salida del segundo PCCS es, por ejemplo, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 48 horas, inclusive, por ejemplo, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 28 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 26 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 24 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 22 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 20 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 16 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 20 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 16 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 10 horas y 12 horas, entre aproximadamente 10 horas y 20 horas, entre aproximadamente 10 horas y 18 horas, entre aproximadamente 10 horas y 16 horas, entre aproximadamente 10 horas y 14 horas, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 25 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 35 horas, o entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 30 horas, inclusive. En otros ejemplos, el tiempo transcurrido entre la alimentación del fluido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido) que contiene una proteína terapéutica en el primer PCCS y la elución de una sustancia farmacéutica proteica terapéutica (que contiene la proteína terapéutica) desde la salida del segundo PCCS es, por ejemplo, mayor de 4 horas y es menor de aproximadamente 40 horas, inclusive, por ejemplo, mayor de aproximadamente 4 horas y menor de aproximadamente 39 horas, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 37 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 5 horas, o aproximadamente 4,5 horas, inclusive.
[0397] La invención se describe además en los siguientes ejemplos.
[0398] EJEMPLOS
[0399] Ejemplo de referencia 1. Uso de un solo sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS) en el procesamiento de flujo continuo de una proteína terapéutica recombinante
[0400] Se realizó un conjunto de experimentos iniciales con el fin de evaluar los parámetros necesarios para el uso satisfactorio de un único PCCS en el procesamiento de flujo continuo de una proteína terapéutica recombinante.
[0401] Materiales y métodos
[0402] Cultivo celular
[0403] Se hicieron funcionar biorreactores con un volumen de trabajo de 12 l (Broadley-James Corp., Irvine, CA) en modo de perfusión utilizando el sistema de retención celular ATF (Refine Technologies) con filtros de poliétersulfona de 0,2 µm. Se usaron burbujeadores sinterizados (20 µm) para el gas O<2>para mantener el punto de consigna de O<2>disuelto, y se usaron burbujeadores de orificio perforado (990 µm) para el gas N<2>para mantener el punto de consigna de pCO<2>. La densidad celular en el cultivo celular se monitorizó mediante mediciones fuera de línea (Vi-CELL, Beckman Coulter, Brea, CA) y/o mediante sondas de capacitancia en línea (Futura, Aber Instruments, Grand Island, NY).
[0404] El proceso de cultivo celular del biorreactor utilizó medios de cultivo químicamente definidos y líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) que secretan anticuerpos terapéuticos recombinantes o enzimas humanas terapéuticas recombinantes. La concentración celular en el cultivo del biorreactor inmediatamente después de la inoculación fue de 0,5 × 10<6>células/ml. Las células se dejaron crecer hasta 50-60 × 10<6>células/ml. Una vez que el cultivo alcanzó esta densidad celular, se iniciaron métodos de cultivo celular para mantener la densidad celular en un estado estacionario. La perfusión del cultivo celular comenzó a las 24 h después de la inoculación, a 1 volumen de reactor/día, con la tasa de perfusión aumentada proporcional a la concentración celular en el cultivo. Se mantuvo una tasa de perfusión específica celular en estado estacionario de 0,04-0,05 nl/célula-d. El O<2>disuelto en el biorreactor se mantuvo por encima del 30 % de saturación de aire. El pH en el medio de cultivo se mantuvo entre 6,8 y 6,95 mediante la adición de carbonato de sodio. Se añadió antiespumante (FoamAway, GIBCO, Grand Island, NY) al medio de cultivo líquido para controlar los niveles de espuma. El medio de cultivo líquido obtenido a partir de los biorreactores se bombeó sobre el único PCCS sin clarificación adicional.
[0405] Sistema cromatográfico a contracorriente periódico (PCC) (PCCS)
[0406] El PCCS usado en estos experimentos fue un sistema ÄKTA modificado a medida (GE Healthcare, Piscataway, NJ) capaz de hacer funcionar hasta cuatro columnas. El sistema estaba equipado con cinco monitores UV (UV-900), tres bombas (P-900), múltiples válvulas (PV-908, SV-903), un medidor de pH y un medidor de conductividad (pH/C-900) y software personalizado basado en Unicornio (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
[0407] Curvas de avance
[0408] Se requieren curvas de avance de proteínas para determinar la estrategia de cambio de columna adecuada para el único PCCS. Para obtener curvas de avance en las condiciones de captura, se realizaron experimentos de carga frontal. La capacidad de unión dinámica (DBC) se evaluó en función del tiempo de residencia usando perfiles de cosecha clarificados y de avance medidos por absorbancia UV (280 nm). Se usaron tamaños de columna de 6,0 ml y 1,0 ml para la determinación de DBC para el anticuerpo terapéutico recombinante y la enzima humana terapéutica recombinante, respectivamente. Los tiempos de residencia se seleccionaron de manera que fueran lo suficientemente largos para satisfacer los requisitos de capacidad de unión, garantizando al mismo tiempo que el tiempo de carga fuera más largo que el resto de las operaciones de la columna (lavado, elución, regeneración, etc.). Por consiguiente, el caudal de carga se ajustó para lograr un tiempo de residencia objetivo de 2,5 minutos para el anticuerpo terapéutico recombinante y 4,8 minutos para la enzima humana terapéutica recombinante.Integración del único PCCS al biorreactor
[0409] En los PCCS, el tiempo de residencia (RT) de la proteína en la columna puede disminuirse sin aumentar el tamaño de la columna debido a que el avance de la primera columna en el sistema puede capturarse en la segunda columna en el sistema. Esta característica única se usó para diseñar un proceso continuo de modo que la cosecha de cultivo se pudiera procesar a cualquier tasa de perfusión (D) variando el volumen de columna (V) y RT, como se describe en la Ec.1:
[0411] Para lograr la captura continua de la proteína recombinante, el único PCCS se conectó directamente al biorreactor tal como se muestra en la FIG. 2. La recolección del biorreactor/ATF se bombeó en una bolsa desechable de 2 l que servía como un pequeño depósito de compensación (Hyclone, Logan, UT) usando una bomba peristáltica (Masterflex, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL). Se añadió un filtro de 0,2 µm (Millipack 40, Millipore, Billerica, MA) entre el biorreactor y la bolsa de compensación como una barrera estéril adicional. Se usaron MabSelect Sure (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y un medio cromatográfico de interacción hidrófoba (HIC) en una columna XK16<™>, 1,6 cm × 6 cm (GE Healthcare) para capturar el anticuerpo terapéutico recombinante y la enzima humana terapéutica recombinante, respectivamente). El funcionamiento de cada columna consistió en etapas de equilibrado, carga, lavado, elución y regeneración. Dado que la modificación del único PCCS a escala de laboratorio no permitió el funcionamiento cerrado, se añadió azida sódica a la corriente de proceso en línea.Métodos analíticos
[0412] Anticuerpos terapéuticos recombinantes
[0413] Se usaron ensayos internos para la cuantificación del título de proteínas de la célula hospedadora (HCP), agregación, proteína A residual y potencia de los anticuerpos recombinantes. El título se midió usando una columna de proteína A (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). La proteína A residual y HCP se cuantificaron mediante ELISA usando antígeno y anticuerpos producidos internamente. La agregación se midió mediante HPLC-SEC usando una columna TSK-GEL, G3000SWXL, 7,8 mm × 30 cm, 5 µm (TOSO HAAS, King of Prusia, PA). La potencia del anticuerpo terapéutico recombinante se midió mediante un ensayoin vitrobasado en células.
[0414] Ensayo de actividad de enzima humana terapéutica recombinante
[0415] El título de enzima humana terapéutica recombinante en la carga de columna y eluido se determinó midiendo la tasa de hidrólisis de un sustrato sintético unido a p-nitrofenol (pNP) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Las muestras (25 µl) se incubaron con 225 µl de sustrato 40 µM durante 15 minutos a 37 °C. Las reacciones se enfriaron rápidamente con 250 µl de glicina 0,3 M, pH 105, y la absorbancia se midió a 400 nm. Una unidad de actividad se definió como la cantidad de enzima terapéutica recombinante requerida para hidrolizar un micromol de sustrato para obtener pNP por minuto en las condiciones de ensayo definidas. La concentración de proteína se determinó mediante RP-HPLC usando una columna POROS R2/H 2,1 × 30 mm (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). La actividad específica se expresó como pPNP (unidades)/mg de proteína
[0416] Se usaron ensayos internos para la cuantificación de HCP, agregación y pureza. Se ensayó HCP mediante ELISA usando reactivos patentados. El ensayo de agregación (SEC-HPLC) usó una columna TSK-GEL, G3000SWXL, 7,8 mm × 30 cm, 5 µm (TOSO HAAS, King of Prussia, PA), mientras que el ensayo de pureza RP-HPLC usó una columna YMC Octyl de 2 mm × 100 mm, 5 µm (Waters, Milford, MA).
[0417] Conceptos básicos del único PCCS
[0418] Una operación de columna consiste generalmente en las etapas de carga, lavado, elución y regeneración. En el único PCCS, se usan múltiples columnas para ejecutar las mismas etapas discreta y continuamente de una manera cíclica. Dado que las columnas funcionan en serie, el flujo continuo y el lavado de una columna es capturado por una segunda columna. Esta característica única de los sistemas de PCC permite la carga de la resina cerca de su capacidad de unión estática en lugar de la capacidad de unión dinámica, como es típico durante la cromatografía en modo discontinuo. Sólo para facilitar la ilustración, se usa un sistema de 3 columnas para describir este principio de funcionamiento de PCCS (FIG. 3). Un ciclo se define como tres operaciones de columna completas que dan como resultado tres combinaciones de elución discretas. Una vez completadas todas las etapas en un ciclo, se reinicia el ciclo. Como resultado, la corriente de alimentación se procesa de manera continua en un sistema de PCC operativo, mientras que la elución de proteínas terapéuticas recombinantes de cada columna es discreta y periódica.
[0419] Estrategia de cambio de columna
[0420] Para avanzar de una etapa a otra dentro de un ciclo de PCCS (FIG. 3), se emplea una estrategia de cambio de columna. Hay dos operaciones de cambio automáticas requeridas por columna en el PCCS, la primera de las cuales está relacionada con el avance inicial de la proteína terapéutica recombinante, mientras que la segunda coincide con la saturación de la columna. El único PCCS descrito en este ejemplo se hizo funcionar usando una estrategia de control que utilizaba una monitorización UV dinámica. En general, el cambio de columna se puede determinar mediante cualquier herramienta de Tecnología Analítica de Procesos (PAT) capaz de medir en línea la concentración de proteína terapéutica recombinante con control de retroalimentación. Sin embargo, una herramienta PAT que funciona en tiempo real, como UV, es ideal para proporcionar la señal de activación para la conmutación de columna.
[0421] La FIG. 4 ilustra el principio de cambio de columna basado en la diferencia de absorbancia UV (ΔUV) entre la entrada de alimentación y la salida de la columna. Durante la carga de la columna (etapa 1; FIG.3), el sistema de control de PCC determina la línea basal de impurezas cuando la absorbancia se estabiliza. A medida que avanza la proteína terapéutica recombinante (etapa 2; FIG.3), hay un aumento en la señal UV de salida por encima de la línea basal de impureza. En el punto en que ΔUV ha alcanzado un umbral predeterminado (tal como un 3 % de ruptura de la proteína terapéutica recombinante), el flujo continuo desde la columna 1 se dirige a la columna 2 en lugar de a desechos (t1; FIG.4). Cuando la columna 1 está casi saturada con proteína terapéutica recombinante y el ΔUV ha alcanzado un valor predeterminado (t2; FIG.4), la alimentación se cambia a la columna 2. Una ventaja importante de esta estrategia de cambio de columna basada en ΔUV es que permite una carga uniforme de las columnas independientemente de la concentración de producto terapéutico recombinante de alimentación y la capacidad de la columna. Dentro de un intervalo razonable, la estrategia es adecuada para la variabilidad del título de recogida, mejorando así la robustez del sistema.
[0422] La determinación precisa del tiempo de cambio de columna, que se basa en la diferencia de absorbancia UV entre la alimentación y la salida de la columna, es uno de los elementos críticos de la estrategia de control en tiempo real del único PCCS. Esto requiere la sincronización de los cinco detectores de UV (un único detector de alimentación y cuatro detectores de salida de la columna) dentro de un intervalo estrecho. Los detectores UV se calibraron usando una disolución de acetona al 3 %. Las longitudes de trayectoria del detector se ajustaron manualmente de modo que los cinco valores de absorbancia estaban dentro del 0,5 % entre sí. El ajuste de la longitud de trayectoria fue ≤ 10 %.
[0423] Viabilidad usando un anticuerpo recombinante
[0424] Cultivo celular
[0425] El anticuerpo terapéutico recombinante modelo para este estudio se produjo de manera continua durante un periodo de 70 días en un biorreactor de perfusión de 12 l en las condiciones descritas en Materiales y métodos (FIG.5). La tasa de productividad volumétrica alcanzó 1 g/l-d entre los días 30 y 40, luego disminuyó lentamente por razones que aún no se han determinado. La tasa de productividad volumétrica máxima fue >5 veces mayor que el proceso semicontinuo usando la misma línea celular, con un potencial ascendente significativo para el proceso continuo. Cabe señalar que el objetivo del estudio era demostrar la funcionalidad del sistema continuo integrado. De hecho, el cambio de la tasa de producción volumétrica permitió comprobar la robustez del único PCCS y, en particular, su capacidad para manejar la variabilidad del título de cosecha.
[0426] Aguas abajo
[0427] En la cromatografía discontinua, la DBC máxima se consigue aumentando el tiempo de residencia (RT) y posteriormente sobredimensionando la columna. En los PCCS, el RT puede disminuirse sin aumentar el tamaño de la columna debido a que el avance desde la primera columna puede capturarse en la segunda columna. Esta ventaja en PCCS permite tamaños de columna más pequeños y RT más cortos. Para que el único proceso de PCCS sea continuo, el RT debe ser más largo que el tiempo combinado que tarda el resto del proceso (equilibrado, lavado, elución, regeneración, etc.). Por lo tanto, el tamaño y el número de columnas a usar con un PCCS para un proceso dado dependen de la capacidad de unión de la resina, que dicta la longitud de la etapa de carga. La alta capacidad de unión de la resina MabSelect SuRe<™>en el proceso de anticuerpos recombinantes (50 g/l) conduce a una etapa de carga que es más larga que el resto de las etapas de columna combinadas, que permite la captura continua de proteínas terapéuticas recombinantes usando un PCCS que contiene tres columnas. Se utilizaron experimentos de carga frontal para determinar las curvas de avance en diferentes tiempos de residencia para el anticuerpo recombinante (datos no mostrados), y se encontró que era óptimo un tiempo de residencia de 2,5 minutos.
[0428] Para probar el rendimiento a largo plazo del único PCCS, la recolección de biorreactores se capturó continuamente durante 30 días, lo que corresponde a 38 ciclos de PCC y 110 operaciones en columna, sin ninguna indicación de disminución del rendimiento basada en el tiempo. La consistencia de la captura continua durante la duración del estudio se evaluó basándose en varios indicadores de rendimiento, tales como perfil cromatográfico, recuperaciones y atributos de calidad crítica de anticuerpos recombinantes (CQA). El perfil UV de la corriente de alimentación fue casi constante durante la duración de la ejecución, y las 3 salidas UV de columna fueron reproducibles a lo largo de varios ciclos. La recuperación y cinco CQA analizados para el eluido de captura fueron comparables entre las 3 columnas, así como durante todo el periodo de captura continua de la cosecha (FIG.6). Estos resultados demostraron la viabilidad de la captura directa continua de anticuerpos recombinantes a partir de un biorreactor de perfusión, produciendo indicadores de rendimiento del proceso consistentes y CQA durante un periodo de tiempo prolongado.
[0429] El único proceso de PCCS se comparó con un sistema de cromatografía discontinua de una sola columna existente en términos de la huella de columna cromatográfica estimada y el consumo de materia prima. Específicamente, la utilización de la capacidad del medio de cromatografía se incrementó en un 20 %, el uso del tampón se redujo en un 25 % y el tamaño de la columna individual se redujo 75 veces, en el único PCCS en comparación con la purificación en modo discontinuo.
[0430] Viabilidad con enzima humana recombinante
[0431] Cultivo celular
[0432] La enzima humana terapéutica recombinante en este estudio se produjo durante un cultivo continuo de 70 días en un biorreactor de 12 l en las condiciones descritas en Materiales y métodos (FIG. 7). La tasa de productividad volumétrica alcanzó 0,4 g/l-d alrededor del día 25, y permaneció estable después de eso con un CV del 16 %, en gran medida relacionada con la variabilidad del ensayo. En comparación con el proceso heredado para la fabricación de la misma molécula, esta productividad volumétrica es ~40 veces mayor, lo que es el resultado del impacto sinérgico de la alta densidad celular y la tasa de producción específica de células significativamente mejorada.
[0433] Aguas abajo
[0434] El objetivo de este estudio fue determinar la consistencia de los indicadores de rendimiento de la columna de captura, CQA del eluido de captura a través de las columnas y ciclos, y la robustez del hardware del único PCCS y la estrategia de control durante largos periodos de tiempo. Dado que la capacidad de unión de la columna de captura de HIC era baja (1 g/l de resina), el tiempo requerido para cargar una columna fue más corto que el resto de las etapas del proceso combinadas (lavado, elución, regeneración, etc.). Esto dio como resultado un único PCCS en el que se necesitaban 4 columnas, en lugar de 3 columnas, para que la cosecha se procesara continuamente. Por lo tanto, se desarrolló un único PCCS de 4 columnas y se usó para capturar continuamente la enzima humana recombinante.
[0435] El estudio se dividió en dos fases. La primera fase consistió en el desarrollo del método, en el que la cosecha previamente recogida se alimentaba al único PCCS de una bolsa desechable estéril. Durante la segunda fase, el único PCCS se integró directamente con el biorreactor para el procesamiento continuo, como se describe en la FIG. 2. En la primera fase de este estudio, el único PCCS se hizo funcionar continuamente durante 9 días y 41 ciclos del único PCCS o 164 operaciones en columna. El perfil UV de la alimentación fue constante durante toda la ejecución, y las señales UV de salida de 4 columnas fueron razonablemente consistentes entre las 4 columnas y a lo largo de los diversos ciclos. La consistencia de la operación del único PCCS durante toda la serie se demostró mediante el análisis de indicadores de rendimiento de columna adicionales y CQA de la proteína terapéutica recombinante capturada (FIG.8). La recuperación y los cinco CQA analizados fueron comparables entre las cuatro columnas durante el periodo de 9 días de captura continua de la cosecha.
[0436] En la segunda fase de este estudio, la proteína terapéutica recombinante se capturó directamente a partir de un biorreactor de perfusión integrando el único PCCS con el biorreactor, como se muestra en la FIG. 2. El objetivo principal fue demostrar el rendimiento de la plataforma de bioprocesamiento continuo con una proteína altamente compleja no de anticuerpo durante un periodo de tiempo prolongado. El tamaño de la columna y el RT se escalaron según la Ecuación 1 con el fin de lograr la captura continua de la cosecha del biorreactor. El único PCCS integrado se hizo funcionar continuamente durante 31 días y 160 ciclos del único PCCS, lo que corresponde a 640 operaciones de columna independientes, sin ningún signo de disminución del rendimiento basado en el tiempo. El perfil UV de alimentación, los perfiles UV de salida de 4 columnas y CQA fueron consistentes durante toda la duración de la operación de PCCS. Dado que los datos fueron prácticamente equivalentes a los obtenidos en la primera fase del estudio, no se muestran los perfiles de tiempo.
[0437] En resumen, estos datos indican que se puede usar un único PCCS para procesar proteínas terapéuticas recombinantes (tanto anticuerpos terapéuticos recombinantes como enzimas humanas terapéuticas recombinantes) producidas por un cultivo de células de mamífero.
[0438] Ejemplo 2. Uso de dos sistemas de cromatografía de contracorriente periódica (PCCS) en el procesamiento de flujo continuo de una proteína recombinante
[0439] Se generó un sistema que usa dos PCCS diferentes que permite el bioprocesamiento continuo de un anticuerpo terapéutico recombinante a partir de un medio de cultivo celular de un biorreactor. El eluido del sistema que contiene el anticuerpo terapéutico recombinante está sustancialmente listo para su formulación como una composición farmacéutica y es una sustancia farmacéutica proteica terapéutica no formulada.
[0440] Materiales y métodos
[0441] Cultivo celular
[0442] Se hicieron funcionar biorreactores con un volumen de trabajo de 10 l (Broadley-James Corp., Irvine, CA) en modo de perfusión utilizando el sistema de retención celular ATF (Refine Technologies) con filtros de poliétersulfona de 0,2 µm. Se usaron burbujeadores sinterizados (20 µm) para el gas O<2>para mantener el punto de consigna de O<2>disuelto, y se usaron burbujeadores de orificio perforado (990 µm) para el gas N<2>para mantener el punto de consigna de pCO<2>en el medio de cultivo. La densidad celular en el biorreactor se monitorizó mediante mediciones fuera de línea (Vi-CELL, Beckman Coulter, Brea, CA) y/o mediante sondas de capacitancia en línea (Futura, Aber Instruments, Grand Island, NY).
[0443] Las series del proceso de cultivo celular en el biorreactor utilizaron medios de cultivo líquidos definidos químicamente y una línea celular CHO que producía un anticuerpo monoclonal terapéutico recombinante. Después de la inoculación, los biorreactores contenían en el medio de cultivo líquido una concentración celular viable de 0,5 × 10<6>células/ml. Las células se dejaron crecer hasta una densidad celular de 30-40× 10<6>células/ml. Una vez que las células alcanzaron esta densidad, se iniciaron métodos de cultivo celular para mantener la densidad celular en estado estacionario. La perfusión comenzó 24 h después de la inoculación, y el volumen de medio de cultivo líquido extraído y reemplazado en el biorreactor aumentó proporcionalmente con la concentración celular. Se mantuvo una tasa de perfusión específica celular en estado estacionario de 0,04-0,05 nl/célula-d. El O<2>disuelto se mantuvo por encima del 30 % de saturación de aire en el medio de cultivo líquido. El pH del medio de cultivo líquido se mantuvo entre 6,8 y 6,95 mediante la adición de carbonato de sodio. Se usó antiespumante (FoamAway, GIBCO, Grand Island, NY) para controlar los niveles de espuma en el biorreactor. El medio de cultivo líquido recogido de los biorreactores se bombeó sobre los dos sistemas de PCC sin clarificación adicional.
[0444] Aguas abajo
[0445] Con el fin de desarrollar un proceso integrado y completamente continuo para la producción de sustancia farmacéutica proteica recombinante (DS), se usaron dos PCCS (PCCS1 y PCCS2) (FIG. 9). Cada PCCS realizó múltiples operaciones además de permitir el uso de cromatografía en contracorriente periódica para operaciones continuas en columna. Dado que la modificación del PCCS a escala de laboratorio no permitió el funcionamiento cerrado, se añadió azida sódica a la corriente de proceso en línea. Esta limitación del sistema a pequeña escala puede ser abordada con éxito mediante el diseño adecuado de hardware para PCCS a gran escala.
[0446] Dos sistemas de cromatografía en contracorriente periódica (PCC)
[0447] Los dos PCCS usados en este estudio fueron un ÄKTA modificado a medida (GE Healthcare, Piscataway, NJ) capaz de hacer funcionar hasta cuatro columnas. Cada sistema estaba equipado con cinco monitores UV (UV-900), tres bombas (P-900), múltiples válvulas (PV-908, SV-903), un medidor de pH y un medidor de conductividad (pH/C-900) y software personalizado basado en Unicornio (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
[0448] Integración de biorreactor a PCCS1 y PCCS2
[0449] La recolección del biorreactor/ATF se bombeó en una bolsa desechable de 2 l que servía como un pequeño depósito de compensación (Hyclone, Logan, UT) usando una bomba peristáltica (Masterflex, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL). Se añadió un filtro de 0,2 µm (Millipack 40, Millipore, Billerica, MA) entre el biorreactor y la bolsa de compensación como una barrera estéril adicional. Se usó medio cromatográfico MabSelect SuRe (GE Healthcare, Piscataway, NJ) en una columna XK16<™>, 1,6 cm × 6 cm para capturar el anticuerpo monoclonal terapéutico recombinante. El eluido de cada columna de proteína A (pH 3,75) se bombeó en un depósito de vidrio con agitación de 250 ml con un tiempo de residencia de 1 h para realizar una operación de inactivación vírica (VI). Se añadió un filtro de 0,2 µm (Millipack 100, Millipore, Billerica, MA) entre PCCS1 y PCCS2 para actuar como un dispositivo de mezcla y una barrera de partículas para columnas aguas abajo.
[0450] El material de carga ajustado de PCCS1 se purificó adicionalmente en PCCS2, usando tres columnas de cromatografía XK16TM, 1,1 cm × 7 cm (GE Healthcare) Capto S (GE Healthcare, Piscataway, NJ) en un modo de unión y elución. Finalmente, se pulió el eluido de Capto S usando una membrana SartoBind Q de 7 ml (Sartorious XX), conectada directamente a salidas de columna Capto-S para proporcionar una sustancia farmacéutica proteica recombinante. Además, la dilución en línea requerida antes de la carga en la membrana Capto-S y SartoBind Q se realizó usando bombas de PCCS1 y PCCS2 respectivamente (FIG.9). Cada operación de la columna consistió en etapas de equilibrado, carga, lavado, elución y regeneración. La membrana Sartobind Q consistió en etapas de equilibrado, carga, lavado y regeneración. Las Tablas 1 y 2 muestran los parámetros del proceso para todas las operaciones unitarias realizadas usando PCCS1 y PCCS2, respectivamente. La FIG.9 también muestra el caudal de los líquidos bombeados a través de las dos PCCS.
[0451] Tabla 1. Parámetros o erativos del rimer PCCS PCCS1
[0452]
[0453] Tabla 2. Parámetros o erativos ara el se undo PCCS PCCS2
[0455]
[0457] Métodos analíticos
[0458] Se usaron ensayos internos para la cuantificación del título de proteínas de células hospedadoras (HCP), agregación, proteína A residual y potencia de anticuerpos monoclonales recombinantes. El título se midió usando una columna de proteína A (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). La proteína A residual y HCP se cuantificaron mediante ELISA usando antígeno y anticuerpos producidos internamente. La agregación se midió mediante HPLC-SEC usando una columna TSK-GEL, G3000SWXL, 7,8 mm × 30 cm, 5 µm (TOSO HAAS, King of Prusia, PA). La potencia del anticuerpo monoclonal terapéutico recombinante se midió mediante un ensayo basado en célulasin vitro.
[0459] Estrategia de cambio de columna
[0460] Para avanzar de una etapa a otra dentro de un ciclo de PCCS (FIG. 3), se emplea una estrategia de cambio de columna. Hay dos operaciones de cambio automáticas requeridas por columna en cada PCC, la primera de las cuales está relacionada con el avance inicial de la proteína terapéutica recombinante, mientras que la segunda coincide con la saturación de la columna. El sistema de PCC descrito en este trabajo se hizo funcionar usando una estrategia de control novedosa utilizando monitorización UV dinámica, así como cambio basado en el tiempo. En general, el cambio de columna se puede determinar mediante cualquier herramienta de PAT capaz de medir en línea la concentración de proteína terapéutica recombinante con control de retroalimentación.
[0461] La FIG. 4 ilustra el principio de cambio de columna basado en la diferencia de absorbancia UV (ΔUV) entre la entrada de alimentación y la salida de la columna. Durante la carga de la columna (etapa 1; FIG.3), el sistema de control de PCC determina la línea basal de impurezas cuando la absorbancia se estabiliza. A medida que avanza la proteína terapéutica recombinante (etapa 2; FIG.3), hay un aumento en la señal UV de salida por encima de la línea basal de impureza. En el punto en que ΔUV ha alcanzado un umbral predeterminado (tal como un 3 % de ruptura de la proteína terapéutica recombinante), el flujo continuo desde la columna 1 se dirige a la columna 2 en lugar de a desechos (t1; FIG.4). Cuando la columna 1 está casi saturada con proteína terapéutica recombinante y el ΔUV ha alcanzado un valor predeterminado (t2; FIG.4), la alimentación se cambia a la columna 2. Una ventaja importante de esta estrategia de cambio de columna basada en ΔUV es que permite una carga uniforme de las columnas independientemente de la concentración de proteína terapéutica recombinante en la alimentación y la capacidad de la columna. Dentro de un intervalo razonable, la estrategia es adecuada para la variabilidad del título de recogida, mejorando así la robustez del sistema.
[0462] Como se ha abordado anteriormente, la determinación precisa del tiempo de cambio de columna, que se basa en la diferencia de absorbancia UV entre la alimentación y la salida de la columna, es uno de los elementos críticos de la estrategia de control en tiempo real de la PCC. Esto requiere la sincronización de los cinco detectores de UV (un único detector de alimentación y cuatro detectores de salida de la columna) dentro de un intervalo estrecho. Los detectores UV se calibraron usando una disolución de acetona al 3 %. Las longitudes de trayectoria del detector se ajustaron manualmente de modo que los cinco valores de absorbancia estaban dentro del 0,5 % entre sí. El ajuste de la longitud de trayectoria fue ≤ 10 %.
[0463] La segunda estrategia usada para el cambio de columna fue con respecto al tiempo. Dado que el título de proteína terapéutica recombinante a lo largo de 31 días de producción era un estado cuasi estable, el cambio de columna se pudo calcular basándose en el tiempo que tardó para el umbral predeterminado, así como la saturación.Resultados y discusión
[0464] Para evaluar el rendimiento a largo plazo de los dos sistemas de PCC, el medio de cultivo líquido recolectado del biorreactor se purificó continuamente durante 31 días, lo que corresponde a 372 ciclos de purificación, o 25 lotes de producción de dos sistemas de PCC, sin ninguna indicación de disminución del rendimiento basada en el tiempo. La consistencia de la captura continua durante la duración del estudio se evaluó basándose en varios indicadores de rendimiento, tales como perfil cromatográfico, recuperaciones y atributos de calidad crítica (CQA) de anticuerpos monoclonales terapéuticos recombinantes. El perfil UV de la corriente de alimentación fue casi constante durante la duración de la ejecución, y las 3 salidas UV de columna fueron reproducibles a lo largo de varios ciclos. Estos detalles y la reproducibilidad de ciclo a ciclo se demuestran en la captura de pantalla del cromatograma de la serie mostrada en las Figuras 12-14. La recuperación y cinco CQA analizados para el eluido de captura fueron comparables entre las 3 columnas, así como durante todo el periodo de captura continua de la cosecha (FIG.16). Estos resultados demuestran la viabilidad de la captura directa continua de anticuerpos monoclonales terapéuticos recombinantes a partir de un biorreactor de perfusión usando un sistema de dos PCC, produciendo indicadores de rendimiento del proceso consistentes y CQA durante un periodo de tiempo prolongado. Se usó un anticuerpo monoclonal terapéutico recombinante modelo para estudiar la viabilidad de una plataforma de bioprocesamiento completamente continua usando un sistema integrado de dos PCC.
[0465] Viabilidad usando un mAb
[0466] Cultivo celular
[0467] El anticuerpo monoclonal terapéutico recombinante modelo para este estudio se produjo de manera continua durante un periodo de 59 días en un biorreactor de perfusión de 12 l en las condiciones descritas en Materiales y métodos. La productividad volumétrica se mantuvo entre 1,0 - 1,6 g/l desde el día 10 hasta el día 59. La productividad volumétrica pico fue ~ 8 veces mayor que el proceso semicontinuo usando la misma línea celular, con un potencial ascendente significativo para el proceso continuo optimizando la velocidad de perfusión y/o aumentando la densidad celular en estado estacionario (Figuras 11 y 12). Cabe señalar que el objetivo del estudio era demostrar la funcionalidad del sistema continuo integrado. De hecho, el cambio de la tasa de producción volumétrica permitió comprobar la robustez de los sistemas de PCC y, en particular, su capacidad para manejar la variabilidad del título de cosecha.
[0468] Aguas abajo
[0469] El objetivo principal fue demostrar el rendimiento de la plataforma de bioprocesamiento continuo con un anticuerpo monoclonal terapéutico recombinante usando un sistema de dos PCC integrado durante un periodo de tiempo prolongado. El tamaño de la columna/membrana y el tiempo de residencia tanto para la columna de proteína A como de intercambio catiónico se escalaron para lograr el procesamiento continuo de la recolección del biorreactor para una sustancia farmacéutica (DS) no formulada. El sistema integrado se hizo funcionar de manera continua durante 31 días, lo que corresponde a 15 lotes de DS independientes no formulados (el lote se define como 1,25 días de procesamiento, 15 filtrados de membrana Q o 0,8 g de DS), sin ningún signo de disminución del rendimiento basada en el tiempo. El perfil UV de alimentación, los perfiles UV de salida de 3 columnas para la captura de proteína A y Capto-S, así como los filtrados de membrana Sartobind Q, fueron constantes durante toda la duración de la operación del biorreactor integrado-PCC1-PCC2 (Figuras 12-14). Además, todos los CQA para DS no formuladas fueron consistentes durante toda la duración de la operación de PCC (Figuras 15 y 16). Las ventajas de uso del sistema de dos PCC continuo integrado para la producción de anticuerpos monoclonales terapéuticos recombinantes en comparación con los procesos de purificación discontinua existentes incluyen un aumento en la productividad volumétrica, un aumento en la utilización de la capacidad de medio cromatográfico, una disminución en el volumen del uso de tampón y una disminución en el volumen del tamaño de la columna individual.
[0470] Implementación de la plataforma de biofabricación completamente continua
[0471] Actualmente, existen dos plataformas dominantes para la fabricación biofarmacéutica: (1) biorreactores de perfusión y (2) biorreactores semicontinuos para la producción de proteínas estables. En ambos casos, los sistemas ejemplares no limitativos descritos en el presente documento proporcionan una operación de biorreactor seguida de múltiples operaciones de unidades discontinuas, que incluyen etapas de clarificación, captura, cromatografía de pulido y retención. La tecnología de producción completamente continua ejemplar descrita en este ejemplo permite la producción de proteínas terapéuticas recombinantes optimizada. Como se demuestra en este ejemplo, este sistema ejemplar en combinación con clones de alta producción y medios químicamente definidos puede lograr una densidad celular muy alta y una productividad volumétrica mientras funciona en estado estacionario. Como resultado, se puede lograr una capacidad de producción suficiente con biorreactores más pequeños (<500 l) frente a procesos tradicionales donde las escalas de reactores superan los 10.000 l. El uso del dispositivo de separación de células ATF elimina la operación unitaria de clarificación. Lo más importante es que la integración directa de la producción totalmente continua hace que los tanques de retención de cosecha queden obsoletos, y reemplaza la columna de captura de lotes grande con columnas de hasta 2 órdenes de magnitud más pequeñas usadas en el sistema continuo. Además, el procesamiento continuo del medio de cultivo líquido recolectado confiere ventajas significativas con respecto a la calidad de la proteína terapéutica recombinante. Específicamente, la eliminación de la cosecha y otras etapas de retención disminuye la exposición de proteínas terapéuticas recombinantes objetivo a degradación enzimática, química y física, y de este modo mitiga los riesgos de estabilidad de proteínas terapéuticas recombinantes. En resumen, el desarrollo satisfactorio de la plataforma de bioprocesamiento totalmente continuo a pequeña escala para la fabricación de anticuerpos monoclonales recombinantes abre el potencial para su implementación industrial a gran escala. Estos datos muestran que el sistema de bioprocesamiento completamente continuo e integrado ejemplar ofrece ventajas únicas respecto a los enfoques tradicionales para la fabricación de proteínas terapéuticas recombinantes. Por ejemplo, las Tablas 3 y 4 que figuran a continuación enumeran algunas de las ventajas proporcionadas por el proceso y sistema ejemplares descritos en este ejemplo.
[0472] Ejemplo 3. Sistema de dos PCC ejemplar que incluye un biorreactor de 500 l
[0473] El método y el sistema descritos a continuación se pueden usar para realizar el bioprocesamiento continuo de una proteína terapéutica recombinante recolectada de un cultivo de biorreactor de 500 l.
[0474] Materiales y métodos
[0475] Cultivo celular
[0476] Los biorreactores con un volumen de trabajo de 500 l se hacen funcionar en modo de perfusión utilizando el sistema de retención celular ATF (Refine Technologies) con filtros de poliétersulfona de 0,2 µm. Se usan burbujeadores sinterizados (20 µm) para el gas O<2>para mantener el punto de consigna de O<2>disuelto, y se usan burbujeadores de orificio perforado (990 µm) para el gas N<2>para mantener el punto de consigna de pCO<2>. La densidad celular en el cultivo celular se monitoriza mediante mediciones fuera de línea (Vi-CELL, Beckman Coulter, Brea, CA) y/o mediante sondas de capacitancia en línea (Futura, Aber Instruments, Grand Island, NY).
[0477] Tabla 3. Ventajas ejemplares de dos sistemas de PCC
[0478]
[0480] Capacidad de resinaNormalizad 100 120 110
[0481] as (%)
[0482] Uso de tampónNormalizad 100 75 80
[0483] as (%)
[0484] VolumenNormalizad 100 3,9 (X 3) 4,7 (X)
[0485] as (%)
[0486] Columna DiámetroNormalizad 100 16 40
[0487] as (%)
[0488] AlturaNormalizad 100 47 30
[0489] as (%)
[0491] Tabla 4. Ventaas eem lares de dos sistemas de PCC
[0493]
[0495] Tiempo de ciclo aguas 1 volumen BRX / 14 días 1 volumen BRX / 12 horas
[0496] arriba
[0497] Tiempo de ciclo aguas Días-meses ~10 horas
[0498] abajo
[0499] Productividad ~0.1-0.2 ~1.2
[0500] volumétrica (g/l-día)
[0501] Automatización Modo de lote, operaciones Completamente
[0502] unitarias discretas automático
[0503] Número total de 9 (cosecha, 3 (PCC1, PCC2 y filtración
[0504] operaciones unitarias centrifugación, filtración vírica)
[0505] aguas abajo en profundidad, Pro A, VI,
[0506] Capto S, Capto Q,
[0507] filtración vírica, filtración
[0508] estéril)
[0509] Etapas de mantenimiento 9 Ninguna
[0511] El proceso de cultivo celular del biorreactor utiliza medios de cultivo químicamente definidos y líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) que secretan anticuerpos recombinantes o enzimas humanas recombinantes. La concentración celular en el cultivo del biorreactor inmediatamente después de la inoculación es de 0,5 × 10<6>células/ml. Las células se dejan crecer hasta 50-60 × 10<6>células/ml. Una vez que el cultivo alcanza esta densidad celular, se inician métodos de cultivo celular para mantener la densidad celular en un estado estacionario. La perfusión del cultivo celular comienza a las 24 h después de la inoculación, a 1 volumen de reactor/día, con la tasa de perfusión aumentada proporcional a la concentración celular en el cultivo. Se mantiene una tasa de perfusión específica celular en estado estacionario de 0,04-0,05 nl/célula-d. El O<2>disuelto en el biorreactor se mantiene por encima del 30 % de saturación de aire. El pH en el medio de cultivo se mantiene entre 6,8 y 6,95 mediante la adición de carbonato de sodio. Se añade antiespumante (FoamAway, GIBCO, Grand Island, NY) al medio de cultivo líquido para controlar los niveles de espuma. El medio de cultivo líquido obtenido a partir de los biorreactores se bombea sobre el sistema de PCC única sin clarificación adicional.
[0513] Sistemas de cromatografía en contracorriente periódica (PCC)
[0515] Los sistemas de PCC que se usan en estos experimentos son un sistema ÄKTA modificado a medida (GE Healthcare, Piscataway, NJ) capaz de hacer funcionar hasta cuatro columnas. El sistema está equipado con cinco monitores UV (UV-900), tres bombas (P-900), múltiples válvulas (PV-908, SV-903), un medidor de pH y un medidor de conductividad (pH/C-900) y software personalizado basado en Unicornio (GE Healthcare, Piscataway, NJ). El primer PCCS es un PCCS de cuatro columnas, donde las tres primeras columnas contienen una resina de unión a proteína A y realizan la operación unitaria de captura de la proteína terapéutica recombinante de un fluido, y la cuarta columna realiza la operación unitaria de inactivación de virus presentes en un fluido (por ejemplo, capaz de mantener el fluido durante aproximadamente 1 horas a un pH de 3,75). El segundo PCCS contiene un total de tres columnas cromatográficas que realizan la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante (que contiene una resina de intercambio catiónico) y una membrana cromatográfica que realiza la operación unitaria de pulido (que contiene una resina de intercambio catiónico). Las tasas de flujo específicas y otras propiedades del primer y segundo sistemas de PCC que se van a usar para producir de manera continua una sustancia farmacéutica proteica recombinante se muestran en las Tablas 5 y 6, respectivamente.
[0516] Tabla 5. Parámetros o erativos ara el rimer PCCS
[0517]
[0518] Tabla 6. Parámetros o erativos ara el se undo PCCS
[0520]
[0522] Curvas de avance
[0523] Se requieren curvas de avance de proteínas para determinar la estrategia de cambio de columna adecuada para cada sistema de PCC. Para obtener curvas de avance en las condiciones de captura, se realizan experimentos de carga frontal. La capacidad de unión dinámica (DBC) es evalúa en función del tiempo de residencia usando perfiles de cosecha clarificados y de avance medidos por absorbancia UV (280 nm). Se usan tamaños de columna de 6,0 ml y 1,0 ml para la determinación de DBC para anticuerpos terapéuticos recombinantes y la enzima humana terapéutica recombinante, respectivamente. Los tiempos de residencia se seleccionan de manera que sean lo suficientemente largos para satisfacer los requisitos de capacidad de unión, garantizando al mismo tiempo que el tiempo de carga sea más largo que el resto de las operaciones de la columna (lavado, elución, regeneración, etc.).
[0524] Integración del sistema de PCC única al biorreactor
[0525] En los sistemas de PCC, el tiempo de residencia (RT) de la proteína en la columna puede disminuirse sin aumentar el tamaño de la columna debido a que el avance de la primera columna en el sistema puede capturarse en la segunda columna en el sistema. Esta característica única es usa para diseñar un proceso continuo de modo que la cosecha de cultivo se pudiera procesar a cualquier tasa de perfusión (D) variando el volumen de columna (V) y RT, como se describe en la Ec.1:
[0527] Para lograr la captura continua de la proteína recombinante, el primer y único PCCS se conecta directamente al biorreactor tal como se muestra en la FIG. 2. La recolección del biorreactor/ATF sea bombea en una bolsa desechable de 2 l que servía como un pequeño depósito de compensación (Hyclone, Logan, UT) usando una bomba peristáltica (Masterflex, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL). Se añade un filtro de 0,2 µm (Millipack 40, Millipore, Billerica, MA) entre el biorreactor y la bolsa de compensación como una barrera estéril adicional. Se usa la columna MabSelect SuRe (GE Healthcare, Piscataway, NJ) para capturar el anticuerpo terapéutico recombinante y la enzima humana terapéutica recombinante, respectivamente). El funcionamiento de cada columna consiste en etapas de equilibrado, carga, lavado, elución y regeneración. Dado que la modificación del sistema de PCC única a escala de laboratorio no permite el funcionamiento cerrado, es añade azida sódica a la corriente de proceso en línea.
[0528] Métodos analíticos
[0529] Anticuerpos recombinantes
[0530] Se usan ensayos internos para la cuantificación del título de proteínas de la célula hospedadora (HCP), agregación, proteína A residual y potencia de los anticuerpos recombinantes. El título es mide usando una columna de proteína A (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). La proteína A residual y HCP se cuantifican mediante ELISA usando antígeno y anticuerpos producidos internamente. La agregación se mide mediante HPLC-SEC usando una columna TSK-GEL, G3000SWXL, 7,8 mm × 30 cm, 5 µm (TOSO HAAS, King of Prusia, PA). La potencia del anticuerpo recombinante se mide mediante un ensayoin vitrobasado en células.
[0531] Conceptos básicos del sistema de PCC única
[0532] Una operación de columna consiste generalmente en las etapas de carga, lavado, elución y regeneración. En cada sistema de PCC, se usarán múltiples columnas para ejecutar las mismas etapas discreta y continuamente de una manera cíclica. Dado que las columnas funcionan en serie, el flujo continuo y el lavado de una columna es capturado por una segunda columna. Esta característica única de los sistemas de PCC permite la carga de la resina cerca de su capacidad de unión estática en lugar de la capacidad de unión dinámica, como es típico durante la cromatografía en modo discontinuo. Para facilitar la ilustración, se usa un sistema de 3 columnas para describir este principio de funcionamiento del sistema de PCC (FIG.3). Un ciclo se define como tres operaciones de columna completas que dan como resultado tres combinaciones de elución discretas. Una vez completadas todas las etapas en un ciclo, se reinicia el ciclo. Como resultado, la corriente de alimentación se procesa de manera continua en un sistema de PCC operativo, mientras que la elución de proteínas terapéuticas recombinantes de cada columna es discreta y periódica.
[0533] Estrategia de cambio de columna
[0534] Para avanzar de una etapa a otra de un ciclo del sistema de PCC (FIG.3), se emplea una estrategia de cambio de columna. Hay dos operaciones de cambio automáticas requeridas por columna en el sistema de PCC, la primera de las cuales está relacionada con el avance inicial de la proteína terapéutica recombinante, mientras que la segunda coincide con la saturación de la columna. Cada sistema de PCC única descrito en este ejemplo se hace funcionar usando una estrategia de control que utiliza monitorización UV dinámica. En general, el cambio de columna se puede determinar mediante cualquier herramienta de Tecnología Analítica de Procesos (PAT) capaz de medir en línea la concentración de proteína terapéutica recombinante con control de retroalimentación. Sin embargo, una herramienta PAT que funciona en tiempo real, tal como UV, es ideal para proporcionar la señal de activación para el cambio de columna.
[0535] La FIG. 4 ilustra el principio de cambio de columna basado en la diferencia de absorbancia UV (ΔUV) entre la entrada de alimentación y la salida de la columna. Durante la carga de la columna (etapa 1; FIG.3), el sistema de control de PCC determina la línea basal de impurezas cuando la absorbancia se estabiliza. A medida que avanza la proteína terapéutica recombinante (etapa 2; FIG.3), hay un aumento en la señal UV de salida por encima de la línea basal de impureza. En el punto en que ΔUV ha alcanzado un umbral predeterminado (tal como un 3 % de ruptura de la proteína terapéutica recombinante), el flujo continuo desde la columna 1 se dirige a la columna 2 en lugar de a desechos (t1; FIG.4). Cuando la columna 1 está casi saturada con proteína terapéutica recombinante y el ΔUV ha alcanzado un valor predeterminado (t2; FIG.4), la alimentación se cambia a la columna 2. Una ventaja importante de esta estrategia de cambio de columna basada en ΔUV es que permite una carga uniforme de las columnas independientemente de la concentración de proteína terapéutica recombinante en la alimentación y la capacidad de la columna. Dentro de un intervalo razonable, la estrategia es adecuada para la variabilidad del título de recogida, mejorando así la robustez del sistema.
[0537] La determinación precisa del tiempo de cambio de columna, que se basa en la diferencia de absorbancia UV entre la alimentación y la salida de la columna, es uno de los elementos críticos de cada estrategia de control en tiempo real del sistema de PCC única. Esto requiere la sincronización de los cinco detectores de UV (un único detector de alimentación y cuatro detectores de salida de la columna) dentro de un intervalo estrecho. Los detectores UV se calibran usando una disolución de acetona al 3 %. Las longitudes de trayectoria del detector se ajustan manualmente de modo que los cinco valores de absorbancia estén dentro del 0,5 % entre sí. El ajuste de la longitud de trayectoria es ≤ 10 %.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES
1. Un proceso integrado y continuo para fabricar una sustancia farmacéutica proteica terapéutica, comprendiendo el proceso:
(i) proporcionar un medio de cultivo líquido que comprende una proteína terapéutica recombinante que está sustancialmente libre de células, en donde el medio de cultivo líquido se alimenta en un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS 1);
(ii) capturar dicha proteína terapéutica recombinante en el medio de cultivo líquido usando el PCCS1, en donde el eluido del PCCS1 que contiene la proteína terapéutica recombinante se alimenta continuamente en un segundo sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS2); y
(iii) realizar al menos dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante usando el PCCS2, en donde la purificación se realiza usando una resina que es diferente de la resina usada para realizar el pulido, y el eluido del PCCS2 contiene una sustancia farmacéutica proteica terapéutica; y
en donde el proceso se integra y se ejecuta continuamente desde dicho medio de cultivo líquido hasta el eluido del PCCS2 que es la sustancia farmacéutica proteica terapéutica.
2. El proceso de la reivindicación 1, en donde:
el PCCS1 realiza al menos dos operaciones unitarias diferentes; y/o el uso del PCCS1 o el PCCS2, o ambos, implica el cambio de columna.
3. El proceso de la reivindicación 2, en donde el PCCS1 realiza las dos operaciones unitarias diferentes de captura de la proteína terapéutica recombinante e inactivación de virus.
4. El proceso de la reivindicación 3, en donde el PCCS1 comprende un PCCS de cuatro columnas, en donde: tres de las cuatro columnas en el PCCS de cuatro columnas realizan la operación unitaria de captura de la proteína terapéutica recombinante a partir del medio de cultivo líquido;
el eluido que contiene la proteína terapéutica recombinante de tres de las cuatro columnas en el PCCS de cuatro columnas se alimenta a la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas; y
la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas realiza la operación unitaria de inactivación de virus manteniendo el eluido que contiene proteína terapéutica recombinante a un pH bajo para la inactivación vírica.
5. El proceso de la reivindicación 1, en donde:
el sistema de cromatografía PCCS2 comprende tres columnas cromatográficas y una membrana cromatográfica; las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 realizan la operación unitaria de purificación de la proteína terapéutica recombinante a partir del eluido del PCCS1 a través de cromatografía de intercambio catiónico o aniónico;
el eluido de las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 se alimenta a la membrana cromatográfica en el PCCS2; y
la membrana cromatográfica en el PCCS2 realiza la función unitaria de pulido de la proteína terapéutica recombinante presente en el eluido de las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 a través de cromatografía de intercambio catiónico o aniónico.
6. Un sistema de fabricación biológica, que comprende:
un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS1) que comprende una entrada; y un segundo sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS2) que comprende una salida, en donde el primer PCCS1 y el segundo PCCS2 están en comunicación fluida entre sí, y en donde el sistema de fabricación está configurado de modo que el fluido se pasa a la entrada, a través del primer PCCS1 y el segundo PCCS2, y sale del sistema de fabricación a través de la salida, el PCCS1 está configurado para realizar la operación unitaria de captura de una proteína terapéutica recombinante, y el PCCS2 está configurado para realizar al menos las dos operaciones unitarias diferentes de purificación y pulido de la proteína terapéutica recombinante, en donde la purificación se realiza usando una resina en el PCCS2 que es diferente de la resina usada en el PCCS2 para realizar el pulido.
7. El sistema de la reivindicación 6, que comprende además un biorreactor, en donde el biorreactor y la entrada están en comunicación fluida entre sí, y en donde el sistema de fabricación está configurado de modo que el fluido presente en el biorreactor pueda pasarse a la entrada.
8. El sistema de la reivindicación 6, donde:
el PCCS1 está configurado para realizar al menos dos operaciones unitarias separadas; y/o el uso del PCCS1 o el PCCS2, o ambos, implica el cambio de columna.
9. El sistema de la reivindicación 8, en donde el PCCS1 está configurado para realizar las operaciones unitarias de captura de la proteína terapéutica recombinante e inactivación de virus.
10. El sistema de la reivindicación 9, en donde:
el PCCS1 comprende un PCCS de cuatro columnas;
tres de las cuatro columnas en el PCCS de cuatro columnas son capaces de capturar la proteína terapéutica recombinante a partir del medio de cultivo líquido; y
la cuarta columna del PCCS de cuatro columnas es un depósito o una columna que es capaz de contener el eluido de las tres de las cuatro columnas del PCCS de cuatro columnas que contienen la proteína terapéutica recombinante a bajo pH para la inactivación vírica.
11. El sistema de la reivindicación 6, en donde:
el PCCS2 comprende tres columnas cromatográficas y una membrana cromatográfica;
las tres columnas cromatográficas en el PCCS2 son capaces de purificar la proteína terapéutica recombinante a través de una cromatografía de intercambio catiónico o aniónico; y
la membrana cromatográfica en el PCCS2 es una membrana cromatográfica de intercambio catiónico.
12. El sistema de la reivindicación 6, que comprende además un sistema de bomba que está en comunicación fluida con la entrada.
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