ES3048007T3

ES3048007T3 - Human collagen 17-type polypeptide, production method therefor and use thereof

Info

Publication number: ES3048007T3
Application number: ES20881368T
Authority: ES
Inventors: Yun Zhu
Original assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2025-12-05
Anticipated expiration: 2040-10-26
Also published as: SI4053160T1; HRP20251216T1; PT4053160T; EP4053160B1; US12043657B2; CN110845603A; US12428469B2; CN110845603B; DK4053160T3; EP4053160A4; BR112022004900A2; JP2023504341A; FI4053160T3; WO2021083072A1; RS67278B1; US20240309067A1; KR102665118B1; JP7300060B2; US20220348639A1; LT4053160T

Abstract

Se proporciona un polipéptido, su método de producción y su uso. El polipéptido incluye de 63 a 1496 residuos de aminoácidos continuos de SEQ ID NO: 9, e incluye una secuencia representada por (A) m o está compuesta por la secuencia representada por (A) m, donde cada A es una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las representadas por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 con 1 o más, por ejemplo 2, 3, 4 o 5, residuos de aminoácidos sustituidos, añadidos o eliminados, o una secuencia con una identidad de secuencia del 83%-97% con una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3; m es un número entero entre 1 y 10; Cada A es igual o diferente, y dos A adyacentes están conectadas directamente por enlaces peptídicos o por al menos un residuo de aminoácido. El polipéptido posee actividad de adhesión celular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Polipéptido de colágeno humano de tipo 17, método de producción para el mismo y uso del mismo

[0005] Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente China n.° 201911051106.3 presentada el 31 de octubre de 2019.

[0007] Campo técnico

[0009] La presente invención pertenece al campo técnico de la ingeniería genética, y se refiere a polipéptidos, métodos de producción y usos de los mismos.

[0011] Antecedentes de la técnica

[0013] Colágeno

[0015] El colágeno es generalmente fibrillas blancas, transparentes y no ramificadas, que es el soporte básico para la piel y los huesos. Puede representar del 25 % al 35 % de la cantidad total de proteína. El colágeno se distribuye principalmente en la piel, los vasos sanguíneos, los huesos, los tendones, los dientes y el cartílago entre otras partes del cuerpo humano, que sirven como matriz principal y los armazones de estos tejidos, y protege y conecta diversos tejidos, y desempeña importantes funciones fisiológicas en el cuerpo. Por lo tanto, el colágeno puede utilizarse ampliamente en industrias tales como medicina y cosmética.

[0017] Los productos de colágeno actualmente en el mercado se toman todos de tejidos de animales tales como cerdos, bovinos y peces. Aunque el colágeno de ciertos animales es muy similar al de los seres humanos, todavía es difícil evitar el riesgo de infección vírica y sensibilización. Actualmente, se ha usado una pequeña cantidad de colágeno de origen animal en cosmética, pero es difícil usarla ampliamente en equipos médicos o productos sofisticados de ingeniería de tejidos para realizar la función biológica original del colágeno. Además, el colágeno preparado por métodos convencionales generalmente tiene una fuerte función de coagulación, lo que conduce a un gran riesgo de trombosis cuando se usa en ciertos productos de ingeniería de tejidos, lo que limita en gran medida su aplicación extensa y profunda.

[0019] El método tradicional de producción de colágeno es procesar tejidos de origen animal utilizando hidrólisis ácida, alcalina y enzimática para extraer derivados de colágeno. El colágeno extraído por estos métodos ha perdido su actividad biológica original y no puede usarse en el campo de la biomedicina para realizar su función real. Algunas instituciones de investigación en China y en el extranjero expresan colágeno de origen humano in vitro a través de métodos de expresión recombinante convencionales, pero el coste de producción es normalmente demasiado alto y el ciclo de producción es demasiado largo para ponerse en producción a gran escala. Por lo tanto, existe una necesidad urgente en el mercado de un material de colágeno con excelentes propiedades biomateriales, un alto grado de homología de secuencia de aminoácidos con el cuerpo humano, y que pueda prepararse en grandes cantidades en un sistema industrializado.

[0021] Colágeno humano tipo 17

[0023] Desde un punto de vista estructural, la estructura del colágeno natural en el cuerpo humano es muy complicada, lo que hace extremadamente difícil expresar y preparar en grandes cantidades colágeno de origen humano por medios convencionales. La característica estructural más común del colágeno es una estructura de triple hélice formada por tres cadenas peptídicas, es decir, tres cadenas peptídicas A forman una proteína de una manera superenrollada hacia la derecha, y dicha región de triple hélice se denomina región de colágeno. Cada cadena peptídica A en la estructura molecular está compuesta por fragmentos peptídicos repetitivos Gly-X-Y (X e Y representan cualquier resto de aminoácido distinto de Gly, X es a menudo Pro e Y es a menudo Hyp) que forman una hélice hacia la izquierda, y bajo la interacción de restos de aminoácido, 3 cadenas peptídicas A se centran en el mismo eje y forman una estructura de triple hélice estable de una manera superenrollada hacia la derecha. Por lo tanto, es generalmente difícil que las secuencias de colágeno se combinen espontáneamente para formar una estructura de triple hélice estable con el fin de realizar funciones biológicas. Dichas dificultades dificultan gravemente el desarrollo y la producción de colágeno humano.

[0025] El cuerpo humano contiene 28 tipos diferentes de colágeno, que se dividen en colágeno fibroso común y colágeno no fibroso poco común. El tipo I, el tipo II y el tipo III en la piel humana pertenecen al colágeno fibroso. Entre el colágeno no fibroso, un subtipo muy importante de colágeno es el colágeno de tipo 17, colágeno XVII, (codificado por el gen COL17A1 en el cuerpo humano). El colágeno de tipo 17 es un homotrímero formado por la combinación de tres cadenas de COL17A1, con un peso molecular de cadena sencilla de 180 kDa. Comprende un dominio intracelular esférico de 70 kDa, un dominio transmembrana y un dominio de colágeno extracelular de 120 kDa, que tiene una estabilidad térmica robusta. Estudios recientes han confirmado que el colágeno de tipo 17 es un componente importante del hemidesmosoma en células madre epidérmicas en el cuerpo humano y desempeña un papel importante tanto en el envejecimiento celular como en la diferenciación de la piel. Sin embargo, los humanos actualmente tienen una comprensión muy limitada de la estructura y función del colágeno no fibroso, especialmente para el colágeno de tipo 17.

[0026] El documento de Patente WO 2012/063088 describe el dominio THD del clon de colágeno humano hCol-37 (SEQ ID No: 568 en el documento de Patente WO 2012/063088) y polinucleótidos, vectores, células huésped, métodos de preparación. El documento de Patente WO 2019/057704 describe células modificadas genéticamente que expresan la proteína de colágeno XVII (SEQ ID No: 4 en el documento de Patente WO 2019/057704), para su uso en el tratamiento de epidermólisis ampollosa, así como para su uso en un método para promover la adhesión celular in vivo, el crecimiento celular in vivo y/o la regeneración celular. J Yao et al ("Design, Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived from Native Collagens", Journal of Biochemistry, Volume 136, Issue 5, November 2004, páginas 643-649) diseñan y preparan dos proteínas similares al colágeno recombinante que consisten en dominios de adhesión celular derivados de colágeno de tipo I nativo mediante un método de ingeniería genética; y la secuencia de reticulación, GPPGPCCGGG, derivada de colágeno III se usa para promover la formación de la triple hélice a través de los enlaces disulfuro formados entre tres cadenas flanqueando el péptido en el extremo C-terminal de las proteínas similares al colágeno.

[0027] El inventor ha estudiado la estructura y la función del colágeno en profundidad durante muchos años. En particular, por primera vez en el mundo, analizó la nueva estructura atómica de múltiples segmentos del colágeno humano, y la publicó en la base de datos internacional de estructuras proteicas para su presentación pública, y acumuló una rica experiencia de investigación. A través de exploraciones repetidas, el inventor ha logrado con éxito la expresión recombinante de varias regiones funcionales extracelulares del colágeno de tipo 17, y ha descubierto que tiene excelentes propiedades biomateriales, su método de preparación es simple, fácil de ampliar la producción, y puede usarse ampliamente en industrias tales como medicina y cosmética.

[0028] Compendio de la invención

[0029] La presente invención se basa en parte en los siguientes hallazgos:

[0030] Los polipéptidos C17A3, C17B3 y C17C1 de la presente invención tienen efectos de adhesión celular comparables o mayores en comparación con el colágeno humano existente, y los polipéptidos C17A3, C17B3 y C17C1 existen en una forma soluble en agua después de expresarse en células huésped, y el método de preparación es sencillo, fácil de ampliar la producción.

[0031] Frente a los inconvenientes de la técnica anterior mostrados en los antecedentes de la técnica, la presente invención proporciona:

[0032] Concepto 1. Un polipéptido que tiene actividad de adhesión celular, en donde

[0033] (i) el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

[0034] a. SEQ ID No. 3,

[0035] b. SEQ ID No. 3, en donde 1,2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos están sustituidos, añadidos, eliminados o insertados, y

[0036] c. una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID No. 3;

[0037] (ii) el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

[0038] a. SEQ ID No. 4,

[0039] b. SEQ ID No. 4, en donde 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos están sustituidos, añadidos, eliminados o insertados, y

[0040] c. una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID No. 4; o

[0041] (iii) el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

[0042] a. SEQ ID No. 6,

[0043] b. SEQ ID No. 6, en donde 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos están sustituidos, añadidos, eliminados o insertados y

[0044] c. una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID No. 6.

[0045] Concepto 2. El polipéptido según el Concepto 1, en donde

[0046] (i) el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

[0047] a. SEQ ID No. 3,

[0048] b. SEQ ID No. 3, en donde 1,2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos están sustituidos, añadidos, eliminados o insertados, y

[0049] c. una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID No. 3;

[0050] (ii) el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

[0051] a. SEQ ID No. 4,

[0052] b. SEQ ID No. 4, en donde 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos están sustituidos, añadidos, eliminados o insertados, y

[0053] c. una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID No. 4; o

[0054] (iii) el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

[0055] a. SEQ ID No. 6,

[0056] b. SEQ ID No. 6, en donde 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos están sustituidos, añadidos, eliminados o insertados, y

[0057] c. una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID No. 6.

[0058] Concepto 3. El polipéptido del Concepto 1 o 2, en donde el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No. 3, la SEQ ID No. 4 o la SEQ ID No. 6.

[0059] Concepto 4. Un polinucleótido que codifica el polipéptido según uno cualquiera de los Conceptos 1-3, preferiblemente, comprendiendo o consistiendo el polinucleótido en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID No. 5, la SEQ ID No. 7, o la SEQ ID No. 8.

[0060] Concepto 5. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según el Concepto 4.

[0061] Concepto 6. Una célula huésped que comprende el vector de expresión según el Concepto 5 o que expresa el polipéptido según uno cualquiera de los Conceptos 1-3, en donde la célula huésped es preferiblemente una célula de Escherichia coli (E. coli).

[0062] Concepto 7. Un método para preparar el polipéptido según uno cualquiera de los Conceptos 1-3, que comprende:

[0063] (1) cultivar la célula huésped según el Concepto 6 en un medio de producción;

[0064] (2) aislar el polipéptido según uno cualquiera de los Conceptos 1-3 de la célula huésped.

[0065] Concepto 8. Una composición que comprende el polipéptido según uno cualquiera de los Conceptos 1-3 o el polipéptido preparado según el método del Concepto 7.

[0066] Concepto 9. Un artículo que comprende el polipéptido según uno cualquiera de los Conceptos 1-3 o el polipéptido preparado según el método del Concepto 7 o la composición según el Concepto 8, en donde el artículo es una composición farmacéutica, un dispositivo médico, un producto de ingeniería de tejidos, cosméticos o un producto sanitario, preferiblemente la composición farmacéutica es una preparación tópica, preferiblemente una preparación tópica para frotis, tal como un gel tópico o una preparación de infiltración tópica; en donde preferiblemente el gel tópico comprende además vehículos farmacéuticamente aceptables, y la preparación de infiltración tópica comprende además bolas de algodón médicas estériles.

[0067] Concepto 10. Uso del polipéptido según uno cualquiera de los Conceptos 1-3 o el polipéptido preparado mediante el método del Concepto 7, el polinucleótido del Concepto 4, el vector de expresión del Concepto 5, la célula huésped del Concepto 6 o la composición del Concepto 8 en la preparación de artículos, preferiblemente dispositivos médicos, productos de ingeniería de tejidos, cosméticos y productos sanitarios. La presente invención presenta, en comparación con la técnica anterior, las siguientes características:

[0068] (1) La secuencia de colágeno humano de tipo 17 seleccionada por primera vez en la presente invención es una secuencia optimizada para la selección a largo plazo;

[0069] (2) Se emplea el sistema de expresión de E. coli, que es adecuado para la amplificación a gran escala, y se puede completar una ronda de fermentación en 20 horas. El coste de producción es muy bajo. Debido a la optimización de codones de E. coli para la secuencia génica y la selección del medio 2xYT, la producción está en una cantidad tremenda;

[0070] (3) El colágeno recombinante de origen humano producido tiene muy buena hidrofilicidad y estabilidad, y su composición de aminoácidos es idéntica en un 100 % a la parte correspondiente de la secuencia de aminoácidos del colágeno natural. No provocará rechazo inmunitario ni reacción alérgica cuando se aplique al cuerpo humano, y puede usarse ampliamente en la industria biomédica y cosmética;

[0071] (4) El producto de la presente invención se ha sometido a detección de actividad y tiene una actividad biológica que puede alcanzar o exceder la actividad biológica de la proteína natural en el cuerpo humano, que puede ejercer la función de la proteína natural en el cuerpo humano para lograr el propósito de aplicación real del producto;

[0072] (5) El diseño técnico de la presente invención puede reducir de manera eficaz el riesgo de coagulación del colágeno cuando se usa en el cuerpo humano, mientras que mantiene la alta actividad de adhesión celular del colágeno, y tiene una amplia gama de perspectivas de aplicación de ingeniería de tejidos.

[0073] Descripción de los dibujos

[0074] La Figura 1 es un perfil de plásmido construido por los vectores pET32a-C17A3, pET32a-C17B3 y PET32a-C17C1 de la presente invención.

[0075] La Figura 2 es un diagrama de electroforesis de proteínas obtenido después de la expresión y purificación de la proteína Trx-C17A3 de la presente invención; el peso molecular de la proteína Trx-C17A3 detectada por electroforesis es de aproximadamente 42 kDa.

[0076] La Figura 3 es un diagrama de electroforesis de proteínas obtenido después de la expresión y purificación de la proteína Trx-C17B3 de la presente invención; el peso molecular de la proteína Trx-C17B3 detectada por electroforesis es de aproximadamente 40 kDa.

[0077] La Figura 4 es un diagrama de electroforesis de proteínas obtenido después de la expresión y purificación de la proteína Trx-C17C1 de la presente invención; el peso molecular de la proteína Trx-C17C1 detectada por electroforesis es de aproximadamente 32 kDa.

[0078] La Figura 5 es un diagrama de electroforesis de la proteína diana proteína C17A3 obtenida después de la expresión de la proteína Trx-C17A3, mediante digestión restrictiva para eliminar la etiqueta Trx y la purificación por intercambio iónico; el peso molecular de la proteína C17A3 detectada por electroforesis es de aproximadamente 25 kDa, que corresponde a la proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4. La Figura 6 es un diagrama de electroforesis de la proteína diana proteína C17B3 obtenida después de la expresión de la proteína Trx-C17B3, mediante digestión restrictiva para eliminar la etiqueta Trx y la purificación por intercambio iónico; el peso molecular de la proteína C17B3 detectada por electroforesis es de aproximadamente 23 kDa, que corresponde a la proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6. La Figura 7 es un diagrama de electroforesis de la proteína diana proteína C17C1 obtenida después de la expresión de la proteína Trx-C17C1, mediante digestión restrictiva para eliminar la etiqueta Trx y la purificación por intercambio iónico; el peso molecular de la proteína C17C1 detectada por electroforesis es de aproximadamente 16 kDa, que corresponde a la proteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 3. La Figura 8 muestra los resultados de la detección de la actividad biológica de la proteína C17A3 de la presente invención en comparación con la proteína C17A1 (SEQ ID No. 1) y el colágeno humano.

[0079] La Figura 9 muestra los resultados de detección de la actividad biológica de la proteína C17B3 de la presente invención en comparación con la proteína C17B1 (SEQ ID No 2) y el colágeno humano.

[0081] La Figura 10 muestra los resultados de detección de la actividad biológica de la proteína C17C1 de la presente invención en comparación con el colágeno humano.

[0083] Realizaciones detalladas

[0085] A continuación se proporciona una descripción adicional para facilitar la comprensión de la presente invención.

[0086] Como se usa en la presente memoria, "dispositivos médicos" se refiere a instrumentos, equipos, aparatos, reactivos y calibradores de diagnóstico in vitro, materiales y otros artículos similares o relacionados usados directa o indirectamente en el cuerpo humano.

[0088] Como se usa en la presente memoria, "productos de ingeniería de tejidos" se refiere a productos usados para la ingeniería de tejidos. La ingeniería de tejidos es una disciplina emergente que combina biología celular y ciencia de materiales para construir tejidos u órganos in vitro o in vivo.

[0090] Como se usa en la presente memoria, "aislamiento" se refiere al aislamiento de polipéptidos diana a partir de células huésped cultivadas, por ejemplo, para romper las células huésped y purificar los polipéptidos diana. En el caso de que los polipéptidos diana purificados tengan etiquetas de purificación, tales como la etiqueta Trx o His, el “aislamiento” también incluye la eliminación de la etiqueta Trx o His mediante digestión restrictiva.

[0091] Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" son bien conocidos por los expertos en la técnica, y los expertos en la técnica pueden seleccionar los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para su uso en las composiciones o artículos de la presente invención. Por ejemplo, los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como ácido fosfórico, ácido cítrico y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecil dimetil bencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, butanol o alcohol bencílico; alquil parabenos tales como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcina; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulina; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrina; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa, o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (tales como complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG).

[0092] En la presente invención, la secuencia de colágeno humano de tipo 17 COL17A1 se selecciona para la selección y optimización. La secuencia del colágeno humano de tipo 17 es la secuencia de referencia del NCBI: Q9UMD9.3 (Se Q ID No. 9), véase https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/Q9UMD9.3.

[0093] MDVTKKNKRDGTEVTERIVTETVTTRLTSLPPKGGTSNGYAKTASLGGG SRLEKQSLTHGSSGYINSTGSTRGHASTSSYRRAHSPASTLPNSPGSTFER KTHVTRHAYEGSSSGNSSPEYPRKEFASSSTRGRSQTRESEIRVRLQSASP STRWTELDD VKRLLKGSRS AS VSPTRN S SNTLPIPKKGT VETKIVT AS SQ S VSGTYDATILDANLPSHVW SSTLPAGSSMGTYHNNMTTQSSSLLNTNAY SAGSVFGVPNNMASCSPTLHPGLSFSSSVFGMQNNLAPSLTFLSHGTTTT ST AY GVKKNMPQ SPAA VNT G V S TS AACTTS VQ SDDLLHKDCKFLILEKD NTPAKKEMELLIMTKDSGKVFTASPASIAATSFSEDTLKKEKQAAYNADS GLK AE ANGDLKT V S TKGKTTT ADIH S YGS S GGGGS GGGGG V GG AGGGP WGPAPAW CPCGSCCSW W KW LLGLLLTW LLLLGLLFGLIALAEEVRKLK ARVDELERIRRSILPYGDSMDRIEKDRLQGMAPAAGADLDKIGLHSDSQE ELWMF VRKKLMMEOENGNLRGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGI PGPLGHPGPOGPKGOKGSVGDPGMEGPMGORGREGPMGPRGEAGP PGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVG LQ G LRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDOGEKGPRGLTGEPGMRGLPG AVGEPGAKGAM GPAGPDGHOGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPG LTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKIVTSEGSSMLFVPGPPGPPGAM GPPGPPGAPGPAGPAGLPGHQEVLNLQGPPGPPGPRGPPGPSIPGPPGPRG PPGEGLPGPPGPPGSFL SN SETFLSGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGE QGLPGF SF S GS S SF GLNLQGPPGPPGPQGPKGDKGDPG VPGALGIPSGPSE GGSSSTMYVSGPPGPPGPPGPPGSISSSGQEIQQYISEYMQSDSIRSYLSGV QGPPGPPGPPGP VTTIFGEFFD Y SEL ASH VV S YLRTSG YG V SLF S S SI SSEDI LAVLQRDDVRQYLRQYLMGPRGPPGPPGASGDGSLLSLDYAELSSRILSY M SS SGISIGLPGPPGPPGLPG TSYEELL SLLRG SEFRGIVGPPGPPGPPGIPG NVWSSTSVEDLSSYLHTAGLSFIPGPPGPPGPPGPRGPPGVSGALATYAAE N SD SFRSELIS YLF SPD VRSFIV GPPGPPGPQGPPGD SRLL STDASHSRGSS S SSHSSSVRRGSSYSSSM STGGGGAGSLGAGGAFGEAAGDRGPYGTDIGPG GGYGAAAEGGMYAGNGGLLGAD FA G D LD YN ELA V RV SESM O RQ G LL OGMAYTVOGPPGOPGPOGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFOTYGAIO GPPGOKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDO VYAGRRRRRSIAVKP(SEQ ID No. 9)

[0095] La parte subrayada en negrita en la secuencia descrita anteriormente es la secuencia de aminoácidos seleccionada en la presente invención. El solicitante descubrió a través de muchas investigaciones que la secuencia seleccionada descrita anteriormente tiene una fuerte solubilidad en agua, un alto rendimiento de expresión recombinante, un proceso de purificación simple y logra una mejor adhesión celular que el colágeno humano comercial u otras secuencias en la SEQ ID No. 9, con una variedad de excelentes propiedades de material biológico. En la presente invención, el polipéptido no es la secuencia de longitud completa de la SEQ ID No. 9.

[0097] En la presente invención, se han detectado las secuencias de varias regiones específicas de aminoácidos:

[0098] (1) C17A:

[0099] GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPG MEGPMGQRGREGPMGPRGEA (SEQ ID No. 1);

[0101] (2) C17B:

[0102] GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLP GAVGEPGAKGAMGPA (SEQ ID No. 2);

[0104] (3) C17C:

[0105] GADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGT SKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPP GHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ (SEQ ID No. 3);

[0107] El polipéptido de la presente memoria puede ser el colágeno C17A3 recombinante de origen humano, que es una secuencia de triple repetición de C17A, que incluye 207 aminoácidos, y la unidad de repetición básica es:

[0108] GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPG MEGPMGQRGREGPMGPRGEA (SEQ ID No. 1), que es un fragmento peptídico de colágeno humano de tipo 17.

[0110] La secuencia de aminoácidos de C17A3 es la siguiente:

[0111] GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPG MEGPMGQRGREGPMGPRGEAGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGTPGP LGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGSPGPKGD MGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQR GREGPMGPRGEA (SEQ ID No. 4).

[0113] La secuencia de DNA de C17A3 es la siguiente:

[0114] GGTAGCCCAGGTCCAAAAGGTGATATGGGAAGCCCAGGTCCGAAAGG TGATCGTGGTTTTCCGGGTACACCAGGTATTCCGGGTCCACTGGGTCAT CC AGGT CCGC A AGGT CCGA A AGGCC AG A A AGGTAGCGT GGGT GATCC GGGTATGGAAGGGCCTATGGGGCAGCGTGGGCGTGAAGGGCCGATGG GTCCGCGTGGTGAAGCAGGTAGCCCGGGGCCTAAAGGGGATATGGGG AGTCCGGGTCCGAAAGGGGATCGTGGATTTCCGGGTACGCCGGGTATC CCGGGTCCGCTGGGTCATCCGGGTCCGCAAGGGCCTAAAGGTCAGAA AGGTAGTGTGGGTGATCCTGGTATGGAAGGTCCGATGGGTCAGCGTGG T CGT GAGGGT CCGAT GGGACCGCGT GGT GAGGCTGGTAGCCCT GGT CC GAAAGGAGATATGGGTAGCCCGGGTCCGAAAGGTGACCGTGGTTTTCC TGGTACACCGGGTATTCCAGGGCCTCTGGGTCATCCTGGTCCTCAGGGT CCGAAAGGT C AG AAAGGGAGT GT GGGAGATCCGGGTAT GGAGGGTCC GATGGGGCAGCGCGGTCGTGAAGGTCCGATGGGCCCGCGTGGTGAAG CC (SEQ ID No. 5).

[0116] El polipéptido de la presente memoria puede ser colágeno C17B3 de origen humano, que es una secuencia de triple repetición de C17B, que incluye 189 aminoácidos, y la unidad de repetición básica es:

[0118] GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLP GAVGEPGAKGAMGPA (SEQ ID No. 2), que es un fragmento peptídico del colágeno humano de tipo 17.

[0120] La secuencia de aminoácidos de C17B3 es la siguiente:

[0121] GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLP GAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGE KGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGYKGD KGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA

[0122] (SEQ ID No. 6).

[0124] La secuencia de DNA de C17B3 es la siguiente:

[0125] GGT C T GC AGGGT CT GC GT GGT G AAGTAGGACT GCCGGGT GT GAAAGG

[0126] AG ATAAAGG ACC AAT GGG TC C ACC AG G AC C AAAAGG AG AT C AAGG AG AAAAAGGACC ACGT GGTCT GAC AGGT GAACCGGGTAT GCGT GGGCTG CCGGGAGCAGTTGGAGAACCGGGAGCAAAAGGAGCAATGGGTCCAG C AGGAC T GC AGGGTCT GC GCGGT G AAGT GGG AC TGCCT GGT GTTAAA GGGGATAAAGGGCCGATGGGTCCGCCGGGTCCGAAAGGAGATCAGGG AGAAAAAGGGCCGCGTGGTCTGACCGGTGAACCGGGAATGCGTGGTC T GCCGGGGGCT GT GGGTGAGCC AGGT GC A A A AGGT GC A AT GGGTCCT GC AGGT CT GCAAGGACT GCGT GGAGAAGTGGGT CTGCCTGGT GT GAA AGGT GATA A AGGT CCGAT GGGTCCT CCGGGTCCGAA AGGT GATCAGGG TGAAAAAGGTCCGCGTGGTCTGACGGGTGAACCGGGCATGCGTGGTC TGCCTGGGGCAGTTGGTGAACCGGGGGCAAAAGGTGCTATGGGGCCG GCA (SEQ ID No. 7).

[0128] El polipéptido de la presente memoria puede ser colágeno C17C1 recombinante de origen humano, que es una secuencia de repetición de C17C, que incluye 119 aminoácidos, y la unidad de repetición básica es:

[0130] GADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGI SKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPP GHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ (SEQ ID No. 3), que es el péptido de colágeno humano de tipo 17.

[0132] La secuencia de aminoácidos de C17C1 es la siguiente:

[0133] GADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGI SKVF S AY SNVTADLMDFF QT YG AIQGPPG QKGEMG TPGPKGDRGPAGPP GHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ (SEQ ID No. 3).

[0135] La secuencia de DNA de C17C1 es la siguiente:

[0136] GGTGCAGATTTTGCAGGTGATCTGGATTATAATGAACTGGCAGTTCGTG TTAGCGAAAGCATGCAGCGTCAGGGACTGCTGCAGGGAATGGCATATA CCGTTCAGGGTCCGCCGGGTCAGCCGGGTCCTCAAGGTCCTCCTGGTA TTAGCAAAGTTTTTAGTGCATATTCAAACGTGACGGCAGATCTGATGGA TTTTTTTCAGACGTATGGTGCAATTCAGGGTCCTCCTGGGCAAAAAGG T GAAATGGGTAC ACCTGGTCCGAAAGGCGATCGTGGTCCGGCCGGT CC GCCGGGCCACCCTGGTCCTCCTGGCCCTCGTGGTCATAAAGGTGAGAA AGGTGATAAAGGTGATCAA (SEQ ID No. 8).

[0138] En la presente memoria, el polipéptido puede consistir en la SEQ ID No. 3 con sustituciones, adiciones, eliminaciones o inserciones de 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos, o secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No. 3, o consistir en o incluir la secuencia de aminoácidos mostrada en una cualquiera de la SEQ ID No. 4 y la SEQ ID No. 6 con sustituciones, adiciones, eliminaciones o inserciones de 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos, o secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la secuencia de aminoácidos mostrada en una cualquiera de la SEQ ID No. 4 y la SEQ ID No. 6. El "porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a la secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia después de que se introduzcan huecos cuando sea necesario para obtener el porcentaje máximo de identidad de secuencia cuando la secuencia candidata se alinea con la secuencia polipeptídica de referencia, sin ninguna sustitución conservativa se considera parte de la identidad de secuencia. El alineamiento usado para determinar el porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos puede lograrse de diversas maneras conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente, tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros adecuados para alinear secuencias, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.

[0140] La adición de aminoácidos se refiere a la adición de aminoácidos al extremo C o N-terminal de las secuencias de aminoácidos, tal como una cualquiera de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No.

[0141] 6 y SEQ ID No. 9, siempre que el polipéptido tenga características de colágeno y actividad de adhesión celular.

[0142] La sustitución de aminoácidos se refiere a la sustitución de un determinado resto de aminoácido en una determinada posición por otro resto de aminoácido en las secuencias de aminoácidos, tal como la secuencia de una cualquiera de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No.

[0143] 9, siempre que el polipéptido tenga características de colágeno y actividad de adhesión celular.

[0145] La inserción de aminoácidos se refiere a la inserción de restos de aminoácidos en posiciones apropiadas de las secuencias de aminoácidos, tales como la secuencia de una cualquiera de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 9. Los restos de aminoácidos insertados pueden ser adyacentes entre sí en su totalidad o en parte, o ninguno de los aminoácidos insertados es adyacente entre sí, siempre que el polipéptido tenga características de colágeno y actividad de adhesión celular.

[0147] La eliminación de aminoácidos se refiere a la eliminación de 1, 2 o más de 3 aminoácidos de las secuencias de aminoácidos, tales como la secuencia de una cualquiera de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 9, siempre que el polipéptido tenga características de colágeno y actividad de adhesión celular.

[0149] En la presente invención, las sustituciones pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas, que se refieren a 3, más preferiblemente 2 aminoácidos o 1 aminoácido sustituidos por aminoácidos con propiedades similares o comparables, en comparación con una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6, para formar péptidos. Estos péptidos variantes conservativos pueden producirse realizando sustituciones de aminoácidos según la Tabla 1.

[0151] Tabla 1. Sustitución conservativa de aminoácidos

[0153]

[0154]

[0156] Todos los aminoácidos en la secuencia polipeptídica de la presente memoria pueden ser aminoácidos de tipo L, dentro de los cuales también pueden sustituirse 1-5 aminoácidos por aminoácidos con conformación de tipo D, aminoácidos modificados artificialmente y aminoácidos raros que existen en la naturaleza, entre otros, para mejorar la biodisponibilidad, estabilidad y/o actividad antiviral de los polipéptidos. Entre ellos, los aminoácidos de tipo D se refieren a los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos de tipo L que constituyen proteínas; los aminoácidos modificados artificialmente se refieren a aminoácidos de tipo L comunes que constituyen proteínas que se han modificado por metilación, fosforilación, etc.; los aminoácidos raros que existen en la naturaleza incluyen aminoácidos poco comunes que constituyen proteínas, y aminoácidos que no constituyen proteínas, tales como 5-hidroxilisina, metilhistidina, ácido Y-aminobutírico, homoserina, etc.

[0157] En la presente invención, la recombinación del colágeno de origen humano puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales en la técnica. Por ejemplo, se puede producir en las siguientes etapas: (1) construir bacterias modificadas genéticamente de E. coli; (2) cultivar por fermentación las bacterias modificadas genéticamente de E. coli; (3) inducir y expresar el colágeno recombinante de origen humano; y (4) purificar y opcionalmente digerir por restricción el colágeno recombinante de origen humano.

[0158] En la etapa (1), la construcción de bacterias modificadas por ingeniería genética de E. coli puede llevarse a cabo de la siguiente manera: (1) optimización de codones y corte y empalme de fragmentos de DNA recombinantes en la región de hélice génica del colágeno de tipo 17 de origen humano mediante el método de PCR para obtener finalmente fragmentos génicos diana; (2) insertar los fragmentos génicos diana obtenidos en vectores de expresión de PET-32a para obtener plásmidos de expresión recombinantes; (3) transformar los plásmidos de expresión recombinantes en células BL21 competentes de E. coli (DE3) y seleccionar para obtener bacterias positivas modificadas por ingeniería genética de E. coli.

[0159] En las etapas (2) y (3), el cultivo por fermentación de las bacterias modificadas genéticamente de E. coli y la inducción y expresión de colágeno recombinante de origen humano se pueden llevar a cabo de la siguiente manera: (1) recoger la colonia única optimizada de las bacterias modificadas genéticamente de E. coli de la placa de LAB, colocarla en 10 ml de medio LB y cultivar a 37 °C, 220 rpm durante 12-16 horas; (2) amplificar cultivando la solución bacteriana inoculada en medio 2xYT en una proporción de 1:100 y cultivar a 37 °C durante aproximadamente 3 horas. Cuando la OD<600>sea 0,4-0,6, añadir IPTG a una concentración final de 0,5 mM para inducción, cultivar a 16 °C durante 20 horas adicionales, y recoger las bacterias por centrifugación.

[0160] En la Etapa (4), la purificación y digestión por restricción de polipéptidos de colágeno recombinante de origen humano se puede llevar a cabo como sigue: (1) volver a suspender las bacterias en tampón fosfato (NaH<2>PO<3>40mM, NaCl 500 mM, pH 7,8), romper mediante ultrasonido y recoger el sobrenadante por centrifugación; (2) utilizar una columna de afinidad NI-NTA para unir colágeno recombinante de origen humano, enjuagar las proteínas impuras con imidazol 10 mM antes de añadir proteasa Tev (enzima del virus del grabado del tabaco), digerir en la columna a 4 °C durante 16 horas y obtener finalmente los polipéptidos de colágeno diana.

[0161] Las células huésped pueden ser células eucariotas, tales como hongos y levaduras, o células procariotas, tales como Enterobacteriaceae, tales como Escherichia coli. Debe entenderse que los expertos en la técnica pueden sustituir las cepas de E. coli mencionadas anteriormente con otras cepas de expresión como células huésped.

[0162] Ejemplos

[0163] Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención. Los expertos en la técnica deben entender que los ejemplos son meramente ilustrativos y no restrictivos. La presente invención está limitada únicamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

[0164] Ejemplo 1: Construcción, expresión y purificación de polipéptidos de colágeno recombinante de origen humano Construcción y expresión del vector de expresión del gen C17A3

[0165] 1. La secuencia génica de longitud completa del colágeno C17A3 de origen humano usada en el Ejemplo 1 se muestra en la SEQ ID No. 5. Esta secuencia ha sido optimizada por codones para los codones de E. coli.

[0166] 2. La longitud completa del gen C17A3 es de 621 bp. Según la secuencia génica del codón C17A3 optimizado SEQ ID No. 5, se le encomienda a Beijing Shengyuan Kemeng Gene Biotechnology Co., Ltd. sintetizar el fragmento génico, y después de unir el fragmento génico C17A3 sintetizado a los sitios de restricción de la proteasa del Tev, el fragmento génico se inserta en el vector de expresión PET32a (proporcionado por the Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences) a través de los sitios de restricción Kpn I y Xho I. El plásmido de expresión construido con éxito se transforma en células BL21 competentes de E. coli (DE3) (Merck Company). El proceso específico es el siguiente: 1: tomar 1 pl de este plásmido por 100 pl de células BL21 competentes de E. coli (DE3), y dejarlo reposar en hielo durante 30 min. 2: someter la mezcla a choque térmico en un baño de agua a 42 °C durante 90s, a continuación colocarla rápidamente en hielo y dejarla reposar durante 2 min. 3: añadir 600 pl de LB no resistente a la mezcla y cultivar durante 1 hora a 37 °C, 220 rpm. 4: tomar 200 pl de la solución bacteriana y extenderla uniformemente en la placa de LB que contiene resistencia a ampicilina (10 g/L de peptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de cloruro de sodio, 15 g/L de agar, 100 pg/ml de antibióticos de ampicilina). 5: cultivar la placa al revés en una incubadora a 37 °C durante aproximadamente 20h hasta que crezcan colonias claras y visibles.

[0168] 3. Recoger una colonia individual de la placa de LB transformada y cultivarla en 10 ml de medio LB (que contiene 100 pg/ml de antibióticos de ampicilina) durante 12 h-16 h, después transferirla a medio 2xYT (16 g/L de peptona, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de cloruro de sodio) en la proporción de 1:100 para el cultivo de amplificación, cultivar a 37 °C, 220 rpm hasta que la OD<600>de la solución bacteriana sea 0,4-0,6, añadir IPTG (Sigma Company, Cat. No: 15502-1G) a una concentración final de 0,5 mM para inducir la expresión. Las condiciones de inducción son 18 °C, 180 rpm durante 20 h. Finalmente, recoger las bacterias por centrifugación y almacenar a -20 °C o pasar inmediatamente a la siguiente etapa de purificación.

[0170] 4. Volver a suspender (1 L) la precipitación bacteriana usando aproximadamente 50 ml de tampón fosfato (pH 7,8) (dihidrógeno fosfato de sodio 40 mM, cloruro de sodio 500 mM) y romper las bacterias utilizando un instrumento de ruptura de bacterias de alta presión (SCIENTIZ BIO) antes de centrifugar a 13000 rpm durante 30 min para aislar completamente la proteína soluble de los cuerpos de inclusión.

[0172] 5. Equilibrar la columna de afinidad Ni-NTA (Qiagen Company, Cat. No: 30210) con 5 volúmenes de columna de tampón de unión (NaH<2>PO<3>40mM, NaCl 500 mM, pH 7,8). A continuación, añadir el sobrenadante de proteína e incubar a 4 °C durante 0,5-1h para permitir que la proteína recombinante diana se una completamente al material de la columna. Después enjuagar la proteína impura con 200 ml de tampón de lavado que contiene imidazol 10 mM (imidazol 10 mM, NaH<2>PO<3>40mM, NaCl 500 mM, pH 7,8) (Sigma Company). Si se necesita la proteína diana marcada con Trx, se puede usar directamente un tampón de elución (imidazol 250 mM, NaH<2>PO<3>40mM, NaCl 500 mM, pH 7,8) para eluir la proteína diana Trx-C17A3. Si es necesario eliminar la proteína diana marcada con Trx, se puede añadir una cantidad apropiada de proteasa del TEV con la etiqueta His. Después de incubar a 4 °C durante 16 h, recoger el fluido de flujo, que es el colágeno C17A3 diana con la proteína portadora Trx eliminada.

[0174] 6. La columna de intercambio aniónico puede usarse para la purificación rápida de la proteína diana. Dializar la proteína diana en tampón A (Tris 20 mM, NaCl 15 mM, pH 8,0), dejarla fluir a través de la columna de intercambio aniónico Hitrap Q (GE Healthcare) y eluir en gradiente con tampón B (Tris 20 mM, NaCl 1 M, pH 8,0), recoger diferentes fracciones de elución para detectar las proteínas. Dializar el producto proteico diana obtenido durante la noche, y liofilizarlo en polvo seco para su uso posterior.

[0176] 7. Detectar del peso molecular y la pureza de la proteína C17A3 obtenida mediante SDS-PAGE. El proceso específico es: tomar 40 pl de solución de proteína purificada, añadir 10 pl de tampón de carga de proteína 5x (Tris-HCl 250 mM (pH: 6,8), SDS al 10 %, azul de bromofenol al 0,5 %, glicerol al 50 %, p-mercaptoetanol al 5 %), hervir en agua hirviendo a 100 °C durante 10 min, después añadir 10 pl por pocillo al gel de proteína de SDS-PAGE, operar a 80 V durante 2h, y teñir la proteína con solución de tinción de azul brillante de Coomassie (azul brillante de Coomassie R-250 al 0,1 %, isopropanol al 25 %, ácido acético glacial al 10 %) durante 20 min, después utilizar solución de decoloración de proteínas (ácido acético al 10 %, etanol al 5 %) para la decoloración. Finalmente, medir la actividad proteica en comparación con el colágeno natural humano.

[0178] Construcción y expresión del vector de expresión del gen C17B3

[0180] 1. La secuencia génica de longitud completa del colágeno C17B3 de origen humano usada en el Ejemplo 2 se muestra en la SEQ ID No. 7. Esta secuencia ha sido optimizada por codones para los codones de E. coli.

[0181] 2. La longitud completa del gen C17B3 es 567 bp. Según la secuencia génica del codón C17B3 optimizado SEQ ID No. 7, se le encomienda a Beijing Shengyuan Kemeng Gene Biotechnology Co., Ltd. sintetizar el fragmento génico, y después de unir el fragmento génico C17B3 sintetizado a los sitios de restricción de la proteasa del Tev, el fragmento génico se inserta en el vector de expresión PET32a (proporcionado por the Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences) a través de los sitios de restricción Kpn I y Xho I. El plásmido de expresión construido con éxito se transforma en células BL21 competentes de E. coli (DE3) (Merck Company). El proceso específico es el siguiente: 1: tomar 1 pl de este plásmido por 100 pl de células BL21 competentes de E. coli (DE3), y dejarlo reposar en hielo durante 30 min. 2: someter la mezcla a choque térmico en un baño de agua a 42 °C durante 90s, a continuación colocarla rápidamente en hielo y dejarla reposar durante 2 min. 3: añadir 600 j l de LB no resistente a la mezcla y cultivar durante 1 hora a 37 °C, 220 rpm. 4: tomar 200 j l de la solución bacteriana y extenderla uniformemente en la placa de LB que contiene resistencia a ampicilina (10 g/L de peptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de cloruro de sodio, 15 g/L de agar, 100 jg/m l de antibióticos de ampicilina). 5: cultivar la placa al revés en una incubadora a 37 °C durante aproximadamente 20h hasta que crezcan colonias claras y visibles.

[0183] 3. Recoger una colonia individual de la placa de LB transformada y cultivarla en 10 ml de medio LB (que contiene 100 jg/m l de antibióticos de ampicilina) durante 12 h-16 h, después transferirla a medio 2xYT (16 g/L de peptona, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de cloruro de sodio) en la proporción de 1:100 para el cultivo de amplificación, cultivar a 37 °C, 220 rpm hasta que la OD<600>de la solución bacteriana sea 0,4-0,6, añadir IPTG (Sigma Company, Cat. No: 15502-1G) a una concentración final de 0,5 mM para inducir la expresión. Las condiciones de inducción son 18 °C, 180 rpm durante 20h. Finalmente, recoger las bacterias por centrifugación y almacenar a -20 °C o pasar inmediatamente a la siguiente etapa de purificación.

[0185] 4. Volver a suspender (1 L) la precipitación bacteriana usando aproximadamente 50 ml de tampón fosfato (pH 7,8) (dihidrógeno fosfato de sodio 40 mM, cloruro de sodio 500 mM) y romper las bacterias utilizando un instrumento de ruptura de bacterias de alta presión (SCIENTIZ BIO) antes de centrifugar a 13000 rpm durante 30 min para aislar completamente la proteína soluble de los cuerpos de inclusión.

[0187] 5. Equilibrar la columna de afinidad Ni-NTA (Qiagen Company, Cat. No: 30210) con 5 volúmenes de columna de tampón de unión (NaH<2>PO<3>40mM, NaCl 500 mM, pH 7,8). A continuación, añadir el sobrenadante de proteína e incubar a 4 °C durante 0,5-1h para permitir que la proteína recombinante diana se una completamente al material de la columna. Después enjuagar las proteínas impuras con 200 ml de tampón de lavado que contiene imidazol 10 mM (imidazol 10 mM, NaH<2>PO<3>40mM, NaCl 500 mM, pH 7,8) (Sigma Company). Si se necesita la proteína diana marcada con Trx, se puede usar directamente un tampón de elución (imidazol 250 mM, NaH<2>PO<3>40mM, NaCl 500 mM, pH 7,8) para eluir la proteína diana Trx-C17B3. Si es necesario eliminar la proteína diana marcada con Trx, se puede añadir una cantidad apropiada de proteasa del TEV con la etiqueta His. Después de incubar a 4 °C durante 16 h, recoger el fluido de flujo, que es el colágeno C17B3 diana con la proteína portadora Trx eliminada.

[0189] 6. La columna de intercambio aniónico puede usarse para la purificación rápida de la proteína diana. Dializar la proteína diana en tampón A (Tris 20 mM, NaCl 15 mM, pH 8,0), dejarla fluir a través de la columna de intercambio aniónico Hitrap Q (GE Healthcare) y eluir en gradiente con tampón B (Tris 20 mM, NaCl 1 M, pH 8,0), recoger diferentes fracciones de elución para detectar las proteínas. Dializar el producto proteico diana obtenido durante la noche, y liofilizarlo en polvo seco para su uso posterior.

[0191] 7. Detectar el peso molecular y la pureza de la proteína C17B3 obtenida mediante SDS-PAGE. El proceso específico es: tomar 40 j l de solución de proteína purificada, añadir 10 j l de tampón de carga de proteína 5x (Tris-HCl 250 mM (pH: 6,8), SDS al 10 %, azul de bromofenol al 0,5 %, glicerol al 50 %, p-mercaptoetanol al 5 %), hervir en agua hirviendo a 100 °C durante 10 min, después añadir 10 j l por pocillo al gel de proteína de SDS-PAGE, operar a 80 V durante 2h, y teñir la proteína con solución de tinción de azul brillante de Coomassie (azul brillante de Coomassie R-250 al 0,1 %, isopropanol al 25 %, ácido acético glacial al 10 %) durante 20 min, después utilizar solución de decoloración de proteínas (ácido acético al 10 %, etanol al 5 %) para la decoloración. Finalmente, medir la actividad proteica en comparación con el colágeno natural humano.

[0193] Construcción y expresión del vector de expresión del gen C17C1

[0195] 1. La secuencia génica de longitud completa del colágeno C17C1 de origen humano usada en el Ejemplo 2 se muestra en la SEQ ID No. 8. Esta secuencia ha sido optimizada por codones para los codones de E. coli.

[0196] 2. La longitud completa del gen C17C1 es 357 bp. Según la secuencia génica del codón C17C1 optimizado SEQ ID No. 8, se le encomienda a Beijing Shengyuan Kemeng Gene Biotechnology Co., Ltd. sintetizar el fragmento génico, y después de unir el fragmento génico C17C1 sintetizado a los sitios de restricción de la proteasa del Tev, el fragmento génico se inserta en el vector de expresión PET32a (proporcionado por the Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences) a través de los sitios de restricción Kpn I y Xho I. El plásmido de expresión construido con éxito se transforma en células BL21 competentes de E. coli (DE3) (Merck Company). El proceso específico es el siguiente: 1: tomar 1 j l de este plásmido por 100 j l de células BL21 competentes de E. coli (DE3), y dejarlo reposar en hielo durante 30 minutos. 2: someter la mezcla a choque térmico en un baño de agua a 42 °C durante 90s, a continuación colocarla rápidamente en hielo y dejarla reposar durante 2 min. 3: añadir 600 j l de LB no resistente a la mezcla y cultivar durante 1 hora a 37 °C, 220 rpm. 4: tomar 200 j l de la solución bacteriana y extenderla uniformemente en la placa de LB que contiene resistencia a ampicilina (10 g/L de peptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de cloruro de sodio, 15 g/L de agar, 100 jg/m l de antibióticos de ampicilina). 5: cultivar la placa al revés en una incubadora a 37 °C durante aproximadamente 20h hasta que crezcan colonias claras y visibles.

[0197] 3. Recoger una colonia individual de la placa de LB transformada y cultivarla en 10 ml de medio LB (que contiene 100 pg/ml de antibióticos de ampicilina) durante 12h-16h, después transferirla a medio 2xYT (16 g/L de peptona, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de cloruro de sodio) en la proporción de 1:100 para el cultivo de amplificación, cultivar a 37 °C, 220 rpm hasta que la OD<600>de la solución bacteriana sea 0,4-0,6, añadir IPTG (Sigma Company, Cat. No: 15502-1G) a una concentración final de 0,5 mM para inducir la expresión. Las condiciones de inducción son 18 °C, 180 rpm durante 20h. Finalmente, recoger las bacterias por centrifugación y almacenar a -20 °C o pasar inmediatamente a la siguiente etapa de purificación.

[0199] 4. Volver a suspender (1 L) la precipitación bacteriana usando aproximadamente 50 ml de tampón fosfato (pH 7,8) (dihidrógeno fosfato de sodio 40 mM, cloruro de sodio 500 mM) y romper las bacterias utilizando un instrumento de ruptura de bacterias de alta presión (SCIENTIZ BIO) antes de centrifugar a 13000 rpm durante 30 min para aislar completamente la proteína soluble de los cuerpos de inclusión.

[0201] 5. Equilibrar la columna de afinidad Ni-NTA (Qiagen Company, Cat. No: 30210) con 5 volúmenes de columna de tampón de unión (NaH<2>PO<3>40mM, NaCl 500 mM, pH 7,8). A continuación, añadir el sobrenadante de proteína e incubar a 4 °C durante 0,5-1h para permitir que la proteína recombinante diana se una completamente al material de la columna. Después enjuagar las proteínas impuras con 200 ml de tampón de lavado que contiene imidazol 10 mM (imidazol 10 mM, NaH<2>PO<3>40mM, NaCl 500 mM, pH 7,8) (Sigma Company). Si se necesita la proteína diana marcada con Trx, se puede usar directamente un tampón de elución (imidazol 250 mM, NaH<2>PO<3>40mM, NaCl 500 mM, pH 7,8) para eluir la proteína diana Trx-C17C1. Si es necesario eliminar la proteína diana marcada con Trx, se puede añadir una cantidad apropiada de proteasa del TEV con la etiqueta His. Después de incubar a 4 °C durante 16h, recoger el fluido de flujo, que es el colágeno C17C1 diana con la proteína portadora Trx eliminada.

[0203] 6. La columna de intercambio aniónico puede usarse para la purificación rápida de la proteína diana. Dializar la proteína diana en tampón A (Tris 20 mM, NaCl 15 mM, pH 8,0), dejarla fluir a través de la columna de intercambio aniónico Hitrap Q (GE Healthcare) y eluir en gradiente con tampón B (Tris 20 mM, NaCl 1 M, pH 8,0), recoger diferentes fracciones de elución para detectar las proteínas. Dializar el producto proteico diana obtenido durante la noche, y liofilizarlo en polvo seco para su uso posterior.

[0205] 7. Detectar el peso molecular y la pureza de la proteína C17C1 obtenida mediante SDS-PAGE. El proceso específico es: tomar 40 pl de solución de proteína purificada, añadir 10 pl de tampón de carga de proteína 5x (Tris-HCl 250 mM (pH: 6,8), SDS al 10 %, azul de bromofenol al 0,5 %, glicerol al 50 %, p-mercaptoetanol al 5 %), hervir en agua hirviendo a 100 °C durante 10 min, después añadir 10 pl por pocillo al gel de proteína de SDS-PAGE, operar a 80 V durante 2h, y teñir la proteína con solución de tinción de azul brillante de Coomassie (azul brillante de Coomassie R-250 al 0,1 %, isopropanol al 25 %, ácido acético glacial al 10 %) durante 20 min, después utilizar solución de decoloración de proteínas (ácido acético al 10 %, etanol al 5 %) para la decoloración. Finalmente, medir la actividad proteica en comparación con el colágeno natural humano.

[0207] Resultados

[0209] Los diagramas de electroforesis de las Figuras 2-4 muestran respectivamente que se obtienen las proteínas de fusión Trx-C17A3, Trx-C17B3 y Trx-C17C1 con pesos moleculares aparentes de 42 kDa, 40 kDa y 32 kDa.

[0210] Los diagramas de electroforesis de las Figuras 5-7 muestran respectivamente que se obtienen las proteínas de fusión C17A3, C17B3 y C17C1 con pesos moleculares aparentes de 25 kDa, 23 kDa y 16 kDa.

[0212] Ejemplo 2: Detección de la actividad de adhesión celular de las proteínas C17A3, C17B3 y C17C1

[0214] Para el método de detección de la actividad del colágeno, véase la bibliografía Juming Yao, Satoshi Yanagiosiswa, Tetsuo Asakura, Design, Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crossslinking Sequences Derived from Native Collagens, J Biochem. 136, 643-649 (2004). El método de implementación específico es el siguiente:

[0216] 1. Detectar la concentración de la muestra de proteína que se va a detectar, incluyendo muestras de proteína control de colágeno humano (Sigma, C7774), C17A3, C17A1 (SEQ ID No. 1, preparadas por el mismo método que C17A3), C17B3, C17B1 (SEQ ID No. 2, preparadas por el mismo método que C17<b>3) y C17C1 utilizando el método de absorción ultravioleta (UV). Específicamente, determinar la absorción UV de las muestras a 215 nm y 225 nm, y calcular las concentraciones de proteína mediante la fórmula empírica C(pg/mL)=144X(A215-A225). Debe observarse que es necesario detectarlo cuando A215<1,5. El principio de este método es determinar la absorción característica de los enlaces peptídicos bajo luz UV lejana, que no se ve afectada por el contenido de cromóforo, tiene menos sustancias de interferencia, y es simple de operar. Es adecuado para detectar el colágeno humano y sus análogos que no están coloreados con azul brillante de Coomassie. (La referencia es Walker JM. The Protein Protocols Handbook, second edition. Humana Press. 43-45). Después de detectar las concentraciones de proteína, ajustar las concentraciones de todas las proteínas detectadas a 0,5 mg/ml con PBS.

[0217] 2. Añadir 100 |jl de diversas soluciones de proteína y control en blanco de solución de PBS a la placa de 96 pocilios, y dejarla reposar a temperatura ambiente durante 60 min.

[0218] 3. Añadir 105 células 3T3 cultivadas en pocillos (de TeacherTong Pei, Tsinghua University) en cada pocillo, e incubar a 37 °C durante 60 minutos.

[0219] 4. Lavar cada pocillo con PBS 4 veces.

[0220] 5. Detectar la absorbancia a OD<492>nm con el kit de detección de LDH (Roche, 04744926001). La absorbancia a OD<492>nm puede reflejar la actividad de adhesión celular del colágeno o de sus fragmentos. Cuanto mayor sea la actividad de adhesión celular de la proteína, más podrá proporcionar a las células un entorno externo de alta calidad en poco tiempo, ayudando a que las células se adhieran a la pared.

[0221] Véanse las Figuras de 8 a 10 para los resultados. Las Figuras de 8 a 10 se representan gráficamente basándose en el error promedio y estándar de OD<492>nm a partir de tres experimentos paralelos.

[0222] Los resultados de las Figuras de 8 a 10 muestran que los tres colágenos recombinantes humanos (es decir, C17A3, C17B3 y C17C1) tienen todos una buena actividad de adhesión celular en comparación con el colágeno humano comercial.

[0223] Secuencias

[0224] SEQ ID No. 1 (C17A)GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPG1FGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPG MEGPMGQRGREGPMGPRGEASEQ ID No. 2 (C17B)

[0225] GLQGLRGE VGLPG VKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLT GEPGMRGLP GAVGEPGAKGAMGPASEQ ID No. 3 (C17C1)GADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGI SKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPP GHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQSEQ ID No. 4 (C17A3)GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPG MEGPMGQRGREGPMGPRGEAGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGP LGTIPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGSPGPKGD MGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQR GREGPMGPRGEASEQ ID No. 5 (C17A3-DNA)

[0226] GGTAGCCC AGGTCCAAAAGGT GATAT GGGAAGCCC AGGT CCGAAAGG TGATCGTGGTTTTCCGGGTACACCAGGTATTCCGGGTCCACTGGGTCAT C C AGGTCCGC AAGGT CCGAAAGGCCAGAAAGGTAGCGT GGGT GATCC GGGTATGGAAGGGCCTATGGGGCAGCGTGGGCGTGAAGGGCCGATGG GTCCGCGTGGTGAAGCAGGTAGCCCGGGGCCTAAAGGGGATATGGGG AGTCCGGGTCCGAAAGGGGATCGTGGATTTCCGGGTACGCCGGGTATC CCGGGTCCGCTGGGTCATCCGGGTCCGCAAGGGCCTAAAGGTCAGAA AGGTAGTGTGGGTGATCCTGGTATGGAAGGTCCGATGGGTCAGCGTGG TCGTGAGGGTCCGATGGGACCGCGTGGTGAGGCTGGTAGCCCTGGTCC GAAAGGAGATATGGGTAGCCCGGGTCCGAAAGGTGACCGTGGTTTTCC TGGTACACCGGGTATTCCAGGGCCTCTGGGTCATCCTGGTCCTCAGGGT CCGAAAGGTCAGAAAGGGAGTGTGGGAGATCCGGGTATGGAGGGTCC GATGGGGCAGCGCGGTCGTGAAGGTCCGATGGGCCCGCGTGGTGAAG

[0227] CC

[0228] SEQ ID No. 6 (C17B3)GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLP GAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGE KGPRGLT GEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGE V GLPGVKGD KGPMGPPGPKGD QGEKGPRGLT GEPGMRGLPG AVGEPGAKGAMGPA

[0229] SEQ ID No. 7 (C17B3-DNA)

[0230] GGT CT GCAGGGTCT GCGT GGT GAAGTAGGACT GCCGGGT GT GAAAGG AG ATAAAGG ACC AAT G GG TCC ACCAG G ACC AAAAGG AG AT C AAGG AG AAAAAGGACCACGT GGTCTGAC AGGT GAACCGGGTAT GCGT GGGCT G CCGGGAGCAGTTGGAGAACCGGGAGCAAAAGGAGCAATGGGTCCAG C AGGACT GCAGGGT CT GCGCGGT GAAGTGGGACT GCCT GGT GTTAAA GGGGATAAAGGGCCGATGGGTCCGCCGGGTCCGAAAGGAGATCAGGG AGAAAAAGGGCC GCGT GGTCTGACCGGTGAACCGGGAAT GCGT GGT C TGCCGGGGGCTGTGGGTGAGCCAGGTGCAAAAGGTGCAATGGGTCCT GC AGGT C T GC AAGGACTGCGT GGAG AAGT GGGT C T GCCT GGT GT GA A AGGT GATAAAGGT CCGAT GGGT CCT CCGGGT CCGAAAGGT GAT C AGGG T GAAAAAGGT CCGCGT GGT CT GACGGGT G AACCGGGC AT GCGT GGT C TGCCTGGGGCAGTTGGTGAACCGGGGGCAAAAGGTGCTATGGGGCCG GCA

[0231] SEQ ID No. 8 (C17C1-DNA)

[0232] GGT GC AGAT TTT GC AGGT GAT CT GGATTATAAT GAACT GGC AGTT C GTG TTAGCGAAAGCATGCAGCGTCAGGGACTGCTGCAGGGAATGGCATATA CCGTTCAGGGT CCGCCGGGT C A GCCGGGT CCT C A AGGT CCT CCT GGTA TTAGCAAAGTTTTTAGTGCATATTCAAACGTGACGGCAGATCTGATGGA TTTTTTTCAGACGTATGGTGCAATTCAGGGTCCTCCTGGGCAAAAAGG

[0233] TGAAATGGGTACACCTGGTCCGAAAGGCGATCGTGGTCCGGCCGGTCC GCCGGGCCACCCTGGTCCTCCTGGCCCTCGTGGTCATAAAGGTGAGAA AGGTGATAAAGGTGATCAA

[0234] SEQ ID No. 9 (COL17A1)MDVTKKNKRDGTEVTER1VTETVTTRLTSLPPKGGTSNGYAKTASLGGGS RLEKQSLTHGSSGYINSTGSTRGHASTSSYRRAHSPASTLPNSPGSTFERKT HVTRHAYEGSSSGNSSPEYPRKEFASSSTRGRSQTRESEIRVRLQSASPSTR WTELDDVKRLLKGSRSASVSPTRNSSNTLPIPKKGTVETKIVTASSQSVSG TYDAT1LDANEPSHVWSSTEPAGSSMGTYHNNMTTQSSSLLNTNAYSAGS VF GVPNNMASC SPTLHPGL STS S S VF GMQNNL APSLTTL SHGTTTT STAYG VKKNMPQSPA AVNTG VST S A ACTT S VQ SDDLLHKDCKFLTLEKDNTPAK KEMELLIMTKDSGKVFTASPASIAATSFSEDTLKKEKQAAYNADSGLKAE ANGDLKTVSTKGKTTTAD1HSYGSSGGGGSGGGGGVGGAGGGPWGPAP AWCPCGSCCSWWKWLLGLLLTWLLLLGLLFGLIALAEEVRKLKARVDEL ERTRRSTLPYGDSMDRTEKDRLQGMAPAAGADLDKrGLHSDSQEELWMFV RKKLMMEQENGNLRGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGP QGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGPPGSGEKGERGA AGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVK GDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA GPDGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLFGPQGPQGEPGTPGR PGIKGEPGAPGKIVTSEGSSMLTVPGPPGPPGAMGPPGPPGAPGPAGPAGL PGHQEVLNLQGPPGPPGPRGPPGPSIPGPPGPRGPPGEGLPGPPGPPGSFLS NSETFLSGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSTSGSSSFGLNL QGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPSGPSEGGSSSTMYVSGPPGPPGP PGPPGSISSSGQEIQQYTSEYMQSDSTRSYLSGVQGPPGPPGPPGPVTTTTGE TFD Y SEL ASH V VS YLRTSGYGVSLF S S SIS SEDIL AVLQRDD VRQ YLRQ YL MGPRGPPGPPGASGDOSLLSLDYAELSSRILSYMSSSGISIGLPGPPGPPGL PGTSYEELLSLLRGSEFRGIVGPPGPPGPPGIPGNVWSSISVEDLSSYLHTA GLSFIPGPPGPPGPPGPRGPPGVSGALATYAAENSDSFRSELISYLTSPDVRS FTVGPPGPPGPQGPPGDSRLLSTDASHSRGSSSSSHSSSVRRGSSYSSSMST GGGGAGSLGAGGAF GE AAGDRGP Y GT DIGPGGG Y GAAAEGGM YAGN G GLLGADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQG PPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPA GPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ V YAGRRRRRS1AV KP

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que tiene actividad de adhesión celular, en donde

(i) el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. SEQ ID No. 3,

b. SEQ ID No. 3, en donde 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos están sustituidos, añadidos o insertados, eliminados, y

c. una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID No. 3;

(ii) el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a. SEQ ID No. 4,

b. SEQ ID No. 4, en donde 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos están sustituidos, añadidos o insertados, eliminados y

c. una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID No. 4; o

(iii) el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a. SEQ ID No. 6,

b. SEQ ID No. 6, en donde 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos están sustituidos, añadidos, insertados o eliminados, y

c. una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID No. 6.

2. El polipéptido según la reivindicación 1, en donde

b. SEQ ID No. 3, en donde 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos están sustituidos, añadidos, insertados o eliminados, y

(ii) el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. SEQ ID No. 4,

b. SEQ ID No. 4, en donde 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos están sustituidos, añadidos, insertados o eliminados, y

(iii) el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. SEQ ID No. 6,

c. una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 91 %,

92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % con la SEQ ID No. 6.

3. El polipéptido según la reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No 3,<s>E<q>ID No 4 y SEQ ID No 6.

4. Un polinucleótido que codifica el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, preferiblemente un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, o SEQ ID No. 8.

5. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 4.

6. Una célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 5 o que expresa el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la célula huésped es preferiblemente una célula de E. coli.

7. Un método para preparar el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende: (1) cultivar la célula huésped según la reivindicación 6 en un medio de producción;

(2) aislar el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 a partir de la célula huésped.

8. Una composición que comprende el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el polipéptido preparado según el método de la reivindicación 7.

9. Un artículo que comprende el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el polipéptido preparado según el método de la reivindicación 7 o la composición según la reivindicación 8, en donde el artículo es una composición farmacéutica, un dispositivo médico, un producto de ingeniería de tejidos, cosméticos o un producto sanitario, preferiblemente la composición farmacéutica es una preparación tópica, preferiblemente una preparación tópica para frotis, tal como un gel tópico o una preparación de infiltración tópica; en donde preferiblemente el gel tópico comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, y la preparación de infiltración tópica comprende además una bola de algodón médica estéril.

10. El uso del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el polipéptido preparado mediante el método de la reivindicación 7, el polinucleótido de la reivindicación 4, el vector de expresión de la reivindicación 5, la célula huésped de la reivindicación 6 o la composición de la reivindicación 8 en la preparación de artículos, preferiblemente dispositivos médicos, productos de ingeniería de tejidos, cosméticos y productos sanitarios.

11. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el polipéptido preparado mediante el método de la reivindicación 7 para su uso como un medicamento.

12. El uso del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el polipéptido preparado mediante el método de la reivindicación 7 en cosméticos.