ES2971871T3 - Composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas - Google Patents

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Susanne Wieland
Nina Mussmann
Taija Leinonen
Leena Valtakari
Michael Rachinger
Kari Juntunen
Daniela Dollak
Patrick Lorenz
Jari Vehmaanperä
Pentti Ojapalo
Terhi Puranen
Kristiina Järvinen
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Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevas composiciones de detergente que comprenden enzimas mananasas bacterianas. Las composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas resultan útiles en aplicaciones de lavandería y limpieza en las que se desea la degradación o modificación de los mananos. La invención se refiere, además, a la utilización de dichas composiciones de detergente en aplicaciones de lavandería y limpieza, así como a un método para la degradación de los mananos.
Antecedentes
Los mananos son polisacáridos que contienen manosa que se encuentran en diversas plantas. Los mananos son poco solubles en medio acuoso y sus propiedades físicoquímicas dan lugar a dispersiones viscosas. Además, los mananos presentan una elevada capacidad de ligado del agua. La totalidad de dichas características provoca problemas en varias industrias, entre las que se incluyen, las de la elaboración de cerveza, panificación, nutrición animal, y aplicaciones de lavandería y limpieza.
En las dietas a base de plantas se encuentran presentes diferentes p-mananos y según sus cantidades y propiedades pueden comprometer la digestión de los nutrientes, la colonización por microorganismos y el rendimiento de crecimiento. La degradación enzimática de los mananos reduce la viscosidad del contenido intestinal de los mananos altamente solubles en agua y lleva a la producción de mano-oligosacáridos que pueden formar mananos lineales insolubles en agua presentes en las leguminosas. La mananasa incrementa la ganancia diaria de peso, la eficiencia, la uniformidad de peso y viabilidad en todos los animales monogástricos.
Para las aplicaciones de alimentación animal, tales como piensos para animales monogástricos con dietas de cereales, el manano es un factor que contribuye a la viscosidad del contenido intestinal y, por lo tanto, afecta adversamente a la digestibilidad del pienso y a la tasa de crecimiento animal. En el caso de los rumiantes, el manano representa un componente importante de la ingesta de fibra y una digestión más completa del manano facilitaría eficiencias de conversión más altas del pienso.
En las aplicaciones de lavandería y limpieza, las composiciones de detergente que comprenden mananasa pueden utilizarse para degradar el manano. Sin embargo, resulta difícil proporcionar mananasas que sean estables en diferentes tipos de almacenamiento y condiciones de uso y que simultáneamente muestren una buena actividad de degradación de los mananos.
Es un objetivo de la presente invención proporcionar composiciones de detergente que comprenden nuevos enzimas que muestran actividad de mananasa al utilizarlos en dichas composiciones de detergente. Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar composiciones de detergente que presentan un rendimiento incrementado de eliminación de manchas en aquellas que contienen manano.
El documento n.° WO 99/646169 da a conocer una composición de detergente para la eliminación de manchas en textiles, que comprende enzimas mananasas que presentan diversas secuencias.
Dhawan Samritil et al. proporcionan una visión general de las mananasas microbianas, en particular sobre la compleja estructura del manano y el complejo enzimático microbiano que participa en su degradación completa, fuentes de mananasa, condiciones de protección y las aplicaciones en el sector comercial.
Sumario
Según el primer aspecto de la invención se proporciona una composición de detergente que comprende por lo menos un enzima que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 12 (Man6), en la que el enzima o enzimas presentan actividad de degradación de mananos.
En una realización de la invención, el enzima o enzimas presentan una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 94 %, de por lo menos 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 % o de por lo menos 99 % respecto a SEC ID n.° 12.
Las mananasas comprendidas en la composición de detergente de la invención resultan adecuadas para degradar y modificar el material que contiene mananos en diversos medios químicos, preferentemente en composiciones de detergente.
En una realización de la presente invención, la composición de detergente comprende, además, uno o más enzimas adicionales seleccionados del grupo que consiste en proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, pectato liasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, xantanasa, lacas y/o peroxidasa, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en proteasas, amilasas, celulasas y lipasas.
En una realización adicional de la presente invención, la composición de detergente se encuentra en forma de una barra, una tableta homogénea, una tableta que presenta dos o más capas, una bolsa que presenta uno o más compartimientos, unos polvos regulares o compactados, un granulado, una pasta, un gel o un líquido regular, compacto o concentrado. En una realización, la composición de detergente puede ser una composición de detergente de lavandería, preferentemente una composición de detergente de lavandería líquida o sólida.
La presente invención se refiere, además, a la utilización de la composición de detergente tal como se describe en la presente memoria para la degradación de mananos.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a la utilización de la composición de detergente tal como se describe en la presente memoria en un procedimiento de lavandería.
La presente invención se refiere, además, a un método para eliminar una mancha de una superficie, que comprende poner en contacto la superficie con una composición de detergente tal como se describe en la presente memoria.
La presente invención se refiere, además, a un método para degradar mananos, que comprende aplicar una composición de detergente tal como se describe en la presente memoria en manano, preferentemente en la que el manano se encuentra sobre la superficie de un textil.
Breve descripción de las figuras
La fig. 1 muestra una representación esquemática del vector pEV1 para la replicación enBacillus.
La fig. 2 muestra esquemáticamente casetes de expresión utilizados en la transformación de protoplastos deTrichoderma reeseipara la sobreproducción de las proteínas mananasas recombinantes (Man6 (invención), Man7 (de referencia) y Man14 (de referencia)). Los genes de mananasa se encontraban bajo el control del promotorcel7A/cbh1deT. reesei (pcbhl)y la terminación de la transcripción se aseguró mediante la utilización de la secuencia de terminadorcel7A/cbh1deT. reesei (tcbhl).Se incluyó el genamdScomo marcador de transformación.
La fig. 3 muestra el perfil de temperatura de las mananasas Man6 recombinante (invención), Man7 (de referencia) y Man14 (de referencia) (producida porBacillus)sometidas a ensayo en tampón de Britton-Robinson 40 mM, pH 7, en 10 min de tiempo de reacción; como sustrato se utilizó galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina. Todas las mediciones se llevaron a cabo por lo menos por duplicado. Los puntos de datos son medias de mediciones independientes.
La fig. 4 describe el efecto del pH sobre la actividad de proteína mananasa Man 6 recombinante (invención), Man7 (de referencia) y Man14 (de referencia) (producida enBacillus)en tampón de Britton-Robinson 40 mM, a un pH de entre 4 y 11. La temperatura de reacción era de 50 °C y el tiempo de reacción era de 10 min. Como sustrato se utilizó galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina. Todas las mediciones se llevaron a cabo por lo menos por duplicado. Los puntos de datos son medias de mediciones independientes.
La fig. 5 muestra el análisis de SDS-PAGE de mananasas bacterianas.
La fig. 6 describe el rendimiento de eliminación de manchas de Man6 (invención) y Man7 (de referencia) (producida enBacillusy enTrichoderma)como incremento de la luminosidad (suma de AL* de 4 manchas) en la presencia de 4,4 g/l de detergente líquido comercial de uso industrial A a 40 °C, 16 °dH, durante 60 min, pH aprox. de 8,3 y enzimas dosificados como unidades de actividad. Para la comparación se utilizó la preparación comercial Mannaway® 4,0 l.
La fig. 7 describe el rendimiento de eliminación de manchas de Man6 (invención) y Man7 (de referencia) (producida enBacillus)como incremento de la luminosidad (suma de AL* de 4 manchas) en la presencia de 4,4 g/l de detergente líquido comercial de uso industrial A a 40 °C, 16 °dH, durante 60 min, pH aprox. de 8,3 y enzimas dosificados como proteína enzimática activa (PEA). Para la comparación se utilizó la preparación comercial Mannaway® 4,0 l.
La fig. 8 describe el rendimiento de eliminación de manchas de Man6 (invención) y Man7 (de referencia) (producida enBacillus)como incremento de la luminosidad (suma de AL* de 4 manchas) en la presencia de 3,8 g/l de detergente en polvo comercial para color a 40 °C, 16 °dH, durante 60 min, pH aprox. de 10 y enzimas dosificados como unidades de actividad. Para la comparación se utilizó la preparación comercial Mannaway® 4,0 l.
La fig. 9 describe el rendimiento de eliminación de manchas de Man6 (invención) y Man7 (de referencia) (producida enBacillus)como incremento de la luminosidad (suma de AL* de 4 manchas) en la presencia de 3,8 g/l de detergente en polvo comercial para color a 40 °C, 16 °dH, durante 60 min, pH aprox. de 10 y enzimas dosificados como unidades de actividad. Para la comparación se utilizó la preparación comercial Mannaway® 4,0 l.
La fig. 10 describe el rendimiento de eliminación de manchas de Man6 (invención) y Man7 (de referencia) (producida enBacillus)como incremento de la luminosidad (suma de AL* de 3 manchas) en la presencia de 4,2 g/l de detergente blanqueador en polvo comercial a 40 °C, 16 °dH, durante 60 min, pH aprox. de 9,5 y enzimas dosificados como proteína enzimática activa. Para la comparación se utilizó la preparación comercial Mannaway® 4,0 l.
Fig. 11: rendimiento de eliminación de manchas de Man14 (de referencia) (producido enBacillus)como incremento de la luminosidad (suma de AL* de 2 manchas) en la presencia de 5 g/l de detergente líquido comercial de uso industrial B a 40 °C, 16 °dH, durante 60 min, pH aprox. de 8,3 y enzimas dosificados como unidades de actividad. Para la comparación se utilizó la preparación comercial Mannaway® 4,0 l.
Fig. 12: rendimiento de eliminación de manchas de Man14 (de referencia) (producido enBacillus)como incremento de la luminosidad (suma de AL* de 2 manchas) en la presencia de 5 g/l de detergente líquido comercial de uso industrial B a 40 °C, 16 °dH, durante 60 min, pH aprox. de 8,3 y enzimas dosificados como proteína enzimática activa. Para la comparación se utilizó la preparación comercial Mannaway® 4,0 l.
La fig. 13 describe la estabilidad de Man6 y Man7 (de referencia) (producido enBacillus)en detergente líquido (OMO Color) a 37 °C. Para la comparación se utilizó la preparación comercial Mannaway® 4,0 l.
La fig. 14 describe la estabilidad de Man6 (producido enBacillus)en detergente líquido comercial de uso industrial A. Para la comparación se utilizó la preparación comercial Mannaway® 4,0 l.
LISTADO DE SECUENCIAS
SEC ID n° 1. Secuencia del cebador oligonucleótido Man6_1
SEC ID n° 2. Secuencia del cebador oligonucleótido Man6_2
SEC ID n° 3. Secuencia del cebador oligonucleótido Man7_1 (de referencia)
SEC ID n° 4. Secuencia del cebador oligonucleótido Man7_2 (de referencia)
SEC ID n° 5. Secuencia del cebador oligonucleótido Man14_1 (de referencia)
SEC ID n° 6. Secuencia del cebador oligonucleótido Man14_2 (de referencia)
SEC ID n° 7. Secuencia del cebador oligonucleótido Vec_1
SEC ID n° 8. Secuencia del cebador oligonucleótido
SEC ID n° 9. Secuencia de nucleótidos de Man6 deii
SEC ID n° 10. Secuencia d enucleótidos de Man6 desiisin secuencia codificante de péptido de señal y con optimización de codones paraTrichoderma ree
SEC ID n° 11. Secuencia de aminoácidos deducida n6 deBacillus clausii
SEC ID n° 12. Secuencia de aminoácidos deducida n6 deBacillus clausiisin péptido de señal SEC ID n° 13. Secuencia de nucleótidos de Man7 deicellulosilyticus(de referencia)
SEC ID n.° 14. Secuencia de nucleótidos de Man7emicellulosilyticussin secuencia codificante de péptido de señal y con optimización de codones parareesei(de referencia).
SEC ID n° 15. Secuencia de aminoácidos deducida n7 deBacillus hemicellulosilyticus(de referencia) SEC ID n° 16. Secuencia de aminoácidos deducida n7 deBacillus hemicellulosilyticussin péptido de señal (de referencia)
SEC ID n° 17. Secuencia de nucleótidos de Man14 deVirgibacillus soli(de referencia)
SEC ID n° 18. Secuencia d enucleótidos de Man14 deVirgibacillus solisin secuencia codificante de péptido de señal y con optimización de codones paraTrichoderma reesei(de referencia)
SEC ID n° 19. Secuencia de aminoácidos deducida de Man14 deVirgibacillus soli(de referencia)
SEC ID n° 20. Secuencia de aminoácidos deducida de Man14 deVirgibacillus solisin péptido de señal (de referencia)
SEC ID n° 21 Secuencia del cebador oligonucleótido BMAN1
SEC ID n° 22 Secuencia del cebador oligonucleótido BMAN2
SEC ID n° 23 Secuencia del cebador oligonucleótido BMAN3
SEC ID n° 24 Secuencia del cebador oligonucleótido BMAN4
SEC ID n° 25. Secuencia de nucleótidos de Man31 deBacillus pumilus(de referencia)
SEC ID n° 26. Secuencia de aminoácidos deducida de Man31 deBacillus pumilus(de referencia)
SEC ID n° 27. Secuencia de nucleótidos de Man32 deBacillus amyloliquefaciens(de referencia)
SEC ID n° 28. Secuencia de aminoácidos deducida de Man32 deBacillus amyloliquefaciens(de referencia)
SEC ID n° 29. Secuencia de nucleótidos de Man33 deAmphibacillus xylanus(de referencia)
SEC ID n° 30. Secuencia de aminoácidos deducida de Man33 deAmphibacillus xylans(de referencia)
SEC ID n° 31 Secuencia de nucleótidos de Man34 dePaenibacillus polymyxa(de referencia)
SEC ID n° 32 Secuencia de aminoácidos deducida de Man34 dePaenibacillus polymyxa(de referencia)
SEC ID n° 33 Secuencia de nucleótidos de Man35 deBacillus hemicellulosilyticus(de referencia)
SEC ID n° 34. Secuencia de aminoácidos deducida de Man35 deBacillus hemicellulosilyticus(de referencia) SEC ID n° 35. Secuencia de nucleótidos de Man36 deBacillus alcalophilus(de referencia)
SEC ID n° 36. Secuencia de aminoácidos deducida de Man36 deBacillus alcalophilus(de referencia)
SEC ID n° 37 Secuencia de nucleótidos de Man37 deBacillussp. (de referencia)
SEC ID n° 38 Secuencia de aminoácidos deducida de Man37 deBacillussp. (de referencia)
SEC ID n° 39. Secuencia de nucleótidos de Man38 deBacillus circulans(de referencia)
SEC ID n° 40. Secuencia de aminoácidos deducida de Man38 deBacillus circulans(de referencia)
SEC ID n° 41. Secuencia de nucleótidos de Man39 dePaenibacillussp. (de referencia)
SEC ID n° 42. Secuencia de aminoácidos deducida de Man39 dePaenibacillussp. (de referencia)
SEC ID n° 43. Secuencia de nucleótidos de Man40 deBacillus circulans(de referencia)
SEC ID n° 44. Secuencia de aminoácidos deducida de Man40 deBacillus circulans(de referencia)
SEC ID n° 45. Secuencia de nucleótidos de Man41 deBacillus nealsonii(de referencia)
SEC ID n° 46. Secuencia de aminoácidos deducida de Man41 deBacillus nealsonii(de referencia)
SEC ID n° 47. Secuencia de nucleótidos de Man42 deBacillus circulans(de referencia)
SEC ID n° 48. Secuencia de nucleótidos de Man42 deBacillus circulans(de referencia)
Descripción detallada
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término «aislado» significa una sustancia en una forma o medio en que no se observa naturalmente. Entre los ejemplos no limitativos de sustancias aisladas se incluyen: (1) cualquier sustancia no existente naturalmente, (2) cualquier sustancia, incluyendo cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se ha separado por lo menos parcialmente respecto de uno o más, o la totalidad, de los constituyentes presentes normalmente con los que está asociado en la naturaleza, (3) cualquier sustancia modificada artificialmente respecto a esa sustancia tal como se encuentra naturalmente, o (4) cualquier sustancia modificada mediante incremento o reducción de la cantidad de la sustancia respecto a otros componentes con los que se encuentra asociada naturalmente (p. ej., la producción recombinante en una célula anfitriona; una o múltiples copias de un gen codificante de la sustancia, y la utilización de un promotor alternativo al promotor naturalmente asociado al gen codificante de la sustancia). En una realización, se aísla un polipéptido, enzima, polinucleótido, célula anfitriona o composición de la invención.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término «comprendiendo» incluye los significados más amplios de «incluyendo», y «conteniendo», así como las expresiones de significado más específico «que consiste en» y «que consiste exclusivamente en».
Tal como se utiliza en la presente memoria, «fragmento» significa una proteína o un polinucleótido que presenta una o más deleciones de aminoácido o nucleótido. En el contexto del ADN, un fragmento incluye tanto ADN de cadena sencilla como ADN de doble cadena, de cualquier longitud. Un fragmento podría ser un fragmento activo que presenta la función biológica, tal como actividad enzimática o actividad reguladora, de la proteína o polinucleótido. Un fragmento también podría ser un fragmento inactivo, es decir, no presenta uno o más efectos biológicos de la proteína o polinucleótido nativo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, «variante» significa un fragmento de secuencia (de nucleótidos o de aminoácidos) insertado o delecionado de uno o más nucleótidos/aminoácidos o que está químicamente modificado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un «péptido» y un «polipéptido» son secuencias de aminoácidos que incluyen una pluralidad de residuos aminoácidos polimerizados consecutivos. Para el propósito de la presente invención, los péptidos son moléculas que incluyen hasta 20 residuos aminoácidos, y polipéptidos que incluyen más de 20 residuos aminoácidos. El péptido o polipéptido puede incluir residuos aminoácidos modificados, residuos aminoácidos naturales no codificados por un codón y residuos aminoácidos no naturales. Tal como se utiliza en la presente memoria, una «proteína» puede referirse a un péptido o a un polipéptido de cualquier tamaño. Una proteína puede ser un enzima, una proteína, un anticuerpo, una proteína membranal, una hormona peptídica, regulador o cualquier otra proteína.
El término «polinucleótido» denota un polímero de cadena sencilla o doble cadena de bases desoxirribonucleótidas o ribonucleótidas leídas de extremo 5' a extremo 3'. Entre los polinucleótidos se incluyen ARN y ADN y pueden aislarse a partir de fuentes naturales, sintetizarse in vitro o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, «modificación», «modificado» y términos similares en el contexto de los polinucleótidos se refieren a la modificación en una región codificante o en una región no codificante del polinucleótido, tal como una secuencia reguladora, región 5' no traducida, región 3' no traducida, elemento genético de regulación positiva, elemento genético de regulación negativa, intensificador, supresor, promotor, o zona de exón o de intrón. La modificación puede ser, en algunas realizaciones, solo estructural, sin presentar ningún efecto sobre el efecto, acción o función biológica del polinucleótido. En otras realizaciones, la modificación es una modificación estructural que proporciona un cambio en el efecto, acción o función biológica del polinucleótido. Dicha modificación puede potenciar, suprimir o cambiar la función biológica del polinucleótido.
Tal como se utiliza en la presente memoria, «identidad» significa el porcentaje de coincidencias exactas de residuos aminoácidos entre dos secuencias alineadas a lo largo del número de posiciones en las que hay residuos presentes en ambas secuencias. En el caso de que una secuencia presente un residuo sin ningún residuo correspondiente en la otra secuencia, el programa de alineación permite un hueco en la alineación y esa posición no se cuenta en el denominador del cálculo de identidad. La identidad es un valor determinado con la herramienta de alineación de secuencias por pares EMBOSS Needle en el sitio web de EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/).
Tal como se utiliza en la presente memoria, «célula anfitriona» significa cualquier tipo celular que es susceptible de transformación, transfección, transducción, apareamiento, cruce o similar con un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido. La expresión «célula anfitriona» comprende cualquier progenie que no sea idéntica debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. Son ejemplos no limitativos de una célula anfitriona, células fúngicas, células fúngicas filamentosas de la DivisiónAscomycota,SubdivisiónPezizomycotina;preferentemente del grupo que consiste en miembros de la ClaseSordariomycetes,SubclaseHypocreomycetidae,ÓrdenesHypocrealesyMicroascalesyAspergillus, Chrysosporium, MyceliophthorayHumicola;más preferentemente del grupo que consiste en las familiasHypocreacea, Nectriaceae, ClavicipitaceaeyMicroascaceae,y los génerosTrichoderma(anamorfo deHypocrea), Fusarium, Gibberella, Nectria, Stachybotrys, Claviceps, Metarhizium, Villosiclava, Ophiocordyceps, CephalosporiumyScedosporium;más preferentemente del grupo que consiste enTrichoderma reesei (Hypocrea jecorina), T. citrinoviridae, T. longibrachiatum, T. virens, T. harzianum, T. asperellum, T. atroviridae, T. parareesei,,Fusarium oxysporum, F. gramineanum, F. pseudograminearum, F. venenatum, Gibberella fujikuroi, G. moniliformis, G. zeaea, Nectria (Haematonectria) haematococca, Stachybotrys chartarum, S. chlorohalonata, Claviceps purpurea, Metarhizium acridum, M. anisopliae, Villosiclava virens, Ophiocordyceps sinensis, Acremonium (Cephalosporium) chrysogenumyScedosporium apiospermumyAspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophila, Humicola insolensyHumicola grisea,lo más preferentemente,Trichoderma reesei.Son ejemplos no limitativos de una célula anfitriona, células bacterianas, preferentemente bacilos gram-positivos (p. ej., B.subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciensyB. pumilus),actinomicetales (p. ej.,Streptomycessp.) y levaduras (p. ej.,Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastorisyYarrowia lipolytica)
Una realización de ejemplo de una célula anfitriona es una célula fúngica, preferentemente una célula fúngica filamentosa, tal comoTrichodermaoTrichoderma reesei.Una realización de ejemplo de la célula anfitriona es una célula bacteriana, preferentemente una célula deBacillusgram-positiva, tal como B.subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciensyB. pumilus.
Una «célula recombinante» o «célula anfitriona recombinante» se refiere a una célula o célula anfitriona que ha sido genéticamente modificada o alterada para comprender una secuencia de ácido nucleico que no es nativa a dicha célula o célula anfitriona. En una realización, la modificación genética comprende integrar el polinucleótido en el genoma de la célula anfitriona. En otra realización, el polinucleótido es exógeno respecto a la célula anfitriona.
Tal como se utiliza en la presente memoria, «expresión» incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido en una célula anfitriona, incluyendo, aunque sin limitación, transcripción, traducción, modificación posttraduccional y secreción. A la expresión puede seguir la recolección, es decir, la recuperación de las células anfitrionas o el producto expresado.
La expresión «vector de expresión» denota una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento codificante un polipéptido de interés operablemente ligado a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Entre dichos segmentos adicionales pueden incluirse secuencias de promotor y de terminador, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un intensificador, una señal de poliadenilación, portador y similares. Los vectores de expresión generalmente se derivan de ADN plasmídico o vírico, o pueden contener elementos de ambos. El vector de expresión puede ser cualquier vector de expresión que se someta convenientemente a procedimiento de ADN recombinante, y la elección del vector con frecuencia dependerá de la célula anfitriona en la que debe introducirse el vector. De esta manera, el vector podría ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe en forma de una entidad extracromosómica, la replicación de la cual es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, al ser introducido en la célula huésped, se integra en el genoma de la célula anfitriona y se replica junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado.
La expresión «expresado recombinantemente» utilizada en la presente memoria en relación con la expresión de un polipéptido o proteína se define según la definición estándar de la técnica.
La expresión «obtenido a partir de» y «obtenible» tal como se utilizan en la presente memoria en relación con una fuente microbiana específica, se refiere a que el polinucleótido y/o polipéptido es producido por la fuente específica (expresión homóloga) o por una célula en la que se ha insertado un gen de la fuente (expresión heteróloga).
La expresión «composición enzimática» s e r fiere a un producto de fermentación enzimática convencional, posiblemente aislado y purificado, a partir de una sola especie de un microorganismo, comprendiendo habitualmente dicha preparación varias actividades enzimáticas diferentes, o una mezcla de enzimas monocomponente, preferentemente enzimas derivados de especies bacterianas o fúngicas mediante la utilización de técnicas recombinantes convencionales, los cuales enzimas han sido fermentados y posiblemente aislados y purificados por separado y que pueden originarse en diferentes especies, preferentemente especies fúngicas o bacterianas, o el producto de fermentación de un microorganismo que actúa como célula anfitriona para la expresión de una mananasa recombinante, pero cuyo microorganismo produce simultáneamente otros enzimas.
La expresión «operablemente ligado», en referencia a segmentos de ADN, denota que los segmentos se disponen de manera que funcionan concertadamente para sus propósitos pretendidos, p. ej., la transcripción se inicia en el promotor y continúa a través del segmento codificante hasta el terminador.
El término «promotor» denota una parte de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias de promotor se encuentran comúnmente, aunque no siempre, en las regiones 5' no codificantes de los genes.
La expresión «secuencia de señal secretoria» denota una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un «péptido secretorio») que, como componente de un polipéptido más grande, dirige al polipéptido de mayor tamaño por una ruta secretoria de una célula anfitriona en la que se sintetiza. La secuencia de señal secretoria puede ser nativa o puede sustituirse por una secuencia de señal secretoria o secuencia portadora de otra fuente. Dependiendo de la célula anfitriona, el péptido de mayor tamaño puede escindirse para eliminar el péptido secretorio durante el tránsito por la ruta secretoria.
La expresión «región de núcleo» denota un dominio de un enzima que podría haber sido modificado o alterado o no, pero que ha conservado su actividad original; el dominio catalítico tal como se conoce en la técnica ha mantenido su funcionalidad.
El término «conector» o «espaciador» se refiere a un polipéptido que comprende por lo menos dos aminoácidos que pueden estar presentes entre los dominios de una proteína multidominio, por ejemplo, un enzima que comprende un centro enzimático y un dominio de unión, tal como un módulo de unión de carbohidrato (MUC) o cualquier otro híbrido enzimático, o entre dos proteínas o polipéptidos expresados en forma de un polipéptido de fusión, por ejemplo una proteína de fusión que comprende dos enzimas centrales. Por ejemplo, la proteína de fusión de un centro enzimático con un MUC se proporciona mediante la fusión de una secuencia de<a>D<n>codificante del centro enzimático, una secuencia de DNA codificante del conector y una secuencia de DNA codificante del MUC secuencialmente en un marco de lectura abierto y la expresión de este constructo.
La expresión «composición de detergente» incluye, a menos que se indique lo contrario, agentes de lavado granulares o en forma de polvos para todos los fines o de uso industrial, especialmente detergentes limpiadores; agentes de lavado para todos los fines líquidos, en gel o en forma de pasta, especialmente los tipos denominados líquido de uso industrial (HDL, por sus siglas en inglés); detergentes líquidos para tejidos finos; agentes para lavar la vajilla a mano o agentes lavavajillas de uso ligero, especialmente aquellos de gran producción de espuma; agentes para lavar la vajilla a máquina, incluyendo los diversos tipos de tableta, gránulo, líquido y abrillantador para uso doméstico e institucional; agentes líquidos de limpieza y desinfección; champús para automóviles o alfombras; limpiadores de baño; limpiadores de metales; así como auxiliares de limpieza, tales como aditivos blanqueadores y agentes quitamanchas o de prelavado. Las expresiones «composición de detergente» y «formulación de detergente» se utilizan en referencia a mezclas que están destinadas al uso en un medio de lavado para limpiar objetos manchados. En algunas realizaciones, el término se utiliza en referencia a la lavandería de telas y/o prendas (p. ej., «detergentes de lavandería»). En realizaciones alternativas, el término se refiere a otros detergentes, tales como los utilizados para lavar platos, cubertería, etc. (p. ej., «detergentes lavavajillas»). No se pretende que la presente invención se encuentre limitada a ninguna formulación o composición de detergente en particular. Se pretende que, además de las variantes según la invención, el término comprenda detergentes que pueden contener, p. ej., tensioactivos, mejoradores de detergente, quelantes o agentes quelantes, sistemas o componentes blanqueadores, polímeros, acondicionadores de tejido, reforzadores de formación de espuma, supresores de espuma de jabón, tintes, perfumes, inhibidores de ennegrecimiento, abrillantadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensión de la suciedad, agentes anticorrosivos, inhibidores o estabilizadores enzimáticos, activadores enzimáticos, una o más transferasas, enzimas hidrolíticos, oxidorreductasas, agentes azulantes y tintes fluorescentes, antioxidantes y solubilizantes.
El término «textil» se refiere a cualquier material textil, incluyendo hilos, intermediarios de hilo, fibras, materiales no tejidos, materiales naturales, materiales sintéticos y cualquier otro material textil, telas fabricadas con estos materiales y productos hechos a partir de telas (por ejemplo, prendas y otros artículos) El textil o tela puede presentar la forma de tejidos de punto, tejidos, tejanos, telas no tejidas, fieltros, hilos y toallas. El textil puede ser a base de celulosa, tal como celulósicos naturales, incluyendo algodón, lino, yute, ramio, sisal o fibra de coco, o celulósicos fabricados (por ejemplo, originados a partir de pulpa de madera), incluyendo viscosa/rayón, ramio, fibras de acetato de celulosa (Tricell), Lyocell, o mezclas de los mismos El textil o tela también puede no estar basado en celulosa, tal como poliamidas naturales, incluyendo lana, camello, cachemira,mohair,conejo y seda, o polímeros sintéticos, tales como nailon, aramida, poliéster, acrílico, polipropileno y Spandex/elastano, o mezclas de los mismos, así como mezclas de fibras basadas en celulosa y no celulósicas. Son ejemplos de mezclas, las mezclas de algodón y/o rayón/viscosa con uno o más materiales acompañantes, tales como lana, fibras sintéticas (p. ej., fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de alcohol polivinílico, fibras de cloruro de polivinilo, fibras de poliuretano, fibras de poliurea y fibras de aramida) y fibras que contienen celulosa (p.ej., rayón/viscosa, ramio, lino, yute, fibras de acetato de celulosa y Lyocell) El tejido puede ser de lavandería lavable convencional, por ejemplo, lavandería doméstica manchada. En donde se utilice el término «tejido» o «prenda», pretende incluir también el término más amplio «textiles».
El término «estabilidad» incluye estabilidad de almacenamiento y estabilidad durante el uso, p. ej., durante un procedimiento de lavado (en estabilidad de lavado) y refleja la estabilidad de la variante de proteasa de acuerdo con la invención como función del tiempo, p. ej., cuánta actividad se retiene al mantener la proteasa en solución, en particular en una solución de detergente. La estabilidad se ve influida por muchos factores, p. ej., pH, temperatura, composición de detergente, p. ej., cantidad de mejorador de detergente, tensioactivos, etc. La estabilidad de la proteasa puede medirse utilizando el «ensayo de estabilidad» tal como se describe en el apartado Materiales y métodos en la presente memoria. La expresión «estabilidad mejorada» o «estabilidad incrementada» se define en la presente memoria como una proteasa variante que muestra una estabilidad incrementada en soluciones, respecto a la estabilidad de la proteasa parental. Las expresiones «estabilidad mejorada» y «estabilidad incrementada» incluyen «estabilidad química mejorada», «estabilidad del detergente» o «estabilidad de detergente mejorada».
Composición de detergente
La presente invención se refiere a nuevas composiciones de detergente que comprenden enzimas mananasas bacterianas. Las composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas resultan útiles en aplicaciones de lavandería y limpieza en las que se desea la degradación o modificación de los mananos. La invención se refiere, además, a la utilización de dichas composiciones de detergente en aplicaciones de lavandería y limpieza, así como a un método para la degradación de los mananos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término «manano» se refiere a polisacáridos que consisten en un esqueleto de manosas unidas entre sí mediante enlaces p-1,4 con cadenas laterales de galactosa unidas al esqueleto mediante enlaces a-1,6. Los mananos comprenden material de origen vegetal, tal como goma guar y goma garrofín. Los glucomananos son polisacáridos que presentan un esqueleto de unidades de manosa y glucosa unidas mediante enlace p-1,4 más o menos regularmente alternantes; los galactomananos y galactoglucomananos son mananos y glucomananos con cadenas laterales de galactosas unidas mediante enlaces alfa-1,6.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término «mananasa» o «galactomananasa» denota un enzima mananasa definido según la técnica como manano endo-1,4-beta-manosidasa y que presenta los nombres alternativos «beta-mananasa» y «endo-1,4-mananasa», y que catalizan la hidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-manosídicos en mananos, galactomananos, glucomananos y galactoglucomananos. Las mananasas se clasifican de acuerdo con la nomenclatura enzimática como EC 3.2.1.78.
La expresión «actividad de mananasa» tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la actividad de degradación de manano de un polipéptido. Degradar o modificar tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que las unidades de manosa son hidrolizadas a partir del polisacárido de manano por la mananasa. La actividad de degradación de manano de los polipéptidos según la presente invención puede someterse a ensayo mediante procedimientos de ensayo estándares conocidos de la técnica. El Ejemplo 7 proporciona un ejemplo de un método estándar para determinar la actividad de mananasa.
Según el primer aspecto, la composición de detergente de la presente invención comprende por lo menos un enzima que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 93 % respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 12 (Man6), en la que el enzima o enzimas presentan actividad de degradación de mananos.
En una realización de la invención, el enzima o enzimas presentan una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 94 %, de por lo menos 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 % o de por lo menos 99 % respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 12.
Las mananasas comprendidas en la composición de detergente de la invención resultan adecuadas para degradar y modificar el material que contiene mananos en diversos medios químicos, preferentemente en composiciones de detergente.
En una realización de la presente invención, la composición de detergente comprende, además, uno o más enzimas adicionales seleccionados del grupo que consiste en proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, pectato liasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, xantanasa, lacas y/o peroxidasa, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en proteasas, amilasas, celulasas y lipasas.
En general, las propiedades del enzima o enzimas seleccionados deben ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.) y el enzima y enzimas deben estar presentes en cantidades eficaces.
Celulasas
Entre las celulasas adecuadas se incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o de proteínas manipuladas. Entre las celulasas adecuadas se incluyen celulasas de los génerosBacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p. ej.,las celulasas fúngicas producidas a partir deHumicola insolens, Myceliophthora thermophilayFusarium oxysporumdadas a conocer en los documentos n.°US 4.435.307, n.° US 5.648.263, n.° US 5.691.178, n.° US 5.776.757 y n.°WO 89/09259. Son células especialmente adecuadas, las celulasas alcalinas o neutras que presentan beneficios de cuidado del color. Se describen ejemplos de dichas celulasas en los documentos n.° EP 0495257, n.° EP 0531 372, n.° WO 96/11262, n.° WO 96/29397 y n.° WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como los indicados en los documentos n.° WO 94/07998, n.° EP 0 531 315, n.° US 5.457.046, n.° US 5.686.593, n.° US 5.763.254, n.° WO 95/24471, n.°WO 98/12307 y n.° PCT/DK98/00299. Son ejemplos de celulasas que muestran actividad endo-beta-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.4), las que se describen en el documento n.° WO02/099091. Entre otros ejemplos de celulasas se incluyen la familia de 45 celulasas descrita en el documento n.° WO96/29397, ay especialmente las variantes de las mismas que presentan una sustitución, inserción y/o deleción en una o más de las posiciones<correspondientes a las posiciones en SEC ID n.° 8 del documento n.°>W<o 02/099091: 2, 4, 7, 8, 10, 13, 15, 19, 20, 21,>25, 26, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 42, 42a, 43, 44, 48, 53, 54, 55, 58, 59, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 72, 76, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 95d, 95h, 95j, 97, 100, 101, 102, 103, 113, 114, 117, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140a, 141, 143a, 145, 146, 147, 150e, 150j, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160c, 160e, 160k, 161, 162, 164, 165, 168, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 188, 191, 192, 195, 196, 200 y/o 20, preferentemente seleccionados de entre P19A, G20K, Q44K, N48E, Q119H o Q146 R. Entre las celulasas disponibles comercialmente se incluyen Celluclean™ Celluzyme™, and Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ y Puradax HA™ (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)™ (Kao Corporation).
Proteasas
Entre las proteasas adecuadas se incluyen las de origen bacteriano, fúngico, vegetal, vírico o animal, p. ej., de origen vegetal o microbiano. Resulta preferente el origen microbiano. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o de proteínas manipuladas. Puede ser una proteasa alcalina, tal como una serina-proteasa o una metaloproteasa. Una serina-proteasa puede ser, por ejemplo, de la familia S1, tal como tripsina, o de la familia S8, tal como la subtilisina. Una proteasa metaloproteasa puede ser, por ejemplo, una termolisina de, p. ej., la familia M4 u otra metaloproteasa, tal como las de las familias M5, M7 o M8.
El término «subtilasas» se refiere a un subgrupo de serina-proteasas según Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y Siezen et al., Protein Science 6 (1997) 501-523. Las serina-proteasas son un subgrupo de proteasas caracterizadas porque presentan una serina en el sitio activo, que forma un aducto covalente con el sustrato. Las subtilasas pueden dividirse en 6 subdivisiones: la familia de la subtilisina, la familia de la termitasa, la familia de la proteinasa K, la familia de la peptidasa lantibiótica, la familia de la kexina y la familia de la pirolisina. Son ejemplos de subtilasas las derivadas deBacillus,tales comoBacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilusyBacillus gibsoniidescritos en los documentos n.° US7262042 y n.° WO09/021867, ysubtilisina lentus, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisina BPN', subtilisina 309, subtilisina 147ysubtilisina 168,descritos en el documento n.° WO89/06279 y la proteasa PD138 descrita en el documento n.° WO93/18140. Otras proteasas útiles pueden ser las descritas en los documentos n.° WO92/175177, n.° WO01/016285, n.° WO02/026024 y n.° WO02/016547. Son ejemplos de proteasas de tipo tripsina, la tripsina (p.ej., de origen porcino o bovino) y la proteasa deFusariumdescrita en los documentos n.° WO89/06270, n.° WO94/25583 y n.° WO05/040372, y las proteasas de quimiotripsina derivadas deCellumonasdescritas en los documentos n.° WO05/052161 y n.° WO05/052146. Una proteasa preferente adicional es la proteasa alcalina deBacillus lentusDSM 5483, tal como se describe en, por ejemplo, el documento n.° WO95/23221, y variantes de la misma, que se describen en los documentos n.° WO92/21760, n.° WO95/23221, n.° EP1921147y n.° EP1921148. Son ejemplos de metaloproteasas las metaloproteasas neutras descritas en el documento n.° WO07/044993 (Genencor Int.) tales como las derivadas deBacillus amyloliquefaciens.
Son ejemplos de proteasas útiles las variantes descritas en: los documentos n.° WO92/19729, n.° WO96/034946, n.° WO98/20115, n.° WO98/20116, n.° WO99/011768, n.° WO01/44452, n.° WO03/006602, n.° WO04/03186, n.° WO04/041979, n.° WO07/006305, n.° WO11/036263, n.° WO11/036264, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las posiciones siguientes: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 y 274 utilizando la numeración BPN'. Más preferentemente, las variantes de subtilasa pueden comprender las mutaciones: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K y T274A (utilizando la numeración BPN'). Entre los enzimas proteasas disponibles comercialmente adecuados se incluyen los comercializados bajo los nombres comerciales Alcalase®, DuralaseTm, DurazymTm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase®y Esperase® (Novozymes A/S), los comercializados bajo los nombres<comerciales Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, PreferenzTm, Purafect m>A<®>,<Purafect Ox®,>Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, EffectenzTm, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, , Opticlean®y Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem™ (Gist-Brocases N.V.), BLAP (secuencia mostrada en la figura 29 del documento n.° US5352604) y variantes en la presente memoria (Henkel AG) y KAP(Bacillus alkalophilussubtilisin) de Kao.
Lipasas y cutinasas
Entre las lipasas y cutinasas adecuadas se incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen enzimas mutantes químicamente modificados o de proteínas manipuladas. Entre los ejemplos se incluyen la lipasa deThermomyces,p. ej., la deT. lanuginosus(previamente denominadaHumicola lanuginosa)tal como se describe en los documentos n.° EP258068 y n.° EP305216, la cutinasa deHumicola,p. ej.,H. insolens(documento n.° WO96/13580), la lipasa de cepas dePseudomonas(algunas de estas ahora se han renombrado comoBurkholderia),p.ej.,P. alcaligenesoP. pseudoalcaligenes(documento n.° EP218272), P.cepacia(documento n.° EP331376),P. sp.cepa SD705 (documentos n.° WO95/06720 y n.° WO96/27002), P.wisconsinensis(documento n.°WO96/12012), lipasas deStreptomycesde tipo GDSL (documento n.° WO10/065455), la cutinasa deMagnaporthe grisea(documento n.° WO10/107560), la cutinasa dePseudomonas mendocina(documento n.° US5.389.536), la lipasa deThermobifida fusca(documento n.°WO11/084412), la lipasa deGeobacillus stearothermophilus(documento n.° WO11/084417), la lipasa deBacillus subtilis(documento n.° WO11/084599) y la lipasa deStreptomyces griseus(documento n.° WO11/150157) y S.pristinaespiralis(documento n.° WO12/l37l47).
Son otros ejemplos, variantes de lipasa tales como las indicadas en los documentos n.° EP407225, n.° WO92/05249, n.° WO94/01541, n.° WO94/25578, n.° WO95/14783, n.° WO95/30744, n.° WO95/35381, n.° WO95/22615, n.° WO96/00292, n.° WO97/04079, n.° WO97/07202, n.° WO00/34450, n.° WO00/60063, n.° WO01/92502, n.° WO07/87508 y n.° WO09/109500.
Entre los productos de lipasa comercial preferentes se incluyen Lipolase™, Lipex™; Lipolex™ y Lipoclean™ (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente de Genencor) y Lipomax (originalmente de Gist-Brocades).
Todavía otros ejemplos son lipasas en ocasiones denominadas aciltransferasas o perhidrolasas, p. ej., aciltransferasas con homología respecto a la lipasa A deCandida antarctica(documento n.° WO10/111143), aciltransferasa deMycobacterium smegmatis(documento n.° WO05/56782), perhidrolasas de la familia CE 7 (documento n.°WO09/67279) y variantes de la perhidrolasa deM. smegmatis,en particular la variante S54V utilizada en el producto comercial Gentle Power Bleach de Huntsman Textile Effects Pte Ltd (documento n.° WO10/100028).
Amilasas
Las amilasas adecuadas que pueden utilizarse junto con variantes de subtilasa de la invención podrían ser una alfaamilasa o una glucoamilasa y podrían ser de origen bacteriano o fúngico. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o de proteínas manipuladas. Entre las amilasas se incluyen, por ejemplo, las alfa-amilasas obtenidas deBacillus,p.ej., una cepa especial deBacillus licheniformis,descrita en mayor detalle en el documento n.°GB 1,296,839.
Entre las amilasas adecuadas se incluyen las amilasas que presentan SEC ID n.° 3 en el documento n.°WO 95/10603 o variantes que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 3 de las mismas. Las variantes preferentes se describen en los documentos n.° WO 94/02597, n.° WO 94/18314, n.° WO 97/43424 y en SEC ID n.° 4 del documento n.° WO 99/019467, tales como variantes con sustituciones en una o más de las posiciones siguientes: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444.
Entre otras amilasas adecuadas se incluyen las amilasas que presentan SEC ID n.° 6 en el documento n.°WO 02/010355 o variantes de las mismas que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a ellas. Las variantes preferentes son aquellas que presentan una deleción en las posiciones 181 y 182 y una sustitución en la posición 193.
Otras amilasas que resultan adecuadas son la alfa-amilasa híbrida que comprende los residuos 1 a 33 de la alfaamilasa derivada deB. amyloliquefaciensmostrada en SEC ID n.° 6 del documento n.° WO 2006/066594 y los residuos 36-483 de la alfa-amilasa deB. licheniformismostrada en SEC ID n.° 4 del documento n.°WO 2006/066594 o variantes que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a la misma. Las variantes preferentes de dicha alfa-amilasa híbrida son aquellas que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 y Q264. Las variantes más preferentes de la alfa-amilasa híbrida que comprenden los residuos 1-33 de la alfa-amilasa derivada deB. amyloliquefaciensmostrada en SEC ID n.° 6 del documento n.° WO 2006/066594 y los residuos 36-483 de SEC ID n.° 4 del documento n.° WO2006/066594 son aquellos que presentan las sustituciones:
M197T;
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; o G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.
Son amilasas adicionales que resultan adecuadas las amilasas que presentan SEC ID n.° 6 en el documento n.° WO 99/019467 o variantes de las mismas que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 6. Son variantes preferentes de SEC ID n° 6, aquellas que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes: R181, G182, h 183, G184, N195, I206, E212, E216 y K269. Son amilasas particularmente preferentes las que presentan una deleción en las posiciones R181 y G182, o en las posiciones H183 y G184. Son amilasas adicionales que pueden utilizarse, aquellas que presentan SEC ID n.° 1, SEC ID n° 3, SEC ID n° 2 o SEQ ID n° 7 del documento n.° WO 96/023873 o variantes de las mismas que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 1, SEC ID n° 2, SEC ID n° 3 o SEQ ID n° 7. Son variantes preferentes de SEC ID n° 1, SEC ID n° 2, SEC ID n° 3 o SEQ ID n° 7, aquellas que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 y 476. Las variantes más preferentes son aquellas que presentan una deleción en las posiciones 181 y 182, o en las posiciones 183 y 184. Las variantes de amilasa más preferentes de SEC ID n° 1, SEC ID n° 2 o s Eq ID n° 7 son aquellas que presentan una deleción en las posiciones 183 y 184 y una sustitución en una o más de las posiciones 140, 195, 206, 243, 260, 304 y 476.
Otras amilasas que pueden utilizarse son las amilasas que presentan SEC ID n.° 2 del documento n.° WO 08/153815, SEC ID n.° 10 en el documento n.° WO 01/66712 o variantes de las mismas que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 2 del documento n.°WO 08/153815 o una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 10 del documento n.°WO 01/66712. Son variantes preferentes de SEC ID n° 10 del documento n.°WO 01/66712 are those having a substitution, a deletion or an insertion in one of more of the following positions: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 y 264.
Son amilasas adecuadas adicionales las amilasas que presentan SEC ID n.° 2 del documento n.° WO 09/061380 o variantes que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a SEC ID n.° 2 de las mismas. Son variantes preferentes de SEC ID n° 2 aquellas que presentan un tranco del extremo C-terminal y/o una sustitución, una deleción o una inserción en una de las posiciones siguientes: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 y G475. Son variantes más preferentes de SEC ID n° 2 aquellas que presentan la sustitución en una o más de las posiciones siguientes: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T1311, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E y G475K y/o una deleción en la posición R180 y/o S181 o en T182 y/o G183. Las variantes de amilasa más preferentes de SEC ID n.° 2 son aquellas que presentan las sustituciones:
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K,
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K,
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K, o S125A+N128C+T1311+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K en las que las variantes están truncadas en el extremo C-terminal y opcionalmente comprenden, además, una sustitución en la posición 243 y/o una deleción en la posición 180 y/o en la posición 181.
Otras amilasas adecuadas son la alfa-amilasa que presenta SEC ID n.° 12 en el documento n.° WO01/66712 o una variante que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90 % respecto a SEC ID n.° 12. Las variantes de amilasa preferente son aquellas que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes de SEC ID n.° 12 en el documento n.° WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Entre las amilasas preferentes particulares se incluyen variantes que presentan una deleción de D183 y G184 y que presentan las sustituciones R118K, N195F, R320K y R458K, y una variante que adicionalmente presenta sustituciones en una o más posiciones seleccionadas del grupo: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 y A339; resulta más preferente una variante que adicionalmente presenta sustituciones en la totalidad de dichas posiciones.
Otros ejemplos son variantes de amilasa tales como los indicados en los documentos n.° WO2011/098531, n.° WO2013/001078 y n.° WO2013/001087.
Son amilasas disponibles comercialmente, Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™, Stainzyme™, Stainzyme Plus™, Natalase™, Liquozyme X y BAN™ (de Novozymes A/S), y Rapidase™, Purastar™/Effectenz™, Powerase y Preferenz S100 (de Genencor International Inc./DuPont).
Peroxidasas/Oxidasas
Entre las peroxidasas/oxidasas adecuadas se incluyen las de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Están incluidos los mutantes químicamente modificados o de proteínas manipuladas. Entre los ejemplos de peroxidasas útiles se incluyen peroxidasas deCoprinus,p.ej., deC. cinereus,y variantes de las mismas tales como las indicadas en los documentos n.° WO 93/24618, n.° WO 95/10602 y n.° WO 98/15257.
Entre las peroxidasas disponibles comercialmente se incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S).
El enzima o enzimas de detergente pueden incluirse en una composición de detergente mediante la adición de aditivos separados que contengan uno o más enzimas, o mediante la adición de un aditivo combinado que comprenda la totalidad de dichos enzimas. Un aditivo de detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede formularse, por ejemplo, en forma de un granulado, líquido, suspensión, etc. Son formulaciones de aditivo de detergente preferentes los granulados, en particular los granulados que no producen polvo; los líquidos, en particular líquidos estabilizados, y las suspensiones.
Pueden producirse granulados que no producen polvo, p. ej., tal como se da a conocer en los documentos n.° US 4.106.991 y n.° 4.661.452 y opcionalmente podrían recubrirse mediante métodos conocidos de la técnica. Son ejemplos de materiales de recubrimiento ceroso los productos de óxido de polietileno (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de entre 1000 y 20000; nonilfenoles etoxilados que presentan entre 16 y 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene entre 12 y 20 átomos de carbono y en los que hay entre 15 y 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos, ácidos grasos y mono, di-y triglicéridos de ácidos grasos. Se proporcionan ejemplos de materiales de recubrimiento formadores de película adecuados para la aplicación mediante técnicas de lecho fluido en el documento n.° GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, estabilizarse mediante la adición de un poliol, tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según métodos establecidos. Pueden prepararse enzimas protegidos según el método dado a conocer en el documento n.° EP 238.216.
Una composición para el uso en detergentes de lavandería sólidos, por ejemplo, puede incluir entre 0,000001 % y 5 %, tal como entre 0,000005 % y 2 %, tal como entre 0,00001 % y 1 %, tal como entre 0,00001 % y 0,1 % de proteína enzimática en peso de la composición.
Una composición para el uso en líquido de lavandería puede incluir, por ejemplo, entre 0,000001 % y 3 %, tal como entre 0,000005 % y 1 %, tal como entre 0,00001 % y 0,01 % de proteína enzimática en peso de la composición.
Una composición para el uso en el lavado automático de vajillas puede incluir, por ejemplo, entre 0,000001 % y 5 %, tal como entre 0,000005 % y 2 %, tal como entre 0,00001 % y 1 %, tal como entre 0,00001 % y 0,1 % de proteína enzimática en peso de la composición.
El enzima o enzimas de la composición de detergente de la invención pueden estabilizarse utilizando agentes estabilizantes convencionales, p. ej., un poliol, tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico, p. ej., un éster de borato aromático o un derivado de ácido fenilborónico, tal como ácido 4-formilfenilborónico y la composición podría formularse tal como se describe en, por ejemplo, los documentos n.° WO92/19709 y n.° WO92/19708.
En una realización, la invención se refiere a composiciones de detergente que comprenden un enzima de la presente invención en combinación con uno o más componentes adicionales de composición limpiadora. La selección de componentes adicionales se encuentra comprendida dentro de los conocimientos del experto en la materia e incluye ingredientes convencionales, incluyendo los componentes no limitativos de ejemplo expuestos posteriormente.
La selección de componentes puede incluir, para el cuidado de textiles, la consideración del tipo de textil que debe lavarse, el tipo y/o grado de ensuciamiento, la temperatura a la que tendrá lugar el lavado, y la formulación del producto de detergente. Aunque los componentes mencionados anteriormente se clasifican según encabezamiento general de acuerdo con una funcionalidad particular, esto no debe interpretarse como una limitación, ya que un componente puede comprender funcionalidades adicionales, tal como apreciará el experto en la materia.
1. Tensioactivos
La composición de detergente puede comprender uno o más tensioactivos, que podrían ser aniónicos y/o catiónicos, y/o no iónicos, y/o semipolares y/o zwiteriónicos, o una mezcla de los mismos. En una realización particular, la composición de detergente incluye una mezcla de uno o más tensioactivos no iónicos y uno o más tensioactivos aniónicos. El tensioactivo o tensioactivos habitualmente están presentes a un nivel de entre aproximadamente 0,1 % y 60 % en peso, tal como entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 40 %, o entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 20 %, o entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 10 %. El tensioactivo o tensioactivos se seleccionan basándose en la aplicación de lavado deseada, e incluyen cualquier tensioactivo o tensioactivos convencionales conocidos de la técnica. Puede utilizarse cualquier tensioactivo conocido de la técnica para el uso en detergentes.
Al incluirlo en el mismo, el detergente habitualmente contendrá entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 40 % en peso, tal como entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 30 %, incluyendo entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 15 %, o entre aproximadamente 20 % y aproximadamente 25 % de un tensioactivo aniónico. Entre los ejemplos no limitativos de tensioactivos aniónicos se incluyen sulfatos y sulfonatos, en particular, alquilbencenosulfonatos lineales (LAS, por sus siglas en inglés), isómeros de LAS, alquilbencenosulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanosulfonatos, alfa-olefinsulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alqueno, alcano-2,3-diilbis(sulfatos), hidroxialcanosulfonatos y disulfonatos, sulfatos de alquilo (AS), tales como dodecilsulfato sódico (SDS), sulfatos de alcohol graso (FAS), sulfatos de alcohol primario (PAS), etersulfatos de alcohol (AES, AEOS o FES, también conocidos como etoxisulfatos de alcohol o sulfatos de éter de alcohol graso, alcanosulfonatos secundarios (SAS), sulfonatos de parafina (PS), sulfonatos de éster, ésteres de glicerol de ácido graso sulfonado, ésteres metílicos de alfa-sulfo-ácidos grasos (alfa-SFMe o SES), incluyendo éster metílico de sulfonato (MES), ácido alquil- o alquenilsuccínico, ácido dodecenil/tetradecenil-succínico (DTSA), derivados de ácido graso de aminoácidos, diésteres y monoésteres de ácido sulfosuccínico o jabón, y combinaciones de los mismos.
Cuando se incluyen en ellos, el detergente habitualmente contendrá entre aproximadamente 0 % y aproximadamente 10 % en peso de un tensioactivo catiónico. Entre los ejemplos no limitativos de tensioactivos catiónicos se incluyen alquildimetiletanolamina quat (ADMEAQ), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), cloruro de dimetildiestearilamonio (DSDMAC) y alquilbencildimetilamonio, compuestos de alquil-amonio cuaternario, compuestos de amonio cuaternario alcoxilados (AQA) y combinaciones de los mismos.
Cuando se incluyen en ellos, el detergente habitualmente contendrá entre aproximadamente 0,2 % y aproximadamente 40 % en peso de un tensioactivo no iónico, por ejemplo entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 30 %, en particular entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 20 %, entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 10 %, tal como entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 5 %, o entre aproximadamente 8 % y aproximadamente 12 %. Entre los ejemplos no limitativos de tensioactivos no iónicos se incluyen etoxilatos de alcohol (AE o AEO), propoxilatos de alcohol, alcoholes grasos proporxilados (PFA), ésteres alquílicos de ácido graso alcoxilados, tales como ésteres alquílicos de ácido graso etoxilados y/o propoxilados, etoxilatos de alquilfenol (APE), etoxilatos de nonilfenol (NPE), alquilpoliglucósido (APG), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácido graso (FAM), dietanolamidas de ácido graso (FADA), monoetanolamidas de ácido graso etoxiladas (EFAM), monoetanolamidas de ácido graso propoxiladas (PFAM), amidas de ácidos grasos alquilados polihidroxilados o derivados N-acilo N-alquilo de glucosamina (glucamidas, GA, o glucamida de ácido graso, FAGA), así como productos disponibles bajo los nombres comerciales SPAN y TWEEN, y combinaciones de los mismos.
Cuando se incluyen en ellos, el detergente habitualmente contendrá entre aproximadamente 0 % y aproximadamente 10 % en peso de un tensioactivo semipolar. Entre los ejemplos no limitativos de tensioactivos semipolares se incluyen óxidos de amina (AO), tales como óxido de alquildimetilamina, óxido de N-(cocoalquil)-W,A/-dimetilamina, y óxido de N-(sebo-alquilo)-W,A/-bis(2-hidroxietil)amina, alcanolamidas de ácido graso y alcanolamidas de ácido graso etoxilado, y combinaciones de los mismos.
Cuando se incluyen en ellos, el detergente habitualmente contendrá entre aproximadamente 0 % y aproximadamente 10 % en peso de un tensioactivo zwiteriónico. Entre los ejemplos no limitativos de tensioactivos zwiteriónicos se incluyen betaína, alquildimetilbetaína, sulfobetaína y combinaciones de las mismas.
2. Hidrótropos
Un hidrótropo es un compuesto que solubiliza compuestos hidrofóbicos en soluciones acuosas (o a la inversa, sustancias polares en un medio no polar). Habitualmente los hidrótropos presentan un carácter tanto hidrofílico como hidrofóbico (propiedades denominadas «anfifílicas», tal como es conocido de los tensioactivos); sin embargo, la estructura molecular de los hidrótropos generalmente no favorece la autoagregación espontánea. Los hidrótrotopos no muestran una concentración crítica sobre la cual ocurre la autoagregación, tal como se observa en tensioactivos y en lípidos que forman fases micelares, lamelares u otras mesofases bien definidas. Por el contrario, muchos hidrótropos muestran un proceso de agregación de tipo continuo en el que el tamaño de los agregados crece a medida que se incrementa la concentración. Sin embargo, muchos hidrótropos alteran el comportamiento de las fases, la estabilidad y las propiedades coloidales de los sistemas que contienen sustancias de carácter polar y no polar, incluyendo mezclas de agua, aceite, tensioactivos y polímeros. Los hidrótrotopos se han utilizado clásicamente en los sectores farmacéutico, del cuidado personal, alimentario y en aplicaciones técnicas. La utilización de hidrótrotopos en las composiciones de detergente permite producir, por ejemplo, formulaciones más concentradas de tensioactivos (tal como en el procedimiento de compactación de detergentes líquidos mediante la eliminación del agua) sin inducir fenómenos no deseados, tales como la separación de fases o una viscosidad elevada.
El detergente puede contener entre 0 % y 5 % en peso, tal como entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 5 %, o entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 5 %, de un hidrótrotopo. Puede utilizarse cualquier hidrótrotopo conocido de la técnica para el uso en detergentes. Entre los ejemplos no limitativos de hidrótropos se incluyen bencenosulfonato sódico, p-toluenosulfonato sódico (STS), xilenosulfonato sódico (SXS), cumeno-sulfonato sódico (SCS), cimeno-sulfonato sódico, óxidos de amina, alcoholes y poliglicoléteres, hidroxinaftoato sódico, hidroxinaftalensulfonato sódico, etilhexilsulfato sódico y combinaciones de los mismos.
3. Agentes mejoradores y co-mejoradores de detergencia
La composición de detergente puede contener entre aproximadamente 0 % y 65 % en peso, tal como entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 45 % de un mejorador o co-mejorador de detergencia, o una mezcla de los mismos. En un detergente para el lavado de vajillas, el nivel de mejorador habitualmente es de entre 40 % y 65 %, particularmente de entre 50 % y 65 %. El mejorador y/o co-mejorador puede ser particularmente un agente quelante que forma complejos solubles en agua con Ca y Mg. Puede utilizarse cualquier mejorador y/o co-mejorador conocido de la técnica para el uso en detergentes de lavandería. Entre los ejemplos no limitativos de mejoradores se incluyen zeolitas, difosfatos (pirofosfatos), trifosfatos, tales como trifosfato sódico (STP o STPP), carbonatos, tales como carbonato sódico, silicatos solubles, tales como metasilicato sódico, silicatos en capas (p. ej., SKS-6, de Hoechst), etanolaminas, tales como 2-aminoetán-1-ol (MEA), dietanolamina (DEA, también conocida como iminodietanol), trietanolamina (TEA, también conocida como 2,2',2''-nitriotrietanol) y carboximetil-inulina (CMI), y combinaciones de los mismos.
La composición de detergente puede contener, además, entre aproximadamente 0 % y 20% en peso, tal como entre aproximadamente 5%y aproximadamente 10% de un co-mejorador de detergencia, o una mezcla de los mismos. La composición de detergente puede incluir un co-mejorador solo o en combinación con un mejorador, por ejemplo, un mejorador de zeolita. Entre los ejemplos no limitativos de co-mejoradores se incluyen homopolímeros de poliacrilatos o copolímeros de los mismos, tales como poli(ácido acrílico) (PAA) o copoli(ácido acrílico/ácido maleico) (PAA/PMA). Entre los ejemplos no limitativos adicionales se incluyen citrato, quelantes, tales como aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos y fosfonatos, y ácido alquil- o alquenilsuccínico. Entre los ejemplos específicos adicionales se incluyen ácido 2,2',2"-nitrilotriacético (NTA), ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), ácido iminodisuccínico (IDS), ácido etilendiamín-N,N'-disuccínico (EDDS), ácido metilgicindiacético (MGDA), ácido glutámico-ácido N,N-diacético (GLDA), ácido 1-hidroxietán-1,1-difosfónico (HEDP), ácido etilendiamintetra-(metilenfosfónico) (EDTMPA), ácido dietilentriaminapentakis(metilenfosfónico) (DTPMPA o DTMPA),ácido N-(2-hidroxietil)iminodiacético (EDG), ácido aspártico-ácido N-monoacético (ASMA), ácido aspárticoácido N,N-diacético (ASDA), ácido aspártico-ácido N-monopropiónico (ASMP), ácido iminodisuccínico (IDA), ácido N-<(2-sulfometil)-aspártico>(<s>M<a>S),<ácido W-(2-sulfoetil)-aspártico>(S<e>A<s>),<ácido W-(2-sulfometil)-glutámico (SMGL),>ácido W-(2-sulfoetil)-glutámico (SEGL), ácido N-metiliminodiacético (MIDA), ácido a-alanín-W, N-diacético (a-ALDA), ácido serina-W, W-diacético (SEDA), ácido isoserina-W, W-diacético (ISDA), ácido fenilalanina-W, W-diacético (PHDA), ácido antranílico-ácido W, W-diacético (ANDA), ácido sulfanílico-ácido W, W-diacético (SLDA), ácido taurina-W, W-diacético (TUDA) y ácido sulfometil-W, W-diacético (SMDA), W-(2-hidroxietil)-etilidendiamín-W, W', W'-triacetato (HEDTA), dietanolglicina (DEG), ácido dietilentriamín-penta(metilenfosfónico) (DTPMP), ácido aminotris(metilenfosfónico) (ATMP) y combinaciones y sales de los mismos. Se describen mejoradores y/o comejoradores de ejemplo adicionales en, p. ej., los documentos n.°WO 09/102854 y n.° US 5977053
4. Sistemas blanqueadores
El detergente puede contener entre 0 % y 50 % en peso, tal como entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 25 % de un sistema blanqueador. Puede utilizarse cualquier sistema blanqueador conocido de la técnica para el uso en detergentes de lavandería. Entre los componentes del sistema blanqueador adecuados se incluyen catalizadores de blanqueamiento, fotoblanqueadores, activadores de blanqueamiento, fuentes de peróxido de hidrógeno, tales como percarbonato sódico y perboratos sódicos, perácidos preformados y mezclas de los mismos. Entre los perácidos preformados adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ácidos y sales peroxicarboxílicos, ácidos y sales percarbónicos, ácidos y sales perimídicos, ácidos y sales peroximonosulfúricos, por ejemplo, Oxone (R), y mezclas de los mismos. Entre los ejemplos no limitativos de sistemas blanqueadores se incluyen sistemas blanqueadores a base de peróxido, que pueden comprender, por ejemplo, una sal inorgánica, incluyendo sales de metal alcalino, tales como sales sódicas de perborato (habitualmente mono- o tetrahidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato o persilicato, en combinación con un activador de blanqueamiento formador de perácido. La expresión «activador de blanqueamiento» se refiere en la presente memoria a un compuesto que reacciona con el blanqueador de peróxido, tal como peróxido de hidrógeno, para formar un perácido. El perácido formado de esta manera constituye el blanqueador activado. Entre los activadores de blanqueamiento adecuados para el uso en la presente memoria se incluyen los pertenecientes a la case de amidas, imidas o anhídridos de ésteres. Son ejemplos adecuados de tetracetiletilén-diamina (TAED), 4-[(3,5,5-trimetilhexanoil)oxi]bencenosulfonato sódico (ISONOBS), ácido diperoxi-dodecanoico, 4-(dodecanoiloxi)bencenosulfonato (LOBS), 4-(decanoiloxi)bencenosulfonato, 4-(decanoiloxi)benzoato (DOBS), 4-(nonanoiloxi)-bencenosulfonato (NOBS) y/o los dados a conocer en el documento n.° WO98/17767. Se ha dado a conocer una familia particular de activadores de blanqueamiento de interés en el documento n.° EP624154 y resulta particularmente preferente en esa familia, acetiltrietilcitrato (ATC). ATC o un triglicérido de cadena corta como la triacetina presenta la ventaja de que es respetuoso con el medio ambiente y eventualmente se degrada en ácido cítrico y alcohol. Además, el acetiltrietilcitrato y la triacetina presentan una buena estabilidad hidrolítica en el producto con el almacenamiento y es un activador de blanqueamiento eficiente. Finalmente, ATC proporciona una buena capacidad de mejoramiento como aditivo de lavandería. Alternativamente, el sistema blanqueador podría comprender peroxiácidos de, por ejemplo, tipo amida, imida o sulfona. El sistema blanqueador puede comprender, además, perácidos, tales como ácido 6-(ftalimido)peroxihexanoico (PAP). El sistema blanqueador puede incluir, además, un catalizador de blanqueamiento. En algunas realizaciones, el componente blanqueador puede ser un catalizador orgánico seleccionado del grupo que consiste en catalizadores orgánicos que presentan las fórmulas siguientes: (iii) y mezclas de los mismos, en los que cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene entre 9 y 24 carbonos o un grupo de alquilo lineal que contiene entre 11 y 24 carbonos, preferentemente cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene entre 9 y 18 carbonos o un grupo de alquilo lineal que contiene entre 9 y 18 carbonos o un grupo de alquilo lineal que contiene entre 11 y 18 carbonos, más preferentemente cada R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en 2-propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, n-dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, n-octadecilo, isononilo, isodecilo, isotridecilo e isopentadecilo. Se describen otros sistemas blanqueadores de ejemplo en, p. ej., los documentos n.° WO2007/087258, n.° WO2007/087244, n.° WO2007/087259 y n.° WO2007/087242. Los fotoblanqueadores adecuados pueden ser, por ejemplo, ftalocianina de zinc sulfonada.
5. Polímeros
El detergente puede contener entre 0 % y 10 % en peso, tal como entre 0,5 % y 5 %, entre 2 % y 5 %, entre 0,5 % y 2 % o entre 0,2 % y 1 % de un polímero. Puede utilizarse cualquier polímero conocido de la técnica para el uso en detergentes. El polímero puede funcionar como un co-mejorador tal como se ha mencionado anteriormente, o puede proporcionar propiedades antirredeposición, de protección de fibras, de desprendimiento de la suciedad, de inhibición de la transferencia de tintes, de limpieza de grasas y/o antiespumantes. Algunos polímeros pueden presentar más de una de las propiedades anteriormente mencionadas y/o más de uno de los motivos mencionados posteriormente. Entre los polímeros de ejemplo se incluyen (carboximetil)celulosa (CMC), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol u óxido de polietileno (PEG), polietilenimina etoxilada, carboximetilinulina (CMI) y policarboxilatos, tales como PAA, PAA/PMA, ácido poliaspártico y copolímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico, CMC modificado hidrofóbicamente (HM-CMC) y siliconas, copolímeros de ácido tereftálico y glicoles oligoméricos, copolímeros de tereftalato de polietileno y poli(tereftalato de oxieteno) (PET-POET), PVP, poli(vinilimidazol) (PVI), poli(vinilpiridín-W-óxido) (PVPO o PVPNO) y polivinilpirrolidona-vinilimidazol (PVPVI). Entre los polímeros de ejemplo adicionales se incluyen policarboxilatos sulfonados, óxido de polietileno y óxido de polipropileno (PEO-PPO) y etoxisulfato de dicuaternium. Se dan a conocer otros polímeros de ejemplos en, p. ej., el documento n.° WO 2006/130575. También se encuentran contempladas sales de los polímeros anteriormente mencionados.
6. Agentes matizantes de tejidos
Las composiciones de detergente de la presente invención pueden incluir, además, agentes matizantes de tejidos, tales como tintes o pigmentos que, al formularse en composiciones de detergente, pueden depositarse sobre un tejido al poner dicho tejido en contacto con una solución de lavado que comprende dichas composiciones de detergente, alterando de esta manera el tinte de dicho tejido mediante absorción/reflexión de la luz visible. Los agentes blanqueadores fluorescentes emiten por lo menos una cierta cantidad de luz visible. En contraste, los agentes matizantes de tejidos alteran el tinte de una superficie, ya que absorben por lo menos una parte del espectro de luz visible. Entre los agentes matizantes de tejidos adecuados se incluyen tintes y conjugados de tinte-arcilla, y pueden incluir también pigmentos. Entre los tintes adecuados se incluyen los tintes de molécula pequeña y los tintes poliméricos. Entre los tintes de molécula pequeña adecuados se incluyen los tintes de molécula pequeña seleccionados del grupo que consiste en tintes dentro de las clasificaciones de Índice de color (I.C.) de Direct Blue, Direct Red, Direct Violet, Acid Blue, Acid Red, Acid Violet, Basic Blue, Basic Violet y Basic Red, o mezclas de los mismos, por ejemplo tal como se describe en los documentos n.° WO2005/03274, n.° WO2005/03275, n.° WO2005/03276 y n.° EP1876226 (incorporados en la presente memoria como referencia). La composición de detergente preferentemente comprende entre aproximadamente 0,00003 % en peso y aproximadamente 0,2 % en peso, entre aproximadamente 0,00008 % en peso y aproximadamente 0,05 % en peso, o incluso entre aproximadamente 0,0001 % en peso y aproximadamente 0,04 % en peso de agente matizante de tejidos. La composición puede comprender entre 0,0001 % en peso y 0,2 % en peso de agente matizante de tejidos; esto puede resultar especialmente preferente cuando la composición se encuentra en la forma de una bolsa de dosis unitaria. Los agentes matizantes de tejidos adecuados también se dan a conocer en, p. ej., los documentos n.° WO 2007/087257 y n.° WO2007/087243.
7. Materiales auxiliares
También puede utilizarse cualquier componente de detergente conocido de la técnica para el uso en detergentes de lavandería. Entre otros componentes de detergente opcionales se incluyen agentes anticorrosión, agentes antiencogimiento, agentes antirredeposición de suciedad, agentes antiarruga, bactericidas, ligantes, inhibidores de la corrosión, desintegrantes/agentes de desintegración, tintes, estabilizantes de enzimas (incluyendo ácido bórico, boratos, CMC y/o polioles, tales como propilenglicol), suavizantes de tejidos, incluyendo arcillas, rellenos/adyuvantes de procesamiento, agentes blanqueadores fluorescentes/abrillantadores ópticos, potenciadores de espuma, reguladores de espuma, perfumes, agentes de suspensión de la suciedad, suavizantes, supresores de espuma, inhibidores del deslustre y agentes de absorción, solos o combinados. Puede utilizarse cualquier ingrediente conocido de la técnica para el uso en detergentes de lavandería. La selección de dichos ingredientes se encuentra perfectamente comprendida en los conocimientos del experto.
Dispersantes: Las composiciones de detergente de la presente invención pueden contener, además, dispersantes. En particular, los detergentes en polvo pueden comprender dispersantes. Entre los materiales orgánicos solubles en agua adecuados se incluyen ácidos homo- o copoliméricos o sus sales, en los que el ácido policarboxílico comprende por lo menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Se describen dispersantes adecuados en, por ejemplo, Powdered Detergents, Surfactant science series, volumen 71, Marcel Dekker, Inc.
Agentes inhibidores de la transferencia de tintes: Las composiciones de detergente de la presente invención pueden incluir, además, uno o más agentes inhibidores de la transferencia de tintes. Entre los agentes inhibidores de la transferencia de tintes poliméricos adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, polímeros polivinilpirrolidona, polímeros N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazolas o mezclas de los mismos. Cuando están presentes en una composición de la invención, los agentes inhibidores de la transferencia de tintes pueden estar presentes a niveles de entre aproximadamente 0,0001 % y aproximadamente 10 %, de entre aproximadamente 0,01 % y aproximadamente 5 %, o incluso de entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 3 % en peso de la composición.
Agente blanqueador fluorescente: Las composiciones de detergente de la presente invención preferentemente también contendrán componentes adicionales que pueden tintar artículos que se están lavando, tales como agente blanqueador fluorescente o abrillantadores ópticos. En caso de estar presente, el abrillantador preferentemente se encuentra a un nivel de entre aproximadamente 0,01 % y aproximadamente 0,5 %. Puede utilizarse cualquier agente blanqueador fluorescente adecuado para el uso en una composición de detergente de lavandería en la composición de la presente invención. Los agentes blanqueadores fluorescentes más comúnmente utilizados son los pertenecientes a las clases de derivados del ácido diaminoestilbén-sulfónico, derivados de diarilpirazolina y derivados bisfenilo-diestirilo. Entre los ejemplos del tipo derivado de ácido diaminoestilbén-sulfónico de agentes blanqueadores fluorescentes se incluyen las sales sódicas de: 4,4-bis-(2-diethanolamino-4-anilino-s-triazín-6-ilamino)estilbén-2,2-disulfonato; 4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazín-6-ilamino) estilbén-2.2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(N-metil-N-2-hidroxi-etilamino)-s-triazín-6-ilamino)estilbén-2,2'-disulfonato, 4,4-bis-(4-fenil-2,1,3-triazol-2-il)estilbén-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(1-metil-2-hidroxi-etilamino)-s-triazín-6-ilamino) estilbén-2,2'-disulfonato y 2-(estilbil-4"-nafto-1.,2':4,5)-1,2,3-trizol-2"-sulfonato. Los agentes blanqueadores fluorescentes preferentes son Tinopal DMS y Tinopal CBS, disponibles de Ciba-Geigy AG, Basel, Suiza. Tinopal DMS es la sal disódica del disulfonato de 4,4'-bis-(2-morfolino-4-anilino-s-triazín-6-ilamino)estilbeno. Tinopal CBS es la sal disódica de 2,2'-bis-(fenil-estiril)disulfonato. También resultan preferentes los agentes blanqueadores fluorescentes como Parawhite KX disponible comercialmente, suministrado por Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, India. Entre otros fluorescentes adecuados para el uso en la invención se incluyen las 1,3-diarilpirazolinas y las 7-alquilaminocoumarinas. Entre los niveles de abrillantador fluorescente adecuado se incluyen niveles entre niveles más bajos, de aproximadamente 0,01 %, 0,05 %, aproximadamente 0,1 % o incluso aproximadamente 0,2 % en peso y niveles más altos, de 0,5 % o incluso 0,75 % en peso.
Polímeros facilitadores del desprendimiento de la suciedad: Las composiciones de detergente de la presente invención pueden incluir, además, uno o más polímeros facilitadores del desprendimiento de la suciedad, que ayudan a eliminar la suciedad de los tejidos, tales como el algodón y los tejidos a base de poliéster, en particular la eliminación de manchas hidrofóbicas en tejidos a base de poliéster. Los polímeros facilitadores del desprendimiento de suciedad pueden ser, por ejemplo, polímeros a base de tereftalato no iónicos o aniónicos, polivinil-caprolactamos y copolímeros relacionados, copolímeros de injertación de vinilo, poliamidas de poliéster; ver, por ejemplo, el capítulo 7 en la obra Powdered Detergents, Surfactant science series, volumen 71, Marcel Dekker, Inc. Otro tipo de polímeros facilitadores del desprendimiento de la suciedad son los polímeros desgrasantes alcoxilados anfifílicos que comprenden una estructura central y una pluralidad de grupos alcoxilato unidos a esa estructura central. La estructura central puede comprender una estructura de polialquilenimina o una estructura de polialcanolamina tal como se describe en detalle en el documento n.° 2009/087523 (incorporada en la presente memoria como referencia). Además, los copolímeros de injertación aleatoria son polímeros facilitadores del desprendimiento de suciedad adecuados. Se describen copolímeros de injertación adecuados en mayor detalle en los documentos n.°WO 2007/138054, n.° WO 2006/108856 y n.°WO 2006/113314 (incorporados en la presente memoria como referencia). Otros polímeros facilitadores del desprendimiento de la suciedad son estructuras polisacáridas sustituidas, especialmente estructuras celulósicas, tales como derivados de celulosa modificada, tales como los descritos en el documento n.° EP 1867808 o en el documento n.° WO 2003/040279 (ambos incorporados en la presente memoria como referencia). Entre los polímeros celulósicos adecuados se incluyen celulosa, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, amidas de celulosa y mezclas de los mismos. Entre los polímeros celulósicos adecuados se incluyen celulosa modificada aniónicamente, celulosa modificada no iónicamente, celulosa modificada catiónicamente, celulosa modificada zwiteriónicamente y mezclas de las mismas. Entre los polímeros celulósicos adecuados se incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, éster de celulosa carboximetilada, y mezclas de las mismas.
Agentes antirredeposición: Las composiciones de detergente de la presente invención pueden incluir, además, uno o más agentes antirredeposición, tales como carboximetilcelulosa (CMC), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polioxietileno y/o polietilenglicol (PEG), homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico y ácido maleico, y polietileniminas etoxiladas. Los polímeros basados en celulosa descritos en el aparato sobre polímeros facilitadores del desprendimiento de la suciedad también podrían funcionar como agentes antirredeposición.
Entre otros materiales auxiliares adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, agentes antiencogimiento, agentes antiarruga, bactericidas, ligantes, portadores, tintes, estabilizantes de enzimas, suavizantes de tejidos, rellenos, reguladores de la espuma, hidrótropos, perfumes, pigmentos, supresores de la espuma, solventes y estructurantes para detergentes líquidos y/o agentes elastificadores de la estructura.
En una realización adicional de la presente invención, la composición de detergente se encuentra en forma de una barra, una tableta homogénea, una tableta que presenta dos o más capas, una bolsa que presenta uno o más compartimientos, unos polvos regulares o compactados, un granulado, una pasta, un gel o un líquido regular, compacto o concentrado. En una realización, la composición de detergente puede ser una composición de detergente de lavandería, preferentemente una composición de detergente de lavandería líquida o sólida. Existen varias formas de formulación de detergente, tales como capas (misma fase o fases diferentes), bolsas, así como formas para una unidad dosificadora.
Las bolsas pueden configurarse como de compartimiento único o multicompartimiento. Puede ser de cualquier forma y material que resulte adecuado para contener la composición, p. ej., sin permitir la salida de la composición de la bolsa antes del contacto con agua. La bolsa está hecha de película soluble en agua que encierra un volumen interior. Dicho volumen interior puede dividirse en compartimientos de la bolsa. Las películas preferentes son materiales poliméricos, preferentemente polímeros que se conforman como una película o lámina. Los polímeros, copolímeros o derivados de los mismos preferentes son poliacrilatos seleccionados y copolímeros de acrilato solubles en agua, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, dextrina sódica, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, maltodextrina, polimetacrilatos, lo más preferentemente copolímeros de alcohol polivinílico e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). Preferentemente, el nivel de polímero en la película, por ejemplo PVA, es de por lo menos aproximadamente 60 %. El peso molecular medio preferente habitualmente es de entre aproximadamente 20.000 y aproximadamente 150.000. Las películas también pueden ser de composiciones de mezcla que comprenden mezclas de polímero hidrolíticamente degradables y solubles en agua, tales como poliláctido y alcohol polivinílico (conocido con la referencia comercial M8630, comercializado por Chris Craft In. Prod. Of Gary, Ind., EE. UU.) más plastificadores como el glicerol, etilenglicerol, propilenglicol, sorbitol y mezclas de los mismos. Las bolsas pueden comprender una composición de detergente de lavandería sólida o componentes parciales y/o una composición limpiadora líquida o componentes parciales separados por la película soluble en agua. El compartimiento para componentes líquidos puede presentar una composición diferente que los compartimientos que contienen sólidos. Ref: (documento n.° US2009/0011970 A1).
Los ingredientes del detergente pueden estar separados físicamente unos de otros por compartimientos en bolsas solubles en agua o en diferentes capas de tabletas. De esta manera, pueden evitarse las interacciones negativas entre componentes durante el almacenamiento. Los diferentes perfiles de disolución de cada uno de los compartimientos también pueden dar lugar a una ralentización de la disolución de componentes seleccionados en la solución de lavado.
Un detergente líquido o en gel que no se presente en forma de dosis unitaria puede ser acuoso, conteniendo normalmente por lo menos 20 % en peso y hasta 95 % de agua, tal como hasta aproximadamente 70 % de agua, hasta aproximadamente 65 % de agua, hasta aproximadamente 55 % de agua, hasta aproximadamente 45 % de agua o hasta aproximadamente 35 % de agua. Pueden incluirse en un líquido acuoso o gel otros tipos de líquidos, incluyendo, aunque sin limitación, alcanoles, aminas, dioles, éteres y polioles. Un detergente líquido acuoso o en gel puede contener entre 0 % y 30 % de solvente orgánico. Un detergente líquido o en gel puede ser no acuoso.
Las composiciones de detergente de la presente invención pueden proporcionarse en la forma de barras de jabón de lavandería y utilizarse para el lavado a mano de lavandería, tejidos y/o textiles. La expresión «jabón de lavandería» incluye barras de lavandería, barras de jabón, barras combinadas, barras Syndet y barras de detergente. Los tipos de barra habitualmente difieren en el tipo de tensioactivo que contienen y la expresión «barra de jabón de lavandería» incluye aquellos que contienen jabones de ácidos grasos y/o jabones sintéticos. La barra de jabón de lavandería presenta una forma física que es sólida y no un líquido, gel o unos polvos a temperatura ambiente. El término «sólido» se define como una forma física que no cambia significativamente durante el tiempo, es decir, si un objeto sólido (p. ej., una barra de jabón de lavandería) se introduce en un recipiente, el objeto sólido no cambia para llenar el recipiente en que se introduce. La barra es un sólido normalmente en forma de barra, aunque puede encontrarse en otras formas sólidas, tales como una forma redonda u ovalada.
La barra de jabón de lavandería puede contener uno o más enzimas adicionales, inhibidores de proteasa, tales como aldehídos peptídicos (o aducto hidrosulfito o aducto hemiacetal), ácido bórico, borato, bórax y/o derivados de ácido fenilborónico, tales como ácido 4-formilfenilborónico, uno o más jabones o tensioactivos sintéticos, polioles, tales como glicerina, compuestos de control del pH, tales como ácidos grasos, ácido cítrico, ácido acético y/o ácido fórmico, y/o una sal de un catión monovalente y un anión orgánico, en los que el catión monovalente puede ser, por ejemplo, Na+, K+ o NH4+ y el anión orgánico puede ser, por ejemplo, formato, acetato, citrato o lactato, de manera que la sal de un catión monovalente y un anión orgánico puede ser, por ejemplo, formato sódico.
La barra de jabón de lavandería puede contener, además, agentes acomplejantes como EDTA y HEDP, perfumes y/o un tipo diferente de rellenos, tensioactivos, p. ej., tensioactivos sintéticos aniónicos, agentes mejoradores de detergencia, agentes facilitadores del desprendimiento de la suciedad poliméricos, quelantes de detergente, agentes estabilizantes, rellenos, tintes, colorantes, inhibidores de la transferencia de tintes, policarbonatos alcoxilados, supresores de espuma, estructurantes, ligantes, agentes blanqueadores, activadores de blanqueamiento, agentes antisuciedad arcillas, agentes antirredeposición, agentes dispersantes poliméricos, abrillantadores, suavizantes de tejidos, perfumes y/u otros compuestos conocidos de la técnica.
La barra de jabón de lavandería puede procesarse en equipos convencionales de producción de barras de jabón de lavandería, tales como, aunque sin limitación, mezcladores, extrusoras de jabón, por ejemplo una extrusora de vacío de dos etapas, extrusores, cortadoras, estampadoras de logotipos, túneles de enfriamiento y envolvedoras. La invención no se encuentra limitada a la preparación de barras de jabón de lavandería mediante un método individual cualquiera concreto. La premezcla de la invención puede añadirse al jabón en diferentes etapas del procedimiento. Por ejemplo, puede prepararse la premezcla que contiene un jabón, un enzima, opcionalmente uno o más enzimas adicionales, un inhibidor de proteasa y una sal de un catión monovalente y un anión orgánico y, a continuación, extruirse la mezcla. El enzima y enzimas adicionales opcionales pueden añadirse simultáneamente al inhibidor de proteasa, por ejemplo en forma líquida. Aparte de la etapa de mezcla y la etapa de extrusión, el procedimiento puede comprender, además, las etapas de molienda, extrusión, corte, estampado, enfriamiento y/o envoltura.
La presente invención se refiere, además, a diferentes usos de la composición de detergente tal como se da a conocer en la presente memoria, tal como para degradar manano y para el uso en un procedimiento de lavandería.
La presente invención se refiere, además, a un método para eliminar una mancha de una superficie, que comprende poner en contacto la superficie con una composición de detergente tal como se describe en la presente memoria.
La presente invención se refiere, además, a un método para degradar mananos, que comprende aplicar una composición de detergente tal como se describe en la presente memoria en manano, preferentemente en la que el manano se encuentra sobre la superficie de un textil. Mediante la degradación del manano adherido al textil o tela, se desprende la suciedad o mancha unida al manano y ya no puede adherirse nuevamente al manano o manchas de manano.
En una realización de la presente invención, la mananasa comprendida en la composición de detergente de la presente invención presenta una actividad relativa de por lo menos 30 % en el intervalo de temperatura de entre 45 °C y 65 °C. La provisión de mananasas que conservan la actividad en temperaturas superiores a la temperatura ambiente y en pH ácido resulta ventajoso para aplicaciones en las que se requiere la degradación de mananaos bajo tales condiciones.
En una realización, la mananasa comprendida en las composiciones de detergente de la presente invención hidroliza los enlaces endo-beta-1,4-manosídicos de forma aleatoria.
En una realización, la mananasa comprendida en las composiciones de detergente de la presente invención puede obtenerse o derivarse a partir de una fuente bacteriana.
En una realización, la mananasa comprendida en las composiciones de detergente de la presente invención se fusiona con por lo menos un polipéptido adicional, formando de esta manera un polipéptido de fusión. El polipéptido de fusión o el polipéptido adicional puede presentar otras actividades catalíticas o de unión además de las de la mananasa. En una realización, el polipéptido adicional comprende o consiste en un módulo de unión de carbohidratos, que es opcionalmente un fragmento de otra proteína o enzima derivado del mismo organismo o de un organismo diferente de la mananasa. La mananasa puede conectarse al polipéptido adicional con un conector.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes se proporcionan a fin de ilustrar diversos aspectos de la presente invención. No pretenden ser limitativos de la invención, que se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1: cribado
Para la identificación de nuevas beta-1,4-mananasas, se cribaron bases de datos públicas (NCBI EBI) y genomas públicos y privados seleccionados. Todos los genomas privados y públicos utilizados en la presente invención se muestran en la Tabla 1. Se agruparon todos los aciertos y finalmente se seleccionaron 15 genes de origen bacteriano para la clonación enBacillusbasándose en la distancia filogenética entre ellos (Tabla 2).
Tabla 1: lista de genomas privados y públicos utilizados para el cribado de beta-1,4-mananasas
Tabla 2: lista de genes seleccionados para la clonación enBacillus
(continuación)
Ejemplo 2: clonación de mananasas bacterianas en Bacillus
A menos que se indique lo contrario, se llevaron a cabo los métodos de biología molecular, incluyendo las manipulaciones y transformaciones del ADN, tal como se indica en Sambrook y Russell (2001), y en Harwood y Cutting (1990). Los genesman6,man7 yman14se amplificaron por PCR utilizando la polimerasa Pfx Accu Prime (Invitrogen). Las PCR se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron las condiciones de PCR siguientes para la construcción de los plásmidos de expresión: 120 s de desnaturalización inicial a 94 °C, seguida de 35 ciclos de 15 s a 94 °C, hibridación durante 30 s a una de las temperaturas siguientes 50/55°C, extensión de 110/290 s a 68 °C y extensión final a 68 °C durante 10 min. Para la amplificación dem aníse utilizó ADN genómico deBacillus hemicellulosilyticusJCM 9152. Los genesman6yman14se obtuvieron de fuentes comerciales como genes sintéticos sin optimización de codones (Eurofins MWG, Alemania). Las secuencias de cebadores utilizados para la clonación se muestran en la Tabla 3. Las secuencias protuberantes para la hibridación están subrayadas.
Tabla 3: lista de cebadores utilizados para la amplificación deman6(invención),man7(de referencia) y man14 (de referencia).
Los genes se clonaron en un vector estándar pEV1 pEV1 (fig. 1), un derivado de pUB110 que incluye el promotor PaprE deBacillus licheniformisy el péptido de seña de xilanasa deBacillus amyloliquefaciens,mediante la utilización de la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder®Hifi (NEB, Frankfurt). Para la clonación se utilizó una relación vector:inserto de 1:3. La cantidad total de fragmentos era de 0,2 pmoles en un volumen total de 20 pl. Las muestras se incubaron durante 40 min a 50 °C. Con fines de construcción, los plásmidos de expresión se transformaron mediante competencia inducida enBacillus subtilisSCK6 tal como indican Zhang y Zhang, 2011. Las células transformadas se sembraron en placas LB (Luria-Bertani) suplementadas con 10 mg/l de kanamicina. Las placas se incubaron durante 20 h a 37 °C. Se recolectaron las colonias que aparecían y se aisló el plásmido utilizando el kit miniprep. QiaPrep (Qiagen, Hilden). Se llevó a cabo el procedimiento de aislamiento siguiendo las recomendaciones del fabricante para preparaciones de plásmidos gram-positivos. Se secuenciaron los insertos mediante secuenciación Sanger (GATC, Alemania) y revelaron las secuencias de ADN correspondientes a las partes maduras de las mananasas Man6, Man7 y Man14. Se llevaron a cabo comparaciones entre secuencias utilizando la alineación de secuencias ClustalW (Thompson et al., 1994). Finalmente, se transformaron los plásmidos de expresión en una cepa de producciónBacillusadecuada mediante electroporación. La cepa de producciónBacillusse cultivó en medio de electroporación que contenía 20 g/l de Tryupton, 10 g/l de extracto de levadura, 10 g de NaCI y sacarosa 2 M y se recolectaron 10 ml a una DO (600 nm) de 0,4. Las células se lavaron con tampón de electroporación que contenía sacarosa 0,272 M, MgCl2 1 mM y Kh 2P047 mM y finalmente se resuspendieron en 250 pl de tampón de electroporación. La electroporación se llevó a cabo utilizando las condiciones siguientes: 1,2 kV, 150 Q, 50 pF. Después, se añadió 1 ml de medio de electroporación y las células se incubaron durante 3 h a 37 °C. Las células se sembraron en placas LB suplementadas con 20 mg/l de kanamicina y se incubaron durante 18 h a 37 °C. Se verificaron los clones tal como se ha indicado anteriormente y se utilizaron para la generación de material para ensayos analíticos. Por lo tanto, se inocularon las cepas bajo condiciones de expresión estándares con inducción de proteínas y se incubaron durante 30 h a 37 °C. Se recolectaron los sobrenadantes y se utilizaron para ensayos analíticos y de aplicación. Se muestran los genes y características de los enzimas las Tablas 4 y 5.
Tabla 4. Resumen de los genes codificantes de mananasa de la familia de GH5 deBacillus clausiiKSM-K16,Bacillus hemicellulosilyticusJCM 9152 yVirgibacillus soliPL205.
Tabla 5. Resumen de las secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias génicas codificantes de mananasa GH5 deBacillus clausiiKSM-K16,Bacillus hemicellulosilyticusJCM 9152y Virgibacillus soliPL205.
Ejemplo 3: clonación por PCR de los genes de mananasa bacterianaman6(invención) ym aní(de referencia) enTrichoderma reesei
Se utilizaron métodos estándares de biología molecular en el aislamiento y tratamientos enzimáticos de ADN (p.ej., aislamiento del ADN plasmídico, digestión del ADN para producir fragmentos de ADN), transformaciones enE. coli,secuenciación, etc. Los métodos básicos utilizados fueron los descritos por el fabricante del enzima, reactivo o kit, o tales como los descritos en el manual estándar de biología molecular, p. ej., Sambrook y Russell (2001). Se llevó cabo el aislamiento del ADN genómico tal como se describe en detalle en Raeder y Broda (1985).
También se clonaron los genesman6yman7deBacillus clausiiyBacillus hemicellulosilyticus,respectivamente, para la expresión enTrichoderma reesei.Los genes se clonaron por PCR utilizando genes sintéticos con optimización de codones paraTrichoderma reesei.Las secuencias de ADN codificantes de los péptidos de señal deman6yman7se eliminaron mediante PCR y se crearon nuevos sitios de clonación. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 6 (SEC ID n.° 21-24).
Tabla 6. Oligonucleótidos utilizados como cebadores de PCR para amplificar los genes de mananasa deBacillus hemicellulosilyticusyBacillus clausii.
(continuación)
Los genes se amplificaron por PCR con los cebadores indicados en la Tabla 6 y utilizando ADN sintéticos como moldes en las reacciones. Las mezclas de PCR deman6deBacillus clausiiym anídeBacillus hemicellulosilyticuscontenían, cada una, tampón 1x HF para la polimerasa HF Phusion (NEB/BioNordika, Finlandia), mezcla de dNTP 0,2 mM (Thermo Fisher Scientific, Finlandia), 1 pM de cada cebador, DMSO al 3 % (Thermo Fisher Scientific), 1 unidad de polimerasa de alta fidelidad Phusion (NEB/BioNordika, Finlandia) y 50 ng del ADN plasmídico correspondiente. Las condiciones de las reacciones de PCR eran las siguientes: 30 s de desnaturalización inicial a 98 °C seguido de 28 ciclos de 10 s a 98 °C; 30 s de hibridación a una de las temperaturas siguientes 45/50/55/60 °C, 45 s de extensión a 72 °C y extensión final a 72 °C durante 7 min.
La combinación de cebadores indicada en la Tabla 6 produjo productos de ADN específicos con los tamaños esperados. Los productos de PCR se aislaron a partir de gel de agarosa con el kit de extracción en gel GenJet (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante; se digirieron con los enzimas de restricciónNruIy BamHI (Thermo Fisher Scientific) y se clonaron en un vector de expresión cortado con NruI y BamHI. Las mezclas de ligación se transformaron enEscherichia coliXL1-Blue (AH Diagnostics) y se sembraron en placas LB (Luria-Bertani) que contenían 50 a 100 pg/ml de ampicilina. Se recogieron varias colonias deE. colide las placas y se aisló el ADN con el kit miniprep de plásmidos GenJet (Thermo Fisher Scientific). Los clones positivos se cribaron utilizando digestiones de restricción. Los genes codificantes de las mananasas GH5man6 de Bacillus clausiiym aní de Bacillus hemicellulosilyticussin las secuencias codificantes de su propio péptido de señal se secuenciaron y los plásmidos se denominaron pALK4274 y pALK4273, respectivamente (para más información, ver el Ejemplo 6).
Ejemplo 4: clonación de la mananasa bacteriana sintética Man14 (de referencia)
Se utilizaron métodos estándares de biología molecular en el aislamiento y tratamientos enzimáticos de ADN (p.ej., aislamiento del ADN plasmídico, digestión del ADN para producir fragmentos de ADN), transformaciones enE. coli,secuenciación, etc. Los métodos básicos utilizados fueron los descritos por el fabricante del enzima, reactivo o kit, o tales como los descritos en el manual estándar de biología molecular, p. ej., Sambrook y Russell (2001). Se llevó cabo el aislamiento del ADN genómico tal como se describe en detalle en Raeder y Broda (1985).
También se clonó el gen de mananasaman14deVirgibacillus solipara la expresión enTrichoderma.El gen codificante de la mananasa de la familia de GH5, Man14 deVirgibacillus solise obtuvo de GenScript en forma de un constructo sintético con optimización de codones paraTrichoderma reesei.
El ADN plasmídico obtenido de GenScript que incluía el genman14se resuspendió en agua estéril, se digirió con los enzimas de restricciónNruIy BamHI (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante y se clonaron en un vector de expresión cortado con NruI y BamHI. La mezcla de ligación se transformó enEscherichia coliXL1-Blue (AH Diagnostics) y se sembró en placas LB (Luria-Bertani) que contenían 50 a 100 pg/ml de ampicilina. Se recogieron varias colonias deE. colide las placas y se aisló el ADN con el kit miniprep de plásmidos GenJet (Thermo Fisher Scientific). Se cribaron los clones positivos utilizando digestiones de restricción y se mostró que contenían insertos de los tamaños esperados. Se secuenciaron los sitios de fusión deman14deVirgibacillus solial plásmido de expresión y el plásmido se denominó pALK4414 (para más información, ver el Ejemplo 6).
Ejemplo 5: producción de proteínas mananasa GH5 bacterianas recombinantes enBacillus
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas mananasas GH5 recombinante (Man6 (invención), Man7 (de referencia) y Man14 (de referencia)) a partir deBacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticus yVirgibacillus soli.Los plásmidos de expresión construidos se muestran en la Tabla 7. Los genes de GH5 recombinantes(man6, man7y man14), sin sus propias secuencias de señal, se fusionaron con el promotorPaprEdeBacillus licheniformisy péptido de señal xilanasa deB. amyloliquefaciens.Se aseguró la terminación de la transcripción con un terminador fuerte y se utilizó un marcador de resistencia a kanamicina para la selección de los transformantes. Las transformaciones se llevaron a cabo tal como se indica en el Ejemplo 2.
Tabla 7. Plásmidos de expresión construidos para producir las proteínas recombinantes Man6, Man7 y Man14 a partir deBacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticusyVirgibacillus solien una cepa de expresión
deBacillusapropiada.
La producción de GH5 de los transformantes se analizaron a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz de agitación. Los transformaron se inocularon a partir de placas LB en matraces de agitación que contenían glucosa al 2 %, polvos de maíz fermentado al 6 %, (NH4Í2HPO4 al 1,3 %, MgSO4x 7H2O al 0,05 % y CaCh al 0,5 %. Se ajustó el pH a 7,5. La producción de proteína GH5 de los transformantes se analizó a partir de sobrenadantes de cultivo tras cultivarlas durante 30 horas a 37 °C a 180 rpm. Se analizó la producción heteróloga de proteínas recombinantes mediante SDS-PAGE con posterior tinción de Coomassie. Se seleccionaron los mejores transformantes productos para el cultivo en biorreactores a escala de laboratorio. Los transformantes se cultivaron en biorreactores a 37 °C bajo condiciones de inducción de proteínas y alimentación adicional hasta alcanzar un rendimiento adecuado. Se recuperaron los sobrenadantes para ensayos de aplicación mediante centrifugación o filtración.
Ejemplo 6: producción de proteínas mananasa GH5 bacterianas recombinantes enTrichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas mananasas GH5 recombinante (Man6 (invención), Man7 (de referencia) y Man14 (de referencia)) a partir deBacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticus yVirgibacillus soli(ver los Ejemplos 3 y 4) enTrichoderma reesei.Los plásmidos de expresión construidos se muestran en la Tabla 8. Los genes de GH5 recombinantes(man6, man7yman14),sin sus propias secuencias de señal, se fusionaron con el promotorcel7A/cbh1deT. reeseicon el portador CBM decel6A/cbh2y conector deT. reeseiseguido de sitio de reconocimiento de la proteasa Kex2. Se aseguró la terminación de transcripción con el terminadorcel7A/cbh1deT. reeseiy se utilizó el gen marcadoramdSdeA. nidulanspara la selección de los transformantes, tal como se describe en Paloheimoet al.(2003). Se aislaron los casetes de expresión lineales (fig. 2) a partir de los esqueletos de vector tras digestiones conNotly se transformaron en protocoplastos deT. reesei.Las cepas anfitrionas utilizadas no producían ninguna de las cuatro celulasas principales deT. reesei(CBHI, CBHII, EGI, EGII). Las transformaciones se llevaron a cabo tal como en Penttilaet al.(1987) con las modificaciones descritas en Karhunenet al.(1993), seleccionando la acetamidasa como única fuente de nitrógeno (gen marcadoramdS). Los transformantes se purificaron en placas de selección mediante conidios individuales antes de esporularlos sobre PD.
Tabla 8. Casetes de expresión construidos para producir las proteínas recombinantes Man6, Man7 y Man14 a partir deBacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticusyVirgibacillus solienTrichoderma reesei.La estructura global de los casetes de expresión era la descrita en la fig. 2.
La producción de mananasa de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz de agitación. Los transformantes se inocularon a partir de los cultivos inclinados en PD en matraces de agitación que contenían 50 ml de medio inductor de celulasa a base de lactosa compleja (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con KH2PO4 al 5 %. La producción de proteína GH5 de los transformantes se analizó a partir de sobrenadantes de cultivo tras cultivarla durante 7 horas a 30 °C a 250 rpm. Se analizó la producción heteróloga de proteínas recombinantes mediante SDS-PAGE con posterior tinción de Coomassie. Se seleccionaron los mejores transformantes productos para el cultivo en biorreactores a escala de laboratorio. Los transformantes se cultivaron en biorreactores por lotes o mediante un tipo de alimentación adicional del proceso bajo condiciones inductoras de proteínas a una temperatura habitual de cultivo fúngico mesofílico y condiciones ligeramente ácidas. Se continuó el cultivo hasta el agotamiento de los azúcares del medio o hasta alcanzar un rendimiento adecuado. Se recuperaron los sobrenadantes para ensayos de aplicación mediante centrifugación o filtración.
Ejemplo 7: ensayo de actividad de galactomananasa mediante el método de DNS
Se midió la actividad de mananasa (MNU) como la liberación de azúcares reductores a partir de galactomanano (al 0,3 % p/p) a 50 °C y pH 7,0 en 5 min. Se determinó espectrofotométricamente la cantidad de carbohidratos reductores liberados utilizando ácido dinitrosalicílico. El sustrato (al 0,3 % p/p) utilizado en el ensayo se preparó del modo siguiente: 0,6 g de goma garrofín (Sigma G-0753) en tampón de citrato sódico 50 mM, pH 7 (o tampón de citratofosfato, pH 7) a aproximadamente 80 °C utilizando un agitador magnético calefactado y se calentaron hasta el punto de ebullición. Se enfrió la solución y se dejó que se disolviese durante la noche en una sala fría (2-8 °C) bajo agitación continua y se eliminaron los residuos insolubles mediante centrifugación. Después, la solución se enrasó a 200 ml con tampón. Se almacenó el sustrato en forma congelada y se fundió mediante calentamiento en un baño de agua hirviendo a aproximadamente 80 °C, se enfrió hasta la temperatura ambiente y se mezcló cuidadosamente antes del uso. Se preparó el reactivo DNS utilizado en el ensayo mediante la disolución de 50 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico (Sigma D-550) en aproximadamente 4 litros de agua. Bajo agitación magnética continua se añadieron gradualmente 80,0 g de NaOH y se dejó que se disolviesen. Se añadió una cantidad de 1500 g de sal de Rochelle (tartrato de K-Na, Merck 8087) en partes pequeñas bajo agitación continua. La solución, calentada cuidadosamente hasta una temperatura máxima de 45 °C, se enfrió hasta la temperatura ambiente y se enrasó a 5000 ml. Después de lo anterior, se filtró a través de papel de filtro Whatman 1 y se almacenó en una botella oscura a temperatura ambiente. En primer lugar, se inició la reacción mediante la adición de 1,8 ml de solución de sustrato a cada una de las probetas y se dejó que se equilibrase a 50 °C durante 5 minutos, seguido de la adición de 200 pl de solución de enzima convenientemente diluida a uno de los tubos; se mezcló bien con un mezclador vórtex y se incubó exactamente durante 5 min a 50 °C. Los blancos de enzima no requirieron equilibración o incubación. La reacción se detuvo mediante la adición de 3,0 ml de reactivo DNS a ambos tubos y mezcla. Se añadieron 200 pl de solución de muestra a los tubos de blanco de enzima. Se introdujeron ambos tubos en un baño de agua hirviendo. Tras someter a ebullición durante exactamente 5 minutos, los tubos se introdujeron en un baño de agua de enfriamiento y se dejaron enfriar hasta la temperatura ambiente. Se midió la absorbancia de la muestra frente al blanco de enzima a 540 nm y se leyó la actividad a partir de la curva de calibración y se multiplicó por el factor de dilución. Una muestra diluida adecuada rindió una diferencia de absorbancia de entre 0,15 y 0,4. Se preparó una curva patrón a partir de solución madre de manosa 20 mM mediante la disolución de 360 mg de manosa (SigmaM-6020, almacenada en un desecador) en tampón de ensayo y se diluyó hasta preparar soluciones que contenían 3, 6, 10 y 14 pmol/ml de manosa. Los patrones se trataron igual que las muestras, excepto por la incubación a 50 °C. Las absorbancias se midieron frente al blanco de reactivo (que contenía tampón en lugar de dilución estándar de manosa) a 540 nm. Se construyó la curva de calibración para cada serie de ensayos. Se define una unidad de mananasa (MNU) como la cantidad de enzima que produce carbohidratos reductores con un poder reductor correspondiente a un nmol de manosa a partir de galactomanano en un segundo bajo las condiciones de ensayo (1 MNU=1nkat).
Ejemplo 8: purificación de mananasa Man6
Se separaron las células y sólidos del medio de cultivo de fermentación mediante centrifugación durante 10 min, 4000 g a 4 °C. Para la purificación de proteína se utilizaron 10 ml de sobrenadante. La muestra se filtró a través de membrana de PVDF de 0,44 pm (Millex-HV, Merck Millipore Ltd,Carrigtwohill, IRL). El filtrado se cargó en una columna de desalado HiPrep 26/10 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) equilibrada en HEPES 20 mM, pH 7. A continuación, se cargó la muestra desalada en una columna HiTrap Q HP de 5 ml (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) preequilibrada con HEPES 20 mM, pH 7. Tras la carga de muestra, la columna se lavó con el mismo tampón (20 ml). Las proteínas se eluyeron con un gradiente salino lineal de HEPES 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7, en 15 VC. Se recogieron fracciones de 5 ml y se analizaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contenían proteína diana se agruparon y se concentraron a 2 ml utilizando dispositivos de ultrafiltración MWCO de 10 kDa Vivaspin 20. La muestra concentrada se fraccionó adicionalmente utilizando una columna de filtración en gel 26/60 Superdex 75 equilibrada con MES 20 mM, NaCl 200 mM, pH 6,5. Se recogieron fracciones de 2 ml y se analizaron mediante SDS-PAGE. Se agruparon las fracciones que contenían mananasa pura. Se purificaron otras mananasas utilizando el mismo protocolo, aunque cambiando la composición del tampón en etapas de desalación e intercambio iónico. Se muestran las composiciones de los tampones en la Tabla 9.
Tabla 9. Tampones utilizados en la cromatografía de intercambio iónico
Se determinó el contenido de enzima de la muestra purificada utilizando mediciones de la absorbancia de UV de 280 nm. Se calcularon los coeficientes de excitación para cada mananasa en las bases de la secuencia de aminoácidos del enzima mediante la utilización de ExPASy servidor http://web.expasy.org/protparam/. (Gasteiger E. et al 2005). Se midió la actividad enzimática (MNU) de muestras purificadas como liberación de los azúcares reductores tal como se indica en el Ejemplo 7. Se calculó la actividad específica (MNU/mg) de las mananasas mediante división de la actividad MNU de la muestra purificada por la cantidad de enzima purificado. Se utilizaron los valores obtenidos para calcular las dosis de enzima utilizadas en los Ejemplos 10 y 11.
Perfiles de pH de las mananasas
Los perfiles de pH de las mananasas purificadas se determinaron utilizando el ensayo de tabletas beta-mannazyme de galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina (T-MNZ 11/14) de Megazyme con modificaciones menores del protocolo propuesto. Se verificó la linealidad del ensayo con cada enzima purificado. El ensayo se llevó a cabo en tampón de Britton-Robinson 40 mM ajustado a valores de pH de entre 4 y 11. La solución de enzima se diluyó en el tampón de ensayo y se equilibraron 50o pl de solución de enzima en un baño de agua a 50 °C durante 5 min antes de añadir una tableta de sustrato. Tras 10 minutos, la reacción se detuvo mediante la adición de 10 ml de Tris al 2 %, pH 12. Se dejaron los tubos de reacción a temperatura ambiente durante 5 min, se sometieron a agitación y el líquido se filtró a través de un filtro de papel de Whatman n.° 1. La liberación de tinte azul del sustrato se cuantificó mediante la medición de la absorbancia a 595 nm. La actividad de enzima a cada pH se informó como actividad relativa en la que se fijó la actividad al pH óptimo en 100 %. Se muestran los perfiles de pH en la figura 3.
Se calculó la actividad relativa (%) de la mananasa mediante la división de la actividad de mananasa de una muestra por la actividad de mananasa de una muestra de referencia. En el caso del perfil de pH, la muestra de referencia es una muestra al pH óptimo. En el caso del perfil de temperatura, la muestra de referencia es una muestra a la temperatura óptima.
Perfiles de temperatura de las mananasas
El óptimo de temperatura de las mananasas purificadas se determinó utilizando el ensayo de tabletas betamannazyme de galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina (T-MNZ 11/14) de Megazyme con modificaciones menores del protocolo propuesto. El ensayo se llevó a cabo a temperaturas variables entre 30 °C y 90 °C durante 10 minutos en tampón de Britton-Robinson 40 mM, pH 7. La actividad de enzima se informa como actividad relativa en la que la actividad a la temperatura óptima se fijó en 100 %. Se muestran los perfiles de temperatura en la figura 4.
Características de temperatura y pH de las mananasas
Man6 presenta una masa molecular de entre 30 y 35 kDa. La temperatura óptima del enzima a pH 7 es de entre 50 °C y 70 °C. Dicho enzima presenta un óptimo de pH en el intervalo de pH de entre por lo menos pH 6 y pH 9 a 50 °C. La temperatura óptima y el pH óptimo se determinaron utilizando un tiempo de reacción de 10 min y galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina a modo de sustrato.
Man7 presenta una masa molecular de entre 50 y 55 kDa. La temperatura óptima del enzima a pH 7 es de entre 50 °C y 70 °C. Dicho enzima presenta un óptimo de pH en el intervalo de pH de entre por lo menos pH 7 y pH 10 a 50 °C. La temperatura óptima y el pH óptimo se determinaron utilizando un tiempo de reacción de 10 min y galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina a modo de sustrato.
Man14 presenta una masa molecular de entre 30 y 40 kDa. La temperatura óptima del enzima a pH 7 es de entre 50 °C y 70 °C. Dicho enzima presenta un óptimo de pH en el intervalo de pH de entre por lo menos pH 7 y pH 8 a 50 °C. La temperatura óptima y el pH óptimo se determinaron utilizando un tiempo de reacción de 10 min y galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina a modo de sustrato.
Ejemplo 9: rendimiento de eliminación de manchas de las mananasas Man6 (invención) y Man7 (de referencia) con detergentes comerciales sin agentes blanqueadores
Se sometieron a ensayo las mananasas Man6 y Man7 producidas enBacillus(tal como se describe en el Ejemplo 5) y enTrichoderma(tal como se describe en el Ejemplo 6) para su capacidad de eliminar las manchas estándares sensibles a mananasa a 40 °C y dureza del agua de 16 °dH con detergentes comerciales sin agentes blanqueadores y en comparación con la preparación comercial de mananasa Mannaway®4,0 L (Novozymes). Se utilizaron las prendas de ensayo artificialmente manchadas siguientes del Center for testmaterial B.V. (Países Bajos): postre de chocolate sensible a mananasa sobre algodón (E-165), goma garrofín con pigmento sobre algodón (C-S-73) y sobre poliéster/algodón (PC-S-73) y goma guar con carbono negro sobre algodón (C-S-43). El tejido se cortó en trozos de 6 cm x 6 cm y se utilizaron 2 trozos de cada en un ensayo.
Se utilizó detergente líquido comercial de uso industrial A que contenía todos los demás enzimas excepto mananasa a una concentración de 4,4 g por litro de solución de lavado y detergente en polvo comercial para ropa de color sin enzimas, a una concentración de 3,8 g/l. Se prepararon soluciones de lavado que contenían detergente en agua corriente sintética con una dureza de 16 °dH. Se añadió proteasa Savinase® 16 L (al 0,5 % p/p) y amilasa Stainzyme® 12 L (al 0,4 % p/p) en agua dura con detergente en polvo comercial para ropa de color, el detergente líquido ya contenía amilasa y proteasa. El pH de la solución de lavado de detergente en polvo para ropa de color era de aproximadamente 10 y con el detergente líquido, de aproximadamente 8,3.
Las dosis de mananasa se encontraban comprendidas en el intervalo de entre 0-0,2/0,25%de peso de detergente, aunque para la evaluación de las dosis se calcularon como unidades de actividad enzimática (MNU) por ml de solución de lavado o como mg de proteína enzimática activa (PEA) por litro de solución de lavado. Se midió la actividad tal como se describe en el Ejemplo 7. Se calculó el contenido de PEA de cada preparación mediante la división de la actividad enzimática por la actividad específica, definida en el Ejemplo 8. La muestra de control contenía la solución de detergente, pero no contenía mananasa.
Para agua corriente sintética con una dureza de 16 °dH, se prepararon las soluciones madre siguientes en agua desionizada (Milli-Q o equivalente):
Solución madre con 1000 °D de dureza de calcio: CaCh x 2 H2O (1.02382.1000, Merck KGaA, Alemania) 26,22 g/I Solución madre con 200 °D de dureza de magnesio: MgSO4 x 7 H2O (1.05886.1000, Merck KGaA, Alemania) 8,79 g/l H2O
Solución madre de NaHCOa: NaHCO3 (1.06329.1000 Merck KGaA, Alemania) 29,6 g/l
Se añadieron 13,3 ml de solución de CaCh, 13,3 ml de solución de MgSO4 y 10,0 ml de solución de NaHCO3 recién preparada a un matraz volumétrico en el orden dado, se enrasaron a 1 litro con agua desionizada y se mezclaron. La dureza de agua se determinó mediante titulación complejoximétrico y se encontró que era correcta.
Los tratamientos de eliminación de manchas se llevaron a cabo en un Atlas LP-2 Launder-Ometer del modo siguiente. En primer lugar, el Launder-Ometer se precalentó a 40 °C. A continuación, se añadió detergente, 250 ml de agua corriente sintética con una dureza de 16 °dH y enzima diluido (<1,0 ml) en recipientes de 1,2 litros. Se añadieron manchas y se hizo funcionar la Launder-Ometer a 40 °C durante 60 min a una velocidad de rotación de 42 rpm. Después, los trozos se enjuagaron cuidadosamente bajo agua corriente y se secaron durante la noche en aire interior, sobre una rejilla protegida de la luz solar. Se evaluó el efecto de eliminación de manchas mediante la medición del color como valore de reflectancia con un espectrofotómetro Konica Minolta CM-3610A utilizando coordenadas de espacio de color L*a*b (iluminante D65/10°, corte de 420 nm). La decoloración de las manchas, que indica el rendimiento de la mananasa (eficiencia de eliminación de manchas) se calculó como AL* (delta L*), que significa el valor de luminosidad L* del tejido tratado con enzima menos el valor de luminosidad L* del tejido tratado con solución de lavado sin mananasa (control). Se muestran los resultados finales (efecto total de eliminación de manchas) como suma de AL* de cada mancha. Se calculó la media de los valores de color de cada mancha en 2 trozos. Los resultados obtenidos con detergente líquido comercial se muestran en las figs. 6-7. Las mananasas según la invención presentan un rendimiento de eliminación de manchas similar (Man6) o considerablemente mejor (Man7) con detergente líquido al dosificarse como unidades de actividad o como proteína enzimática activa, en comparación con preparación comercial de mananasa Mannaway® 4,0 L. Se obtuvo un rendimiento similar con Man6 y Man7 con independencia del anfitrión de expresión:BacillusoTrichoderma(fig 6). Los resultados obtenidos con detergente en polvo comercial para ropa de color (figs. 8-9) muestran que las mananasas según la invención presentan un mejor rendimiento de eliminación de manchas con detergente en polvo para ropa de color al dosificarlo como unidades de actividad o como proteína enzimática activa, en comparación con la preparación comercial de mananasa Mannaway® 4,0 L.
Ejemplo 10: rendimiento de eliminación de manchas de las mananasas Man6 (invención) y Man7 (de referencia) con detergente que contiene blanqueador
Se sometieron a ensayo las mananasas Man6 y Man7 producidas enBacillus(tal como se describe en el Ejemplo 5) para su capacidad de eliminar las manchas estándares sensibles a mananasa a 40 °C y dureza del agua de 16 °dH con detergentes comerciales con agentes blanqueadores y en comparación con la preparación comercial de mananasa Mannaway® 4,0 L (Novozymes). El sistema de ensayo era similar al descrito en el Ejemplo 9, excepto en que se utilizaron 3 trozos de tejido de ensayo artificialmente manchados diferentes del Center for testmaterial B.V. (Países Bajos): postre de chocolate sensible a mananasa sobre algodón (E-165), goma garrofín con pigmento sobre algodón (C-S-73) y goma guar con carbono negro sobre algodón (C-S-43). Se utilizó detergente en polvo comercial para ropa de color a una concentración de 4,2 g por litro de solución de lavado y el pH de la solución de lavado era de aprox. 9,5. Se añadió proteasa Savinase® 16 L (al 0,5 % p/p) y amilasa Stainzyme® 12 L (al 0,4 % p/p) en agua dura utilizada en el ensayo, ya que el detergente no contenía ningún enzima. Se midió el color de los trozos de tejido tras el tratamiento y se calcularon los resultados como la suma de AL* de cada 3 manchas tal como se describe en el Ejemplo 9. Los resultados (fig. 10) obtenidos con detergente comercial que contenía blanqueador indican que la mananasa según la invención (Man7) presenta un rendimiento de eliminación de manchas considerablemente mejor que la mananasa comercial Mannaway® 4,0 L al dosificarla como proteína enzimática activa. Con Man6 se obtuvo un rendimiento similar al de una mananasa bacteriana comercial.
Ejemplo 11: rendimiento de eliminación de manchas de mananasa Man14 (de referencia) con detergente líquido comercial
Se sometió a ensayo mananasa Man14 producida enBacillus(tal como se describe en el Ejemplo 5) para su capacidad de eliminar manchas estándares sensibles a mananasa a 40 °C y dureza del agua de 16 °dH con detergente líquido comercial de uso industrial B y se comparó con la preparación de mananasa comercial Mannaway® 4,0 L (Novozymes). El sistema de ensayo era similar al descrito en el Ejemplo 9, excepto en que se utilizaron dos tejidos de ensayo artificialmente manchados diferentes de Center for testmaterial B.V. (Países Bajos): postre de chocolate sensible a mananasa sobre algodón (E-165) y goma garrofín con pigmento sobre algodón (C-S-73). Se utilizó detergente B líquido comercial para uso industrial B a una concentración de 5 g por litro de solución de lavado y el pH de la solución de lavado era de aprox. 8,3. Se añadió proteasa Savinase® 16 L (al 0,5 % p/p) y amilasa Stainzyme® 12 L (al 0,4 % p/p) en agua dura utilizada en el ensayo, ya que el detergente no contenía ningún enzima. Se midió el color de los trozos de tejido tras el tratamiento y se calcularon los resultados como la suma de AL* de cada 2 manchas tal como se describe en el Ejemplo 9. Los resultados (figs. 11-12) obtenidos con detergente líquido comercial indican que Man14 presenta un buen rendimiento en un detergente líquido, comparable al producto comercial, al dosificarlo como unidades de actividad o como proteína enzimática activa.
Ejemplo 12: estabilidad de las mananasas Man6 (invención) y Man7 (de referencia) en detergentes líquidos comerciales
Se sometió a ensayo la estabilidad de preparaciones de las mananasas Man6 y Man7 producidas enBacillusen líquido OMO Color obtenido del supermercado local y se compararon a la preparación de mananasa comercial Mannaway® 4,0 L. Se añadieron preparaciones de mananasa al 0,5 % p/p en detergentes y se incubaron muestras en tubos de plástico con tapones a 37 °C durante 5 semanas. Se midió la actividad a determinados intervalos mediante el ensayo de actividad descrito en el Ejemplo 7, excepto en que se utilizó un tiempo de incubación de 30 min. Se calcularon los resultados como actividad residual (%), que se obtuvo mediante división de la actividad de una muestra obtenida en un determinado punto temporal por la actividad inicial de la muestra. Se sometió a ensayo la actividad de Man7 producida tanto enBacilluscomo enTrichodermay Man6 producida enTrichoderma,frente a Mannaway® 4,0 L también en detergente líquido comercial de uso industrial A que contiene proteasa pero no mananasa. En dicho ensayo, se utilizó una solución al 1 % (p/p) de mananasas y las muestras se incubaron a 37 °C durante 12 semanas. Los resultados en Omo Color (fig. 13) muestran que Man6 presentaba una estabilidad considerablemente mejor y Man7 similar a la Mannaway® 4,0 L. Man7 y especialmente Man6 eran ambos más estables que Mannaway® 4,0 L con otro detergente líquido comercial A, tal como se muestra en la fig. 14. Los resultados obtenidos en otro ensayo bajo las mismas condiciones mostraron que Man6 presentaba una estabilidad similar con independencia del anfitrión de expresión:BacillusoTrichoderma(datos no mostrados). Los resultados de los experimentos de estabilidad muestran que la mananasa según la invención es estable en detergentes durante varias semanas, incluso al almacenarla a alta temperatura, tal como 37 °C. La estabilidad de las mananasas según la invención (Man6 y Man7) está mejorada en comparación con una mananasa bacteriana comercial en detergente líquido.
Ejemplo 13: rendimiento de lavado de composiciones de detergente líquidas según la invención
Se determinó el rendimiento de lavado de composiciones de detergente líquidas según la presente invención mediante la utilización de manchas estandarizadas obtenibles de CFT (Center for Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Países Bajos ("CFT"), Eidgenossische Material- und Prüfanstalt Testmaterialien AG [Federal materials and testing agency, Testmaterials], St. Gallen, Suiza ("EMPA") y Warwick Equest Ltd Unit 55, Consett Business Park, Consett, County Durham ("Equest").
Se utilizó un agente de lavado líquido con la composición siguiente como formulación de base (todos los valores en porcentaje en peso):
El pH de la composición de detergente era de entre 8,2 y 8,6.
Basándose en dicha formulación de base, se prepararon las composiciones de detergente líquidas 1 y 2 mediante la adición de enzimas respectivos, tal como se indica a continuación:
Composición 1: enzima según SEC ID n.° 12 (Man6) (invención)
Composición 2: enzima según SEC ID n.° 16 (Man7) (de referencia)
El lavado se llevó a cabo de la manera siguiente, de acuerdo con el método AISE: 3,5 kg de trapos de ensayo (SBL, por sus siglas en inglés) limpios, 4 trapos SBL, lavadora Miele, a 20 °C y programa corto a 40 °C.
Se añadieron todas las mananasas en las mismas cantidades basándose en el contenido total de proteínas.
La proporción de dosificación del agente de lavado líquido era de 4,0 gramos por litro de solución de lavado. El procedimiento de lavado se llevó a cabo durante 60 minutos a una temperatura de 20 °C y de 40 °C, en el que el agua presentaba una dureza de entre 15,5 y 16,5 ° (grados alemanes de dureza).
Los resultados obtenidos son valores de la diferencia entre las unidades de remisión obtenidos con los detergentes y las unidades de remisión obtenidas con el detergente que contenía la mananasa de referencia disponible comercialmente (Mannaway 4.0L, obtenida de Novozymes). Por lo tanto, un valor positivo indica un rendimiento de lavado mejorado de las composiciones de detergente que comprenden las mananasas de la presente invención en comparación con la misma composición de detergente que comprende la mananasa de referencia. Se sometió a ensayo un amplio abanico de manchas dentro del ensayo de lavado.
La blancura, es decir, el abrillantamiento de las manchas, se determinó fotométricamente como indicación del rendimiento de lavado. Se utilizó un dispositivo espectrómetro Minolta CM508d, que se calibró previamente utilizando un patrón blanco proporcionado con la unidad.
Los resultados obtenidos son valores de la diferencia entre las unidades de remisión obtenidas con los detergentes y las unidades de remisión obtenidas con el detergente que contenía las combinaciones de enzimas. Por lo tanto, un valor positivo indica un rendimiento de lavado mejorado debido a las combinaciones de enzimas presentes en el detergente. Las mananasas de la invención en composiciones de detergente muestran un rendimiento mejorado sobre una diversidad de manchas que comprenden manano.
Ejemplo 14: rendimiento de lavado de composiciones de detergente en polvo según la invención
Se determinó el rendimiento de lavado de composiciones de detergente en polvo según la presente invención mediante la utilización de manchas estandarizadas obtenibles de CFT (Center for Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Países Bajos ("CFT"), Eidgenossische Material- und Prüfanstalt Testmaterialien AG [Agencia federal de materiales y ensayos, Testmaterials], St. Gallen, Suiza ("EMPA") y Warwick Equest Ltd Unit 55, Consett Business Park, Consett, County Durham ("Equest").
Se utilizó un agente de lavado sólido con la composición siguiente como formulación de base (todos los valores en porcentaje en peso):
(continuación)
Basándose en dicha formulación de base, se prepararon las composiciones de detergente líquidas 3 y 4 mediante la adición de enzimas respectivos, tal como se indica a continuación:
Composición 3: enzima según SEC ID n.° 12 (Man6) (invención)
Composición 4: enzima según SEC ID n.° 16 (Man7) (de referencia)
El lavado se llevó a cabo de la manera siguiente, de acuerdo con el método AISE: 3,5 kg de trapos de ensayo (SBL, por sus siglas en inglés) limpios, 4 trapos SBL, lavadora Miele, a 20 °C y programa corto a 40 °C. Se añadieron todas las mananasas en las mismas cantidades basándose en el contenido total de proteínas.
La proporción de dosificación del agente de lavado en polvo era de 3,8 gramos por litro de solución de lavado. El procedimiento de lavado se llevó a cabo durante 60 minutos a una temperatura de 20 °C y de 40 °C, en el que el agua presentaba una dureza de entre 15,5 y 16,5 ° (grados alemanes de dureza).
La blancura, es decir, el abrillantamiento de las manchas, se determinó fotométricamente como indicación del rendimiento de lavado. Se utilizó un dispositivo espectrómetro Minolta CM508d, que se calibró previamente utilizando un patrón blanco proporcionado con la unidad.
Los resultados obtenidos son valores de la diferencia entre las unidades de remisión obtenidos con los detergentes y las unidades de remisión obtenidas con el detergente que contenía la mananasa de referencia (Mannaway 4.0L, obtenida de Novozymes). Por lo tanto, un valor positivo indica un rendimiento de lavado mejorado de las variantes en el detergente. Las mananasas de la invención muestran un rendimiento mejorado sobre varias manchas. Por lo tanto, resulta evidente que las mananasas según la invención muestran un rendimiento de lavado mejorado en comparación con Mannaway.
Sin limitación del alcance e interpretación de las reivindicaciones de patente, determinados efectos técnicos de uno o más de los aspectos o realizaciones descritos en la presente memoria se señalan a continuación: Un efecto técnico es la degradación o modificación de mananos. Otro efecto técnico es la provisión de mananasa que presenta una buena estabilidad de almacenamiento. La descripción anterior proporciona mediante ejemplos no limitativos de implementaciones particulares y realizaciones de la invención, una descripción completa e informativa del mejor modo actualmente contemplado por los inventores de llevar a cabo la invención. Sin embargo, resultará evidente para el experto en la materia que la invención no se encuentra restringida a los detalles de las realizaciones presentadas anteriormente, sino que puede implementarse en otras realizaciones utilizando medios equivalentes sin desviarse de las características de la invención.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Composición de detergente que comprende por lo menos un enzima que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95 % respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 12, en la que el enzima o enzimas presentan actividad de degradación de mananos.
2. Composición de detergente según la reivindicación 1, en la que el enzima o enzimas presentan una secuencia de aminoácidos que presentan una identidad de secuencia de por lo menos 96 %, de por lo menos 97 %, de por lo menos 98 % o de por lo menos 99 % respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 12.
3. Composición de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, comprendiendo adicionalmente la composición uno o más enzimas adicionales seleccionados del grupo que consiste en proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, pectato liasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, xantanasa, lacasa y/o peroxidasa.
4. Composición de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición se encuentra en forma de una barra, una tableta homogénea, una tableta que presenta dos o más capas, una bolsa que presenta uno o más compartimientos, unos polvos regulares o compactados, un granulado, una pasta, un gel o un líquido regular, compacto o concentrado.
5. Composición de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición de detergente es una composición de detergente de lavandería, preferentemente una composición de detergente de lavandería líquida o sólida.
6. Utilización de una composición de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la degradación de mananos.
7. Utilización de una composición de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en un procedimiento de lavandería.
8. Método para eliminar una mancha de una superficie, que comprende poner en contacto la superficie con una composición de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
9. Método para degradar manano que comprende aplicar una composición de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en manano, preferentemente en el que el manano se encuentra sobre la superficie de un textil.
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