ES2964813T3 - Conjugados de fármacos que comprenden anticuerpos contra claudina 18.2 - Google Patents

Conjugados de fármacos que comprenden anticuerpos contra claudina 18.2 Download PDF

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Abstract

La presente invención proporciona conjugados de fármaco-anticuerpo anti-CLDN18.2 que son eficaces para tratar y/o prevenir enfermedades cancerosas asociadas con células que expresan CLDN18.2, incluyendo cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon. , cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de vesícula biliar y metástasis de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de fármacos que comprenden anticuerpos contra claudina 18.2
Los anticuerpos monoclonales (mABs) han revolucionado el tratamiento del cáncer en las últimas dos décadas (Sliwkowski, M. X. et al. (2013) Science 341 (6151), 1192-1198). Una característica crítica de los mABs es su alta especificidad y su capacidad para atacar células tumorales, marcándolas para la muerte celular mediada por efectores inmunes (citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)) y/o conduciendo a una reducción proliferación y apoptosis (Kubota, T. et al. (2009) Cancer Sci. 100 (9), 1566-1572). La conjugación con fármacos citotóxicos puede ampliar la utilidad de los mABs y mejorar su potencia y eficacia (Goldmacher, V. S. et al. (2011) Ther. Deliv. 2 (3), 397-416; Sievers, E. L. (2013) Annu. Rev. Med. 64, 15-29).
Históricamente, el uso de fármacos citotóxicos para el tratamiento del cáncer se ha centrado en quimioterapias dirigidas a células cancerosas en división. Estos compuestos no solo se dirigen a las células cancerosas sino también a otras células sanas en división del cuerpo, y los pacientes que reciben tratamiento experimentan efectos secundarios graves que limitan la dosis. El índice terapéutico (dosis máxima tolerada/dosis mínima eficaz) de estos fármacos es bajo, lo que da lugar a una ventana terapéutica estrecha (Ismael, G. F. V. et al. (2008) Cancer Treat Rev. 34 (1), 81 91). Para sortear este obstáculo en el desarrollo de fármacos y mejorar el índice terapéutico, se pueden utilizar anticuerpos para administrar el fármaco citotóxico específicamente al tumor. Al combinar las capacidades únicas de direccionamiento de un anticuerpo con la capacidad de matar el cáncer de un fármaco citotóxico, los conjugados anticuerpo-fármaco (ADCs) exhiben menores efectos secundarios y proporcionan una ventana terapéutica más amplia en comparación con los agentes quimioterapéuticos tradicionales (Gerber, H.-P. et al. (2013) Nat. Prod. Rep. 30 (5), 625-639).
Los ADCs están diseñados para matar células cancerosas de manera dependiente del objetivo. El primer paso en este proceso es la unión del anticuerpo a su antígeno. Tras la unión del ADC, todo el complejo antígeno-ADC se internaliza y la carga citotóxica se libera en la célula tumoral, lo que provoca la muerte celular. Los factores que influyen en el índice terapéutico de los ADC incluyen el anticuerpo, el antígeno diana del tumor, el fármaco citotóxico y el enlazzador (Panowksi, S. et al. (2014) MAbs 6 (1), 34-45).
Como requisito previo básico para el desarrollo de ADCs, el antígeno diana del tumor debe estar localizado en la superficie celular y ser accesible al anticuerpo circulante. Además, la selectividad tumoral y el nivel de expresión del antígeno diana son parámetros críticos para el diseño de ADC seguros y eficaces. Actualmente, se están evaluando una variedad de antígenos de superficie celular asociados a tumores como objetivos de ADC para la terapia del cáncer (Trail, P. A. (2013) Antibodies 2 (1), 113-129; Teicher, B. A. (2009) Curr. Cancer Drug Targets 9 (8), 982-1004).
La eficacia de un ADC también depende del fármaco citotóxico. Como la cantidad de anticuerpo que se localiza en un tumor es muy pequeña en comparación con la dosis administrada, se requieren compuestos tóxicos con potencia subnanomolar. Las auristatinas y los maitansinoides son dos clases de citotoxinas muy potentes que se utilizan actualmente en el desarrollo de ADC (Trail, PA (2013) Anticuerpos 2 (1), 113-129). Ambos son agentes antimitóticos que bloquean la polimerización de la tubulina causando la muerte celular mediante una detención del ciclo celular en la fase G2/M (Lopus, M. et al. (2010) Mol. Cancer Ther. 9 (10), 2689-2699; Francisco, J. A et al. (2003) Blood 102 (4), 1458-1465). Además de la especificidad del mAB y la potencia del fármaco, el enlazador es un elemento importante en el desarrollo del ADC. El enlazador debe ser estable para aprovechar la vida media farmacocinética del mAB y no debe liberar el fármaco citotóxico hasta la internalización mediada por antígeno. Los enlazadores se pueden clasificar según su mecanismo de liberación de fármacos: Los enlazadores escindibles liberan el fármaco mediante hidrólisis o escisión enzimática después de la internalización específica del antígeno, mientras que los enlazadores no escindibles liberan el fármaco mediante la degradación del mAB en los lisosomas después de la internalización (Dosio, F. et al. (2011) Toxins (Basel) 3 (7), S. 848-883).
Dependiendo del diseño del enlazador, las toxinas permeables a la membrana (lipófilas) que se liberan dentro de las células diana positivas pueden atravesar la membrana celular y matar otras células que están muy cerca, incluidas las células cancerosas vecinas que carecen de expresión de antígenos (efecto del espectador) (Kovtun, Y. V. et al. (2006) Cancer Res.66 (6), 3214-3221). La capacidad de estos fármacos citotóxicos para mediar en la muerte de espectadores locales es un criterio de selección importante para aquellos ADCs dirigidos contra antígenos que se expresan de forma heterogénea en tumores.
La molécula de unión estrecha claudina 18 isotipo 2 (CLDN18.2) es una variante de empalme de Claudina 18 asociada al cáncer. CLDN18.2 es una proteína transmembrana de 27,8 kDa que comprende cuatro dominios que atraviesan la membrana con dos pequeños bucles extracelulares (bucle 1 abrazado por la región hidrofóbica 1 y la región hidrofóbica 2; bucle 2 abrazado por las regiones hidrofóbicas 3 y 4). CLDN18.2 es un antígeno de linaje gástrico altamente selectivo, expresado exclusivamente en células epiteliales gástricas diferenciadas de vida corta y no detectable en ningún otro tejido humano normal. El antígeno se expresa ectópicamente en niveles significativos en una diversidad de cánceres humanos, incluido el cáncer gastroesofágico y pancreático (Sahin, U., et al., Clin Cancer Res, 2008.
14(23): pág. 7624-34). La proteína CLDN18.2 también se detecta con frecuencia en metástasis a ganglios linfáticos de cáncer gástrico y en metástasis a distancia. CLDN18.2 parece estar involucrada en la proliferación de células tumorales positivas para CLDN18.2, ya que la regulación negativa del objetivo mediante la tecnología de ARNip da como resultado la inhibición de la proliferación de células de cáncer gástrico.
El documento EP1997832 describe la preparación de anticuerpos que se unen a CLDN18.2 y propone la preparación de ADCs.
IMAB362 es un anticuerpo monoclonal quimérico del subtipo IgG1 dirigido contra CLDN18.2. IMAB362 reconoce el primer dominio extracelular de CLDN18.2 con alta afinidad y especificidad y no se une a ningún otro miembro de la familia de claudina, incluida la variante de empalme 1 estrechamente relacionada de Claudin 18. (CLDN18.1). En xenoinjertos humanos que expresan CLDN18.2 se han observado beneficios en la supervivencia y regresiones tumorales en ratones después de la administración de IMAB362. Cuando se administra por vía intravenosa en especies animales relevantes, no se observa toxicidad en el tejido gástrico ya que el epítopo diana no es accesible. Sin embargo, el objetivo del tumor se vuelve accesible para IMAB362 durante la transformación maligna. IMAB362 agrupa cuatro mecanismos de acción independientes muy potentes: (i) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), (ii) citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), (iii) inducción de apoptosis inducida por entrecruzamiento del objetivo en la superficie del tumor y (iv) inhibición directa de la proliferación. Un ensayo de fase I anterior evaluó IMAB362 como monoterapia en una dosis única en pacientes con cáncer gastroesofágico en etapa tardía. Este estudio demuestra que una sola administración de este anticuerpo es segura y bien tolerada en una dosis de hasta 1000 mg/m2, ya que no se pudieron observar diferencias relevantes en el perfil de AE y otros parámetros de seguridad entre los grupos de dosis (AE = evento adverso). Los mejores resultados con respecto a la actividad antitumoral se obtuvieron con los grupos de 300 mg/m2 y 600 mg/m2. Se llevó a cabo un ensayo clínico de fase IIa para determinar la seguridad, tolerabilidad y actividad antitumoral de dosis repetidas de IMAB362 en pacientes con enfermedad metastásica, refractaria o recurrente de adenocarcinoma avanzado de estómago o esófago inferior comprobado mediante histología.
Como se describió anteriormente, CLDN18.2 tiene un patrón de expresión restringido en células normales y, por lo tanto, parece ser un objetivo ideal para la terapia del cáncer dirigida por anticuerpos que expresan CLDN18.2. En consecuencia, existe la necesidad de una terapia dirigida contra las células cancerosas que expresan CLDN18.2 que sea capaz de ejercer un efecto citotóxico o citostático clínicamente útil sobre las células que expresan CLDN18.2, particularmente sin ejercer efectos indeseables sobre las células que no expresan CLDN18.2. Preferiblemente, la terapia no debería estar asociada con desventajas y efectos secundarios indeseables comúnmente asociados con enfoques que se han utilizado para aumentar la eficacia terapéutica de los anticuerpos tales como el radiomarcado y la combinación con quimioterapia. Por ejemplo, la terapia con isótopos se asocia con mielosupresión, y la terapia combinada con anticuerpos y quimioterapia se asocia con inmunosupresión. Además, las sustancias marcadas isotópicamente son difíciles de producir, y los pacientes a menudo experimentan una recaída después del tratamiento inicial con sustancias marcadas isotópicamente.
La presente enseñanza demuestra la existencia de anticuerpos monoclonales anti-CLDN18.2 que pueden internalizarse de manera muy eficiente tras la unión de CLDN18.2 a células que expresan CLND18.2 y, por lo tanto, son adecuados para el desarrollo de ADC. Además, se describe la conjugación exitosa de dichos anticuerpos con los fármacos DM4 y MMAE utilizando enlazadores SPDB o Val-Cit (vc) escindibles, respectivamente.In vitro,los conjugados de anticuerpos reducen la viabilidad de las células cancerosas gástricas y pancreáticas que expresan Cl Dn 18.2. IMAB362-vcMMAE e IMAB362-DM4 no se unen ni influyen en la viabilidad de las células ClDn 18.2 negativas. Tanto los conjugados DM4 como vcMMAE ejercen efectos de destrucción de espectadores en células cancerosas CLDN18.2 negativas cocultivadas con células cancerosas CLDN18.2 positivasin vitro.Además,in vivo,La administración intravenosa de los conjugados de anticuerpos en ratones lampiños con tumores de xenoinjerto gástrico o pancreático CLDN18.2 positivos da como resultado una inhibición del crecimiento tumoral dependiente de la dosis, un beneficio en la supervivencia e incluso una regresión completa de los tumores tempranos y avanzados. Se observan efectos terapéuticos importantes con la aplicación intravenosa de una dosis única de ~4 a 8 mg/kg; los efectos terapéuticos óptimos se logran con 15-16 mg/kg. No se pudo determinar la dosis única máxima tolerada de ambos conjugados ya que las dosis más altas posibles probadas de 15,2 y 16 mg/kg no produjeron toxicidades hepáticas ni otros efectos tóxicos.
A partir de los datos presentados en este documento se puede concluir que los conjugados de fármaco-anticuerpo anti-CLDN18.2 como los descritos en este documento son fármacos muy potentes para el tratamiento de carcinomas humanos CLDN18.2 positivos, como los carcinomas gástricos y pancreáticos.
Sumario de la invención
La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
La invención se basa en la enseñanza que se explicará a continuación:
Resumen
La presente enseñanza proporciona generalmente una terapia para tratar y/o prevenir eficazmente el cáncer asociado con células que expresan CLDN18.2 tal como cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de colon. cáncer, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de vesícula biliar y metástasis de los mismos, en particular metástasis de cáncer gástrico tales como tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal y metástasis de ganglios linfáticos. Las enfermedades cancerosas especialmente preferidas son los adenocarcinomas de estómago, esófago, conducto pancreático, conductos biliares, pulmón y ovario.
En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un método para tratar o prevenir un cáncer que expresa CLDN18.2 que comprende administrar un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 unido covalentemente a al menos una fracción de fármaco de toxina para un paciente con cáncer.
El conjugado anticuerpo-fármaco se internaliza en las células tras la unión al CLDN18.2 expresado por las células.
El anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une específicamente a CLDN18.2. El conjugado anticuerpo-fármaco se une específicamente a CLDN18.2.
En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado, o un fragmento de un anticuerpo. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo monoclonal.
En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une a epítopos nativos de CLDN18.2 presentes en la superficie de células vivas. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une a un dominio extracelular de CLDN18.2. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une al primer bucle extracelular de CLDN18.2.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en (i) un anticuerpo producido y/o obtenible a partir de un clon depositado con el número de acceso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809, o DSM ACC 2810, (ii) un anticuerpo que es una forma quimerizada o humanizada del anticuerpo según (i), (iii) un anticuerpo que tiene la especificidad del anticuerpo según (i) y (iv) un anticuerpo que comprende la porción de unión al antígeno o el sitio de unión al antígeno, en particular la región variable, del anticuerpo según (i) y preferiblemente que tiene la especificidad del anticuerpo según (i). En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 o 51 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24 En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 reconoce el mismo o esencialmente el mismo epítopo que un anticuerpo de unión a CLDN18.2 que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos, y/o compite con dicho anticuerpo de unión a CLDN18.2 para unirse a CLDN18.2. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 reconoce el mismo o esencialmente el mismo epítopo que un anticuerpo de unión a CLDN18.2 que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 o 51 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos, y/o compite con dicho anticuerpo de unión a CLDN18.2 para unirse a CLDN18.2. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 reconoce el mismo o esencialmente el mismo epítopo que un anticuerpo de unión a CLDN18.2 que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos, y/o compite con dicho anticuerpo de unión a CLDN18.2 para unirse a CLDN18.2. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 reconoce el mismo o esencialmente el mismo epítopo que un anticuerpo de unión a CLDN18.2 que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos, y/o compite con dicho anticuerpo de unión a CLDN18.2 para unirse a CLDN18.2. Un anticuerpo que compite con un segundo anticuerpo por unirse a una diana preferiblemente es antagonista de dicho segundo anticuerpo.
En una realización, la fracción de fármaco de toxina es permeable a la membrana celular. En una realización, la fracción de fármaco de toxina es un agente citotóxico o citostático. En una realización, la fracción de fármaco de la toxina es un maitansinoide o una auristatina. En una realización, el maitansinoide se selecciona del grupo que consiste en DM1 y DM4. En una realización, la auristatina se selecciona del grupo que consiste en monometil auristatina E (MMAE) y monometil auristatina F (MMAF).
Según la invención, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 está unido covalentemente a la fracción del fármaco de la toxina mediante un enlazador que es escindible mediante una proteasa intracelular. En una realización, el enlazador es un enlazador escindible por catepsina. En una realización, el enlazador comprende un dipéptido. En una realización, el dipéptido es val-cit o phe-lys. En una realización, el anticuerpo se une al enlazador a través de una cisteína tiol del anticuerpo. En una realización, el anticuerpo se une al enlazador a través de grupos amina, en particular grupos amina de residuos de lisina del anticuerpo.
En una realización, el conjugado anticuerpo-fármaco se administra en una cantidad eficaz para el tratamiento o prevención del cáncer que expresa CLDN18.2. En una realización, el conjugado anticuerpo-fármaco se administra a una dosis de entre 3 y 30 mg/kg de peso corporal, tal como entre 4 y 25, 5 a 20, 10 a 18 o 15 a 16 mg/kg de peso corporal. En una realización, el conjugado anticuerpo-fármaco se administra a una dosis de entre 8 a 150, 9 a 100 o 9 a 90 mg/m2 de superficie corporal de un paciente humano, tal como entre 12 a 75, 15 a 60, 30 a 54 o 45 a 48 mg/m2 de superficie corporal de un paciente humano. En una realización, se administra una dosis única del conjugado anticuerpo-fármaco o dos o más dosis del conjugado anticuerpo-fármaco. En una realización, el conjugado anticuerpofármaco se administra mediante inyección intravenosa.
En una realización, el método de la enseñanza comprende además administrar cirugía, quimioterapia y/o radioterapia.
En una realización, la expresión de CLDN18.2 se produce en la superficie celular de las células cancerosas. En una realización, el cáncer es un adenocarcinoma, en particular un adenocarcinoma avanzado. En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de cabeza-cuello. cáncer, cáncer de vesícula biliar y sus metástasis, un tumor de Krukenberg, metástasis peritoneal y/o metástasis en ganglios linfáticos. En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de estómago, cáncer de esófago, en particular cáncer de esófago inferior, cáncer de la unión eso-gástrica y cáncer gastroesofágico. En una realización, el paciente es un paciente negativo para HER2/neu o un paciente con estado positivo para HER2/neu pero no elegible para la terapia con trastuzumab.
En una realización, CLDN18.2 tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1.
En un aspecto adicional, la presente enseñanza proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 unido covalentemente a al menos una fracción de fármaco de toxina.
El conjugado anticuerpo-fármaco se internaliza en las células tras la unión al CLDN18.2 expresado por las células.
El anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une específicamente a CLDN18.2. El conjugado anticuerpo-fármaco se une específicamente a CLDN18.2.
En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado, o un fragmento de un anticuerpo. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo monoclonal.
En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une a epítopos nativos de CLDN18.2 presentes en la superficie de células vivas. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une a un dominio extracelular de CLDN18.2. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une al primer bucle extracelular de CLDN18.2.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en (i) un anticuerpo producido y/o obtenible a partir de un clon depositado con el número de acceso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 o DSM ACC 2810, (ii) un anticuerpo que es una forma quimerizada o humanizada del anticuerpo según (i), (iii) un anticuerpo que tiene la especificidad del anticuerpo según (i) y (iv) un anticuerpo que comprende la porción de unión al antígeno o el sitio de unión al antígeno, en particular la región variable, del anticuerpo según (i) y preferiblemente que tiene la especificidad del anticuerpo según (i). En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 o 51 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35. En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 reconoce el mismo o esencialmente el mismo epítopo que un anticuerpo de unión a CLDN18.2 que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos, y/o compite con dicho anticuerpo de unión a CLDN18.2 para unirse a CLDN18.2. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 reconoce el mismo o esencialmente el mismo epítopo que un anticuerpo de unión a CLDN18.2 que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 o 51 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos, y/o compite con dicho anticuerpo de unión a CLDN18.2 para unirse a CLDN18.2. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 reconoce el mismo o esencialmente el mismo epítopo que un anticuerpo de unión a CLDN18.2 que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos, y/o compite con dicho anticuerpo de unión a CLDN18.2 para unirse a CLDN18.2. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 reconoce el mismo o esencialmente el mismo epítopo que un anticuerpo de unión a CLDN18.2 que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos, y/o compite con dicho anticuerpo de unión a CLDN18.2 para unirse a CLDN18.2. Un anticuerpo que compite con un segundo anticuerpo por unirse a una diana preferiblemente es antagonista de dicho segundo anticuerpo.
En una realización, la fracción de fármaco de toxina es permeable a la membrana celular. En una realización, la fracción de fármaco de toxina es un agente citotóxico o citostático. En una realización, la fracción de fármaco de la toxina es un maitansinoide o una auristatina. En una realización, el maitansinoide se selecciona del grupo que consiste en DM1 y DM4. En una realización, la auristatina se selecciona del grupo que consiste en monometil auristatina E (MMAE) y monometil auristatina F (MMAF).
Según la invención, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 está unido covalentemente a la fracción de fármaco de la toxina mediante un enlazador que es escindible mediante una proteasa intracelular. En una realización, el enlazador es un enlazador escindible por catepsina. En una realización, el enlazador comprende un dipéptido. En una realización, el dipéptido es val-cit o phe-lys. En una realización, el anticuerpo se une al enlazador a través de una cisteína tiol del anticuerpo. En una realización, el anticuerpo se une al enlazador a través de grupos amina, en particular grupos amina de residuos de lisina del anticuerpo.
En una realización, CLDN18.2 tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1.
En un aspecto adicional, la presente enseñanza proporciona una formulación farmacéutica que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco de la enseñanza, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional, la presente enseñanza proporciona una preparación médica que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco de la enseñanza. En una realización, la preparación médica está presente en forma de un kit que comprende un recipiente que incluye el conjugado anticuerpo-fármaco. En una realización, la preparación médica incluye además instrucciones impresas para el uso de la preparación en un método para tratar o prevenir el cáncer, en particular un cáncer que expresa CLDN18.2.
En un aspecto adicional, la presente enseñanza proporciona el conjugado anticuerpo-fármaco de la enseñanza, la composición farmacéutica de la enseñanza o la preparación médica de la enseñanza para uso en terapia, en particular para uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer, en en particular un cáncer que expresa CLDN18.2. En una realización, el método para tratar o prevenir el cáncer es un método para tratar un cáncer que expresa CLDN18.2 de la enseñanza.
Otras características y ventajas de la presente enseñanza serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Cifra 1: Conjugación de anticuerpos y fármacos.
Figura 2: Reducción de la viabilidad después de la coincubación de células HEK293~CLDN18.2 con mAbs quiméricos anti-CLDN18.2 y Fab-ZAP (evaluación indirecta de la intemalización). Se incubaron células HEK293~C<l>DN18.2 durante 72 h con anticuerpos específicos anti-CLDN18.2 y un fragmento Fab de IgG antihumano conjugado con saporina (Fab-ZAP humano). La endocitosis de IMAB362, chim mAB294, chim mAB308 y chim mAB359 se determinó indirectamente midiendo la viabilidad celular. Los puntos de datos (n= 3 réplicas) se representan como media ± SD.
Figura 3: Reducción de la viabilidad después de la coincubación de células HEK293~CLDN18.2 con anticuerpos murinos anti-CLDN18.2 y Fab-ZAP (evaluación indirecta de la internalización). Se incubaron células HEK293 ~ CLDN18.2 durante 72 h con anticuerpos murinos reactivos anti-CLDN18.2 y un fragmento Fab de IgG anti-ratón conjugado con saporina (Fab-ZAP murino). La endocitosis de diferentes anticuerpos murinos reactivos anti-CLDN18.2 se determinó indirectamente midiendo la viabilidad celular.
Figura 4: Afinidades de unión relativas de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE a células CLDN18.2 positivas.
Las afinidades de unión relativas de los conjugados IMAB362-toxina en comparación con IMAB362 no conjugado se determinaron en (A) células NUGC-4 10cF7-5 sort3a y (B) DAN-G 1C5F2 que expresan endógenamente CLDN18.2, (C) NCI-N87~C<l>D<n>18.2 y (D) células B<x>PC-3~CL<d>N18.2 que sobreexpresan ectópicamente CLDN18.2 mediante citometría de flujo en concentraciones de anticuerpos de hasta 20 pg/ml. Los puntos de datos (n= 2 réplicas) se representan como media ± SD.
Figura 5: Unión mediada por CLDN18.2 de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE. La unión mediada por CLDN18.2 de los conjugados IMAB362-toxina se analizó en (A) células NCI-N87~CLDN18.2 que sobreexpresan ectópicamente CLDN18.2 y en (B) la correspondiente línea celular tumoral humana CLDN18.2 negativa mediante citometría de flujo en concentraciones de anticuerpo de hasta 20 pg/ml. Los puntos de datos (n= 2 réplicas) se representan como media ± SD.
Figura 6: Especificidades de unión de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE.
Las especificidades de unión de los conjugados IMAB362-toxina se determinaron en (A) HEK293-CLDN18.2, (B) HEK293~CLDN18.1 o (C) HEK293~células simuladas como control negativo. La unión se analizó mediante citometría de flujo a concentraciones de anticuerpo de hasta 20 pg/ml. Los puntos de datos (n= 2 réplicas) se representan como media ± SD.
Figura 7: Efecto de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE sobre la viabilidad de líneas celulares de carcinoma humano que expresan CLDN18.2.
Curvas dosis-respuesta de la reducción mediada por IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE de (A) NUGC-4 10cF7-5 sort 3a, (B) NCI-N87-CLDN18.2 y (C) BxPC-3~CLDN18.2 viabilidad celular. Se utilizó IMAB362 como control negativo (sin efecto en los ensayos de viabilidad en estas condiciones). Las células se incubaron durante 72 h en presencia de anticuerpos en concentraciones de hasta 16875 ng/ml. La reducción de la viabilidad celular se midió utilizando un ensayo de viabilidad basado en XTT. Los puntos de datos (n= 3 réplicas) se representan como media ± SD.
Figura 8: La dependencia de CLDN18.2 de IMAB362-vcMMAE media la reducción de la viabilidad de las células tumorales.
La dependencia del objetivo de la reducción de la viabilidad celular mediada por IMAB362-vcMMAE se determinó en células NCI-N87 (CLDN18.2 negativas) y células NCI-N87~CLDN18.2 que expresan ectópicamente el objetivo. Las células se incubaron durante 72 h con IMAB362-vcMMAE o IMAB362 no conjugado en concentraciones de hasta 16875 ng/ml. Se sabe que IMAB362 no tiene actividad en las condiciones experimentales utilizadas aquí. La reducción de la viabilidad celular se midió utilizando un ensayo de viabilidad basado en XTT. Los puntos de datos (n= 3 réplicas) se representan como media ± SD.
Figura 9: Especificidad de la reducción de la viabilidad celular mediada por IMAB362-vcMMAE.
La especificidad objetivo de la reducción de la viabilidad celular mediada por IMAB362-vcMMAE se probó con células HEK293-CLDN18.2, HEK293~CLDN18.1 y HEK293~ transfectadas de forma estable. Las células se incubaron durante 72 h en presencia de IMAB362-vcMMAE en concentraciones de hasta 16875 ng/ml. La reducción de la viabilidad celular se midió utilizando un ensayo de viabilidad basado en XTT. Los puntos de datos (n= 3 réplicas) se representan como media ± SD.
Figura 10: Actividades de espectadores de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE.
La inducción mediada por IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE de efectos espectadores se determinó en experimentos de cocultivo utilizando células PA-1(Luc) (CLDN18.2 negativas/luciferasa positivas) y células NUGC-4 10cE8 (CLDN18.2 positivas/ luciferasa negativa). Como control de fondo, se incubaron células PA-1 (Luc) con IMAB362-DM4- o IMAB362-vcMMAE. Para el tratamiento, las células se cultivaron durante 4 días en presencia de IMAB362-DM4200 ng/ml, IMAB362-vcMMAE 800 ng/ml o IMAB362800 ng/ml. Se midió la actividad luciferasa.
Figura 11: Inhibición del crecimiento tumoral de tumores de xenoinjerto BxPC-3 ~ CLDN18.2 avanzados por IMAB362-DM4.
Se injertaron células BxPC-3 ~ CLDN18.2 positivas para CLDN18.2 por vía subcutánea en el flanco de ratones hembra atímicos lampiños. El día 14, los ratones se organizaron en 4 grupos y se les inyectó por vía intravenosa una dosis única de vehículo, 7,5 mg/kg, 15 mg/kg de IMAB362-DM4 o una dosis repetida de 15 mg/kg de IMAB362-DM4 (días 14 y 21).. El tamaño de los tumores subcutáneos se midió dos veces por semana (media SEM). Tamaño del grupo n=5. SD: dosis única, RD: dosis repetida.
Figura 12: Peso corporal medio de ratones tratados con IMAB362-DM4.
El peso corporal de ratones lampiños portadores de tumores BxPC-3~CLDN18.2 tratados con una dosis única de vehículo de control, 7,5 mg/kg o 15 mg/kg o dosis repetidas de 15 mg/kg de IMAB362-DM4, respectivamente, se controló dos veces por semana. El peso corporal de los 4 grupos se presenta como media. Tamaño del grupo n=5.
Figura 13: Parámetros de química clínica de la administración de dosis única y repetida de IMAB362-DM4 en ratones lampiños con xenoinjerto.
Se analizó la química clínica de ratones hembra lampiños portadores de tumores BxPC-3~CLDN18.2 tratados por vía intravenosa con una dosis única de vehículo, 7,5 mg/kg, 15 mg/kg de IMAB362-DM4 o una dosis repetida de 15 mg/kg de IMAB362-DM4. analizado el día 49 después del injerto. A) Alanina transaminasa (GPT), B) aspartato transaminasa (GOT), C) glutamato deshidrogenasa, D) fosfatasa alcalina, E) a-amilasa, F) colinesterasa, G) creatina quinasa (CK), H) lactato deshidrogenasa (LDH)), I) lipasa, J) urea, K) glucosa, L) proteína total y M) albúmina.
Figura 14: Análisis histológico de secciones de estómago de IMAB362-DM4 y ratones tratados con vehículo.
Los ratones con tumores de xenoinjerto BxPC-3 ~ CLDN18.2 se trataron con IMAB362-DM4. El día 49, se sacrificaron los ratones post-injerto y se diseccionaron órganos seleccionados y se fijaron con formalina. Se tiñeron secciones de estos tejidos FFP<e>con hematoxilina-eosina y se examinaron microscópicamente en busca de alteraciones morfológicas. (A, C) Tejidos del estómago de un ratón representativo del grupo de tratamiento con la mayor exposición a IMAB362-DM4 (15 mg/kg de IMAB362-DM4 el día 14 y el día 21 después del injerto). (B, D) Tejido del estómago del ratón del grupo de control tratado únicamente con el vehículo. Ampliación: ver barra de escala.
Figura 15: Inhibición del crecimiento tumoral de tumores de xenoinjerto BxPC-3 ~ CLDN18.2 avanzados IMAB362-vcMMAE.
Se injertaron células BxPC-3~CLDN18.2 positivas para CLDN18.2 por vía subcutánea en el flanco de ratones hembra lampiños. El día 14, los ratones se organizaron en 4 grupos y se les inyectó por vía intravenosa una dosis única de vehículo, 8 mg/kg, 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE o una dosis repetida de 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE (días 14 y 21).. El tamaño de los tumores subcutáneos se midió dos veces por semana (media SEM). Tamaño del grupo n=5.
Figura 16: Peso corporal medio de ratones tratados con IMAB362-vcMMAE.
El peso corporal de ratones hembra lampiños portadores de tumores tratados con una dosis única de control de vehículo, 8 mg/kg o 16 mg/kg, o dosis repetidas de 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE, se controló dos veces por semana. El peso corporal de los 4 grupos se presenta como media. Tamaño del grupo n=5.
Figura 17: Parámetros de química clínica de la administración de dosis única y repetida de IMAB362-vcMMAE en ratones lampiños con xenoinjerto.
Se analizó la química clínica de ratones hembra lampiños portadores de tumores BxPC-3~CLDN18.2 tratados por vía intravenosa con una dosis única de vehículo, 8 mg/kg, 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE o una dosis repetida de 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE analizado el día 37 después del injerto. A) Alanina transaminasa (GPT), B) aspartato transaminasa (GOT), C) glutamato deshidrogenasa, D) fosfatasa alcalina, E) a-amilasa, F) colinesterasa, G) creatina quinasa (CK), H) lactato deshidrogenasa (LDH)), I) lipasa, J) urea, K) glucosa, L) proteína total y M) albúmina.
Figura 18: Eficacia antitumoral dependiente de la dosis de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE en un modelo de tumor de xenoinjerto gástrico humano avanzado NCI-N87 ~ CLDN18.2. Se injertaron por vía subcutánea células NCI-N87~CLDN18.2 que expresaban ectópicamente CLDN18.2 humano en el flanco de ratones hembra lampiños. El día 10 después del injerto, los ratones se organizaron en grupos y se les inyectó por vía intravenosa una dosis única de vehículo, 3,8, 7,6 o 15,2 mg/kg de IMAB362-DM4 o 4, 8 o 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE el día 13. Otro grupo de control recibió dosis repetidas de ~8 mg/kg de IMAB362 dos veces por semana alternando administración intravenosa e inyecciones i.p. Los volúmenes de los tumores se midieron dos veces por semana. Los animales fueron sacrificados cuando el volumen del tumor superó los 1400 mm3 o cuando los tumores se ulceraron. El análisis estadístico del crecimiento tumoral se realizó mediante Kruskal-Wallis y la prueba post-hoc de Dunn. La supervivencia se analizó mediante la prueba de Mantel Cox comparando el grupo de control del vehículo con IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE, respectivamente. (A-H) Curvas de crecimiento tumoral, (I, K) crecimiento tumoral medio (± SEM) y (J, L) gráficos de supervivencia de ratones tratados con control de vehículo, IMAB362 o IMAB362-DM4 o IMAB362-vcMMAE. Tamaño del grupo: n=11; *:p<0,05; ***p<0,001. La flecha indica el inicio del tratamiento.
Figura 19: Eficacia antitumoral de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE en un modelo de tumor de xenoinjerto gástrico humano temprano NUGC-4 10cF7-5 sort3a.
Se injertaron por vía subcutánea células NUGC-4 10cF7-5 sort3a que expresaban endógenamente CLDN18.2 en el flanco de ratones hembra lampiños. El día 3, los ratones recibieron vehículo, 15,2 mg/kg de IMAB362-DM4 o 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE mediante una única inyección IV. Los volúmenes de los tumores se midieron dos veces por semana. Los animales fueron sacrificados cuando el volumen del tumor superó los 1400 mm3 o cuando los tumores se ulceraron o después del período de observación predefinido de 120 días. El análisis estadístico del crecimiento tumoral se realizó mediante Kruskal-Wallis y la prueba post-hoc de Dunn. La supervivencia se analizó mediante la prueba de Mantel Cox. (A-C) Curvas de crecimiento tumoral, (D) crecimiento medio del tumor (± SEM) y (E, F) gráficos de supervivencia de ratones tratados con control de vehículo, IMAB362-DM4 o IMAB362-vcMMAE. Tamaño del grupo: n=10; ***:p<0,001; ****:p<0,0001. La flecha indica el momento del tratamiento.
Figura 20: Eficacia antitumoral dependiente de la dosis de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE en un modelo avanzado de tumor de xenoinjerto pancreático humano BxPC-3 ~ CLDN18.2.
Se injertaron por vía subcutánea células BxPC-3~CLDN18.2 que expresaban ectópicamente CLDN18.2 humano en el flanco de ratones hembra lampiños. El día 13, los ratones se organizaron en grupos y se les inyectó por vía intravenosa una dosis única de vehículo, 3,8, 7,6 o 15,2 mg/kg de IMAB362-DM4 o 4, 8 o 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE el día 14. Los ratones del grupo de control de anticuerpos recibieron ~8 mg/kg de IMAB362 no conjugado dos veces por semana alternando administración intravenosa e inyecciones i.p. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana. Los animales fueron sacrificados cuando el volumen del tumor superó los 1400 mm3 o cuando los tumores se ulceraron. El análisis estadístico del crecimiento tumoral se realizó mediante Kruskal-Wallis y la prueba post-hoc de Dunn. La supervivencia se analizó mediante la prueba de Mantel Cox comparando el grupo de control del vehículo con IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE, respectivamente. (A-H) Las curvas de crecimiento tumoral (I, K) significan el crecimiento tumoral (± SEM) y (J, L) las gráficas de supervivencia de ratones tratados con control de vehículo, IMAB362, IMAB362-DM4 o IMAB362-vcMMAE. Tamaño del grupo: n=11; p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001; ****: p<0.0001. La flecha indica el momento del tratamiento.
Figura 21: Eficacia antitumoral de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE en un modelo temprano de tumor de xenoinjerto pancreático humano DAN-G 1C5F2.
Se injertaron células DAN-G 1C5F2 que expresaban endógenamente CLDN18.2 por vía subcutánea en el flanco de ratones hembra lampiños. El día 3 después del injerto, los ratones se trataron con una única inyección IV de control de vehículo, 15,2 mg/kg de IMAB362-DM4 o 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE. Los volúmenes de los tumores se midieron dos veces por semana. Los animales fueron sacrificados cuando los ratones perdieron más del 10% de su peso corporal debido a la caquexia del cáncer, cuando los tumores se ulceraron o después del período de observación predefinido de 120 días. El análisis estadístico del crecimiento tumoral se realizó mediante Kruskal-Wallis y la prueba post-hoc de Dunn. La supervivencia se analizó mediante la prueba de Mantel Cox. (A-C) Curvas de crecimiento tumoral (D) medias de crecimiento tumoral (± SEM) y (E, F) gráficas de supervivencia de ratones tratados con control de vehículo, IMAB362-DM4 o IMAB362-vcMMAE. Tamaño del grupo: n=10; **: p<0.01; ***: p<0.001. La flecha indica el momento del tratamiento.
Figura 22: Análisis histológico de secciones de estómago de IMAB362-vcMMAE y ratones tratados con vehículo.
Los ratones con tumores de xenoinjerto BxPC-3 ~ CLDN18.2 se trataron con IMAB362-vcMMAE. El día 37, se sacrificaron los ratones post-injerto y se diseccionaron órganos seleccionados y se fijaron con formalina. Se tiñeron secciones de estos tejidos FFPE con hematoxilina-eosina y se examinaron microscópicamente en busca de alteraciones morfológicas. (A, C) Tejido del estómago de un ratón representativo del grupo de tratamiento con la mayor exposición a IMAB362-<vc>M<m a>E (16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE el día 14 y el día 21 después del injerto). (B, D) Tejido del estómago de un ratón del grupo de control tratado únicamente con el vehículo. Ampliación: ver barra de escala.
Figura 23: Inducción de apoptosis por IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE.
La inducción de apoptosis mediada por IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE se determinó midiendo la actividad de caspasa 3/7 y teñiendo con anexina V utilizando células NUGC-4 10cE8 positivas al objetivo. A) Se analizó la actividad de caspasa 3/7 después de que las células se incubaran durante 3 días en presencia de 2,5 pg/ml de anticuerpos IMAB362 (n=3 réplicas, media ± SD). B) El análisis de citometría de flujo de células teñidas conjuntamente con anexina V y yoduro de propidio (PI) se realizó 4 días después del tratamiento con 2,5 pg/ml de anticuerpos IMAB362 (n= 3 réplicas). Las células no tratadas sirvieron como control.
Figura 24: Eficacia antitumoral de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE en un modelo de tumor de xenoinjerto gástrico humano avanzado NUGC-4 10cF7-5 sort3a.
Se injertaron por vía subcutánea células NUGC-4 10cF7-5 sort3a que expresaban endógenamente CLDN18.2 en el flanco de ratones hembra lampiños. El día 10, los ratones recibieron vehículo, 15,2 mg/kg de IMAB362-DM4 o 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE mediante una única inyección intravenosa. Los volúmenes de los tumores se midieron dos veces por semana. Los animales se sacrificaron cuando el volumen del tumor superó los 1400 mm3, cuando los tumores se ulceraron o después del período de observación predefinido de 120 días. El análisis estadístico del crecimiento tumoral se realizó mediante Kruskal-Wallis y la prueba post-hoc de Dunn. La supervivencia se analizó mediante la prueba de Mantel Cox. (A-C) Curvas de crecimiento tumoral, (D) crecimiento medio del tumor (± SEM) y (E, F) gráficos de supervivencia de ratones tratados con control de vehículo, IMAB362-DM4 o IMAB362-vcMMAE. Tamaño del grupo: n=10; *: p<0.05; ***: p<0.001. La flecha indica el momento del tratamiento.
Figura 25: IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE mediaron ADCC en CLDN18.2 que expresaba células cancerosas humanas.
A) Curvas de dosis-respuesta de IMAB362-DM4 (círculos negros sólidos), IMAB362-vcMMAE (triángulos negros sólidos) e IMAB362 (cuadrados negros abiertos) mediadas por ADCC en CLDN18.2 endógeno que expresa NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 células de carcinoma de estómago humano. Los experimentos se realizaron utilizando una relación de efector a objetivo de -40:1. Los puntos de datos (n= 4 réplicas) se representan como media ± SD. B) Análisis de citometría de flujo de la expresión de CLDN18.2 en células NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10. Histograma relleno de gris: anti-CLDN18.2 (IMAB362, 50 pg/ml). Línea de puntos negra: Control de isotipos.
Figura 26: CDC mediado por IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE en CLDN18.2 que expresan células cancerosas humanas. A) Curvas de respuesta a la dosis de CDC mediadas por IMAB362-DM4 (círculos negros sólidos), IMAB362-vcMMAE (triángulos negros sólidos) e IMAB362 (cuadrados negros abiertos) en CLDN18.2 endógeno que expresa KATO-III FGF BP#12 adM p3151#25 (izquierda) y células de carcinoma de estómago humano NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 (derecha). Las células diana que expresan luciferasa se incubaron durante 90 minutos con suero humano al 20% (agrupación de donantes humanos sanos) y los respectivos anticuerpos en las concentraciones indicadas. Los puntos de datos (n= 3 réplicas) se representan como media ± SD. B) Análisis de citometría de flujo de la expresión de CLDN18.2 en células KATO-III FGF BP#12 adM p3151#25 (izquierda) y NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 (derecha). Histograma relleno de gris: anti-CLDN18.2 (IMAB362, 50 pg/ml). Línea de puntos negra: Control de isotipos.
Descripción detallada
La invención es como se define en las reivindicaciones.
Aunque la presente enseñanza se describe en detalle a continuación, debe entenderse que esta enseñanza no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende limitar el alcance de la presente enseñanza, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la técnica.
A continuación se describirán los elementos de la presente enseñanza. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas; sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos descritos de diversas formas y las realizaciones preferidas no deben interpretarse como que limitan la presente enseñanza sólo a las realizaciones descritas explícitamente. Se debe entender que esta descripción respalda y abarca realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos divulgados y/o preferidos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud debe considerarse divulgada por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario.
Preferiblemente, los términos utilizados en el presente documento se definen como se describe en "Un glosario multilingüe de términos biotecnológicos: (Recomendaciones de la IUPAC)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, y H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza, (1995).
La práctica de la presente enseñanza empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología celular, inmunología, y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura en el campo (cf., por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende", y variaciones tales como "comprenden" y "que comprende" implican la inclusión de un miembro, número entero o paso o grupo indicado. de miembros, enteros o pasos pero sin la exclusión de cualquier otro miembro, entero o paso o grupo de miembros, enteros o pasos aunque en algunas realizaciones dicho otro miembro, entero o paso o grupo de miembros, enteros o pasos pueden excluirse, es decir la materia consiste en la inclusión de un miembro, número entero o paso determinado o grupo de miembros, números enteros o pasos. Los términos "un" y "uno, una" y "el, la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la enseñanza (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento. o claramente contradicha por el contexto. La enumeración de rangos de valores en este documento simplemente pretende servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del rango. A menos que se indique lo contrario en este documento, cada valor individual se incorpora a la especificación como si se enumerara individualmente en este documento. Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como"), proporcionados en este documento tiene como objetivo simplemente ilustrar mejor la enseñanza y no plantea una limitación en el alcance de la enseñanza reivindicada. Ningún lenguaje en la especificación debe interpretarse como que indica algún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la enseñanza.
Las claudinas son una familia de proteínas que son los componentes más importantes de las uniones estrechas, donde establecen la barrera paracelular que controla el flujo de moléculas en el espacio intercelular entre las células de un epitelio. Las claudinas son proteínas transmembrana que atraviesan la membrana 4 veces con el extremo N-terminal y el extremo C-terminal, ambos ubicados en el citoplasma. El primer bucle o dominio extracelular consta de una media de 53 aminoácidos, y el segundo bucle o dominio extracelular consta de alrededor de 24 aminoácidos. Las proteínas de la superficie celular de la familia de las claudinas, como por ejemplo CLDN18.2, se expresan en tumores de diversos orígenes, y debido a su expresión selectiva, son especialmente adecuadas como estructuras diana en relación con la inmunoterapia contra el cáncer mediada por anticuerpos (ninguna expresión en una toxicidad normal relevante). tejido) y localización en la membrana plasmática.
El término "CLDN", tal como se utiliza en el presente documento, significa claudina e incluye CLDN18.2. Preferiblemente, una claudina es una claudina humana.
El término "CLDN18" se refiere a claudina 18 e incluye cualquier variante, incluida la variante 1 de empalme de claudina 18 (claudina 18.1 (CLDN18.1)) y la variante 2 de empalme de claudina 18 (claudina 18.2 (CLDN18.2)).
El término "CLDN18.2" se refiere preferiblemente a CLDN18.2 humano, y, en particular, a una proteína que comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer bucle o dominio extracelular de CLDN18.2 comprende preferiblemente los aminoácidos 27 a 81, más preferiblemente los aminoácidos 29 a 78 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1. El segundo bucle o dominio extracelular de CLDN18.2 comprende preferiblemente los aminoácidos 140 a 180 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1. Dichos bucles o dominios extracelulares primero y segundo forman preferiblemente la porción o dominio extracelular de CLDN18.2.
CLDN18.2 se expresa selectivamente en tejidos normales en células epiteliales diferenciadas de la mucosa gástrica. CLDN18.2 se expresa en cánceres de diversos orígenes, como carcinoma de páncreas, carcinoma de esófago, carcinoma gástrico, carcinoma bronquial, carcinoma de mama, y tumores ETN. CLDN18.2 es un objetivo valioso para la prevención y/o el tratamiento de tumores primarios, como el cáncer gástrico, el cáncer de esófago, el cáncer de páncreas, el cáncer de pulmón como el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), el cáncer de ovario, el cáncer de colon y el cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, y cánceres de vesícula biliar, y metástasis de los mismos, en particular metástasis de cáncer gástrico tales como tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal, y metástasis en ganglios linfáticos.
El término "CLDN18.1" se refiere preferiblemente a CLDN18.1 humano, y, en particular, a una proteína que comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
El término "variante" según la enseñanza se refiere, en particular, a mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellos que están presentes de forma natural. Una variante alélica se relaciona con una alteración en la secuencia normal de un gen, cuyo significado a menudo no está claro. La secuenciación completa de genes a menudo identifica numerosas variantes alélicas de un gen determinado. Un homólogo de especie es un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos con una especie de origen diferente al de un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos determinado. El término "variante" abarcará cualquier variante modificada postraduccionalmente y variante de conformación.
Según la enseñanza, el término "cáncer que expresa CLDN18.2" o "cáncer positivo para CLDN18.2" significa un cáncer que involucra células cancerosas que expresan CLDN18.2, preferiblemente en la superficie de dichas células cancerosas.
"Superficie celular" se utiliza de acuerdo con su significado normal en la técnica, y por tanto, incluye el exterior de la célula que es accesible a la unión mediante proteínas y otras moléculas.
CLDN18.2 se expresa en la superficie de las células si está ubicado en la superficie de dichas células y es accesible para unirse mediante anticuerpos específicos de CLDN18.2 añadidos a las células.
El término "porción extracelular" o "dominio extracelular" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a una parte de una molécula tal como una proteína que está frente al espacio extracelular de una célula y preferiblemente es accesible desde el exterior de dicha célula, por ejemplo, por moléculas de unión a antígenos, como los anticuerpos ubicados fuera de la célula. Preferiblemente, el término se refiere a uno o más bucles o dominios extracelulares o un fragmento de los mismos.
Según la enseñanza, CLDN18.2 no se expresa sustancialmente en una célula si el nivel de expresión es menor en comparación con la expresión en células del estómago o tejido del estómago. Preferiblemente, el nivel de expresión es inferior al 10 %, preferiblemente inferior al 5 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % o 0,05 % de la expresión en células del estómago o tejido del estómago o incluso inferior. Preferiblemente, CLDN18.2 no se expresa sustancialmente en una célula si el nivel de expresión excede el nivel de expresión en tejido no canceroso distinto del estómago en no más de 2 veces, preferiblemente 1,5 veces, y preferiblemente no excede el nivel de expresión en dicho tejido no canceroso. Preferiblemente, CLDN18.2 no se expresa sustancialmente en una célula si el nivel de expresión está por debajo del límite de detección y/o si el nivel de expresión es demasiado bajo para permitir la unión mediante anticuerpos específicos de CLDN18.2 añadidos a las células.
Según la enseñanza, CLDN18.2 se expresa en una célula si el nivel de expresión excede el nivel de expresión en tejido no canceroso distinto del estómago, preferiblemente en más de 2 veces, preferiblemente 10 veces, 100 veces, 1000 veces, o 10000 veces. Preferiblemente, CLDN18.2 se expresa en una célula si el nivel de expresión está por encima del límite de detección y/o si el nivel de expresión es lo suficientemente alto como para permitir la unión mediante anticuerpos específicos de CLDN18.2 añadidos a las células. Preferiblemente, CLDN18.2 expresado en una célula se expresa o se expone en la superficie de dicha célula.
El término "enfermedad" se refiere a una condición anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad a menudo se interpreta como una condición médica asociada con síntomas y signos específicos. Una enfermedad puede ser causada por factores originalmente de una fuente externa, como una enfermedad infecciosa, o puede ser causada por disfunciones internas, como enfermedades autoinmunes. En los seres humanos, "enfermedad" se utiliza a menudo de manera más amplia para referirse a cualquier condición que causa dolor, disfunción, angustia, problemas sociales, o muerte al individuo afectado, o problemas similares para quienes están en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, a veces incluye lesiones, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, síntomas aislados, conductas desviadas, y variaciones atípicas de estructura y función, mientras que en otros contextos y para otros fines pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades suelen afectar a las personas no sólo físicamente, sino también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva de la vida, y la personalidad. Según la enseñanza, el término "enfermedad" incluye cáncer, en particular aquellas formas de cáncer descritas en el presente documento. Cualquier referencia en el presente documento a cáncer o formas particulares de cáncer también incluye metástasis de cáncer de los mismos. En una realización preferida, una enfermedad a tratar según la presente solicitud implica células que expresan CLDN18.2.
"Enfermedad que involucra células que expresan CLDN18.2" o "enfermedad asociada con células que expresan CLDN18.2" o expresiones similares significa, según la enseñanza, que CLDN18.2 se expresa en células de un tejido u órgano enfermo. En una realización, la expresión de CLDN18.2 en células de un tejido u órgano enfermo aumenta en comparación con el estado en un tejido u órgano sano correspondiente. Un aumento se refiere a un aumento de al menos el 10%, en particular al menos el 20%, al menos el 50%, al menos el 100%, al menos el 200%, al menos el 500%, al menos el 1.000%, al menos el 10.000% o incluso más. En una realización, la expresión sólo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que se reprime la expresión en un tejido sano correspondiente. Según la enseñanza, las enfermedades asociadas con células que expresan CLDN18.2 incluyen enfermedades cancerosas. Además, según la enseñanza, las enfermedades cancerosas son preferiblemente aquellas en las que las células cancerosas expresan CLDN18.2.
Los términos "enfermedad cancerosa" o "cáncer" se refieren o describen la condición fisiológica en un individuo que típicamente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cánceres incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Más particularmente, ejemplos de tales cánceres incluyen cáncer de huesos, cáncer de sangre, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, carcinoma de los órganos sexuales y reproductivos, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de tiroides glándula, cáncer de glándula paratiroidea, cáncer de glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), neuroectodérmico cáncer, tumores del eje espinal, glioma, meningioma, y adenoma hipofisario. El término "cáncer" según la enseñanza también comprende metástasis de cáncer. Preferiblemente, una "enfermedad cancerosa" se caracteriza por células que expresan CLDN18.2 y una célula cancerosa expresa CLDN18.2. Una célula que expresa CLDN18.2 es preferiblemente una célula cancerosa, preferiblemente de los cánceres descritos en el presente documento.
Según la enseñanza, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas, células tumorígenas o células tumorales) que forman preferiblemente una hinchazón o lesión. Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida e incontrolada y continúa creciendo después de que cesan los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una falta parcial o total de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal y, por lo general, forman una masa distinta de tejido, que puede ser benigna, premaligna o maligna. Según la enseñanza, una "enfermedad cancerosa" es preferiblemente una "enfermedad tumoral". Sin embargo, en general, los términos "cáncer" y "tumor" se usan indistintamente en el presente documento.
En una realización, un cáncer según la enseñanza implica células cancerosas que expresan CLDN18.2. En una realización, el cáncer es CLDN18.2 positivo. En una realización, la expresión de CLDN18.2 está en la superficie de las células. En una realización, al menos el 50 %, preferiblemente el 60 %, 70 %, 80 % o el 90 % de las células cancerosas son positivas para CLDN18.2 y/o al menos el 40 %, preferiblemente al menos el 50 % de las células cancerosas son positivas para expresión superficial de CLDN18.2. En una realización, al menos el 95 % o al menos el 98 % de las células cancerosas son CLDN18.2 positivas. En una realización, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % de las células cancerosas son positivas para la expresión superficial de CLDN18.2.
En una realización, un cáncer que expresa CLDN18.2, un cáncer que involucra células cancerosas que expresan CLDN18.2 o un cáncer positivo para CLDN18.2 se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón tal como cáncer no pequeño. cáncer de pulmón celular (NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de vesícula biliar y metástasis de los mismos, en particular metástasis de cáncer gástrico tales como tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal y metástasis en ganglios linfáticos. En una realización, el cáncer es un adenocarcinoma, en particular un adenocarcinoma avanzado. Las enfermedades cancerosas especialmente preferidas son los adenocarcinomas de estómago, esófago, conducto pancreático, conductos biliares, pulmón y ovario. En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de estómago, cáncer de esófago, en particular cáncer de esófago inferior, cáncer de la unión eso-gástrica y cáncer gastroesofágico. En una realización particularmente preferida, el cáncer es cáncer gastroesofágico tal como cáncer gastroesofágico avanzado metastásico, refractario o recurrente.
Según la enseñanza, un "carcinoma" es un tumor maligno derivado de células epiteliales. Este grupo representa los cánceres más comunes, incluidas las formas comunes de cáncer de mama, próstata, pulmón y colon.
El "adenocarcinoma" es un cáncer que se origina en el tejido glandular. Este tejido también forma parte de una categoría de tejido más amplia conocida como tejido epitelial. El tejido epitelial incluye piel, glándulas y una variedad de otros tejidos que recubren las cavidades y órganos del cuerpo. El epitelio se deriva embriológicamente del ectodermo, endodermo y mesodermo. Para ser clasificado como adenocarcinoma, las células no necesariamente tienen que ser parte de una glándula, siempre y cuando tengan propiedades secretoras. Esta forma de carcinoma puede ocurrir en algunos mamíferos superiores, incluidos los humanos. Los adenocarcinomas bien diferenciados tienden a parecerse al tejido glandular del que derivan, mientras que los mal diferenciados pueden no serlo. Al teñir las células de una biopsia, un patólogo determinará si el tumor es un adenocarcinoma o algún otro tipo de cáncer. Los adenocarcinomas pueden surgir en muchos tejidos del cuerpo debido a la naturaleza ubicua de las glándulas dentro del cuerpo. Si bien es posible que cada glándula no secrete la misma sustancia, siempre que la célula tenga una función exocrina, se considera glandular y, por lo tanto, su forma maligna se denomina adenocarcinoma. Los adenocarcinomas malignos invaden otros tejidos y, a menudo, metastatizan si se les da tiempo suficiente para hacerlo. El adenocarcinoma de ovario es el tipo más común de carcinoma de ovario. Incluye los adenocarcinomas serosos y mucinosos, el adenocarcinoma de células claras y el adenocarcinoma endometrioide.
Por "metástasis" se entiende la diseminación de células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales endoteliales para ingresar a la cavidad corporal y los vasos, y luego, después de ser transportada por la sangre, infiltración de órganos diana. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor en el sitio diana depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo ocurre incluso después de la extirpación del tumor primario porque las células o componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar potencial metastásico. En una realización, el término "metástasis" según la enseñanza se refiere a "metástasis a distancia" que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales. En una realización, el término "metástasis" según la enseñanza se refiere a metástasis en los ganglios linfáticos. Una forma particular de metástasis que se puede tratar usando la terapia de la enseñanza es la metástasis que se origina en el cáncer gástrico como sitio primario. En realizaciones preferidas, dicha metástasis de cáncer gástrico son tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal y/o metástasis en ganglios linfáticos.
El tumor de Krukenberg es un tumor metastásico poco común del ovario que representa del 1% al 2% de todos los tumores de ovario. El pronóstico del tumor de Krukenberg sigue siendo muy malo y no existe un tratamiento establecido para los tumores de Krukenberg. El tumor de Krukenberg es un adenocarcinoma de ovario metastásico de células en anillo de sello. El estómago es el sitio principal en la mayoría de los casos de tumores de Krukenberg (70%). Los carcinomas de colon, apéndice, y mama (principalmente carcinoma lobular invasivo) son los siguientes sitios primarios más comunes. Se han notificado casos raros de tumor de Krukenberg originados en carcinomas de vesícula biliar, vías biliares, páncreas, intestino delgado, ampolla de Vater, cuello uterino, y vejiga urinaria/uraco. El intervalo entre el diagnóstico de un carcinoma primario y el descubrimiento posterior de afectación ovárica suele ser de seis meses o menos, pero se han informado períodos más prolongados. En muchos casos, el tumor primario es muy pequeño y puede escapar a la detección. Se pueden obtener antecedentes de un carcinoma previo de estómago u otro órgano en sólo entre el 20% y el 30% de los casos.
Los pacientes con tumores de Krukenberg tienen una tasa de mortalidad general significativamente alta. La mayoría de los pacientes mueren dentro de los 2 años (mediana de supervivencia, 14 meses). Varios estudios muestran que el pronóstico es malo cuando el tumor primario se identifica después de que se descubre la metástasis en el ovario, y el pronóstico empeora si el tumor primario permanece oculto.
En la literatura no se ha establecido claramente una estrategia de tratamiento óptima para los tumores de Krukenberg. No se ha abordado adecuadamente si se debe realizar una resección quirúrgica. La quimioterapia o la radioterapia no tienen ningún efecto significativo sobre el pronóstico de los pacientes con tumores de Krukenberg.
El término "tratamiento (terapéutico)", en particular en relación con el tratamiento del cáncer como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier tratamiento que tenga como objetivo mejorar el estado de salud y/o prolongar (aumentar) la esperanza de vida de un paciente. Dicho tratamiento puede eliminar el cáncer, reducir el tamaño o el número de tumores en un paciente, detener o retardar el desarrollo del cáncer en un paciente, inhibir o retardar el desarrollo de un nuevo cáncer en un paciente, disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas en un paciente, y/o disminuir las recurrencias en un paciente que actualmente tiene o que ha tenido cáncer anteriormente. Se puede seleccionar un tratamiento (terapéutico) del cáncer del grupo que consiste en cirugía, quimioterapia, radioterapia y terapia dirigida.
El término "cirugía", tal como se utiliza en el presente documento, incluye la extirpación de tumores en una operación. Es un tratamiento común para el cáncer. Un cirujano puede extirpar los tumores mediante escisión local.
El término "quimioterapia", como se usa en el presente documento, se refiere al uso de agentes quimioterapéuticos o combinaciones de agentes quimioterapéuticos, preferiblemente para detener el crecimiento de células cancerosas, ya sea matando las células o impidiendo que se dividan. Cuando la quimioterapia se toma por vía oral o se inyecta en una vena o músculo, los medicamentos ingresan al torrente sanguíneo y pueden llegar a las células cancerosas de todo el cuerpo (quimioterapia sistémica). Cuando la quimioterapia se aplica directamente en el líquido cefalorraquídeo, un órgano, o una cavidad corporal como el abdomen, los medicamentos afectan principalmente a las células cancerosas en esas áreas (quimioterapia regional).
Los agentes quimioterapéuticos según la enseñanza incluyen compuestos citostáticos y compuestos citotóxicos. Los agentes quimioterapéuticos tradicionales actúan matando las células que se dividen rápidamente, una de las principales propiedades de la mayoría de las células cancerosas. Esto significa que la quimioterapia también daña las células que se dividen rápidamente en circunstancias normales, como las células de la médula ósea, el tracto digestivo, y los folículos pilosos. Esto da como resultado los efectos secundarios más comunes de la quimioterapia. Según la enseñanza, el término "quimioterapia" preferiblemente no incluye anticuerpos que se dirigen a proteínas que se expresan anormalmente en células cancerosas (antígenos tumorales tales como CLDN18.2) y actúan mediante el reclutamiento del sistema inmunológico del paciente para destruir las células tumorales. Sin embargo, los anticuerpos que se dirigen a proteínas que se expresan de forma anormal en las células cancerosas (antígenos tumorales como CLDN18.2) y actúan a través de una fracción terapéutica o un agente conjugado al anticuerpo pueden verse como una forma de quimioterapia. Sin embargo, en el sentido más estricto, el término "quimioterapia" según la enseñanza no incluye la terapia dirigida.
Según la enseñanza, el término "terapia dirigida" se refiere a cualquier terapia que pueda usarse para dirigirse preferiblemente a células enfermas tales como células cancerosas, mientras que las células no enfermas no están dirigidas o se dirigen en menor medida. Dirigirse a células enfermas preferiblemente da como resultado la muerte y/o el deterioro de la proliferación o viabilidad de las células enfermas. Dicha terapia incluye i) anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y proteínas que están desnudas o conjugadas con una fracción terapéutica que se dirige a ciertos objetivos de la superficie celular en células enfermas, tales como antígenos tumorales, por ejemplo, CLDN18.2 (por ejemplo, anticuerpos o conjugados de anticuerpos). contra CLDN18.2 como se describe en el presente documento) o ii) moléculas pequeñas que perjudican la proliferación o viabilidad de las células enfermas. En una realización específica, el agente se une a un antígeno que se expresa a un nivel mayor en células madre enfermas que en células madre normales. En una realización específica, el agente se une específicamente a un antígeno tumoral. La quimioterapia o radioterapia tradicional no se considera una "terapia dirigida" a pesar de que a menudo está dirigida a los tumores. Además, el término "terapia con anticuerpos" según la enseñanza no incluye preferiblemente terapia con anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos que estén conjugados con una fracción terapéutica sino que simplemente se relaciona con terapia con anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos que actúan mediante el reclutamiento del sistema inmunológico del paciente para destruir las células tumorales.
En el contexto de la presente enseñanza, términos tales como "proteger", "prevenir" o "profiláctico" se refieren a la prevención de la aparición y/o la propagación de una enfermedad en un sujeto y, en particular, a minimizar la posibilidad de que un sujeto desarrollará una enfermedad o retrasar el desarrollo de una enfermedad. Por ejemplo, un sujeto con riesgo de cáncer sería candidato a una terapia para prevenir el cáncer.
Por "estar en riesgo" se entiende un sujeto que se identifica con una probabilidad mayor de lo normal de desarrollar una enfermedad, en particular cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido, o que actualmente tiene, una enfermedad, en particular cáncer, es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, ya que dicho sujeto puede continuar desarrollando una enfermedad. Los sujetos que actualmente tienen, o han tenido, un cáncer también tienen un mayor riesgo de metástasis del cáncer.
Los términos "individuo" y "sujeto" se utilizan aquí indistintamente. Se refieren a seres humanos, primates no humanos u otros mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, cerdos, ovejas, caballos o primates) que pueden padecer o son susceptibles a una enfermedad o trastorno (por ejemplo,, cáncer) pero puede o no tener la enfermedad o trastorno. En muchas realizaciones, el individuo es un ser humano. A menos que se indique lo contrario, los términos "individuo" y "sujeto" no denotan una edad particular, y por tanto, abarcan adultos, ancianos, niños, y recién nacidos. En realizaciones preferidas de la presente enseñanza, el "individuo" o "sujeto" es un "paciente". El término "paciente" significa según la enseñanza un sujeto a tratar, en particular un sujeto enfermo.
El término "antígeno" se refiere a un agente tal como una proteína o péptido que comprende un epítopo contra el cual se dirige y/o se va a dirigir una respuesta inmune. En una realización preferida, un antígeno es un antígeno asociado a tumores, tal como CLDN18.2, es decir, un constituyente de células cancerosas que puede derivarse del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular, en particular aquellos antígenos que se producen, preferiblemente en gran cantidad, intracelular o como antígenos de superficie en células cancerosas.
En el contexto de la presente enseñanza, el término "antígeno asociado a tumores" o "antígeno tumoral" se refiere preferiblemente a proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en un número limitado de tejidos y/u órganos o en etapas de desarrollo específicas y se expresan o expresado de forma aberrante en uno o más tejidos tumorales o cancerosos. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno asociado a tumores está asociado preferiblemente a la superficie celular de una célula cancerosa y preferiblemente no se expresa o sólo raramente se expresa en tejidos normales.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula, es decir, a la parte de una molécula que es reconocida por el sistema inmunológico, por ejemplo, que es reconocida por un anticuerpo. Por ejemplo, los epítopos son sitios tridimensionales discretos de un antígeno, que son reconocidos por el sistema inmunológico. Los epítopos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero pero no al segundo se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Un epítopo de una proteína tal como CLDN18.2 comprende preferiblemente una porción continua o discontinua de dicha proteína y tiene preferiblemente entre 5 y 100, preferiblemente entre 5 y 50, más preferiblemente entre 8 y 30, lo más preferiblemente entre 10 y 25 aminoácidos en de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferiblemente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud.
El término "anticuerpo" incluye una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, y cualquier molécula que comprenda una porción de unión a antígeno de dicha glicoproteína. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, moléculas que comprenden fragmentos de unión o derivados de anticuerpos, incluyendo, sin limitación, anticuerpos de cadena sencilla, por ejemplo, scFv y fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno tales como Fragmentos Fab y Fab' y también incluye todas las formas recombinantes de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos expresados en procariotas, anticuerpos no glicosilados, y cualquier fragmento y derivado de anticuerpo de unión a antígeno como se describe en el presente documento. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesto por tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, f R4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluidas varias células del sistema inmunológico (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.
El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad de unión única. En una realización, los anticuerpos monoclonales se producen mediante un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano, por ejemplo, un ratón, fusionada a una célula inmortalizada.
El término "anticuerpo recombinante", como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresado, creado o aislado por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina con otras secuencias de ADN.
El término "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitioin vitroo por mutación somáticain vivo).
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión a antígeno que deriva sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, en donde la estructura de inmunoglobulina restante de la molécula se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión al antígeno puede comprender dominios variables completos fusionados en dominios constantes o sólo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) injertadas en regiones marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión al antígeno pueden ser de tipo salvaje o estar modificados por una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo modificado para parecerse más a las inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDRs del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen una o más CDRs que están alteradas con respecto al anticuerpo original.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a aquellos anticuerpos en los que una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera es homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase particular, mientras que el segmento restante de la cadena es homóloga a secuencias correspondientes en otra. Normalmente, la región variable de las cadenas ligera y pesada imita las regiones variables de los anticuerpos derivados de una especie de mamífero, mientras que las porciones constantes son homólogas a secuencias de anticuerpos derivados de otra especie. Una clara ventaja de tales formas quiméricas es que la región variable puede derivarse convenientemente de fuentes actualmente conocidas usando células B o hibridomas fácilmente disponibles de organismos hospedadores no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Si bien la región variable tiene la ventaja de ser fácil de preparar y la especificidad no se ve afectada por la fuente, es menos probable que la región constante, siendo humana, provoque una respuesta inmune de un sujeto humano cuando se inyectan los anticuerpos que la región constante de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo en particular.
Los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de unión") o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "fragmento de unión") o términos similares se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservar la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consisten en los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) fragmentos Fd que consisten en los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Naturaleza 341: 544-546), que constan de un dominio VH; (vi) regiones determinantes de complementariedad (CDRs) aisladas, y (vii) combinaciones de dos o más CDR aisladas que pueden estar opcionalmente unidas mediante un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una única cadena proteica en la que VL y las regiones VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); ver, por ejemplo, Bird et al. (1988) Ciencia 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena sencilla estén incluidos dentro del término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Un ejemplo adicional son las proteínas de fusión de inmunoglobulinas con dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido del dominio de unión que está fusionado a un polipéptido de la región bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la región bisagra, y (iii) una región constante CH3 de cadena pesada fusionada a la región constante CH2. El polipéptido del dominio de unión puede ser una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera. Las proteínas de fusión de inmunoglobulinas con dominio de unión se describen además en Estados Unidos 2003/0118592 y Estados Unidos 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se analizan para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
Los anticuerpos naturales son generalmente monoespecíficos, es decir, se unen a un único antígeno. La presente enseñanza comprende anticuerpos que se unen a una célula diana (mediante la interacción con un antígeno tumoral) y una segunda entidad tal como una célula citotóxica (por ejemplo, mediante la interacción con el receptor CD3). Los anticuerpos de la presente enseñanza pueden ser biespecíficos o multiespecíficos tales como triespecíficos, tetraespecíficos, etc.
El término "molécula biespecífica" pretende incluir un agente que tiene dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse, o interactuar con (a) un antígeno de superficie celular tal como CLDN18.2, y (b) un receptor tal como un receptor Fc en la superficie de una célula efectora. El término "molécula multiespecífica" pretende incluir un agente que tiene más de dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse, o interactuar con (a) un antígeno de superficie celular tal como CLDN18.2, (b) un receptor tal como un receptor Fc en la superficie de una célula efectora, y (c) al menos un otro componente. Por consiguiente, el término "anticuerpo" incluye, pero no se limita a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas, y otras multiespecíficas que están dirigidas a un antígeno tumoral y a otras dianas, tales como receptores Fc en células efectoras. El término "anticuerpos biespecíficos" también incluye diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero utilizan un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con complementarios. dominios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (ver, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).
Los anticuerpos pueden derivarse de diferentes especies, incluidas, pero no limitadas a, ratón, rata, conejo, cobaya y ser humano.
Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por genes de la región constante de la cadena pesada.
Como se utiliza en el presente documento, "cambio de isotipo" se refiere al fenómeno por el cual la clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a una de las otras clases de Ig.
Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos IgA tales como IgA1 o IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, e IgD. En diversas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, más particularmente un isotipo IgG1, kappa o IgG1, lambda (es decir, IgG1,<k>, A), un anticuerpo IgG2a (por ejemplo, IgG2a,<k>, A), un anticuerpo IgG2b (por ejemplo, IgG2b, k, A), un anticuerpo IgG3 (por ejemplo, IgG3, k, A) o un anticuerpo IgG4 (por ejemplo, IgG4, k, A).
Tal como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación con un organismo transgénico que produce dicho anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico codificante correspondiente a la encontrada en un organismo que no consiste en el organismo transgénico, y que generalmente deriva de una especie distinta del organismo transgénico.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que tiene cadenas ligeras y pesadas de diferentes orígenes organismos. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera murina es un anticuerpo heterohíbrido.
Los anticuerpos descritos en el presente documento se aíslan preferiblemente. Un "anticuerpo aislado", tal como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a un antígeno tumoral está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a otros antígenos). que el antígeno tumoral). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de un antígeno tumoral humano puede tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies de antígenos tumorales). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos. En una realización de la enseñanza, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" se refiere a anticuerpos que tienen diferentes especificidades y que se combinan en una composición o mezcla bien definida.
En el contexto de la presente enseñanza, un anticuerpo es capaz de actuar mediante el reclutamiento del sistema inmunológico del paciente para destruir células tumorales si el anticuerpo, en particular cuando se une a su objetivo tal como un antígeno tumoral en una célula enferma, provoca funciones efectoras inmunes como aquí descrito. Preferiblemente, dichas funciones efectoras inmunes están dirigidas contra células tales como células cancerosas que portan un antígeno tumoral como CLDN18.2 en su superficie.
El término "funciones efectoras inmunes" en el contexto de la presente enseñanza incluye cualquier función mediada por componentes del sistema inmune que resultan, por ejemplo, en la inhibición del crecimiento tumoral y/o la inhibición del desarrollo tumoral, incluyendo la inhibición de la diseminación y metástasis del tumor. Preferiblemente, las funciones efectoras inmunes dan como resultado la destrucción de células cancerosas. Dichas funciones comprenden la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP), la inducción de la apoptosis en las células que portan el antígeno tumoral, la citólisis de las células que portan el antígeno tumoral, y/o inhibición de la proliferación de las células que portan el antígeno tumoral.
Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos.
ADCC describe la capacidad de destrucción celular de las células efectoras, en particular de los linfocitos, lo que requiere preferiblemente que la célula diana esté marcada por un anticuerpo.
La ADCC ocurre preferiblemente cuando los anticuerpos se unen a antígenos en las células tumorales y los dominios Fc del anticuerpo se acoplan a los receptores Fc (FcR) en la superficie de las células efectoras inmunes. Se han identificado varias familias de receptores Fc y poblaciones celulares específicas expresan característicamente receptores Fc definidos. ADCC puede verse como un mecanismo para inducir directamente un grado variable de destrucción tumoral inmediata que conduce a la presentación de antígenos y a la inducción de respuestas de células
T dirigidas al tumor. Preferiblemente, la inducciónin vivode ADCC conducirá a respuestas de células T dirigidas a tumores y respuestas de anticuerpos derivadas del huésped.
Citotoxicidad dependiente del complemento
CDC es otro método de destrucción de células que puede ser dirigido por anticuerpos. La IgM es el isotipo más eficaz
para la activación del complemento. IgG1 e IgG3 también son muy eficaces para dirigir las CDC a través de la vía
clásica de activación del complemento. Preferiblemente, en esta cascada, la formación de complejos antígenoanticuerpo da como resultado el descubrimiento de múltiples sitios de unión a C1q muy próximos en los dominios CH2
de las moléculas de anticuerpo participantes, tales como las moléculas de IgG (C1q es uno de los tres subcomponentes del complemento C1). Preferiblemente, estos sitios de unión de C1q no encubiertos convierten la interacción C1q-IgG que anteriormente tenía baja afinidad en una de alta avidez, lo que desencadena una cascada de eventos que involucran una serie de otras proteínas del complemento y conduce a la liberación proteolítica de los agentes quimiotácticos/activadores de las células efectoras C3a y C5a. Preferiblemente, la cascada del complemento
termina en la formación de un complejo de ataque a la membrana, que crea poros en la membrana celular que facilitan
el paso libre de agua y solutos dentro y fuera de la célula.
Sorprendentemente se ha encontrado que los conjugados anticuerpo-fármaco descritos en el presente documento
son capaces de mediar la destrucción de células, en particular células que expresan CLDN18.2, tales como células cancerosas, induciendo lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Por lo tanto, en una realización, los conjugados anticuerpofármaco de la enseñanza median la destrucción de células induciendo lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), preferiblemente induciendo lisis mediada por CDC y lisis mediada por ADCC.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo "deriva de" una secuencia de línea germinal particular si el anticuerpo se obtiene de un sistema mediante la inmunización de un animal o mediante la selección de una biblioteca
de genes de inmunoglobulina, y en donde el anticuerpo seleccionado es al menos el 90%, más preferiblemente al menos 95%, incluso más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntico en secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Normalmente, un anticuerpo derivado de una secuencia de línea germinal particular mostrará no más de 10 aminoácidos de diferencia, más preferiblemente, no más de 5, o incluso más preferiblemente, no más de 4, 3, 2, o 1 aminoácido de diferencia del aminoácido. Secuencia ácida codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.
Como se usa en el presente documento, el término "heteroanticuerpos" se refiere a dos o más anticuerpos, derivados
de los mismos, o regiones de unión a antígeno unidas entre sí, al menos dos de los cuales tienen especificidades diferentes. Estas diferentes especificidades incluyen una especificidad de unión por un receptor Fc en una célula efectora y una especificidad de unión por un antígeno o epítopo en una célula diana, por ejemplo, una célula tumoral.
El término "transfectoma", como se usa en el presente documento, incluye células huésped eucariotas recombinantes
que expresan un anticuerpo, tales como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetales, u hongos, incluidas células de levadura.
La enseñanza incluye todos los anticuerpos y derivados de anticuerpos como se describe en el presente documento
que, para los fines de la enseñanza, están abarcados por el término "anticuerpo". El término "derivados de anticuerpos"
se refiere a cualquier forma modificada de un anticuerpo, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo.
El término "anticuerpo contra un antígeno tumoral" o términos similares se refieren a un anticuerpo dirigido al antígeno
tumoral o que tiene la capacidad de unirse al mismo. El término "unión" según la enseñanza se refiere preferiblemente
a una unión específica.
Según la presente enseñanza, un anticuerpo o conjugado anticuerpo-fármaco es capaz de unirse a una diana predeterminada si tiene una afinidad significativa por dicha diana predeterminada y se une a dicha diana predeterminada en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" a menudo se mide mediante la constante de disociación de equilibrio (K<d>). Preferiblemente, el término "afinidad significativa" se refiere a la unión a un objetivo predeterminado con una constante de disociación (K<d>) de 1°'5 M o inferior, 1°'6 M o inferior, 1°'7 M o i inferior, 1°'9 M o inferior, 10'1° M o inferior, 1°'11 M o inferior, o 1°'12 M o inferior.
Un anticuerpo o conjugado anticuerpo-fármaco no es (sustancialmente) capaz de unirse a una diana si no tiene una afinidad significativa por dicha diana y no se une significativamente, en particular no se une de manera detectable, a
dicha diana en ensayos estándar. Preferiblemente, el anticuerpo o el conjugado anticuerpo-fármaco no se une de manera detectable a dicha diana si está presente en una concentración de hasta 2, preferiblemente 1°, más preferiblemente 20, en particular 50 o 100 |jg/ml o superior. Preferiblemente, un anticuerpo o conjugado anticuerpofármaco no tiene afinidad significativa por una diana si se une a dicha diana con una K<d>eso es al menos 10 veces, 100 veces, 10<3>-veces, 10<4>-veces, 10<5>-veces, o 10<6>-veces más alto que el K<d>para unirse a la diana predeterminada a la que el anticuerpo o el conjugado anticuerpo-fármaco es capaz de unirse. Por ejemplo, si el K<d>para la unión de un anticuerpo o conjugado anticuerpo-fármaco a la diana a la que el anticuerpo o conjugado anticuerpo-fármaco es capaz de unirse es 10<' 7>M, la K<d>para unirse a un objetivo por el cual el anticuerpo o el conjugado anticuerpo-fármaco no tiene afinidad significativa sería al menos 10<' 6>M, 10<' 5>M, 10<' 4>M, 10<-3>M, 10<' 2>M, o 10<' 1>M.
Un anticuerpo o conjugado anticuerpo-fármaco es específico para una diana predeterminada si es capaz de unirse a dicha diana predeterminada mientras que no es capaz de unirse a otras dianas, es decir, no tiene afinidad significativa por otras dianas y no se une significativamente a otras dianas. en ensayos estándar. Según la enseñanza, un anticuerpo o un conjugado anticuerpo-fármaco es específico para un antígeno tumoral tal como CLDN18.2 si es capaz de unirse al antígeno tumoral pero no es (sustancialmente) capaz de unirse a otras dianas. Preferiblemente, un anticuerpo o un conjugado anticuerpo-fármaco es específico para un antígeno tumoral si la afinidad y la unión a dichas otras dianas no excede significativamente la afinidad o la unión a proteínas no relacionadas con el antígeno tumoral, tales como la albúmina sérica bovina (BSA), caseína, albúmina sérica humana (HSA) o proteínas transmembrana de antígenos no tumorales tales como moléculas MHC o receptores de transferrina o cualquier otro polipéptido específico. Preferiblemente, un anticuerpo o conjugado anticuerpo-fármaco es específico para una diana predeterminada si se une a dicha diana con una K<d>eso es al menos 10 veces, 100 veces, 10<3>-veces, 10<4>-veces, 10<5>-veces, o 10<6>-veces por debajo de la K<D>para unirse a un objetivo para el cual no es específico. Por ejemplo, si el K<D>para la unión de un anticuerpo o conjugado anticuerpo-fármaco al objetivo para el cual es específico es 10<' 7>M, la K<d>para vincularse a un objetivo para el cual no es específico sería al menos 10<' 6>M, 10<' 5>M, 10<' 4>M, 10<-3>M, 10<' 2>M, o 10<' 1>M.
La unión de un anticuerpo a una diana se puede determinar experimentalmente usando cualquier método adecuado; ver, por ejemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), y los métodos descritos en el presente documento. Las afinidades pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales, tales como mediante diálisis en equilibrio; utilizando el instrumento BIAcore 2000, utilizando procedimientos generales descritos por el fabricante; mediante radioinmunoensayo utilizando antígeno diana radiomarcado; o mediante otro método conocido por el experto en la técnica. Los datos de afinidad pueden analizarse, por ejemplo, mediante el método de Scatchard et al., Ann NY Acad. ScL, 51:660 (1949)). La afinidad medida de una interacción anticuerpo-antígeno particular puede variar si se mide en diferentes condiciones, por ejemplo, concentración de sal, pH. Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión al antígeno, por ejemplo, K<d>, IC<50>, se elaboran preferiblemente con soluciones estandarizadas de anticuerpos y antígenos y un tampón estandarizado.
El término "de origen natural", tal como se utiliza en el presente documento y se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural.
El término "reordenado" como se usa en el presente documento se refiere a una configuración de un locus de inmunoglobulina de cadena pesada o de cadena ligera en el que un segmento V está colocado inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio VH o VL completo, respectivamente. Se puede identificar un locus genético de inmunoglobulina (anticuerpo) reordenado comparándolo con el ADN de la línea germinal; un locus reordenado tendrá al menos un elemento de homología heptámero/nonámero recombinado.
El término "no reordenado" o "configuración de línea germinal" como se usa en el presente documento en referencia a un segmento V se refiere a la configuración en la que el segmento V no se recombina para ser inmediatamente adyacente a un segmento D o J.
Según las enseñanzas, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo presente en CLDN18.2, preferiblemente un epítopo ubicado dentro de los dominios extracelulares de CLDN18.2, en particular el primer dominio extracelular, preferiblemente las posiciones de aminoácidos 29 a 78 de CLDN18.2. En realizaciones particulares, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo capaz de unirse a (i) un epítopo en CLDN18.2 que no está presente en CLDN18.1, preferiblemente SEQ ID NO: 3, 4, y 5, (ii) un epítopo localizado en CLDN18.2-loop1, preferiblemente SEQ ID NO: 8, (iii) un epítopo localizado en CLDN18.2-loop2, preferiblemente SEQ ID NO: 10, (iv) un epítopo localizado en CLDN18.2-loopD3, preferiblemente SEQ ID NO: 11, (v) un epítopo, que abarca CLDN18.2-loop1 y CLDN18.2-loopD3, o (vi) un epítopo no glicosilado localizado en CLDN18.2-loopD3, preferiblemente SEQ ID NO: 9.
Según las enseñanzas, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es preferiblemente un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 pero no a CLDN18.1. Preferiblemente, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es específico para CLDN18.2. Preferiblemente, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es preferiblemente un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 expresado en la superficie celular. En realizaciones particularmente preferidas, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une a epítopos nativos de CLDN18.2 presentes en la superficie de células vivas. Preferiblemente, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 3-11, 44, 46 y 48-50. Preferiblemente, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es específico para las proteínas, péptidos o fragmentos inmunogénicos o derivados de los mismos mencionados anteriormente. Se puede obtener un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 3-11, 44, 46, y 48-50, o un ácido nucleico o célula huésped que expresa dicha proteína o péptido. Preferiblemente, el anticuerpo se une a células cancerosas, en particular células de los tipos de cáncer mencionados anteriormente y, preferiblemente, no se une sustancialmente a células no cancerosas.
En un aspecto particularmente preferido de la divulgación, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se produce mediante un hibridoma depositado en DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Alemania; nueva dirección: InhoffenstraJe. 7B, 31824 Braunschweig, Alemania) y que tiene la siguiente designación y número de acceso:
a. 182-D1106-055, número de acceso. DSM ACC2737, depositado el 19 de octubre de 2005
b. 182-D1106-056, número de acceso. DSM ACC2738, depositado el 19 de octubre de 2005
c. 182-D1106-057, número de acceso. DSM ACC2739, depositado el 19 de octubre de 2005
d. 182-D1106-058, número de acceso. DSM ACC2740, depositado el 19 de octubre de 2005
e. 182-D1106-059, número de acceso. DSM ACC2741, depositado el 19 de octubre de 2005
f. 182-D1106-062, número de acceso. DSM ACC2742, depositado el 19 de octubre de 2005,
g. 182-D1106-067, número de acceso. DSM ACC2743, depositado el 19 de octubre de 2005
h. 182-D758-035, número de acceso. DSM ACC2745, depositado el 17 de noviembre de 2005
i. 182-D758-036, número de acceso. DSM ACC2746, depositado el 17 de noviembre de 2005
j. 182-D758-040, número de acceso. DSM ACC2747, depositado el 17 de noviembre de 2005
k. 182-D1106-061, número de acceso. DSM ACC2748, depositado el 17 de noviembre de 2005
l. 182-D1106-279, número de acceso. DSM ACC2808, depositado el 26 de octubre de 2006
m. 182-D1106-294, número de acceso. DSM ACC2809, depositado el 26 de octubre de 2006,
n. 182-D1106-362, número de acceso. DSM ACC2810, depositado el 26 de octubre de 2006.
Los anticuerpos preferidos según la enseñanza son aquellos producidos y obtenibles a partir de los hibridomas descritos anteriormente; es decir, 37G11 en el caso de 182-D1106-055, 37H8 en el caso de 182-D1106-056, 38G5 en el caso de 182-D1106-057, 38H3 en el caso de 182-D1106-058, 39F11 en el caso de 182-D1106-059, 43A11 en el caso de 182-D1106-062, 61C2 en el caso de 182-D1106-067, 26B5 en el caso de 182-D758-035, 26D12 en el caso de 182-D758-036, 28D10 en el caso de 182-D758-040, 42E12 en el caso de 182-D1106-061, 125E1 en el caso de 182-D1106-279, 163E12 en el caso de 182-D1106-294, y 175D10 en el caso de 182-D1106-362; y sus formas quimerizadas y humanizadas.
En un aspecto de la divulgación, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en (i) un anticuerpo producido y/o obtenible a partir de un clon depositado con el número de acceso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 o DSM ACC 2810, (ii) un anticuerpo que es una forma quimerizada o humanizada del anticuerpo según (i), (iii) un anticuerpo que tiene la especificidad del anticuerpo según (i), y (iv) un anticuerpo que comprende la porción de unión al antígeno o el sitio de unión al antígeno, en particular la región variable, del anticuerpo según (i) y preferiblemente que tiene la especificidad del anticuerpo según (i).
Los anticuerpos preferidos, en particular los anticuerpos quimerizados y sus secuencias, se muestran en la siguiente tabla.
En realizaciones preferidas, los anticuerpos, en particular las formas quimerizadas de anticuerpos según la enseñanza, incluyen anticuerpos que comprenden una región constante de cadena pesada (CH) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una región constante de cadena pesada humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID. NO: 13 o un fragmento del mismo. En realizaciones preferidas adicionales, los anticuerpos, en particular formas quimerizadas de anticuerpos según la enseñanza, incluyen anticuerpos que comprenden una región constante de cadena ligera (CL) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una región constante de cadena ligera humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 o un fragmento del mismo. En una realización preferida particular, los anticuerpos, en particular las formas quimerizadas de anticuerpos según la enseñanza, incluyen anticuerpos que comprenden un CH que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de un CH humano tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 13 o un fragmento del mismo y que comprenden una CL que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una CL humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 o un fragmento del mismo.
En una realización, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 es un anticuerpo monoclonal quimérico IgG1 de ratón/humano que comprende kappa, cadena ligera variable murina, alotipo de región constante de cadena ligera kappa humana Km(3), región variable de cadena pesada murina, Región constante de IgG1 humana, alotipo G1m(3).
En ciertas realizaciones preferidas, las formas quimerizadas de anticuerpos incluyen anticuerpos que comprenden una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 51, y un fragmento de los mismos y/o que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en<s>E<q>ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, y un fragmento de los mismos.
En ciertos aspectos preferidos de la divulgación, las formas quimerizadas de anticuerpos incluyen anticuerpos que comprenden una combinación de cadenas pesadas y cadenas ligeras seleccionadas de las siguientes posibilidades (i) a (ix):
(i) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 21 o un fragmento de la misma,
(ii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20 o un fragmento de la misma,
(iii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 16 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 o un fragmento de la misma,
(iv) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 25 o un fragmento de la misma,
(v) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24 o un fragmento de la misma,
(vi) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 19 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23 o un fragmento de la misma,
(vii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 19 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 26 o un fragmento de la misma,
(viii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 19 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 27 o un fragmento de la misma,
(ix) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 19 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 28 o un fragmento de la misma, y
(x) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 51 o un fragmento del mismo y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24 o un fragmento de la misma.
Los anticuerpos según (ii), (v) o (x) son realizaciones preferidas de un "anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2". Se prefiere especialmente el anticuerpo según (v) o (x).
"Fragmento" o "fragmento de una secuencia de aminoácidos" como se usa anteriormente se refiere a una parte de una secuencia de anticuerpo, es decir, una secuencia que representa la secuencia de anticuerpo acortada en el terminal N y/o C, que cuando reemplaza dicha secuencia de anticuerpo en un anticuerpo conserva la unión de dicho anticuerpo a CLDN18.2. Preferiblemente, un fragmento de una secuencia de aminoácidos comprende al menos el 80 %, preferiblemente al menos el 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de los residuos de aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos. Un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 51 se refieren preferiblemente a dicha secuencia en la que 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 aminoácidos se eliminan en el terminal N.
En un aspecto preferido de la divulgación, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, y un fragmento del mismo.
En un aspecto preferido de la divulgación, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, y un fragmento del mismo.
En ciertos aspectos preferidos de la divulgación, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una combinación de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) seleccionada de las siguientes posibilidades (i) a (ix):
(i) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 29 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 36 o un fragmento de la misma, (ii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35 o un fragmento de la misma, (iii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37 o un fragmento de la misma, (iv) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 33 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 40 o un fragmento de la misma, (v) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39 o un fragmento de la misma, (vi) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 34 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 38 o un fragmento de la misma, (vii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 34 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 o un fragmento de la misma, (viii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 34 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 42 o un fragmento de la misma, (ix) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 34 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 43 o un fragmento de la misma. Los anticuerpos según (ii) o (v) son realizaciones preferidas de un "anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2". Se prefiere especialmente el anticuerpo según (v).
Según la enseñanza, el término "fragmento" se refiere, en particular, a una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), preferiblemente al menos la región variable CDR3, de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la región variable de cadena ligera (VL). En una realización, dicha una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) se seleccionan de un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3. En una realización particularmente preferida, el término "fragmento" se refiere a las regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la región variable de cadena ligera (VL).
En un aspecto preferido de la divulgación, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una VH que comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de las siguientes realizaciones (i) a (vi):
(i) CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 14, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 14, CDR3: posiciones 116 125 de SEQ ID NO: 14,
(ii) CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 15, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 15, CDR3: posiciones 116 126 de SEQ ID NO: 15,
(iii) CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 16, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 16, CDR3: posiciones 116 124 de SEQ ID NO: 16,
(iv) CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 17, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 17, CDR3: posiciones 116 126 de SEQ ID NO: 17,
(v) CDR1: posiciones 44-51 de SEQ ID NO: 18, CDR2: posiciones 69-76 de SEQ ID NO: 18, CDR3: posiciones 115 125 de SEQ ID NO: 18, y
(vi) CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117 128 de SEQ ID NO: 19.
En un aspecto preferido de la divulgación, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una VL que comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de las siguientes realizaciones (i) a (ix):
(i) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 20, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 20, CDR3: posiciones 115 123 de SEQ ID NO: 20,
(ii) CDR1: posiciones 49-53 de SEQ ID NO: 21, CDR2: posiciones 71-73 de SEQ ID NO: 21, CDR3: posiciones 110 118 de SEQ ID NO: 21,
(iii) CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 22, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 22, CDR3: posiciones 109 117 de SEQ ID NO: 22,
(iv) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 23, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 23, CDR3: posiciones 115 123 de SEQ ID NO: 23,
(v) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 24, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 24, CDR3: posiciones 115 123 de SEQ ID NO: 24,
(vi) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 25, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 25, CDR3: posiciones 115 122 de SEQ ID NO: 25,
(vii) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 26, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 26, CDR3: posiciones 115 123 de SEQ ID NO: 26,
(viii) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 27, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 27, CDR3: posiciones 115 123 de SEQ ID NO: 27, y
(ix) CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 28, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 28, CDR3: posiciones 109 117 de SEQ ID NO: 28.
En un aspecto preferido de la divulgación, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende una combinación de VH y VL, cada una de las cuales comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de las siguientes realizaciones (i) a (ix):
(i) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 14, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 14, CDR3: posiciones 116-125 de SEQ ID NO: 14, VL: CDR1: posiciones 49-53 de SEQ ID NO: 21, CDR2: posiciones 71-73 de SEQ ID NO: 21, CDR3: posiciones 110-118 de SEQ ID NO: 21,
(ii) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 15, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 15, CDR3: posiciones 116-126 de SEQ ID NO: 15, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 20, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 20, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 20,
(iii) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 16, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 16, CDR3: posiciones 116-124 de SEQ ID NO: 16, VL: CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 22, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 22, CDR3: posiciones 109-117 de SEQ ID NO: 22,
(iv) VH: CDR1: posiciones 44-51 de SEQ ID NO: 18, CDR2: posiciones 69-76 de SEQ ID NO: 18, CDR3: posiciones 115- 125 de SEQ ID NO: 18, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 25, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 25, CDR3: posiciones 115-122 de SEQ ID NO: 25,
(v) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 17, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 17, CDR3: posiciones 116- 126 de SEQ ID NO: 17, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 24, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 24, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 24,
(vi) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117- 128 de SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 23, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 23, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 23,
(vii) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 26, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 26, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 26,
(viii) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 27, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 27, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 27, y
(ix) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 19, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 19, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 28, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 28, CDR3: posiciones 109-117 de SEQ ID NO: 28.
Los anticuerpos según (ii) o (v) son realizaciones preferidas de un "anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2". Se prefiere especialmente el anticuerpo según (v).
En aspectos preferidos adicionales de la divulgación, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende preferiblemente una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), preferiblemente al menos la región variable CDR3, de la región variable de cadena pesada (VH).) y/o de la región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal contra CLDN18.2, preferiblemente de un anticuerpo monoclonal contra CLDN18.2 descrito en el presente documento, y preferiblemente comprende una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs), preferiblemente al menos la región variable CDR3, de las regiones variables de cadena pesada (VH) y/o regiones variables de cadena ligera (VL) descritas en el presente documento. En un aspecto de la divulgación, dicha una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se seleccionan de un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 descritas en el presente documento. En un aspecto particularmente preferido de la divulgación, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 comprende preferiblemente las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la región variable de cadena ligera. (VL) de un anticuerpo monoclonal contra CLDN18.2, preferiblemente de un anticuerpo monoclonal contra CLDN18.2 descrito en el presente documento, y preferiblemente comprende las regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de las regiones variables de cadena pesada (VH) y/o regiones variables de cadena ligera (VL) descritas en el presente documento.
En un aspecto de la divulgación, un anticuerpo que comprende una o más CDRs, un conjunto de CDRs o una combinación de conjuntos de CDRs como se describe en el presente documento comprende dichas CDRs junto con sus regiones marco intermedias. Preferiblemente, la porción también incluirá al menos aproximadamente el 50% de una o ambas de la primera y cuarta regiones marco, siendo el 50% el 50% C-terminal de la primera región estructural y el 50% N-terminal de la cuarta región marco. La construcción de anticuerpos elaborados mediante técnicas de ADN recombinante puede dar como resultado la introducción de residuos N- o C-terminales en las regiones variables codificadas por enlazadores introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación, incluyendo la introducción de enlazadores para unir regiones variables de la enseñanza a secuencias de proteínas adicionales que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulinas, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de diacuerpos) o marcadores de proteínas.
En un aspecto de la divulgación, un anticuerpo que comprende una o más CDRs, un conjunto de CDRs o una combinación de conjuntos de CDRs como se describe en el presente documento comprende dichas CDRs en un marco de anticuerpo humano.
La referencia en el presente documento a un anticuerpo que comprende con respecto a su cadena pesada una cadena particular, o una región o secuencia particular, se refiere preferiblemente a la situación en la que todas las cadenas pesadas de dicho anticuerpo comprenden dicha cadena, región o secuencia particular. Esto se aplica correspondientemente a la cadena ligera de un anticuerpo.
En una realización, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 según la enseñanza se refiere a un anticuerpo que reconoce, es decir, se une al mismo o esencialmente el mismo epítopo que un anticuerpo de unión a CLDN18.2 descrito en el presente documento, y/ o compite con dicho anticuerpo de unión a CLDN18.2 para unirse a CLDN18.2.
Según la enseñanza, un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2, en particular cuando está presente en el conjugado anticuerpo-fármaco, preferiblemente tiene una afinidad y/o especificidad por CLDN18.2 apropiada para permitir la endocitosis del anticuerpo y/o el conjugado anticuerpo-fármaco.
El término "endocitosis" se refiere al proceso en el que las células eucariotas internalizan segmentos de la membrana plasmática, receptores de la superficie celular y componentes del líquido extracelular. Los mecanismos de endocitosis incluyen la endocitosis mediada por receptores. El término "endocitosis mediada por receptores" se refiere a un mecanismo biológico mediante el cual un ligando, al unirse a su objetivo, desencadena la invaginación y el pellizco de la membrana, se internaliza y se libera en el citosol o se transfiere a los compartimentos intracelulares apropiados.
La presente enseñanza también prevé realizaciones en las que un "anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2" tiene un significado que abarca cualquier "agente de unión a CLDN18.2". Según la enseñanza, un "agente de unión a CLDN18.2" incluye cualquier compuesto que tenga capacidad de unión a CLDN18.2. Preferiblemente, dicho agente de unión comprende al menos un dominio de unión para CLDN18.2. El término incluye todas las moléculas de unión artificiales (andamios) que tienen capacidad de unión a CLDN18.2, incluidos, entre otros, nanocuerpos, aficuerpos, anticalinas, DARPins, monocuerpos, avímeros y microcuerpos. En una realización, dicho agente de unión se une a un dominio extracelular de CLDN18.2. En una realización, dicho agente de unión se une a epítopos nativos de CLDN18.2 presentes en la superficie de células vivas. En una realización, dicho agente de unión se une al primer bucle extracelular de CLDN18.2. En una realización, dicha unión a CLDN18.2 es una unión específica.
El término "dominio de unión" caracteriza, en relación con la presente enseñanza, una estructura, por ejemplo de un anticuerpo, que se une a/interactúa con una estructura diana/antígeno/epítopo determinado. Por tanto, el dominio de unión según la enseñanza designa un "sitio de interacción antígeno".
Cualquier agente que ejerza un efecto terapéutico sobre las células cancerosas se puede utilizar como fármaco para la conjugación con un anticuerpo anti-CLDN18.2 o un derivado del mismo. Preferiblemente, la conjugación del fármaco no altera o altera significativamente las características de unión, en particular la especificidad, del anticuerpo, como se analiza en el presente documento. Por tanto, el conjugado anticuerpo-fármaco según la enseñanza tiene preferiblemente las mismas o esencialmente las mismas características de unión, en particular la especificidad, que el anticuerpo usado para la conjugación. Por consiguiente, si en el presente documento se describen ciertas características de unión para el anticuerpo usado para la conjugación, se prefiere que también el conjugado anticuerpo-fármaco tenga dichas características de unión. Por ejemplo, si se describe que el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 se une a un dominio extracelular de CLDN18.2 y/o se une al primer bucle extracelular de CLDN18.2, se prefiere que también el anticuerpo- el conjugado de fármaco se une a un dominio extracelular de CLDN18.2 y/o se une al primer bucle extracelular de CLDN18.2.
Típicamente, el fármaco es un agente citotóxico o citostático. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células y, en particular, que las destruya.
Las clases útiles de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, aglutinantes de surcos menores del ADN (por ejemplo, enediinas y lexitropsinas), inhibidores de la replicación del ADN, agentes alquilantes (por ejemplo, complejos de platino tales como cisplatino, mono(platino), bis(platino) y complejos trinucleares de platino y carboplatino), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de la quimioterapia, duocarmicinas, etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, nitrosoureas, platinoles, compuestos preformantes, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiación, esteroides, taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), inhibidores de la topoisomerasa, alcaloides de la vinca o similares.
Los agentes citotóxicos individuales incluyen, por ejemplo, un andrógeno, antramicina (AMC), asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfán, butionina sulfoximina, camptotecina, carboplatino, carmustina (BSNU), CC-1065, clorambucilo, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, arabinósido de citidina, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunorrubicina, decarbazina, docetaxel, doxorrubicina, un estrógeno, 5-fluordesoxiuridina, 5-fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecán, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalán, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, estreptozotocina, tenopósido, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecán, vinblastina, vincristina, vinorelbina, VP-16 y VM-26.
Los ejemplos de agentes antitubulina incluyen, pero no se limitan a, dolastatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB), maitansinoides, taxanos (por ejemplo, paclitaxel, docetaxel), T67 (Tularik), alquiloides de vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, y vinorelbina), derivados de bacatina, análogos de taxanos (por ejemplo, epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcimid, estramustina, criptofisinas, cemadotina, combretastatinas, discodermolida, y eleuterobina.
En realizaciones específicas, el agente citotóxico o citostático es auristatina E (también conocida en la técnica como dolastatina-10) o un derivado de la misma. Normalmente, el derivado de auristatina E es, por ejemplo, un éster formado entre auristatina E y un cetoácido. Por ejemplo, la auristatina E se puede hacer reaccionar con ácido paraacetilbenzoico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados típicos de auristatina incluyen AFP, MMAF y MMAE.
En determinadas realizaciones, el agente citotóxico o citostático es un maitansinoide, otro grupo de agentes antitubulina. Por ejemplo, en realizaciones específicas, el maitansinoide es maitansina, DM-1 o DM-4.
Los maitansinoides son potentes compuestos dirigidos a los microtúbulos que inhiben la proliferación de células en la mitosis. Los maitansinoides son derivados de la maitansina, que es una estructura ansa macrólido de 19 miembros unida a un anillo de benceno clorado. Maytansina tiene la siguiente fórmula:
Se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, como el maitansinol y los ésteres de maitansinol C-3 (Patente de EE.UU. N° 4,151,042). Se ha informado de maitansinol sintético y análogos de maitansinol, por ejemplo, en Patente de EE.UU. Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,362,663; u 4,371,533, y Kawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451.
Los maitansinoides son bien conocidos en la técnica y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Los maitansinoides especialmente preferidos según las enseñanzas son los derivados de maitansina que contienen tiol, tales como DM1 y DM4. Dichos derivados de maitansina que contienen tiol incluyen compuestos en los que el grupo metilo unido al grupo carbonilo se reemplaza por un grupo que contiene un grupo sulfhidrilo libre tal como el grupo -R-SH donde R representa un grupo alquileno u otro grupo de átomos que contiene carbono.
DM1, también conocido como mertansina, es un maitansinoide que tiene la siguiente fórmula:
En particular, el término "mertansina" o "DM1" se refiere al compuesto W2'-desacetil-W2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina.
"DM4" se refiere al compuesto W2'-desacetil-N2'-(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina.
Los conjugados de anticuerpo anti-CLDN18.2-maitansinoide se pueden preparar uniendo químicamente un anticuerpo anti-CLDN18.2 a una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o de la molécula de maitansinoide. Se puede conjugar un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo, aunque se espera que incluso una molécula de toxina/anticuerpo mejore la citotoxicidad con respecto al uso de anticuerpo desnudo.
A este respecto, la expresión "anticuerpo unido covalentemente a al menos una fracción de fármaco de toxina" incluye situaciones en las que una o más moléculas del mismo fármaco están unidas covalentemente a una molécula de anticuerpo, así como en las que diferentes fármacos están unidos covalentemente a una molécula de anticuerpo. En la última situación, una o más moléculas de cada uno de los diferentes fármacos pueden estar unidas a una molécula de anticuerpo, o una combinación de las mismas (por ejemplo, una molécula de un fármaco está unida mientras que varias moléculas de otro fármaco están unidas).
En algunas realizaciones de la enseñanza, un anticuerpo se conjuga con dolastatinas o análogos y derivados peptídicos de dolostatina, las auristatinas (Patentes de E<e>. UU. Nos. 5,635,483; 5,780,588). Las auristatinas son análogos sintéticos de la dolostatina 10, un producto natural derivado de un molusco marino,Dolabela auricularia.Al igual que los maitansinoides, las auristatinas son disruptores de microtúbulos. La fracción farmacológica dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo a través del extremo N (amino) o el terminal C (carboxilo) de la fracción farmacológica peptídica.
Las realizaciones ejemplares de auristatina incluyen fracciones farmacológicas de monometilauristatina tales como MMAE y MMAF que preferiblemente están unidas por el terminal N.
MMAE, también conocida como Monometil auristatina E, tiene la siguiente fórmula:
En particular, el término "MMAE" se refiere al compuesto (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamida. MMAE es en realidad desmetil-auristatina E, es decir, el grupo amino N-terminal tiene solo un sustituyente metilo en lugar de dos como en la propia auristatina E.
Según las enseñanzas, son particularmente preferidos los conjugados de anticuerpo-vcAuristatina tales como los conjugados de anticuerpo-vcMMAE. Según la enseñanza, el término "anticuerpo-vcAuristatina" o "vcMMAE" se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) que comprende una auristatina tal como MMAE, unida mediante un enlazadorque comprende el dipéptido lisosómicamente escindible, valina-citrulina (vc), al anticuerpo.
MMAF, también conocido como monometil auristatina F, se refiere al compuesto ácido (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico.
La generación de conjugados anticuerpo-fármaco se puede realizar mediante cualquier técnica conocida por el experto. Los conjugados anticuerpo-fármaco se pueden preparar uniendo el fármaco a un anticuerpo según una técnica convencional. Un anticuerpo y un fármaco pueden unirse directamente entre sí a través de sus propios grupos enlazadores o indirectamente a través de un enlazador u otra sustancia.
Se encuentran disponibles varias reacciones diferentes para la unión covalente de fármacos a anticuerpos. Esto a menudo se logra mediante la reacción de los residuos de aminoácidos de la molécula de anticuerpo, incluidos los grupos amino de la lisina, los grupos de ácido carboxílico libre del ácido glutámico y aspártico, los grupos sulfhidrilo de la cisteína y las diversas fracciones de los aminoácidos aromáticos. Uno de los métodos no específicos de unión covalente más comúnmente utilizados es la reacción de carbodiimida para unir un grupo carboxi (o amino) de un compuesto a grupos amino (o carboxi) del anticuerpo. Además, se han utilizado agentes bifuncionales como dialdehídos o imidoésteres para unir el grupo amino de un compuesto a los grupos amino de la molécula de anticuerpo. También está disponible para la unión de fármacos a anticuerpos la reacción de la base de Schiff. Este método implica la oxidación del periodato de un fármaco que contiene glicol o grupos hidroxi, formando así un aldehído que luego reacciona con la molécula de anticuerpo. La unión se produce mediante la formación de una base de Schiff con grupos amino de la molécula de anticuerpo. Los isotiocianatos también se pueden utilizar como agentes de acoplamiento para unir covalentemente fármacos a anticuerpos. El experto en la técnica conoce otras técnicas y están dentro del alcance de la presente enseñanza.
Hay muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para preparar conjugados anticuerpo-fármaco. Un enlazador comprende preferiblemente uno o más grupos funcionales que reaccionan con uno o ambos del anticuerpo y el fármaco. Ejemplos de grupos funcionales incluyen grupos amino, carboxilo, mercapto, maleimida, y piridinilo.
En una realización de la enseñanza, un anticuerpo se une a un fármaco mediante un reactivo de reticulación bifuncional. Como se usa en el presente documento, un "reactivo de reticulación bifuncional" se refiere a un reactivo que posee dos grupos reactivos, uno de los cuales es capaz de reaccionar con un anticuerpo, mientras que el otro es capaz de reaccionar con el fármaco para unir el anticuerpo con el fármaco, con lo que formando un conjugado. Se puede usar cualquier reactivo de reticulación bifuncional adecuado en relación con la enseñanza, siempre que el reactivo enlazador proporcione la retención del fármaco, por ejemplo, citotoxicidad y características de direccionamiento del anticuerpo. Preferiblemente, la molécula enlazadora une el fármaco al anticuerpo a través de enlaces químicos, de modo que el fármaco y el anticuerpo estén acoplados químicamente (por ejemplo, unidos covalentemente) entre sí.
En una realización, el reactivo de reticulación bifuncional comprende enlazadores no escindibles. Un enlazador no escindible es cualquier fracción química que sea capaz de unir un fármaco, tal como un maitansinoide, a un anticuerpo de forma covalente estable. Preferiblemente, un enlazador no escindible no es escindible en condiciones fisiológicas, en particular dentro de una célula. Por lo tanto, los enlazadores no escindibles son sustancialmente resistentes a la escisión inducida por ácido, la escisión inducida por luz, la escisión inducida por peptidasa, la escisión inducida por esterasa, y la escisión por enlaces disulfuro, en condiciones en las que el fármaco o el anticuerpo permanecen activos. Los reactivos de reticulación adecuados que forman enlaces no escindibles entre un fármaco y un anticuerpo son bien conocidos en la técnica. En una realización, el fármaco está unido al anticuerpo mediante un enlace tioéter.
En una realización particularmente preferida, el reactivo de enlace es un enlazador escindible. Preferiblemente, un enlazador escindible es escindible en condiciones fisiológicas, en particular dentro de una célula. Ejemplos de enlazadores escindibles adecuados incluyen enlazadores disulfuro, enlazadores lábiles a ácidos, enlazadores fotolábiles, enlazadores lábiles de peptidasa, y enlazadores lábiles de esterasa.
Los ejemplos de enlazadores incluyen, pero no se limitan a, N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato (SPDB), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC), N-succinimidil-4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-maleimidobutírico (GMBS), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-maleimidocaproico (EMCS), éster de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-(a-maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil-4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB), N-(pmaleimidofenil)isocianato (PMPI), 6 -maleimidocaproilo (MC), maleimidopropanoilo (MP), p-aminobenciloxicarbonilo (PAB), N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP), y (4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB). También se puede usar un enlazador peptídico tal como valina-citrulina (Val-Cit) o alanina-fenilalanina (ala-phe), y cualquiera de los enlazadores antes mencionados se puede usar en una combinación adecuada.
Los enlazadores que contienen disulfuro son enlazadores que se pueden escindir mediante intercambio de disulfuro, que puede ocurrir en condiciones fisiológicas. Aún en otras realizaciones, el enlazador se puede escindir en condiciones reductoras (por ejemplo, un enlazador disulfuro). Se conocen en la técnica una variedad de enlazadores disulfuro, incluidos, por ejemplo, aquellos que pueden formarse usando SATA (N-succinimidil-5-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidiloxicarbonil-alfametil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno).
Los enlazadores lábiles a los ácidos son enlazadores que se pueden escindir a pH ácido. Por ejemplo, ciertos compartimentos intracelulares, tales como endosomas y lisosomas, tienen un pH ácido (pH 4-5), y proporcionan condiciones adecuadas para escindir enlaces lábiles en ácido. Los enlazadores lábiles a los ácidos son relativamente estables en condiciones de pH neutro, como las de la sangre, pero son inestables a un pH inferior a 5,5 o 5,0. Por ejemplo, se puede utilizar una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal o similares.
Los enlazadores fotolábiles son útiles en la superficie del cuerpo y en muchas cavidades corporales accesibles a la luz. Además, la luz infrarroja puede penetrar el tejido.
Los enlazadores lábiles de peptidasa se pueden utilizar para escindir ciertos péptidos dentro o fuera de las células. En una realización, el enlazador escindible se escinde en condiciones suaves, es decir, condiciones dentro de una célula en las que la actividad del agente citotóxico no se ve afectada.
El enlazador puede ser o puede comprender, por ejemplo, un enlazador peptidilo que se escinde mediante una enzima peptidasa o proteasa intracelular, incluyendo, pero no limitado a, una proteasa lisosomal o endosomal. Normalmente, el enlazador peptidilo tiene una longitud de al menos dos aminoácidos o de al menos tres aminoácidos. Los agentes de escisión pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todos los cuales se sabe que hidrolizan derivados de fármacos dipéptidos, lo que da como resultado la liberación del fármaco activo dentro de las células diana. Por ejemplo, se puede usar un enlazador peptidilo que es escindible por la proteasa catepsina-B dependiente de tiol, que se expresa altamente en tejido canceroso (por ejemplo, un enlazador Phe-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly). En realizaciones específicas, el enlazador peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un enlazador valina-citrulina (Val-Cit; vc) o un enlazador fenilalanina-lisina (Phe-Lys). Una ventaja de utilizar la liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente normalmente se atenúa cuando se conjuga y las estabilidades séricas de los conjugados suelen ser altas.
En una realización particularmente preferida, el enlazador según la enseñanza comprende o consiste en el dipéptido valina (Val) - citrulina (Cit) (vc), que se escinde mediante catepsina dentro de las células tumorales.
En una realización, el fármaco es un maitansinoide tal como DM4 que está acoplado a un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 a través de un entrecruzador de proteína heterobifuncional reactivo con amino y sulfhidrilo que reacciona con aminas primarias (como las que se encuentran en las cadenas laterales de lisina o las N-terminal de las proteínas) del anticuerpo y con el grupo sulhidrilo del maitansinoide para producir un enlace disulfuro reversible. En una realización, el reticulante de proteína heterobifuncional reactivo con amino y sulfhidrilo es SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato), que reacciona mediante un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) con aminas primarias (como las que se encuentran en las cadenas laterales de lisina o el terminal N de las proteínas) del anticuerpo y a través de un grupo disulfuro de piridinilo con el grupo sulhidrilo de DM4 para producir un enlace disulfuro reversible (Figura 1).
En una realización, el fármaco es una auristatina tal como MMAE que está acoplada a un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 mediante un enlazador peptídico tal como un enlazador peptídico escindible con catepsina, en particular Val-Cit (vc). En una realización, el anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2 está tiolado, por ejemplo con el enlazador heterobifuncional 2-IT (2-iminotiolano) que reacciona con aminas libres de residuos de lisina.
En una realización particularmente preferida, un conjugado anticuerpo-fármaco según la enseñanza comprende un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento acoplado (preferiblemente a través de sus grupos amino) a DM4 (preferiblemente a través de su grupo sulfhidrilo). En una realización, el anticuerpo se acopla a DM4 a través de un enlazador SPDB.
En una realización, un conjugado anticuerpo-fármaco según la enseñanza comprende un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 o 51 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento acoplado (preferiblemente a través de sus grupos amino) a DM4 (preferiblemente a través de su grupo sulfhidrilo). En una realización, el anticuerpo se acopla a DM4 a través de un enlazador SPDB.
En una realización particularmente preferida, un conjugado anticuerpo-fármaco según la enseñanza comprende un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento acoplado (preferiblemente a través de sus grupos amino) a MMAE (preferiblemente a través de su grupo amino N-terminal). En una realización, el anticuerpo se acopla a MMAE a través de un enlazador que comprende el dipéptido vc.
En una realización particularmente preferida, un conjugado anticuerpo-fármaco según la enseñanza comprende un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 o 51 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24 o un fragmento del mismo o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento acoplado (preferiblemente a través de sus grupos amino) a MMAE (preferiblemente a través de su grupo amino N-terminal). En una realización, el anticuerpo se acopla a MMAE a través de un enlazador que comprende el dipéptido vc.
El término "ácido nucleico", tal como se utiliza en el presente documento, pretende incluir ADN y ARN. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, pero preferiblemente es ADN bicatenario.
Según la enseñanza, el término "expresión" se utiliza en su significado más general y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína/péptido. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede llevarse a cabo de forma transitoria o estable.
Las enseñanzas proporcionadas en el presente documento con respecto a secuencias de aminoácidos específicas, por ejemplo, las que se muestran en el listado de secuencias, en particular aquellas a las que se hace referencia en el presente documento indicando una SEQ ID NO:, deben interpretarse de manera que también se relacionen con variantes de dichas secuencias específicas. Dichas secuencias variantes pueden ser funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo secuencias de aminoácidos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos específicas. Una propiedad importante es retener la unión de un anticuerpo a su objetivo. Preferiblemente, una secuencia que es una variante con respecto a una secuencia específica, cuando reemplaza la secuencia específica en un anticuerpo, conserva la unión de dicho anticuerpo a CLDN18.2.
Los expertos en la técnica apreciarán que, en particular, las secuencias de las regiones CDR, hipervariables y variables se pueden modificar sin perder la capacidad de unirse a CLDN18.2. Por ejemplo, las regiones CDR serán idénticas o altamente homólogas a las regiones de anticuerpos especificadas en el presente documento. Por "altamente homólogo" se contempla que se pueden realizar de 1 a 5, preferiblemente de 1 a 4, tal como de 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones en las CDRs. Además, las regiones hipervariable y variable pueden modificarse para que muestren una homología sustancial con las regiones de anticuerpos específicamente divulgados en el presente documento.
El término "variante" según la enseñanza se refiere, en particular, a mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellos que están presentes de forma natural. Una variante alélica se relaciona con una alteración en la secuencia normal de un gen, cuyo significado a menudo no está claro. La secuenciación completa de genes a menudo identifica numerosas variantes alélicas de un gen determinado. Un homólogo de especie es un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos con una especie de origen diferente al de un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos determinado. El término "variante" abarcará cualquier variante modificada postraduccionalmente y variante de conformación.
Para los fines de la presente enseñanza, las "variantes" de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos. Las variantes de deleción de aminoácidos que comprenden la deleción en el N-terminal y/o C-terminal de la proteína también se denominan variantes de truncamiento N-terminal y/o C-terminal.
Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible una inserción aleatoria con un cribado apropiado del producto resultante.
Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones amino y/o carboxi terminales de uno o más aminoácidos, tales como 1,2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, o más aminoácidos.
Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tal como por la eliminación de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, o más aminoácidos. Las eliminaciones pueden estar en cualquier posición de la proteína.
Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de al menos un residuo de la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar. Se prefieren las modificaciones en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no están conservadas entre proteínas o péptidos homólogos y/o la sustitución de aminoácidos por otros que tengan propiedades similares. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos en variantes de proteínas son cambios de aminoácidos conservadores, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de manera similar. Un cambio de aminoácido conservador implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos naturales generalmente se dividen en cuatro familias: ácidos (aspartato, glutamato), aminoácidos básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.
Preferiblemente, el grado de similitud, preferiblemente identidad, entre una secuencia de aminoácidos dada, tal como una secuencia de aminoácidos a la que se hace referencia en el presente documento indicando una SEQ ID NO:, y una secuencia de aminoácidos que es una variante de dicha secuencia de aminoácidos dada estará en al menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. El grado de similitud o identidad se proporciona preferiblemente para una región de aminoácidos que es al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o aproximadamente 100 % de la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos de referencia consta de 200 aminoácidos, el grado de similitud o identidad se proporciona preferiblemente para al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180 o aproximadamente 200 aminoácidos, preferiblemente aminoácidos continuos. En realizaciones preferidas, el grado de similitud o identidad se proporciona para toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de referencia. La alineación para determinar la similitud de secuencia, preferiblemente la identidad de secuencia, se puede realizar con herramientas conocidas en la técnica, preferiblemente usando la mejor alineación de secuencia, por ejemplo, usando Align, usando configuraciones estándar, preferiblemente EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.
"Similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones de aminoácidos conservadoras. La "identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias.
El término "identidad porcentual" pretende designar un porcentaje de residuos de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido después del mejor alineamiento, siendo este porcentaje puramente estadístico y distribuyéndose las diferencias entre las dos secuencias aleatoriamente y en toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se llevan a cabo convencionalmente comparando estas secuencias después de haberlas alineado de manera óptima, realizándose dicha comparación por segmento o por "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias a comparar puede producirse, además de manualmente, mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, mediante el algoritmo de homología local de Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, mediante el método de búsqueda por similitud de Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, o mediante programas informáticos que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, dividiendo este número por el número de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
El término "animal transgénico" se refiere a un animal que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes, preferiblemente transgenes de cadena pesada y/o ligera, o transcromosomas (integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que es preferiblemente capaz de expresar los transgenes. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgén de cadena ligera humana y un transgén de cadena pesada humana o un transcromosoma de cadena pesada humana, de modo que el ratón produzca anticuerpos anti-CLDN18.2 humanos cuando se inmuniza con antígeno CLDN18.2 y/o células que expresan CLDN18.2. El transgén de cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso de los ratones transgénicos, por ejemplo, ratones HuMAb, tales como ratones HCo7 o HCol2, o el transgén de cadena pesada humana puede mantenerse extracromosómicamente, como es el caso para ratones transcromosómicos (por ejemplo, KM) como se describe en WO 02/43478. Dichos ratones transgénicos y transcromosómicos pueden ser capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos contra CLDN18.2 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) sometiéndose a recombinación V-D-J y conmutaciónde isotipo.
"Reducir", "disminuir" o "inhibir" como se usa en el presente documento significa una disminución general o la capacidad de provocar una disminución general, preferiblemente del 5% o más, del 10% o más, del 20% o más, más preferiblemente del 50% o más, y lo más preferiblemente del 75% o mayor, en el nivel, por ejemplo en el nivel de expresión o en el nivel de proliferación de células.
Términos tales como "aumentar" o "mejorar" preferiblemente se refieren a un aumento o mejora en aproximadamente al menos un 10 %, preferiblemente al menos un 20 %, preferiblemente al menos un 30 %, más preferiblemente al menos un 40 %, más preferiblemente al menos un 50 %, incluso más preferiblemente al menos el 80%, y lo más preferiblemente al menos el 100%, al menos el 200%, al menos el 500%, al menos el 1000%, al menos el 10000% o incluso más.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden producirse mediante una variedad de técnicas, incluida la metodología de anticuerpos monoclonales convencionales, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B o técnicas de presentación en fagos usando bibliotecas de genes de anticuerpos.
El sistema animal preferido para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos de inmunización y las técnicas para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión se conocen en la técnica. También se conocen compañeros de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y procedimientos de fusión.
Otros sistemas animales preferidos para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales son el sistema de rata y conejo (por ejemplo, descrito en Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), véase también Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
En otra realización preferida más, se pueden generar anticuerpos monoclonales humanos usando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunológico humano en lugar del sistema del ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones conocidos como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en el presente documento "ratones transgénicos". La producción de anticuerpos humanos en tales ratones transgénicos se puede realizar como se describe en detalle para CD20 en WO2004035607
Otra estrategia más para generar anticuerpos monoclonales es aislar directamente genes que codifican anticuerpos de linfocitos que producen anticuerpos de especificidad definida, por ejemplo, véase Babcock et al., 1996; Una nueva estrategia para generar anticuerpos monoclonales a partir de linfocitos únicos y aislados que producen anticuerpos con especificidades definidas. Para obtener detalles sobre la ingeniería de anticuerpos recombinantes, véase también Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 and Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.
Para generar anticuerpos, se pueden inmunizar ratones con péptidos conjugados con portador derivados de la secuencia del antígeno, es decir, la secuencia contra la que se van a dirigir los anticuerpos, una preparación enriquecida de antígeno expresado recombinantemente o fragmentos del mismo y/o células que expresan el antígeno, como descrito. Alternativamente, se pueden inmunizar ratones con ADN que codifica el antígeno o fragmentos del mismo. En el caso de que las inmunizaciones que utilizan una preparación purificada o enriquecida del antígeno no den como resultado anticuerpos, los ratones también pueden inmunizarse con células que expresan el antígeno, por ejemplo, una línea celular, para promover respuestas inmunitarias.
La respuesta inmune se puede monitorizar durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma y suero que se obtienen mediante hemorragias retroorbitarias o de la vena de la cola. Para las fusiones se pueden utilizar ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina. Los ratones pueden recibir un refuerzo por vía intraperitoneal o intravenosa con células que expresan antígenos 3 días antes del sacrificio y la extracción del bazo para aumentar la tasa de hibridomas secretores de anticuerpos específicos.
Para generar hibridomas que produzcan anticuerpos monoclonales, se pueden aislar esplenocitos y células de ganglios linfáticos de ratones inmunizados y fusionarlos con una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden entonces cribarse para determinar la producción de anticuerpos específicos de antígeno. A continuación, los pocillos individuales pueden examinarse mediante ELISA para detectar hibridomas secretores de anticuerpos. Mediante inmunofluorescencia y análisis FACS utilizando células que expresan antígenos, se pueden identificar anticuerpos con especificidad para el antígeno. Los hibridomas que secretan anticuerpos pueden resembrarse, examinarse nuevamente y, si aún son positivos para anticuerpos monoclonales, pueden subclonarse mediante dilución limitante. Los subclones estables pueden luego cultivarsein vitropara generar anticuerpos en un medio de cultivo de tejidos para su caracterización.
También se pueden producir anticuerpos en un transfectoma de célula huésped usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección genética como son bien conocidos en la técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
Por ejemplo, en una realización, los genes de interés, por ejemplo, genes de anticuerpos, pueden ligarse en un vector de expresión tal como un plásmido de expresión eucariótico tal como el utilizado por el sistema de expresión del gen GS divulgado en Documento WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338841 u otros sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. El plásmido purificado con los genes de anticuerpos clonados se puede introducir en células huésped eucariotas tales como células CHO, células NS/0, células HEK293T o células HEK293 o, alternativamente, otras células eucariotas como células derivadas de plantas, células de hongos o de levadura. El método utilizado para introducir estos genes pueden ser métodos descritos en la técnica tales como electroporación, lipofectina, lipofectamina u otros. Después de la introducción de estos genes de anticuerpos en las células huésped, se pueden identificar y seleccionar las células que expresan el anticuerpo. Estas células representan los transfectomas que luego pueden amplificarse según su nivel de expresión y ampliarse para producir anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes pueden aislarse y purificarse a partir de estos sobrenadantes y/o células de cultivo.
Alternativamente, los genes de anticuerpos clonados pueden expresarse en otros sistemas de expresión, incluidas células procarióticas, tales como microorganismos, por ejemplo E. coli. Además, los anticuerpos pueden producirse en animales no humanos transgénicos, como por ejemplo en leche de oveja y de conejo o en huevos de gallina, o en plantas transgénicas; véase por ejemplo . Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; y Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.
Quimerización
La inmunogenicidad de los anticuerpos murinos en el hombre puede reducirse o evitarse por completo si los respectivos anticuerpos se quimerizan o humanizan. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyas diferentes porciones derivan de diferentes especies animales, tales como aquellos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo murino y una región constante de inmunoglobulina humana. La quimerización de anticuerpos se logra uniendo las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo murino con la región constante de la cadena pesada y ligera humana (por ejemplo, como se describe en Kraus et al., en Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). En una realización preferida, los anticuerpos quiméricos se generan uniendo la región constante de la cadena ligera kappa humana a la región variable de la cadena ligera murina. En una realización también preferida, se pueden generar anticuerpos quiméricos uniendo la región constante de la cadena ligera lambda humana a la región variable de la cadena ligera murina. Las regiones constantes de cadena pesada preferidas para la generación de anticuerpos quiméricos son IgG1, IgG3 e IgG4. Otras regiones constantes de cadena pesada preferidas para la generación de anticuerpos quiméricos son IgG2, IgA, IgD e IgM.
Humanización
Los anticuerpos interactúan con los antígenos diana predominantemente a través de residuos de aminoácidos que se encuentran en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de las cadenas pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDRs son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDRs. Debido a que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos específicos de origen natural mediante la construcción de vectores de expresión que incluyan secuencias CDR del anticuerpo específico de origen natural injertados en secuencias marco de un anticuerpo diferente. con diferentes propiedades (ver, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; y Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Estas secuencias marco se pueden obtener de bases de datos públicas de ADN que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Estas secuencias de la línea germinal diferirán de las secuencias de genes de anticuerpos maduros porque no incluirán genes variables completamente ensamblados, que se forman mediante la unión de V (D) J durante la maduración de las células B. Las secuencias de genes de la línea germinal también diferirán de las secuencias de un anticuerpo del repertorio secundario de alta afinidad en cada individuo de manera uniforme en toda la región variable.
La capacidad de los anticuerpos para unirse a un antígeno se puede determinar utilizando ensayos de unión estándar (por ejemplo, ELISA, transferencia Western, inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo).
Para purificar anticuerpos, se pueden cultivar hibridomas seleccionados en matraces giratorios de dos litros para la purificación de anticuerpos monoclonales. Alternativamente, se pueden producir anticuerpos en biorreactores basados en diálisis. Los sobrenadantes se pueden filtrar y, si es necesario, concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína G-sefarosa o proteína A-sefarosa. La IgG eluida se puede comprobar mediante electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento para garantizar la pureza. La solución tampón se puede cambiar por PBS y la concentración se puede determinar mediante OD280 utilizando un coeficiente de extinción de 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pueden dividir en alícuotas y almacenar a -80°C.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales seleccionados se unen a epítopos únicos, se puede utilizar mutagénesis dirigida a un sitio o dirigida a múltiples sitios.
Para determinar el isotipo de los anticuerpos, se pueden realizar ELISA de isotipo con varios kits comerciales (por ejemplo, Zymed, Roche Diagnostics). Los pocillos de las placas de microtitulación se pueden recubrir con Ig anti-ratón. Después del bloqueo, las placas se hacen reaccionar con anticuerpos monoclonales o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, los pocillos se pueden hacer reaccionar con sondas conjugadas con peroxidasa específicas de IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3, IgA o IgM de ratón de ratón. Después del lavado, las placas pueden revelarse con sustrato ABTS (1 mg/ml) y analizarse a una OD de 405-650. Alternativamente, el kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón IsoStrip (Roche, cat. No. 1493027) se puede utilizar como lo describe el fabricante.
Para demostrar la presencia de anticuerpos en el suero de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan antígenos, se puede utilizar la citometría de flujo. Las líneas celulares que expresan antígeno de forma natural o después de la transfección y los controles negativos que carecen de expresión de antígeno (crecidas en condiciones de crecimiento estándar) se pueden mezclar con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en sobrenadantes de hibridoma o en PBS que contenga FBS al 1%, y se pueden incubar a 4°C durante 30 minutos. Después del lavado, el anticuerpo anti IgG marcado con APC o Alexa647 puede unirse al anticuerpo monoclonal unido al antígeno en las mismas condiciones que la tinción del anticuerpo primario. Las muestras se pueden analizar mediante citometría de flujo con un instrumento FACS utilizando propiedades de luz y dispersión lateral para detectar células vivas individuales. Para distinguir los anticuerpos monoclonales específicos de antígeno de los aglutinantes no específicos en una sola medición, se puede emplear el método de cotransfección. Las células transfectadas transitoriamente con plásmidos que codifican antígeno y un marcador fluorescente pueden teñirse como se describe anteriormente. Las células transfectadas se pueden detectar en un canal de fluorescencia diferente al de las células teñidas con anticuerpos. Como la mayoría de las células transfectadas expresan ambos transgenes, los anticuerpos monoclonales específicos de antígeno se unen preferiblemente a células que expresan marcadores de fluorescencia, mientras que los anticuerpos no específicos se unen en una proporción comparable a las células no transfectadas. Se puede utilizar un ensayo alternativo que utiliza microscopía de fluorescencia además del ensayo de citometría de flujo o en lugar del mismo. Las células pueden teñirse exactamente como se describe anteriormente y examinarse mediante microscopía de fluorescencia.
Para demostrar la presencia de anticuerpos en el suero de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan antígenos, se puede utilizar el análisis de microscopía de inmunofluorescencia. Por ejemplo, líneas celulares que expresan antígeno de forma espontánea o después de la transfección y controles negativos que carecen de expresión de antígeno se cultivan en portaobjetos de cámara en condiciones de crecimiento estándar en medio DMEM/F12, suplementado con suero fetal de ternera (FCS) al 10 %, L-glutamina 2 mM, 100 Ul/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Luego, las células pueden fijarse con metanol o paraformaldehído o dejarse sin tratar. Luego, las células pueden hacerse reaccionar con anticuerpos monoclonales contra el antígeno durante 30 min. a 25°C. Después del lavado, las células se pueden hacer reaccionar con un anticuerpo secundario IgG anti-ratón marcado con Alexa555 (Molecular Probes) en las mismas condiciones. Luego, las células pueden examinarse mediante microscopía de fluorescencia.
Se pueden preparar extractos celulares de células que expresan antígeno y controles negativos apropiados y someterlos a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS). Después de la electroforesis, los antígenos separados se transferirán a membranas de nitrocelulosa, se bloquearán y se sondarán con los anticuerpos monoclonales que se van a analizar. La unión de IgG se puede detectar utilizando peroxidasa de IgG anti ratón y se puede desarrollar con sustrato ECL.
Los anticuerpos pueden ensayarse adicionalmente para determinar su reactividad con antígeno mediante inmunohistoquímica de una manera bien conocida por el experto, por ejemplo usando criosecciones fijadas con paraformaldehído o acetona o secciones de tejido embebidas en parafina fijadas con paraformaldehído de muestras de tejido no canceroso o de tejido canceroso obtenidas de pacientes durante la rutina. procedimientos quirúrgicos o de ratones portadores de tumores xenoinjertados inoculados con líneas celulares que expresan antígeno de forma espontánea o después de la transfección. Para la inmunotinción, se pueden incubar anticuerpos reactivos al antígeno seguidos de anticuerpos anti-ratón de cabra o anti-conejo de cabra (DAKO) conjugados con peroxidasa de rábano picante de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Los conjugados de anticuerpos que se unen a CLDN18.2 también se pueden probar en un modeloin vivo(por ejemplo, en ratones inmunodeficientes que portan tumores xenoinjertados e inoculados con líneas celulares que expresan CLDN18.2, por ejemplo, DAN-G, S<n>U-16 o KATO-III, o después de la transfección, por ejemplo HEK293) para determinar su eficacia en el control del crecimiento de células tumorales que expresan CLDN18.2.
Los conjugados de anticuerpos se pueden administrar a ratones libres de tumores seguido de una inyección de células tumorales para medir los efectos de los conjugados de anticuerpos para prevenir la formación de tumores o síntomas relacionados con tumores. Los conjugados de anticuerpos se pueden administrar a ratones portadores de tumores para determinar la eficacia terapéutica de los respectivos conjugados de anticuerpos para reducir el crecimiento tumoral, la metástasis o los síntomas relacionados con el tumor. La aplicación de conjugados de anticuerpos se puede combinar con la aplicación de otras sustancias como fármacos cistostáticos, inhibidores del factor de crecimiento, bloqueadores del ciclo celular, inhibidores de la angiogénesis u otros anticuerpos para determinar la eficacia sinérgica y la toxicidad potencial de las combinaciones. Para analizar los efectos secundarios tóxicos mediados por los conjugados de anticuerpos, se puede inocular a los animales con conjugados de anticuerpos o reactivos de control e investigar exhaustivamente para detectar síntomas posiblemente relacionados con la terapia con conjugados de anticuerpos CLDN18.2. Los posibles efectos secundarios de la aplicaciónin vivode conjugados de anticuerpo CLDN18.2 incluyen particularmente toxicidad en los tejidos que expresan CLDN18.2, incluido el estómago.
El mapeo de epítopos reconocidos por anticuerpos se puede realizar como se describe en detalle en "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 and in "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.
Los compuestos y agentes descritos en el presente documento se pueden administrar en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada.
Las composiciones farmacéuticas son preferiblemente estériles y contienen una cantidad eficaz de los conjugados de anticuerpos descritos en el presente documento y opcionalmente de agentes adicionales como se analiza en el presente documento para generar la reacción deseada o el efecto deseado.
Las composiciones farmacéuticas normalmente se proporcionan en una forma de dosificación uniforme y pueden prepararse de una manera conocida per se. Una composición farmacéutica puede, por ejemplo estar en forma de solución o suspensión.
Una composición farmacéutica puede comprender sales, sustancias tampón, conservantes, vehículos, diluyentes y/o excipientes, todos los cuales son preferiblemente farmacéuticamente aceptables. El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.
Se pueden usar sales que no son farmacéuticamente aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables y están incluidas en la enseñanza. Las sales farmacéuticamente aceptables de este tipo comprenden de forma no limitativa las preparadas a partir de los siguientes ácidos: ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. También se pueden preparar sales farmacéuticamente aceptables como sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.
Las sustancias tampón adecuadas para usar en una composición farmacéutica incluyen ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.
Los conservantes adecuados para usar en una composición farmacéutica incluyen cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y timerosal.
Una formulación inyectable puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable tal como Ringer Lactato.
El término "portador" se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de naturaleza natural o sintética, en el que el componente activo se combina con el fin de facilitar, mejorar o posibilitar la aplicación. Según la enseñanza, el término "portador" también incluye uno o más rellenos, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidos o líquidos compatibles, que son adecuados para la administración a un paciente.
Posibles sustancias portadoras para la administración parenteral son, por ejemplo, agua esterilizada, Ringer, Ringer lactato, solución estéril de cloruro de sodio, polialquilenglicoles, naftalenos hidrogenados y, en particular, polímeros de lactida biocompatibles, copolímeros de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno.
El término "excipiente", cuando se usa en el presente documento, pretende indicar todas las sustancias que pueden estar presentes en una composición farmacéutica y que no son ingredientes activos tales como, por ejemplo, vehículos, aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes tensioactivos, conservantes, emulsionantes, tampones, aromatizantes, o colorantes.
Los agentes y composiciones descritos en el presente documento pueden administrarse mediante cualquier vía convencional, tal como mediante administración parenteral, incluso mediante inyección o infusión. La administración es preferiblemente parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intradérmica o intramuscular.
Las composiciones adecuadas para administración parenteral normalmente comprenden una preparación acuosa o no acuosa estéril del compuesto activo, que es preferiblemente isotónica para la sangre del receptor. Ejemplos de vehículos y disolventes compatibles son la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, como medio de solución o suspensión se utilizan aceites fijos, normalmente estériles.
Los agentes y composiciones descritos en el presente documento se administran en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado sola o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de una condición particular, la reacción deseada se refiere preferiblemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende frenar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o invertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad o de una afección también puede ser un retraso de la aparición o una prevención de la aparición de dicha enfermedad o dicha afección.
Una cantidad eficaz de un agente o composición descrita en el presente documento dependerá de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluyendo la edad, la condición fisiológica, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de una terapia de acompañamiento (si está presente), la vía de administración específica y factores similares. Por consiguiente, las dosis administradas de los agentes descritos en el presente documento pueden depender de varios de dichos parámetros. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas logradas mediante una vía de administración diferente y más localizada).
Los agentes y composiciones proporcionados en el presente documento se pueden usar solos o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).
El tratamiento del cáncer representa un campo en el que las estrategias combinadas son especialmente deseables ya que frecuentemente la acción combinada de dos, tres, cuatro o incluso más fármacos/terapias contra el cáncer genera efectos sinérgicos que son considerablemente más fuertes que el impacto de un enfoque monoterapéutico. Por tanto, en otra realización de la presente enseñanza, un tratamiento contra el cáncer se puede combinar eficazmente con otros diversos fármacos. Entre ellos se encuentran, por ejemplo, combinaciones con terapias tumorales convencionales, estrategias de múltiples epítopos, inmunoterapia adicional y enfoques de tratamiento dirigidos a la angiogénesis o la apoptosis (para una revisión, ver, por ejemplo, Andersen et al. 2008: Cancer treatment: the combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743.) La administración secuencial de diferentes agentes puede inhibir el crecimiento de células cancerosas en diferentes puntos de control, mientras que otros agentes pueden, por ejemplo inhibir la neoangiogénesis, la supervivencia de células malignas o metástasis, convirtiendo potencialmente el cáncer en una enfermedad crónica.
Los agentes y composiciones descritos en el presente documento se pueden administrar a pacientes, por ejemplo,in vivo,para tratar o prevenir una variedad de trastornos tales como los descritos en el presente documento. Los pacientes preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos que pueden corregirse o mejorarse mediante la administración de los agentes y composiciones descritos en el presente documento. Esto incluye trastornos que involucran células caracterizadas por un patrón de expresión alterado de CLDN18.2.
Por ejemplo, en una realización, los agentes y composiciones descritos en el presente documento se pueden usar para tratar a un paciente con una enfermedad cancerosa, por ejemplo, una enfermedad cancerosa tal como se describe en el presente documento caracterizada por la presencia de células cancerosas que expresan CLDN18.2.
Las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento descritos según la enseñanza también se pueden usar para inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en el presente documento.
La presente enseñanza se ilustra mejor con los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos del alcance de la enseñanza.
Ejemplos
Ejemplo 1: Materiales y métodos
1. Endocitosis
La endocitosis de IMAB362 unido a CLDN18.2 se determinó utilizando un ensayo de endocitosis basado en citotoxicidad que se basa en la cointernalización del anticuerpo unido al objetivo y un fragmento Fab de IgG antihumano o antiratón conjugado con saporina (Fab-ZAP human, Advanced Targeting Systems, IT-51, Lot: #93-23; Fab-ZAP mouse, Advanced Targeting Systems, IT-48, Lot: #93-21). La saporina es una proteína que inactiva los ribosomas y que, al internalizarse, inhibe la biosíntesis de proteínas y, por lo tanto, provoca la muerte celular. Para garantizar una lisis celular óptima, se aplicó el anticuerpo Fab-ZAP en una molaridad de al menos 6 veces en comparación con el anticuerpo objetivo.
Se recolectaron células HEK293~CLDN18.2 transfectadas de forma estable con tripsina/EDTA al 0,05 % (Gibco, 25300-054) y se sembraron 2,5 x 103 células/pocillo en 50 pl de medio de crecimiento en una placa de cultivo celular de 96 pocillos. Después de 24 h, se agregaron a las células 25 pl de Fab-ZAP y 25 pl de mAB anti-CLDN18.2 o anticuerpo de control de isotipo diluido en medio de cultivo celular (Tabla 1). Las células se cultivaron durante 72 h adicionales.
Tabla 1: Concentraciones de mAB anti-CLDN18.2 y Fab-ZAP para el ensayo de endocitosis.Peso molecular: ~150 kDa para IMAB362 y 110 kDa para FabZAP.
La viabilidad celular se analizó como se describe en 6. Se utilizaron como control células incubadas sin anticuerpos en presencia de Fab-ZAP.
2. Mapeo de epítopos
El epítopo antigénico responsable de la especificidad de CLDN18.2 se analizó mediante citometría de flujo (ver 5) en células HEK293T que sobreexpresan transitoriamente mutantes CLDN18.2. Mediante PCR se generó un total de ocho mutantes CLDN18.2 con sustituciones de aminoácidos únicos dentro del primer dominio extracelular. Por lo tanto, los aminoácidos de CLDN18.2 se sustituyeron con aminoácidos de la proteína homóloga CLDN18.1 en las posiciones correspondientes. Las células HEK293T se cotransfectaron con plásmidos que codifican un mutante CLDN18.2 específico y EGFP como gen informador. Los anticuerpos purificados se analizaron a una concentración de 5 |jg/ml, mientras que los anticuerpos derivados de sobrenadantes de hibridoma se diluyeron hasta 1:4 antes del análisis. Para determinar si la unión del anticuerpo estuvo influenciada por una sustitución de aminoácido específica, se comparó la intensidad de fluorescencia media (MFI) medida en la población de células transfectadas (EGFP positiva) entre un mutante que exhibía el valor de MFI más alto y el mutante de interés. Si el MFI del mutante de interés estaba por debajo del 50%, el residuo de aminoácido se caracterizó por ser esencial para la unión del anticuerpo y la especificidad de CLDN18.2.
3. Conjugados de anticuerpos y fármacos
Las conjugaciones de DM4 y vcMMAE con el anticuerpo monoclonal IMAB362 (lote # p412118) y la caracterización analítica se realizaron en Piramal Healthcare (Grangemouth, Reino Unido). Los métodos se describen brevemente en la siguiente sección:
DM4 se acopló a IMAB362 mediante SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato). El reactivo SPDB es un reticulante de proteínas heterobifuncional reactivo con amino y sulfhidrilo que reacciona a través de un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) con aminas primarias (como las que se encuentran en las cadenas laterales de lisina o el extremo N de las proteínas) del anticuerpo y a través de un grupo disulfuro de piridinilo con el grupo sulhidrilo de DM4 para producir un enlace disulfuro reversible (Figura 1). En resumen, para la conjugación de DM4, se diafiltró IMAB362 en tampón PBS (pH 7,2) usando un filtro ultracentrífugo y se acopló a SPDB en una relación molar de 1:6 (IMAB362:SPDB) durante 1 h a temperatura ambiente. El anticuerpo modificado se dializó frente a tampón citrato 35 mM (pH 5,5) y se determinó la relación entre enlazador y anticuerpo. Se conjugó DM4 con IMAB362-SPDB en una relación molar de 1:6 (IMAB362-SPDB:DM4) durante 19 h a 2-8°C. El anticuerpo conjugado se ajustó al tampón de almacenamiento (His 20 mM, sacarosa 85 mg/ml, pH 5,8) y se almacenó a -80 °C. La proporción de anticuerpos farmacológicos se analizó mediante espectrometría UV, el contenido de monómero mediante SEC-HPLC y el contenido de fármaco libre mediante RP-HPLC.
vcMMAE se acopló a IMAB362 tiolado. Por lo tanto, IMAB362 se tioló inicialmente con el enlazador heterobifuncional 2-IT (2-iminotiolano) que reacciona con aminas libres de residuos de lisina. Luego, se conjugó vcMMAE, que contenía el enlazador peptídico escindible con catepsina Val-Cit (vc), mediante valina con el grupo sulfhidrilo del anticuerpo tiolado (Figura 1). En resumen, se diafiltró IMAB362 en tampón PBS (pH 7,2) utilizando un filtro ultracentrífugo y se incubó con 2-IT en una relación molar de 1:20 (IMAB362:2-IT) durante 2 h a temperatura ambiente. El anticuerpo modificado se dializó en tampón citrato 35 mM (pH 5,5) y se determinó la relación entre enlazador y anticuerpo. Posteriormente, se conjugó vcMMAE con IMAB362 tiolado en una relación molar de 1:6 (IMAB362-Sh :vcMm Ae ) mediante incubación durante 20 h a 2-8°C. Los anticuerpos conjugados se dializaron en tampón de almacenamiento (His 20 mM, sacarosa 85 mg/ml, pH 5,8) y se almacenaron a -80°C. La relación de anticuerpos farmacológicos se analizó mediante espectrometría UV, el contenido de monómero mediante SEC-HPLC y el contenido de fármaco libre mediante RP-HPLC.
4. Cultivo de células
Las líneas celulares se cultivaron de acuerdo con las instrucciones de los proveedores y las hojas de datos de líneas celulares de Ganymed en un medio específico para cada tipo de célula a 37 °C en incubadoras humidificadas con 5% o 7,5% de CO2 (Tabla 2). Los medios de cultivo celular y los suplementos se obtuvieron de Invitrogen, Gibco y Sigma.
Tabla 2: Sistemas de modelos celulares.
5. Citometría de flujo
Las afinidades y especificidades de unión relativas de los anticuerpos desnudos anti-CLDN18.2 y los conjugados de fármaco-anticuerpo se determinaron mediante citometría de flujo utilizando líneas celulares CLDN18.2 positivas y negativas.
Se recogieron células de un cultivo de crecimiento exponencial con tripsina/EDTA al 0,05 % (Gibco, 25300-054) y se contaron utilizando una cámara de recuento de Neubauer. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 1500 rpm (468 x g), se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en tampón FACS (PBS que contiene FCS al 2 % (Gibco, 10270-106) para análisis con anticuerpos conjugados con toxina, PBS que contiene 2 % FCS y EDTA 2 mM para la detección de anticuerpos desnudos reactivos CLDN18.2) a 2 * 106 células/ml. 100 pl de la suspensión celular por pocillo (corresponden a 2 * 105 células/pocillo) se transfirieron a una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo. Después de la centrifugación durante 1 min a 1500 rpm, se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en tampón FACS que contenía anticuerpos desnudos o conjugados con toxina en concentraciones apropiadas (hasta 20 pg/ml para la medición de la afinidad relativa o 50 pg/ml para el control de la expresión) y se incubaron durante 30-45 min a 4°C (Tabla 3). Las células se centrifugaron durante 1 min a 1500 rpm y se descartó el sobrenadante. Después de que las células se lavaron tres veces con tampón FACS, se resuspendieron en tampón FACS que contenía IgG antihumana conjugada con APC (Jackson Immuno Research, 109-136-170) o IgG anti-ratón de cabra conjugada con APC (Jackson Immuno Research, 109-136-170), 115-136-146) o Proteína L-FITC (1 pg/ml, análisis de chim mAB294) y se incubaron durante 30 min a 4°C (Tabla 3). Después de la incubación, se agregaron 100 pl de tampón FACS a cada muestra, las células se centrifugaron durante 1 min a 1500 rpm y se descartó el sobrenadante. El paso de lavado con tampón FACS se repitió dos veces. Finalmente, las células se resuspendieron en 100 pl de tampón FACS y se determinó la unión utilizando un BD FACS Array Bioanalyzer.
Cabe señalar que los anticuerpos desnudos y conjugados con toxina se aplicaron en concentraciones iguales. Se ignoraron las diferencias entre el peso molecular de los anticuerpos.
Tabla 3: Detalles experimentales de citometría de flujo.
6. Ensayo de viabilidad
El efecto de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE sobre la viabilidad celular se determinó mediante un ensayo colorimétrico que detecta las actividades metabólicas celulares. El ensayo se basa en la capacidad de las células metabólicamente activas para reducir el XTT amarillo (2,3-Bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida) a un compuesto de formazán de color naranja que puede detectarse mediante espectrofotometría. La intensidad del tinte es proporcional al número de células vivas.
Las células se recogieron con tripsina/EDTA al 0,05% (Gibco, 25300-054), se resuspendieron en medio de cultivo celular (Tabla 2) y se sembraron 50 pl de la suspensión celular con la cantidad correspondiente de células por pocillo en placas de cultivo celular de 96 pocilios (Tabla 4). Después de 24 h, se agregaron IMAB362 conjugado con toxina o anticuerpos de control diluidos en 50 j l de medio a concentraciones apropiadas y las células se cultivaron durante otras 72 h.
Tabla 4: Descripción general de las líneas celulares utilizadas en ensayos de viabilidad.
La viabilidad celular se analizó utilizando el kit de proliferación celular AppliChem II (AppliChem, A8088, 1000) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 3-5 h de incubación con reactivo XTT, se midió la absorbancia a 480 nm (referencia 630 nm) usando un espectrofotómetro (Tecan). La reducción de la viabilidad se calculó utilizando la siguiente ecuación:
¡muestra - en blanco
Reducción de viabilidad :[%] — 100 — [control - en blanco
en blanco: control medio
control: células sin anticuerpos
muestra: células con anticuerpo
Los valores de EC50 se determinaron con GraphPad Prism 6 mediante regresión no lineal.
7. Ensayo de espectador
Se analizó la actividad espectadora de los anticuerpos IMAB362 conjugados con toxina en células diana negativasin vitrococultivando la línea celular PA-1(Luc) que expresa luciferasa negativa para CLDN18.2 en presencia o ausencia de la línea celular NUGC-4 10cE8 positiva para CLDN18.2. Por lo tanto, se sembraron 1,5 * 103 PA-1 (Luc) células por pocillo para un solo cultivo o junto con 1,5 x 103 NUGC-4 10cE8 células por pocillo para cocultivo en medio RPMI suplementado con 10 % de Fc S y 1 % de pen/estrep. Después de 24 h, se agregaron IMAB362-DM4, IMAB362-vcMMAE o IMAB362 no conjugado como control negativo y las células se cultivaron durante otras 72 h. La viabilidad celular se analizó como se describe en 6. La lisis de las células diana negativas se determinó midiendo la bioluminiscencia de las células PA-1 (Luc) que expresan luciferasa. Por lo tanto, se agregaron por pocillo 50 j l de mezcla de luciferina (1,92 mg/ml de D-luciferina (Sigma, 50227) y HEPES 160 mM en ddH2O). La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 90 minutos y la bioluminiscencia se midió utilizando un luminómetro (Infinite M200, TECAN). Los resultados se expresan como unidades de luz relativas (RLU) digitales integradas. La reducción de la viabilidad se calculó como se describe en 6.
8. Experimentos con animales
Todos los estudios de xenoinjerto se llevaron a cabo de conformidad con las regulaciones nacionales y las pautas éticas para estudios experimentales con animales. Todos los animales se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos en jaulas ventiladas individuales y en un ciclo de luz y oscuridad artificial de 12 h. Se proporcionó comida y aguaad libitium.Antes del inicio de los estudios, se permitió que los ratones se aclimataran durante un mínimo de 6 días.
8.1. Estudio de dosis máxima tolerada (MTD)
Los tumores de xenoinjerto se inocularon mediante inyección subcutánea de 8,5 * 106 células tumorales pancreáticas humanas BxPC-3~CLDN18.2 en 200 j l de PBS en los flancos de ratones hembra Hsd:Athymic Nude-Foxnlnu. Para determinar la MTD y la eficacia de los conjugados de fármacos con anticuerpos anti-CLDN18.2, los ratones con tumores recibieron diferentes dosis de IMAB362-DM4 o IMAB362-vcMMAE. La dosis máxima aplicable estuvo limitada por la concentración de anticuerpos y el volumen de inyección recomendado por GV-SOLAS para inyección intravenosa en ratones (~200 jl). Ambos anticuerpos se aplicaron en la concentración máxima como dosis única y repetida (es decir, 15 y 16 mg/kg, respectivamente), así como la mitad de esta concentración (es decir, 7,5 y 8 mg/kg respectivamente) o vehículo de control (tamaño del grupo: n= 5). Los anticuerpos se inyectaron por vía intravenosa el día 14 después del injerto y para dosis repetidas adicionalmente el día 21 después del injerto. El peso corporal, la salud de los animales, el comportamiento y el tamaño del tumor se controlaron dos veces por semana con un calibrador y los volúmenes de los tumores se calcularon según la siguiente fórmula: [largo * ancho * (ancho/2)]. Todos los animales fueron disecados cuando el primer tumor del grupo vehículo alcanzó un máximo de 1400 mm3 o cuando el tumor se volvió ulceroso (día 49 después del injerto para IMAB362-DM4, día 37 después del injerto para IMAB362-vcMMAE). Se recogieron muestras de sangre para química clínica bajo anestesia general iniciada con 250 j l i.p. de una mezcla que consistía en 1,25 ml de ketamina, 1 ml de xilazina (2%) y 7,75 ml de H2O. Posteriormente, los ratones fueron perfundidos con PBS seguido de una perfusión con formalina al 4% bajo anestesia general. Se diseccionaron órganos y tejidos seleccionados (estómago, esófago, cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, páncreas, bazo, duodeno, íleon, colon, útero y ovarios) y se fijaron en formalina al 4%, se almacenaron a 4°C y finalmente se embebieron en parafina. Se cortaron secciones de tejido de tres micrómetros de cada muestra de FFPE (fijada con formalina embebida en parafina) y se montaron en portaobjetos adhesivos (SuperFrost Ultra Plus, Thermo Fisher Scientific). Después de hornear durante 60 minutos a 58°C, las secciones de tejido FFPE se desparafinaron usando xileno y se rehidrataron a través de una serie graduada de etanol (2x 100%, 2x 96%, 2x 70% de etanol durante 3 minutos cada uno). Los núcleos se tiñeron durante 5 minutos a temperatura ambiente con hematoxilina de Mayer, seguido de coloración azul en grifo de H2O. Posteriormente, el citoplasma se contratiñó con eosina acuosa al 0,5% durante 2 minutos a temperatura ambiente. Después de la deshidratación a través de una serie graduada de etanol, las secciones de xileno se montaron utilizando el kit X-TRA de medio de montaje no acuoso.
8.2. Bioquímica clínica
Para comprobar la posible toxicidad en órganos, se analizaron marcadores relevantes de páncreas, nefronas y hepatotoxicidad en muestras de suero.
Niveles de alanina aminotransferasa/transaminasa glutámico-pirúvica (GPT), aspartato aminotransferasa/transaminasa glutámico-oxalacética (GOT), gamma-glutamiltransferasa (gamma-GT), fosfatasa alcalina (AP), glutamato deshidrogenasa (GLDH), creatinina, creatinina quinasa (CK), urea, colinesterasa, bilirrubina, lipasa, alfa-amilasa, lactato deshidrogenasa (LDH), albúmina y proteína total se determinaron en la Universitatsmedizin der Johannes Gutenberg Universitat (Mainz, Alemania). Se prepararon muestras de suero a partir de sangre obtenida después del sangrado final. La sangre se recogió mediante punción venosa retrobulbar después de anestesiar a los ratones con ketamina/xilazina.
8.3. Estudios de eficacia
Para establecer tumores de xenoinjerto humanos, se suspendió un número apropiado de células en un volumen de 200 j l de PBS y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de ratones hembra Hsd:Athymic Nude-Foxnlnu. Los ratones portadores de tumores se trataron con una única inyección intravenosa de IMAB362-DM4 o IMAB362-vcMMAE en dosis que no excedían la MTD. El control de anticuerpos desnudos se administró quincenalmente alternando inyecciones IV/i.p. de ~8 mg/kg de IMAB362. En los primeros estudios de tratamiento, el tratamiento se inició 3 días después del injerto. En estudios de tratamiento avanzado, los tumores crecieron hasta un volumen de entre 50 y 200 mm3 y los ratones se redistribuyeron en grupos de control y de anticuerpos con volúmenes medios de tumor homogéneos antes del tratamiento. El peso corporal, la salud de los animales, el comportamiento y el tamaño del tumor se controlaron quincenalmente con un calibrador. Los volúmenes de los tumores se calcularon mediante la siguiente fórmula: [largo * ancho * (ancho/2)]. Un criterio de aborto fue un tamaño de tumor con >16 mm de largo o ancho o con un volumen calculado de >1400 mm3. Otros criterios de aborto fueron tumores ulcerosos o cuando el animal perdió más del 10% de su peso corporal. En caso de inhibición completa del crecimiento del tumor, se observó a los ratones durante 120 días después del tratamiento. Los tumores persistentes se prepararon y fijaron en formalina al 4% para estudios IHC posteriores.
9. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)
La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) se determinó midiendo el contenido de ATP intracelular en células no lisadas después de la adición de PBMC humanas a las células diana en presencia de conjugados de toxina IMAB362. Se utilizó bioluminiscencia generada por luciferasa para la cuantificación de ATP.
Se sembraron células diana NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 con números de células definidos (8 * 106 células) dos días antes del ensayo para obtener confluencias reproducibles.
Las células diana se recolectaron con tripsina/EDTA al 0,05% (Gibco, 25300-054) y se ajustaron a una concentración de 1,6 x 105 células/ml en medio de crecimiento que contenía HEPES 20 mM (Gibco, 15630-056). 8 * 103 Se sembraron células por pocillo en una placa de PP blanca de 96 pocillos y se incubaron durante aproximadamente 5 h a 37 °C y 5% de CO2.
Las PBMCs se prepararon a partir de capas leucocitarias frescas obtenidas de donantes sanos. Se diluyeron aproximadamente 20-25 ml de sangre (1:2) con PBS en 3 tubos Falcon y se colocaron cuidadosamente en capas sobre 15 ml de Ficol-Paque Plus (GE Healthcare, 17144003) en cuatro tubos Falcon de 50 ml. Los gradientes se centrifugaron (25 min, 700 x g, sin frenos). Después de la centrifugación, se recogieron PBMC de la interfase, se lavaron en 50 ml de PBS/EDTA2 mM, se centrifugaron (5 min, 468 x g), se resuspendieron nuevamente en 50 ml de PBS/EDTA 2 mM y se centrifugaron nuevamente (10 min, 208 x g) para eliminar las plaquetas. Los sedimentos se resuspendieron en 50 ml de PBS/EDTA 2 mM y se contaron las células. Posteriormente, las PBMCs se centrifugaron (5 min, 468 * g), se resuspendieron en medio de cultivo X-Vivo-15 (Lonza, BE04-418Q) que contenía suero humano al 5 % y se cultivaron durante 1,5 h a 37 °C, 5 % de CO2. Las PBMCs se recogieron, se centrifugaron (5 min, 468 xg) y se resuspendieron en medio de cultivo X-Vivo-15 (Lonza, BE04-418Q) ajustando la concentración celular (para una relación E:T de 40:1) a 1,28 x 107 células/ml. IMAB362-DM4, IMAB362-vcMMAE e IMAB362 se diluyeron en serie (pasos de dilución de 4,5 veces) 11 veces, dando como resultado un rango de concentración entre 160 pg/ml y 0,05 ng/ml (concentración final de 40 pg/ml a 0,01 ng/ml). Se añadieron 25 pl de cada dilución a las células diana y para cada condición se utilizaron cuadruplicados. Se añadió PBS sin anticuerpos a los pocillos de control de lisis total y medio. Posteriormente, 25 pl de las PBMCs preparadas (3,2 * 105 células) se añadieron a cada pocillo para lograr una relación E:T de 40:1 y las placas se incubaron durante 15 h ± 1 h a 37 °C, 5 % de CO2. Después de la incubación durante la noche, se añadieron 10 pl de solución Triton X-100/PBS al 8 % a los pocillos de control de lisis máxima y 10 pl de PBS a los otros pocillos. Finalmente, se agregaron 50 pl de solución madre de luciferina recién preparada (HEPES 160 mM, 1x PBS, D-luciferina 3,84 mg/ml (Sigma Aldrich, 50227)) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La bioluminiscencia se midió utilizando un luminómetro (Infinite M200, TECAN). Los resultados se expresan como unidades de luz relativas (RLU) digitales integradas.
La lisis específica se calcula como:
(muestra - lisis total)
lisis específica [% ] = 10 0 ------------------------------------------------ x 100
(máx. de células viables - lisis total)
(máximo de células viables: 10 pl de PBS, sin anticuerpo; lisis total: 10 pl de Triton X-100 al 8 % (v/v) en PBS, sin anticuerpo)
Todos los datos de ADCC se procesaron con GraphPad Prism 6 utilizando la función "registro (agonista) vs respuesta - buscar EC cualquier cosa". La lisis máxima se definió como el intervalo (diferencia de arriba a abajo) de la curva dosis-respuesta, pero como máximo del 100%.
10. Citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)
La citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se determinó midiendo el contenido de ATP intracelular en células no lisadas después de la adición de complemento humano a las células diana en presencia de conjugados de toxina IMAB362. Como lectura se midió la bioluminiscencia dependiente de ATP generada por la luciferasa.
Se sembraron células diana NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 o KATO-III FGF-BP#12 adM p3151#25 con números de células definidos (8 * 106 y 9*106 células, respectivamente) dos días antes del ensayo para obtener confluencias reproducibles.
Las células diana se recolectaron con tripsina/EDTA al 0,05% y se ajustaron a una concentración de 1,6 x 105 células/ml en su respectivo medio de cultivo que contiene 10% (v/v) de FCS. Se sembraron 8 * 103 células en una placa blanca de 96 pocillos y se incubaron a 37 ° C y 5% de CO2. Después de 24 h, se añadieron 50 pl de anticuerpos diluidos en serie en medio de ensayo (60 % RPMI, que contenía HEPES 20 mM; 40 % suero humano, combinado de varios donantes sanos) (concentración final de 80 pg/ml a 78,13 ng/ml) y las células se incubaron durante 80 min a 37 °C y 5% de CO2. Posteriormente, se agregaron 10 pl de Triton X-100 al 8 % (v/v) en PBS a los controles de lisis total, mientras que se agregaron 10 pl de PBS a todos los demás pocillos (controles de células viables máximas y las muestras reales). La reacción de luciferasa se inició añadiendo 50 pl de mezcla de luciferina (3,84 mg/ml de D-luciferina, HEPES 160 mM en ddH2O) por pocillo. La placa se mantuvo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 90 minutos y la bioluminiscencia se midió usando un luminómetro (Infinite M200, TECAN). Los resultados se expresan como unidades de luz relativas (RLU) digitales integradas.
La lisis específica se calcula como:
(muestra - lisis total)
lisis específica [% ] = 100 — ------------------------------------------------x 100
(máx. de células viables - lisis total)
(máximo de células viables: 10 |jl de PBS, sin anticuerpo; lisis total: 10 |jl de Tritón X-100 al 8% (v/v)en PBS, sin anticuerpo)
Todos los datos de la CDC se procesaron con GraphPad 6 utilizando la función "registro (agonista) frente a respuesta - buscar EC cualquier cosa". La lisis máxima se definió como el intervalo (diferencia de arriba a abajo) de la curva dosis-respuesta, pero como máximo del 100%.
Ejemplo 2: cribado en endocitosis de anticuerpos específicos ANTI-CLDN18.2
Mientras que en la terapia tumoral con anticuerpos desnudos, la internalización de anticuerpos unidos a la diana puede reducir la cantidad de anticuerpos unidos a la membrana accesibles para los principales modos de acción, por ejemplo, ADCC y CDC, la endocitosis es una característica esencial para el desarrollo de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). Una propiedad importante de los ADCs es la endocitosis del complejo objetivo-ADC. Por tanto, la tasa de endocitosis del anticuerpo desnudo es uno de los factores clave esenciales para el desarrollo de anticuerpos conjugados con toxina.
Se determinaron las propiedades de unión, es decir, la afinidad relativa con CLDN18.2, la reactividad cruzada con CLDN18.1 y el epítopo antigénico que media la especificidad de CLDN18.2, para diferentes anticuerpos anti-CLDN18.2 murinos y quiméricos mediante análisis de citometría de flujo (Tabla 5 y Tabla 6). Se seleccionaron anticuerpos que demostraban una alta unión a CLDN18.2 para una mayor detección de endocitosis.
La eficacia de la endocitosis de diferentes anticuerpos específicos de CLDN18.2 y reactivos de CLDN18.2/CLDN18.1 se probóin vitroincubando conjuntamente los anticuerpos con fragmentos Fab conjugados con saporina (Fab-ZAP) junto con CLDN18.2 que expresa células HEK293~CLDN18.2. Tras la internalización con el anticuerpo unido al objetivo, la saporina inhibe la biosíntesis de proteínas de la célula, lo que provoca la muerte celular, que puede controlarse mediante un ensayo de viabilidad celular. Este método es una forma indirecta de evaluar la endocitosis del complejo objetivo-anticuerpo. Los anticuerpos se probaron como anticuerpos quiméricos cuando estaban disponibles; de lo contrario, la detección de endocitosis se realizó con anticuerpos murinos.
El mAb362 quim. (IMAB362), así como el mAB294 quim., se pueden internalizar eficientemente tras la unión de CLDN18.2, lo que lleva a una reducción de la viabilidad de las células HEK293~CLDN18.2 incluso a concentraciones de anticuerpos muy bajas (IMAB362: EC50 = 11 ng/ml; mAB294 quim.: EC50 = 10 ng/ml). Por el contrario, mAB308 quim. y mAB359 quim. no redujeron la viabilidad celular (Figura 2). Como mAB294 quim. y mAB359 quim. exhiben afinidades de unión relativas similares y muestran discrepancias considerables en la internalización (mAB294 quim.: EC50 = 10 ng/ml; mAB359 quim.: sin endocitosis), la eficacia de la endocitosis parece no sólo correlacionarse con la afinidad de unión del anticuerpo sino que también depende del epítopo de unión.
Incluso la internalización de mu mAB362 fue superior a todos los demás anticuerpos reactivos CLDN18.2 murinos probados que no revelaron endocitosis sustancial en el ensayo Fab-Zap (Figura 3). En resumen, los anticuerpos específicos de CLDN18.2 IMAB362 y mAB294 quim. se internalizaron eficientemente al unirse a CLDN18.2 y son adecuados para una evaluación adicional como conjugados de fármaco-anticuerpo.
Tabla 5: Afinidad de unión relativa y especificidad de los anticuerpos reactivos CLDN18.2.La unión a CLDN18.2 (EC50 normalizada [%] y la unión máxima normalizada [%] están normalizadas a IMAB362) y la reactividad de CLDN18.1 se determinaron mediante citometría de flujo en células HEK293 que expresaban de manera estable la proteína respectiva. El epítopo antigénico responsable de la especificidad de CLDN18.2 se analizó mediante citometría de flujo en células HEK293T que sobreexpresaban transitoriamente el mutante CLDN18.2 correspondiente. n.a.: no analizado. Los anticuerpos marcados con el mismo número (1, 2, 3 o 4) se analizaron en el mismo ensayo de unión.
1-3: detección con anticuerpo secundario conjugado con APC; 4: detección con ProteinL-FITC; n.a:.no analizado.
Ejemplo 3: conjugación de toxina de IMAB362
Piramal Healthcare realizó la conjugación de la toxina, incluido el intercambio final del tampón. Se realizaron estudios de estabilidad para demostrar que los ADCs permanecen dentro de las especificaciones durante un período determinado si se almacenan en condiciones de almacenamiento definidas. IMAB362 se conjugó con MMAE mediante el enlazador escindible valina-citrulina (enlazador vc) o con DM4 mediante el enlazador escindible N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butirato (enlazador SPDB). Los conjugados de la toxina IMAB362 se almacenaron en tampón de almacenamiento (histidina 20 mM y sacarosa 85 mg/ml, pH 5,8) a 2-8 °C.
Tabla 7: Pruebas de estabilidad de 28 días de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE.DAR: relación de anticuerpo fármaco
IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE demuestran un alto contenido de monómero de >95 % y solo cantidades bajas de fármaco libre (<1 %). Las pruebas de estabilidad de 28 días de anticuerpos IMAB362 conjugados con toxina a una temperatura de almacenamiento de 2-8 °C muestran sólo una pequeña disminución del contenido de monómero y un bajo aumento del fármaco libre para ambos ADCs. Ambos anticuerpos se conjugaron eficientemente y exhiben una proporción de fármaco a anticuerpo de 3,2 para IMAB362-DM4 y 4,5 para IMAB362-vcMMAE (Tabla 7).
Ejemplo 4: unión de IMAB362-ADCS
Las propiedades de unión de IMAB362 se han probado en detalle antes:
IMAB362 se une al primer bucle extracelular de la variante 2 de empalme de claudina 18 (CLDN18.2).
La afinidad por CLDN18.2 está en el rango nanomolar bajo.
No se observó reactividad cruzada con ningún tipo de célula o tejido negativo para CLDN18.2.
No hay reactividad cruzada con el miembro más cercano de la familia Claudina 18, variante de empalme 1 (CLDN18.1). Las afinidades de unión relativas de los anticuerpos IMAB362 conjugados con DM4- y MMAE se compararon con IMAB362 no conjugado mediante citometría de flujo utilizando líneas celulares que expresan CLDN18.2 de forma endógena y ectópica. Las propiedades de unión se probaron a diferentes concentraciones de anticuerpos en un rango de 0,1 a 20 pg/ml (Figura 4, Tabla 8).
Tabla 8: Descripción general de los ensayos de unión realizados con conjugados de toxina IMAB362 en líneas celulares positivas para CLDN18.2.Bmáx: unión máxima, MFI: intensidad media de fluorescencia
En comparación con IMAB362 no conjugado, IMAB362 conjugado con DM4- y MMAE mostró afinidades de unión relativas ligeramente reducidas en células que expresan CLDN18.2 de forma endógena y ectópica (Figura 4, Tabla 8). Ambos anticuerpos conjugados con toxina tenían valores de EC50 muy similares, pero valores de unión máxima ligeramente diferentes en los que IMAB362-DM4 exhibió una unión máxima más alta (Tabla 8).
La unión mediada por CLDN18.2 de anticuerpos conjugados con toxina IMAB362 se probó en células que sobreexpresan CLDN18.2 ectópicamente y en las correspondientes líneas celulares parentales negativas para CLDN18.2 (Figura 5, Tabla 8).
La unión de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE depende estrictamente de la presencia de su molécula objetivo CLDN18.2 (Figura 5). La especificidad de unión se analizó mediante citometría de flujo utilizando transfectantes HEK293 diseñados para sobreexpresar CLDN18.2 humano o la proteína CLDN18.1 humana altamente homóloga. Se utilizaron células simuladas HEK293~ como controles negativos (Figura 6, Tabla 8).
IMAB362 y los anticuerpos conjugados con toxina IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE se unieron con afinidades relativas similares a células HEK293~CLDN18.2 que expresan ectópicamente CLDN18.2 humano (Tabla 8). Además, IMAB362, IMAB362 conjugado con DM4- y MMAE no mostró reactividad cruzada con CLDN18.1 humano o células transfectadas simuladas (Figura 6B y C).
Ejemplo 5: eficacia y especificidad de IMAB362-ADCSin vitro
1. Influencia en la viabilidad celular.
La influencia de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE en la viabilidad celular se probó con varias líneas celulares de cáncer gástrico y pancreático humano que expresan CLDN18.2 de forma endógena y ectópica utilizando un ensayo colorimétrico basado en XTT para la cuantificación espectrofotométrica de células metabólicamente activas. Las actividades antitumorales se probaron a diferentes concentraciones de anticuerpos en un rango de 3 a 16875 ng/ml (Figura 7, Tabla 9).
IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE inhibieron eficientemente la viabilidad de la línea celular de cáncer gástrico NUGC-4, NCI-N87~CLDN18.2 y la línea celular pancreática BxPC-3~CEDN18.2in vitro(Figura 7). Ambos conjugados IMAB362-toxina inhibieron la viabilidad celular de células NUGC-4 que expresan endógenamente CLDN18.2 (valores de EC50: 155 - 631 ng/ml, reducción máxima de viabilidad: > 85%) y células CLDN18.2 que expresan ectópicamente BxPC-3~CEDN18.2 (valores de EC50: 43 - 54 ng/ml, reducción máxima de viabilidad: > 83%) y células NCI-N87~CLDN18.2 (valores EC50: 75 - 180 ng/ml, reducción máxima de viabilidad: 45 - 61%) en concentraciones similares (Figura 7, Tabla 9).
Tabla 9<:>Descripción general de los ensayos de viabilidad celular realizados con conjugados de toxina IMAB362 en líneas celulares positivas para CLDN18.2.
Además, se probó la actividad antitumoral mediada por diana de un conjugado de toxina IMAB362in vitroutilizando la línea celular negativa NCI-N87 CLDN18.2 y la línea celular NCI-N87~CLDN18.2 transfectada de forma estable (Figura 8). IMAB362-vcMMAE inhibió la viabilidad celular solo en células CLDN18.2 positivas pero no en células CLDN18.2 negativas. Por lo tanto, la actividad de IMAB362-vcMMAE depende estrictamente de la expresión de CLDN18.2 (Figura 8).
La especificidad de los anticuerpos IMAB362 conjugados con toxina se analizó utilizando transfectantes HEK293 que sobreexpresan CLDN18.2 humano o la proteína CLDN18.1 humana altamente homóloga. Se utilizaron células HEK293 transfectadas de forma estable con el vector vacío como controles negativos (Figura 9). IMAB362-vcMMAE reduce la viabilidad celular en células CLDN18.2 positivas pero no en células CLDN18.2 negativas. El efecto es estrictamente específico de CLDN18.2 porque no se pudo observar inhibición de la proliferación celular en células que expresan la proteína homóloga 18.1 (Figura 9).
En resumen, IMAB362-vcMMAE e IMAB362-DM4 mostraron eficacias similaresin vitroy ambos ADCs inhibieron de manera muy eficiente la viabilidad celular de varias líneas celulares de cáncer gástrico y pancreático humano. El efecto depende estrictamente de la expresión objetivo.
2. Efecto del espectador
La actividad de los espectadores de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAEin vitrose determinó utilizando cultivos mixtos de células tumorales que consisten en líneas celulares CLDN18.2 positivas y negativas. Se utilizaron células PA-1(Luc) diana negativas que expresaban establemente luciferasa de luciérnaga como células informadoras para medir la lisis celular.
La actividad luciferasa de cocultivos de luciferasa que expresa PA-1(Luc) y células NUGC-4 negativas para luciferasa mostró que el tratamiento con IMAB362-DM4 o IMAB362-vcMMAE eliminó las células PA-1(Luc) diana negativas de manera muy eficaz en presencia de células NUGC-4 positivas al objetivo. Además, las células PA-1(Luc) no se vieron afectadas en ausencia de células que expresan CLDN18.2 (Figura 10).
En resumen, las ADCs IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE pudieron inducir un efecto espectador en las células tumorales vecinas CLDN18.2-negativas. Ambas toxinas se liberaron eficientemente de IMAB362 dentro de las células cancerosas positivas para CLDN18.2 y, debido a la permeabilidad de su membrana, pueden ejercer actividad citotóxica en las células circundantes.
Ejemplo 6: eficacia antitumoral de IMAB362-ADCSin vivo
1. Estudios de dosis máxima tolerada
En un primer experimentoin vivo,la dosis máxima tolerada (MTD) de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE se determinó en ratones lampiños con tumores de xenoinjerto pancreático humano avanzado BxPC-3~CLDN18.2. La MTD se refiere a la dosis más alta en un tratamiento que producirá el efecto deseado sin una toxicidad inaceptable.
1.1. MTD de IMAB362-DM4
Se inyectaron por vía subcutánea células BxPC-3~CLDN8.2 que expresaban ectópicamente CLDN18.2 humano en el flanco de ratones hembra Hsd:Athymic Nude-Foxnlnu. Después de que los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 75 ± 13 mm3 (media ± SD) el día 13, los ratones se agruparon en grupos de control y de anticuerpos. Los ratones recibieron una dosis única de 7,5 o 15 mg/kg de IMAB362-DM4 mediante inyección en bolo intravenoso el día 14 o dosis repetidas de 15 mg/kg de IMAB362-DM4 mediante inyecciones en bolo intravenoso el día 14 y el día 21, respectivamente. Los ratones del grupo de control recibieron el vehículo el día 14. El día 49 después del injerto, se sacrificaron los animales. Para realizar pruebas de toxicidad, se recolectaron muestras de sangre y se prepararon y almacenaron órganos para estudios histopatológicos adicionales.
Crecimiento tumoral:
IMAB362-DM4 inhibió el crecimiento tumoral en ratones con tumores de xenoinjerto humanos avanzados BxPC-3 ~ CLDN8.2. Los tratamientos únicos o repetidos con IMAB362-DM4 dieron como resultado regresiones tumorales casi completas en todos los ratones tratados durante el período de observación del estudio (49 días), independientemente de la dosis. Por tanto, una dosis única de 7,5 mg/kg de IMAB362-DM4 podría ser suficiente para la remisión completa del tumor (Figura 11).
Estado de salud:
Se controlaron el peso corporal, el comportamiento de los animales y el estado de salud general dos veces por semana. Todos los animales mostraron un peso corporal normal durante todos los experimentos (Figura 12). No se observaron anomalías de comportamiento. Sin embargo, un animal murió después de la aplicación intravenosa de la segunda dosis de 15 mg/kg de IMAB362-DM4 por motivos desconocidos.
Química Clínica:
Se determinaron los niveles séricos de alanina transaminasa (GPT), aspartato transaminasa (GOT), glutamato deshidrogenasa (GLDH), fosfatasa alcalina (AP), a-amilasa, colinesterasa, creatinina quinasa (CK), lactato deshidrogenasa (LDH), lipasa, urea, glucosa, proteínas totales y albúmina. No se detectaron diferencias entre el vehículo y los grupos IMAB362-DM4 (Figura 13). La creatinina y la gamma-glutamil transferasa estuvieron por debajo del límite de detección en todos los grupos (datos no mostrados). Todos los animales de todos los grupos mostraron niveles séricos normales de marcadores sustitutos probados para toxicidad hepato, nefrona o pancreática incluso después de dosis repetidas de 15 mg/kg de IMAB362-DM4.
En resumen, 15 mg/kg de IMAB362-DM4 (equivalente a 45 mg/m2 en humanos) como administración única fueron bien tolerados en ratones y demostraron una alta eficacia antitumoral en el tratamiento de xenoinjertos positivos para CLDN18.2. Debido a las limitaciones de concentración y volumen de inyección, la inyección intravenosa de dosis más altas no fue factible y no se pudo determinar la dosis única máxima tolerada.
Análisis histológico:
Para el análisis histológico, se tiñeron con hematoxilina-eosina secciones en parafina de cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, páncreas, bazo y estómago y se examinaron microscópicamente para detectar cambios morfológicos mediados por IMAB362-vcMMAE. No se pudieron observar cambios morfológicos en secciones de tejido de animales tratados con IMAB362-DM4 en comparación con ratones tratados con vehículo. En particular, el estómago, el único tejido que expresa Cldn18.2 murino, no demostró daño tisular mediado por terapia con anticuerpos (Figura 14).
1.2. MTD de IMAB362-vcMMAE
La MTD de IMAB362-vcMMAE se probó utilizando el mismo modelo de ratón que para IMAB362-DM4 (1.1). Los ratones se agruparon después de que los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 111 ± 27 mm3 (media ± SD) el día 13 y tratados con una única inyección intravenosa en bolo de 8 o 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE (equivalente a 24 y 48 mg/m2 en humanos) el día 14 o con dosis repetidas de inyecciones en bolo IV de 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE los días 14 y 21. Los ratones del grupo de control recibieron control del vehículo el día 14. Los animales fueron sacrificados el día 37. Se determinó la bioquímica clínica y los órganos se recolectaron y almacenaron para estudios histopatológicos adicionales.
Crecimiento tumoral:
El tratamiento con IMAB362-vcMMAE indujo la regresión tumoral e inhibió aún más el crecimiento tumoral en ratones con tumores de xenoinjerto humanos avanzados BxPC-3~CLDN8.2. Al final del estudio (37 días), los tratamientos únicos o repetidos con IMAB362-vcMMAE dieron como resultado regresiones tumorales casi completas en todos los ratones tratados, independientemente de la dosis. Por lo tanto, una dosis única de 8 mg/kg de IMAB362-vcMMAE podría ser suficiente para la remisión completa del tumor (Figura 15).
Estado de salud:
Se controlaron el peso corporal, el comportamiento de los animales y el estado de salud general dos veces por semana. Todos los animales mostraron un peso corporal normal durante todos los experimentos (Figura 16). Dos animales (un ratón del grupo SD y RD) estuvieron apáticos durante un corto tiempo directamente después de la primera inyección de 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE. Sin embargo, este comportamiento anormal no se observó en ningún otro animal ni después de la segunda aplicación de IMAB362-vcMMAE.
Química Clínica:
Se determinaron los niveles séricos de marcadores sustitutos de toxicidad hepato, nefro o pancreática (alanina transaminasa (GPT), aspartato transaminasa (GOT), glutamato deshidrogenasa (GLDH), fosfatasa alcalina (AP), alfaamilasa, colinesterasa, creatinina quinasa (CK), lactato deshidrogenasa (LDH), lipasa, urea, glucosa, proteínas totales y albúmina). En comparación con el grupo de control del vehículo, no se observaron desviaciones importantes de los marcadores sustitutos del suero en los animales tratados con IMAB362-vcMMAE (Figura 17). La creatinina y la gamma-glutamil transferasa estuvieron por debajo del límite de detección en todos los grupos. Por lo tanto, en la bioquímica clínica no se observan signos de hígado, páncreas o nefrotoxicidad en el rango de dosis evaluado.
Análisis histológico:
Para el análisis histológico, se tiñeron con hematoxilina-eosina secciones en parafina de cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, páncreas, bazo y estómago y se examinaron microscópicamente para detectar cambios morfológicos mediados por IMAB362-vcMMAE.
No se pudieron observar cambios morfológicos relacionados con IMAB362-vcMMAE en secciones de tejido de animales tratados con IMAB362-vcMMAE en comparación con ratones tratados con vehículo, lo que indica que IMAB362-vcMMAE no induce daño tisular ni inflamación. En particular, incluso el estómago, el único tejido que expresa Cldn18.2 murino, no demostró daño tisular mediado por terapia con anticuerpos (Figura 22).
2. Estudios de eficacia
Se analizaron adicionalmente los efectos antitumorales de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAEin vivoen ratones Nude-Foxn1nu atímicos injertados por vía subcutánea con células de carcinoma humano que expresan CLDN18.2 de forma endógena o ectópica. La dosis terapéutica óptima de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE en modelos de tumores animales se determinó en estudios de búsqueda de rangos de dosis (Figura 18 y Figura 20, respectivamente). Se realizaron más estudios de eficacia en tumores de xenoinjertos humanos con la dosis óptima de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE (Figura 19 y Figura 21, respectivamente).
IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE inhiben de manera muy significativa el crecimiento tumoral y mejoran la supervivencia de ratones portadores de tumores en diferentes modelos tempranos de xenoinjerto (inicio de la terapia 3 días después de la implantación del tumor), así como en tratamientos de tumores sólidos avanzados (inicio de la terapia a -100 mm3 tamaño del tumor).
Tratamiento de tumores de xenoinjerto gástrico humanos avanzados NCI-N87~CLDN18.2:
En un estudio de búsqueda de rango de dosis, se analizó la eficacia antitumoral de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE en ratones con tumores de xenoinjerto NCI-N87~CLDN18.2 positivos para CLDN18.2 avanzados. 13 días después del injerto, los animales se trataron con 15,2, 7,6 o 3,8 mg/kg de IMAB362-DM4 o 16, 8 o 4 mg/kg de IMAB362-vcMMAE o el control del vehículo aplicado como inyecciones únicas en bolo IV. Los animales del grupo de control recibieron 8 mg/kg de IMAB362 no conjugado (dos veces por semana, IV/i.p.).
IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE inhibieron de manera muy significativa el crecimiento tumoral, mediaron la regresión tumoral y prolongaron la supervivencia de ratones portadores de tumores de una manera dependiente de la dosis, mientras que el anticuerpo desnudo IMAB362 en este modelo de tratamiento avanzado no exhibió efectos antitumorales estadísticamente significativos (Figura 18). Ambos anticuerpos conjugados con la toxina IMAB362 prolongaron la supervivencia de ratones con tumores (supervivencia media: 73 días en el grupo de vehículo en comparación con 143 días en el grupo de IMAB362-vcMMAE 16 mg/kg y 136 días en el grupo de IMAB362-DM4 15,2 mg/kg) (Figura 18).
Tratamiento de tumores de xenoinjerto gástrico NUGC-4 10cF7-5 sort3a humanos tempranos:
La eficacia antitumoral de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE se analizó en ratones injertados por vía subcutánea con células de carcinoma gástrico NUGC-4 10cF7-5 sort3a que expresan endógenamente CLDN18.2. Los animales se trataron el día 3 después del injerto mediante una inyección IV de dosis única de 15,2 mg/kg de IMAB362-DM4, 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE o control de vehículo.
IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE impidieron el crecimiento tumoral en los animales tratados, mientras que todos los ratones del grupo control desarrollaron tumores (p<0,0001) (Figura 19). Después del tiempo de observación predefinido de 120 días, 9 de cada 10 animales que recibieron IMAB362-DM4 o IMAB362-vcMMAE estaban vivos y libres de tumores, mientras que todos los animales del grupo de control con vehículo tuvieron que ser sacrificados debido a los criterios de aborto a más tardar el día 41 después del injerto (mediana de supervivencia 34 días, p<0,0003) (Figura 19).
Tratamiento de tumores de xenoinjerto pancreático humano avanzado BxPC-3~CLDN18.2:
La actividad antitumoral dependiente de la dosis de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAEin vivose analizó en un estudio de búsqueda de rango de dosis en ratones con tumores de xenoinjerto pancreático humano avanzado BxPC-3~CLDN18.2. Los animales se trataron el día 14 con 15,2, 7,6 o 3,8 mg/kg de IMAB362-DM4, 16, 8 o 4 mg/kg de IMAB362-vcMMAE, vehículo administrado como inyecciones IV en bolo único o con dosis repetidas de 8 mg/kg de IMAB362 (dos veces una semana, IV/i.p.).
IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE inhibieron de manera muy significativa el crecimiento tumoral, mediaron la regresión tumoral y prolongaron la supervivencia de ratones portadores de tumores de una manera dependiente de la dosis. Por el contrario, IMAB362 no conjugado no mostró actividades antitumorales estadísticamente significativas en este modelo de tumor avanzado (Figura 20). Ambos anticuerpos conjugados con toxina IMAB362 prolongaron de manera muy significativa la supervivencia de ratones con tumores (supervivencia media: 48 días en el grupo de vehículo en comparación con 98,5 días en el grupo de IMAB362-vcMMAE 16 mg/kg y 81 días en el grupo de IMAB362-DM4 15,2 mg/kg) (Figura 20).
Tratamiento de los tumores de xenoinjerto pancreático DAN-G 1C5F2 humanos tempranos:
La actividad antitumoral de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAEin vivose probó en ratones a los que se les injertaron por vía subcutánea células de carcinoma de páncreas DAN-G 1C5F2 que expresaban endógenamente CLDN18.2. Las células DAN-G 1C5F2 tienen sólo cantidades extremadamente bajas de CLDN18.2 en la superficie celular; aunque se pueden detectar cantidades considerables de proteína o ARN mediante inmunotransferencia o qRT-PCR. Los análisis IHC de tumores de xenoinjerto DAN-G 1C5F2 demostraron que solo una subpoblación de células tumorales mostró tinción CLDN18.2 asociada a membrana de moderada a fuerte. Por lo tanto, los tumores de xenoinjerto DAN-G 1C5F2 podrían ser adecuados para el tratamiento con conjugados de anticuerpos y fármacos que exhiben muerte por parte de los espectadores. Los animales se trataron el día 3 después del injerto mediante una inyección intravenosa de dosis única de 15,2 mg/kg de IMAB362-DM4, 16 mg/kg de IMAB362-<vcm>M<a>E o control de vehículo.
IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE inhibieron de manera muy significativa el crecimiento tumoral y prolongaron la supervivencia de ratones portadores de tumores en comparación con el control del vehículo (Figura 21). En la mayoría de los ratones (> 50%) se evitó por completo el crecimiento del tumor. Después del período de observación de 120 días, 2 de 7 animales en el grupo de tratamiento IMAB362-DM4 (supervivencia media de 87 días, p=0,0002) y 4 de 7 animales en el grupo de tratamiento IMAB362-vcMMAE todavía estaban vivos (supervivencia no definida, p=0,0006), mientras que todos los animales del grupo del vehículo tuvieron que ser sacrificados dentro de los 31 días debido a criterios de aborto como la caquexia por cáncer (supervivencia media de 24 días) (Figura 21). Tanto IMAB362-DM4 como IMAB362-vcMMAE inhiben significativamente el crecimiento tumoral y prolongan la supervivencia de ratones con tumores de xenoinjerto que exhiben una expresión heterogénea de CLDN18.2.
En resumen, los tumores con expresión baja y/o heterogénea de CLDN18.2 (por ejemplo, tumores de xenoinjerto NUGC-4 y DAN-G) se pueden tratar eficazmente con IMAB362-DM4 o IMAB362-vcMMAE y una gran parte de los animales portadores de tumores se curaron. Las actividades antitumorales de ambos ADCs se pueden explicar mediante el efecto espectador: La liberación de formas de DM4 y MMAE permeables a la membrana celular después del procesamiento celular facilita la destrucción de las células tumorales vecinas incluso si son dianas negativas. Por lo tanto, ambos ADCs son muy eficaces para erradicar tumores que contienen sólo fracciones de células CLDN18.2 positivas.
Ejemplo 7: inducción de apoptosis
La citotoxicidad de IMAB362 conjugado con toxina se evaluó mediante ensayos de apoptosis que midieron la actividad de caspasa 3/7 y la externalización de fosfatidilserina. La activación de caspasa representa uno de los primeros marcadores medibles de apoptosis, que es importante para el inicio de la muerte celular programada (Henkart 1996). La actividad de caspasa 3/7 se determinó en un ensayo basado en luciferasa mediante la escisión de un sustrato proluminógeno específico de caspasa 3/7. Otro evento temprano en la apoptosis fue monitorizado mediante citometría de flujo usando anexina V conjugada con fluorescencia (Vermes et al. 1995). La anexina V se une específicamente a la fosfatidilserina que se transloca desde la valva interna de la membrana plasmática a la valva externa inmediatamente después de la inducción de la apoptosis. Para discriminar entre células vivas y muertas, las células se co-tiñen con el tinte de ADN yoduro de propidio (PI).
Para analizar la inducción de la apoptosis, se trataron células NUGC4 positivas para CLDN18.2 con una dosis única de conjugados de toxina IMAB362 durante varios días. Las células no tratadas y las células tratadas con IMAB362 no conjugado sirvieron como controles (Figura 23). Después de 3 días, las células tratadas con IMAB362-DM4 o IMAB362-vcMMAE mostraron actividades de caspasa 3/7 aumentadas, mientras que la incubación con el anticuerpo desnudo no influyó en la actividad de caspasa (Figura 23A). La co-tinción con anexina V y PI se utilizó como parámetro independiente para verificar la inducción de apoptosis por anticuerpos IMAB362 conjugados con toxina. 4 días después del tratamiento, se encontró que aproximadamente el 50 % de las células tratadas con IMAB362-DM4- o IMAB362vcMMAE eran positivas para anexina V o anexina V/PI, lo que indica que la muerte celular se produjo mediante la inducción de apoptosis. Por el contrario, IMAB362 desnudo sin entrecruzamiento no induce apoptosis en el rango de concentración aplicado (Figura 23B). En resumen, el tratamiento de células tumorales positivas para CLDN18.2 con IMAB362 conjugado con DM4 o vcMMAE induce la apoptosis.
Ejemplo 8: tratamiento de tumores de xenoinjerto gástrico avanzado NUGC-4 10CF7-5 SORT3A humanos
La eficacia antitumoral de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE se analizó en ratones injertados por vía subcutánea con células de carcinoma gástrico NUGC-4 10cF7-5 sort3a que expresan endógenamente CLDN18.2. Los animales con tumores avanzados (tamaño tumoral de ~200 mm3) se trataron el día 10 después del injerto mediante inyección intravenosa de 15,2 mg/kg de IMAB362-DM4, 16 mg/kg de IMAB362-vcMMAE o control de vehículo y después de la recurrencia de tumores en los grupos tratados con conjugado IMAB362 mediante una segunda inyección del fármaco respectivo (día 38).
IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE inhibieron significativamente el crecimiento tumoral y mediaron la regresión tumoral en todos los animales tratados (día 52), mientras que todos los ratones del grupo control desarrollaron tumores (IMAB362-DM4: p<0,05; IMAB362-vcMMAE: p<0,001) (Figura 24). 28 días después de la terapia (día 38 después del injerto), se observó crecimiento tumoral recurrente (tamaño del tumor >~100 mm3) en el 50 % de los animales del grupo tratado con IMAB362-DM4. La segunda inyección de los respectivos IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE nuevamente resultó en la remisión parcial o completa de los tumores. Finalmente se observó crecimiento tumoral recurrente en 7 de 8 animales en el grupo IMAB362-DM4 y en 4 de 8 animales en el grupo IMAB362-vcMMAE. Después del final del tratamiento predefinido (día 108 después del injerto), 4 de 8 animales en el grupo IMAB362-vcMMAE y un animal en el grupo IMAB362-DM4 e IMAB362 estaban vivos, mientras que todos los animales del grupo vehículo murieron más tarde el día 52 después del injerto (supervivencia media de 32,5 días para vehículo, 90 días para IMAB362-DM4 (p<0,0003 frente a vehículo) e indefinida para IMAB362-vcMMAE (p<0,0003 frente a vehículo)) (Figura 24).
Ejemplo 9: inducción de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC)
Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC):
Las actividades ADCC de los anticuerpos IMAB362 conjugados con DM4 y MMAE se compararon con IMAB362 no conjugado usando células de carcinoma de estómago humano NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 que expresan endógenamente CLDN18.2 (Figura 25, Tabla 10).
Tabla 10: Actividad ADCC de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE en células NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10
Donante IMAB362 IMAB362-DM4 IMAB362-vcMMAE
Ambos anticuerpos conjugados con toxina, IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE, exhibieron valores de EC50 y de lisis máxima similares en comparación con el anticuerpo no conjugado IMAB362, lo que indica que la actividad de ADCC se mantuvo después de la conjugación del fármaco.
Citotoxicidad dependiente del complemento (CDC):
Las actividades CDC de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE se analizaron en células de carcinoma de estómago humano NUGC-4 10cF7_5 sort3A p3151#10 y KATO-III FGF-BP#12 adM p3151#25 que expresan endógenamente CLDN18.2 (Figura 26, Tabla 11).).
Tabla 11: Actividad CDC de IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE en células de carcinoma que expresan endógenamente CLDN18.2.
La actividad de CDC no se vio afectada por la conjugación de las toxinas con el anticuerpo IMAB362. Ambos anticuerpos conjugados con toxina, IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE, exhibieron valores de EC50 y de lisis máximos al menos similares en comparación con el anticuerpo no conjugado IMAB362.
Por lo tanto, IMAB362-DM4 e IMAB362-vcMMAE combinan la citotoxicidad mediada por toxinas con la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la citotoxicidad dependiente del complemento, los principales modos de acción del IMAB362 no conjugado, mejorando así la actividad terapéutica general.
Hoja Adicional para Material Biológico
Identificación de depósitos adicionales:
1) El nombre y dirección de la institución depositará de los depósitos (DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748) son:
DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH
Mascheroder Weg 1b
38124 Brunswick
DE
2) El nombre y dirección de la institución depositaria de los depósitos (DSM ACC2808, DSM ACC2809, DSM ACC2810) son:
DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH
InhoffenstraJe. 7B
38124 Brunswick
DE
Indicaciones adicionales para todos los depósitos mencionados anteriormente:
Mieloma P3X63Ag8U.1 de ratón (Mus musculus) fusionado con esplenocitos de ratón (Mus musculus) Anticuerpo secretor de hibridoma contra claudina-18A2 humana
3) Depositante:
Todas las declaraciones antes mencionadas fueron hechas por:
Ganymed Pharmaceuticals AG
FreiligrathstralJe 12
55131 Maguncia
DE

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de anticuerpo-fármaco para uso en el tratamiento de un cáncer que expresa CLDN18.2 mediante la administración del conjugado de anticuerpo-fármaco a un paciente, comprendiendo dicho conjugado de anticuerpofármaco un anticuerpo que se une a CLDN18.2 unido covalentemente con al menos una fracción de fármaco de toxina, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39; y
(b) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35,
en donde el anticuerpo está unido a la fracción del fármaco de toxina mediante un enlazador escindible que es escindible mediante una proteasa intracelular y opcionalmente en donde la fracción del fármaco de toxina es un agente citotóxico o citostático.
2. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por s Eq ID NO: 32 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39.
3. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 o 51 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24.
4. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por<s>E<q>ID NO: 30 y una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35.
5. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la fracción del fármaco de toxina es un maitansinoide o una auristatina, en donde el maitansinoide se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en DM1 y DM4 y, en donde la auristatina se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en monometil auristatina E (MMAE) y monometil auristatina F (MMAF).
6. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el enlazador es un enlazador escindible por catepsina.
7. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el enlazador comprende un dipéptido.
8. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso de la reivindicación 7, en donde el dipéptido es val-cit o phe-lys.
9. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además administrar cirugía, quimioterapia y/o radioterapia.
10. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el cáncer es un adenocarcinoma, en particular un adenocarcinoma avanzado.
11. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vesícula biliar y metástasis de los mismos, un tumor de Krukenberg, metástasis peritoneal y/o metástasis en ganglios linfáticos.
12. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de estómago, cáncer de esófago, en particular el esófago inferior, cáncer de la unión eso-gástrica y cáncer gastroesofágico.
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