ES2944081T3 - Vacunas OMV - Google Patents

Abstract

La invención se encuentra en el campo de las vesículas de membrana externa (OMV) y sus usos. Más particularmente, la presente invención proporciona OMV obtenida de una bacteria que es un mutante ompA y/o un mutante en uno o más componentes del complejo Tol-Pal y que presenta un antígeno heterólogo en su superficie. El antígeno heterólogo se selecciona del grupo que consiste en Chlamydia trachomatis CT823, CT681, CT372, CT443, CT043, CT733, CT279, CT601 y CT153 para el tratamiento, prevención o diagnóstico de la infección por Chlamydia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vacunas OMV

Campo técnico

La invención está en el campo de vesículas de membrana externa que presentan un antígeno heterólogo sobre su superficie y sus usos.

Antecedentes

C. trachomatis es una bacteria Gram negativa que es un patógeno intracelular obligado. Es una causa común de infecciones del tracto urogenital, que lleva a una enfermedad inflamatoria pélvica (el 10-20 % de los casos), infertilidad y embarazo ectópico. Tales afecciones son comunes en los países industrializados y están causadas por los serotipos D-K.

C. trachomatis también es la causa principal de infecciones oculares, que dan como resultado tracoma (150 millones de casos al año) y ceguera (6 millones de casos al año), principalmente en países en desarrollo. Estas afecciones las causan los serotipos AC. La infección con los serotipos L1-l3 de C. trachomatis provoca linfogranuloma venéreo.

El desarrollo de vacunas se ha identificado como esencial para controlar la infección por C. trachomatis. Las vacunas contra C. trachomatis parecen depender de una respuesta inmunitaria mediada por células Th1 polarizadas, en particular, linfocitos CD4+ que producen IFN-^y. Por ejemplo, la reducción de los células T CD4+ en ratones da como resultado la pérdida de inmunidad protectora [1], y la transferencia adoptiva de células T CD4+ específicas de Chlamydia confiere protección frente a la exposición a C. trachomatis ([2], [3]). Además, los estudios recientes informan de que la infección por C. trachomatis en ratones induce una respuesta inmunitaria protectora de Th1-CD4, lo que indica que los antígenos importantes de Chlamydia se procesan y se presentan a través de la vía del MHC de clase II ([4]; [5]).

Es probable que la protección inmunitaria contra la infección por C. trachomatis esté mediada por la inmunización con proteínas de C. trachomatis que son dianas de células T CD4+ y que son capaces de inducir respuestas de células B. Se ha demostrado que las células B y los anticuerpos son importantes para potenciar la respuesta protectora de las células T efectoras contra infección primaria [6]. Los linfocitos B y los anticuerpos también desempeñan un papel importante en la resolución de la infección secundaria ([7], [8]).

Los anticuerpos neutralizantes han demostrado que desempeñan un papel importante en la protección frente a la infección por Chlamydia.

Muchos estudios sobre el candidato de vacuna más prometedor (la proteína principal de la membrana externa, PPME) han demostrado que es probable que una vacuna eficaz se base en varios antígenos de C. trachomatis. Las proteínas homólogas CT823 de Chlamydia trachomatis (Ct) y TC0210 de Chlamydia muridarum (Cm) se anotan como serina proteasas y comparten una identidad de secuencia del 93,36 por ciento. Los estudios previos, con análisis de espectrometría de masas y citofluorometría sobre CT823 han confirmado su localización sobre la superficie de la bacteria [9]. El antígeno CT823 es capaz de inducir una respuesta específica de Th1-CD4 en esplecnocitos aislados de ratones infectados por C. trachomatis y se ha predicho que contienen epítopos del MHC de clase II ([10]; [11]).

Es un objeto de la invención proporcionar un vehículo para administrar antígenos tales como el CT823 de Chlamydia en formulaciones de vacuna.

DIVULGACIÓN

La presente invención proporciona una vesícula de membrana externa (OMV) que presenta un antígeno heterólogo en su superficie, en la que la OMV se obtiene a partir de una bacteria Gram negativa que es un mutante ompA, en la que la bacteria no expresa la proteína OmpA y, además, puede estar mutada en uno o más componentes del complejo Tol-Pal. El complejo Tol-Pal se muestra en la Figura 1a.

Las bacterias Gram negativas desprenden de forma natural OMV que se liberan en el medio de crecimiento. Los antígenos heterólogos se expresan en las bacterias Gram negativas de manera que se ensamblan en la membrana que después se libera en el sobrenadante del cultivo. Las VME de las bacterias Gram negativas son representativas de la membrana externa y de los compartimentos periplásmicos bacterianos y permiten la presentación de proteínas de membrana en su composición y conformación natural. Como las VME llevan las proteínas recombinantes en la conformación adecuada, representan una excelente elección como vehículos de administración para proteínas heterólogas de membrana.

El uso de OMV para expresar proteínas de la membrana externa se describe en el documento WO 2002/062380 (GlaxoSmithKline Biologicals S.A.). El documento WO 2002/062380 desvela una VME de bacteria Gram negativa que presenta en su superficie una o más proteínas de la membrana externa de Chlamydia. Es sabido que es preferente la presentación de la proteína de membrana externa PorB de C. trachomatis. También se ha descrito la presentación de las proteínas de la membrana externa PmpG y MOMP de C. trachomatis.

El documento WO 2002/062380 describe procedimientos para optimizar la proteína de membrana externa (OMP) y la composición de LPS de vacunas de OMV ("ampolla") por la deleción de ^o M^p variables inmunodominantes, así como también OMP no de protección, creando OMP conservadas mediante la deleción de regiones variables, mediante la regulación por acumulación de la expresión de las OMP y mediante la eliminación de los mecanismos de control para la expresión de OMP de protección.

El documento WO 2006/046143 (Novartis Vaccines & Diagnostics, SRL) desvela que la alteración de las trayectorias implicadas en la degradación del peptidoglicano (la capa de mureína) da bacterias que liberan vesículas en su medio de cultivo, y que estas vesículas son ricas en proteínas de membrana externa inmunogénicas y pueden generar respuestas inmunitarias bactericidas de amplio alcance. En particular, los inventores del documento WO 2006/046143 descubrieron que la supresión del homólogo meningocócico de mltA da bacterias que liberan de manera espontánea vesículas que son ricas en proteínas de la membrana externa inmunogénicas y que pueden generar respuestas de anticuerpos con reactividad cruzada con mayores títulos bactericidas que las ^v M^e preparadas mediante procesos de producción normales. También se describe la E. coli que tiene una supresión de uno o más de los componentes del complejo Tol-Pal, tales como tolA, tolQ, tolB, pal y/o tolR.

Inesperadamente, los inventores han descubierto que el uso de las OMV de la presente invención como vehículos de administración permite que la antigenicidad de los antígenos prometedores aumente en comparación a cuando los antígenos se administran en su forma purificada. Por ejemplo, se ha descubierto que los antígenos que no son protectores cuando se ensayan en un modelo animal de Chlamydia cuando se administran en su forma purificada, pueden llegar a ser protectores cuando se presentan en una VME de la invención.

Bacterias

También se describe una bacteria mutante que expresa un antígeno heterólogo. Esta permite la producción de OMV a partir de una bacteria de elección. La bacteria a partir de la cual se prepara la OMV puede ser Gram-positiva, pero preferentemente es Gram-negativa. La bacteria puede ser cualquier bacteria adecuada, por ejemplo, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brocella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Escherischia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria meningitidis o N. gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri, Treponema, Porphyromonas, Helicobacter o Salmonella enterica serovar typhimurium.

La bacteria puede ser del género Escherichia, por ejemplo, E. coli. Puede utilizarse cualquier cepa de E. coli adecuada. Por ejemplo, la E. coli puede ser de la cepa BL21, por ejemplo, E. coli BL21(DE3). Inesperadamente, los inventores de la presente han descubierto que el uso de una cepa BL21(DE3) de E. coli es un excelente vehículo de administración para presentar antígenos heterólogos. Por ejemplo, bacterias de las cepas K1 o K12.

La bacteria se habrá generado típicamente por mutación de al menos un componente del complejo Tol-Pal y/o del gen OmpA en una cepa de partida seleccionada.

Cuando la bacteria no es E. coli, la bacteria puede tener una mutación del homólogo del gen ompA y/o de uno o más componentes del homólogo del complejo Tol-Pal de E. coli.

Uno o más componentes del complejo Tol-Pal (por ejemplo, 2, 3, 4, 5) de E. coli puede estar mutado. En la Figura 1a se muestra un diagrama esquemático del complejo Tol-Pal (véase también [12], [13], [14]). Puede estar mutada cualquier combinación de tolA, tolQ, tolB, pal y/o tolR. Por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o todas las tolA, tolQ, tolB, pal y/o tolR pueden estar mutadas. Por ejemplo, una o más (por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más o todas) de tolA, tolQ, tolB, pal y/o tolR pueden estar mutadas. Se prefiere la mutación de tolR.

Como también se ha descrito en la presente memoria, la OMV se obtiene de una bacteria que presenta un antígeno heterólogo en su superficie y que es un mutante ompA que no expresa la proteína OmpA. Como también se ha descrito en la presente memoria, la OMV se obtiene a partir de una bacteria que es un mutante de ompA y un mutante en al menos un componente de su complejo Tol-Pal, por ejemplo, un mutante de tolR. La OMV puede obtenerse de una bacteria que es un mutante de ompA, pero que es el tipo silvestre en los genes que codifican el complejo Tol-Pal, o que expresa un complejo Tol-Pal funcional. Si la bacteria es un mutante ompA, la bacteria puede ser de tipo silvestre en su gen tolR o expresar una proteína TolR funcional. La bacteria puede ser un mutante ompA y todos los demás genes pueden ser genes de tipo silvestre.

La bacteria puede ser una mutante ompA de E. coli o una mutante ompA y tolR de E. coli. La bacteria puede seleccionarse de E. coli BL21(DE3)AompA, E. coli BL21(DE3)AompAAtolR, o E. coli BL21(DE3)AtolR. El símbolo A se usa en el presente documento para referirse a una cepa bacteriana en la que se ha delecionado la secuencia codificante del gen citado tras el símbolo A. Por lo tanto, una cepa bacteriana que es "AompA" no comprende la secuencia codificante para el gen ompA. Asimismo, una cepa bacteriana que es "AtolR" no comprende la secuencia de codificación para el gen tolR. Puede suprimirse toda la secuencia de codificación. Sin embargo, la secuencia codificante puede estar parcialmente delecionada. Por ejemplo, se puede delecionar la mitad de N-terminal o la mitad de C-terminal.

Los presentes inventores sorprendentemente han descubierto que las cepas mutantes E. coli AtoIR y las cepas mutantes E. coli AompA sobreproducen VME en comparación con la E. coli de tipo silvestre. Por lo tanto, la mutación del gen ompA y/o uno o más componentes del complejo Tol-Pal preferentemente da como resultado una bacteria mutante que produce un aumento en el número de v Me en comparación con su respectiva cepa de tipo silvestre que lleva un gen ompA y un complejo Tol-Pal de tipo silvestre. OmpA es una proteína integral de membrana y es la más abundante de las proteínas de membrana externa en E. coli. Es, por lo tanto, particularmente sorprendente que una E. coli que carece de la proteína OmpA sea viable. De hecho, de acuerdo con Murakami y col. [15], una E. coli de mutación única de ompA no puede promover la liberación de vesículas.

Las bacterias de hiperformación de ampollas a partir de las cuales se pueden formar más fácilmente ampollas vesículas con mayor rendimiento y que pueden ser más homogéneas en la naturaleza se describen en el documento WO 02/062378 (Smithkline Beecham Biologicals S.A.). Las ampollas provienen de bacterias seleccionadas del grupo que consiste en Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Shigella spp., Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa y Moraxella catarrhalis. Tales bacterias se han modificado genéticamente mediante regulación negativa de la expresión de uno o más genes tol y mutaciones de uno o más genes que codifican una proteína que comprende un sitio asociado a peptidoglicano para atenuar la actividad de unión a peptidoglicano de la(s) proteína(s) mientras se asegura que la proteína truncada se pliega correctamente en la membrana externa.

Los presentes inventores sorprendentemente han descubierto que las VME de las cepas mutantes E. coli AompA expresan un mayor porcentaje de proteínas de la membrana externa en comparación con las cepas mutantes E. coli AtolR (véase el Ejemplo 9). Por lo tanto, la bacteria mutante expresa un mayor porcentaje de proteínas de la membrana externa en comparación con su respectiva cepa de tipo silvestre, más preferentemente, en comparación con una cepa mutante de tolR. En algunas realizaciones, la OMV producida a partir de la bacteria puede expresar un mayor porcentaje de proteínas de la membrana externa en comparación con una OMV de la respectiva cepa de tipo silvestre de la bacteria, más preferentemente, en comparación con un mutante de tolR de la misma cepa. Por ejemplo, la composición de proteína de la OMV puede comprender 60 % o más de proteínas de membrana externa. En algunas realizaciones, la composición de proteína de la OMV puede comprender al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90 % o al menos 95 % de las proteínas de membrana externa. La composición de proteína de la OMV puede comprender al menos 98 % o al menos 99 % de las proteínas de membrana externa. La OMV puede comprender 100% de proteínas de membrana externa. La composición de proteína de la OMV puede comprender 25 % o menos de las proteínas citoplasmáticas (por ejemplo, 20 % o menos, 15 % o menos, 10 % o menos, 5% o menos, 3% o menos, 2% o menos, 1% o menos). La OMV puede no comprender proteínas citoplasmáticas. El porcentaje de proteínas de membrana externa y proteínas citoplasmáticas puede ser evaluado preferentemente de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 9.

Inesperadamente, los inventores de la presente también han descubierto que una OMV de la presente invención de una cepa mutante AompA de E. coli, que presenta un antígeno heterólogo en su superficie, en la que la bacteria no expresa una proteína de ompA, expresa una cantidad elevada del antígeno heterólogo en comparación con una OMV de una cepa mutante AtolR de E. coli (véase el Ejemplo 10). Por lo tanto, la bacteria mutante puede expresar una cantidad elevada del antígeno heterólogo en comparación con su respectiva cepa de tipo silvestre, más preferentemente en comparación con una cepa mutante de tolR. La OMV producida a partir de la bacteria puede expresar una mayor cantidad del antígeno heterólogo en comparación con una OMV de la respectiva cepa de tipo silvestre de la bacteria, más preferentemente, en comparación con una OMV producida por un mutante de tolR de la misma cepa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la VME de la invención expresa el 105 % o más (por ejemplo, el 110 % o más, el 125 % o más, el 150 % o más, el 175 % o más, el 200 % o más o el 250 % o más) de antígeno heterólogo en comparación con una VME de la respectiva cepa de tipo silvestre de la bacteria, o más preferentemente, en comparación con una VME de un mutante de tolR de la misma cepa.

La mutación del gen ompA y/o uno o más componentes del complejo Tol-Pal es preferentemente una mutación de inactivación. Por ejemplo, una parte o toda la secuencia génica se puede delecionar de manera que no se exprese la proteína. Como también se describe en la presente memoria, se puede eliminar un fragmento de la secuencia de codificación, por ejemplo, al menos 20 %, al menos 40 %, al menos 60 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % de la secuencia de codificación. Por lo tanto, la proteína expresada puede carecer de un dominio o de más de uno. La mutación puede ser una deleción de la secuencia de codificación completa de la proteína OmpA y (opcionalmente) el al menos un componente del complejo Tol-Pal. Esto da como resultado que la bacteria no exprese la proteína OmpA y (opcionalmente) al menos un componente del complejo Tol-Pal (preferentemente TolR). Por consiguiente, la OMV no expresa la proteína OmpA y (opcionalmente) el al menos un componente del complejo Tol-Pal.

El al menos un componente del complejo Tol-Pal o la proteína OmpA se puede inactivar mediante cualquier procedimiento adecuado. El al menos un componente del complejo Tol-Pal y/o el gen ompA se puede delecionar usando técnicas de ADN recombinante, tal como técnicas de recombinación homóloga. Tales técnicas son bien conocidas en la materia (por ejemplo, usar la tecnología recombinante Red/ET tal como el kit de deleción génica de E. coli de Gene Bridges, GmbH) [16]. Por ejemplo, el al menos un componente del complejo Tol-Pal y/o el gen ompA se pueden sustituir con un casete de resistencia a antibióticos como un marcador de selección. El gen tolR puede sustituirse con un gen de resistencia a la kanamicina mediante recombinación homóloga, tal como se muestra en la Figura 1b.

Como también se describe en la presente memoria, las una o más mutaciones en al menos un componente del complejo Tol-Pal y/o el gen ompA, pueden ser independientemente una sustitución, una inserción o una deleción. Por ejemplo, cada mutación puede implicar un único aminoácido, tal como una mutación puntual. Un truncamiento es un ejemplo de una deleción. Los truncamientos pueden implicar la deleción de hasta 10, hasta 20, hasta 30 o hasta 40 (o más) aminoácidos en el extremo N-terminal y/o en el extremo C-terminal. Preferentemente, tales mutaciones dan como resultado la producción de una proteína no funcional.

Bacterias mutantes - expresión de otros genes

Las OMV de un mutante doble de E. coli que carece tanto de la lipoproteína de Braun (lpp) y de OmpA se describen en el documento US 6.558.677. La bacteria puede tener un gen de lipoproteína de Braun de tipo silvestre. La bacteria puede expresar una versión mutada pero funcional de la lipoproteína de Braun.

Murakami et al. [15] desvelan que un mutante ompA de E. coli por sí mismo podría no promover la liberación de vesículas; sin embargo, los mutantes ompA, pal y las principales lipoproteínas lpp formaron grandes cantidades de vesículas. Por lo tanto, la OMV puede ser de una bacteria que es de tipo silvestre en sus genes de pal y de las lipoproteínas lpp principales. La bacteria puede expresar una versión mutada pero funcional de los genes de pal y de las lipoproteínas principales.

Bacterias mutantes - mutaciones de otros genes

Como también se describe en la presente memoria, además de tener una mutación del gen ompA y/u uno o más componentes del complejo Tol-Pal, la bacteria puede tener una o más mutaciones de otros genes. Para reducir la actividad pirógena, por ejemplo, la bacteria podría tener bajos niveles de endotoxina (lipo-oligosacárido (LOS) / lipopolisacárido (LPS)), y esto se puede lograr mediante inactivación de las enzimas implicadas en la biosíntesis de LPS. Las OMV de la invención preferentemente contienen no más de 20 % en peso de LOS/LPS, medido en relación con la proteína total (es decir, debe ser de al menos 4 veces más proteína que LOS/LPS, en peso). El nivel máximo de LOS/LPS es preferentemente incluso menor que 20 %, por ejemplo, 15 %, 10 %, 5 %, o menor. Los procesos para preparar membranas externas bajas en LPS de bacterias Gram negativas se desvelan en la Patente Europea No.

0624376.

Además de tener mutaciones o inactivaciones de genes endógenos particulares, la bacteria puede expresar uno o más genes no endógenos. Por ejemplo, puede utilizarse una cepa recombinante que expresa nuevos genes en relación con la correspondiente cepa de tipo silvestre. La expresión de los genes no endógenos de este modo se puede lograr mediante diversas técnicas, por ejemplo, inserción cromosómica, mutaciones de activación, expresión a partir de vectores extracromosómicos, por ejemplo, a partir de plásmidos, etc.

Adicionalmente, además de regular por disminución la expresión de proteínas específicas, en algunas realizaciones la bacteria puede sobreexpresar (en relación con la correspondiente cepa de tipo silvestre) otros inmunógenos.

Composiciones de vesículas

La invención proporciona las OMV de bacterias Gram negativas que son mutantes de ompA, que presentan un antígeno heterólogo en sus superficies, en las que las bacterias no expresan la proteína OmpA, que son liberados espontáneamente en el medio de cultivo por las bacterias descritas en la presente memoria. Estas ^o M^v son diferentes de las vesículas que se pueden preparar de manera artificial a partir de las mismas bacterias, tal como las OMV extraídas con sarkosil preparadas en Adu-Bobie et al. [17] de meningococos 'AGNA33'. También son diferentes de las microvesículas (MV [18]) y las 'VME naturales' ('VMEN' [19]), aunque las vesículas de la invención parecen ser más similares a las MV y a las VMEN que a las VME extraídas por sarkosil. Las vesículas también son diferentes de las ampollas, que son protrusiones de la membrana externa que permanecen unidas a las bacterias antes de liberarse como MV([20]; [21]).

Las vesículas de la invención tienen un diámetro de 50-100 nm mediante microscopía electrónica, que es más pequeño que el de las OMV artificiales de meningococo (diámetro de ~270 nm, [22]). El diámetro es aproximadamente igual que el de las OMV artificiales que se han desnaturalizado térmicamente (~105 nm, [22]), pero las vesículas de la invención conservan su antigenicidad mientras que las OMV artificiales desnaturalizadas térmicamente pierden su antigenicidad. Además, las VME de la invención están sustancialmente libres de contaminación citoplasmática.

A diferencia del cultivo inicial, las composiciones que contienen OMV de la invención generalmente estarán sustancialmente libres de bacterias completas, tanto vivas como muertas. El tamaño de las VME de la invención implica que se puedan separar fácilmente de las bacterias completas mediante filtración a través de un filtro de 0,22 |jm, por ejemplo, como el que se usa típicamente para la esterilización por filtración. Por lo tanto, también se describe en la presente memoria un procedimiento para preparar OMV de la invención, que comprende filtrar el medio de cultivo de bacterias de la presente memoria a través de un filtro que retiene a las bacterias completas pero deja que las OMV pasen a través del mismo, por ejemplo, un filtro de 0,22 jm . Aunque las OMV pasarán a través de filtros estándares de 0,22 |jm, estos se pueden obstruir fácilmente por otro material, y por lo tanto es preferente realizar etapas secuenciales o esterilización por filtración a través de una serie de filtros con reducción de tamaño de poro, finalizando con un filtro de esterilización estándar (por ejemplo, un filtro de 0,22 jm ). Los ejemplos de los filtros anteriores pueden ser aquellos con un tamaño de poro de 0,8 jm , 0,45 jm , etc. El filtrado se puede tratar adicionalmente por ejemplo mediante ultracentrifugación.

Combinaciones de vesículas

También se describen en la presente memoria proedimientos para preparar OMV a partir de más de una cepa bacteriana, y las OMV de las diferentes bacterias pueden combinarse, proporcionando así una composición que comprende una mezcla de n conjuntos de OMV de la invención, preparados a partir de n cepas diferentes de una bacteria. El valor de n puede ser 1, 2, 3, 4, 5, etc. Las diferentes cepas pueden ser del mismo serogrupo o de serogrupos distintos.

También se describe en la presente memoria un kit que comprende OMV de la invención preparadas a partir de n cepas diferentes de una bacteria. Las OMV se pueden mantener y almacenar de manera separada en el kit hasta que se requiera su uso en conjunto, por ejemplo, como una mezcla, o para uso simultáneo, separado o secuencial.

También se describe en la presente memoria un procedimiento que comprende: preparar n conjuntos de OMV de la invención, uno de cada una de las n cepas diferentes de una bacteria; y combinar los n conjuntos de OMV. Los diferentes conjuntos se pueden combinar en un kit o en una mezcla.

Además de estar seleccionadas a partir de diferentes cepas de una bacteria, tal como diferentes cepas de Escherichia, las OMV se pueden seleccionar a partir de diferentes géneros de bacterias, o a partir de diferentes patógenos. Por lo tanto, también se describe en la presente memoria una composición que comprende una mezcla de n conjuntos de OMV de la invención, preparada a partir de n especies diferentes de bacterias. De manera similar, también se describe en la presente memoria un kit que comprende OMV de la invención preparadas a partir de n especies diferentes de bacterias, y un procedimiento que comprende la etapa de preparar n conjuntos de OMV de la invención, uno de cada una de las n especies diferentes de bacterias.

Diferentes antígenos heterólogos se expresan sobre diferentes OMV.

Antígenos heterólogos

Un antígeno "heterólogo" es un antígeno que proviene de una especie patógena que es diferente de la especie de bacteria de la que se obtiene la OMV, y es preferentemente un antígeno de un género de patógeno diferente del género de bacteria del que se obtiene la OMV.

El antígeno heterólogo es preferentemente de una bacteria o virus. Por ejemplo, el antígeno heterólogo puede ser un antígeno bacteriano, tal como un antígeno de Chlamydia, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Streptococcus, Pseudomonas, Shigella, Campylobacter, Salmonella, Yersinia pestis, Rickettsia prowazekii, Neisseria o Helicobacter. El antígeno heterólogo puede ser un antígeno vírico, tal como un antígeno de un virus de la familia Adenoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Rhabdoviridae o Togaviridae, por ejemplo, un antígeno del VIH o de la gripe.

El antígeno heterólogo puede ser un antígeno de Chlamydia, por ejemplo, un antígeno de C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum, C. muridarum o C. suis. Cuando el antígeno heterólogo es de Chlamydia, la bacteria de la que se obtiene la vesícula de la membrana externa no es de la misma especie de Chlamydia y preferentemente no es del género Chlamydia.

Las serovariedades humanas ("serotipos") de C. trachomatis se dividen en dos biovariedades ("biotipos"). Los serotipos A-K generan infecciones principalmente en el tejido ocular (A-C) o en el tracto urogenital (D-K). Los serotipos L1, L2 y L3 son los agentes de linfogranuloma venéreo (LGV) invasivo. El antígeno heterólogo se puede seleccionar de uno cualquiera de los serotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L1, L2 o L3. Preferentemente, el antígeno heterólogo es del serotipo D de C. trachomatis, o de otro serotipo con prevalencia epidemiológica.

Preferentemente, el antígeno heterólogo es una proteína de membrana, más preferentemente, una proteína de membrana externa.

Los ejemplos de antígenos de C. trachomatis que son adecuados para uso en la presente invención son CT823, CT601, CT372, CT443, CT043, CT733, CT279, CT153 y MOMP (CT681). Los ejemplos de antígenos de C. muridarum que son adecuados para su uso en la presente invención son TC0210, TC0052, TC0106, TC0313, TC0431, TC0551, TC0651, TC0727 y TC0890. Los ejemplos de otros antígenos adecuados para su uso en la invención son TC0660 y TC0741.

El antígeno heterólogo puede ser CT823 o TC0210. Las secuencias de CT823 y TC0210 se presentan en la Figura 9. CT823 de Chlamydia trachomatis (Ct) y TC0210 de Chlamydia muridarum (Cm) son homólogos de proteína que se anotan como serina proteasas y comparten el 93,36 por ciento de identidad de secuencia. Junto con la proteína A de requerimiento de alta temperatura (HtrA) de E. coli y los homólogos en otras bacterias y eucariotas, estas proteínas constituyen la familia de proteasas de HtrA. El papel principal de estas proteasas es degradad las proteínas mal plegadas en el periplasma ([23]; [24]; [25]). La HtrA de Chlamydia trachomatis (también citada en el presente documento como "CtHtrA" o "CT823") se ha caracterizado como una serina endoproteasa, específica para proteínas no plegadas, que se activa a temperaturas por encima de los 34 °C ([26]). Se ha observado la actividad chaperona, aunque esto parece ser dependiente de la diana.

CT823 es una proteína de membrana externa. Para que se genere una respuesta inmune protectora contra este antígeno heterólogo, el antígeno heterólogo se debería presentar preferentemente en su estado correctamente plegado.

Inesperadamente, los inventores han descubierto que la expresión de TC0210 en una OMV mutante de acuerdo con la invención da como resultado una respuesta inmunitaria neutralizante que se genera tanto contra C. muridarum como contra C. trachomatis. La respuesta inmunitaria se mejora en comparación con la respuesta generada mediante el antígeno TC0210 purificado (es decir, cuando no se expresa en una VME).

El antígeno heterólogo es preferentemente el antígeno de tipo silvestre. Sin embargo, en algunas realizaciones, el antígeno heterólogo es una variante de un antígeno de tipo silvestre. Por ejemplo, la variante puede tener al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con el antígeno de tipo silvestre. Los procedimientos de determinación de identidad de secuencia son bien conocidos en la materia. La identidad entre antígenos heterólogos se determina preferentemente mediante el algoritmo de búsqueda de homología que se implementó en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), utilizando una búsqueda de hueco afín con penalización por hueco abierto = 12 y penalización por extensión del hueco = 2. Tales variantes incluyen homólogos, ortólogos, variantes alélicas y mutantes funcionales. En realizaciones en las que el antígeno heterólogo es una variante de un antígeno de tipo silvestre, la inmunogenicidad de la variante es preferentemente la misma que o muy similar a la inmunogenicidad del antígeno de tipo silvestre cuando se ensaya en las mismas condiciones, tal como cuando se usa en un ensayo ELISA o en un ensayo de neutralización.

Cuando el antígeno heterólogo es una variante de un antígeno de tipo silvestre, la secuencia de aminoácidos de la variante contiene preferentemente menos de veinte mutaciones (por ejemplo, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) en relación con la secuencia de tipo silvestre. Cada mutación preferentemente implica a un único aminoácido y es preferentemente una mutación puntual. Las mutaciones pueden ser cada una independientemente una sustitución, una inserción o una deleción. Las mutaciones preferidas son sustituciones de un solo aminoácido. La variante también puede incluir una o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) deleciones de un solo aminoácido en relación con las secuencias de tipo silvestre. La variante también puede incluir una o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) inserciones (por ejemplo, cada una de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos) en relación con las secuencias de tipo silvestre. Las deleciones, sustituciones o inserciones pueden ser en el extremo N-terminal y/o C-terminal, o pueden estar entre los dos extremos. Por lo tanto, un truncamiento es un ejemplo de una deleción. Los truncamientos pueden implicar la deleción de hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 40 (o más) aminoácidos en el extremo N-terminal y/o en el extremo C-terminal.

Las sustituciones de aminoácidos pueden ser para uno cualquiera de los otros diecinueve aminoácidos de origen natural. En realizaciones preferidas, una o más mutaciones es una sustitución conservativa. En otra realización, una o más mutaciones es una sustitución no conservativa. Una sustitución conservadora se define comúnmente como una sustitución que introduce un aminoácido que tiene propiedades química suficientemente similares, por ejemplo, que tiene una cadena lateral relacionada (por ejemplo, un aminoácido básico cargado positivamente se sustituiría por otro aminoácido básico cargado positivamente), para conservar la estructura y la función biológica de la molécula. Los aminoácidos codificados genéticamente generalmente se dividen en cuatro familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican juntos como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de un solo aminoácido en estas familias no tienen un mayor efecto sobre la actividad biológica. Los ejemplos adicionales de sustituciones conservativas que se pueden usar en la invención se presentan en la Tabla I.

TABLA 1

Los ejemplos de sustituciones no conservadoras que se pueden usar en la invención incluyen la sustitución de un aminoácido polar sin carga por un aminoácido no polar, la sustitución de un aminoácido no polar por un aminoácido polar sin carga, la sustitución de un aminoácido ácido por un aminoácido básico y la sustitución de un aminoácido básico por un aminoácido ácido.

En algunas realizaciones en las que el antígeno heterólogo es una variante de un antígeno de tipo silvestre, la variante puede comprender uno o más derivados de aminoácidos. Por "derivado de aminoácido" se entiende un aminoácido o compuesto químico similar a aminoácido que no sea uno de los 20 aminoácidos de origen natural codificados genéticamente. En particular, el derivado de aminoácido puede contener restos alquilo lineales, ramificados o cíclicos sustituidos o no sustituidos, y puede incluir uno o más heteroátomos. Los derivados de aminoácidos se pueden preparar de novo o se pueden obtener de fuentes comerciales (Calbiochem-Novabiochem AG, Suiza; Bachem, Estados Unidos).

En algunas realizaciones, el antígeno heterólogo comprende o consiste en un fragmento de un antígeno de tipo silvestre o en una variante del mismo. El fragmento debe comprender al menos n aminoácidos consecutivos del antígeno de tipo silvestre o de una variante del mismo y, dependiendo de la secuencia particular, n es 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 15 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más (por ejemplo, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 390, 420, 450, 480 o más). Tales fragmentos no comprenden la secuencia de longitud completa del antígeno de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el fragmento es de 481 aminoácidos o menos de longitud (por ejemplo, 400 o menos, 300 o menos, 200 o menos, 100 o menos, 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 25 o menos, 22 o menos o 20 o menos aminoácidos de longitud).

Preferentemente, el fragmento comprende uno o más epitopos del antígeno de tipo silvestre. Tales epítopos se pueden definir usando técnicas de mapeo de epítopos tales como las descritas en el Ejemplo 8. En algunas realizaciones, el antígeno heterólogo es un fragmento del antígeno TC0210 de C. muridarum. Por ejemplo, el fragmento puede comprender o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en DYFNDEFFNRFFGLP (SEQ ID NO: 36), SHREQ (SEQ ID NO: 37), ALQKMGVRVQNLTPE (SEQ ID NO: 38), NQVLKNAKGENVLLM (SEQ ID NO: 39), SPMLGYSAPKKDSSTGICLA (SEQ ID NO: 40), EDLLKEVSRGFSKVAAQATP (SEQ ID NO: 41), TGSQAIASPGNKRGFQENPF (SEQ ID NO: 42), PRPQQRDAVR (SEQ ID NÚM.: 43), IAIGNPFGLQATVTVGVISAKGRNQLHIVD (SEQ ID NÚM.: 44) y NTAIVSGSGGYIGIGFAIPSLMAKRVIDQL (SEQ ID NO: 45). Por ejemplo, puede comprender o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en DYFNDEFFNRFFGLP (SEQ ID NO: 36), SHREQ (SEQ ID NO: 37), ALQKMGVRVQNLTPE (SEQ ID NO: 38) y NQVLKNAKGENVLLM (SEQ ID NÚM.: 39) DYFNDEFFNRFFGLP (SEQ ID NO: 36) es particularmente preferido.

En algunas realizaciones, el antígeno heterólogo es un fragmento del antígeno TC0210 de C. muridarum que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en VAAQATPGVVYIENFPK (SEQ ID NÚM.: 46), GFQENPFDYFNDEFFNRFFGLPSHREQPRPQQR (SEQ ID NO: 47), GTGFIVSEDGYVVTNHHVVEDAGK (SEQ ID NÚM.: 48), TDLAVIKIQAK (SEQ ID NÚM.: 49), VIDQLISDGQVTR (SEQ ID NO: 50), AGLRQEDVIVAYNGKEVESLSALR (SEQ ID NO: 51), FIEIPVTVTQIPAEDGVSALQK (SEQ ID NO: 52), VQNLTPEICK (SEQ ID NO: 53), NAKGENVLLMVSQGEVIR (SEQ ID NO: 54) y GENVLLMVSQGEVIR (SEQ ID NO: 55).

En algunas realizaciones, el antígeno heterólogo se selecciona del grupo que consiste en los fragmentos correspondientes del antígeno CT823 de C. trachomatis. Por ejemplo, el fragmento puede comprender o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en DYFNDEFFNRFFGLP (SEQ ID NO: 56), SHREQ (SEQ ID NO: 57), ALQKMGVRVQNITPE (SEQ ID NO: 58), NQVLKNSKGENVLLM (SEQ ID NO: 59), SPMLGYSASKKDSKADICLA (SEQ ID NO: 60), EDLLKEVSRGFSRVAAKATP (SEQ ID NO: 61), TGNQAIASPGNKRGFQENPF (SEQ ID NO: 62), IAIGNPFGLQATVTVGVISAKGRNQLHIVD (SEQ ID NO: 63) y NTAIVSGSGGYIGIGFAIPSLMAKRVIDQL (SEQ ID NO: 64). Por ejemplo, puede comprender o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en DYFNDEFFNRFFGLP (SEQ ID NO: 56), SHREQ (SEQ ID NO: 57), ALQKMGVRVQNITPE (SEQ ID NO: 58) y NQVLKNSKGENVLLM (SEQ ID NO: 59). DYFNDEFFNRFFGLP (SEQ ID NO: 56) es particularmente preferido.

Preferentemente, el antígeno heterólogo es inmunogénico cuando está presente en la OMV. En realizaciones en las que el antígeno heterólogo comprende o consiste en un fragmento de un antígeno de tipo silvestre o en una variante del mismo, el fragmento es preferentemente inmunogénico. El término "inmunogénico", en el contexto de un antígeno heterólogo inmunogénico, significa que el antígeno heterólogo es capaz de generar una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta mediada por células y/o una respuesta de anticuerpos, frente al patógeno (tal como una bacteria o un virus) del que proviene el antígeno, por ejemplo, frente al antígeno en el ámbito del patógeno. Preferentemente, la respuesta inmunitaria se genera frente al patógeno de tipo silvestre del que proviene el antígeno. Por ejemplo, tal respuesta inmunitaria se puede generar cuando la VME de la invención se usa para inmunizar a un sujeto (preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano o un ratón). En una realización, la OMV de la invención es capaz de estimular células CD4+ IFN+-Y in vitro en esplecnocitos purificados de ratones infectados con el patógeno vivo (tal como C. trachomatis) y/o genera anticuerpos que reconocen al patógeno (tal como C. trachomatis). El antígeno heterólogo preferentemente genera anticuerpos que reconocen el patógeno del que proviene el antígeno heterólogo. Por ejemplo, el antígeno heterólogo preferentemente genera anticuerpos que se pueden unir a, y preferentemente neutralizan la infección y/o la virulencia del patógeno del que proviene el antígeno heterólogo. Los antígenos heterólogos preferidos son aquellos que se reconocen mediante antisuero tras la infección por un patógeno de interés. Los más preferidos son aquellos antígenos heterólogos que generan una respuesta inmunitaria protectora frente a un patógeno de interés.

En algunas realizaciones, el antígeno heterólogo es inmunogénico cuando está presente en la OMV pero no es inmunogénico cuando se administra en la forma purificada.

En algunas realizaciones, el antígeno heterólogo presentado en la OMV de la invención genera una respuesta inmunitaria que es de reacción cruzada con un antígeno de una especie diferente del patógeno y por lo tanto, el antígeno heterólogo se puede usar para generar una respuesta inmunitaria frente a esa especie de patógeno diferente. Por ejemplo, cuando el antígeno heterólogo es de C. muridarum, la respuesta inmunitaria puede ser de reacción cruzada con un antígeno de C. trachomatis o C. pneumoniae. De manera similar, cuando el antígeno heterólogo es de C. trachomatis, la respuesta inmunitaria puede ser de reacción cruzada con un antígeno de C. pneumoniae o C. muridarum. Además, cuando el antígeno heterólogo es de C. pneumoniae, la respuesta inmunitaria puede ser de reacción cruzada con un antígeno de C. trachomatis o C. muridarum.

El antígeno heterólogo presentado sobre la superficie de la OMV está en la forma de un polipéptido que comprende o consiste en el antígeno heterólogo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el polipéptido contiene la secuencia de aminoácidos de N-terminal y/o C-terminal para el antígeno heterólogo.

Combinaciones con otros antígenos

En algunas realizaciones, una OMV de la invención presenta solo un antígeno heterólogo sobre su superficie. En otras realizaciones, una VME de la invención presenta más de un antígeno heterólogo sobre su superficie, por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis o más, diez o más, quince o más, etc. Por ejemplo, la VME puede presentar TC0210 y un antígeno heterólogo adicional; o CT823 y un antígeno heterólogo adicional. El antígeno heterólogo adicional puede ser cualquier antígeno heterólogo tal como se describe en el presente documento, pero es preferentemente un antígeno de Chlamydia.

En realizaciones en las que la OMV comprende más de un antígeno heterólogo, los dos o más antígenos heterólogos pueden estar en la forma de polipéptidos separados o pueden estar presentes en el mismo polipéptido como una proteína de fusión. Por ejemplo, el polipéptido puede comprender dos o más antígenos de longitud completa. Como alternativa, el polipéptido puede comprender una cadena de epítopos de antígenos heterólogos que son epítopos de uno o más antígenos. Por ejemplo, la cadena de epitopos puede comprender dos o más de los fragmentos de C. muridarum y/o C. trachomatis que se describen anteriormente. Los epítopos pueden estar unidos directamente sin ninguna secuencia intermedia o pueden estar unidos mediante una longitud de secuencia de aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, u 11 o más aminoácidos). En algunas realizaciones, una VME de la invención comprende una combinación de antígenos heterólogos que comprenden antígenos de tipos silvestre de longitud completa o variantes de los mismos y antígenos heterólogos que comprenden fragmentos de antígenos de tipo silvestre o variantes de los mismos.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición que comprende una primera OMV de la invención junto con uno o más antígenos adicionales. El uno o más antígenos adicionales puede estar en el ámbito de una VME tal como se describe en el presente documento, o se puede administrar en una forma alternativa, por ejemplo, como un antígeno purificado o como su ácido nucleico codificante. Preferentemente, el antígeno adicional es un antígeno heterólogo de acuerdo con la presente invención que es diferente del antígeno heterólogo presentado sobre la primera VME.

La invención también incluye una composición inmunogénica que comprende una combinación de antígenos, por ejemplo, antígenos de Chlamydia, comprendiendo dicha combinación una OMV de la invención en combinación con uno o más antígenos adicionales, tal como antígenos de Chlamydia. También se proporciona una VME de la invención para un uso tal como se describe en el presente documento, en el que la VME es para su uso en combinación con uno o más antígenos de Chlamydia adicionales (o sus ácidos nucleicos codificantes). Los uno o más antígenos adicionales (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más antígenos adicionales) se pueden administrar de manera simultánea, de manera separada o de manera secuencial con la VME de la invención, por ejemplo, como una preparación combinada.

Los ejemplos de combinaciones de antígenos heterólogos para uso en la invención incluyen TC0106+TC0431; TC0660+TC0741; TC0551+TC0890; TC0106+TC0210+TC0741+TC0313; y TC0551+TC0890+TC106+TC431.

El documento PCT/IB2010/050988 (Novartis Vaccines and Diagnostics, SRL) desvela que la inmunización con tres combinaciones de estos antígenos (TC0106-TC0431; TC0660-TC0741; TC0551-TC0890) proporcionó una reducción significativa de IFU en los pulmones de ratones infectados por C. muridarum. La contribución de los antígenos individuales a la protección también se evaluó en el modelo de ratón, que lleva a la identificación de 4 antígenos (TC0106, TC0210, TC0741 y TC0313) que fueron capaces de reducir parcialmente la carga de IFU por pulmón (aproximadamente 0,5-1 Log). Se evaluó entonces si se podría lograr una mayor protección administrando combinaciones de 4 antígenos. En comparación con la combinación de 2 antígenos, la combinación de 4 antígenos (TC0551+TC0890+TC0106+TC0431) pareció tener un efecto protector aditivo en la reducción de la acumulación de bacterias en el pulmón, (reducción de 2,2 log-10 con P=0,0003). También se observó una eficacia ligeramente mayor en la aceleración de la eliminación bacteriana, con el 29 % de los animales recuperándose por completo de la infección.

En una realización, los uno o más antígenos son antígenos de Chlamydia seleccionados de los antígenos presentados en la Tabla 2. Por ejemplo, uno o más (por ejemplo, todos) de los antígenos adicionales se seleccionan de los antígenos de Chlamydia trachomatis enumerados en la Tabla 2, pero se pueden seleccionar como alternativa o adicionalmente de los antígenos de Chlamydia pneumoniae enumerados en la Tabla 2. En una realización, uno o más de los uno o más antígenos adicionales se seleccionan de CT823, CT372, CT443, CT043, CT153, CT279, CT601, CT711, CT114, CT480, CT456, CT381, CT089, CT734 y CT016. Estos antígenos adicionales se enumeran en la Tabla 2 y sus secuencias se establecen en la sección de "Secuencias" que sigue a la Tabla 2.

En una realización, una OMV de la invención está combinaba con CT089. En otra realización, una VME de la invención se combina con CT089 y CT381. Las combinaciones preferidas son una VME de la invención con uno o más antígenos seleccionados de CT372, CT443, CT601, CT153 y CT279. Otra combinación preferida incluye una VME de la invención en combinación con 1, 2, o 3 de CT456, CT733 y/o CT043 (en particular, una combinación de los cuatro antígenos).

Preferentemente, CT823 es el antígeno heterólogo presentado por la OMV de la invención. Las combinaciones preferidas incluyen CT823+CT089; CT823+CT089+CT381; CT823 con uno o más antígenos seleccionados de CT372, CT443, CT601, CT153 y CT279 (por ejemplo CT823+CT372; CT823+CT443, CT823+CT601, CT823+CT153 y CT823+CT279); CT823 con 1,2 o 3 de CT456, CT733 y/o CT043 (por ejemplo, CT823+CT456; CT823+CT733; CT823+CT043 o más preferentemente, CT823+CT456+CT733+CT043).

Las combinaciones ventajosas de la invención son aquellas en las que dos o más antígenos actúan de manera sinérgica. Por lo tanto, la protección frente a Chlamydia lograda por su administración combinada supera la esperada por la mera adición de su eficacia protectora individual.

Los uno o más antígenos de Chlamydia adicionales pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) con 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con una secuencia presentada en la Tabla 2; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de una secuencia presentada en la Tabla 2, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estos uno o más antígenos de Chlamydia adicionales incluyen variantes de una secuencia presentada en la Tabla 2. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de una secuencia presentada en la Tabla 2. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de una secuencia presentada en la Tabla 2, mientras conserva al menos un epitopo de una secuencia presentada en la Tabla 2. Otros fragmentos omiten uno o más dominios proteicos. Cuando un antígeno adicional de Chlamydia comprende una secuencia que no es idéntica a una secuencia completa de la Tabla 2 (por ejemplo, cuando comprende una secuencia con menos del 100 % de identidad de secuencia con la misma o cuando comprende un fragmento de la misma), se prefiere en cada caso individual que el antígeno de Chlamydia pueda generar un anticuerpo que reconoce una proteína que tiene la secuencia completa del antígeno de la Tabla 2 del que proviene.

TABLA 2

Como también se describe en la presente memoria, los antígenos de Chlamydia adicionales usados pueden estar presentes en la composición como polipéptidos individuales separados. Como alternativa, la combinación puede estar presente como un polipéptido híbrido en el que dos o más (es decir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más) de los antígenos se expresan como una cadena individual de polipéptidos. Los polipéptidos híbridos ofrecen dos ventajas principales: primera, un polipéptido que puede ser inestable o que esté mal expresado puede ser asistido mediante la adición de un compañero híbrido adecuado que solucione el problema; segunda, la fabricación comercial se simplifica de manera que solo se necesita emplear una expresión y purificación para producir dos polipéptidos que sean ambos antigénicamente útiles. Los diferentes polipéptidos híbridos se pueden mezclar juntos en una única formulación. En estas combinaciones, un antígeno de Chlamydia trachomatis puede estar presente en más de un polipéptido híbrido y/o como un polipéptido no híbrido. Alternativamente, un antígeno puede estar presente bien como un híbrido o bien como un no híbrido, pero no como ambos.

Los polipéptidos híbridos se pueden representar mediante la fórmula NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH, en la que: al menos una X es una secuencia de aminoácidos de un antígeno heterólogo tal como se describe anteriormente; L es una secuencia opcional de aminoácidos de enlace; A es una secuencia opcional de aminoácidos de extremo N-terminal; B es una secuencia opcional de aminoácidos de extremo C-terminal; n es un número entero de 2 o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, etc.). Normalmente n es 2 o 3.

Si un resto -X- tiene una secuencia líder de péptidos en su forma silvestre, esta se puede incluir o suprimir en la proteína híbrida. Los péptidos líder se eliminarán excepto por el del resto -X- localizado en el extremo N-terminal de la proteína híbrida, es decir, el péptido líder de X1 será retenido, pero los péptidos líder de X2... Xn se suprimirán. Esto es equivalente a eliminar todos los péptidos líder y usar el péptido líder de X1 como resto -A-.

Para cada uno de los n casos de {-X-L-}, la secuencia de aminoácidos de enlace -L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n=2 el híbrido puede ser NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH, etc. La(s) secuencia(s) de aminoácidos enlazadora(s) -L- típicamente será(n) corta(s) (por ejemplo, de 20 aminoácidos o menos, es decir, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos comprenden secuencias de péptidos cortos que facilitan la clonación, enlazadores de poliglicina (es decir, que comprenden Glyn cuando n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), y marcadores de histidina (es decir, Hisn cuando n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos enlazadoras serán evidentes para los expertos en la materia. Un enlazador útil es GSGGGG (SEQ ID NÚM.: 65), estando formado el dipéptido Gly-Ser a partir de un sitio de restricción BamHI, ayudando así a la clonación y a la manipulación, y siendo el tetrapéptido (Gly)4 un típico enlazador de poliglicina.

- A- es una secuencia opcional de aminoácidos de N-terminal. Esta será típicamente corta (por ejemplo, 40 aminoácidos o menos, es decir, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias líder para dirigir el tráfico de proteínas o secuencias peptídicas que facilitan la clonación o la purificación (por ejemplo, marcadores de histidina, es decir, Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias adecuadas de aminoácidos de N-terminal serán evidentes para los expertos en la materia. Si X1 carece de su propia metionina del extremo N-terminal, -A- es preferentemente un oligopéptido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos) que proporciona una metionina del extremo N-terminal.

- B es una secuencia opcional de aminoácidos de C-terminal. Ésta será típicamente corta (por ejemplo, 40 aminoácidos o menos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o la purificación (por ejemplo, que comprenden marcadores de histidina, es decir, Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), o secuencias que mejoran la estabilidad de la proteína. Otras secuencias adecuadas de aminoácidos de C-terminal serán evidentes para los expertos en la materia.

Cuando se usan polipéptidos híbridos, los antígenos individuales en el híbrido (es decir, los restos -X- individuales) pueden ser de una o más cepas. Cuando n=2, por ejemplo, X2 puede ser de la misma cepa que X1 o de una cepa diferente. Cuando n=3, las cepas pueden ser (i) X-^f X2=X^s (ii) X-i=X2^X3 (iii) X#X2=X3 (iv) X-^X2^X3 o (v) X-i=X3^X2, etc.

También se describe en la presente memoria un kit que comprende una OMV de la invención y uno o más antígenos adicionales para administración simultánea, separada o secuencial.

El antígeno heterólogo puede estar presente mediante cualquier procedimiento adecuado. En algunas realizaciones, la secuencia codificante del antígeno heterólogo se fusiona con una secuencia peptídica líder, por ejemplo, la secuencia peptídica líder de OmpA, y la fusión se pone bajo el control de un promotor en un plásmido. El promotor lac es un ejemplo de un promotor adecuado. Se puede usar cualquier plásmido adecuado, por ejemplo, el plásmido multicopia pET. Tal como se ha mencionado anteriormente, el antígeno heterólogo se puede presentar en el contexto de una secuencia de polipéptidos más larga, por ejemplo, con una secuencia adicional de N-terminal y/o C-terminal para el antígeno heterólogo. En tales casos, los péptidos líder se fusionarán a la secuencia peptídica más larga.

El plásmido derivado puede usarse para transformar la bacteria y los clones recombinantes se cultivan en cultivos líquidos. Las VME liberadas se pueden purificar mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, centrifugación.

Anticuerpos

El antígeno heterólogo preferentemente induce anticuerpos capaces de neutralizar la infección o la virulencia del patógeno del que proviene el antígeno. Como también se describen en la presente memoria, estos anticuerpos neutralizantes se pueden usar como una vacuna capaz de neutralizar la infección o la virulencia del patógeno, por ejemplo, de Chlamydia, más en particular, de C. trachomatis o C. pneumoniae.

También se describen en la presente memoria uno o más anticuerpos que se unen a un antígeno heterólogo presentado por una OMV de la invención. El anticuerpo puede no unirse al antígeno heterólogo cuando no está presente en una OMV descrita en la presente memoria. Por ejemplo, el anticuerpo puede no unirse al antígeno heterólogo en su forma purificada. El anticuerpo puede unirse a un epitopo que está inmunoaccesible y en su conformación natural cuando el antígeno heterólogo está presente en una OMV de la invención pero que no está inmunoaccesible y/o no en su conformación natural cuando está presente por el antígeno en su forma purificada. Por ejemplo, los presentes inventores han descubierto que se reconocen diferentes epítopos en TC0210 cuando se presenta por una VME de la invención que cuando se presenta en su forma purificada (véanse los resultados del Ejemplo 8). Por lo tanto, como también se describe en la presente memoria, se proporciona una OMV, composición o vacuna para uso en la generación de anticuerpos que se unen a uno o más epitopos en el antígeno heterólogo que no están inmunoaccesibles cuando el antígeno heterólogo se administra en una forma purificada.

El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como también sus fragmentos que son capaces de unirse a un antígeno. Éstas incluyen moléculas de anticuerpo híbridas (quiméricas) ([27], [28]); fragmentos F(ab')2 y F(ab) y moléculas de Fv; heterodímeros no covalentes ([29]; [30]); moléculas de Fv de cadena simple (sFv) [31]; construcciones de fragmentos de anticuerpos diméricos o triméricos; minicuerpos [32],[33]; moléculas de anticuerpo humanizadas [34], [35], [36]; y cualquiera de los fragmentos funcionales obtenido de tales moléculas, así como anticuerpos obtenidos mediante procesos no convencionales tales como la expresión en fago. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales. Los procedimientos de obtención de anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la materia. Los anticuerpos humanizados o los completamente humanos son los preferidos.

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y se pueden producir mediante cualquier medio adecuado. El anticuerpo puede incluir un marcador detectable.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para preparar anticuerpos que comprende inmunizar a un mamífero (tal como un ratón o un conejo) con una OMV de la invención y obtener anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, el antisuero policlonal se puede obtener mediante el sangrado de animales inmunizados en un recipiente de cristal o de plástico, la incubación de la sangre a 25 °C durante una hora, seguida de la incubación a 4 °C durante 2-18 horas. El suero se recupera mediante centrifugación (por ejemplo, 1.000g durante 10 minutos). Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando el procedimiento habitual de Kohler y Milstein [37], o una modificación del mismo, o mediante cualquier otro procedimiento adecuado. También se describe una preparación de anticuerpo policlonal preparado mediante este procedimiento.

Los títulos y las especificidades de los anticuerpos se pueden medir usando procedimientos habituales disponibles en la técnica. Otros procedimientos para ensayar la inmunogenicidad de proteínas también son bien conocidos en la materia.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden usar en combinación con uno o más anticuerpos específicos para uno o más antígenos adicionales (por ejemplo, antígenos de Chlamydia) para su uso en el diagnóstico de infecciones (por ejemplo, infecciones de Chlamydia).

Composiciones inmunogénicas y medicamentos

La OMV, el medicamento o la bacteria puede estar en la forma de una composición. Estas composiciones pueden ser adecuadas como composiciones inmunogénicas (por ejemplo, vacunas), o como reactivos de diagnóstico. Generalmente, la composición comprenderá múltiples copias de la misma VME o bacteria.

Es particularmente ventajoso usar una OMV de la invención en una composición inmunogénica tal como una vacuna. Preferentemente, la formulación final de la vacuna es más estable en comparación con las composiciones inmunogénicas que comprenden el antígeno heterólogo en la forma purificada.

También se describen en la presente memoria composiciones inmunogénicas que comprenden una o más bacterias descritas en la presente memoria. La bacteria puede ser una bacteria no patógena. En tales realizaciones, las OMV se generan in vivo.

Una composición inmunogénica de la invención comprende una OMV de acuerdo con la invención. Las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la invención pueden bien ser profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero típicamente serán profilácticas. Cuando la composición inmunogénica es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño que está aprendiendo a andar o un lactante) o un adolescente; cuando la composición inmunogénica es para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una composición inmunogénica destinada a los niños también se puede administrar a los adultos, por ejemplo, para evaluar su seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.

La composición inmunogénica puede ser para el tratamiento o la prevención de infección por Chlamydia o una afección asociada (por ejemplo, tracoma, ceguera, cervicitis, enfermedad inflamatoria pélvica, infertilidad, embarazo ectópico, dolor pélvico crónico, salpingitis, uretritis, epididimitis, neumonía infantil, pacientes infectados por carcinoma de células escamosas de cuello uterino, y/o infección por VIH, etc.), por ej., infección por C. trachomatis. La composición inmunogénica puede ser eficaz frente a C. pneumoniae.

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de la OMV de la invención, así como cualesquier otros componentes, según lo requerido. El término "cantidad inmunológicamente eficaz" significa que la administración de esa cantidad a un individuo, bien en una dosis única o bien como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condiciones físicas del individuo a tratar, de la edad, del grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), de la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección deseado, de la formulación de la vacuna, de la evaluación del médico a cargo del tratamiento de la situación médica, y de otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté dentro de un rango relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos habituales. Cuando se incluye más de un antígeno en una composición, los dos antígenos pueden estar presentes a la misma dosis entre sí o a diferentes dosis.

En general, una composición de la invención comprenderá un antígeno heterólogo a una concentración que será suficiente para generar una respuesta inmunitaria frente a ese antígeno. Los antígenos heterólogos en la composición típicamente estarán presentes a una concentración de al menos 1 pg/ml cada uno. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una dosis de una composición de la invención comprende de 1 a 600 pg del antígeno heterólogo, por ejemplo, 1 a 500 pg, 100-500 pg, 100-200 pg, 1 a 300 pg, 1 a 100 pg, 1 a 50 pg, 1 a 35 pg, 1 a 25 pg, 10 a 30 pg, 20 a 30 pg, 23 a 27 pg o 24 a 26 pg de antígeno heterólogo. Preferentemente, una dosis de una composición de la presente invención comprende 25 pg del antígeno heterólogo. Estas preferencias de la dosis se pueden aplicar a los procedimientos de la invención haciendo los cambios necesarios.

El tratamiento de dosis puede ser un cronograma de una única dosis o un cronograma de múltiple dosis. Pueden usarse múltiples dosis en una pauta de inmunización primaria y/o en una pauta de inmunización de refuerzo. En una pauta de dosificación múltiple, las diversas dosis se pueden dar por la misma vía o por vías diferentes, por ejemplo, una primera dosis por vía parenteral y un refuerzo por vía mucosal, una primera dosis por vía mucosal y un refuerzo por vía parenteral, etc. Las múltiples dosis se administrarán típicamente con al menos 1 semana de diferencia (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

El pH de una composición generalmente estará entre 5,0 y 8,1 y más típicamente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, entre 6,5 y 7,5 o entre 7,0 y 7,8, preferentemente aproximadamente 7. El pH se puede mantener mediante el uso de un tampón.

La composición es preferentemente estéril. La composición preferentemente no es pirogénica, por ejemplo, que contiene <1 UE (unidad de endotoxina, una medición estándar) por dosis, y preferentemente <0,1 UE por dosis. La composición es preferentemente sin gluten. La composición puede ser isotónica con respecto a los seres humanos.

Las composiciones inmunogénicas de la invención se administrarán generalmente de forma directa al paciente. La administración directa se puede lograr mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, o al espacio intersticial de un tejido), o por vía mucosal, tal como mediante administración rectal, oral (por ejemplo, comprimido, pulverizador), vaginal, tópica, transdérmica (véase, por ejemplo, [38]) o transcutánea (véase, por ejemplo, [39] y [40]), intranasal (véase, por ejemplo [41]), ocular, ótica, pulmonar u otra administración mucosal.

Las infecciones por patógenos (tal como infecciones por Chlamydia) afectan diversas áreas del cuerpo y, por lo tanto, las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden preparar de diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, bien como soluciones líquidas o bien como suspensiones. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición secada por pulverización en frío). La composición puede prepararse para administración tópica, por ejemplo, como una pomada, crema o polvo. La composición se puede preparar para la administración oral, por ejemplo, como un comprimido o cápsula o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición se puede preparar para la administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un pulverizador. La composición se puede preparar como un supositorio o pesario. La composición se puede preparar para la administración nasal, ótica u ocular, por ejemplo, como gotas.

También se describe en la presente un dispositivo de administración previamente llenado con una composición inmunogénica de la invención.

También se describe en la presente memoria un kit que comprende un primer componente y un segundo componente en el que ni el primer componente ni el segundo componente son una composición de la invención tal como se describe en la presente memoria, pero en el que el primer componente y el segundo componente se pueden combinar para proporcionar una composición de la invención tal como se describe en la presente memoria. El kit puede incluir adicionalmente un tercer componente que comprende uno o más de los siguientes: instrucciones, jeringas u otro dispositivo de administración, adyuvante o solución de formulación farmacéuticamente aceptable.

La composición puede estar en forma de kit, diseñada de tal forma que una composición combinada se reconstituya exactamente antes de la administración a un paciente. Tales kits pueden comprender uno o más VME en forma líquida y uno o más agentes liofilizados.

Cuando una composición se prepara de manera extemporánea antes de su uso (por ejemplo, cuando un componente está presente en forma liofilizada) y está presente como un kit, el kit puede comprender dos viales, o puede comprender una jeringa rellena y lista y un vial, usando los contenidos de la jeringa para reactivar los contenidos del vial antes de la inyección.

Por lo tanto, las composiciones pueden ser aceptables para uso farmacéutico. Normalmente incluirán componentes además de las VME, por ejemplo, típicamente incluirán uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticos. Una discusión completa de dichos componentes está disponible en la referencia 166.

Las composiciones se administrarán generalmente a un mamífero en forma acuosa. Antes de la administración, sin embargo, la composición puede haber estado en una forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se han fabricado en forma acuosa, después se rellenan y se distribuyen y se administran también en forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante la fabricación y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento de su uso. Por lo tanto, una composición descrita en la presente memoria puede estar seca, tal como una formulación liofilizada.

La composición puede incluir conservantes tal como tiomersal o 2-fenoxietanol. Sin embargo, es preferente que la vacuna esté sustancialmente libre de (es decir, menos de 5 |jg/ml) material de mercurio, por ejemplo, libre de tiomersal. Las vacunas que no contienen mercurio son más preferidas. Las vacunas sin conservantes son particularmente preferidas.

Para controlar la tonicidad, es preferente incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Es preferente cloruro sódico (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo entre 10±2 mg/ml de NaCl. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrogenofosfato potásico, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

Las composiciones generalmente tendrán una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg, que más preferentemente estará en el intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón histidina (en particular con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón citrato. Se incluirán normalmente tampones en el intervalo de 5-20 mM.

La composición puede incluir material para una única inmunización, o puede incluir material para múltiples inmunizaciones (es decir, un kit 'multidosis'). La inclusión de un conservante se prefiere en disposiciones multidosis. Como alternativa (o adicionalmente) a la inclusión de un conservante en composiciones multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tiene un adaptador aséptico para la eliminación del material.

Las vacunas humanas se administran típicamente en un volumen de dosificación de aproximadamente 0,5 ml, aunque se puede administrar media dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml) a los niños.

Las composiciones inmunogénicas descritas en la presente memoria también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. Preferentemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2, tratados en detalle a continuación.

Por lo tanto, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una combinación de: (1) una VME de la invención; y (2) un adyuvante, tal como un adyuvante de hidróxido de aluminio (por ejemplo, uno o más antígenos pueden estar adsorbidos a hidróxido de aluminio).

Los adyuvantes que se pueden usar en las composiciones de la invención incluyen, pero sin limitación:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales adecuadas para uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tal como sales de aluminio y sales de calcio (o sus mezclas). Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas "CAP" desveladas en la ref. 42). Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., con las sales adoptando cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.). Es preferente la adsorción a estas sales (por ejemplo, todos los antígenos pueden estar adsorbidos). Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de sal de metal [43].

Se pueden usar los adyuvantes conocidos como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. Estos nombres son convencionales, pero se usan sólo por conveniencia, ya que ninguno de las dos es una descripción precisa del compuesto químico real que está presente (por ejemplo, véase el capítulo 9 de la referencia 48). La invención puede usar cualquiera de los adyuvantes de "hidróxido" o "fosfato" que se usan en general como adyuvantes. Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, que normalmente son al menos parcialmente cristalinas. Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente sales de hidroxifosfatos de aluminio, que a menudo contienen también una pequeña cantidad de sulfato (es decir, hidroxifosfato sulfato de aluminio). Se pueden obtener mediante precipitación, y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación influencian el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo en la sal.

Una morfología fibrosa (por ejemplo, tal como se observa en micrografías electrónicas de transmisión) es típica de los adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pl de los adyuvantes de hidróxido de aluminio es normalmente de aproximadamente 11, es decir, el propio adyuvante tiene una carga superficial positiva a pH fisiológico.

Se han informado capacidades de adsorción entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de hidróxido de aluminio.

Los adyuvantes de fosfato de aluminio tienen generalmente una relación molar PO^Al de entre 0,3 y 1,2, preferentemente entre 0,8 y 1,2, y más preferentemente 0,95±+0,1. El fosfato de aluminio será generalmente amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato. Un adyuvante típico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de POVAl entre 0,84 y 0,92, incluida a 0,6 mg Al3+/ml. El fosfato de aluminio será generalmente particulado (por ejemplo, morfología similar a placas como se observa en micrografías electrónicas de transmisión). Los diámetros típicos de las partículas están en el intervalo de 0,5-20 pm (por ejemplo, aproximadamente 5-10 pm) después de cualquier adsorción del antígeno. Las capacidades adsortivas de entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 se han documentado para los adyuvantes de fosfato de aluminio.

El punto de carga cero (PZC) del fosfato de aluminio está inversamente relacionado con el grado de sustitución del fosfato por hidroxilo, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción utilizadas para preparar la sal mediante precipitación. El PZC también se altera cambiando la concentración de iones fosfato libres en solución (más fosfato = más PZC ácido) o añadiendo un tampón, tal como un tampón de histidina (hace que el PZC sea más básico). Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo con la invención tendrán un PZC de entre 4,0 y 7,0, más preferentemente entre 5,0 y 6,5 por ejemplo, aproximadamente 5,7.

La adsorción de los antígenos de la proteína de S. aureus (excepto IsdA, Sta019 y Sta073) a un adyuvante de hidróxido de aluminio es ventajosa, particularmente en una combinación de múltiples proteína (en la que todos los antígenos se pueden adsorber). Un tampón de histidina puede estar incluido de forma útil en tales composiciones con adyuvante.

Las suspensiones de sales de aluminio usadas para preparar composiciones de la invención pueden contener un tampón (por ejemplo, un tampón fosfato o de histidina o Tris), pero esto no es siempre necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y sin pirógenos. Una suspensión puede incluir iones fosfato acuosos libres, por ejemplo, presentes a una concentración de entre 1,0 y 20 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM, y más preferentemente aproximadamente 10 mM. Las suspensiones también pueden comprender cloruro sódico.

La invención puede usar una mezcla de un hidróxido de aluminio y un fosfato de aluminio. En este caso puede haber más fosfato de aluminio que hidróxido, por ejemplo, en una relación en peso de al menos 2:1, por ejemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc.

La concentración de Al+++ en una composición para su administración a un paciente es preferentemente menor que 10 mg/ml, por ejemplo, <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Un intervalo preferente es entre 0,3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0,85 mg/dosis.

B. Emulsiones de aceite

Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tal como MF59 [Capítulo 10 de la ref. 48; véase también la ref. 44] (escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 %, y Span 85 al 0,5 %, formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador). El adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA) también se pueden usar.

Son conocidos diversos adyuvantes de emulsiones de aceite en agua, y típicamente incluyen al menos un aceite y al menos un tensioactivo, con los aceites y tensioactivos siendo biodegradables (que se pueden metabolizar) y biocompatibles. Las gotas de aceite en la emulsión son generalmente menores de 5 pm de diámetro, e idealmente tener un diámetro submicrométrico, alcanzando estos tamaños pequeños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Las gotas con un tamaño menor de 220 nm son preferidas dado que se pueden someter a esterilización por filtrado.

La emulsión puede comprender aceites tal como los de una fuente animal (tal como peces) o vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. El aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de algodón o aceite de oliva, el más comúnmente disponible, ejemplifican los aceites de frutos secos. Se puede usar aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido a partir de la jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de sésamo y similares. En el grupo de los cereales, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero el aceite de otros cereales tales como el trigo, la avena, el centeno, el arroz, el teff, el triticale y similares también se pueden usar. Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no se dan de manera natural en aceites de semilla, se pueden preparar mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados comenzando a partir de los aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y aceites de la leche de mamífero se pueden metabolizar y, por tanto, se pueden usar en la práctica de la presente invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros a partir de fuentes animales son bien conocidos en la materia. La mayoría de animales marinos contienen aceites que se pueden metabolizar que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón, y los aceites de ballena tales como esperma de ballena ejemplifican varios de los aceites de animales marinos que se pueden usar en el presente documento. Una serie de aceites de cadena ramificada se sintetizan de manera bioquímica en unidades de isopreno de 5 carbonos y se denominan de manera general terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide ramificado e insaturado conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que es particularmente preferido en el presente documento. El escualano, el análogo saturado del escualeno, es también un aceite preferido. Los aceites de animales marinos, incluyendo escualeno y escualano, están fácilmente disponibles a partir de fuentes comerciales o se pueden obtener mediante procedimientos conocidos en la materia. Otros aceites preferidos son los tocoferoles (véase a continuación). Se pueden usar mezclas de aceites.

Los tensioactivos se pueden clasificar por su "HLB" (equilibrio hidrófilo-lipófilo). Los tensioactivos preferidos de la invención tienen un HLB de al menos 10, preferentemente al menos 15, y más preferentemente al menos 16. La invención se puede usar con tensioactivos que incluyen, pero sin limitación: los tensioactivos de ésteres de polioxietilen sorbitán (comúnmente denominados Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), y/u óxido de butileno (BO), comerciliazados bajo el nombre comercial de DOWFAX™, tal como copolímeros de bloque EO / PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de repeticiones de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo), con octoxinol-9 (Triton X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol) siendo de interés particular; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tal como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilados de nonilfenol, tal como la serie NP de Tergitol™; éteres grasos de polioxietileno que provienen de alcoholes de laurilo, cetilo, estearilo y oleilo (conocidos como tensioactivos Brij), tal como el trietilenglicol monolauril éter (Brij 30); y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como SPAN), tal como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Se prefieren los tensioactivos no iónicos. Los tensioactivos preferidos para incluirlos en la emulsión son Tween 80 (monooleato de polioxietileno sorbitán), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Triton X-100.

Se pueden usar mezclas de tensioactivos, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85. Una combinación de un éster de polioxietilen sorbitán tal como monooleato de polioxietilen sorbitán (Tween 80) y un octoxinol tal como toctilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) es también adecuada. Otra combinación útil comprende laureth 9 y más un éster de polioxietilen sorbitán y/o un octoxinol.

Las cantidades preferentes de tensioactivos (% en peso) son: ésteres de polioxietilen sorbitán (tal como Tween 80 ) de 0,01 al 1 %, en particular, aproximadamente el 0,1 %; octil- o nonilfenoxietanoles (tal como Triton X-100 u otros detergentes de la serie Triton) del 0,001 al 0,1 %, en particular, del 0,005 al 0,02 %; éteres de polioxietileno (tal como laureth 9) del 0,1 al 20 %, preferentemente del 0,1 al 10 % y en particular, del 0,1 al 1 % o aproximadamente el 0,5 %.

Los adyuvantes de emulsión preferentes tienen un tamaño de gota promedio de <1 pm, por ejemplo, <750 nm, <500 nm, <400 nm, <300 nm, <250 nm, <220 nm, <200 nm, o más pequeño. Estos tamaños de gota se pueden lograr convenientemente mediante técnicas tales como la microfluidización.

Los adyuvantes específicos de emulsión de aceite en agua útiles para la invención incluyen, pero sin limitación:

• Una emulsión submicrométrica de escualeno, Tween 80 y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser de aproximadamente el 5 % de escualeno, aproximadamente el 0,5 % de polisorbato 80 y aproximadamente el 0,5 % de Span 85. En términos de peso, estas proporciones llegan a ser del 4,3 % de escualeno, el 0,5 % de polisorbato 80 y el 0,48 % de Span 85. Este adyuvante se conoce como 'MF59' [45-47], tal como se describe en más detalle en el Capítulo 10 de la ref. 48 y en el capítulo 12 de la ref. 49. La emulsión MF59 ventajosamente incluye iones de citrato, por ejemplo, tampón de citrato de sodio 10 mM.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y polisorbato 80 (Tween 80). La emulsión puede incluir solución salina tamponada con fosfato. También puede incluir Span 85 (por ejemplo, al 1 %) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener desde el 2 hasta el 10 % de escualeno, desde el 2 hasta el 10 % de tocoferol y desde el 0,3 hasta el 3 % de Tween 80, y la proporción de peso de escualeno:tocoferol es preferentemente <1 dado que esto proporciona una emulsión más estable. El escualeno y Tween 80 pueden estar presentes en una proporción de volumen de aproximadamente 5:2 o en una proporción de peso de aproximadamente 11:5. Una emulsión así se puede preparar disolviendo Tween 80 en PBS para dar una solución del 2 %, después mezclando 90 ml de esta solución con una mezcla de 5 g de DL-a-tocoferol y 5 ml de escualeno, después microfluidizando la mezcla. La emulsión resultante pude tener gotas submicrométricas de aceite, por ejemplo, con un diámetro promedio de entre 100 y 250 nm, preferentemente de aproximadamente 180 nm. La emulsión también puede incluir un monofosforil lípido A 3-de-O-acilado (3d-MPL). Otra emulsión útil de este tipo puede comprender, por dosis humana, 0,5-10 mg de escualeno, 0,5-11 mg de tocoferol y 0,1-4 mg de polisorbato 80 [50].

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente Triton (por ejemplo Triton X-100). La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La emulsión puede contener un tampón fosfato.

• Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente de Triton (por ejemplo, Triton X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un succinato de a-tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes en una relación de masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo, 750 pg/ml de polisorbato 80, 110 pg/ml de Triton X-100 y 100 pg/ml de succinato de a-tocoferol), y estas concentraciones deben de incluir cualquier contribución de estos componentes a partir de los antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La fase acuosa puede contener un tampón fosfato.

• Una emulsión de escualano, polisorbato 80 y poloxámero 401 ("Pluronic™ L121"). La emulsión se puede formular en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de administración útil para dipéptidos de muramilo, y se ha usado con treonil-MDP en el adyuvante "SAF-1" [51] (0,05-1 % de Thr-MDP, el 5 % de escualano, el 2,5 % de Pluronic L121 y el 0,2 % de polisorbato 80). También se puede usar sin el Thr-MDP, como en el adyuvante "AF" (52) (5 % de escualano, 1,25% de Pluronic L121 y el 0,2 % de polisorbato 80). Se prefiere la microfluidización.

• Una emulsión que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un tensioactivo no iónico hidrófilo de polioxietileno alquiléter (por ejemplo, polioxietileno (12) cetoesteariléter) y un tensioactivo no iónico hidrofóbico (por ejemplo, un éster de sorbitán o un éster de manida, tal como monoleato de sorbitán o 'Span 80'). La emulsión es preferentemente termorreversible y/o tiene al menos el 90 % de las gotas de aceite (en volumen) con un tamaño menor de 200 nm [53]. La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azúcar, tal como dodecil maltósido y/o sacarosa); y/o un alquilpoliglucósido. La emulsión puede incluir un agonista de TLR4 [54]. Tales emulsiones se pueden liofilizar.

• Una emulsión de escualeno, poloxámero 105 y Abil-Care [55]. La concentración final (peso) de estos componentes en vacunas con adyuvante es del 5 % de escualeno, el 4 % de poloxámero 105 (poliol plurónico) y el 2 % de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicérido caprílico/cáprico).

• Una emulsión que tiene desde el 0,5-50 % de un aceite, el 0,1-10 % de un fosfolípido y el 0,05-5 % de un tensioactivo no iónico. Tal como se describe en la referencia 56, los componentes de fosfolípidos preferidos son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina. Los tamaños de gota submicrométricos son ventajosos.

• Una emulsión de aceite en agua de un aceite que no se puede metabolizar (tal como aceite mineral ligero) y al menos un tensioactivo (tal como lecitina, Tween 80 o Span 80). Se pueden incluir aditivos, tal como saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito en la referencia 57, producido mediante la adición de una amina alifática la desacilsaponina mediante el grupo carboxilo del ácido glucurónico), bromuro de dimetiidioctadecilamonio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil)propanodiamina.

• Una emulsión en la que una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, un colesterol) se asocian como micelas helicoidales [58].

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso no iónico, lipofílico y etoxilado y un tensioactivo no iónico hidrofílico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno) [59].

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso no iónico, hidrófilo y etoxilado, y un tensioactivo no iónico lipófilo (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno) [59].

En algunas realizaciones, una emulsión se puede mezclar con antígeno de manera extemporánea, al momento de la administración y, por lo tanto, el adyuvante y el antígeno se pueden mantener por separado en una vacuna empacada o distribuida, lista para la formulación final en el momento de su uso. En otras realizaciones, una emulsión se mezcla con antígeno durante la fabricación, y por lo tanto, la composición se envasa en una forma líquida con adyuvante. El antígeno estará de manera general en una forma acuosa, de manera que la vacuna se prepare finalmente mezclando dos líquidos. La proporción en volumen de los dos líquidos para la mezcla puede variar (por ejemplo, entre 5:1 y 1:5) pero está generalmente sobre 1:1. Cuando las concentraciones de los componentes se dan en las descripciones anteriores de emulsiones específicas, estas concentraciones son típicamente para una composición no diluida y la concentración tras la mezcla con una solución de antígeno, por lo tanto, disminuirá.

Cuando una composición incluye un tocoferol, se puede usar cualquiera de los tocoferoles a, p, ^y, 6, £ o ,^ pero son preferentes los a-tocoferoles. El tocoferol puede adoptar varias formas, por ejemplo, diferentes sales y/o isómeros. Las sales incluyen sales orgánicas, tales como succinato, acetato, nicotinato, etc. Se puede usar tanto D-a-tocoferol como DL-a-tocoferol. Los tocoferoles se incluyen de manera ventajosa en las vacunas para uso en pacientes ancianos (por ejemplo, de 60 años de edad o mayores) dado que se ha documentado que la vitamina E tiene un efecto positivo sobre la respuesta inmunitaria en este grupo de pacientes [60]. También tienen propiedades antioxidantes que pueden ayudar a estabilizar las emulsiones [61]. Un a-tocoferol preferido es DL-a-tocoferol, y la sal preferida de este tocoferol es el succinato. Se ha descubierto que la sal de succionato coopera con los ligandos relacionados con TNF in vivo.

C. Formulaciones de saponina Icapítulo 22 de la ref. 4811

Las formulaciones de saponina también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterogéneo de glucósidos de esterol y glucósidos de triterpenoides que se encuentran en la corteza, en las hojas, en los tallos, en las raíces e incluso en las flores de un rango amplio de especies vegetales. La saponina de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina se ha estudiado ampliamente como adyuvantes. La saponina también se puede obtener comercialmente de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia), y Saponaria officianalis (raíz de jabón). Las formulaciones de adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones de lípidos, tales como ISCOMs. QS21 se comercializa como Stimulon™.

Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones específicas purificadas usando estas técnicas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Un procedimiento de producción de QS21 se desvela en la ref. 62. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [63].

Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden usar para formar partículas únicas denominadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM) [capítulo 23 de la ref. 48]. Los ISCOM típicamente también incluyen un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Cualquier saponina conocida se puede usar en los ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las refs. 63-65. Opcionalmente, los ISCOM se pueden estar desprovistos de detergente adicional [66].

Una revisión del desarrollo de los adyuvantes basados en saponinas se puede encontrar en las referencias. 67 y 68.

D. Virosomas y partículas de tipo virus

Los virosomas y partículas de tipo virus (VLP) también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. De manera general, son no patógenos, replicantes, y generalmente no contienen ninguno del genoma vírico natural. Las proteínas víricas se pueden producir de manera recombinante o aislar de los virus completos. Estas proteínas víricas adecuadas para uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus de la gripe (tal como HA o NA), del virus de la hepatitis B (tal como las proteínas del núcleo o de la cápside), del virus de la hepatitis E, del virus del sarampión, del virus Sindbis, del rotavirus, del virus de la enfermedad de fiebre aftosa, del retrovirus, del Virus de Norwalk, del virus del papiloma humano, del VIH, de los fagos de ARN, del fago Qp (tal como proteínas de revestimiento), del fago GA, del fago fr, del fago AP205 y de Ty (tal como la proteína p1 del retrotransposón Ty).. Las VLP se discuten con más detalle en las referencias. 69-74. Los virosomas se tratan adicionalmente en, por ejemplo, la ref. 75.

E. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tal como derivados no tóxicos de lipopolisacáridos enterobacterianos (LPS), derivados de lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas ADP-ribosilantes y derivados detoxificados de las mismas.

Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-deacilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla de monofosforil lípido A 3 de-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma de "pequeña partícula" preferida de monofosforil lípido A 3 De-O-acilado se desvela en la ref. 76. Tales "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas para esterilizarlas por filtración a través de una membrana de 0,22 pm [76]. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen miméticos de monofosforil lípido A, tal como derivados de aminoalquil glucosaminida fosfato, por ejemplo, RC-529 [77,78].

Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tal como OM-174. OM-174 se describe por ejemplo en las refs. 79 y 80.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contienen una citosina no metilada enlazada mediante una unión de fosfato a una guanosina). Los ARN de cadena doble y los nucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) también han demostrado ser inmunoestimuladores.

Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tal como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble cadena o de cadena individual. Las referencias 81, 82 y 83 desvelan posibles sustituciones análogas, por ejemplo sustitución de guanosina con 2'-desoxi-7-deazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se trata adicionalmente en las refs. 84-89.

Se puede dirigir la secuencia CpG a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [90]. La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria Th1, tal como un ODN de CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como un ODN CdG-B. Los ODN de CpG-A y CpG-B se discuten en las referencias. 91-93. Preferentemente, el CpG es un ODN CpG-A.

Preferentemente, el oligonucleótido CpG se construye de manera que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, se pueden unir dos secuencias de oligonucleótidos CpG en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Véanse, por ejemplo, las refs. 90-94, 96.

Un adyuvante útil de CpG es CpG7909, también conocido como ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Otro es CpG1826. Como alternativa o adicionalmente, para usar secuencias CpG, se pueden usar las secuencias TpG [97], y estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. El oligonucleótido inmunoestimulador puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de timidina consecutivo (por ejemplo TTTT, tal como se desvela en la ref. 97), y/o puede tener una composición de nucleótidos con > 25 % en timidina (por ejemplo, > 35%, > 40%, > 50%, > 60%, > 80%, etc.). Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de citosina consecutivo (por ejemplo CCCC, tal como se desvela en la ref. 97), y/o puede tener una composición de nucleótidos con > 25 % en citosina (por ejemplo, > 35%, > 40%, > 50%, > 60%, > 80%, etc.). Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores comprenderán típicamente al menos 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos.

Un adyuvante particularmente útil con base en oligonucleótidos inmunoestimuladores, se conoce como IC-31™ [98]. Por lo tanto, un adyuvante usado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo, entre 15-40 nucleótidos) que incluye al menos un (y preferentemente, múltiples) motivo CpI (es decir, una citosina enlazada a una inosina para formar un dinucleótido) y (II) un polímero policatiónico, tal como un oligopéptido (por ejemplo, entre 5-20 aminoácidos) que incluye al menos una (y preferentemente múltiples) secuencias de tripéptido Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende una secuencia de 26-mero 5'-(IC)13-3' (SEQ ID NO: 66). El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende una secuencia 11-mera de aminoácidos KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 67). El oligonucleótido y el polímero pueden formar complejos, por ejemplo, tal como se desvela en las referencias 99 y 100.

Las toxinas ribosilantes de ADP bacteriano y los derivados detoxificados de las mismas se pueden usar como adyuvantes en la invención. Preferentemente, la proteína proviene de E. coli (enterotoxina de E.coli lábil al calor, "LT"), del cólera ("CT") o de pertussis ("PT"). El uso de las toxinas ADP-ribosilantes detoxificadas como adyuvantes de la mucosa se describe en la ref. 101 y como adyuvantes parenterales en la referencia 102. La toxina o el toxoide está preferentemente en la forma de una holotoxina, que comprende las subunidades A y B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación detoxificante; preferentemente, la subunidad B no está mutada. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación para detoxificación; preferentemente, la subunidad B no está mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante LT detoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de toxinas ADP-ribosiladas y sus derivados detoxificados, en particular LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes puede encontrarse en las referencias. 103-110. Un mutante de CT útil es CT-E29H [111]. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas ADP-ribosilantes expuestas en la ref. 112.

F. Inmunomoduladores humanos

Los inmunomoduladores humanos adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas, tal como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [113], etc.) [114], interferones (por ejemplo, interferóny), factor estimulante de colonias de macrófagos, y factor de necrosis tumoral. Un inmunomodulador preferido es IL-12.

G. Bioadhesivos y mucoadhesivos

Los bioadhesivos y mucoadhesivos también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificadas [115] o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de ácido poli(acrílico), alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. El quitosano y los derivados del mismo también se pueden usar como adyuvantes en la invención [116].

H. Micropartículas

Las micropartículas también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 pm de diámetro, más preferentemente de ~200 nm a ~ 30 pm de diámetro, y lo más preferentemente de ~500 nm a ~10 pm de diámetro) formada a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo,, un poli(a-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(láctido-co-glicólido) son preferentes, opcionalmente tratados para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la ref. 48)

Los ejemplos de las formulaciones de liposoma adecuadas para uso como adyuvantes se describen en las referencias.

117-119.

J. Formulaciones de éter de polioxietileno y de éster de polioxietileno

Los adyuvantes adecuados para uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [120]. Tales formulaciones incluyen adicionalmente tensioactivos de éster de polioxietileno sorbitán en combinación con un octoxinol [121] así como polioxietileno alquil éteres o tensioactivos de éster en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol [122]. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: polioxietilen-9-lauril éter (laureth 9), polioxietilen-9 esteroil éter, polioxietilen-8-esteroil éter, polioxietilen-4-lauril éter, polioxietilen-35-lauril éter, y polioxietilen-23-lauril éter.

K. Fosfacenos

Se puede usar un fosfaceno, tal como poli[di(carboxilatofenoxi)fosfaceno] ("PCPP") tal como se describe, por ejemplo, en las referencias 123 y 124.

L. Péptidos de muramilo

Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).

M. Compuestos de imidazoquinolona

Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen Imiquimod ("R-837") [125, 126], Resiquimod ("R-848") [127], y sus análogos; y sus sales (por ejemplo, sales de clorhidrato). Los detalles adicionales sobre las imidazoquinolinas inmunoestimuladoras se pueden encontrar en las referencias 128 a 132.

N. Ureas sustituidas

Las ureas sustituidas útiles como adyuvantes incluyen los compuestos de fórmula I, II o III, o sus sales:

como se define en la referencia 133, tal como 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', ER 804058', 'ER 804059',

'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', ER 803022 o 'ER 804057' porej.,:

O. Adyuvantes adicionales

Los adyuvantes adicionales que se pueden usar con la invención incluyen:

• Diguanilato cíclico (’c-di-GMP’), que se ha documentado como un adyuvante útil para las vacunas de S. aureus [134].

• Un compuesto de tiosemicarbazona, tal como los desvelados en la referencia 135. Los procedimientos para formular, fabricar y seleccionar compuestos activos también se describen en la referencia 135. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares humanas de sangre periférica para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

• Un compuesto de triptantrina, tal como los desvelados en la referencia 136. Los procedimientos para formular, fabricar y seleccionar compuestos activos también se describen en la referencia 136. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares humanas de sangre periférica para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

• Un análogo de nucleósido, tal como: (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):

y profármacos de los mismos; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) los compuestos desvelados en las referencias 137 a 139, Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) [140].

• Los compuestos desvelados en la referencia 141, incluyendo: compuestos de acilpiperazina, compuestos de indolediona, compuestos de tetrahidraisoquinolina (Th IQ), compuestos de benzociclodiona, compuestos de aminoazavinilo, compuestos de aminobenzimidazol quinolinona (ABIQ) [142, 143], compuestos de hidraptalamida, compuestos de benzofenona, compuestos de isoxazol, compuestos de esterol, compuestos de quinazilinona, compuestos de pirrol [144], compuestos de antraquinona, compuestos de quinoxalina, compuestos de triazina, compuestos de pirazalopirimidina, y compuestos de benzazol [145].

• Compuestos que contienen lípidos enlazados a una estructura principal acíclica que contiene fosfato, tales como el antagonista de TLR4 e 5564 [146,147]:

• Un polímero de polioxidonio [148, 149] u otros derivados N-oxidados de polietileno-piperazina.

• Metil inosina 5'-monofosfato ("MIMP") [150].

• Un compuesto de polihidroxilado de pirrolizidina [151], tal como el que tiene la fórmula:

en la que R se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, grupos acilo, alquilo (por ejemplo, cicloalquilo), alquenilo, alquinilo y arilo lineales o ramificados, no sustituidos o sustituidos, saturados o insaturados, o una sal o derivado aceptable para uso farmacéutico. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: casuarina, casuarina-6-a-D-glucopiranosa, 3-ep/-casuarina, 7-ep/-casuarina, 3,7-diep/-casuarina, etc.

• Un ligando de CDId , tal como una a-glucosilceramida [152-159] (por ejemplo, a-galactosilceramida), a-glucosilceramidas que contienen fitoesfingosina, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(a-D-galactopiranosil)-2-(N-hexacosanoilamino)-1,3,4-octadecanotriol], CRONY-101,3"-O-sulfo-galactosilceramida, etc.

• Una gamma inulina [160] o derivado de la misma, tal como algammulina.

Combinaciones de adyuvantes

La invención también puede comprender combinaciones de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, las siguientes composiciones de adyuvantes se pueden usar en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [161]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL) [162]; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL) un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) 3dMPL IL-12 (opcionalmente, un esterol) [163]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [164]; (6) SAF, que contiene el 10 % de escualano, el 0,4 % de Tween 80™, el 5 % de polímero de bloques de plurónico L121, y thr-MDP, bien microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado vorticialmente para generar una emulsión de partículas de tamaño más grande. (7) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y estructura de pared celular (CWS), preferentemente MPL CWS (Detox™); y (8) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).

Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se desvelan en el capítulo 7 de la referencia 48.

El uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio es particularmente preferente, y los antígenos están generalmente adsorbidos a estas sales. El fosfato de calcio es otro adyuvante preferido. Otras combinaciones de adyuvantes preferidas incluyen combinaciones de adyuvantes de Th1 y Th2 tales como CpG y alumbre o resiquimod y alumbre. Se puede usar una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL.

Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente de protección de la temperatura. Este componente puede ser particularmente útil en composiciones con adyuvante (particularmente, aquellas que contienen un adyuvante mineral, tal como una sal de aluminio). Tal como se describe en la referencia 165, un agente protector de temperatura líquido se puede añadir a una composición de vacuna acuosa para disminuir su punto de congelación, por ejemplo, para reducir el punto de congelación por debajo de 0 °C. Por lo tanto, la composición se puede almacenar por debajo de los 0 °C, pero por encima de su punto de congelación, para inhibir su degradación térmica. El agente protector de temperatura también permite la congelación de la composición mientras que protege los adyuvantes de sales minerales frente a la aglomeración o sedimentación tras la congelación y descongelación, y también puede proteger la composición a elevadas temperaturas, por ejemplo, por encima de 40 °C. Una vacuna acuosa de partida y el agente protector de temperatura líquido se pueden mezclar de manera que el agente protector de temperatura líquido forme del 1 al 80 % del volumen de la mezcla final. Los agentes protectores de temperatura adecuados deberían ser seguros para la administración humana, fácilmente miscibles/solubles en agua, y no deberían dañar otros componentes (por ejemplo, antígeno y adyuvante) en la composición. Los ejemplos incluyen glicerina, propilenglicol, y/o polietilenglicol (PEG). Los PEG adecuados pueden tener un peso molecular promedio que varía desde 200 hasta 20.000 Da. En una realización preferida, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 300 Da ('PEG-300').

También se describe en la presente memoria una composición inmunogénica que comprende: (i) una o más VME de la invención y (ii) un agente protector de temperatura. Esta composición se puede formar mezclando (i) una composición acuosa que comprende una o más VME de la invención, con (ii) un agente protector de temperatura. La mezcla se puede almacenar por ejemplo, por debajo de los 0 °C, de 0-20 °C, de 20-35 °C, de 35-55 °C o más. Se puede almacenar en forma líquida o congelada. La mezcla se puede liofilizar. La composición se puede formar de manera alternativa mezclando (i) una composición seca que comprende una o más VME de la invención, con (ii) una composición líquida que comprende un agente protector de temperatura. Por lo tanto, el componente (ii) se puede usar para reconstituir el componente (i).

Las composiciones pueden generar tanto una respuesta inmunitaria mediada por células como una respuesta inmunitaria humoral. Esta respuesta inmunitaria inducirá preferentemente anticuerpos de larga duración (por ejemplo, neutralizantes) y una inmunidad mediada por células que puede responder rápidamente tras la exposición al patógeno (por ejemplo, a Chlamydia).

Se presume que dos tipos de linfocitos T, los CD4 y los CD8 son necesarios para iniciar y/o mejorar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral. Los linfocitos T CD8 pueden expresar un correceptor de CD8 y se denominan comúnmente linfocitos T citotóxicos (LTC). Los linfocitos T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con antígenos presentados en las moléculas de MHC de Clase I.

Los linfocitos T CD4 pueden expresar un correceptor de CD4, y se denominan comúnmente células T colaboradoras. Los linfocitos T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a las moléculas de MHC de clase II. Tras la interacción con una molécula de MHC de clase II, los linfocitos CD4 pueden secretar factores tales como citocinas. Estas citocinas secretadas pueden activar los linfocitos B, los linfocitos T citotóxicos, los macrófagos, y otras células que participan en una respuesta inmunitaria. Las células T colaboradoras o células CD4+ pueden dividirse a su vez en dos subconjuntos funcionalmente distintos: Fenotipo TH1 y fenotipo TH2 que difieren en su función citocínica y efectora.

Las células TH1 activadas mejoran la inmunidad celular (incluyendo un aumento en la producción de LTC específicos de antígeno) y por tanto son de valor particular en la respuesta a las infecciones intracelulares. Las células TH1 activadas pueden secretar una o más de IL-2, IFN-^y, y TNF-p. Una respuesta inmunitaria de TH1 puede dar como resultado reacciones inflamatorias locales mediante la activación de macrófagos, células NK (linfocitos citolíticos naturales) y linfocitos T CD8 citotóxicos (LTC). Una respuesta inmunitaria de TH1 también puede actuar para expandir la respuesta inmunitaria mediante la estimulación del crecimiento de linfocitos B y T con IL-12. Los linfocitos B estimulados por TH1 pueden secretar IgG2a.

Las células TH2 activadas mejoran la producción de anticuerpos y son, por tanto, de valor en la respuesta a infecciones extracelulares. Los linfocitos TH2 activados pueden secretar uno o más de IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10. Una respuesta inmune de TH2 puede dar como resultado la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria para una futura protección.

Una respuesta inmunitaria mejorada puede incluir una o más de una respuesta inmunitaria de TH1 y una respuesta inmunitaria de TH2.

Una respuesta inmunitaria de TH1 puede incluir uno o más de un aumento en LTC, un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria de TH1 (tal como IL-2, IFN-y, y TNF-p), un aumento en los macrófagos activados, un aumento en la actividad de las NK, o un aumento en la producción de IgG2a. Preferentemente, Preferentemente, la respuesta inmunitaria de TH1 mejorada incluirá un aumento en la producción de IgG2a.

Una respuesta inmunitaria de TH1 se puede promover usando un adyuvante de TH1. Un adyuvante de TH1 generalmente promoverá niveles elevados de producción de IgG2a relacionados con la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH1 adecuados para su uso en la invención pueden incluir por ejemplo formulaciones de saponina, virosomas y partículas de tipo virus, derivados no tóxicos de lipopolisacáridos enterobacterianos (LPS), oligonucleótidos inmunoestimuladores. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores, tales como los oligonucleótidos que contiene un motivo de CpG, son adyuvantes TH1 preferidos para su uso en la invención.

Una respuesta inmunitaria de TH2 puede incluir uno o más de un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria de TH2 (tal como IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10), o un aumento en la producción de IgG1, IgE, IgA y células B de memoria. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de TH2 mejorada incluirá un aumento en la producción de IgG1.

La respuesta inmunitaria de TH2 se puede promover usando un adyuvante de TH2. Un adyuvante de TH2 generalmente promoverá niveles elevados de producción de IgG1 relacionados con la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH2 adecuados para su uso en la invención incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite, y toxinas ADP-ribosilantes y derivados detoxificados de las mismas. Las composiciones que contienen minerales, tales como sales de aluminio son adyuvantes de TH2 preferidos para su uso en la invención.

También se describe en la presente memoria una composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y un adyuvante de t H2. Tal composición puede generar una respuesta mejorada de TH1 y TH2, es decir, un aumento en la producción tanto de IgG1 como de la producción de IgG2 en relación con la inmunización sin un adyuvante. La composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y TH2 puede generar una respuesta inmunitaria elevada de t H1 y TH2 en relación con un único adyuvante (es decir, en relación con la inmunización con un adyuvante solo de TH1 o la inmunización con un adyuvante solo de TH2).

La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria de TH1 y una respuesta de TH2. La respuesta inmunitaria puede proporcionar una o ambas de una respuesta mejorada de TH1 y una respuesta mejorada de TH2.

La respuesta inmunitaria mejorada puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica o de la mucosa. La respuesta inmunitaria puede proporcionar uno o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica mejorada y una respuesta inmunitaria de la mucosa mejorada. La respuesta inmunitaria de la mucosa puede ser una respuesta inmunitaria de TH2. La respuesta inmunitaria de la mucosa incluye un aumento en la producción de IgA.

Procedimiento de tratamiento y administración de la vacuna

También se describe en la presente memoria un procedimiento para aumentar una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una OMV o de la composición inmunogénica de la invención. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y preferentemente implica anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El procedimiento puede generar una respuesta de refuerzo.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para inmunizar un mamífero frente a una infección por Chlamydia, preferentemente frente a la infección por C. trachomatis, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una OMV o una composición inmunogénica de la invención.

También se describe en la presente memoria una OMV de la invención en combinación con un antígeno adicional para su uso combinado como un medicamento para la administración simultánea, separada o secuencial, por ejemplo, para su uso en el aumento de una respuesta inmunitaria en un mamífero.

La invención también proporciona una OMV o una composición inmunogénica para su uso en terapia.

También se describe en la presente memoria el uso de una OMV de la invención en la fabricación de un medicamento para el aumento de una respuesta inmunitaria en un mamífero. Al generar una respuesta inmunitaria en el mamífero mediante estos usos y procedimientos, el mamífero se puede proteger frente a la infección por el patógeno, por ejemplo, frente a la infección por Chlamydia. Más particularmente, el mamífero se puede proteger frente a la infección por Chlamydia trachomatis. La invención es eficaz frente a diversos serotipos diferentes de Chlamydia, pero puede ser particularmente útil en la protección frente a enfermedades que son resultado de la infección de Chlamydia de cepas del serotipo D.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, la invención también proporciona una OMV, un anticuerpo o una composición inmunogénica para uso como un medicamento (por ejemplo, una vacuna). En una realización, la OMV, el anticuerpo o la composición inmunogénica se usan para el tratamiento, la prevención o el diagnóstico de la infección por Chlamydia (preferentemente C. trachomatis) en un mamífero. También se describe en la presente memoria un procedimiento para tratamiento, prevención o diagnóstico de infección por Chlamydia (preferentemente, infección por C. trachomatis) en un paciente (preferentemente un mamífero), que comprende la administración de una cantidad eficaz para uso terapéutico de una OMV o un anticuerpo de la invención.

La OMV o el anticuerpo descritos en la presente memoria puede ser para uso en el tratamiento o la prevención de infección por Chlamydia o una afección asociada (por ejemplo, tracoma, ceguera, cervicitis, enfermedad inflamatoria pélvica, infertilidad, embarazo ectópico, dolor pélvico crónico, salpingitis, uretritis, epididimitis, neumonía infantil, carcinoma de células escamosas del cuello uterino, infección por VIH, etc.), preferentemente, infección por C.

trachomatis (tal como una afección ocular, una afección del tracto urogenital o un linfogranuloma venéreo invasivo que está causado por C. trachomatis). La composición inmunogénica puede ser eficaz de manera adicional o como alternativa frente a C. pneumoniae.

En algunas realizaciones, la OMV de la presente invención es para uso en el aumento de anticuerpos neutralizantes frente a la infección por un patógeno particular. El patógeno es preferentemente una bacteria o un virus. Los ejemplos de bacterias adecuadas son Chlamydia, Streptococcus, Salmonella, E. coli y Helicobacter. Los ejemplos de virus adecuados son VIH, el virus de la gripe y el virus de Epstein Barr. Preferentemente, la OMV es para uso en el aumento de anticuerpos neutralizantes frente a Chlamydia, por ejemplo, frente a C. trachomatis, C. pneumoniae o C. muridarum.

El mamífero es preferentemente un ser humano. Las vacunas preparadas de acuerdo con la invención se pueden usar para tratar tanto a niños como a adultos. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño que está aprendiendo a andar o un lactante) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a los niños también se puede administrar a los adultos, por ejemplo, para evaluar su seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc. Por lo tanto, un paciente humano puede ser de menos de 1 año de edad, de 1-5 años de edad, de 5-15 años de edad, de 15-55 años de edad, o al menos de 55 años de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son personas que están en la pubertad, adolescentes, personas sexualmente activas, en la vejez (por ejemplo, >50 años de edad, >60 años de edad, y preferentemente >65 años), en la infancia (por ejemplo, <5 años de edad), pacientes hospitalizados, personal sanitario, las fuerzas armadas y efectivos militares, mujeres embarazadas, los enfermos crónicos o pacientes inmunodeprimidos. Las vacunas no solo son adecuadas para estos grupos, sin embargo, y se pueden usar de manera más general en una población.

Las vacunas producidas por la invención se pueden administrar a pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la consulta médica o la visita a un profesional de la salud o a un centro de vacunación) otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna de papilomavirus tal como Cervarix® o Gardasil®; una vacuna del tétanos, de difteria y de pertussis acelular tal como TDaP, DTaP o Boostrix®; una vacuna de la rubeola tal como MMR; o una vacuna de la tuberculosis tal como la BCG. Los ejemplos de otras vacunas producidas por la invención que se pueden administrar sustancialmente al mismo tiempo que la vacuna producida por la invención son una vacuna del sarampión, una vacuna de lpaperas, una vacuna de varicela, una vacuna de MMRv , una vacuna de difteria, una vacuna de tétanos, una vacuna de pertussis, una vacuna DPT, una vacuna de H. influenziae de tipo b conjugada, una vacuna de poliovirus inactivo, una vacuna del virus de la hepatitis B, una vacuna de conjugado meningocócico (tal como la vacuna tetravalente A-C-W135-Y), una vacuna del virus respiratorio sincitial, etc.

En una realización preferente, la OMV de la invención se usa para generar anticuerpos que son capaces de neutralizar la infectividad o la virulencia de Chlamydia, por ejemplo, de Chlamydia trachomatis. Los anticuerpos neutralizantes se pueden usar como una vacuna capaz de neutralizar CE infecciosos neutralizantes. En una realización, la VME de la invención se usa para generar anticuerpos que son capaces de neutralizar la infectividad y/o la virulencia de Chlamydia. Por lo tanto, también se describen en la presente memoria anticuerpos para neutralizar la infectividad y/o la virulencia de Chlamydia.

También se describe en la presente memoria el uso de una OMV o un anticuerpo de la presente memoria en la fabricación de: (i) un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección bacteriana; (ii) un reactivo de diagnóstico para la detección de la presencia de bacterias o de anticuerpos generados frente a las bacterias; y/o (iii) un reactivo que puede generar anticuerpos contra las bacterias. Dichas bacterias son preferentemente de Chlamydia, por ejemplo, Chlamydia trachomatis o Chlamydia pneumoniae, pero son preferentemente de Chlamydia trachomatis.

Procedim ientos de detección y de diagnóstico

También se describe en la presente memoria un procedimiento para detectar un patógeno, tal como una bacteria de Chlamydia (por ejemplo, C. trachomatis) en una muestra. El procedimiento puede implicar la detección de la presencia o ausencia de un antígeno del patógeno o de ácido nucleico que codifica un antígeno del patógeno. El procedimiento se puede usar para la prueba microbiológica, para el diagnóstico clínico o no clínico, etc. La detección del antígeno puede implicar, por ejemplo, poner en contacto la muestra con un anticuerpo descrito en la presente memoria, tal como un anticuerpo marcado. La detección del antígeno de ácido nucleico puede implicar cualquier procedimiento conveniente, por ejemplo, con base en la hibridación de ácido nucleico, tal como mediante el uso de northern o southern blots, micromatrices de ácido nucleico o 'chips de genes', reacciones de amplificación (por ejemplo, PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, etc.).

También se describe en la presente memoria un procedimiento para detectar si un paciente se ha infectado con un patógeno (por ejemplo, una bacteria de Chlamydia tal como C. trachomatis), que comprende una etapa de detectar en una muestra tomada del paciente, la presencia o ausencia de un anticuerpo descrito en la presente memoria. La detección del antígeno puede implicar, por ejemplo, poner en contacto la muestra con un anticuerpo descrito en la presente memoria.

La presencia del antígeno (por ejemplo, el CT823), o de ácido nucleico que codifica el antígeno (por ejemplo, el antígeno CT823) o de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-CT823), indica la presencia del patógeno (por ejemplo, C. trachomatis) en la muestra. En un entorno de diagnóstico clínico, por lo tanto, los resultados del procedimiento se pueden usar para educar o dictar una estrategia terapéutica para un paciente, por ejemplo, una elección de antibióticos, etc.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para detectar un antígeno (por ejemplo, CT823), que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-CT823) con una muestra biológica en condicione adecuadas para la formación de un complejo anticuerpo-antígeno; y (b) detectar el complejo.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para detectar anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-CT823), que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un antígeno con una muestra biológica (por ejemplo, una muestra de sangre o de suero) en condiciones adecuadas para la formación de complejos anticuerpo-antígeno; y (b) detectar los complejos.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para diagnosticar una infección por un patógeno (por ejemplo, infección por Chlamydia), que comprende:

(a) generar un anticuerpo frente a un antígeno heterólogo presentado en el ámbito de una VME de acuerdo con la invención;

(b) poner en contacto el anticuerpo de la etapa (a) con una muestra biológica de la que se sospecha que está infectada por el patógeno (por ejemplo, Chlamydia) en condiciones adecuadas para la formación de complejos anticuerpo-antígeno; y

(c) detectar dichos complejos, en el que la detección de dicho complejo es indicativo de la infección por el patógeno (por ejemplo, infección por Chlamydia).

También se describe en la presente memoria el uso de OMV de la invención en inmunoensayos para detectar los niveles de anticuerpos (o, por el contrario, los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden usar para detectar los niveles de proteína). Se pueden desarrollar inmunoensayos basados en antígenos recombinantes bien definidos para sustituir los procedimientos de diagnóstico invasivos. Los anticuerpos para las proteínas de las muestras biológicas, incluyendo, por ejemplo, muestras de sangre o de suero, se pueden detectar. El diseño de los inmunoensayos está sujeto a una gran variación, y se conocen en la técnica una variedad de estos. Los protocolos para el inmunoensayo se pueden basar, por ejemplo, en los ensayos competitivos o de reacción directa o de tipo sándwich. Los protocolos también pueden, por ejemplo, usar soportes sólidos, o pueden ser mediante inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos implican el uso de anticuerpos o polipéptidos marcados; los marcadores pueden ser, por ejemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o de tinción. Los ensayos que amplifican las señales de la sonda también son conocidos; cuyos ejemplos son los ensayos que utilizan biotina y avidina, y los inmunoensayos marcados y mediados por enzimas, tal como los ensayos ELISA.

También se describen en la presente memoria kits adecuados para el inmunodiagnóstico y que contienen los reactivos marcadores apropiados, que se construyen empacando los materiales apropiados, incluyendo las composiciones de la invención, en recipientes adecuados, junto con los reactivos y materiales restantes (por ejemplo, tampones adecuados, soluciones salinas, etc) requeridos para llevar a cabo el ensayo, así como un conjunto adecuado de instrucciones del ensayo.

Pruebas de la eficacia de las composiciones

La eficacia de las composiciones inmunogénicas de la presente invención se puede evaluar in vitro e in vivo en modelos animales antes de la administración al huésped, por ejemplo, ser humano. Por ejemplo, la neutralización in vitro por Peterson y col. (1988) es adecuada para evaluar las composiciones de vacuna dirigidas a Chlamydia trachomatis.

Una forma de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico implica supervisar la infección (por ejemplo, la infección por C. trachomatis) tras la administración de las composiciones de la invención. Un modo de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica el control de respuestas inmunitarias tanto de manera sistémica (tales como el control del nivel de producción de IgG1 e IgG2) y mucosal (tal como el control del nivel de producción de IgA) frente a los antígenos (por ejemplo frente a antígenos de Chlamydia trachomatis) en las composiciones de la invención tras la administración de la composición. Normalmente, las respuestas de anticuerpos específicos del patógeno (por ejemplo, Chlamydia) en el suero se determinan tras la inmunización pero antes de la exposición mientras que se determinan respuestas de anticuerpos específicos del patógeno de la mucosa (por ejemplo, Chlamydia) tras la inmunización y antes de la exposición.

Un ejemplo de tal prueba in vitro se describe a continuación. El antisuero hiperinmunológico se diluye en PBS que contiene el 5 % de suero de cobaya, como una fuente complementaria. Chlamydia trachomatis (104 IFU; unidades formadoras de inclusión) se añade a las diluciones de antisueros. Las mezclas de antígeno-anticuerpo se incuban a 37 °C durante 45 minutos y se inoculan en monocapas duplicadas de células Hep-2 o HeLa confluentes contenidas en frascos de cristal (por ejemplo, 15 por 45 mm) que se han lavado dos veces con PBS antes de la inoculación. Las células de la monocapa se infectan mediante centrifugación a 1000X g durante 1 hora seguido por la incubación estacionaria a 37 °C durante 1 hora. Las monocapas infectadas se incuban durante 48 o 72 horas, se fijan y se tiñen con anticuerpos específicos de Chlamydia, tales como anti-PPME. Las células que llevan la inclusión se recuentan en diez campos a un aumento de 200X. El título de neutralización se asigna sobre la dilución que da el 50 % de inhibición en comparación con las monocapas de control/IFU.

Otro modo de evaluar la inmunogenicidad de las composiciones de la presente invención es expresar las proteínas de manera recombinante para seleccionar sueros o secreciones de las mucosas de pacientes mediante inmunotransferencia y/o micromatrices. Una reacción positiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha desarrollado una respuesta inmunitaria para el antígeno heterólogo en cuestión. Este procedimiento también se puede usar para identificar antígenos inmunodominantes y/o epítopos en antígenos.

La eficacia de las composiciones de vacuna también se puede determinar in vivo exponiendo modelos animales de infección (por ejemplo, infección por Chlamydia trachomatis), por ejemplo, cobayos o ratones, con las composiciones de vacuna. Por ejemplo, se pueden realizar estudios in vivo de exposición a la composición de la vacuna en el modelo de cobaya de infección por Chlamydia trachomatis. A continuación se da un ejemplo de este tipo de estrategia. Las cobayas hembra que pesan 450 - 500 g se instalan en una jaula en una sala ambientalmente controlada con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y se inmunizan con composiciones de vacuna a través de una variedad de rutas de inmunización. Tras la vacunación, los cobayos se infectan en el tracto genital con el agente de conjuntivitis de inclusión en cobayos (GPIC), que se ha cultivado en células HeLa o McCoy (Rank et al. (1988)). Cada animal recibe aproximadamente 1,4x107 unidades formadoras de inclusión (IFU) contenidas en 0,05 ml de tampón sacarosa-fosfatoglutamato, a pH 7,4 (Schacter, 1980). El trascurso de la infección se controla mediante la determinación del porcentaje de células que llevan la inclusión por inmunofluorescencia con antisuero específico de GPIC, o por frotis teñido con Giemsa de un raspado del tracto genital (Rank y col., 1988). Los títulos de anticuerpo en el suero se determinan mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

Como alternativa, se pueden realizar estudios in vivo de exposición a composiciones de vacuna en el modelo murino de Chlamydia trachomatis (Morrison et al., 1995). A continuación se da una descripción de un ejemplo de este tipo de estrategia. Los ratones hembra de 7 a 12 semanas de vida recibieron 2,5 mg de depo-provera por vía subcutánea en los días 10 t 3 antes de la infección vaginal. Tras la vacunación, los ratones se infectan en el tracto genital con 1.500 unidades formadoras de inclusión de Chlamydia trachomatis contenidas en 5 ml de tampón sacarosa-fosfatoglutamato, a pH 7,4. El trascurso de la infección se controla mediante la determinación del porcentaje de células que llevan la inclusión por inmunofluorescencia con antisuero específico de Chlamydia trachomatis, o por frotis teñido con Giemsa de un raspado del tracto genital de un ratón infectado. La presencia de los títulos de anticuerpo en el suero de un ratón se determinan mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

General

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se ilustran por completo en las referencias. Véanse, por ejemplo, las referencias 166-173, etc.

Cuando la descripción se refiere a un "epitopo", este epitopo puede ser un epitopo de células B y/o un epitopo de células T Tales epitopos se pueden identificar empíricamente (por ejemplo, usando PEPSCAN [174,175] o procedimientos similares), o se pueden predecir (por ejemplo, usando el índice antigénico de Jameson-Wolf [176], estrategias basadas en matrices [177], MAPITo Pe [178], TEPITOPE [179,180], redes naturales [181], OptiMer & EpiMer [182, 183], ADEPT [184], Tsites [185], hidrofilicidad [186], índice antigénico [187] o los procedimientos desvelados en las referencias 188-192, etc.). Los epítopos son las partes de un antígeno que se reconocen mediante y se unen a los sitios de unión a antígeno de los anticuerpos o los receptores de linfocitos T, y también pueden denominarse "determinantes antigénicos".

Cuando se omite un "dominio" del antígeno, esto puede implicar la omisión de un péptido señal, de un dominio citoplásmico, de un dominio transmembrana, de un dominio extracelular, etc.

El término "que comprende" abarca "que incluye" así como también "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x ± 10%.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significan que, cuando están alineadas, ese porcentaje de aminoácidos es el mismo al comparar las dos secuencias. La alineación y el porcentaje de homología o la identidad de secuencia se pueden determinar usando programas informáticos conocidos en la materia, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la ref. 193. Una alineación preferida se determina mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman que usa una búsqueda de hueco afín con una penalización de hueco abierto de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se desvela en la ref. 194.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A muestra los componentes del complejo Tol-Pal;

La Figura 1B es una representación esquemática de la inactivación del gen tolR en el ADN cromosómico de E. coli IHE 3034 usando la recombinación homóloga y sustituyéndolo con el casete de resistencia a la kanamicina;

La Figura 2 muestra el contenido proteico liberado en el sobrenadante del cultivo de E. coli de tipo silvestre (carril a mano izquierda) y de la cepa ΔTolR de E. coli (carril a mano derecha);

La Figura 3 es un gel SD-PAGE que muestra las proteínas totales de E. coli ΔTolR que expresa TC0106 (carril 1) , TC0052 (carril 2), TC0727 (carril 3) y TC02l0 (carril 4). Los marcadores de bajo peso molecular se proporcionan en el lado izquierdo del gel. Los círculos en los carriles 1, 2 y 4 indican la expresión de las proteínas TC0106, TC0052 y TC0210, respectivamente;

La Figura 4 es una representación esquemática de un protocolo de preparación de VME;

La Figura 5A muestra los resultados de análisis por transferencia de Western para (i) TC0052 (41 kDa), (ii) TC0106 (47 kDa), (iii) TC0210 (53 kDa) y (iv) TC0727 (58 kDa). Para el análisis por transferencia de Western (i), se analizaron las siguientes muestras de proteína: E. coli BL21(DE3)ΔTolR que expresa el antígeno heterólogo (carril 1); las proteínas totales contenidas en la OMV que expresa el antígeno heterólogo (carril 2) ; y las proteínas contenidas en la OMV preparada a partir de E. coli BL21(DE3)ΔTolR que no expresa el antígeno de Chlamydia (carril 3). Para cada uno de los Western blots (ii), (iii) y (iv), se analizaron las siguientes muestras de proteína: la proteína recombinante purificada de los clones de expresión de E. coli (carril 1); E. coli BL21(DE3)ΔTolR que expresa el antígeno heterólogo (carril 2); las proteínas totales contenidas en la OMV que expresa el antígeno heterólogo (carril 3); y las proteínas contenidas en la OMV preparada a partir de E. coli BL21(DE3)ΔTolR que no expresa el antígeno de Chlamydia (carril 4). Cada Western blot se incubó con suero obtenido mediante inmunización de ratones con el respectivo antígeno recombinante de Chlamydia purificado. Las flechas indican las bandas que se corresponden con los respectivos antígenos heterólogos.

La Figura 5B muestra los resultados de análisis por transferencia de Western para TC0313 y TC0890. Las muestras que se analizaron son las siguientes: marcadores de peso molecular estándar (carril de la izquierda); TC0313His (23 kDa) recombinante purificada de los clones de expresión de E. coli (carril 1); proteína TC0313 total contenida en la OMV que expresa el antígeno heterólogo (carril 2); proteínas contenidas en la OMV preparada a partir de E. coli BL21(DE3)ΔTolR que no expresa el antígeno de Chlamydia (carril 3); TC0890His (19 kDa) recombinante purificada de los clones de expresión de E. coli (carril 4); proteína TC0890 total contenida en la OMV que expresa el antígeno heterólogo (carril 5); proteínas contenidas en la OMV preparada a partir de E. coli BL21(DE3)ΔTolR que no expresa el antígeno de Chlamydia (carril 6). Los carriles 1, 2 y 3 se incubaron con sueros obtenidos mediante inmunización de ratones con antígeno recombinante TC0313 purificado (23 kDa), mientras que los carriles 4, 5 y 6 se incubaron con sueros obtenidos mediante la inmunización de ratones con antígeno recombinante TC0890 purificado (19 kDa). Los carriles se enumeran de izquierda a derecha. Las flechas indican las bandas correspondientes con los antígenos heterólogos de 23 kDa y de 19 kDa, respectivamente;

La Figura 5C muestra los resultados de los análisis por transferencia de Western de izquierda a derecha para (i) TC0651 (53 kDa), (ii) TC0551 (32 kDa) y (iii) TC0431 (90 kDa), respectivamente. Para TC0651, el carril 1 muestra las proteínas contenidas en la ^o M^v preparada a partir de E. coli BL21(DE3)ΔTolR que no expresa antígeno de Chlamydia, mientras que el carril 2 muestra la proteína TC0651 total contenida en OMV que expresa el antígeno heterólogo. Para TC0551, el carril 1 muestra TC0551His (32 kDa) recombinante purificada de los clones de expresión de E. coli, el carril 2 muestra TC0551 contenida en la OMV preparada a partir de E. coli BL21(DE3)ΔTolR que expresa TC0551 y el carril 3 muestra proteínas contenidas en la OMV preparada a partir de E. coli BL21(DE3)ΔTolR que no expresa el antígeno de Chlamydia. Para TC0431, el carril 1 muestra TC0431His (90 kDa) recombinante purificada de los clones de expresión de E. coli, el carril 2 muestra proteínas contenidas en la OMV preparada a partir de E. coli BL21(DE3)ΔTolR que no expresa el antígeno de Chlamydia y el carril 3 muestra TC0431 contenida en la OMV preparada a partir de E. coli BL21(DE3)ΔTolR que expresa TC0431;

La Figura 5D muestra los resultados de los análisis por transferencia de Western de izquierda a derecha para (i) TC0431 (90 kDa), y (ii) TC0052 (41 kDa). Para cada uno de los Western blot, el carril 1 se cargó con una preparación de OMV preparada a partir de E.coli BL21(DE3)ΔTolR que expresa el antígeno de Chlamydia, mientras que el carril 2 se cargó con una preparación de OMV preparada a partir de E.coli BL21(DE3)ΔTolR que no expresa antígenos de Chlamydia (usados como un control negativo). La Figura 5D (i) muestra la proteína TC0431 total contenida en una OMV que expresa el antígeno heterólogo (véase el carril 1).

La Figura 6 muestra la curva de crecimiento de E. coli para diversos mutantes E. coli ΔTolR preparados en el Ejemplo 3. El tiempo en horas se indica a lo largo del eje X; la DO600 se indica a lo largo del eje Y La curva de crecimiento de E. coli que expresa TC0210 se indica con una flecha. (-♦-) es TC0210pET BL21(DE3)ΔTolR; ( - * - ) es TC0052pET BL21(DE3)ΔTolR; es TC0106pET BL21(DE3)ΔTolR; ( ) es TC0313pET BL21(DE3)ΔTolR; ( '-* -) es TC0431pET BL21(DE3)ΔTolR; (HH) es TC0551pET BL21(DE3)ΔTolR; ( -+ - ) es TC0651 pET BL21(DE3)ΔTolR; (-—- ) es TC0727pET BL21(DE3)ΔTolR y ( ) es TC0890pET BL21(DE3)ΔTolR.

La Figura 7 es un diagrama esquemático de experimentos de rasurado y de espectrometría de masas llevados a cabo para confirmar la presencia del antígeno heterólogo en la preparación de VME. El diagrama muestra (partiendo de la parte superior izquierda y progresando en dirección de las agujas del reloj): i) rasurar la VME, ii) recuperar los sobrenadantes, iii) DTT detergente a 100 °C durante 10 minutos, iv) recuperación de péptidos; v) separación de los péptidos mediante cromatografía de RP fragmentación de péptidos mediante MS/MS ESI-Q-TOF y vi) identificación de la proteína;

La Figura 8 muestra la secuencia del antígeno TC0210 de C. muridarum. El péptido reconocido en el rasurado y en el análisis de espectrometría de masas se resalta en negrita y subrayado;

La Figura 9 es una alineación de secuencia de TC0210 de C. muridarum (secuencia de búsqueda) y CT823 de C. trachomatis (secuencia objeto);

La Figura 10A muestra un análisis de FACS de anticuerpo que se une a la superficie de células completas de Chlamydia;

La Figura 10B muestra los resultados de un experimento de micromatriz de proteína en el que los antígenos de Chlamydia se expresan en E. coli, se purifican por afinidad y se detectan sobre portaobjetos de cristal en un formato de micromatriz. Se usaron dos grupos de sueros humanos para cada antígeno: Sueros MIF positivos (barra de la izquierda) y sueros MIF negativos (barra de la derecha). Los antígenos aparecen en el eje X. LDe izquierda a derecha, los antígenos enumerados sobre el eje X son CT681His, CT823His, CT443His, CT456GST, CT110GST, CT622His, CT089His, CT415GST, CT119GST, CT049GST, CT589GST, CT372GST, CT077His, CT559His, CT322His, CT316His, CT350GST, CT381His, CT355GST, CT389GST, CT127GST, CT157GST, CT567His, CT266His, CT470His, CT398His y CT114His. El % de suero está sobre el eje Y. Cada barra vertical representa la intensidad media obtenida con los sueros (suero positivo en MIF frente a negativo en MIF) sobre antígenos únicos. El segundo dato de la izquierda se refiere a CT823.

La Figura 10C muestra los antígenos que dan una alta señal en un ensayo sign-bkg. Los antígenos se enumeran sobre el eje X y la señal se da sobre el eje Y. Las microplacas de proteína de Chlamydia se analizaron mediante inmunotinción con suero de ratones que estaban (de izquierda a derecha) i) no inmunizados (suero preinmunológico), ii) inmunizados con CE inactivados térmicamente (anti-CE inactivados térmicamente antes de la exposición), iii) inmunizados con CE inactivados térmicamente y después expuestos con CE vivos (anti-CE inactivados térmicamente tras la exposición), iv) inmunizados con CE vivos (anti-CE vivos antes de la exposición); y v) inmunizados con CE vivos y después expuestos nuevamente con CE vivos (anti-CE vivos tras la exposición). Los anticuerpos están a una dilución de 1:100. Los antígenos que dan una baja señal de menos de 800 no se muestran. De izquierda a derecha, los antígenos son: CT016His, CT045His, CT077His, CT242His, CT266His, CT396His, CT443His, CT444His, CT480His, CT547His, CT587His, CT600His, CT823His, CT859His, ctEBpel, ctEBsup, ctGst381, ctGst398, ctGst480, GstNN y NNhis;

La Figura 10D muestra los resultados de Western blot con suero obtenido a partir de ratones inmunizados con, de izquierda a derecha (i), TC0210His (ii) preparación de OMV de BL21(DE3)bTolR TC0210 y (iii) preparación de OMV de BL21(DE3)ΔTolR, respectivamente. 200 ng de HtrA recombinante (carril 1) y CE de C. muridarum (aproximadamente 10 CE) (carril 2) se disolvieron en tampón de carga y se separaron por tamaño mediante SDS-PAGE (gel 4-12 %) en condiciones reductoras y se sometieron a electrotransferencia en membranas de nitrocelulosa. Las membranas se saturaron hasta el día siguiente con leche Marwell al 10% en PBS (tampón de fosfato), Triton al 0,1 % y después se incubaron con suero obtenido de ratones inmunizados con, de izquierda a derecha, (i) TC0210His, (ii) preparación de OMV de BL21(DE3)LfhTolR TC0210 y (iii) preparación de OMV de BL21(DE3)ΔTolR, respectivamente. Una IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (Amersham Bioscience TM) se usó como el anticuerpo secundario.

La Figura 10E muestra un análisis de FACS de anticuerpo que se une a la superficie de células completas de Chlamydia. Los picos, de izquierda a derecha, se corresponden con CE purificados de C. muridarum incubados con (i) suero anti-His (pico llenado, ubicado más a la izquierda), (ii) suero obtenido de ratones inmunizados con la preparación de OMV de BL21(DE3)dTolR (segundo pico de la izquierda), (iii) suero obtenido de ratones inmunizados con TC210 (segundo pico de la derecha) o (iv) BL21(DE3)ΔTolR TC0210 (pico ubicado más a la derecha).

La Figura 11 es un diagrama esquemático de un protocolo de inmunización para ratones BALB/c;

La Figura 12 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de neutralización de C. muridarum que usa suero de ratones BALB/c que se han inmunizado con OMV de E. coli BL21(DE3)ΔTolR que presenta OMV (5 pg) (--o --) , OMV-TC0210 (5 pg) ( - ● - ) , OMV (50 pg) (--O--), OMV-TC0210 (50 pg) ( - ■ ) , y MOMP (-o-). La dilución del suero se presenta a lo largo del eje X y el % de neutralización se presenta sobre el eje Y.

La Figura 13 son los resultados de dos análisis por transferencia de Western. Las membranas se incubaron con suero obtenido mediante la inmunización de ratones con PBS alumbre 50 pg de preparación de OMV de E. coli BL21(DE3)ΔTolR (Western blot a la izquierda) o PBS alumbre 50 pg de preparación de OMV de E. coli BL21(DE3)ΔTolR-TC0210. En cada análisis por transferencia de Western, los marcadores de peso molecular se presentan sobre el lado izquierdo y el carril 1 se carga con 200 ng de proteína purificada TC0210His (53 kDa). La flecha muestra la banda que se corresponde con la proteína TC0210His de 53 kDa;

La Figura 14 es un diagrama de barras que muestra los resultados de un ensayo ELISA. Las cuatro muestras de suero que se usaron son de ratones inmunizados con (de izquierda a derecha) 5 pg de VME alumbre; 50 pg de VME alumbre; 5 pg de VME-TC0210 alumbre; 50 pg de VME-TC0210 alumbre. Se proporcionan tres resultados para cada una de las muestras de suero tal como sigue (de izquierda a derecha): IgG2a, IgG1 e IgGtot. El título de ELISA se muestra sobre el eje Y;

La Figura 15 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de neutralización de C. muridarum que usa suero de ratones BALB/c que se han inmunizado con OMV de E. coli BL21(DE3)AtolR que presenta TC0210 (50 pg) (-*-); con TC0210HÍS recombinante purificado (20 pg) ( > ): con MOMP (20 pg) (-♦-) y solo con las OMV (50 pg) (-*--). Los resultados son la media de 6 experimentos independientes. La dilución del suero se presenta a lo largo del eje X y el % de neutralización se presenta sobre el eje Y

La Figura 16 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de neutralización de C. trachomatis que usa suero de ratones BALB/c que se han inmunizado con: MOMP de C. trachomatis (20 pg) (-♦-); OMV-TC0210 (50 pg) (-# -); MOMP C. muridarum (20 pg) ( - * - ) ; CT823-HÍS (20 pg) ( ); TC0210-HÍS (20 pg) (-*-) y OMV (50 pg) (~é~). La dilución del suero se presenta sobre el eje X y el % de neutralización se presenta sobre el eje Y Los resultados son la media de dos experimentos;

La Figura 17a es un diagrama esquemático de un protocolo de inmunización de ratones CD1;

La Figura 17b son los resultados de 6 análisis por transferencia de Western en los que se carga en cada uno 200 ng de proteína recombinante TC0210His purificada. De izquierda a derecha, las membranas se incubaron, respectivamente, con suero obtenido de ratones inmunizados con: Grupo 1 (50 pg de VME alumbre); Grupo 2 (50 pg de VME-TC0210 alumbre); Grupo 3 (20 pg TC0210His+50 pg de VME alumbre); Grupo 4 (1 pg TC0210His 50 pg de VME alumbre); Grupo 5 (1 pg de TC0210 alumbre) y Grupo 6 (20 pg de TC0210His alumbre);

La Figura 17c muestra los análisis por transferencia de Western para (i) el grupo 2 y (ii) el grupo 4 en más detalle. La flecha indica la proteína TC0210 de 53 kDa. Se usó una dilución de suero de 1:200;

La Figura 18 es un diagrama de barras que muestra los resultados de un ensayo ELISA. El título de ELISA se muestra junto con el eje Y Los grupos de inmunización se presentan a lo largo del eje X. De izquierda a derecha, las barras representan sueros de ratones inmunizados con: i) 50 pg OMV-TC0210 alumbre; ii) 20 pg TC0210His 50 pg OMV alumbre; iii) 20 pg TC0210His alumbre; 1 pg TC0210His alumbre; 1 pg TC0210His 50 pg Om V alumbre, vi) 50 pg OMV;

La Figura 19 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de neutralización de C. muridarum que usa suero de ratones CD1 que se han inmunizado con a) MOMP (20 pg); b) OMV de E. coli BL21(DE3)AtolR que presenta TC0210 (50 pg); c) OMV de E. coli BL21(DE3)AtolR que no expresa ningún antígeno heterólogo (50 pg); d) TC0210-His (20 pg) recombinante purificado; e) 50 pg de OMV más TC0210HIS (1 pg). La dilución del suero se presenta a lo largo del eje X y el % de neutralización se presenta a lo largo del eje Y. Los resultados son la media de 6 experimentos independientes;

La Figura 20 muestra los resultados del experimento de mapeo del epítopo y muestra los diferentes epítopos del antígeno TC0210 que se reconocieron mediante el suero de ratones inmunizados con VME-TC0210 (parte superior), TC0210His (parte media) o VME (parte inferior);

La Figura 21 muestra dos geles de SDS PAGE en los que se cargaron: (i) 20 pg de una preparación de VME de E. coli BL21(DE3)AtolR (a mano izquierda); y (ii) 20 pg de una preparación de VME de E. coli BL21(DE3)AompA (a mano derecha);

La Figura 22 es un gel de SDS PAGE que muestra el contenido proteico de E. coli BL21(DE3)AompA y el contenido proteico de E. coli BL21(DE3)AompA que expresa TC0210. Los carriles se cargaron con 5 pg, 10 pg y 20 pg, respectivamente. La banda de TC0210 se marca mediante la flecha;

La Figura 23 son los resultados de un experimento de espectrometría de masas llevado a cabo para confirmar la presencia del antígeno TC0210 en la preparación de VME.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA DESCRIPCIÓN

Ejemplo 1: Materiales y procedimientos

Los siguientes materiales y procedimientos se usan en los ejemplos salvo indicación en contrario:

1) Cepas bacterianas, cultivos y reactivos:

La cepa Nigg de Chlamydia muridarum y cepa D/UW-3/CXde C. trachomatis serotipo D se cultivaron sobre monocapas confluyentes de LLC-MK2 (ATCC CCL7) en medio esencial mínimo de Earle (EMEM) tal como se describe previamente [195]; [196]. La purificación de CE de C. trachomatis y C. muridarum se llevó a cabo mediante centrifugación de gradiente de densidad de renografina tal como se describe anteriormente [195]. Se cultivó aeróbicamente Escherichia coli BL21 (DE3) en medio de caldo Luria (LB) (Difco) a 37 °C. Cuando fue apropiado, se añadieron al medio ampicilina (100 |jg/ml) e isopropil-p-D-galactopiranósido (IPTG; 1 mM). A menos que se especifique, todos los compuestos químicos en el presente estudio se encargaron a Sigma. Las enzimas de restricción y las enzimas de modificación fueron de New England Biolabs.

2) Clonación de genes y purificación de proteínas:

Para producir proteínas recombinantes tal como CT823, TC0210, TC0727, TC0651, TC0313, TC0106, TC0551, TC0431, TC0890, CT681 (MOMP de C. trachomatis [MOMPct]) y TC0052 (MOMP de C. muridarum [MOMPcm]), los genes se amplificaron por PCR a partir de ADN cromosómico de C. trachomatis y C. muridarum usando cebadores específicos que hibridan en los extremos 5' y 3' de cualquier gen y se clonaron en el plásmido pET21b+ (Invitrogen) para fusionar una secuencia de seis marcadores de histidina en el extremo 3'. La clonación y la purificación de las fusiones de His se realizaron como ya se ha descrito [196]. TC0727, TC0651, TC0106, TC0551, TC0431, TC0890, MOMPCt y MOMPcm expresados como proteínas de fusión de His se purificaron a partir de la fracción de proteína insoluble, mientras que TC0313, CT823 y TC0210 expresados como proteínas de fusión de His se purificaron a partir de la fracción de proteína soluble de acuerdo con el procedimiento del fabricante.

3) Construcción del mutante de deleción BL21(DE3) AtolR:

El mutante AtolR se produjo sustituyendo la secuencia de codificación de tolR con un casete de resistencia a la kanamicina ("kmr"). Con este fin, se usó un protocolo de PCR de tres etapas para fusionar las regiones de aguas arriba y aguas abajo de tolR con el gen kmr. En resumen, las regiones de 528 pb aguas arriba y de 466 pb aguas abajo del gen tolR se amplificaron a partir de ADN genómico de E. coli BL21 (DE3) con el par de cebadores específico UpF (TCTGGAATCGAACTCTCTCG) (SEQ ID NO: 68)/UpR-kan (ATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCATGGCTTACCCCTTGTTG) (SEQ ID NO: 69); DownF-kan (TTCACGAGGCAGACCTCATAAACATCTGCGTTTCCCTTG) (SEQ ID NO: 70)/ DownR (TTGCTTCTGCTTTAACTCGG) (SEQ ID NÚM.: 71), respectivamente. En paralelo, el casete de kmr se amplificó a partir del plásmido pUC4K usando los cebadores kan-F (ATGAGCCATATTCAACGGGAAAC) (SEQ ID NO: 72) y kan-R (TTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAA) (SEQ ID NO: 73). Finalmente, los tres fragmentos amplificados se fusionaron entre sí mezclando 100 ng de cada uno en una PCR que contiene los cebadores UpF/DownR. El fragmento lineal obtenido, en el que el gen kmr estuvo flanqueado por las regiones de aguas arriba y aguas abajo de tolR, se usó para transformar la cepa de E. coli BL21(DE3) (hecha electrocompetente mediante tres etapas de lavado en agua fría) y los mutantes de tolR se seleccionaron cultivando en placa bacterias transformadas sobre placas de Luria-Bertani (LB) que contienen 30 ug/ml de kanamicina.

Las células de recombinación BL21 (DE3) se produjeron usando el sistema de recombinación homóloga altamente competente (operón red) [197]. En resumen, las células bacterianas electrocompetentes se transformaron con 5 ug de plásmido pAJD434 mediante electroporación (5,9 ms a 2,5 kV). Las bacterias entonces se cultivaron durante 1 h a 37 °C en 1 ml de caldo SOC y después se cultivaron sobre placas de LB que contienen trimetoprima (100 ug/ml). La expresión de los genes red llevada a cabo por pAJD434 se indujo añadiendo L-arabinosa al 0,2 % al medio. La deleción génica del gen tolR se confirmó mediante amplificación de ADN genómico por PCR usando los pares de cebadores UpF /Kan-R; Kan-F/Kan-R; Kan-F/DownR. La deleción también se confirmó usando los cebadores tolR-F (CGGACCCGTATTCTTAAC) (SEQ ID NO: 74) y tolR-R (GCCTTCGCTTTAGCATCT) (SEQ ID NO: 75) hibridando posteriormente aguas arriba y aguas abajo de las regiones flanqueantes 5' y 3', respectivamente.

4) Construcción del mutante de deleción BL21(DE3) AompA:

El mutante AompA se produjo sustituyendo la secuencia de codificación de ompA con un casete de resistencia al cloranfenicol ("Cmr") usando cebadores específicos. El procedimiento es el mismo que el utilizado para producir BL21(DE3)AtolR (véase la sección 3) anterior). En particular, los cebadores usados para amplificar las regiones de aproximadamente 530 pb aguas arriba y de aproximadamente 470 pb aguas abajo del gen ompA se amplificaron a partir de ADN genómico de BL21(DE3) con los pares de cebadores específicos ompA_Up dir: (GATCGGTTGGTTGGCAGAT) (SEQ ID NO: 76)/ ompA cm_Up-inv: (CACCAGGATTTATTTATTCTGCGTTTTTGCGCCTCGTTATCAT)(SEQ ID NÚM.: 77); ompA cm_Down dir: (TACTGCGATGAGTGGCAGGCGCAGGCTTAAGTTCTCGTC) (SEQ ID NO: 78) / ompA Down inv: (AAAATCTTGAAAGCGGTTGG) (SEQ ID NO: 79); CMr DIR: (CGCAGAATAAATAAATCCTGGTG)(SEQ ID NÚM.: 80)/ CMr INV: (CCTGCCACTCATCGCAGTA) (SEQ ID NO: 81). Finalmente, los tres fragmentos amplificados se fusionaron entre sí mezclando 100 ng de cada uno en una PCR que contiene los cebadores UpF/ompA inv.

El fragmento lineal obtenido, en el que el gen Cmr era flanqueado por las regiones corriente arriba y corriente abajo de ompA, se usó para transformar la cepa BL21(DE3) de E. coli (vuelta electrocompetente mediante tres etapas de lavado en agua fría). Los mutantes de ompA se seleccionaron cultivando en placas bacterias transformadas sobre placas Luria-Bertani (LB) que contienen 20 ug/ml de Cloranfenicol.

La deleción génica del gen ompA se confirmó mediante amplificación de ADN genómico por PCR usando cebadores que hibridan específicamente con el casete de Cmr (CMr DIR/CMr INV), u ompA_Up dir/ CMr INV, o usando cebadores específicos para ompA con el fin de verificar posteriormente la deleción de este gen (ompa DIR: (ATGAAAAAGACAGCTATCGC) (SEQ ID NO: 82) / ompA INV: (TTAAGCCTGCGGCTGAGTT) (SEQ ID NO: 83).

5) Expresión de antígenos de Chlamydia sobre BL21(DE3) AtoIR o sobre BL21(DE3) AompA:

Para expresar los 9 antígenos de Chlamydia muridarum (TC0052, TC0106, TC0210, TC0313, TC0431, TC0551, TC0651, TC0727, TC0890) sobre la membrana externa de las cepas mutantes de E. coli, los genes que codifican los antígenos de Chlamydia se fusionaron en marco con el péptido líder OmpA de E. coli. Estas fusiones se insertaron después en pET 21b (Invitrogen), un plásmido previamente modificado para la clonación con el procedimiento pipe [198], usando cebadores específicos que se alinean con la secuencia de seis marcadores de histidina en el extremo 3' y con el gen que codifica el péptido líder OmpA de E. coli en el extremo 5'. Las fusiones se colocaron bajo el control de un promotor lac en el plásmido multicopia (pET). El plásmido obtenido se denomina pET-TC0xyz. Los plásmidos se transformaron en células E. coli HK 100, se hicieron competentes al CaCh tras varios lavados sucesivos en soluciones frías de MgCh y CaCh [198].

Las células se laminaron en placas sobre LB conteniendo 100 ug/ml de Amp. a 37 °C hasta el día siguiente. Los clones positivos se cultivaron en LB para producir mini preparaciones de plásmidos (usando el kit mini prep de Qiagen).

Las cepas BL21(DE3) AtolR y BL21(DE3) AompA de E. coli (vueltas electrocompetentes mediante tres etapas de lavado en agua fría) se transformaron con 10 ng de cada mini preparación de plásmido pET-TC0xyz. Las bacterias se cultivaron durante 1 h a 37 °C en 1 ml de caldo SOC y después se cultivaron en placas sobre placas LB que contienen Amp. (100ug/ml) y se incubaron toda la noche a 37 °C.

6) Preparación de VME:

Las células de E. coli BL21(DE3)AtolR y BL21(DE3)AompA que expresan o no expresan antígenos de Chlamydia se inocularon a partir de placas recién preparadas en 500 ml de LB (caldo Luria Bertani) Amp (100 ug/ml) y se incubaron a 37 °C con agitación (200 r.p.m.) y se dejaron crecer. La inducción de la expresión de proteína recombinante se hizo mediante la adición de IPTG 0,1 mM a D.O.=0,4. El cultivo bacteriano se dejó crecer hasta que a 37 °C la D.O.=1. A ese punto, los medios de cultivo se filtraron a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 pm (Millipore, Bedford, MA). Los filtrados se sometieron a centrifugación de alta velocidad (200.000 x g durante 90 min), y los sedimentos conteniendo las OMV se lavaron con PBS y finalmente se resuspendieron con PBS [199].

7) Análisis por transferencia de Western:

20 ug de preparaciones de OMV y 200 ng de TC0210 His se separaron por tamaño respectivamente mediante SDS-PAGE (gel al 4-12 %) en condiciones reductoras y se sometieron a electrotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa. Las membranas se saturaron durante toda la noche con leche Marwell al 10 % en PBS (tampón fosfato) y Tritón al 0,1 %, agitando a 4 °C. Después, las membranas se incubaron con suero de ratón específico a TA durante 2 horas (dilución de suero 1:200). Una IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (Amersham Bioscience) se usó como el anticuerpo secundario. La tinción colorimétrica se realizó con el kit de sustrato Opti 4CN (Bio-Rad).

8) Ensayo de ELISA:

Las IgG dirigidas a TC0210 recombinante purificada se ensayaron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los pocillos individuales de placas de micro-ELISA (Nunc Maxisorp) se recubrieron con 1 pg de proteína recombinante en PBS (a pH 7,4) a 4 °C durante toda la noche. Las placas se lavaron, se trataron durante 1 hora a 37 °C con PBS-BSA al 1%, y se añadieron a los pocillos 100 pl de alícuotas de antisuero a diferentes soluciones seriadas en PBS-Tween al 0,1 %. Tras la incubación durante 2 horas a 37 °C, las placas se lavaron de nuevo y se incubaron durante 1 hora a 37 °C con IgG anti-ratón de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma) diluida a 1:2500 en PBS-Tween. A continuación, se añadieron 100 pl de PNPP (Sigma) a las muestras y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las densidades ópticas se leyeron a 405 nm y los títulos de anticuerpo sérico se definieron como la dilución en suero que produce un valor de DO de 0,5.

9) Ensayo de neutralización:

Los sueros obtenidos mediante inmunización de los ratones (BALB/c o CD1) con OMV-TC0210 se ensayaron in vitro para la actividad de neutralización. Los ensayos de neutralización in vitro se realizaron sobre cultivos de células epiteliales LLC-MK2 (riñón de mono Rhesus). Tres diluciones seriadas de cada grupo de sueros se ensayaron mediante su dilución a 1:30, 1:90, 1:270 en tampón fosfato sacarosa (SP). También, los CE de C. muridarum infecciosos purificados se diluyeron en el mismo tampón para contener 3x10(5) IFU/ml, y se añadieron 15 ul de suspensión de CE a cada dilución de suero en un volumen final de 150 ul. Se permitió la interacción anticuerpo-CE mediante incubación durante 30 min a 37 °C. También, se incubaron los CE sin sueros como un control de la infección.

100 ul de cada mezcla de reacción, incluyendo CE diluidos en SP sin sueros, se usaron para inocular las monocapas confluentes de LLC-MK2 (por duplicado para cada dilución de suero) en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos, y se centrifugaron a 2000g durante 1 hora a 37 °C. Tras la centrifugación, se añadió el medio esencial mínimo de Eagle que contiene las sales de Eagle, suero bovino fetal al 10 % y 1 ug/ml de cicloheximida. Los cultivos infectados se incubaron a 37 °C durante 24 horas, mientras que en los ensayos de neutralización, en los que se usaron para la infección CE de C. trachomatis, los cultivos infectados se incubaron durante 48 horas. A continuación, los cultivos celulares se fijaron añadiendo 100 ul de metanol durante 5 minutos y las inclusiones de Chlamydia se detectaron mediante tinción con un anticuerpo monoclonal anti-Chlamydia de ratón conjugado con fluoresceína (Chlamydia Merifluor, Meridian Diagnostics, Inc.). Finalmente, todas las inclusiones para cada pocillo se contaron con una magnificación de 10x.

Los cálculos de la reducción de la infectividad mediante cada grupo de sueros se llevaron a cabo usando títulos de neutralización de sueros preinmunológicos como niveles basales.

10) Mapeo de epítopos:

Sobre una membrana de nitrocelulosa, se detectaron 95 péptidos sintéticos de TC0210. Cada péptido está constituido por 15 aminoácidos y se solapa en 10meros con el siguiente péptido. Tres membranas, hechas con el mismo diseño, se lavaron con TBS (Tris-HCl 50 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM) que contiene el 0,05 % de tween 20 (T-TBS), y después se incubaron toda la noche a 4 °C con leche Marwell al 2 % en TBS (MBS). A continuación, sobre las tres membranas, se ensayaron respectivamente diferentes grupos de sueros (dilución de los sueros a 1:100): sueros de ratones inmunizados con a) ^v M^e que expresa TC0210, b) TC0210His, y c) VME sola.

Finalmente, una IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences) se usó como el anticuerpo secundario (dilución de sueros a 1:5000). La tinción colorimétrica se realizó con el kit de sustrato Opti 4CN (Bio-Rad).

Ejemplo 2: Construcción de un mutante de deleción BL21(DE3)AtolR de E. coli

BL21 (DE3)AtolR es una cepa mutante de E. coli en la que la mutación AtolR se introdujo sustituyendo la secuencia de codificación tolR con un casete de resistencia a la kanamicina. Esta cepa es capaz de liberar una gran cantidad de vesículas de membrana externa en el sobrenadante del cultivo. Se descubrió que el contenido proteico liberado en el sobrenadante de cultivo de la cepa mutante AtolR es mayor en comparación con el liberado a partir de la cepa de tipo silvestre (véase la Figura 2).

Ejemplo 3: Expresión de antígenos de chlamydia en BL21(DE3) AtolR o en BL21(DE3) AompA

Para permitir la presentación de cada uno de los 9 antígenos de Chlamydia muridarum (TC0052, TC0106, TC0210, TC0313, TC0431, TC0551, TC0651, TC0727 y TC0890 - véase la Tabla 3 a continuación) sobre la membrana externa de las cepas mutantes de E. coli, los genes que codifican los antígenos de Chlamydia se fusionaron en marco con el péptido líder OmpA de E. coli.

TABLA 3:

Las fusiones se colocaron bajo el control de un promotor lac en el plásmido multicopia pET21b+ (Novagen). El plásmido obtenido se denomina pET-TC0xyz.

Los 9 plásmidos pET-YC0xyz diferentes se transformaron en cepas de E. coli BL21(DE3)AtolR y E. coli BL21(DE3)Aomp^ 4. El análisis en gel SDS PAGE en la Figura 3 muestra que la expresión del antígeno de Chlamydia fue claramente visible en los extractos totales de cultivo de E. coli BL21(DE3)AtolR que expresan TC0106, TC0052 y TC0210 (véanse los carriles 1, 2 y 4 de la Figura 3). Al contrario, la expresión de TC0727 en E. coli no fue claramente visible (véase el carril 3 de la Figura 3).

Ejemplo 4: Preparación de OMV

En la Figura 4 se muestra un diagrama esquemático de la preparación de OMV. Las bacterias se indujeron cuando alcanzaron una DO600 de 0,4. Las bacterias se cultivaron hasta una DO600 = 1 y después se centrifugaron a 6.000g. Los medios de cultivo de las cepas BL21(DE3)AtolR y pET-TC0xyz BL21(DE3)AtolR se filtraron a través de un filtro de 0,22 |jm, se centrifugaron a alta velocidad (200.000 x g, 120 min.) y se recuperaron las OMV en el sedimento, se lavaron con fosfato y después se resuspendieron en fosfato para obtener las ^o M^v [199].

Ejemplo 5: Análisis de las preparaciones de VME

Se usó análisis por Western blot para determinar si las preparaciones de OMV expresaban los antígenos heterólogos. Seis de las nueve VME recombinantes demostraron llevar las proteínas heterólogas. Las Figuras 5A y 5B muestran que cada una de las TC0052, TC0106, TC0210, TC0727, TC0313 y TC0890 se expresaron en las OMV recombinantes. Al contrario, la Figura 5C muestra que TC0651, TC0551 y TC0431 no se expresaron en las VME recombinantes.

Sin embargo, en los experimentos de seguimiento, TC0431 demostró, de hecho, que se expresaba en las OMV recombinantes pero a un bajo nivel al que se puede observar en la Figura 5D (i) en la que la cantidad de preparaciones de OMV cargada en el gel se duplicó para obtener niveles detectables del antígeno. Por otra parte, la expresión de TC0052 no se detectó en los experimentos de seguimiento (véase la Figura 5D (ii)). Se cree que la razón para esta aparente variabilidad es resultado de la inestabilidad de las cepas diseñadas genéticamente que codifican TC0052, llevando esta inestabilidad a la lisis de las bacterias durante el crecimiento en el cultivo.

La curva de crecimiento de E. coli BL21(DE3)AtolR preparada en el Ejemplo 3 que expresa cada uno de los 9 antígenos de Chlamydia se muestra en la Figura 6. La E. coli que expresa TC0210 tuvo la tasa más grande de crecimiento. La tasa de crecimiento de E. coli que expresa TC0313, TC0890, TC0431 o TC0106 fue similar pero fue más lenta que la tasa de crecimiento de E. coli que expresa TC0210. La tasa de crecimiento de E. coli que expresa TC0727 fue más lenta que la E. coli que expresa cualquiera de TC0313, TC0890, TC0431 o TC0106. La E. coli que expresa TC0052, TC0551 o TC0651 tuvo la tasa de crecimiento más lenta.

Se ha descubierto que TC0210-OMV fue la mejor preparación en términos de producción y cantidad de antígeno de Chlamydia expresados. La espectrometría de masas confirmó la presencia del péptido TC0210 sobre la superficie de preparaciones de TC0210-VME tras el rasurado de la misma preparación de VME (la técnica del rasurado de Chlamydia se describe en el documento WO 2007/110700 y se muestra un diagrama esquemático en la Figura 7). El péptido identificado en el experimento de rasurado se corresponde con los aminoácidos 65-75 de la proteína TC0210 de longitud completa. El péptido que coincide se muestra en negrita y subrayado (véase también la Figura 8):

TC0210 tiene las propiedades que se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

Un alineamiento de secuencia de TC0210 de C. muridarum con CT823 de C. trachomatis se proporciona en la Figura 9. La TC0210 es idéntica a la CT823 en el 93 %.

La Figura 10B muestra los resultados de un experimento de micromatriz de proteínas en el que los antígenos de Chlamydia se expresaron en E. coli, se purificaron por afinidad y se detectaron sobre portaobjetos de cristal en un formato de micromatriz. Los instrumentos y los protocolos fueron como los descritos en Bombaci, M. y col [200]. Los portaobjetos se inmunotiñeron con cientos de sueros humanos diferentes y se midió la intensidad de tinción de cada zona. Se muestran las proteínas reconocidas con una intensidad de fluorescencia de más de 1000. Se usaron dos grupos de sueros humanos para cada antígeno: Sueros positivos en MIF (barra a mano izquierda) y sueros negativos en MIF (barra a mano derecha) (en donde "MIF" se refiere al ensayo de microinmunofluorescencia [201], que se usa para comprobar si los sueros de los pacientes contienen anticuerpos contra el patógeno (positivo en MIF) o no (negativo en MIF)).

El análisis de la microplaca de proteínas mostrado en la Figura 10B usando sueros positivos en MIF y negativos en MIF muestra que hay tres grupos de antígenos de Chlamydia: un grupo de antígenos se reconoce principalmente mediante suero positivo en MIF (CT681His, CT823His, CT443His, CT456GST, CT110GST, CT622His, CT089His), otro grupo se reconoce tanto por sueros positivos en MIF como por sueros negativos en MIF (CT415GST, CT119GST, CT049GST, CT589GST, CT372GST, CT077His, CT559His, CT322His, CT316His, CT350GST, CT381His, CT355GST, CT389GST, CT127GST, CT157GST, CT567His y CT266His), y un tercer grupo de antígenos se reconoce principalmente mediante sueros negativos en MIF (CT470His, CT398His y CT114His). El antígeno CT823 se reconoce claramente mediante sueros positivos en MIF, pero no mediante sueros negativos en MIF, lo que sugiere que CT823 es un antígeno de Chlamydia capaz de generar una respuesta inmunitaria humoral durante infecciones naturales en el ser humano. Por lo tanto, CT823 es inmunogénico en seres humanos.

Esto se sostiene mediante la Figura 10A, que muestra que CT823 se expone sobre la superficie de CE (KS=19,1, véase la figura 10A). El ensayo se realizó tal como se describió anteriormente [196]. Se usó un suero de anticuerpos policlonales de ratón que se había preparado inmunizando ratones con TC0210His. Los sueros de control de fondo fueron de ratones inmunizados con proteínas contaminantes de E. coli. El desplazamiento entre el histograma de control de fondo y el histograma del ensayo del suero inmunológico se tomó como una medida de la unión de anticuerpos a la superficie de células de CE. La prueba de I.T de Kolmogorov-Smirnov (K-S) para dos muestras se realizó sobre los dos histogramas solapados. El valor D/s(n) (un índice de disparidad entre las dos curvas) se informa como la "puntuación de K-S". Se obtuvo una K-S de 19,1 (T(X) = 1146; valor de T max = 1719; diferencia máx. = 78,5 % a valor de 19,1; la confianza en la diferencia es mayor del 99,9%; porcentaje del EED positivo: 82,6; datos de comparación de la población 0,06)

La Figura 10C muestra que el antígeno CT823 es uno de los tres antígenos fuertemente reconocidos por los sueros de ratones inmunizados con los CE completos de C. trachomatis. Esto sugiere que la CT823 natural está contenida en los CE en una cantidad que es suficiente como para generar una respuesta de anticuerpos en ratones.

La HtrA recombinante y la HtrA natural contenida en los CE de C. muridarum también fueron reconocidas por un suero de anticuerpos policlonales de ratón que se había preparado mediante inmunización de ratones con una preparación de OMV de BL21(DE3)bTolR TC0210 tal como se muestra mediante Western Blot en la Figura 10D.

El análisis de FACS descrito anteriormente para la Figura 10Ase repitió usando suero de anticuerpos policlonales de ratón obtenido de ratones inmunizados con la preparación de OMV de BL21(DE3)ΔTolR TC0210. Habiendo demostrado anteriormente en la Figura 10A que se puede usar citometría de flujo para seguir a los anticuerpos que se unen a la superficie de los CE, los datos presentados en la Figura 10E muestran que los anticuerpos policlonales generados contra TC0210 en el ámbito de las OMV fueron capaces de reconocer la HtrA expuesta sobre la superficie de los CE de C. muridarum (Figura 10E).

Ejemplo 6: Inmunización de ratones BALB con VME-TC0210:

Los ratones se inmunizaron de acuerdo con el cronograma mostrado en la Figura 11. Específicamente, los ratones BALB (5/6 semanas de vida) se inmunizaron por vía intramuscular en los días 1,20 y 35 antes de que se tomasen las PBMC en el día 45 y se recogiese el suero en el día 60. Los ratones se dividieron en 5 grupos, con 12 ratones por cada grupo, y la inmunización se llevó a cabo de acuerdo con el siguiente esquema: GRUPO 1: PBS Alumbre; GRUPO 2: ^p B^s + Alumbre 5 |jg de preparación de VME de E. coli BL21(DE3)^a T^oIR; GRUPO 3: PBS Alumbre 5 |jg de preparación de VME de Bl21(De 3)AToIR TC0210; GRUPO 4: PBS Alumbre 50 jg de preparación de VME de BL21(DE3)ΔTolR; y GRUPO 5: PBS Alumbre 50 jg de preparación de VME de BL21(DE3)ΔTolR TC0210.

Análisis p o r transferencia de Western y ensayo de ELISA

Tras la inmunización de los ratones, los sueros de los ratones se probaron por análisis Western blot y ELISA con el fin de evaluar la producción de anticuerpos anti-TC0210. Para cada Western blot, se cargó la proteína recombinante TC0210 purificada de C. muridarum. La Figura 13 muestra que los sueros de ratones inmunizados con preparaciones de VME que expresan TC0210 fueron capaces de reconocer la proteína recombinante, mientras que los sueros de ratones inmunizados con preparaciones de VME sin TC0210 no lo fueron.

Los resultados de ELISA de la Figura 14 muestran que para los ratones inmunizados con 5 jg de OMV-TC0210 (ratones del Grupo 3), se generó una misma cantidad de anticuerpos IgG1 e IgG2a. Sin embargo, para los ratones inmunizados con 50 jg de VME-TC0210 (ratones del Grupo 5), se generaron más anticuerpos IgG2a que IgG1. La cantidad total de anticuerpos IgG generados fue aproximadamente la misma en ambos casos. Por lo tanto, la dosis de 50 jg funciona mejor en términos de calidad de los anticuerpos generados (tal como se muestra mediante el título de neutralización). Se generaron más anticuerpos IgG en ratones inmunizados con VME que expresan TC0210 que los generados en ratones inmunizados solo con VME alumbre.

Neutralización de la infección con C.E. de C. muridarum.

Existen muchas evidencias que sustentan un rol importante para los anticuerpos neutralizantes en la protección frente a la infección por Chlamydia. Con el fin de evaluar esto, se realizó un ensayo de neutralización usando sueros de ratones inmunizados con la preparación de VME que expresa el antígeno TC0210 de Chlamydia. Los resultados se muestran en la Figura 15, que muestra el porcentaje de neutralización frente a la infección por C. muridarum con respecto a tres diluciones de sueros diferentes (media de seis experimentos independientes).

Los sueros de ratones inmunizados con 50 |jg de OMV que expresan TC0210 (ratones del Grupo 5) son capaces de neutralizar in vitro la infección por C. muridarum con un título de 1:90 (el título de neutralización se define como la dilución de suero capaz de reducir la infección por CE al 50 %) (véase la línea (■♦*)). Este suero es casi tan potente en la neutralización in vitro de C. muridarum como el suero obtenido mediante inmunización de ratones con MOMP recombinantes purificadas (control positivo - véase la línea (-♦-)). Por el contrario, los sueros de ratones inmunizados con TC0210 recombinante purificado no son capaces de neutralizar la infección por C. muridarum; de hecho, los porcentajes de neutralización son muy bajos también en la dilución mínima del suero (1:30) (véase la línea()). La línea (~fr-j muestra el porcentaje de neutralización en relación con la OMV sin antígenos de Chlamydia. Por lo tanto, el porcentaje de neutralización para la TC0210 recombinante purificada es muy similar al porcentaje de neutralización obtenido para la VME sola. Estos cálculos se han hecho frente a los sueros preinmunológicos. Este es uno de los primeros ejemplos en los que los anticuerpos dirigidos contra un antígeno de Chlamydia, que no sea PPME, han sido capaces de neutralizar in vivo la infectividad de Chlamydia. Sorprendentemente, estos datos muestran que el antígeno TC0210, que no es protector cuando se ensaya en un modelo animal de Chlamydia cuando se administra en su forma purificada, se vuelve protector cuando se presenta en una VME de la infección.

El ensayo de neutralización se repitió nuevamente y los resultados se muestran en la Figura 12. Los resultados en la Figura 12 mantienen los hallazgos tratados anteriormente.

Neutralización de la infección con C.E. de C. trachom atis

CT823 es la proteína de C. trachomatis homóloga a TC0210. Se ensayó la capacidad de los sueros ant-VME-TC0210 para neutralizar in vitro la infección por Chlamydia trachomatis.

Los CE purificados de C. trachomatis se incubaron con sueros de ratón a tres diferentes diluciones a 37 °C durante 30 minutos. La infectividad residual se determinó sobre células LLC-MK2 mediante recuento de IFU/cs. Los porcentajes de neutralización se midieron en dos ensayos de neutralización realizados de forma independiente y se calcularon frente a los sueros preinmunológicos. La Figura 16 muestra los resultados. El suero policlonal de ratón anti-OMV-TC0210 (véase la línea (=*-)) es capaz de neutralizar in vitro a C. trachomatis de manera eficaz (con un título similar observado infectando con C.E. de C. muridarum). De hecho, se ha descubierto que el suero policlonal de ratón anti-OMV-TC0210 era casi tan potente en la neutralización de la infectividad de C. trachomatis que los sueros de ratones inmunizados con MOMP de C. trachomatis (véase la línea (-♦-), que es el control positivo). El porcentaje de neutralización de este suero es también superior que el obtenido tras la inmunización con la proteína purificada recombinante homóloga de C. trachomatis, CT823 (véase la línea ( )). La línea ('-♦-) representa el porcentaje de neutralización de los sueros inmunizados con MOMP de C. muridarum; este suero no neutraliza la infección por Chlamydia. Asimismo, los sueros de ratones inmunizados con OMV (véase la línea ( - * - ) ) o con TC0210HÍS (véase la línea (~*~) no neutralizaron la infección por Chlamydia. se ha descubierto que el anticuerpo específico de OMV-TC0210 neutraliza in vitro la infección por C. trachomatis al mismo nivel observado para C. muridarum. Por lo tanto, una respuesta inmunitaria aumentada contra el antígeno de C. muridarum también puede neutralizar la infección contra C. trachomatis.

Ejemplo 7: Inmunización de ratones CD1 con VME-TC0210:

Con el fin de confirmar los resultados de neutralización del Ejemplo 6, la inmunización se repitió en ratones CD1 (de 5-6 semanas de vida). Los grupos de ratones CD1 (5 ratones en cada grupo) se inmunizaron de acuerdo con el siguiente esquema de inmunización: Grupo 1: 50 jg VME Alumbre; Grupo 2: 50 jg de VME-TC0210 alumbre; Grupo 3: 20 jg de TC0210His 50 jg de VME alumbre; Grupo 4: 1 jg de TC0210His 50 jg de VME alumbre; Grupo 5: 1 jg de TC0210His alumbre; Grupo 6: 20 jg de TC0210His alumbre. El esquema también se diseñó para ensayar si existe un efecto adyuvante de v Me (véase los grupos 3 y 4). Los ratones se inmunizaron en los días 1, 20 y 40. Los sueros se recogieron para el ensayo de neutralización el día 60 (véase la Figura 17A).

Comparación de la inm unogenicidad entre TC0210 expresado sobre la OMV y la forma recombinante.

Se realizaron Western blots usando suero de ratones inmunizados con 50 jg de OMV-TC0210 (Grupo 2) y suero de ratones inmunizados con 1 jg de TC0210His más 50 jg de OMV sin antígenos de Chlamydia (Grupo 4=, con el fin de comparar la inmunogenicidad entre TC0210 expresado sobre la OMV y la forma recombinante. Se estimó que la cantidad de antígeno de Chlamydia presente sobre la superficie de la OMV de E. coli era el 1 % del contenido total de las proteínas de E. coli (aproximadamente 0,5 jg de proteína de Chlamydia en 50 jg de OMV).

Los resultados de Western blot de la Fig. 17B muestran que los sueros de ratones inmunizados con OMVTC0210 o con TC0210-His, producen anticuerpos contra el antígeno de Chlamydia. Sin embargo, tal como se muestra en la Fig. 17B, tras la inmunización de ratones con una combinación de 1 ug de TC0210-His más 50 ug de OMV que no expresa un antígeno de Chlamydia, la producción de anticuerpos contra TC0210 no es visible. En este caso, 1 ug de TC0210His sola es inmunogénica, pero 1 ug de proteína recombinante TC0210His en combinación con VME no es inmunogénica. Por lo tanto, parece que la presencia de las VME separadas inhiben la inmunogenicidad de la proteína purificada cuando se usa 1 ug de proteína purificada. Sin embargo, el uso de una menor concentración de proteína (0,5 ug de TC0210) expresada en el sistema de VME es inmunogénica. La combinación de 20 ug de TC0210-His más 50 ug de VME es adecuada para generar la producción de anticuerpos.

Los resultados del Western blot de la Fig. 17C resaltan adicionalmente las diferencias entre los sueros producidos mediante inmunización con 50 ug de OMV-TC0210 y los sueros producidos mediante inmunización con 1 ug de TC0210-His más 50 ug de OMV. Los resultados del análisis por transferencia de Western de la Figura 17B y 17C muestran que solo los sueros de ratones inmunizados con VME-TC0210 producen anticuerpos contra este antígeno. Esto sugiere que el efecto neutralizante generado por los sueros obtenidos mediante inmunización con VME-TC0210 no están causados por un efecto adyuvante de las VME, pero sí por la capacidad de las VME para presentar TC0210 en su conformación y composición naturales.

Títulos de ELISA

La Figura 18 muestra el análisis cuantitativo de la producción de anticuerpos por ELISA. Las microplacas de ELISA se revistieron con 0,5 |jg de TC0210His en PBS y se almacenaron a 4 °C durante hasta el día siguiente. Las placas se saturaron con PBS-BSA al 1% y entonces se añadieron a los pocillos los antisueros a diferentes diluciones seriadas en PBS-Tween al 0,1 %. Las placas se incubaron después con IgG anti-ratón de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma). Tras esto, se añadieron a las muestras 100 j l de PNPP (Sigma). Las densidades ópticas se leyeron a 405 nm y el título de los anticuerpos séricos se definió como la dilución del suero que produce un valor de DO de 0,5. Los títulos de IgG de cada grupo de ratones inmunizados con OMV que expresa TC0210, o la proteína recombinante TC0210-His (1 jg o 50 jg ) más OMV, o con TC0210-His (1 jg o 50 jg ) solo.

De izquierda a derecha, las barras en la Figura 18 se corresponden con los Grupos de ratones 2, 3, 6, 5, 4 y 1, respectivamente.

Aunque los títulos de anticuerpo de los sueros de ratones inmunizados con OMV que expresa TC0210 son menores que los obtenidos con TC0210His o con la misma proteína recombinante las OMV, los anticuerpos que están presentes en los sueros de ratones inmunizados con las OMV que expresan TC0210 son mejores en términos de actividad neutralizante (véase a continuación).

Aunque no se ha investigado todavía, es razonable que los resultados de ELISA hayan sido diferentes sin los CE de Chlamydia se han usado para el revestimiento, ya que estos incluyen TC0210 en su conformación natural, en lugar de la proteína recombinante tal como se usa en el presente experimento. De hecho, un recubrimiento con los CE permitiría la detección de anticuerpos generados contra epítopos conformacionales.

Ensayo de neutralización

La Figura 19 muestra la neutralización in vitro de la infectividad de C. muridarum sobre células LL-CMK2. Los CE purificados se incubaron con sueros de ratón a tres diferentes diluciones a 37 °C durante 30 minutos. La infectividad residual se determinó sobre células LLC-MK2 mediante conteo de IFU/cs. Los porcentajes de neutralización se midieron en seis ensayos de neutralización realizados de manera independiente usando suero de ratones CD1 inmunizados con 50 ug de OMV recombinante que expresa TC0210 (Grupo 2:

con 20 |jg de proteína purificada por TC0210-HÍS (Grupo 6: ). Los sueros de ratones inmunizados solo con OMV (Grupo 1: ~*~) y con TC0210-HÍS recombinante (1 pg) más OMV sola (Grupo 4: se incluyeron como controles negativos, mientras que los sueros de ratones inmunizados con MOMP recombinante ( - * - ) se usaron como el control positivo. Los datos mostrados son las medias y las desviaciones típicas de las 12 muestras.

Se ha descubierto que los sueros de ratones inmunizados con OMV que expresa TC0210 ( -# -) neutralizan la infección con chlamydia muridarum de manera tan eficiente como MOMP (-♦-), mientras que los sueros de ratones inmunizados con OMV sin antígeno de chlamydia o TC0210His no lo hacen.

También, los resultados de la neutralización indican que las OMV no tienen un efecto adyuvante. En su lugar, el resultado se debe a la capacidad de la VME-TC0210 recombinante para presentar el antígeno heterólogo en su conformación y composición natural.

Ejemplo 8: Análisis de la asignación de epitopos sobre TC0210

Los experimentos de asignación de epitopos se realizaron con el fin de verificar si había algunas diferencias en términos de epitopos lineales reconocidos entre los sueros de ratones inmunizados con OMV-TC0210 y sueros de ratones inmunizados con TC0210His. Se detectaron sobre tres membranas, 95 péptidos sintéticos solapantes que cubren la longitud completa del antígeno TC0210, respectivamente. Cada péptido está constituido por 15 aminoácidos y se solapa en 10meros con el siguiente péptido. Sobre las tres membranas, se ensayaron diferentes grupos de sueros: los sueros de ratones inmunizados a) con VME que expresa TC0210, b) con TC0210His, c) con VME sola (los sueros de ratones inmunizados con VME sin el antígeno de Chlamydia se usaron como control negativo), respectivamente. Se usó una IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante como el anticuerpo secundario.

La Figura 20 muestra que los sueros de ratones inmunizados con OMV que expresan TC0210 (membrana superior) reconocen diferentes epitopos en comparación con los sueros de ratones inmunizados con proteína purificada recombinante TC0210His (membrana intermedia). Los sueros de ratones inmunizados con VME-TC0210 reconocieron los siguientes epítopos con alta especificidad: DYFNDEFFNRFFGLP (SEQ ID NO: 36). Los sueros de ratones inmunizados con VME-TC0210 reconocieron los siguientes epítopos con especificidad media: SHREQ (SEQ ID NO: 37), ALQKMGVRVQNLTPE (SEQ ID NO: 38) y NQVLKNAKGENVLLM (SEQ ID NO: 39). Los sueros de ratones inmunizados con VME-TC0210 reconocieron los siguientes epítopos con baja especificidad: SPMLGYSAPKKDSSTGICLA (SEQ ID NO: 40); EDLLKEVSRGFSKVAAQATP (SEQ ID NO: 41); TGSQAIASPGNKRGFQENPF (SEQ ID NO: 42); PRPQQRDAVR (SEQ ID NO: 43), IAIGNPFGLQATVTVGVISAKGRNQLHIVD (SEQ ID NO: 44) y NTAIVSGSGGYIGIGFAIPSLMAKRVIDQL (SEQ ID NÚM.: 45).

Los sueros de ratones inmunizados con TC0210His reconocieron los siguientes epitopos con alta especificidad: NKRGFQENPFDYFNDEFFNRFFGLP (SEQ ID NO: 84). Los sueros de ratones inmunizados con TC0210His reconocieron los siguientes epítopos con especificidad media: SHREQ.

El epitopo GENVLLMVSQGEVIR (SEQ ID NÚM.: 55) indicado dentro del recuadro sobre la membrana de OMV-TC0210 de la Figura 20 es el mismo epitopo hallado en la rasuración sobre los E.B. de C. trachomatis (véase GENVLLMVSQGDVVR (SEQ ID NÚM.: 86 en la presente solicitud), que se corresponde con la SEQ ID NÚM.: 43 del documento WO 2007/110700, Novartis Vaccines and Diagnostics, SRL), mientras que el epitopo TPGVVYIENFPK (SEQ ID NÚM.: 85), indicado en el otro recuadro para la membrana de VME-TC0210, es el mismo que el epítopo hallado en la rasuración sobre la preparación de VME-TC0210 que se describe en el Ejemplo 5.

Se sostiene la hipótesis de que los sueros producidos mediante inmunización con OMV-TC0210 y los sueros producidos mediante inmunización con TC0210 son capaces de reconocer los epitopos que coinciden en CT823. Por lo tanto, se hipotetiza que los sueros de ratones inmunizados con VME-TC0210 presumiblemente reconocerían el siguiente epítopo de CT823 con alta especificidad: DYFNDEFFNRFFGLP (SEQ iD NO: 56). Los sueros de ratones inmunizados con VME-TC0210 presumiblemente reconocerían los siguientes epítopos de CT823 con especificidad media: SHREQ (SEQ ID NO: 57), ALQKMGVRVQNITPE (SEQ ID NO: 58) y NQVLKNSKGENVLLM (SEQ ID NO: 59). Los sueros de ratones inmunizados con VME-TC0210 presumiblemente reconocerían los siguientes epítopos de CT823 con baja especificidad: SPMLGYSASKKDSKADICLA (SEQ ID NO: 60), EDLLKEVSRGFSRVAAKATP (SEQ ID NO: 61), TGNQAIASPGNKRGFQENPF (SEQ ID NO: 62), IAIGNPFGLQATVTVGVISAKGRNQLHIVD (SEQ ID NO: 63) y NTAIVSGSGGYIGIGFAIPSLMAKRVIDQL (SEQ ID NO: 64). Los sueros de ratones inmunizados con TC0210-His presumiblemente reconocerían los siguientes epítopos de CT823 con alta especificidad: DYFNDEFFNRFFGLP. Los sueros de ratones inmunizados con TC0210-His presumiblemente reconocerían los siguientes epítopos de CT823 con especificidad media: SHREQ (SEQ ID NO: 57).

Ejemplo 9: Aumento de la cantidad de proteínas de la membrana externa sobre la VME

OmpA se implica en el mantenimiento estructural del sistema de membranas. Probablemente por este motivo, la ausencia de esta proteína desestabiliza la membrana externa bacteriana, dando como resultado la liberación de una abundante cantidad de VME. En este caso, se observó la liberación de VME en el sobrenadante de cultivo de la cepa mutante BL21(DE3)AompA. La preparación de VME se hizo tal como se ha descrito anteriormente y se muestra en el diagrama esquemático de la Figura 7. La rasuración se realizó sobre las VME con el fin de analizar su calidad. Los resultados se presentan en la Figura 21. Las 29 proteínas (todas proteínas de la membrana externa) identificadas en la VME de E. coli BL21(DE3)AompA en el análisis del rasurado y de espectrometría de masas son: Precursor de lipoproteína hipotética yiaD [Escherichia coli CFT073], canal de transporte [Escherichia coli W3110], chaperona periplásmica [Escherichia coli K12], Posible toxina de sistema toxina-antitoxina regulado osmóticamente asociada con la muerte celular programada [muerte celular de Escherichia coli [Escherichia coli CFT073], lipoproteína mureína [Escherichia coli K12], peptidil-prolil cis-trans isomerasa de tipo ^f K^b P (rotamasa) [Escherichia coli K12], proteína hipotética b0177 [Escherichia coli K12], proteína hipotética ECP_0753 [Escherichia coli 536], precursor de maltoproteína [Escherichia coli K12], canal de nucleósido, receptor de fago T6 y colicina K [Escherichia coli K12], lipoproteína de membrana externa asociada a peptidoglicano [Escherichia coli K12], precursor de lipoproteína 34 [Escherichia coli CFT073], proteína de andamiaje para la maquinaria de síntesis de mureína [Escherichia coli K12], lipoproteína menor [Escherichia coli K12], lipoproteína predicha [Escherichia coli K12], precursor de lipoproteína de membrana externa slyB [Escherichia coli CFT073], proteína X de membrana externa [Escherichia coli K12], proteína periplásmica de regulón de maltosa Escherichia coli K12], proteína periplásmica de transporte ABC de maltosa [Escherichia coli K12], precursor de lipoproteína hipotética yajG [Escherichia coli CFT073], transportador de ácidos grasos de cadena larga de membrana externa [Escherichia coli K12], precursor de proteína hipotética ybaY [Escherichia coli CFT073], lipoproteína de membrana externa predicha [Escherichia coli K12], precursor de proteína de translocación TolB [Escherichia coli K12], proteína hipotética b3147 [Escherichia coli K12], transportador predicho de hierro de membrana externa [Escherichia coli K12], subunidad de transportador de oligopéptidos [Escherichia coli K12], proteína hipotética c4729 [Escherichia coli CFT073], proteína hipotética b1604 [Escherichia coli K12].

Inesperadamente, se ha descubierto que todas las proteínas presentes en esta nueva preparación de OMV son proteínas de membrana externa. Este resultado resalta que la calidad de la nueva preparación de VME es mejor que la obtenida de la cepa mutante E. coli BL21(DE3)AtolR, en la que también se hallaron algunas proteínas citoplásmicas. Específicamente, en la cepa mutante E. coli BL21(DE3)AtolR, solo aproximadamente el 75 % de las 100 proteínas de VME eran proteínas de la membrana externa.

Ejemplo 10: Expresión de antígenos de chlamydia en la cepa mutante BL21(DE3)AmpA-.

Los antígenos de Chlamydia se expresaron en la cepa E. coli BL21(DE3)AompA con el fin de verificar si hay un aumento en la cantidad de antígenos de Chlamydia en la OMV recombinante derivada.

Las OMV se prepararon a partir de sobrenadantes de cultivo de la cepa BL21(DE3)AompA que expresa TC0210 tal como se describe anteriormente y como se muestra en el diagrama esquemático de la Figura 4. Se cargaron diferentes cantidades de cada preparación de VME en gel de poliacrilamida al 4-12 %.

Tal como se muestra en la Figura 22, en estas nuevas preparaciones de OMV de la cepa BL21(DE3)AompA, fue posible identificar la presencia de TC0210 directamente sobre SDS PAGE (datos confirmados mediante análisis de espectrometría de masas - véase la banda indicada con la flecha sobre la Figura 22). La banda de TC0210 es claramente visible a todas las concentraciones. Por el contrario, las preparaciones de VME obtenidas a partir de la cepa mutante E. coli BL21(DE3)AtolR, se observó la presencia de TC0210 solo mediante análisis por transferencia de Western. Esto confirma que la cantidad de antígeno de TC0210 expresado aumenta notablemente en la cepa BL21(DE3)AompA en relación con la cepa mutante BL21(DE3)AtolR. La espectrometría de masas confirmó la presencia del péptido TC0210 sobre las preparaciones de TC0210-VME (Figura 23). Los péptidos identificados se muestran en negrita. Específicamente, se identificaron los siguientes péptidos: VAAQATPGVVYIENFPK (SEQ ID NÚM.: 46), GFQENPFDYFNDEFFNRFFGLPSHREQPRPQQR (SEQ ID NO: 47), GTGFIVSEDGYVVTNHHVVEDAGK (SEQ ID NO: 48), TDLAVIKIQAK (SEQ ID NO: 49), VIDQLISDGQVTR (SEQ ID NO: 50), AGLRQEDVIVAYNGKEVESLSALR (SEQ ID NO: 51), FIEIPVTVTQIPAEDGVSALQK (SEQ ID NO: 52), VQNLTPEICK (SEQ ID NO: 53), y NAKGENVLLMVSQGEVIR (SEQ ID NÚM.: 54).

Los inventores han descubierto inesperadamente que las cepas mutantes BL21(DE3)AompA generaron una cantidad elevada de antígeno heterólogo sobre sus OMV en relación con las cepas OmpA de tipo silvestre. OmpA es la proteína más abundante sobre la membrana externa de E. coli. Los inventores han descubierto que, en la VME, la deleción de esta proteína mejora la abundancia relativa del antígeno de Chlamydia con respecto a las proteínas de la membrana externa de E. coli.

Esta elevada cantidad de antígeno de Chlamydia expresada sugiere que las OMV de cepas AompA, por ejemplo, BL21(DE3)AompA-TC0210, son buenos candidatos para generar anticuerpos neutralizantes en ratones.

SECUENCIA

SEQ ID NÚM.:1: secuencia de proteína CT823

SEQ ID NÚM.:2: secuencia de nucleótidos CT823

SEQ ID NO: 3 - Secuencia de nucleótidos de CT733

SEQ ID NÚM: 4 - Secuencia de proteína CT733

SEQ ID NÚM.:5: Secuencia de nucleótidos CT153

SEQ ID NÚM .:6: secuencia de prote ína CT153

SEQ ID NÚM.:7: secuencia de nucleótidos CT601

SEQ ID NÚM.: 8 - Secuencia de proteína CT601

SEQ ID NÚM.:9: secuencia de nucleótidos CT279

SEQ ID NÚM.:10: secuencia de proteína CT279

SEQ ID NÚM .:11: secuencia de nucleótidos CT443

SEQ ID NÚM.:12: secuencia de proteína CT443

SEQ ID NÚM.:13: secuencia de nucleótidos CT372

SEQ ID NÚM .:14: secuencia de prote ína CT372

SEQ ID NÚM.:15: 3 - Secuencia de nucleótidos CT043

SEQ ID NÚM.:16: - Secuencia de proteína CT043

SEQ ID NÚM.:17: secuencia de proteína CT681

SEQ ID NÚM.:18: secuencia de nucleótidos CT823

SEQ ID NÚM.:19: secuencia de proteína TC0210

SEQ ID NÚM .:20: secuencia de prote ína TC0052

SEQ ID NÚM.:21: secuencia de nucleótidos TC0052

SEQ ID NÚM.:22: secuencia de proteína TC0106

SEQ ID NÚM.:23: hom ólogo de CM de CT601 = TC_0551

SEQ ID NÚM.:24: hom ólogo de CM de secuencia de la proteína CT601 = secuencia de proteína TC_0551

SEQ ID N ÚM .:25: hom ólogo de C M de CT372 = secuencia de nucleótidos TC_0651

SEQ ID NÚM.:26: hom ólogo de CM de CT372 = secuencia de proteína TC_0651

SEQ ID NÚM.:27: hom ólogo de CM de CT443 = TC_0727

SEQ ID NÚM.:28: homólogo de CM de CT443 = TC_0727

SEQ ID NÚM .:29: hom ólogo de C M de CT043 = secuencia de nucleótidos TC_0313

SEQ ID NÚM.:30: hom ólogo de CM de CT043 = secuencia de proteína TC_0313

SEQ ID NÚM.:31: secuencia de proteína TC0431

SEQ ID NÚM.:32 homólogo de CM de CT279 = secuencia de nucleótidos TC_0890

SEQ ID NÚM.:33: SEQ ID NÚM.:26: homólogo de CM de CT279 = secuencia de proteína TC_0890

SEQ ID NÚM.:34: secuencia de la proteína TC0660

SEQ ID NÚM .:35: secuencia de proteína TC0741

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Claims (12)

REIVINDICACIONES

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2. La vesícula de membrana externa de acuerdo con la reivindicación 1, que no expresa uno o más componentes del complejo Tol-Pal.

3. La vesícula de membrana externa de acuerdo con la reivindicación 2, que no expresa TolR.

4. La vesícula de membrana externa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que expresa la lipoproteína de Braun Ipp.

5. La vesícula de membrana externa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la bacteria es E. coli.

6. La vesícula de membrana externa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el antígeno heterólogo es de Chlamydia.

7. Una composición inmunogénica que comprende una vesícula de membrana externa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

8. Una vacuna que comprende una vesícula de membrana externa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 7 o una vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además uno o más antígenos adicionales en una preparación combinada para la administración simultánea, separada o secuencial.

10. Una vesícula de membrana externa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 7, o una vacuna de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, para uso en el aumento de una respuesta inmunitaria en un mamífero.

11. Una vesícula de membrana externa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 7, o una vacuna de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, para uso en la profilaxis o terapia para elevar anticuerpos que se unen a uno o más epítopos en el antígeno heterólogo que no son inmunoaccesibles y/o no están en su conformación nativa cuando el antígeno heterólogo está presente en una forma purificada.

12. Una vesícula de membrana externa, una composición inmunogénica o vacuna para uso de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el uso es para elevar una respuesta de anticuerpos neutralizantes.