ES2943488T3 - Forma cristalina de compuesto tri-ciclo y aplicación del mismo - Google Patents

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Jing Wang
Zhigan Jiang
Haiying He
Yaxun Yang
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Abstract

Se describen la forma cristalina A y la forma cristalina B de un compuesto representado por la fórmula (I) y su aplicación en la preparación de fármacos para tratar enfermedades relacionadas con el VHB. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Forma cristalina de compuesto tri-ciclo y aplicación del mismo
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente china CN2018109690068, presentada el 23 de agosto de 2018.
Campo técnico
La presente descripción se refiere a la forma cristalina A y la forma cristalina B de un compuesto representado por la fórmula (I), y la aplicación del mismo en la preparación de un medicamento para tratar enfermedades relacionadas con el VHB.
Antecedentes de la técnica
La hepatitis B es una respuesta inflamatoria provocada por la invasión del virus de la hepatitis B, que puede derivar en una serie de problemas como dolor en la región hepática, hepatoesplenomegalia, fibrosis hepática, y cirrosis e incluso cáncer de hígado en casos graves. Estadísticamente, hay entre 350-400 millones de portadores del virus de la hepatitis B en todo el mundo, 1/3 de los cuales se encuentran en China, y el número de muertes causadas por la hepatitis B en China asciende a 500.000 cada año.
No existen medicamentos específicos para el tratamiento de la hepatitis B en todo el mundo en esta etapa. Los medicamentos de primera línea para el tratamiento de la hepatitis B en China son principalmente los fármacos de nucleósidos, los interferones y la medicina tradicional china. Sin embargo, existen problemas como el alto costo y la susceptibilidad a la recaída, por lo que es imperativo desarrollar un nuevo tipo de fármaco anti-hepático.
El documento WO2008154817A1 describe la estructura de GLS4 de la siguiente manera:
Figure imgf000002_0001
Los documentos US2020/247819A1, WO2018/153285A1, CN106413402A y WO2017/069279A1 se refieren todos a los compuestos para tratar enfermedades relacionadas con el VHB.
Contenido de la presente invención
La presente descripción proporciona una forma cristalina A de un compuesto representado por la fórmula (I) que tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo (XRPD) que comprende picos de difracción característicos con los siguientes ángulos de 20: 5,56±0,2°, 15,56±0,2° y 16,17±0,2°,
Figure imgf000002_0002
En algunas realizaciones de la presente descripción, el patrón de difracción de rayos X en polvo de la forma cristalina A como se define anteriormente comprende picos de difracción característicos con los siguientes ángulos de 20: 5,56±0,2°, 10,84±0,2°, 15,56±0,2°, 16,17±0,2°, 22,14±0,2°, 22,70±0,2°, 27,76±0,2° y 28,44±0,2°.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el patrón de XRPD de la forma cristalina A como se define anteriormente se muestra en la Figura 1.
En algunas realizaciones de la presente descripción, los datos de análisis del patrón de XRPD de la forma cristalina A como se define anteriormente se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Datos analíticos del patrón de XRPD de la forma cristalina A
Figure imgf000003_0001
En algunas realizaciones de la presente descripción, la forma cristalina A como se define anteriormente presenta un pico endotérmico con un inicio de 229,95°C como se mide por la curva de calorimetría diferencial de barrido (DSC). En algunas realizaciones de la presente descripción, el DSC de la forma cristalina A como se define anteriormente se muestra en la Figura 2.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la forma cristalina A como se define anteriormente tiene una curva de análisis termogravimétrico (TGA) con una pérdida de peso de 0,3382% a 62±3°C y una pérdida de peso de 0,8753% a 230±3°C.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la TGA de la forma cristalina A como se define anteriormente se muestra en la Figura 3.
La presente descripción también proporciona una forma cristalina B de un compuesto representado por la fórmula (I) que tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos de difracción característicos con los siguientes ángulos de 20: 12,70±0,2°, 15,64±0,2° y 23,03±0,2°.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el patrón de difracción de rayos X en polvo de la forma cristalina B como se define anteriormente comprende picos de difracción característicos con los siguientes ángulos de 20: 9,56±0,2°, 12,70±0,2°, 14,41±0,2°, 15,64 ±0,2°, 19,70±0,2°, 23,03±0,2°, 23,98±0,2° y 27,65±0,2°.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el patrón de XRPD de la forma cristalina B como se definió anteriormente se muestra en la Figura 4.
En algunas realizaciones de la presente descripción, los datos de análisis del patrón de XRPD de la forma cristalina B como se definió anteriormente se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Datos analíticos del patrón de XRPD de la forma cristalina B
Figure imgf000004_0001
En algunas realizaciones de la presente descripción, la forma cristalina B, como se define anteriormente, presenta un pico endotérmico con un inicio de 233,59°C, como se mide mediante una curva de calorimetría diferencial de barrido. En algunas realizaciones de la presente descripción, el DSC de la forma cristalina B como se define anteriormente se muestra en la Figura 5.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la forma cristalina B como se define anteriormente tiene una curva de análisis termogravimétrico con una pérdida de peso de 0,04890% a 120±3°C.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la TGA de la forma cristalina B como se define anteriormente se muestra en la Figura 6.
La presente descripción también proporciona la forma cristalina A o la forma cristalina B como se define anteriormente para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el VHB.
Efectos técnicos
La forma cristalina A y la forma cristalina B del compuesto representado por la fórmula (I) de la presente invención son estables y menos afectadas por el calor y la humedad con buena eficacia de administración in vivo, y son prometedores en la preparación de medicamentos.
Definiciones y explicaciones
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos y frases utilizados en este documento pretenden tener los siguientes significados. Un término o frase específica no debe considerarse indefinido o poco claro en ausencia de una definición particular, sino que debe entenderse en el sentido convencional. Cuando aparece un nombre comercial en el presente documento, se pretende hacer referencia a su correspondiente producto o ingrediente activo del mismo. Los compuestos intermedios de la presente descripción se pueden preparar mediante varios métodos sintéticos conocidos por los expertos en la técnica, incluidas las realizaciones descritas a continuación, las realizaciones formadas mediante la combinación de las realizaciones descritas a continuación con otros métodos de síntesis química y alternativas equivalentes bien conocidas por los expertos en la materia. Las realizaciones preferidas incluyen, pero no se limitan a las realizaciones de la presente descripción.
Las reacciones químicas en las realizaciones de la presente descripción se llevan a cabo en un disolvente adecuado, y el disolvente debe ser adecuado para el cambio químico y los reactivos y materiales requeridos de la presente descripción. Para obtener los compuestos de la presente descripción, a veces es necesario que los expertos en la técnica modifiquen o seleccionen los pasos sintéticos o los esquemas de reacción en función de las realizaciones existentes.
La presente descripción se describirá específicamente a continuación a modo de realizaciones, pero el alcance de la presente descripción no se limita a las mismas.
Todos los disolventes usados en la presente descripción están disponibles comercialmente y pueden usarse directamente sin purificación adicional.
Los disolventes usados en la presente descripción están disponibles comercialmente. La presente descripción emplea las siguientes abreviaturas: EtOH significa etanol; MeOH significa metanol; TFA significa ácido trifluoroacético; TsOH significa ácido p-toluenosulfónico; pf significa punto de fusión; EtSO3H significa ácido etanosulfónico; MeSO3H significa ácido metanosulfónico; THF significa tetrahidrofurano; EtOAc significa acetato de etilo; THF significa tetrahidrofurano; EA significa acetato de etilo; DMAP significa 4-dimetilaminopiridina; DCM significa diclorometano; DIPEA significa N,N-diisopropiletilamina.
Difractómetro de rayos X en polvo (XRPD)
Se usaron aproximadamente 10-20 mg de muestra para la detección de XRPD.
Los parámetros detallados de XRPD son los siguientes:
Tubo de rayos X: Cu, ka, (A=1,54056 Á).
Voltaje del tubo de rayos X: 40 kV, corriente del tubo de rayos X: 40 mA
Ranura de divergencia: 0,60 mm
Rendija detectora: 10,50 mm
Rendija antidispersión: 7,10 mm
Intervalo de escaneo: 3-40 grados o 4-40 grados
Tamaño de paso: 0,02 grados
Tiempo de paso: 0,12 segundos
Velocidad de rotación de la bandeja de muestra: 15 rpm
Calorímetro diferencial de barrido (DSC)
Se colocaron 0,5-1 mg de muestra en un crisol de aluminio de DSC para realizar la prueba aumentando la temperatura de la muestra de 30°C a 300°C a una velocidad de 10°C/min por debajo de 50 mL/min de N2.
Analizador Térmico Gravimétrico (TGA)
Se colocaron 2-5 mg de muestra en un crisol de platino de TGA para la prueba y se calentó a una velocidad de 10°C/min a 25 mL/min de N2 para aumentar la temperatura de la muestra desde temperatura ambiente hasta 300°C o hacer que la muestra pierda un 20% de peso.
El analizador dinámico de sorción de vapor (DVS)
Condición de detección: se colocaron 10-15 mg de la muestra en la bandeja de muestras para la detección de DVS. Los parámetros detallados de DVS son los siguientes:
Temperatura: 25°C
Equilibrio: dm/dt=0,01%/min: (más corto: 10 min, más largo: 180 min)
Secado: 0% de HR, 120 min
Gradiente de HR (%) para pruebas: 10%
Intervalo de gradiente de HR (%) para pruebas: 0%-90%-0%
Los siguientes son los criterios para las evaluaciones:
Figure imgf000006_0001
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es el patrón de XRPD de radiación Cu-Ka de la forma cristalina A del compuesto representado por la fórmula (I).
La figura 2 es el patrón de DSC de la forma cristalina A del compuesto representado por la fórmula (I).
La Figura 3 es el patrón de TGA de la forma cristalina A del compuesto representado por la fórmula (I).
La figura 4 es el patrón de XRPD de radiación Cu-Ka de la forma cristalina B del compuesto representado por la fórmula (I).
La figura 5 es el patrón de DSC de la forma cristalina B del compuesto representado por la fórmula (I).
La Figura 6 es el patrón de TGA de la forma cristalina B del compuesto representado por la fórmula (I).
Figura 7: El nivel de ADN del virus de la hepatitis B en plasma; la línea discontinua 1 significa control en blanco, se administró una solución acuosa de solutol al 10% quaque die (QD), per os (PO); la línea discontinua 2 significa que se administró WX-325 a una dosis de 15 mg/kg bis in die (BID) con un intervalo de 8 horas, per os (PO); la línea discontinua 3 significa que se administró WX-325 a una dosis de 50 mg/kg bis in die (BID) con un intervalo de 8 horas, per os (PO); la línea discontinua 5 significa que se administró WX-325 a una dosis de 150 mg/kg bis in die (BID) con un intervalo de 8 horas, p e ro s (PO); la línea discontinua 6 significa que se administró tenofovir (TDF) del compuesto positivo a una dosis de 15 mg/kg bis in die (BID) con un intervalo de 8 horas, per os (PO); LLOQ significa límite inferior de detección; Nota: WX-325 en la Figura 7 significa el compuesto representado por la fórmula (I) de la presente invención.
Figura 8: El nivel de ADN del virus de la hepatitis B en el hígado el día 28; Nota: QD significa quaque die; BID significa bis in die; MPK significa mg/kg; Vehículo significa control en blanco; Nota: WX-325 en la Figura 8 significa el compuesto representado por la fórmula (I) de la presente invención.
Descripción detallada de la realización preferida
Para comprender mejor el contenido de la presente descripción, las siguientes realizaciones ilustran adicionalmente la presente descripción, pero la presente descripción no se limita a ellas.
Ejemplo 1 Preparación del compuesto representado por la fórmula (I)
Figure imgf000007_0001
Ruta sintética
Figure imgf000007_0002
Paso 1: Síntesis del compuesto 1-A
Se añadió diclorometano anhidro (5 L) a un matraz seco de tres bocas (10 L) y se agitó, luego se añadieron sucesivamente el compuesto 1-SMA (500,00 g) y nitrometano al matraz de tres bocas para obtener una mezcla. La mezcla se colocó en un baño de etanol con hielo seco y se enfrió a -10°C. La temperatura se controló entre -10°C-0°C. Se añadió lentamente tricloruro de aluminio (1,15 kg) al matraz de reacción y se controló la temperatura a menos de -0°C. A continuación, se añadió lentamente a,a-diclorodimetil-metiléter (495,00 g) a la caldera de reacción para obtener una solución de reacción, que se calentó lentamente a temperatura ambiente y se agitó durante 18 horas. El seguimiento por TLC (PE:EA 3:1) reveló la desaparición de la mancha de materia prima y la aparición de una nueva mancha con alta polaridad. Se añadió lentamente gota a gota solución de bisulfato de potasio (3 L) a la solución de reacción extraída a una concentración del 10%, se agitó durante 20 minutos mientras se añadía hielo picado para evitar el sobrecalentamiento. La solución mixta se transfirió a un embudo de decantación de 25 L y se dejó reposar para la estratificación para separar la fase de diclorometano, y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 L*2). Después de lavar con solución de bisulfato de potasio al 10% (5 L*2), la fase orgánica se separó y se secó con sulfato de sodio anhidro (1 kg). La fase orgánica se concentró a presión reducida para obtener el compuesto 1-A como un sólido de color verde oscuro.
1H RMN (400 MHz, cloroformo deuterado) 5 = 9,97 (br s, 1H), 9,87 - 9,82 (m, 1H), 7,58 (dd, J=1,5, 3,3 Hz, 1H), 7,36 -7,29 (m, 1H), 4,37 (q, J=7,1 Hz, 2H), 1,38 (t, J=7,2 Hz, 3H).
Paso 2: Síntesis del compuesto 1-B
Se añadió hidrazida de p-toluenosulfonilo (2,23 kg, 11,96 moles) a la solución de THF (20 L) que contenía el compuesto 1-A (2 kg, 11,96 moles). La solución se agitó a 20°C durante aproximadamente 1 h. Cuando se monitorizó la desaparición de la materia prima por TLC, el sistema de reacción se calentó a 60°C y se añadió por lotes cianoborohidruro de sodio (902 g, 14,36 moles). Después de la adición, la solución de reacción se calentó a 70°C y se agitó durante 3 h. Después de que se detuviera el calentamiento y se enfriara a temperatura ambiente, se añadieron 5 L de agua para desactivar la reacción, seguido de la eliminación de la mayor parte del THF a presión reducida, y el residuo se extrajo con una gran cantidad de EA (1,5 L*3). Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con cloruro de sodio saturado y se secaron con sulfato de sodio anhidro. Luego se filtraron las fases orgánicas y se eliminó el disolvente a presión reducida. Finalmente, el producto bruto se cromatografió en columna para obtener el compuesto 1 -B como un sólido de color amarillo pálido.
Paso 3: Síntesis del compuesto 1-C
Se añadió metanol (32 L) a una caldera con camisa de 50 L y se agitó, luego se añadieron sucesivamente el compuesto 1-SMB (4000,00 g) y diisopropiletilamina (5,25 L), y la temperatura interna se redujo a 5-10°C. Se añadió lentamente gota a gota bencilmercaptano (2490,00 g) y la temperatura interna se mantuvo a 5-15°C. Una vez completada la adición, se apagó el sistema de refrigeración para dejar que la temperatura aumentara de forma natural y se continuó agitando durante 2,5 h. A continuación, se detuvo la agitación, se ajustó la velocidad a 100 rpm y se liberó el líquido de reacción y se filtró a través de un filtro de mesa para obtener una torta de filtrado. La torta del filtrado se lavó tres veces con agua (5 L), seguido de una vez con EtOH (3 L). La torta del filtrado se filtró por filtración por succión hasta que dejó de ser viscosa, obteniendo así el compuesto 1 -C como un sólido de color amarillo pálido.
Paso 4: Síntesis del compuesto 1-D
Se añadió diclorometano (7,5 L) a una caldera de 50 L y se agitó, luego se añadió el compuesto 1-C (1500 g). La temperatura interna se redujo a 0-10°C y se añadió solución de HCl (6 M, 4,12 L). La solución de hipoclorito de sodio (solución al 8% comercialmente disponible, 23,0 kg) se añadió gota a gota a 0-10°C con la tapa abierta. Después de la adición gota a gota, se apagó el sistema de refrigeración y se continuó agitando durante aproximadamente 17 horas con la tapa abierta. Luego se añadió bisulfito de sodio para la capacidad térmica (1000 g, 5 L de solución acuosa), y se usó papel de prueba de yoduro de potasio de almidón para detectar si no quedaba oxidante en la fase acuosa. A continuación, se detuvo la agitación y se dejó reposar la solución para la estratificación. La fase de diclorometano se recogió mientras que la fase acuosa se extrajo con diclorometano (2,5 L) y las fases de diclorometano se agruparon. La fase orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro y se filtró, luego se eliminó el disolvente a presión reducida para obtener el compuesto 1 -D como un sólido blanco.
1H RMN (400 MHz, cloroformo deuterado) 5 = 8,50 - 8,43 (m, 2H), 8,34 (d, J=8,2 Hz, 1H), 4,04 (s, 3H).
Paso 5: Síntesis del compuesto 1-E
Se añadió tetrahidrofurano (10 L) a una caldera con camisa seca de 50 L y se agitó, luego se añadió el compuesto 1-B (2000 g). La temperatura interna se redujo a 0-10°C. La temperatura se mantuvo a 0-15°C durante aproximadamente 1,5 horas y se añadió terc-butóxido de potasio (solución en THF 1 M, 15,67 L). Después de la adición, se elevó la temperatura a aproximadamente 20°C y se continuó agitando durante 1 hora. A continuación, la temperatura se redujo a 0-10°C y se añadió lentamente la solución de THF (10 L) que contenía el compuesto 1-D (4380 g). Después de la adición, la temperatura se elevó lentamente a 15°C y se continuó agitando durante aproximadamente 16 horas. Se añadió acetato de etilo (10 L) para la extracción y la fase orgánica se lavó dos veces con solución saturada de cloruro de sodio (10 L). Las fases acuosas se combinaron y extrajeron con EA (5 L) y las fases orgánicas se combinaron. Finalmente, el disolvente se eliminó de la fase orgánica a presión reducida para obtener el compuesto 1-E como un sólido de color amarillo pálido.1
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 = 8,55 (d, J=1,4 Hz, 1H), 8,37 (dd, J=1,5, 8,3 Hz, 1H), 7,91 (d, J=8,3 Hz, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,13 (d, J=1,8 Hz, 1H), 4,02 (q, J=7,0 Hz, 2H), 3,93 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 1,08 (t, J=7,1 Hz, 3H).
Paso 6: Síntesis del compuesto 1-SM1
Se añadió el compuesto 1-E (1000,0 g) a un matraz seco de tres bocas de 10 L y se agitó, luego se añadió ácido acético glacial (5 L) y la temperatura interna de la reacción se controló a 25-30°C. Se añadió lentamente polvo de hierro (1 eq, 140,9 g). Después de agitar durante 30 minutos, se añadió lentamente el segundo lote de polvo de hierro (0,5 eq, 70,44 g). Después de continuar la agitación durante 30 minutos, se añadió el tercer lote de polvo de hierro (0,5 eq, 70,44 g). Después de otros 30 min de agitación, se añadió el cuarto lote de polvo de hierro (0,5 eq, 70,44 g) y se continuó agitando la reacción hasta que se monitorizó la desaparición de la materia prima y la aparición de un nuevo punto con alta polaridad. A continuación, se detuvo la agitación y la solución de reacción se transfirió a un dispensador de 25 L para la separación de líquidos. Se añadieron 10 L de acetato de etilo a la solución, que luego se lavó dos veces con 5 L de solución acuosa saturada de bisulfato de sodio. Después de la separación líquida, la fase acuosa se volvió a extraer con 5 L de acetato de etilo. A continuación, las fases orgánicas se combinaron y se lavaron con solución acuosa de NaOH al 10% hasta pH > 8, y la fase orgánica se recogió mediante separación líquida. La fase orgánica se concentró a presión reducida para obtener el compuesto 1-SM1 como un sólido blanco.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 = 7,79 - 7,71 (m, 2H), 7,50 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,14 (dd, J=1,7, 8,5 Hz, 1H), 6,96 (d, J=2,0 Hz, 1H), 6,42 (s, 2H), 4,11 (q, J=7,2 Hz, 2H), 3,84 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 1,16 (t, J=7,1 Hz, 3H).
Paso 7: Síntesis del compuesto 1-F
Se añadió tolueno (12 L) a una caldera con camisa seca de 50 L y se agitó, luego se añadió 2-bromoetanol (9930 g), seguido de éter de trifluoruro de boro (268 g). La reacción se calentó a 30-35°C. Se añadió gota a gota lentamente el compuesto 1-SMC (3500 g) y la adición se completó en aproximadamente 1,5 horas. Después de la adición, la temperatura interna de la reacción se elevó a aproximadamente 55-65°C y el nivel de temperatura del calentador se ajustó a 60°C para mantener la temperatura interna a 55-65°C durante 1 hora. A continuación, la temperatura interna del sistema se redujo a aproximadamente 10°C y se añadió lentamente al sistema de reacción una solución acuosa de hidróxido de sodio (3783 g, 17,5 L de agua) a aproximadamente 20°C mientras la temperatura interna se mantenía a 10-20°C. Después de la adición de la solución de NaOH, se apagó el control de temperatura del calentador y la reacción continuó en agitación durante aproximadamente 16 h. Luego se detuvo la agitación para repartir estacionariamente la solución de reacción. La fase acuosa se extrajo con 2-metiltetrahidrofurano (10 L) y las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con agua (10 L) y se dejaron reposar para la estratificación para recoger la fase orgánica. La fase orgánica finalmente se concentró a presión reducida para obtener el compuesto 1 -F como un aceite incoloro.
1H RMN (400 MHz, cloroformo deuterado) 5 = 3,87 - 3,71 (m, 4H), 3,66 - 3,59 (m, 3H), 3,42 (dd, J=6,0, 11,7 Hz, 1H), 3,20 - 3,13 (m, 1H), 2,79 (t, J=4,6 Hz, 1H), 2,65 - 2,59 (m, 1H).
Paso 8: Síntesis del compuesto 1-G
Se añadió una solución acuosa de hidróxido de sodio (3240 g, 15 L de agua) a una caldera con camisa de 50 L, luego se añadió el compuesto 1 -F (4430 g) y se encendió el calentamiento. Después de que la reacción se calentara a 90°C, se continuó agitando durante 1 h. Se encendió el enfriamiento para reducir la reacción a aproximadamente 15°C, luego se añadió solución de THF (6180 g, tetrahidrofurano 15 L) que contenía solución de cloruro de p-toluenosulfonilo. Se apagó el control de temperatura del calentador y la reacción se agitó adicionalmente a aproximadamente 15°C durante aproximadamente 16 h. A continuación, se detuvo la agitación para dejar reposar la reacción para la estratificación. La fase acuosa se extrajo con 2-metiltetrahidrofurano (10 L), y la fase de 2-metiltetrahidrofurano (había materia blanca insoluble, que desapareció después del lavado) se lavó con agua (5 L), y las fases orgánicas se combinaron. Se añadieron DMAP (500 g) y trietilamina (2,5 L) a la fase orgánica, seguido de agitación de la fase orgánica durante 30 minutos. Luego se lavó la fase orgánica con solución saturada de cloruro de sodio (10 L) y se dejó reposar para la estratificación, y se descartó la fase acuosa. La fase orgánica se lavó con solución de hidrogenosulfato de potasio (3800 g, 15 L de agua) y solución saturada de cloruro de sodio (5 L* dos veces) sucesivamente, y luego se dejó reposar para la estratificación, y se recogió la fase orgánica. La fase orgánica finalmente se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente para obtener el compuesto de producto bruto 1 -G.1
1H RMN (400 MHz, cloroformo deuterado) 5 = 7,77 (d, J=8,3 Hz, 2H), 7,34 (d, J=8,2 Hz, 2H), 4,03 - 3,91 (m, 2H), 3,80 - 3,49 (m, 8H), 3,33 (dd, J=9,9, 11,4 Hz, 1H), 2,43 (s, 3H).
Paso 9: Síntesis del compuesto 1-H
Se añadió acetona (30 L) a una caldera con camisa limpia de 50 L y se agitó, luego se añadió el compuesto 1 -G (4500 g), seguido de yoduro de sodio (6190 g). Se encendió el calentamiento y, después de calentar la reacción a 75°C, se continuó agitando durante 16 horas. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la reacción se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida a 50°C. Se añadieron acetato de etilo (15 L) y agua (10 L) al producto en bruto concentrado, y la mezcla se agitó y luego se dejó reposar para la estratificación. La fase orgánica se lavó con tiosulfato de sodio 0,5 M (10 L). La fase acuosa y la solución de tiosulfato de sodio se combinaron y se extrajeron con EtOAc (5 L). Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron con una solución saturada de cloruro de sodio (10 L), luego se dejaron reposar para la estratificación y se recogió la fase orgánica. La fase orgánica finalmente se concentró a presión reducida para eliminar el disolvente para obtener el compuesto producto en bruto 1 -H.
1H RMN (400 MHz, cloroformo deuterado) 5 = 3,90 - 3,83 (m, 2H), 3,81 - 3,75 (m, 2H), 3,74 - 3,65 (m, 5H), 3,63 - 3,49 (m, 7H), 3,31 - 3,18 (m, 3H), 3,06 - 3,04 (m, 2H).
Paso 10: Síntesis del Compuesto 1 -I
Se añadió DMSO (20 L) a una caldera con camisa de 50 L limpia y se agitó, luego se añadió el compuesto 1 -H (4700 g) y la temperatura se elevó a 35°C, seguido de la adición de cianuro de sodio (1010 g). La temperatura interna de la reacción se elevó a aproximadamente 60°C en 20 minutos, luego la temperatura se redujo gradualmente a 35°C y se continuó agitando durante aproximadamente 16 horas. Se añadió solución de bicarbonato de sodio (2000 g de bicarbonato de sodio, 10 L de agua) al sistema de reacción, que luego se agitó durante aproximadamente 5 minutos. Se añadió EtOAc:MeOH (20 L, 2 L) y el sistema de reacción se agitó adicionalmente durante 2 minutos, seguido de reposo durante aproximadamente 1 hora. A continuación, se repartió el sistema de reacción y se separaron aproximadamente 30 L de la solución de la fase inferior. La solución de la fase inferior se extrajo dos veces con EtOAc:MeOH (15 L: 1,5 L la primera vez y 5 L: 0,5 L la segunda vez). Después de la extracción, la fase orgánica superior y la fase superior del líquido de reacción restante se combinaron, se lavaron tres veces con solución saturada de cloruro de sodio (10 L cada vez) y se dejaron reposar para la estratificación. Se descartó la fase acuosa mientras se recogía la fase orgánica. Finalmente, el disolvente se eliminó de la fase orgánica a presión reducida y el producto en bruto se cromatografió en columna para obtener el compuesto 1-I como un aceite incoloro.
1H RMN (400 MHz, cloroformo deuterado) 5 = 3,84 - 3,65 (m, 6H), 3,61 - 3,53 (m, 2H), 3,35 (t, J=10,5 Hz, 1H), 2,49 -2,44 (m, 2H).
Paso 11: Síntesis del compuesto 1-J
Bajo la protección de argón, se añadieron níquel Raney (10,00 g, 116,73 mmoles) y EtOH (150 mL) al matraz de hidrogenación seco y luego se añadieron 1-I (20 g, 157,31 mmoles) y NH3 H2O (13,65 g, 97,36 mmoles, 15,00 mL, 25% de pureza), seguido de reemplazo, y la reacción se agitó a 344,74 kPa (50 psi) y 50°C durante 3,5 h. La solución de reacción se filtró utilizando tierra de diatomeas y el filtrado se concentró a presión reducida para obtener el compuesto 1-J como un aceite amarillo.
1H RMN (400 MHz, cloroformo deuterado) 5 = 3,82 - 3,57 (m, 6H), 3,34 - 3,18 (m, 1H), 2,86 - 2,72 (m, 2H), 1,60 - 1,38 (m, 2H).
Paso 12: Síntesis del compuesto 1-SM2
Se añadió 1 -J (800,00 g) a un matraz de tres bocas de 5 L y se agitó, luego se añadió acetato de etilo (800 mL) en 0,5 h y se añadió HCl 4 M/EtOAc (1,6 L) gota a gota lentamente hasta que el pH del sistema fue más pequeño que 5 mientras que la temperatura interna se mantenía a 5-15°C. A continuación, se apagó el sistema de enfriamiento y la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó adicionalmente durante 1 hora. Después de detener la agitación, la reacción se filtró a través de un filtro de escritorio para obtener una torta de filtrado, que luego se concentró a presión reducida (40-45°C) para obtener un producto en bruto. Se añadió acetonitrilo (2 mL/g) al producto anterior y la mezcla se suspendió durante 1 hora. Después de filtrar el producto en suspensión, la torta de filtrado se recogió por separado y la solución orgánica se eliminó a presión reducida para obtener un compuesto sólido blanco 1-SM2.
1H RMN (399 MHz, METANOL-d*) 5 = 3,88 - 3,72 (m, 5H), 3,67 - 3,59 (m, 1H), 3,36 -3,31 (m, 1H), 3,14 (t, J=6,7 Hz, 2H), 1,87 - 1,67 (m, 2H).
Paso 13: Síntesis del compuesto 1-1 -A y el compuesto 1-1-B
Se añadió tolueno (20 L) a una caldera con camisa seca de 50 L y se agitó, luego el compuesto 1-SM1 (2500 g), y la temperatura interna se elevó a 30-35°C. El entorno de gas inerte en la caldera se mantuvo mediante purga con nitrógeno. Luego se añadió gota a gota trimetilaluminio (3,0 L, la temperatura en la caldera aumenta lentamente con la adición de Al (CH3)3). Después de la adición, se apagó la purga de nitrógeno. La temperatura se elevó a 80-85°C y la reacción se agitó durante aproximadamente 16 horas. A continuación, se encendió el enfriamiento para reducir la temperatura de la reacción a 20-30°C. La mitad de la solución de reacción (aproximadamente 12 L), a la que se añadió EtOAc (10 L), se transfirió y se mezcló bien. La solución mezclada se añadió a solución de KHSO4 al 10% (10 L) mientras se agitaba, se agitó durante 2 minutos y luego se dejó reposar para la estratificación. La fase orgánica se lavó con solución de KHSO4 al 10% (10 L), las fases acuosas se combinaron y se extrajeron dos veces con DCM (7,5 L cada vez). Se transfirió la otra mitad de la solución de reacción (aproximadamente 12 L), que se trató de la misma manera que se definió anteriormente. Luego, las fases orgánicas se combinaron y concentraron a presión reducida para obtener un producto en bruto. Se añadió dos veces el volumen de n-heptano y se batió durante 1 hora para formar una suspensión. La suspensión se filtró y se secó al vacío durante >12 horas a 40°C, P<-0,1 MPa. Se obtuvo una mezcla del compuesto 1-1-A y el compuesto 1-1-B como un sólido blanco.
Paso 14: Síntesis del compuesto 1-2
Se añadió tetrahidrofurano (3840 mL) a un matraz de tres bocas de 10 L y se agitó, y se añadió lentamente la mezcla del compuesto 1-1-A y el compuesto 1-1-B (480,00 g), luego se añadió solución de H2O (960 mL) de LiOHH2O gota a gota lentamente (118,84 g). Después de la adición, la temperatura se elevó a 602C y la reacción se agitó durante 1 hora. Luego se añadió HCl concentrado a la solución de reacción para ajustar el pH del sistema a 2 y detener la agitación. A continuación, la solución se dejó reposar para la estratificación del líquido. La fase acuosa se extrajo dos veces con THF (600 mL) y las fases orgánicas se combinaron y concentraron a presión reducida (40-45°C). El sólido se suspendió con agua pura (2 mL/g) durante 0,5 horas y se filtró, y la torta de filtrado se secó al vacío durante más de 12 horas a 40°C y P<-0,1 MPa para obtener el compuesto 1-2 como un sólido amarillo pálido.
1H RMN (399 MHz, DMSO-afe) 5 = 11,19 (s, 1H), 8,09 (d, J=8,2 Hz, 1H), 8,00 (d, J=1,6 Hz, 1H), 7,88 (dd, J=1,5, 8,3 Hz, 1H), 7,39 (dd, J=1,2, 2,0 Hz, 1H), 7,01 (d, J=2,0 Hz, 1H), 2,05 (s, 3H).
Paso 15: Síntesis del compuesto representado por la fórmula (I)
Se añadió DMF (2,25 L) a un matraz de tres bocas de 5 L y se agitó, luego se añadieron sucesivamente el compuesto 1-2 (400,00 g) y HATU (744,83 g) y se agitó durante 30 min, seguido del compuesto 1-SM2 (229,86 g). Se añadió DIPEA (568,68 mL) gota a gota lentamente a temperatura ambiente en 1 hora. Después de la adición, la reacción se agitó adicionalmente a temperatura ambiente durante 16 horas. A continuación, la solución de reacción se transfirió a un embudo de decantación, se añadieron acetato de etilo (2 L) y agua pura (1 L), y la solución se agitó durante 2 min y luego se dejó reposar para la estratificación para separar la fase acuosa. Luego se añadió agua pura (1 L) para lavar la fase acuosa que luego se agitó y se dejó reposar para la estratificación. La fase acuosa combinada se extrajo tres veces con EtOAc (500 mL) y las fases orgánicas se combinaron. La fase orgánica se lavó dos veces con solución de carbonato de sodio (1,5 L), dos veces con solución de hidrogenosulfato de potasio (1 L) y dos veces con agua pura (1 L), sucesivamente. La fase orgánica se concentró a presión reducida (40-45°C) para obtener un producto en bruto. Se añadió acetato de etilo (2 mL/g) al producto en bruto y la mezcla se suspendió durante 1 hora. Finalmente, la mezcla en suspensión se filtró y la torta de filtrado se recogió para obtener el compuesto representado por la fórmula (I).
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 = 11,13 (br s, 1H), 8,73 (br t, J=5,5 Hz, 1H), 8,05 (d, J=8,2 Hz, 1H), 7,83 (d, J=1,3 Hz, 1H), 7,74 (dd, J=1,5, 8,4 Hz, 1H), 7,36 (s, 1H), 6,98 (d, J=2,0 Hz, 1H), 3,71 - 3,48 (m, 5H), 3,45 - 3,31 (m, 1H), 3,45 -3,30 (m, 1H), 3,27 - 3,21 (m, 1H), 3,14 (dd, J=9,9, 11,2 Hz, 1H), 2,03 (s, 3H), 1,53 (q, J=7,0 Hz, 2H).
Ejemplo 2 Preparación de la forma cristalina A del compuesto representado por la fórmula (I)
Se añadieron secuencialmente 35 mg del compuesto representado por la fórmula (I) y 400 pL de terc-butil metil éter en un vial de fase líquida de 1,5 mL y así se mezclaron o disolvieron ultrasónicamente. La muestra en suspensión se agitó (protegida de la luz) durante 3 días en un agitador a temperatura constante (40°C). Luego, la solución de muestra se centrifugó rápidamente y el sólido centrifugado se secó en un horno de secado al vacío a 30°C durante 5 horas. La muestra seca obtenida se sometió a XRPD, verificando que se obtuvo una forma cristalina A del compuesto representado por la fórmula (I).
Ejemplo 3 Preparación de la forma cristalina B del compuesto representado por la fórmula (I)
Se añadieron secuencialmente 35 mg del compuesto representado por la fórmula (I) y 400 pL de acetona en un vial de fase líquida de 1,5 mL y así se mezclaron o disolvieron ultrasónicamente. La muestra en suspensión se agitó (protegida de la luz) durante 3 días en un agitador a temperatura constante (40°C). Luego, la solución de muestra se sometió a una centrifugación rápida y el sólido después de la centrifugación se secó en un horno de secado al vacío a 30°C durante 5 horas. La muestra seca obtenida se sometió a XRPD, verificando que se obtuvo una forma cristalina B del compuesto representado por la fórmula (I).
Ejemplo 4 Prueba de estabilidad previa de la forma cristalina B del compuesto representado por la fórmula (I)
Tabla 3: Condiciones de investigación y elementos de prueba
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Pasos del experimento:
Se pesaron aproximadamente 10 mg de la forma cristalina B del compuesto representado por la fórmula (I) y se colocaron en el fondo de una botella de vidrio de 40 mL y se esparcieron en una capa delgada. El cuello de la botella se envolvió con papel de aluminio (excepto en el caso de las muestras iluminadas) y se perforaron algunos agujeros pequeños en el papel de aluminio para garantizar que las muestras puedan entrar en contacto total con el aire ambiental. La muestra iluminada se colocó en el fondo de una botella de vidrio de 40 mL, la cual se colocó verticalmente en la caja iluminada con la tapa abierta; la muestra de control se colocó en el fondo de viales de vidrio, los cuales se colocaron verticalmente con la tapa abierta, y se envolvieron con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Bajo cada condición, se pesaron 2 alícuotas de muestra en paralelo en cada punto de tiempo, y se tomó una cantidad apropiada adicional de muestra (no pesada) para la detección de XRPD. Las muestras preparadas se colocaron bajo varias condiciones que se muestran en la siguiente tabla, y las muestras se analizaron respectivamente por HPLC después de alcanzar los puntos de tiempo. El método de análisis se muestra en la Tabla 4 y los resultados experimentales se muestran en la Tabla 5.
Análisis HPLC:
1.1 Preparación de diluyente y fase móvil
Diluyente: Acetonitrilo: Agua (2:1)
Ejemplo: se mezclaron uniformemente 1000 mL de acetonitrilo y 500 mL de agua, se desgasificaron ultrasónicamente y se enfriaron a temperatura ambiente.
Fase móvil A: solución acuosa de ácido trifluoroacético al 0,1%
Ejemplo: se añadieron 2,0 mL de ácido trifluoroacético a 2 L de agua y se mezclaron bien, se desgasificaron ultrasónicamente y se enfriaron a temperatura ambiente.
Fase móvil B: acetonitrilo al 100%
1.2 Preparación de muestra de control y soluciones de muestra
La forma cristalina B del compuesto representado por la fórmula (I) se usó como control. La forma cristalina B del compuesto representado por la fórmula (I) se colocó en una botella de vidrio, luego se añadieron 5 mL de diluyente a la botella a una concentración de 1 mg/mL y la solución se mezcló bien ultrasónicamente. Y luego la mezcla se diluyó 5 veces para obtener la solución de muestra de control STD1. STD1 se diluyó 1, 2, 4, 20 y 200 veces para preparar una solución de control al 1%.
1.3 Preparación de la solución de muestra de prueba
Se añadió diluyente a cada muestra de prueba a una concentración de 10 mL, luego las muestras se disolvieron ultrasónicamente. La prueba de HPLC se realizó después de enfriar a temperatura ambiente.
Mientras tanto, la solución de muestra se diluyó 5 veces y se mezcló bien, y luego se analizó mediante HPLC. El método de análisis se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4. Método de análisis de HPLC
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Conclusión: La forma cristalina B del compuesto representado por la fórmula (I) es estable en condiciones de alta temperatura y alta humedad.
Ejemplo 5 prueba de VHB in vitro: prueba de qPCR cuantitativa
1 Objetivos del experimento:
El contenido de ADN del VHB en las células HepG2.2.15 se detectó mediante qPCR cuantitativa en tiempo real y el valor EC50 de los compuestos se utilizó como indicador para evaluar el efecto inhibitorio de los compuestos sobre el VHB.
2 Materiales experimentales:
2.1 Línea celular: células HepG2.2.15
Medio de cultivo de células HepG2.2.15 (DMEM/F12, Invitrogen-11330057; 10% de suero, Invitrogen-10099141; 100 unidades/mL de penicilina y 10 pg/mL de estreptomicina, Invitrogen-15140122; 1% de aminoácidos no esenciales, Invitrogen-11140076; L-glutamina 2 mM, Invitrogen-25030081; 300 pg/ml de geneticina, Invitrogen-10131027.
2.2 Reactivos:
Pancreatina (Invitrogen-25300062)
DPBS (Hyclone-SH30028.01 B)
DMSO (Sigma-D2650-100ML)
Kit de purificación de ADN de alto rendimiento (QIAamp 96 DNA Blood Kit, Qiagen-51162)
Reactivo de sonda universal de inicio rápido cuantitativo (FastStart Universal Probe Master, Roche-04914058001) 2.3 Consumibles e instrumentos:
Placa de cultivo celular de 96 pocillos (Corning-3599)
Incubadora de CO2 (HERA-CELL-240)
Película de sellado óptico (ABI-4311971)
Placa de 96 pocillos para PCR cuantitativa (Applied Biosystems-4306737)
Instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia (sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems-7500) 3. Pasos y métodos experimentales:
3.1 Se colocaron células HepG2.2.15 (4x104 células/pocillo) en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche a 37°C, 5% de CO2.
3.2 El día 2, el compuesto se diluyó a un total de 8 concentraciones, con una dilución de gradiente de 3 veces. Se añadieron diferentes concentraciones de compuestos a los pocillos de cultivo por duplicado. La concentración final de DMSO en el medio de cultivo fue del 1%. Se usó GLS4 1 pM como control de inhibición del 100%; Se usó DMSO al 1% como control de inhibición al 0%.
3.3 El día 5, el medio de cultivo se reemplazó con medio de cultivo nuevo que contenía el compuesto.
3.4 El día 8, se recogió el medio de cultivo en los pocillos de cultivo y se extrajo el ADN con el kit de purificación de ADN de alto rendimiento (Qiagen-51162). Consulte el manual del producto para conocer los pasos específicos. 3.5 La preparación de la solución de reacción de PCR se muestra en la Tabla 6:
Tabla 6: Preparación de la solución de reacción de PCR
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Secuencia del cebador directo: GTGTCTGCGGCGTTTTATCA (SEQ ID NO.1)
Secuencia de cebador inverso: GACAAACGGGCAACATACCTT (SEQ ID NO.2)
Secuencia de sonda: 5'+FAM+CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC (SEQ ID NO.3) TAMRA -3'
3.6 Se añadieron 15 gL de mezcla de reacción a cada pocilio de una placa de PCR de 96 pocilios y luego se añadieron 10 gL de ADN de muestra o estándar de ADN de VHB a cada pocillo.
3.7 Los ajustes de reacción para la PCR son: calentamiento a 95°C durante 10 minutos; luego desnaturalización a 95°C durante 15 segundos, y extensión a 60°C durante 1 minuto, un total de 40 ciclos.
3.8 Análisis de los datos:
3.8.1 Cálculo del porcentaje de inhibición: % de Inh. = [1-(número de copias de ADN en la muestra - número de copias de ADN 1 gM en GLS4)/(número de copias de ADN en el control de DMSO - número de copias de ADN 1 gM en GLS4)]x100.
3.8.2 Cálculo de EC50: La concentración inhibitoria al 50% (EC50) del compuesto contra el VHB se calculó mediante el software GraphPad Prism.
4. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 7:
Tabla 7: resultados de la prueba de EC50 del experimento qPCR
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Conclusión: El compuesto representado por la fórmula (I) tiene un efecto inhibidor significativo sobre el VHB.
Ejemplo 6 Inhibición de las isoenzimas del citocromo P450
Objetivos del experimento: Determinar el efecto inhibidor del compuesto de prueba sobre la actividad de las isoenzimas del citocromo p450 microsomal hepático humano (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 y CYP3A4).
Operación experimental: Primero, el compuesto de prueba (10 mM) se diluyó en un gradiente para preparar las soluciones de trabajo (100x concentración final). Las concentraciones de las soluciones de trabajo fueron 5, 1,5, 0,5, 0,15, 0,05, 0,015 y 0,005 mM. Mientras tanto, también se prepararon las soluciones de trabajo de mezcla (5 en 1) de inhibidores positivos de cada isoenzima P450 (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 y CYP3A4) y el sustrato específico de las isoenzimas; los microsomas hepáticos humanos congelados en el frigorífico a -80°C se descongelaron en hielo. Una vez que los microsomas hepáticos humanos se disolvieron por completo, se diluyeron con PB para preparar una determinada concentración (0,253 mg/mL) de solución de trabajo; se añadieron 20 uL de la mezcla de sustrato a la placa de reacción (se añadieron 20 gl de PB al pocillo de blanco), así como 158 gL de solución de trabajo de microsomas hepáticos humanos, luego se colocó la placa de reacción en hielo y se dejó aparte; en este momento se añadieron al pocillo correspondiente 2 gL de cada concentración de compuesto de ensayo (N=1) e inhibidor específico (N=2), el grupo sin inhibidor (compuesto de ensayo o inhibidor positivo) se añadió con el disolvente orgánico correspondiente como muestra de control (la muestra de control del compuesto de prueba era DMSO:MeOH 1:1, y la muestra de control positivo era DMSO:MeOH 1:9); después de pre-incubar en un baño de agua a 37°C durante 10 min, se añadieron a la placa de reacción 20 gL de solución de factor de coenzima (NADPH) y se dejó en baño de agua a 37°C durante 10 min; se añadieron 400 gL de solución fría de acetonitrilo (el patrón interno era 200 ng/mL de tolbutamida y labetalol) para finalizar la reacción; luego se colocó la placa de reacción en un agitador y se agitó durante 10 min, seguido de centrifugación a 4.000 rpm durante 20 min; se añadieron 200 gL de sobrenadante a 100 gL de agua para la dilución de la muestra; finalmente, la placa se selló, se agitó bien y se sometió a detección por LC/MS/MS. Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 8:
Tabla 8. Resultados del efecto inhibidor del compuesto de prueba sobre la actividad de las ¡soenzimas del citocromo P450 microsomal hepático humano
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Conclusión: el compuesto representado por la fórmula (I) no tiene un efecto inhibitorio evidente sobre CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 y CYP3A4.
Ejemplo 7 Estudio sobre la tasa de unión a proteínas plasmáticas
Objetivos del experimento: determinar la tasa de unión del compuesto de prueba a proteínas en plasma humano y de ratón CD-1
Operación experimental: se tomaron 796 pL de plasma en blanco de humanos y ratones CD-1, y se añadieron 4 pL de solución de trabajo del compuesto de prueba (400 pM) o solución de trabajo de warfarina (400 pM) para obtener las concentraciones finales tanto del compuesto de prueba como de la warfarina en la muestra de plasma 2 pM. La muestra se mezcló completamente. La concentración final de DMSO en la fase orgánica fue del 0,5%; se pipetearon 50 pL de muestras de plasma del compuesto de prueba y de warfarina en la placa receptora de muestras (por triplicado) e inmediatamente se añadió el volumen correspondiente de plasma en blanco o tampón para hacer que el volumen final de cada muestra fuera de 100 pL y la relación de volumen de plasma: tampón de diálisis 1:1. Luego se añaden 400 pL de solución de parada a estas muestras. Estas muestras se utilizarían como muestras T0 para determinar la recuperación y la estabilidad. Las muestras T0 se almacenaron a 2-8°C y esperaron para su posterior procesamiento con otras muestras dializadas; se añadieron 150 pL de las muestras de ensayo del compuesto y plasma de warfarina al extremo de dosificación de cada pocillo de diálisis y 150 pL de tampón de diálisis blanco al extremo receptor de los correspondientes pocillos de diálisis. Después, la placa de diálisis se selló con una membrana permeable a los gases y se incubó en una incubadora humidificada al 5% de CO2 y 37°C con agitación a aproximadamente 100 rpm durante 4 horas. Después de la diálisis, se pipetearon 50 pL de la muestra de tampón de diálisis y la muestra de plasma de diálisis en una nueva placa receptora de muestras. Se añadió el volumen correspondiente de plasma en blanco o tampón a las muestras, de modo que el volumen final de cada pocillo de muestra fue de 100 pL, y la relación de volumen de plasma:tampón de diálisis fue de 1:1. Todas las muestras se analizaron mediante LC/Ms /MS después de la precipitación de proteínas, y la tasa de unión a proteínas y la tasa de recuperación se calcularon con la fórmula: % no unido (tasa no unida) = 100 * FC/TC, % unido (tasa unida) = 100- % No unido, % de Recuperación (tasa de recuperación) = 100 * (FC+TC) / T0. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 9:
Tabla 9. La tasa de unión del compuesto de prueba a la proteína en plasma humano y de ratón CD-1
Figure imgf000018_0002
Conclusión: el compuesto representado por la fórmula (1) muestra una menor tasa de unión a proteínas tanto en plasma humano como de ratón CD-1.
Ejemplo 8 estudio farmacocinético in vivo
1. Estudio sobre la farmacocinética de la administración oral e inyección intravenosa del compuesto representado por la fórmula (I) en ratones Balb/c
El compuesto representado por la fórmula (I) se mezcló con 5% de DMSO/55% de polietilenglicol 400/ 40% de solución acuosa, se agitó con formación de vórtice y se sonicó para obtener una solución aproximadamente transparente de 1 mg/mL, que luego se filtró mediante una membrana microporosa para uso posterior. Se seleccionaron ratones hembra Balb/c de 7 a 10 semanas de edad y la solución del compuesto candidato se administró por vía intravenosa a una dosis de 1 mg/kg. El compuesto representado por la fórmula (I) se mezcló con una solución acuosa de solutol (hidroxiestearato de polietilenglicol-15) al 10%, se agitó con formación de vórtice y se sonicó para obtener una solución aproximadamente transparente de 1 mg/mL, que luego se filtró a través de una membrana microporosa para su uso posterior. Se seleccionaron ratones hembra Balb/c de 7 a 10 semanas de edad y la solución del compuesto candidato se administró por vía oral a una dosis de 10 mg/kg.
Se recolectó sangre completa en un cierto período de tiempo para preparar el plasma, la concentración del fármaco se analizó mediante el método LC-MS/MS y los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante el software Phoenix WinNonlin (Pharsight, EE. UU.).
2. Estudio sobre la farmacocinética de la administración oral e inyección intravenosa del compuesto representado por la fórmula (I) en ratas SD
El compuesto representado por la fórmula (I) se mezcló con 5% de DMSO/55% de polietilenglicol 400/40% de solución acuosa, se agitó con formación de vórtice y se sonicó para obtener una solución aproximadamente transparente de 1 mg/mL, que luego se filtró mediante una membrana microporosa para uso posterior. Se seleccionaron ratas macho SD de 7 a 10 semanas de edad y la solución del compuesto candidato se administró por vía intravenosa a una dosis de 1 mg/kg.
El compuesto representado por la fórmula (I) se mezcló con una solución acuosa de solutol al 10%, se agitó con formación de vórtice y se sonicó para obtener una solución aproximadamente transparente de 1 mg/mL, que luego se filtró a través de una membrana microporosa para su uso posterior. Se seleccionaron ratas macho SD de 7 a 10 semanas de edad y la solución del compuesto candidato se administró por vía oral a una dosis de 10 mg/kg.
Se recolectó sangre completa en un cierto período de tiempo para preparar el plasma, la concentración del fármaco se analizó mediante el método LC-MS/MS y los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante el software Phoenix WinNonlin (Pharsight, EE. UU.).
3. Estudio sobre la farmacocinética de administración oral e inyección intravenosa del compuesto representado por la fórmula (I) en Beagle
El compuesto representado por la fórmula (I) se mezcló con 5% de DMSO/55% de polietilenglicol 400/40% de solución acuosa, se agitó con formación de vórtice y se sonicó para obtener una solución aproximadamente transparente de 1 mg/ml, que luego se filtró mediante una membrana microporosa para uso posterior. Se seleccionaron perros Beagle macho que pesaban aproximadamente 10 kg y la solución del compuesto candidato se administró por vía intravenosa a una dosis de 1 mg/kg.
El compuesto representado por la fórmula (I) se mezcló con una solución acuosa de solutol al 10%, se agitó con formación de vórtice y se sonicó para obtener una solución aproximadamente transparente de 2 mg/mL, que luego se filtró a través de una membrana microporosa para su uso posterior. Se seleccionaron perros Beagle macho que pesaban aproximadamente 10 kg y la solución del compuesto candidato se administró por vía oral a una dosis de 10 mg/kg.
Se recolectó sangre completa en un cierto período de tiempo para preparar el plasma, la concentración del fármaco se analizó mediante el método LC-MS/MS y los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante el software Phoenix WinNonlin (Pharsight, EE. UU.).
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 10:
Tabla 10. Resultados de la farmacocinética del compuesto de prueba
Figure imgf000019_0001
Conclusión: el compuesto representado por la fórmula (I) tiene un buen índice único o parcial de farmacocinética en el Beagle.
Ejemplo 9 Estudio sobre la eficacia del fármaco in vivo
Modelo AAV/HBV
Objetivos del experimento: detectar el efecto del compuesto contra el virus de la hepatitis B in vivo utilizando el modelo de ratón AAV/HBV.
Operación experimental: El día de la primera administración se designó como día 0, el día anterior a la administración se designó como día -1, el día posterior a la administración se designó como día 1, y así sucesivamente. El día 28 antes de la administración, a todos los animales se les inyectó en la cola por vía intravenosa 1*1011 v.g. de virus rAAV8-1.3HBV, 200 pL para cada animal. 14 días antes de la administración y 7 días antes de la administración, se recogió suero sanguíneo de todos los ratones inyectados con el virus rAAV8-1.3HBV a través de la vena submandibular. Las muestras de sangre recogidas se colocaron a 37°C durante aproximadamente 30 minutos, luego se centrifugaron a 13.200 g a 4°C durante 3 minutos y se recogió el sobrenadante. El contenido de ADN del VHB, HBeAg y HBsAg se detectó utilizando el suero. Los ratones con niveles más bajos de ADN del VHB, HBsAg y HBeAg y de menor peso probablemente serían excluidos del experimento. Los 25 ratones seleccionados se asignaron por igual a cada grupo y se aseguró de que no hubiera diferencias estadísticas en los niveles de ADN del VHB, HBsAg y HBeAg y el peso corporal de los ratones en cada grupo de tratamiento con compuesto el día 21 después de la inyección del virus en comparación con los del grupo con disolvente (P>0,05). El compuesto representado por la fórmula (I) (WX-325) se mezcló con solución acuosa de solutol al 10%, se agitó con formación de vórtice y se sonicó para obtener una suspensión homogénea, la cual se filtró por una membrana microporosa para su uso posterior. El tenofovir, como compuesto positivo, se disolvió en solución salina fisiológica, se sonicó y se agitó hasta que se disolvió, luego se preparó como una mezcla maestra de 0,1 mg/mL, que se diluyó a 0,01 mg/ml con solución salina fisiológica y se almacenó a 4°C hasta su uso. El compuesto representado por la fórmula (I) (WX-325) se administró per os (PO) y bis in die (BID), con un intervalo de 8 horas. El compuesto de referencia tenofovir se administró per os y bis in die. Ambos fármacos se administraron durante 28 días, y se tomaron muestras de sangre los días 3, 7, 10 y 28 después de la administración, y el nivel de ADN del VHB en plasma se detectó mediante qPCR. El día 28, los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO2, se recogieron sus hígados y se midió el nivel de ADN del VHB mediante qPCR. Los resultados del experimento se muestran en la Figura 7 y la Figura 8.
Conclusión: el compuesto de la presente invención muestra una buena eficacia in vivo y un efecto dependiente de la dosis.
Debe entenderse para los expertos en la técnica que la descripción anterior de realizaciones específicas pretende ser puramente ilustrativa, y varios cambios o modificaciones serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del principio y la esencia de la presente invención. Por lo tanto, no se pretende que la presente invención esté limitada más allá de lo establecido expresamente en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una forma cristalina A de un compuesto representado por la fórmula (I) que tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo (XRPD) que comprende picos de difracción característicos con los siguientes ángulos de 20: 5,56±0,2°, 15,56±0,2° y 16,17±0,2°,
Figure imgf000021_0001
2. La forma cristalina A según la reivindicación 1, en la que el patrón de difracción de rayos X en polvo comprende picos de difracción característicos con los siguientes ángulos de 20: 5,56±0,2°, 10,84±0,2°, 15,56±0,2°, 16,17±0,2°, 22,14±0,2°, 22,70±0,2°, 27,76±0,2° y 28,44±0,2°.
3. La forma cristalina A según la reivindicación 2, en la que el patrón de XRPD se muestra en la Figura 1.
4. La forma cristalina A según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que presenta un pico endotérmico con un inicio de 229,95°C como se mide por la curva de calorimetría diferencial de barrido (DSC).
5. La forma cristalina A según la reivindicación 4, en la que el DSC se muestra en la Figura 2.
6. La forma cristalina A según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3 que tiene una curva de análisis termogravimétrico (TGA) con una pérdida de peso de 0,3382% a 62±3°C y una pérdida de peso de 0,8753% a 230±3°C.
7. La forma cristalina A según la reivindicación 6, en la que el TGA se muestra en la Figura 3.
8. Una forma cristalina B de un compuesto representado por la fórmula (I) que tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos de difracción característicos con los siguientes ángulos de 20: 12,70±0,2°, 15,64±0,2° y 23,03±0,2°,
Figure imgf000021_0002
9. La forma cristalina B según la reivindicación 8, en la que el patrón de difracción de rayos X en polvo comprende picos de difracción característicos con los siguientes ángulos de 20: 9,56±0,2°, 12,70±0,2°, 14,41±9,2°, 15,64±0,2°, 19,70±0,2°, 23,03±0,2°, 23,98±0,2° y 27,65±0,2°.
10. La forma cristalina B según la reivindicación 9, en la que el patrón de XRPD se muestra en la Figura 4.
11. La forma cristalina B según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10 que presenta un pico endotérmico con un inicio de 233,59°C como se mide mediante una curva de calorimetría diferencial de barrido.
12. La forma cristalina B según la reivindicación 11, en la que el DSC se muestra en la Figura 5.
13. La forma cristalina B según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10 que tiene una curva de análisis termogravimétrico con una pérdida de peso de 0,04890% a 120±3°C.
14. La forma cristalina B según la reivindicación 13, en la que el TGA se muestra en la figura 6.
15. La forma cristalina A según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o la forma cristalina B según una cualquiera de las reivindicaciones 8-14 para el uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el VHB.
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