KR102397741B1 - 세고리식 화합물의 결정 형태 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 식 (I)의 화합물의 A 결정 형태 및 B 결정 형태, 및 HBV 관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 이의 용도에 관한 것이다:
Figure 112021033015582-pct00008
.

Description

세고리식 화합물의 결정 형태 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 23일자 출원된 중국특허출원 CN2018109690068을 우선권 주장한다. 본 출원은 해당 중국특허출원의 전문을 인용한다.
기술분야
본 발명은 식 (I)의 화합물의 A 결정 형태, B 결정 형태 및 HBV 관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
B형 간염은 B형 간염 바이러스의 침입으로 일어나는 염증 반응으로 이는 간 부위의 통증, 간비종대, 간섬유화 등 일련의 문제를 일으킬 수 있으며 심할 경우 간경화, 심지어 간암을 일으키기도 한다. 통계에 따르면 전세계에는 약 3.5억 내지 4억 명의 B형 간염 바이러스 보균자가 있으며 이 중 3분의 1의 보균자가 중국에 있으며 매년 중국의 B형 간염으로 인한 사망자 수는 50만 명을 넘는다.
현 단계에서 전세계적 범위 내에 B형 간염을 치료하는 특효약은 아직 없으며 중국에서 B형 간염을 치료하기 위한 1차 약물로는 주로 뉴클레오시드계 약물, 인터페론 및 한약이 있으나 비용이 비싸고 재발하기 쉬운 등의 문제가 있어 새로운 유형의 항 B형 간염 약물의 개발이 필수적인 것으로 되고 있다.
WO2008154817A1은 GLS4를 개시하였으며, 구조는 아래와 같다:
Figure 112021033015582-pct00001
.
본 발명은 X선 분말 회절 패턴이 5.56°±0.2°, 15.56°±0.2° 및 16.17°±0.2°의 2θ 각에서 특징적 피크를 가지는 식 (I)의 화합물의 A 결정 형태를 제공한다:
Figure 112021033015582-pct00002
.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 A 결정 형태의 X선 분말 회절 패턴은 5.56±0.2°, 10.84±0.2°, 15.56±0.2°, 16.17±0.2°, 22.14±0.2°, 22.70±0.2°, 27.76±0.2° 및 28.44±0.2°의 2θ 각에서 특징적 회절 피크를 가진다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 A 결정 형태의 XRPD 패턴은 도 1에 도시된 바와 같다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 A 결정 형태의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터는 표 1에 나타낸 바와 같다.
A 결정 형태의 XRPD 패턴 분석 데이터
번호 2θ 각(°) 면간 거리(A) 강도 상대 강도(%) 면적 상대 면적(%)
1 5.559 15.8847 9479 100 125596 100
2 10.837 8.1568 212 2.2 3329 2.7
3 11.121 7.9493 323 3.4 8739 7
4 11.335 7.7998 413 4.4 8593 6.8
5 14.924 5.9312 272 2.9 1960 1.6
6 15.559 5.6904 820 8.7 8717 6.9
7 16.167 5.4778 909 9.6 8321 6.6
8 18.611 4.7638 144 1.5 2007 1.6
9 18.968 4.6749 162 1.7 1986 1.6
10 22.143 4.0112 391 4.1 4717 3.8
11 22.698 3.9144 577 6.1 9392 7.5
12 25.299 3.5175 175 1.8 2183 1.7
13 26.82 3.3213 106 1.1 2409 1.9
14 27.147 3.282 118 1.2 3302 2.6
15 27.765 3.2104 464 4.9 4055 3.2
16 28.437 3.136 425 4.5 4436 3.5
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 A 결정 형태의 시차 주사 열량 곡선은 229.95℃에서 흡열 피크의 개시점을 가진다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 A 결정 형태의 DSC 스펙트럼은 도 2에 도시된 바와 같다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 A 결정 형태의 열중량 분석 곡선은 62±3℃에서 중량 손실이 0.3382%에 달하며; 230±3℃에서 중량 손실이 0.8753%에 달한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 A 결정 형태의 TGA 스펙트럼은 도 3에 도시된 바와 같다.
본 발명은 또한 X선 분말 회절 패턴이 12.70±0.2°, 15.64±0.2° 및 23.03±0.2°의 2θ 각에서 특징적 회절 피크를 가지는 식 (I)의 화합물의 B 결정 형태를 제공한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 B 결정 형태의 X선 분말 회절 패턴은 9.56±0.2°, 12.70±0.2°, 14.41±0.2°, 15.64±0.2°, 19.70±0.2°, 23.03±0.2°, 23.98±0.2° 및 27.65±0.2°의 2θ 각에서 특징적 회절 피크를 가진다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 B 결정 형태의 XRPD 패턴은 도 4에 도시된 바와 같다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 B 결정 형태의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터는 표 2에 나타낸 바와 같다.
B 결정 형태의 XRPD 패턴 분석 데이터
번호 2θ 각(°) 면간 거리(A) 강도 상대 강도
(%)		 면적 상대 면적
(%)
1 9.563 9.2407 548 7.6 4827 6.9
2 12.206 7.2452 169 2.4 2005 2.9
3 12.696 6.9666 1456 20.3 13463 19.3
4 14.414 6.1399 909 12.7 8228 11.8
5 15.638 5.6621 7183 100 69797 100
6 17.194 5.153 728 10.1 6918 9.9
7 17.47 5.072 519 7.2 5752 8.2
8 18.675 4.7474 158 2.2 1339 1.9
9 19.009 4.6648 244 3.4 2337 3.3
10 19.698 4.5032 548 7.6 4198 6
11 20.368 4.3566 306 4.3 2729 3.9
12 22.125 4.0144 374 5.2 3126 4.5
13 22.636 3.9249 144 2 2929 4.2
14 23.03 3.8586 2928 40.8 29432 42.2
15 23.624 3.763 240 3.3 1652 2.4
16 23.98 3.7079 775 10.8 6496 9.3
17 24.826 3.5833 212 3 2080 3
18 25.618 3.4744 222 3.1 4391 6.3
19 25.951 3.4306 125 1.7 1238 1.8
20 26.482 3.363 214 3 2557 3.7
21 26.824 3.3209 310 4.3 3168 4.5
22 27.646 3.224 1137 15.8 10294 14.7
23 28.633 3.1151 245 3.4 2126 3
24 29.029 3.0735 276 3.8 3120 4.5
25 29.699 3.0056 351 4.9 4634 6.6
26 30.386 2.9392 108 1.5 1086 1.6
27 31.789 2.8126 151 2.1 3160 4.5
28 32.99 2.7129 135 1.9 2222 3.2
29 33.738 2.6544 113 1.6 1322 1.9
30 34.607 2.5898 103 1.4 1580 2.3
31 35.416 2.5324 209 2.9 2355 3.4
32 35.946 2.4963 113 1.6 1987 2.8
33 38.85 2.3161 93 1.3 1304 1.9
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 B 결정 형태의 시차 주사 열량 곡선은 233.59℃에서 흡열 피크의 개시점을 가진다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 B 결정 형태의 DSC 스펙트럼은 도 5에 도시된 바와 같다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 B 결정 형태의 열중량 분석 곡선은 120±3℃에서 중량 손실이 0.04890%에 달한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 B 결정 형태의 TGA 스펙트럼은 도 6에 도시된 바와 같다.
본 발명은 또한 HBV 관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서, 상기 A 결정 형태 및 B 결정 형태의 용도를 제공한다.
기술 효과
본 발명의 식 (I)의 화합물의 A 결정 형태 및 B 결정 형태는 안정적이며 열 및 습도에 의한 영향이 적고 양호한 생체내 투여 효과를 가지며 의약으로 제조하기 위한 전망이 있다.
정의 및 설명
별다른 설명이 없는 한, 본문에 사용되는 이하 용어와 짧은 문구는 하기 뜻을 구비한다. 하나의 특정된 짧은 문구 또는 용어는 특별히 정의되지 않을 경우, 불확정되거나 불명확한 것으로 이해해서는 아니되며 통상의 뜻에 따라 이해해야 한다. 본문에 상품명칭이 나타날 경우, 이는 이와 대응되는 상품 또는 이의 활성성분을 의미한다.
본 발명의 중간체 화합물은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들이 숙지하고 있는 다양한 합성 방법으로 제조될 수 있고, 이하 예를 든 구체적인 실시형태, 이와 기타 화학 합성 방법으로 결합된 실시형태 및 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들이 숙지하고 있는 등가적 대체방안, 바람직한 실시형태는 본 발명의 실시예를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시형태의 화학 반응은 적합한 용매에서 완료되고, 상기 용매는 본 발명의 화학적 변화 및 그에 필요한 시약 및 물질에 적합해야 한다. 본 발명의 화합물을 획득하기 위해, 당업자는 기존의 실시 방식에 기초하여 합성 단계 또는 반응 과정을 변경하거나 선택하는 것이 때때로 필요하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이러한 실시예가 본 발명을 그 어떠한 한정을 하는 것은 아니다.
본 발명에 사용된 모든 용매는 시판되고, 추가 정제없이 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 약어를 사용한다: EtOH는 에탄올을 나타내며, MeOH는 메탄올을 나타내며, TFA는 트리플루오로아세트산을 나타내며, TsOH는 p-톨루엔술폰산을 나타내며, mp는 융점을 나타내며, EtSO3H는 에탄술폰산을 나타내며, MeSO3H는 메탄술폰산을 나타내며, THF는 테트라히드로푸란을 나타내고, EtOAc는 초산에틸을 나타내고, THF는 테트라히드로푸란을 나타내고, EA는 초산에틸을 나타내고, DMAP는 4-디메틸아미노피리딘을 나타내고, DCM은 디클로로메탄을 나타내고, DIPEA는 N,N-디이소프로필에틸아민을 나타낸다.
X선 분말 회절계(XRPD)
약 10 내지 20mg의 샘플을 XRPD 검출에 사용하였다.
상세한 XRPD 매개변수는 다음과 같다.
광 파이프: Cu, kα(λ = 1.54056Å)
광 파이프 전압: 40kV, 광 파이프 전류:40mA
발산 슬릿: 0.60mm
검출기 슬릿: 10.50mm
산란 방지 슬릿: 7.10mm
스캔 범위: 3 내지 40도 또는 4 내지 40도
스텝 폭: 0.02도
스텝 시간: 0.12초
샘플 판 회전 속도: 15 rpm
시차 주사 열량계(DSC)
샘플(0.5 내지 1mg)을 DSC 알루미늄 냄비에 놓고 시험을 진행하며, 방법은: 50mL/분 N2의 조건 하에서, 샘플을 10℃/분의 승온 속도로 30℃에서 300℃로 가열하는 것이다.
열 중량 분석기(TGA)
샘플(2 내지 5mg)을 TGA 백금 냄비에 놓고 시험을 진행하며, 25mL/분 N2의 조건 하에서, 샘플을 10℃/분의 승온 속도로 실온에서 300℃ 또는 중량이 20% 감소할 때까지 가열한다.
동적 증기흡착 분석기(DVS)
시험 방법: 샘플(10 내지 15mg)을 취하여 DVS 샘플 판에 놓고 검측을 진행한다.
상세한 DVS 매개변수는 다음과 같다.
온도: 25℃
평형 dm/dt=0.01%/분: (최소: 10분, 최대: 180분)
건조: 0% RH에서 120분간 건조
RH(%) 측정 구배: 10%
RH(%) 측정 구배 범위: 0% 내지 90% 내지 0%
하기의 기재는 판단 표준이다:
Figure 112021033015582-pct00003
* 25℃/80%RH 하에서의 흡습에 의한 무게 증가를 나타낸다.
도 1은 식 (I)의 화합물의 A 결정 형태의 Cu-Kα선의 XRPD 패턴이다.
도 2는 식 (I)의 화합물의 A 결정 형태의 DSC 곡선이다.
도 3은 식 (I)의 화합물의 A 결정 형태의 TGA 곡선이다.
도 4는 식 (I)의 화합물의 B 결정 형태의 Cu-Kα선의 XRPD 패턴이다.
도 5는 식 (I)의 화합물의 B 결정 형태의 DSC 곡선이다.
도 6은 식 (I)의 화합물의 B 결정 형태의 TGA 곡선이다.
도 7은 혈장 중 B형 간염 바이러스의 DNA 레벨이며; 점선 1은 블랭크 대조를 나타내며, 10%의 솔루톨 수용액을 1일 1회(QD)로 경구 투여(PO)의 방법으로 투여함을 나타내고; 점선 2는 15mg/kg 용량의 WX-325를 1일 2회(BID), 매회 8시간 간격으로 경구 투여(PO)의 방법으로 투여함을 나타내고; 점선 3은 50mg/kg 용량의 WX-325를 1일 2회(BID), 매회 8시간 간격으로 경구 투여(PO)의 방법으로 투여함을 나타내고; 점선 5는 150mg/kg 용량의 WX-325를 1일 2회(BID), 매회 8시간 간격으로 경구 투여(PO)의 방법으로 투여함을 나타내며; 점선 6은 15mg/kg 용량의 양성 화합물인 테노포비르(TDF)를 1일 2회(BID), 매회 8시간 간격으로 경구 투여(PO)의 방법으로 투여함을 나타내고; LLOQ는 검출 하한 값 나타낸다(주: 도 7의 WX-325는 본 발명의 식 (I)의 화합물을 나타낸다).
도 8은 28일째의 간장 중의 B형 간염 바이러스의 DNA 레벨을 나타낸다(주: QD는 1일 1회의 투여를 나타내고; BID는 1일 2회의 투여를 나타내고; MPK 는mg/kg을 나타내고; Vehicle은 블랭크 대조군을 나타내며; 도 8의 WX-325는 본 발명의 식 (I)의 화합물을 나타낸다).
본 발명의 내용을 더 잘 이해하기 위하여, 이하에서는 구체적인 실시예를 참조하여 더 설명하지만, 구체적인 실시 방식은 본 발명의 내용을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
식 (I)의 화합물의 제조
Figure 112021033015582-pct00004
합성 경로:
Figure 112021033015582-pct00005
공정 1: 화합물 1-A의 합성
무수 디클로로메탄(5L)을 10L의 건조한 삼구 플라스크에 첨가하고, 교반을 시작하고 순서대로 화합물 1-SMA(500.00g)와 니트로메탄을 삼구 플라스크에 첨가하고, 반응계를 드라이아이스 에탄올 배스에 두어, -10℃까지 냉각시켰다. 온도를 -10℃ 내지 0℃로 제어하고 반응 플라스크에 삼염화알루미늄(1.15kg)을 천천히 첨가하고 온도를 -0℃ 미만으로 제어하고 α,α-디클로로디메틸메틸에테르(495.00g)를 천천히 반응 챔버에 첨가하고 천천히 실온으로 승온시킨 후 18시간 동안 교반하였다. TLC(PE:EA3:1)로 원료 포인트가 사라지고 극성이 매우 높은 새로운 포인트가 생성되었음을 모니터링하였다. 반응 용액을 흡인하여 제거하고 천천히 10%의 황산수소칼륨 용액(3L)에 적가하고 20분간 교반하고 부서진 얼음을 넣어 과열을 방지하였다. 혼합 용액을 25L의 분액 깔때기에 옮기고, 정치하여 분층시키고, 분층하여 디클로로메탄 층을 얻었으며, 수상을 디클로로메탄(2Lx2)으로 추출하였다. 유기상을 10%의 황산수소칼륨 용액(5Lx2)으로 세척하고 유기상을 분리한 후 무수 황산나트륨(1kg)으로 건조시켰다. 유기상을 감압 농축하여 암록색 고체 화합물 1-A를 얻었다.
1H NMR(400MHz, 중수소화 클로로포름)δ=9.97(brs, 1H), 9.87 내지 9.82(m, 1H), 7.58(dd, J=1.5, 3.3Hz, 1H), 7.36 내지 7.29(m, 1H), 4.37(q, J=7.1Hz, 2H), 1.38(t, J=7.2Hz, 3H).
공정 2: 화합물 1-B의 합성
화합물 1-A(2kg, 11.96mol)의 THF(20L) 용액에 p-톨루엔술포닐 히드라지드(2.23kg, 11.96mol)를 첨가하였다. 20℃하에 약 1시간 동안 교반하였다. TLC는 원료가 소실되었음을 나타냈으며, 반응계를 60℃로 승온시킨 다음 배치로 시아노수소화붕소나트륨(902g, 14.36mol)을 첨가하고 첨가 완료 후 반응계를 70℃로 승온시켜 3시간 동안 교반하였다. 가열을 정지시키고 실온으로 냉각시킨 후 5L의 물을 첨가하여 반응을 퀀칭시키고, 감압하여 대부분의 THF를 제거하고, 잔류물을 대량의 EA(1.5Lx3)로 추출하였다. 유기상 합병하고 유기상을 포화염화나트륨으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과하고, 감압하여 용매를 제거하고, 조질의 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 담황색 고체 화합물 1-B를 얻었다.
공정 3: 화합물 1-C의 합성
메탄올(32L)을 50L의 재킷이 달린 챔버에 첨가하고 교반을 시작하고 순서대로 화합물 1-SMB(4000.00g)와 디이소프로필에틸아민(5.25L)을 첨가하고 내부 온도를 5 내지 10℃로 냉각시킨 후 천천히 벤질메르캅탄(2490.00g)을 적가하고 내부 온도를 5 내지 15℃로 유지시켰다. 적가 완료 후 냉각 반응계를 닫고, 자연적으로 승온시키고, 계속하여 2.5시간 동안 교반하였다. 교반을 정지시키고 회전 속도를 100rpm으로 조정하였다. 반응 용액을 방출하고 데스크탑 필터로 여과하고, 여과한 뒤 케이크를 얻었다. 케이크를 물(5L)로 3회 세척한 후 EtOH(3L)를 첨가하여 1회 세척하고 케이크가 더이상 끈적하지 않을 때까지 흡인 여과하여 담황색 고체 화합물 1-C를 얻었다.
공정 4: 화합물 1-D의 합성
디클로로메탄(7.5L)을 50L의 챔버에 첨가하여 교반을 시작하고 화합물 1-C(1500g)를 첨가하고, 내부 온도를 0 내지 10℃로 냉각시키고 HCl 용액(6M, 4.12L)을 첨가하였다. 0 내지 10℃의 조건하에 개구한 상태에서 차아염소산나트륨 용액(시판의 8% 용액, 23.0kg)의 적가를 완료하고, 적가 완료 후 냉각 반응계를 닫고 개구한 상태에서 계속하여 약 17시간 교반하였다. 다음 이에 아황산수소나트륨 용액(1000g, 5L 수용액)을 첨가하고 요오드화 칼륨 전분지로 수상에 산화제 잔여가 없음을 검출하였다. 교반을 정지시키고, 정치하여 분층하고, 디클로로메탄 층을 수집하고, 수층을 디클로로메탄(2.5L)으로 추출하고, 디클로로메탄 층을 합병하였다. 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하고 감압하여 용매를 제거하여, 백색의 고체 화합물 1-D를 얻었다.
1H NMR(400MHz, 중수소화 클로로포름)δ=8.50 내지 8.43(m, 2H), 8.34(d, J=8.2Hz, 1H), 4.04(s, 3H).
공정 5: 화합물 1-E의 합성
테트라히드로푸란(10L)을 50L의 건조한 재킷 달린 챔버에 첨가하여 교반을 시작하고 화합물 1-B(2000g)를 첨가하고 내부 온도를 0 내지 10℃로 냉각시켰다. 1.5시간 내에 온도를 0 내지 15℃로 유지시키고 칼륨 tert-부톡시드(1M의 THF 용액, 15.67L)를 첨가하고 완료 후 온도를 약 20℃로 승온시켜 계속하여 1시간 동안 교반하였다. 온도를 0 내지 10℃로 냉각시키고 천천히 화합물 1-D(4380g)의 테트라히드로푸란(10L) 용액을 첨가하였다. 첨가 완료 후 온도를 천천히 15℃로 승온시키고 계속하여 약 16시간 동안 교반하였다. 아세트산에틸(10L)을 첨가하여 추출하고, 유기상을 포화염화나트륨 용액(10L)으로 2회 세척하고, 수상을 합병하고, EA(5L)로 추출하고 유기상을 합병하였다. 유기상을 감압하여 용매를 제거하여 담황색 고체화합물 1-E를 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ=8.55(d, J=1.4Hz, 1H), 8.37(dd, J=1.5, 8.3Hz, 1H), 7.91(d, J=8.3Hz, 1H), 7.60(s, 1H), 7.13(d, J=1.8Hz, 1H), 4.02(q, J=7.0Hz, 2H), 3.93(s, 3H), 2.10(s, 3H), 1.08(t, J=7.1Hz, 3H).
공정 6: 화합물 1-SM1의 합성
화합물 1-E(1000.0g)를 10L의 건조한 삼구 플라스크에 첨가하여 교반을 시작하고 빙초산(5L)을 첨가하고 반응 내부 온도를 25 내지 30℃로 제어하였다. 천천히 철분(1eq, 140.9g)을 첨가하고 30분간 교반한 후 천천히 제2배치의 철분(0.5eq, 70.44g)을 첨가한 다음 계속하여 30분간 교반한 후 천천히 제3배치의 철분(0.5eq, 70.44g)을 첨가하고, 다시 30분간 교반한 후, 제4배치의 철분(0.5eq, 70.44g)을 첨가한 다음 원료가 소실되고 극성이 높은 새로운 포인트가 형성될 때까지 계속하여 교반하였다. 교반을 정지하고 반응 용액을 25L로 옮겨 분층하고 10L의 초산에틸을 첨가하고 포화 황산수소나트륨 수용액 5Lx2로 세척하고 분층하고, 수상을 5L의 초산에틸로 역추출하였다. 유기상을 합병하고 pH>8이 될 때까지 유기상을 10%의 NaOH 수용액으로 세척하고 분층하고 유기상을 수집하였다. 유기상을 감압 농축하여 백색의 고체 화합물 1-SM1을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ=7.79 내지 7.71(m, 2H), 7.50(d, J=1.8Hz, 1H), 7.14(dd, J=1.7, 8.5Hz, 1H), 6.96(d, J=2.0Hz, 1H), 6.42(s, 2H), 4.11(q, J=7.2Hz, 2H), 3.84(s, 3H), 2.04(s, 3H), 1.16(t, J=7.1Hz, 3H).
공정 7: 화합물 1-F의 합성
톨루엔(12L)을 50L의 건조한 재킷이 달린 챔버에 첨가하여 교반을 시작하고 2-브로모에탄올(9930g)을 첨가한 다음 삼불화붕소에테르(268g)를 첨가하고 반응을 30 내지 35℃로 승온시켰다. 천천히 화합물 1-SMC(3500g)를 적가하고 약 1.5시간 동안 적가를 완료하였으며, 이때 반응의 내부 온도는 약 55 내지 65℃로 승온시켰으며 히터 온도를 60℃로 조절하여 내부 온도를 55 내지 65℃에서 1시간 동안 유지시켰다. 반응계의 내부 온도를 약 10℃로 냉각시키고 반응계 내에 천천히 약 20℃의 수산화나트륨 수용액(3783g, 물 17.5L)을 첨가하고 내부 온도를 10 내지 20℃로 유지시켰다. NaOH 용액의 첨가가 완료된 후, 온도 제어를 닫고, 반응을 계속하여 약 16시간 동안 교반하였다. 교반을 정지하고, 정치하고, 분층하고, 수층을 2-메틸테트라하이드로푸란(10L)으로 추출하고 유기상을 합병하고, 물(10L)로 세척하고, 정치하고, 분층하고, 유기상을 수집하였다. 유기상을 감압 농축하여 무색의 오일상태의 화합물 1-F를 얻었다.
1H NMR(400MHz, 중수소화 클로로포름)δ=3.87 내지 3.71(m, 4H), 3.66 내지 3.59(m, 3H), 3.42(dd, J=6.0, 11.7Hz, 1H), 3.20 내지 3.13(m, 1H), 2.79(t, J=4.6Hz, 1H), 2.65 내지 2.59(m, 1H).
공정 8: 화합물 1-G의 합성
수산화나트륨(3240g, 물 15L) 수용액을 50L의 재킷이 달린 챔버에 첨가하고 화합물 1-F(4430g)를 첨가하고 가열을 시작하여 반응을 90℃로 승온시킨 뒤 계속하여 1시간 동안 교반하였다. 냉각을 시작하여 약 15℃로 냉각시키고, p-톨루엔술포닐클로라이드의 테트라히드로푸란 용액(6180g, 테트라히드로푸란 15L)을 첨가하고 온도 제어를 닫고, 반응을 약 15℃에서 계속하여 약 16시간 동안 교반하였다. 교반을 정지하고, 정치하고, 분층하고, 수상을 2-메틸테트라히드로푸란(10L)으로 추출하고, 2-메틸테트라히드로푸란 상(흰색의 불용성 물질이 존재하며, 물로 세척한 후 소실됨)을 물(5L)로 세척하고 유기상을 합병하였다. 유기상에 DMAP(500g), 트리에틸아민(2.5L)을 첨가하고 30분간 교반하고 포화염화나트륨 용액(10L)을 첨가하여 세척하고, 정치하여 분층하고, 수상을 버렸다. 유기상을 황산수소칼륨 용액(3800g, 물 15L), 포화염화나트륨 용액(5Lx2회)으로 세척하고, 정치하여 분층하고 유기상을 수집하였다. 유기상을 감압 농축하여 용매를 제거하여, 조질의 생성물 화합물 1-G를 얻었다.
1H NMR(400MHz, 중수소화 클로로포름)δ=7.77(d, J=8.3Hz, 2H), 7.34(d, J=8.2Hz, 2H), 4.03 내지 3.91(m, 2H), 3.80 내지 3.49(m, 8H), 3.33(dd, J=9.9, 11.4Hz, 1H), 2.43(s, 3H).
공정 9: 화합물 1-H의 합성
아세톤(30L)을 깨끗한 50L의 재킷이 달린 챔버에 첨가하여 교반을 시작하고 화합물 1-G(4500g)를 첨가한 다음 요오드화나트륨(6190g)을 첨가하여 가열을 시작하고, 반응을 75℃로 승온시킨 뒤 계속하여 16시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후 여과하고 여액을 50℃에서 감압 농축하였다. 농축한 후의 조질의 생성물에 초산에틸(15L), 물(10L)을 첨가하여 교반하고 정치하여 분층하고 유기상을 0.5M의 티오황산나트륨(10L)으로 세척하였다. 수상과 티오황산나트륨 용액을 합병한 후 EtOAc(5L)로 추출하였다. 유기상을 합병하여 포화염화나트륨 용액(10L)으로 세척하고 정치하고 분층하고 유기상을 수집하였다. 유기상을 감압 농축하여 용매를 제거하여, 조질의 생성물 화합물 1-H를 얻었다.
1H NMR(400MHz, 중수소화 클로로포름)δ=3.90 내지 3.83(m, 2H), 3.81 내지 3.75(m, 2H), 3.74 내지 3.65(m, 5H), 3.63 내지 3.49(m, 7H), 3.31 내지 3.18(m, 3H), 3.06 내지 3.04(m, 2H).
공정 10: 화합물 1-I의 합성
DMSO(20L)를 깨끗한 50L의 재킷이 달린 챔버에 첨가하여 교반을 시작하고 화합물 1-H(4700g)를 첨가하고 온도를 35℃로 승온시킨 다음 시안화나트륨(1010g)을 첨가하고 반응 내부 온도를 20분 이내에 약 60℃로 승온시켰다. 그 다음 천천히 온도를 35℃까지 냉각시키고, 계속하여 약 16시간 동안 교반하였다. 반응계 내에 탄산수소나트륨 용액(탄산수소나트륨 2000g, 물 10L)을 첨가하고, 계속하여 약 5분간 교반하고, EtOAc:MeOH(20L, 2L)를 첨가하고, 계속하여 2분간 교반하고 약 1시간 동안 정치시켰다. 분층하고 하층의 용액을 약 30L 분리하여 EtOAc:MeOH(1차 15L:1.5L, 2차 5L:0.5L)로 2회 추출하였다. 추출 후 상층의 유기상과 나머지 반응 용액의 상층을 합병한 후 포화염화나트륨 용액(각각 10L)으로 3회 세척하고, 정치하고, 분층하고, 수상을 버리고 유기상을 수집하였다. 유기상을 감압하여 용매를 제거하고, 조질의 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 무색의 오일상 화합물 1-I를 얻었다.
1H NMR(400MHz, 중수소화 클로로포름)δ=3.84 내지 3.65(m, 6H), 3.61 내지 3.53(m, 2H), 3.35(t, J=10.5Hz, 1H), 2.49 내지 2.44(m, 2H).
공정 11: 화합물 1-J의 합성
아르곤 가스의 보호하에 건조한 수소화 병에 라니 니켈(10.00g, 116.73mmol) 및 EtOH(150mL)를 첨가한 다음 반응계에 1-I(20g, 157.31mmol), NH3·H2O(13.65g, 97.36mmol, 15.00mL, 순도:25%)를 첨가한 후 치환하고 반응을 50psi, 50℃에서 3.5시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 규조토로 여과하고 여액을 감압 농축하여 황색 오일 상태의 화합물 1-J를 얻었다.
1H NMR(400MHz, 중수소화 클로로포름)δ=3.82 내지 3.57(m, 6H), 3.34 내지 3.18(m, 1H), 2.86 내지 2.72(m, 2H), 1.60 내지 1.38(m, 2H).
공정 12: 화합물 1-SM2의 합성
1-J(800.00g)를 5L의 삼구 플라스크에 첨가하여 교반을 시작하고 약 0.5시간내로 초산에틸(800mL)을 첨가하고, 반응계가 pH<5가 될 때까지 4M의 HCl/EtOAc(1.6L)를 천천히 적가하고 내부 온도를 5 내지 15℃로 유지시켰다. 냉각 시스템을 닫고 실온까지 승온시키고, 계속하여 1시간 동안 교반하였다. 교반을 정지하고, 데스크탑 필터로 여과하고 여과한 뒤 케이크를 얻었다. 케이크를 감압 농축(40 내지 45℃)하여, 조질의 생성물을 얻었다. 상기 생성물에 아세토니트릴(2mL/g)을 첨가하고, 1시간 동안 슬러리화하였다. 여과하고 케이크를 따로 수집하고 감압하여 유기 용액을 제거하여 흰색의 고체 화합물 1-S M2를 얻었다.
1H NMR(399MHz, METHANOL-d4)δ=3.88 내지 3.72(m, 5H), 3.67 내지 3.59(m, 1H), 3.36 내지 3.31(m, 1H), 3.14(t, J=6.7Hz, 2H), 1.87 내지 1.67(m, 2H).
공정 13: 화합물 1-1-A 및 화합물 1-1-B의 합성
톨루엔(20L)을 50L의 건조한 재킷이 있는 챔버에 첨가하고, 교반을 시작하고 화합물 1-SM1(2500g)을 첨가하고, 내부 온도를 30 내지 35℃로 승온시켰다. 질소 가스의 퍼지에 의하여, 챔버 내에 불활성 가스 분위기를 유지시키고, 트리메틸알루미늄(3.0L, Al(CH3)3을 첨가함에 따라 챔버 내의 온도가 천천히 상승)을 적가하고 완료 후, 질소 가스를 닫고 온도를 80 내지 85℃로 승온시켜 계속하여 16시간 동안 교반하였다. 냉각을 시작하고 반응 온도를 20 내지 30℃로 냉각시키고, 약 12L인 반응 용액의 절반을 옮기고, EtOAc(10L)를 첨가하여 균일하게 혼합하였다. 교반하에 혼합 용액을 10%의 KHSO4 용액(10L)에 첨가하고 2분간 교반하고 정치하고 분층하고 유기층을 다시 10%의 KHSO4 용액(10L)으로 세척하고 수상을 합병하고 DCM(각각 7.5L)으로 2회 추출하였다. 남은 절반의 반응 용액(약 12L)을 옮기고, 처리 방법은 상기와 같았으며, 유기상을 합병하고, 유기상을 감압 농축하여 조질의 생성물을 얻었고, 2배 용적의 n-헵탄을 첨가하여 1시간 동안 슬러리화하였다. 여과하고 진공에서 >12시간 건조시켰고, 온도는 40℃이며, P≤-0.1Mpa이었다. 얻은 백색 고체는 화합물 1-1-A와 화합물 1-1-B의 혼합물이었다.
공정 14: 화합물 1-2의 합성
테트라히드로푸란(3840mL)을 10L의 삼구 플라스크에 첨가하고 교반을 시작하고 이에 화합물 1-1-A와 화합물 1-1-B의 혼합물(480.00g)을 첨가하고 천천히 LiOH·H2O(118.84g)의 H2O(960mL) 용액을 적가하였다. 적가 완료 후, 60℃로 승온시키고, 1시간 동안 교반하고 반응 용액에 농축 HCl을 첨가하여, 반응계의 pH를 2로 조절하고 교반을 정지하였다. 정치하고 분층하였다. 수상을 THF(600mL)로 2회 추출하고 유기상을 합병하였다. 유기상을 감압 농축(40 내지 45℃)하고, 고체를 순수한 물(2mL/g)로 0.5시간 슬러리화하고 여과하고, 케이크를 진공에서 >12시간 건조시켰으며, 온도는 40℃이고, P≤0.1Mpa이었으며, 담황색 고체 화합물 1-2를 얻었다.
1H NMR(399MHz, DMSO-d6)δ=11.19(s, 1H), 8.09(d, J=8.2Hz, 1H), 8.00(d, J=1.6Hz, 1H), 7.88(dd, J=1.5, 8.3Hz, 1H), 7.39(dd, J=1.2, 2.0Hz, 1H), 7.01(d, J=2.0Hz, 1H), 2.05(s, 3H).
공정 15: 식 (I)의 화합물의 합성
DMF(2.25L)를 5L의 삼구 플라스크에 첨가하고 교반을 시작하고 순차적으로 화합물 1-2(400.00g) 및 HATU(744.83g)를 첨가하여 30분간 교반한 다음 화합물 1-SM2(229.86g)를 첨가하였다. 1시간 내에 실온에서 DIPEA(568.68mL)를 천천히 적가하고, 적가 완료 후 실온에서 교반하였으며 16시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 분액 깔때기에 옮기고 아세트산에틸(2L)과 순수한 물(1L)을 첨가하여 2분간 교반하였다. 정치하고 수상을 분리하였다. 다음 순수한 물(1L)을 첨가하여 세척하고 교반하고 정치하고 분층하였다. 수상을 합병하여 EtOAc(500mL)로 3회 추출하고 유기상을 합병하였다. 유기상을 순차적으로 탄산나트륨 용액(1.5L)으로 2회 세척하고, 황산수소칼륨 용액(1L)으로 2회 세척하고, 순수한 물(1L)로 2회 세척하였다. 유기상을 감압 농축(40 내지 45℃)하여 조질의 생성물을 얻었다. 조질의 생성물에 아세트산에틸(2mL/g)을 첨가하고, 1시간 동안 슬러리화하였다. 여과하고 케이크를 수집하여 식 (I)의 화합물을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ=11.13(brs, 1H), 8.73(brt, J=5.5Hz, 1H), 8.05(d, J=8.2Hz, 1H), 7.83(d, J=1.3Hz, 1H), 7.74(dd, J=1.5, 8.4Hz, 1H), 7.36(s, 1H), 6.98(d, J=2.0Hz, 1H), 3.71 내지 3.48(m, 5H), 3.45 내지 3.31(m, 1H), 3.45 내지 3.30(m, 1H), 3.27 내지 3.21(m, 1H), 3.14(dd, J=9.9, 11.2Hz, 1H), 2.03(s, 3H), 1.53(q, J=7.0Hz, 2H).
실시예 2
식 (I)의 화합물의 A 결정 형태의 제조
35mg의 식 (I)의 화합물을 칭량하여 1.5mL의 액상 바이알에 넣고, 400μL의 tert-부틸 메틸에테르를 첨가하고, 초음파로 균일하게 혼합 또는 용해시켰다. 현탁액 샘플을 항온 쉐이커(40℃)에 두고 3일간 교반(빛 차단)하였다. 다음, 샘플 용액을 신속하게 원심분리하고 원심분리 후의 고체를 30℃의 진공 건조함에 넣어 5시간 동안 건조시키고, 얻은 건조한 샘플을 XRPD로 검출하여 식 (I)의 화합물의 A 결정 형태를 얻었다.
실시예 3
식 (I)의 화합물의 B 결정 형태의 제조
35mg의 식 (I)의 화합물을 칭량하여 1.5mL의 액상 바이알에 넣고, 400μL의 아세톤을 첨가하고 초음파로 균일하게 혼합 또는 용해시켰다. 현탁액 샘플을 항온 쉐이커(40℃)에 두고 3일간 교반(빛을 피하여)하였다. 다음, 샘플 용액을 신속하게 원심분리하고 원심분리 후의 고체를 30℃의 진공 건조함에 넣어 5시간 동안 건조시키고, 얻은 건조한 샘플을 XRPD로 검출하여 식 (I)의 화합물의 B 결정 형태를 얻었다.
실시예 4
식 (I)의 화합물의 B 결정 형태의 예비 안정성 시험
연구 조건 및 시험 항목
시험 항목 조건 0일 5일 10일 1개월
영향 요인 시험 고온(60℃, 개구) X X X -
고습도(상대 습도92.5%, 개구) X X -
광 조사(총 조도≥1.2Х106Lux·hr/근자외선≥200w·hr/m2, 개구) X(1ICH)+빛 차단
가속 시험 40℃/75%RH, 개구 X - X X
60℃/75%RH, 개구 - X X
주: X는 시험 항목을 나타내고 , XRPD, 함유량 및 관련물질을 포함하며, 0일째의 샘플은 -20℃에서 보존하였고; ICH는 가이던스 샘플을 방치한 광조사 조건을 나타내고, 즉 광조사(총 조도=1.2Х106Lux·hr/근자외선 ≥200w·hr/㎡, 개구)를 나타냈다.
실험 공정:
식 (I)의 화합물의 B 결정 형태를 약 10mg으로 정확하게 칭량하여 40mL의 유리병에 넣어 얇은 층으로 펼치고 병 입구를 알루미늄 호일로 덮고 샘플이 주위 공기와 충분히 접촉할 수 있도록 작은 구멍을 찔러놓았다. 광조사 샘플은 40mL의 유리병 바닥에 두고 개구하여 수직으로 라이트 박스에 두었고; 차광 대조군은 개구하여 수직으로 두고 유리병의 외부를 주석 호일로 감쌌다. 각 조건의 시간점에서 2부를 병행하여 칭량하고, 그 밖에 적당한 양의 샘플(칭량하지 않음)을 취하여 XRPD 검출에 사용하였으며, 준비가 끝난 샘플은 하기 표의 각 조건에 방치하고, 각각 시간점에 도달한 후 샘플을 취하여 HPLC 분석을 진행하였으며, 분석 방법은 표 4에 나타낸 바와 같으며, 실험 결과는 표 5에 나타낸 바와 같다.
HPLC 분석:
1.1. 희석제 및 이동상의 제조
희석제: 아세토니트릴:물(2:1)
예: 1000mL의 아세토니트릴과 500mL의 물을 균일하게 혼합한 후 초음파로 탈기하고 실온까지 냉각시켰다.
이동상 A: 0.1%의 트리플루오로아세트산 수용액
예: 2.0mL의 트리플루오로아세트산을 2L의 물에 첨가하여 혼합한 후 초음파로 탈기하고 실온까지 냉각시켰다.
이동상 B: 100%의 아세토니트릴
1.2. 대조군 샘플과 샘플 용액의 제조
식 (I)의 화합물의 B 결정 형태를 대조군으로 하고, 5mg의 식 (I)의 화합물의 B 결정 형태를 칭량하여 유리병에 놓고 농도가 1mg/mL가 될 때까지 5mL의 희석제를 첨가하고 초음파로 균일하게 혼합하고 다시 5배로 희석하여 대조군 샘플 용액 STD1을 얻었다. STD1을 1, 2, 4, 20 및 200배로 희석하여 1%의 대조군 용액으로 하였다.
1.3. 시험 샘플 용액의 제조
각 시험 샘플에 농도가 10mL가 될 때까지 희석제를 첨가하고 초음파로 용해시키고 실온까지 냉각시킨 후 HPLC 시험을 실시하였다.
동시에 샘플 용액을 5배로 희석하고 균일하게 혼합한 다음, HPLC 시험을 실시하였으며 분석 방법은 표 4에 나타낸 바와 같다.
HPLC 분석 방법
기기 애질런트 고성능 액체 크로마토그래피
(PDS-PF-HPLC-16)
크로마토그래피 컬럼 Waters Xbridge shield RP18, 4.6*150mm, 3.5μm(PDS-HPLC-038)
이동상 A 0.1%의 트리플루오로아세트산 수용액
이동상 B 100%의 아세토니트릴 용액
유속 0.8 mL/분
샘플 주입 체적 10 μL
검출 파장 220 nm
컬럼 온도 40℃
희석제 아세토니트릴/순수한 물=2/1(v/v)
경사 용리 절차 시간 (분) 이동상 A(%) 이동상 B(%)
0.00 90 10
50.00 10 90
55.00 10 90
57.00 90 10
62.00 90 10
식 (I)의 화합물의 B 결정 형태의 고체 안정성 시험의 HPLC 분석 결과
상대 유지 시간 0일째 광 조사 광 조사 대조군 60℃에서
5일		 60℃에서
10일		 92.5%의 습도에서 5일 92.5%의 습도에서 10일 40℃, 75%의 습도에서 10일 40℃, 75%의 습도에서 1개월 60℃,75%의 습도에서 10일 60℃,75%의 습도에서 1개월
0.16 - 0.07 - - - - - - - - -
0.19 - 0.32 - - - - - - - - -
0.24 - 0.12 - - - - - - - - -
0.26 - 0.12 - - - - - - - - -
0.31 - 0.12 - - - - - - - - -
0.36 - 0.19 - - - - - - - - -
0.38 - 0.08 - - - - - - - - -
0.60 - 0.28 - - - - - - - - -
0.62 - 0.12 - - - - - - - - -
0.70 - 0.10 - - - - - - - - -
0.78 - 0.16 - - - - - - - - -
0.79 - 0.24 - - - - - - - - -
0.82 - 2.26 - - - - - - - - -
0.87 0.35 4.49 0.34 0.35 0.36 0.36 0.35 0.34 0.34 0.35 0.35
0.89 - 0.07 - - - - - - - - -
0.90 - 0.07 - - - - - - - - -
1.07 0.06 <0.05% 0.07 0.07 0.07 0.07 0.06 0.06 0.07 0.07 0.07
1.12 0.65 0.52 0.64 0.65 0.65 0.65 0.65 0.65 0.65 0.65 0.65
1.14 0.14 0.12 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13 0.13
1.42 - 0.06 - - - - - - - - -
TRS(%) 1.20 9.50 1.18 1.19 1.21 1.21 1.20 1.19 1.20 1.20 1.21
Assay(%) 100.5 83.5 100.3 100.1 100.1 100.0 100.7 100.7 100.6 101.4 100.3
주: "-"는 미검출을 나타내고; TRS는 메인 피크 외의 잔여 불순물의 합계를 나타내고; Assay는 샘플의 함유량을 나타낸다.
실험 결론: 식 (I)의 화합물의 B 결정 형태는 고온 및 고습도의 환경하에서 안정적이다.
실시예 5
HBV의 체외 정량 qPCR 측정 시험
1. 실험 목적
실시간 정량 qPCR 시험(real time-qPCR)을 통하여 HepG 2.2.15 세포 내의 HBV DNA 함유량을 검출하고, 화합물의 EC50 값을 지표로 HBV에 대한 화합물의 억제 효과를 평가하는 것이다.
2. 실험 재료
2.1. 세포주: HepG 2.2.15 세포
HepG 2.2.15 세포 배지(DMEM/F12, Invitrogen-11330057; 10%의 혈청, Invitrogen-10099141; 100units/mL의 페니실린 및 10μg/mL의 스트렙토마이신, Invitrogen-15140122; 1%의 불필수 아미노산, Invitrogen-11140076; 2mM의 L-글루타민, Invitrogen-25030081; 300μg/ml의 제네티신, Invitrogen-10131027.
2.2. 시약
트립신(Invitrogen-25300062)
DPBS(Hyclone-SH30028.01B)
DMSO(Sigma-D2650-100ML)
고 처리량 DNA 정제 키트(QIAamp 96 DNA Blood Kit, Qiagen-51162)
정량 퀵 스타트 범용 프로브 시약(FastStart Universal Probe Master, Roche-04914058001)
2.3. 소모품 및 기기
96웰 세포 배양 플레이트(Corning-3599)
CO2 인큐베이터(HERA-CELL-240)
광학 실링 필름(ABI-4311971)
정량 PCR 96웰 플레이트(Applied Biosystems-4306737)
형광 정량 PCR 기기(Applied Biosystems-7500 real time PCR system)
3. 실험 공정 및 방법
3.1. HepG 2.2.15 세포(4x104 세포/웰)를 96웰 플레이트에 접종하고, 37℃ 5%의 CO2의 조건하에서 하룻밤 배양하였다.
3.2. 2일째에 화합물을 희석하여 3배의 구배로 합계 8개의 농도를 희석하였다. 부동한 농도의 화합물을 배양 웰에 첨가하고, 2개의 반복 웰을 설정하였다. 배양액 중의 DMSO의 최종 농도는 1%이다. 1μM의 GLS4를 100% 억제 대조군으로 하고, 1%의 DMSO는 0% 억제 대조군으로 하였다.
3.3. 5일째에 화합물을 포함한 새로운 배지로 변경하였다.
3.4. 8일째에 배양 웰의 배양액을 회수하고 고 처리량 DNA 정제 키트(Qiagen-51162)를 사용하여 DNA를 추출하였으며 구체적인 절차는 제품 설명서를 참조하였다.
3.5. PCR 반응 용액의 제조는 표 6에 나타낸 바와 같다.
PCR 반응 용액의 제조
항목 1웰 배치 시 필요한 용적(μl) 80웰 배치 시 필요한 용적(μl)
정량 퀵 스타트 범용 프로브 시약 12.5 1000
상류의 프라이머(10μmol) 1 80
하류의 프라이머(10μmol) 1 80
프로브(10μmol) 0.5 40
상류의 프라이머의 배열: GTGTCTGCGGCGTTTTATCA(서열번호 1)
하류의 프라이머의 배열: GACAAACGGGCAACATACCTT(서열번호 2)
프로브의 배열: 5＇+FAM+CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC(서열번호 3) + TAMRA-3＇
3.6. 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 15 μL의 반응 혼합물을 첨가한 다음 각 웰에 10 μL의 샘플 DNA 또는 HBV DNA 표준품을 첨가하였다.
3.7. PCR의 반응 조건은 95℃에서 10분간 가열하고; 다음 95℃에서 15초간 변성시키고, 60℃에서 1분간 연장시키며, 총 40개의 순환을 실시하였다.
3.8. 데이터의 분석
3.8.1. 억제율의 계산: %Inh.= [1 - (샘플 중 DNA 복사 수량 - 1μM의 GLS4 중 DNA 복사 수량) / (DMSO 대조군 중 DNA 복사 수량 - 1μM의 GLS4 중 DNA 복사 수량) ≠ 100.
3.8.2. EC50의 계산: GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 HBV에 대한 화합물의 50% 억제 농도(EC50)를 계산하였다.
4. 실험 결과는 표 7에 나타낸 바와 같다.
qPCR 실험에 의하여 검출한 EC50 시험 결과
시험 화합물 HBV의 50% 억제 농도(EC50)값
식 (I)의 화합물 8.158nM
실험 결론: 식 (I)의 화합물은 HBV에 대하여 유의한 억제 효과를 가진다.
실시예 6
시토크롬 P450 동종효소 억제성의 연구
실험 목적: 인체 간장 마이크로 시토크롬 P450 동종효소(CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4)의 활성에 대한 시험 화합물의 억제 작용을 검출하는 것이다.
실험 작업: 우선 시험 화합물(10mM)을 구배로 희석하여 작업 용액(100x최종 농도)을 제조하였으며, 작업 용액의 농도는 각각 5, 1.5, 0.5, 0.15, 0.05, 0.015, 0.005mM이고, 동시에, P450 동종효소(CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4)의 각 양성 억제제와 이의 특정 기질의 혼합물(5 in 1)의 작업 용액을 준비하였고; -80℃의 냉동고에 동결한 인체 간장 마이크로솜을 얼음 위에서 해동시킨 뒤 인체 간장 마이크로솜이 완전히 해동된 다음 PB로 희석하여 일정한 농도(0.253mg/mL)의 작업 용액을 제조하였고; 20μL의 기질 혼합 용액을 반응 플레이트(Blank 웰에 20μl의 PB를 첨가)에 첨가하고 동시에 158μL의 인체 간장 마이크로솜 작업 용액을 반응 플레이트에 첨가하고 반응 플레이트를 얼음 위에 놓고 사용을 대기하였고; 이때 2μL의 각 농도의 시험 화합물(N=1)과 특이성 억제제(N=2)를 대응하는 웰에 첨가하고 억제제를 첨가하지 않은(시험 화합물 또는 양성 억제제) 군에는 대응하는 유기 용매를 첨가하여 대조군 샘플(시험 화합물 대조군 샘플은 1:1의 DMSO:MeOH이고 양성 대조군 샘플은 1:9의 DMSO:MeOH이다)로 하였고; 37℃의 수욕에서 10분간 배양한 뒤 20μL의 코엔자임 인자(NADPH) 용액을 반응 플레이트에 첨가하고 37℃의 수욕에서 10분간 배양하였고; 400μL의 차거운 아세트니트릴 용액(내부 표준은 200ng/mL의 Tolbutamide와 Labetalol이다)을 첨가하여 반응을 중지시켰고; 반응 플레이트를 쉐이커에 두고 10분간 진탕시켰고; 4,000rpm으로 20분간 원심분리시켰고; 200μL의 상청액을 취하여 100μL의 물에 첨가하여 샘플을 희석하였고; 마감으로 플레이트를 밀봉하고 균일하게 진탕시키고 LC/MS/MS로 검출하였다. 실험 결과는 표 8에 표시되는 바와 같다.
인체 간장 마이크로솜 시토크롬 P450 동종효소의 활성에 대한 시험 화합물의 억제 작용의 결과
화합물 IC50(μM)
CYP1A2 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4
식 (I)의 화합물 >50 >50 >50 >50 >50
실험 결론: 식 (I)의 화합물은 CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4에 대하여 전부 현저한 억제 작용이 없었다.
실시예 7
혈장 단백질 결합률의 연구
실험 목적: 사람 및 CD-1 마우스 혈장 중의 시험 화합물의 단백질 결합률을 측정하는 것이다.
실험 작업: 사람 및 CD-1 마우스에서 796μL의 블랭크 혈장을 채취하고 4μL의 시험 화합물의 작업 용액(400μM) 또는 와파린 작업 용액(400μM)을 첨가하여 혈장 샘플 중의 시험 화합물 및 와파린의 최종 농도를 2μM로 하였다. 샘플을 충분히 혼합하였다. 유기상 중의 DMSO의 최종 농도는 0.5%이고; 50μL의 시험 화합물과 와파린 혈장 샘플을 샘플 수용 플레이트(3개 반복)에 첨가하고 즉시 대응하는 용적의 블랭크 혈장 또는 완충액을 첨가하여 각 샘플 웰의 최종 용적을 100μL가 되게 하고, 혈장:투석 완충액의 용적비는 1:1이며, 다음 이러한 샘플에 400μL의 정지액을 첨가하고, 샘플을 T0 샘플로 하였으며 회수율과 안정성의 검출에 사용하였다. T0 샘플을 2 내지 8℃에서 보존하고 기타 투석 완료 샘플과 함께 후처리를 하였고; 150μL의 시험 화합물과 와파린 혈장 샘플을 각 투석 웰의 투여 포트에 첨가하고 투석 웰에 대응하는 수용 포트에 150μL의 블랭크 투석 완충액을 첨가하였다. 다음, 투석 플레이트를 가스 투과성 막으로 밀봉하고 습윤한 5%의 CO2 인큐베이터에 놓고 37℃하에서 약 100rpm으로 진동하면서 4시간 동안 배양하였다. 투석 종료 후, 50μL의 투석후의 완충액 샘플과 투석후의 혈장 샘플을 새로운 샘플 수용 플레이트로 이동하였다. 각 샘플 웰의 최종 용적이 100μL로 되고, 혈장:투석 완충액의 용적비가 1:1이 되도록 대응하는 용적의 블랭크 혈장 또는 완충액 샘플을 첨가하였다. 모든 샘플은 단백질 침전 후 LC/MS/MS분석을 진행하였으며 공식[%Unbound(미 결합률)=100*FC/TC, %Bound(결합률)=100-%Unbound, %Recovery(회수율)=100*(FC+TC)/T0]을 이용하여 단백질 결합률 및 회수율을 계산하였다. 실험 결과는 표 9에 나타낸 바와 같다.
인체 및 CD-1마우스 혈장에서의 시험 화합물의 단백질 결합률
화합물 혈장 단백질 결합률
Human(인체) CD-1mouse(마우스)
식 (I)의 화합물 81% 94%
실험 결론: 식 (I)의 화합물은 인체 및 CD-1마우스 혈장에서 모두 비교적 낮은 단백질 결합률을 나타내었다.
실시예 8
생체내 약동학적 연구
1. Balb/c마우스에 경구 투여 및 정맥내 주사한 식 (I)의 화합물의 약동학적 연구
식 (I)의 화합물과 5%의 DMSO/55%의 폴리에틸렌글리콜400/40%의 수용액을 혼합하고, 볼텍싱 및 초음파처리하여 1mg/mL의 투명에 근접한 용액을 제조하고 사용을 위하여 미공성 막으로 여과하였다. 7 내지 10주령의 Balb/c 암컷 마우스를 선택하여 후보 화합물 용액을 1mg/kg의 용량으로 정맥 내 주사하였다. 식 (I)의 화합물과 10%의 솔루톨(폴리에틸렌글리콜-15 히드록시스테아레이트) 수용액을 혼합하고 볼텍싱 및 초음파 처리하여 1mg/mL의 투명에 근접한 용액을 얻었으며 사용을 위하여 미공성 막으로 여과하였다. 7 내지 10주령의 Balb/c 암컷 마우스를 선택하여 후보 화합물을 10mg/kg의 용량으로 경구 투여하였다.
일정한 시간내의 전혈을 수집하고, 제조하여 혈장을 얻었으며 LC-MS/MS법으로 약물의 농도를 분석하고 Phoenix Win Nonlin 소프트웨어(미국 Pharsight사)를 사용하여 약동학적 매개변수를 계산하였다.
2. SD 랫트에 경구 투여 및 정맥내 주사한 식 (I)의 화합물의 약동학적 연구
식 (I)의 화합물과 5%의 DMSO/55%의 폴리에틸렌글리콜 400/40%의 수용액을 혼합하고, 볼텍싱 및 초음파 처리하여 1mg/mL의 투명에 근접한 용액을 제조하고 사용을 위하여 미공성 막으로 여과하였다. 7 내지 10주령의 SD 수컷 랫트를 선택하여, 후보 화합물 용액을 1mg/kg 용량으로 정맥 내 주사하였다.
식 (I)의 화합물과 1%의 솔루톨 수용액을 혼합하고, 볼텍싱 및 초음파 처리하여 1mg/mL의 투명에 근접한 용액을 제조하고 사용을 위하여 미공성 막으로 여과하였다. 7 내지 10주령의 SD 수컷 랫트를 선택하여, 후보 화합물 용액을 10mg/kg 용량으로 경구 투여하였다.
일정한 시간내의 전혈을 수집하고 제조하여 혈장을 얻었으며 LC-MS/MS법으로 약물의 농도를 분석하고 Phoenix Win Nonlin 소프트웨어(미국 Pharsight사)를 사용하여 약동학적 매개변수를 계산하였다.
3. 비글견에 경구 투여 및 정맥 내 주사한 식 (I)의 화합물의 약동학적 연구
식 (I)의 화합물과 5%의 DMSO/55%의 폴리에틸렌글리콜 400/40%의 수용액을 혼합하고 볼텍싱 및 초음파 처리하여 1mg/mL의 투명에 근접한 용액을 제조하고, 사용을 위하여 미공성 막으로 여과하였다. 약 10kg의 수컷 비글견을 선택하여, 후보 화합물 용액을 1mg/kg 용량으로 정맥 내 주사하였다.
식 (I)의 화합물과 10%의 솔루톨 수용액을 혼합하고 볼텍싱 및 초음파 처리하여 2mg/mL의 균일한 현탁액을 제조하고 사용을 위하여 미공성 막으로 여과하였다. 약 10kg의 수컷 비글견을 선택하여, 후보 화합물 용액을 10mg/kg의 용량으로 경구 투여하였다.
일정한 시간 내의 전혈을 수집하고 제조하여 혈장을 얻었으며 LC-MS/MS법으로 약물의 농도를 분석하고 Phoenix Win Nonlin 소프트웨어(미국 Pharsight사)를 사용하여 약동학적 매개변수를 계산하였다.
실험 결과는 표 10에 나타낸 바와 같다.
시험 화합물의 약동학적 결과
화합물 식 (I)의 화합물
마우스 랫트 개
PK iv
(1mpk)		 T1/2(h) 1.2 0.95 2.87
Vdss(L/kg) 0.45 0.56 2.95
Cl(ml/분/kg) 8.5 8.5 15.6
AUC0-last(nM.h) 4672 4818 2679
po
(10mpk)		 Tmax(h) 0.5 0.5 1.67
Cmax(nM) 19933 8573 5847
AUC0-24h(nM.h) 32543 31132 33218
F% 70 65 126
주: T1/2은 반감기를 나타내고; Vdss는 겉보기 분포 용적을 나타내고; Cl는 클리어런스를 나타내고; AUC0-last는 약물-시간 곡선하 면적을 나타내며; Tmax는 피크에 도달하는 시간을 나타내고; Cmax는 피크에 도달하는 농도를 나타내며; F%는 경구 투여 생체이용률을 나타내고; iv는 정맥내 주사를 나타내고; PO는 경구 투여를 나타내며; mpk는mg/kg을 나타낸다.
실험 결론: 식 (I)의 화합물은 양호한 개 약동학적 단일 또는 부분적 지표를 가진다.
실시예 9
생체내 약물 효과성 연구
AAV/HBV 모델
실험 목적: AAV/HBV 마우스 모델을 통하여 화합물의 마우스 체내에서의 항 B형 간염 바이러스 효과를 검출하는 것이다.
실험 작업: 첫 번째 투여일을 0일째, 투여 1일 전을 -1일째, 투여 1일 후를 1일째로 설정하였다. 투여 28일 전, 모든 동물에 1*1011v.g.rAAV8-1.3HBV 바이러스를 미정맥에 주사하였으며, 동물 당 200mL를 주사하였다. 투여 14일 전 및 투여 7일 전에, rAAVI8-1.3HBV 바이러스를 주사한 모든 마우스를 이하 정맥에서 혈액을 채취하여 혈청을 수집하였다. 수집한 혈액 샘플을 37℃에서 약 30분간 두고, 4℃, 13200g에서 3분간 원심분리하여 상청액을 채취하였다. 혈청은 HBV DNA, HBeAg 및 HBsAg 함유량을 검출하는데 사용되었다. HBV DNA, HBsAg, HBeAg의 레벨이 낮은 마우스 및 체중이 가벼운 마우스는 이 실험에서 제외될 가능성이 있었다. 선택한 25마리의 마우스를 각 군에 균등하게 나누고, 각 화합물 처리군 마우스의 바이러스 주사 후 21일째의 HBV DNA, HBsAg, HBeAg 레벨 및 체중이 용매군과 비교하여 통계학적 차이가 없음(P>0.05)을 확보하였다. 식 (I)의 화합물(WX-325)과 10%의 솔루톨 수용액을 혼합하고 볼텍싱 및 초음파 처리하여 균일한 현탁액으로 제조하고 사용을 위하여 미공성 막으로 여과하였다. 양성 화합물인 테노호빌을 생리적 식염수에 용해시키고 초음파로 용해될 때까지 교반하여 0.1mg/mL의 모액으로 제조하고, 생리적 식염수로 0.01mg/mL로 희석하고 사용하기 전까지 4℃에서 보존하였다. 식 (I)의 화합물(WX-325)은 1일 2회(BID)로, 8시간의 간격으로 경구 투여(PO)의 방법으로 투여하였다. 참조 화합물 테노호빌은 1일 2회 경구 투여의 방법으로 투여하였다. 두가지 약물 모두 28일간 투여하였으며, 그 중 투여 후 3, 7, 10, 28일째의 혈액 샘플을 채취하고 qPCR법으로 혈장 중 HBV DNA의 레벨을 측정하였다. 28일째에, 마우스를 CO2 흡입으로 안락사시키고 간을 수집하였으며 qPCR법으로 마우스의 간장 중 HBV DNA 레벨을 검출하였다. 실험 결과는 도 7, 도 8에 도시된 바와 같다.
실험 결론: 본 발명의 화합물은 양호한 생체내 약물 효과성 및 용량 의존적 효과를 나타낸다.
이상에서 본 발명의 구체적인 실시형태를 서술하였지만, 당업자는 이들이 단지 예를 들어 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 원리와 실질을 벗어나지 않는 전제 하에서, 이러한 실시형태에 대하여 다양한 변경 또는 수정을 실시할 수 있는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 첨부된 청구범위에 의해 한정된다.
SEQUENCE LISTING <110> FUJIAN COSUNTER PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> CRYSTAL FORM OF TRI-CYCLE COMPOUND AND APPLICATION THEREOF <130> P21410110KR <140> PCT/CN2019/102183 <141> 2019-08-23 <150> CN201810969006.8 <151> 2018-08-23 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence <400> 1 gtgtctgcgg cgttttatca 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence <400> 2 gacaaacggg caacatacct t 21 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of probe <400> 3 cctctkcatc ctgctgctat gcctcatc 28

Claims (15)

  1. 5.56±0.2°, 10.84±0.2°, 15.56±0.2°, 16.17±0.2°, 22.14±0.2°, 22.70±0.2°, 27.76±0.2° 및 28.44±0.2°의 2θ 각에서의 특징적 회절 피크를 포함하는 X선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는 A 결정 형태를 갖는 하기 식 (I)의 화합물:
    Figure 112022011890209-pct00006
    .
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    XRPD 패턴의 데이터가 하기 표에 제시된 바와 같은 화합물.
    Figure 112022011890209-pct00017
  4. 제1항에 있어서,
    시차 주사 열량(DSC) 곡선이 229.95℃에서 흡열 피크의 개시점을 나타내는 화합물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    열중량 분석(TGA) 곡선이 62±3℃에서 0.3382%의 중량 손실을 갖고 230±3℃에서 0.8753%의 중량 손실을 갖는 화합물.
  7. 삭제
  8. 9.56±0.2°, 12.70±0.2°, 14.41±0.2°, 15.64±0.2°, 19.70±0.2°, 23.03±0.2°, 23.98±0.2° 및 27.65±0.2°의 2θ 각에서의 특징적 회절 피크를 포함하는 X선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는 B 결정 형태를 갖는 하기 식 (I)의 화합물:
    Figure 112022011890209-pct00007
    .
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서,
    XRPD 패턴의 데이터가 하기 표에 제시된 바와 같은 화합물.
    Figure 112022011890209-pct00018
  11. 제8항에 있어서,
    시차 주사 열량(DSC) 곡선이 233.59℃에서 흡열 피크의 개시점을 나타내는 화합물.
  12. 삭제
  13. 제8항에 있어서,
    열중량 분석(TGA) 곡선이 120±3℃에서 0.04890%의 중량 손실을 갖는 화합물.
  14. 삭제
  15. HBV 관련 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제8항, 제10항, 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
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