ES2923001T3

ES2923001T3 - Microscopio con una hoja de luz

Info

Publication number: ES2923001T3
Application number: ES16193117T
Authority: ES
Inventors: Robert Hauschild; Helmut Lippert; Christopher Power; Matthias Wald
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2009-09-24
Filing date: 2010-09-17
Publication date: 2022-09-22
Anticipated expiration: 2030-09-17
Also published as: US20150323774A1; EP3173838B1; US20120200693A1; US9500849B2; WO2011036094A1; EP2480922A1; JP2013506150A; EP3173838A1; JP5635104B2; DE102009044983A1; US9110301B2

Abstract

La invención se refiere a un microscopio que comprende un dispositivo de iluminación (19) con el que se genera una hoja de luz para iluminar un área de muestra (P) por medio de un espejo de exploración (23), que se dirige en la dirección de un eje de iluminación (X) de una trayectoria del haz de iluminación (35) y en la dirección de un eje transversal (Y), que es transversal al eje de iluminación (X), que comprende además un dispositivo de detección (1) con el que se detecta la luz, que se emite a lo largo de un eje de detección (Z) de una trayectoria de haz de detección desde el área de muestra (P). , donde el eje de iluminación (X) y el eje de detección (Z), así como el eje transversal (Y) y el eje de detección (Z) están en un ángulo distinto de cero entre sí. El dispositivo de iluminación (19) comprende medios para desviar la luz de iluminación hacia una trayectoria de haz de iluminación adicional (36) y para generar una hoja de luz adicional, que se extiende aproximadamente plana en la dirección del eje de iluminación (X) y en la dirección de la el eje transversal (Y), con la trayectoria del haz de iluminación (35) y la trayectoria del haz de iluminación adicional (36) se componen de elementos ópticos esencialmente idénticos y tienen las mismas longitudes de trayectoria óptica, y la hoja de luz y la hoja de luz adicional están alineadas entre sí de tal manera que cubren el área de muestra (P) en el mismo eje de iluminación (X) iluminan desde direcciones opuestas. En un microscopio de este tipo, los medios para desviar la luz de iluminación comprenden un elemento de conmutación que cambia la luz de iluminación entre la trayectoria del haz de iluminación (35) y la trayectoria del haz de iluminación adicional (36) y/o desplaza la hoja de luz en la dirección del eje de detección con el propósito de ajuste. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Microscopio con una hoja de luz

Campo de la invención

La invención se refiere a un microscopio que comprende un equipo de iluminación con el que se genera una hoja de luz para iluminar un área de muestra que se extiende de manera aproximadamente plana en la dirección de un eje de iluminación X de una trayectoria del haz de iluminación y en la dirección de un eje transversal Y, que es transversal al eje de iluminación X. El microscopio comprende, además, un equipo de detección con el que se detecta la luz que se irradia a lo largo de un eje de detección Z de una trayectoria del haz de detección desde el área de muestra, situándose el eje de iluminación X y el eje de detección Z, así como el eje transversal Y y el eje de detección Z, en un ángulo distinto de cero entre sí. Los ejes respectivos preferiblemente son aproximadamente perpendiculares entre sí.

Estado de la técnica

Tal configuración de microscopio entra dentro de la categoría de los llamados microscopios SPIM (SPIM - Selective Plane Illumination Microscopy - microscopía de iluminación plana selectiva). A diferencia de la microscopía confocal de barrido láser (LSM), en la que se realiza un barrido de una muestra tridimensional punto por punto en planos individuales de diferentes profundidades y la información gráfica así obtenida se combina a continuación para formar una imagen tridimensional de la muestra, la tecnología SPIM se basa en la microscopía de campo amplio y permite la representación gráfica de la muestra sobre la base de secciones ópticas a través de planos individuales de la muestra.

Las ventajas de la tecnología SPIM consisten, entre otras, en la mayor velocidad con la que se captura la información gráfica, el menor riesgo de decoloración de las muestras biológicas, así como una mayor profundidad de penetración del foco en la muestra.

En principio, con la tecnología SPIM, los fluoróforos que están contenidos en la muestra o que se introdujeron en la muestra con fines de contraste se excitan con luz láser, y la radiación láser se conforma en una denominada hoja de luz. Un plano seleccionado en la profundidad de la muestra en el área de muestra se ilumina con la hoja de luz y se obtiene una imagen de este plano de la muestra en forma de una sección óptica utilizando una óptica de formación de imágenes.

Los primeros planteamientos modernos sobre la tecnología SPIM los describe A.H. Voie et al., Journal of Microscopy, vol. 170 (3), pág. 229-236, 1993. En dicho documento se exponen las características principales de la moderna tecnología SPIM, con la que se ilumina una muestra con una fuente de luz coherente, generándose la hoja de luz con la ayuda de una lente cilíndrica. Perpendicularmente a la dirección de propagación de la hoja de luz, que, sin embargo, tiene un espesor finito, hay dispuestos medios de detección que comprenden una óptica de formación de imágenes, así como una cámara.

En los últimos años, la tecnología se ha desarrollado aún más, en particular con respecto a su aplicación en microscopía de fluorescencia. Por ejemplo, el documento DE 102 57 423 A1 y el documento WO2004/053558A1, basado en el mismo, describen procedimientos en los que se genera una iluminación a modo de hoja de luz debido a un movimiento relativo entre un campo de luz lineal y la muestra que se va a observar. La iluminación a modo de hoja de luz se crea poniendo en fila el campo de luz varias veces en sucesión gracias al movimiento relativo. En este sentido, sin embargo, se forman sombras dentro del plano que se va a examinar de la muestra, causadas por partes del conjunto de muestras que se encuentran en la dirección de la iluminación y no son transparentes a la luz de iluminación. Stelzer et al., Science (305) pág. 1007-1009 (2004), y Reynaud et al., HFSP Journal 2, pág. 266 (2008) también describen estructuras similares.

En lugar de una hoja de luz puramente estática, que se genera utilizando una óptica cilíndrica, también se puede generar una hoja de luz cuasiestática escaneando rápidamente un haz de luz con simetría de revolución sobre la muestra. El tiempo de integración de la cámara en la que se forma la imagen de la muestra se selecciona, a este respecto, de tal manera que el barrido se complete dentro del tiempo de integración. Tales estructuras se describen, por ejemplo, en Keller et al., Science (322), pág. 1765 (2008) y Keller et al., Current Opinion in Neurobiology 18, pág.

1-9 (2009), así como en KELLER PJ ET AL: "Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy", CURRENT OPINION IN NEUROBIOLOGY, LONDRES, GB, tomo 18, n.° 6, 1 de diciembre de 2008, páginas 624-632, XP026104064, ISSN: 0959-4388, DOI: 10.1016/J.CONB.2009.03.008ViewerXP.

Sin embargo, todas las estructuras y procedimientos conocidos en el estado de la técnica presentan inconvenientes más o menos graves que limitan el uso de la tecnología SPIM en el sector comercial, en el que es importante, entre otras cosas, lograr una gran facilidad de uso de los microscopios y, por regla general, se requiere un alto rendimiento: se deben examinar un gran número de muestras en un tiempo relativamente corto. A continuación se describen desventajas significativas.

En la mayoría de las estructuras implementadas hasta la fecha que utilizan tecnología SPIM, por ejemplo también en los documentos DE 102 57 423 A1 y WO2004/053558A1, la variación del tamaño del campo de imagen para la detección es ya muy compleja: por ejemplo, cambiar de un tamaño de campo de imagen que proporcione una buena visión general de la muestra a una área detallada. Esto solo se puede implementar cambiando el objetivo de detección. A este respecto, el espacio de muestra se ve afectado negativamente, lo que puede tener un efecto negativo en particular en el caso de una trayectoria del haz de detección horizontal. En el peor de los casos, esto también incluye retirar y vaciar la cámara de muestra. A continuación suele ser necesario reenfocar. Además, la muestra se calienta o enfría innecesariamente.

Becker et al., Journal of Biophotonics 1 (1), pág. 36-42 (2008) describen una mejora. En dicho documento, la trayectoria del haz de detección está dispuesta verticalmente, de modo que puede tener lugar un cambio en el tamaño del campo de imagen sin una interacción significativa con el espacio de la cámara de muestra. El objetivo de detección se puede introducir desde arriba en la cámara de muestra y extraerse de forma sencilla. No obstante, no se pueden evitar interacciones menores con la cámara de muestra y, por lo tanto, indirectamente con la muestra.

Adaptar el tamaño del campo de la imagen es aún más fácil cuando se usan objetivos de detección con zoom. Tal estructura es descrita, por ejemplo, por Santi et al., Biotechnics 46, pág.287-294 (2009). En dicho documento se utiliza para la detección un microscopio comercial, el Olympus MVX10, que dispone de un objetivo con zoom. Este también se inserta en la cámara de muestra desde arriba, de modo que en este caso también hay interacciones menores con la cámara de muestra -e l objetivo generalmente se inserta en la cámara de muestra llena de un líquido de inmersióncuando la función de zoom del objetivo está en funcionamiento o cuando se ajusta el enfoque, simplemente debido a la regulación a motor de las lentes, que se pueden transmitir al líquido en la cámara de muestra a través de vibraciones.

En caso de modificar el tamaño del campo de imagen para la detección, es deseable adaptar también el campo de imagen en el lado de la iluminación, es decir, una adaptación de la extensión de la hoja de luz a lo largo del eje transversal Y y del eje de detección Z. En el estado de la técnica, esto se ha implementado hasta la fecha mediante el uso de diafragmas intercambiables y/o expansores de haz (beam expander), como describen, por ejemplo, Keller et al., Science 322, pág. 176 y siguientes (2008) y Huisken et al., Optics Letters 32 (17), pág. 2608-2610 (2007). Por un lado, la sobreexposición de los diafragmas que se produce a este respecto provoca pérdidas de luz y, por otro lado, la flexibilidad disminuye cuando se utilizan expansores de haz, ya que tienen que ser reemplazados con un gran coste.

Mientras que convencionalmente, como se describe por ejemplo en el documento WO2004/053558A1, la hoja de luz se genera a través de lentes cilíndricas dispuestas en la trayectoria del haz, en el estado de la técnica, por ejemplo en el artículo de Keller et al., Science 322, pág. 176 y siguientes (2008) que se acaba de mencionar, se describen estructuras en las que no se genera una hoja de luz estática, sino solo una hoja de luz cuasiestática en la que un haz de luz con simetría de revolución realiza un barrido rápido de la muestra. Rápido significa, a este respecto, que el tiempo de integración del detector de área de resolución espacial que se utiliza normalmente, por ejemplo, una cámara con chip CCD o chip CMOS, se selecciona de tal manera que el haz de luz realice un barrido del área de muestra, que corresponde a la hoja de luz cuasiestática, dentro de este tiempo de integración. El tiempo de integración -que en el caso de la cámara corresponde, por ejemplo, al tiempo de apertura del obturador- y la frecuencia de barrido o el tiempo de barrido del haz de luz normalmente también se pueden ajustar, a este respecto, de forma independiente, de modo que el tiempo de barrido se puede adaptar a un tiempo de integración fijo. Dado que al realizar el barrido con un haz de luz con simetría de revolución también se produce una hoja de luz, al menos en cuanto a su efecto, este enfoque también se incluye en el concepto de generación de una hoja de luz.

Ambos tipos de generación de hoja de luz ofrecen ventajas y desventajas. Por ejemplo, cuando se utilizan lentes cilíndricas, la carga de la muestra es menor porque la intensidad con la que se irradia la muestra se puede seleccionar para que sea menor, con el fin de lograr, aun así, la misma dosis que en el caso del barrido. Además, el uso de lentes cilíndricas es muy adecuado para capturar secuencias de imágenes en rápida sucesión en el menor tiempo posible, ya que la velocidad no está restringida por elementos en movimiento en la trayectoria del haz de iluminación. En particular, una iluminación de tipo estroboscópico se puede implementar muy bien usando lentes cilíndricas. Durante el barrido, el espejo de barrido pivotante que suele utilizarse con este fin puede representar el elemento limitador de velocidad. Si se combina el barrido puro adicionalmente con un barrido angular, es decir, iluminación desde diferentes ángulos, para reducir los artefactos de rayas, como se describe, por ejemplo, en el documento DE 102007 015063 A1, existe el riesgo de que se generen artefactos de latido si los escáneres para el barrido angular y espacial de la hoja de luz no están coordinados entre sí, no están sincronizados.

Las ventajas de la generación de hoja de luz para el barrido son, entre otras, que es posible una iluminación más homogénea de la muestra, por lo que también son posibles evaluaciones de imágenes cuantitativas.

Cuando se utiliza una óptica cilíndrica, esto solo se puede lograr de forma aproximada mediante la sobreexposición de un diafragma, lo que conlleva pérdidas de luz. Además, el tamaño de la imagen se puede adaptar de forma muy flexible mediante la selección flexible de la desviación máxima del medio de barrido, el escáner. El barrido disminuye la coherencia espacial de la luz de excitación, lo que también conduce a una disminución de los artefactos de rayas. Finalmente, las estructuras de rejilla también se pueden proyectar en la muestra mediante modulaciones especiales de la fuente de luz, por ejemplo, con un AOTF.

También se describen estructuras en el estado de la técnica en las que las muestras se iluminan desde ambos lados a lo largo del eje de iluminación X desde direcciones opuestas. En la estructura descrita por Santi et al., Biotechnics 46, pág. 287-294 (2009), la muestra se ilumina simultáneamente desde ambos lados. Una estructura de este tipo no es ventajosa para muchos tipos de muestras, como los embriones de la mosca de la fruta (Drosophila), ya que de esta manera los componentes de imagen dispersos y no dispersos se combinan desfavorablemente entre sí. Huisken et al., Optics Letters 32(17), pág. 2608-2610 (2007) y Becker et al., Journal of Biophotonics 1 (1), pág. 36-42 (2008) describen estructuras que iluminan la muestra secuencialmente, es decir, de manera alterna a lo largo del eje de iluminación X desde ambas direcciones, lo que es más favorable para la muestra mencionada anteriormente. Se utiliza un obturador generador de vibraciones o un espejo giratorio para alternar entre las dos direcciones de iluminación, de manera que los tiempos necesarios para la conmutación son relativamente largos.

Keller et al. describen, en Science 322, pág. 1765 y siguientes (2008) y en Current Opinion in Neurobiology, 18, pág.

1-9 (2009), una estructura SPIM en la que el objetivo de iluminación y/o detección está montado en un accionamiento piezoeléctrico, que permite el enfoque. El ajuste de la distancia se realiza aquí desplazando el objetivo completo. En particular, la lente frontal no mantiene su distancia al plano de la imagen, por lo que puede existir una interacción con la cámara de muestra. Esto se aplica en particular a las trayectorias del haz de detección horizontales con objetivos de detección sumergidos: En este caso, el movimiento necesario del objetivo conlleva problemas de estanqueidad. Por otro lado, un elemento móvil en el espacio de muestra también suele ser perturbador, ya que el usuario puede necesitar espacio aquí para diferentes tipos de alimentaciones a la cámara de muestra. Las vibraciones que se producen cuando se mueve el objetivo se pueden transferir a la muestra, ya que no hay aire entre la lente y la muestra, sino un líquido correspondiente.

Cuando se utilizan captadores o escáneres para generar la hoja de luz, la imagen del escáner en la pupila del objetivo de iluminación generalmente no es óptima, por lo que el barrido espacial puro se superpone con componentes de barrido angulares.

También se conocen estructuras en el estado de la técnica en las que la trayectoria del haz de detección se divide en dos trayectorias parciales del haz; esto se describe, por ejemplo, en las dos publicaciones de Keller et al. ya mencionadas anteriormente. Para dividir el haz se usan divisores de haz que transmiten una parte de la luz en una trayectoria parcial del haz y reflejan la otra parte de la luz en la otra trayectoria parcial del haz. Para ello, se utilizan elementos dicroicos convencionales con un espesor relativamente pequeño, inferior a 2 mm, que se disponen en una parte divergente de la trayectoria del haz de detección. La ventaja de una disposición de este tipo es que apenas se producen artefactos causados por astigmatismo en la dirección de la transmisión. Sin embargo, en la dirección de la luz reflejada se producen artefactos de imagen como astigmatismo o desenfoque, debido a las tensiones superficiales en el elemento dicroico, que pueden ser causadas, por ejemplo, por el revestimiento o por una instalación incorrecta. Huisken et al., en Optics Letters 32, págs. 2608-2610 (2007), proponen otra forma de dividir en dos trayectorias parciales del haz de detección. En este caso, el elemento dicroico se coloca en el infinito con respecto al recorrido del haz, de modo que también en este caso se minimizan los problemas que se producen durante la transmisión. Sin embargo, con respecto a la trayectoria parcial del haz reflejado, el problema de la tensión superficial también puede ocurrir en este caso cuando se usan elementos dicroicos convencionales.

Descripción de la invención

El objetivo de la invención es mejorar un dispositivo del tipo descrito al inicio, reducir las desventajas mencionadas del estado de la técnica y proporcionar a un usuario profesional un aparato manejable en comparación con las soluciones hasta la fecha, que presente componentes para eliminar uno o más de estas desventajas.

Este objetivo se resuelve mediante un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1. Configuraciones ventajosas se describen en las reivindicaciones dependientes.

Por lo que respecta a una adaptación de la extensión de la hoja de luz mediante una adaptación de imagen en el lado de la iluminación, teniendo en cuenta el tamaño del campo de imagen ajustado en el lado de la detección y con vistas a un enfoque de la iluminación y/o la detección con acoplamiento mínimo a la cámara de muestra y a la muestra para un microscopio del tipo descrito al inicio, el equipo de detección presenta un elemento de detección óptico dispuesto espacialmente separado de una lente frontal del objetivo de detección y regulable independientemente de esta lente frontal, por medio del cual puede variarse continuamente el tamaño de un campo de imagen de detección y/o por medio del cual puede desplazarse continuamente un plano focal de detección en el área de muestra. Por lente frontal se entiende a este respecto la lente más próxima en la trayectoria del haz, es decir, la más próxima al área de muestra, o un elemento cementado correspondiente.

Por un lado, el tamaño del campo de imagen de detección se puede variar continuamente por medio del elemento de detección óptico y, por otro lado, un plano focal de detección en el área de muestra se puede desplazar continuamente con el elemento de detección. El elemento de detección puede estar diseñado, a este respecto, de tal manera que solo cumpla una de estas dos funciones, alternativamente, que pueda efectuar ambas configuraciones, o que ambas configuraciones se puedan efectuar simultáneamente. El elemento de detección puede ser una parte componente integral del objetivo de detección, por ejemplo en forma de dos o más elementos de lente que se pueden mover uno con respecto a otro, sin que la lente frontal se mueva cuando se mueven estos elementos de lente. Sin embargo, también puede estar dispuesto como componente independiente en la trayectoria del haz a una distancia del objetivo de detección.

En una configuración ventajosa, el elemento de detección óptico está diseñado como elemento de zoom de detección. Por ejemplo, el elemento de zoom de detección puede comprender dos elementos de lente móviles y un elemento de lente fijo entremedias. También son posibles otras configuraciones del elemento de detección con solo un elemento de lente móvil o con el elemento de lente fijo en otro lugar o con más de dos elementos de lente móviles. Mediante el uso de un elemento de zoom de detección, es posible pasar fácilmente entre imagen general e imagen detallada y localizar de manera eficiente un área de muestra de interés. Se puede utilizar una muestra de imagen intermedia para la generación automatizada de tablas de posición del actuador, por ejemplo, introduciendo una estructura de rejilla de transmisión en un plano de imagen intermedio de la trayectoria del haz de detección. Alternativamente, también se puede usar un objetivo de calibración. También se pueden compensar diversos errores cromáticos del equipo de detección mediante una correspondiente regulación del elemento de zoom de detección, y se pueden generar diferentes tablas para diferentes longitudes de onda de emisión y posiciones de zoom. Para compensar estos errores, el plano focal en el área de muestra se desplaza continuamente por medio del elemento de zoom de detección, dado el caso con ayuda de las tablas. Debido a la separación espacial entre la lente frontal del objetivo de detección y el elemento de zoom de detección, el objetivo de detección o, en particular, la lente frontal del propio objetivo de detección no tienen que moverse; con la ayuda del elemento de zoom de detección, que a su vez está dispuesto de manera fija en la trayectoria del haz de detección, se puede efectuar el denominado enfoque interno de la trayectoria del haz de detección. Esto ofrece ventajas tanto al manipular la muestra como al capturar pilas de imágenes a lo largo de la dirección de detección.

En otra configuración, la dirección de detección también puede presentar una unidad de lente de tubo dispuesta espacialmente separada del elemento de detección y del objetivo de detección, por medio de la cual se puede desplazar el plano focal de detección en el área de muestra. En este caso, el elemento de detección, en particular el elemento de zoom de detección, solo se usa para regular el tamaño del campo de imagen; el plano de enfoque se regula, por ejemplo, moviendo una correspondiente lente de tubo o un elemento de lente de tubo de la unidad de lente de tubo. La combinación de ambas opciones, es decir, que el plano focal de detección se pueda regular tanto con la unidad de lente de tubo como con el elemento de zoom de detección, también es una posible configuración.

En otra configuración preferida de la invención, el equipo de iluminación presenta en la trayectoria del haz de iluminación al menos un objetivo de iluminación y un elemento de iluminación óptico dispuesto separado espacialmente de una lente frontal del objetivo de iluminación y regulable independientemente de esta, por medio del cual se puede variar continuamente la extensión de la hoja de luz en la dirección del eje de detección Z y/o por medio del cual se puede desplazar continuamente un plano focal de iluminación en el área de muestra. Con el elemento de iluminación, el tamaño del campo de imagen o el aumento en el lado de la iluminación se pueden adaptar continuamente, o también se puede fijar el enfoque. El elemento de iluminación puede ser una parte componente integral del objetivo de iluminación, por ejemplo en forma de dos o más elementos de lente que se pueden mover uno con respecto a otro, sin que la lente frontal se mueva cuando se mueven estos elementos de lente. Sin embargo, también puede estar dispuesto como componente independiente en la trayectoria del haz a una distancia del objetivo de iluminación.

Esto es posible de manera especialmente sencilla si el elemento de iluminación está diseñado como elemento de zoom de iluminación con ventajosamente al menos tres elementos de lente que se pueden desplazar independientemente uno de otro. Si el equipo de detección dispone de un elemento de zoom de detección, el elemento de zoom de iluminación se puede usar para ajustar de manera óptima y continua la apertura numérica de la iluminación al tamaño del campo de imagen de detección. De esta forma, se reduce la frecuencia de cambio de los objetivos de iluminación y la carga de la muestra siempre se mantiene al mínimo. La relación entre el tamaño del campo de imagen en el lado de detección y el tamaño del campo de imagen en el lado de iluminación se puede ajustar a este respecto de modo que la relación de los espesores de hoja de luz se ajuste de 1 en el centro a 2 en el borde del campo de visión y se mantenga constante en caso de variación del tamaño del campo de imagen.

El uso de tres elementos desplazables es ventajoso en el sentido de que, además de un aumento correcto, también se puede garantizar una formación de imagen correcta de la pupila y la imagen intermedia. En total, se pueden ajustar los tres grados de libertad, que se pueden manejar con los tres elementos desplazables por separado unos de otros. Si solo se han de ajustar correspondientemente menos grados de libertad, también son necesarios correspondientemente menos elementos de lente desplazables en el elemento de zoom de detección.

Para adaptar el tamaño del campo de imagen en el lado de iluminación al tamaño del campo de imagen de detección, es ventajoso que el elemento de zoom de iluminación y el elemento de zoom de detección estén acoplados a través de un circuito de control para ajustar el elemento de zoom de iluminación en función del tamaño de imagen de detección especificado por el elemento de zoom de detección y, por supuesto, también por el aumento estático de las ópticas de detección restantes. En este caso, en caso de cambio del tamaño del campo de imagen de detección, lo que puede ser realizado por un observador, por ejemplo manualmente, el tamaño del campo de imagen en el lado de la iluminación se adapta automáticamente a este cambio. Por supuesto, el circuito de control también puede estar diseñado para elementos de detección y/o iluminación que formen parte del objetivo de detección o iluminación correspondiente.

Además, se proporciona un microscopio del tipo descrito al inicio, comprendiendo el equipo de iluminación, adicionalmente, primeros medios generadores de hoja de luz, que a su vez comprenden medios para generar un haz de luz con simetría de revolución y medios de barrido para realizar un barrido del área de muestra en forma de hoja de luz a lo largo del eje transversal en un intervalo de tiempo predeterminado, comprendiendo además el equipo de iluminación segundos medios generadores de hoja de luz, comprendiendo estos un primer elemento óptico de efecto astigmático con al menos una lente astigmática para generar una hoja de luz estática, y también están previstos medios de selección con los que se pueden seleccionar los primeros o los segundos medios generadores de hoja de luz o ambos juntos para generar la hoja de luz. Una lente cilíndrica, por ejemplo, puede usarse como lente de efecto astigmático; de manera equivalente, también puede usarse otra lente de efecto astigmático, tal como una lente Powell.

Mientras que los primeros medios generadores de hoja de luz generan una hoja de luz cuasiestática con la ayuda de un espejo de barrido rápido, con la ayuda de los segundos medios generadores de hoja de luz se genera una hoja de luz estática. De esta manera, las ventajas de una generación de hoja de luz de barrido pueden combinarse con las de la generación de hoja de luz por medio de óptica cilíndrica. Los medios de barrido comprenden convenientemente un espejo de barrido conmutable rápidamente y un objetivo de barrido. Opcionalmente, también se puede utilizar a este respecto o bien uno o bien el otro método de generación de hoja de luz; por ejemplo, es posible dejar el espejo de barrido en su posición cero y utilizar el elemento óptico cilíndrico para generar una hoja de luz estática, que ilumina la muestra de manera estroboscópica, para lo cual el espejo de barrido es demasiado lento. Además, también pueden estar previstos medios de barrido angular, por medio de los cuales se puede variar el ángulo que forma la hoja de luz con el eje de iluminación. Los medios de barrido angular también pueden comprender un espejo de barrido angular conmutable rápidamente. Puede tratarse a este respecto de un escáner de resonancia sobre una base microelectromecánica, por ejemplo. El espejo de barrido angular suele trabajar con frecuencias de 10 kHz, mientras que el espejo de barrido para generar la hoja de luz lo hace con una frecuencia entre aproximadamente 1 kHz y 2 kHz.

El espejo de barrido angular puede disponerse conjugado con el plano focal de iluminación cuando se seleccionan los segundos medios generadores de hoja de luz, es decir, por ejemplo, cuando el elemento óptico cilíndrico se encuentra en la trayectoria del haz. Con la ayuda del espejo de barrido angular, la muestra se puede iluminar desde diferentes ángulos, lo que se puede usar para reducir las rayas.

Además del espejo de barrido rápido para generar la hoja de luz, también se puede colocar otro espejo de barrido rápido en la trayectoria del haz en las inmediaciones, con el que, por ejemplo, la hoja de luz se puede desplazar en la dirección del eje de detección con fines de ajuste o la luz se puede desviar a otra trayectoria del haz de iluminación, aunque esto último también puede realizarse por medio de un espejo de conmutación independiente.

Adicionalmente, en la trayectoria del haz de iluminación también puede estar dispuesto un segundo elemento óptico con efecto astigmático, que también puede estar configurado como elemento óptico cilíndrico. Este sirve para la correcta formación de imágenes de uno de los dos espejos de barrido en un plano de pupila, mientras que el otro espejo de barrido respectivo forma imágenes correctamente incluso sin el efecto del elemento óptico cilíndrico. Se trata a este respecto esencialmente de una óptica de corrección para la correcta formación de imágenes de los dos espejos de barrido mencionados.

Además, se proporciona un microscopio del tipo descrito al inicio, en el que el equipo de iluminación comprende además medios para desviar la luz de iluminación en una trayectoria adicional del haz de iluminación y para generar una hoja de luz adicional, que se extiende de manera aproximadamente plana en la dirección del eje de iluminación y en la dirección del eje transversal, en donde la trayectoria del haz de iluminación y la trayectoria adicional del haz de iluminación se componen de elementos ópticos esencialmente idénticos y tienen las mismas longitudes de camino óptico, y en donde la hoja de luz y la hoja de luz adicional están orientadas entre sí de tal manera que iluminan el área de muestra sobre el mismo eje de iluminación desde direcciones opuestas, en donde el equipo de iluminación también comprende además medios de conmutación para conmutar la luz de iluminación entre la trayectoria del haz de iluminación y la trayectoria adicional del haz de iluminación y en donde el equipo de detección comprende un objetivo de detección para la formación de imágenes de la luz irradiada desde el área de muestra sobre un detector de área para la detección de la luz en función de la ubicación, en donde los medios de conmutación comprenden un elemento de conmutación conmutable rápidamente con un tiempo de conmutación de menos de 10 ms, en donde un tiempo de integración predeterminado del detector de área y el tiempo de conmutación del elemento de conmutación están coordinados entre sí de tal manera que el área de muestra se ilumina al menos una vez sobre el eje de iluminación desde cada dirección durante el tiempo de integración.

Los tiempos de integración para el detector de área, es decir, el tiempo dentro del cual el obturador de una cámara, por ejemplo, está abierto y se recopilan valores medidos, tampoco debe ser demasiado largo por este motivo, ya que de lo contrario la relación señal-ruido se ve afectada negativamente. En este sentido, normalmente se descartan los espejos giratorios accionados a motor o similares. Por lo tanto, es ventajoso utilizar un espejo accionado galvanométricamente con un tiempo de conmutación de menos de 10 ms.

En lugar de un espejo de conmutación, también se pueden utilizar otros elementos de conmutación, por ejemplo, elementos de conmutación acústico-ópticos o electro-ópticos, que pueden funcionar tanto de forma reflexiva como, de manera equivalente, de forma transmisiva.

Es importante que el tiempo de conmutación sea corto en comparación con el tiempo de integración del detector de área -normalmente no es más de 20 ms, ya que de lo contrario las vibraciones pueden tener un efecto negativo- y debe dimensionarse de forma que el área de muestra se ilumine al menos una vez desde cada dirección dentro del tiempo de integración. También son concebibles múltiples barridos desde cada dirección si el tiempo de conmutación es lo suficientemente pequeño, por ejemplo, menos de 5 ms.

De esta manera, se puede lograr una iluminación de dos haces conmutable rápidamente, que se puede utilizar tanto para la iluminación alterna secuencial de la muestra desde dos lados como para la iluminación cuasi simultánea de la muestra desde dos lados, dependiendo de la naturaleza de la muestra. Cuasi simultáneamente porque la dirección de iluminación cambia durante el tiempo de integración de la cámara y, si la hoja de luz se genera de forma escaneada mediante el barrido de la muestra con un haz de luz con simetría de revolución, el haz de luz recorre la muestra al menos dos veces, pero desde diferentes direcciones. Con los cortos tiempos de conmutación mencionados, la muestra generalmente no cambia su posición, de modo que la muestra aparece efectivamente en la imagen como si estuviera iluminada desde ambos lados.

Por lo tanto, efectivamente la muestra en el área de muestra se ilumina simultáneamente desde direcciones opuestas a lo largo del eje de iluminación, ya que durante el tiempo de integración del detector de área la luz de iluminación se conmuta al menos una vez de la trayectoria del haz de iluminación a la trayectoria adicional del haz de iluminación.

El espejo de conmutación está dispuesto, a este respecto, ventajosamente en un plano conjugado con la pupila de iluminación. Esto tiene la ventaja de que para la conmutación se aprovecha el desfase espacial generado por la desviación del espejo de conmutación y por el uso del objetivo de barrido. Por otro lado, por supuesto, también son concebibles estructuras en las que el desfase angular se utilice directamente para la conmutación.

El equipo de iluminación también puede comprender medios generadores de hoja de luz, que a su vez comprenden medios para generar un haz de luz con simetría de revolución y medios de barrido para realizar un barrido del área de muestra en forma de hoja de luz a lo largo del eje transversal, comprendiendo los medios de barrido, por ejemplo, un espejo de barrido conmutable rápidamente y un objetivo de barrido. Opcionalmente, también pueden estar previstos medios de barrido angular, por medio de los cuales se puede variar el ángulo que la hoja de luz forma con el eje de iluminación. Estos medios de barrido de ángulo pueden, por ejemplo, comprender un espejo de barrido angular conmutable rápidamente para reducir las rayas.

Además del espejo de barrido rápido para generar la hoja de luz, también se puede colocar otro espejo de barrido rápido en la trayectoria del haz en las inmediaciones, con el que, por ejemplo, la hoja de luz se puede desplazar en la dirección del eje de detección con fines de ajuste. Esto también se puede hacer usando el espejo de conmutación.

Con un diseño correspondiente de la estructura, el otro espejo de barrido rápido o espejo de conmutación también se puede usar al mismo tiempo para el ajuste de la hoja de luz en la dirección de detección mediante una ligera desviación.

Puede ser ventajoso a este respecto que el equipo de iluminación comprenda un elemento óptico de efecto astigmático dispuesto en la trayectoria del haz de iluminación o en la trayectoria adicional del haz de iluminación, preferiblemente un elemento óptico cilindrico para la correcta formación de imágenes del espejo de barrido o el espejo conmutable o del espejo de barrido adicional en un plano de la pupila. Mientras que de uno de los dos espejos se forman correctamente imágenes en el plano de la pupila, la formación de imágenes del otro espejo es incorrecta sin un elemento de efecto astigmático adicional de este tipo; se trata de una óptica correctora para formar correctamente imágenes de ambos espejos.

También surge una posible aplicación interesante cuando el detector de área dispone de áreas de píxeles legibles por separado para las cuales se pueden especificar diferentes tiempos de integración, como es el caso, por ejemplo, con los detectores de área modernos basados en CMOS. En este caso, el tiempo de conmutación del elemento de conmutación también se puede sincronizar adicionalmente con estos diferentes tiempos de integración.

Además, se proporciona un microscopio del tipo descrito al inicio, en el que el equipo de detección comprende además un objetivo de detección y medios de división para dividir la trayectoria del haz de detección en dos trayectorias parciales del haz en la trayectoria del haz de detección, en donde un detector de área de resolución espacial, en el que se forman imágenes de la luz que se ha de detectar, está dispuesto a su vez en cada caso en las trayectorias parciales del haz, y en donde los medios de división comprenden por su parte, a su vez, al menos un divisor de haz dicroico, en donde el divisor de haz dicroico está dispuesto en la trayectoria del haz en el rango hiperfocal con respecto a los detectores de área de resolución espacial y tiene un espesor de al menos 3 mm, preferiblemente de al menos 4 mm, en donde en cada una de las dos trayectorias parciales del haz están dispuestos elementos ópticos de formación de imágenes para la formación de imágenes de la luz que se va a detectar en el detector de área respectivo y en al menos una de las dos trayectorias parciales del haz está dispuesta transversalmente al eje de detección al menos una placa oscilante para generar un desfase del haz a lo largo de dos direcciones ortogonales entre sí. De esta forma, se pueden realizar superposiciones automatizadas de los valores de medición leídos por los dos detectores de área. En particular, es posible fácilmente una adaptación a diferentes tipos de cámara que pueda utilizar el usuario final. Si bien cuando se usa solo una placa oscilante, esta se tiene que colocar en las dos direcciones ortogonales, también se pueden usar dos placas oscilantes con un efecto equivalente. El desfase del haz en una dirección se ajusta entonces con una de las dos placas, y el desfase del haz en la dirección ortogonal a esta se ajusta con la otra.

Ventajosamente, a este respecto en un plano de imagen intermedia de la trayectoria del haz de detección está dispuesta de manera conmutable una estructura de transmisión con la que las imágenes se pueden orientar entre sí, por ejemplo una estructura de rejilla de transmisión. Alternativamente, también se puede usar un objetivo de calibración, en la posición del objetivo de detección. Una vez que se han orientado las imágenes, la estructura de rejilla de transmisión o el objetivo de calibración se pueden retirar de la trayectoria del haz nuevamente. La superposición de las imágenes puede entonces tener lugar automáticamente. El desfase se ajusta con ayuda de las placas oscilantes, siendo suficiente la disposición de las placas oscilantes en una de las dos trayectorias parciales del haz.

Los elementos ópticos de formación de imágenes en las respectivas trayectorias parciales del haz pueden estar dispuestos de forma desplazable, de modo que pueda ajustarse el enfoque en el respectivo detector de área. Esto es especialmente ventajoso para compensar aberraciones cromáticas longitudinales cuando, por ejemplo, las mediciones se realizan en muestras marcadas con dos colorantes diferentes y los intervalos de emisión espectral o las longitudes de onda de emisión deben detectarse en las dos trayectorias parciales del haz. A este respecto, basta con que al menos uno de los elementos ópticos de formación de imágenes se pueda desplazar, siempre que el enfoque también se pueda ajustar con otros medios.

De manera complementaria o alternativa, en cada una de las dos trayectorias parciales del haz entre el elemento de formación de imágenes óptico y el detector de área, es decir, la parte divergente de la trayectoria del haz, puede estar también dispuesta una estructura de cuña que consta de dos cuñas ópticas que sobresalen en la trayectoria del haz y desplazables entre sí transversalmente a la dirección del haz, de modo que el enfoque en el detector de área respectivo puede ajustarse desplazando las cuñas una con respecto a la otra.

En lugar de disponer el divisor de haz en la trayectoria del haz en el rango hiperfocal, el divisor de haz dicroico también puede disponerse en la parte divergente de la trayectoria del haz entre los detectores de área y un elemento de formación de imágenes óptico para generar imágenes de la luz que se va a detectar en los detectores de área. En la trayectoria parcial del haz que capta la luz transmitida por el divisor de haz, está dispuesta entre el detector de área y el divisor de haz una placa de vidrio del mismo espesor que el divisor de haz, que forma un ángulo de aproximadamente 90° con el divisor de haz. De esta manera, el astigmatismo causado por el uso del divisor de haz en la trayectoria parcial del haz de transmisión se vuelve a corregir.

En una configuración particularmente preferida, esta placa de vidrio está diseñada como una placa oscilante, por lo que también se puede usar para generar un desfase del haz transversalmente a la dirección del haz, de modo que los valores medidos leídos desde los detectores de área también se pueden superponer automáticamente en este caso.

Para cambiar la posición de enfoque, el elemento óptico de formación de imágenes puede estar dispuesto de forma desplazable en una configuración sencilla, de modo que pueda ajustarse el enfoque en los detectores de área. Si se miden dos longitudes de onda diferentes, se puede suponer que el foco no está ajustado con precisión para al menos una de las dos longitudes de onda. Para evitar esto, al menos en una de las dos trayectorias parciales del haz entre el divisor de haz y el detector de área está dispuesta una estructura de cuña compuesta por dos cuñas ópticas que sobresalen en la trayectoria del haz y que se pueden desplazar transversalmente a la dirección del haz, de modo que el enfoque se puede ajustar en el detector de área respectivo. En este caso, la trayectoria del haz en la que no se encuentra la estructura de cuña, por tanto, por ejemplo, la trayectoria parcial del haz de transmisión, se enfoca en primer lugar con ayuda del desplazamiento del elemento óptico de formación de imágenes. Esto se realiza utilizando una de las dos longitudes de onda a medir. Entonces tiene lugar un ajuste fino con respecto a la otra longitud de onda mediante un desplazamiento de las dos cuñas entre sí en la otra trayectoria del haz, es decir, por ejemplo, en la trayectoria parcial del haz de reflexión. Alternativamente, el elemento óptico de formación de imágenes también puede estar dispuesto de forma fija y las estructuras de cuña pueden estar dispuestas en consecuencia en cada una de las dos trayectorias parciales del haz.

Se entiende que las características mencionadas anteriormente y que a continuación aún deben explicarse no solo pueden utilizarse en las combinaciones indicadas, sino también en otras combinaciones o por sí mismas sin abandonar el marco de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La invención se explica con más detalle a continuación a modo de ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos, que también divulgan, entre otras, características esenciales para la invención. Muestran:

la Fig. 1 una trayectoria del haz de detección para un microscopio SPIM,

la Fig. 2 tres configuraciones diferentes de la trayectoria del haz de iluminación para un microscopio SPIM, la Fig. 3 detalles de las configuraciones que se muestran en la Fig. 2,

la Fig. 4 una trayectoria adicional del haz de iluminación,

la Fig. 5 una trayectoria del haz de iluminación para una iluminación desde dos lados,

la Fig. 6 los efectos de la iluminación desde dos lados sobre una muestra,

la Fig. 7 un detalle de una trayectoria del haz de detección con dos canales y

la Fig. 8 un detalle de una trayectoria adicional del haz de detección con dos canales.

Descripción detallada de los dibujos

En la Fig. 1 está representada la trayectoria del haz de detección de un microscopio que funciona según el principio de la tecnología SPIM. Un equipo de iluminación del microscopio, con el que se genera una hoja de luz para iluminar un área de muestra P, no se muestra en la Fig. 1, sin embargo forma parte de esto. La hoja de luz está configurada de manera aproximadamente plana en la dirección de un eje de iluminación X de una trayectoria del haz de iluminación y en la dirección de un eje transversal Y, que se encuentra transversal al eje de iluminación X. A lo largo de la trayectoria del haz de detección se muestran elementos de un equipo de detección 1, con los que se detecta la luz que se irradia a lo largo de un eje de detección Z desde el área de muestra P. El eje de iluminación X y el eje de detección Z son aproximadamente perpendiculares entre sí, al igual que el eje transversal Y y el eje de detección Z.

El equipo de detección 1 comprende un objetivo de detección 2 dispuesto en la trayectoria del haz de detección. Otros elementos esenciales en la trayectoria del haz de detección 1 son una unidad de lente de tubo 3 y un detector de área de resolución espacial 4, que puede estar configurado, por ejemplo, como un chip CCD o como un chip CMOS de una cámara correspondiente. La luz se refleja en este detector de área 4 por medio de un elemento óptico de formación de imágenes 5.

Un elemento esencial del equipo de detección 1 es un elemento de detección óptico que está dispuesto espacialmente separado de la lente frontal del objetivo de detección 2 y que puede ajustarse independientemente de éste. Por un lado, el tamaño de un campo de imagen de detección se puede variar continuamente por medio del elemento de detección óptico y, por otro lado, un plano focal de detección en el área de muestra P se puede desplazar continuamente con el elemento de detección. El elemento de detección puede diseñarse de tal manera que cumpla solo una de las dos tareas, ambas tareas se puedan realizar alternativamente o ambas configuraciones se puedan realizar simultáneamente. El elemento de detección puede ser un componente integral del objetivo de detección 2, por ejemplo en forma de dos o más elementos de lente que se pueden mover entre sí, sin que la lente frontal se mueva cuando se mueven estos elementos de lente. Sin embargo, también puede estar dispuesto como componente independiente en la trayectoria del haz a una distancia del objetivo de detección 2. Cuando se ajusta el elemento de detección, es decir, cuando uno o más de sus elementos de lente se desplazan a lo largo de la trayectoria del haz, la lente frontal permanece firmemente en su lugar.

El elemento de detección óptica como componente independiente puede estar configurado, por ejemplo, como se muestra en la figura 1, como un elemento de zoom de detección 6 con dos elementos de lente móviles 6.1 y 6.2 y un elemento de lente fijo 6.3 entre estos. El uso de un elemento de zoom de detección 6 hace posible cambiar fácilmente entre la imagen general y la imagen detallada o bien localizar eficientemente las partes de la muestra que son de interés. Con la ayuda del elemento de zoom de detección 6 también se pueden registrar pilas de imágenes de manera sencilla a lo largo de la dirección de detección Z en diferentes ángulos de muestra, las denominadas pilas de imágenes de vistas múltiples. El elemento de zoom de detección 6 se puede ajustar completamente mediante un motor. Una muestra de imagen intermedia se puede utilizar para la generación automatizada de tablas de posición de actuador, en el que una estructura de transmisión, por ejemplo una estructura de rejilla de transmisión 7, se mueve a un plano de imagen intermedio de la trayectoria del haz de detección. Esta estructura de rejilla de transmisión 7 se muestra en la Fig. 1 en el estado insertado, pero también puede extenderse y no es necesaria para la detección una vez que se han determinado todos los parámetros. Alternativamente, en lugar del objetivo de detección 2 en la trayectoria del haz, también se puede usar un objetivo de calibración no mostrado.

El registro de los denominados registros multipista a diferentes longitudes de onda de la luz también puede facilitarse, ya que puede aprovecharse que pueden generarse diferentes tablas para los ajustes de posición para diferentes longitudes de onda de emisión. Ajustando el elemento de zoom de detección 6 en consecuencia, las aberraciones cromáticas longitudinales del equipo de detección 1 pueden compensarse de esta manera.

Para este fin, ventajosamente, el plano focal en el área de muestra P se desplaza continuamente mediante el elemento de zoom de detección 6. Dado que el elemento de zoom de detección 6 está espacialmente separado del objetivo de detección 2 , las masas a mover son muy pequeñas porque el propio objetivo de detección 2 no tiene que moverse. Un llamado enfoque interno de la trayectoria del haz de detección se puede lograr con la ayuda del elemento de zoom de detección 6, que por su parte está dispuesto de manera fija en la trayectoria del haz de detección. Debido a las menores a mover más pequeñas, las pilas de imágenes se pueden registrar con mayor precisión y velocidad a lo largo de la dirección de detección Z, en la que se debe ajustar el enfoque.

Además, se simplifica el cierre de agua de la cámara de muestra porque el objetivo de detección 2 o la lente frontal del objetivo de detección no se mueve con respecto a la cámara de muestra en la que se almacena la muestra y cuya área de muestra P está iluminada. De este modo se evitan interacciones con la muestra debidas a vibraciones y no actúan fuerzas adicionales sobre la muestra. Además, es posible especificar el plano de foco de detección en función de la temperatura del líquido con el que se llena la cámara de muestra, para lo cual se mide la temperatura de este líquido y se fija una posición de foco en función de ello. Si cambia la temperatura, esto se transmite al elemento de detección a través de una unidad de evaluación y una unidad de control, y el plano de foco de detección se ajusta en consecuencia. De esta forma, es posible compensar la variación del índice de refracción del líquido con el que se llena la cámara de muestra. El agua se usa a menudo como líquido o medio de inmersión. A este respecto, los datos correspondientes con respecto al índice de refracción se pueden depositar para diferentes líquidos, y el ajuste se puede corregir automáticamente si se especifica qué medio de inmersión se utiliza. Este tipo de variación del plano de foco de detección en función de la temperatura se puede utilizar, por ejemplo, en los llamados experimentos de choque térmico, en los que la muestra o el líquido de inmersión se exponen a cambios de temperatura elevados en un tiempo muy corto.

En el ejemplo mostrado, el elemento de zoom de detección 6 está configurado con dos elementos de lente móviles 6.1, 6.2, entre los cuales se encuentra un elemento de lente fijo 6.3, pero también son posibles otras configuraciones con más elementos de lente que pueden desplazarse o con solo un elemento de lente que puede desplazarse. Por ejemplo, ciertamente se puede prever que el elemento de zoom de detección 6 no se utilice para el enfoque interno, es decir, para el ajuste continuo del plano de foco de detección. En este caso, por ejemplo, se puede usar una lente de tubo 8 de la unidad de lente de tubo 3 para ajustar el plano de foco de detección en el área de muestra, es decir, para el enfoque interno. Esta lente de tubo 8 está entonces dispuesta de manera desplazable a lo largo de la trayectoria del haz, como se simboliza mediante la flecha doble. La unidad de lente de tubo 3 también está separada espacialmente del objetivo de detección 2 , así como del elemento de detección o el elemento de zoom de detección 6.

El equipo de detección 1 también tiene otros elementos ópticos, de los cuales se describirán aquí algunos esenciales. Para un diseño compacto, la trayectoria del haz se desvía a través de los espejos de desviación 9 y 10 desde el área de muestra P hacia el detector de área de resolución espacial 4. Mediante el acoplador de haz 11 se puede acoplar opcionalmente una trayectoria de haz adicional, que se puede utilizar para la iluminación de luz incidente. Además, se puede disponer un divisor de haz 13 dicroico en la trayectoria del haz entre el elemento de zoom 6 y el elemento de formación de imagen 5 en el rango hiperfocal, es decir, en un rango en el que el haz está lo más colimado posible, pero no necesariamente completamente colimado - 12 de la trayectoria del haz, que sirve como un medio de división para dividir la trayectoria del haz de detección en dos trayectorias parciales del haz 14 y 15, en donde un detector de área de resolución espacial en el que se puede generar una imagen de la luz que se va a detectar, se dispone en las trayectorias parciales del haz 14 y 15. En la Fig. 1 sólo se muestran los elementos ópticos para la trayectoria parcial del haz 14, la trayectoria parcial del haz 15 se puede construir de forma idéntica.

A este respecto, el divisor de haz dicroico tiene un espesor de más de 3 mm, por lo que se pueden evitar los problemas que se presentan en el estado de la técnica, tales como errores de imagen debido a la aparición de tensiones superficiales. Los elementos ópticos de formación de imágenes están dispuestos en cada una de las dos trayectorias parciales del haz 14 y 15 para la formación de imágenes de la luz a detectar en el detector de área respectivo. En al menos una de las dos trayectorias parciales del haz 14 o 15 también pueden estar dispuestas opcionalmente placas oscilantes 16 y 17, con las que puede ajustarse un desplazamiento en las dos direcciones ortogonales transversales al eje de detección Z. De esta forma, los valores de medición leídos por los dos detectores de área se pueden superponer automáticamente. Esto tiene sentido, por ejemplo, si las imágenes para dos longitudes de onda de emisión diferentes deben registrarse por separado y superponerse. Para ello está representado en la Fig. 1 también en la trayectoria parcial del haz 14 un filtro de emisión 18 opcional, con el que se puede seleccionar una longitud de onda. En la otra trayectoria parcial del haz 15 puede estar dispuesto un filtro de emisión 18 correspondiente que selecciona una longitud de onda diferente. Para ajustar correctamente la superposición de imágenes, también se puede usar una muestra de imagen intermedia para la calibración, en la que la estructura de rejilla de transmisión 7 mencionada anteriormente se conecta en un plano de imagen intermedio de la trayectoria del haz de detección o un objetivo de calibración no mostrado se utiliza en lugar del objetivo de detección 2.

Además, los elementos ópticos de formación de imágenes también pueden estar dispuestos de forma desplazable en las respectivas trayectorias parciales del haz, de modo que el enfoque puede adaptarse a cada detector de área respectivo.

En la Fig. 2 se muestra un equipo de iluminación 19 con el que se genera una hoja de luz para iluminar un área de muestra P, que está configurada de manera aproximadamente plana en la dirección de un eje de iluminación X de una trayectoria de haz de iluminación y en la dirección de un eje transversal Y transversal al eje de iluminación X. Por motivos de claridad se ha prescindido de la representación de un equipo de detección 1, como se muestra a modo de ejemplo en la Fig. 1, sin embargo ambos pueden combinarse sin más entre sí, en donde se realiza una orientación de manera correspondiente a los sistemas de coordenadas mostrados en las figuras 1 y 2.

El equipo de iluminación 19 que se muestra en la Fig. 2 se muestra a este respecto en tres configuraciones diferentes A, B y C. El equipo de iluminación 19 comprende a este respecto en la trayectoria del haz de iluminación al menos un objetivo de iluminación 20 y un elemento de iluminación que está dispuesto espacialmente separado de una lente frontal del objetivo de iluminación 20 y puede ajustarse independientemente de este último, por medio del cual la expansión de la hoja de luz en la dirección del eje de detección Z puede variar continuamente y/o por medio del cual un plano de foco de iluminación puede desplazarse continuamente en el área de muestra P. El elemento de iluminación puede ser un componente integral del objetivo de iluminación 20, por ejemplo en forma de dos o más elementos de lente que se pueden mover entre sí, sin que la lente frontal se mueva cuando se mueven estos elementos de lente. Sin embargo, también puede estar dispuesto como componente independiente en la trayectoria del haz a una distancia del objetivo de iluminación 20. Cuando se ajusta el elemento de iluminación, es decir, cuando uno o más de sus elementos de lente se desplazan a lo largo de la trayectoria del haz, la lente frontal permanece firmemente en su lugar.

Con el elemento de iluminación, la hoja de luz se puede ajustar continuamente según el tamaño del campo de la imagen o se puede fijar el foco. Esto es posible de manera sencilla, por ejemplo, si el elemento de iluminación está configurado como elemento de zoom de iluminación 21. Con esto, especialmente si el equipo de detección 1 también tiene un elemento de zoom de detección 6, la apertura numérica de la iluminación se puede ajustar de manera óptima y continua al tamaño del campo de imagen de detección. En comparación con otras soluciones, como los telescopios intercambiables, el elemento de zoom de iluminación 21 se puede usar para ajustar continuamente la apertura numérica. En comparación con otras soluciones como las pantallas, a este respecto no se pierde luz de excitación, por lo que al final solo se requiere una potencia menor de la fuente de iluminación, generalmente un láser. De esta manera, se reduce la carga de muestra, se pueden lograr densidades de potencia más altas y los objetivos de iluminación 20 necesitan cambiarse con menos frecuencia. La relación entre el tamaño del campo de la imagen de detección y el tamaño del campo de la imagen de iluminación se puede ajustar a este respecto de modo que la relación de los grosores de la hoja de luz se pueda ajustar de 1 en el centro a 2 en el borde del campo de visión y se pueda mantener constante cuando el tamaño del campo de la imagen varía.

Si, con la ayuda del elemento de iluminación, el plano de foco de iluminación en el área de muestra P también se puede desplazar continuamente, este ajuste también se realiza como enfoque interno, similar al elemento de zoom de detección 6, en el que uno o más elementos de lente del elemento de zoom de iluminación 21 se desplazan uno contra otro - el cuello de la hoja de luz también puede desplazarse continuamente sobre el campo de visión en la dirección del eje de iluminación X, esto se denomina barrido de cuello. La resolución más alta en la dirección de detección Z se puede lograr a este respecto en todo el campo de visión.

En combinación con una iluminación de dos lados a lo largo del eje de iluminación X, los cuellos pueden posicionarse mediante el enfoque interno hasta aprox. % y aproximadamente % del campo de visión. De esta manera, la variación en el grosor de la hoja de luz se puede mantener significativamente más baja que en el caso de iluminación unilateral. Finalmente, de manera análoga al enfoque dependiente de la temperatura, que se describió en relación con el elemento de zoom de detección 6, también es posible compensar la posición del cuello de la hoja de luz dependiendo de la temperatura del medio de inmersión o diferentes espesores ópticos del medio de inclusión para la muestra.

Para adaptar el tamaño del campo de imagen del lado de iluminación o la extensión de la hoja de luz al tamaño del campo de imagen de detección, es ventajoso acoplar a este respecto el elemento de zoom de iluminación 21 y el elemento de zoom de detección 6 a través de un circuito de control para ajustar el elemento de zoom de iluminación 21 dependiendo del tamaño del campo de imagen de detección especificado por el elemento de zoom de detección 6. En este caso, el tamaño del campo de imagen en el lado de la iluminación se adapta automáticamente a este cambio cuando hay un cambio en el tamaño del campo de imagen de detección, que es realizado por un observador, por ejemplo manualmente. Por lo tanto, el observador puede prescindir de un ajuste del elemento de zoom de iluminación 21 en el lado de la iluminación, esto lo realiza el circuito de control, de modo que siempre se establece la apertura numérica óptima para la iluminación.

El elemento de zoom de iluminación 21 mostrado en la figura 2 está configurado con al menos tres elementos de lente 21.1, 21.2 y 21.3 que se pueden desplazar independientemente uno de otro, así como un elemento de lente fijo 21.4. Las trayectorias del haz A, B y C muestran tres posiciones diferentes del elemento de zoom de iluminación 21. En este caso, es necesario el uso de tres elementos desplazables para garantizar no solo el aumento correcto sino también la correcta formación de imágenes de la pupila y la imagen intermedia, por lo que se pueden establecer un total de tres grados de libertad. Si hay que tener en cuenta menos grados de libertad, son suficientes menos elementos móviles.

El efecto del elemento de zoom de iluminación 21 se muestra con más detalle en la Fig. 3 para las tres configuraciones diferentes A, B y C. El elemento de zoom de iluminación 21 desarrolla su efecto tanto en el plano delimitado por el eje de iluminación X y el eje transversal Y, como se muestra en la Fig. 3a, como en el plano delimitado por el eje de iluminación X y el eje de detección Z, como se ilustra en la Fig. 3b. En la Fig. 3b puede verse cómo el grosor de la hoja de luz se hace más delgado desde la posición A a través de la posición B hasta la posición C del elemento de zoom de iluminación 21 ajustando la abertura de iluminación. En la Fig. 3a se muestra la adaptación resultante del ajuste del elemento de zoom de iluminación 21 en el plano X-Y.

Para aumentar aún más la flexibilidad con respecto a la selección de la apertura de iluminación, el equipo de iluminación 19 también puede contener un cambiador de telescopio 22, que aumenta correspondientemente el rango de aperturas alcanzables. Alternativa o adicionalmente, el objetivo de iluminación 20 también se puede intercambiar para producir un efecto similar.

El equipo de iluminación 19 que se muestra en la Fig. 2 también comprende primeros medios generadores de hoja de luz, que a su vez contienen medios para generar un haz de luz con simetría de rotación y medios de barrido para escanear el área de muestra en forma de una hoja de luz a lo largo del eje transversal Y en un intervalo de tiempo predeterminado. Si bien no se muestran los medios para generar el haz de luz con simetría de rotación, los medios de barrido de la estructura que se muestra en la Fig. 2 comprenden un espejo de barrido 23, con el que se conduce el haz de luz con simetría de rotación sobre la muestra y concretamente tan rápido que el escáner barra la muestra durante el tiempo de integración - es decir, el tiempo que transcurre antes de que los valores medidos se lean en el detector - al menos una vez, pero preferiblemente también varias veces, pero en cualquier caso siempre por completo, es decir, el tiempo de integración no debe terminar mientras el haz de luz todavía barre la muestra. El tiempo de integración, el tiempo de barrido y las ejecuciones de barrido se sincronizan entre sí para que el intervalo de tiempo especificado corresponda esencialmente al tiempo de integración. Sin embargo, el efecto del espejo de barrido 23 no se muestra en la Fig. 2 o la Fig. 3.

La luz de iluminación que sale del espejo de barrido 23 se refleja en el área de muestra P a través de un objetivo de barrido 24, un elemento de lente de tubo 25 y el objetivo de iluminación 20. Para hacer la estructura lo más compacta posible, también se utilizan varios espejos 26 para la desviación del haz.

Además del espejo de barrido 23, el equipo de iluminación 19 también está provisto opcionalmente de segundos medios generadores de hojas de luz, que comprenden un primer elemento óptico astigmático, en el ejemplo un primer elemento óptico cilíndrico 27 con al menos una lente astigmática, en el ejemplo una lente cilíndrica, para generar una hoja de luz estática. Además, se proporcionan medios de selección no mostrados, con los que se pueden seleccionar los primeros o los segundos medios de generación de hoja de luz o ambos juntos para generar la hoja de luz. por tanto, el espejo de barrido 23, el elemento óptico cilíndrico 27 o ambos se utilizan juntos. El elemento óptico cilíndrico 27 se puede diseñar, por ejemplo, de tal manera que se pueda mover hacia adentro o hacia afuera de la trayectoria del haz desde el lateral. De esta forma, se pueden combinar las ventajas descritas explícitamente de ambos métodos para la generación de hojas de luz. En lugar de una lente cilíndrica, el primer elemento óptico con efecto astigmático también puede comprender una lente de Powell u otras lentes con efecto astigmatismo.

En particular, la cobertura general del campo de imagen en el área de muestra P está acoplada al elemento óptico cilíndrico 27, que se usa en este caso al mismo tiempo con el espejo de barrido 23 en la estructura mostrada. Sin embargo, el elemento óptico cilíndrico 27 no puede cubrir todo el campo de imagen en todas las posiciones del elemento de zoom de iluminación 21.

En la Fig. 2, el equipo de iluminación 19 comprende además medios de barrido angular opcionales. En la realización que se muestra en la Fig. 2, los medios de barrido angular comprenden un espejo de barrido angular 28 rápidamente conmutable. El ángulo que la hoja de luz encierra con el eje de iluminación X puede variarse por medio del espejo de barrido angular 28. Un escáner de resonancia o poligonal, por ejemplo, puede usarse como el espejo de barrido angular 28, también sobre una base microelectromecánica. Si se utiliza el primer elemento óptico cilíndrico 27, se dispone conjugado con el plano de foco de iluminación. Con la ayuda del espejo de barrido angular 28, la muestra se puede iluminar desde diferentes ángulos, lo que se puede usar para reducir las rayas. El efecto del espejo de barrido angular 28 se ilustra en la Fig. 2 para la configuración C mediante las dos trayectorias del haz 29 y 30. Mientras el espejo de barrido angular está en la posición cero en la trayectoria del haz 29, por tanto no desviado, la trayectoria del haz 30 muestra el desarrollo cuando el espejo de barrido angular 28 se desvía alejándose de cero. Esto se muestra de nuevo para todas las configuraciones A, B, C en la Fig. 3a. El espejo de barrido angular 28 normalmente trabaja a frecuencias de 10 kHz, el espejo de barrido 23 para generar la hoja de luz con una frecuencia entre aproximadamente 1 kHz y 2 kHz.

El uso del elemento óptico cilíndrico 27 también tiene ventajas en el sentido de que artefactos de pulsación que se producen eventualmente originados con el uso simultáneo del espejo de barrido angular 28 mediante una activación asíncrona del espejo de barrido angular 28 y el espejo de barrido 23 conmutable rápidamente se revisten parcialmente por el elemento óptico cilíndrico 27 introducido en la trayectoria del haz. Debido a la paralelización del haz de luz mediante el uso del elemento óptico cilíndrico 27, la intensidad de la iluminación se reduce en comparación con el uso exclusivo del espejo de barrido 23 conmutable rápidamente, lo que da como resultado una mejor protección de la muestra.

El efecto del elemento óptico cilíndrico 27 en combinación con el espejo de barrido 23 conmutable rápidamente se muestra de nuevo en detalle en la Fig. 4, donde sin embargo los elementos individuales del equipo de iluminación se representan solo esquemáticamente mediante marcadores de posición individuales. A este respecto queda claro que cuando se usa un elemento óptico cilíndrico 27 solo con la posición del elemento de zoom de iluminación 21 descrita en este caso, solo se puede cubrir una parte del campo de la imagen, por lo que se debe usar el espejo de barrido 23 rápido para una cobertura completa. Si el espejo de barrido 23 rápido no se desvía, la luz se refleja en el área de muestra P a lo largo del área del haz 31, cuya delimitación se muestra en este caso. La luz se puede desviar a lo largo del área del haz 32 hacia el área de muestra P con una desviación distinta de cero. Mediante el movimiento de barrido adicional del espejo de barrido 23 puede conseguirse por tanto aún una iluminación homogénea del área de muestra P. Sin embargo, si no se utiliza el espejo de barrido 23, se hace posible una iluminación estroboscópica muy rápida del área de muestra seleccionada, que de otro modo habría sido impedida por el lento movimiento del espejo de barrido 23 con respecto a ella.

En la trayectoria del haz de iluminación del equipo de iluminación 19 de la Fig. 2 está dispuesto en este caso adicionalmente también aún un segundo elemento óptico que actúa astigmaticamente, configurado en este caso a modo de ejemplo como segundo elemento óptico cilíndrico 33. En lugar de un elemento óptico cilíndrico 33 con al menos una lente cilíndrica, también se pueden utilizar elementos astigmáticos con lentes Powell. Este segundo elemento óptico cilíndrico es también un elemento opcional. Sirve para formar imágenes del espejo de barrido 23 rápido en un plano de pupila y para formar imágenes del espejo de barrido angular 28 en un plano de foco de iluminación. Sin este segundo elemento óptico cilíndrico 33 adicional, un elemento de corrección, el espejo de barrido 23 rápido y un espejo de conmutación 34 conmutable posiblemente dispuesto en la misma posición o equivalente en la trayectoria del haz de iluminación - para el ajuste de la hoja de luz y/o para desviar la luz de iluminación en una segunda trayectoria del haz de iluminación para la iluminación desde dos lados - sólo aproximadamente en el plano de la pupila de la óptica de iluminación. La consecuencia de esto es que una cierta proporción de un movimiento angular se superpone también a un movimiento espacial en el área de muestra P generada por uno de los dos espejos 23 o 34. Esto puede tener un efecto desventajoso, en particular para el espejo de desviación 34, que también dado el caso puede ser responsable de ajustar la hoja de luz en la dirección de detección, ya que dependiendo de la posición del espejo, la hoja de luz puede colocarse en un ángulo con respecto al plano de detección.

Sin embargo, dado que la iluminación en la microscopía de hoja de luz tiene inherentemente propiedades astigmáticas, estas propiedades pueden aprovecharse para lograr una formación de imagen de pupila exacta de ambos espejos 23 y 34. El elemento óptico cilíndrico 33 sólo actúa sobre un eje y está diseñado y posicionado de tal manera que el espejo de barrido o deflector, que actúa también en este eje, se refleja en la pupila. La trayectoria del haz también está diseñada de tal manera que el espejo que actúa en el otro eje, en el que el elemento óptico cilíndrico 33 no tiene influencia en su efecto, también se refleja exactamente. De este modo se puede evitar una superposición de componentes angulares en el caso de un desplazamiento local en el área de muestra P. El elemento óptico cilíndrico 33 también se puede diseñar de tal manera que el espejo de barrido angular 28 se refleja exactamente en el plano de la muestra. Por consiguiente, en el área de muestra P se evita una superposición del movimiento angular con un movimiento local. Dado que los dos espejos 23 y 34 están dispuestos muy cerca uno del otro, el elemento óptico cilíndrico 33 está configurado con una distancia focal muy grande.

La Fig. 5 muestra un microscopio que puede tener, por ejemplo, un equipo de iluminación 19 como se describe en la Fig. 2 y un equipo de detección 1, por ejemplo como en la Fig. 1, en el que el equipo de iluminación 19 comprende adicionalmente aún medios para desviar luz de iluminación en otra trayectoria del haz de iluminación 36 y para generar una hoja de luz adicional con las propiedades correspondientes, que se extiende por tanto en dirección del eje de iluminación X y en la dirección del eje transversal Y de manera aproximadamente plana. En la trayectoria del haz de iluminación 35 y en la otra trayectoria del haz de iluminación 36 están dispuestos elementos ópticos sustancialmente idénticos, ambas trayectorias del haz tienen también las mismas longitudes de trayectorias ópticas; la hoja de luz y la hoja de luz adicional están alineadas entre sí de tal manera que iluminan el área de muestra P en el mismo eje de iluminación X desde direcciones opuestas.

Además, el equipo de iluminación 19 también incluye medios de conmutación para cambiar la luz de iluminación entre la trayectoria del haz de iluminación 35 y la trayectoria adicional del haz de iluminación 36. Los medios de conmutación comprenden un elemento de conmutación rápidamente conmutable con un tiempo de conmutación de menos de 10 ms, en donde un tiempo de integración predeterminado del detector de área 4 y el tiempo de conmutación del elemento de conmutación están sincronizados entre sí de tal manera que el área de muestra P se ilumina al menos una vez desde cada dirección en el eje de iluminación X durante el tiempo de integración.

El elemento de conmutación está configurado en este caso como un espejo de conmutación 34 rápidamente conmutable. Por ejemplo, el espejo de conmutación 34 puede ser un espejo accionado galvanométricamente. El espejo de conmutación 34 está dispuesto a este respecto en un plano conjugado con el plano de la pupila de iluminación. De esta manera, se puede lograr una iluminación de dos haces conmutable rápidamente. Dependiendo de la posición del espejo de conmutación 34, la luz se dirige hacia la trayectoria del haz de iluminación 35 o - con la ayuda de un espejo deflector 37 - hacia la otra trayectoria del haz de iluminación 36. Según la posición del espejo de conmutación 34, la luz alcanza así el objetivo de iluminación 20 o el objetivo de iluminación 20'. Ambas trayectorias del haz están diseñadas con los mismos elementos ópticos y las mismas longitudes de trayectoria óptica.

En lugar de un espejo de conmutación 34, también se pueden usar otros elementos de conmutación, por ejemplo, elementos de conmutación acústico-ópticos o electro-ópticos, que pueden funcionar tanto de manera reflexiva como transmisiva.

Aunque con esta construcción no es posible la iluminación simultánea de las muestras desde ambos lados, se puede lograr una iluminación casi simultánea, si fuera necesario, debido al hecho de que el espejo de conmutación 34 tiene tiempos de conmutación muy cortos. Para hacer esto, la iluminación solo tiene que cambiarse una vez de una trayectoria del haz de iluminación a la otra dentro del tiempo de integración de la cámara, de modo que la muestra aparezca en la imagen iluminada desde ambos lados simultáneamente, aunque realmente se realizó una iluminación secuencial.

La muestra en el área de muestra P se ilumina por tanto eficazmente de manera simultánea desde direcciones opuestas a lo largo del eje de iluminación X, ya que durante el tiempo de integración del detector de área 4 la luz de iluminación se cambia al menos una vez desde la trayectoria del haz de iluminación a la trayectoria adicional del haz de iluminación.

En la Fig. 6, por ejemplo, se muestra una muestra 38 para la que la iluminación secuencial no es absolutamente necesaria. La Fig. 6a muestra la imagen de muestra ideal sin artefactos de dispersión. La Fig. 6b muestra las imágenes reales con iluminación de hoja de luz unilateral desde la izquierda (I) y la derecha (II). La muestra 38 se dispersa en este caso con tanta fuerza que las imágenes generadas con iluminación unilateral no muestran estructuras comunes; en este caso, la generación significativa de una imagen común no es posible o sólo es posible con dificultad. Este caso también ocurre cuando hay un entorno que bloquea la luz en el centro de la muestra que es esencialmente opaco. Este es parcialmente el caso de los embriones de pez cebra, por ejemplo, donde el saco vitelino del embrión bloquea la luz. La iluminación simultánea desde ambos lados puede tener sentido en este caso debido a una posible ganancia en velocidad que resulta de un registro de imágenes más rápido y una eliminación del procesamiento de imágenes posterior. La iluminación simultánea real no es posible con la ayuda del espejo de conmutación 34 rápido descrito anteriormente, sino un registro casi simultáneo, que corresponde efectivamente a la iluminación simultánea. En este caso, durante el tiempo de integración de la cámara, se realiza una conmutación rápida que el usuario apenas puede distinguir en la imagen final.

Sin embargo, por otra parte, debido al hecho de que no es posible una verdadera iluminación simultánea de la muestra, se evitan las desventajas que se producen en algunas otras muestras. Tal muestra está representada por la muestra 39 en la Fig. 6, puede tratarse de un grupo de células, por ejemplo. La Fig. 6a muestra la imagen de muestra ideal con estructuras nítidas en toda el área de muestra. La Fig. 6c muestra las imágenes reales con iluminación de hoja de luz unilateral desde la izquierda (I) y la derecha (II). La dispersión está tan pronunciada en este caso que con la iluminación unilateral todas las partes de la muestra permanecen visibles, pero se puede notar una pérdida de calidad de izquierda a derecha o de derecha a izquierda. La iluminación simultánea de dos haces no es apropiada en este caso, ya que la pérdida de calidad debe evitarse en la medida de lo posible. La iluminación secuencial tiene más sentido. Sin embargo, la iluminación secuencial debe tener lugar muy rápidamente, de modo que cuando se registra una pila de imágenes en la dirección de detección Z, es posible iluminar cada plano individualmente desde ambos lados. Si bien la conmutación de espejos con motores tiene tiempos de conmutación que son demasiado largos y las vibraciones también pueden transmitirse al espejo, lo que reduce la calidad, los tiempos de conmutación necesarios de menos de 10 ms se pueden lograr fácilmente con la ayuda de espejos accionados galvanométricamente rápidos.

La estructura mostrada en la Fig. 5 también tiene la ventaja de que el espejo de conmutación 34 está dispuesto en un plano de pupila y, por lo tanto, el desplazamiento local generado por la desviación del espejo de conmutación 34 y la lente de barrido 24 se utiliza para la conmutación. Por otro lado, por supuesto, también son concebibles estructuras en las que el desfase angular se utilice directamente para la conmutación. Otra ventaja de la estructura mostrada es que el espejo de conmutación 34 también se puede utilizar al mismo tiempo para el ajuste de la hoja de luz en la dirección de detección Z por medio de un ligero desplazamiento.

El equipo de iluminación que se muestra en la Fig. 5 también puede comprender medios generadores de hojas de luz, no representados, para generar un haz de luz con simetría de rotación - por ejemplo, por medio de un espejo de barrido 23 y el objetivo de barrido 24 - para barrer el área de muestra a lo largo del eje transversal en forma de hoja de luz, y opcionalmente - por ejemplo en forma de un espejo de barrido angular 28 - medios de barrido angular, por medio de los cuales se puede variar un ángulo que la hoja de luz encierra con el eje de iluminación.

A este respecto puede ser ventajoso que el equipo de iluminación comprenda un elemento óptico astigmático dispuesto en la trayectoria del haz de iluminación o en la trayectoria del haz de iluminación adicional, preferentemente un elemento óptico cilíndrico para la formación de imágenes correcta del espejo de conmutación o del espejo de barrido en un plano de pupila. Mientras que de uno de los dos espejos se forman correctamente imágenes en el plano de la pupila, la formación de imágenes del otro espejo es incorrecta sin un elemento de efecto astigmático adicional de este tipo; se trata de una óptica correctora para formar correctamente imágenes de ambos espejos.

También surge una posible aplicación interesante cuando el detector de área dispone de áreas de píxeles legibles por separado para las cuales se pueden especificar diferentes tiempos de integración, como es el caso, por ejemplo, con los detectores de área modernos basados en CMOS. En este caso, el tiempo de conmutación del elemento de conmutación también se puede sincronizar adicionalmente con estos diferentes tiempos de integración. Esto también se puede combinar con la realización mostrada en la Fig. 4.

Los medios de división para dividir la trayectoria del haz de detección en dos trayectorias parciales del haz 14 y 15 se muestran en las Fig. 7 y 8, en donde en las trayectorias del haz de detección 14 y 15 está dispuesto en cada caso un detector de área 4 o bien 4' con resolución espacial, en el que se forma la imagen de la luz que va a detectarse y en donde los medios de división comprenden al menos un divisor de haz dicroico 13 y 40 respectivamente. Ambas construcciones pueden integrarse en un equipo de detección 1, como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 1, y que se puede combinar con un equipo de iluminación 19, como se muestra en la Fig. 2.

Al dividir la trayectoria del haz de detección en dos trayectorias parciales del haz 14 y 15, se puede detectar un rango espectral diferente en cada caso para las dos trayectorias parciales del haz 14, 15 mientras se suprime simultáneamente la luz de excitación con filtros de emisión y filtros de paso de banda. Esto hace posible registrar varias áreas de color al mismo tiempo, por ejemplo, si la muestra está marcada con fluoróforos de diferentes colores. Si se utilizan más de dos colores, también se pueden realizar registros secuenciales en el llamado modo multipista cambiando las líneas de excitación y posiblemente también el divisor de haz dicroico, los filtros de paso de banda o los filtros de emisión.

Los detectores de área de resolución espacial 4 y 4' pueden ser CCD, EMCCD, chips CMOS o similares, que pueden integrarse en cámaras de usuario. Convenientemente, se proporciona una interfaz de montura C estándar (no mostrada) para unir tales cámaras, con el fin de conectar diferentes tipos de cámaras. Las tolerancias de la montura C de 0,2 mm lateralmente y la orientación, es decir, la rotación de la imagen de la cámara, se pueden compensar, por ejemplo, con tornillos de ajuste.

En la realización mostrada en la Fig. 7, el divisor de haz dicroico 13 está dispuesto en la trayectoria del haz en el espacio casi infinito 12 con respecto a los detectores de área de resolución espacial 4 y 4'. El divisor de haz dicroico 13 tiene un espesor de al menos 3 mm, preferiblemente de al menos 4 mm. De esta manera, pueden eliminarse los artefactos de imagen conocidos en el estado de la técnica, que son provocados por tensiones superficiales en el divisor de haz, en particular desenfoque y astigmatismo. Los elementos ópticos de formación de imágenes 5 o bien 5' están dispuestos en cada una de las dos trayectorias parciales del haz 14 y 15 para la formación de imágenes de la luz a detectar en el detector de área 4, 4' respectivo.

Los elementos ópticos de formación de imágenes 5 y 5' pueden estar dispuestos opcionalmente - como se muestra en este caso - de forma desplazable en las respectivas trayectorias parciales del haz 14 y 15, de modo que pueda ajustarse el enfoque en el respectivo detector de área. Esto puede ser ventajoso, por ejemplo, cuando se debe corregir un error de color longitudinal en la óptica de detección. Dado que solo se detectan rangos espectrales o longitudes de onda individuales, es posible un ajuste muy preciso a la longitud de onda a detectar en cada caso. Si existen además otros medios para desplazar el foco, como por ejemplo un elemento de zoom de detección 6, basta con disponer un elemento de formación de imagen desplazable en una de las dos trayectorias parciales del haz, pudiendo entonces fijarse el otro.

En al menos una de las dos trayectorias parciales del haz 14 y 15 también hay al menos una placa oscilante para generar un desplazamiento del haz a lo largo de dos direcciones ortogonales transversales al eje de detección Z. Si bien cuando se usa solo una placa oscilante, esta se tiene que colocar en las dos direcciones ortogonales, también se pueden usar dos placas oscilantes con un efecto equivalente. El desfase del haz en una dirección se ajusta entonces con una de las dos placas, y el desfase del haz en la dirección ortogonal a esta se ajusta con la otra. En la Fig. 7, para una de las dos trayectorias del haz, la trayectoria del haz de transmisión 14, dos placas oscilantes 16 y 17 están dispuestas transversalmente al eje de detección Z para generar un desplazamiento del haz a lo largo de dos direcciones mutuamente ortogonales.

La placa oscilante 16 se puede utilizar, por ejemplo, para generar un desplazamiento del haz en la dirección X, y la placa oscilante 17 se puede utilizar para generar un desplazamiento del haz en la dirección Y. En la otra trayectoria parcial del haz 15, la trayectoria del haz reflejado, no se requieren placas oscilantes. De esta manera, se puede producir una superposición de imágenes de los dos canales de detección, que también puede tener lugar automáticamente si la calibración se ha realizado previamente con ayuda de un objetivo de calibración dispuesto de manera conmutable en un plano de imagen intermedio de la trayectoria del haz de detección o una estructura de transmisión correspondiente, por ejemplo, una estructura de rejilla de transmisión 7. Una vez que se ha determinado el desplazamiento del haz, las imágenes de los dos detectores de área 4, 4' se pueden superponer fácilmente y solo se muestra la superposición al usuario.

Puede lograrse un ajuste de enfoque no solo desplazando los elementos ópticos de formación de imágenes 5, 5', sino también disponiendo una estructura de cuña 41 compuesta de dos cuñas ópticas que se proyectan en la trayectoria del haz y desplazables transversalmente a la dirección del haz. En este sentido se trata de dos cuñas de vidrio simples que se pueden acercar o alejar una de la otra. De esta manera, una trayectoria de vidrio adicional variable entra y sale de la trayectoria del haz, lo que provoca un desplazamiento correspondiente del plano de foco del elemento óptico de formación de imágenes 5 o 5'. La estructura de cuña 41 está dispuesta entre el respectivo elemento óptico de formación de imágenes 5 o 5' y el correspondiente detector de área 4 o 4' en la parte divergente de la trayectoria del haz, pero no se muestra en la Fig. 7.

En la Fig. 8 se muestra otra realización para la detección de dos canales. En este caso se encuentra un divisor de haz dicroico 40 con cualquier espesor en la parte divergente de la trayectoria del haz de formación de imágenes, es decir, entre el elemento óptico de formación de imágenes 5 y los detectores de área 4 y 4'. En una de las dos trayectorias parciales del haz, a saber, la trayectoria parcial del haz 14 para la luz emitida por el divisor del haz, entre el detector de área 4 y el divisor del haz 40 también está dispuesta una placa de vidrio 42, que encierra un ángulo de aproximadamente 90 ° con el divisor de haz 40. Esta placa de vidrio 42 tiene el mismo espesor que el divisor de haz 40, de esta forma se vuelve a corregir el astigmatismo provocado por el divisor de haz 40 en la dirección de transmisión.

En una forma de realización ventajosa, la placa de vidrio 42 se puede utilizar al mismo tiempo como placa oscilante para ajustar el desplazamiento entre los dos canales de la cámara. La placa de vidrio 42 solo es necesaria en la trayectoria del haz de transmisión, es decir, en la trayectoria parcial del haz 14 que refleja la luz transmitida por el divisor de haz 40 en el detector de área 4. La estructura de cuña 41 mencionada ya anteriormente está dispuesta en la trayectoria parcial del haz 15 reflejada en la Fig. 8, con la que mediante desplazamiento de las dos cuñas de vidrio acercándose o alejándose una de otra - indicado por la doble flecha - puede desplazarse el plano de foco del elemento óptico de formación de imágenes 5. Una estructura de cuña 41 de este tipo también puede estar dispuesta en la trayectoria del haz de transmisión, en cuyo caso, por ejemplo, puede prescindirse de un desplazamiento del elemento óptico de formación de imágenes 5, este no debe estar configurado de forma desplazable. En principio, sin embargo, es suficiente hacer desplazable el elemento óptico de formación de imágenes 5 e introducir una estructura de cuña 41 en una de las dos trayectorias del haz. Mientras que, por ejemplo, como se muestra en la Fig. 8, el plano de foco para la trayectoria parcial del haz de transmisión se modifica solo con la ayuda del elemento óptico de formación de imágenes 5, el plano de foco para la trayectoria del haz reflejado se puede ajustar aún más utilizando la estructura de cuña 41.

Se entiende que las características mencionadas anteriormente no solo se pueden utilizar en las combinaciones indicadas, sino también en otras combinaciones o por sí mismas sin abandonar el marco de la presente invención. Los elementos individuales descritos anteriormente pueden combinarse entre sí, y también es posible usar elementos individuales mientras se prescinde de otros elementos mostrados, por ejemplo, es posible prescindir de un dispositivo de zoom mientras se usan dos trayectorias parciales del haz de detección al mismo tiempo. La combinación de una iluminación desde dos direcciones también se puede combinar con detección en dos canales, esto también con los elementos de zoom de iluminación y detección con enfoque interno simultáneo. En general, las disposiciones descritas anteriormente tienen mejoras significativas con respecto a las disposiciones conocidas en el estado de la técnica.

Lista de referencias

1 equipo de detección

2 objetivo de detección

3 unidad de lente de tubo

4, 4' detector de área

5, 5' elemento de formación de imágenes

6 elemento de zoom de detección

7 estructura de rejilla de transmisión

8 lente de tubo

9, 10 espejo deflector

11 acoplador de haz

12 rango hiperfocal

13 divisor de haz

14, 15 trayectoria parcial del haz

16, 17 placa oscilante

18 filtro de emisión

19 equipo de iluminación

20 objetivo de iluminación

21 elemento de zoom de iluminación

22 relé alternador de telescopio

23 espejo de barrido

24 objetivo de barrido

25 elemento de lente de tubo

26 espejo

27 elemento óptico cilíndrico

28 espejo de barrido angular

29, 30 trayectoria del haz

31,32 áreas de radiación

33 elemento óptico cilíndrico

34 espejo de conmutación

trayectoria del haz de iluminación trayectoria adicional del haz de iluminación

espejo de desviación

, 39 muestra

divisor de haz

estructura de cuña

placa de vidrio

Claims

REIVINDICACIONES

1. Microscopio, que comprende

- un equipo de iluminación (19), con el que se genera una hoja de luz para iluminar un área de muestra (P) por medio de un espejo de barrido (23), que se extiende de manera aproximadamente plana en la dirección de un eje de iluminación (X) de una trayectoria del haz de iluminación (35) y en la dirección de un eje transversal (Y), que es transversal al eje de iluminación (X),

- un equipo de detección (1) con el que se detecta la luz que se irradia a lo largo de un eje de detección (Z) de una trayectoria del haz de detección desde el área de muestra (P), situándose el eje de iluminación (X) y el eje de detección (Z), así como el eje transversal (Y) y el eje de detección (Z), en un ángulo distinto de cero entre sí,

- comprendiendo el equipo de detección (1 ) un objetivo de detección (2 ) en la trayectoria del haz de detección, en donde

- el equipo de iluminación (19) comprende medios para desviar la luz de iluminación en una trayectoria adicional del haz de iluminación (36) y para generar una hoja de luz adicional, extendiéndose la hoja de luz adicional de manera aproximadamente plana en la dirección del eje de iluminación (X) y en la dirección del eje transversal (Y), en donde la trayectoria del haz de iluminación (35) y la trayectoria adicional del haz de iluminación (36) están formadas por elementos ópticos esencialmente idénticos y presentan las mismas longitudes de camino óptico, y en donde la hoja de luz y la hoja de luz adicional están orientadas entre sí de tal manera que iluminan el área de muestra (P) sobre el mismo eje de iluminación (X) desde direcciones opuestas,

- en donde los medios para desviar la luz de iluminación comprenden un elemento de conmutación que conmuta la luz de iluminación entre la trayectoria del haz de iluminación (35) y la trayectoria adicional del haz de iluminación (36) y/o desplaza la hoja de luz en la dirección del eje de detección con fines de ajuste,

- en donde el elemento de conmutación está dispuesto en la trayectoria del haz de iluminación en la proximidad inmediata del espejo de barrido o está dispuesto en una posición equivalente en la trayectoria del haz de iluminación a la del espejo de barrido.

2. Microscopio según la reivindicación 1, caracterizado por que el elemento de conmutación está diseñado como espejo de barrido adicional.

3. Microscopio según la reivindicación 2, caracterizado por que el espejo de barrido adicional está colocado en la proximidad inmediata del espejo de barrido (23).

4. Microscopio según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el elemento de conmutación está diseñado como espejo de conmutación (34), elemento de conmutación acústico-óptico o electro-óptico.

5. Microscopio según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que aguas arriba del espejo de barrido (23) está dispuesto un elemento de efecto astigmático que puede introducirse en la trayectoria del haz de iluminación con al menos una lente astigmática para generar una hoja de luz estática.

6. Microscopio según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el equipo de detección (1) comprende además un detector de área (4) de resolución espacial, caracterizado por que un tiempo de conmutación del elemento de conmutación está dimensionado de tal manera que el área de muestra (P) puede iluminarse dentro del tiempo de integración del detector de área (4) al menos una vez desde cada dirección sobre el eje de iluminación (X) para la detección de la luz irradiada desde el área de muestra (P).