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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur scannenden Erfassung oder Manipulation eines Objektes mit einem Mikroskop.
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Im Stand der Technik sind verschiedenste Lösungsansätze bekannt, um bei Bildaufnahmen mit Scannern die Abtastpositionen der Sensorelemente, die sowohl örtlich als auch zeitlich „verzerrte“ Signale aufgenommen haben können, zu korrigieren oder durch eine entsprechend gestaltete Scannersteuerung zu minimieren.
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So ist z. B. aus der
DE 102 61 155 B4 ein Verfahren bekannt, bei dem jedem Bildelement (Pixel) eine Zeitinformation zugeordnet wird, die den Zeitpunkt beschreibt, an dem der zugehörige Ortsbereich gescannt wurde.
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In der
US 6 914 238 B2 ist ein Rastermikroskop offenbart, bei dem jedem Detektionssignal ein dem Zeitverlauf des Rastervorganges entsprechendes Stellungssignal zugeordnet ist.
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Ferner ist aus der
DE 197 02 752 C2 eine Korrektur der Ansteuerbewegung (Vorverzerrung) über Fourierkoeffizienten bekannt. Hierbei ist nachteilig, dass die einmalig angepasste Ansteuerung des Scanners nicht in der Lage ist, auf thermische oder andere nicht systematisch bedingte Abweichungen zwischen Positionssignal und Detektionssignal zu reagieren.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gegenüber dem Stand der Technik verbessertes Verfahren zur Erfassung eines Bildes vorzuschlagen. Es soll zudem eine Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens angegeben werden.
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Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 und eine Vorrichtung gemäß Anspruch 13 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
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Das Verfahren dient zur Erfassung eines Bildes eines Objekts. Bei dem Verfahren wird mindestens ein Abtaststrahl mit mindestens einer optischen Abtastvorrichtung, insbesondere mit einem Scanner, entlang einer Abtastbahn oder Scanbahn über das Objekt, beispielsweise über eine Probe, geführt. Die Bewegung des Scanners, also die Scanbewegung, ist in mindestens einer Richtung zumindest zeitweise periodisch. Das Verfahren umfasst die nachstehend beschriebenen Schritte, kann aber in weiteren Ausgestaltungen zusätzlich weitere Verfahrensschritte umfassen.
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In einem Schritt erfolgt ein Abtasten der Scanbewegung des mindestens einen Scanners mit einem ersten Abtasttakt einer ersten Abtastfrequenz zur Detektion und Erfassung einer aktuellen Position des Scanners.
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Außerdem wird, beispielsweise mittels mindestens eines Detektors, eine vom Objekt ausgehende Strahlung als erfasste Abtastwerte mit einem zweiten Abtasttakt einer zweiten Abtastfrequenz erfasst. Diese Strahlung, die auch als Detektionsstrahlung bezeichnet werden kann, kann ein vom Objekt reflektierter Anteil einer Beleuchtungsstrahlung sein. Zusätzlich oder alternativ kann die Detektionsstrahlung eine in dem Objekt angeregte Emissionsstrahlung sein. Beispielsweise kann mittels einer Anregungsstrahlung eine Fluoreszenzstrahlung in dem Objekt angeregt und durch dieses emittiert werden. Die erfassten aktuellen Positionen (Positionswerte) des Scanners werden in einem weiteren Schritt zur Berechnung von Momentanwerten der Amplitude, der Phase und der Frequenz der Scanbewegung des mindestens einen Scanners verwendet. In Abhängigkeit der berechneten Momentanwerte wird eine Funktion, insbesondere eine mathematische Funktion wie beispielsweise eine Regressionsfunktion, zum Schätzen von zukünftigen Änderungen der Amplitude, Phase und/oder Frequenz über die Zeit ermittelt. Diese Funktion wird auch als Bewegungsfunktion bezeichnet.
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Es wird ein Bildraster mit Rasterelementen festgelegt. Zu den Rasterelementen werden die erfassten Abtastwerte zugeordnet. Diese Zuordnung erfolgt, indem anhand der ermittelten Funktion Zeitpunkte berechnet werden, zu denen der Abtaststrahl jeweils mindestens eine Grenze benachbarter Rasterelemente überquert beziehungsweise überqueren wird.
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Die innerhalb einer durch die Zeitpunkte begrenzten Zeitdauer erfassten Abtastwerte eines jeden Rasterelements werden dem betreffenden Rasterelement als resultierende Bilddaten zugeordnet. Die Rasterelemente mit den resultierenden Bilddaten werden zu dem resultierenden Bild zusammengesetzt.
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Für die Durchführung des Verfahrens kann ein Basistakt erzeugt und zur Verfügung gestellt werden. Der erste Abtasttakt kann gleich dem Basistakt gewählt werden. Der jeweilige erste Abtasttakt kann zu dem Basistakt synchron sein. In weiteren Ausgestaltungen des Verfahrens kann der erste Abtastakt ein ganzzahliges Vielfaches oder ein ganzzahliger Teil des Basistakts sein.
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In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der zweite Abtasttakt zeitlich variabel sein. Außerdem muss dieser keinem Vielfachen oder Teiler des ersten Abtasttakts entsprechen und kann zu diesem asynchron sein. Die jeweiligen durch den zweiten Abtasttakt bedingten Erfassungszeitpunkte werden aufgezeichnet und bei der Zuordnung der Abtastwerte zu den Rasterelementen berücksichtigt. Der zweite Abtasttakt kann beispielsweise durch ein externes Signal vorgegeben werden.
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Das Abtasten der Scanbewegung, also die Erfassung der jeweils aktuellen Position des Scanners, erfolgt mit der ersten Abtastfrequenz und vorzugsweise zeitlich äquidistant, das heißt, dass der Basistakt unverändert bleibt.
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Die Abtasteinheit beziehungsweise der Scanner überstreicht das abgetastete Objekt mit einer Scanfrequenz.
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Eine periodische Scanbewegung ist beispielsweise näherungsweise sinusförmig. Außerdem kann eine Scanbewegung verwendet werden die lineare Abschnitte aufweist, wie eine Sägezahn- oder Dreiecksbewegung. Die der periodischen Scanbewegung zugrunde liegende Ansteuerung kann beispielsweise mit einer begrenzten Anzahl harmonischer Ordnungen erzeugt werden.
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Unter den in dieser Beschreibung synonym verwendeten Begriffen Bildelement, Pixel beziehungsweise Bildpixel wird jeweils ein Abschnitt eines resultierenden Bildes verstanden. Das resultierende Bild besteht aus einer Anzahl von Bildelementen. Jedes Bildelement ist durch resultierende Bilddaten hinsichtlich seines Inhalts, beispielsweise hinsichtlich Farbe und Intensität, charakterisiert. Vereinfachend kann angenommen werden, dass ein Rasterelement einem Bildelement (Pixel, Bildpixel) entspricht, da in der Regel die einem Rasterelement zugeordneten erfassten Abtastwerte den resultierenden Bilddaten des Rasterelements und des Bildelements entsprechen.
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Die erfasste Scanbewegung, also die zeitliche Abfolge der Positionssignale und der daraus abgeleiteten Positionswerte wird einer Frequenzanalyse unterzogen. Diese besteht vorzugsweise aus einer Sinus- und Kosinus-Korrelation mit der zu erwartenden fundamentalen Frequenz und einer anschließenden Koordinatentransformation zur Berechnung von Momentan-Phase und -Amplitude. Mit einer Anzahl von Momentanwerten von Amplitude und Phase der Scanbewegung wird mittels Regressionsanalyse die zukünftige Amplitude, Phase und Frequenz als Bewegungsfunktion berechnet. Die Regression kann zum Beispiel eine lineare Regression der kleinsten Abweichungsquadrate (least-square-Schätzer) sein. Die Bewegungsfunktion kann beispielsweise sinusförmig, dreiecksförmig oder sägezahnförmig sein. Zusätzlich oder alternativ kann die Bewegungsfunktion in tabellierter Form, beispielsweise als eine look-up-table (LUT) oder als Parameter einer harmonischen Synthese oder Splinefunktion vorliegen.
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In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die erste Abtastfrequenz kleiner als die zweite Abtastfrequenz gewählt. Beispielsweise ist die zweite Abtastfrequenz um ein Vielfaches, z. B. 2, 4, 8 oder 16-mal, höher als die erste Abtastfrequenz. So kann die erste Abtastfrequenz zum Beispiel 10 MHz und die zweite Abtastfrequenz 80 MHz betragen. Dadurch werden zwischen zwei Erfassungszeitpunkten der aktuellen Position des Scanners mehrere Abtastwerte erfasst.
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Diejenigen erfassten Abtastwerte, die innerhalb einer Zeitdauer erfasst wurden, die einen Zeitpunkt umfasst, zu dem der Abtaststrahl eine Grenze zweier Rasterelemente überquert oder überquert hat, werden in einer möglichen Ausgestaltung des Verfahrens anteilig den betreffenden Rasterelementen zugeordnet. Auf diese Weise werden zeitliche Artefakte durch Asynchronität von Abtasttakt und Scanfrequenz (Bewegungs-Moire) vermieden. Außerdem werden leere Rasterelemente vermieden und eine adäquate Verteilung der erfassten Abtastwerte erreicht.
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Es ist auch möglich, dass die einem Rasterelement zugeordneten oder zuzuordnenden erfassten Abtastwerte normiert werden und dem Rasterelement als normierte Bilddaten zugeordnet werden. Die Bildung beispielsweise eines Mittelwerts kann dabei auf die Anzahl von erfassten Abtastwerten des betreffenden Rasterelements bezogen werden. Eine derartige Normierung führt zu einer besseren Vergleichbarkeit der Inhalte der Rasterelemente. Normierte Bilddaten stellen eine Form resultierender Bilddaten dar.
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Rasterelemente mit erfassten Abtastwerten können gruppenweise in Rasterelemente mit resultierenden Bilddaten überführt werden. Dies führt zu einer effektiveren Verrechnung und kann beispielsweise zeilenweise erfolgen. Es können auch Rasterelemente mehrerer Zeilen, ganzer Bilder (bildweise) oder sogar mehrerer Bilder (z-Stapel-weise) in dieser Weise überführt werden.
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Die Phase und Frequenz können auch dazu genutzt werden, um die Zeitpunkte zur Berechnung weiterer Momentanwerte von Amplitude und Phase auszuwählen. Die dynamische Anpassung im Sinne einer Regelung führt zu einer erhöhten Stabilität des Verfahrens. Die Scanfrequenz muss nicht vorab genau bekannt sein.
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Das zweidimensionale oder dreidimensionale Abtastraster kann jeweils mit Rasterelementen unterschiedlicher Form und/oder Größe gewählt werden. So können die virtuellen Rasterelemente zueinander und/oder in mindestens einer ihrer Dimensionen äquidistant, zweidimensional oder dreidimensional gedreht oder beliebig geformt sein. Eine äquidistante Anordnung ist rechnerisch leicht zu handhaben. Gedrehte und/oder verschieden geformte Rasterelemente ermöglichen eine flexible Anpassung des Abtastrasters an das Objekt sowie an die Scanbewegung. Die Rasterelemente können auch verzerrt gewählt sein, um eine Verzeichnungskorrektur zu erreichen. Vorteilhaft werden die Rasterelemente so gewählt, dass im Ergebnis ein resultierendes Bild mit möglichst geringen Abbildungsfehlern erhalten wird. So können Rasterelemente unterschiedlicher Form und Größe miteinander kombiniert werden. Die Größe der Rasterelemente und damit die Dauer eines Zeitintervalls, in dem der Abtaststrahl das betreffende Rasterelement durchquert, können in Abhängigkeit der zukünftigen Scanbewegung gewählt werden.
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Die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe wird ferner mit einer Vorrichtung zur Erfassung eines Objekts gelöst. Eine solche Vorrichtung weist mindestens einen Scanner zum Führen eines Abtaststrahls entlang einer Scanbahn über das Objekt auf. Die Scanbewegung des Scanners ist dabei in mindestens einer Richtung zumindest zeitweise periodisch. Es ist mindestens ein Positionsdetektor zur Abtastung der Scanbewegung des Scanners mit Abtasttakten einer ersten Abtastfrequenz vorhanden.
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Außerdem ist mindestens ein Detektor zum Erfassen einer vom Objekt ausgehenden Strahlung (Detektionsstrahlung) als erfasste Abtastwerte vorhanden. Die Erfassung erfolgt mit einem zweiten Abtasttakt einer zweiten Abtastfrequenz. Ferner ist eine Auswerteeinheit vorhanden, die konfiguriert ist, um:
- ◯ Momentanwerten der Amplitude und der Phase der Scanbewegung von mindestens einem Scanner zu berechnen;
- ◯ eine (mathematische) Funktion zum Schätzen von zukünftigen Änderungen der Amplitude, Phase und/oder Frequenz über die Zeit in Abhängigkeit der berechneten Momentanwerte zu ermitteln,
- ◯ ein Bildraster festzulegen, zu dessen Rasterelementen die erfassten Abtastwerte zugeordnet werden, indem
- ■ mittels der ermittelten (mathematischen) Funktion (Grenz-) Zeitpunkte berechnet werden, zu denen der Abtaststrahl jeweils mindestens eine Grenze der Rasterelemente überquert beziehungsweise überqueren wird,
- ■ und die innerhalb der (Grenz-)Zeitpunkte erfassten Abtastwerte innerhalb eines Rasterelements aufzusummieren und dem betreffenden Rasterelement als resultierende Bilddaten zuzuordnen,
- ◯ und die Rasterelemente mit den resultierenden Bilddaten zu einem resultierenden Bild zusammenzusetzen, um das Bild des Objekts zu erfassen.
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Die Erfindung basiert auf der Grundüberlegung, dass übliche Präzisionsscanner für die scannende Abtastung von Objekten eine aufwändige Steuerung bzw. Regelung der Scanner benötigen, die eine Zuordnung der Bildpixel auch dann exakt auf den gewünschten Abtastort optimieren, wenn der Scanner beziehungsweise der Abtaststrahl z. B. durch Umwelteinflüsse von seiner optimalen, gewünschten Abtastbahn abweicht. Die Erfindung umgeht diese aufwändige Steuerung oder Regelung, indem der Scanner unbeeinflusst gelassen wird und stattdessen die Scanbewegung des frei arbeitenden Scanners optisch (z. B. mit einer Rückseitendetektion) oder anderweitig detektiert wird. Diese Detektionssignale werden als Positionsdetektorsignale oder Positionssignale bezeichnet.
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Die scannende Abtastung des Objekts erfolgt in mindestens einer Richtung mehrfach und näherungsweise periodisch. Durch eine Zeilenvorschubbewegung in einer meist senkrechten Richtung dazu wird ein Objekt zweidimensional abgetastet. Mit zeitlichen Abständen wird das zurückgesendete Detektionslicht des Objekts als Abtastwerte erfasst. Das Positionssignal wird in seine fundamentalen Parameter zerlegt (Amplitude, Frequenz, Phase und eventuell einen Offset). Mit der relativen Bewegung des Scanners während einer Scanperiode und den Parametern der periodischen Bewegung lassen sich Rasterelementen entsprechende Zeitpunkte zuordnen, wobei die Definition des Rasters frei wählbar ist.
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Das Verfahren gemäß der Erfindung kann verallgemeinert in zwei Abschnitte unterteilt werden: in die Synchronisation bzw. Scanpositionsaufbereitung und die Umwandlung der erfassten Abtastwerte in resultierende Bilddaten:
- A) Synchronisation und Rekonstruktion der Scanbewegung
- 1) Generieren einer Zeitbasis durch Bereitstellen eines Basistakts und Nutzen dieses Basistakts als zeitliche Referenz; Erfassen der Positionssignale, wobei die Positionssignale synchron zum Basistakt erfasst werden;
- 3) Ermittlung periodischer Scanparameter beispielsweise mittels Sinus- /Kosinus-Korrelation der erfassten Scanbewegung und Ermitteln von Momentanwerten der Amplitude und Phase sowie optional eines Offsets (Ortsversatz);
- 4) Regression der Parameter und Abschätzung der zukünftigen Bewegungsparameter und Berechnung der Nulldurchgänge bzw. der Frequenz; Aktualisierung der für die Ermittlung der Scanparameter verwendeten Zeitpunkte und optional Bereitstellen dieser Metadaten für andere Komponenten um die folgende Bildrekonstruktion dezentral durchzuführen.
- B) Umwandlung der Abtastwerte in resultierende Bilddaten
- 1) Detektion: Erfassung von Abtastwerten und deren Detektionszeitpunkten; bei einer Erfassung der Abtastwerte synchron zum Basistakt ist eine indirekte Erfassung der Detektionszeitpunkte möglich;
- 2) Ermittlung der Zeitpunkte der Erfassung von Abtastwerten und Berechnung von Zeitpunkten des Überstreifens von Grenzen der Rasterelemente (Pixelgrenzen) aus den berechneten Parametern der Scanbewegung(en);
- 3) Bildrekonstruktion: Zusammenfassen der einzelnen erfassten Abtastwerte innerhalb von Grenzen der Rasterelemente und Aufteilung von erfassten Bilddaten, die auf einer Grenze zwischen zwei Rasterelementen liegen;
- 4) Zusammensetzen der so resultierende Bilddaten oder eines 3-dimensionalen-Bildstapels zu einem vollständigen Bilddokument (resultierendes Bild).
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Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die erfindungsgemäße Vorrichtung bieten gegenüber dem Stand der Technik eine Reihe von Vorteilen. So werden die erfassten Abtastwerte mittels einer mindestens in einer Richtung periodischen Scanbewegung erhalten, für die keine aufwändig geregelten oder korrigierten Präzisionsscanner notwendig sind. Außerdem können bei Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens thermische und/oder zeitliche Änderung der Scanbewegung weitgehend ausgeglichen werden. Die Erfindung erlaubt selbst bei verrauschten Positionssignalen eine sichere Zuordnung zu den jeweiligen zugehörigen Bildelementen (Pixel, Bildpixel). Das ist insbesondere für die typisch hohen Scanfrequenzen von Resonanzscanner wichtig.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass mit geringem Rechenaufwand, der vorzugsweise in Hardware realisierbar ist, bei einem Scanmikroskop objektidentische Bilder ohne Bildfehler und Artefakte erhalten werden können. Weiterhin können alle ermittelten Parameter des Positionssignals beziehungsweise der Scanbewegung an beliebige andere Bilddetektoren verteilt werden, um diese in äquidistante Bildinformationen umzuwandeln. Dies ist so mit Positionssignalen direkt nicht möglich.
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In einer speziellen Ausführung der Erfindung ist es möglich, dass das Erfassen der Abtastwerte nicht synchron zum Basistakt oder einem Vielfachen beziehungsweise Teil dessen erfolgt. Dies ist zum Beispiel dann von Vorteil, wenn die Abtastung des Objektes mit einer gepulsten Lichtquelle, zum Beispiel mit einem Titan-Saphir-Laser erfolgt. Dieser läuft mit einem eigenen Takt und die Erfassung der Bilddaten erfolgt dazu synchron. Des Weiteren sind die zeitlichen Abstände der einzelnen Pulse und damit der Abtastung nicht äquidistant über der Zeit. Zum einen müssen die Detektionszeitpunkte oder Erfassungszeitpunkte erfasst werden, zum anderen werden diese bei der Berechnung der Rasterelemente und der diesen zugeordneten Zeitpunkte berücksichtigt. Eine Synchronität der Erfassung der Bilddaten zum Basistakt ist damit nicht notwendig. Ohne eine pulssynchrone Detektion besitzen die Abtastwerte ein variierendes Signal, was bei der Bildverrechnung nicht mehr korrigiert werden kann und zu sogenanntem Bewegungs-Moire führt.
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In einer weiteren möglichen Ausgestaltung des Verfahrens werden mehrere Abtaststrahlen mittels mindestens eines Scanners entlang jeweiliger Scanbahnen über das Objekt geführt. Dabei besitzen die Abtaststrahlen einen Ortsversatz in mindestens einer Richtung zueinander. Die jeweils als Wirkung eines Abtaststrahls erfassten Abtastwerte werden unter Einberechnung des Versatzes den Rasterelementen des Bildrasters zugeordnet. Die Abtastwerte werden zu resultierenden Bilddaten und einem resultierenden Bild verrechnet, wie dies oben für einzelne Abtaststrahlen beschrieben wurde. Es ist auch möglich, dass Mittelwerte mehrerer Abtastwerte gebildet werden und ausgehend von diesen die resultierenden Bilddaten und das resultierende Bild erzeugt werden.
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Eine weitere Ausgestaltung des Verfahrens sieht vor, dass unterschiedliche Bereiche des Bildrasters mit den Abtastwerten aus der Vielzahl von Scanbahnen zu einem Bild kombiniert werden (zeitsimultanes Scannen). Möglich ist auch, dass die Abtastwerte der unterschiedlichen Abtaststrahlen für eine Erzeugung unterschiedlicher Kanäle eines resultierenden Bildes verwendet werden.
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Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können eine Reihe von Bewegungsfehlern der Abtastvorrichtung, beispielsweise des Scanners, erfasst und optional korrigiert werden. So können parasitäre Schwingungen senkrecht zur Scanrichtung (Wobble), Fehler zwischen Vor- und Rücklauf der Scanbewegung (bidirektionale Fehler), Übersprechen (crosstalk) zwischen den Bewegungsachsen, Linearitätsfehler, Amplitudenfehler und/oder Offsetfehler erfasst, berechnet und korrigiert werden. Es kann die Maximalamplitude erfasst werden, was insbesondere bei Resonanzscannern und bei Multipunkt-Scan-Anwendungen vorteilhaft ist. Anhand der erfassten Scanbewegung kann die zweite Abtastfrequenz angepasst werden, um die Bildqualität weiter zu verbessern.
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Mittels der Erfindung können bereits erfasste Positionssignale geglättet und Positionssignale geringer Qualität unter Umständen erst nutzbar werden. Zukünftige Positionssignale können insbesondere anhand der Regressionsfunktion vorhergesagt werden. Die Qualität der Vorhersage kann positiv beeinflusst werden, wenn eine Regelung des Korrelationsintervalls auf Basis der berechneten Nullstellen, Phasen oder Frequenzen (Feedback) erfolgt. Eine Auswertung der erfassten Bilddaten kann im Wesentlichen in Echtzeit erfolgen, was vorteilhaft die zu speichernde Datenmenge begrenzt. Alternativ ist auch ein Speichern der Bilddaten und eine spätere Verarbeitung möglich. Weiterhin ist eine Steuerung von Aktoren und Lichtquellen annähernd in Echtzeit und synchron zum Scan möglich.
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Beispielsweise können Detektionssysteme vorteilhaft mit dem erfindungsgemäßen Verfahren betrieben werden, wenn diese eine Vielzahl von parallel arbeitenden Einzeldetektoren aufweisen. Solch ein Einzeldetektor kann zum Beispiel eine Lawinenphotodiode (APDs, avalanche photo diode) eines Arrays von APDs (SPAD-Array, single-photon avalanche diode array) oder eines Arrays von PMTs (Mehrkanal-PMT; photomultiplier tube) oder anderen Detektoren sein. Jeder der Einzeldetektoren erhält die Informationen beispielsweise zu den Grenzen der Rasterelemente und verarbeitet die Daten direkt. So können Daten zusammengefasst werden und als ein gesamtes Bilddatenpaket, beispielsweise mit einem einzigen Zeitstempel versehen, ausgegeben werden. Bei einer Implementierung auf einem Chip kann ein hoher interner Datenstrom von beispielsweise 80 GByte/s vorhanden sein, während lediglich ein geringerer Datenstrom von z. B. 80 Mbyte/s den Chip verlässt.
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Außerdem ist es möglich, anhand der Bewegungsfunktion und dem geschätzten zukünftigen Verlauf der Scanbewegung Rasterelemente selektiv mit der Beleuchtungsstrahlung zu beaufschlagen. So können in vorbestimmten Rasterelementen Manipulationen mit einer ebenfalls ausgewählten Intensität, Polarisation und/oder Wellenlänge der Beleuchtungsstrahlung bewirkt werden. Beispielsweise werden mit Fluoreszenzmarkern versehen Moleküle oder Strukturen des Objekts zur Emission von Fluoreszenzstrahlung angeregt. Die Beleuchtungsstrahlung kann während des Überstreichens anderer vorbestimmter Rasterelemente auch ausgeschalten oder in ihrer Intensität, Wellenlänge und/oder Polarisation geändert werden, um dort eben keine Veränderungen des Objekts, also keine Manipulation, hervorzurufen. Beispielsweise können Rasterelemente ausgewählter Bereiche des Objekts nicht beleuchtet werden, um schädigende Wirkungen der Beleuchtungsstrahlung lokal und/oder temporär zu vermeiden (blanking).
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Zeichnungen näher erläutert. Dabei zeigen:
- 1: eine schematische Darstellung der Erfindung als Blockschema;
- 2a: eine schematische Darstellung einer ersten Ausgestaltung des Verfahrensablaufs mit Darstellung von Verarbeitungseinheiten angepasst auf ein Laserscanmikroskop;
- 2b: eine schematische Darstellung einer zweiten Ausgestaltung des Verfahrensablaufs mit Darstellung von Verarbeitungseinheiten angepasst auf ein Laserscanm ikroskop;
- 3: ein drittes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens als Blockschema in einem Scanmikroskop;
- 4: ein Blockschema zur Erläuterung des Zusammenhangs von erfassten Abtastwerte und Positionssignalen zur Scannerposition;
- 5: ein erstes Ausführungsbeispiel eines Positionsdetektors als Scanner-Rückseitendetektor mit positionssensitiver Diode (PSD);
- 6: ein zweites Ausführungsbeispiel des Positionsdetektors als Rückseitendetektor mit einer Vier-Quadrantendiode (QPD);
- 7 eine weitere Ausführung der Erfindung in einem Laserscanningmikroskop mit mehreren Detektorkonfigurationen zur alternativen Objektabtastung; und
- 8 eine schematische Darstellung einer Ausgestaltung des Verfahrensablaufs zur ortsaufgelösten Manipulation eines Objekts, bei dem Bereiche des Objekts beleuchtet werden und andere Bereiche des Objekts unbeleuchtet bleiben.
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Der grundsätzliche Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß 1 umfasst eine Strahlungsquelle 1, beispielsweise eine Laserlichtquelle, zur Bereitstellung eines Abtaststrahls 12, der auf einen Spiegel 21 eines schwingenden Scanners 2 trifft, um ein Objekt 3 linear und entlang einer Abtastbahn (durch Pfeile wechselnder Richtung symbolisiert) abzutasten. Die Abtastbewegung, hier die Scanbewegung, ist in mindestens einer Richtung periodisch. Der von dem Objekt 3 reflektierte Anteil des Abtaststrahls führt aufgrund der Scanbewegung des Spiegels 21 zu einer linearen Signalfolge (Abtastwerte 42), die von einem Strahlungsdetektor 4 mit einer zweiten Abtastrate (Samplingfrequenz; zweite Abtastfrequenz fS ) aufgenommen wird. Alternativ kann durch die Strahlung des Abtaststrahls 12 in dem Objekt 3 eine Emissionsstrahlung, beispielsweise eine Fluoreszenzstrahlung, bewirkt sein und als Detektionsstrahlung mittels des Strahlungsdetektors 4 erfasst werden.
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Der Scanner 2 ist ein nicht synchronisierter Scanner, vorzugsweise ein freischwingender Resonanzscanner oder auch ein Galvanometerscanner (Galvoscanner). Um dennoch eine (Rück-)Kopplung der durch seine Scanbewegung erzeugten Anregung bezüglich Ort und Zeit am Objekt 3 realisieren zu können, um beispielsweise Nichtlinearitäten und Schwankungen der Scanbewegung infolge von Umwelteinflüssen berücksichtigen oder kompensieren zu können, wird erfindungsgemäß der Bewegungsablauf des Scanners 2 mittels eines Positionsdetektors 61 einer Scananalyseeinheit 6 abgetastet und erfasst. Dies geschieht durch eine Positionsdetektion 611 (siehe 2a bis 4) des Spiegels 21 mit einem ersten Abtasttakt einer vorgegebenen ersten Abtastfrequenz fP . Zu dieser ersten Abtastfrequenz fP ist die Samplingfrequenz oder zweite Abtastfrequenz fS des Strahlungsdetektors 4 so gewählt, dass letztere größer als die erste Abtastfrequenz fP , beispielsweise ein Vielfaches ist. Die Positionsdetektion 611 erfolgt vorteilhaft berührungslos durch eine Rückseitendetektion am Spiegel 21 des Scanners 2, indem eine optische Abtastung der Rückseite des Spiegels 21 durch einen Lichtstrahl und Erfassung dessen Reflexionswinkels erfolgt. Infolge des mit der Spiegelbewegung variierenden Reflexionswinkels kann die Spiegelbewegung detektiert werden. Alternativ zur beschriebenen Methode können andere Methoden der Positionsdetektion, zum Beispiel auf kapazitiven, resistiven oder piezoresistiven Wirkprinzipien beruhende Erfassungen, zur Anwendung kommen. Die erfasste Abtast- oder Scanbewegung des Scanners 2, insbesondere des Spiegels 21, wird als eine zeitliche Folge von Positionssignalen erfasst, in Positionswerte übersetzt und für weitere Auswertungen bereitgestellt.
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Die Scananalyseeinheit 6 und ein noch näher zu beschreibender Bildkorrekturrechner 5 sind Elemente oder Einheiten einer Auswerteeinheit 56. In einem Positionsfunktionskorrelator 62, der beispielsweise eine Untereinheit der Scananalyseeinheit 6 ist, wird eine Sinus- und/oder Kosinus-Transformation der erfassten Positionssignale ausgeführt. Es findet eine Positionsdatenaufbereitung statt. Weiterhin kann die Form der periodischen Scanbewegung erfasst und bei der Bildverrechnung berücksichtigt werden.
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Mit den Momentanwerten der Scanbewegung wird durch Regression die zukünftige Bewegung des Scanners 2 berechnet (siehe auch 2a und 2b). Dafür kann vorteilhaft eine lineare oder quadratische Regression verwendet werden. Die Schätzung der zukünftigen Scanbewegung erlaubt eine hinreichend genaue Berechnung von Zeitpunkten, zu denen virtuelle Grenzen von Rasterelementen eines Bildabtastrasters (siehe auch 2a, 2b) vom Abtaststrahl überstrichen werden.
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Die Festlegung des Bildabtastrasters und dessen Rasterelemente erfolgt in dem Pixelpositionsrechner 63. Außerdem erfolgt dort die Berechnung (Schätzung) der Zeitintervalle zwischen den Grenzen beziehungsweise von Zeitpunkten des Überstreichens der Grenzen durch den Abtaststrahl 12.
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Eine Zuordnung erfasster Abtastwerte 42 des Strahlungsdetektors 4 und der Rasterelemente des Bildabtastrasters erfolgt in dem Bildkorrekturrechner 5. Durch den Vorgang der Zuordnung werden die erfassten Abtastwerte 42 in resultierende Bilddaten der jeweiligen Rasterelemente überführt. Als Ergebnis wird aus den Rasterelementen ein resultierendes oder rekonstruiertes Bild 7 erhalten.
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In 2a ist - aufbauend auf dem in 1 stilisiert dargestellten Scanprinzip - ein sog. Sectioning eines konfokalen Laserscanningmikroskops angenommen und eine Fluoreszenzanregung in einer Scanebene des Objekts 3 (nur in 1 bezeichnet) dargestellt. Laserstrahlung eines als Strahlungsquelle 1 dienenden Lasers 11 wird über den Spiegel 21 des Scanners 2 zu einem mäanderförmig fortschreitenden Scan in der ausgewählten Scanebene des Objekts 3 gesteuert. Die mittels der Strahlung des Anregungslasers 11 angeregte Fluoreszenzstrahlung wird mit dem Strahlungsdetektor 4 (nur in 1 gezeichnet) detektiert und ein zeilenweise erfasstes Objektbild 4.1 erhalten. Die erfassten Abtastwerte 42 werden zu dem Bildkorrekturrechner 51 übertragen. In diesem erfolgen die Zuordnungen und die Summierung der erfassten Abtastwerte 42 zu Rasterelementen. Im Ergebnis der Zuordnung und Summierung werden Abtastfehler korrigiert, die durch den unsynchronisierten, frei schwingenden Scanner 2 hervorgerufen sind.
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Die dafür erforderlichen Korrekturdaten werden wie folgt generiert. Der Bewegungsverlauf (Scanbewegung) des Spiegels 21 des Scanners 2 wird während einer Positionsdetektion 611 mittels des Positionsdetektors 61 erfasst und durch Positionssignale und daraus erhaltenen Positionsdaten 612 erfasst. Bevorzugt erfolgt eine optische Rückseitendetektion am Spiegel 21. Dabei ist die Scanfrequenz des Scanners 2 nicht mit der ersten Abtastfrequenz fP der Positionsdetektion 611 synchronisiert und die Abtastfrequenz fP ist in jedem Fall wesentlich größer als Erstere. Die Positionsdaten 612 der Positionsdetektion 611 werden über der Zeit aufgetragen und als Amplituden-, Phasen- und Zeitdaten einer Funktionskorrelation 621, vorzugsweise einer Sinus- und Kosinustransformation, unterzogen.
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Auf Basis der Bewegung über die Zeit und der Amplituden- und Phasenentwicklung über die Zeit kann eine gemittelte normierte Bewegung berechnet werden. Diese kann für eine Look-up-Table (LUT) der Scanbewegung verwendet werden. Für eine rauschreduzierte LUT der Scanbewegung kann vorteilhaft eine harmonische Analyse und Rücksynthese relevanter Koeffizienten verwendet werden.
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Für die Verrechnung der Abtastwerte 42 in Bilddaten erfolgt zuerst die Berechnung der Zeitpunkte der Grenzen zwischen den Rasterelementen aus den Parametern der Scanbewegung (Amplitude, Phase, Nulldurchgänge, Frequenz) und der LUT der Scanbewegung.
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Bei synchroner Erfassung der Abtastwerte 42 relativ zum ersten Abtasttakt des Positionsdetektors 61 können die Abtastwerte 42 direkt den Rasterelementen zugeordnet werden.
Bei asynchroner Erfassung der Abtastwerte 42 relativ zum ersten Abtasttakt des Positionsdetektors 61 muss der jeweilige Zeitpunkt (Erfassungszeitpunkt) der Abtastwerte 42 erfasst werden. Mit diesem erfolgt dann die Zuordnung zu Bildelementen basierend auf einer Zuordnungsfunktion 642. Abtastwerte 42 in der Nähe oder zwischen Pixelgrenzen werden anteilig anhand des Detektionszeitpunkts auf die Rasterelemente aufgeteilt (Bildumrechnung 51). Grundsätzlich ist diese Vorgehensweise natürlich auch bei einer synchronen Erfassung möglich.
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Weiterhin werden die zugeordneten Abtastwerte 42 und die Anteile von Abtastwerten 42 innerhalb der jeweiligen Rasterelemente aufsummiert und bezüglich der Anzahl normiert. Aus einer Vielzahl von Rasterelementen, die im Beispiel als rekonstruierte Bildzeilen ausgegeben werden, wird ein rekonstruiertes Bild 7 zusammengesetzt.
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In 2b ist bei dem gleichen Verfahrensablauf wie in 2a ein anderes Ergebnis bei der Bestimmung der Positionsdaten ermittelt worden. Der Scan erfolgt in Form einer Dreiecksfunktion. Hier werden die Positionsdaten 612 des Scanners 2 bei der Funktionskorrelation 621 ebenfalls mit Sinus- und Kosinuskorrelation analysiert.
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In dem in 2b gezeigten Beispiel entsteht aufgrund der zur Scanbewegung korrelierten Sinus- und Cosinusfunktion und der Look-up-Tabelle eine näher an einem linearen Zusammenhang liegende Funktion zur Zuordnung der relativen Orte zu den Detektionszeitpunkten des Strahlungsdetektors 4 (siehe Zuordnungsfunktion 642). Im Ergebnis entstehen sukzessive rekonstruierte Bildzeilen, die zum resultierenden Bild 7 zusammengesetzt werden.
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Die vorstehend beschriebene Vorgehensweise zur Korrektur der fehlerhaften Bildabtastung infolge eines unsynchronisierten Scanners 2 ist in 3 als schematische Darstellung der Umsetzung der Erfindung in einem Scanmikroskop mit frei schwingendem Galvanometerscanner 23 gezeigt. Der Positionsdetektor 61 besteht in diesem Fall aus einem Rückseitendetektor 613, bei dem aus den Positionssignalen in der Berechnung der Positionsdetektion 611 Positionsdaten 612 der Scanbewegung ermittelt und in einem Positionszwischenspeicher 615 gespeichert werden. Mögliche Realisierungen des Rückseitendetektors 613 sind in 5 und 6 beschrieben.
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In dem Bewegungsfunktionskorrelator 62 wird mittels Funktionskorrelation 621 eine Korrelationsprüfung der fortlaufend aufgenommenen Positionssignale des Spiegels 21 durchgeführt und das Ergebnis in einem Korrelationszwischenspeicher 623 abgelegt. Danach erfolgt durch Regression 622, eine Abschätzung der zukünftigen Scanbewegung. In dem Pixelpositionsrechner 63 erfolgen die Festlegungen des Bildrasters, der Rasterelemente und die Berechnung der Zeitpunkte des Überquerens von Grenzen der Rasterelemente durch den Abtaststrahl 12.
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Anhand der Regression 622 und einer aus dieser abgeleiteten Regressionsfunktion können Regressionsparameter optional für die Ermittlung von Nulldurchgangszeitpunkten und zu einer Synchronisation mit einem Taktsystem des Scanmikroskops genutzt werden. Außerdem ist es möglich, dass anhand der Regressionsfunktion ermittelte Daten für optionale Datenausgänge, beispielsweise für einen akustooptischen Transmissionsfiltertreiber (AOTF- acusto optical tunable filter) oder Niederspannungs-Differentialsignalübertragungssteuerungen (LVDS - Low-Voltage Differential Signalling) für eine Datenübertragung der Strahlungsdetektoren 4 mittels eines LVDS-Multiplexer 44 zur Verfügung gestellt werden.
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Eine Ansteuerung eines AOTF kann beispielsweise derart erfolgen, dass auf jeden abgetasteten Bereich des abzubildenden Objekts 3 eine gleiche Leistung des Abtaststrahls 12 (siehe 1 bis 2b sowie 5 und 6) gerichtet ist. Weiterhin kann mittels der Ansteuerung eine Korrektur von Zeitpunkten vorgenommen werden, zu denen ein Bereich des Objekts gebleicht werden soll oder zu denen keine Beleuchtung mit Strahlung des Abtaststrahls 12 erfolgen soll (sog. beam blanking), wie dies in 8 beispielhaft dargestellt ist.
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Im eigentlichen Signalkanal, der im unteren Teil von 3 stilisiert dargestellt ist, werden die Strahlungsdetektoren 4, die beispielsweise als PMT 1 bis PMT 4 (Sekundärelektronenvervielfältiger; photomultiplier tube = PMT) ausgebildet sind und deren digitalen Signale an jeweils einen Integrator 43 abgeben werden, an dieser Stelle der einzelnen Signalleitungen (Signalströme der einzelnen PMTs) mit den Daten aus der Scananalyseeinheit 6 korrigiert. Die vom Pixelpositionsrechner 63 bereitgestellten Koordinaten werden über einen in dem Pixelpositionsrechner 63 integrierten Pixelzuordnungsverteiler 64 den erfassten Abtastwerten 42 oder Detektorsignalen 42 zugeordnet. In einem jeweiligen Integrator 43, wird die Funktion der Bildumrechnung 51 (nur in 2a und 2b bezeichnet) für die einzelnen Signalströme der erfassten Abtastwerte 42 ausgeführt. Die so korrigierten resultierenden Bilddaten werden als rekonstruierte Bildzeilen an den LVDS-Multiplexer 44 zur Übertragung eines kompletten resultierenden Bildes 7 (siehe z. B. 1) weitergeleitet.
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In 4 ist das Prinzip der erfindungsgemäßen Pixelkorrektur nochmals als vereinfachtes Blockschema dargestellt, in dem die Datenverarbeitung mittels eines Positionsdetektors 61 für die Korrektur der Detektorsignale eines betrachteten Strahlungsdetektors 4 gezeigt ist.
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Dabei wird in einem Schritt aus dem Positionssignal eines Positionsdetektors 61 eine Positionsberechnung des Spiegels 21 des Scanners 2 (und mithin der Position des auf das Objekt 3 gerichteten Abtaststrahls 12) vorgenommen. Das kann das AD-gewandelte direkte Signal eines positionsempfindlichen Bauelements (z. B. kapazitive Sensorreihe, piezoelektrische oder piezoresistive Sensoren) sein, aber auch das verrechnete Signal einer Lichtwaage (wie z. B. in 6 gezeigt), in der das Verhältnis der Differenz zur Summe von Lichtmengen bestimmt wird, die auf zwei räumlich getrennte Sensorflächen (beispielweise Teilflächen einer 4-Quadrantendiode oder eines positionssensitiven Detektors (PSD, position sensitive device) fallen. Die Scanposition wird mit einer Abtastfrequenz fP laufend ermittelt, wobei die Daten des Scanners 2 von der Positionsdetektion 611 aufgenommen und in Positionsdaten 612 umgerechnet werden.
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Im Schritt der Funktionskorrelation 621 und Transformation erfolgt eine Berechnung der Sinus- und Kosinuskorrelierten der Positionsdaten 612 zu vorgebbaren Zeitpunkten. Hier wird die Momentanphase und Momentanamplitude der Scanbewegung bestimmt. Das Ergebnis ist ein zeitlicher Verlauf von Amplitude und Phase. Die Transformation beinhaltet die Berechnung der Momentanwerte von Phase und Amplitude aus der Sinus- und der Kosinuskorrelierten, die im zweiten Schritt gewonnen wurden, durch Koordinatentransformation von einem kartesischen in ein Polarkoordinatensystem.
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Im Schritt der Regression wird beispielsweise ein Kleinste-Quadrate-Schätzer (least-square-estimator) für die Ermittlung einer Regressionsfunktion und einer Berechnung des Verlaufs von Amplitude und Phase über der Zeit angewendet. Die Regression der Momentanwerte der Amplituden und Phasen kann über mehrere Messungen, insbesondere über mehrere Perioden, erfolgen.
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Ein Schritt der Nachbearbeitung beinhaltet die Berechnung der aktuell zu erwartenden Werte für Amplitude, Phase, Periodenlänge, Frequenz und Zeitpunkte der nächsten Nulldurchgänge aus der Regressionsfunktion. Dieser Schritt liefert die geschätzten aktuell zu erwartenden Werte für Amplitude, Phase und Frequenz. Diese Werte fließen als neue Hilfsdaten, wie Berechnungszeitpunkte oder Periodenlänge in den Schritt der Korrelation und Transformation ein.
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In einem optionalen Zwischenschritt, der Metadatenausgabe, erfolgt die Ausgabe der Daten: Amplitude, Periodenlänge und Zeiten von Nulldurchgängen in digitaler Form zur Steuerung von weiteren Komponenten des Scanningmikroskops. Diese können sein:
- - Erzeugung von Synchronimpulsen für die Synchronisierung mit anderen Systemen,
- - Ansteuerung von weiteren Strahlungsdetektoren 4,
- - synchrone und pixelgenaue Beleuchtungssteuerung für AOTFs, AOM (akustooptischer Modulator) und/oder direktmodulierte Lichtquellen 1,
- - sonstige synchron zur Bildabtastung stattfindende Prozesse bis hin zur Stimulation einer als Objekt 3 dienenden Probe (z. B. elektrische oder optische Reizung der Probe).
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Gleichzeitig zu den Positionsdaten 612 werden die Abtastwerte 42 des Strahlungsdetektors 4 laufend aufgezeichnet. Die Aufzeichnung erfolgt in der Regel mit einem höheren Abtasttakt als die Abtastung der Position des Scanners 2.
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In einem weiteren Schritt erfolgt eine numerische Berechnung von Zeitpunkten, zu denen der Abtaststrahl 12 eine Grenze eines zuvor festgelegten Rasterelements überquert. Diese Zeitpunkte werden für jedes einzelne Rasterelement berechnet und an den Integrator 43 weitergeleitet. Diese Bestimmung erfolgt sub-Rasterelement-genau.
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Ein weiterer Schritt umfasst die Pixelintegration, in der Bildpixel aus den Zeitintervallen (berechnet im vorher beschriebenen Schritt) und den Abtastwerten 42 berechnet werden.
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In einem weiteren Schritt erfolgt optional eine Umsortierung der Rasterelemente zu den resultierenden Bilddaten, ein Entfernen von Umkehrphasen der Scanbewegung und optional ein Auffüllen von fehlenden Rasterelementen.
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Hierdurch wird ein Datenstrom erzeugt, der in normaler Reihenfolge (Zeile für Zeile, Pixel für Pixel) für jedes Pixel einen Datenwert enthält. Die während einer Rückschwingung des Scanners erfassten Abtastwerte 42 werden hinsichtlich ihrer zeitlichen Reihenfolge umgedreht, sodass die Bilddaten aller Zeilen in einer einheitlichen Leserichtung vorliegen. Rasterelementen, die beispielsweise wegen einer zu geringen Schwingungsamplitude des Scanners 2 nicht abgetastet wurden und denen daher keine erfassten Abtastwerte 42 beziehungsweise resultierenden Bilddaten zugeordnet wurden, können gewählte Werte (Dummy-Werte, Zufallswerte) zugeordnet werden. Die erfassten Abtastwerte 42 werden also je nach Erfordernis umsortiert, beschnitten, ergänzt, zusammengefasst und in den Datenstrom umgewandelt, der im nächsten (letzten) Schritt ausgegeben wird.
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Im abschließenden Schritt der Bilddatenausgabe erfolgt das Versenden der resultierenden Bilddaten an das aufzeichnende und/oder darstellende Gerät (Speicher und/oder Anzeige).
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In der 4 ist die Zuordnung von Abtastwerten zu den gescannten Orten des Objekts, hier in Form von Rasterelementen, schematisch dargestellt. Der obere Teil von 4 illustriert dabei die Gewinnung von Positionsdaten des frei schwingenden Scanners 2, während der untere Teil schematisch veranschaulicht, wie die Bilddaten aufgenommen und mittels der Positionsdaten korrigiert (umgeordnet) werden.
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Einer der Kernpunkte der vorliegenden Erfindung ist die hochaufgelöste und rauschreduzierte Positionsdetektion der Scanbewegung, d.h. die Aufnahme des zeitlichen Verlaufs der Scannerpositionen im Hinblick auf die Position des Anregungsortes des Abtaststrahls 12 der Strahlungsquelle 1 gegenüber einem gewünschten idealen (metrischen) Scan- oder Abtastraster in einer Scanebene des Objekts 3. Die Möglichkeiten der Ausführung des Positionsdetektors 61 zum Erfassen der Position des Spiegels 21 des Scanners 2 sind vielfältig und reichen von kapazitiven bzw. elektro-magnetischen über induktive und piezoresistive bis zu optischen Detektoren. Die optischen Positionsdetektoren 61, die sich die Reflexion eines auf die Rückseite des Spiegels 21 gerichteten Lichtstrahls zunutze macht, ist dabei von Vorteil. Neben der berührungslosen Messung ist eine gegenüber dem Drehwinkel des frei schwingenden Scanners 2 doppelt so große Winkelauflösung erreichbar. Zu dieser vorteilhaften optischen Detektionsmethode der Bewegung des Scanners 2 sind zwei vorteilhafte Ausführungsformen des sog. Rückseitendetektors 613 in 5 und 6 schematisch dargestellt.
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In der Ausgestaltung gemäß 5 wird das Licht einer Lichtquelle 614 als kollimiertes oder leicht konvergentes bzw. divergentes Strahlungsbündel unter schrägem Einfallswinkel auf die Rückseitenfläche des Spiegels 21 gerichtet. Der reflektierte Anteil des Strahlungsbündels wird mittels eines positionsempfindlichen Detektors 613 aufgefangen, dessen Empfängerfläche so angeordnet ist, dass er das annähernd komplett reflektierte Bündel der Lichtquelle 614 aufzunehmen in der Lage ist. Unterschiedliche Bereiche der Empfängerfläche sind dabei vorzugsweise separat auswertbar. Dazu ist in 5 ein Positions-Sensitiver-Detektor (PSD), beispielsweise eine positionssensitive Diode, als Rückseitendetektor 613 vorgesehen, um das Auswandern des reflektierten Bündels mindestens an den beiden Umkehrpositionen der Schwingung des Spiegels 21 im Sinne einer sogenannten Lichtwaage zu erfassen, in der das Verhältnis der Differenz zur Summe von Lichtmengen zweier separater Empfängerflächen der PSD bestimmt wird. Alternativ kann ein optischer Positionsdetektor genutzt werden der das Licht integral von zwei oder mehreren Bereichen detektiert. Die Position kann dann über das Verhältnis der Signale zum Gesamtsignal ermittelt werden. Selbstverständlich kann in gleicher Weise zweckmäßig der vollständige Verlauf der Scanbewegung mit einer ersten Abtastfrequenz fP aufgenommen werden.
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Eine zweite Ausführungsform des Rückseitendetektors 613 ist in 6 gezeigt, die ebenfalls das Prinzip der Lichtwaage ausnutzt. Im Unterschied zu 5 wird hier mit einem divergenten Bündel einer Lichtquelle 614 gearbeitet, wobei die Lichtquelle 614 in einer Mittenausnehmung einer als Rückseitendetektor 613 dienenden 4-QuadrantenDiode (QPD) angeordnet ist und die QPD parallel zur mittleren Position des Spiegels 21 innerhalb der Schwingbewegung ausgerichtet ist. Dadurch verschiebt sich das reflektierte Bündel der Lichtquelle 614 zwischen den Umkehrpunkten der Scanbewegung des Spiegels 21 jeweils in unterschiedliche Quadranten der QPD. Anhand der jeweiligen Messwerte der Quadranten kann die Position des Spiegels 21 sehr genau bestimmt werden.
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In einer modifizierten Variante, die in 6 gestrichelt dargestellt ist, kann eine Lichtquelle 614' hinter der QPD angeordnet sein und ihr Lichtbündel durch die Mittenausnehmung der QPD auf die Rückseite des Spiegels 21 gerichtet sein. Das aus der Mittenausnehmung austretende Lichtbündel kann als Lichtquelle 614 angesehen werden. Das Detektionsprinzip bleibt dabei gleich. Wiederum wird das Verhältnis der Differenz zur Summe von Lichtmengen zweier separater Empfängerflächen der QPD bestimmt.
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Im Ergebnis liefern die optischen Rückseitendetektoren 613 gemäß den 5 und 6 gleichwertig sehr hoch aufgelöste Positionsdaten 612, die eine exakte Umrechnung in die realen Scanpositionen des Anregungsstrahls und/oder Abtaststrahls 12 der Strahlungsquelle 1 eines Scanmikroskops über der Zeit erlauben, sodass die zum frei schwingenden Scanner 2 (siehe z. B. 1) nicht synchronisierte Bildaufnahme des Strahlungsdetektors 4 damit in einem nachgeordneten Verfahren (postprocessing) korrigiert werden kann.
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In 7 ist die Erfindung in einem Laserscanningmikroskop schematisch dargestellt. Als Besonderheit weist dieses eine Mehrzahl von Detektoren 45, 46 und 47 auf, die als alternative oder parallele bildaufnehmende Strahlungsdetektoren 4 fungieren und deren Messwerte der erfindungsgemäßen Signalverarbeitung zugeführt werden.
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Ein Laser 11 als Strahlungsquelle 1 des Laserscanningmikroskops richtet sein Beleuchtungsbündel entlang des Beleuchtungsstrahlengangs 10 auf einen oder mehrere Scanner 23, dessen reflektiertes Strahlungsbündel auf das Objekt 3 gerichtet ist und eine Scanbewegung in einer Scanebene ausführt. Von dem derart zeilenweise abgetasteten Objekt 3 wird im Durchlichtprinzip der Linienscan auf einen Durchlichtdetektor 45 abgebildet und im Auflichtprinzip mittels eines Strahlteilers 13 zu einem Auflichtdetektor 46 ausgekoppelt.
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Vom Objekt 3 ausgehendes reflektiertes, transmittiertes und/oder gestreutes Licht oder Fluoreszenzstrahlung kann je nach Wellenlänge und Gestaltung des Strahlteilers 13 von diesem durchgelassen werden. Vom Strahlteiler 13 durchgelassenes Licht gelangt zurück über den/die Scanner 23 zu einem weiteren Strahlteiler 14, der das zurück kommende Licht zumindest teilweise auskoppelt und den ausgekoppelten Anteil auf den weiteren Konfokaldetektor 47 abbildet. Der Positionsdetektor 61 kann beispielsweise Positionsdaten 612 von der Rückseite des Scanners 23 erfassen und das jeweilige Positionssignal 612 ausgeben.
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Die Detektoren, Durchlichtdetektor 45, Auflichtdetektor 46 und Konfokaldetektor 47, können räumlich getrennt vom Bildkorrekturrechner 5 angeordnet sein und weisen deshalb ihre eigene Verarbeitungselektronik auf, die über die Taktleitungen 48 mit einem Basistakt einer Auswerte- und Verarbeitungseinheit 8 gekoppelt sind. Die erfassten Abtaswerte 42, insbesondere Detektorsignal 42, von Durchlichtdetektor 45, Auflichtdetektor 46, Konfokaldetektor 47 sowie die in der Scananalyseeinheit 6 berechneten Bildkoordinaten vom Pixelpositionsrechner 63 sind über Datenleitungen ebenfalls der Auswerte- und Verarbeitungseinheit 8 zugeführt. Dabei werden von den Positionsdaten 612 aus dem Positionsdetektor 61 - wie oben zu 2a oder 2b beschrieben -mit Hilfe einer Funktionskorrelation 621 Momentanamplitude, Momentanphase, Frequenz und zeitlicher Verlauf berechnet und eine Regression vorgenommen. Im Pixelzuordnungsverteiler 64 erfolgt dann die subpixelgenaue Zuordnung der relativen Orte zu den Detektionszeitpunkten der Detektoren 45, 46 und 47. Vom Bildkorrekturrechner 5 werden in der Auswerte- und Verarbeitungseinheit 8 aus den einzelnen Abtastwerten 42 von Durchlicht-, Auflicht- und Konfokaldetektor 45, 46, 47 jeweils rekonstruierte Bilder 7 zusammengestellt.
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Mit der vorstehend beschriebenen Vorrichtung sind auf Basis des erfindungsgemäßen Verfahrens punktgenaue metrische Bildaufnahmen mit einem scannenden Bildaufnehmer ohne aufwändig geregelte oder korrigierte Präzisionsscanner möglich, wobei diese sogar eine größere Robustheit gegenüber thermisch bedingten Änderungen der Scanbewegung aufweisen.
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Die Abschätzung der zukünftigen Scanbewegung kann beispielsweise genutzt werden, um eine als Objekt 3 dienende Probe, beispielsweise eine biologische Probe, zu manipulieren. Ist zum Beispiel aus einer vorangegangenen Auswertung eines Übersichtsbildes des Objekts 3 bekannt, welche Bereiche des Objekts 3 in je einer bestimmten Weise manipuliert werden sollen, kann die Lichtquelle 1 entsprechend angesteuert werden, wenn der Abtaststrahl 12 die betreffenden Rasterelemente beleuchtet (Scanner 2 nicht gezeigt). In der 8 ist schematisch die zukünftige Bahn der Scanbewegung als unterbrochene Volllinie gezeigt. Die schwarz ausgefüllten Bereiche des Objekts 3 sollen mittels der Strahlung des Abtaststrahls 12 gebleicht werden. Aufgrund der bekannten zukünftigen Scanbewegung kann die Lichtquelle 1 entsprechend angesteuert, beispielsweise ein- oder ausgeschaltet werden. Zusätzlich oder alternativ können auch Filter oder Blenden (shutter) (nicht dargestellt) in den Strahlengang des Abtaststrahls 12 eingebracht beziehungsweise aus diesem entfernt werden.
In weiteren Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in den ausgewählten Bereichen eine Aktvierung oder Anregung von Farbstoffen oder die Abgabe von gekapselten Substanzen (z. B. release of caged compounds) mittels einer entsprechenden Ansteuerung der Lichtquelle 1 bewirkt werden.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Strahlungsquelle
- 10
- Beleuchtungsstrahlengang
- 11
- Laser
- 12
- Abtaststrahl
- 13
- Strahlteiler
- 14
- Strahlteiler
- 2
- Scanner
- 21
- Spiegel
- 22
- Resonanzscanner
- 23
- Galvanometerscanner
- 3
- Objekt
- 4
- Strahlungsdetektor
- 41
- zeilenweise erfasstes Objektbild
- 42
- Abtastwert
- 43
- Integrator
- 44
- LVDS-Multiplexer
- 45
- Durchlichtdetektor (7)e
- 46
- Auflichtdetektor (7)
- 47
- Konfokaldetektor
- 5
- Bildkorrekturrechner
- 51
- Bildumrechnung
- 56
- Auswerteeinheit
- 6
- Scananalyseeinheit
- 61
- Positionsdetektor
- 611
- Positionsdetektion
- 612
- Positionsdaten
- 613
- Rückseitendetektor
- 614, 614'
- Lichtquelle (des Rückseitendetektors)
- 615
- Positionszwischenspeicher
- 62
- Bewegungsfunktionskorrelator
- 621
- Funktionskorrelation
- 622
- Regressionsrechnung
- 623
- Korrelationszwischenspeicher
- 63
- Pixelpositionsrechner
- 64
- Pixelzuordnungsverteiler
- 641
- Pixelkoordinatenberechnung
- 642
- Zuordnungsfunktion
- 7
- rekonstruiertes Bild
- 8
- Verarbeitungseinheit
- fP
- erste Abtastfrequenz
- fS
- zweite Abtasttfrequenz
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 10261155 B4 [0003]
- US 6914238 B2 [0004]
- DE 19702752 C2 [0005]
