DE102007008009B3

DE102007008009B3 - Verfahren zur Ansteuerung eines Scanmikroskops

Info

Publication number: DE102007008009B3
Application number: DE200710008009
Authority: DE
Inventors: Bernd Widzgowski; Holger Birk
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2007-02-15
Filing date: 2007-02-15
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2027-02-16

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Steuerung eines eine Strahlablenkeinrichtung (130) umfassenden Scanmikroskist: - die Strahlablenkeinrichtung (130) wird mittels eines Ansteuersignals (150) angesteuert, um eine Scanbewegung durchzuführen; - ein Messsignal (140, 140') wird erzeugt, wobei das Messsignal (140, 140') mindestens eine Information über eine Frequenz und/oder eine Phase und/oder eine Amplitude der Strahlablenkeinrichtung (130) aufweist; - in einem Signalverarbeitungsschritt wird das Messsignal (140, 140') einer Signalverarbeitung unterworfen und ein aufbereitetes Messsignal (144) erzeugt; - in einem Steuerschritt wird mittels des aufbereiteten Messsignals (144) das Ansteuersignal (150) gesteuert und/oder geregelt und/oder modifiziert; und - in einem Aufnahmeschritt wird mittels des aufbereiteten Messsignals (144) eine Aufnahme von Bilddaten gesteuert und/oder aufgenommene Bilddaten einer Position auf einer Probe (118) zugeordnet.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steuerung eines eine Strahlablenkeinrichtung umfassenden Scanmikroskops. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Scanmikroskop, welches eingerichtet ist, um ein erfindungsgemäßes Verfahren durchzuführen. Derartige Verfahren und Scanmikroskope werden insbesondere im Bereich der Analytik eingesetzt, insbesondere im Bereich der Materialuntersuchung, der Biologie oder der Medizin.
Stand der Technik
Scannmikroskope werden in den verschiedensten Bereichen der Technik und Naturwissenschaften eingesetzt. Ein Grundprinzip derartiger Scanmikroskope besteht darin, dass ein oder mehrere Mikroskopstrahlen mittels einer Strahlablenkeinrichtung in einer oder mehreren Dimensionen abgelenkt werden, um so eine Probe abzurastern (Scan).
Scanmikroskope sind in verschiedenen Varianten bekannt, welche sich beispielsweise in der Art und Erzeugung des Mikroskopstrahles unterscheiden. So können beispielsweise elektromagnetische Strahlen im optischen, infraroten oder ultravioletten Bereich des Spektrums eingesetzt werden, oder auch in anderen Bereichen des elektromagnetischen Spektrums, beispielsweise im Röntgenbereich. Auch andere Arten von Strahlen sind möglich, beispielsweise Partikelstrahlen in Form von Elektronenstrahlen oder geladenen oder neutralen Teilchen. Auch die gleichzeitige Verwendung mehrerer Mikroskopstrahlen ist denkbar.
Weitere Unterschiede zwischen den verschiedenen Arten von Scanmikroskopen ergeben sich aus der Wechselwirkung des bzw. der Mikroskopstrahlen mit der zu untersuchenden Probe. Bei der folgenden Beschreibung wird im Wesentlichen auf Fluoreszenzmikroskope Bezug genommen, bei welchen der Mikroskopstrahl eine Probenfluoreszenz anregt, welche erfasst werden kann und zur Bildaufnahme genutzt wird. Daneben existieren jedoch zahlreiche weitere Messprinzipien, beispielsweise Messprinzipien, welche auf laserspektroskopischen Verfahren beruhen, Messprinzipien, welche auf einer Teilchenemission beruhen oder andere Messprinzipien. Die nachfolgende Erfindung ist grundsätzlich auf alle derartigen Verfahren anwendbar.
Eine wesentliche Herausforderung, welche insbesondere die Abbildungsqualität der erzeugten Bildinformationen bestimmt, liegt in der Ansteuerung der mindestens einen Strahlablenkeinrichtung, über welche ein derartiges Scanmikroskop verfügt. Wird beispielsweise eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten, so beschreibt idealerweise die Auftreffstelle des Abtastlichtstrahls auf bzw. in der Probe ein Mäandermuster. Dabei wird idealerweise eine Zeile in X-Richtung bei konstanter Y-Position abgetastet, um anschließend auf die nächste abzutastende Zeile zu schwenken und dann bei konstanter Y-Position diese Zeile in negativer X-Richtung abzutasten. Die Abtastbahn weicht bei zunehmend höherer Abtastgeschwindigkeit jedoch mehr und mehr von einer Mäanderform ab. Dieses Phänomen ist im Wesentlichen auf die Massenträgheit der bewegten Elemente zurückzuführen, so dass bei schnellem Abtasten die Abtastbahn eher einer Sinuskurve ähnelt. Dabei kommt es auch oft vor, dass sich die Teil-Bahnkurve für die Abtastung in positiver X-Richtung von der Teil-Bahnkurve in negativer X-Richtung unterscheidet.
Die DE 197 02 752 A1 beschreibt ein Ansteuersystem für einen Scannerbetrieb. Das Ansteuersystem umfasst einen Schwingmotor zum Antreiben eines Schwingspiegels, der zur linear oszillierenden Ablenkung eines Strahlenbündels dient. Weiterhin umfasst das Ansteuersystem eine Ansteuereinheit zur Speisung des Schwingmotors mit einem Erregerstrom, einen mit der Ansteuereinheit verbundenen Funktionsgenerator sowie einen Messwertaufnehmer zur Gewinnung von Informationen über die Ablenkposition des Schwingspiegels. Der Messwertaufnehmer ist über eine Logikeinheit zur Ermittlung von Korrekturwerten für den Erregerstrom mit dem Funktionsgenerator verknüpft. Aus den vom Messwertaufnehmer zur Verfügung gestellten Informationen über die tatsächliche Ablenkposition des Schwingspiegels werden mittels der Logikeinheit Korrekturwerte ermittelt. Diese werden genutzt, um die vom Funktionsgenerator ausgegebenen Ansteuerfrequenzen so zu beeinflussen, dass die Abweichungen minimiert bzw. vollkommen vermieden werden.
Bei herkömmlichen Verfahren wird dabei in festen Zeitabständen während eines Abtastvorganges eine Bildinformation aufgenommen und so Rasterpunkt für Rasterpunkt abgetastet. Eine Problematik besteht dabei jedoch darin, diese Messwerte eindeutig der zugehörigen Scanposition zuzuordnen, um aus den Messdaten ein Bild zu erzeugen.
DE 101 44 593 A1 beschreibt daher ein Verfahren, bei welchem mittels eines unabhängigen Oszillators eine Antriebsoszillation mit einer Antriebsfrequenz innerhalb eines Resonanzbereiches erzeugt wird. Diese Antriebsoszillation wird an eine resonante Strahlablenkeinrichtung übergeben. Gleichzeitig kann diese Antriebsoszillation bzw. ein daraus abgeleitetes Signal genutzt werden, um einen Pixeltakt zu erzeugen, in welchem vom Objekt ausgehendes Detektionslicht detektiert wird.
Das in DE 101 44 593 A1 dargestellte Verfahren stellt einen erheblichen Fortschritt hin zu einer Verbesserung der Bildqualität insbesondere bei resonanten Scanmikroskopen dar. Gleichwohl hat es sich gezeigt, dass in vielen Fällen weitere Verbesserungen erforderlich sind. So haben beispielsweise in optischen Scanmikroskopen verwendete Galvanometer typischerweise eine Güte von ca. 4000 bei einer Resonanzfrequenz von ca. 8000 Hz. Bei einer Frequenzverschiebung im Bereich der Resonanzfrequenz von lediglich 1:4000 (2 Hz) ändert sich beispielsweise die Phasenlage zwischen Ansteuerung der Strahlablenkeinrichtung und tatsächlicher Position um ca. 90°. Eine derartige Verschiebung entspricht bei einer Datenerfassung bereits etwa einer vollständigen Zeilenlänge. Dieses einfache Beispiel zeigt, dass für eine weitere Verbesserung der Bildqualität eine genauere Ansteuerung der Strahlablenkeinrichtung und eine Synchronisation der exakten Strahlposition mit einer Bilddatenerfassung wünschenswert wären.
Aufgabe der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein Verfahren und ein Scanmikroskop bereitzustellen, welche eine präzisiere Steuerung einer Strahlablenkeinrichtung ermöglichen und insbesondere eine Ansteuerung der Bilderfassung und/oder eine genauere Zuordnung erfasster Bilddaten zu Positionen in und/oder auf einer zu untersuchenden Probe ermöglichen.
Beschreibung der Erfindung
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren gemäß dem unabhängigen Verfahrensanspruch sowie durch ein Scanmikroskop gemäß dem unabhängigen Vorrichtungsanspruch gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung, welche jeweils einzeln oder auch in Kombination verwirklicht werden können, sind in den Unteransprüchen dargestellt.
Das Verfahren umfasst die folgenden Verfahrensschritte, welche jedoch nicht notwendigerweise in der dargestellten Reihenfolge durchgeführt werden müssen. Es können auch Verfahrensschritte zeitlich parallel zueinander durchgeführt werden, einzelne Verfahrensschritte können zu einem einzigen Verfahrensschritt zusammengefasst werden, oder Verfahrensschritte können wiederholt durchgeführt werden.
Die Verfahrensschritte sind:

– eine Strahlablenkeinrichtung eines Scanmikroskops wird mittels eines Ansteuersignals angesteuert, um eine Scanbewegung durchzuführen;
– ein Messsignal wird erzeugt, wobei das Messsignal mindestens eine Information über eine Frequenz und/oder eine Phase und/oder eine Amplitude der Strahlablenkeinrichtung aufweist;
– in einem Signalverarbeitungsschritt wird das Messsignal einer Signalverarbeitung unterworfen und ein aufbereitetes Messsignal erzeugt; und
– in einem Steuerschritt wird mittels des aufbereiteten Messsignals das Ansteuersignal gesteuert und/oder geregelt und/oder modifiziert.

Dabei wird in einem Aufnahmeschritt mittels des aufbereiteten Messsignals eine Aufnahme von Bilddaten gesteuert und/oder aufgenommene Bilddaten werden einer Position auf einer Probe zugeordnet. In einem Syntheseschritt wird aus dem aufbereiteten Messsignal ein synthetisches Signal erzeugt. Das synthetische Signal ist dabei derart ausgestaltet, dass dieses mindestens eine Information über die Frequenz und/oder die Phase und/oder die Amplitude der Strahlablenkeinrichtung beinhaltet. Zur Erzeugung des synthetischen Signals und/oder des synthetischen Aufnahmesignals wird dabei ein direktes digitales Syntheseverfahren verwendet.
Im Gegensatz zur in DE 101 44 593 A1 aufgezeigten Idee wird also bei dem vorliegend vorgeschlagenen Verfahren nicht mit einem unabhängigen Oszillator zur Ansteuerung der Strahlablenkeinrichtung gearbeitet, sondern es werden aktuelle Informationen über eine Position der Strahlablenkeinrichtung gewonnen, welche aufbereitet werden, um damit einerseits das Ansteuersignal selbst steuern bzw. regeln zu können (beispielsweise um eine Phasenlage der Ansteuerung konstant zu halten) und um gleichzeitig die Aufnahme von Bilddaten synchronisieren zu können mit der Position der Strahlablenkeinrichtung oder, alternativ oder zusätzlich, gewonnene Bilddaten einer bestimmten Position auf und/oder in der Probe zuordnen zu können.
Für die Strahlablenkeinrichtung können dabei beliebige Strahlablenkeinrichtungen, welche aus dem Stand der Technik bekannt sind, und welche eingangs bereits teilweise beschrieben wurden, eingesetzt werden. Das vorgeschlagene Scanmikroskop, welches eingerichtet ist, um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen, kann eine oder mehrere Strahlablenkeinrichtungen umfassen. Beispielsweise kann eine separate Strahlablenkeinrichtung für eine Strahlablenkung in X-Richtung und eine Strahlablenkeinrichtung für eine Ablenkung in Y-Richtung vorgesehen sein. Weiterhin können optische Elemente verschiedenster Art vorgesehen sein, beispielsweise Linsensysteme, um beispielsweise einen Punktscan oder einen Linienscan zu ermöglichen. Vorzugsweise ist das Scanmikroskop ein Mikroskop mit konfokaler Strahloptik.
Die Strahlablenkeinrichtung kann beispielsweise einen Spiegel und/oder ein Gitter umfassen. Derartige Strahlablenkeinrichtungen können resonant oder nicht-resonant betrieben werden. Insbesondere kann die Strahlablenkeinrichtung vorzugsweise einen Galvanometerspiegel umfassen, welcher insbesondere resonant betrieben werden kann. Die resonante Betriebsweise bietet den Vorteil, dass im Bereich der Resonanz eine erhebliche Amplitude erreicht wird.
Typische nicht-resonante Spiegel lassen sich in der Regel nur bis zu einer Scanfrequenz von ca. 1400 bis 1500 Hz einsetzen, wobei bei diesen Frequenzen im kHz-Bereich bereits eine deutliche Reduktion des Scanfeldes zu verzeichnen ist. Um eine ausreichende Amplitude und damit ein ausreichendes Scanfeld zu ermöglichen (beispielsweise eine Amplitude mit einer Strahlablenkung bis zu 8°) werden daher resonante Galvanometerspiegel eingesetzt, welche beispielsweise bei den bereits oben beschriebenen Frequenz im Bereich von einigen kHz (beispielsweise 8 kHz) betrieben werden.
Die beschriebene vorgeschlagene Vorgehensweise, bei welcher das Messsignal mit den Informationen über die tatsächliche augenblickliche Position der Strahlablenkeinrichtung (wobei unter „Position" sinngemäß eine Frequenz und/oder eine Phase und/oder eine Amplitude verstanden werden kann) sowohl zur Steuerung der Ansteuerung der Strahlablenkeinrichtung als auch zur Steuerung der Aufnahme der Bilddaten stellt somit einen erheblichen Schritt in Richtung einer hohen Bildauflösung und guten Bildqualität auch für hochauflösende Mikroskopieverfahren dar.
Die Signalverarbeitung in dem Signalverarbeitungsschritt kann unter Verwendung zahlreicher bekannter Signalaufbereitungstechniken erfolgen. Insbesondere lassen sich Frequenzfiltertechniken einsetzen, wie beispielsweise Bandpass-, Hochpass- oder Tiefpassfilterungen oder Kombinationen derartiger Techniken. Dabei kann auch eine Rauschunterdrückung erfolgen. Weiterhin kann eine Mittelwertbildung erfolgen, und es können Lock-In-Verfahren eingesetzt werden und andere phasensensitive Messverfahren. Auch PLL-Verfahren (Phase Locked Loop) können eingesetzt werden sowie Verfahren, bei welchen Kurven, insbesondere parametrisierte Kurven, an das Messsignal angepasst werden, wobei im letzteren Fall vorzugsweise dann die angepasste Kurve als aufbereitetes Messsignal verwendet wird. Derartige Verfahren sind aus dem Bereich der Hochfrequenztechnik bekannt und können als digitale und/oder als analoge Verfahren umgesetzt werden. Bei der Umsetzung können zumindest teilweise Softwarebausteine eingesetzt werden, oder es können, alternativ oder zusätzlich, auch ganz oder teilweise diskrete elektronische Bausteine für die Umsetzung eingesetzt werden. Wie oben bereits beschrieben, können die Aufnahme des Messsignals und die Signalverarbeitung des Messsignals in zeitlich nachgeordneter Reihenfolge erfolgen, oder diese Schritte können auch gleichzeitig durchgeführt werden.
So kann beispielsweise die Aufnahme des Messsignals auch grundsätzlich mit der Signalverarbeitung kombiniert werden, so dass, ohne weitere Berücksichtigung des „Rohmesssignals", unmittelbar die Aufnahme derart erfolgt, dass bereits das aufbereitete Messsignal aufgenommen wird.
Die beschriebenen vorteilhaften Verfahren zur Durchführung des Signalverarbeitungsschrittes lassen sich grundsätzlich unter Verwendung von entsprechender Hardware und/oder Software durchführen, das heißt unter Verwendung entsprechend eingerichteter Signalaufbereitungselektronik (beispielsweise eines Lock-In-Verstärkers), oder es können, alternativ oder zusätzlich, auch entsprechend programmtechnisch eingerichtete Prozessoren und Computer verwendet werden, um den Signalverarbeitungsschritt durchzuführen. Auch eine Kombination derartiger Techniken ist möglich.
Dabei hat es sich aufgrund der hohen Frequenzen und der hohen Genauigkeit derartiger Systeme als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn zur Durchführung des Signalverarbeitungsschrittes (bzw. zumindest eines Teils des Signalverarbeitungsschrittes ein digitaler Filter verwendet wird. Der digitale Filter kann z. B. als diskrete Hardwarekomponente (beispielsweise als elektronischer Baustein) implementiert sein oder kann, alternativ oder zusätzlich, auch ganz oder teilweise als Softwarebaustein realisiert werden. Dieser Softwarebaustein kann wiederum ganz oder teilweise vorzugsweise in einem Field Programmable Gate Array (FPGA) umgesetzt werden. Alternativ ist auch eine vollständige oder teilweise Umsetzung in einem digitalen Signalprozessor (DSP) möglich oder in einem anderen Baustein. Dabei stellt die bevorzugte Lösung die Verwendung des FPGAs dar, bei welchem es sich um einen freiprogrammierbaren Logikschaltkreis handelt. Mittels dieses FPGAs können digitale Schaltungen mit nahezu beliebiger Funktionalität realisiert werden, die sonst auf einzelnen integrierten Schaltkreisen mit festgelegten Funktionen durchgeführt werden müssten. Die Schaltung kann sogar im Betrieb des Mikroskops noch verändert werden, um Verbesserungen einzuarbeiten, veränderte Verfahren (beispielsweise mit unterschiedlichen Filterparametern) durchzuführen oder auch um Fehler zu korrigieren. Da die Funktion eines FPGAs in der Regel ausschließlich durch seine Konfiguration festgelegt wird, kann der gleiche Baustein für viele verschiedene Arten von Mikroskopen verwendet werden. Die vorgeschlagene Lösung zeichnet sich somit durch eine hohe Flexibilität, benutzerspezifische Einstellbarkeit und eine hohe Kosteneffizienz aus.
So wird in vielen Fallen, insbesondere bei optischen Scanmikroskopen (beispielsweise Fluoreszenzmikroskopen) eine subpixelgenaue Regelung der Steuerung der Strahlablenkeinrichtung und/oder der Bildaufnahme verlangt. Dies bedeutet bei den oben beschriebe nen Frequenzen von ca. 8 kHz und einer Güte von ca. 4000, dass die Messung der Phase mit einer Genauigkeit von besser als 0,09° bzw. eine Amplitudenmessung mit einer Genauigkeit von mehr als 1:1000 erfolgen sollte. Dies kann beispielsweise durch Realisierung eines Lock-In-Verfahrens auf einem FPGA gewährleistet werden. Bei dem Lock-In-Verfahren handelt es sich um eine phasenempfindliche Gleichrichtung, welche insbesondere für die Messung schwacher Signale einsetzbar ist. Dabei ist das schwache Signal in der Regel mit einem (z. B. in Frequenz und Phase bekannten) Referenzsignal moduliert. Durch entsprechende Mischung mit dem Referenzsignal und nachfolgende Frequenzfilterung lässt sich das Signal mit gutem Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR, Signal to Noise Ratio) messen. Verschiedene Arten von Lock-In-Verfahren sind bekannt und im Rahmen der Erfindung einsetzbar. Zusätzlich kann eine Mittelung über mehrere Perioden erfolgen. Daneben sind auch andere Signalaufbereitungsverfahren, wie beispielsweise die oben beschriebenen phasenempfindlichen Messverfahren, Anpassungsverfahren (Fits), PLL-Verfahren oder ähnliche Verfahren auf einem FPGA realisierbar. Weiterhin wird auch eine Nutzung von Hin- und Rücklauf des Scans zur Bildaufnahme (bidirektional) und damit ein höherer Duty Cycle ermöglicht.
Die vorgeschlagene Verwendung des aufbereiteten Messsignals zur Steuerung des Ansteuersignals, insbesondere zur Regelung desselben, ist in vielen Fällen, insbesondere unter den zuvor genannten Bedingungen, erforderlich, da sich die Resonanzfrequenz der Strahlablenkeinrichtung temperaturbedingt leicht um mehrere Hertz verschieben kann. Eine derartige Regelung der Frequenz des Ansteuersignals kann beispielsweise anhand des Phasenwertes des aufbereiteten Messsignals erfolgen. Gleichzeitig oder alternativ kann, vorzugsweise mit langsamerer Zeitkonstante, auch die Amplitude der Strahlablenkeinrichtung gesteuert bzw. geregelt werden, ebenfalls unter Verwendung des aufbereiteten Messsignals.
Bei den beschriebenen Güten im Bereich von mehreren 1000 und Resonanzfrequenzen im Bereich von einigen Kilohertz hat eine Frequenzverschiebung von wenigen Hertz bereits eine gravierende Auswirkung auf die Phasenlage zwischen Anregung und tatsächlicher Position der Strahlablenkeinrichtung. Um eine Phasenlage der Position der Signalablenkeinrichtung vorzugsweise subpixelgenau zu regeln (beispielsweise bei 1024 Pixeln pro Zeile) ist daher eine Frequenzeinstellung im Bereich von weniger als 2 mHz wünschenswert. Um der derartig genaue Ansteuersignale einstellen zu können, hat es sich daher als vorteilhaft erwiesen, mit synthetischen Ansteuersignalen zu arbeiten. Die im Folgenden beschriebene Idee der Verwendung synthetischer Signale, für die Ansteuerung der Signalablenkeinrichtung und/oder auch für die Steuerung bzw. Synchronisation der Bilderfas sung, lässt sich besonders bevorzugt in Kombination mit dem oben beschriebenen vorgeschlagenen Verfahren einsetzen. Alternativ ist jedoch auch eine Implementierung dieser Idee der Verwendung synthetischer Signale ohne die Realisierung der bzw. aller übrigen Merkmale des oben beschriebenen Verfahrens denkbar.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird in einem Syntheseschritt aus dem aufbereiteten Messsignal ein synthetisches Signal erzeugt. Dieses synthetische Signal ist derart ausgestaltet, dass dieses mindestens eine Information über die Frequenz und/oder die Phase und/oder die Amplitude der Strahlablenkeinrichtung beinhaltet. Diese Informationen werden im Folgenden summarisch und ohne Beschränkung auch als „Positionsinformationen" bezeichnet.
Das synthetische Signal kann mittels der oben beschriebenen Techniken erheblich rauschärmer ausgestaltet werden als das ursprüngliche Messsignal. So lässt sich beispielsweise das Signal-zu-Rausch-Verhältnis gegenüber dem ursprünglichen Messsignal um mindestens einen Faktor 10 verbessern, vorzugsweise um mindestens einen Faktor 100 und besonders bevorzugt um mindestens einen Faktor 1000.
Die direkte digitale Synthese (kurz DDS) ist ein Verfahren zur Erzeugung analoger Signale mit (nahezu) beliebiger Signalform und Frequenz mittels digitaler Hardware. Diese Hardware wird üblicherweise mit einer festen Frequenz betrieben. Entsprechend wird vorgeschlagen, das Scanmikroskop mit einem DDS-Baustein auszustatten. Derartige Bausteine können insbesondere mit einer festen Frequenz betrieben werden. DDS-Verfahren und DDS-Bausteine zeichnen sich dadurch aus, dass diese eine hohe Signalqualität in einem breiten Frequenzbereich zur Verfügung stellen können. Weiterhin eignen sich DDS-Bausteine und DDS-Verfahren gut, um schnelle und genaue Frequenz- und Phasenänderungen zu erzeugen. Kommerziell sind üblicherweise DDS-Bausteine erhältlich, die mit bis zu 1 GHz betrieben werden können und üblicherweise Signale im Bereich zwischen 0 Hz und 500 MHz ausgeben können. Unter einem „DDS-Baustein" kann dabei sowohl ein Softwarebaustein verstanden werden, welcher auf einem Hardwaremodul implementiert ist (beispielsweise auf einen FPGA und/oder einem DSP) als auch ein diskreter DDS-Hardwarebaustein.
Üblicherweise wird beim DDS-Verfahren eine Periode eines beliebigen 2π-periodischen Signals in einem Rechnerspeicher abgelegt. Idealerweise werden dabei möglichst viele Werte mit einer möglichst guten Amplitudenauflösung abgespeichert. Diese Tabelle von Amplituden (Stützstellen) ist in der Regel fest in einem DDS-Baustein gespeichert. Die gespeicherten Werte werden in einem gleichmäßigen Takt nacheinander über einen Digital-Analog-Umsetzer (DAC oder DAU) ausgegeben. In der (in dieser Erfindung bevorzugten, jedoch nicht ausschließlich einsetzbaren) Erzeugung eines synthetischen Sinussignals ergibt sich beispielsweise, abhängig von der Anzahl und der Quantisierungsgenauigkeit der Stützstellen und der Qualität einer gegebenenfalls nachfolgenden Filterung, wiederum ein mehr oder weniger genaues Sinussignal. Werden alle Speicherstellen pro Periode genau einmal ausgegeben so entsteht eine Grundfrequenz, die nur von der Anzahl der Stützstellen und der Ausgabegeschwindigkeit abhängt. Um andere Frequenzen als die Grundfrequenz zu erzeugen, wird bei der Ausgabe der Stützstellen nach einem vorgegebenen Rechenschema die Ausgabe einiger Speicherstellen übersprungen oder verdoppelt. Auf diese Weise lassen sich Frequenzänderungen im Millihertz-Bereich realisieren. Weiterhin lassen sich Ausgabefrequenzen und Phase der synthetischen Signale praktisch ohne Zeitversatz ändern, indem beispielsweise die Anzahl der ausgelassenen Stützstellen variiert wird oder lediglich Teile von Perioden übersprungen werden. Auf diese Weise lassen sich ohne größeren technischen Aufwand Frequenz- und Phasenmodulationen realisieren.
Alternativ zu einem synthetischen Sinussignal lassen sich jedoch auch andere, vorzugsweise periodische, synthetische Signalformen realisieren, wie beispielsweise ein synthetischer Cosinus oder ein Mischsignal derartiger Signale. Im Folgenden wird ohne Beschränkung dieser allgemeinen von der Erfindung umfassten Möglichkeiten anderer Signalformen die Verwendung eines synthetischen Sinussignals betrachten.
Für den vorgeschlagenen Einsatzzweck ist eine virtuelle DDS-Länge (Länge des Phasenakkumulators) von 8 Bit bis 64 Bit, vorzugsweise von 30 Bit, bevorzugt, sowie eine Ausgabe im Bereich von ca. 625 kHz. Daraus ergibt sich die Ausgabe eines 8 kHz-Signals eine Einstellgenauigkeit von ca. 0,5 mHz.
Wie oben beschrieben, ist insbesondere die Erzeugung eines synthetischen Sinussignals für die Steuerung der Strahlablenkeinrichtung bevorzugt. Dieses synthetische Sinussignal beinhaltet vorzugsweise die Frequenz und/oder Phase und/oder Amplitude der Strahlablenkeinrichtung und stellt somit eine äußerst präzise, praktisch rauschfreie und aktuelle Information über die Position der Strahlablenkeinrichtung dar. Diese aktuelle Information kann wiederum zur Steuerung und/oder Regelung der Strahlablenkeinrichtung verwendet werden, um beispielsweise die Frequenz und/oder die Phase und/oder die Amplitude der Strahlablenkeinrichtung auch für resonante Systeme mit der erforderlichen Genauigkeit zu steuern bzw. regeln.
Weiterhin kann die Idee der Verwendung eines DDS-Verfahrens bzw. von DDS-Bausteinen auch für die Aufnahme von Bilddaten eingesetzt werden. Dies stellt eine besonders vorteilhafte Weiterentwicklung der Idee der Verwendung von DDS-Verfahren zu der oben beschriebenen Erfindung dar, welche jedoch auch unabhängig hiervon, das heißt unabhängig von den zuvor beschriebenen Verfahrensschritten für die Aufnahme von Bilddaten eingesetzt werden kann. Als besonders vorteilhaft hat es sich dabei erwiesen, dass das oben beschriebene synthetische Signal, insbesondere das synthetische Sinussignal, welches Informationen über die aktuelle Position der Strahlablenkeinrichtung beinhaltet, entweder direkt oder indirekt verwendet wird, um auch in einem Aufnahmeschritt die Aufnahme von Bilddaten zu steuern. Alternativ oder zusätzlich kann dieses Signal auch direkt oder indirekt genutzt werden, um aufgenommene Bilddaten (beispielsweise unabhängig von der Position aufgenommene Bilddaten) einer bestimmten Position auf der Probe zuzuordnen.
Unter „direkt oder indirekt" ist dabei zu verstehen, dass entweder das erzeugte synthetische Signal, insbesondere der synthetische Sinus, unmittelbar mit einer Position auf und/oder in der Probe korreliert wird, beispielsweise um jeweils einen Bildpunkt mit einer Bildinformation und einer zugehörigen Positionskoordinate bzw. Positionskoordinaten zu erzeugen. Alternativ kann das zuvor beschriebene synthetische Signal auch in ein weiteres Signal umgewandelt werden, beispielsweise indem aus dem synthetischen Signal ein synthetisches Aufnahmesignal erzeugt wird. Dieses synthetische Aufnahmesignal kann beispielsweise unmittelbar eine Position eines Mikroskopstrahls auf und/oder in der Probe beinhalten. Dieses synthetische Aufnahmesignal, wobei es sich beispielsweise wiederum um einen (zweiten) synthetischen Sinus handeln kann, kann dann genutzt werden, um die Aufnahme von Bilddaten zu steuern und/oder aufgenommene Bilddaten einer Position auf und/oder in einer Probe zuzuordnen, analog der obigen Beschreibung der unmittelbaren Verwendung des synthetischen Signals.
Dieses vorgeschlagene Verfahren, bei welchem mit synthetischen Signalen und/oder synthetischen Aufnahmesignalen gearbeitet wird, wird, wie oben beschrieben, erfindungsgemäß mittels eines direkten digitalen Syntheseverfahrens (DDS) umgesetzt. Neben DDS können jedoch auch andere Verfahren zur Erzeugung der synthetischen Signale eingesetzt werden. Auch müssen nicht notwendigerweise Sinussignale eingesetzt werden, sondern es können auch andere Signalformen verwendet werden, wie beispielsweise Rechtecksignale, Dreiecksignale, Sägezahnsignale oder sogar nicht-periodische Signale.
Das beschriebene Verfahren in einer der oben genannten Ausgestaltungen lasst sich insbesondere mittels einer elektronischen Steuerung in dem vorgeschlagenen Scanmikroskop umsetzen. Unter einer elektronischen Steuerung ist dabei jedoch nicht notwendigerweise eine einzelne Einheit zu verstehen, sondern die elektronische Steuerung kann mehrere, integrierte oder auch dezentralisiert angeordnete Komponenten umfassen, welche eingerichtet sind, um die obigen Verfahrensschritte ganz oder teilweise durchzuführen. Neben den bereits genannten elektronischen Bausteinen (wie beispielsweise einem FPGA, einem DSP oder einem DDS-Schaltkreis), kann beispielsweise auch ein Computersystem zum Einsatz kommen, beispielsweise ein Mikrocomputer, beispielsweise in Form eines eingebetteten Systems und/oder in Form eines separaten Personal-Computers. Auch eine Kombination mehrerer Computersysteme ist denkbar. Diese können entsprechend programmtechnisch eingerichtet sein, um die beschriebenen Verfahrensschritte ganz oder teilweise durchzuführen. Weiterhin können entsprechend flüchtige und/oder nicht-flüchtige Speicherelemente vorgesehen sein sowie Ein- und Ausgabemittel, insbesondere ein Bildschirm zur Darstellung der Bilddaten.
Wie oben beschrieben, kann die Strahlablenkeinrichtung beispielsweise einen oder mehrere Ablenkspiegel umfassen. Um einen möglichst großen Scanbereich zu erreichen, ist die Verwendung eines oder mehrerer resonant betriebener Galvanometerspiegel bevorzugt. Eine vorteilhafte Weiterbildung des vorgeschlagenen Verfahrens und des vorgeschlagenen Scanmikroskops betrifft die Gewinnung des Messsignals, welches die mindestens eine Information über die Position der Strahlablenkeinrichtung beinhaltet. Dieses mindestens eine Messsignal kann beispielsweise unmittelbar aus der Galvanometersteuerung bzw. der entsprechenden Ansteuerung der Strahlablenkeinrichtung gewonnen werden, beispielsweise indem elektrische Signale, welche diese Ansteuerung bereitstellt, ausgewertet werden. So kann beispielsweise eine kapazitive Messeinrichtung und/oder eine induktive Messeinrichtung vorgesehen sein, welche aktuelle Ansteuersignale entsprechend auswertet und das Messsignal erzeugt.
Da die Mechanik und/oder Elektronik zur Steuerung der Strahlablenkeinrichtung, insbesondere des Galvanometerspiegels, jedoch in der Regel entfernt von der eigentlichen Strahlablenkeinrichtung angeordnet ist und mit dieser beispielsweise über eine Welle oder ähnliche mechanische Aktoreinrichtung verbunden ist, sind die derart gewonnenen Signale häufig mit gewissen Fehlern behaftet, welche beispielsweise in einer Phasenverschiebung des Messsignals zur tatsächlichen Position der Strahlablenkeinrichtung, in einer Frequenzverschiebung und/oder auch in einer verfälschten Amplitude bestehen können. In einer vorteilhaften Weiterbildung werden daher eine unmittelbare Messmethode und eine Mess einrichtung verwendet, welche ausgelegt ist, um unmittelbar die Position der Strahlablenkeinrichtung zu erfassen.
So kann die Messeinrichtung eine Einrichtung zur Messung einer Frequenz und/oder Phase und/oder Amplitude der Strahlablenkeinrichtung mit einer optischen Messeinrichtung umfassen. Diese optische Messeinrichtung kann beispielsweise einen Detektor zur Detektion mindestens eines von der Strahlablenkeinrichtung emittierten und/oder reflektierten optischen Signals umfassen. Auf diese Weise kann die Position der Strahlablenkeinrichtung unmittelbar und in Echtzeit erfasst werden.
Der Detektor kann beispielsweise eine Kamera umfassen, welche beispielsweise unmittelbar die Strahlablenkeinrichtung beobachtet und entsprechend deren Stellung bestimmt. Bevorzugt ist es jedoch, wenn der Detektor einen positionssensitiven Detektor, ein Array von mindestens zwei Photodetektoren, eine Anordnung mindestens zweier unter verschiedenen Winkelstellungen zur Strahlablenkeinrichtung angeordneter Photodetektoren, eine Vierquadrantendiode, eine Zweiquadrantendiode oder eine Kombination der vorgenannten Elemente aufweist. Diese Detektoren können entweder wiederum unmittelbar die Strahlablenkeinrichtung beobachten, oder die Messeinrichtung kann eine Vorrichtung zur Erzeugung eines Messstrahls umfassen, insbesondere eines infraroten Messstrahls (wobei jedoch auch andere Wellenlängebereiche denkbar sind), welcher auf die Strahlablenkeinrichtung gerichtet ist und dort das optische Signal bewirkt. Dieses optische Signal kann beispielsweise in einer Reflexion des Messstrahls bestehen, oder es können auch beispielsweise Fluoreszenzen ausgelöst werden. Aufgrund der einfach zu realisierenden Messweise ist jedoch eine Reflexionsanordnung bevorzugt.
Positionssensitive Photodetektoren (auch PSDs genannt) sind optische Positionssensoren, welche eine Position eines Lichtpunktes messen können. Dabei können verschiedene Prinzipien zum Einsatz kommen. Es können isotrope Sensoroberflächen eingesetzt werden, welche eine kontinuierliche Positionsinformation liefern, oder es können, alternativ oder zusätzlich, auch diskrete Sensoren zum Einsatz kommen, beispielsweise Sensoren, deren Oberfläche rasterartig strukturiert ist und welche daher eine diskrete Ortsinformation liefern. Beispielsweise können Halbleiterbauelemente mit mehreren Elektrodenanschlüssen verwendet werden, wobei sich das Verhältnis der Ströme an den einzelnen Elektrodenanschlüssen je nach Position des Lichtpunktes auf der Sensoroberfläche ändert. Auch andere Prinzipien sind bekannt.
Besonders bevorzugt ist, wie oben beschrieben, eine unmittelbare Messung der Position des Galvanometerspiegels mittels eines reflektierten Messstrahls. Zu diesem Zweck kann der Galvanometerspiegel bzw. eine andere Form einer Strahlablenkeinrichtung beispielsweise auf einer Rückseite verspiegelt ausgestaltet sein. Alternativ könnte jedoch auch eine reflektierende Vorderseite genutzt werden, an welcher gleichzeitig oder zeitversetzt der bzw. die Mikroskopstrahlen abgelenkt werden. Auch andere Positionen für eine Reflexion an der Strahlablenkeinrichtung sind jedoch denkbar, wobei aus Genauigkeitsgründen jedoch eine Reflexionsposition in räumlicher Nähe zum Galvanometerspiegel bevorzugt wird.
Insgesamt stellt diese Weiterbildung der Verwendung einer Messeinrichtung einen weiteren wesentlichen Schritt hin zu einer verbesserten Synchronisation der Strahlablenkeinrichtung und der Datenerfassung und somit zu einer Verbesserung der Bildqualität dar. Diese und auch andere der oben beschriebenen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer der beschriebenen Ausgestaltungen sowie des vorgeschlagenen Scanmikroskops in einer der beschriebenen Formen lassen sich nicht nur bei Verwendung resonanter Strahlablenkeinrichtungen einsetzen, sondern sind auch bei Einsatz nicht-resonanter Anordnungen mit periodischen Ablenkungen vorteilhaft einsetzbar. So lassen sich beispielsweise nicht-resonante Anordnungen realisieren, welche besonders große, bislang nicht zugängliche Formate an Proben abscannen.
Ausführungsbeispiele
Weitere Einzelheiten und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt. Die Ausführungsbeispiele sind in den Figuren schematisch dargestellt. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche oder funktionsgleiche bzw. hinsichtlich der Funktionen einander entsprechende Elemente.
Im Einzelnen zeigt:
1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Scanmikroskops zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens;
2A und B Beispielen von Resonanzkurven einer Strahlablenkeinrichtung; und
3A bis 3C Ausführungsbeispiele einer Strahlablenkeinrichtung mit verschiedenen Möglichkeiten zur Erzeugung eines Messsignals.
In 1 ist ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Scanmikroskops 110 schematisch dargestellt. Dabei ist exemplarisch das hier dargestellte Scanmikroskop 110 als Fluoreszenzmikroskop ausgestaltet, welches in seinem optischen Aufbau beispielsweise dem in DE 101 44 593 A1 beschriebenen Aufbau entsprechen kann. Wie oben beschrieben sind jedoch auch andere Arten von Scanmikroskopen 110 realisierbar.
Das Scanmikroskop weist eine Lichtquelle 112 zur Erzeugung eines Mikroskopstrahls 114 sowie einen Mikroskopdetektor 116 zur Detektion eines von einer Probe 118 emittierten und/oder reflektierten und/oder transmittierten Bildstrahls 120 (in 1 gestrichelt dargestellt) auf. Dabei sind allgemein in 1 optische Strahlen mit offenen Pfeilspitzen dargestellt, im unterschied zu elektrischen Signalen bzw. elektrischen Verbindungen einzelner Komponenten, welche mit geschlossenen Pfeilspitzen dargestellt sind. Neben den beschriebenen Elementen weist das Scanmikroskop 110 einen oder mehrere Strahlteiler 122 zur Trennung von Mikroskopstrahl 114 und Bildstrahl 120 sowie ein optisches System 124 und Blenden 126, 128 auf. Sämtliche Elemente sind in 1 lediglich symbolisch dargestellt und können beliebig und entsprechend dem Wissen des Fachmanns erweitert werden, beispielsweise durch Einsatz zusätzlicher Linsensysteme, Blenden, Spiegel, Filter oder Strahlteile.
Die Lichtquelle 112 kann beispielsweise einen oder mehrere Laser umfassen, insbesondere Laser mit fester und/oder variabler Wellenlänge, wobei sowohl der Einsatz von Dauerstrichlasern als auch der Einsatz gepulster Laser denkbar ist. Auch andere Lichtquellen sind jedoch einsetzbar, beispielsweise konventionelle Glühlampen, Entladungslampen oder auch Leuchtdiodensysteme.
Auch für den Mikroskopdetektor 116 lassen sich eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Techniken einsetzen. So kann der Mikroskopdetektor 116 beispielsweise einen oder mehrere Photomultiplier und/oder andere Arten von Photodetektoren umfassen, welche vorzugsweise in ihrer Sensitivität auf den Bildstrahl 120 angepasst sind.
Ein Kernelement des Scanmikroskops 110 stellt eine (in 1 ebenfalls nur symbolisch angedeutete) Strahlablenkrichtung 130 dar. Hierbei kann es sich in diesem Ausführungsbeispiel gemäß 1 bevorzugt um einen Scanspiegels in Form eines Galvanometerspiegels handeln. Wie oben beschrieben, kann die Strahlablenkeinrichtung 130 jedoch auch mehrere derartiger Spiegel umfassen, beispielsweise für eine Strahlablenkung in verschiedenen Raumrichtungen. Im Folgenden sei angenommen, dass diese Strahlablenkeinrichtung 130 resonant betrieben wird.
Neben den zuvor beschriebenen optischen, optomechanischen und mechanischen Komponenten, welche für die Bildgebung, Bildaufnahme und Formung des optischen Strahlengangs erforderlich sind, weist das Scanmikroskop 110 eine elektronische Steuerung 132 auf. Diese elektronische Steuerung 132 setzt sich beispielsweise aus mehreren Einzelkomponenten zusammen, welche dezentral oder auch ganz oder teilweise integriert in einem einzelnen Steuermodul ausgestaltet sein können. Eine vollständige oder teilweise Umsetzung der Einzelkomponenten und Einzelfunktionen der Steuerung 132 mittels digitaler und/oder analoger Softwarebausteine ist denkbar und/oder eine vollständige oder teilweise Umsetzung mittels diskreter elektronischer Hardwarebausteine.
So verfügt die elektronische Steuerung 132 über einen Prozessor 134, bei welchem es sich beispielsweise um einen Prozessor eines Personal-Computers (nicht dargestellt) und/oder auch um einen Mikroprozessor handeln kann. Neben dem Prozessor 134 können weitere Computerbausteine (nicht dargestellt) vorgesehen sein, wie beispielsweise Speicherelemente. Ebenfalls nicht dargestellt sind Ein- und Ausgabemittel, mit Ausnahme eines Bildschirms 135, welcher eingerichtet ist, um Bilddaten eines oder mehrerer Scans des Scanmikroskops grafisch darzustellen.
Weiterhin weist das Scanmikroskop eine Steuerung 136 zur Ansteuerung der Strahlablenkeinrichtung 130 auf. Diese Steuerung 136 kann elektrische und/oder elektromechanische und/oder auch mechanische Komponenten aufweisen, beispielsweise um einen oder mehrere Galvanometerspiegel entsprechend zu steuern. Entsprechend ist diese Steuerung 136 mit der Strahlablenkeinrichtung 130 verbunden. Weiterhin kann die Steuerung 136 auch mit dem Prozessor 134 verbunden sein, um mit diesem entsprechende Signale auszutauschen, so dass beispielsweise über den Prozessor 134 Vorgaben an die Steuerung 136 übermittelt werden können.
Weiterhin umfasst das Scanmikroskop 110 in diesem Ausführungsbeispiel eine Messeinrichtung 138. Diese Messeinrichtung 138 ist mit der Strahlablenkeinrichtung 130 verbunden und ist ausgestaltet, um mindestens ein Messsignal 140 zu erzeugen. Dieses mindestens eine Messsignal 140 enthält mindestens eine Information über eine Frequenz und/oder eine Phase und/oder eine Amplitude der Strahlablenkeinrichtung 130. Alternativ kann die Messeinrichtung 138 auch mit der Steuerung 136 zusammenwirken, so dass ein Messsignal 140' unmittelbar aus der Steuerung 136 entnommen werden kann. Dies ist in 1 symbolisch durch den gestrichelten Pfeil dargestellt. Dieses Messsignal 140' kann beispielsweise kapazitive und/oder induktive Messsignale der Steuerung 136 umfassen und/oder daraus abgeleitete Signale.
Das bzw. die Messsignale 140 bzw. 140' werden übermittelt an einen FPGA 142. In diesem FPGA 142 werden die Messsignale 140 bzw. 140' einer Signalverarbeitung unterzogen, wobei beispielsweise, wie oben beschrieben, ein Lock-In-Verfahren eingesetzt werden kann. Zu diesem Zweck kann das FPGA auch weitere Informationen verarbeiten, beispielsweise im Rahmen eines Lock-In-Verfahrens periodische Ansteuersignale der Steuerung 136, periodische Signale eines DDS (siehe unten) und/oder periodische Signale, welche vom Prozessor 134 geliefert werden. Diese können beispielsweise in dem Lock-In-Verfahren mit dem Messsignal 140 bzw. 140' gemischt werden, entsprechend der bekannten Lock-In-Technik.
Auf diese Weise erzeugt das FPGA 142 in dem Signalverarbeitungsschritt ein aufbereitetes Messsignal, welches in 1 symbolisch mit der Bezugsziffer 144 bezeichnet ist. Dieses aufbereitete Messsignal 144 wird an einen DDS-Baustein 146 übermittelt, in welchem aus diesem aufbereiteten Messsignal ein synthetisches Signal 148 erzeugt wird. Dieses synthetische Signal 148, bei welchem es sich vorzugsweise um ein synthetisches Sinussignal handeln kann, wird wiederum an die Steuerung 136 der Strahlablenkeinrichtung 130 übermittelt und wird dort zur Steuerung bzw. Regelung des Ansteuersignals 150 für die Strahlablenkeinrichtung 130 verwendet. Auf diese Weise kann insbesondere eine Rückkopplung hochaktueller und präziser Informationen über die Position der Strahlablenkeinrichtung genutzt werden, um die Ansteuerung der Strahlablenkeinrichtung zu verbessern, beispielsweise um eine Frequenz und/oder eine Amplitude und/oder eine Phase einer Scanbewegung der Strahlablenkeinrichtung 130 präzise einzustellen bzw. zu regeln. Zu Beginn einer Messung kann, insbesondere wenn noch keine Messsignale 140, 140' zur Verfügung stehen, der DDS 146 über den Prozessor 134 angesteuert werden, um entsprechende synthetische Signale 148 als Anfangsvorgaben an die Steuerung 136 zu liefern. Alternativ oder zusätzlich kann die Steuerung 136 auch unmittelbar über den Prozessor 134 angesteuert werden, um entsprechende Anfangsvorgaben zu liefern.
Das synthetische Signal 148 kann weiterhin auch vom DDS 146 an den Prozessor 134 übermittelt werden, um dort als aktuelle Information zur Verfügung zu stehen.
Weiterhin kann das synthetische Signal 148 auch für die Aufnahme von Bilddaten genutzt werden. Zu diesem Zweck wird das synthetische Signal 148 in der in 1 dargestellten Ausführungsform jedoch nicht unmittelbar verwendet, sondern wird zunächst an einen zweiten DDS 152 übermittelt, um dort in ein synthetisches Aufnahmesignal 154 umgewandelt zu werden. Dieses synthetische Aufnahmesignal 154 ist vorzugsweise derart ausgestaltet, dass dieses eine aktuelle Information über die Position des Mikroskopstrahls 114 auf bzw. in der Probe 118 beinhaltet.
Diese Information kann an eine Bilderfassungseinrichtung 156 übermittelt werden. Dort kann diese Information auf zweifache Weise genutzt werden: Einerseits können dort zu beliebigen Zeiten Bildinformationen, welche vom Mikroskopdetektor 116 an die Bilderfassungseinrichtung 156 geliefert werden, ausgewertet und jeweils einer bestimmten Position des Mikroskopstrahls 114 auf bzw. in der Probe 118 zugeordnet werden. Auf diese Weise kann beispielsweise eine entsprechende Bilddatenmatrix erstellt werden, welche dann beispielsweise auf dem Bildschirm 135 dargestellt werden kann oder auch in einem entsprechenden Speicher abgespeichert werden kann.
Eine weitere, bevorzugte Möglichkeit besteht darin, die Bilddatenerfassung selbst durch das synthetische Aufnahmesignal 154 zu steuern. So kann beispielsweise die Bilderfassung derart getriggert werden, dass jeweils Bildpunkte in äquidistanten Abstanden in bzw. auf der Probe 118 erfasst werden. Auf diese Weise gibt sich ein räumlich äquidistantes Rasterbild der Probe 118. Beim Abscannen dieser Probe 118 durch den Mikroskopstrahl 114. Weiterhin sei erwähnt, dass das synthetische Aufnahmesignal 154 auch genutzt werden kann, um die Lichtquelle 112 anzusteuern, was beispielsweise bei bestimmten laserspektroskopischen Verfahren (beispielsweise Anregungs-Abfrage-Spektroskopie) von Vorteil sein kann.
In 1 wird, wie oben beschrieben, der FPGA 142 zur Durchführung des Signalverarbeitungsschrittes eingesetzt. Da es sich bei einem FPGA jedoch um ein sehr universell einsetzbares Element handelt, kann der FPGA neben der beschriebenen Signalverarbeitung weitere Aufgaben übernehmen, insbesondere weitere Aufgaben der Steuerung 132. Dies ist in 1 symbolisch mit der Bezugsziffer 143 dargestellt, welche in gestrichelter Umrandung zeigt, welche weiteren Komponenten/Funktionen der Steuerung 132 vorzugsweise ganz oder auch teilweise im FPGA integriert sein können. Auch andere Ausgestaltungen sind jedoch denkbar.
In den 2A und 2B sind Resonanzkurven dargestellt, welche bei einer typischen, resonant betriebenen Strahlablenkeinrichtung 130 in Form eines Galvanometerspiegels auftreten. Dabei zeigt 1 die Amplitude I der Ablenkung der Strahlablenkeinrichtung 130 (beispielsweise einen Verkippungswinkel eines Galvanometerspiegels), wohingegen in 2B die Phase φ der Verkippung des Galvanometerspiegels π in Grad aufgetragen ist. Auf der X-Achse ist dabei jeweils die Anregungsfrequenz f der Strahlablenkeinrichtung 130 in Hz aufgetragen.
In diesem Fall zeigt die Strahlablenkeinrichtung das Verhalten eines schwingenden Systems mit einer Resonanzfrequenz von ca. 8 kHz. Nähert sich die Anregungsfrequenz f dieser Resonanzfrequenz von 8 kH, so steigt die Amplitude stark an. So ändert sich die Amplitude in diesem Bereich bei einer Frequenzverschiebung von ca. 2 Hz um einen Faktor Zwei.
Die Darstellung der Phasenlage in 2B zeigt, dass unterhalb der Resonanzfrequenz von 8 kHz die Schwingung der Strahlablenkeinrichtung 130 der Anregungsfrequenz ohne größere Phasenverschiebung folgt. Nähert sich die Anregungsfrequenz dann der Resonanzfrequenz, so tritt eine Phasenverschiebung von ca. 90° auf, bis dann, oberhalb der Resonanzfrequenz, sich die Phase einem konstanten Wert einer Phasenverschiebung von 180° annähert.
Die Breite der in 2A dargestellten Resonanzkurve bestimmt die so genannte Güte des Resonators. Die Güte berechnet sich als der Quotient der Resonanzfrequenz, dividiert durch die Breite der in 2A dargestellten Resonanzkurve bei einer Amplitude von
der maximalen Amplitude bei der Resonanzfrequenz. In diesem Fall ergibt sich eine Güte von ca. 4000.
Diese Güte bestimmt wesentlich die Genauigkeit, mit der die Phasenlage geregelt werden muss. Bei der Resonanzfrequenz bedeutet eine relative Verschiebung der Resonanzfrequenz um 1:4000 (in diesem Fall 2 Hz) bereits eine Änderung der Phasenlage zwischen Anregung und tatsächlicher Position um ca. 90°. Eine derartige Verschiebung entspricht, wie oben beschrieben, bei der Datenerfassung in etwa einer kompletten Zeilenlänge. Um eine Phasenlage der Spiegelposition also subpixelgenau (bei 1024 Pixeln pro Zeile) regeln zu können, ist eine Frequenzeinstellung mit einer Genauigkeit von mehr als 2 mHz wünschenswert, wie sie beispielsweise durch das oben beschriebene Verfahren erreicht werden kann.
In den 3A bis 3C sind verschiedene Ausführungsbeispiele einer Strahlablenkeinrichtung 130 dargestellt, anhand derer verschiedene Beispiele und Möglichkeiten aufgezeigt werden sollen, wie Messsignale 140' bzw. 140 generiert werden können.
In allen Fällen weist die Strahlablenkeinrichtung 130 in diesen Beispielen einen Galvanometerspiegel 158 auf, welcher in dem Ausführungsbeispiel gemäß 3A in Vorderansicht (mit Blick auf die Spiegelfläche 160) und in den Ausführungsbeispielen gemäß den 3B und 3C in Seitenansicht dargestellt ist. Der Galvanometerspiegel 158 wird mittels einer mechanischen Antriebsachse 162 gedreht, um eine Scanbewegung des Galvanometerspiegels 158 durchzuführen. Dadurch wird der Mikroskopstrahl 114 auf der Probe 118 entsprechend abgelenkt, wobei der Bildstrahl 120 in 3B und 3C nicht dargestellt ist. Die Antriebsachse 162 wird durch einen elektromechanischen Steller 164 angetrieben, welcher in den 3B und 3C nicht dargestellt ist. Der Steller 164 wird wiederum durch eine Steuerung 136 mit einem entsprechenden Ansteuersignal 150 beaufschlagt, um die gewünschte Winkelstellung einzustellen bzw. um eine gwünschte Schwingbewegung durchzuführen.
Das Ausführungsbeispiel gemäß 3A entspricht dabei im Wesentlichen den Stand der Technik. Hierbei wird, wie oben beschrieben, das Messsignal 140 unmittelbar an der Steuerung 136 bzw. (alternativ oder zusätzlich) am Steller 164 abgegriffen. Beispielsweise kann es sich dabei um ein induktives oder kapazitives Signal handeln, beispielsweise ein Signal, welches mittels einer zusätzlichen Induktionsspule in einem Schwingkreis des Stellers 164 generiert wird. Dieses Messsignal 140', wie oben beschrieben, vorzugsweise dem FPGA 142 für eine Signalverarbeitung zugeführt.
In den Ausführungsbeispielen gemäß den 3B und 3C ist hingegen eine eigenständige Messeinrichtung 138 zur Erzeugung des Messsignals 140 vorgesehen. Diese Messeinrichtung 138 ist in dem in diesen Beispielen dargestellten Fall eine optische Messeinrichtung und umfasst eine Vorrichtung 166 zur Erzeugung eines (vorzugsweise optischen) Messstrahls 168. Beispielsweise kann es sich bei der Vorrichtung 166 um eine infrarote Leuchtdiode oder einen infraroten Laser handeln. Wie oben beschrieben sind jedoch auch andere Strahlenquellen einsetzbar sowie andere Arten von Messstrahlen.
Weiterhin umfasst die Messeinrichtung 138 einen Detektor 170. Der Messstrahl 168 wird dabei in diesem Ausführungsbeispiel auf die Rückseite des Galvanometerspiegels gelenkt, dort an einer Reflektorfläche 172 reflektiert und vom Detektor 170 aufgenommen. Ändert sich die Winkelstellung des Galvanometerspiegels 158 bei Drehung um die Antriebsachse 162, so ändert sich die Position, unter der der Messstrahl 168 auf den Detektor 170 auftrifft. Diese Position bzw. deren Änderung kann vom Detektor 170 erfasst werden.
Dabei unterscheiden sich die Ausführungsbeispiele gemäß den 3B und 3C in der Ausgestaltung des Detektors 170. So wird im Ausführungsbeispiel gemäß 3B ein positionssensitiver Detektor (PSD) 174 eingesetzt, der nach dem oben beschriebenen Prinzip eine Änderung des Auftreffpunktes des Messstrahls 168 auf seine Detektorfläche in entsprechende elektrische Signale umwandeln kann. Diese bilden dann das Messsignal 140, oder, alternativ oder zusätzlich, werden umgewandelt (z. B. durch eine Datenaufbereitung, Vorfilterung, Verstärkung etc.) in das eigentliche Messsignal 140.
Bei der in 3C dargestellten Ausführungsform wird hingegen das positionssensitive Messprinzip des Detektors 170 durch Verwendung zweier einzelner Photodioden 176 realisiert. Dieses Messprinzip ist dementsprechend bei größeren Bereichen der Ablenkung des Messstrahls 168 sinnvoll. Die Signalanteile der Photodioden 176 (wobei auch weitere Photodioden eingesetzt werden können, beispielsweise Photodioden-Arrays, siehe oben) werden einer Auswertungseinheit 178 zugeführt, wo diese Signalanteile verglichen werden (beispielsweise mittels einer Differenzbildung oder ähnlichen Verfahren). Das Verhältnis dieser Signalanteile lässt einen Rückschluss auf die Winkelstellung des abgelenkten Messstrahls 168 zu, woraus sich wiederum (direkt oder nach weiterer Verarbeitung) das Messsignal 140 bilden lässt.

110: Scanmikroskop
112: Lichtquelle
114: Mikroskopstrahl
116: Mikroskopdetektor
118: Probe
120: Bildstrahl
122: Strahlteile
124: Optisches System
126: Blende
128: Blende
130: Strahlablenkeinrichtung
132: elektronische Steuerung
134: Prozessor
135: Bildschirm
136: Steuerung
138: Messeinrichtung
140: Messsignal
140': Messsignal
142: FPGA
143: Weitere im FPGA implementierbare Komponenten
144: aufbereitetes Messsignal
146: DDS-Baustein
148: Synthetisches Signal
150: Ansteuersignal
152: DDS-Baustein
154: Synthetisches Aufnahmesignal
156: Bilderfassungseinrichtung
158: Galvanometerspiegel
160: Spiegelfläche
162: Antriebsachse
164: Steller
166: Vorrichtung zur Erzeugung Messstrahl
168: Messstrahl
170: Detektor
172: Reflektorfläche
174: PSD
176: Photodioden
178: Auswertungseinheit

Claims

Verfahren zur Steuerung eines eine Strahlablenkeinrichtung (130) umfassenden Scanmikroskops (110), mit folgenden Schritten: – die Strahlablenkeinrichtung (130) wird mittels eines Ansteuersignals (150) angesteuert, um eine Scanbewegung durchzuführen; – ein Messsignal (140, 140') wird erzeugt, wobei das Messsignal (140, 140') mindestens eine Information über eine Frequenz und/oder eine Phase und/oder eine Amplitude der Strahlablenkeinrichtung (130) aufweist; – in einem Signalverarbeitungsschritt wird das Messsignal (140, 140') einer Signalverarbeitung unterworfen und ein aufbereitetes Messsignal (144) erzeugt; und – in einem Steuerschritt wird mittels des aufbereiteten Messsignals (144) das Ansteuersignal (150) gesteuert und/oder geregelt und/oder modifiziert; dadurch gekennzeichnet, dass in einem Aufnahmeschritt mittels des aufbereiteten Messsignals (144) eine Aufnahme von Bilddaten gesteuert wird und/oder aufgenommene Bilddaten einer Position auf einer Probe (118) zugeordnet werden, wobei in einem Syntheseschritt aus dem aufbereiteten Messsignal (144) ein synthetisches Signal (148) erzeugt wird, wobei das synthetische Signal (148) derart ausgestaltet ist, dass dieses mindestens eine Information über die Frequenz und/oder die Phase und/oder die Amplitude der Strahlablenkeinrichtung (130) beinhaltet, wobei zur Erzeugung des synthetischen Signals (148) und/oder des synthetischen Aufnahmesignals (154) ein direktes digitales Syntheseverfahren verwendet wird.
Verfahren gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Signalverarbeitungsschritt mindestens eine der folgenden Signalaufbereitungstechniken verwendet wird: eine Frequenzfiltertechnik, insbesondere eine Bandpassfilterung, eine Hochpassfilterung oder eine Tiefpassfilterung; eine Rauschunterdrückung; ein Lock-In-Verfahren; eine Mittelwertbildung; ein phasenempfindliches Messverfahren; ein PLL-Verfahren; ein Anpassungsverfahren zur Anpassung einer Kurve, insbesondere einer parametrisierten Kurve, an das Messsignal (140, 140').
Verfahren gemäß einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Durchführung des Signalverarbeitungsschrittes mindestens eine der folgenden Vorrichtungen verwendet wird: ein digitaler Filter, insbesondere ein Field Programmable Gate Array (142) und/oder ein digitaler Signalprozessor.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das synthetische Signal (148) mindestens ein synthetisches periodisches Signal, insbesondere ein synthetisches Sinussignal, aufweist, wobei eine Amplitude und eine Phase des synthetischen periodischen Signals derart gewählt werden, dass das synthetische Sinussignal die Frequenz und/oder die Phase und/oder die Amplitude der Strahlablenkeinrichtung (130) beinhaltet.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das synthetische Signal (148) im Steuerschritt verwendet wird, um das Ansteuersignal (150) zu steuern und/oder regeln und/oder modifizieren.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem synthetischen Signal (148) ein synthetisches Aufnahmesignal (154) erzeugt wird, wobei das synthetische Aufnahmesignal (154) eine Information über eine Position eines Mikroskopstrahls (114) auf und/oder in einer Probe (118) beinhaltet, wobei das synthetische Aufnahmesignal (154) im Aufnahmeschritt verwendet wird, um die Aufnahme von Bilddaten zu steuern und/oder aufgenommene Bilddaten einer Position auf und/oder in einer Probe (118) zuzuordnen.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine virtuelle DDS-Länge von 8 Bit bis 64 Bit, insbesondere von 30 Bit, verwendet wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein DDS-Softwarebaustein und/oder ein integrierter digitaler DDS-Schaltkreis (146) verwendet wird.
Scanmikroskop (110) zur Aufnahme von Bilddaten einer Probe (118), wobei das Scanmikroskop (110) eine elektronische Steuerung (132) aufweist, welche eingerich tet ist, um ein Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche durchzuführen.
Scanmikroskop (110) gemäß dem vorhergehenden Anspruch, gekennzeichnet durch eine konfokale Strahloptik (124, 126, 128).
Scanmikroskop (110) gemäß einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlablenkeinrichtung (130) eine resonant betriebene Ablenkeinrichtung umfasst, insbesondere mindestens einen resonant betriebenen Galvanometerspiegel (158).
Scanmikroskop (110) gemäß einem der vorhergehenden, auf ein Scanmikroskop (110) gerichteten Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Messeinrichtung (138), wobei die Messeinrichtung (138) mindestens eine der folgenden Einrichtungen zur Messung einer Frequenz und/oder Phase und/oder Amplitude der Strahlablenkeinrichtung (130) umfasst: eine kapazitive Messeinrichtung, eine induktive Messeinrichtung, eine optische Messeinrichtung.
Scanmikroskop (110) gemäß einem der vorhergehenden, auf ein Scanmikroskop (110) gerichteten Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Messeinrichtung (138) zur Messung einer Frequenz und/oder Phase und/oder Amplitude der Strahlablenkeinrichtung (130), wobei die Messeinrichtung (138) einen Detektor (170) zur Detektion mindestens eines von der Strahlablenkeinrichtung (130) emittierten und/oder reflektierten optischen Signals umfasst.
Scanmikroskop (110) gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (170) mindestens eine der folgenden Vorrichtungen umfasst: einen positionssensitiven Photodetektor (174); ein Array mit mindestens zwei Photodetektoren; eine Anordnung mit mindestens zwei unter verschiedenen Winkelstellungen zur Strahlablenkeinrichtung (130) angeordneten Photodetektoren (176); eine Vierquadrantendiode; eine Zweiquadrantendiode.
Scanmikroskop (110) gemäß einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messeinrichtung (138) weiterhin eine Vorrichtung (166) zur Erzeugung eines Messstrahls (168) umfasst, insbesondere eine Vorrichtung zur Erzeugung eines optischen Messstrahls, insbesondere eine Vorrichtung zur Erzeugung eines infraroten Messstrahls, wobei der Messstrahl (168) auf die Strahlablenkeinrichtung (130) gerichtet ist und das optische Signal bewirkt.
Scanmikroskop (110) gemäß dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Strahlablenkeinrichtung (130) mindestens einen Galvanometerspiegel (158) umfasst, wobei der Messstrahl (168) an mindestens einer Position auf den Galvanometerspiegel (158) auftrifft und dort reflektiert wird, wobei der reflektierte Messstrahl (168) das optische Signal bewirkt.
Scanmikroskop (110) gemäß dem vorhergehenden Anspruch, wobei die mindestens eine Position auf einer der Spiegelseite (160) des Galvanometerspiegels (158) abgewandten Rückseite angeordnet ist.