JP2016090766A

JP2016090766A - 顕微鏡

Info

Publication number: JP2016090766A
Application number: JP2014224086A
Authority: JP
Inventors: 剛劉; Takeshi Ryu
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2014-11-04
Filing date: 2014-11-04
Publication date: 2016-05-23

Abstract

【課題】倍率を切り替えても標本への不要な励起光の照射を防止する。【解決手段】標本Ｓから発せられる蛍光を検出する検出光学系７と、該検出光学系７の光軸に交差する方向に沿って平面状の励起光を入射させる、励起光源としてのシート照明光学系３と、検出光学系７の倍率が高くなるとシート照明光学系３により標本Ｓに入射される励起光の照射幅を縮小するようにシート照明光学系３を制御する制御部４とを備える顕微鏡１を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡に関するものである。

従来、標本からの蛍光を検出する検出光学系の光軸に対して直交する平面に沿って励起光を標本に入射させるシート照明方式の顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。落射照明方式あるいは透過照明方式においては、共焦点光学系により１点または複数点に集光させた励起光を２次元的に走査することにより、光軸方向のボケ像の少ない２次元的な画像を取得するが、シート照明方式によれば、一度に広い範囲に照明でき、検出光学系の光軸方向には照明光の焦点があった部分のみが照明されるために、画像の取得に要する時間を短縮することができる。

特許第５２５９９１６号公報

しかしながら、一般的に、顕微鏡観察は、対物レンズを交換したり、ズーム倍率を調整したりして、観察に適した検出光学系の倍率を選択して行われるため、特許文献１のシート照明方式の顕微鏡では、低倍率での観察状態から倍率を高く切り替えると、観察範囲以外の領域にも励起光が照射されてしまい標本の劣化や褪色の問題が発生する。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、倍率を切り替えても標本への不要な励起光の照射を防止することができる顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、標本から発せられる蛍光を検出する検出光学系と、該検出光学系の光軸に交差する方向に沿って平面状の励起光を入射させるシート照明光学系と、前記検出光学系の倍率が高くなると前記シート照明光学系により標本に入射される励起光の照射幅を縮小するように前記シート照明光学系を制御する制御部とを備える顕微鏡を提供する。

本態様によれば、シート照明光学系によって標本に平面状の励起光が入射されると、入射された平面に沿って標本内の蛍光物質が励起され蛍光が発生する。発生した蛍光はシート照明光学系と交差する光軸を有する検出光学系によって検出される。励起光の入射位置を検出光学系の焦点位置に一致させておけば、この焦点位置より手前側に配置されている標本からは蛍光が発生しないので、焦点面からの蛍光のみを検出できて鮮明な画像を取得することができる。

この場合において、検出光学系の倍率を変化させると、倍率の変化に応じて視野範囲が変化する。すなわち、検出光学系の倍率を高くすると視野範囲が狭まるので、制御部が励起光の照射幅を縮小するようにシート照明光学系を制御することにより、観察に不必要な範囲に励起光が照明されないようにすることができる。これにより、倍率を切り替えることによる不要な励起光の照射による標本の劣化や褪色を防止することができる。

上記態様においては、前記検出光学系が、蛍光を撮影する撮像素子を備え、前記制御部が、前記検出光学系の倍率と前記撮像素子のサイズとに基づいて、前記シート照明光学系により標本に入射される励起光の照射幅を算出してもよい。
このようにすることで、検出光学系の倍率が設定された場合に、その倍率において撮像素子のサイズ内に蛍光を取得可能な最大限の視野範囲が計算できる。これにより、制御部が、倍率を切り替えることによる不要な励起光の照射を防止しつつ、最大限の視野範囲を確保することができる。

また、上記態様においては、前記シート照明光学系が、所定の幅寸法を有する平面状の励起光を形成する励起光形成光学系と、該励起光形成光学系により形成された平面状の励起光をその幅方向に走査させる走査部とを備えていてもよい。
このようにすることで、シート照明光学系の励起光形成光学系により形成された所定の幅寸法の平面状の励起光が、走査部によってその幅方向に走査されることにより、標本における照射幅を簡易に調節することができる。

また、上記態様においては、前記走査部が、前記励起光の幅方向に揺動するガルバノミラーを備え、前記制御部が、前記ガルバノミラーの振り角を制御してもよい。
このようにすることで、制御部がガルバノミラーの振り角を制御することにより、所例の幅寸法の平面状の励起光の走査範囲が調節され、標本における照射幅を簡易に調節することができる。

本発明によれば、倍率を切り替えても標本への不要な励起光の照射を防止することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡を示す全体構成図である。図１の顕微鏡の光源装置を示す斜視図である。図２の光源装置を示す平面図である。図１の光源装置からの励起光が視野範囲を走査する場合における励起光の強度分布を示すイメージ図である。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、顕微鏡本体２と、該顕微鏡本体２に接続される光源装置（シート照明光学系）３と、該光源装置３および顕微鏡本体２を制御する制御部４とを備えている。制御部４にはモニタ５が接続され、顕微鏡本体２により取得された画像を表示するようになっている。

顕微鏡本体２は、標本Ｓを搭載するステージ６と、該ステージ６に搭載された標本Ｓから発せられる蛍光を検出する検出光学系７とを備えている。検出光学系７は、該ステージ６に搭載された標本Ｓの鉛直上方に対向して配置される対物レンズ８と、該対物レンズ８により集光された標本Ｓからの蛍光を結像させる結像レンズ９と、該結像レンズ９により結像された蛍光を撮影する撮像素子１０とを備えている。図中、符号１１は、蛍光に含まれる励起光を除去するバリアフィルタを備えるフィルタホイールである。

光源装置３は、図２および図３に示されるように、略平行光からなる励起光を射出する励起光源１２と、該励起光源１２からの励起光を集光して、標本Ｓ位置と光学的に共役な位置に励起光の中間像を結像させる一対のリレーレンズ１３ａ，１３ｂと、該リレーレンズ１３ａによる励起光の中間像位置に配置され、励起光を偏向させるガルバノミラー（走査部）１４と、リレーレンズ１３ｂにより略平行光に変換された励起光をライン状に集光させるシリンドリカルレンズ（励起光形成光学系）１５とを備えている。

シリンドリカルレンズ１５は、光軸Ｐに直交する一方向にパワーを有し、略平行光からなる励起光をその光束径寸法と同じ所定の幅寸法を有する略平面状に集光するようになっている。
ガルバノミラー１４は、一方向に揺動可能に設けられ、揺動させられることにより、励起光をその幅方向に移動させることができるようになっている。

制御部４は、対物レンズ８の倍率および結像レンズ９の倍率を制御する顕微鏡制御部１７と、光源装置３を制御する光源制御部１８とを備えている。制御部４は、コンピュータにより構成され、後述する画像処理部１９、顕微鏡制御部１７および光源制御部１８の動作（例えば、画像の生成、入力部１６や図示しない操作部からの指示入力の処理、各種電動部（例えば、ステージ６、レンズ切替器またはズーム機構、フィルタホイール１１、ガルバノミラー１４など）やモニタ５の表示の制御、各種パラメータの記憶など）がこのコンピュータの演算処理装置とメモリにより実行される。また、センササイズの記憶やガルバノミラー１４の振り角の算出もこのコンピュータによって行われる。

また、顕微鏡制御部１７および光源制御部１８は、コンピュータからの制御信号に基づいて各種電動部を駆動する制御基板を備えている。

光源制御部１８は、撮像素子１０のセンササイズを記憶している。また、顕微鏡制御部１７には、選択されている対物レンズ８の倍率および結像レンズ９の倍率を入力する入力部１６が接続されている。
光源制御部１８は、入力部１６から入力されることにより顕微鏡本体２に設定された対物レンズ８の倍率および結像レンズ９の倍率に基づいて、ガルバノミラー１４の振り角を算出し、光源装置３を制御するようになっている。

撮像素子１０のセンササイズとしては、励起光の入射光軸に直交する方向の幅寸法、例えば、横長の視野範囲に対して横方向から励起光を入射させる場合には、センササイズとして撮像素子１０の縦幅寸法が記憶されている。
この場合のガルバノミラー１４の振り角は、次式（１）により算出されるようになっている。

α＝ｔａｎ^−１（ｃ／（ａ×ｂ）／２／ｆ）／２（１）
ここで、
αはガルバノミラー１４の片側振り角、
ａは対物レンズ８の倍率、
ｂは結像レンズ９の倍率、
ｃはカメラのセンサの縦幅寸法、
ｆはリレーレンズ１３ｂの焦点距離
である。

また、制御部４は操作部からの入力によってステージ６を作動させて標本Ｓを移動させ、顕微鏡制御部１７が対物レンズ８や結像レンズ９を交換あるいは倍率調節し、フィルタホイール１１を作動させてフィルタを交換する等の顕微鏡本体２の制御を行うようになっている。
また、制御部４は、撮像素子１０により取得された画像信号を処理してモニタ５に表示する画像を生成する画像処理部１９を備えている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１を用いて標本Ｓの観察を行うには、ステージ６に標本Ｓを搭載し、ステージ６を作動させて、標本Ｓを対物レンズ８の焦点位置に配置する。そして、入力部１６から顕微鏡制御部１７に対物レンズ８の倍率および結像レンズ９の倍率を入力する。これにより、顕微鏡本体２において対物レンズ８の倍率および結像レンズ９の倍率が設定される。

光源制御部１８においては、記憶しているセンササイズと、入力部１６から入力され顕微鏡本体２に設定された対物レンズ８の倍率および結像レンズ９の倍率とに基づいて、式（１）によってガルバノミラー１４の振り角が算出され、算出された振り角に基づいてガルバノミラー１４が制御される。

励起光源１２から射出された略平行光からなる励起光は、一方のリレーレンズ１３ａによって集光され、その集光点に配置されているガルバノミラー１４によって偏向されて他方のリレーレンズ１３ｂによって略平行光に戻される。励起光はその後にシリンドリカルレンズ１５によって直線状に集光される。このシリンドリカルレンズ１５の焦点距離を十分に長く確保しておくことにより、励起光は、焦点位置近傍では、所定の幅寸法の帯状（平面状）の励起光となって標本Ｓに照射される。

ガルバノミラー１４が揺動させられると、帯状の励起光はその幅方向に移動するので、ガルバノミラー１４の振り角に応じた範囲に、帯状の励起光を照射することができる。すなわち、光源装置３からの帯状の励起光を検出光学系７の焦点面に沿って入射させることにより、焦点面に沿う薄い領域のみにおいて蛍光を発生させることができ、検出光学系７によって、焦点面に沿う鮮明な蛍光画像を取得することができる。

この場合において、本実施形態に係る顕微鏡１によれば、ガルバノミラー１４の振り角が式（１）によって設定されるので、対物レンズ８の倍率および結像レンズ９の倍率（２つの倍率の乗算が検出光学系７の倍率である。）が高くなると撮像素子１０に撮影される視野範囲が狭くなるので、これに応じてガルバノミラー１４の振り角が小さくなる。

すなわち、式（１）によれば、撮像素子１０の有効受光範囲全体に蛍光信号が取り込まれるのに必要な、標本Ｓにおける視野範囲のみを、帯状の励起光の幅方向の中心位置が走査するようにガルバノミラー１４が揺動させられる。これにより、標本Ｓの視野範囲外となる領域に不必要な励起光が照射されるのを防止することができる。その結果、検出光学系７の倍率を切り替えても、標本Ｓが励起光の照射によって劣化あるいは褪色することを防止することができるという利点がある。

ここで、図４に示されるように、帯状の励起光の幅方向の中心位置が視野範囲Ｗを走査するように振り角を設定したため、実際に励起光が照射される範囲は視野範囲Ｗよりも励起光の幅Ｘ分だけ大きくなる。しかしながら、帯状の励起光の強度分布は中心位置から幅方向に減少していくので、式（１）を満たすようにガルバノミラー１４を揺動させることにより、蛍光画像が周辺部分で暗くならないようにすることができる。

なお、ガルバノミラー１４による帯状の励起光の走査は、一回の撮影露光中に複数回繰り返して行うようにしてもよい。
また、本実施形態においては、走査部としてガルバノミラー１４を採用したが、これに限定されるものではなく、他の任意の走査手段、例えば、音響光学素子やポリゴンミラー等を採用してもよい。

また、対物レンズ８や結像レンズ９あるいはフィルタホイール１１を制御部４が駆動することとしたが、これらが手動により駆動されることとしてもよい。また、入力部１６によって倍率を入力することとしたが、選択されている対物レンズ８の情報を読み取るセンサや、結像レンズ９の倍率を読み取るセンサを設け、読み取られた倍率からガルバノミラー１４の振り角を算出することにしてもよい。

また、ガルバノミラー１４の振り角は、式（１）による演算で求めることとしたが、各パラメータの設定値に対応した片側振り角αを予めコンピュータ内のメモリに参照テーブルとして記憶させ、撮影実行時にこの参照テーブルから対応する片側振り角αを読み出すようにしてもよい。

１顕微鏡
３光源装置（シート照明光学系）
４制御部
７検出光学系
１０撮像素子
１４ガルバノミラー（走査部）
１５シリンドリカルレンズ（励起光形成光学系）
Ｓ標本

Claims

標本から発せられる蛍光を検出する検出光学系と、
該検出光学系の光軸に交差する方向に沿って平面状の励起光を入射させるシート照明光学系と、
前記検出光学系の倍率が高くなると前記シート照明光学系により標本に入射される励起光の照射幅を縮小するように前記シート照明光学系を制御する制御部とを備える顕微鏡。
前記検出光学系が、蛍光を撮影する撮像素子を備え、
前記制御部が、前記検出光学系の倍率と前記撮像素子のサイズとに基づいて、前記シート照明光学系により標本に入射される励起光の照射幅を算出する請求項１に記載の顕微鏡。
前記シート照明光学系が、所定の幅寸法を有する平面状の励起光を形成する励起光形成光学系と、該励起光形成光学系により形成された平面状の励起光をその幅方向に走査させる走査部とを備える請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
前記走査部が、前記励起光の幅方向に揺動するガルバノミラーを備え、
前記制御部が、前記ガルバノミラーの振り角を制御する請求項３に記載の顕微鏡。