ES2901989T3 - Nucleasas específicas de objetivo modificadas - Google Patents

Abstract

Un semidominio de escisión de FokI modificado, en el que el semidominio de escisión modificado comprende una o más mutaciones como sigue: (a) el residuo de tipo salvaje en la posición 479 se reemplaza con un residuo Gln (Q) o Thr (T) (I479Q o I479T); (b) el residuo de tipo salvaje en la posición 418 se reemplaza con un residuo Glu (E) o Asp (D) (S418E o S418D); (c) el residuo de tipo salvaje en la posición 446 se reemplaza con un residuo Asp (D) (S446D); (d) el residuo de tipo salvaje en la posición 448 se reemplaza con un residuo Ala (A) (K448A); (e) el residuo de tipo salvaje en la posición 481 se reemplaza con un residuo Ala (A), Glu (E), Cys (C) o Ser(s) (Q481A, Q481E, Q481C o Q481S); (f) el residuo salvaje en la posición 416 se reemplaza con un residuo Glu (E), Asp (D), His (H) o Asn (N) (R416E, R416D, R416H o R416N); (g) el residuo de tipo salvaje en la posición 422 se reemplaza con un residuo His (H) (R422H); (h) el residuo de tipo salvaje en la posición 424 se reemplaza con un residuo Phe (F) (L424F); (i) el residuo de tipo salvaje en la posición 472 se reemplaza con un residuo Asp (D) (S472D); (j) el residuo de tipo salvaje en la posición 476 se reemplaza con un residuo Glu (E) o un residuo Gly (G) (N476E o N476G); (k) el residuo de tipo salvaje en la posición 478 se reemplaza con un residuo Asp (D) (P478D); (l) el residuo de tipo salvaje en la posición 480 se reemplaza con un residuo Asp (D) (G480D); (m) el residuo de tipo salvaje en la posición 525 se reemplaza con un residuo Ala (A), Cys (C), Glu (E), Ile (I), Ser(s), Thr (T) o Val (V) (K525A, K525C, K525E, K525I, K525S, K525T o K525V); y/o (n) el residuo de tipo salvaje en la posición 542 se reemplaza con un residuo de Asp (D) (N542D), en el que los residuos de aminoácidos se enumeran con respecto al dominio de escisión de tipo salvaje de FokI de longitud completa, como se muestra en la SEQ. ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Nucleasas específicas de objetivo modificadas

CAMPO TÉCNICO

[0001] La presente invención se refiere a dominios medios de escisión Fokl modificados, heterodímeros y nucleasas artificiales que comprenden polinucleótidos que codifican células aisladas que comprenden métodos in vitro de utilización, y los usos médicos de dichos dominios medios de escisión modificados.

ANTECEDENTES

[0002] Nucleasas artificiales, como las nucleasas de dedos de zinc modificadas (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), el sistema CRISPR/Cas con un ARN crARN/tracr modificado ('ARN de guía única'), también conocidas como nucleasas guiadas por ARN y/o nucleasas basadas en el sistema Argonaute (p. ej., de T. thermophilus, conocidos como 'TtAgo', (Swarts et al (2014) Nature 507 (7491): 258-261), comprenden dominios de unión al ADN (nucleótidos o polipéptidos) asociados o unidos operativamente a dominios de escisión, y se han utilizado para alteraciones dirigidas de secuencias genómicas. Por ejemplo, nucleasas se han utilizado para insertar secuencias exógenas, inactivar uno o más genes endógenos, crear organismos (p. ej., los cultivos) y líneas celulares con patrones de expresión génica alterada, y similares. Ver, p. ej., Patentes de Estados Unidos N° 9.255.250; 9.200.266; 9.045.763; 9.005.973; 8.956.828; 8.945.868; 8.703.489; 8.586.526; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.067.317; 7.262.054; 7.888.121; 7.972.854; 7.914.796; 7.951.925; 8.110.379; 8.409.861; Publicaciones de patente de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 y 20130177960 y 20150056705. Por ejemplo, un par de nucleasas (p. ej., nucleasas de dedos de zinc, Talens, fusiones DCA-Fok) pueden usarse para escindir secuencias genómicas. Cada miembro del par incluye generalmente una proteína de unión a ADN modificada (de origen no natural) unida a uno o más dominios de escisión (o semidominios) de una nucleasa. Cuando las proteínas de unión a ADN se unen a sus sitios diana, los dominios de escisión que están unidos a esas proteínas de unión a ADN se colocan de manera que puede producirse la dimerización y la posterior escisión del genoma.

[0003] En general, los pares de iones intermoleculares (puentes de sal) son esenciales para muchas interacciones ADN-proteína. A menudo, cadenas laterales de aminoácidos cargadas (es decir, - NH3+, = NH2+) interactúan con los grupos fosfatos cargados negativamente de la columna vertebral del ADN para formar un puente salino. Estos pares de iones pueden ser bastante dinámicos y pueden alternar entre el apareamiento directo de los dos iones y de emparejamiento que es un 'par de iones de disolvente separados' cuando un disolvente (p. ej. una molécula de agua) se inserta entre los dos iones (Chen et al (2015) J Phys Chem Lett 6: 2733-2737).

[0004] En lo que respecta a proteínas con dedos de zinc, la especificidad de una ZFP para una secuencia de ADN diana es dependiente de los contactos específicos de secuencia entre los dominios de dedo de zinc y bases de ADN específicas. Además, los dominios con dedos de zinc también comprenden residuos de aminoácidos que participan en interacciones de pares de iones no específicos con los fosfatos de la cadena principal del ADN. Elrod-Erickson et al ((1996) Structure 4: 1171) demostraron a través de la cocristalización de una proteína con dedos de zinc y su ADN diana afín que existen aminoácidos específicos capaces de interactuar con los fosfatos en la cadena principal del ADN mediante la formación de enlaces de hidrógeno. Las proteínas con dedos de zinc que emplean la conocida cadena principal Zif268 suelen tener una arginina como residuo amino terminal de su segunda hebra de la hoja p, que también es la segunda posición carboxilterminal de la segunda cisteína invariante (ver Figura 5A). Esta posición puede ser referida como (-5) dentro de cada dominio de dedos de zinc, ya que es el 5° residuo anterior al inicio de la a-hélice (Figura 5A). La arginina en esta posición puede interactuar con un fosfato en la columna vertebral del ADN mediante la formación de un enlace de hidrógeno cargado con su grupo guanidinio de cadena lateral. Las proteínas con dedos de zinc en la cadena principal de Zif268 también tienen con frecuencia una lisina en una posición que es de 4 residuos aminoterminales de la primera cisteína invariante. Esta posición puede denominarse (-14) dentro de cada dedo, ya que es el 14° residuo que precede al inicio de la hélice a para los dedos de zinc con dos residuos entre los residuos de cisteína de coordinación de zinc (Figura 5A). La lisina puede interactuar con un fosfato en la columna vertebral del ADN mediante la formación de un enlace de hidrógeno cargado mediado por agua con su grupo amino de cadena lateral. Dado que los grupos fosfato se encuentran a lo largo de la columna vertebral del ADN, este tipo de interacción entre el dedo de zinc y una molécula de ADN generalmente se considera no específico de secuencia (J. Miller, Massachusetts Institute of Technology Ph.D. Thesis, 2002).

[0005] Estudios recientes han planteado la hipótesis de que el fosfato no específico en contacto con cadenas laterales en algunas nucleasas también puede dar cuenta de una cierta cantidad de actividad de escisión no de especificidad de esas nucleasas (Kleinstiver et al, (2016) Nature 529 (7587): 490-5; Guilinger et al (2014) Nat Meth: 429-435). Los investigadores han propuesto que estas nucleasas pueden poseer un "exceso de energía de unión al ADN", lo que significa que las nucleasas pueden tener una mayor afinidad por su ADN diana de la necesaria para unirse sustancialmente y escindir el sitio diana. Por lo tanto, se intentó disminuir las cargas catiónicas en el dominio de unión al ADN de TALE (Guilinger, ibid) o el dominio de unión al ADN Cas9 (Kleinstiver, ibid) para disminuir la energía de unión al ADN de estas nucleasas, lo que resultó en una mayor especificidad de escisión in vitro. Sin embargo, estudios adicionales (Sternberg et al (2015) Nature 527 (7576): 110-113) también sugieren un papel en el plegamiento y activación adecuados del dominio de nucleasa Cas9 para algunos de los aminoácidos catiónicos que fueron mutados en el estudio de Kleinstiver de el dominio de unión al ADN Cas9. Por lo tanto, se desconoce el papel exacto de estos aminoácidos en la actividad de Cas9.

[0006] Para óptima especificidad de escisión por una nucleasa secuencia selectiva (artificial), es deseable disponer condiciones para que la unión en diana y la actividad no satura. En condiciones de saturación, por definición, se usa un exceso de nucleasa sobre lo necesario para lograr una actividad completa en el objetivo. Este exceso no proporciona ningún beneficio en el objetivo pero, no obstante, puede resultar en un aumento de la escisión en sitios fuera del objetivo. Para las nucleasas monoméricas, las condiciones de saturación pueden evitarse fácilmente realizando un estudio de respuesta a la dosis simple para identificar y evitar la meseta de saturación en una curva de titulación. Sin embargo, para una nucleasa dimérica como ZFN, TALEN o dCas-Fok, identificar y evitar las condiciones de saturación puede ser más complicado si las afinidades de unión de los monómeros individuales son diferentes. En tales casos, un estudio de respuesta a la dosis utilizando una relación de nucleasa simple de 1:1 solo revelará el punto de saturación del monómero de unión más débil. En tal escenario, si, por ejemplo, las afinidades de los monómeros difieren en un factor de 10, entonces en el punto de saturación identificado en un estudio de titulación 1:1, el monómero de mayor afinidad estará presente en una concentración 10 veces mayor que la necesaria. El exceso resultante del monómero de mayor afinidad puede, a su vez, conducir a un aumento de la actividad fuera del objetivo sin proporcionar ningún aumento beneficioso en la escisión en el objetivo pretendido, lo que potencialmente conduce a una disminución de la especificidad general para cualquier par de nucleasas dado.

[0007] Para disminuir acontecimientos de escisión fuera de objetivo, medios dominios obligados de escisión heterodimérica modificados se han desarrollado. Ver, p. ej., la Patente de Estados Unidos N° 7.914.796.; 8.034.598; 8.961.281 y 8.623.618; Publicaciones de Patentes de Estados Unidos Nos 20080131962 y 20120040398; y WO 2011/097036. Estos heterodímeros obligados dimerizan y escinden sus dianas sólo cuando los dominios de escisión modificados por ingeniería diferentes se colocan en el sitio diana apropiado por las ZFP, reduciendo así y/o eliminando la escisión monomérica fuera del objetivo. Waugh y col. (Journal of Biological Chemistry (1994) 269 (16): 12298-12303) describe mutantes de endonucleasa de restricción Fokl que escinden sustratos hemi-metilados.

[0008] Sin embargo, sigue habiendo una necesidad de métodos y composiciones a los sistemas de escisión de nucleasa modificados adicionales para disminuir actividad de escisión fuera de objetivo.

RESUMEN

[0009] La presente descripción proporciona métodos y composiciones para aumentar la especificidad de una nucleasa (p. ej., par de nucleasa) para su objetivo previsto en relación con otros sitios de escisión no deseados, también conocidos como sitios fuera de objetivo. Por lo tanto, descritos en este documento son las nucleasas artificiales (p. ej., nucleasas de dedo de zinc (ZFNs), Talens, CRISPR/Cas nucleasas) que comprenden mutaciones en una o más de las regiones de dominio de unión a ADN (p. ej., La columna vertebral de un dedo de proteína de zinc o TALE) y/o una o más mutaciones en un dominio de escisión de nucleasa Fokl o semidominio de escisión. Además, se describen aquí procedimientos para aumentar la especificidad de la actividad de escisión mediante el uso de estas nuevas nucleasas (p. ej., ZFNs, Talens, etc.) y/o por medio de titulación independientes de los socios de semidominio de escisión modificados genéticamente de un complejo de nucleasa. Cuando se usan individualmente o en combinación, los métodos y composiciones de la invención proporcionan incrementos sorprendentes e inesperados en la especificidad de dirección a través de reducciones en la actividad de escisión fuera de la diana. La divulgación también proporciona métodos para usar estas composiciones para la escisión dirigida de la cromatina celular en una región de interés y/o la integración de un transgén mediante la integración dirigida en una región predeterminada de interés en las células.

[0010] La invención proporciona un semidominio de escisión Fokl modificado, en el que el semidominio de escisión modificado genéticamente comprende una o más mutaciones de la siguiente manera: (a) el residuo de tipo salvaje en la posición 479 se sustituye con un residuo Gln (Q) o Thr (T) (I479Q o I479T); (b) el residuo de tipo salvaje en la posición 418 se reemplaza con un residuo Glu (E) o Asp (D) (S418E o S418D); (c) el residuo de tipo salvaje en la posición 446 se reemplaza con un residuo Asp (D) (S446D); (d) el residuo de tipo salvaje en la posición 448 se reemplaza con un residuo de Ala (A) (K448A); (e) el residuo de tipo salvaje en la posición 481 se reemplaza con un residuo Ala (A), Glu (E), Cys (C) o Ser (S) (Q481A, Q481E, Q481C o Q481S); (f) el residuo salvaje en la posición 416 se reemplaza con un residuo Glu (E), Asp (D), His (H) o Asn (N) (R416E, R416D, R416H o R416n ); (g) el residuo de tipo salvaje en la posición 422 se reemplaza con un residuo His (H) (R422H); (h) el residuo de tipo salvaje en la posición 424 se reemplaza con un residuo Phe (F) (L424F); (i) el residuo de tipo salvaje en la posición 472 se reemplaza con un residuo Asp (D) (S472D); (j) el residuo de tipo salvaje en la posición 476 se reemplaza con un residuo Glu (E) o un residuo Gly (G) (N476E o N476G); (k) el residuo de tipo salvaje en la posición 478 se reemplaza con un residuo Asp (D) (P478D); (l) el residuo de tipo salvaje en la posición 480 se reemplaza con un residuo Asp (D) (G480D); (m) el residuo de tipo salvaje en la posición 525 se reemplaza con un residuo Ala (A), Cys (C), Glu (E), Ile (I), Ser (S), Thr (T) o Val (V) (K525A, K525C, K525E, K525I, K525S, K525T o K525V); y/o (n) el residuo de tipo salvaje en la posición 542 se reemplaza con un residuo de Asp (D) (N542D), en el que los residuos de aminoácidos se enumeran con respecto al dominio de escisión de tipo salvaje de Fokl de longitud completa, como se muestra en la SEQ. ID NO: 1. La invención también proporciona un heterodímero que comprende un primer semidominio de escisión de la invención y un segundo semidominio de escisión. La invención proporciona además una nucleasa artificial que comprende un semidominio de escisión modificado de la invención y un dominio de unión al ADN. La invención proporciona uno o más polinucleótidos que codifican el semidominio de escisión modificado de la invención, el primer y segundo dominios de escisión modificados genéticamente de la invención o una nucleasa artificial de acuerdo con la invención. La invención también proporciona una célula aislada que comprende el semidominio de escisión modificado de la invención, el heterodímero de la invención, una nucleasa artificial de acuerdo con la invención o el polinucleótido de la invención. La invención proporciona además un método in vitro para escindir la cromatina celular genómica en una región de interés, el método comprende: expresar una nucleasa artificial que comprende un dominio de escisión diseñado según la invención en una célula, en el que el sitio de la nucleasa escinde específicamente una secuencia de nucleótido en la región de interés de la cromatina celular genómica. La invención proporciona un método in vitro para escindir al menos dos sitios diana en la cromatina celular genómica, comprendiendo el método: escindir al menos el primer y segundo sitios diana en la cromatina celular genómica, en el que cada sitio diana se escinde usando una composición que comprende una nucleasa artificial según a la invención. La invención también proporciona semidominio de escisión modificado de la invención, el heterodímero de la invención, la nucleasa artificial de acuerdo con la invención, el uno o más polinucleótidos de la invención o la célula aislada de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedad en un sujeto. La invención proporciona además un método in vitro para aumentar la especificidad de escisión por nucleasa modificada, el método comprende poner en contacto una célula con un complejo de nucleasa modificada que comprende parejas de semidominio de escisión modificadas según la invención, donde la proporción de las parejas es distinta de uno a uno, opcionalmente en el que: (i) la relación es 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:9, 1:10 o 1:20, o cualquier valor entre ellos, o es mayor que 1:30; y/o (ii) cada pareja se administra a la célula como un ARNm o se administra en un vector viral o no viral donde se administran diferentes cantidades de ARNm o vector que codifica a cada pareja.

Las mutaciones como se describen en el presente documento incluyen, pero no se limitan a mutaciones que cambian la carga del dominio de escisión, por ejemplo, mutaciones de residuos cargados positivamente en residuos cargados no positivamente (p. ej., mutaciones de residuos K y R (p. ej., mutado a S); residuos N (p. ej., a D) y residuos Q (p. ej., a E); mutaciones en residuos que se predice que están cerca de la columna vertebral del ADN según el modelo molecular y que muestran variación en los homólogos de FokI (Figuras 1 y 17); y/o mutaciones en otros residuos (p. ej., Patente de Estados Unidos N° 8.623.618 y Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. 400 (1): 96-107).

[0011] Se encontraron las mutaciones más prometedoras usando el segundo criterio. Las mutaciones prometedoras iniciales eran residuos cargados positivamente que se prevén que estarán cerca de la cadena del ADN cuando se une FokI a ADN. Los dominios de escisión descritos en este documento pueden incluir una, dos, tres, cuatro, cinco o más de las mutaciones descritas en este documento y pueden incluir además una mutación conocida adicional. Por lo tanto, las mutaciones de la invención no incluyen mutaciones específicas dadas a conocer en la patente estadounidense N° 8.623.618 (p. ej., N527D, S418P, K448M, Q531R, etc.) cuando se usa solo; sin embargo, aquí se proporcionan mutantes novedosas que se pueden usar en combinación con los mutantes de la patente de EE. UU. n° 8.623.618. Los mutantes de nickasa en los que uno de los dominios de nucleasa catalítica en un par de dímeros comprende una o más mutaciones que lo vuelven catalíticamente inactivo (véanse las patentes de EE. UU. Nos 8.703.489; 9.200.266; y 9.631.186) también se pueden usar en combinación con cualquiera de los mutantes descritos en este documento. Las ninasas pueden ser ninasas ZFN, ninasas TALEN y sistemas CRISPR/dCas.

[0012] . Los dominios de nucleasa también pueden comprender una o más mutaciones en posiciones que incluyen pero no se limitan a ELD, KKR, ELE, KKS. Ver, p. ej., Patente de Estados Unidos N° 8.623.618. En determinadas formas de realización, los dominios de escisión variantes descritos en este documento incluyen mutaciones en los residuos implicados en la dimerización de nucleasa (mutaciones del dominio de dimerización) y una o más mutaciones adicionales; por ejemplo para residuos de fosfato en contacto: p. ej. mutantes de dimerización (como ELD, KKR, ELE, KKS, etc.) en combinación con una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más mutaciones en posiciones de aminoácidos fuera del dominio de dimerización, por ejemplo en residuos de aminoácidos que puede participar en contacto con fosfato.

[0013] En otras formas de realización, el dominio de un medio de escisión modificado comprende mutaciones en el dominio de dimerización, por ejemplo, residuos de aminoácidos 490, 537, 538, 499, 496 y 486, además de las mutaciones descritas en este documento. En una forma de realización preferida, son proteínas de fusión en las que el semidominio de escisión diseñado comprende un polipéptido en el que el residuo Gln (Q) de tipo salvaje en la posición 486 se reemplaza con un residuo Glu (E), el residuo Ile (I) de tipo salvaje en la posición 499 se reemplaza con un residuo Leu (L) y el residuo Asn (N) de tipo salvaje en la posición 496 se reemplaza con un residuo Asp (D) o Glu (E) ("ELD" o "ELE") además de una o más mutaciones descritas en el presente documento. En otra forma de realización, los semidominios de escisión modificados genéticamente se derivan de un semidominio de escisión del homólogo de FokI o FokI de tipo salvaje y comprenden mutaciones en los residuos de aminoácidos 490, 538 y 537, numerados en relación con el FokI de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1) además de una o más mutaciones en los residuos de aminoácidos 416, 422, 448 o 525. En una forma de realización preferida es una proteína de fusión, en la que el semidominio de escisión modificado comprende un polipéptido en el que la Glu de tipo salvaje (E) el residuo de la posición 490 se reemplaza con un residuo de Lys (K), el residuo de Ile (I) de tipo salvaje en la posición 538 se sustituye por un residuo de Lys (K) y el residuo de His (H) de tipo salvaje en la posición 537 se reemplaza con un residuo Lys (K) o un residuo Arg (R) ("KKK" o "KKR") (véase la patente de EE. UU. 8.962.281).

[0014] En otra forma de realización, los semidominios de escisión modificados se derivan de un semidominio de tipo salvaje Fokl de escisión o homólogos de los mismos y comprenden mutaciones en los residuos de aminoácidos 490 y 538, numerados en relación con el FokI de tipo salvaje además a una o más mutaciones en los residuos de aminoácidos 416, 422, 448 o 525. Una forma de realización preferida es una proteína de fusión, en la que el semidominio de escisión modificado comprende un polipéptido en el que el residuo Glu (E) de tipo salvaje en la posición 490 se reemplaza con un residuo Lys (K), y el residuo Ile (I) de tipo salvaje en la posición 538 se reemplaza con un residuo Lys (K) ("KK") además de una o más mutaciones en las posiciones 416, 422, 448 o 525. En una forma de realización preferida es una proteína de fusión, en la que el semidominio de escisión modificado comprende un polipéptido en el que el residuo Gln (Q) de tipo salvaje en la posición 486 se reemplaza con un residuo Glu (E), y el residuo de Ile (I) de tipo salvaje en la posición 499 se reemplaza con un residuo Leu (L) e ("EL") (véase la patente de EE. UU. 8.034.598), además de la una o más mutaciones en las posiciones 416, 422, 448, o 525.

[0015] En otro aspecto, cualquiera de los semidominios de escisión modificados descritos anteriormente pueden incorporarse en nucleasas artificiales, por ejemplo asociándolos con un dominio de unión a ADN, que incluyen, pero no se limitan a nucleasas con dedos de zinc, TALEN, nucleasas CRISPR/Cas y similares. Las proteínas con dedos de zinc de las nucleasas de dedos de zinc pueden comprender residuos coordinantes de zinc no canónicos (p. ej. CCHC en lugar de la configuración canónica C2H2, ver la patente de Estados Unidos 9.234.187).

[0016] En otro aspecto, se proporcionan moléculas de fusión que comprenden un dominio de unión a ADN y un semidominio de escisión de FokI modificado u homólogo del mismo como se describe aquí que producen una nucleasa artificial. En ciertas formas de realización, el dominio de unión a ADN de la molécula de fusión es un dominio de unión de dedo de zinc (p. ej., un dominio de unión de dedo de zinc modificado). En otras formas de realización, el dominio de unión a ADN es un dominio de unión a ADN de TALE. En todavía otras formas de realización, el dominio de unión de ADN comprende una molécula de unión de ADN (p. ej. ARN de guía) y una proteína catalíticamente inactiva Cas9 o CFP1 (dCas9 o dCfp1). En algunas formas de realización, las moléculas de fusión modificadas forman un complejo de nucleasa con un semidominio de escisión modificado catalíticamente inactivo, de modo que la nucleasa dimérica solo es capaz de escindir solo una hebra de una molécula de ADN de doble hebra, formando una nickasa (véase la patente de EE. UU. 9.200.266).

[0017] Los métodos y composiciones de la invención incluyen también mutaciones en uno o más aminoácidos dentro del dominio de unión a ADN fuera de los residuos que reconocen los nucleótidos de la secuencia diana (p. ej., una o más mutaciones a la 'cadena ZFP' (fuera de la región de la hélice de reconocimiento del ADN) o en la 'cadena de TALE' (fuera de los RVD)) que pueden interactuar de forma no específica con los fosfatos en la cadena del ADN. Por tanto, en determinadas formas de realización, la invención incluye mutaciones de residuos de aminoácidos catiónicos en el esqueleto de ZFP que no son necesarias para la especificidad de la diana de nucleótidos. En algunas formas de realización, estas mutaciones en la cadena principal de ZFP comprenden la mutación de un residuo de aminoácido catiónico en un residuo de aminoácido aniónico o neutro. En algunas formas de realización, estas mutaciones en el esqueleto de ZFP comprenden mutar un residuo de aminoácido polar en un residuo de aminoácido neutro o no polar. En formas de realización preferidas, las mutaciones se realizan en la posición (-5), (-9) y/o en la posición (-14) con respecto a la hélice de unión al ADN. En algunas formas de realización, un dedo de zinc puede comprender una o más mutaciones en (-5), (-9) y/o (-14). En formas de realización adicionales, uno o más dedos de zinc en una proteína de dedos de zinc de múltiples dedos pueden comprender mutaciones en (-5), (-9) y/o (-14). En algunas formas de realización, los aminoácidos en (-5), (-9) y/o (-14) (p. ej. Una arginina (R) o lisina (K)) se mutan a una alanina (A), leucina (L), Ser (S), Asp (N), Glu (e ), Tyr (Y) y/o glutamina (Q).

[0018] En otro aspecto, se proporcionan polinucleótidos que codifican cualquiera de los semidominios de escisión modificados o proteínas de fusión como se describe en el presente documento.

[0019] En aún otro aspecto, las células que comprenden cualquiera de las nucleasas, polipéptidos (p. ej. también se proporcionan moléculas de fusión o polipéptidos de fusión) y/o polinucleótidos como se describe en el presente documento.

[0020] En cualquiera de estos polipéptidos de fusión descritos en el presente documento, los socios de ZFP pueden comprender además las mutaciones en el ADN de dominio de unión de dedo de zinc en las posiciones (-5), (-9) y/o (­ 14). En algunas formas de realización, Arg (R) en la posición -5 se cambia a Tyr (Y), Asp (N), Glu (E), Leu (L), Gln (Q) o Ala (A). En otras formas de realización, Arg (R) en la posición (-9) se reemplaza con Ser (S), Asp (N) o Glu (E). En formas de realización adicionales, el Arg (R) en la posición (-14) se reemplaza con Ser (S) o Gln (Q). En otras formas de realización, los polipéptidos de fusión pueden comprender mutaciones en el dominio de unión al ADN del dedo de zinc donde los aminoácidos en las posiciones (-5), (-9) y/o (-14) se cambian a cualquiera de los aminoácidos enumerados anteriormente en cualquier combinación.

[0021] También se proporcionan en el presente documento las células que han sido modificadas por los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención. En algunas formas de realización, las células comprenden una inserción de un transgén mediada por nucleasa, o una desactivación de un gen mediada por nucleasa. Las células modificadas y cualquier célula derivada de las células modificadas no comprenden necesariamente las nucleasas de la invención más que de forma transitoria, pero permanecen las modificaciones genómicas mediadas por tales nucleasas.

[0022] En aún otro aspecto, los métodos para la escisión selectiva de la cromatina celular en una región de interés; métodos para provocar la recombinación homóloga en una célula; composiciones para su uso en el tratamiento de infecciones; y/o se proporcionan composiciones para su uso en el tratamiento de enfermedades. Los métodos se pueden practicar in vitro o ex vivo. Los métodos implican la escisión de la cromatina celular en una región predeterminada de interés en células mediante la expresión de un par de polipéptidos de fusión como se describe en este documento (es decir, un par de polipéptidos de fusión en la que uno o ambos polipéptido(s) de fusión comprende(n) el semidominio de escisión modificado como se describe en este documento). En determinadas formas de realización, la escisión dirigida del sitio en el objetivo aumenta en al menos 50 a 200% (o cualquier valor entre ellos) o más, incluyendo 50%-60% (o cualquier valor entre ellos), 60%-70% (o cualquier valor entre ellos), 70%-80% (o cualquier valor entre ellos), 80%-90% (o cualquier valor entre ellos, 90% a 200% (o cualquier valor entre ellos), en comparación con los dominios de escisión sin las mutaciones como descrito en este documento. de manera similar, utilizando los métodos y composiciones como se describe aquí, la escisión de sitio fuera del objetivo es reducida por 1-100 o más veces, incluyendo pero no limitado a 1-50 veces (o cualquier valor intermedio).

[0023] Los semidominios de escisión modificados descritos en este documento se pueden usar en métodos para la escisión dirigida de cromatina celular en una región de interés y/o recombinación homóloga en una región de interés predeterminada en las células. Las células incluyen células cultivadas, líneas celulares, células en un organismo, células que se han extraído de un organismo para el tratamiento en los casos en que las células y/o sus descendientes serán devueltos al organismo después del tratamiento, y las células extraídas de un organismo, modificadas utilizando las moléculas de fusión de la invención, y luego devueltas al organismo en un método de tratamiento (terapia celular). Una región de interés en la cromatina celular puede ser, por ejemplo, una secuencia genómica o una parte de la misma. Las composiciones incluyen moléculas de fusión o polinucleótidos que codifican las moléculas de fusión que comprenden una molécula de unión de ADN (p. ej., Un dedo por modificado zinc o dominio de unión al testigo o un ARN de guía CRISPR modificado) y un semidominio de escisión tal como se describe.

[0024] Una molécula de fusión puede expresarse en una célula, p. ej., administrando la molécula de fusión a la célula como un polipéptido, o administrando un polinucleótido que codifica la molécula de fusión a una célula, en el que el polinucleótido, si es ADN, se transcribe y se traduce, para generar la molécula de fusión. Además, si el polinucleótido es un ARNm que codifica la molécula de fusión, después de la entrega del ARNm a la célula, el ARNm se traduce, generando así la molécula de fusión.

[0025] En otros aspectos de la invención se proporcionan métodos y composiciones para aumentar la especificidad de la nucleasa modificada. En un aspecto, se proporcionan métodos para aumentar la especificidad de escisión global en el objetivo mediante la disminución de la actividad de escisión fuera del objetivo. En algunas formas de realización, las parejas de semidominio de escisión modificadas genéticamente de un complejo de nucleasa modificadas genéticamente se utilizan para contactar una célula, donde cada pareja del complejo se proporciona en una relación con la otra pareja distinta de uno a uno. En algunas formas de realización, la proporción de los dos socios (dominios de mitad de escisión) se da en 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:9, 1:10 o relación 1:20, o cualquier valor entre ellos. En otras formas de realización, la relación de los dos socios es superior a 1:30. En otras formas de realización, los dos socios se despliegan en una proporción que se elige diferente de 1:1. En algunos aspectos, cada pareja se entrega a la célula como un ARNm o se administra en un vector viral o no viral donde se administran diferentes cantidades de ARNm o vector que codifica a cada pareja. En formas de realización adicionales, cada socio del complejo de nucleasa puede estar comprendido en un solo vector viral o no viral, pero se expresa deliberadamente de tal manera que un socio se expresa en un valor mayor o menor que el otro, finalmente entregando a la célula una proporción de mitad de dominios de escisión que son distintos de uno a uno. En algunas formas de realización, cada semidominio de escisión se expresa usando diferentes promotores con diferentes eficiencias de expresión. En otras formas de realización, los dos dominios de escisión se administran a la célula usando un vector viral o no viral en el que ambos se expresan a partir del mismo marco de lectura abierto, pero los genes que codifican las dos parejas están separados por una secuencia (p. ej. escindiendo la secuencia 2A o IRES) que da como resultado que el socio 3' se exprese a una tasa más baja, de modo que las proporciones de los dos socios sean una relación de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:9, 1:10 o 1:20, o cualquier valor intermedio. En otras formas de realización, los dos socios se despliegan en una proporción que se elige diferente de 1:1.

[0026] También se proporcionan métodos para disminuir actividad nucleasa fuera de objetivo cuando se utilizan dos o más complejos de nucleasas. Por ejemplo, métodos para variar la proporción de moléculas de unión a ADN cuando se utilizan dos o más complejos de nucleasas. En algunas formas de realización, las moléculas de unión de ADN son dominios de polipéptido de unión al ADN (p. ej., ZFNs, Talens, DCA-Fok, megaTALs, meganucleasas), mientras que en otros, las moléculas de unión de ADN son los ARN de guía para su uso con nucleasas ARN guía. En formas de realización preferidas, la proporción de las dos o más moléculas de unión al ADN es una relación de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:9, 1:10 o 1:20, o cualquier valor entre ellos. En otras formas de realización, las dos moléculas de unión a ADN se despliegan en una proporción que se elige para que sea diferente de 1:1. En algunos aspectos, la proporción distinta de 1:1 se logra alterando la proporción de ARN guía utilizada para transfectar una célula. En otros aspectos, la proporción se modifica cambiando la proporción de cada complejo de ARN guía-proteína Cas9 utilizado para tratar las células de interés. En otro aspecto más, la proporción alterada se logra usando diferentes proporciones de ADN que codifican los ARN guía (virales o no virales) para el tratamiento de las células, o usando promotores con diferentes fuerzas de expresión para expresar diferencialmente las moléculas de unión al ADN en el interior de las células. Los eventos fuera del objetivo se pueden reducir de 2 a 1000 veces (o cualquier cantidad entre ellos) o más, que incluyen, entre otros, la reducción en al menos 10, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 veces (de cualquier valor entre ambos) o más.

[0027] Los métodos para escindir la cromatina celular en una región de interés pueden comprender (a) seleccionar una primera secuencia en la región de interés; (b) manipular una primera molécula de unión a ADN para que se una específicamente a la primera secuencia; (c) expresar una primera molécula de fusión en la célula, comprendiendo la primera molécula de fusión la primera molécula de unión a ADN (p. ej., dedo de zinc, TALE, sgARN) y un dominio de escisión (o semidominio); y (d) expresar una segunda proteína de fusión en la célula, comprendiendo la segunda molécula de fusión un segundo dominio de unión al ADN y un segundo dominio de escisión (o semidominio), en el que al menos una de las moléculas de fusión comprende un enlazador como se describe en este documento, y además en el que la primera molécula de fusión se une a la primera secuencia, y la segunda molécula de fusión se une a una segunda secuencia ubicada entre 2 y 50 nucleótidos de la primera secuencia, de modo que se puede formar un complejo de nucleasa activa y la cromatina celular se escinde en la región de interés. Ambas moléculas de fusión pueden comprender un enlazador como se describe en el presente documento entre el dominio de unión al ADN y el dominio de nucleasa catalítica.

[0028] También se proporcionan métodos para alterar una región de la cromatina celular, por ejemplo, para introducir mutaciones dirigidas. Los métodos para alterar la cromatina celular pueden comprender la introducción en la célula de una o más nucleasas dirigidas para crear una ruptura bicatenaria en la cromatina celular en un sitio predeterminado, y un polinucleótido donante, que tiene homología con la secuencia de nucleótidos de la cromatina celular en la región dl descanso. Los procesos de reparación del ADN celular se activan por la presencia de la rotura bicatenaria y el polinucleótido donante se utiliza como molde para reparar la rotura, lo que da como resultado la introducción de la totalidad o parte de la secuencia de nucleótidos del donante en la cromatina celular. Por tanto, se puede alterar una secuencia en la cromatina celular y, en ciertos casos, se puede convertir en una secuencia presente en un polinucleótido de donantes.

[0029] Alteraciones selectivas incluyen, pero no se limitan a mutaciones puntuales (es decir, la conversión de un solo par de bases de un par de bases diferente), las sustituciones de (es decir, la conversión de una pluralidad de pares de bases a una secuencia diferente de longitud idéntica), inserciones o uno o más pares de bases, deleciones de uno o más pares de bases y cualquier combinación de las alteraciones de secuencia mencionadas anteriormente. Las alteraciones también pueden incluir la conversión de pares de bases que son parte de una secuencia codificante de modo que se altere el aminoácido codificado.

[0030] El polinucleótido donante puede ser ADN o ARN, puede ser lineal o circular, y puede ser o de doble hebra de cadena sencilla. Se puede suministrar a la célula como ácido nucleico desnudo, como un complejo con uno o más agentes de entrega (p. ej., liposomas, nanopartículas, poloxámeros) o contenidos en un vehículo de entrega viral, tal como, por ejemplo, un adenovirus, lentivirus o un virus adenoasociado (AAV). Las secuencias donantes pueden variar en longitud de 10 a 1000 nucleótidos (o cualquier valor integral de nucleótidos entre ellas) o más. En algunas formas de realización, el donante comprende un gen de longitud completa flanqueado por regiones de homología con el sitio de escisión dirigido. En algunas formas de realización, el donante carece de regiones homólogas y se integra en un locus diana a través de homología mecanismo independiente (es decir, NHEJ). En otras formas de realización, el donante comprende una pieza más pequeña de ácido nucleico flanqueado por regiones homólogas para su uso en la célula (es decir, para la corrección de genes). En algunas formas de realización, el donante comprende un gen que codifica un componente funcional o estructural como un shARN, ARNi, miARN o similares. En otras formas de realización, el donante comprende secuencias que codifican un elemento regulador que se une y/o modula la expresión de un gen de interés. En otras formas de realización, el donante es una proteína reguladora de interés (p. ej. ZFP TFs, TALE TFs o una CRISPR/Cas TF) que se une a y/o modula la expresión de un gen de interés.

[0031] Para cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, la cromatina celular puede estar en un cromosoma, episoma o genoma organoide. La cromatina celular puede estar presente en cualquier tipo de célula, incluidas, entre otras, células procariotas y eucariotas, células fúngicas, células vegetales, células animales, células de mamíferos, células de primates y células humanas.

[0032] En aún otro aspecto, también se proporcionan las células que comprenden cualquiera de los polipéptidos (p. ej., moléculas de fusión) y/o polinucleótidos como se describe en este documento. En una forma de realización, las células comprenden un par de moléculas de fusión, cada una de las cuales comprende un dominio de escisión como se describe en el presente documento. Las células incluyen células cultivadas, células de un organismo y células que se han extraído de un organismo para su tratamiento en los casos en que las células y/o sus descendientes volverán al organismo después del tratamiento. Una región de interés en la cromatina celular puede ser, por ejemplo, una secuencia genómica o una parte de la misma.

[0033] Estos y otros aspectos serán fácilmente evidentes para el experto en la materia a la luz de la divulgación en su conjunto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0034]

Figura 1 representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2) de una porción de una nucleasa FokI de tipo salvaje. La secuencia muestra el dominio de nucleasa catalítica FokI, y la numeración, con respecto a la proteína FokI de tipo salvaje, es utilizada para generar las estructuras cristalinas 1FOK.pdb y 2FOK.pdb (Wah ibid) (el aminoácido Q del dominio nucleasa comienza en 384). Las posiciones encuadradas indican posibles sitios de mutación.

Figuras 2A a 2C son esquemas que muestran modelos del dominio FokI que interactúan con una molécula de ADN. Figura 2A indica las ubicaciones de los aminoácidos R422, R416 y K525. Figura 2B indica las ubicaciones de los aminoácidos R447, K448 y R422. Figura 2C es una ilustración que muestra un subconjunto de los diferentes tipos de ZFN que se pueden hacer incorporando 1, 2 o 3 (1x, 2x o 3x, respectivamente) mutaciones (ya sea R-> Q o R -> L) en la cadena del dedo de zinc. Las flechas negras indican las posiciones de las mutaciones.

Figuras 3A y 3B muestran la actividad de las ZFN específicas de BCL11A que llevan las nuevas mutaciones de FokI descritas en el presente documento. Figura 3A muestra la modificación dirigida en células CD34 para ZFN específicos de BCL11A SBS # 51857-ELD/SBS # 51949-KKR contra el objetivo afín de BCL11A (indicado con el identificador único de 'placa de matrícula' PRJIYLFN, SEQ ID NO: 13) y dos sitios fuera de objetivo también identificados por sus identificadores de "placa de matrícula" NIFMAEVG (SEQ ID NO: 14) y PEVYOHIU (SEQ ID NO: 20). Las ZFP se describen en PCT/US2016/032049. Todos los experimentos se realizaron con 2 |jg de cada mRNA ZFN para la entrega nucleasa y los valores representan el porcentaje de lecturas de secuencia que contienen inserciones y supresiones (% de indeles) consistentes con la actividad de nucleasa. Figura 3A muestra los resultados cuando se sustituyó un residuo de serina en las posiciones 416, 422, 447, 448 y 525 del dominio FokI en una o ambas ZFN. Figura 3B muestra un conjunto de datos similar excepto que se han cambiado las cadenas principales del dominio de dimerización heterodimérico FokI, es decir, Figura 3A muestra resultados usando mutaciones en el par SBS # 51857-ELD/SBS # 51949-KKR, mientras que la Figura 3B muestra resultados usando mutaciones en el par SBS # 51857-KKR/SBS # 51949-ELD.

Figura 4 es un gráfico que representa la actividad dentro y fuera del objetivo para varias variantes de ZFN FokI específicas de TCRA (región constante dirigida, también conocida como TRAC) (publicación PCT WO2017106528). Excepto por las dos réplicas del par ZFN parental, el dominio FokI en uno de los dos ZFN lleva una mutación en un residuo cargado positivamente. Se calculó la distancia entre el carbono alfa del residuo mutado en FokI y el oxígeno fosfato más cercano en la cadena del ADN de un modelo molecular ZFN-ADN (Miller et al (2007) Nat Biotech 25 (7): 778-785) y los puntos de datos están codificados por colores según esta distancia calculada (ya sea <10 Angstroms: gris;> 10 Angstroms: negro). Cada punto de datos representa la actividad dentro del objetivo y la actividad combinada fuera del objetivo para un par de ZFN diferente que lleva mutaciones de FokI en uno de los ZFN del par. Se indican los puntos de datos que representan el par parental.

Figuras 5A y 5B son esquemas que representan la región de la cadena de un dedo de zinc. Figura 5A (SEQ ID NO: 3) muestra los aminoácidos en el segundo dedo de la proteína Zif268 donde se indican la hoja beta y las estructuras helicoidales alfa. También se muestra la ubicación de los aminoácidos involucrados en el reconocimiento de bases de ADN específicas (-1 a 6). Los residuos cargados positivamente con el potencial de interactuar con la cadena principal de fosfato en el ADN se indican mediante cuadrados. Se subrayan los residuos de cisteína invariables implicados en la coordinación del zinc. Figura 5B es un dibujo de primer plano de un solo dedo en su estado tridimensional (la esfera sólida representa el ión de zinc coordinado) e indica cómo las diferentes regiones de cada dedo de zinc tienden a interactuar con el ADN. El ADN está representado por un diagrama donde los fosfatos se indican con la letra P y las bases del ADN se muestran en recuadros con esquinas redondeadas. Las flechas grises indican la posición aproximada de las posiciones de los residuos indicadas en los recuadros y las flechas negras indican interacciones entre la proteína del dedo de zinc y el ADN.

Figura 6 (SEQ ID NO: 4-6) que representa la conservación de aminoácidos en cada posición dentro de un dedo de zinc. Las primeras líneas muestran una alineación de secuencias de aminoácidos en los conocidos dedos de zinc de Zif268 y Sp1 (dedo 2 de Zif268 (SEQ ID NO: 4), dedo 3 de Zif268 (SEQ ID NO: 5) y dedo 2 de Sp1 (SEQ ID NO: 6)). Los residuos de histidina y cisteína coordinadores de zinc están encuadrados, al igual que las hélices de reconocimiento. Los residuos de arginina (R) y lisina (K) cargados positivamente que entran en contacto con los fosfatos de la cadena principal del ADN también se indican en los recuadros. Los números debajo de las primeras tres líneas son las frecuencias de cada aminoácido en cada posición, donde se analizaron 4867 dedos de zinc diferentes de origen natural. Las letras a la izquierda del diagrama son los códigos de una letra correspondientes a los residuos de aminoácidos cuyas frecuencias se dan en la tabla. Se identificaron tres aminoácidos no cargados, alanina, leucina y glutamina (indicados en óvalos) en la posición de contacto con el fosfato a una frecuencia baja, pero distinta de cero.

Figuras 7A y 7B (SEQ ID NO: 7 y 8) representan dibujos de las cadenas principales de ZFP que incluyen módulos de una proteína de dedo de zinc de seis dedos (Figura 7A, SEQ ID NO: 7) o una proteína de dedo de zinc de cinco dedos (Figura 7B, SEQ ID NO: 8). Las letras sobre algunas de las posiciones encuadradas indican mutaciones que se probaron en la posición indicada. La identidad de cada dedo viene dada por las etiquetas F1 a F6. Cada una de estas proteínas se ensambla a partir de tres "módulos" diferentes indicados como "Módulo A", Módulo B "y" Módulo C ". Las mutaciones en las posiciones -14, -9 y -5 del dedo N-terminal en cada módulo pueden realizarse alterando la secuencia del cebador de PCR utilizado durante el proceso de ensamblaje.

Figuras 8A a 8C son gráficos que representan la actividad de escisión dentro y fuera del objetivo para el ZFN específico de TCRA (TRAC) (publicación PCT WO2017106528) que comprende las nuevas mutaciones de cadena de dedo de zinc de la presente invención. TCRA (TRAC) ZFNs específicos de ambos contienen 6 repeticiones de dedos de cinc y para mutaciones de facilidad experimentales en la posición -5 solamente se introdujeron en el dedo N-terminal de cada módulo (p. ej. F1, f 3 o F5 en el ZFN de longitud completa). Por lo tanto, cada ZFN individual podría tener 0, 1, 2 o 3 mutaciones y el par de ZFN completo podría tener hasta 6 mutaciones en total (p. ej., 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 mutaciones). Los valores trazados indican el promedio de todos los pares de ZFN probados con el número y los tipos indicados de mutaciones en la posición -5. Las barras de error representan el error estándar de la media. Para cada par de ZFN, se midieron los tres fuera de objetivos indicados en la Tabla 3; Los valores fuera del objetivo promediados para generar los valores representados incluyen la fracción de actividad de los ZFN de TCRA (TRAC) parentales para cada uno de estos tres fuera del objetivo para cada construcción. Figura 8A muestra la fracción de actividad de los ZFN de TCRA (TRAC) parentales, donde los conjuntos de datos muestran los cambios en la actividad dentro del objetivo (barras negras) o fuera del objetivo (barras grises) de la sustitución de los aminoácidos indicados en la posición -5 en una o más de las repeticiones de dedos de zinc de solo una de las dos ZFN del par. Figura 8B muestra la fracción de actividad de realizar la sustitución de arginina-alanina indicada en uno o ambos socios de ZFN simultáneamente. La mitad izquierda de la Figura 8B representa pares de ZFN donde el número indicado de mutaciones ocurre en solo un ZFN en el par (y corresponde al tercio izquierdo de la Figura 8A) mientras que la mitad derecha de la Figura 8B representa pares de ZFN donde el mismo número de mutaciones se hicieron para ambos ZFN en el par (p. ej. 2 representa una mutación en cada ZFN en el par, 4 representa dos mutaciones en cada ZFN en el par y 6 representa tres mutaciones en cada ZFN en el par. Los experimentos realizados en Figuras 8A y 8B eran con células CD34 a una dosis de 6 |jg por experimento. Figura 8C muestra datos similares a los dos tercios derechos de Figura 8A, donde la dosificación de ARN fue de 2 jg por experimento.

Figura 9 es un gráfico que representa la actividad de escisión en el objetivo (barras negras) y fuera del objetivo (barras grises) en el sitio fuera del objetivo NIFMAEVG para los ZFN específicos de BCL11A que comprenden las nuevas mutaciones de la estructura del dedo de zinc de la invención (en este caso, la abreviatura de tres letras es utilizada e indica el número de residuos de arginina en la posición -5 que se mutaron al residuo indicado; p. ej. "6 Gln" indica que 6 argininas (3 por ZFN) se mutaron a 6 glutaminas en el par ZFN). Las barras de error representan el error estándar. Los experimentos se realizaron en células CD34 a una dosis de 2 jg de ARNm por ZFN por experimento.

Figura 10 muestra una transferencia de Western para la detección de la expresión de ZFN específica de BCL11A en células CD34 después de la transfección con ARNm que codifica ambas parejas de ZFN en un solo polinucleótido unido por una secuencia 2A (51857-2a-51949), dosificando con ARNm que codifican las ZFN por separado; o una mezcla de los dos ARNm que codifican cada pareja en las dosis indicadas. Las proteínas se detectaron mediante un anticuerpo anti-Flag y demuestran que la cantidad de proteína expresada después de transfección de ARNm está en línea con la cantidad de ARNm utilizada. Como se esperaba, la construcción 2a produjo una mayor cantidad de 5' ZFN SBS # 51857 en comparación con 3'ZFN, SBS # 51949.

Figura 11 muestra la titulación de la dosificación para los dos socios de ZFN específicos de BCl11A 51949 y 51857 contra la ubicación en el objetivo (BCL11A, panel izquierdo) o contra la ubicación fuera del objetivo NIFMAEVG (panel derecho). Los resultados demuestran que cambiar las proporciones de los socios de ZFN puede preservar la actividad en el objetivo mientras se reduce la actividad fuera del objetivo (compare el objetivo de BCL11A en 60 jg de cada ARNm (actividad en el objetivo de 85,92% de indeles o 60 jg de 51949, 6,6 jg 51857 actividad dentro del objetivo de 86,42%) con disminución fuera del objetivo (se usa 27,34% de actividad fuera del objetivo con 60 jg de cada ARNm en comparación con 4,21% de indeles cuando se usan 60 jg 51949 con 6,6 jg 51857)).

Figura 12 es una tabla que enumera la actividad de escisión dentro y fuera del objetivo para las ZFN específicas de BCL11A cuando las células CD34 se trataron con un solo ARNm que codifica ambos socios de ZFN como se describió anteriormente, (51857/519492a), o se trataron con el dosis titulada de las parejas de ZFN donde una pareja (51949) comprende una mutación Fokl R-> S en la posición 416. Los identificadores de "placa de matrícula" se muestran en la Tabla 1 del Ejemplo 2 (s Eq ID NO: 13-53). Los datos correspondientes a PRJIYLFN representan la fracción de lecturas de secuencia en la diana deseada en BCL11A que contiene indeles coherentes con la actividad de ZFN. Los datos correspondientes a todos los demás identificadores de 'matrículas' enumerados en la columna más a la izquierda corresponden a loci fuera del objetivo confirmados o sospechosos para el par ZFN 51857/51949. La relación que se muestra en la columna de la derecha indica la actividad en la muestra tratada con 51857/519492a dividida por la actividad en la muestra tratada con 51857/51949 R416S titulado en el lugar indicado.

Figura 13 muestra los resultados de un ensayo de captura insesgado, comparando dos pares de ZFN. El panel izquierdo ("Par parental ZFN") muestra los resultados utilizando el par SBS51857 y SBS51949 y el panel derecho ("Par variante ZFN") muestra el resultado utilizando SBS63014 y SBS65721), cuyo par comprende el par parental y, además, las mutaciones de cadena ZFP como se describe en el presente documento, así como una mutación Fokl R416S en la construcción SBS65721. En particular, en el par de variantes, cada ZFN del par comprende tres mutaciones R-> Q en los dedos y la construcción SBS65721 comprende además la mutación FokI R416S. Los datos demuestran que las mutaciones disminuyen el número de eventos de captura únicos de 21 ubicaciones para el par parental a 4 en la variante. Además, cuando los socios en los pares ZFN se dan en cantidades no iguales, los eventos de captura también disminuyen. Para el par parental, los eventos de captura caen de 21 (dosificación igual) a 13 (dosificación desigual) ubicaciones (28% a 3.4% agregados fuera de los objetivos, respectivamente), y para el par de variantes, los eventos de captura caen de 4 a 2 (0,26% a 0,08% de escisión agregada fuera del objetivo, respectivamente). La combinación de estos dos enfoques provoca una disminución general en 21 ubicaciones en el padre a 2 en la variante dosificada en concentraciones desiguales de pareja, para una disminución del 28% de eventos fuera del objetivo en conjunto para el par parental al 0,08% de eventos fuera del objetivo en el agregado para la variante.

Figura 14 muestra los resultados que demuestran la reducción de los eventos de escisión fuera del objetivo utilizando ZFN como se describe en el presente documento producidos en condiciones de fabricación a gran escala. El par ZFN utilizado comprendía SBS63014 y SBS65722.

Figuras 15A a 15D muestran resultados que demuestran eventos de escisión fuera del objetivo reducidos utilizando mutantes ZFN (dirigidos a AAVS1) como se describe en el presente documento. Figura 15A representa los resultados de la actividad de los ZFN parentales 30035/30054. Figura 15B representa la actividad de escisión dentro del objetivo y la relación de la actividad de escisión dentro del objetivo/fuera del objetivo para tres conjuntos de mutantes FokI: mutantes ELD FokI que comprenden mutaciones individuales adicionales (conjunto de datos más a la izquierda); Mutantes KKR FokI que comprenden mutaciones únicas adicionales (conjunto de datos intermedio); y tanto ELD como KKR FokI mutantes que comprenden las mismas mutaciones únicas adicionales (conjunto de datos más a la derecha). Figura 15C muestra una cuadrícula de actividad en el objetivo donde los dominios ELD o KKR FokI comprenden dos mutaciones, y Figura 15D muestra las proporciones dentro del objetivo/fuera del objetivo para los datos mostrados en Figura 15C.

Figuras 16A y 16B muestran resultados que demuestran la reducción de eventos de escisión fuera del objetivo usando mutantes ZFN dirigidos a AAVS1 ejemplares como se describe en el presente documento. Figura 16A muestra mutantes en el contexto ELD y KKR y Figura 16B muestra mutantes en el contexto ELD-KKR.

Figura 17 muestra una alineación de homólogos de FokI y FokI (SEQ ID NO: 54 a 64). El sombreado indica el grado de conservación. La numeración se realiza de acuerdo con el dominio FokI de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1).

Figura 18 muestra mutaciones de ejemplo en la que los corresponde de posición a la FokI o Fok homólogos I mostrada en la Figura 17.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0035] Se describen aquí métodos y composiciones para aumentar la especificidad de la escisión de nucleasa en el objetivo modificada a través de la escisión fuera del objetivo diferencialmente disminuida. Los métodos implican disminuir las interacciones no específicas entre el dominio de escisión de FokI y el ADN, disminuir las interacciones no específicas entre la cadena del dedo de zinc y el ADN, y alterar las proporciones relativas de cada socio de dominio de mitad de escisión fuera de la proporción predeterminada de 1:1.

General

[0036] La práctica de los métodos, así como la preparación y uso de las composiciones descritas en el presente documento empleará, a menos se indique lo contrario, técnicas convencionales de la biología molecular, la bioquímica, la estructura y el análisis de la cromatina, química computacional, cultivo celular, ADN recombinante y campos relacionados que están dentro de la experiencia de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY m A n UAL, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y tercera edición, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987 y actualizaciones periódicas; la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (PM Wassarman y AP Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (PB Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Definiciones

[0037] Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se utilizan indistintamente y se refieren a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido, en conformación lineal o circular, y en forma monocatenaria o bicatenaria. Para los propósitos de la presente divulgación, estos términos no deben interpretarse como limitantes con respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como los nucleótidos que están modificados en la base, azúcar y/o restos de fosfato (p. ej., cadenas principales de fosforotioato). En general, un análogo de un nucleótido particular tiene la misma especificidad de apareamiento de bases; es decir, un análogo de A se emparejará con T.

[0038] Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. El término también se aplica a polímeros de aminoácidos en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos o derivados modificados de los correspondientes aminoácidos naturales.

[0039] "Unión" se refiere a una secuencia específica, la interacción no covalente entre macromoléculas (p. ej., entre una proteína y un ácido nucleico). No todos los componentes de una interacción de unión tienen que ser específicos de secuencia (p. ej., los contactos con los residuos de fosfato en una cadena principal de ADN), siempre que la interacción como un todo es secuencia específica. Estas interacciones se caracterizan generalmente por una constante de disociación (Kd) de 10-6M-1 o menor. "Afinidad" se refiere a la fuerza de la unión: una mayor afinidad de unión se correlaciona con una menor Kd. "La unión no específica" se refiere a interacciones no covalentes que se producen entre cualquier molécula de interés (p. ej. una nucleasa modificada) y una macromolécula (p. ej. ADN) que no son dependientes de secuencia en el objetivo.

[0040] Una "proteína de unión" es una proteína que es capaz de unirse no covalentemente a otra molécula. Una proteína de unión puede unirse, por ejemplo, a una molécula de ADN (una proteína de unión a ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteínas). En el caso de una proteína de unión a proteínas, puede unirse a sí misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o puede unirse a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes. Una proteína de unión puede tener más de un tipo de actividad de unión. Por ejemplo, las proteínas con dedos de zinc tienen unión a ADN, unión a ARN y actividad de unión a proteínas. En el caso de un sistema de nucleasa guiado por ARN, la guía de ARN es heteróloga al componente de nucleasa (Cas9 o Cfp1) y ambos pueden modificarse.

[0041] Una "molécula de unión a DNA" es una molécula que puede unirse al ADN. Tal molécula de unión a ADN puede ser un polipéptido, un dominio de una proteína, un dominio dentro de una proteína más grande o un polinucleótido. En algunas formas de realización, el polinucleótido es ADN, mientras que en otras formas de realización, el polinucleótido es ARN. En algunas formas de realización, la molécula de unión a ADN es un dominio de proteína de una nucleasa (p. ej. el dominio de FokI), mientras que en otras formas de realización, la molécula de unión a ADN es un componente guía de ARN de un nucleasa ARN-guiada (p. ej., Cas9 o Cfp1).

[0042] Una "ADN de la proteína de unión" (o dominio de unión) es una proteína, o un dominio dentro de una proteína más grande, que se une al ADN de una manera específica de la secuencia, por ejemplo a través de uno o más dedos de zinc o mediante la interacción con uno o más RVD en una proteína de dedo de zinc o TALE, respectivamente. El término proteína de unión al ADN con dedos de zinc a menudo se abrevia como proteína con dedos de zinc o ZFP.

[0043] Una "proteína de unión a ADN de dedo de zinc" (o dominio de unión) es una proteína, o un dominio dentro de una proteína más grande, que se une al ADN de una manera específica de la secuencia a través de uno o más dedos de zinc, que son regiones de secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión cuya estructura se estabiliza mediante la coordinación de un ion zinc. El término proteína de unión al ADN con dedos de zinc a menudo se abrevia como proteína con dedos de zinc o ZFP.

[0044] Un "dominio de unión a ADN TALE" o "TALE" es un polipéptido que comprende uno o más dominios/unidades de repetición de TALE. Los dominios repetidos están implicados en la unión del TALE a su secuencia de ADN diana afín. Una única "unidad de repetición" (también denominada "repetición") tiene típicamente 33-35 aminoácidos de longitud y exhibe al menos alguna homología de secuencia con otras secuencias de repetición de TALE dentro de una proteína TALE de origen natural. Ver, p. ej., Patente de Estados Unidos N° 8.586.526.

[0045] Los dominios de unión al ADN del dedo de zinc y de TALE se pueden "modificar" para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo mediante modificación (alteración de uno o más aminoácidos) de la región de la hélice de reconocimiento de una proteína de dedo de zinc de origen natural o mediante modificación de los aminoácidos implicados en la unión al ADN (el "residuo variable de repetición" o región RVD). Por lo tanto, las proteínas genéticamente modificadas con dedos de zinc o las proteínas TALE son proteínas que no ocurren naturalmente. Ejemplos no limitativos de métodos para diseñar proteínas con dedos de zinc y TALE son el diseño y la selección. Una proteína diseñada es una proteína que no se encuentra en la naturaleza y cuyo diseño/composición resulta principalmente de criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar información en una base de datos que almacena información de diseños ZFP o TALE existentes y datos vinculantes. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 8.586.526; 6.140.081; 6.453.242; y 6.534.261; ver también WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.

[0046] Una proteína con dedos de zinc "seleccionada", proteínas TALE o sistema de CRISPR/Cas no se encuentra en la naturaleza cuya producción resulta principalmente de un proceso empírico tal como presentación de fagos, la trampa de interacción, el diseño racional o la selección híbrida. Ver, p. ej., US 5.789.538; US 5.925.523; US 6.007.988; US 6.013.453; US 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197 y WO 02/099084.

[0047] "TtAgo" es una proteína Argonaute procariota que se cree que participa en el silenciamiento de genes. TtAgo se deriva de la bacteria Thermus thermophilus. Ver, p. ej. Swarts et al, ibid; G. Sheng y col., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 111,652). Un "sistema TtAgo" son todos los componentes necesarios, incluidos, por ejemplo, ADN guía para la escisión por una enzima TtAgo.

[0048] "Recombinación" se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos, incluyendo pero no limitado a la captura por extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga. Para los propósitos de esta divulgación, "recombinación homóloga (RH)" se refiere a la forma especializada de dicho intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas de doble hebra en células mediante mecanismos de reparación dirigidos por homología. Este proceso requiere de nucleótidos de homología de secuencia, utiliza una molécula "donante" a la plantilla de la reparación de una molécula "diana" (es decir, el que experimenta la rotura en la doble cadena), y es conocido diversamente como la conversión de genes no cruzada" o "conversión de genes de tracto corto”, porque conduce a la transferencia de información genética del donante al objetivo. Sin desear ceñirse a ninguna teoría en particular, dicha transferencia puede implicar la corrección de desajustes del ADN heterodúplex que se forma entre el objetivo roto y el donante, y/o "hibridación de hebra dependiente de síntesis", en la que el donante se utiliza para resintetizar información genética. que se convertirán en parte del objetivo y/o procesos relacionados. Tal RH especializada a menudo da como resultado una alteración de la secuencia de la molécula diana de manera que parte o toda la secuencia del polinucleótido donante se incorpora al polinucleótido diana.

[0049] En ciertos métodos de la descripción, una o más nucleasas como se describe aquí crean un salto de doble hebra (DSB) en la secuencia diana (p. ej., la cromatina celular) en un sitio predeterminado (p. ej., un gen o locus de interés). El OSD media la integración de una construcción (p. ej. Donante) tal como se describe en el presente documento. Opcionalmente, la construcción tiene homología con la secuencia de nucleótidos en la región de la ruptura. Una construcción de expresión puede integrarse físicamente o, alternativamente, el casete de expresión se usa como molde para reparar la ruptura mediante recombinación homóloga, dando como resultado la introducción de toda o parte de la secuencia de nucleótidos como en el casete de expresión en la cromatina celular. Por tanto, se puede alterar una primera secuencia en la cromatina celular y, en determinadas formas de realización, se puede convertir en una secuencia presente en un casete de expresión. Así, el uso de los términos "reemplazar" o "sustitución" se puede entender para representar la sustitución de una secuencia de nucleótido por otro, (es decir, la sustitución de una secuencia en el sentido de información), y no requiere necesariamente física o sustitución química de un polinucleótido por otro.

[0050] En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, nucleasas modificadas adicionales se pueden utilizar para la escisión de doble cadena adicional de sitios diana adicionales dentro de la célula.

[0051] En ciertas formas de realización de métodos para la recombinación dirigida y/o sustitución y/o alteración de una secuencia en una región de interés en la cromatina celular, una secuencia cromosómica se altera por recombinación homóloga con una secuencia de nucleótidos de "donante" exógena. Tal recombinación homóloga es estimulada por la presencia de una ruptura bicatenaria en la cromatina celular, si están presentes secuencias homólogas a la región de la ruptura.

[0052] En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la primera secuencia de nucleótidos (la "secuencia donadora") pueden contener secuencias que son homólogas, pero no idénticas, a las secuencias genómicas en la región de interés, estimulando así la recombinación homóloga para insertar una secuencia no idéntica en la región de interés. Por tanto, en determinadas formas de realización, las porciones de la secuencia donante que son homólogas a las secuencias en la región de interés exhiben entre aproximadamente un 80 y un 99% (o cualquier número entero entre ellas) de identidad de secuencia con la secuencia genómica que se reemplaza. En otras formas de realización, la homología entre el donante y la secuencia genómica es superior al 99%, por ejemplo, si solo 1 nucleótido difiere entre el donante y las secuencias genómicas de más de 100 pares de bases contiguos. En ciertos casos, una porción no homóloga de la secuencia donante puede contener secuencias que no están presentes en la región de interés, de modo que se introducen nuevas secuencias en la región de interés. En estos casos, la secuencia no homóloga está generalmente flanqueada por secuencias de 50-1.000 pares de bases (o cualquier valor integral entre ellas) o cualquier número de pares de bases superior a 1.000, que son homólogas o idénticas a secuencias en la región de interés. En otras formas de realización, la secuencia donante no es homóloga a la primera secuencia y se inserta en el genoma mediante mecanismos de recombinación no homólogos.

[0053] Cualquiera de los métodos descritos en este documento pueden usarse para la inactivación parcial o completa de una o más secuencias diana en una célula mediante integración dirigida de la secuencia donante o a través de la escisión de la secuencia diana seguida por reparación mediada por NHEJ propensa a errores que interrumpe la expresión del gen o genes de interés. También se proporcionan líneas celulares con genes parcial o completamente inactivados.

[0054] Además, los métodos de integración dirigida como se describen en el presente documento también se pueden usar para integrar una o más secuencias exógenas. La secuencia de ácido nucleico exógena puede comprender, por ejemplo, uno o más genes o moléculas de ADNc, o cualquier tipo de secuencia codificante o no codificante, así como uno o más elementos de control (por ejemplo, promotores). Además, la secuencia de ácido nucleico exógeno puede producir una o más moléculas de ARN (por ejemplo, ARN en horquilla pequeña (ARNhc), ARN inhibidores (ARNis), microARN (miARN), etc.).

[0055] "Escisión" se refiere a la rotura de la cadena covalente de una molécula de ADN. La escisión puede iniciarse mediante una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Tanto la escisión monocatenaria como la escisión bicatenaria son posibles, y la escisión bicatenaria puede producirse como resultado de dos eventos de escisión monocatenarios distintos. La escisión del ADN puede resultar en la producción de extremos romos o extremos escalonados. En determinadas formas de realización, los polipéptidos de fusión se utilizan para la escisión de ADN de doble hebra dirigida.

[0056] Un "semidominio de escisión" es una secuencia de polipéptido que, en conjunción con un segundo polipéptido (idénticos o diferentes) forma una actividad de escisión que tiene complejo (preferiblemente actividad de la doble cadena de escisión). Los términos "semidominios de escisión primero y segundo"; los "semidominios de escisión y -" y los "semidominios de escisión derecho e izquierdo" se usan indistintamente para referirse a pares de semidominios de escisión que dimerizan. El término "dominio de escisión" se usa indistintamente con el término "semidominio de escisión". El término "dominio de escisión F okl" incluye la secuencia Fokl como se muestra en SEQ ID NO: 1, así como cualesquiera homólogos Fokl, incluyendo, pero no limitado a las secuencias mostradas en la Figura 17.

[0057] Un "semidominio de escisión modificado" es un semidominio de escisión que ha sido modificado a fin de formar heterodímeros obligados con otro semidominio de escisión (p. ej., otro semidominio de escisión modificado).

[0058] El término "secuencia" se refiere a una secuencia de nucleótidos de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN; puede ser lineal, circular o ramificado y puede ser monocatenario o bicatenario. El término "transgén" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se inserta en un genoma. Un transgén puede tener cualquier longitud, por ejemplo, entre 2 y 100.000.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero entre ellos o superior), preferiblemente entre aproximadamente 100 y 100.000 nucleótidos de longitud (o cualquier número entero entre ellos), más preferiblemente entre aproximadamente 2000 y 20.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entre ellos) e incluso más preferiblemente, entre aproximadamente 5 y 15 kb (o cualquier valor entre ellos).

[0059] Un "cromosoma", es un complejo de cromatina que comprende la totalidad o una porción del genoma de una célula. El genoma de una célula a menudo se caracteriza por su cariotipo, que es la colección de todos los cromosomas que componen el genoma de la célula. El genoma de una célula puede comprender uno o más cromosomas.

[0060] Un "episoma" es un ácido nucleico replicante, complejo de nucleoproteínas, u otra estructura que comprende un ácido nucleico que no es parte del cariotipo cromosómico de una célula. Los ejemplos de episomas incluyen plásmidos, minicírculos y ciertos genomas virales. Las construcciones específicas de hígado descritas en el presente documento pueden mantenerse episómicamente o, alternativamente, pueden integrarse de manera estable en la célula.

[0061] Una molécula "exógena" es una molécula que normalmente no está presente en una célula, pero puede ser introducida en una célula por uno o más métodos genéticos, bioquímicos u otros métodos. La "presencia normal en la célula" se determina con respecto a la etapa de desarrollo particular y las condiciones ambientales de la célula. Así, por ejemplo, una molécula que está presente solo durante el desarrollo embrionario del músculo es una molécula exógena con respecto a una célula muscular adulta. De manera similar, una molécula inducida por choque térmico es una molécula exógena con respecto a una célula sin choque térmico. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión funcional de una molécula endógena que funciona mal o una versión que funciona mal de una molécula endógena que funciona normalmente.

[0062] Una molécula exógena puede ser, entre otras cosas, una molécula pequeña, como se genera por un proceso de química combinatoria, o una macromolécula tal como una proteína, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, glicoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser monocatenarios o bicatenarios; puede ser lineales, ramificados o circulares; y pueden tener cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen los que pueden formar dúplex, así como los ácidos nucleicos que forman tríplex. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.176.996 y 5.422.251. Las proteínas incluyen, pero no se limitan a proteínas de unión al ADN, factores de transcripción, factores de remodelación de la cromatina, proteínas de unión al ADN metilado, polimerasas, metilasas, demetilasas, acetilasas, desacetilasas, quinasas, fosfatasas, ligasas, deubiquitinasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas y helicasas.

[0063] Una molécula exógena puede ser el mismo tipo de molécula como una molécula endógena, p. ej., una proteína o ácido nucleico exógeno. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede comprender un genoma viral infectante, un plásmido o episoma introducido en una célula o un cromosoma que normalmente no está presente en la célula. Los métodos para la introducción de moléculas exógenas en células son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a la transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas, coprecipitación con fosfato cálcico, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vectores virales. Una molécula exógena también puede ser del mismo tipo de molécula que una molécula endógena pero derivada de una especie diferente de la que deriva la célula. Por ejemplo, se puede introducir una secuencia de ácido nucleico humano en una línea celular derivada originalmente de un ratón o un hámster. Los métodos para la introducción de moléculas exógenas en células de plantas son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a la transformación de protoplastos, carburo de silicio (p. ej., WHISKERS™), Agrobacterium mediada por transformación, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas (p. ej., usando una "pistola de genes"), co-precipitación de fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vectores virales.

[0064] Por el contrario, una molécula "endógena" es una que está normalmente presente en una célula particular en una etapa de desarrollo particular bajo condiciones ambientales particulares. Por ejemplo, un ácido nucleico endógeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, cloroplasto u otro orgánulo, o un ácido nucleico episómico de origen natural. Las moléculas endógenas adicionales pueden incluir proteínas, por ejemplo, factores de transcripción y enzimas.

[0065] Como se usa en el presente documento, el término "producto de un ácido nucleico exógeno" incluye productos tanto de polinucleótidos como de polipéptidos, por ejemplo, productos de transcripción (polinucleótidos tales como ARN) y productos de traducción (polipéptidos).

[0066] Una molécula de "fusión" es una molécula en la que dos o más moléculas de subunidades están vinculadas, preferentemente de forma covalente. Las moléculas subunitarias pueden ser del mismo tipo químico de molécula o pueden ser tipos químicos diferentes de moléculas. Los ejemplos de moléculas de fusión incluyen, pero no se limitan a proteínas de fusión (por ejemplo, una fusión entre un dominio de unión a ADN de proteína y un dominio de escisión), fusiones entre un dominio de unión a ADN polinucleotídico (p. ej., sgARN) operativamente asociado con un dominio de escisión y ácidos nucleicos de fusión (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión).

[0067] La expresión de una proteína de fusión en una célula puede resultar de la entrega de la proteína de fusión a la célula o de la entrega de un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula, donde el polinucleótido se transcribe y la transcripción se traduce, para generar la proteína de fusión. El empalme trans, la escisión de polipéptidos y la ligación de polipéptidos también pueden estar implicados en la expresión de una proteína en una célula. Los métodos para el suministro de polinucleótidos y polipéptidos a las células se presentan en otra parte de esta descripción.

[0068] Un "gen", para los propósitos de la presente descripción, incluye una región de ADN que codifica un producto génico (véase infra), así como todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto del gen, si o no tales secuencias reguladoras son adyacentes a secuencias codificantes y/o transcritas. En consecuencia, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de traducción como sitios de unión de ribosomas y sitios de entrada de ribosomas internos, potenciadores, silenciadores, aislantes, elementos de contorno, orígenes de replicación, sitios de unión de matriz y regiones de control de locus.

[0069] La "expresión génica" se refiere a la conversión de la información contenida en un gen en un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (p. ej., ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida por traducción de un ARNm. Los productos génicos también incluyen ARN que se modifican mediante procesos tales como taponamiento, poliadenilación, metilación y edición, y proteínas modificadas, por ejemplo, mediante metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, miristilación y glicosilación.

[0070] La "modulación" de la expresión génica se refiere a un cambio en la actividad de un gen. La modulación de la expresión puede incluir, pero no se limita a activación génica y represión génica. La edición del genoma (p. ej., escisión, alteración, inactivación, mutación aleatoria) se puede utilizar para modular la expresión. La inactivación génica se refiere a cualquier reducción en la expresión génica en comparación con una célula que no incluye un sistema ZFP, TALE o CRISPR/Cas como se describe en el presente documento. Por tanto, la inactivación de genes puede ser parcial o completa.

[0071] Una "región de interés" es cualquier región de la cromatina celular, tal como, por ejemplo, un gen o una secuencia no codificante dentro o adyacentes a un gen, en la que es deseable unir una molécula exógena. La unión puede tener el propósito de escisión de ADN dirigida y/o recombinación dirigida. Una región de interés puede estar presente en un cromosoma, un episoma, un genoma de organoides (p. ej., mitocondrial, de cloroplastos), o un genoma viral que infecta, por ejemplo. Una región de interés puede estar dentro de la región codificante de un gen, dentro de regiones no codificantes transcritas tales como, por ejemplo, secuencias líder, secuencias finales o intrones, o dentro de regiones no transcritas, ya sea corriente arriba o corriente abajo de la región codificante. Una región de interés puede ser tan pequeña como un solo par de nucleótidos o hasta 2000 pares de nucleótidos de longitud, o cualquier valor integral de pares de nucleótidos.

[0072] Un locus de "puerto seguro" es un locus dentro del genoma en el que un gen puede ser insertado sin efectos deletéreos en la célula huésped. Lo más beneficioso es un locus de puerto seguro en el que la expresión de la secuencia del gen insertada no se ve perturbada por ninguna expresión de lectura de genes vecinos. Los ejemplos no limitantes de loci de puerto seguro que están dirigidos por nucleasa(s) incluyen CCR5, HPRT, AAVS1, Rosa y albúmina. Ver, p. ej., la Patente de Estados Unidos N° 7.951.925.; 8.771.985; 8.110.379; 7.951.925; Publicaciones de EE. UU. Núms. 20100218264; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983; 20130177960; 20150056705 y 20150159172.

[0073] Un "gen informador" o "secuencia indicadora" se refiere a cualquier secuencia que produce un producto de proteína que se mide fácilmente, de preferencia aunque no necesariamente en un ensayo de rutina. Los genes indicadores adecuados incluyen, pero no se limitan a secuencias que codifican proteínas que median la resistencia a antibióticos (p. ej., resistencia a ampicilina, resistencia a neomicina, resistencia a G418, resistencia a puromicina), secuencias que codifican proteínas coloreadas o fluorescentes o luminiscentes (p. ej., proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde mejorada, proteína fluorescente roja, luciferasa), y las proteínas que median en el aumento del crecimiento celular y/o amplificación de genes (p. ej., reductasa de dihidrofolato). Las etiquetas de epítopo incluyen, por ejemplo, una o más copias de FLAG, His, myc, Tap, HA o cualquier secuencia de aminoácidos detectable. Las "etiquetas de expresión" incluyen secuencias que codifican indicadores que se pueden unir operativamente a una secuencia génica deseada para controlar la expresión del gen de interés.

[0074] Las células "eucariotas" incluyen, pero no se limitan a células de hongos (tales como levadura), células vegetales, células animales, células de mamíferos y células humanas (p. ej., células T), incluyendo las células madre (pluripotentes y multipotentes).

[0075] Los términos "unión operativa" y "unido operativamente" (o "enlazado operativamente") se usan indistintamente con referencia a una yuxtaposición de dos o más componentes (tales como elementos de secuencia), en la que los componentes están dispuestos de tal manera que ambos componentes funcionan normalmente y permiten la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda mediar en una función que se ejerce sobre al menos uno de los otros componentes. A modo de ilustración, una secuencia reguladora transcripcional, como un promotor, está operativamente ligada a una secuencia codificante si la secuencia reguladora transcripcional controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores transcripcionales. Una secuencia reguladora de la transcripción está generalmente unida operativamente en cis con una secuencia codificante, pero no es necesario que esté directamente adyacente a ella. Por ejemplo, un potenciador es una secuencia reguladora de la transcripción que está operativamente ligada a una secuencia codificante, aunque no sean contiguas.

[0076] Un "fragmento funcional" de una proteína, polipéptido o ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la proteína de longitud completa, polipéptido o ácido nucleico, sin embargo, conserva la misma función que la proteína de longitud completa, polipéptido o ácido nucleico. Un fragmento funcional puede poseer más, menos o el mismo número de residuos que la molécula nativa correspondiente y/o puede contener una o más sustituciones de aminoácidos o nucleótidos. Los métodos para determinar la función de un ácido nucleico o proteína (p. ej., función, capacidad de hibridar de codificación a otro ácido nucleico, ensayos de actividad enzimática) son bien conocidos en la técnica.

[0077] Un "vector" o "constructo" polinucleotídico es capaz de transferir secuencias génicas a células diana. Normalmente, "construcción de vector", "vector de expresión", "construcción de expresión", "casete de expresión" y "vector de transferencia de genes" significan cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir secuencias de genes a las células objetivo. Por tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores de integración.

[0078] Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente y se refieren a mamíferos tales como pacientes humanos y primates no humanos, así como animales experimentales tales como conejos, perros, gatos, ratas, ratones y otros animales. Por consiguiente, el término "sujeto" o "paciente", como se usa en el presente documento, significa cualquier paciente o sujeto mamífero al que se pueden administrar los casetes de expresión de la invención. Los sujetos de la presente invención incluyen aquellos con un trastorno.

[0079] Los términos "tratar" y "tratamiento" como se usa en este documento se refieren a la reducción en la gravedad y/o frecuencia de los síntomas, eliminación de los síntomas y/o causa subyacente, la prevención de la aparición de síntomas y/o su causa subyacente, y mejora o reparación de daños. El cáncer, las enfermedades monogénicas y la enfermedad de injerto contra huésped son ejemplos no limitantes de afecciones que pueden tratarse usando las composiciones y métodos descritos en este documento.

[0080] La "cromatina" es la estructura de nucleoproteína que comprende el genoma celular. La cromatina celular comprende ácido nucleico, principalmente ADN, y proteínas, incluidas las histonas y las proteínas cromosómicas que no son histonas. La mayor parte de la cromatina celular eucariota existe en forma de nucleosomas, donde un núcleo de nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociado con un octámero que comprende dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y el ADN enlazador (de longitud variable según el organismo) se extiende entre los núcleos de los nucleosomas. Una molécula de histona H1 generalmente se asocia con el ADN enlazador. Para los propósitos de la presente divulgación, el término "cromatina" pretende abarcar todos los tipos de nucleoproteínas celulares, tanto procariotas como eucariotas. La cromatina celular incluye cromatina tanto cromosómica como episomal.

[0081] Una "región accesible" es un sitio de la cromatina celular en el que un sitio diana presente en el ácido nucleico puede estar unido por una molécula exógena que reconoce el sitio de destino. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, se cree que una región accesible es aquella que no está empaquetada en una estructura nucleosómica. La estructura distintiva de una región accesible a menudo se puede detectar por su sensibilidad a sondas químicas y enzimáticas, por ejemplo, nucleasas.

[0082] Un "sitio diana" o "secuencia diana" es una secuencia de ácido nucleico que define una parte de un ácido nucleico a la cual se unirá una molécula de unión, siempre que las condiciones suficientes para existir unión. Por ejemplo, la secuencia 5'-GAATTC-3' es un sitio diana para la endonucleasa de restricción Eco RI. Una secuencia "prevista" o "en el objetivo" es la secuencia a la que se pretende que se una la molécula de unión y una secuencia "no intencionada" o "fuera del objetivo" incluye cualquier secuencia unida por la molécula de unión que no es el objetivo previsto.

Moléculas/dominios de unión a ADN

[0083] Se describen en el presente documento composiciones que comprenden una molécula/dominio de unión a ADN que se une específicamente a un sitio diana en cualquier gen o locus de interés. Se puede usar cualquier molécula/dominio de unión a ADN en las composiciones y métodos descritos en este documento, incluidos, entre otros, un dominio de unión a ADN con dedo de zinc, un dominio de unión a ADN de TALE, la porción de unión a ADN (guía o sgARN) de un CRISPR/Cas nucleasa, o un dominio de unión al ADN de una meganucleasa.

[0084] En ciertas formas de realización, el dominio de unión de ADN comprende una proteína de dedo de zinc. Preferiblemente, la proteína de dedo de zinc no se produce de forma natural porque está diseñada para unirse a un sitio diana de elección. Véase, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo y col. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313-340; Isalan y col. (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal y col. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 632-637; Choo y col. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416; Patentes de Estados Unidos N° 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; y Publicaciones de Patentes de Estados Unidos Nos 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061. En ciertas formas de realización, el dominio de unión a ADN comprende una proteína de dedos de cinc se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2012/0060230 (p. ej., Tabla 1).

[0085] Un dominio de unión de dedo de zinc modificado puede tener una especificidad de unión novela, en comparación con una proteína de dedo de zinc de origen natural. Los métodos modificados incluyen, pero no se limitan a diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de tripletes (o cuadrupletes) y secuencias de aminoácidos de dedos de zinc individuales, en las que cada secuencia de nucleótidos de tripletes o cuadrupletes está asociada con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc que se unen al triplete particular o secuencia de cuadrupletes. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 6.453.242 y 6.534.261.

[0086] Los métodos de selección ejemplares, que incluyen la presentación de fagos y los sistemas de dos híbridos, se describen en las Patentes de Estados Unidos 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237. Además, se ha descrito la mejora de la especificidad de unión para los dominios de unión con dedos de zinc, por ejemplo, en la patente de EE. Uu . N° 6.794.136.

[0087] Además, como se describe en estas y otras referencias, dominios de dedos de zinc y/o proteínas de dedos de zinc de múltiples dedos pueden unirse entre sí utilizando cualquier secuencia de enlazador adecuado, incluyendo por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véanse también las Patentes de Estados Unidos N° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias de enlace ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína. Además, se ha descrito la mejora de la especificidad de unión para los dominios de unión con dedos de zinc, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N° 6.794.136.

[0088] Selección de sitios objetivo; Los expertos en la técnica conocen las ZFP y los métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que las codifican) y se describen en detalle en las Patentes de Estados Unidos N° 6.140.081; 5.789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.

[0089] Además, como se describe en estas y otras referencias, dominios de dedos de zinc y/o proteínas de dedos de zinc de múltiples dedos pueden unirse entre sí utilizando cualquier secuencia de enlazador adecuado, incluyendo por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véanse también las Patentes de Estados Unidos N° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias de enlace ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.

[0090] Por lo general, las ZFP incluyen al menos tres dedos. Algunas ZFP incluyen cuatro, cinco o seis dedos. Las ZFP que incluyen tres dedos normalmente reconocen un sitio objetivo que incluye 9 o 10 nucleótidos; Las ZFP que incluyen cuatro dedos normalmente reconocen un sitio objetivo que incluye de 12 a 14 nucleótidos; mientras que las ZFP que tienen seis dedos pueden reconocer sitios de destino que incluyen de 18 a 21 nucleótidos. Las ZFP también pueden ser proteínas de fusión que incluyen uno o más dominios reguladores, dominios que pueden ser dominios de activación o represión transcripcional.

[0091] En algunas formas de realización, el dominio de unión a ADN puede ser derivado de una nucleasa. Por ejemplo, las secuencias de reconocimiento de endonucleasas y meganucleasas homing como I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, IPanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII y I-TevIII son conocidos. Véase también la Patente de Estados Unidos N° 5.420.032; Patente de Estados Unidos N° 6.833.252; Belfort y col. (1997) Nucleic Acids Res.

25: 3379-3388; Dujon y col. (1989) Gene 82: 115-118; Perler y col. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12: 224-228; Gimble y col. (1996) J. Mol. Biol. 263: 163-180; Argast y col. (1998) J. Mol. Biol.

280: 345-353 y el catálogo de New England Biolabs. Además, la especificidad de unión al ADN de endonucleasas y meganucleasas autodirigidas puede modificarse para unirse a sitios diana no naturales. Véase, por ejemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10: 895-905; Epinat y col. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 2952-2962; Ashworth y col. (2006) Nature 441: 656-659; Paques y col. (2007) Current Gene Therapy 7: 49-66; Publicación de Patente de Estados Unidos N °20070117128.

[0092] En ciertas formas de realización, la proteína de dedos de cinc se utiliza con los dominios de escisión mutantes descritos en este documento comprende una o más mutaciones (sustituciones, deleciones, y/o inserciones) de las regiones de cadena principal (por ejemplo, las regiones fuera de la región de hélice de reconocimiento de 7 aminoácidos numerada -1 a 6), por ejemplo en una o más de las posiciones -14, -9 y/o -5 (ver, p. ej., la Figura 5A). El residuo de tipo salvaje en una o más de estas posiciones se puede eliminar, reemplazar con cualquier residuo de aminoácido y/o incluir uno o más residuos adicionales. En algunas formas de realización, Arg (R) en la posición -5 se cambia a Tyr (Y), Asp (N), Glu (E), Leu (L), Gln (Q) o Ala (A). En otras formas de realización, Arg (R) en la posición (­ 9) se reemplaza con Ser (S), Asp (N) o Glu (E). En formas de realización adicionales, el Arg (R) en la posición (-14) se reemplaza con Ser (S) o Gln (Q). En otras formas de realización, los polipéptidos de fusión pueden comprender mutaciones en el dominio de unión al ADN del dedo de zinc donde los aminoácidos en las posiciones (-5), (-9) y/o (­ 14) se cambian a cualquiera de los aminoácidos enumerados anteriormente en cualquier combinación.

[0093] En otras formas de realización, el dominio de unión de ADN comprende un dominio modificado de un efector transcripcional del tipo activador de (TAL) (TALE) similar a los derivados de la planta de patógenos Xanthomonas (ver Boch et al, (2009) Science 326: 1509-1512 y Moscou y Bogdanove, (2009) Science 326: 1501) y Ralstonia (véase Heuer et al (2007) Applied and Environmental Microbiology 73 (13): 4379-4384); Publicaciones de Patente de EE. UU. Nos 20110301073 y 20110145940. Se sabe que las bacterias patógenas de plantas del género Xanthomonas causan muchas enfermedades en plantas de cultivo importantes. La patogenicidad de Xanthomonas depende de un sistema de secreción conservado de tipo III (T3S) que inyecta más de 25 proteínas efectoras diferentes en la célula vegetal. Entre estas proteínas inyectadas se encuentran efectores de tipo activador de la transcripción (TALE) que imitan los activadores de la transcripción de las plantas y manipulan el transcriptoma de las plantas (véase Kay et al (2007) Science318: 648-651). Estas proteínas contienen un dominio de unión al ADN y un dominio de activación transcripcional. Uno de los TALE mejor caracterizados es AvrBs3 de Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (véase Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 y WO2010079430). Los TALE contienen un dominio centralizado de repeticiones en tándem, cada repetición contiene aproximadamente 34 aminoácidos, que son clave para la especificidad de unión al ADN de estas proteínas. Además, contienen una secuencia de localización nuclear y un dominio de activación transcripcional ácido (para una revisión, véase Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163 (3): 256-272). Además, en las bacterias fitopatógenas Ralstonia solanacearum se han encontrado dos genes, designados brg11 y hpx17, que son homólogos a la familia AvrBs3 de Xanthomonas en la cepaGMI1000 de R. solanacearum biovar 1 y en la cepa RS1000 de biovar 4 (Ver Heuer et al (2007) Appl y Envir Micro 73 (13): 4379­ 4384). Estos genes son 98,9% idénticos entre sí en la secuencia de nucleótidos, pero se diferencian por una deleción de 1575 pares de bases en el dominio de repetición de hpx17. Sin embargo, ambos productos génicos tienen menos del 40% de identidad de secuencia con las proteínas de la familia AvrBs3 de Xanthomonas.

[0094] La especificidad de estos efectores de TAL depende de las secuencias encontradas en las repeticiones en tándem. La secuencia repetida comprende aproximadamente 102 pares de bases y las repeticiones son típicamente 91-100% homólogas entre sí (Bonas et al, ibid). El polimorfismo de las repeticiones generalmente se ubica en las posiciones 12 y 13 y parece haber una correspondencia uno a uno entre la identidad de los diresiduos hipervariables (el diresiduo variable de repetición o región RVD) en las posiciones 12 y 13 con la identidad de los nucleótidos contiguos en la secuencia diana del efector TAL (ver Moscou y Bogdanove, (2009) Science 326: 1501 y Boch et al (2009) Science 326: 1509-1512). Experimentalmente, el código natural para el reconocimiento del ADN de estos efectores TAL se ha determinado de tal manera que una secuencia de HD en las posiciones 12 y 13 (diresiduo variable de repetición o RVD) conduce a una unión a la citosina (C), NG se une a T, NI a A, C, G o T, NN se une a A o G, y ING se une a T. Estas repeticiones de unión de ADN se han ensamblado en proteínas con nuevas combinaciones y números de repeticiones, para producir factores de transcripción artificiales que pueden interactuar con nuevas secuencias y activar la expresión de un gen indicador no endógeno en células vegetales (Boch et al, ibid). Las proteínas de TAL modificadas genéticamente se han vinculado a un semidominio de escisión de FokI para producir una fusión de nucleasa de dominio efector de TAL (TALEN), que incluye TALEN con RVD atípicos. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 8.586.526.

[0095] En algunas formas de realización, el TALEN comprende un dominio de escisión de endonucleasa (p. ej., FokI) o semidominio de escisión. En otras formas de realización, la nucleasa de TALE es un mega TAL. Estas nucleasas mega TAL son proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión al ADN de TALE y un dominio de escisión de meganucleasas. El dominio de escisión de meganucleasa es activo como monómero y no requiere dimerización para su actividad. (Véase Boissel y col., (2013) Nucl Acid Res: 1-13, doi: 10.1093/nar/gktl224).

[0096] En todavía otras formas de realización, la nucleasa comprende un TALEN compacto. Estas son proteínas de fusión de cadena sencilla que unen un dominio de unión de ADN de TALE a un dominio de nucleasa TevI. La proteína de fusión puede actuar como una nickasa localizada por la región TALE, o puede crear una ruptura de doble hebra, dependiendo de dónde se encuentre el dominio de unión al ADN de TALE con respecto al dominio nucleasa TevI (ver Beurdeley et al (2013) Nat Comm: 1-8 DOI: 10.1038/ncomms2782). Además, el dominio de nucleasa también puede exhibir funcionalidad de unión a ADN. Cualesquier TALENs se pueden usar en combinación con TALENs adicionales (p. ej., una o más TALENs (cTALENs o FokI-TALENs) con uno o más mega-TALEs.

[0097] Además, como se describe en estas y otras referencias, dominios de dedos de zinc y/o proteínas de dedos de zinc de múltiples dedos o TALE pueden unirse entre sí usando cualquier secuencia de enlace adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlaces de 5 o más aminoácidos de longitud. y 7.153.949 para secuencias de enlace ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de enlaces adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína. Además, se ha descrito la mejora de la especificidad de unión para los dominios de unión del dedo de zinc, por ejemplo, en la patente de e E. UU. N° 6.794.136. En ciertas formas de realización, el dominio de unión al ADN es parte de un sistema de nucleasa CRISPR/Cas, incluyendo un ARN guía única de molécula de unión de ADN (sgARN) que se une a ADN. Véase, p. ej., Patente de EE. UU. N° 8.697.359 y las publicaciones de patente de EE. UU. Nos 20150056705 y 20150159172. El locus CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas), que codifica los componentes de a Rn del sistema, y el locus cas (asociado a CRISPR), que codifica proteínas (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova y col., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova y col., 2006. Biol. Direct 1:7; Haft y col., 2005. PLoS Comput. Biol. 1:e60) componen las secuencias de genes del sistema de nucleasa CRISPR/Cas. Los loci CRISPR en huéspedes microbianos contienen una combinación de genes asociados a CRISPR (Cas), así como elementos de ARN no codificantes capaces de programar la especificidad de la escisión del ácido nucleico mediada por CRISPR.

[0098] En algunas formas de realización, el dominio de unión de ADN es parte de un sistema TtAgo (ver Swarts et al, ibid; Sheng et al, ibid). En eucariotas, el silenciamiento génico está mediado por la familia de proteínas Argonaute (Ago). En este paradigma, Ago está ligado a ARN pequeños (19-31 nt). Este complejo de silenciamiento de proteína-ARN reconoce los ARN diana a través del emparejamiento de bases de Watson-Crick entre el ARN pequeño y la diana y escinde endonucleolíticamente el ARN diana (Vogel (2014) Science 344: 972-973). Por el contrario, las proteínas procarióticas Ago se unen a pequeños fragmentos de ADN monocatenario y probablemente funcionan para detectar y eliminar ADN extraño (a menudo viral) (Yuan et al., (2005) Mol. Cell 19, 405; Olovnikov, et al. (2013) Mol. Cell 51, 594; Swarts et al., Ibid). Las proteínas Ago procarióticas ejemplares incluyen las de Aquifex aeolicus, Rhodobacter sphaeroides y Thermus thermophilus.

[0099] Una de las proteínas Ago procarióticas más bien caracterizadas es la de T. thermophilus (TtAgo; Swarts et al. ibid). TtAgo se asocia con fragmentos de ADN monocatenario de 15 nt o 13-25 nt con grupos fosfato 5' . Este "ADN guía" unido por TtAgo sirve para dirigir el complejo proteína-ADN para que se una a una secuencia de ADN complementaria de Watson-Crick en una molécula de ADN de terceros. Una vez que la información de la secuencia en estos ADN guía ha permitido la identificación del ADN diana, el complejo de ADN guía TtAgo escinde el ADN diana. Dicho mecanismo también está respaldado por la estructura del complejo de ADN guía-TtAgo mientras está unido a su ADN diana (G. Sheng et al., Ibid). Ago de Rhodobacter sphaeroides (RsAgo) tiene propiedades similares (Olivnikov et al. Ibid).

[0100] ADNs de guía exógenos de la secuencia de ADN arbitraria pueden ser cargados en la proteína TtAgo (Swarts et al. Ibid.). Dado que la especificidad de la escisión de TtAgo está dirigida por el ADN guía, un complejo de TtAgo-ADN formado con un ADN guía exógeno, especificado por el investigador, dirigirá la escisión del ADN diana de TtAgo a un ADN diana complementario especificado por el investigador. De esta manera, se puede crear una ruptura de doble hebra específica en el ADN. El uso del sistema de ADN guía TtAgo (o sistemas de ADN guía Ago ortólogos de otros organismos) permite la escisión dirigida del ADN genómico dentro de las células. Tal escisión puede ser monocatenaria o bicatenaria. Para la escisión del ADN genómico de mamíferos, sería preferible utilizar una versión del codón TtAgo optimizada para la expresión en células de mamíferos. Además, podría ser preferible tratar las células con un complejo TtAgo-ADN formado in vitro donde la proteína TtAgo se fusiona con un péptido que penetra en las células. Además, podría ser preferible utilizar una versión de la proteína TtAgo que se haya alterado mediante mutagénesis para tener una actividad mejorada a 37°C. La escisión de ADN mediada por ARN-Ago podría usarse para afectar a una amplia gama de resultados que incluyen eliminación de genes, adición de genes dirigidos, corrección de genes, eliminación de genes dirigidos utilizando técnicas estándar en la técnica para la explotación de roturas de ADN.

[0101] Por lo tanto, cualquier molécula/dominio de unión a ADN se puede utilizar.

Moléculas de fusión

[0102] Las moléculas de fusión que comprenden dominios de unión al ADN (p. ej., componentes de ZFPs o TALEs, CRISPR/Cas tales como ARNs de guía individuales) como se describe en el presente documento y un dominio heterólogo de regulación (funcional) (o un fragmento funcional del mismo) también se proporcionan. Publicaciones de Patentes de Estados Unidos Nos 20050064474; 20060188987 y 2007/0218528 para obtener detalles sobre fusiones de dominios de unión a ADN y dominios de escisión de nucleasa.

[0103] Las moléculas de fusión se construyen mediante métodos de clonación y conjugación bioquímica que son bien conocidos para los expertos en la técnica. Las moléculas de fusión comprenden un dominio de unión al ADN y un dominio funcional. Las moléculas de fusión también comprenden opcionalmente señales de localización nuclear (como, por ejemplo, las del antígeno T del medio SV40) y etiquetas de epítopo (como, por ejemplo, FLAG y hemaglutinina). Las proteínas de fusión (y los ácidos nucleicos que las codifican) están diseñadas de manera que el marco de lectura de traducción se conserva entre los componentes de la fusión.

[0104] Las fusiones entre un componente de polipéptido de un dominio funcional (o un fragmento funcional de la misma), por un lado, y un dominio de unión a ADN no de proteína (por ejemplo, antibiótico, intercalador, de menor importancia de unión al surco, ácido nucleico) en el otro, se construyen mediante métodos de conjugación bioquímica conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, el catálogo de Pierce Chemical Company (Rockford, IL). Se han descrito métodos y composiciones para realizar fusiones entre un aglutinante de surco menor y un polipéptido. Mapp y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 97: 3930-3935. Además, los ARN de guía única del sistema CRISPR/Cas pueden asociarse con dominios funcionales para formar nucleasas.

[0105] En ciertas formas de realización, el sitio diana está presente en una región accesible de la cromatina celular. Las regiones accesibles se pueden determinar como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos 7.217.509 y 7.923.542. Si el sitio diana no está presente en una región accesible de cromatina celular, se pueden generar una o más regiones accesibles como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nos 7.785.792 y 8.071.370. En formas de realización adicionales, el dominio de unión al ADN de una molécula de fusión es capaz de unirse a la cromatina celular independientemente de si su sitio diana está en una región accesible o no. Por ejemplo, dichos dominios de unión al ADN son capaces de unirse al ADN enlazador y/o al ADN nucleosómico. Ejemplos de este tipo de dominio de unión de ADN "pionero" se encuentran en ciertos receptores de esteroides y en el factor nuclear 3 de los hepatocitos (HNF3) (Cordingley et al. (1987) Cell 48: 261-270; Pina et al. (1990) Cell 60: 719-731; y Cirillo et al. (1998) EMBO J. 17: 244-254).

[0106] La molécula de fusión se puede formular con un vehículo farmacéuticamente aceptable, como se conoce por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., 1985; y Patentes de Estados Unidos N° 6.453.242 y 6.534.261.

[0107] Dominios funcionales ejemplares adicionales se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Nos 6.534.261 y 6.933.113.

[0108] Los dominios funcionales que están regulados por moléculas pequeñas exógenas o ligandos también pueden seleccionarse. Por ejemplo, puede emplearse la tecnología RheoSwitch® en la que un dominio funcional solo asume su conformación activa en presencia del ligando RheoChem™ externo (véase, por ejemplo, el documento US 20090136465).

Nucleasas

[0109] En determinadas formas de realización, la proteína de fusión comprende un dominio de unión de unión a ADN y un dominio de escisión (nucleasa). Como tal, la modificación génica se puede lograr usando una nucleasa, por ejemplo, una nucleasa manipulada. La tecnología de nucleasas diseñada se basa en la modificación de proteínas de unión al ADN de origen natural. Por ejemplo, se ha descrito la modificación de endonucleasas autodirigidas con especificidades de unión a ADN adaptadas. Chames y col. (2005) Nucleic Acids Res 33 (20): e178; Arnould y col. (2006) J. Mol. Biol. 355: 443-458. Además, también se ha descrito la modificación de ZFP. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 6.534.261; 6.607.882; 6.824.978; 6.979.539; 6.933.113; 7.163.824; y 7.013.219.

[0110] Además, ZFPs y/o TALEs se han fusionado con dominios de nucleasa para crear ZFNs y TALENs - una entidad funcional que es capaz de reconocer su diana de ácido nucleico destinado a través de su dominio de unión a ADN modificados (ZFP o TALE) y hacer que el ADN se corta cerca del sitio de unión del ADN a través de la actividad nucleasa. Ver, p. ej., Kim y col. (1996) Proc Nat'l Acad Sci EE. UU. 93 (3): 1156-1160. Más recientemente, tales nucleasas se han utilizado para la modificación del genoma en una variedad de organismos. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; y publicación internacional WO 07/014275.

[0111] Los ejemplos no limitantes de nucleasas incluyen TALENs y nucleasas de dedos de zinc. La nucleasa puede comprender dominios heterólogos de unión y escisión de ADN (por ejemplo, nucleasas con dedos de zinc).

[0112] En cualquiera de las nucleasas descritas aquí, la nucleasa puede comprender un dominio de unión a ADN TALE modificado y un dominio de nucleasa, también referido como TALENs. Se han publicado métodos y composiciones para modificar estas proteínas TALEN para una interacción sólida y específica del sitio con la secuencia diana elegida por el usuario (véase la patente de EE. UU. N° 8.586.526). En algunas formas de realización, TALEN comprende un dominio de escisión de endonucleasa (Fokl) o un semidominio de escisión.

[0113] Se han utilizado dominios de unión a ADN de meganucleasas naturales, principalmente de la familia LAGLIDADG, para promover la modificación del genoma específico de sitio en plantas, levaduras, Drosophila, células de mamíferos y ratones, pero este enfoque se ha limitado a la modificación de genes homólogos que conservan la secuencia de reconocimiento de meganucleasa (Monet et al. (1999), Biochem. Biophysics. Res. Common. 255: 88­ 93) o genomas prediseñados en los que se ha introducido una secuencia de reconocimiento (Route et al. (1994), Mol. Cell. Biol. 14: 8096-106; Chilton y col. (2003), Plant Physiology. 133: 956-65; Puchta y col. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci EE. UU. 93: 5055-60; Rong y col. (2002), Genes Dev. 16: 1568-81; Gouble y col. (2006), J. Gene Med. 8 (5): 616­ 622). En consecuencia, se han hecho intentos de diseñar meganucleasas para exhibir una nueva especificidad de unión en sitios médicamente o biotecnológicamente relevantes (Porteus et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23: 967-73; Sussman et al. (2004), J. Mol. Biol. 342: 31-41; Epinat et al. (2003), Nucleic Acids Res. 31: 2952-62; Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10: 895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441: 656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7: 49-66; Publicaciones de patente de EE. UU. Nos 20070117128; 20060206949; 20060153826; 20060078552; y 20040002092). Además, los dominios de unión a ADN de origen natural o manipulados a partir de meganucleasas pueden unirse operativamente con un dominio de escisión de una nucleasa heteróloga (Fokl).

[0114] En otras formas de realización, la nucleasa es una nucleasa de dedos de cinc (ZFN) o fusión de nucleasa de dominio de ADN TALE (TALEN). Los ZFN y TALEN comprenden un dominio de unión a ADN (proteína de dedo de zinc o dominio de unión a ADN de TALE) que se ha diseñado para unirse a un sitio diana en un gen de elección y dominio de escisión o un semidominio de escisión.

[0115] Como se describe en detalle anteriormente, dominios de unión de dedo de zinc y dominios de unión a ADN TALE pueden ser diseñados para unirse a una secuencia de elección. Véase, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo y col. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313-340; Isalan y col. (2001) Nature Biotechnol.

19: 656-660; Segal y col. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 632-637; Choo y col. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416. Un dominio de unión de dedos de zinc diseñado o una proteína TALE puede tener una nueva especificidad de unión, en comparación con una proteína de origen natural. Los métodos modificados incluyen, pero no se limitan a diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de tripletes (o cuadrupletes) y secuencias de aminoácidos de dedos de zinc individuales o TALE, en las que cada secuencia de nucleótidos de tripletes o cuadrupletes está asociada con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc o unidades de repetición de TALE que se unen a la secuencia particular de triplete o cuadruplete. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 6.453.242 y 6.534.261.

[0116] Selección de sitios objetivo; y los expertos en la técnica conocen métodos para el diseño y construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que las codifican) y se describen en detalle en las Patentes de Estados Unidos Nos 7.888.121 y 8.409.861.

[0117] Además, como se describe en estas y otras referencias, dominios de dedos de zinc, TALEs y/o proteínas de dedos de zinc de múltiples dedos pueden unirse entre sí utilizando cualquier secuencia de enlazador adecuado, incluyendo por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de largo. (p. ej., TGEKP (SEQ ID NO: 9), TGGQRP (SEQ ID NO: 10), TGQKP (SEQ ID NO: 11) y/o TGSQKP (SEQ ID NO: 12). Véase, p. ej., Patentes de EE. UU. Números 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias de enlace ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en este documento pueden incluir cualquier combinación de enlaces adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína. Véase, también, Patente de EE. UU. 8.772.453.

[0118] Los dominios de escisión heterólogos se pueden obtener a partir de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Ejemplos de endonucleasas de las que se puede derivar un dominio de escisión incluyen, pero no se limitan a endonucleasas de restricción y endonucleasas autodirigidas. Ver, por ejemplo, 2002-2003 Catalog, New England Biolabs, Beverly, MA; y Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388. Se conocen enzimas adicionales que escinden el a Dn (p. ej., Nucleasa S1; nucleasa de vigna radiate; DNasa pancreática I; nucleasa microcócica; endonucleasa HO de levadura; ver también Linn et al. (Eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Labora tory Press, 1993). Una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) se pueden usar como fuente de dominios de escisión y semidominios de escisión.

[0119] Del mismo modo, un medio en el dominio de escisión se puede derivar de cualquier nucleasa o porción del mismo, como se ha expuesto anteriormente, que requiere dimerización para la actividad de escisión. En general, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden semidominios de escisión. Alternativamente, se puede usar una única proteína que comprende dos semidominios de escisión. Los dos semidominios de escisión pueden derivarse de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma), o cada semidominio de escisión puede derivarse de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios diana para las dos proteínas de fusión están preferiblemente dispuestos, uno con respecto al otro, de manera que la unión de las dos proteínas de fusión a sus respectivos sitios diana coloque los semidominios de escisión en una orientación espacial entre sí que permita que los semidominios de escisión formen un dominio de escisión funcional, p. ej., mediante la dimerización. Por tanto, en determinadas formas de realización, los bordes cercanos de los sitios diana están separados por 5-10 nucleótidos o por 15-18 nucleótidos. Sin embargo, cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos puede intervenir entre dos sitios diana (p. ej., de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En general, el sitio de escisión se encuentra entre los sitios objetivo.

[0120] Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unirse al ADN (a un sitio de reconocimiento), y la escisión de ADN en o cerca del sitio de unión específico a las secuencias. Ciertas enzimas de restricción (p. ej., Tipo IIS) escinden ADN en sitios retirados del sitio de reconocimiento y que tienen dominios de unión y escisión separables. Por ejemplo, la enzima de tipo IIS FokI cataliza la escisión bicatenaria del ADN, en 9 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en una hebra y 13 nucleótidos en su sitio de reconocimiento en la otra. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89: 4275-4279; Li y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.

90: 2764-2768; Kim y col. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 91: 883-887; Kim y col. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 31.978-31.982.

[0121] Una enzima de restricción de tipo IIs, cuyo dominio de escisión es separable del dominio de unión, es FokI. Esta enzima particular es activa como un dímero. Bitinaite y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 95: 10.570­ 10.575. Por consiguiente, para los propósitos de la presente divulgación, la porción de la enzima FokI usada en las proteínas de fusión descritas se considera un semidominio de escisión. Por tanto, para la escisión bicatenaria dirigida y/o la sustitución dirigida de secuencias celulares usando fusiones de dedo de zinc-FokI, se pueden usar dos proteínas de fusión, cada una de las cuales comprende un semidominio de escisión FokI, para reconstituir un dominio de escisión catalíticamente activo. Alternativamente, también se puede usar una única molécula de polipéptido que contenga un dominio de unión de dedo de zinc y dos semidominios de escisión de FokI. Los parámetros para la escisión dirigida y la alteración de la secuencia dirigida usando fusiones de dedo de zinc-FokI se proporcionan en otra parte de esta descripción.

[0122] Un dominio de escisión o semidominio de escisión puede ser cualquier porción de una proteína que conserva la actividad de escisión, o que conserva la capacidad de multimerizar (p. ej., dimerizar) para formar un dominio de escisión funcional.

[0123] Enzimas de restricción de tipo IIS ejemplares se describen en la publicación internacional WO 07/014275. Las enzimas de restricción adicionales también contienen dominios de unión y escisión separables, y estos se contemplan en la presente divulgación. Véase, por ejemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 418-420.

[0124] En ciertas formas de realización, el dominio de escisión comprende un dominio Fokl de escisión utilizado para generar las estructuras cristalinas 1FOK.pdb y 2FOK.pdb (ver Wah et al (1997) Nature 388: 97-100) teniendo la secuencia mostrada a continuación: Semidominio de escisión de FokI de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1)

QLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRG

KHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNK

HINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIG

GEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF

[0125] Los semidominios de escisión derivados de FokI según la invención comprenden una mutación en uno o más residuos de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 1. Las mutaciones incluyen sustituciones (de un residuo de aminoácido de tipo salvaje por un residuo diferente, inserciones (de uno o más residuos de aminoácidos) y/o deleciones (de uno o más residuos de aminoácidos). Residuos 414-426, 443-450, 467-488, 501-502 y/o 521-531 (numerados en relación con SEQ ID NO: 1 y las secuencias que se muestran en la Figura 17) se pueden mutar de acuerdo con la invención ya que estos residuos se encuentran cerca de la cadena principal del a Dn en un modelo molecular de un ZFN unido a su sitio objetivo descrito en Miller et al. ((2007) Nat Biotechnol 25: 778-784). En otras formas de realización, el residuo de tipo salvaje en una o más de las posiciones 416, 418, 422, 446, 448, 479, 480, 481 y/o 525 se pueden reemplazar con R416D, R416E, S418E, S418D, R422H, S446D, K448A, I479Q, I479T, G480D, Q481A, Q481E, K525S, K525A, N527 R4 R416D R422H, R416E K448A, R416D R422H, K448A I479Q, K448A Q481A. K448A K525A.

[0126] En ciertas formas de realización, el dominio de escisión comprende uno o más semidominios de escisión modificados (también denominados mutantes del dominio de dimerización) que minimizan o previenen la homodimerización, como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos 7,914,796; 8.034.598 y 8.623.618; y la Publicación de Patente de los Estados Unidos N° 20110201055. Residuos de aminoácidos en las posiciones 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491,496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 y 538 de Fokl (numerados en relación con SEQ ID NO: 1 y las secuencias mostradas en la Figura 17) son todas dianas para influir en la dimerización de los semidominios de escisión de FokI. Las mutaciones pueden incluir mutaciones a residuos que se encuentran en enzimas de restricción naturales homólogas a FokI. En otra forma de realización, el semidominio de escisión modificado comprende mutaciones en los residuos de aminoácidos 499, 496 y 486 además de las mutaciones en uno o más residuos de aminoácidos 416, 422, 448 o 525, todos numerados en relación con la SEQ ID NO: 1. o secuencias que se muestran la figura 17.

[0127] En ciertas formas de realización, las composiciones descritas en la presente memoria incluyen semidominios de escisión modificados de FokI que forman heterodímeros obligados como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 7.914.796.; 8.034.598; 8.961.281 y 8.623.618; Publicaciones de Patente de Estados Unidos Nos 20080131962 y 20120040398. Por tanto, en una forma de realización preferida son proteínas de fusión en las que el semidominio de escisión modificado comprende un polipéptido en el que el residuo Gln (Q) de tipo salvaje en la posición 486 se reemplaza con un residuo Glu (E), el residuo de tipo salvaje Ile (I) en la posición 499 se reemplaza con un residuo de Leu (L) y el residuo de Asn (N) de tipo salvaje en la posición 496 se reemplaza con un Asp (D) o un residuo Glu (E) ("ELD" o "ELE") además de una o más mutaciones en las posiciones 416, 422, 448 o 525 (numeradas en relación con la SEQ ID NO: 1 y las secuencias mostradas en la Figura 17). En otra forma de realización, los semidominios de escisión modificados se derivan de un semidominio de escisión de FokI de tipo salvaje y comprenden mutaciones en los residuos de aminoácidos 490, 538 y 537, numerados en relación con FokI de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1 y las secuencias mostradas en la Figura 17) además de una o más mutaciones en los residuos de aminoácidos 416, 422, 448 o 525. En una forma de realización preferida es una proteína de fusión, en la que el semidominio de escisión modificado comprende un polipéptido en el que el residuo de Glu (E) de tipo salvaje en la posición 490 se reemplaza con un residuo de Lys (K), el residuo de Ile (I) de tipo salvaje en la posición 538 se reemplaza con un residuo de Lys (K) y el residuo de His (H) de tipo salvaje en la posición 537 se reemplaza con un residuo Lys (K) o un residuo Arg (R) ("KKK" o "KKR") (ver US 8.962.281) además de una o más mutaciones en las posiciones 416, 422, 448 o 525 Ver, p. ej., la Patente de Estados Unidos N° 7.914.796.; 8.034.598 y 8.623.618. En otras formas de realización, el semidominio de escisión modificado comprende las mutacines "Sharkey" y/o "Sharkey" (véase Guo et al, (2010) J. Mol Biol 400 (1):. 96-107).

[0128] En otra forma de realización, los semidominios de escisión modificados se derivan de un semidominio de escisión de FokI de tipo salvaje y comprenden mutaciones en los residuos de aminoácidos 490 y 538, numerados en relación con el FokI de tipo salvaje o un homólogo de FokI además de una o más mutaciones en los residuos de aminoácidos 416, 422, 448 o 525. En una forma de realización preferida es una proteína de fusión, en la que el semidominio de escisión modificado comprende un polipéptido en el que el residuo de Glu (E) de tipo salvaje en la posición 490 se reemplaza con el residuo Lys (K) y el residuo Ile (I) de tipo salvaje en la posición 538 se reemplaza con un residuo Lys (K) ("KK") además de una o más mutaciones en las posiciones 416, 422, 448 o 525. En una forma de realización preferida es una proteína de fusión, en la que el semidominio de escisión modificado comprende un polipéptido en el que el residuo Gln de tipo salvaje (Q) en la posición 486 se reemplaza con un residuo Glu (E), y el residuo Ile (I) de tipo salvaje en la posición 499 se reemplaza con un residuo Leu (L) ("EL") (ver US 8.034.598) además de una o más mutaciones en las posiciones 416, 422, 448, o 525.

[0129] Los ejemplos no limitantes de mutaciones incluyen las mutaciones (p. ej., sustituciones) de los residuos de tipo salvaje de cualquier dominio de escisión (p. ej., FokI u homólogo de FokI) en las posiciones 393, 394, 398, 421, 442, 444, 473 o 530 con cualquier residuo de aminoácido (p. ej., K393X, K394X, R398X, D421X, K444X, G473X y A530X, donde el primer residuo representa el tipo salvaje y X se refiere a cualquier aminoácido que está sustituido por el residuo de tipo salvaje). En algunas formas de realización, X es E, D, H, A, K, S, T, D o N. Otras mutaciones ejemplares incluyen S418E, S418D, S446D, K448A, I479Q, I479T, Q481A, Q481N, Q481E, A530E y/o A530K en donde los residuos de aminoácidos están numerados con respecto al dominio de escisión FokI de tipo salvaje de longitud completa y sus homólogos (Figura 17). En determinadas formas de realización, las combinaciones pueden incluir 416 y 422, una mutación en la posición 416 y K448A, K448A e I479Q, K448A y Q481A y/o K448A y una mutación en la posición 525. En una forma de realización, el residuo salvaje en la posición 416 puede ser reemplazado con un residuo de Glu (E) (R416E), el residuo de tipo salvaje en la posición 422 se reemplaza con un residuo de His (H) (R422H), y el residuo de tipo salvaje en la posición 525 se reemplaza con un residuo Ala (A). Los dominios de escisión como se describen en el presente documento pueden incluir además mutaciones adicionales, que incluyen, entre otras, las posiciones 432, 441, 483, 486, 487, 490, 496, 499, 527, 537, 538 y/o 559, por ejemplo, mutantes del dominio de dimerización. (p. ej., ELD, KKR) yo mutantes de nickasa (mutaciones en el dominio catalítico). Los semidominios de escisión con las mutaciones descritas en el presente documento forman heterodímeros como se conoce en la técnica.

[0130] Alternativamente, las nucleasas se pueden ensamblar in vivo en el sitio diana de ácido nucleico utilizando la llamada tecnología "enzima escindida" (véase p. ej. Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20090068164). Los componentes de tales enzimas divididas pueden expresarse en construcciones de expresión separadas o pueden unirse en un marco de lectura abierto donde los componentes individuales están separados, por ejemplo, por un péptido 2A autoescindible o una secuencia IRES. Los componentes pueden ser dominios de unión de dedos de zinc individuales o dominios de un dominio de unión de ácido nucleico de meganucleasa.

[0131] Las nucleasas (p. ej., ZFNs y/o TALENs) pueden ser examinados para la actividad antes de su uso, por ejemplo en un sistema cromosómico a base de levadura como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 8.563.314.

[0132] En ciertas formas de realización, la nucleasa comprende un sistema de CRISPR/Cas. El locus CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas), que codifica los componentes de ARN del sistema, y el locus Cas (asociado a CRISPR), que codifica proteínas (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565­ 1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1:7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1:e60) forman las secuencias de genes del sistema de nucleasa CRISPR/Cas. Los loci CRISPR en huéspedes microbianos contienen una combinación de genes asociados a CRISPR (Cas), así como elementos de ARN no codificantes capaces de programar la especificidad de la escisión del ácido nucleico mediada por CRISPR.

[0133] El CRISPR de Tipo II es uno de los sistemas más bien caracterizados y lleva a cabo rotura de doble hebra de ADN dirigida en cuatro pasos secuenciales. Primero, dos ARN no codificantes, la matriz pre-crARN y tracrARN, se transcriben desde el locus CRISPR. En segundo lugar, tracrARN se hibrida con las regiones repetidas del pre-crARN y media el procesamiento de pre-crARN en crARN maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales. En tercer lugar, el complejo crARN: tracrARN maduro dirige Cas9 al ADN objetivo a través del emparejamiento de bases de Watson-Crick entre el espaciador en el crARN y el protoespaciador en el ADN objetivo junto al motivo adyacente del protoespaciador (PAM), un requisito adicional para el reconocimiento del objetivo. Finalmente, Cas9 media la escisión del ADN diana para crear una ruptura de doble hebra dentro del protoespaciador. La actividad del sistema CRISPR/Cas consta de tres pasos: (i) inserción de secuencias de ADN ajenas en la matriz CRISPR para prevenir ataques futuros, en un proceso llamado 'adaptación', (ii) expresión de las proteínas relevantes, así como expresión y procesamiento de la matriz, seguido de (iii) interferencia mediada por ARN con el ácido nucleico ajeno. Por tanto, en la célula bacteriana, varias de las denominadas proteínas 'Cas' están implicadas en la función natural del sistema CRISPR/Cas y cumplen funciones tales como la inserción del ADN ajeno, etc.

[0134] En algunas formas de realización, se utiliza el sistema CRISPR-Cpfl. El sistema CRISPR-Cpfl, identificado en Francisella spp, es un sistema CRISPR-Cas de clase 2 que media una fuerte interferencia de ADN en células humanas. Aunque funcionalmente conservados, Cpfl y Cas9 difieren en muchos aspectos, incluidos los ARN guía y la especificidad del sustrato (ver Fagerlund et al, (2015) Genom Bio 16: 251). Una diferencia importante entre las proteínas Cas9 y Cpfl es que Cpfl no utiliza tracrARN y, por lo tanto, solo requiere un crARN. Los ARNr de FnCpfl tienen una longitud de 42-44 nucleótidos (repetición de 19 nucleótidos y espaciador de 23-25 nucleótidos) y contienen un único tallo-bucle, que tolera cambios de secuencia que retienen la estructura secundaria. Además, los crARN de Cpfl son significativamente más cortos que los sgARN modificados de ~ 100 nucleótidos requeridos por Cas9, y los requisitos de PAM para FnCpfl son 5'-TTN-3' y 5-CTA-3' en la hebra desplazada. Aunque tanto Cas9 como Cpfl hacen roturas de doble hebra en el ADN diana, Cas9 usa sus dominios similares a RuvC y HNH para hacer cortes de extremos romos dentro de la secuencia semilla del ARN guía, mientras que Cpfl usa un dominio similar a RuvC para producir cortes fuera de la semilla. Debido a que Cpfl hace cortes escalonados lejos de la región de semilla crítica, NHEJ no interrumpirá el sitio objetivo, por lo tanto, asegurará que Cpfl pueda continuar cortando el mismo sitio hasta que haya tenido lugar el evento de recombinación HDR deseado. Por lo tanto, en los métodos y composiciones descritos en este documento, se entiende que el término "Cas" incluye proteínas Cas9 y Cfp1. Por lo tanto, como se usa en este documento, un "sistema CRISPR/Cas" se refiere a sistemas tanto CRISPR/Cas como CRISPR/Cfp1, incluyendo tanto nucleasa como sistemas de factor de transcripción.

[0135] En ciertas formas de realización, la proteína Cas puede ser un "derivado funcional" de una proteína Cas natural. Un "derivado funcional" de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. Los "derivados funcionales" incluyen, pero no se limitan a fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un correspondiente polipéptido de secuencia nativa. Una actividad biológica contemplada en el presente documento es la capacidad del derivado funcional de hidrolizar un sustrato de ADN en fragmentos variantes de secuencia ácida de polipéptido, modificaciones covalentes y fusiones de los mismos tales como proteínas Cas derivadas. Los derivados adecuados de un polipéptido Cas o un fragmento del mismo incluyen, pero no se limitan a mutantes, fusiones, modificaciones covalentes de la proteína Cas o un fragmento de la misma. La proteína Cas, que incluye la proteína Cas o un fragmento de la misma, así como los derivados de la proteína Cas o un fragmento de la misma, puede obtenerse de una célula o sintetizarse químicamente o mediante una combinación de estos dos procedimientos. La célula puede ser una célula que produce proteína Cas de forma natural, o una célula que produce proteína Cas de forma natural y está diseñada genéticamente para producir la proteína Cas endógena a un nivel de expresión más alto o para producir una proteína Cas a partir de un ácido nucleico introducido exógenamente, que el ácido codifica un Cas que es igual o diferente del Cas endógeno. En algunos casos, la célula no produce proteína Cas de forma natural y está diseñada genéticamente para producir una proteína Cas. En algunas formas de realización, la proteína Cas es un pequeño ortólogo Cas9 para su administración a través de un vector AAV (Ran et al (2015) Nature 510, p. 186).

[0136] La(s) nucleasa(s) puede(n) hacer uno o más cortes de doble cadena y/o de cadena única en el sitio objetivo. La nucleasa puede comprender un dominio de escisión catalíticamente inactivo (FokI). Ver, p. ej., patente de e E. UU. N° 9.200.266; 8.703.489 y Guillinger et al. (2014) Nature Biotech. 32 (6): 577-582. El dominio de escisión catalíticamente inactivo puede, en combinación con un dominio catalíticamente activo, actuar como una nickasa para hacer un corte monocatenario. Por lo tanto, se pueden usar dos nickasas en combinación para hacer un corte de doble hebra en una región específica. También se conocen en la técnica nickasas adicionales, por ejemplo, McCaffery et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44 (2): e11. doi: 10.1093/nar/gkv878. Publicación electrónica de 2015 19 de octubre.

Adm inistración

[0137] Las proteínas (p. ej., nucleasas), polinucleótidos y/o composiciones que comprenden las proteínas y/o polinucleótidos descritos en este documento pueden administrarse a una célula diana por cualquier medio adecuado, incluyendo, por ejemplo, mediante inyección de los componentes de proteína y/o ARNm.

[0138] Las células adecuadas incluyen, pero no se limitan a células eucariotas y procariotas y/o líneas celulares. Los ejemplos no limitantes de dichas células o líneas celulares generadas a partir de dichas células incluyen células T, COS, CHO (p. ej., CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (p. ej., HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) y células perC6, así como células de insectos como Spodoptera fugiperda (Sf), o células fúngicas como Saccharomyces, Pichia y Schizosaccharomyces. En determinadas formas de realización, la línea celular es una línea celular CHO-K1, MDCK o HEK293. Las células adecuadas también incluyen células madre tales como, a modo de ejemplo, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas (células iPS), células madre hematopoyéticas, células madre neuronales y células madre mesenquimales.

[0139] Los métodos de administración de proteínas que comprenden dominios de unión a ADN como se describen en el presente documento se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses N° 6.453.242; 6.503.717; 6.534.261; 6.599.692; 6.607.882; 6.689.558; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824.

[0140] Dominios de unión a ADN y proteínas de fusión que comprenden estos dominios de unión como se describe en el presente documento también se pueden administrar usando los vectores que contienen secuencias que codifican una o más de las proteínas de unión a ADN. Adicionalmente, los ácidos nucleicos adicionales (p. ej., los donantes) también se pueden administrar a través de estos vectores. Se puede utilizar cualquier sistema de vectores, incluidos, entre otros, vectores plasmídicos, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores adenovirales, vectores poxvirus; vectores de herpesvirus y vectores de virus adenoasociados, etc. Véanse también las Patentes de Estados Unidos N° 6.534.261; 6.607.882; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824. Además, resultará evidente que cualquiera de estos vectores puede comprender una o más secuencias que codifican proteínas de unión a ADN y/o ácidos nucleicos adicionales según sea apropiado. Por tanto, cuando se introducen en la célula una o más proteínas de unión a ADN, como se describe en el presente documento, y ADN adicionales según sea apropiado, pueden transportarse en el mismo vector o en diferentes vectores. Cuando se utilizan múltiples vectores, cada vector puede comprender una secuencia que codifica una o múltiples proteínas de unión al ADN y ácidos nucleicos adicionales, según se desee.

[0141] Métodos de transferencia génica basados en virus y no virales convencionales se pueden utilizar para introducir ácidos nucleicos que codifican proteínas de unión al ADN modificados en las células (p. ej., células de mamífero) y tejidos diana y co-introducen secuencias de nucleótidos adicionales según se desee. Tales métodos también se pueden utilizar para administrar ácidos nucleicos (p. ej., que codifican proteínas y/o donantes de unión al ADN) a células in vitro. En determinadas formas de realización, los ácidos nucleicos se administran para usos de terapia génica in vivo o ex vivo. Los sistemas de administración de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ácido nucleico desnudo y ácido nucleico complejado con un vehículo de administración tal como un liposoma o poloxámero. Los sistemas de administración de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después de la administración a la célula. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, véase Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Nabel y Felgner, TIBTECH 11: 211 -217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11: 167 - 175 (1993); Miller, Nature 357: 455 - 460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35 - 36 (1995); Kremer y Perricaudet, British Medical Bulletin 51 (1): 31-44 (1995); Haddada et al., En Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler y Bohm (eds.) (1995); y Yu y col., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

[0142] Los métodos de suministro no virales de ácidos nucleicos incluyen electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o conjugados de lípido: ácido nucleico, ADN desnudo, ARNm, viriones artificiales y absorción de ADN potenciada por agentes. Uso de sonoporación, p. ej., el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) también se puede utilizar para el suministro de ácidos nucleicos. En una forma de realización preferida, uno o más ácidos nucleicos se administran como ARNm. También se prefiere el uso de ARNm protegidos para aumentar la eficacia de traducción y/o la estabilidad del ARNm. Se prefieren especialmente las tapas ARCA (análogo de tapa anti-reverso) o variantes de las mismas. Véanse las patentes estadounidenses números 7.074.596 y 8.153.773.

[0143] Los sistemas de administración adicionales a modo de ejemplo de ácido nucleico incluyen los proporcionados por Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), MaxCyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) y Copernicus Therapeutics Inc, (véase por ejemplo US6008336). La lipofección se describe en p. ej., US 5.049.386, Us 4.946.787; y US 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™, Lipofectin™ y Lipofectamine™ RNAiMAX). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección de polinucleótidos de reconocimiento de receptor eficaz incluyen los de Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024. La administración puede ser a células (administración ex vivo) o tejidos diana (administración in vivo).

[0144] La preparación de complejos de lípido: ácido nucleico, incluidos liposomas dirigidos tales como complejos de inmunolípidos, es bien conocida para un experto en la técnica (véase, p. ej., Crystal, Science 270:. 404-410 (1995); Blaese y col., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1995); Behr y col., Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1994); Remy y col., Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1994).); Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res.52: 4817-4820 (1992); Patentes de Estados Unidos Nos 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028 y 4.946.787).

[0145] Los métodos adicionales de administración incluyen el uso de envasado de los ácidos nucleicos a ser entregado en vehículos de reparto EnGeneIC (VED). Estas VED se administran específicamente a tejidos diana utilizando anticuerpos biespecíficos donde un brazo del anticuerpo tiene especificidad por el tejido diana y el otro tiene especificidad por la VED. El anticuerpo lleva las EDV a la superficie de la célula diana y luego la EDV se introduce en la célula por endocitosis. Una vez en la célula, el contenido se libera (ver MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7) p. 643).

[0146] El uso de sistemas basados en virus de ARN o ADN para la administración de ácidos nucleicos que codifican proteínas modificadas de unión al ADN, y/o donantes (p. ej. CARs o ACTRs) según se desee, se aprovecha de procesos altamente evolucionados para dirigir un virus a células específicas en el cuerpo y el tráfico de la carga viral al núcleo. Los vectores víricos pueden administrarse directamente a los pacientes (in vivo) o pueden usarse para tratar células in vitro y las células modificadas se administran a los pacientes (ex vivo). Los sistemas basados en virus convencionales para el suministro de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a vectores de virus retrovirales, lentivirus, adenovirales, adenoasociados, vaccinia y herpes simplex para la transferencia de genes. La integración en el genoma del huésped es posible con los métodos de transferencia de genes de retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados, lo que a menudo da como resultado la expresión a largo plazo del transgén insertado. Además, se han observado altas eficiencias de transducción en muchos tipos de células y tejidos diana diferentes.

[0147] El tropismo de un retrovirus puede alterarse por incorporación de proteínas de la envoltura exterior, la ampliación de la potencial población diana de células diana. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que pueden transducir o infectar células que no se dividen y típicamente producen títulos virales altos. La selección de un sistema de transferencia de genes retrovirales depende del tejido diana. Los vectores retrovirales se componen de repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento de hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR mínimas que actúan en cis son suficientes para la replicación y el empaquetamiento de los vectores, que luego se utilizan para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar una expresión transgénica permanente. Vectores retrovirales ampliamente usados incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), virus de leucemia mono gibón (GaLV), virus de simio de inmunodeficiencia (SIV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y combinaciones de los mismos (véase, p. ej., Buchscher et al., J. Virol. 66: 2731-2739 (1992); Johann y col., J. Virol. 66: 1635-1640 (1992); Sommerfelt y col., Virol. 176: 58-59 (1990); Wilson y col., J. Virol. 63: 2374-2378 (1989); Miller y col., J. Virol. 65: 2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).

[0148] En aplicaciones en las que se prefiere la expresión transitoria, los sistemas basados adenovirales pueden ser utilizados. Los vectores basados en adenovirus son capaces de una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con dichos vectores se han obtenido títulos elevados y niveles elevados de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Los vectores de virus adenoasociado ("a Av ") también se utilizan para transducir células con ácidos nucleicos diana, p. ej., en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (véase, p. ej., West et al., Virology 160: 38-47 (1987); Patente de EE. UU. 4.797.368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1351 (1994). La construcción de vectores AAV recombinantes se describe en varias publicaciones, incluyendo la Patente de Estados Unidos N° 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081 (1984); Hermonat y Muzyczka, PNAS EE. UU. 81: 6466-6470 (1984); y Samulski et al, J. Virol 63:. 03822-3.828 (1989).

[0149] Al menos seis enfoques de vectores víricos están disponibles actualmente para transferencia génica en ensayos clínicos, que utilizan enfoques que implican la complementación de vectores defectuosos con genes insertados en líneas de células auxiliares para generar el agente transductor.

[0150] pLASN y MFG-S son ejemplos de vectores retrovirales que se han utilizado en ensayos clínicos (Dunbar et al., Blood 85: 3048 - 305 (1995); Kohn y col., Nat. Med. 1:1017 - 102 (1995); Malech y col., PNAS EE. UU. 94:22 12133­ 12138 (1997)). PA317/pLASN fue el primer vector terapéutico utilizado en un ensayo de terapia génica. (Blaese y col., Science 270: 475-480 (1995)). Se han observado eficiencias de transducción del 50% o más para los vectores empaquetados MFG-S. (Ellem et al, Immunol Immunother 44 (1): 10-20 (1997); Dranoff y col, Hum Gene Ther 1:111-2 (1997).

[0151] Los vectores de virus adeno-asociados recombinantes (rAAV) son un prometedor sistema alternativo de administración de genes basado en el virus adenoasociado de parvovirus defectuoso y no patógeno tipo 2. Todos los vectores se derivan de un plásmido que retiene solo las repeticiones terminales invertidas de 145 pb del AAV que flanquean el casete de expresión del transgén. Transferencia génica eficiente y el suministro de transgén estable debido a la integración en los genomas de la célula transducida son características clave para este sistema de vector (Wagner et al., Lancet 351: 9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9: 748- 55 (1996)). También se pueden utilizar otros serotipos de AAV, incluidos AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV8.2, AAV9 y AAVrh10 y AAV seudotipados como AAV2/8, AAV2/5 y AAV2/6 de acuerdo con la presente invención.

[0152] Los vectores adenovirales recombinantes deficientes en replicación (Ad) pueden ser producidos a alto título e infectan fácilmente el número de diferentes tipos de células. La mayoría de los vectores de adenovirus se diseñan de manera que un transgén sustituya a los genes Ad E1a, E1b y/o E3; posteriormente, el vector de replicación defectuosa se propaga en células 293 humanas que suministran la función génica delecionada en trans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidos in vivo, incluidas células diferenciadas que no se dividen, como las que se encuentran en el hígado, los riñones y los músculos. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad de carga. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico implicó la terapia con polinucleótidos para la inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Sterman y col., Hum. Gene Ther. 7: 1083-9 (1998)). Ejemplos adicionales del uso de vectores de adenovirus para la transferencia de genes en ensayos clínicos incluyen Rosenecker et al., Infection 24: 15-10 (1996); Sterman y col., Hum. Gene Ther. 9: 71083 - 1089 (1998); Welsh y col., Hum. Gene Ther. 2: 205 - 18 (1995); Álvarez y col., Hum. Gene Ther. 5: 597 - 613 (1997); Topf y col., Gene Ther. 5: 507-513 (1998); Sterman y col., Hum. Gene Ther. 7: 1083 - 1089 (1998).

[0153] Células de empaquetamiento se utilizan para formar partículas de virus que son capaces de infectar una célula huésped. Dichas células incluyen células 293, que empaquetan adenovirus, y células ^2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores virales utilizados en la terapia génica generalmente se generan mediante una línea de células productoras que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula viral. Los vectores contienen típicamente las secuencias virales mínimas necesarias para el empaquetamiento y la integración posterior en un huésped (si corresponde), siendo reemplazadas otras secuencias virales por un casete de expresión que codifica la proteína que se va a expresar. Las funciones virales faltantes son suministradas en trans por la línea celular empaquetadora. Por ejemplo, los vectores de AAV utilizados en terapia génica normalmente solo poseen secuencias de repetición terminal invertida (ITR) del genoma de AAV que son necesarias para el empaquetamiento y la integración en el genoma del huésped. El ADN viral está empaquetado en una línea celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes de AAV, a saber, rep y cap, pero que carece de secuencias ITR. La línea celular también está infectada con adenovirus como auxiliar. El virus auxiliar promueve la replicación del vector de AAV y la expresión de genes de AAV a partir del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no está empaquetado en cantidades significativas debido a la falta de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus puede reducirse mediante, por ejemplo, tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que el AAV.

[0154] En muchas aplicaciones de terapia génica, es deseable que el vector de terapia génica puede administrarse con un alto grado de especificidad para un tipo de tejido particular. Por consiguiente, un vector viral puede modificarse para que tenga especificidad para un tipo de célula dado expresando un ligando como una proteína de fusión con una proteína de la cubierta viral en la superficie exterior del virus. El ligando se elige para que tenga afinidad por un receptor que se sabe que está presente en el tipo de célula de interés. Por ejemplo, Han et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.

92: 9747-9751 (1995)), informaron que el virus de la leucemia murina de Moloney se puede modificar para expresar herregulina humana fusionada con gp70, y el virus recombinante infecta ciertas células de cáncer de mama humano que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. Este principio puede extenderse a otros pares de virus-célula diana, en los que la célula diana expresa un receptor y el virus expresa una proteína de fusión que comprende un ligando para el receptor de la superficie celular. Por ejemplo, los fagos filamentosos se pueden diseñar para que presenten fragmentos de anticuerpos (p. ej., FAB o Fv) que tienen afinidad de unión específica por prácticamente cualquier receptor celular elegido. Aunque la descripción anterior se aplica principalmente a los vectores virales, se pueden aplicar los mismos principios a los vectores no virales. Dichos vectores se pueden diseñar para que contengan secuencias de captación específicas que favorezcan la captación por células diana específicas.

[0155] Métodos de administración de los sistemas de CRISPR/Cas pueden comprender aquellos procedimientos descritos anteriormente. Por ejemplo, en modelos animales, Cas transcrito in vitro que codifica ARNm o proteína Cas recombinante puede inyectarse directamente en embriones en etapa de una célula usando agujas de vidrio para animales editados con genoma. Para expresar Cas y guiar ARN en células in vitro, normalmente los plásmidos que los codifican se transfectan en células mediante lipofección o electroporación. Además, la proteína Cas recombinante se puede complejar con ARN guía transcrito in vitro donde la ribonucleoproteína del ARN guía Cas es captada por las células de interés (Kim et al (2014) Genome Res 24 (6): 1012). Con fines terapéuticos, los ARN Cas y guía pueden administrarse mediante una combinación de técnicas virales y no virales. Por ejemplo, el ARNm que codifica Cas puede administrarse mediante administración de nanopartículas, mientras que los ARN guía y cualquier transgén o molde de reparación deseado se administran a través de AAV (Yin et al (2016) Nat Biotechnol 34 (3) p. 328).

[0156] Los vectores de terapia génica se pueden administrar in vivo mediante administración a un paciente individual, típicamente mediante administración sistémica (p. ej., infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica o intracraneal) o aplicación tópica, como se describe a continuación. Alternativamente, los vectores pueden administrarse a células ex vivo, como células explantadas de un paciente individual (p. ej., linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido) o células madre hematopoyéticas de un donante universal, seguido de la reimplantación de las células en un paciente. generalmente después de la selección de las células que han incorporado el vector.

[0157] La transfección celular ex vivo para diagnóstico, investigación, trasplante o para terapia génica (p. ej., mediante reinfusión de las células transfectadas en el organismo huésped) es bien conocida por los expertos en la técnica. En una forma de realización preferida, las células se aíslan del organismo sujeto, se transfectan con un ácido nucleico de proteínas de unión a ADN (gen o ADNc) y se vuelven a infundir en el organismo sujeto (p. ej., paciente). Los expertos en la técnica conocen bien varios tipos de células adecuados para la transfección ex vivo (véase, por ejemplo, Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3a edición, 1994)) y las referencias allí citadas. para una discusión sobre cómo aislar y cultivar células de pacientes).

[0158] En una forma de realización, las células madre se utilizan en procedimientos ex vivo para la transfección celular y terapia génica. La ventaja de usar células madre es que pueden diferenciarse en otros tipos de células in vitro o pueden introducirse en un mamífero (como el donante de las células) donde se injertarán en la médula ósea. Se conocen métodos para diferenciar las células CD34 in vitro en tipos de células inmunes clínicamente importantes utilizando citocinas tales como GM-CSF, IFN-y y TNF-a (véase Inaba et al., J. Exp. Med. 176: 1693-1702 (l992)).

[0159] Las células madre se aíslan para transducción y diferenciación utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, las células madre se aíslan de las células de la médula ósea mediante el cribado de las células de la médula ósea con anticuerpos que se unen a células no deseadas, como CD4 y CD8 (células T), CD45 (células panB), GR-1 (granulocitos) y lad (células presentadoras de antígeno diferenciadas) (véase Inaba y col., J. Exp. Med. 176: 1693­ 1702 (1992)).

[0160] Las células madre que han sido modificadas también pueden utilizarse en algunas formas de realización. Por ejemplo, las células madre neuronales que se han hecho resistentes a la apoptosis pueden usarse como composiciones terapéuticas en las que las células madre también contienen los TF de ZFP de la invención. La resistencia a la apoptosis puede producirse, por ejemplo, al eliminar BAX y/o BAK utilizando ZFN específicos de BAX o BAK (ver, patente de EE. UU. N° 8.597.912) en las células madre, o aquellas que se rompen en una caspasa, nuevamente utilizando ZFN específicos de caspasa-6, por ejemplo.

[0161] Los vectores (p. ej., retrovirus, adenovirus, liposomas, etc.) que contienen proteínas terapéuticas de unión al ADN (o ácidos nucleicos que codifican estas proteínas) también se pueden administrar directamente a un organismo para la transducción de células in vivo. Alternativamente, se puede administrar ADN desnudo. La administración se realiza mediante cualquiera de las vías normalmente utilizadas para introducir una molécula en contacto final con células sanguíneas o tisulares, incluidas, entre otras, inyección, infusión, aplicación tópica y electroporación. Los métodos adecuados para administrar dichos ácidos nucleicos están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la técnica y, aunque se puede usar más de una ruta para administrar una composición particular, una ruta particular a menudo puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta.

[0162] Los métodos para la introducción de ADN en células madre hematopoyéticas se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N° 5.928.638. Los vectores útiles para la introducción de transgenes en células madre hematopoyéticas, por ejemplo, células CD34+, incluyen adenovirus de tipo 35.

[0163] Los vectores adecuados para la introducción de transgenes en células inmunes (p. ej., células T) incluyen vectores de lentivirus no integradores. Véase, por ejemplo, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 93: 11382­ 11388; Dull y col. (1998) J. Virol. 72: 8463-8471; Zuffery y col. (1998) J. Virol. 72: 9873-9880; Follenzi y col. (2000) Nature Genetics 25: 217-222.

[0164] Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular usado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas disponibles, como se describe a continuación (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., 1989).

[0165] Como se señaló anteriormente, los métodos y composiciones descritos se pueden usar en cualquier tipo de célula, incluidas, entre otras, células procariotas, células fúngicas, células Archaeal, células vegetales, células de insectos, células animales, células de vertebrados, células de mamíferos y células humanas, incluidas las células T y las células madre de cualquier tipo. Las líneas celulares adecuadas para la expresión de proteínas son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, entre otras, COS, CHO (p. ej., CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHODUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (p. ej., HEK293-F, HEK293H, HEK293-T), perC6, células de insectos como Spodoptera fugiperda (Sf) y células fúngicas como Saccharomyces, Pichia y Schizosaccharomyces. También se pueden usar la progenie, variantes y derivados de estas líneas celulares.

Aplicaciones

[0166] Se espera que el uso de nucleasas modificadas en el tratamiento y la prevención de enfermedades sea uno de los desarrollos más importantes en medicina en los próximos años. Los métodos y composiciones descritos en este documento sirven para aumentar la especificidad de estas nuevas herramientas para asegurar que los sitios diana deseados sean el lugar principal de escisión. Será necesario minimizar o eliminar la escisión fuera del objetivo para aprovechar todo el potencial de esta tecnología, para todas las aplicaciones in vitro, in vivo y ex vivo.

[0167] Enfermedades genéticas de ejemplo incluyen, pero no se limitan a acondroplasia, acromatopsia, deficiencia de maltasa ácida, deficiencia de adenosina desaminasa (OMIM N° 102700), la adrenoleucodistrofia, síndrome de aicardi, alfa-1 antitripsina, alfa-talasemia, síndrome de insensibilidad a andrógenos, síndrome de apertura, ventricular derecho arritmogénico, displasia, ataxia telangictasia, síndrome de barth, beta-talasemia, síndrome del nevo de la ampolla de caucho azul, enfermedad de Canavan, enfermedades granulomatosas crónicas (CGD), síndrome cri du chat, fibrosis quística, enfermedad de dercum, displasia ectodérmica, anemia de Fanconi, síndrome progresivo de fibrodisplasia osificante, síndrome X frágil, galactosemis, enfermedad de Gaucher, gangliosidosis generalizadas (por ejemplo., GM1), la hemocromatosis, la mutación de la hemoglobina C en el 6° codón de beta-globina (HBC), la hemofilia, la enfermedad de Huntington, síndrome de Hurler, hipofosfatasia, síndrome de Klinefleter, enfermedad de Krabbes, síndrome de Langer-Giedion, deficiencia de adhesión leucocitaria (LAD, OMIM N° 116920), leucodistrofia, síndrome de QT largo, síndrome de Marfan, síndrome de Moebius, mucopolisacaridosis (MPS), síndrome de rótula ungueal, diabetes insípida nefrogénica, neurofibromatosis, enfermedad de Neimann-Pick, osteogénesis imperfecta, fenilcetonuria (PKU). porfiria, síndrome de Prader-Willi, progeria, síndrome de Proteus, retinoblastoma, síndrome de Rett, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Sanfilippo, inmunodeficiencia combinada grave (SCID), síndrome de Shwachman, enfermedad de células falciformes (anemia de células falciformes), síndrome de Smith-Magenis, síndrome de Stickler, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de trombocitopenia ausente del radio (TAR), síndrome de Treacher Collins, trisomía, esclerosis tuberosa, síndrome de Turner, trastorno del ciclo de la urea, enfermedad de von Hippel-Landau, síndrome de Waardenburg, síndrome de Williams, enfermedad de Wilson, síndrome de Wiskott-Aldrich, Síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X (XLP, OMIM N° 308240).

[0168] Enfermedades ejemplares adicionales que pueden tratarse mediante escisión de ADN dirigida y/o recombinación homóloga incluyen inmunodeficiencias adquiridas, enfermedades de almacenamiento lisosómico (p. ej., enfermedad de Gaucher, GM1, enfermedad de Fabry y enfermedad de Tay-Sachs), mucopolisaccahidosis (p. ej., enfermedad de Hunter, enfermedad de Hurler), hemoglobinopatías (p. ej., drepanocitosis, HbC, a-talasemia, ptalasemia) y hemofilias.

[0169] Dichos métodos también permiten el tratamiento de infecciones (virales o bacterianas) en un huésped (p. ej., mediante el bloqueo de la expresión de los receptores virales o bacterianos, evitando de este modo la infección y/o la propagación en un organismo huésped) para tratar enfermedades genéticas.

[0170] La escisión selectiva de genomas virales infectados o integrados se pueden utilizar para tratar infecciones virales en un huésped. Además, la escisión dirigida de genes que codifican receptores de virus puede usarse para bloquear la expresión de tales receptores, evitando así la infección viral y/o la propagación viral en un organismo huésped. La mutagénesis dirigida de genes que codifican receptores virales (p. ej., los receptores CCR5 y CXCR4 para VIH) puede usarse para hacer que los receptores sean incapaces de unirse al virus, previniendo así una nueva infección y bloqueando la propagación de infecciones existentes. Véase la publicación de patente de EE. UU. N° 2008/015996. Los ejemplos no limitantes de virus o receptores virales que pueden ser dirigidos incluyen el virus del herpes simple (HSV), como el HSV-1 y HSV-2, el virus de la varicela zoster (VZV), el virus de Epstein-Barr (EBV) y el citomegalovirus (CMV), HHV6 y HHV7. La familia de virus de la hepatitis incluye el virus de la hepatitis A (HAV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV), el virus de la hepatitis delta (HDV), el virus de la hepatitis E (HEV) y el virus de la hepatitis G (HGV). Se pueden dirigir otros virus o sus receptores, incluidos, entre otros, Picornaviridae (p. ej., poliovirus, etc.); Caliciviridae; Togaviridae (p. ej., virus de la rubéola, virus del dengue, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabodoviridae (p. ej., virus de la rabia, etc.); Filoviridae; Paramyxoviridae (p. ej., virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio, etc.); Orthomyxoviridae (p. ej., virus de la influenza tipos A, B y C, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviradae; lentivirus (p. ej., HTLVI; HTLV-II; VIH-1 (también conocido como HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc.) VIH-II); virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS), virus del papiloma humano (VPH), virus de la influenza y virus de la encefalitis transmitida por garrapatas. Ver, por ejemplo, Virology, 3a edición (WK Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2a Edición (BN Fields y DM Knipe, eds. 1991), para una descripción de estos y otros virus. Los receptores del VIH, por ejemplo, incluyen c CR-5 y CXCR-4.

[0171] Por lo tanto, las variantes de dominio de escisión heterodiméricas como se describe en este documento proporcionan una amplia utilidad para mejorar la especificidad de ZFN en aplicaciones de modificación génica. Estos dominios de escisión variantes pueden incorporarse fácilmente en cualquier ZFN existente mediante mutagénesis dirigida al sitio o subclonación para mejorar la especificidad in vivo de cualquier dímero de ZFN.

[0172] Como se señaló anteriormente, las composiciones y métodos descritos aquí se pueden utilizar para la modificación genética, la corrección de genes, y la interrupción génica. Los ejemplos no limitantes de modificación génica incluyen integración dirigida basada en reparación dirigida por homología (HDR); corrección genética basada en HDR; modificación de genes basada en HDR; alteración genética basada en HDR; disrupción genética basada en NHEJ y/o combinaciones de HDR, NHEJ y/o recocido de una sola hebra (SSA). SingleStrand Annealing (SSA) se refiere a la reparación de una ruptura de doble cadena entre dos secuencias repetidas que ocurren en la misma orientación mediante la resección del DSB por exonucleasas 5'-3' para exponer las 2 regiones complementarias. Las hebras simples que codifican las 2 repeticiones directas luego se hibridan entre sí, y el intermedio hibridado se puede procesar de modo que las colas monocatenarias (la parte del ADN monocatenario que no está hibridada con ninguna secuencia) se digieran, los huecos rellenados por la ADN polimerasa y los extremos del ADN se volvieron a unir. Esto da como resultado la eliminación de secuencias ubicadas entre las repeticiones directas.

[0173] Las composiciones que comprenden dominios de escisión (p. ej., ZFN, TALEN, sistemas CRISPR/Cas) y los métodos descritos en el presente documento también pueden usarse en el tratamiento de diversas enfermedades genéticas y/o enfermedades infecciosas.

[0174] Las composiciones y métodos también se pueden aplicar para detener las terapias basadas en células, incluyendo pero no limitándose a: la corrección de mutaciones de células somáticas por conversión génica de parche corto o integración dirigida para la terapia génica monogénica; interrupción de alelos negativos dominantes; alteración de los genes necesarios para la entrada o la infección productiva de patógenos en las células; modificación de tejidos mejorados, por ejemplo, modificando la actividad genética para promover la diferenciación o formación de tejidos funcionales; y/o alteración de la actividad genética para promover la diferenciación o formación de tejidos funcionales; bloquear o inducir la diferenciación, por ejemplo, al interrumpir genes que bloquean la diferenciación para promover que las células madre se diferencien por una vía de linaje específico, inserción dirigida de un gen o casete de expresión de ARNip que puede estimular la diferenciación de células madre, inserción dirigida de un gen o expresión de casete ARNip que puede bloquear la diferenciación de células madre y permitir una mejor expansión y mantenimiento de la pluripotencia, y/o la inserción dirigida de un gen indicador en el marco con un gen endógeno que es un marcador de pluripotencia o estado de diferenciación que permitiría un marcador fácil para puntuar el estado de diferenciación de células madre y cómo los cambios en los medios, citocinas, condiciones de crecimiento, expresión de genes, expresión de moléculas de ARNip, shARN o miARN, exposición a anticuerpos a marcadores de superficie celular o fármacos alteran este estado; transferencia nuclear de células somáticas, por ejemplo, se pueden aislar las propias células somáticas de un paciente, modificar el gen objetivo deseado de la manera adecuada, generar clones celulares (y controlar la calidad para garantizar la seguridad del genoma) y aislar y transferir los núcleos de estas células a óvulos no fertilizados para generar células hES específicas del paciente que podrían inyectarse o diferenciarse directamente antes de injertarse en el paciente, reduciendo o eliminando así el rechazo de tejido; células madre universales mediante la desactivación de los receptores MHC (p. ej., para generar células de identidad inmunológica disminuida o totalmente anulada). Los tipos de células para este procedimiento incluyen, entre otros, células T, células B, células madre hematopoyéticas y células madre embrionarias. Además, pueden usarse células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que también se generarían a partir de las propias células somáticas del paciente. Por tanto, estas células madre o sus derivados (tipos de células o tejidos diferenciados) podrían injertarse potencialmente en cualquier persona independientemente de su origen o histocompatibilidad.

[0175] Las composiciones y métodos también se pueden utilizar para la terapia de células somáticas, permitiendo de este modo la producción de las poblaciones de células que han sido modificadas para mejorar sus propiedades biológicas. Estas células se pueden infundir en una variedad de pacientes, independientemente de la fuente donante de las células y su histocompatibilidad con el receptor.

[0176] Además de las aplicaciones terapéuticas, el aumento de la especificidad proporcionada por las variantes descritas en el presente documento cuando se usa en las nucleasas modificado se puede utilizar para la modificación de cultivos, modificación de la línea celular y la construcción de modelos de enfermedad. Los semidominios de escisión de heterodímeros obligados proporcionan un medio sencillo para mejorar las propiedades de las nucleasas.

[0177] Los semidominios de escisión modificados genéticamente descritos también pueden usarse en protocolos de modificación génica que requieren escisión simultánea en múltiples dianas para eliminar la región interviniente o para alterar dos loci específicos a la vez. La escisión en dos objetivos requeriría la expresión celular de cuatro z Fn o TALEN, lo que podría producir diez combinaciones activas diferentes de ZFN o TALEN. Para tales aplicaciones, la sustitución de estas nuevas variantes por el dominio de nucleasa de tipo salvaje eliminaría la actividad de las combinaciones no deseadas y reduciría las posibilidades de escisión fuera del objetivo. Si la escisión en una determinada diana de ADN deseada requiere la actividad del par de nucleasas A B, y la escisión simultánea en una segunda diana de ADN deseada requiere la actividad del par de nucleasas X Y, entonces el uso de las mutaciones descritas en este documento puede prevenir los emparejamientos de A con A, A con X, A con Y y así sucesivamente. Por tanto, estas mutaciones de FokI disminuyen la actividad de escisión inespecífica como resultado de la formación de pares "ilegítimos" y permiten la generación de pares de nucleasas mutantes ortogonales más eficientes (véanse las publicaciones de patente de EE. UU.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Preparación de ZFN

[0178] Se diseñaron ZFN dirigidas a sitios en los genes BCL11A y TCRA (que se dirigen a la región constante, también conocida como TRAC) y se incorporaron en vectores de plásmidos esencialmente como se describe en Urnov et al. (2005) Nature 435 (7042): 646-651, Perez et al (2008) Nature Biotechnology 26 (7): 808-816, y Publicación de Patente PCT N° WO 2016183298 y Publicación p Ct N° WO2017106528. También se utilizaron ZFNs dirigidos a AAVS1 como se describe en el documento de publicación de EE. UU. N° 20150110762.

Ejemplo 2: Mutantes en residuos Fokl dirigidos a la interacción con fosfatos

[0179] El uso de modelos del dominio de escisión Fokl (Miller et al (2007) Nat Biotech 25 (7): 778-85), se identificaron residuos de aminoácidos de lisina o arginina cargados positivamente (Figura 1) que interactúan potencialmente con los fosfatos en la cadena principal del ADN.

[0180] Las posiciones identificadas en el dominio Folkl (aminoácidos 416, 422, 447, 448 y 525) fueron entonces cambiados específicamente (mutados) a residuos de serina para eliminar la interacción entre el aminoácido positivo original y los fosfatos cargados negativamente en el ADN (ver Figuras 2A y 2B). Cuando ambos socios de ZFN comprenden estas mutaciones, pueden resultar varias combinaciones diferentes (ver ilustración en la Figura 2C). Estos nuevos mutantes Fokl se fabricaron en el socio Fokl 'KKR' de los heterodímeros ELD/KKR (consulte la patente de EE. UU. N° 8,962,281), y luego se unieron a un par ZFN específico para la región potenciadora de BCL11A, SBS # 51857 ELD/SBS # 51949 KKR o SBS # 51857_KKR/SBS # 51949_ELD, las proteínas 'parentales' resaltadas en gris en la Figura 3. Las mutaciones se realizaron en cada socio y luego se analizaron para determinar la actividad de escisión contra la diana BCL11A original en células T CD34 en varias combinaciones como se muestra en la Figura 3. Los sitios fuera del objetivo se habían identificado previamente mediante análisis de captura no sesgado (publicación de patente PCT N° WO 2016/183298). Los sitios fuera del objetivo se enumeran a continuación en la Tabla 1, donde cada sitio se identifica con un identificador de letra de 'placa' único y generado aleatoriamente, donde la placa PRJIYLFN indicaba la secuencia de BCL11A objetivo deseada. En la siguiente tabla, también se indica el locus de cada sitio (las coordenadas se enumeran de acuerdo con el ensamblaje hg38 de la base de datos de secuencias del Navegador del Genoma Humano de UC Santa Cruz, (Kent et al (2002), Genome Res.12 (6): 996­ 1006).

[0181] Los datos presentados en la Figura 3 demostraron que ciertas mutaciones disminuyeron la actividad de las proteínas frente al sitio diana BCL11A afín, con una caída proporcional en la actividad de escisión fuera del objetivo

(p. ej., ver 51857-ELD/51949-KKR_R447S: la actividad dentro del objetivo se redujo a 11.60% de indeles, en comparación con el 80,59% del padre; la actividad fuera del objetivo de NIFMAEVG también cayó al 0,05% en comparación con el valor del 9,04% para el padre y la actividad en el PEVYOHIU fuera del objetivo cayó al 0.03% desde el valor del 0,65% para el padre (Figura 3A)). Sin embargo, para otras mutaciones, la actividad de escisión en el objetivo permaneció robusta mientras que la actividad en ambos sitios fuera del objetivo medidos disminuyó sustancialmente. Por ejemplo, el par 51857-ELD/51949-KKR_R416S tuvo una actividad en el objetivo para BCL11A que es muy similar a las proteínas originales (80,63% de indeles para el par mutante versus 80,59% para el padre a la dosis de 2 |jg (20 jg/mL)), mientras que la actividad en los dos fuera de objetivos disminuyó sustancialmente (0,75% para el par mutante versus 9,04% para los padres en el sitio fuera de destino NIFMAEVG y 0,08% para el par mutante versus 0,65% para los padres en -sitio de destino PEVYOHIU) (Figura 3A).

[0182] Las proteínas mutantes también fueron ensambladas utilizando el dominio heterodímero Folkl en la orientación opuesta, es decir, mientras que la Figura 3A mostró los resultados con 51857-ELD/51949-KKR, la Figura 3B representa los resultados con 51857-KKR/51949-ELD. Nuevamente, hubo algunos pares que mantuvieron una actividad robusta en el objetivo (p. ej., 51857-KKR/51949-ELD_K448S) similar al par principal (83,02% versus 88,28%, respectivamente), pero mostraron una menor actividad en las ubicaciones fuera del objetivo (1,00 % frente a 9,26% para NIFMAEVG; 0,33% frente a 0,87% para PEVYOHIU (Figura 3B).

[0183] Los experimentos también se realizaron utilizando un par de TCRA (TRAC) ZFNs específicos de: SBS # 52742_ELD/SBS # 52774_KKR (publicación de patente de EE. UU. N° US-2017-0211075-A1). Estos experimentos se llevaron a cabo en células K562 donde las células se trataron con 100 o 400 ng de ARNm que codifica cada ZFN. Los pares de ZFN consistieron en una pareja mutada como se describe a continuación en la Tabla 2 y un compañero no mutado. En estos experimentos, todos los aminoácidos cargados positivamente identificados en la Figura 1 se mutaron a Serina (S). En resumen, se usaron 2x10e5 células por transfección donde los ARNm se entregaron a la célula mediante el uso de Sistema lanzadera Amaxa de 96 pocillos. Las células transfectadas se recolectaron el día 3 después de la transfección y procesadas para el análisis de MiSeq (Illumina) según los métodos estándar. Los datos se muestran a continuación en la Tabla 2, y demostraron que algunas de las mutaciones mantuvieron una fuerte actividad en el objetivo, mientras que otras (p. ej., 52742 ELD_K469S, identificado como un residuo de sitio activo en la Figura 1) eliminaron la actividad de escisión.

Tabla 2: Resultados en el objetivo para TCRA (TRAC) ZFN con mutaciones FokI

[0184] También se realizaron análisis fuera del objetivo para determinar los sitios de escisión superiores fuera del objetivo según lo determinado por análisis de captura no sesgado (publicación de patente PCT N° WO 2016/183298). Cuatro loci genómicos (la diana prevista en TCRA (TRAC) y tres fuera de objetivo) identificados para este par de ZFN por el ensayo de captura insesgado se presentan a continuación en la Tabla 3.

T l i i i i n r ZF ífi T RA TRA

[0185] Se analizó la actividad de nucleasa en dos sitios fuera de objetivo (denominados OT11 o XVFENVRX y OT16 o XSKWTVWD, que se muestran arriba en la Tabla 3) a la dosis de ARNm de 400 ng de cada ZFN, donde un compañero en el par ZFN tenía la mutación indicada y el otro retuvo el dominio ELD o KKR FokI sin modificar. Los datos mostrados (Tabla 4) indican el porcentaje de indeles (actividad) observado usando 400 ng de cada socio de ZFN. Estos datos también mostraron que algunas de las mutaciones mantuvieron una actividad en el objetivo casi equivalente, pero mostraron una disminución en las actividades fuera del objetivo. Por ejemplo, para SBS # 52774_KKR_K387S mostró una actividad en el objetivo de 89,06% de indeles a 400 ng (en comparación con 89,08 para el padre 52774_KKR) y una actividad combinada fuera del objetivo en OT11 y OT16 de 6,39% de indeles (en comparación con 15,07% para el padre 52774_KKR). Los resultados incluyeron mutaciones de FokI probadas en el ZFN específico de BCL11A donde la alteración de las cargas positivas en las posiciones 416, 422, 447, 448 y 525 redujo la actividad fuera del objetivo.

Tabla 4: Escisión fuera del objetivo de mutantes TRAC ZFN FokI

(Continuación)

[0186] Los datos se comparan entonces con la distancia estimada entre el residuo de aminoácido mutado y la molécula de ADN para examinar el efecto tanto en y fuera del objetivo de escisión (Figura 4). La actividad de cada par de ZFN se muestra como un solo punto y demostró que las proteínas con los perfiles más deseables (alta actividad en el objetivo y baja actividad fuera del objetivo) eran aquellas cuyas mutaciones estaban dentro de los 10 Angstroms de la molécula de ADN (Figura 4). Se indican los puntos de datos correspondientes a pares de ZFN donde un ZFN lleva una mutación FokI en la posición 416, 422, 447, 448 o 525.

[0187] Estos resultados demostraron que las mutaciones en uno o más de los residuos 416, 422, 447, 448, o 525 pueden aumentar la actividad en la diana mientras que la disminución desviado actividad.

Ejemplo 3: Diseño de mutaciones de la cadena de dedos de zinc modificadas novedosas

[0188] Estudios anteriores habían sugerido que puede haber alguna interacción entre los residuos de aminoácidos cargados positivamente en una 'cadena' de dedos de zinc (regiones de la estructura que no están involucradas en el reconocimiento de sitio específico de nucleótidos de ADN) y los fosfatos en la molécula de ADN (Elrod-Erickson et al, ibid), ver Figura 5A. Los aminoácidos en las posiciones -14, -9 y -5 (todos en relación con la numeración convencional de la región de la hélice alfa) a menudo están cargados positivamente y pueden interactuar con los fosfatos cargados negativamente en la cadena principal del ADN (ver Figura 5B). Por consiguiente, se analizaron 4867 secuencias de dedos de zinc para determinar la presencia de residuos de aminoácidos en cada posición de una secuencia de dedos (ver Figura 6). En la posición -5, los aminoácidos neutros alanina, leucina y glutamina se observaron a una frecuencia baja, pero distinta de cero, por lo que estos aminoácidos se usaron en las modificaciones de la cadena del dedo. También se identificaron posiciones en ZFP de 6 y 5 dedos junto con posibles sustituciones (Figuras 7A y 7B).

[0189] Las mutaciones se realizaron en el par ZFN específico de TCRA (TRAC) SBS # 52774/SBS # 52742 (ver PCT WO2017106528 de publicación). Para estas proteínas, se hicieron un total de 21 variantes de cada socio ((F1, F3, F5, F1 F3, F1 F5, f 3 F5, F1 F3 F5) x (R-> A, R-> Q, R-> L)). Una selección representativa de los datos (Tabla 5) demostró que muchos de los pares mostraron una disminución en la actividad fuera del objetivo frente a tres fuera del objetivo analizados. En esta tabla, el 52774 ZFN se combinó con variantes del 52742 ZFN que tenían las mutaciones indicadas en la posición -5 dedo 1 (F1), dedo 3 (F3) y dedo 5 (F5). El tipo de mutación realizada también se indica cuando todos los mutantes en este conjunto de datos son mutantes de Arginina (R) a Glutamina (Q). Por ejemplo, la proteína etiquetada 52742-F1RQ indica un mutante donde la arginina en la posición -5 en el dedo 1 se ha alterado para ser una glutamina. La parte superior de la tabla muestra la actividad como % de indeles y la mitad inferior de la tabla muestra la actividad como una fracción del promedio de la actividad de las dos réplicas del par ZFN parental 52774/52742. Estos experimentos demostraron que estas mutaciones podrían tener un impacto en la escisión fuera del objetivo. Por ejemplo, mientras que en la diana de escisión se mantiene a un nivel robusto para el 52742-F1RQ; F3RQ; F5RQ mutante (69,96% en el objetivo actividad en comparación con la actividad de 62,59% para las proteínas parentales en dosis de 6 |jg), la escisión fuera de diana disminuyó (OT16 mostró un 19,16% de actividad de escisión para las proteínas originales y un 1,43% de actividad en el triple mutante).

Tabla 5: Datos ejemplares para mutaciones de la cadena del dedo de zinc

[0190] A partir de ZFNs matrices específicas a TCRA (TRAC) 52742 y 52774, las argininas (R) en el primer dedo de cada módulo fueron reemplazados ya sea con alanina (A), glutamina (Q), o leucina (L). Las construcciones se probaron en células CD34 donde las células se trataron con 6 jg de ARNm que codifica cada pareja de ZFN (ver Figura 8A). Para estos conjuntos de datos, cada barra de datos que se muestra está en el promedio de los datos para todas las mutaciones de cada tipo, y las barras de error representan el error estándar. Por ejemplo, en la Figura 8A para la barra negra más a la izquierda que indica la actividad en el objetivo, este valor es un promedio del objetivo para los 6 mutantes en el par ZFN que podrían tener una sola mutación. Con referencia al diagrama de la Figura 7, estos incluyen una sola mutación en el dedo N-terminal del módulo A de 52742 (F1 en la proteína de longitud completa), una sola mutación en el dedo N-terminal del módulo B de 52742 (F3 en la proteína de longitud completa), una sola mutación en el dedo N-terminal del módulo C de 52742 (F5 en la proteína de longitud completa) y el conjunto similar de mutaciones en la proteína 52774 asociada. Para la segunda barra negra (que indica la actividad en el objetivo), el grupo en el objetivo es un promedio de las 2 proteínas de mutación (un conjunto de 6 posibilidades, donde las mutaciones se realizan en un solo socio ZFN), y para la tercera barra negra, el grupo en el objetivo es un promedio de las 2 posibilidades con los tres módulos en el ZFN izquierdo o derecho mutado. Para los datos fuera del objetivo, mostrados por las barras grises, se crearon grupos similares, excepto que los datos de los tres sitios fuera del objetivo se combinaron de modo que el grupo de mutaciones simples o dobles en el conjunto de datos fuera del objetivo comprendía cada uno 18 datos, y el grupo de las tres mutaciones comprendía 6 puntos de datos. Las mutaciones dieron como resultado una disminución de hasta 4,8 veces en la actividad fuera del objetivo.

[0191] Los experimentos también se llevaron a cabo donde ambos socios de un par ZFN se mutaron en una manera similar (mitad derecha de la figura 8B). Por ejemplo, si el dedo N-terminal en el módulo A se modificó para ser una alanina, (52742-F1RA), entonces la proteína asociada también se mutaría en el dedo N-terminal en el módulo A (52774-F1RA) para un total de 2 mutaciones en el dímero ZFN. Solo se probaron simultáneamente las sustituciones de alanina en ambos ZFN en el dímero y estos datos se muestran en la mitad derecha de la Figura 8B (indicada con 2, 4 o 6). Las mutaciones R-> A realizadas en solo un ZFN en el dímero (indicado por 1, 2 o 3) del tercio izquierdo de la Figura 8A se muestran de nuevo en la mitad izquierda de la Figura 8B con fines comparativos. La Figura 8C es similar a la parte derecha de la Figura 8A, excepto que solo se utilizaron 2 |jg (20 jg/m l) de ARN. Estos experimentos demostraron que estas mutaciones podrían generar una disminución de 27 veces en la actividad fuera del objetivo cuando ocurren un total de seis mutaciones en ambas ZFN en el dímero.

[0192] Estos experimentos también se realizaron con el par ZFN específico a BCL11A 51857-ELD/51949-KKR descrito anteriormente. El diseño experimental fue similar al descrito para el par ZFN específico de TCRA (TRAC), y los resultados se muestran en la Figura 9A. Los datos presentados muestran los resultados para los pares que comprenden mutaciones R -> Q (Gln) o R-> L (Leu) dosificadas a 2 jg (20 jg/mL) donde los resultados fuera del objetivo representados fueron solo para una sitio fuera del objetivo (NlFMAEVG, consulte la Tabla 1).

[0193] Variantes de aminoácidos adicionales en la posición -5 fueron hechas mediante la sustitución de R con E, N, Y, A, o L. Además de alterar los aminoácidos en la posición -5, una serie de mutaciones se hicieron en las posiciones -9 y -14 en el dedo 1 del par ZFN específico de B C L llA 51857/51949. Estos se probaron para determinar la actividad dentro y fuera del objetivo como se describió anteriormente, solos y en combinación con alteraciones de -5 en los dedos 2-6. Los datos se muestran a continuación en la Tabla 6. Cada proteína tenía las mismas regiones de hélice de especificidad de ADN que las descritas para las proteínas parentales anteriormente, pero se le dio un nuevo número identificador de SBS para reflejar las mutaciones de la estructura de ZFP. En resumen, los nombres completos de las proteínas reflejan las variantes enumeradas en el dedo. Por lo tanto, la parte "cR" del nombre completo se refiere a los cambios que se realizan en el dedo del terminal C del módulo de dos dedos (consulte la Figura 7), y "nR" se refiere a los cambios que se realizan en el terminal N dedo del módulo de dos dedos. La descripción "rQa" significa que se hicieron alteraciones en la posición - 5 en el módulo A, y el dedo en el que se hizo está definido por cR o nR. Por lo tanto, SBS # 65461 (nombre completo 51857-NELD-cR-5Qa) es un derivado de SBS # 51857 donde las alteraciones se realizan en el dedo C-terminal, en la posición -5, donde Q reemplaza a la R en el Módulo A. Esto también se puede ver en la tabla donde hay una Q indicada en la columna F2, -5. Cuando se hicieron cambios a la posición -14, como se indica para SBS # 65459 (nombre completo 51857-NELD-nR-14Q-5Qabc). Por lo tanto, s Bs # 65459 es un derivado de SBS # 51857, donde los cambios se realizan en el dedo N-terminal en los módulos, donde -14 del dedo 1 se ha cambiado de R a Q, y las posiciones -5 en N- El dedo terminal de los módulos A, B y C se ha cambiado de R a Q. En el caso de SBS # 65460, el -14 del dedo 1 se ha cambiado de R a S. Nuevamente, esto también se puede determinar a partir de la tabla. Las denotaciones "NELD" y "CKKR" indican el tipo de dominios nucleasa Fokl (variantes del dominio Fokl "ELD" o "KKR") y otros aspectos del vector (ver Publicación PCT N° WO 2017/136049). La Tabla 6A muestra los emparejamientos de las mutaciones realizadas en el socio derivado de SBS # 51857 con el socio de SBS # 51949 o un socio de SBS # 51949 que comprende alteraciones que insertaron una Q en los dedos N-terminales en las posiciones -5 en los módulos A, B y C, donde este socio comprende además la mutación R416S en el dominio Fokl, donde los experimentos se llevaron a cabo utilizando 2 jg de ARNm que codifica cada ZFN. Estos experimentos también se realizaron usando mutaciones en la proteína SBS # 51949 (ver Tabla 6B) donde también se probaron mutaciones en los aminoácidos que interactúan con fosfato del dominio Fokl en combinación con las mutaciones de la cadena principal. Estos datos indicaron que las alteraciones adicionales podían influir en la especificidad de los pares de ZFN.

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Los experimentos se repitieron usando células CD34 en las que los ARN se administraron a las células usando un sistema de transfección BTX usando condiciones optimizadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron tres concentraciones de ARN: concentración final de 60, 20 y 5 pg/mL. Los datos se muestran a continuación en la Tabla 6C y demuestran que se puede detectar una escisión robusta en el objetivo incluso a niveles muy bajos de ARNm de ZFN, de modo que la escisión fuera del objetivo se reduce sustancialmente (> 100x). Las mutaciones se indican en la nomenclatura que se muestra en la Figura 2C. El experimento se repitió usando solo el parental y el par 3x (R-> Q)/3x (R-> Q) de la Tabla 6C a continuación para determinar la solidez de los resultados. Como se ve en la Tabla 6D, los resultados fueron altamente repetibles.

Tabla 6D: Medidas repetidas de la actividad en el objetivo

Ejemplo 4: Titulación de parejas de ZFN para una actividad óptima en el objetivo

[0195] La titulación de cada pareja de un par de ZFN individualmente puede permitir determinar la concentración óptima de cada pareja de ZFN y, por lo tanto, tener la máxima modificación en el objetivo por el par mientras se minimiza modificaciones fuera del objetivo. Cada semidominio de ZFN individual puede tener su propia cinética de unión a su diana de ADN afín, de modo que a través de la titulación separada de cada uno, se puede lograr una actividad óptima. Por consiguiente, el par específico de BCL11A SBS # 51949/SBS # 51857 se usó para estudios de titulación en células CD34 usando ZFN introducidos como ARNm, donde se usaron altas concentraciones de ZFN para permitir la detección de escisión fuera del objetivo. Los experimentos (Tabla 7 a continuación) encontraron que la titulación de la pareja SBS # 51857 dio como resultado una disminución en la escisión fuera del objetivo (aproximadamente 8 veces) mientras se mantenía una escisión sólida en el objetivo. Por ejemplo, cuando se usaron 60 pg/mL de 51949 mARN en combinación con 6,6 pg/mL de 51857 mARN, la modificación en el objetivo permaneció aproximadamente igual que cuando se usaron 60 pg/mL de cada ZFN (76,1% de indeles cuando se usaron 60 pg/mL de cada uno, 78,3% de indeles cuando se usaron 60 pg/mL de 51949 en combinación con 6,6 pg/mL de 51857), mientras que el agregado fuera del objetivo pasó de 32,4% de indeles a 4,0%. Tenga en cuenta que la reducción de la entrada de ARNm para ambos ZFN conduce igualmente a una caída gradual en la modificación en el objetivo, mientras que la modificación fuera del objetivo solo se redujo sustancialmente cuando se redujo la modificación en el objetivo.

[0196] También se realizó un análisis de Western para demostrar que la expresión de cada pareja de ZFN se correlacionaba con la cantidad de ARNm que codifica ZFN que se administra (Figura 10). En este experimento, se transfectaron células CD34 con las ZFN indicadas y 24 horas después se detectó la expresión de las proteínas ZFN usando un anticuerpo anti-Flag (las construcciones de expresión comprendían una etiqueta Flag codificada). También se analizó la expresión de las dos proteínas cuando las ZFN se cointrodujeron como un único ARN separado por una secuencia de péptido autoescindible 2a (ver carril 2 en la Figura 10).

[0197] Las titulaciones se repitieron variando tanto ZFNs independientemente para ver si había algún efecto en actividad de escisión tanto en objetivo como fuera de objetivo. Los resultados (Figura 11) demostraron que una titulación a la baja de ambas parejas disminuyó la escisión fuera del objetivo, pero el efecto fue más fuerte para SBS # 51857. Los recuadros en el gráfico de BCL11A en el objetivo en la Figura 11 indican un mantenimiento de la actividad de escisión contra el objetivo BCL11A deseado utilizando 60 |jg de ARNm de SBS # 51949 con 6,6 o 60 |jg de ARNm de SBS # 51857, mientras que la actividad fuera del objetivo en el sitio, NIFMAEVG descendió de 27 a 4% de indeles con la dosis disminuida de SBS # 51857.

Ejemplo 5: Combinación de titu laciones de parejas de ZFN y mutaciones de contacto de FokI-fosfato

[0198] A continuación, se llevaron a cabo análisis para medir la actividad de las titulaciones de parejas de ZFN combinadas conmutaciones de Fokl ejemplares. Los ZFN específicos de BCL11A que comprenden las mutaciones Fok se utilizaron en las proporciones mostradas anteriormente para preservar la actividad en el objetivo mientras se reducía el corte fuera del objetivo. Los experimentos se llevaron a cabo en células CD34 donde las células se transfectaron con ARNm que codifican las ZFN. Los datos se presentan a continuación en la Tabla 8. La "proporción activada/desactivada" indica la proporción de actividad dentro del objetivo a toda la actividad fuera del objetivo combinada para la muestra indicada. La combinación de 6,6 jg/m l de SBS # 51857 y 60 jg/m l de SBS # 51949-R416S Fokl mutante produjo niveles similares de actividad en el objetivo (84,85% frente a 78,17% para 60 jg de ambos ZFN parentales) mientras que se reduce drásticamente la actividad en los cinco sitios fuera del objetivo monitoreados y se obtiene una mejora de 32 veces en la relación dentro del objetivo/fuera del objetivo (89,52 frente a 2,76 para 60 jg/m l de cada ZFN parental).

[0199] Se examinaron todos los sitios fuera del objetivo enumerados anteriormente en la Tabla 1 para determinar el efecto sobre la actividad fuera del objetivo mediante la combinación de la titulación y el enfoque del mutante FokI (ver Figura 12).

[0200] Los datos mostraron una disminución global en la actividad fuera de objetivo de aproximadamente 30 veces.

[0201] Los datos también se analizaron en términos sobre el número de eventos de captura detectado por el ensayo de captura imparcial descrito anteriormente después de la escisión. Se utilizaron los pares específicos de BCL11A descritos anteriormente en la Tabla 6D, tanto el par principal (SBS51857/SBS51949) como el par de variantes (SBS63014/SBS65721) y se analizó el número de eventos de captura fuera del objetivo. En este experimento, las ZFN se administraron en cantidades iguales a las células CD34 (concentración final de 60 |jg/ml) o en concentraciones finales de 6,6 jg y 60 jg , para el par parental, y a 20 jg y 60 jg concentraciones finales, para la variante.

[0202] Los resultados se muestran en la Figura 13, y demuestran que mientras que el padre y la variante demostraron actividad de escisión robusto en ambas condiciones de concentración (> 80% indeles), eventos de captura fuera del objetivo se redujeron en gran medida, especialmente para el par variante cuando se entrega en las dosis no iguales. La combinación de las mutaciones de ZFN Fokl y las concentraciones desiguales de parejas de ZFN dio como resultado un aumento de 350 veces en la especificidad de escisión.

Ejemplo 6: Combinación de mutaciones de la cadena principal de ZFP con mutaciones de contacto con fosfato de FokI

[0203] También generamos ZFN que comprenden las mutaciones de la cadena principal con dedos de zinc descritas en el Ejemplo 3 con las mutaciones de contacto con fosfato de FokI descritas en el Ejemplo 2. Esta combinación se probó con el par ZFN específico a BCL11A en células CD34 en dos dosis: 6 jg o 2 jg . Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 9 y demuestran que la combinación de estos dos tipos de enfoques puede afectar significativamente la cantidad de actividad fuera del objetivo. En esta tabla, las mutaciones de la cadena se muestran como el tipo de mutación por módulo (A, B y/o C, refiriéndose a la Figura 7). Por ejemplo, en una muestra etiquetada como 51949 LeuABC R416S, la proteína comprendía sustituciones de la cadena R-> L en los dedos 1 (módulo A), 3 (módulo B) y 5 (módulo C), y además portaba la mutación R416S FokI. En varios ejemplos, hubo pares de ZFN sin actividad detectable fuera del objetivo mientras que retuvieron la actividad completa en el objetivo. Estos ejemplos están encuadrados en la Tabla 9.

Tabla 9: Actividad (% NHEJ) para ZFN que comprenden la estructura de ZFN y mutaciones de contacto con fosfato de FokI.

Ejemplo 7: combinación de titu lación de pareja, esqueleto de ZFP y mutaciones de contacto con fosfato de FokI

[0204] También se realizan mediciones de actividad donde las valoraciones de pareja óptimas se combinan con ZFN que comprenden mutaciones de esqueleto de ZFP y mutaciones de ZFN FokI. Los ZFN se prueban en células CD34 como se describió anteriormente y demuestran una mayor especificidad del par ZFN a través de un nivel reducido de actividad fuera del objetivo.

Ejemplo 8: Especificidad de ZFN en células CD34 a escala clínica

[0205] La especificidad del par de variantes BCL11A SBS63014/SBS65722 también se probó en un procedimiento a gran escala que es adecuado para generar materiales celulares para un ensayo clínico. En resumen, se transdujeron aproximadamente 95-130 millones de células CD34 por lote usando un dispositivo Maxcyte de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se utilizaron 80 pg/ml de los ARNm de SBS63014 y 20 pg/ml de los ARNm de SBS # 65722, y las células se analizaron dos días después para la escisión fuera del objetivo usando el ensayo de captura insesgado.

[0206] Los resultados mostraron que cuando 47 loci de captura diferentes potenciales se analizaron por PCR (véase la Figura 14), ninguna modificación significativa fue detectable excepto en la ubicación diana, donde se encontraron 79,54% indeles. Estos datos demuestran que estas nucleasas como se describen en el presente documento son muy específicas incluso cuando se utilizan en un procedimiento de fabricación a gran escala.

Ejemplo 9: Estudios de especificidad adicionales

[0207] También se llevaron a cabo estudios de especificidad utilizando ZFN dirigidos a AAVS1 con diversas mutaciones como se describe anteriormente. En particular, ZFNs SBS # 30035 y SBS # 30054 como se describe en la Publicación de EE. UU. N° 20150110762 se usaron para estudios de varios mutantes, incluidos mutantes de dimerización (p. ej., ELD, KKR y mutantes adicionales), otras mutaciones (p. ej., Sharkey) así como mutantes de contacto de fosfato en ensayos de actividad como se describió anteriormente.

[0208] Para los resultados en las tablas siguientes, el (los) mutante(s) de Fokl indicado(s) fue/fueron introducidos en ya sea el dominio Folkl ELD de SBS 30035 (marcado ELD_X donde X es la mutación de Fokl), el dominio Folkl KKR de SBS 30054 (etiquetado KKR_X donde X es la mutación Fokl), o introducido en los dominios Fokl de ambas construcciones (etiquetado ELD_KKR_X donde X es la misma mutación Fokl introducida en los dominios ELD y KKR Fokl). Los resultados de la combinación de las "construcciones parentales" 30035 y 30054 no modificadas se etiquetan como "parental", "parentales", "ZFN parentales" o similares. Una dosis más baja de cada construcción parental a menudo se etiqueta como "media dosis". El control negativo sin nucleasas se suele etiquetar como "GFP". La proporción del % de indeles en el locus deseado (a menudo etiquetado como "AAVS1") dividida por la suma de los % de indeles en todos los objetivos fuera de los objetivos medidos en un experimento determinado a menudo se etiqueta como "proporción", "relación activada/desactivada", etc.

[0209] La ubicación del AAVS1 objetivo y fuera del objetivo se muestra a continuación, donde 'hg38' denota los datos del genoma ensamblado de acuerdo con la base de datos del navegador del genoma UCSC, compilación hg38:

[0210] Las tablas 10A-10C muestran los resultados de escisión de 2 experimentos diferentes en el objetivo (AAVS1) y los tres fuera del objetivo (OT1, OT2, OT3), así como la proporción de los mutantes de dimerización ELD, KKR y ELD-KKR en y fuera del objetivo con mutación de sustitución adicional (cada aminoácido para el tipo salvaje) en R416 o K525. También se muestran resultados con mutantes ELD_S418D, ELD_N476D, ELD_W79T, El D_Q481E, ELD_N527D y ELD_Q531R.

Tabla 10A

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Tabla 10B

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Tabla 10C

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[0211] Las tablas 11A-11C muestran los resultados de escisión de 2 experimentos diferentes en el objetivo (AAVS1) y tres fuera del objetivo (OT1, OT2, OT3) así como la proporción de dentro y fuera del objetivo de los mutantes indicados, incluidos los mutantes de sustitución en 418, 422 y 525 en combinación con los mutantes de dimerización ELD y/o KKR.

Tabla 11A

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Tabla ^{h b}

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Tabla 11C

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[0212] Las Tablas 12A a 12C muestran resultados de escisión en y fuera del objetivo usando ZFN dirigidos a AAVS1 con las mutaciones indicadas (ELD, KKR, ELD/KKR y mutaciones adicionales indicadas).

Tabla 12A

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[0213] Las Tablas 13A a 13C muestran eventos de escisión en y fuera del objetivo usando ZFN dirigidos a AAVS1 con las mutaciones indicadas (ELD, KKR, ELD/KKR y mutaciones adicionales indicadas).

Tabla i3A

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Continuación)

Tabla 13B

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Tabla 13C

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[0214] Las Tablas 14A-14C muestras los resultados con los mutantes indicados.

Tabla 14A

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Tabla 14B

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Tabla 14C

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[0215] Las Tablas 15A a 15C muestran los resultados de los experimentos de duplicados con los mutantes indicados.

Tabla 15A

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(Continuación)

Tabla 15C

(Continuación)

[0216] Las Tablas 16A y 16B muestran los resultados de escisión diana (AAVS 1) y fuera de diana utilizando los mutantes indicados.

Tabla 16A

(Continuación)

Tabla 16B

(Continuación)

[0217] Las Tablas 17A a 17C muestran resultados con los mutantes ejemplares indicados, incluidos los mutantes dobles ejemplares.

Tabla 17A

(Continuación)

Tabla 17B

(Continuación)

Tabla 17C

Continuación

[0218] Las tablas 18A a 18C muestran los resultados del uso de los mutantes del dominio de escisión indicados.

Tabla 18A

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Tabla 18B

(Continuación)

Tabla 18C

[0219] Las Figuras 15 y 16 también muestran resúmenes de resultados seleccionados con los mutantes indicados.

[0220] Los resultados demuestran la escisión altamente específica con los mutantes descritos en este documento.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un semidominio de escisión de Fokl modificado, en el que el semidominio de escisión modificado comprende una 0 más mutaciones como sigue:

(a) el residuo de tipo salvaje en la posición 479 se reemplaza con un residuo Gln (Q) o Thr (T) (I479Q o I479T);

(b) el residuo de tipo salvaje en la posición 418 se reemplaza con un residuo Glu (E) o Asp (D) (S418E o S418D);

(c) el residuo de tipo salvaje en la posición 446 se reemplaza con un residuo Asp (D) (S446D);

(d) el residuo de tipo salvaje en la posición 448 se reemplaza con un residuo Ala (A) (K448A);

(e) el residuo de tipo salvaje en la posición 481 se reemplaza con un residuo Ala (A), Glu (E), Cys (C) o Ser(s) (Q481A, Q481E, Q481C o Q481S);

(f) el residuo salvaje en la posición 416 se reemplaza con un residuo Glu (E), Asp (D), His (H) o Asn (N) (R416E, R416D, R416H o R416N);

(g) el residuo de tipo salvaje en la posición 422 se reemplaza con un residuo His (H) (R422H);

(h) el residuo de tipo salvaje en la posición 424 se reemplaza con un residuo Phe (F) (L424F);

(i) el residuo de tipo salvaje en la posición 472 se reemplaza con un residuo Asp (D) (S472D);

(j) el residuo de tipo salvaje en la posición 476 se reemplaza con un residuo Glu (E) o un residuo Gly (G) (N476E o N476G);

(k) el residuo de tipo salvaje en la posición 478 se reemplaza con un residuo Asp (D) (P478D);

(l) el residuo de tipo salvaje en la posición 480 se reemplaza con un residuo Asp (D) (G480D);

(m) el residuo de tipo salvaje en la posición 525 se reemplaza con un residuo Ala (A), Cys (C), Glu (E), Ile (I), Ser(s), Thr (T) o Val (V) (K525A, K525C, K525E, K525I, K525S, K525T o K525V); y/o

(n) el residuo de tipo salvaje en la posición 542 se reemplaza con un residuo de Asp (D) (N542D), en el que los residuos de aminoácidos se enumeran con respecto al dominio de escisión de tipo salvaje de FokI de longitud completa, como se muestra en la SEQ. ID NO: 1.

2. El semidominio de escisión modificado de la reivindicación 1, en el que el residuo de tipo salvaje en la posición 481 se reemplaza con un Ala (A).

3. El semidominio de escisión modificado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende mutaciones como sigue: mutaciones R416E y R422H; mutaciones R416D y R422H; mutaciones R416E y K448A; mutaciones K448A e I479Q; mutaciones K448A y Q481A; o mutaciones K448A y K525A.

4. El semidominio de escisión modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una mutación de aminoácido adicional en una o más de las posiciones 432, 441, 483, 486, 487, 490, 496, 499, 527, 537, 538 y 559.

5. Un heterodímero que comprende un primer semidominio de escisión modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un segundo semidominio de escisión.

6. Una nucleasa artificial que comprende un semidominio de escisión modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un dominio de unión al ADN.

7. La nucleasa artificial de la reivindicación 6, en la que el dominio de unión al ADN comprende una proteína con dedos de zinc, un dominio efector TALE o un ARN guía único (ARNg).

8. La nucleasa artificial de la reivindicación 7, en la que la proteína con dedos de zinc comprende una o más mutaciones en las posiciones -14, -9 y -5.

9. Uno o más polinucleótidos que codifican el semidominio de escisión modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el primer y segundo dominios de escisión modificados de la reivindicación 5 o una nucleasa artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

10. Una célula aislada que comprende el semidominio de escisión modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el heterodímero de la reivindicación 5, una nucleasa artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, o el polinucleótido de la reivindicación 9.

11. Un método in vitro para escindir cromatina celular genómica en una región de interés, comprendiendo el método:

expresar una nucleasa artificial que comprende un dominio de escisión modificado según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en una célula,

en el que el sitio de la nucleasa escinde específicamente una secuencia de nucleótidos en la región de interés de la célula genómica cromatina.

12. El método in vitro de la reivindicación 11, que comprende además poner en contacto la célula con un polinucleótido donante; donde la escisión de la cromatina celular facilita la recombinación homóloga entre el polipéptido donante y la cromatina celular.

13. Un método in vitro para escindir al menos dos sitios diana en la cromatina celular genómica, comprendiendo el método: escindir al menos el primer y segundo sitios diana en la cromatina celular genómica, donde cada sitio diana se escinde usando una composición que comprende una nucleasa artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

14. El semidominio de escisión modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el heterodímero de la reivindicación 5, la nucleasa artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, el uno o más polinucleótidos de la reivindicación 9 o la célula aislada de la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad en un sujeto.

15. El semidominio de escisión modificado por modificado genética, el heterodímero, la nucleasa artificial, el uno o más polinucleótidos o la célula aislada, en combinación con una secuencia donante, para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la secuencia donante está integrada en una secuencia diana. después de la ruptura de la doble hebra por medio del dominio de escisión modificado, heterodímero o nucleasa artificial.

16. El semidominio de escisión modificado, el heterodímero, la nucleasa artificial, el uno o más polinucleótidos o la célula aislada para su uso de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde:

(a) las células aisladas comprenden células que se han eliminado del sujeto y/o sus descendientes; o (b) las células se han aislado del sujeto, se han transfectado con el polinucleótido de la reivindicación 9 y se han reinfundido de nuevo en el sujeto.

17. Un método in vitro para aumentar la especificidad de escisión de nucleasa modificada, comprendiendo el método poner en contacto una célula con un complejo de nucleasa modificada que comprende parejas de semidominio de escisión modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la proporción de las parejas es distinta de uno a uno, opcionalmente en el que:

(i) la relación es 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:9, 1:10 o 1:20, o cualquier valor entre ellos, o es mayor que 1:30; y/o

(ii) cada pareja se entrega a la célula como un ARNm o se administra en un vector viral o no viral donde se administran diferentes cantidades de ARNm o vector que codifica a cada pareja.