JP2023100751A - 操作された標的特異的ヌクレアーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年8月24日に出願された米国仮出願第62/378,978号及び2017年1月9日に出願された米国仮出願第62/443,981号の利益を主張し、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
非適用。
ができる(Chen et al(2015)J Phys Chem Lett 6:2733-2737)。
dCas-Fokなどの二量体ヌクレアーゼについて、個々の単量体の結合親和性が異なる場合に飽和条件を特定して、回避することはより複雑であり得る。そのような場合、単純な1:1ヌクレアーゼ比を用いた用量反応試験は、より弱い結合モノマーの飽和点を明らかにするだけであろう。そのようなシナリオの下では、例えば、モノマー親和性が10倍異なるならば、1:1滴定試験で特定された飽和点において、より高い親和性の単量体が、必要とされるよりも10倍高い濃度で存在するであろう。結果として生じる過剰の高親和性モノマーは、意図された標的での切断のいかなる有益な増加ももたらすことなく、オフターゲット活性の増加をもたらし、潜在的に任意の所与のヌクレアーゼ対について全体的な減少した特異性をもたらす可能性がある。
、二量体化または触媒ドメイン中の追加の残基)での変異が行われる。
ヌクレアーゼに組み込まれ得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガータンパク質は、非カノニカル亜鉛配位残基(例えば、カノニカルC2H2立体配置よりはむしろCCHCであり、米国特許第9,234,187号を参照されたい)を含み得る。
インの変異をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、-5位のArg(R)はTyr(Y)、Asp(N)、Glu(E)、Leu(L)、Gln(Q)、またはAla(A)に変更される。他の実施形態では、(-9)位のArg(R)は、Ser(S)、Asp(N)、またはGlu(E)で置換される。さらなる実施形態では、(-14)位のArg(R)は、Ser(S)またはGln(Q)で置換される。他の実施形態では、融合ポリペプチドは、(-5)、(-9)及び/または(-14)位のアミノ酸が任意の組み合わせで上記のアミノ酸のいずれかに変更されているジンクフィンガーDNA結合ドメインに変異を含むことができる。
成物が提供される。一態様では、オフターゲット切断活性を減少させることによって全体的なオンターゲット切断特異性を増加させるための方法が提供される。いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼ複合体の操作された切断ハーフドメインパートナーは、細胞と接触させるために使用され、ここでは、複合体の各パートナーが、1対1以外の他のパートナーに対する比で与えられる。いくつかの実施形態では、2つのパートナー(ハーフ切断ドメイン)の比は、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:8、1:9、1:10または1:20の比、もしくはそれらの間の任意の値で与えられる。他の実施形態では、2つのパートナーの比は、1:30より大きい。他の実施形態では、2つのパートナーは、1:1とは異なるように選択された比で展開される。いくつかの態様では、各パートナーは、mRNAとして細胞に送達されるか、または各パートナーをコードするmRNAもしくはベクターの異なる量が送達されるウイルスまたは非ウイルスベクター中で送達される。さらなる実施形態では、ヌクレアーゼ複合体の各パートナーは、単一のウイルスベクターまたは非ウイルスベクター上で構成されてもよいが、一方のパートナーが他方のパートナーよりも高いまたは低い値で発現されるように意図的に発現され、最終的に1対1以外の切断ハーフドメインの比を細胞に送達する。いくつかの実施形態では、各切断ハーフドメインは、異なる発現効率を有する異なるプロモーターを用いて発現される。他の実施形態では、2つの切断ドメインは、両方とも同じオープンリーディングフレームから発現されるウイルス性または非ウイルス性ベクターを使用して細胞に送達されるが、2つのパートナーをコードする遺伝子は、2つのパートナーの比が1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:8、1:9、1:10または1:20の比、またはその間の任意の値であるように、3’パートナーがより低い割合で発現される配列(例えば、自己切断型2A配列またはIRES)によって分離されている。他の実施形態では、2つのパートナーは、1:1とは異なるように選択された比で配置される。
TALE、sgRNA)、及び切断ドメイン(またはハーフドメイン)を含む)、(d)第2の融合タンパク質を細胞内で発現させること(第2の融合分子が、第2のDNA結合-ドメイン、及び第2の切断ドメイン(またはハーフドメイン)を含む)と、を含むことができ、融合分子のうちの少なくとも1つは、本明細書に記載されるリンカーを含み、さらに、第1の融合分子は第1の配列に結合し、活性なヌクレアーゼ複合体が形成することができ、細胞クロマチンが対象領域において切断されるように、第2の融合分子は、第1の配列から2~50個のヌクレオチドの間に位置する第2の配列に結合する。ある特定の実施形態では、両方の融合分子は、DNA結合ドメインと触媒ヌクレアーゼドメインとの間に、本明細書に記載されるリンカーを含む。
本明細書に開示される方法の実施、ならびに本明細書に開示される組成物の調製及び使用は、他に示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、計算化学、
細胞培養、組換えDNAならびに関連分野は当該技術分野の範囲内である。これらの技術は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook et al.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 and Third edition,2001、Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987 and periodic updates、the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego、Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998、METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin”(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999、及びMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker, ed.)Humana Press,Totowa,1999を参照されたい。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、直鎖状または環状のコンフォメーションで、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語を、ポリマーの長さに関する限定として解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖、及び/またはリン酸(ホスホロチオエート主鎖)部分内で修飾されるヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対形成特異性を有し、すなわち、Aの類似体は、Tと塩基対を形成するであろう。
付けられる。「親和性」は、結合強度を指し、結合親和性の増加は、Kdの低下と相関す
る。「非特異的結合」は、オンターゲット配列に依存しない任意の対象の分子(例えば、操作されたヌクレアーゼ)と高分子(例えば、DNA)との間に生じる非共有相互作用を指す。
合活性を有する。RNAにガイドされたヌクレアーゼ系の場合には、RNAガイドは、ヌクレアーゼ構成要素(Cas9またはCfp1)に対して異種であり、そして両方とも操作され得る。
/または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列が、外因性の「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって変更される。そのような相同組換えは、切断領域に相同な配列が存在する場合、細胞クロマチンにおける二本鎖切断の存在によって刺激される。
形成するように修飾されている切断ハーフドメイン(例えば、別の操作された切断ハーフドメイン)である。
、内因性分子と同一の種類の分子とすることができるが、細胞が由来する種とは異なる種に由来する。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに本来由来する細胞株に導入し得る。植物細胞への外因性分子の導入方法は当業者に既知であり、プロトプラスト形質転換、炭化ケイ素(例えば、WHISKERS(商標))、アグロバクテリウム媒介形質転換、脂質媒介伝達(すなわち、中性及びカチオン性脂質を含むリポソーム)、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃(例えば、「遺伝子銃」を使用する)、リン酸カルシウム共沈、DEAE-デキストラン媒介導入及びウイルスベクター媒介導入が挙げられるが、これらに限定されない。
が1つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じて、コード配列の転写レベルを制御する場合は、コード配列に作動的に連結結合される。転写調節配列は、一般に、コード配列とはシスに、作動的に連結されているが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえそれらが隣接していなくても、コード配列に作動的に連結される転写調節配列である。
、結合分子が結合することになる核酸の一部を決定する核酸配列である。例えば、5’-GAATTC-3’という配列は、Eco RI制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。「意図された」または「オンターゲット」配列は、結合分子が結合することが意図される配列であり、「意図されない」または「オフターゲット」配列は、意図された標的ではない結合分子によって結合される任意の配列を含む。
対象の任意の遺伝子または遺伝子座の標的部位に特異的に結合するDNA結合分子/ドメインを含む組成物が本明細書に記載される。ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、TALE DNA結合ドメイン、CRISPR/CasヌクレアーゼのDNA結合部分(ガイドまたはsgRNA)、またはメガヌクレアーゼ由来のDNA結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない、任意のDNA結合分子/ドメインを本明細書に開示される組成物及び方法において使用することができる。
、同第7,030,215号 、同第6,794,136号 、同第7,067,317
号 、同第7,262,054号 、同第7,070,934 、同第7,361,635
号 、同第7,253,273号 、及び米国特許出願公開第2005/0064474号
、同第2007/0218528号 、同第2005/0267061を参照されたい。ある特定の実施形態では、DNA結合ドメインは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第2012/0060230号(例えば、表1)に開示されるジンクフィンガータンパク質を含む。
6号 、同第6,200,759号 、及び同第6,242,568号 、ならびに国際公
開第98/37186号 、国際公開第98/53057号 、国際公開第00/27878号 、国際公開第01/88197号及びGB2,338,237号に開示されている
。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、米国特許第6,794,136号に記載されている。
1号 、同第5,925,523号 、同第6,007,988号 、同第6,013,4
53号 、同第6,200,759号 、国際公開第95/19431号 、国際公開第9
6/06166号 、国際公開第98/53057号 、国際公開第98/54311号
、国際公開第00/27878号 、国際公開第01/60970号 、国際公開第01/88197号 、国際公開第02/099084号 、国際公開第98/53058号 、
国際公開第98/53059号 、国際公開第98/53060号 、国際公開第02/016536号及び国際公開第03/01649号に詳細に記載されている。
アーゼ及びメガヌクレアーゼのDNA結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Chevalier et al.(2002)Molec.Cell 10:895-905;Epinat et al.(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962、Ashworth et
al.(2006)Nature 441:656-659;Paques et al.(2007)Current Gene Therapy 7:49-66、米国特許公開第20070117128号を参照されたい。
Gen Genet 218:127-136及び国際公開第2010079430を参照のされたい)。TALEはタンデムリピートの集中ドメインを含み、各リピートは、これらのタンパク質のDNA結合特異性にとって重要である約34個のアミノ酸を含む。加えて、それらは核局在化配列及び酸性転写活性化ドメインを含む(総説についてはSchornack S,et al(2006)J Plant Physiol 163(3):256-272を参照されたい)。加えて、植物病原性細菌Ralstonia
solanacearumでは、R.solanacearum biovar1株GMI1000及びbiovar4株RS1000において、Xanthomonas属のAvrBs3ファミリーと相同な2つの遺伝子brg11及びhpx17が見出されている(Heuer et al(2007)Appl and Envir Micro
73(13):4379-4384を参照されたい)。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列が互いに98.9%同一であるが、hpx17のリピートドメインにおける1,575個の塩基対の欠失によって異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、Xanthomonas属のAvrBs3ファミリータンパク質と40%未満の配列同一性を有する。
326:1509-1512を参照されたい)。実験的に、12位及び13位のHD配列(繰り返し可変方向またはRVD)がシトシン(C)への結合をもたらし、NGがTへ結合し、NIがA、C、GまたはTへ結合し、NNはAまたはGに結合し、及びINGはTに結合するように、これらのTALエフェクターのDNA認識のための天然コードが決定された。これらのDNA結合リピートは、新しい組み合わせ及びリピート数でタンパク質に組み立てられ、植物細胞中で新しい配列と相互作用し、非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子を作製した(Bochら、同書)。操作されたTALタンパク質は、非定型RVDを有するTALENを含む、TALエフェクタードメインヌクレアーゼ融合(TALEN)を生じるためにFokI切断ハーフドメインに結合されている。例えば、米国特許第8,586,526号を参照されたい。
al(2013)Nat Comm:1-8 DOI:10.1038/ncomms2782を参照されたい)。加えて、ヌクレアーゼドメインはまた、DNA結合機能性を示し得る。任意のTALENが、追加のTALEN(例えば、1つ以上のTALEN(cTALENまたはFokI-TALEN)と1つ以上のメガTALE)と組み合わせて使用され得る。
されている。ある特定の実施形態では、DNA結合ドメインは、DNAに結合するシングルガイドRNA(sgRNA)DNA結合分子を含む、CRISPR/Casヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第8,697,359号、ならびに米国特許公開第20150056705号及び同第20150159172号を参照されたい。系のRNA成分をコードするCRISPR(クラスター化された規則的に散在した短い回文構造のリピート)遺伝子座、及びタンパク質をコードするcas(CRISPR関連)遺伝子座(Jansen et al.,2002.Mol.Microbiol.43:1565-1575、Makarova et al.,2002.Nucleic Acids Res.30:482-496、Makarova et al.,2006.Biol Direct 1:7、Haft et al.,2005.PLoS Comput.Biol.1:e60)は、CRISPR/Casヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるCRISPR遺伝子座は、CRISPR関連(Cas)遺伝子ならびにCRISPR媒介核酸切断の特異性をプログラムすることができる非コードRNA要素の組み合わせを含有する。
ンの使用が好ましいであろう。さらに、TtAgoタンパク質が細胞透過性ペプチドに融合している場合、インビトロで形成されたTtAgo-DNA複合体で細胞を処理することが好ましい可能性がある。さらに、37℃で活性が改善されるように変異誘発を介して変更されたTtAgoタンパク質のバージョンを使用することが好ましい可能性がある。Ago-RNA媒介DNA切断は、DNA破壊の利用のための当技術分野において標準的な技術を用いた、遺伝子ノックアウト、標的化された遺伝子の付加、遺伝子修正、標的化された遺伝子の欠失を含む一連の結果に影響を及ぼすために使用され得る。
本明細書に記載されるDNA結合ドメイン(例えば、ZFPまたはTALE、シングルガイドRNAなどのCRISPR/Cas成分)及び異種調節(機能)ドメイン(またはその機能的フラグメント)を含む融合分子もまた提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン(活性化因子、抑制因子、活性化補助因子、補助抑制因子)、サイレンサー、発癌遺伝子(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーメンバーなど);DNA修復酵素とその関連因子及び修飾因子;DNA再配列酵素ならびにそれらに関連する因子及び修飾因子;クロマチン関連タンパク質及びそれらの修飾因子(例えば、キナーゼ、アセチラーゼ及びデアセチラーゼ);及びDNA修飾酵素(例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ)ならびにそれらの関連因子及び修飾因子が挙げられる。DNA結合ドメインとヌクレアーゼ切断ドメインとの融合に関する詳細については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20050064474号、同第20060188987号及び同第2007/0218528号を参照されたい。
、AP1、ARF-5、-6、-7、ならびに-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP、及びTRAB1が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ogawa et al.(2000)Gene 245:21-29、Okanami et al.(1996)Genes Cells 1:87-99、Goff et al.(1991)Genes Dev.5:298-309;Cho et al.(1999)Plant Mol.Biol.40:419-429、Ulmason et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:5844-5849、Sprenger-Haussels et al.(2000)Plant J.22:1-8、Gong et al.(1999)Plant Mol.Biol.41:33-44及びHobo et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15,348-15,353を参照されたい。
節因子及びヌクレアーゼを形成する。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質はDNA結合結合ドメイン及び切断(ヌクレアーゼ)ドメインを含む。したがって、遺伝子修飾は、ヌクレアーゼ、例えば、操作されたヌクレアーゼを使用して達成することができる。操作されたヌクレアーゼ技術は、天然に存在するDNA結合タンパク質の操作に基づく。例えば、目的に合わせたDNA結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの操作は、Chames et al.(2005)Nucleic Acids Res 33(20):e178;Arnould et al.(2006)J.Mol.Biol.355:443-458に記載されている。加えて、ZFPの操作もまた記載されている。例えば、米国特許第6,534,261号、同第6,607,882号、同第6,824,978号、同第6,979,539号、同第6,933,113号、同第7,163,824号及び同第7,013,219号を参照されたい。
Res:1-13,doi:10.1093/nar/gkt1224を参照されたい)。加えて、ヌクレアーゼドメインはまた、DNA結合機能性を示し得る。
、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII、及びI-TevIIIが挙げられる。それらの認識配列は周知である。米国特許第5,420,032号;米国特許第6,833,252号、Belfort et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388;Dujon et al.(1989)Gene 82:115-118、Perler et al.(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127、Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228、Gimble et al.(1996)J.Mol.Biol.263:163-180、Argast et al.(1998)J.Mol.Biol.280:345-353及びNew England Biolabsカタログもまた参照されたい。
et al.(2002)Molec.Cell 10:895-905、Epinat et al.(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962、Ashworth et al.(2006)Nature 441:656-659、Paques et al.(2007)Current Gene Therapy 7:49-66、米国特許公開第20070117128号、同第20060206949号、同第20060153826号、同第20060078552号及び同第20040002092号)。加えて、メガヌクレアーゼ由来の天然に存在するまたは操作されたDNA結合ドメインは、異種ヌクレアーゼ(例えば、FokI)由来の切断ドメインと作動可能に結合することができ、及び/またはメガヌクレアーゼ由来の切断ドメインは、異種DNA結合ドメイン(例えば、ZFPまたはTALE)と作動可能に結合することができる。
135-141、Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340、Isalan et al.(2001)Nature Biotechnol.19:656-660、Segal et al.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637、Choo et al.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインまたはTALEタンパク質は、天然に存在するタンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。操作方法としては、合理的設計及び様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、三重(または四重)ヌクレオチド配列及び個々のジンクフィンガーまたはTALEアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、ここで、各三重または四重ヌクレオチド配列は、特定の三重または四重配列に結合するジンクフィンガーまたはTALE繰り返し単位の1つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第6,453,242号及び同第6,534,261号を参照されたい。
る、任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来することができる。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、2つの融合タンパク質が切断に必要とされる。あるいは、2つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。2つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ(またはその機能的断片)に由来し得るか、または各切断ハーフドメインは異なるエンドヌクレアーゼ(またはその機能的断片)に由来することができる。加えて、2つの融合タンパク質の標的部位は、2つの融合タンパク質のそれらのそれぞれの標的部位への結合が、例えば、二量体化によって、切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にする互いに対して空間的配向で切断ハーフドメインを配置するように、互いに配設されていることが好ましい。これにより、ある特定の実施形態では、標的部位の近端部は、5~10個のヌクレオチドまたは15~18個のヌクレオチドだけ離間している。しかしながら、任意の整数個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が2つの標的部位の間に介在することができる(例えば、2~50個のヌクレオチド対以上)。一般に、切断部位は標的部位間にある。
89:4275-4279、Li et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768、Kim et al.(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887、Kim et al.(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982を参照されたい。これにより、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも1つのIIS型制限酵素由来の切断ドメイン(または切断ハーフドメイン)及び操作されてもされなくてもよい1つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
Iである。この特定の酵素は二量体として活性がある(Bitinaite et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95: 10,570-10,575)。したがって、本開示の目的のために、開示された融合タンパク質において使用されるFok I酵素の一部は切断ハーフドメインとみなされる。これにより、ジンクフィンガー-FokI融合を用いた細胞配列の標的化された二本鎖切断及び/または標的化された置換のために、それぞれがFokI切断ハーフドメインを含む2つの融合タンパク質は触媒活性切断ドメインを再構成するために使用することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメイン及び2つのFok I切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子もまた使用することができる。ジンクフィンガー-FokI融合物を用いた標的化された切断及び標的化された配列変更のためのパラメータは、本開示の他の場所に提供される。
oberts et al.(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420を参照されたい。
野生型FokI切断ハーフドメイン(配列番号1)
QLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF
配列番号1または図17に示される配列に対して番号付けされている。
ら中性の残基または負に荷電した残基に変更する。これらの実施形態のいずれでも、記載された変異体はまた、1つ以上の追加の変異を含むFokIドメイン中に作製され得る。好ましい実施形態では、これらの追加の変異は二量体化ドメイン、例えば、418、432、441、481、483、486、487、490、496、499、523、527、537、538及び/または559位にある。変異の非限定的な例には、393、394、398、416、421、422、442、444、472、473、478、480、525または530位における任意の切断ドメイン(例えば、FokIまたはFokIの相同体)の野生型残基の任意のアミノ酸残基(例えば、K393X、K394X、R398X、R416S、D421X、R422X、K444X、S472X、G473X、S472、P478X、G480X、K525X、及びA530Xであって、ここで、最初の残基は野生型を描写し、Xは野生型残基を置換する任意のアミノ酸を指す)との変異(例えば、置換)が挙げられる。いくつかの実施形態では、XはE、D、H、A、K、S、T、DまたはNである。他の例示的な変異には、S418E、S418D、S446D、K448A、I479Q、I479T、Q481A、Q481N、Q481E、A530E及び/またはA530Kが挙げられ、ここで、アミノ酸残基は、全長のFokI野生型切断ドメイン及びその相同体に対して番号付けされている(図17)。ある特定の実施形態では、組み合わせは、416及び422、416及びK448A、K448A及びI479Q、K448A及びQ481A及び/またはK448A位における変異ならびに525位における変異を含み得る。一実施形態では、416位の野生型残基がGlu(E)残基(R416E)と置換されていてもよく、422位の野生型残基がHis(H)残基(R422H)と置換されていてもよく、及び525位の型残基がAla(A)残基と置換されていてもよい。本明細書に記載される切断ドメインとしては、432、441、483、486、487、490、496、499、527、537、538及び/または559位におけるものが挙げられるが、これらに限定されない追加の変異、例えば、二量体化ドメイン変異体(例えば、ELD、KKR)及び/またはニッカーゼ変異体(触媒ドメインへの変異)含むことができる。本明細書に記載される変異を有する切断ハーフドメインは、当技術分野において周知のようなヘテロ二量体を形成する。
らに限定されない。Casタンパク質またはその断片、ならびにCasタンパク質またはその断片の誘導体を含むCasタンパク質は、細胞から得ることができるか、または化学的に合成され得るか、もしくはこれらの2つの手法の組み合わせによって得ることができる。この細胞は、Casタンパク質を自然に産生する細胞、あるいはCasタンパク質を自然に産生し、内因性Casタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、または外因的に導入された核酸(この核酸は、内因性Casと同じであるか、または異なるCasをコードする)からCasタンパク質を産生するように遺伝子操作されている細胞であり得る。場合によっては、この細胞は自然にはCasタンパク質を産生せず、Casタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、AAVベクターを介して送達するための小さなCas9オルソログである(Ran et al(2015)Nature 510,p.186)。
本明細書に記載のタンパク質(例えば、ヌクレアーゼ)、ポリヌクレオチド及び/またはタンパク質及び/またはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、タンパク質及び/またはmRNA成分の注入によることを含む、任意の好適な手段によって、標的細胞に送達され得る。
Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm(eds.)(1995)及びYu
et al.,Gene Therapy 1:13-26(1994)を参照されたい。
スキャップアナログ)キャップまたはその変異体が特に好ましい。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,074,596号及び同第8,153,773号を参照されたい。
46,787号及び米国特許第4,897,355号に記載されており、リポフェクチン試薬は、商業的に販売されている(例えば、Transfectam(商標)、Lipofectamine(商標)RNAiMAX)。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適であるカチオン性及び中性脂質には、Felgner、国際公開第91/17424号、国際公開第91/16024号のものが挙げられる。送達は、細胞に対して(エクスビボ投与)または標的組織に対して(インビボ投与)のものであり得る。
Res.52:4817-4820(1992)、米国特許第4,186,183号、同第4,217,344号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号及び同第4,946,787号を参照されたい)。
ene Ther.1:111-2(1997))。
et al.,Lancet 351:9117 1702-3(1998)、Kearns et al.,Gene Ther.9:748-55(1996))。AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV8.2、AAV9及びAAVrh10を含む他のAAV血清型ならびにAAV2/8、AAV2/5及びAAV2/6などのシュードタイプ化AAVもまた、本発明に従って使用することができる。
E1a、E1b、及び/またはE3遺伝子に取って代わるように操作され、その後、複製欠損ベクターがトランスでの欠失遺伝子機能を供給するヒト293細胞中に伝播させられる。Adベクターは、インビボで、肝臓、腎臓及び筋肉で見出されるものなどの非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織を形質導入することができる。従来のAdベクターは、大運搬能力を有する。Adベクターの臨床試験における使用の一例は、LTR筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を伴った(Sterman et al.,Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998))。アデノウイルスの遺伝子導入のための使用の追加の例としては、Rosenecker et al.,Infection 24:1 5-10(1996)、Sterman et al.,Hum.Gene Ther.9:7 1083-1089(1998)、Welsh et al.,Hum.Gene Ther.2:205-18(1995)、Alvarez et al.,Hum.Gene Ther.5:597-613(1997)、Topf et al.,Gene Ther.5:507-513(1998)、Sterman et al.,Hum.Gene Ther.7:1083-1089(1998)が挙げられる。
異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、リガンドをウイルスの外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質として発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、対象の細胞型に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Hanら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995))は、モロニーネズミ白血病ウイルスは、gp70に融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、この組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告している。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、かつウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現するウイルス-標的細胞対に拡大することができる。例えば、繊維状ファージを、実際上任意の選択された細胞受容体に対して特異的結合親和性を有する抗体断片(例えば、FABまたはFv)を発現するように操作することができる。上記説明は主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を、非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特異的標的細胞による取り込みを助ける特異的取込配列を含有するように操作することができる。
ed.1994)及び患者から細胞を単離し培養する方法の説明についてのその中に引用された参考文献を参照されたい)。
化することができるか、または哺乳動物(細胞のドナーなど)に導入することができる(ここでは、これらが骨髄に生着するであろう)という点にある。インビトロでCD34+細胞を、GM-CSF、IFN-γ及びTNF-αなどのサイトカインを用いて、臨床的に重要な免疫細胞型に分化させる方法が既知である(Inaba et al.,J.Exp.Med.176:1693-1702(1992)を参照されたい)。
物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞、例えばT細胞及び任意の型の細胞が挙げられるが、これらに限定されない任意の型の細胞で使用することができる。タンパク質発現に好適な細胞株は、当業者に既知であり、COS、CHO(例えば、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例えば、HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)、perC6、Spodoptera fugiperda(Sf)などの昆虫細胞、及びSaccharomyces、PichiaならびにSchizosaccharomycesなどの真菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞株の子孫、変異体及び誘導体も使用することができる。
操作されたヌクレアーゼの疾患の治療及び予防における使用は、今後何年間もの医薬品の最も重要な開発のうちの1つであると期待される。本明細書に記載の方法及び組成物は、所望の標的部位が切断の主たる場所になることを確実にするために、これらの新規ツールの特異性を増大させる働きをする。オフターゲット切断を最小化または排除することが、全てのインビトロ、インビボ及びエクスビボ応用のために、この技術の最大の可能性を実現するために必要であろう。
よって宿主生物中の感染及び/または拡大を予防することによって)。
の所望のDNA標的における同時切断がヌクレアーゼ対X+Yの活性を必要とするならば、本明細書に記載の変異の使用が、AとAとの、AとXとの、AとYとのなどの対形成を防止することができる。したがって、これらのFokI変異は、「不適正な」対形成の結果としての非特異的切断活性を減少させて、ヌクレアーゼのより効率的な直交的変異体対の生成を可能にする(共有特許の米国特許公開第20080131962号及び同第20090305346号を参照されたい)。
BCL11A及びTCRA(定常領域を標的化する、TRACとしても知られる)遺伝子を標的とするZFNを、本質的に、Urnov et al.(2005)Nature 435(7042):646-651、Perez et al(2008)Nature Biotechnology 26(7):808-816、及びPCT特許公開第WO2016183298号ならびにPCT公開第WO2017106528に記載されるように設計し、プラスミドベクターに組み込んだ。AAVS1標的化ZFNも、米国特許公開第20150110762号に記載されるように使用した。
FokI切断ドメインのモデル(Miller et al(2007)Nat Biotech 25(7):778-85)を用いて、正に荷電したアルギニンまたはリジンアミノ酸残基を、DNA主鎖上のリン酸と潜在的に相互作用することを特定した(図1)。
Browser配列データベースのhg38アセンブリに該当する座標が列挙されている)(Kent et al(2002)、Genome Res.12(6):996-1006)。
774_KKRを用いての実験も実施した(米国特許公開第US-2017-0211075-A1号)。これらの実験は、K562細胞で行われ、ここでは細胞を、各ZFNをコードするmRNAの100ngまたは400ngのいずれかで処理した。ZFN対は、表2に以下に開示する1つの変異型パートナーと、1つの非変異型パートナーとからなった。これらの実験では、図1で特定された全ての正に荷電したアミノ酸をセリン(S)に変異させた。簡単に言うと、2×10e5個の細胞を、トランスフェクションごとに使用し、ここでは、mRNAを、Amaxa 96ウェルシャトル系の使用を介して細胞に送達させた。トランスフェクトされた細胞をトランスフェクションから3日後に採取し、標準的な方法によりMiSeq(Illumina)解析に対して処理した。データを以下の表2に示し、変異のうちのいくつかが、堅調なオンターゲット活性を維持し、一方他のもの(例えば、図1で活性部位残基として特定された52742 ELD_K469S)は、切断活性をノックアウトした。
以前の研究は、ジンクフィンガー「主鎖」(DNAヌクレオチドの部位特異的認識に関与しない構造の領域)中の正に荷電したアミノ酸残基と、DNA分子上のリン酸との間になんらかの相互作用があり得ることを示唆している(Elrod-Erickson etal、同書)(図5Aを参照されたい)。-14、-9、及び-5位におけるアミノ酸(全て、アルファヘリックス領域の従来の番号付けに対して)は、正に荷電することが多く、DNA主鎖内の負に荷電したリン酸と相互作用し得る(図5Bを参照されたい)。したがって、4867個のジンクフィンガー配列を、フィンガー配列内の各位置におけるアミノ酸残基の存在について解析した(図6を参照されたい)。-5位において、中性アミノ酸のアラニン、ロイシン及びグルタミンを、低い頻度であるが、ゼロではない頻度で観察し、したがって、これらのアミノ酸をフィンガー主鎖の修飾において使用した。6位及び5位のフィンガーZFPもまた、潜在的置換と共に特定した(図7A及び7B)。
質は、フィンガー1の-5位でのアルギニンがグルタミンに変更された変異体を示している。表の最上部は、活性をインデル%として表示し、表の下半分は、活性を親ZFN対52774/52742の2つの複製物の活性の平均に対する割合として示している。これらの実験は、これらの変異が、オフターゲット切断に及ぼす影響を有し得ることを示した。例えば、オンターゲット切断は、52742-F1RQ;F3RQ;F5RQ変異体について堅調なレベルで維持されたが(6μgの用量において、親タンパク質についての62.59%の活性と比較して、69.96%のオンターゲット活性)、オフターゲット切断は低下した(OT16は、親タンパク質について19.16%、及び三重変異体では1.43%の切断活性を示した)。
の3つのモジュールが左側または右側ZFNにおいて変異された状態の2つの可能性の平均である。灰色バーによって示されるオフターゲットデータについては、オフターゲットデータセット内の単一または二重変異についてのプールが、それぞれ18個のデータ点を含むように、3つのオフターゲット部位からのデータが組み合わされた以外は、同様なプールが作製された。これらの変異は、オフターゲット活性における最大4.8倍の減少をもたらした。
きる。「NELD」及び「CKKR」という表示は、FokIヌクレアーゼドメインの型(「ELD」または「KKR」FokIドメイン変異体のいずれか)及びベクターの他の態様を示す(PCT公開第WO2017/136049号を参照されたい)。表6Aは、SBS#51857誘導体パートナー中で作製された変異の、SBS#51949パートナー、またはモジュールA、B、及びC内の-5位においてN末端フィンガー中のQに挿入された変更を含むSBS#51949パートナー(このパートナーは、FokIドメイン中bにR416S変異をさらに含む)のいずれかとの対形成を示し、ここでは、実験は、各ZFNをコードするmRNAの2μgを用いて行った。これらの実験はまた、SBS#51949タンパク質における変異を用いて行われ(表6Bを参照されたい)、ここでは、FokIドメインのアミノ酸と相互作用するリン酸中の変異を、主鎖変異と組み合わせて試験した。これらのデータは、追加の変更が、ZFN対の特異性に及ぼす影響を有することができることを示した。
(R->Q)対を用いて繰り返した。表6Dから分かるように、結果は高い再現性があった。
ZFN対の各パートナーを個々に漸増することは、各ZFNパートナーの最適な濃度の決定を可能にし、これによって、オフターゲット修飾を最小化しながら、対による最大のオンターゲット修飾を有すること可能にする。各個々のZFNハーフドメインは、その同族のDNA標的に結合するその独自の動態を有することができ、そのため、それぞれの別々の漸増を通して、最適な活性を達成することができる。したがって、BCL11A特異的対SBS#51949/SBS#51857を、誘導されるZFNをmRNAとして用いるCD34+細胞における漸増試験に使用し、ここでは、高濃度のZFNを用いて、オフターゲット切断の検出を可能にした。実験(以下の表7)は、SBS#51857パートナーの漸増が、堅牢なオンターゲット切断を維持しながら、オフターゲット切断の減少(およそ8倍)をもたらすことを見出した。例えば、60μg/mLの51949のmRNAが6.6μg/mLの51857のmRNAと組み合わせて使用するとき、オンター
ゲット修飾は、60μg/mLの各ZFNを使用した場合とほぼ同じままであり(それぞれ60μg/mLを使用するとき76.1%インデルであり、60μg/mLの51949を6.6μg/mLの51857と組み合わせて使用するとき、78.3%インデルである)、一方、総オフターゲットは、32.4%インデルから4.0%になった。両方のZFNへのmRNA投入を減少させることが、オンターゲット修飾における段階的低下を等しくもたらしたが、一方オフターゲット修飾は、オンターゲット修飾が低減されると実質的に低減したに過ぎないことに留意されたい。
次に、例示的なFokI変異と組み合わされたZFNパートナー漸増の活性を測定するために分析を行った。Fok変異を含むBCL11Aに特異的なZFNを上記に示した比で用いて、オフターゲット切断を減少させながらオンターゲット活性を保持した。実験をCD34+細胞において行い、そこでは細胞を、ZFNをコードするmRNAでトランスフェクトした。データを以下の表8に示す。「オン/オフ比」は、指示され試料についての、オンターゲットの組み合わされた全てのオフターゲット活性に対する比を示す。6.6μg/mLのSBS#51857と60μg/mLのSBS#51949-R416S
FokI変異体との組み合わせは、全ての5つの監視されたオフターゲット部位における活性を劇的に低下させながらオンターゲット活性の同様なレベルをもたらし(60μg
の両方の親ZFNに対して84.85%対78.17%)、オンターゲット/オフターゲット比における32倍の改善をもたらした(60μg/mLの各親ZFNに対して89.52対2.76)。
我々は、実施例3に記載されたジンクフィンガー主鎖変異を、実施例2に記載されたFokIリン酸接触変異と共に含むZFNも生成した。この組み合わせを、CD34+細胞
中で、BCL11Aに特異的なZFN対を2つの用量:6μgまたは2μgで用いて試験した。結果が以下の表9に提示され、これらの2つの種類のアプローチを組み合わせると
、オフターゲット活性の量に著しく影響を与えることができることを示している。この表では、主鎖変異は、モジュールごとの変異の種類として示されている(A、B及び/またはC、図7を参照)。例えば、51949LeuABC R416Sと標示された試料では、タンパク質は、フィンガー1(モジュールA)、フィンガー3(モジュールB)、及びフィンガー5(モジュールC)中にR->L主鎖置換を含み、R416S FokI変異をさらに保有した。いくつかの例では、完全なオンターゲット活性を保持しながら検出可能なオフターゲット活性を有さないZFN対が存在した。これらの例を、表9において四角で囲んでいる。
最適なパートナーの漸増を、ZFP主鎖変異及びZFN FokI変異を含むZFNと組み合わせる場合の活性測定も行う。ZFNを、上述したようにCD34+細胞中で試験し、オフターゲット活性の減少レベルを通して、ZFN対の特異性の増加を示す。
BCL11A変異体対SBS63014/SBS65722の特異性を、臨床試験用に細胞物質を生成するのに好適である大規模な手順においても試験した。簡単に言うと、ロ
ット当たりおよそ9500万~1億3000万個のCD34+細胞を、Maxcyteデバイスを用いて、製造元の仕様書に従って導入した。80μg/LのSBS63014のmRNA及び20μg/mLのSBS#65722のmRNAを使用し、細胞を、2日後に、無作為のキャプチャーアッセイを用いてオフターゲット切断についてアッセイした。
特異性試験を、上述したような様々な変異を有するAAVS1標的化ZFNを用いても行った。特に、米国特許公開第20150110762号に記載されるようなZFN SBS#30035及びSBS#30054を、二量体化変異体(例えば、ELD、KKR、及び追加の変異体)、他の変異(例えば、Sharkey)ならびに上述したような活性アッセイにおけるリン酸接触変異体を含む様々な変異体の試験し使用した。
異体ELD、KKR、及びELD-KKRのオンターゲットのオフターゲットに対する比を示す。ELD_S418D、ELD_N476D、ELD_I479T、ELD_Q481E、ELD_N527D、及びELD_Q531R変異体による結果も示している。
本明細書に組み込まれる。
Claims (14)
- 操作されたFokI切断ハーフドメインであって、前記操作された切断ハーフドメインが、残基393、394、398、416、421、422、442、444、472、473、478、480、525、または530において1つ以上の変異を含むか、あるいは、その中で418位における野生型残基が、Glu(E)またはAsp(D)残基で置換されるか、446位における野生型残基が、Asp(D)残基で置換されるか、448位における野生型残基が、Ala(A)残基で置換されるか(K448A)、479位における野生型残基が、Gln(Q)またはThr(T)残基で置換されるか(I479QまたはI479T)、481位における野生型残基が、Ala(A)、Asn(N)、またはGlu(E)残基で置換されるか(Q481A、Q481N、Q481E)、523位における野生型残基が、Phe(F)残基で置換されており、前記アミノ酸残基が、配列番号1に示される完全長FokI野生型切断ドメインに対して番号付けされる、前記操作されたFokI切断ハーフドメイン。
- 残基416及び422における変異、416位における変異及びK448A、K448AならびにI479Q、K448A及びQ481Aならびに/またはK448A及び525位における変異を含む、請求項1に記載の操作された切断ハーフドメイン。
- 前記416位における野生型残基が、Glu(E)残基で置換され(R416E)、前記422位における野生型残基が、His(H)残基で置換され(R422H)、かつ前記525位における野生型残基が、Ala(A)残基で置換されている、請求項2に記載の操作された切断ハーフドメイン。
- 432、441、483、486、487、490、496、499、527、537、538及び559位のうちの1つ以上において追加のアミノ酸変異をさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の操作された切断ハーフドメイン。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の第1の操作された切断ハーフドメインと、第2の切断ハーフドメインとを含む、ヘテロ二量体。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の操作された切断ハーフドメインと、DNA結合ドメインとを含む、人工ヌクレアーゼ。
- 前記DNA結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質、TALEエフェクタードメイン、またはシングルガイドRNA(sgRNA)を含む、請求項6に記載の人工ヌクレアーゼ。
- 前記ジンクフィンガータンパク質が、-14位、-9位、及び-5位において1つ以上の変異を含む、請求項7に記載の人工ヌクレアーゼ。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の前記操作された切断ハーフドメイン、請求項5に記載の前記第1及び第2の操作された切断ドメイン、または請求項6~8のいずれか一項に記載の人工ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含む単離された細胞。
- ゲノム細胞クロマチンを対象領域において切断するための方法であって、前記方法が、請求項6~8のいずれか一項に記載の操作された切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼを細胞内で発現させることを含み、
前記ヌクレアーゼが、前記ゲノム細胞クロマチンの前記対象領域内でヌクレオチド配列を部位特異的に切断する、前記方法。 - 前記細胞を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含み、前記細胞クロマチンの切断が、前記ドナーポリペプチドと前記細胞クロマチンとの間の相同組換えを容易にする、請求項11に記載の方法。
- ゲノム細胞クロマチンにおける少なくとも2つの標的部位を切断する方法であって、前記方法が、
ゲノム細胞クロマチンにおける少なくとも第1及び第2の標的部位を切断することを含み、
各標的部位が、請求項6~8のいずれか一項に記載の人工ヌクレアーゼを含む組成物を用いて切断される、前記方法。 - 請求項6~8のいずれか一項に記載の人工ヌクレアーゼによって作製された、少なくとも1つの部位特異的ゲノム修飾を含む、単離された細胞または細胞株。
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