ES2896298T3 - Composiciones y métodos para inhibir la expresión génica de LPA - Google Patents
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Abstract
Un agente de interferencia de ARN (ARNi) de LPA (lipoproteína(a) que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende la secuencia de una cualquiera de la SEQ ID NO:1280, SEQ ID NO:1282, SEQ ID NO:1246, SEQ ID NO:1242, SEQ ID NO:1244, o SEQ ID NO:1254, y donde la cadena sentido comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia de la cadena sentido.
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para inhibir la expresión génica de LPA
ANTECEDENTES
La lipoproteína(a) [Lp(a)] es una partícula tipo lipoproteína de baja densidad heterogénea que contiene un núcleo lípido y una apolipoproteína B (apoB-100) con un componente único, la apolipoproteína (a) (apo(a)), que se une a apoB-100 a través de un enlace disulfuro.
El gen de apo(a) (LPA) se expresa predominantemente en el hígado y la expresión se limita a los primates humanos y no humanos. Los niveles de Lp(a) en los seres humanos se definen genéticamente y no cambian significativamente con la dieta, el ejercicio u otros cambios en el estilo de vida. LPA varía en su longitud dependiendo de la cantidad de dominios Kringle KIV2 presentes y su expresión se correlaciona inversamente con la cantidad de dominios presentes. Los niveles normales de Lp(a) varían de 0.1 a 25 mg/dl y aproximadamente el 25% de la población de Estados Unidos de América tiene niveles de Lp(a) de 30 mg/dl o más.
El análisis de los niveles de Lp(a) en varios estudios relaciona los altos niveles de Lp(a) como un factor de riesgo independiente de enfermedades cardiovasculares, infarto y otros trastornos relacionados tales como estenosis aterosclerótica. Además, los análisis de asociación del genoma completo también relacionan al LPA como un factor de riesgo genético de enfermedades tales como la estenosis aterosclerótica.
Tadin-Strapps et al., 2015, J. Cardiovasc. Transl. Res.8, 44-53 describe ARNic formulados en nanopartículas lipídicas que se dirigen a los genes LPA para estudiar el papel de la lipoproteína(a) en ateroesclerosis en primates no humanos.
Al usar la aféresis de lipoproteína terapéutica para reducir los niveles de tanto Lp(a) como LDL en pacientes hiperlipidémicos, se observan reducciones significativas de los eventos cardiovasculares.
Por lo tanto, existe la necesidad de agentes terapéuticos y tratamientos relacionados con estas y otras enfermedades relacionadas con el gen de LPA.
COMPENDIO
La invención se define en las reivindicaciones.
La presente invención se refiere a un agente de interferencia de ARN (ARNi) de LPA que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, donde la cadena sentido comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO:1280, SEQ ID NO:1282, SEQ ID NO:1246, SEQ ID NO:1242, SEQ ID NO:1244, o SEQ ID NO:1254, y donde la cadena sentido comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia de la cadena sentido.
Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el agente de ARNi de LPA de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también se refiere a un agente de ARNi de LPA de la presente invención para su uso en un método para inhibir la expresión de un gen de LPA en un sujeto.
La presente invención también incluye el agente de ARNi de LPA de la presente invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad cardiovascular en un sujeto con necesidad de ello.
La presente invención también incluye el agente de ARNi de LPA de la presente invención para su uso en el tratamiento de enfermedad de Berger, enfermedad arterial periférica, enfermedad arterial coronaria, síndrome metabólico, síndrome coronario agudo, estenosis de la válvula aórtica, regurgitación de la válvula aórtica, disección aórtica, oclusión de la arteria retiniana, enfermedad cerebrovascular, isquemia mesentérica, oclusión arterial mesentérica superior, estenosis arterial renal, angina estable/inestable, síndrome coronario agudo, hipercolesterolemia familiar heterocigota u homocigota, hiperapobetalipoproteinemia, ateroesclerosis cerebrovascular, enfermedad cerebrovascular y trombosis venosa en un sujeto con necesidad de ello.
En la presente se describen agentes de interferencia de ARN (ARNi) (también denominados desencadenantes de ARNi o desencadenantes) de LPA (también denominado apo(a)) y composiciones que contienen agentes de ARNi de LPA para inhibir de forma selectiva y eficaz la expresión del gen de LPA. LPA es el nombre del gen que codifica la apolipoproteína (a) (apo(a)), un componente clave de la partícula de lipoproteína (a) (Lp(a)). Los agentes de ARNi de LPA que se describen
en la presente pueden usarse para prevenir o tratar o preparar un medicamento para prevenir o tratar enfermedades que incluyen, de modo no taxativo: Enfermedad de Berger, enfermedad arterial periférica, enfermedad arterial coronaria, síndrome metabólico, síndrome coronario agudo, estenosis de la válvula aórtica, regurgitación de la válvula aórtica, disección aórtica, oclusión de la arteria retiniana, enfermedad cerebrovascular, isquemia mesentérica, oclusión arterial mesentérica superior, estenosis arterial renal, angina estable/inestable, síndrome coronario agudo, hipercolesterolemia familiar heterocigota u homocigota, hiperapobetalipoproteinemia, ateroesclerosis cerebrovascular, enfermedad cerebrovascular y trombosis venosa.
Cada agente de ARNi de LPA incluye al menos una cadena sentido y una cadena antisentido. La cadena sentido y la cadena antisentido pueden ser parcialmente, sustancialmente o completamente complementarias entre sí. La longitud de las cadenas sentido y antisentido del agente de ARNi que se describen en la presente puede ser cada una de 17 a 30 nucleótidos. En algunas modalidades, las cadenas sentido y antisentido son independientemente de 17 a 26 nucleótidos de longitud. Las cadenas sentido y antisentido pueden tener la misma longitud o tener longitudes diferentes. Los agentes de ARNi que se describen en la presente, al suministrarse a una célula que expresa el gen de LPA, inhiben la expresión del gen de LPA in vitro o in vivo.
Una cadena sentido de un agente de ARNi de LPA comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 90% de identidad en un tramo central de al menos 17 nucleótidos consecutivos con una secuencia en un ARNm de LPA. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos de la cadena sentido con al menos 90% de identidad con una secuencia en el ARNm de LPA tiene 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 nucleótidos de longitud. Una cadena antisentido de un agente de ARNi de LPA comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 90% de complementariedad en un tramo central de al menos 16 nucleótidos consecutivos con una secuencia en el ARNm de LPA y la cadena sentido correspondiente. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos de la cadena antisentido con al menos 90% de complementariedad con una secuencia en el ARNm de LPA o la cadena sentido correspondiente tiene 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 nucleótidos de longitud.
En algunas modalidades, uno o más agentes de ARNi de LPA se suministran a las células o tejidos diana a través de cualquier tecnología de suministro de oligonucleótidos conocida en la técnica. Los métodos de suministro de ácidos nucleicos incluyen, de modo no taxativo, encapsulación en liposomas, iontoforesis, o incorporación en otros vehículos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, vectores proteináceos o Dynamic Polyconjugates™ (DPC (véase, por ejemplo, WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011/104169, y WO 2012/083185)). En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA se conjuga con un grupo diana. En algunas modalidades, el grupo diana puede incluir un ligando receptor celular, tal como un conjunto de galactosa, incluyendo un conjunto de galactosa que comprende un trímero de N-acetil-galactosamina.
En algunas modalidades se describen composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más agentes de ARNi de LPA. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA se combina opcionalmente con uno o más agentes terapéuticos adicionales (es decir, segundo, tercero, etc.). Un agente terapéutico adicional puede ser otro agente de ARNi de LPA (por ejemplo, un agente de ARNi de LPA que se dirige a una secuencia diferente dentro de la diana de LPA). Un agente terapéutico adicional también puede ser un fármaco de molécula pequeña, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y/o una vacuna. Los agentes de ARNi de LPA, con o sin el uno o más agentes terapéuticos adicionales, pueden combinarse con uno o más excipientes para formar composiciones farmacéuticas.
En algunas modalidades, se describen las composiciones para suministrar un agente de ARNi de LPA a una célula hepática, particularmente hepatocitos, en vivo, que comprenden: un agente de ARNi de LPA conjugado con un grupo diana. En algunas modalidades, el grupo diana es un ligando de asialoglicoproteína.
También se describen métodos para tratar a un sujeto humano con un estado patológico o en riesgo de desarrollar un estado patológico mediado al menos en parte por la expresión de LPA, donde los métodos comprenden el o los pasos de administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi de LPA o una composición que contiene un agente de ARNi de LPA. El método para tratar a un sujeto con un agente de ARNi de LPA o una composición que contiene un agente de ARNi de LPA puede combinarse opcionalmente con uno o más pasos de administrar uno o más agentes terapéuticos o tratamientos adicionales (es decir, un segundo). El agente de ARNi de LPA y los agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse en una composición única o pueden administrarse de forma separada. Los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales incluyen, de modo no taxativo, inhibidores (cepas) de reductasa HMg Co-A, ezetimiba, inhibidores de PCSK-9, inhibidores de CTEP, terapias que se dirigen a ANGPTL3, terapias que se dirigen a APOC3 y niacina.
Los agentes de ARNi de LPA descritos pueden usarse en métodos para la prevención o tratamiento terapéutico de enfermedades, que incluyen, de modo no taxativo: Enfermedad de Berger, enfermedad arterial periférica, enfermedad arterial coronaria, síndrome metabólico, síndrome coronario agudo, estenosis de la válvula aórtica, regurgitación de la
válvula aórtica, disección aórtica, oclusión de la arteria retiniana, enfermedad cerebrovascular, isquemia mesentérica, oclusión arterial mesentérica superior, estenosis arterial renal, angina estable/inestable, síndrome coronario agudo, hipercolesterolemia familiar heterocigota u homocigota, hiperapobetalipoproteinemia, ateroesclerosis cerebrovascular, enfermedad cerebrovascular y trombosis venosa. Tales métodos comprenden la administración de un agente de ARNi de LPA tal como se describe en la presente a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano o animal.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de varias formas, dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratarse. La administración puede realizarse de cualquier forma conocida en la técnica, tal como, de modo no taxativo, tópica (por ejemplo, mediante un parche transdérmico), pulmonar (por ejemplo, mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante un nebulizador, intratraqueal, intranasal), epidérmica, transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye, de modo no taxativo, inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; administración subdérmica (por ejemplo, a través de un dispositivo implantado), intracraneal, intraparenquimal, intratecal e intraventricular. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente se administran mediante inyección subcutánea.
Las composiciones y/o agentes de ARNi de LPA descritos pueden usarse en los métodos para el tratamiento terapéutico de enfermedades, incluyendo, de modo no taxativo: Enfermedad de Berger, enfermedad arterial periférica, enfermedad arterial coronaria, síndrome metabólico, síndrome coronario agudo, estenosis de la válvula aórtica, regurgitación de la válvula aórtica, disección aórtica, oclusión de la arteria retiniana, enfermedad cerebrovascular, isquemia mesentérica, oclusión arterial mesentérica superior, estenosis arterial renal, angina estable/inestable, síndrome coronario agudo, hipercolesterolemia familiar heterocigota u homocigota, hiperapobetalipoproteinemia, ateroesclerosis cerebrovascular, enfermedad cerebrovascular y trombosis venosa. Tales métodos comprenden la administración de un agente de ARNi de LPA tal como se describe en la presente a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano o animal.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Si bien pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o experimentación de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva incluyendo definiciones, regirá. Adicionalmente, los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser taxativos.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Gráfica que ilustra los niveles de proteína de Lp(a) en suero en ratones transgénicos (Tg) Lp(a) luego de una única administración subcutánea de 0.5 mg/kg (línea punteada) o 2 mg/kg (línea continua) del agente de ARNi de LPA indicado. Los niveles de Lp(a) se normalizaron al día 1 y al control salino.
FIG. 2. Gráfica que ilustra los niveles de proteína de Lp(a) en suero en ratones Tg Lp(a) luego de la administración de tres dosis subcutáneas de 1 mg/kg (línea punteada) o 3 mg/kg (línea continua) del agente de ARNi de LPA indicado, administradas una vez a la semana durante tres semanas (dosis en los días 1,8 y 15). Los niveles de Lp(a) se normalizaron al día 1 y al control salino.
FIG. 3. Gráfica que ilustra los niveles de partículas de Lp(a) en suero de mono cinomolgo luego de la administración de una dosis única de 2 mg/kg de agente de ARNi de LPA AD01196 1:1 (p/p) con el polímero de suministro el día 1. Los niveles de Lp(a) se normalizaron hasta dos valores previos a la dosis (que se muestran como el día 0).
FIG. 4. Gráfica que ilustra los niveles de partículas de Lp(a) en suero de mono cinomolgo luego de la administración de 4 mg/kg o 6 mg/kg de agente de ARNi de LPA 1:1 (p/p) con el polímero de suministro el día 1 y el día 71. Los niveles de Lp(a) se normalizaron hasta dos valores previos a la dosis (que se muestran como el día 0). Dosis de 4 mg/kg = círculos negros; dosis de 6 mg/kg = círculos grises.
FIG. 5. Gráfica que ilustra los niveles de partículas de Lp(a) en suero de mono cinomolgo luego de tres dosis subcutáneas semanales de 3 mg/kg de agente de ARNi de LPA AD02819 el día 1,8 y 15. Los niveles de Lp(a) se normalizaron hasta tres valores previos a la dosis (que se muestran como el día 0).
FIG. 6. Gráfica que ilustra los niveles de partículas de Lp(a) en suero de mono cinomolgo luego de una administración subcutánea única de 3 mg/kg de agente de ARNi el día 1. Los grupos AD03460 y AD03536 recibieron una dosis adicional
de 1 mg/kg de agente de ARNi de LPA el día 48. Los niveles de Lp(a) se normalizaron hasta tres valores previos a la dosis (que se muestran como el día 0).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En la presente se describen agentes de ARNi para inhibir la expresión del gen de LPA (que se refieren en la presente como agentes de ARNi de LPA). Los agentes de ARNi que se describen en la presente, tras ser suministrados a una célula que expresa el gen LPA, inhiben o inactivan la expresión de LPA in vitro y/o in vivo a través del proceso biológico de interferencia de ARN (ARNi). Tal como se usa en la presente, a menos que se indique específicamente lo contrario, LPA puede referirse a un gen LPA, un ARNm LPA o una proteína LP(a), tal como corresponda.
Un agente de ARNi de LPA comprende una cadena sentido y una cadena antisentido. La cadena sentido y la cadena antisentido, cada una, contienen una secuencia de núcleo de 17-23 nucleobases de longitud. Una secuencia de núcleo de una cadena antisentido es 100% (perfectamente) complementaria o al menos 90% (sustancialmente) complementaria con una secuencia de nucleótidos (a veces referida como, por ejemplo, una secuencia diana) presente en un ARNm de LPA. Una secuencia de núcleo de la cadena sentido es 100% (perfectamente) complementaria o al menos 90% (sustancialmente) complementaria con una secuencia en la cadena antisentido y por lo tanto la secuencia de núcleo de la cadena sentido es perfectamente idéntica o al menos 90% idéntica a una secuencia de nucleótidos (secuencia diana) presente en el ARNm de LPA. Una secuencia de núcleo de la cadena sentido puede tener la misma longitud que una secuencia de núcleo antisentido correspondiente o puede tener una longitud distinta. En algunas modalidades, la secuencia de núcleo de la cadena antisentido tiene 17, 18, 19, 20, 21, 22, o 23 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la secuencia de núcleo de la cadena sentido tiene 17, 18, 19, 20, 21,22, o 23 nucleótidos de longitud.
Las cadenas sentido y antisentido del agente de ARNi de LPA se hibridan para formar un dúplex. Una cadena sentido y una cadena antisentido de un agente de ARNi de LPA son parcialmente, sustancialmente o completamente complementarias entre sí. Dentro de la región dúplex complementaria, la secuencia de núcleo de cadena sentido es al menos 90% complementaria o 100% complementaria con la secuencia de núcleo antisentido. En algunas modalidades, la secuencia de núcleo de cadena sentido contiene una secuencia de al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20 o al menos 21 nucleótidos que es al menos 90% o 100% complementaria con una secuencia correspondiente de 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos de la secuencia de núcleo de cadena antisentido (es decir, las secuencias de núcleo antisentido y de cadena sentido de un agente de ARNi de LPA tienen una región de al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20 o al menos 21 nucleótidos que es al menos 90% pares de bases o 100% pares de bases).
Tal como se usa en la presente y a menos que se indique lo contrario, el término "complementaria", cuando se utiliza para describir a una primera secuencia de nucleótidos (por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi o ARNm de LPA) en relación con una segunda secuencia de nucleótidos (por ejemplo, la cadena antisentido del agente de ARNi), se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos de hibridar (formar enlaces de hidrógeno de pares de bases) y formar un dúplex o una estructura helicoidal doble en determinadas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos. Las secuencias complementarias incluyen pares de bases de Watson-Crick o pares de base no de Watson-Crick e incluyen nucleótidos naturales o modificados o imitaciones de nucleótidos siempre que se cumplan con los requisitos mencionados anteriormente relativos a su capacidad de hibridar. "Perfectamente complementaria" o "completamente complementaria" se refiere a que todas (100%) las bases en una secuencia contigua de un primer polinucleótido se hibridarán con la misma cantidad de bases en una secuencia contigua de un segundo polinucleótido. La secuencia contigua puede comprender toda o una parte de una primera o segunda secuencia de nucleótidos. Tal como se usa en la presente, "parcialmente complementaria" se refiere a que en un par hibridado de secuencias de nucleobases, al menos 70% de las bases en una secuencia contigua de un primer polinucleótido se hibridarán con la misma cantidad de bases en una secuencia contigua de un segundo polinucleótido. Tal como se usa en la presente, "sustancialmente complementaria" se refiere a que en un par hibridado de secuencias de nucleobases, al menos 85% de las bases en una secuencia contigua de un primer polinucleótido se hibridarán con la misma cantidad de bases en una secuencia contigua de un segundo polinucleótido. Los términos "complementaria", "completamente complementaria" y "sustancialmente complementaria" tal como se usan en la presente pueden usarse respecto de la coincidencia de bases entre la cadena sentido y la cadena antisentido de un agente de ARNi o entre la cadena antisentido de un agente de ARNi y una secuencia de un ARNm de LPA. La complementariedad o identidad de secuencia es independiente de las modificaciones. Con el fin de determinar la identidad o complementariedad, por ejemplo, a y Af son complementarios con U (o T) e idénticos a A.
Las longitudes de las cadenas sentido y antisentido del agente de ARNi de LPA descritas en la presente tienen independientemente de 17 a 30 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, las cadenas sentido y antisentido tienen independientemente de 19 a 26 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, las cadenas sentido y antisentido tienen de 19 a 26 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, las cadenas sentido y antisentido del agente de ARNi descritas tienen independientemente de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o 26 nucleótidos de longitud. Las cadenas sentido y
antisentido pueden tener la misma longitud o tener longitudes diferentes. En algunas modalidades, una cadena sentido y una cadena antisentido tienen cada una 26 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, una cadena sentido tiene 23 nucleótidos de longitud y una cadena antisentido tiene 21 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, una cadena sentido tiene 22 nucleótidos de longitud y una cadena antisentido tiene 21 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, una cadena sentido tiene 21 nucleótidos de longitud y una cadena antisentido tiene 21 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, una cadena sentido tiene 19 nucleótidos de longitud y una cadena antisentido tiene 21 nucleótidos de longitud.
La cadena sentido y/o la cadena antisentido pueden contener opcional e independientemente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos adicionales (extensión) en el extremo 3', el extremo 5', o tanto los extremos 3' y 5' de las secuencias de núcleo. Los nucleótidos adicionales de la cadena antisentido, si están presentes, pueden o no ser complementarios respecto de la secuencia correspondiente en el ARNm de LPA. Los nucleótidos adicionales de la cadena sentido, si están presentes, pueden o no ser idénticos a la secuencia correspondiente en el ARNm de LPA. Los nucleótidos adicionales de la cadena antisentido, si están presentes, pueden o no ser complementarios respecto de los nucleótidos adicionales de la cadena sentido correspondientes, si están presentes.
Tal como se usa en la presente, una extensión comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos en el extremo 5' y/o 3' de la secuencia de núcleo de cadena sentido y/o la secuencia de núcleo de cadena antisentido. Los nucleótidos de extensión en una cadena sentido pueden o no ser complementarios con los nucleótidos, ya sea los nucleótidos de la secuencia de núcleo o los nucleótidos de extensión, en la cadena antisentido correspondiente. En cambio, los nucleótidos de extensión en una cadena antisentido pueden o no ser complementarios con los nucleótidos, ya sea los nucleótidos de la secuencia de núcleo o los nucleótidos de extensión, en la cadena sentido correspondiente. En algunas modalidades, tanto la cadena sentido y la cadena antisentido de un agente de ARNi contienen extensiones 3' y 5'. En algunas modalidades, uno o más de los nucleótidos de extensión 3' de una cadena forma pares de bases con uno o más nucleótidos de extensión 5' de la otra cadena. En otras modalidades, uno o más de los nucleótidos de extensión 3' de una cadena no forman pares de bases con uno o más nucleótidos de extensión 5' de la otra cadena. En algunas modalidades, el agente de ARNi de LPA tiene una cadena antisentido con una extensión 3' y una cadena sentido con una extensión 5'.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido con una extensión 3' de 1, 2, 3, 4, 5, o 6 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido con una extensión 3' de 1, 2, o 3 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, uno o más de los nucleótidos de extensión de la cadena antisentido comprenden nucleótidos de uracilo o timidina o nucleótidos que son complementarios con la secuencia de ARNm de LPA correspondiente. En algunas modalidades, una extensión de cadena antisentido 3' incluye o está formada por, de modo no taxativo: Ab, AbAb, AUA, UGCUU, CUG, UG, UGCC, CUGCC, CGU, CUU, UGCCUA, CUGCCU, UGCCU, UGAUU, GCCUAU, T, TT (cada uno como 5' a 3').
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido con una extensión 5' de 1, 2, 3, 4, o 5 nucleótidos de longitud. En otras modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido con una extensión 5' de 1 o 2 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, uno o más de los nucleótidos de extensión de la cadena antisentido comprende nucleótidos de uracilo o timidina o nucleótidos que son complementarios con la secuencia de ARNm de LPA correspondiente. En algunas modalidades, la extensión de cadena antisentido 5' incluye o está formada por, de modo no taxativo, UA, TU, U, T, CUC (cada uno como 5' a 3'). Una cadena antisentido puede tener cualquiera de las extensiones 3' que se describen anteriormente en combinación con cualquiera de las extensiones de la cadena antisentido 5' que se describen, si están presentes.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena sentido con una extensión 3' de 1, 2, 3, 4, o 5 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, uno o más de los nucleótidos de extensión de la cadena sentido comprende nucleótidos de adenosina, uracilo o timidina, dinucleótido AT o nucleótidos que corresponden con los nucleótidos en la secuencia de ARNm de LPA. En algunas modalidades, la extensión de cadena sentido 3' incluye o está formada por, de modo no taxativo: T, UUAb, UAb, Ab, UT, TT, UUT, TTT, o TTTT (cada uno como 5' a 3').
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena sentido con una extensión 5' de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, uno o más de los nucleótidos de extensión de la cadena sentido comprende nucleótidos de uracilo o adenosina, o nucleótidos que corresponden con los nucleótidos en la secuencia de ARNm de LPA. En algunas modalidades, la extensión 5' de la cadena sentido puede ser, de modo no taxativo: CA, AUAGGC, AUAGG, AUAG, AUA, A, AA, AC, GCA, GGCA, GGC, UAUCA, UAUC, Ab, UCA, UAU (cada uno como 5' a 3'). Una cadena sentido puede tener una extensión 3' y/o una extensión 5'.
En las Tablas 1,2A, 2B, 3A y 3B se proporcionan ejemplos de secuencias de nucleótidos que se usan para formar agentes de ARNi de LPA. Tal como se usa en la presente, el término "secuencia" o "secuencia de nucleótidos" se refiere a una sucesión u orden de nucleobases, nucleótidos y/o nucleósidos, ya sea modificados o sin modificar, descritos con una
sucesión de letras que usan la nomenclatura de nucleótidos estándar y la clave de los nucleótidos modificados descritos en la presente.
Los agentes de ARNi incluyen, de modo no taxativo: ARN interferentes cortos (ARNic), ARN de cadena doble (ARNcd), micro ARN (ARNmi), ARN horquillado corto (ARNhc) y sustratos de dicer (por ejemplo, patentes estadounidenses 8084599, 8349809,y 8513207).
En la Tabla 1 se proporcionan las secuencias de cadena sentido y cadena antisentido del agente de ARNi de LPA sin modificar. Al formar los agentes de ARNi de LPA, cada uno de los nucleótidos de cada una de las secuencias que figuran en la Tabla 1 puede ser un nucleótido modificado.
Tabla 1. Secuencias de cadena sentido y cadena antisentido del agente de ARNi de LPA sin modificar.
Los agentes de ARNi de LPA descritos en la presente se forman mediante la hibridación de una cadena antisentido con una cadena sentido. Una cadena sentido que contiene una secuencia que figura en la Tabla 1 o la Tabla 2B puede hibridarse con cualquier cadena antisentido que contiene una secuencia que figura en la Tabla 1 o la Tabla 2A siempre que las dos secuencias tengan una región de al menos 90% de complementariedad en una secuencia contigua de 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos.
En algunas modalidades, las cadenas sentido y antisentido de los agentes de ARNi descritos en la presente contienen la misma cantidad de nucleótidos. En algunas modalidades, las cadenas sentido y antisentido de los agentes de ARNi descritos en la presente contienen una cantidad distinta de nucleótidos. En algunas modalidades, el extremo 5' de la cadena sentido y el extremo 3' de la cadena antisentido de un agente de ARNi forman un extremo romo. En algunas modalidades, el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido de un agente de ARNi forman un extremo romo. En algunas modalidades, ambos extremos de un agente de ARNi forman extremos romos. En algunas modalidades, ningún extremo de un agente de ARNi tiene extremos romos. Tal como se usa en la presente, un extremo romo se refiere a un extremo de un agente de ARNi de cadena doble en el cual los nucleótidos terminales de las dos cadenas hibridadas son complementarios (forman un par de bases complementarias). En algunas modalidades, el extremo 5' de la cadena sentido y el extremo 3' de la cadena antisentido de un agente de ARNi forman un extremo desparejo. En algunas modalidades, el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido de un agente de ARNi forman un extremo desparejo. En algunas modalidades, ambos extremos de un agente de ARNi forman un extremo desparejo. En algunas modalidades, ninguno de los extremos de un agente de ARNi es un extremo desparejo. Tal como se usa en la presente, un extremo desparejo se refiere a un extremo de un agente de ARNi de cadena doble en el cual los nucleótidos terminales de las dos cadenas hibridadas forman un par (es decir, no forman un excedente) pero no son complementarios (es decir, forman un par no complementario). Tal como se usa en la presente, un excedente es un tramo de uno o más nucleósidos sin emparejar en el extremo de una cadena de un agente de ARNi de cadena doble. Los nucleótidos no emparejados pueden estar en la cadena sentido o la cadena antisentido, creando así excedentes 3' o 5'. En algunas modalidades, el agente de ARNi contiene: un extremo romo un extremo desparejo, un extremo romo y un extremo excedente 5', un extremo romo un extremo excedente 3', un extremo desparejo y un extremo excedente 5', un extremo desparejo y un extremo excedente 3', dos extremos excedentes 5', dos extremos excedentes 3', un extremo excedente 5' y un extremo excedente 3', dos extremos desparejos o dos extremos romos.
Una base de nucleótidos (o nucleobase) es un compuesto de pirimidina o purina heterocíclica que constituye todos los ácidos nucleicos e incluye adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U). Tal como se usa en la presente, el término "nucleótido" puede incluir un nucleótido modificado o imitación de nucleótido, un sitio abásico (Ab o X) o un resto de remplazo sustituto.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA se prepara o proporciona como una sal, mezcla de sal o ácido libre.
Nucleótidos modificados
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA contiene uno o más nucleótidos modificados. Tal como se usa en la presente, un "nucleótido modificado" es un nucleótido que no sea un ribonucleótido (nucleótido 2'-hidroxilo). En algunas modalidades, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o 100% de los nucleótidos están modificados. Los nucleótidos modificados incluyen, de modo no taxativo, desoxinucleótidos, imitaciones de nucleótidos, nucleótidos abásicos (representados en la presente como X, Ab), nucleótidos modificados en 2', nucleótidos de enlaces 3' a 3' (invertidos) (representados en la presente como invdN, invN, invn, invX, invAb, nucleótidos que comprenden bases no naturales, nucleótidos puenteados, ácidos péptidonucleicos (PNA), imitaciones de nucleótidos 2',3'seco (análogos de nucleobases desbloqueadas, representados en la presente como Nuna o NUNA), nucleótidos bloqueados (representados en la presente como Nlna o NLNA), nucleótidos 3'-O-Metoxi (unido con internucleósido 2') (representados en la presente como 3'-OMen), nucleótidos 2'-F-Arabino (representados en la presente como NfANA o NfANA), nucleótido 5'-Me,2'-fluoro (representado en la presente como 5Me-Nf), nucleótidos morfolino, desoxirribonucleótidos de fosfonato de vinilo (representados en la presente como vpdN), nucleótidos que contienen fosfonato de vinilo y nucleótidos que contienen fosfonato de ciclopropilo (cPrpN). Los nucleótidos modificados en 2' (es decir, un nucleótido con un grupo que no sea un grupo hidroxilo en la posición 2' del anillo de azúcar de cinco miembros) incluyen, de modo no taxativo, nucleótidos 2'-O-metilo (representados en la presente como una letra minúscula "n" en una secuencia de nucleótidos), nucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro (representados en la presente como Nf, también representados en la presente como nucleótidos 2'-fluoro), nucleótidos 2'-desoxi (representados en la presente como dN), nucleótidos 2'-metoxietilo (2'-O-2-metoxiletilo) (representados en la presente como NM o 2'-MOE), nucleótidos 2'-amino, y nucleótidos 2'-alquilo. No es necesario que todas las posiciones en un compuesto determinado estén modificadas uniformemente. En cambio, puede incorporarse más de una modificación en un único agente de ARNi de LPA o incluso en un único nucleótido del mismo. Las cadenas sentido y antisentido del agente de ARNi de LPA pueden sintetizarse y/o modificarse mediante métodos conocidos en la técnica. La modificación en un nucleótido es independiente de la modificación en otro nucleótido.
Los nucleótidos modificados también incluyen nucleótidos con nucleobases modificadas. Las nucleobases modificadas incluyen, de modo no taxativo, nucleobases sintéticas y naturales, pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina, 5-metilcitosina (5-me-C), 5hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2- tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4tiouracilo, 8-halo, 8amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8- hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5- trifluorometilo y otros uracilos 5 sustituidos y citosinas, 7metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
Enlaces internucleósidos modificados
En algunas modalidades, uno o más nucleótidos de un agente de ARNi de LPA se unen mediante enlaces o estructuras no estándares (es decir enlaces internucleósidos modificados o estructuras modificadas). En algunas modalidades, un enlace internucleósido modificado es un enlace internucleósido covalente que no contiene fosfato. Las estructuras o enlaces modificados incluyen, de modo no taxativo, grupo 5'-fosforotioato (representado en la presente como una "s" minúscula antes de un nucleótido, tal como en sN, sn, sNf o sdN), fosforotioatos quirales, tiofosfato, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilo-fosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros de alquilo, incluyendo 3'-alquileno fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquil-fosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, enlaces morfolino y boranofosfatos con enlaces 3'-5' normales, análogos unidos de 2'-5' de estos y aquellos con la polaridad invertida donde los pares adyacentes de las unidades de nucleósidos se unen en 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. En otras modalidades, una estructura o enlace internucleósido modificado carece de un átomo de fósforo. Los enlaces internucleósidos modificados que no tienen un átomo de fósforo incluyen, de modo no taxativo, enlaces interazúcar alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces interazúcar alquilo o cicloalquilo mixtos de heteroátomo o uno o más enlaces interazúcar heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. En algunas modalidades, las estructuras internucleósidas modificadas incluyen, de modo no taxativo, estructuras de siloxano; estructuras de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras de formacetilo y tioformacetilo; estructuras de metileno formacetilo y tioformacetilo; estructuras que contienen alqueno; estructuras de sulfamato; estructuras de
metilenimino y metilenhidrazino; estructuras de sulfonato y sulfonamida; estructuras de amida; y otras que tienen partes componentes N. O, S y CH2 mezcladas.
En algunas modalidades, una cadena sentido de un agente de ARNi de LPA puede contener 1, 2, 3, 4 enlaces de fosforotioato, una cadena antisentido de un agente de ARNi de LPA puede contener 1,2, 3, o 4 enlaces de fosforotioato o tanto la cadena sentido como la cadena antisentido pueden contener independientemente 1, 2, 3 o 4 enlaces de fosforotioato.
En algunas modalidades, una cadena sentido del agente de ARNi de LPA contiene dos enlaces internucleósidos de fosforotioato. En algunas modalidades, los dos enlaces internucleósidos de fosforotioato se encuentran entre los nucleótidos en las posiciones 1-3 del extremo 3' de la cadena sentido. En algunas modalidades, los dos enlaces internucleósidos de fosforotioato se encuentran entre los nucleótidos en las posiciones 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 4-5, o 6-8 del extremo 5' de la cadena sentido. En algunas modalidades, una cadena antisentido del agente de ARNi de LPA contiene cuatro enlaces internucleósidos de fosforotioato. En algunas modalidades, los cuatro enlaces internucleósidos de fosforotioato se encuentran entre los nucleótidos en las posiciones 1-3 del extremo 5' de la cadena sentido y entre los nucleótidos en las posiciones 19-21, 20-22, 21-23, 22-24, 23-25, o 24-26 del extremo 5'. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA contiene dos enlaces internucleósidos de fosforotioato en la cadena sentido y cuatro enlaces internucleósidos de fosforotioato en la cadena antisentido.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA contiene uno o más nucleótidos modificados y uno o más enlaces internucleósidos modificados. En algunas modalidades, un nucleótido modificado en 2' se combina con un enlace internucleósido modificado.
Agentes de ARNI de LPA con nucleótidos modificados
En la Tabla 2A se proporcionan ejemplos de cadenas antisentido que contienen nucleótidos modificados. En la Tabla 2B se proporcionan ejemplos de cadenas sentido que contienen nucleótidos modificados. En las Tablas 2A y 2B se usan las siguientes referencias para indicar los nucleótidos modificados:
N = ribonucleótido 2'-OH (sin modificar) (letra mayúscula sin indicación de f o d).
n = nucleótido modificado 2'-OMe
Nf = nucleótido modificado 2'-fluoro
dN = nucleótidos 2'-desoxi
Nuna = imitaciones de nucleótidos 2',3'-seco (análogos de nucleobases desbloqueadas)
Nlna = nucleótido bloqueado
NfANA = nucleótido 2'-F-Arabino
NM = nucleótido 2'-metoxietilo
Ab = ribosa abásica
(invdN) = desoxirribonucleótido invertido (nucleótido unido 3'-3')
(invAb) = nucleótido abásico invertido
(invn) = nucleótido 2'-OMe invertido
s = nucleótido unido a fosforotioato
p = fosfato
vpdN = desoxirribonucleótido de fosfonato de vinilo
(3'OMen) = nucleótido 3'-OMe
(5Me-Nf) = nucleótido 5'-Me, 2'-fluoro
cPrp = fosfonato de ciclopropilo
epTcPr = véase la Tabla 4
epTM = véase la Tabla 4
Además se mencionan los siguientes grupos diana y grupos de enlace en las Tablas 2A y 2B: (Alk-PEG5-C6), (C11-PEG3-NAG3), (C12), (C6-PEG4-NAG3), (C6-SS-Alk-Me), (CholTEG), (Dy540), (NAG13), (NAG18), (NAG24), (NAG25), (NAG26), (NAG27), (NAG28), (NAG29), (NAG30), (NAG31), (NAG32), (NAG33), (NAG34), (NAG35), (NAG36), (NAG37), (NAG4), (PAZ), (Sp18), (esterilo), (Alk-SMPT-C6). Cada cadena sentido y/o cadena antisentido puede tener cualquiera de los grupos diana o grupos de enlace indicados anteriormente, así como otros grupos diana o de enlace, conjugados con el extremo 5' y/o 3' de la secuencia. En la Tabla 4 se proporcionan las estructuras químicas de estos grupos.
Tabla 2A. Cadenas antisentido de agentes de ARNi de LPA con nucleótidos modificados
Tabla 2B. Cadenas sentido de agentes de ARNi de LPA con nucleótidos modificados
Una cadena sentido que contiene una secuencia que figura en la Tabla 2B puede hibridarse con cualquier cadena antisentido que contiene una secuencia que figura en la Tabla 2A siempre que las dos secuencias tengan una región de al menos 90% de complementariedad en una secuencia contigua de 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos. Los agentes de ARNi de LPA representantes se representan mediante los números de identidad de dúplex que se muestran en las Tablas 3A y 3B.
En algunas modalidades un agente de ARNi de LPA comprende un compuesto con cualquiera de los números de identidad de dúplex presentados en la presente, donde la cadena sentido comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO:1280, SEQ ID NO:1282, SEQ ID NO:1246, SEQ ID NO:1242, SEQ ID NO:1244, o SEQ ID NO:1254
__
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1242 (TCGUAUAACAAUAAGGGGC). En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1244 (UCGUAUAACAAUAAGGGG). En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1246 (UCGUAUAACAAUAAGGG).
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1254 (UGUAUAACAAUAAGGGG). En algunas modalidades, un agente de ARNi comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1280 (CGUAUAACAAUAAGGGGC).
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1282 (UCGUAUAACAAUAAGGGGC).
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1243 (GCCCCUUAUUGUUAUACGA). En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1245 (CCCCUUAUUGUUAUACGA). En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1247 (CCCUUAUUGUUAUACGA). En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1255 (CCCCUUAUUGUUAUACA). En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1284 (GCCCCUUAUUGUUAUACG).
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1242 y una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1243. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1244 y una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la
SEQ ID NO:1245. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1246 y una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1247.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1254 y una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1255. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1280 y una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la
SEQ ID NO:1284. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1282 y una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1259.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 156, 164 o 188. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 310, 357, 384 o 376. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido y una cadena sentido que comprenden las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NOs:156/310, SEQ ID NOs:164/357, SEQ ID NOs:188/384, SEQ ID NOs:164/376, o SEQ ID NOs:164/384. En algunas modalidades, uno o más de los nucleótidos está modificado.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 637, 709, 790, 787, o 788. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1132, 1135, 1189 o 1191. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido y una cadena sentido que comprenden las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NOs:637/1132, SEQ ID NOs:709/1135, SEQ ID NOs:790/1189, SEQ ID NOs:787/1191, o SEQ ID NOs:788/1189.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende las SEQ ID NO. 637, 709, 790, 787, o 788. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende las SEQ ID NO:1132, 1135, 1189, 1191, o 1186. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende las SEQ ID NOs:637/1132, SEQ ID NOs:709/1135, SEQ ID NOs:790/1189, SEQ ID NOs:787/1191, o SEQ ID NOs:788/1189.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA está formado por las SEQ ID NO. 637, 709, 790, 787, o 788. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA está formado por las SEQ ID NO:1132, 1135, 1189 o 1191. En algunas
modalidades, un agente de ARNi de LPA está formado por las SEQ ID NOs:637/1132, SEQ ID NOs:709/1135, SEQ ID NOs:790/1189, SEQ ID NOs:787/1191, o SEQ ID NOs:788/1189.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido y una cadena sentido con las secuencias de nucleótidos AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847, o AD04110.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido y una cadena sentido con las secuencias de nucleótidos AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847, o AD04110, y además comprende un grupo diana de ligandos receptores de asialoglicoproteína.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido y una cadena sentido con las secuencias de nucleótidos AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847, o AD04110 y además comprende un grupo diana seleccionado del grupo que consiste en (C11-PEG3-NAG3), (C6-PEG4-NAG3), (NAG 3), (NAG4), (NAG3-AA2), (NAG3-Palm), (NAG13), (NAG18), (NAG24), (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG27), (NAG28), (NAG29), (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG13), (NAG31s), (NAG32), (NAG33), (NAG34), (NAG35), (NAG36), y (NAG37).
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido y una cadena sentido con las secuencias de nucleótidos modificadas AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847, o AD04110.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido y una cadena sentido con las secuencias de nucleótidos modificadas AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847, o AD04110 y además comprende un grupo diana de ligandos receptores de asialoglicoproteína.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende una cadena antisentido y una cadena sentido con las secuencias de nucleótidos modificadas AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847, o AD04110 y además comprende un grupo diana seleccionado del grupo que consiste en (C11-PEG3-NAG3), (C6-PEG4-NAG3), (NAG3), (NAG4), (NAG3-AA2), (NAG3-Palm), (NAG13), (NAG18), (NAG24), (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG27), (NAG28), (NAG29), (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG13), (NAG31s), (NAG32), (NAG33), (NAG34), (NAG35), (NAG36), y (NAG37).
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA comprende AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847, o AD04110.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA consiste en AD03460, AD03536, AD03851, AD03853, AD3847, o AD04110.
Grupo no nucleótido
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA contiene o se conjuga con uno o más grupos no nucleótidos que incluyen, de modo no taxativo, un grupo diana, un grupo de enlace, un polímero de suministro o un vehículo de suministro. El grupo no nucleótido puede mejorar la dirección, suministro o unión del agente de ARNi. En la Tabla 4 se proporcionan ejemplos de grupos diana y grupos de enlace. El grupo no nucleótido puede estar unido de forma covalente con el extremo 3' y/o 5' de cualquiera de la cadena sentido y/o la cadena antisentido. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA contiene un grupo no nucleótido unido al extremo 3' y/o 5' de la cadena sentido. En algunas modalidades, un grupo no nucleótido está unido al extremo 5' de una cadena sentido de un agente de ARNi de LPA. Un grupo no nucleótido puede unirse directa o indirectamente al ARNi a través de un enlazador / grupo de enlace. En algunas modalidades, un grupo no nucleótido se une al agente de ARNi a través de un enlace o enlazador lábil, escindible o reversible.
En algunas modalidades, un grupo no nucleótido mejora las propiedades farmacocinéticas o de biodistribución de un agente de ARNi o conjugado al cual se une para mejorar la distribución específica al tejido o la célula y la absorción específica a la célula del conjugado. En algunas modalidades, un grupo no nucleótido mejora la endocitosis del agente de ARNi.
Grupo diana
Un grupo diana puede ser monovalente, divalente, trivalente, tetravalente o tener una valencia más alta. Los grupos diana representativos incluyen, sin limitación, los compuestos con afinidad a la molécula de superficie celular, ligandos receptores celulares, haptenos, anticuerpos, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos e imitaciones de anticuerpos con afinidad a las moléculas de superficie celular. En algunas modalidades, un grupo diana se une a un agente de ARNi usando un enlazador, tal como un enlazador PEG o uno, dos, o tres grupos abásicos y/o de ribitol. En algunas modalidades, el grupo diana comprende un conjunto de galactosa.
Los agentes de ARNi de LPA descritos en la presente pueden sintetizarse y tienen un grupo reactivo, tal como un grupo amina, en el extremo 5'. El grupo reactivo puede usarse para unir posteriormente un resto diana usando métodos típicos en la técnica.
En algunas modalidades, un grupo diana comprende un ligando receptor de asialoglicoproteína. En algunas modalidades, un ligando receptor de asialoglicoproteína incluye o consiste en uno o más derivados de galactosa o conjuntos de galactosa. Tal como se usa en la presente, el término derivado de galactosa incluye tanto la galactosa como los derivados de galactosa con afinidad para el receptor de asialoglicoproteína que es igual o mayor al de la galactosa. Los derivados de galactosa incluyen, de modo no taxativo: galactosa, galactosamina, N-formilgalactosamina, N-acetil-galactosamina, N-propionil-galactosamina, N-n-butanoil-galactosamina y N-iso-butanoilgalactos-amina (véase por ejemplo: Iobst, S.T. y Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271,6686. Los derivados de galactosa y conjuntos de galactosa que son útiles para la dirección in vivo de los oligonucleótidos y otras moléculas al hígado son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Baenziger y Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et ál., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939, -945). Los derivados de galactosa se han usado para dirigir las moléculas a los hepatocitos in vivo a través de su unión al receptor de asialoglicoproteína (ASGPr) expresado en la superficie de los hepatocitos. La unión de los ligandos de ASGPr con ASGPr(s) facilita la dirección específica de la célula a los hepatocitos y la endocitosis de la molécula en los hepatocitos. El conjunto de galactosa puede unirse al extremo 3' o 5' del polinucleótido de ARNi usando métodos conocidos en la técnica.
Tal como se usa en la presente, un conjunto de galactosa comprende una molécula con dos a cuatro derivados de galactosa de extremo. Un derivado de galactosa de extremo se une a una molécula a través de su carbono C-1. En algunas modalidades, el conjunto de galactosa es un trímero derivado de galactosa, un derivado de galactosa triantenario o un derivado de galactosa trivalente. En algunas modalidades, el conjunto de galactosa comprende N-acetilgalactosaminas (GalNac). En algunas modalidades, el conjunto de galactosa comprende una N-acetil-galactosamina trivalente. En algunas modalidades, el conjunto de galactosa es un tetrámero derivado de galactosa, un derivado de galactosa tetraantenario o un derivado de galactosa tetravalente. En algunas modalidades, el conjunto de galactosa comprende una N-acetilgalactosamina tetravalente.
Tal como se usa en la presente, un trímero de galactosa contiene tres derivados de galactosa, cada uno unido a un punto de ramificación central. Tal como se usa en la presente, un tetrámero derivado de galactosa contiene cuatro derivados de galactosa, cada uno unido a un punto de ramificación central. Los derivados de galactosa pueden unirse al punto de ramificación central a través de los carbonos C-1 de los sacáridos. En algunas modalidades, los derivados de galactosa se unen al punto de ramificación a través de enlazadores o espaciadores. En algunas modalidades, el enlazador o espaciador es un espaciador hidrofílico flexible, tal como un grupo PEG (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5885968; Biessen et ál. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). En algunas modalidades, el espaciador PEG es un espaciador PEG3 El punto de ramificación puede ser cualquier molécula pequeña que permita unirse a los tres derivados de galactosa y que además permite la unión del punto de ramificación al agente de ARNi. Un ejemplo de grupo de puntos de ramificación es una dilisina o diglutamato. La unión del punto de ramificación al agente de ARNi puede tener lugar a través de un enlazador o espaciador. En algunas modalidades, el enlazador o espaciador comprende un espaciador hidrofílico flexible, tal como, de modo no taxativo: un espaciador PEG. En algunas modalidades, un espaciador pEg es un espaciador PEG3 (tres unidades de etileno). En otras modalidades, el espaciador PEG tiene de 1 a 20 unidades de etileno (PEG1 a PEG20). En algunas modalidades, un derivado de galactosa comprende una N-acetilgalactosamina (GalNac o NAG). En algunas modalidades, el conjunto de galactosa está formado por un tetrámero de derivado de galactosa, que puede ser, por ejemplo, un tetrámero de N-acetil-galactosamina.
En algunas modalidades, se describen composiciones farmacéuticas para suministrar un agente de ARNi de LPA a una célula hepática in vivo. Tales composiciones farmacéuticas pueden incluir, por ejemplo, un agente de ARNi de LPA conjugado con un conjunto de galactosa. En algunas modalidades, el conjunto de galactosa está formado por un trímero derivado de galactosa, que puede ser, por ejemplo, un trímero de N-acetilo-galactosamina, o tetrámero derivado de galactosa, que puede ser, por ejemplo, un tetrámero de N-acetil-galactosamina.
Los grupos diana incluyen, de modo no taxativo (Chol-TEG), (TEG-Chol), (C11-PEG3-NAG3), (Cm-PEGn-NAG3), (Cx-PEGz-NAG3), (NAG 3), (NAG4), (NAG3AA2), (NAG3-Palm), (NAG13), (NAG18), (NAG24), (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG27), (NAG28), (NAG29), (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG13), (NAG31s), (NAG32), (NAG33), (NAG34), (NAG35), (NAG36), y (NAG37).
Grupo de enlace
En algunas modalidades, un grupo de enlace está conjugado con el agente de ARNi. El grupo de enlace facilita un enlace covalente del agente a un grupo diana o polímero de suministro o vehículo de suministro. El grupo de enlace puede estar unido al extremo 3' o 5' de la cadena antisentido o la cadena sentido del agente de ARNi. En algunas modalidades, el grupo de enlace está unido a una cadena sentido del agente de ARNi. En algunas modalidades, el grupo de enlace está conjugado con el extremo 5' o 3' de una cadena sentido de un agente de ARNi. En algunas modalidades, un grupo de enlace está conjugado con el extremo 5' de una cadena sentido de un agente de ARNi. Algunos ejemplos de grupos de enlace, incluyen, de modo no taxativo: Alk-SMPT-C6, Alk-SS-C6, DBCO-TEG, Me-Alk-SS-C6, y C6-SS-Alk-Me, grupos reactivos tales como aminas y alquinas primarias, grupos alquilo, ribosa abásica, ribitol y/o grupos PEG.
Un enlazador o grupo de enlace es una conexión entre dos átomos que une un grupo químico (tal como un agente de ARNi) o segmento de interés con otro grupo químico (tal como un grupo diana o polímero de suministro) o segmento de interés a través de uno o más enlaces covalentes. Un enlace lábil contiene una unión lábil. Un enlace puede incluir opcionalmente un espaciador que aumenta la distancia entre los dos átomos unidos. Un espaciador puede adicionalmente agregar flexibilidad y/o longitud al enlace. Los espaciadores pueden incluir, de modo no taxativo, grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos arilo, grupos aralquilo, grupos aralquenilo y grupos aralquinilo; cada uno de los cuales pueden contener uno o más heteroátomos, heterociclos, aminoácidos, nucleótidos y sacáridos. Los grupos espaciadores son bien conocidos en la técnica y la lista anterior no pretende limitar el alcance de la descripción.
Los grupos de enlace, incluyen, de modo no taxativo, alquilo, PEG, (C6-PEGn-Alk), (Cn-SMPT-Alk), y (Cn-SS-Alk-Me).
Cualquiera de los agentes de ARNi de LPA que figuran en las Tablas 2A y 2B que contienen un grupo diana o grupo de enlace 3' o 5', pueden contener alternativamente ningún grupo diana o grupo de enlace 3' o 5' o pueden contener un grupo diana o grupo de enlace 3' o 5' diferente incluyendo, de modo no taxativo, los que se describen en la Tabla 4. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos del agente de ARNi de LPA que figuran en las Tablas 1, 2A y 2B, ya sea modificadas o sin modificar, pueden contener un grupo diana o grupo de enlace de 3' o 5' incluyendo, de modo no taxativo, los que se describen en la Tabla 4. Cualquiera de los dúplex de agente de ARNi de LPA que figuran en las Tablas 3A y 3B, ya sea modificados o sin modificar, pueden comprender adicionalmente un grupo diana o grupo de enlace, incluyendo, de modo no taxativo, los descritos en la Tabla 4, y el grupo diana o grupo de enlace puede unirse al extremo 3' o 5' de ya sea la cadena sentido o cadena antisentido del dúplex de agente de ARNi de LPA.
Tabla 4. Las estructuras representan distintos nucleótidos, grupos diana y grupos de enlace modificados.
En cada una de las estructuras anteriores, NAG comprende una N-Acetil-Galactosamina y otro ligando ASGPR. Cada (NAGx) puede estar unido a un agente de ARNi de LPA a través de un grupo fosfato (tal como en (NAG25), (NAG30) y (NAG31)) o un grupo fosforotioato, (como NAG25), (NAG30) y (NAG31)) u otro grupo de enlace. Alternativamente, pueden emplearse otros grupos de enlace conocidos en la técnica.
Grupo fosfato Grupo fosforotioato N-Acetil galactosamina
Vehículos de suministro
En algunas modalidades, un vehículo de suministro puede usarse para suministrar un agente de ARNi a una célula o tejido. Un vehículo de suministro es un compuesto que mejora el suministro del agente de ARNi a una célula o tejido. Un vehículo de suministro puede incluir, o estar formado por, de modo no taxativo: un polímero, tal como un polímero anfipático, un polímero activo de membrana, un péptido, un péptido de melitina, un péptido de tipo melitina (MLP), un lípido, un polímero o péptido reversiblemente modificado o una poliamina activa de membrana modificada.
En algunas modalidades, los agentes de ARNi pueden combinarse con lípidos, nanopartículas, polímeros, liposomas, micelas, DPC u otros sistemas de suministro disponibles en la técnica. Los agentes de ARNi también pueden conjugarse químicamente con los grupos diana, lípidos (incluyendo, de modo no taxativo, al colesterol y derivados de colesterol), nanopartículas, polímeros, liposomas, micelas, d Pc (véase, por ejemplo, WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011 /104169, y WO 2012/083185, WO 2013/032829, WO 2013/158141) u otros sistemas de suministro disponibles en la técnica.
Composiciones farmacéuticas
En la presente se describen métodos para suministrar agentes de ARNi de LPA a las células hepáticas de un mamífero in vivo. En algunas modalidades, puede usarse un vehículo de suministro. Un vehículo de suministro es un compuesto que mejora el suministro del agente de ARNi a la célula. Un vehículo de suministro puede ser, de modo no taxativo: un polímero, tal como un polímero anfipático, un polímero activo de membrana, un péptido, tal como melitina o un péptido tipo melitina, un polímero o péptido modificado reversiblemente o un lípido. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA se une a un ligando diana que comprende un ligando de asialoglicoproteína. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA se une a un ligando diana que comprende o está formado por un conjunto de galactosa.
Un agente de ARNi de LPA puede usarse para inhibir la expresión de LPA en una célula, grupo de células o un tejido, por ejemplo, en un sujeto. En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA se usa para formular una composición, es decir, una composición farmacéutica o medicamento, para administrar a un sujeto. Tal como se usa en la presente, una composición farmacéutica o medicamento comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de al menos uno de los agentes de ARNi de LPA descritos y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes farmacéuticamente aceptables (excipientes) son sustancias que no sean el ingrediente farmacéuticamente activo (IFA, producto terapéutico, por ejemplo, el agente de ARNi de LPA) que se han evaluado adecuadamente en términos de su seguridad y se incluyen intencionalmente en el sistema de suministro del fármaco. Los excipientes no ejercen ni pretenden ejercer un efecto terapéutico en la dosis que se pretende usar. Los excipientes pueden actuar para a) asistir en el procesamiento del sistema de suministro del fármaco durante la fabricación, b) proteger, apoyar o mejorar la estabilidad, biodisponibilidad o aceptabilidad por parte del paciente del IFA, c) asistir en la identificación del producto, y/o d) mejorar cualquier otro atributo de seguridad general, efectividad o suministro del IFA durante el almacenamiento o uso. Un excipiente farmacéuticamente aceptable puede o no ser una sustancia inerte.
Los excipientes incluyen, de modo no taxativo: mejoradores de la absorción, antiadherentes, agentes antiespumantes, antioxidantes, aglutinantes, agentes de amortiguación, portadores, agentes de recubrimiento, colores, mejoradores del suministro, polímeros de suministro, dextrán, dextrosa, diluyentes, desintegrantes, emulsionantes, extensores, rellenos, sabores, deslizantes, humectantes, lubricantes, aceites, polímeros, conservantes, solución salina, sales, solventes,
azúcares, agentes de suspensión, matrices de liberación sostenida, endulzantes, agentes espesantes, agentes de tonicidad, vehículos, agentes repelentes al agua y agentes humectantes.
Una composición farmacéutica puede contener otros componentes adicionales que se encuentran comúnmente en las composiciones farmacéuticas. Tales componentes adicionales incluyen, de modo no taxativo: antipruriginosos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios (por ejemplo, antihistamina, difenhidramina, etc.). También se prevé que las células, tejidos u órganos aislados que expresan o comprenden los agentes de ARNi definidos en la presente pueden usarse como "composiciones farmacéuticas". Tal como se usa en la presente, "una cantidad farmacológicamente eficaz", una "cantidad terapéuticamente eficaz" o simplemente una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de agente de ARNi que produce el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo que se pretende.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA se combina con uno o más agentes terapéuticos o tratamientos adicionales, incluyendo, de modo no taxativo: un segundo agente de ARNi de LPA u otro agente de ARNi, un fármaco de molécula pequeña, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y/o una vacuna. Los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales incluyen, de modo no taxativo, inhibidores (cepas) de reductasa HMg Co-A, ezetimiba, inhibidores de PCSK-9, inhibidores de CTEP, terapias que se dirigen a ANGPTL3, terapias que se dirigen a APOC3 y niacina.
Los agentes de ARNi descritos y las composiciones farmacéuticas que comprenden agentes de ARNi de LPA que se divulgan en la presente pueden empaquetarse o incluirse en un kit, recipiente, paquete o dispensador. Los agentes de ARNi de LPA y las composiciones farmacéuticas que comprenden tales agentes de ARNi de LPA pueden empaquetarse en jeringas o viales precargados.
En algunas modalidades, se contemplan las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos uno de los agentes de ARNi de LPA descritos. Estas composiciones farmacéuticas son útiles para inhibir la expresión del gen de LPA en una célula, tejido u organismo. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas descritas se usan para tratar un sujeto con una enfermedad, afección o trastorno que se beneficiaría de la reducción o inhibición de la expresión de LPA. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas descritas se usan para tratar un sujeto con el riego de desarrollar una enfermedad, afección o trastorno que se beneficiaría de la reducción o inhibición de la expresión de LPA. Las enfermedades, afecciones o trastornos que se beneficiarían de la reducción o inhibición de la expresión de LPA incluyen, de modo no taxativo: Enfermedad de Berger, enfermedad arterial periférica, enfermedad arterial coronaria, síndrome metabólico, síndrome coronario agudo, estenosis de la válvula aórtica, regurgitación de la válvula aórtica, disección aórtica, oclusión de la arteria retiniana, enfermedad cerebrovascular, isquemia mesentérica, oclusión arterial mesentérica superior, estenosis arterial renal, angina estable/inestable, síndrome coronario agudo, hipercolesterolemia familiar heterocigota u homocigota, hiperapobetalipoproteinemia, ateroesclerosis cerebrovascular, enfermedad cerebrovascular y trombosis venosa. En algunas modalidades, el sujeto es un mamífero, incluyendo de modo no taxativo, un paciente humano.
Se contemplan las células, tejidos y organismos no humanos que incluyen al menos uno de los agentes de ARNi de LPA descritos en la presente La célula, tejido u organismo no humano se realiza suministrando el agente de ARNi a la célula, tejido u organismo no humano mediante cualquier medio disponible en la técnica. En algunas modalidades, la célula es una célula de mamífero, incluyendo, de modo no taxativo, una célula humana. La célula, tejido u organismo no humano son útiles con fines de investigación o como herramientas de investigación (por ejemplo, análisis de drogas o diagnósticos).
Agentes ARNi de LPA para su uso en un método de tratamiento
En algunas modalidades, los agentes de ARNi de LPA descritos en la presente son para su uso en el tratamiento de un sujeto con una enfermedad, trastorno o afección o con riesgo de tener una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de la reducción o inhibición de la expresión de LPA. El tratamiento de un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen de LPA incluye un tratamiento terapéutico y/o profiláctico. Los ejemplos de enfermedades, afecciones o trastornos incluyen, de modo no taxativo: Enfermedad de Berger, enfermedad arterial periférica, enfermedad arterial coronaria, síndrome metabólico, síndrome coronario agudo, estenosis de la válvula aórtica, regurgitación de la válvula aórtica, disección aórtica, oclusión de la arteria retiniana, enfermedad cerebrovascular, isquemia mesentérica, oclusión arterial mesentérica superior, estenosis arterial renal, angina estable/inestable, síndrome coronario agudo, hipercolesterolemia familiar heterocigota u homocigota, hiperapobetalipoproteinemia, ateroesclerosis cerebrovascular, enfermedad cerebrovascular y trombosis venosa. En algunas modalidades, el método comprende administrar una composición, tal como una composición farmacéutica, que comprende un agente de ARNi de LPA descrito en la presente a un mamífero a tratarse.
En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los agentes de ARNi de LPA descritos se administra a un sujeto, por lo tanto, inhibiendo la expresión de LPA en el sujeto (por ejemplo, una cantidad eficaz para inhibir la expresión de LPA en el sujeto). En algunas modalidades, uno o más de los agentes de ARNi de LPA descritos
en la presente son para su uso en el tratamiento de un sujeto con una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de la reducción o inhibición de la expresión de LPA. En algunas modalidades, los agentes de ARNi de LPA descritos son para su uso en el tratamiento o la prevención de al menos un síntoma en un sujeto con una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de la reducción o inhibición de la expresión de LPA tal como se reivindica. Al sujeto se le administra una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquier uno o más de los agentes de ARNi descritos, tratando así el síntoma. En algunas modalidades, al sujeto se le administra una cantidad profilácticamente eficaz de cualquier uno o más de los agentes de ARNi descritos, previniendo así el al menos un síntoma.
En algunas modalidades, un agente de ARNi de LPA es para su uso en el tratamiento o la gestión de una presentación clínica donde a un sujeto que necesita dicho tratamiento, prevención o manejo se le administra una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los agentes de ARNi de LPA o composiciones que contienen agentes de ARNi de LPA que se describen en la presente. En algunas modalidades, el para su uso en el tratamiento comprende administrar una composición que comprende un agente de ARNi de LPA descrito en la presente a un mamífero a tratarse.
En alguna modalidad, el para su uso en el tratamiento comprende adicionalmente el paso de administrar un segundo agente terapéutico o tratamiento. En algunas modalidades, el segundo agente terapéutico es otro agente de ARNi de LPA (por ejemplo, un agente de ARNi de LPA que se dirige a una secuencia diferente dentro de la diana de LPA). En otras modalidades, el segundo agente terapéutico puede seleccionarse del grupo que comprende: fármaco de molécula pequeña, anticuerpo, fragmento de anticuerpo y vacuna.
La vía de administración es el camino por el cual un agente de ARNi se pone en contacto con el cuerpo. En general, los métodos para administrar fármacos y ácidos nucleicos para el tratamiento de un sujeto se conocen bien en la técnica y pueden aplicarse a la administración de las composiciones que se describen en la presente. Los compuestos que se describen en la presente pueden administrarse mediante cualquier vía adecuada en una preparación adaptada adecuadamente a la vía en particular. Por lo tanto, los compuestos que se describen en la presente pueden administrarse mediante inyección, por ejemplo, de forma intravenosa, intramuscular, intracutánea, subcutánea o intraperitoneal.
En algunas modalidades, los agentes de ARNi de LPA o las composiciones que se describen en la presente pueden suministrarse a una célula, grupo de células, tejido o sujeto mediante tecnologías de suministro de oligonucleótidos que se conocen en la técnica. En general, cualquier método adecuado que se reconoce en la técnica para el suministro de una molécula de ácido nucleico (in vitro o in vivo) puede adaptarse para usarse con un agente de ARNi de LPA que se describe en la presente. Por ejemplo, el suministro puede ser mediante administración local, (por ejemplo, inyección directa, implantación o administración tópica), administración sistémica o vía subcutánea, intravenosa, oral, intreperitoneal o parenteral, incluyendo intracraneal (por ejemplo, intraventricular, intraparenquimal e intratecal), administración intramuscular, transdérmica, por vía aérea (aerosol), nasal, rectal, o tópica (incluyendo bucal y sublingual). En determinadas modalidades, las composiciones se administran mediante infusión o inyección intravenosa o subcutánea.
En algunas modalidades, los agentes de ARNi pueden combinarse con lípidos, nanopartículas, polímeros, liposomas, micelas, DPC u otros sistemas de suministro disponibles en la técnica. Los agentes de ARNi también pueden conjugarse químicamente a los grupos diana, lípidos (incluyendo, de modo no taxativo, al colesterol y derivados de colesterol), nanopartículas, polímeros, liposomas, micelas, Dp C (véase, por ejemplo, WO 2000/053722, WO 2008/0022309, w O 2011/104169, y WO 2012/083185) y otros sistemas de suministro disponibles en la técnica.
Un agente de ARNi de LPA puede conjugarse con un polímero de suministro. En algunas modalidades, el polímero de suministro es una poliamina activa de membrana anfipática enmascarada/modificada.
Inhibición de la expresión
Tal como se usa en la presente, los términos "silenciar", "reducir", "inhibir" "regular por disminución" o "inactivar la expresión génica", al referirse a un gen de LPA se refieren a que la expresión del gen, medida mediante el nivel de ARN transcripto del gen o el nivel de polipéptidos, proteínas o subunidades de proteínas traducidas del ARNm en una célula, grupo de células o tejido en el cual se transcribe el gen de LPA se reduce cuando la célula, grupo de células o tejido se tratan con los agentes de ARNi de LPA descritos en comparación con una segunda célula, grupo de células o tejido que fue o no tratado o comparado con la misma célula, grupo de células o tejido, antes de la administración del agente de ARNi de LPA.
En algunas modalidades, el nivel de expresión génica y/o el nivel de ARNm de LPA en un sujeto al cual se administra un agente de ARNi de LPA descrito se reduce en al menos alrededor de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 98% en relación con el sujeto antes de administrársele el agente de ARNi de LPA o con un sujeto que no recibió el agente de ARNi de LPA. El nivel de expresión génica y/o el nivel de ARNm en el sujeto pueden reducirse en una célula, grupo de células y/o tejido del sujeto. En algunas modalidades, el nivel de proteína de LPA en un sujeto al cual se le ha administrado un agente de ARNi de LPA descrito se reduce en al
m enos a lrededor de 5% , 10% , 15% , 20% , 25% , 30% , 35% , 40% , 45% , 50% , 55% , 60% , 65% , 70% , 75% , 80% , 85% , 90% , 95% , o 98% en re lac ión con el su je to antes de adm in is trá rse le el agente de AR N i de LP A o con un su je to que no ha rec ib ido el agente de AR N i de LPA. El nivel de p ro te ína en el su je to puede reduc irse en una cé lu la , g rupo de cé lu las , te jido, sangre y/o o tros flu idos del su jeto. Una reducción en los nive les de exp res ión gén ica , AR N m o p ro te ína puede eva lua rse m ediante cu a lqu ie r m étodo conoc ido en la técn ica . La reducción o d ism inuc ión del nivel de A R N m de LP A y/o el nivel de p ro te ína se denom ina en su con jun to en la p resen te una reducción o d ism inuc ión de LP A o inh ib ic ión o reducc ión de la exp res ión de LPA.
In troducir en una cé lu la , al re fe rirse a un agente de A R N i, se refie re a sum in is tra r func iona lm en te el agente de AR N i a la cé lu la . Por sum in is tro func iona l se qu ie re dec ir que el agente de AR N i se sum in is tra a la cé lu la y que tiene la activ idad b io lóg ica espe ra d a (por e jem p lo , inh ib ic ión espec ífica a las secuenc ias de la exp res ión gén ica).
C élu las y te jidos y o rgan ism os no hum anos
Se con tem p lan las cé lu las , te jidos y o rgan ism os no hum anos que inc luyen al m enos uno de los agentes de AR N i de LPA descritos en la p resen te La cé lu la , te jido u o rgan ism o no hum ano se rea liza sum in is trando el agente de AR N i a la cé lu la, te jido u o rgan ism o no hum ano.
Las m oda lidades y e lem en tos p roporc ionados an te rio rm en te se ilustran ahora m ediante los s igu ien tes e jem p los no taxa tivos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1.
S ín tes is agen te ARN i.
A) S ín tes is .S e s in te tiza ron agentes de AR N i de LP A de acuerdo a la tecno log ía de fos fo ram id ita en fase só lida que se utilizó en la s ín tes is de o ligonuc leó tidos . D epend iendo de la esca la se utilizó un M erM ade96E (B ioau tom atizac ión ) o un M erM ade12 (B ioau tom atizac ión ).Las sín tes is se rea lizaron en un soporte só lido de v id rio de poro con tro lado (CPG , 500 A o 600 A, ob ten ido en Prim e S yn thesis , A ston, PA, E E .U U .). T odos los AD N , AR N con m od ificac iones en los g rupos 2', y fos fo ram id itas U N A se adquirie ron en T herm o F isher S c ien tific (M ilw aukee, W I, EE .U U .). E specíficam en te , se u tilizaron las s igu ien tes 2 '-O -m etil fosforam id itas:(5 '-O -d im etoxitritil-N 6-(benzoil)-2'-O-metil-adenosina-3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilamino) fosforamidita, 5 ,-O -d im e to x i-tr itil-N 4-(a ce til)-2 '-O -m e til-c itid ina -3 '-O -(2 -c ianoe til-N ,N -d iisop rop il-am ino ) fos fo ram id ita , (5 ,-O -d im e tox itr itil-N 2-(iso b u tir il)-2 '-O -m e til-guanos ina -3 '-O -(2 -c iano -e til-N ,N -d iisop rop ilam ino )fos fo ram id ita , y 5,-O-d im etoxi-tritil-2-O -m etil-urid ina-3-O -(2-cianoetil-N ,N -diisopropilam ino)fosforam id ita . Los 2 '-desox i-2 '-fluo ro -fós fo r-am id itas llevaron los m ism os g rupos p ro tecto res com o las am id itas CO N ARN 2 ’-O -m etilo . E specíficam en te , se u tiliza ron las s igu ien tes 2 '-O -m etil fos fo ram id itas : 5 ,-(4 ,4 '-D im e tox itr itil)-N -benzo il-2 ,,3 -seco -adenos ina , 2 ,-benzo il-3 ,-[(2 -c ianoe til)-(N ,N -d iisop rop il)]-fos fo r-am id ita , 5 -(4 ,4 '-D im e tox itritil)-N -ace til-2 ,,3 ,-seco -c itos ina , 2 ,-b e n zo il-3 -[(2 -c ianoe til)-(N ,N -d iiso -p rop il)]-fos fo ram id ita , 5 ,-(4 ,4 '-D im e tox itritil)-N -isobu tiril-2 ,,3 ,-seco -guanos ina , 2 ,-benzo il-3 ,-[(2 -c ianoe til)-(N ,N -d iisop rop il)]-fos fo ram id ita , y 5 ,-(4 ,4 '-D im e tox i-tr itil)-2 ,,3 -seco -u rid ina , 2 ,-benzo il-3 ,-[(2-c ianoe til)-(N ,N - d iiso -p rop il)]-fos fo ram id ita . T odas las am id itas se d iso lv ie ron en ace ton itrilo anh id ro (50 mM) y se agregaron tam ices m olecu la res (3A). C on el fin de in troduc ir el T E G -co les te ro l en el ex trem o 5 'de los o ligóm eros, se u tilizó 1 -D im e tox itr itilo x i-3 -O - (N -co les te ril-3 -am inoprop il) -tr ie tileneg lico l-g lice ril-2 -O - (2-c ianoetil) - (N, N, -d iisoprop il) -fos fo ram id itade G len R esearch (S terling , VA , EE .U U .). Se in trodu je ron m od ificac iones en los g rupos 5 ’ sin m od ificac ión a lguna del c ic lo de s ín tes is .S e u tilizó com o so luc ión de ac tivadora 5 -benc iltio -1H -te trazo l (BTT, 250 mM en ace ton itrilo ). Los tiem pos de acop lam ien to fueron de 10 min (RNA), 180 seg (co leste ro l), 90 seg (2 'O M e y UNA), y 60 seg (2'F y A D N ).C on el fin de in troduc ir en laces de fos fo ro tioa to , se utilizó una so luc ión de 100 mM de 3-fen il 1 ,2 ,4 -d itia zo lina -5 -ona (PO S, ob ten ida de PolyO rg, Inc., Leom inste r, MA, EE .U U .) en ace ton itrilo anh id ro . Para consu lta r secuenc ias específicas véanse las T ab las 1 , 2 A y 2B.
B. E sc is ión y desp ro tecc ión de o ligóm ero un ido a l soporte . D espués de la fina lizac ión de la sín tes is decfase sólida, el soporte só lido seco se tra tó con un vo lum en de 1 :1 de una so luc ión de m etilam ina al 40 % de peso en agua y so luc ión de h idróx ido de am on io al 28 % (A ldrich) du ran te dos horas a 30 °C. La so luc ión se evaporó y el res iduo só lido se reconstituyó en agua (véase m ás ade lante).
C. P urificac ión . El co les te ro l en bru to que con ten ía o ligóm eros se purificó m ed ian te H PLC de fase inversa u tilizando una co lum na W a te rs X B ridge BE H 300 C 4 5u Prep y un s is tem a S h im adzu LC-8. El tam pón A cons is tió en 100 mM de TEAA , pH 7,5 e inc luyó ace ton itrilo al 5 % y el tam pón B cons is tió en 100 mM de T E A A 100 e incluyó ace ton itrilo al 95% . Se reg is tra ron rastros de UV a 260 nm. Luego las fracc iones ap rop iadas se e jecu ta ron en un H PLC de exc lus ión de tam año u tilizando una co lum na 16/40 XK GE H ea lthca re re llenada con m edio S ephadex G -25 con un tam pón de 100 mM de b ica rbona to de am on io , pH 6.7 y ace ton itrilo al 20% .O tros o ligóm eros crudos se purifica ron m ed ian te H PLC de in te rcam bio an ión ico u tilizando una co lum na 13u TK S ge l S uperQ -5P W y el s is tem a S h im adzu LC-8.E l tam pón A cons is tió en 20 mM de Tris, 5 mM de EDTA, pH 9.0 e inc luyó ace ton itrilo al 20% y el tam pón B cons is tió en lo m ism o que el tam pón A con el
agregado de cloruro de sodiol, 5 M. Se registraron rastros de UV a 260 nm. Luego las fracciones apropiadas se combinaron y se ejecutó la HPLC de exclusión por tamaño tal como se describe para los oligómeros que contienen colesterol.
D. Apareamiento. Las cadenas complementarias se mezclaron combinando soluciones equimolares (sentido y antisentido) en 0.2 x PBS (Fosfato- Suero Fisiológico Tamponado, 1 x, Corning, Cellgro) para formar los agentes ARNi. Se colocó esta solución en un termomezclador a 70 ° C, se calentó a 95 ° C, se mantuvo a 95 ° C durante 5 min, y se enfrió a temperatura ambiente lentamente. Algunos agentes ARNi se liofilizaron y se conservaron a -15 hasta -25 ° C. Se determinó la concentración dúplex midiendo la solución de absorbancia en un espectrómetro de UV-Vis en 0.2 x PBS. A continuación, la solución de absorbancia a 260 nm se multiplicó por un factor de conversión y el factor de dilución para determinar la concentración dúplex. A menos que se indique lo contrario, todos los factores de conversión fueron de 0.037 mg / (mLcm). Para algunos experimentos, el factor de conversión se calcula a partir de un coeficiente de extinción determinado en forma experimental.
Ejemplo 2. Análisis primario in vitro de agentes ARNi LPA.Se seleccionaron secuencias de canditatos identificados como primates humanos y no humanos de reacción cruzada mediante análisis in silico. Se sintetizaron 108 agentes de ARNi de LPA potenciales identificados in silico y se examinó su eficacia in vitro en tres grupos. Para los fines de la detección selectiva, se subclonó la secuencia de ADNc LPA humano (acceso # NM_005577.1) a partir de un vector de expresión de mamíferos disponible comercialmente (Origene, Rockville, Maryland) en un plásmido de detección basado en un gen indicador, comercialmente disponible, psiCHECK2 (Promega, Madison, WI) que generó un ARNm de fusión de luciferasa de Renilla / LPA. Para la eficacia del agente de ARNi de LPA en los antecedentes humanos, se sembraron células Hep3B, una línea de carcinoma hepatocelular humano, a ~ 10.000 células por pocillo en formato de 96 pocillos.Cada uno de los 108 agentes de ARNi de LPA se cotransfectó en dos o tres concentraciones (1 nM y 0.1 nM, o 0.02, 0.2 y 2 nM) con 50 100 ng de ADN plasmídico LPA-psiCHECK2 por pocillo y 0.2 pL de LipoFectamina 2000 por pocillo. Se determinó el knockdown de genes mediante la medición de los niveles de luciferasa de Renilla normalizados a los niveles de luciferasa de luciérnaga expresada constitutivamente, también presentes en el plásmido psiCHECK2, usando el Ensayo Dual Luciferase Reporter Assay (Promega, Madison, WI) (Tablas 5A y 5B).
Tabla 5A. Análisis in vitro de agentes ARNi LPA, inhibición de la expresión LPA.
Tabla 5B. Análisis in vitro de agentes ARNi LPA, inhibición de la expresión LPA.
Tabla 5C. Análisis in vitro de 10 mM de agentes ARNi LPA, inhibición de la expresión LPA
Tab la 5D . A ná lis is in v itro de 1 mM de agentes AR N i LPA, inh ib ic ión de la exp res ión LPA.
Ejemplo 3. D e te rm ina c ió n de ECso en e l a g en te A R N i LPA. Se genera ron curvas de C E 50 de d iez pun tos m ed ian te la u tilizac ión de las m ism as cé lu las y cond ic iones de transfecc ión , con concen trac iones de agente de AR N i de LP A que osc ila ron en tre 150fM y 3 nM. Se de te rm ina ron EC 50 con el p rog ram a G raphP ad Prism (Tabla 6).
T ab la 6. V a lo res (nM ) de E C 50 de te rm inados in v itro para los agentes de AR N i de LP A ind icados.
Ejemplo 4. A ná lis is in v itro de la R e lac ión E s truc tu ra -A c tiv ida d (S A R ) des ignó agen tes A R N i LPA. Se s in te tiza ron y se lecc iona ron con jun tos de agente de AR N i de LP A (364 secuenc ias basadas en A D 01532 y 351 secuenc ias basadas en A D 01533) para la e ficac ia in v itro . Para los fines de la de tecc ión , se s in te tizó y c lonó 2756 pb de la secuenc ia de A D N c hum ano LPa de K IV -3 a KIV-9 (acceso # N M _005577.1 ) (G eneW iz, S outh P la in fie ld , NJ) en un p lásm ido de de tecc ión basado en un gen ind icador, com erc ia lm ente d ispon ib le , ps iC H E C K 2 (P rom ega, M adison, W I) que generó un A R N m de fus ión de luc ife rasa de R enilla / LPA. Para la e ficac ia del agente de AR N i de LP A de an teceden tes hum anos, se sem braron cé lu las HuH7, una línea de ca rc inom a hepatoce lu la r hum ano, a ~ 7500 cé lu las por pocillo en fo rm a to de 96 pocillos. C ada uno de los agentes de AR N i de LP A se co trans fec tó en dos concen trac iones (1 nM y 0.1 nM, o 10nM y 1 nM) con 25 ng de AD N p lasm íd ico LP A -ps iC H E C K 2 por pocillo y 0.2 pL de L ipoFectam ina 2000 por pocillo . Se de te rm inó el knockdow n de genes m id iendo los n ive les de luc ife rasa de R enilla no rm a lizados a los n ive les de luc ife rasa de luc ié rnaga exp resada cons titu tivam en te , tam b ién p resen tes en el p lásm ido ps iC H E C K 2, usando el Ensayo Dual Luc ife rase R eporte r A ssay (P rom ega, M ad ison , W I) (Tab las 7A y 7B).
T ab la 7A. R esu ltados de de tecc ión de e ficac ia de agentes de AR N i de LP A in vitro,
tal com o fueron de te rm inados por el ensayo Dual Lucife rase R eporte r Assay.
Tabla 7B Resultados de detección de eficacia de agentes de ARNi de LPA in vitro, tal como fueron determinados por el ensayo Dual Luciferase Reporter Assay.
Ejemplo 5.
A ná lis is in v ivo de la e fica c ia d e l agen te A R N i en ra tones transgén icos y trans ito ria m en te transgén icos.
A ) A dm in is tra c ión y tom a de m uestras. Con el fin de eva lua r la e ficac ia de los agentes de AR N i de LP A in vivo, se u tilizaron ra tones trans ito riam en te transgén icos. Al m enos 30 d ías antes de la adm in is trac ión del agente de AR N i de LP A con jugado con co les te ro l, los ratones de tipo sa lva je rec ib ie ron una inyecc ión h id rod inám ica en la vena de la co la de un p lásm ido que con tiene el gen SE A P bajo el con tro l del p rom o to r de a lbúm ina de ratón. Se c lona ron las secuenc ias d iana del gen LPA de un 3 ’-U TR del p lásm ido . Estos ratones se seña la ron com o ra tones S E A P -LP A HTV. Los ratones rec ib ieron agentes de AR N i de LP A con jugados con co les te ro l u tilizando un po lím ero de en trega de M LP el d ía 1 (W O 2012/083185 ; la m elitina se s in te tizó y se m od ificó con C D M -N A G para p roduc ir un po lím ero de en trega de M LP com o se describe en este docum en to ). C ada ratón recibió una inyección in travenosa (IV) en la vena de la co la de 200 a 250 gL de so luc ión que con ten ía una dosis de agente de ARN i de LP A po lím ero de en trega de M LP (1: 1 p /p agente A R N i: po lím ero de en trega de M LP en la m ayoría de los casos). En a lgunos experim en tos, los agentes de AR N i de LPA se con jugaron d irec tam en te con un po lím ero de en trega . De fo rm a s im ila r se inyecta ron agentes de ARN i de LPA con jugados con po lím eros en la vena de la co la . El agente de AR N i de LP A ind icado (Tab la 8B) se con jugó con un po lím ero po liacrila to , A R F 1164-106A-5, que cons taba de 54.4 % de m onóm eros e toxi etil am ino acrila to (EEA A) y 45.6 % de m onóm eros de p rop il de propil acrila to (M W 41962 g /m ol, po lím ero s in te tizado com o se describe en W O 2013/158141) y se enm ascaró con 3x A c it-N A G , 6x A c it-P E G (po lím ero enm ascarado com o se describe en W O 2012/092373 y P C T /U S 16 /34512). Las m uestras de suero (pre tra tam ien to ) de con tro l se tom aron de los ratones antes de la inyección en los d ías -4, o -1. Las m uestras de suero
después de la inyección fueron tomadas de los ratones los días 4, 8, 15, 22, 29, 36 y 43.Para algunos ratones, las muestras se recogieron en el día 3 o el día 5, en lugar del día 4.
En experimentos adicionales, se evaluaron los agentes de ARNi de LPA in vivo utilizando ratones transitoriamente transgénicos que LPA de longitud completa.AL menos 30 días antes de la administración del agente de ARNi de LPA conjugado con colesterol, los ratones con inmunidad comprometida recibieron una inyección hidrodinámica en la vena de la cola con un minicírculo que contenía el ADNc LPA bajo el control del promotor de albúmina de ratón. Estos ratones se señalaron como ratones LPA mc HTV. Los ratones recibieron el día 1 agentes de ARNi de LPA conjugados con NAG (también denominados GalNAc) o con colesterol dirigido. Para los agentes de ARNi dirigidos con colesterol, cada ratón recibió una inyección intravenosa (IV) en la vena de la cola de 200 a 250 pL de solución que contenía una dosis de agente ARNi polímero de entrega de MLP (1: 1 p/p agente ARNi : polímero de entrega de MLP). Para los agentes de ARNi LPA conjugados con NAG, los ratones recibieron una inyección subcutánea (SC) en la piel suelta del lomo, entre los hombros de una solución de 300 j l que contenía una dosis del agente ARNi en suero fisiológico tamponado. Para algunas muestras, el agente de ARNi de LPA se administró con o sin péptido de entrega de MLP.Se administraron agentes ARNi entregados con péptidos de entrega de MLP mediante una inyección intravenosa (IV) en la vena de la cola de una solución de 200 a 250 pL que contenía una dosis de agente ARNi polímero de entrega de MLP (1: 2 p/ p agente ARNi: polímero de entrega de MLP en la mayoría de los casos). Las muestras de suero (pretratamiento) de control se tomaron de los ratones antes de la inyección en los días -4, o -1. Las muestras de suero después de la inyección fueron tomadas de los ratones los días 4, 8, 15, 22, 29, 36 y 43. Para algunos ratones, las muestras se recogieron en el día 3 o el día 5, en lugar del día 4.
En experimentos adicionales, se administraron agentes de ARNi de LPA a ratones transgénicos para Lp(a) y apo(a) (Frazer KA et ál 1995, Nature Genetics 9: 424-431). Este ratón expresa apo (a) humana de un YAC que contiene el gen LPA completo (que codifica la apo(a) proteína) con las secuencias adicionales en 5‘ y en 3'.Se criaron ratones con lp(a) mediante cruzamiento de ratones que tenían YAC apo(a) con ratones con expresión de apoB-100 humana (Callow MJ et ál 1994, PNAS 91: 2130-2134).Se administraron agentes ARNi con colesterol dirigido y agentes ARNi con nAg conjugado como se describió anteriormente.Las muestras de suero (pretratamiento) de control se tomaron de los ratones antes de la inyección el día -1. Las muestras de suero después de la inyección fueron tomadas de los ratones los días 4, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50 y 64.
B) Análisis de knockdown de la expresión LPA. Se monitorearon los niveles de proteína SEAP en el suero de los ratones SEAP-LPA HTV, mediante el ensayo del suero de los ratones utilizando Phospha-Light ™, un sistema de ensayo de gen indicador quimioluminiscente (Life Technologies). Para la normalización, el nivel de SEAP para cada animal en un momento determinad se dividió entre el nivel de pretratamiento de la expresión en dicho animal para determinar la relación de la expresión "normalizada a un tratamiento previo". Luego se promedió la expresión en un momento específico entre los individuos del grupo.
Se monitorearon los niveles de proteína apo(a) humana en el suero mediante el ensayo del suero de los ratones utilizando un ensayo ELISA de la apo(a) (Abcam) de los ratones LPA mc HTV y de los ratones transgénicos. Para la normalización, el nivel de apo(a) de cada animal en un momento determinado se dividió entre el nivel de pretratamiento de la expresión en dicho animal (en este caso en el día 1) para determinar la relación de la expresión "normalizada al día 1". Luego se normalizó la expresión en un momento específico con el grupo de control con suero fisiológico dividiendo la relación "normalizado al día 1" de un animal individual entre la media "normalizada al día 1" de todos los ratones del grupo de control con suero fisiológico. Esto, dio lugar a la expresión para cada momento normalizado con el del grupo de control.
Se determinaron los niveles de Lp(a) en un Cobas Integra 400 (Roche Diagnostics) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para la normalización, el nivel de apo(a) de cada animal en un momento determinad se dividió entre el nivel de pretratamiento de la expresión en dicho animal (en este caso en el día 1) para determinar la relación de la expresión "normalizada al día 1". Luego se normalizó la expresión en un momento específico con el grupo control de suero fisiológico dividiendo la relación "normalizado al día 1" de un animal individual entre la media "normalizada al día 1" de todos los ratones del grupo de control con suero fisiológico. Esto dio lugar a la expresión para cada momento normalizado con el del grupo de control.
T ab la 8A. N ive les de LP A re la tivos en ra tones después de la adm in is trac ión in travenosa de agentes de AR N i de LP A con co les te ro l con jugado po lím ero de en trega de M LP.
A gen te de AR N i de LPA
ID de dúp lex M LP (m g/kg) LPA re lativo (m g/kg)
A D 01184 2 2 0.20
A D 01187 2 2 0.18
A D 01190 2 2 0.17
A D 01193 2 2 0.22
A D 01196 2 2 0.02
A D 01197 2 2 0.065
A D 01198 2 2 0.051
A D 01199 2 2 0.070
A D 01200 2 2 0.094 AD01201 2 2 0.029
A D 01202 8 8 0.14
A D 01205 2 2 0.21
A D 01206 2 2 0.37
A D 01207 2 2 0.19
A D 01208 2 2 0.35
A D 01209 2 2 0.16
A D 01210 2 2 0.18 AD01211 2 2 0.38
A D 01212 2 2 0.26
A D 01213 2 2 0.30
A D 02662 2 2 0.0010
A D 02663 2 2 0.010
A D 02664 2 2 0.0010
T ab la 8B. N ive les de LP A re la tivos en ra tones después de la adm in is trac ión in travenosa de agentes de AR N i de LP A con po lím ero con jugado de entrega.
ID de dúp lex A gen te de AR N i de LP A (m g/kg) LP A re lativo
A D 01462 0.5 0.38 A D 01463 0.5 0.41 A D 01466 0.5 0.33 A D 01467 0.5 0.46
T ab la 8C. N ive les de LP A re la tivos en ra tones después de la adm in is trac ión subcu tánea de agentes de AR N i de LP A con NAG con jugado .
Ejemplo 6. D e tecc ión in v ivo de ag en te s de A R N i de LP A y tiem po d e l kno ckdo w n de SEAP. Se adm in is tra ron agentes de AR N i de LP A con co les te ro l con jugado a ratones trans ito riam en te transgén icos tal com o se describ ió an terio rm en te . C ada ra tón rec ib ió una sola dosis in travenosa (IV) de 8 mg / kg de agente de AR N i de LP A con 8 mg / kg de po lím ero de en trega de M LP. Los n ive les de p ro te ína de S E AP en el suero fueron m on ito reados du ran te un m áxim o de 36 días. Los n ive les de knockdow n y la durac ión de la respuesta se p resen tan en la T ab la 9. Se ob tuvo una d ism inuc ión del nivel de pro te ína sé rica de S E AP de más del 85 % después de la adm in is trac ión de todos los agentes de AR N i de LPA som etidos a prueba; con todos m enos con dos agentes de AR N i LP A som etidos a p rueba que p resen tan un knockdow n m ayor al 99.4 %. A D 01196 y A D 01199 presen ta ron > 95 % de knockdow n el d ía 36.
Ejemplo 7. D etecc ión in v ivo de agen tes de A R N i de LP A y tiem po de kno ckdo w n d e l LPA en dos is b a ja s d e l agen te A R N i LPA. Se adm in is tra ron agentes de AR N i de LPA con co les te ro l con jugado a ratones trans ito riam en te transgén icos tal com o se describ ió an te rio rm en te . C ada ratón rec ib ió una sola dosis in travenosa (IV) de 2 mg / kg de agente de ARN i de LPA con 2 mg / kg de po lím ero de en trega de M LP. Los n ive les de p ro te ína de S E AP en el suero fue ron m on ito reados du ran te un m áxim o de 43 d ías (Tab la 10).
Ejemplo 8. P ruebas in v ivo de los ag en te s de A R N i de LP A en ra tones T ransgén icos (Tg) p a ra apo(a ). Se adm in is tró A D 01196 a ra tones tal com o se describ ió an te rio rm en te . C ada ratón rec ib ió una so la dosis in travenosa (IV) de 2 mg / kg de agente de AR N i de LP A con 2 mg / kg de po lím ero de en trega de M LP o suero fis io lóg ico . Se m on ito rea ron los nive les séricos apo(a) (apo(a)) hum anos du ran te un m áxim o de 64 d ías (Tab la 11). El d ía 15, los an im a les del g rupo con suero fis io lóg ico rec ib ieron una so la dosis IV de 2 mg / kg de un agente AR N i de Factor VII (F7) de ratón de con tro l con 2 mg / kg de po lím ero de en trega de M LP. El d ía 22, los n ive les de F7 se m id ie ron en todos los an im ales. La activ idad F7 cayó un 99% 7 d ías después de la adm in is trac ión , sin que hub ie ra e fecto a lguno en los n ive les séricos de apo(a). AD 01196 p resen tó un knockdow n de > 3 log 10 de los n ive les de apo(a) en el nadir, con > 80 % de knockdow n observado después de 3 sem anas (Tab la 11).
T a b la 11. N iv e le s d e p ro te ín a a p o (a ) e n s u e ro e n ra to n e s T g p a ra a p o (a ) d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e 2 m g / kg de a g e n te s A R N i-c o n c o le s te ro l c o n ju g a d o c o n 2 m g /kg d e p o lím e ro d e e n tre g a d e M LP .
S e n o rm a liz a ro n los n iv e le s d e a p o (a ) al d ía -1 y c o n tro l d e s u e ro f is io ló g ic o .
Ejemplo 9. K nockdow n de la apo lipo p ro te ín a (a) (apo (a)) en p r im a te s no hum anos tras la en tre ga de l a g en te de A R N i de LP A m ed ian te e l p o lím e ro de en tre ga de M LP. El po lím ero de en trega de M LP y el agente de AR N i de LP A se p repara ron y se com b ina ron en un tam pón fa rm acéu ticam en te acep tab le tal com o se describ ió an te rio rm en te . El d ía 1, dos prim ates m acacos c inom o lgos (M acaca fasc icu la ris ) (los dos m achos, de 5.0 kg y 8.15 kg, respectivam ente ) rec ib ieron una inyección con 2 mg / kg de A D 01196 2 mg / kg de po lím ero de en trega de M LP. Para cada inyección, se inyectó el agente de ARN i de LP A po lím ero de en trega de M LP (2 ml / kg) en la vena sa fena con un ca té te r in travenoso de ca lib re 22-25. En los m om entos ind icados (ind icados en la T ab la 12), se extra je ron y ana liza ron m uestras de sangre de los n ive les de apo (a), n ive les lip íd icos y m arcadores de tox ic idad .S e extra jo sangre de la vena fem ora l y los p rim ates se m an tuv ie ron en ayunas du ran te la noche an te rio r a todas las ex tracc iones de sangre .S e rea lizaron aná lis is de sangre de n itrógeno ure ico (BUN), a lan ina transam inasa (ALT), asparta to am ino trans fe rasa (AST), crea tin ina , co les te ro l to ta l (CT) y trig licé ridos (TG) en un ana lizador qu ím ico au tom atizado en los labo ra to rios M erite r. Los aná lis is de sangre de lipop ro te ína (a) (Lp (a)) y lipop ro te ínas de ba ja dens idad (LD L) se m id ieron en un ana lizador qu ím ico au tom atizado . Se m id ieron los n ive les apo(a) en suero m ed ian te el ensayo ELIS A . Se obse rvó un s ign ifica tivo knockdow n de apo(a) con un p rom ed io m áxim o de knockdow n del 94.5 % que se obse rvó el d ía 22. El knockdow n m áxim o prom ed io de Lp (a) fue del 91.5 % observado el d ía 15 (F ig.3). No se observó tox ic idad re lac ionada con la dosis en los an im a les tra tados.
T ab la 12. P ro te ína apo(a) sérica, L ipop ro te ína(a ) (m g/dL), L ipop ro te ína de baja dens idad (LD L), C o leste ro l to ta l, y n ive les de tr ig licé ridos de los p rim a tes m acaco c inom o lgos (M acaca fasc icu la ris ) después de la adm in is trac ión de 2 m g/kg de A D 01196 con 2 m g/kg de po lím ero de en trega de M LP. Se no rm a liza ron los n ive les de apo(a) a la predosis .
T ab la 13. N ive les de n itrógeno de urea, c rea tin ina , a lan ina transm inasa , y asparta to am ino trans fe rasa en
p rim a tes m acacos c inom o lgos (M acaca fasc icu la ris ) tras la adm in is trac ión de 2 mg / kg de A D 01196 con 2 mg / kg de po lím ero de en trega MLP.
Ejemplo 10. D e tecc ión in v ivo de ag en te s de A R N i de LP A con N A G con jugado y tiem po de knockdow n. Se adm in is tra ron agentes de AR N i de LP A con NAG con jugado a ratones trans ito riam en te transgén icos tal com o se describ ió an terio rm ente . C ada ratón recibió una sola dosis in travenosa (IV) de 2 m g/kg de agente de AR N i de LP A con 1 m g/kg de po lím ero de en trega de M LP, o una sola dosis subcu tánea (SC) de 10 m g/kg de agente de AR N i de LP A con jugado con NAG. Los n ive les de pro te ína de S E AP en el suero fue ron m on ito reados du ran te un m áxim o de 22 días. Los n ive les de knockdow n y la du rac ión de la respuesta se p resen tan en la T ab la 14-15. A D 01529 , A D 01532 y A D 01533 presen ta ron un knockdow n de los n ive les de SE A P de s 85 % después de la adm in is trac ión IV con po lím ero de en trega de M LP, y un knockdow n m áxim o del s 60 % de los n ive les de S E AP después de la adm in is trac ión SC del agente de AR N i de LP A con NAG con jugado solo.
T ab la 14. Los n ive les de p ro te ína SE A P en suero en ratones S E A P -LP A H TV después de la adm in is trac ión de 10 m g/ kg de agentes AR N i con NAG con jugado . Se no rm a liza ron los n ive les de S E AP al d ía -1 y con tro l de suero fis io lóg ico .
T a b la 15. Los n iv e le s d e p ro te ín a S E A P e n s u e ro e n ra to n e s S E A P -L P A H T V d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e 1 m g / kg d e a g e n te s A R N i c o n N A G c o n ju g a d o 2 m g /kg d e p o lím e ro d e e n tre g a d e M LP .
S e n o rm a liz a ro n los n iv e le s d e S E A P al d ía -1 y c o n tro l d e s u e ro f is io ló g ic o .
Ejemplo 11. D e te cc ió n in v ivo de ag en te s de A R N i de LP A con N A G con jugado y tiem po de knockdow n. Se adm in is tra ron agentes de AR N i de LPA con NAG con jugado a ratones S E A P -L P A H TV tal com o se describ ió an te rio rm en te . C ada ratón rec ib ió una dosis ún ica subcu tánea (SC) de 10 m g/kg agente de AR N i de LP A con NAG con jugado . Los n ive les de p ro te ína de S E AP en el suero fueron m on ito reados du ran te un m áxim o de 22 días. Los n ive les de knockdow n y la du rac ión de la respuesta se p resen tan en la T ab la 16-17. A D 01765 y A D 01768 presen ta ron > 89% de activ idad de knockdow n.
T ab la 16. Los n ive les de p ro te ína S E AP en suero en ratones S E A P -LP A H TV después de la adm in is trac ión subcu tánea de 10 m g/ kg de agente ARN i con NAG con jugado .
Se no rm a liza ron los n ive les de S E AP al d ía -1 y con tro l de suero fis io lóg ico .
T a b la 17. Los n iv e le s d e p ro te ín a S E A P e n s u e ro d e los ra to n e s S E A P -L P A H T V d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n s u b c u tá n e a d e 10 m g / kg d e a g e n te A R N i co n N A G c o n ju g a d o . S e n o rm a liz a ro n los n iv e le s d e S E A P al d ía -1 y c o n tro l d e s u e ro f is io ló g ic o .
Ejemplo 12. P ruebas in v ivo de lo s ag en te s de A R N i de LP A con N A G con jugado en ra tones Tg p a ra apo(a ). Se adm in is tra ron agentes de ARN i de LP A con NAG con jugado a ra tones Tg para apo(a) tal com o se describ ió an terio rm ente . C ada ratón rec ib ió una sola dosis subcu tánea (SC) de 10 mg / kg de agente de AR N i de LP A o suero fis io lóg ico . Se m on ito rea ron los n ive les sé ricos apo(a) hum anos du ran te un m áxim o de 22 d ías (Tab la 18). A D 01765 p resen tó el m ayor knockdow n de los n ive les de apo(a) el d ía 8 con el 96 % de knockdow n, y >74 % de knockdow n observado 3 sem anas después de la adm in is trac ión .
T ab la 18. Los n ive les de p ro te ína apo(a) en suero en ratones Tg para apo(a) después de la adm in is trac ión SC de 10 m g/ kg de agente AR N i con NAG con jugado . Se no rm a liza ron los n ive les de apo(a) al d ía -1 y con tro l de suero fis io lóg ico .
Ejemplo 13. P ruebas in v ivo de los agen tes de A R N i de LP A con N A G con jugado en ra tones LP A m c HTV. Se adm in is tra ron agentes de ARN i de LP A con NAG con jugado a ratones LP A mc H TV tal com o se describ ió an terio rm ente . C ada ratón rec ib ió una sola dosis subcu tánea (SC) de 10 mg / kg de agente de AR N i de LP A o suero fis io lóg ico . Se ana liza ron los n ive les séricos apo(a) (apo(a)) hum anos el d ía 4 (Tab la 19). A D 02001y A D 01765 y A D O 01768 presen ta ron > 90% de knockdow n el d ía 4.
T ab la 19. N ive les de p ro te ína apo(a) en suero en ratones LPA mc H TV después de la adm in is trac ión SC de 10 m g/ kg de agente AR N i con NAG con jugado . Se no rm a liza ron los n ive les de apo(a) al d ía -1 y con tro l de suero fis io lóg ico .
Ejemplo 14. K nockdow n de la apo lipo p ro te ín a (a) (apo (a)) en p rim a te s no hum anos tras la en trega d e l agen te de A R N I de LP A m ed ian te e l po lím e ro de en tre ga de M LP. El po lím ero de en trega de M LP y el agente de AR N i de LP A se p repara ron y se com b ina ron en un tam pón fa rm acéu ticam en te acep tab le . El d ía 1 y 71, se inyectó a dos p rim ates m acacos c inom o lgos (M acaca fasc icu la ris ) con 4 m g/kg de A D 01196 4 mg / kg de po lím ero de en trega de M LP o 6 m g/kg de A D 01196 6 m g/kg de po lím ero de en trega de M LP. Para cada inyección , se inyectó el agente de AR N i de LP A po lím ero de en trega de M LP en la vena sa fena con un ca té te r in travenoso de ca lib re 22-25. En todos los m om entos ind icados (FIG . 4), se tom aron m uestras de sangre y se ana liza ron los n ive les de apo(a), los n ive les de líp idos y los m arcadores de tox ic idad com o se describ ió an te rio rm en te . Se obse rvó un s ign ifica tivo knockdow n de apo(a) después de la p rim era dosis con un knockdow n m áxim o p rom ed io del 96 % para una dosis de 4 mg / kg el d ía 15, y del 96 % para una dosis de 6 mg / kg obse rvado el d ía 15. El knockdow n m áxim o p rom ed io de la Lp(a) después de la p rim era dosis fue del 98 ,5% para una dos is de 4 mg / kg el d ía 29, y del 98 ,5% para una dosis de 6 mg / kg el d ía 22. No se obse rvó tox ic idad re lac ionada con la dosis en los an im a les tra tados.
Ejemplo 15. P ruebas in v ivo de los ag en te s de A R N i de LPA con N A G con jugado en respues ta de dos is de ra tones Tg p a ra Lp(a). Se adm in is tra ron agentes de AR N i de LP A con NAG con jugado a ratones Tg para (a) tal com o se describ ió an te rio rm en te . C ada ratón rec ib ió una so la dosis subcu tánea (SC) de dos is agente de AR N i de LP A a n ive les de dosis de 0,5 mg / kg o 2 mg / kg o suero fis io lóg ico . Se m on ito rea ron los n ive les de Lp(a) en suero hasta el d ía 43 (FIG . 1, FIG . 2). T odos los agentes de AR N i LPA m ostra ron respuestas a la dosis con las dosis más altas p resen tando un m ayor knockdow n con el nad ir en tre los días 15 y 22.
Ejemplo 16. K nockdow n de la a p o lipo p ro te ín a (a) (apo(a)) en p r im a te s no hum anos tras la en tre ga de m o lécu la de l agen te de A R N i de LPA espec ífica de apo(a ). Se preparó agente de AR N i de LP A en un tam pón fa rm acéu ticam en te acep tab le tal com o se describ ió en el p resen te docum en to para inyecc ión subcu tánea (SC). En los días 1, 7 y 15, se inyectó a dos p rim a tes m acacos c inom o lgos (M acaca fasc icu la ris ) por v ía subcu tánea con 3 mg / kg de A D 02713 , A D 02819 , A D 02820, o A D 02821. A dem ás, se adm in is tró de nuevo a los m onos tra tados con A D 02819 3 mg / kg de A D 02819 el d ía 57 y el d ía 85. Se tom aron m uestras de sangre y se ana liza ron los n ive les de apo(a), los n ive les de líp idos y los m arcadores de tox ic idad com o se describ ió an te rio rm en te . Se obse rvó un knockdow n s ign ifica tivo de la Lp(a) con un knockdow n m áxim o p rom ed io del 89 % que se observó el d ía 43 para A D 02713 , del 87 % observado el d ía 36 para A D 02819 , del 79 % observado el d ía 36 para A D 02820 , y del 95 % observado el d ía 29 para AD02821 (F ig.5). No se obse rvó tox ic idad re lac ionada con la dos is en los an im a les tra tados duran te el transcu rso del experim en to .
Ejemplo 17. K nockdow n de a p o lipo p ro te ín a (a) (apo(a )) en p r im a te s no hum anos tras la en trega d e l agen te A R N i LPA. Se p reparó agente de AR N i de LP A en un tam pón fa rm acéu ticam en te acep tab le tal com o se describ ió en el presente docum en to para la inyecc ión subcu tánea (SC). En el d ía 1, se inyectó a dos p rim ates m acacos c inom o lgos (M acaca fasc icu la ris ) por v ía subcu tánea con 3 mg / kg de A D 03272 , A D 03462 , A D 03549 , A D 03547 , A D 03668 , A D 03460 , o A D 03536. A dem ás, se adm in is tró de nuevo a los m onos tra tados con A D 03460 y A D 03536 1 mg / kg del respectivo agente de AR N i de LP A el d ía 48. Se tom aron m uestras de sangre y se ana liza ron los n ive les de apo(a), los n ive les de líp idos y los m arcadores de tox ic idad com o se describ ió an te rio rm en te . Se observó un s ign ifica tivo knockdow n of Lp(a) con un knockdow n m áxim o p rom ed io del 62 % para A D 03272 el d ía 15, del 28 % para A D 03462 el d ía 15, del 47 % para A D 03549 el d ía 29, del 44 % para A D 03547 el d ía 15, del 53 % para A D 03668 el d ía 22, del 79 % para A D 03460 el d ía 29, y del 71 % 'p a ra A D 03536 el d ía 22 (FIG. 6). No se obse rvó tox ic idad re lac ionada con la dosis en los an im a les tra tados du ran te el transcu rso del experim en to .
Ejemplo 18. K nockdow n de ap o lipop ro te ína (a) (apo(a )) en p r im a te s no hum anos tras la en tre ga de m o lécu la d e l agen te de A R N i de LP A espec ífica de apo(a ). Se p reparó agente de AR N i de LP A y se com b inó en un tam pón fa rm acéu ticam en te
acep tab le tal com o se describ ió en el p resen te docum en to para la inyecc ión subcu tánea (SC). En el d ía 1, se inyectó a dos p rim a tes m acacos c inom o lgos (M acaca fasc icu la ris ) por v ía subcu tánea con suero fis io lóg ico o 2 mg / kg de A D 03460, A D 03536 , A D 03851 , A D 03853 , o A D 04110. Se tom aron m uestras de sangre y se ana liza ron los n ive les de apo(a), los n ive les de líp idos y los m arcadores de tox ic idad los d ías 8 y 15 com o se describ ió an te rio rm en te . Se norm a liza ron los n ive les de Lp(a) al p rom ed io de tres va lo res de predosis .
T ab la 20. N ive les de lipopro te ína(a) en p rim ates m acaos c inom o lgos después de la adm in is trac ión de suero fis io lóg ico o de 2 m g/kg de A D 03460 , A D 03536 , A D 03851 , A D 03853 o A D 04110.
Claims (21)
1. Un agente de in te rfe renc ia de ARN (ARN i) de LP A (lipopro te ína(a) que com prende una cadena sen tido y una cadena an tisentido , donde la cadena sen tido com prende la secuenc ia de una cu a lqu ie ra de la S E Q ID N O :1280, S E Q ID NO :1282, S E Q ID N O :1246, S E Q ID N O :1242, SE Q ID N O :1244, o S E Q ID N O :1254, y donde la cadena sentido com prende una secuenc ia que es com p lem en ta ria a la secuenc ia de la cadena sentido.
2. El agente de AR N i de LPA de la re iv ind icac ión 1, donde la cadena sentido y la cadena an tisen tido tienen cada una de 19 a 26 nuc leó tidos de long itud.
3. El agente de AR N i de LPA de la re iv ind icac ión 2, donde la cadena sentido y la cadena an tisen tido tienen cada una 21 nucleó tidos de long itud.
4. El agente de AR N i de LP A de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 3, donde el agente de AR N i de LP A com prende uno o dos exceden tes.
5. El agente de AR N i de LP A de la re iv ind icac ión 4, donde el agente de AR N i de LP A com prende un exceden te en el ex trem o 3' de la cadena an tisen tido y un exceden te en el ex trem o 3 ' de la cadena sentido.
6. El agente de AR N i de LP A de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 3, donde el agente de AR N i de LP A com prende uno o dos extrem os rom os.
7. El agente de AR N i de LP A de la re iv ind icac ión 6, donde el agente de AR N i de LP A com prende dos extrem os rom os.
8. El agente de AR N i de LPA de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 7, donde la cadena sen tido, la cadena an tisen tido o tan to la cadena sentido com o la cadena an tisentido com prenden uno o más nucleó tidos m odificados.
9. El agente de AR N i de LP A de la re iv ind icac ión 8, donde los, uno o m ás, nuc leó tidos m od ificados se se lecc ionan independ ien teen te a partir de un nucleó tido m od ificado en 2', un nucleó tido b loqueado, un nucleó tido abásico , un desox inuc leó tido invertido , un nuc leó tido m orfo lino , una im itac ión de nucleó tido 2 ',3 '-seco , o un nucleó tido que con tiene una base no natura l.
10. El agente de AR N i de LP A de la re iv ind icac ión 9, donde el nuc leó tido m od ificado en 2 ' es un 2 '-O -m e til-nuc leó tido , un 2 '-deox i-2 '-fluo ro -nuc leó tido , un 2 '-deox inuc leó tido , un 2 '-m e tox ie til-nuc leó tido , un 2 '-am ino -nuc leó tido , o un 2 '-a lqu ilnucleó tido .
11. El agente de AR N i de LPA de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 10, donde el agente de AR N i de LPA com prende uno o más en laces in te rnuc leós idos de fos fo ro tioa to .
12. El agente de AR N i de LPA de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 11, donde el agente de AR N i de LPA com prende un g rupo d iana, donde el g rupo d iana com prende un ligando recep to r de la as ia log lucopro te ína .
13. El agente de AR N i de LP A de la re iv ind icac ión 12, donde el ligando recep to r de la as ia log lucop ro te ína com prende un con jun to de ga lac tosa se lecc ionado a partir de (C 11-P E G 3-N A G 3), (C 6-P E G 4-N A G 3), (N AG 3), (N AG 4), (N A G 3-A A 2), (N A G 3-P a lm ), (N A G 13), (N A G 18), (N AG 24), (N A G 25), (N A G 25)s, (N A G 26), (N A G 27), (N A G 28), (N A G 29), (N AG 30), (N A G 30)s, (N A G 31), (N A G 31s), (N A G 32), (N A G 33), (N A G 34), (N A G 35), (N A G 36), y (N A G 37).
14. El agente de AR N i de LPA de la re iv ind icac ión 12 o 13, donde el g rupo d iana se con juga al ex trem o 5' de la cadena sen tido o al ex trem o 3' de la cadena sentido.
15. El agente de AR N i de LP A de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 14, donde:
a) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de la S E Q ID N O :1280 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de la SE Q ID NO :1284;
b) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de la S E Q ID N O :1246 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de la SE Q ID NO :1247;
c) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de la SE Q ID N O :1242 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de la SE Q ID NO :1243;
d) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de la S E Q ID N O :1244 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de la SE Q ID NO :1245;
e) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de la S E Q ID N O :1254 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de la SE Q ID NO :1255;
f) la cadena an tisen tido com prende la secuenc ia de la SE Q ID N O :1280 y la cadena sentido com prende la secuenc ia de la SE Q ID N O :1260; o
g) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de la S E Q ID N O :1282 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de la SE Q ID NO :1259.
16. El agente de AR N i de LP A de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 15, donde:
a) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de la S E Q ID N O :188 y la cadena sentido com prende la secuenc ia de la SE Q ID N O :384;
b) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de la S E Q ID N O :156 y la cadena sentido com prende la secuenc ia de la SE Q ID N O :310;
c) la cadena an tisen tido com prende la secuenc ia de la S E Q ID N O :164 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de la SE Q ID N O :357;
d) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de la S E Q ID N O :164 y la cadena sentido com prende la secuenc ia de la SE Q ID N O :376; o
e) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de la S E Q ID N O :164 y la cadena sentido com prende la secuenc ia de la SE Q ID N O :384.
17. El agente de AR N i de LP A de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 16, donde:
a) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de nucleó tidos m od ificados de acuerdo con la SE Q ID NO: 790 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de nucleó tidos m od ificados de acuerdo con la SE Q ID NO: 1189;
b) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de nucleó tidos m od ificados de acuerdo con la SE Q ID NO: 637 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de nucleó tidos m od ificados de acuerdo con la SE Q ID NO: 1132;
c) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de nuc leó tidos m od ificados de acuerdo con la SE Q ID NO: 709 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de nucleó tidos m od ificados de acuerdo con la SE Q ID NO: 1135;
d) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de nucleó tidos m od ificados de acuerdo con la SE Q ID NO: 787 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de nucleó tidos m od ificados de acuerdo con la SE Q ID NO: 1191; o e) la cadena an tisentido com prende la secuenc ia de nucleó tidos m od ificados de acuerdo con la SE Q ID NO: 788 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de nucleó tidos m od ificados de acuerdo con la SE Q ID NO: 1189.
18. El agente de AR N i de LP A de la re iv ind icac ión 17, donde la cadena an tisen tido com prende la secuenc ia de nucleó tidos m od ificados de acuerdo con la S E Q ID NO: 790 y la cadena sen tido com prende la secuenc ia de nuc leó tidos m od ificados de acuerdo con la SE Q ID NO: 1189.
19. Una com posic ión fa rm acéu tica que com prende el agente de AR N i de LP A de una cu a lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 18 y un exc ip ien te fa rm acéu ticam en te aceptab le .
20. El agente de AR N i de LP A de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 18 para su uso en el tra tam ien to de una en fe rm edad ca rd iovascu la r en un su je to con necesidad de ello.
21. El agente de AR N i de LP A de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 18 para su uso en el tra tam ien to de en fe rm edad de Berger, en fe rm edad arte ria l perifé rica , en fe rm edad arteria l co ronaria , s índrom e m etabó lico , s índrom e co ronario agudo, es tenos is de la vá lvu la aórtica , regu rg itac ión de la vá lvu la aórtica , d isecc ión aórtica , oc lus ión de la a rte ria re tin iana, en fe rm edad ce reb rovascu la r, isquem ia m esenté rica , oc lus ión arteria l m esen té rica superio r, es tenos is arteria l renal, ang ina estab le /ines tab le , s índrom e co ronario agudo, h ipe rco les te ro lem ia fam ilia r he te roc igo ta u hom ocigota , h ipe rapobe ta lipop ro te inem ia , a te roesc le ros is ce reb rovascu la r, en fe rm edad ce reb rovascu la r y trom bosis ven o sa en un su je to con necesidad de ello.
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