ES2891177T3

ES2891177T3 - Composición de glicosil hesperetina y procedimiento para producir la misma

Info

Publication number: ES2891177T3
Application number: ES15758551T
Authority: ES
Inventors: Mitsuyuki KAMBE; Koichi Nishi; Akira Kawashima; Akiko Yasuda; Hitoshi Mitsuzumi; Toshio Ariyasu
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 2014-03-03
Filing date: 2015-03-03
Publication date: 2022-01-26
Anticipated expiration: 2035-03-03
Also published as: BR112016020356B1; JPWO2015133483A1; KR20160127763A; TWI673282B; KR102172553B1; US20170081354A1; US10703773B2; EP3135682A1; US20200283466A1; MY177500A; PH12016501729A1; TW201623322A; MX2016011424A; JP6675528B2; EP3135682B1; CN106661073A; WO2015133483A1; EP3935960A1; US11453694B2; CN106661073B

Abstract

Una composición de glicosil hesperetina, que comprende, como glicosil hesperetina, α-glicosil hesperidina y una o ambas de hesperidina y 7-O-β-glucosil hesperetina en una cantidad del 90% o más en masa, pero menos de 100% en masa, en una base sólida seca, en donde el contenido de α-glucosil hesperidina es de 90% en masa o menos, en una base sólida seca, y en la que el contenido de furfural medido en el análisis de GC/MS es inferior a 200 ppb, en una base sólida seca.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición de glicosil hesperetina y procedimiento para producir la misma

Campo técnico

La presente invención se refiere a una nueva composición de glicosil hesperetina, y más concretamente, a una composición de glicosil hesperetina que tiene una reducción significativa de sabores diversos, y su producción. Aunque los detalles se describirán más adelante, el término glicosil hesperetina como se menciona en la memoria descriptiva significa compuestos en general constituidos de hesperetina acoplada con uno o varios sacáridos (denominados "compuestos que tienen la estructura de hesperetina", de aquí en adelante); hesperidina, 7-O-pglucosil hesperetina que tiene una estructura parcial de hesperidina, en la que el resto de ramnosa como constituyente de rutinosa en la hesperidina se ha liberado de la misma, y a-glicosil hesperidinas, en las que sacáridos tales como D-glucosa, D-fructosa y D-galactosa se unen a hesperidina en los enlaces a en cantidades equimolares o mayores.

Técnica anterior

Se sabe que, entre las vitaminas, la vitamina P se relaciona con las funciones fisiológicas de la vitamina C en los organismos vivos, por ejemplo, se relaciona con la reacción de hidroxilación de prolina y lisina requerida para la síntesis de colágeno como ingrediente principal de los tejidos conectivos biológicos. así como a la reacción rédox para reducir Fe+++ en el citocromo C a Fe++ y al efecto inmunopotenciador de la leucocitosis; y juega un papel importante en el mantenimiento y promoción de la salud de los organismos vivos.

La hesperidina, también conocida como vitamina P, es un compuesto representado por la siguiente Fórmula Química 1 con la estructura de la hesperetina, donde la rutinosa compuesta de ramnosa y glucosa se une a la hesperetina, y es una forma de flavonoide contenido abundantemente en los pericarpios de los frutos cítricos; adicionalmente, se sabe, y se utiliza desde hace mucho tiempo, que la vitamina P tiene funciones fisiológicas de refuerzo de los capilares, prevención de hemorragias y regulación de la presión arterial; y es ampliamente utilizada, por ejemplo, en productos alimenticios, cosméticos, productos farmacéuticos, etc.

Fórmula Química 1:

[Qüim. 1]

(Ramnosa) (Glucosa) (Hesperetina)

Rutinosa

Hesperidina (Formula Química 1)

Además del uso de hesperidina como agente enriquecido en vitamina P como mero nutriente, la hesperidina, en vista de su estructura química y funciones fisiológicas, se puede incorporar sola o combinada con otras vitaminas en productos alimenticios como antioxidante, estabilizador, agente de mejora de la calidad, agente absorbente de ultravioleta, etc.; productos farmacéuticos tales como agentes profilácticos y terapéuticos, es decir, agentes para enfermedades sensibles a hesperidina tales como enfermedades virales, enfermedades bacterianas, enfermedades circulatorias y tumores malignos sensibles a la hesperidina; e incluso en cosméticos tales como agentes embellecedores de la piel, agentes blanqueadores de la piel y agentes antienvejecimiento como estabilizador, antioxidante, agente absorbente de ultravioleta y agente inhibidor de la formación de melanina. Por tanto, la hesperidina se utiliza de forma bastante amplia.

Sin embargo, dado que la hesperidina apenas se disuelve en agua a una mera concentración de aproximadamente un gramo en 50 L de agua (o aproximadamente 0,002% p/v) a temperatura ambiente, tiene una gran dificultad de uso.

Como medio para mejorar el problema anterior, por ejemplo, la Bibliografía de Patentes 1 describe a-glicosil hesperidina, preparada permitiendo que una enzima de transferencia de sacáridos (o glicosiltransferasa) actúe sobre una solución que contiene hesperidina y un producto de la hidrólisis parcial del almidón, que tiene una solubilidad en agua relativamente alta y que se hidroliza fácilmente in vivo para ejercer las funciones fisiológicas inherentes a la hesperidina sin temor a inducir toxicidad alguna, y un método para producir la misma.

Como ejemplo representativo de a-glicosil hesperidina, la a-glucosil hesperidina, conocida como hesperidina tratada con enzimas, glicosil hesperidina con sacáridos transferidos, hesperidina soluble en agua o glicosil vitamina P con sacáridos transferidos, es un compuesto que se muestra en la siguiente Fórmula Química 2, en donde una glucosa en moles se une a la glucosa en la estructura de rutinosa de la hesperidina a través de enlaces a, y se comercializa como un producto que lo contiene como ingrediente principal, por ejemplo, "HAYASHIBARA HESPERIDIN® S", un nombre de producto de una glucosil hesperidina comercializada por Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japón.

Fórmula Química 2:

[Quim. 2]

(Glucosa)

^{o í ~} Glucosil hesperidina (Formula Química 2)

Se sabe que los productos convencionales que contienen a-glicosil hesperidina contienen hesperidina concomitante conocida como material de producción causante de la reducción de la solubilidad en agua de a-glicosil hesperidina; y, como prueba para mejorar la reducción anterior, una conversión de hesperidina en 7-O-p-glucosil hesperetina, como se muestra en la siguiente Fórmula Química 3, que se puede obtener liberando el resto de ramnosa que constituye la estructura de rutinosa de la hesperidina y tiene una solubilidad en agua claramente más alta que la hesperidina. Por ejemplo, la Bibliografía de Patentes 2 describe un método para producir un producto con alto contenido de a-glicosil hesperidina con una mejor solubilidad en agua al permitir que la a-L-ramnosidasa (EC 3.2.1.40) actúe sobre una solución que contiene hesperidina junto con a-glucosil hesperidina. a una concentración relativamente alta para convertir la hesperidina en 7-O-p-glucosil hesperetina y reducir el contenido de hesperidina restante.

Fórmula Química 3:

(Glucosa) (Hesperetina)

7-0-3-glucosil hesperetina (Fórmula Química 3)

Los productos que contienen glicosil hesperetinas, es decir, las que se denominan glicosil hesperetinas, tales como la hesperidina convencional, la a-glucosil hesperidina y la 7-O-p-glucosil hesperetina (en lo sucesivo, pueden denominarse simplemente "productos convencionales"), tienen un amargor específico (que incluye dureza, aspereza o astringencia) y un retrogusto desfavorable, es decir, un sabor diverso; se describe, por ejemplo, en la Bibliografía de Patentes 3, un método para añadir ácido málico a bebidas que contienen a-glicosil hesperidina, es decir, glicosil hesperetina, también conocida como hesperidina soluble en agua, como método para mejorar el defecto anterior. Sin embargo, incluso ahora, todavía no se ha proporcionado ningún producto de glicosil hesperetina, cuyos sabores diversos característicos de los productos convencionales se hayan mejorado hasta un nivel completamente satisfactorio.

Bibliografía de la técnica anterior

Bibliografía de patentes

Bibliografía de Patentes 1: Patente Japonesa Registrada Núm. 3060227

Bibliografía de Patentes 2: Patente Japonesa Registrada Núm. 3833811

Bibliografía de Patentes 3: Patente Japonesa Kokai Núm. 2011-126849

Bibliografía de Patentes 4: Documento JP H11-346792 A, que divulga una a-glicosilhesperidina que tiene restos de D-glucosa en una cantidad equimolar o mayor unidos a una hesperidina a través de un enlace a. Bibliografía de Patentes 5: Documento TW201319080 A, que divulga una a-glucosil hesperidina cristalina. Bibliografía No Relacionada con Patentes

Bibliografía no relacionada con patentes 1: "Opinion of the Scientific Panel on Food Additives, Flavourings, Processing Aids and Materials in Contact with Food on a request from the Commission related to Furfural and Furfural Diethylacetal", EFSA Journal, 1 de junio de 2004, páginas 1 a 27.

Divulgación de la invención

Objeto de la invención

La presente invención, que se realizó para superar el defecto anterior, tiene como objetivo proporcionar una composición de a-glicosil hesperetina que tiene una reducción significativa de sabores diversos en comparación con los productos convencionales, y su producción.

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

Medios para lograr el objeto

Los autores de la presente invención se centraron en los sabores diversos como un defecto de los productos convencionales y realizaron esfuerzos de investigación con interés con el objetivo de superar el defecto. Los autores de la presente invención asumieron que deben existir una o varias sustancias causantes de los diversos sabores de los productos convencionales, que están inherentemente contenidas en algunos materiales de producción de los productos (se pueden denominar simplemente "sustancia o sustancias causantes de los sabores diversos", en lo sucesivo) o tal o tales sustancias causantes se forman durante sus etapas de producción. Bajo la suposición anterior, los autores de la presente invención realizaron repetidamente varios estudios sobre los medios para reducir los sabores diversos de los productos convencionales y encontraron recientemente una composición de glicosil hesperetina cuyos sabores diversos se reducen significativamente en comparación con los productos convencionales, cuando coexisten uno o varios agentes reductores en cualquiera de sus etapas de producción. Adicionalmente, los autores de la presente invención han descubierto recientemente que tal nueva composición de glicosil hesperetina tiene una clara reducción de la coloración y del olor en comparación con los productos convencionales. Además, los autores de la presente invención compararon en detalle las características de la nueva composición de glicosil hesperetina así obtenida con las de los productos convencionales y encontraron lo siguiente: (A) Ambos son productos basados en glicosil hesperetina pero tienen un contenido de furfural diferente, es decir, un aldehído aromático como ingrediente traza, o 2-furancarboxialdehído como Nombre IUPAC; y (B) la nueva composición de glicosil hesperetina de la presente invención que tiene una reducción significativa de sabores diversos tiene un contenido de furfural significativamente reducido en comparación con los productos convencionales, y en otras palabras, esto significa que la que tiene un contenido de furfural significativamente reducido es una composición de glicosil hesperetina que tiene una reducción significativa de sabores diversos en comparación con los productos convencionales. Basándose en estos hallazgos, los autores de la presente invención descubrieron recientemente que el contenido de furfural seguramente podría convertirse en un índice para obtener una glicosil hesperetina que tiene una reducción significativa de sabores diversos.

Basándose en la serie de hallazgos anterior, los autores de la presente invención completaron la presente invención de tal manera que se centraron en el contenido de furfural, como un índice para obtener una composición de glicosil hesperetina que tiene una reducción significativa de sabores diversos como un defecto de los productos convencionales, contenidos en tal composición de glicosil hesperetina; y obtuvieron una composición deseada de glicosil hesperetina que tiene una reducción significativa de sabores diversos en comparación con los productos convencionales, utilizando un agente reductor en cualquiera de sus etapas de producción como un medio para obtener tal glicosil hesperetina que tiene un contenido de furfural significativamente reducido.

La presente invención resuelve los objetos anteriores proporcionando una composición de glicosil hesperetina según la reivindicación 1 que no contiene sustancialmente furfural. El término "no contiene sustancialmente furfural" como se menciona en la presente invención significa que el contenido de furfural en la composición de glicosil hesperetina está en un nivel significativamente bajo en comparación con los productos convencionales. Concretamente, significa que el nivel de contenido de furfural es menos de 200 ppb, donde una ppb significa una parte por mil millones, preferiblemente menos de 100 ppb, más preferiblemente menos de 50 ppb, además preferiblemente menos de 30 ppb, además menos de 20 ppb, particularmente preferiblemente menos de 15 ppb, y más preferiblemente menos de 10 ppb, cuando se determina con el método analítico descrito más adelante utilizando una cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de (abreviado como "analizador GC/MS", en lo sucesivo) que se muestra en el apartado "(1) Contenido de furfural" en el Experimento 1 descrito más adelante. Entre las composiciones de glicosil hesperetina de acuerdo con la presente invención, aquellas que tienen un contenido de furfural reducido a un nivel por debajo del límite de detección del analizador GC/MS son composiciones de glicosil hesperetina claramente de alta calidad cuyos sabores diversos se reducen significativamente en comparación con los productos convencionales y también cuyas coloraciones se reducen notablemente. Dejando de lado el uso de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención en los campos de productos farmacéuticos, aparatos de precisión, etc., la glicosil hesperetina con una pureza máxima no debería necesariamente ser necesaria cuando se utiliza en los campos de productos alimenticios, delicias ("shikohin"), cosméticos, materias primas/materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos o productos de plástico; lo que significa que la glicosil hesperetina no debe ser necesariamente una cuyo contenido de furfural se reduzca a un nivel por debajo de su límite de detección.

La presente invención resuelve el otro objeto mencionado anteriormente proporcionando un método de acuerdo con la reivindicación 4 para producir la composición de glicosil hesperetina de la invención, que comprende las etapas de (a) proporcionar una solución acuosa que contiene hesperidina y un producto de la hidrólisis parcial del almidón, (b) permitir una glicosiltransferasa para actuar sobre la solución acuosa para formar glicosil hesperetina, y (c) recolectar la glicosil hesperetina formada para obtener la composición de glicosil hesperetina, en donde una o más de las etapas (a) a (c) se llevan a cabo en presencia de una agente reductor inorgánico.

Adicionalmente, la presente invención resuelve el otro objeto mencionado anteriormente al proporcionar productos alimenticios, delicias ("shikohin"), cosméticos, productos farmacéuticos, cuasifármacos, productos químicos, materias primas/materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos o productos de plástico, todos los cuales contienen la composición de glicosil hesperetina de la presente invención. La presente divulgación también proporciona un método para reducir los sabores diversos de un producto que contiene glicosil hesperetina, que contiene una etapa para permitir que el producto entre en contacto con un agente reductor.

Efecto de la invención

A diferencia de los productos convencionales, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención tiene la característica sobresaliente de tener una reducción significativa de sabores diversos. De acuerdo con el método para producir la composición de glicosil hesperetina de la presente invención, se pueden ejercer beneficios prácticos al proporcionar una composición de glicosil hesperetina que tiene una reducción significativa de sabores diversos en comparación con los productos convencionales a escala industrial, de manera estable y con un rendimiento relativamente alto, así como de forma sencilla y a menor coste. Por lo tanto, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención se puede utilizar preferiblemente en artículos/bienes/productos en los que los productos convencionales difícilmente podrían utilizarse o serían problemáticos debido a sus sabores diversos solos o junto con sus coloraciones, o incluso debido a sus olores. Dado que la composición de glicosil hesperetina de la presente invención tiene una reducción significativa de sabores diversos en comparación con los productos convencionales, además de tener una clara reducción de la coloración y del olor, ejerce un beneficio práctico ventajoso en el sentido de que proporciona productos de alta calidad incluso cuando se producen a través de etapas de calentamiento. Descripción detallada

Las composiciones de glicosil hesperetina de la presente invención tienen en común con los productos convencionales la propiedad de que están compuestas principalmente de glicosil hesperetina, pero las primeras consisten en una nueva composición de glicosil hesperetina que tiene una reducción significativa de sabores diversos en comparación con las últimas.

El término "composición de glicosil hesperetina" en el contexto de la presente invención significa una composición que contiene como ingrediente o ingredientes principales (1) a-glicosil hesperidina y (2) una o ambas de hesperidina y 7-O-p-glucosil hesperetina en una cantidad de 90% o más en masa pero menos de 100% en masa, en base sólida seca, y en donde el contenido de a-glucosil hesperidina es de 90% en masa o menos, en base sólida seca, y donde el contenido de furfural medido en el análisis GC/MS es inferior a 200 ppb, en base sólida seca, como se define en la reivindicación 1. La composición puede contener adicionalmente (3) flavonoides tales como narirutina, diosmina, neoponcirina y glucosil narirutina, y (4) elementos traza tales como sales. El porcentaje total (% en masa) de los ingredientes anteriores (1) y (2) en la glicosil hesperetina de la presente invención (simplemente denominado "contenido de glicosil hesperetina", a menos que se especifique lo contrario, en lo sucesivo) es, en base sólida seca (d.s.b), al menos 90% en masa pero menos de 100% en masa, preferiblemente al menos 93% en masa pero menos de 100% en masa, más preferiblemente al menos 95% en masa pero menos de 100% en masa, más preferiblemente al menos 97% en masa pero menos de 100% en masa, y adicionalmente al menos 98% en masa pero menos de 100% en masa (en toda la memoria descriptiva, "% en masa" se abrevia como "%", si no se especifica lo contrario).

Dejando de lado el uso de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención en los campos de los productos farmacéuticos, aparatos de precisión, etc., cuando se utiliza en los campos de los productos alimenticios, delicias ("shikohin"), cosméticos, materias primas/materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos o productos de plástico, en los que la glicosil hesperetina con una pureza máxima no debería ser sustancialmente necesaria o incluso la que tiene una pureza relativamente baja no causa sustancialmente ningún problema específico, el límite superior de la cantidad de glicosil hesperetina en la composición de la presente invención es usualmente de 99%, d.s.b, lo que facilita el suministro a escala industrial y a un coste menor; 98%, d.s.b., que proporciona el suministro a menor coste; e incluso un nivel bajo de hasta 97% d.s.b., o inferior, que permite el suministro a menor coste, considerando las formas de los productos finales y posibilitando el suministro de los productos a menor coste. Sin embargo, en el caso del contenido, d.s.b, de glicosil hesperetina en la composición de glicosil hesperetina, este se requeriría inevitablemente en una cantidad mayor que en caso de utilizar una con un mayor contenido de glicosil hesperetina, lo que daría como resultado un manejo laborioso y una manejabilidad desfavorable. Para evitar tal defecto, el límite inferior del contenido de glicosil hesperetina es al menos 90%, preferiblemente al menos 93%, más preferiblemente al menos 95% e incluso más preferiblemente al menos 97%.

Los ejemplos de las realizaciones preferidas de la glicosil hesperetina de la presente invención incluyen aquellas con un contenido de a-glicosil hesperidina de al menos 50% pero menos de 100%.

En el caso de proporcionar la composición de glicosil hesperidina de la presente invención como fuente de a-glucosil hesperidina a un coste menor, el límite superior del contenido de a-glucosil hesperidina en la composición de glicosil hesperidina de la presente invención puede ser usualmente de 90% o inferior para proporcionarla industrialmente fácilmente en una cantidad relativamente mayor y a un coste menor; preferiblemente 85% o inferior para proporcionarlo a un coste menor; y más preferiblemente 80% o inferior para proporcionarlo a un coste adicionalmente menor. Al mismo tiempo, el límite inferior del contenido de a-glucosil hesperidina es usualmente de al menos 60%, 65% o 70% por una razón similar a la del contenido de glicosil hesperetina mencionado anteriormente. En particular, los ejemplos de realizaciones preferidas de las composiciones de glicosil hesperetina de la presente invención incluyen aquellas con un contenido de a-glucosil hesperidina de 60 a 90%, d.s.b.

El contenido de glicosil hesperetina mencionado anteriormente en la composición de glicosil hesperetina de la presente invención se puede determinar mediante cualquier aparato de medición utilizado comúnmente en la técnica. Un ejemplo de esto es el siguiente. El contenido de glicosil hesperetina se determina tomando muestras de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención; diluyendo o disolviendo la muestra con agua refinada para proporcionar una concentración de, por ejemplo, 0,1% p/p; filtrando la solución resultante con un filtro de membrana de 0,45 pm comercializado; someter el producto filtrado a cromatografía líquida de alto rendimiento (denominada "HPLC", en lo sucesivo) utilizando una hesperidina de grado reactivo, comercializada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japón, como sustancia patrón en las siguientes condiciones; y calculando el contenido de glicosil hesperetina basado en el área de cada pico que aparece en el cromatograma a una longitud de onda UV de 280 nm y el peso molecular correspondiente a cada pico para cada glicosil hesperetina tal como hesperidina, a-glicosil hesperidina (a-glucosil hesperidina, etc.), o 7-O-p-glucosil hesperetina. La cuantificación de glicosil hesperetina se describe a continuación.

<Condiciones analíticas de HPLC>

■ Aparato HPLC: "LC-20AD", comercializado por SHIMADZU CORPORATION, Kyoto, Japón

■ Desgasificador: "DGU-20A3", comercializado por SHIMADZU CORPORATION, Kyoto, Japón

■ Columna: "CAPCELL PAK C18 UG 120", comercializada por Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japón

■ Volumen de inyección de muestra: 10 pL

■ Eluyente: agua/acetonitrilo/ácido acético (80/20/0,01 (en razón en volumen))

■ Velocidad de flujo: 0,7 mL/min

■ Temperatura: 40°C

■ Detección: "SPD-20A", un detector UV, comercializado por SHIMADZU CORPORATION, Kyoto, Japón ■ Longitud de onda de medición: 280 nm

■ Procesador de datos: "CHROMATOPAC C-R7A" comercializado por SHIMADZU CORPORATION, Kyoto, Japón

<Cuantificación de glicosil hesperetina>

(1) Contenido de hesperidina: Se analiza mediante HPLC y se calcula basándose en la razón entre un área del pico de hesperidina en una muestra y la de una hesperidina de grado reactivo como sustancia patrón, comercializada porWako Pure Chemical Industries, Tokio, Japón, a una concentración prescrita.

(2) Contenido de a-glucosil hesperidina: Se analiza mediante HPLC y se calcula basándose en la razón entre un área del pico de a-glucosil hesperidina en una muestra y la de una hesperidina de grado reactivo como sustancia patrón, comercializada por Wako Pure Chemical Industries, Tokio, Japón, a una concentración prescrita; y en la razón del peso molecular de a-glucosil hesperetina con respecto a hesperidina.

(3) Contenido de 7-O-p-glucosil hesperetina: se analiza mediante HPLC y se calcula basándose en la razón entre el área del pico de 7-O-p-glucosil hesperetina en una muestra y la de una hesperidina de grado reactivo como sustancia patrón, comercializada por Wako Pure Chemical Industries, Tokio, Japón, a una concentración prescrita; y en la razón del peso molecular de a-glucosil hesperetina con respecto a hesperidina.

(4) Contenido de otras glicosil hesperetinas: se analizan mediante HPLC y se calculan basándose en la razón entre el área del pico de cada una de las otras glicosil hesperetinas en una muestra y la de una hesperidina de grado reactivo como sustancia patrón, comercializada porWako Pure Chemical Industries, Tokio, Japón, a una concentración prescrita; y en la razón del peso molecular de las otras a-glucosil hesperetinas respectivas con respecto a la hesperidina.

El término "el contenido de glicosil hesperetina, d.s.b." en la composición de glicosil hesperetina de la presente invención significa un porcentaje (%) del contenido total de glicosil hesperetina determinado en los apartados (1) a (4) anteriores con respecto al peso, d.s.b, de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención utilizada como muestra.

En comparación con los productos convencionales, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención es aquella que tiene una reducción significativa de sabores diversos y que, habiendo sido obtenida con referencia al contenido de furfural, no contiene sustancialmente furfural. En otras palabras, el contenido de furfural en la composición de glicosil hesperetina de la presente invención es un índice para obtener una composición de glicosil hesperetina que tiene una reducción significativa de sabores diversos, y la memoria descriptiva describe un método para producir tal glicosil hesperetina utilizando el contenido de furfural como índice. No hace falta decir que cuanto menor es el contenido de furfural, más significativamente se reducen los sabores diversos de la glicosil hesperetina. Durante los procedimientos para examinar diversamente la composición de glicosil hesperetina de la presente invención, los autores de la presente invención encontraron que, entre las composiciones de glicosil hesperetina de la presente invención, aquellas que no contienen sustancialmente furfural y 4-vinil anisol (abreviado como "4-VA", en lo sucesivo) también conocido como 4-metoxiestireno, una clase de éter fenólico, tienen una más clara reducción de sabores diversos, así como coloración. El contenido de 4-VA, que se estima que es un posible ingrediente generado a partir de cualquiera de las sustancias utilizadas para producir la composición de glicosil hesperetina de la presente invención, suele ser inferior a 30 ppb con respecto a la masa de la composición de glicosil hesperetina, d.s.b; y el contenido de 4-VA suele estar en una relación paralela con el contenido de furfural en la composición de glicosil hesperetina que tiene un contenido de furfural de menos de 200 ppb. El término "no contiene sustancialmente 4-VA" en el contexto de la presente invención significa que, de forma similar al furfural, el contenido de 4-VA está en un nivel significativamente bajo en comparación con los productos convencionales. Concretamente, el contenido de 4-VA en la composición de glicosil hesperetina de la presente invención es usualmente menos de 30 ppb, preferiblemente menos de 15 ppb, más preferiblemente 10 ppb, además preferiblemente menos de 5 ppb, más preferiblemente menos de 3 ppb, e incluso más preferiblemente menos de 2 ppb de la masa de la glicosil hesperetina, d.s.b, cuando se determina en el método analítico utilizando el analizador GC/MS mostrado en "(2) 4-VA" en el Experimento 1 descrito más adelante.

Adicionalmente, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención tiene la característica ventajosa de tener una reducción significativa de sabores diversos, que son un defecto de los productos convencionales; o no solo tiene la característica ventajosa de tener una reducción significativa de sabores diversos en comparación con los productos convencionales, sino que conserva esa característica ventajosa incluso cuando se calienta después de disolverse en una solución acuosa. Los sabores diversos de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención pueden evaluarse con la evaluación sensorial de los panelistas mostrada en el "Experimento 2: Prueba sensorial" descrito más adelante.

La composición de glicosil hesperetina de la presente invención tiene la característica ventajosa de tener una clara reducción de la coloración en comparación con los productos convencionales (puede denominarse "grado de coloración", de aquí en adelante). El grado de coloración de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención se determina con el método mostrado en "(2) Tono de color y grado de coloración" en el Experimento 1 descrito más adelante y descrito de la siguiente manera. Una solución acuosa con una concentración prescrita de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención se somete a un tratamiento térmico en un recipiente sellado, y la solución resultante se observa macroscópicamente para determinar su tono de color y se mide para determinar sus absorbancias de DO⁴²⁰nm y DO⁷²⁰nm a las respectivas longitudes de onda de 420 nm y 720 nm, seguido del cálculo de la diferencia entre las absorbancias anteriores, DO⁴²⁰nm menos OD⁷²⁰nm, para obtener un valor para su uso como grado de coloración. Las realizaciones preferidas de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención incluyen aquellas que tienen la diferencia anterior menor que 0,24, preferiblemente 0,20 o menor, más preferiblemente 0,17 o menor, y además preferiblemente 0 o mayor, pero 0,15 o menor. Dado que los productos convencionales tienen el defecto de aumentar claramente su grado de coloración cuando se calientan, la solución acuosa anterior se calienta intencionalmente al poner en práctica este ensayo para evaluar con precisión la coloración de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención per se y el grado de coloración mediante calentamiento.

Las realizaciones preferidas de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención incluyen aquellas que tienen una conductividad eléctrica de menos de 10 pS/cm, preferiblemente menos de 8 pS/cm, más preferiblemente menos de 6 pS/cm, además preferiblemente más de 0 pS/cm pero menos de 4,5 pS/cm, cuando se determina preparándolas en soluciones acuosas al 1% p/p, calentando las soluciones acuosas a 100°C durante 30 min en los respectivos recipientes sellados y enfriando las soluciones calentadas a 20°C antes de determinar su conductividad eléctrica. La conductividad eléctrica se puede determinar con un medidor de conductancia convencional. Dado que los productos convencionales tienen una conductividad eléctrica de más de 10 pS/cm, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención puede tener un rasgo característico de un contenido menor de compuestos ionizables en comparación con los productos convencionales. La razón por la que las soluciones acuosas de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención se calientan en el ensayo anterior se ha establecido en vista de la dinámica del grado de coloración mencionado anteriormente.

Las realizaciones preferidas de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención incluyen aquellas que tienen un contenido relativamente bajo de calcio, potasio, magnesio y sodio, que son compuestos iónicos que influyen en la conductividad eléctrica de la glicosil hesperetina, en comparación con los productos convencionales. El contenido de calcio, potasio, magnesio y sodio en la composición de glicosil hesperetina de la presente invención se puede determinar con un método de análisis espectrométrico de emisión de plasma acoplado inductivamente de alta frecuencia, comúnmente utilizado en la técnica. Los ejemplos de composiciones de glicosil hesperetina preferidas de la presente invención incluyen aquellas que tienen contenidos de calcio, potasio, magnesio y sodio de 1 ppm o menos, 0,1 ppm o menos, 0,2 ppm o menos, y 0,4 ppm o menos, respectivamente, frente a la glicosil hesperetina, d.s.b; más preferiblemente 0,6 ppm o menos, 0,06 ppm o menos, 0,1 ppm o menos y 0,3 ppm o menos, respectivamente; y más preferiblemente 0 ppm o más pero 0,5 ppm o menos, 0 ppm o más pero 0,05 ppm o menos, 0 ppm o más pero 0,08 ppm o menos, y 0 ppm o más pero 0,2 ppm o menos, respectivamente.

Por lo tanto, se considera que la composición de glicosil hesperetina de la presente invención tiene una reducción del contenido de compuestos iónicos fisiológicamente aceptables tales como sales y otros componentes iónicos debido a que, en comparación con los productos convencionales, la composición de glicosil hesperetina tiene una reducción tanto de conductividad eléctrica como de concentración de elementos metálicos (o iones metálicos) tales como calcio, potasio, magnesio y sodio.

Las siguientes son explicaciones secuenciales de método para producir la glicosil hesperetina de acuerdo con la presente invención, y el método para reducir los sabores diversos de los productos que contienen glicosil hesperetina de acuerdo con la presente divulgación.

El método de la presente invención produce la glicosil hesperetina según la invención y comprende las etapas de: (a) proporcionar una solución acuosa que contiene hesperidina y un producto de la hidrólisis parcial del almidón; (b) permitir que una glicosiltransferasa actúe sobre la solución acuosa resultante para formar glicosil hesperetina que contiene a-glucosil hesperidina; y (c) recoger la glicosil hesperetina formada; donde una o más de las etapas (a) a (c) se llevan a cabo en presencia de un agente reductor inorgánico en una cantidad de 0,001 a 0,5% en masa con respecto a la masa de la solución de reacción enzimática obtenida después de la etapa (b). Las siguientes son explicaciones sucesivas de los materiales de producción, reacciones enzimáticas tales como reacciones de transferencia/transglicosilación de sacáridos, tratamientos con agentes reductores y métodos de purificación utilizados en el método de producción anterior.

Materiales de producción:

Los ejemplos de hesperidina como material de producción utilizado en la presente divulgación incluyen cualquiera de las hesperidinas utilizadas en la producción de productos convencionales y aquellas con una pureza de hesperidina relativamente alta, así como otras, que tienen una pureza de hesperidina relativamente baja, tales como extractos, zumos y productos parcialmente purificados derivados de plantas que contienen hesperidina, uno o más de los cuales se pueden utilizar adecuadamente combinados. Los ejemplos de las plantas que contienen hesperidina mencionadas anteriormente incluyen, por ejemplo, cítricos que pertenecen al género Citrus de la familia Rutaceae tales como mandarinas, naranjas, cítricos ácidos sabrosos, cítricos de razas mixtas, tangors, tangelos, shaddocks, kumquats y naranjas amargas; donde las partes representativas que contienen hesperidina son frutas, cáscaras, semillas, frutas inmaduras, etc.

Los ejemplos del producto de la hidrólisis parcial del almidón como material de producción utilizable en el método de la presente invención incluyen aquellos que permiten la transglicosilación en hesperidina para formar a-glicosil hesperidina como glicosil hesperetina, cuando se permite que la glicosiltransferasa descrita más adelante actúe sobre ellos; productos de la hidrólisis parcial del almidón tales como amilosas, dextrinas, ciclodextrinas, maltooligosacáridos, así como almidones licuados y gelatinizados, uno o más de los cuales se pueden seleccionar arbitrariamente.

La cantidad de un producto de la hidrólisis parcial del almidón utilizado en la reacción enzimática descrita más adelante es usualmente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 150 veces, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, y más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 veces la cantidad en masa del material de hesperidina. En la reacción enzimática, los sacáridos obenidos a partir de productos de la hidrólisis parcial del almidón son transferidos mediante glicosiltransferasa a la hesperidina para formar eficientemente a-glicosil hesperidina, en donde los productos de la hidrólisis parcial del almidón se deben utilizar preferiblemente en una cantidad en exceso con respecto a la hesperidina de manera que no quede hesperidina intacta en un sistema de reacción enzimática en una cantidad tan baja como sea posible. La razón es que, en la etapa de purificación descrita más adelante, los productos de la hidrólisis parcial del almidón y los sacáridos derivados de los mismos se pueden separar con relativa facilidad de la a-glicosil hesperidina; sin embargo, dado que la hesperidina muestra la misma dinámica que la a-glicosil hesperidina y es difícilmente separable de la a-glicosil hesperidina, la solubilidad en agua de la glicosil hesperidina resultante disminuirá inconvenientemente en su conjunto, cuando la hesperidina intacta con una solubilidad en agua claramente baja todavía permanece en una cantidad considerablemente grande.

Reacción enzimática:

El término "reacción enzimática" como se menciona en la presente invención significa una reacción enzimática que permite que la glicosiltransferasa actúe sobre la hesperidina y un producto de la hidrólisis parcial del almidón como los materiales de producción antes mencionados para formar a-glicosil hesperidina.

Los ejemplos de glicosiltransferasa utilizada en la reacción enzimática incluyen a-glucosidasa (EC 3.2.1.20), ciclomaltodextrina glucanotransferasa (EC 2.4.1.19, denominada "CGTasa", en lo sucesivo) y a-amilasa (EC 3.2.1.1), etc. Los ejemplos de las a-glucosidasa anteriores incluyen aquellas que se obtienen a partir de tejidos animales y vegetales tales como hígado de cerdo y semillas de trigo sarraceno; y los que se obtienen a partir de cultivos de hongos pertenecientes al género Mucor, Penicillium, y Aspergillus incluyendo Aspergillus niger, etc.., u otros cultivos obtenidos mediante cultivo de levaduras del género Saccharomyces en medios de cultivo con nutrientes. Los ejemplos de CGTasa incluyen aquellos que se obtienen a partir de los géneros Bacillus, Geobacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Thermococcus, Thermoanaerobacter, Brevibacterium, Pyrococcus, Brevibacillus y Saccharomyces. Los ejemplos de a-amilasa incluyen aquellos que se obtienen a partir de cultivos de bacterias del género Geobacillus u hongos del género Aspergillus incluyendo Aspergillus niger, uno o más de los cuales se pueden utilizar en una combinación apropiada. Cualquiera de las glicosiltransferasas naturales o recombinantes se puede utilizar como glicosiltransferasas anteriores siempre que alcancen los objetos de la presente invención, y si están disponibles los productos comercializados de las mismas, también se pueden utilizar apropiadamente. Todas las glicosiltransferasas anteriores no se deben utilizar necesariamente después de la purificación, y usualmente se pueden utilizar incluso en forma de enzima bruta siempre que se alcancen los objetos de la presente invención. Tras el uso de las glicosiltransferasas naturales o recombinantes anteriores, el rendimiento de producción de aglicosil hesperidina se puede aumentar seleccionando un producto de la hidrólisis parcial del almidón adecuado para las enzimas anteriores.

En el caso de utilizar la a-glucosidasa anterior, se pueden utilizar adecuadamente maltooligosacáridos tales como maltosa, maltotriosa y maltotetraosa o productos de la hidrólisis parcial del almidón con un equivalente de dextrosa (ED) de aproximadamente 10 a aproximadamente 70; en el caso de utilizar la CGTasa anterior, se pueden utilizar adecuadamente a-, p- o Y-ciclodextrina o aquellas que varían de almidón licuado con una ED de uno o menor a productos parciales de la hidrólisis de almidón con una ED de aproximadamente 60; y en el caso de utilizar la aamilasa anterior, se pueden utilizar adecuadamente productos parciales de la hidrólisis de almidón que varían de almidones licuados con un ED de uno o menor a dextrinas con un ED de aproximadamente 30.

Los ejemplos de las soluciones que contienen hesperidina utilizadas en las reacciones enzimáticas incluyen aquellas que contienen la mayor cantidad posible de hesperidina; se utilizan preferiblemente suspensiones de hesperidina o soluciones que contienen hesperidina a concentraciones relativamente altas, preparadas disolviendo hesperidina en medios tales como agua a temperaturas relativamente altas o bajo pH alcalinos de más de 7,0 utilizando agentes alcalinos. Como tales agentes alcalinos, se utilizan apropiadamente los siguientes; una o más de soluciones acuosas fuertemente alcalinas de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, hidróxido de calcio y amoniaco acuoso de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 N.

La concentración de hesperidina en forma de solución, preparada con hesperidina y un agente alcalino, es usualmente de aproximadamente 0,005% p/v o superior, preferiblemente de aproximadamente 0,05 a 10% p/v, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10% p/v, y además preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10% p/v.

Cuando se utiliza en una forma de suspensión preparada sin utilizar ningún agente alcalino, la hesperidina se suspende en un medio tal como agua en una forma de suspensión, en donde la concentración de hesperidina es usualmente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2% p/v, preferiblemente de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 2 % p/v, y más preferiblemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 2% p/v.

Aunque la temperatura y el tiempo durante el cual se permite que la glicosiltransferasa actúe sobre la hesperidina y un producto de la hidrólisis parcial del almidón varían dependiendo de las concentraciones de hesperidina y del producto de la hidrólisis parcial del almidón utilizadas en dicha reacción enzimática, así como del tipo, temperatura óptima, pH óptimo, o la cantidad de enzima utilizada, la temperatura es usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100°C, preferiblemente de aproximadamente 60 a aproximadamente 90°C, más preferiblemente de aproximadamente 70 a aproximadamente 90°C; y el tiempo es de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 horas, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 horas, y más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 horas.

Aunque el pH y la temperatura a los que se permite que la glicosiltransferasa actúe sobre una solución alcalina con una concentración relativamente alta de hesperidina, varían dependiendo del tipo, el pH óptimo, la temperatura óptima o la cantidad de enzima utilizada, así como de la concentración de hesperidina, estos deben ajustarse al pH y la temperatura más altos posibles a los que la enzima sea funcional; en donde el pH es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 10, y preferiblemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 10; y la temperatura es de aproximadamente 40 a aproximadamente 80°C, y preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 80°C. Dado que la hesperidina en sí misma es susceptible de descomponerse en soluciones alcalinas, debe mantenerse preferiblemente bajo condiciones anaeróbicas y protegidas contra la luz tanto como sea posible para evitar dicha descomposición.

Cuando se permite que la glicosiltransferasa actúe sobre la hesperidina en forma de suspensión, el pH de la enzima empleada varía dependiendo del tipo, la temperatura óptima, el pH óptimo o la cantidad de enzima utilizada, así como de la concentración de hesperidina en la suspensión; sin embargo, usualmente tiene un pH que varía de aproximadamente 4 a aproximadamente 7, preferiblemente de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,5.

Adicionalmente, si fuera necesario, la reacción de transferencia de glicosilo o de transferencia de sacárido de la hesperidina se puede facilitar arbitrariamente aumentando la solubilidad de la hesperidina antes de la reacción enzimática prescrita de tal manera que se permita una cantidad apropiada de uno o más disolventes orgánicos altamente compatibles con el agua, tales como alcoholes inferiores o cetonas que incluyen metanol, etanol, npropanol, isopropanol, n-butanol, acetol y acetona para coexistir en soluciones de alto contenido de hesperidina, particularmente soluciones acuosas de alto contenido de hesperidina.

En términos de aspectos económicos, la cantidad y el tiempo de reacción de las enzimas están estrechamente relacionados entre sí y, por lo tanto, la cantidad de glicosiltransferasa normalmente se establece de manera apropiada a un nivel suficiente para terminar la reacción enzimática en aproximadamente 5 a aproximadamente 150 horas, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 horas, más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 horas, dependiendo del tipo de enzima utilizada. Mediante el uso de una glicosiltransferasa inmovilizada, se puede realizar apropiadamente una reacción enzimática deseada repetidamente de forma discontinua o consecutiva.

Dependiendo del uso, la solución de reacción enzimática que contiene hesperidina y a-glicosil hesperidina, obtenida después de la reacción de transferencia de glicosilo anterior, puede ser utilizada intacta o sometida sucesivamente a purificación utilizando resinas adsorbentes sintéticas porosas y a hidrólisis parcial con amilasa tal como glucoamilasa (EC 3.2.1.3) o p-amilasa (EC 3.2.1.2) para reducir el número de restos a-D-glucosilo de la a-glicosil hesperidina. Por ejemplo, en caso de utilizar la glucoamilasa anterior en la reacción enzimática, se pueden hidrolizar a-maltosil hesperidina o moléculas superiores para formar y acumular a-glucosil hesperidina junto con glucosa. Mientras que, en caso de utilizar la p-amilasa anterior, la a-maltotriosil hesperidina y las moléculas superiores se pueden hidrolizar para formar y acumular una mezcla de a-glucosil hesperidina y a-maltosil hesperidina junto con maltosa.

La glicosil hesperetina con una solubilidad en agua relativamente alta se prepara permitiendo que la glucoamilasa y la a-L-ramnosidasa actúen simultánea o sucesivamente en un orden aleatorio sobre una solución de reacción enzimática que contiene hesperidina y a-glicosil hesperidina obtenida después de la reacción de transferencia de glicosilo, por medio de lo cual se liberan cantidades de glucosa equimolares o mayores conectadas a través de un enlace a en la estructura de rutinosa de la a-glicosil hesperidina para transformar la a-glicosil hesperidina en aglucosil hesperidina, lo que da como resultado un incremento del contenido de a-glucosil hesperidina y una conversión de hesperidina con una relativa baja solubilidad en agua en 7-O-p-monoglucosil hesperetina con una solubilidad en agua relativamente alta.

De manera similar a la glicosiltransferasa, la glucoamilasa y la a-L-ramnosidasa tienen una estrecha relación entre sus cantidades de enzimas y los tiempos de reacción enzimática y, por lo tanto, en vista de los aspectos económicos, la cantidad de las enzimas anteriores se ajusta preferiblemente a un nivel suficiente para terminar sus reacciones enzimáticas en el plazo de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 horas, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 horas, más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 horas, dependiendo de los tipos de enzimas utilizadas. Mediante el uso de una a-L-ramnosidasa inmovilizada, se puede llevar a cabo apropiadamente una reacción enzimática deseada repetidamente o continuamente de forma discontinua o consecutiva.

Tratamiento con agente reductor:

De acuerdo con la invención, el agente reductor es un agente reductor inorgánico. Los agentes reductores inorgánicos utilizables en la presente invención no deberían restringirse específicamente siempre que logren los objetos deseados de la presente invención, y se pueda utilizar cualquier agente reductor inorgánico convencional disponible en la técnica. Sin embargo, dado que se presupone que la glicosil hesperetina de la presente invención se utiliza principalmente para seres humanos, se utilizan deseablemente aquellas que tienen de alta seguridad y estabilidad y manejabilidad superiores.

Los ejemplos concretos de agentes reductores inorgánicos incluyen hidroxilaminas, compuestos de hidrazina, dióxido de cloro, hidrógeno, compuestos de hidrógeno (sulfuro de hidrógeno, borohidruro de sodio, hidruro de litio y aluminio, hidruro de potasio y aluminio, etc.), compuestos de azufre (dióxido de azufre, dióxido de tiourea, tiosulfato, sulfito, sulfato ferroso, persulfato de sodio, persulfato de potasio, persulfato de amonio, sulfito de calcio, etc.), nitrito, cloruro de estaño, cloruro ferroso, yoduro de potasio, peróxido de hidrógeno, peróxido de benzoilo diluido, hidroperóxido y clorito tal como clorito de sodio. Los ejemplos de agentes reductores orgánicos incluyen fenoles, aminas, quinonas, poliaminas, ácido fórmico y sus sales, ácido oxálico y sus sales, ácido cítrico y sus sales, dióxido de tiourea, sacáridos reductores, peróxido de benzoilo, persulfato de benzoilo, hidruro de diisobutilaluminio, catequina, quercetina, tocoferol, ácido gálico y sus ésteres, etilendiaminotetraacetato (EDTA), ditiotreitol, glutatión reducido y polifenoles. Se pueden utilizar uno o más de los agentes reductores orgánicos e inorgánicos anteriores en combinaciones apropiadas.

Entre los agentes reductores inorgánicos y orgánicos anteriores, el primero se utiliza debido a que reduce significativamente los sabores diversos inherentes a los productos convencionales y proporciona una glicosil hesperetina de alta calidad con menor olor. Aunque la razón no es segura, es estimable como sigue. Es presumible que debido a que los agentes reductores orgánicos son compuestos orgánicos, pueden generar sabores o coloraciones diversos y ellos mismos o sus productos de descomposición aún permanecen en los procesos de producción de la composición de glicosil hesperetina sin ser eliminados por completo, lo que influye negativamente en la calidad de la composición de glicosil hesperetina.

Entre los agentes reductores inorgánicos, lo que se denominan subsulfatos (se pueden denominar sulfitos), que se componen de un ion metálico y los iones SO^2", HSO^{3 '}, SO^32', S²O^42", o S²O^72"son superiores en seguridad, estabilidad y manejabilidad, se utilizan más adecuadamente como agentes reductores en la práctica de la presente invención. En particular, los siguientes agentes reductores inorgánicos se pueden utilizar de manera más adecuada: subsulfatos tales como sulfito de sodio, sulfito de potasio, hidrogenosulfito de sodio, hiposulfito de sodio, hiposulfito de potasio, pirosulfito de sodio, pirosulfito de potasio, metasulfito de sodio, metasulfito de potasio, metabisulfito de sodio y metabisulfito de potasio.

Los agentes reductores mencionados anteriormente se utilizan en cualquiera de las etapas (a) a (c) para producir la glicosil hesperetina. Los presentes objetos de la presente invención se pueden lograr con una cantidad menor del o de los agentes reductores cuando el agente o los agentes se utilizan en porciones en dos o más de las etapas o se añaden al material o materiales de partida antes de poner en práctica uno o más de las etapas.

La cantidad total de aditivo de los agentes reductores anteriores utilizados en cada uno de las etapas (a) a (c) anteriores es de 0,001% a 0,5%, y preferiblemente de 0,01 a 0,5% de la masa de la solución de reacción enzimática, obtenida después la etapa (b) anterior, o de la obtenida después de completar todas las reacciones enzimáticas, cuando se utiliza cualquier enzima diferente a la glicosiltransferasa. En los ejemplos de referencia, la cantidad total de aditivo del agente reductor puede ser de 0,01 a 3%, opcionalmente de 0,01 a 1%. En caso de que se utilicen los agentes reductores antes de la etapa (c), los agentes restantes se eliminan usualmente sustancialmente en la etapa de purificación; por consiguiente, no se detecta sustancialmente ningún agente reductor en la composición de glicosil hesperetina resultante obtenida como producto final. La cantidad total de agentes reductores, añadidos a la vez o varias veces durante las etapas anteriores, es usualmente de al menos 0,001%, preferiblemente de al menos 0,01% y más preferiblemente de 0,01 a 1% en masa de la masa de la solución de reacción enzimática obtenida después de la reacción enzimática anterior. Con referencia a las temperaturas a las que se añaden los agentes reductores, estas normalmente se refieren a las temperaturas empleadas en las etapas (a) a (c) anteriores, u opcionalmente incluyen otras temperaturas que superan las temperaturas anteriores. Los ejemplos concretos de esto son temperaturas no inferiores a la temperatura ambiente, preferiblemente al menos 50°C, más preferiblemente al menos 70°C, más preferiblemente al menos 80°C, y además preferiblemente 90 a 120°C.

Método de purificación:

Las soluciones de reacción enzimática así obtenidas se pueden utilizar intactas como composición de glicosil hesperetina de la presente invención; sin embargo, generalmente se preparan en composiciones de glicosil hesperetina en forma de líquido, sólido o polvo empleando apropiadamente, ya sea solos o combinados con, uno o más medios de métodos de separación, métodos de filtración, métodos de purificación utilizando resinas sintéticas porosas, métodos de concentración, métodos de pulverización, métodos de secado, etc., todos los cuales se conocen convencionalmente en la técnica.

Los ejemplos de las resinas sintéticas porosas anteriores incluyen resinas sintéticas tales como copolímeros de estireno-divinilbenceno no iónicos, resinas de fenol-formalina, resinas de acrilato y resinas de metacrilato, todas las cuales no tienen ionicidad pero tienen un área de superficie de adsorción porosa y grande: resinas con los nombres comerciales de AMBERLITE XAD-1, AMBERLITE XAD-2, AMBERLITE XAD-4, AMBERLITE XAD-7, AMBERLITE XAD-8, AMBERLITE XAD-11, AMBERLITE XAD-12, etc., comercializadas por Rohm & Hass Company, Filadelfia, EE.UU.; resinas con los nombres comerciales de DIAION HP-10, DIAION HP-20, DIAION HP-30, DIAION HP-40, DIAION HP-50, DIAION HP-2MG, SEPABEADS SP70, SEPABEADS SP207, SEPABEADS SP700, SEPABEADS SP800, etc. comercializadas por Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokio, Japón; y otras resinas con los nombres comerciales de IMACTI Syn-42, IMACTI Syn-44, IMACTI Syn-46, etc., comercializadas por IMACTI Company, Amsterdam, Reino de los Países Bajos.

De acuerdo con los métodos de purificación que utilizan resinas sintéticas porosas, la glicosil hesperetina se adsorbe sobre las resinas sintéticas porosas, mientras que los productos de la hidrólisis parcial del almidón restantes, sacáridos solubles en agua, etc., se eluyen de columnas empaquetadas con las resinas sin adsorción sobre las resinas, cuando las soluciones de reacción enzimáticas se alimentan a las columnas. En este caso, la hesperidina, la 7-O-p-glucosil hesperetina y la a-glicosil hesperetina como glicosil hesperetinas se comportan usualmente de manera similar y, por lo tanto, no podrían separarse entre sí utilizando resinas sintéticas porosas; sin embargo, aunque el manejo se complica y los rendimientos disminuyen, las glicosil hesperetinas que se adsorben selectivamente en columnas empaquetadas con resinas sintéticas porosas, se lavan con disolventes como álcalis diluidos o agua y, a continuación, se alimentan con cantidades relativamente pequeñas de disolventes orgánicos o soluciones mixtas de disolventes orgánicos y agua, es decir, soluciones acuosas de metanol o etanol, para eluir en primer lugar a-glicosil hesperidina de las columnas y a continuación eluir la hesperidina intacta aumentando los volúmenes de alimentación o las concentraciones de disolventes orgánicos. Las soluciones resultantes que contienen glicosil hesperetina se tratan con evaporación, seguido de la eliminación de los disolventes orgánicos restantes y la concentración de las soluciones resultantes hasta las concentraciones prescritas para obtener las composiciones de glicosil hesperetina de la presente invención con menores contenidos de hesperidina. Dado que la etapa anterior de elución de glicosil hesperetina con los disolventes orgánicos mencionados anteriormente también actuaría como una etapa de regeneración de las resinas sintéticas porosas, esto permitiría el uso repetido de las resinas como un mérito.

La composición de glicosil hesperetina con un mayor contenido de glicosil hesperetina en forma líquida de acuerdo con la presente invención se puede producir de tal manera, después de completar las reacciones enzimáticas y antes de poner en contacto las soluciones de reacción enzimática resultantes con las resinas sintéticas porosas, por ejemplo, eliminando las sustancias insolubles generadas cuando se calientan las soluciones de reacción enzimática, eliminando las sustancias proteínicas en las soluciones de reacción tratándolas con aluminosilicato de magnesio, aluminato de magnesio, etc.; o desalando las soluciones con resinas de intercambio iónico de ácido fuerte (forma H), resinas de intercambio iónico básicas intermedias/básicas débiles (forma OH), o similares.

Adicionalmente, la glicosil hesperetina líquida mencionada anteriormente se puede secar y pulverizar arbitrariamente en una composición en partículas de glicosil hesperetina mediante métodos de secado convencionales.

De esta manera, se puede producir una composición de glicosil hesperetina en la que los sabores diversos, característicos de los productos convencionales como defecto, se reducen de manera eficaz y significativa. Los autores de la presente invención confirmaron que los sabores diversos de los productos convencionales sin ningún tratamiento de agentes reductores no se modifican sustancialmente con el mero uso de los métodos de purificación mencionados anteriormente: métodos de purificación convencionales, que utilizan, por ejemplo, las resinas sintéticas porosas antes mencionadas utilizadas comúnmente en la producción de productos convencionales, de manera ventajosa, elimina simultáneamente sustancias concomitantes tales como sales solubles en agua, así como productos de la hidrólisis parcial del almidón y sacáridos solubles en agua; sin embargo, es difícil reducir significativamente los sabores diversos característicos de los productos convencionales, independientemente de cómo se utilicen los métodos de purificación anteriores. Es estimable que cualquier sustancia causante de sabores diversos, contenida en glicosil hesperetina, exhiba una dinámica de adsorción y desorción de resinas sintéticas porosas similar a las de la glicosil hesperetina y, por lo tanto, dicha sustancia causante no podría separarse de la glicosil hesperetina.

En comparación con los productos convencionales, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención tiene una reducción significativa de sabores diversos, así como de conductividad eléctrica y de contenido de compuestos iónicos relacionados con la conductividad eléctrica. Los ejemplos de dichos compuestos iónicos incluyen compuestos tales como narirutina, diosmina y neoponcirina, que coexisten intrínsecamente en la hesperidina como material para la glicosil hesperetina; glucosil narirutina, glucosil neoponcirina, etc., como subproductos de reacciones enzimáticas, así como sus productos de descomposición y compuestos estrechamente relacionados con tales productos de descomposición; furfurales tales como furfural utilizados como índice para la práctica de la presente invención, alcohol furfurílico e hidroximetil furfural, así como sales de los mismos; y otros compuestos que liberan cationes metálicos de calcio, potasio, magnesio, sodio, etc., cuando están en forma de solución; todos los cuales se obtienen a partir de los materiales de producción para la glicosil hesperetina o se forman como productos secundarios durante sus etapas de producción. Usualmente, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención contiene sólo ligeramente los ingredientes anteriores tales como narirutina, diosmina, neoponcirina, glucosil narirutina y glucosil neoponcirina identificadas anteriormente.

Como se describió anteriormente, la composición de glicosil hesperetina, que tiene una reducción significativa del contenido de furfural, según la presente invención, es una composición de glicosil hesperetina de alta calidad cuyos sabores diversos se reducen significativamente en comparación con los productos convencionales.

El mecanismo de cómo se logra una composición de glicosil hesperetina cuyos sabores diversos se reducen significativamente mediante el método para producir la composición de glicosil hesperetina de la presente invención es incierto, sin embargo, se puede estimar como sigue.

(1) Al producir la composición de glicosil hesperetina de la presente invención, los agentes reductores prescritos actúan sobre las sustancias, como causantes de sabores diversos derivados de los materiales de producción, para enmascararlos, descomponerlos o modificarlos para obtener una composición de glicosil hesperetina deseada que tiene una reducción significativa de sabores diversos;

(2) En la etapa o etapas para producir la composición de glicosil hesperetina de la presente invención, los agentes reductores prescritos reducen o inhiben la formación de sustancias como causantes de sabores diversos; o enmascarar, descomponer o modificar las sustancias formadas para obtener una composición de glicosil hesperetina deseada que tiene una reducción significativa de sabores diversos; o

(3) Las sustancias que se muestran en los apartados (1) y (2) anteriores se modifican con los agentes reductores prescritos para facilitar la separación de glicosil hesperetina en una etapa de purificación utilizando adsorbentes sintéticos porosos, etc., y para obtener una composición de glicosil hesperetina deseada que tiene una reducción significativa de sabores diversos.

El método para disminuir los sabores diversos de una composición que contiene glicosil hesperetina proporcionada en la presente invención contiene una etapa para permitir que dicha composición entre en contacto con un agente reductor prescrito. El término "una composición que contiene glicosil hesperetina", como se menciona en el contexto del presente método, significa cualquiera de los que en general contienen glicosil hesperetina como ingrediente principal. De acuerdo con el método, la coloración de una composición que contiene glicosil hesperetina también se puede reducir de manera clara y eficaz. Las condiciones para poner en contacto composiciones que contienen glicosil hesperetina con un agente reductor prescrito deben realizarse preferiblemente, en lugar de en estado sólido, en estado de solución o suspensión utilizando un disolvente apropiado tal como agua. Los ejemplos de glicosil hesperetina que se debe poner en contacto con un agente reductor incluyen glicosil hesperetina que contiene una o más de hesperidina, a-glicosil hesperidina y 7-O-p-glucosil hesperetina. Los ejemplos de tales composiciones que contienen glicosil hesperetina incluyen aquellas que contienen glicosil hesperetina en una cantidad de, usualmente, al menos 70% pero menos de 100%, preferiblemente al menos 80% pero menos de 100%, y más preferiblemente al menos 90% pero menos de 100%.

Los agentes reductores utilizados en el método para disminuir los sabores diversos de la glicosil hesperetina son similares a los que se utilizan en el método para producir la glicosil hesperetina de la presente invención. La cantidad de agentes reductores respectivos que se añaden a la glicosil hesperetina es usualmente de al menos 0,00001%, preferiblemente de 0,0001 a 0,5%, más preferiblemente de 0,001 a 0,4% y, además, preferiblemente de 0,001 a 0,3% en masa de la masa de glicosil hesperetina, d.s.b., donde la mezcla resultante se mezcla hasta homogeneidad para permitir que la glicosil hesperetina entre en contacto con los agentes reductores, dando como resultado una reducción significativa de los sabores diversos característicos de los productos convencionales.

La glicosil hesperetina así obtenida se puede proporcionar, por ejemplo, en diversas formas de líquidos, pastas, sólidos, gránulos o polvos.

Dado que la composición de glicosil hesperetina obtenida por el método para producir la composición de glicosil hesperetina de acuerdo con la presente invención tiene en sí misma una reducción significativa de sus sabores diversos y también una reducción clara de su coloración y olor, así como una mejora de su termoestabilidad; ejerce las características ventajosas de tener una reducción significativa de sus sabores diversos y una reducción clara de su coloración y olor en comparación con los productos convencionales, incluso cuando se calienta de 80 a 100°C durante al menos 30 minutos o se almacena a temperatura ambiente o a una temperatura ligeramente superior a la temperatura ambiente durante varias decenas de minutos a varios meses durante una etapa de su incorporación o después de su incorporación a productos alimenticios, delicias ("shikohin") incluyendo tabacos y cigarrillos, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas y materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos o productos de plástico. En consecuencia, dado que la composición de glicosil hesperetina de la presente invención armoniza bien con sustancias que tienen sabores tales como acidez, salinidad, astringencia, sabor delicioso o amargor, y tiene una tolerancia a los ácidos y una termoestabilidad relativamente altas, se puede utilizar amplia y ventajosamente en productos alimenticios en general, incluidos suplementos dietéticos, tales como alimentos para usos sanitarios específicos: condimentos; repostería de estilo japonés; repostería de estilo occidental; dulces helados; bebidas que incluyen tés tales como tés verdes, tés negros, tés de hierbas, zumos, refrescos, cafés, cacao y bebidas tónicas; alcoholes tales como sakes japoneses, whiskies, vinos, licores y bebidas espirituosas; untables; pastas; pepinillos; productos alimenticios envasados y enlatados; carnes procesadas; carnes de pescado/productos pesqueros; leche procesada/productos de huevo; productos vegetales procesados; productos de frutas procesados; y productos de cereales procesados, etc. Asimismo, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención se puede utilizar ventajosamente en alimentos y cebos para la cría de animales tales como animales domésticos, aves de corral, abejas, gusanos de seda y peces como un agente enriquecido en vitamina P, agente de mejora de la predisposición, etc.

Adicionalmente, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención se puede utilizar como alimento embellecedor e incorporarse apropiadamente en alimentos embellecedores y otros alimentos, incluidas las bebidas.

La composición de glicosil hesperetina de la presente invención se puede utilizar en los siguientes artículos: cosméticos limpiadores/de limpieza tales como jabones, jabones cosméticos, jabones de medicina china, polvos para lavar la piel, cremas limpiadoras, espumas limpiadoras, enjuagues faciales, champús corporales, enjuagues corporales, champús, enjuagues y polvos para lavar el cabello; productos cosméticos para el cuidado del cabello tales como lociones para el cabello, cremas para el cabello, tiques, cremas para el cabello, pomadas, lacas para el cabello, líquidos para el cabello, tónicos para el cabello, lociones para el cabello, restauradores de cabello, tintes para el cabello y grasas para el cuero cabelludo; productos cosméticos básicos para el cuidado de la piel tales como lociones cosméticas, cremas evanescentes, cremas emolientes, lociones emolientes, cosméticos en paquete (incluidos cosméticos tipo jalea tipo retirable, cosméticos tipo hisopo tipo gelatina, cosméticos tipo pasta tipo enjuague y cosméticos en polvo), cremas limpiadoras, cremas frías, cremas para manos, lociones para manos, lociones lechosas, lociones humectantes, lociones para después del afeitado, lociones para el afeitado, cremas para antes de afeitado, cremas para después del afeitado, espumas para después del afeitado, cremas para antes de afeitado, aceites cosméticos y aceites para bebés; preparaciones de maquillaje tales como bases en forma líquida, de crema, sólida o similar, polvos de talco, polvos para bebés, polvos corporales, polvos con perfume, bases de maquillaje, polvos faciales en forma de crema, pasta, líquido, sólidos, polvo o similares, sombras de ojos, cremas de ojos, máscaras, lápices, cosméticos para pestañas, coloretes o humectantes para las mejillas; cosméticos aromáticos tales como perfumes, perfumes sólidos, perfumes en polvo, agua de colonia, perfumes colonias o agua e tocador; cosméticos bronceadores o protectores solares tales como cremas bronceadoras, lociones bronceadoras, aceites bronceadores, cremas protectoras solares, lociones protectoras solares o aceites protectores solares; cosméticos para uñas como manicuras, pedicuras, colores para uñas, lacas para uñas, quitaesmaltes, cremas para uñas o cosméticos para uñas; cosméticos delineadores de ojos; cosméticos de lápiz labial/colorete tales como lápices labiales, bálsamos labiales, lápices labiales o coloretes de color turbio, o brillos de labios; cosméticos orales tales como preventivos de olores bucales, pastas de dientes/dentífricos o enjuagues bucales; cosméticos de baño tales como sales de baño, aceites de baño o cosméticos de baño; agentes embellecedores de la piel; agentes blanqueadores de la piel; e inhibidores y preventivos anti-envejecimiento. Asimismo, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención se puede utilizar preferiblemente en productos de plástico como agente absorbente de ultravioleta o agente inhibidor del deterioro. Adicionalmente, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención se puede incorporar arbitrariamente a delicias ("shikohin") y agentes para enfermedades susceptibles tales como agentes profilácticos y terapéuticos para enfermedades susceptibles en forma de, por ejemplo, un sólido, pasta o líquido, tales como tabacos, trociscos, gotas de aceite de hígado, complejos vitamínicos, refrigerantes bucales, cachous, gárgaras, nutrientes de intubación, medicinas internas o inyecciones. Además, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención también se puede utilizar preferiblemente en productos químicos, materias primas y materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos o productos de plástico.

La composición de glicosil hesperetina de la presente invención se utiliza en una cantidad de, usualmente, al menos aproximadamente 0,0001%, preferiblemente, aproximadamente 0,001 a aproximadamente 50%, más preferiblemente aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30%, además preferiblemente aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20%, y más preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10% de la masa total de cualquiera de las composiciones o artículos mencionados anteriormente.

El término "enfermedades susceptibles" como se menciona en la memoria descriptiva significa enfermedades que se pueden prevenir o tratar en general con glicosil hesperetina; los ejemplos de tales incluyen enfermedades sensibles a la glicosil hesperetina, por ejemplo, enfermedades virales, enfermedades bacterianas, enfermedades traumáticas, inmunopatías, reumatismos, diabéticas, enfermedades alérgicas, anomalías del metabolismo de los lípidos, enfermedades circulatorias y tumores malignos, que se pueden prevenir o tratar con glicosil hesperetina. La forma del agente profiláctico/terapéutico para las enfermedades sensibles a la glicosil hesperetina se puede elegir apropiadamente entre las siguientes, dependiendo de su propósito de uso; líquidos tales como nébulas, soluciones oftálmicas, colunarios, gárgaras o inyectables; pastas tales como pomadas, cataplasmas o cremas; y sólidos tales como polvos, medicamentos en polvo, gránulos, comprimidos o cápsulas. En la preparación de productos farmacéuticos, se utilizan otros ingredientes tales como ingredientes medicinales, sustancias fisiológicamente activas, antibióticos, adyuvantes, cargas, excipientes, estabilizadores, colorantes, aromas, conservantes, antisépticos o bacteriostáticos, uno o más de los cuales se pueden utilizar arbitrariamente combinados, si fuera necesario.

La dosis de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención se puede controlar apropiadamente dependiendo del contenido, vía de administración y frecuencia de administración de la glicosil hesperetina, así como de los síntomas de los sujetos a los que se administrará la misma. La composición de glicosil hesperetina de la presente invención se utiliza habitualmente en el intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 10 g/adulto/día, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 g/adulto/día, y más preferiblemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1 g/adulto/día, d.s.b.

Los ejemplos del método para incorporar la composición de glicosil hesperetina de la presente invención en varias composiciones incluyen uno o más de los métodos convencionales de mezclado, amasado, disolución, remojo, penetración, dispersión, aplicación, pulverización, inyección, etc., uno o más de los cuales se pueden utilizar solos o en una combinación apropiada antes de completar cada una de las composiciones. Las composiciones son, por ejemplo, productos alimenticios, delicias ("shikohin"), cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas/materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos o productos de plástico. Las composiciones anteriores a las que se incorporada la composición de glicosil hesperetina de la presente invención ejercen beneficios reales de que los olores, así como los sabores y coloraciones diversos de las composiciones, se reducen de manera clara y eficaz incluso cuando se almacenan a las temperaturas mencionadas anteriormente durante varias decenas de minutos a varios meses, en comparación con aquellas a las que se incorporan productos convencionales. De manera similar a los productos convencionales, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención se puede utilizar ventajosamente en varios compuestos o composiciones no solo como un agente enriquecido en vitamina P sino como un antioxidante natural, estabilizador, mejorador de la calidad, agente profiláctico, agente terapéutico o agente absorbente de ultravioleta.

Los siguientes experimentos explican la composición de glicosil hesperetina de la presente invención con más detalle.

<Experimento 1: Propiedad de la glicosil hesperetina en partículas>

Excepto porque se utilizó 0,1, 0,09, 0,07 o 0,04% de pirosulfito de sodio como agente reductor en el Ejemplo 1 descrito más adelante, se prepararon cuatro tipos de glicosil heperetinas pulverizadas (muestras de ensayo 5 a 8: producidas de acuerdo con la presente invención) de manera similar al método del Ejemplo 1. Mientras que, como control, excepto porque no se utilizó ningún agente reductor en los métodos de los Ejemplos 1, 3, 4 y 5, se prepararon cuatro tipos de glicosil hesperetinas pulverizadas (muestras de prueba 1 a 4: productos convencionales) de forma similar a los métodos anteriores. Entre las muestras de prueba 1 a 4, la muestra de prueba 1 es equivalente a la glicosil hesperetina pulverizada, obtenida en el Ejemplo de Referencia 1 descrito más adelante. (1) Contenido de furfural

Las muestras de prueba 1 a 8 se determinaron respectivamente para determinar su contenido de furfural mediante los siguientes procedimientos y aparatos:

<A. Preparación de muestras>

(a) Se colocó medio gramo, d.s.b., de cualquiera de las glicosil hesperetinas pulverizadas anteriores como muestras de ensayo en un matraz Erlenmeyer con tapón de 50 mL;

(b) Cada una de las glicosil hesperetinas pulverizadas se añade y se disuelve en 5,0 mL de agua desionizada y se añaden 20 pL de ciclohexanol al 0,0025% como sustancia sustituta para su uso como índice para determinar la tasa de recuperación de cada muestra de prueba después del análisis;

(c) Se añade y disuelve adicionalmente un gramo y medio de cloruro de sodio en cada una de las soluciones resultantes anteriores, a continuación, cada una de las mezclas resultantes se añade a tres mililitros de éter dietílico, un reactivo de grado especial, comercializado por Wako Pure Chemical Industries., Ltd., Osaka, Japón, y se agita a 700 rpm durante 10 min;

(d) Cada una de las mezclas resultantes se coloca totalmente en un embudo de decantación y se deja reposar durante 10 minutos, a continuación, se recoge la capa de éter dietílico, se deshidrata la capa con sulfato de sodio anhidro y se concentra la solución deshidratada en una corriente de gas nitrógeno hasta proporcionar un volumen de aproximadamente 200 pl;

(e) Se recoge un microlitro del producto concentrado resultante y se somete a un analizador GC/MS; y (f) Como control, excepto porque se utiliza furfural de grado reactivo, una muestra de grado especial, comercializada por Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokio, Japón, en lugar de la glucosil hesperetina pulverizada, se trata con los elementos (a) a (e) anteriores de manera similar a las muestras de prueba. <Condiciones de análisis de GC/MS>

Analizador GC/MS: "Clarus SQ8T GC/MS", comercializado por PerkinElmer, Inc., MA, EE. UU.

Columna: VF-WAXms, de 30 m de longitud, 0,25 mm de diámetro interior y 0,25 pm de espesor, comercializada por Agilent Technologies Inc., CA, EE. UU.

■ Detector: analizador de masas

Gas portador: gas helio

■ Velocidad lineal: 35 cm/seg.

■ Condiciones de aumento de temperatura: mantener la temperatura de la columna a 40°C durante tres minutos, aumentar la temperatura de la columna de 40°C a 80°C a una velocidad de 5°C/min, aumentar la temperatura de la columna de 80°C a 200°C a una velocidad de 10°C/min, manteniendo la temperatura de la columna a 200°C durante siete minutos, aumentar la temperatura de la columna de 200°C a 220°C a una velocidad de 10°C/min, y a continuación, mantener la temperatura de la columna a 220°C durante ocho minutos.

Sustancia sustituta: ciclohexanol, un reactivo de primer grado, comercializado por Katayama Chemical Industries Co., Ltd., Osaka, Japón.

■ Sustancia patrón interno: heneicosano, una sustancia patrón para GC, comercializada por Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokio, Japón.

■ Disolvente de extracción: éter dietílico, un reactivo de grado especial, comercializado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japón.

<B. Cuantificación de furfural en la muestra>

Se trazó una curva de calibración con los datos del furfural, como control, un reactivo de grado especial, comercializado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japón, determinada mediante análisis GC/MS; Basándose en esto, se determinó el contenido de furfural las muestras de prueba.

(2) Contenido de 4-VA

Se determinó respectivamente el contenido de 4-VA en las muestras de prueba 1 a 8 utilizando los siguientes reactivos, protocolos y aparatos. El método de medición se realizó de acuerdo con "About benzene in soft drinks" de la Notificación Núm. 0728008, de 28 de julio de 2006, expedida por el Jefe de la División de Primera Evaluación y Registro del Departamento de Seguridad Alimentaria, División de Normas y Evaluación, Oficina Farmacéutica y de Seguridad Alimentaria, Organización del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar.

<A. Reactivos y preparaciones de soluciones>

(a) Cloruro de sodio, una muestra para pruebas de calidad del agua, comercializada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japón.

(b) Preparación de la solución de partida patrón de ciclohexanol

El ciclohexanol, un reactivo de primer grado, comercializado por Katayama Chemical Industries, Co., Ltd., Osaka, Japón, se disolvió en metanol para su uso en pruebas generales, procedimientos y aparatos de la farmacopea japonesa (JP), en una solución de ciclohexanol al 0,01% p/p (denominada "solución de partida patrón de ciclohexanol", en lo sucesivo).

(c) Solución de patrón interno

Utilizando la solución de partida patrón de ciclohexanol anterior y metanol, se prepararon una solución de ciclohexanol al 0,0004 p/p% (denominada "solución de patrón interno 1", en lo sucesivo) y una solución al 0,00004% p/p de ciclohexanol (denominada "solución de patrón interno 2", en lo sucesivo).

(d) Preparación de la solución de partida patrón

4-VA, comercializado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japón, se disolvió en metanol en una solución de 4-VA al 0,0005 p/p% (denominada "solución patrón A", en lo sucesivo) o 0,00005% p/p de 4-VA solución (denominada "solución patrón B", en lo sucesivo).

(e) Preparación de la solución de partida patrón para la curva de calibración.

Se prepararon cinco soluciones de mezclas de partida patrón diferentes para la curva de calibración, con concentraciones respectivas de 4-VA de 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 y 1,0 pg/mL, utilizando las soluciones patrón A y B anteriores, la solución de patrón interno 1 anterior, y metanol.

(f) Preparación de la solución patrón para la curva de calibración.

Se prepararon cinco soluciones patrón diferentes para la curva de calibración de la siguiente manera: Se colocaron alícuotas de diez mililitros de agua ultrapura en cinco viales con espacio superior de 20 mL, se añadieron 10 pl de cualquiera de las cinco soluciones de mezcla de partida patrón diferentes para la curva de calibración y se mezclaron con 3,0 g de cloruro de sodio, sellando inmediatamente a continuación los viales y agitando el contenido de cada vial para su disolución.

<B. Preparación de la muestra de prueba>

Las muestras de prueba 1 a 8, respectivamente, pesadas con precisión a 0,20 g, d.s.b., se colocaron en ocho viales con espacio superior de 20 mL, se les añadió agua ultrapura para proporcionar un peso total de 10,0 g y se agitaron para su disolución. A cada una de las soluciones resultantes se le añadieron 10 pL de la solución de patrón interno 2 anterior y 3,0 g de cloruro de sodio, sellando inmediatamente a continuación los viales, disolviendo el contenido en los viales mediante agitación para obtener ocho muestras de prueba diferentes que contenían una cualquiera de las muestras de prueba 1 a 8.

<C. Método cuantitativo para 4-VA>

(a) Condiciones de medición

<Condición de análisis de GC/MS>

Analizador GC/MS: "Clarus SQ8T GC/MS", comercializado por PerkinElmer Co., Ltd., Kanagawa, Japón. ■ Muestreador de espacio superior: "TurboMatrix Trap 40"

Columna: VF-WAXms, que tiene una longitud de columna de 30 m, un diámetro interior de 0,25 mm y un espesor de membrana de 0,25 pm, comercializado por Agilent Technologies Inc., CA, EE. UU.

■ Detector: analizador de masas

Gas portador: gas helio

■ Velocidad lineal: 35 cm/seg.

Temperatura de inyección de la columna: 200°C

■ Condiciones de aumento de temperatura: mantener la temperatura de la columna a 40°C durante tres minutos, aumentar la temperatura de la columna de 40°C a 80°C a una velocidad de 5°C/min, aumentar la temperatura de la columna de 80°C a 200°C a una velocidad de 10°C/min, mantener la temperatura de la columna a 200°C durante siete minutos, aumentar la temperatura de la columna de 200°C a 220°C a una velocidad de 10°C/min, y a continuación, mantener la temperatura de la columna a 220°C durante ocho minutos.

■ Temperatura del horno de viales: 60°C

■ Temperatura de la aguja: 140°C

■ Temperatura de la línea de transferencia: 205°C

■ Tiempo de calentamiento del vial: 30 min.

<Método de detección>

■ Método de ionización (impacto electrónico (EI))

■ Seguimiento de iones seleccionados (SIM)

m/z 134, 119 (4-VA)

m/z 82, 57 (ciclohexanol, una muestra de primer grado, comercializada por Katayama Chemical Industries Co., Ltd., Osaka, Japón)

(b) Cuantificación de 4-VA

Basándose en la razón de las alturas de los picos de 4-VA y ciclohexanol como patrón interno para cada una de las ocho muestras de prueba anteriores y las cinco soluciones de mezcla patrón para generar una curva de calibración, así como en una curva de calibración de 4-VA creada por separado, se determinaron las concentraciones de 4-VA de las muestras de prueba 1 a 8 para calcular su contenido de 4-VA.

(3) Tono de color y grado de coloración

De las soluciones acuosas de las muestras de ensayo 1 a 8 se observó macroscópicamente, respectivamente, su tono de color y se determinó su grado de coloración mediante el siguiente procedimiento. Las muestras de prueba 1 a 8 se prepararon respectivamente en soluciones acuosas al 1% p/p, y se colocaron 40 mL de cada una de las cuales en un recipiente sellado de 50 mL y se calentaron a 100°C durante 30 min. Posteriormente, cada una de las soluciones resultantes se ajustó a 27°C, se colocó en una celda con un ancho de 1 cm y se midieron las absorbancias de DO⁴²⁰nm y DO⁷²⁰nm a longitudes de onda de 420 nm y 720 nm utilizando "UV-2600", un nombre de producto de un espectrofotómetro, comercializado por Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón, seguido de la determinación de la diferencia entre las dos absorbancias (DO⁴²⁰nm - DO⁷²⁰nm) para su uso como grado de coloración.

(4) Conductividad eléctrica

Las muestras de prueba 1 a 8 se disolvieron respectivamente en agua refinada en soluciones acuosas al 1% p/p, que a continuación, se calentaron respectivamente a 100°C durante 30 min en un recipiente sellado, se enfriaron a 20°C y se midió la conductividad eléctrica a 20°C utilizando "CM-50AT", un nombre de producto de un medidor de conductancia, comercializado por DKKToa Corporation, Tokio, Japón.

(5) Contenido de compuesto iónico

Los compuestos iónicos no se pudieron cuantificar fácilmente, pero se determinó el contenido de elementos metálicos catiónicos mediante el siguiente procedimiento como método sencillo: Se pesaron con precisión aproximadamente 0,5 g de cada una de las muestras de prueba 1 a 8 en "Falcon Tube", un nombre de producto de un recipiente de 50 mL, comercializado por Japón, Becton Dickinson and Company, Tokio, Japón, se añadieron y disolvieron en 20 mL de agua ultrapura mediante calentamiento, se añadieron 0,54 mL de solución acuosa de ácido nítrico al 60% p/p para el ensayo de precisión, se calentó a 70°C durante 14 horas, se enfrió a temperatura ambiente, se ajustó para proporcionar un volumen total de 50 mL con agua ultrapura y se cuantificó el contenido de elementos metálicos utilizando el siguiente analizador en las condiciones siguientes. Como control, se utilizó una muestra que consistía en agua ultrapura.

<Aparatos y condiciones de medición>

■ Espectrofotómetro de emisión de plasma acoplado inductivamente: "CIROS-120", comercializado por SPECTRO Analytical Instruments GmbH, Boschstrasse, Alemania

■ Potencia de plasma: 1.400 W

■ Plasma gas (Ar): 13,0 L/min

■ Gas auxiliar (Ar): 1,0 L/min

■ Gas nebulizador (Ar): 1,0 L/min

■ Funcionamiento de la bomba: 1,0 mL/min

■ Método de cálculo del contenido de elemento metálico (ppm): {(Valor medido de la muestra de prueba) -(Valor medido del control)} x tasa de dilución

La Tabla 1 muestra los resultados de los apartados (1) a (5) anteriores. Dado que las composiciones de las glicosil hesperetinas de las muestras de ensayo 1 a 8 eran sustancialmente las mismas que las que se muestran en los Ejemplos 1, 3, 4 y 5, estas se omitieron de la tabla.

Como se desprende de la Tabla 1, todas las muestras de prueba 1 a 4 tenían un contenido de furfural de más de 300 ppb, mientras que todas las muestras de prueba 5 a 8 tenían un contenido de aproximadamente 10 ppb. Además, todas las muestras de prueba 1 a 4 tenían un contenido de 4 VA superior a 40 ppb, mientras que todas las muestras de prueba 5 a 8 tenían un contenido de aproximadamente 2 ppb o menos.

Asimismo, como se muestra en la Tabla 1, las muestras de prueba 1 a 4 (Controles) en forma de solución acuosa proporcionaron un tono de color macroscópico de amarillo pálido, mientras que las muestras de prueba 5 a 8 en forma de solución acuosa (Presente invención) tenían un tono amarillo aparentemente más pálido en comparación con los controles. Todas las muestras de prueba 1 a 4 en forma de solución acuosa tenían un grado de coloración de 0,24 o más, mientras que todas las muestras de prueba 5 a 8 en forma de solución acuosa tenían un grado de coloración más bajo de 0,20 o menos. Los grados de coloración de las muestras de ensayo 5 a 8 en forma de solución acuosa disminuyeron a medida que aumentaba la cantidad de agente reductor utilizado.

Como se desprende de la Tabla 1, las muestras de prueba 1 a 4 en forma de solución acuosa tenían una conductividad eléctrica de aproximadamente 11 a aproximadamente 12 pS/cm por encima de 10 pS/cm, mientras que las muestras de prueba 5 a 8 en forma de solución acuosa tenía una conductividad eléctrica de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 pS/cm siendo menor de 10 pS/cm.

Además, como se desprende de la Tabla 1, uno cualquiera de los contenidos de los elementos metálicos de calcio, potasio, magnesio y sodio en las muestras de prueba 5 a 8 fue evidentemente bajo en comparación con las muestras de prueba 1 a 4, y los resultados coincidieron bien con sus conductividades eléctricas medidas.

Estos resultados revelaron que, en comparación con los productos convencionales, las glicosil hesperetinas de la presente invención preparadas con los agentes reductores prescritos tuvieron una reducción significativa del contenido de furfural, del contenido de 4-VA y del grado de coloración, así como de la conductividad eléctrica y del contenido de elementos metálicos.

<Experimento 2: Prueba sensorial>

Se realizó una prueba sensorial como se indica a continuación con productos convencionales y las composiciones de glicosil hesperetina según la presente invención.

(1) Esquema de la prueba sensorial y preparación de la muestra de prueba.

Se realizó una prueba sensorial que se muestra en el siguiente apartado (2) con ocho panelistas sanos, que consistieron en dos mujeres y seis hombres, de 28 a 59 años, utilizando, como ejemplo representativo de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención, la muestra de prueba 6 que había mostrado valores intermedios para el contenido de furfural, los grados de coloración, las conductividades eléctricas y el contenido de elementos metálicos de las muestras de prueba 5 a 8 como se empleó en el Experimento 1; y, como ejemplo representativo de productos convencionales, la muestra de prueba 1 que había mostrado valores mínimos en el contenido de furfural, los grados de coloración, las conductividades eléctricas y el contenido de elementos metálicos de las muestras de prueba 1 a 4 como se empleó en el Experimento 1. La muestra de prueba 1 como producto convencional y la muestra de prueba 6 como composición de glicosil hesperetina de la presente invención se disolvieron respectivamente a temperatura ambiente en agua de ósmosis inversa, obtenida a través de una membrana de ósmosis inversa, para su uso como muestras de prueba 1 y 6 no calentadas, respectivamente, que a continuación, se almacenaron en recipientes sellados hasta ser sometidos a la siguiente prueba. Mientras, las muestras de prueba 1 y 6 sin calentar (denominadas "muestras de prueba 1 y 6 no calentadas", en lo sucesivo) se colocaron respectivamente en un recipiente, se sellaron en el mismo, se calentaron en un baño de agua hirviendo durante 30 min (denominado "tratamiento térmico", en lo sucesivo), y a continuación, se enfriaron a temperatura ambiente para su uso como muestras de prueba 1 y 6 con tratamiento térmico (denominadas "muestras de prueba calentadas 1 y 6", en lo sucesivo).

(2) Prueba sensorial

Se pidió a cada panelista que evaluara individualmente (a) la coloración y (b) el olor de alícuotas de 10 mL de las muestras de prueba 1 y 6 no calentadas y las muestras de prueba 1 y 6 calentadas, todas las cuales se habían obtenido en el apartado (1) anterior y se ajustaron para proporcionar una temperatura ambiente antes de someterlas a prueba. Después de eso, a cada panelista se le permitió hacer gárgaras con agua hervida antes de degustar cada muestra de prueba y se le permitió evaluar individualmente (c) el amargor (incluida la aspereza, dureza o astringencia), (d) retrogusto y (e) olor al degustar. A cada panelista se le pidió que evaluara las muestras de prueba 1 y 6 calentadas y no calentadas para los apartados de evaluación (a) a (e), en donde un patrón de evaluación era el mostrado en la siguiente Tabla 2, en la que el término "producto convencional" significa "la muestra de prueba 1" y la muestra de prueba 1 no calentada y la muestra de prueba 1 calentada se proporcionaron respectivamente como controles para la muestra de prueba 6 no calentada y la muestra de prueba 6 calentada, respectivamente. Los resultados se encuentran respectivamente en las Tablas 3 y 4.

Patrón de evaluación:

[Tabla 2]

(3) Resultado de la prueba sensorial

Tabla 3

[Tabla 4]

Los resultados de la evaluación en las Tablas 3 y 4 no muestran los resultados de la evaluación de (a) coloración, (b) olor, (c) amargor, (d) retrogusto y (e) olor para el producto convencional (la muestra de prueba 1 calentada/no calentada como control) per se; sin embargo, como se indica en el patrón de evaluación, se evaluaron los resultados de evaluación en las Tablas 3 y 4 de la composición de glicosil hesperetina de la presente invención basándose en los del producto convencional, y por lo tanto los resultados de evaluación de los productos convencionales corresponden al punto medio de "3" para cada puntuación, evaluados basándose en una escala de evaluación de 5 puntos, que se muestra en el patrón de evaluación.

Por el contrario, como se desprende de los resultados de la evaluación en la Tabla 3, la muestra de prueba 6 no calentada, es decir, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención sin tratamiento térmico proporcionó el número de panelistas, que habían considerado "1 punto" la puntuación más alta en la escala de evaluación de 5 puntos para los apartados de evaluación de (a) coloración, (b) olor, (c) amargor, (d) retrogusto y (e) olor, como cuatro, tres, cero, tres y cuatro (14 sujetos en total), respectivamente, entre cada uno de los ocho panelistas. Mientras, la muestra de prueba 6 calentada que se muestra en los resultados de la evaluación en la Tabla 4, es decir, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención con tratamiento térmico, tuvo el número de panelistas, que habían considerado "1 punto" la puntuación más alta en la escala de evaluación de 5 puntos para los apartados de evaluación de (a) coloración, (b) olor, (c) amargor, (d) retrogusto y (e) olor, como cuatro, cinco, siete, cuatro y cuatro (24 sujetos en total), entre cada uno de los ocho panelistas, respectivamente. Estos resultados indican que la composición de glicosil hesperetina de la presente invención es una composición de glicosil hesperetina de calidad relativamente alta que tiene una reducción eficaz del olor, así como de sabores diversos y coloración, en comparación con los productos convencionales.

De manera similar, como se desprende de los resultados de la evaluación en la Tabla 3, la muestra de prueba 6 no calentada, es decir, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención sin tratamiento térmico proporcionó el número de panelistas, que habían considerado "4 puntos" 1 punto más alto que el nivel más bajo de 5 puntos en la escala de evaluación de 5 puntos para los ítems de evaluación de (a) coloración, (b) olor, (c) amargor, (d) retrogusto y (e) olor, fueron respectivamente todos cero (cero en total). Mientras que, como se desprende de los resultados de la evaluación en la Tabla 4, la muestra de prueba calentada 6, es decir, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención con tratamiento térmico proporcionó el número de panelistas, que habían considerado "4 puntos" 1 punto más alto que el nivel más bajo de 5 puntos en la escala de evaluación de 5 puntos para los ítems de evaluación de (a) coloración, (b) olor, (c) amargor, (d) retrogusto y (e) olor, fueron respectivamente todos cero (cero en total). Estos resultados muestran que la composición de glicosil hesperetina de la presente invención es una composición de glicosil hesperetina de calidad relativamente alta que tiene una reducción eficaz del olor, así como de sabores diversos y coloración, en comparación con los productos convencionales.

Basándose en estos resultados, en comparación con los productos convencionales, la composición de glicosil hesperetina de la presente invención, independientemente de su tratamiento con calentamiento o sin calentamiento, es claramente ventajosa en términos de todos los apartados de evaluación de (a) coloración, (b) olor, (c ) amargor, (d) retrogusto y (e) olor, en donde la diferencia de calidad entre las composiciones de glicosil hesperetina calentadas y no calentadas se vuelve más clara cuando se calientan.

Cuando se someten a una prueba sensorial similar a "(2) Prueba sensorial" como en el Experimento 2 mencionado anteriormente, las muestras de prueba 5, 7 y 8, que se exponen en "(1) Preparación de la muestra de prueba" como en el Experimento 2, proporcionaron sustancialmente los mismos resultados que en la muestra de prueba 6 anterior. Por tanto, se reveló que la composición de glicosil hesperetina de la presente invención tiene una reducción significativa del amargor, incluido el sabor áspero, el sabor amargo, el sabor astringente y el retrogusto; o tiene una reducción significativa de sabores diversos y una clara reducción de la coloración. Además, se reveló que la composición de glicosil hesperetina tiene una clara reducción del olor en comparación con los productos convencionales.

<Experimento 3: Relación entre (a) los sabores diversos y la coloración de la glicosil hesperetina y (b) el contenido de furfural y 4-VA>

Se llevaron a cabo las siguientes pruebas para examinar la razón entre (a) los sabores diversos y coloración de la composición de glicosil hesperetina y (b) el contenido de furfural y 4-VA.

(1) Preparación de la muestra de prueba

De acuerdo con los métodos del Ejemplo 4 descrito más adelante y el Ejemplo de Referencia 1, una muestra para la composición de glicosil hesperetina de la presente invención (denominada "Muestra A", en lo sucesivo) y otra muestra como representante de productos convencionales (denominada "Muestra B", en lo sucesivo). Por conveniencia, las Muestras A y B se mezclaron en proporciones apropiadas para obtener tres tipos de muestras de glicosil hesperetina con contenido de furfural escalonadamente diferentes (denominadas "muestras de prueba 9 a 11") como se muestra en la Tabla 5.

(2) Contenido de furfural y 4-VA

Los contenidos de furfural y 4-VA en las muestras de prueba 9 a 11 se determinaron respectivamente de acuerdo con los métodos de medición mostrados en los apartados (1) y (2) en el Experimento 1.

(3) Prueba de valoración de la coloración

Nueve mujeres y hombre sanos, constituidos por dos mujeres y siete hombres, de 28 a 57 años, como panelistas, fueron sometidos a una prueba de evaluación de la coloración utilizando las muestras de prueba 9 a 11 y la muestra B (denominada "Control", en lo sucesivo). Estas muestras de prueba 9 a 11 y de Control se disolvieron respectivamente en agua destilada a temperatura ambiente en soluciones acuosas al 1% p/p, que a continuación, fueron observadas macroscópicamente y valoradas por los panelistas de la siguiente manera: Se consideró "Valoración A1", cuando los panelistas evaluaron y consideraron que la solución o las soluciones tenían "reducción de la coloración" en comparación con el control; y se consideró "Valoración B1", cuando los panelistas evaluaron y consideraron que la solución o las soluciones tenían "una reducción de la coloración". Los resultados están en la Tabla 5.

(4) Prueba sensorial

Las nueve mujeres y hombres anteriores como panelistas se sometieron a una prueba sensorial sobre los sabores diversos de las muestras de prueba 9 a 11 y de Control antes mencionadas. Estas muestras de prueba 9 a 11 y de Control se disolvieron respectivamente en agua destilada a temperatura ambiente en soluciones acuosas al 1% p/p, que a continuación, fueron bebidas por los panelistas y consideradas por ellos como "Valoración A2" cuando la solución o las soluciones acuosas fue/fueron evaluadas como "mejoradas en sabores diversos", y consideradas como "Valoración B2" cuando la solución o las soluciones fue/fueron evaluadas como "no mejoradas en sabores diversos". Los resultados están en la Tabla 5.

Tabla 5

Como se desprende de los resultados de la Tabla 5, los sabores diversos de las composiciones de glicosil hesperetina mejoraron clara y significativamente con el contenido de furfural de alrededor de 200 ppb como límite y mejoraron clara y significativamente con el contenido de 4-VA de alrededor de 30 ppb como otro límite. Lo mismo se aplica a la coloración de las composiciones de glicosil hesperetina. Estos resultados sugirieron fuertemente que el contenido de furfural y el contenido de 4-VA se pueden utilizar como índices para distinguir con seguridad las composiciones de glicosil hesperetina que tienen una reducción significativa de sabores diversos y una clara reducción de la coloración de tal manera que se seleccionan las que tienen un contenido de furfural no superior a 200 ppb y un contenido de 4-VA no superior a 30 ppb para obtener las composiciones de glicosil hesperetina deseadas que se tienen una reducción significativa de sabores diversos y tienen una clara reducción de la coloración en comparación con los productos convencionales.

La siguiente Tabla 6 muestra la razón entre (a) los sabores diversos de diferentes composiciones de glicosil hesperetina en partículas y (b) el contenido de furfural y 4-VA como se describe en la Tabla 1 antes mencionada en el Experimento 1, los Ejemplos 1 a 7 descritos más adelante, y el Ejemplo de referencia 1. En la Tabla 6, las muestras de prueba 5 a 8 como las composiciones de glicosil hesperetina de la presente invención y las glicosil hesperetinas pulverizadas de los Ejemplos 1 a 7 (denominadas "las presentes muestras de prueba" en conjunto, en lo sucesivo) tenían contenidos de furfural no superiores a 191 ppb y contenidos de 4-VA no superiores a 28,7 ppb, lo que significa que las muestras de prueba presentes tenían una reducción significativa de sabores diversos característicos de los productos convencionales. Por el contrario, las muestras de prueba 1 a 4 y la glicosil hesperetina pulverizada del Ejemplo de Referencia 1 como Controles 1 a 5 (denominadas "muestras de prueba de control" en conjunto, en lo sucesivo) tenían contenidos de furfural de 308 ppb o más y contenidos de 4-VA de 40,0 ppb o más, y todas tenían los sabores diversos característicos de los productos convencionales.

Los resultados de estos Experimentos, Ejemplos y Ejemplo de Referencia resumidos en la siguiente Tabla 6 coincidieron bien con los resultados del Experimento 3; y basándose en estos resultados, se puede considerar que la selección de composiciones de glicosil hesperetina con un contenido de furfural de menos de 200 ppb y/o un contenido de 4-VA de menos de 30 ppb, que se obtiene utilizando el contenido de furfural y/o el contenido de 4-VA como índices, da como resultado una obtención de las composiciones de glicosil hesperetina deseadas que tienen una reducción significativa de sabores diversos en comparación con los productos convencionales.

Tabla 6

A partir de los resultados Experimentales antes mencionados, dado que las composiciones de glicosil hesperetina de la presente invención tienen una reducción significativa de sabores diversos y tienen una clara reducción de la coloración y del olor en comparación con los productos convencionales, per se son muy ventajosamente útiles como productos alimenticios que tienen una reducción significativa de sabores diversos y tienen una clara reducción de la coloración y del olor, y se han vuelto útiles sin ningún inconveniente incluso cuando se utilizan en productos alimenticios, artículos comestibles de lujo, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas y materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, productos de plástico, etc., en los que no se podrían haber utilizado productos convencionales debido a sus sabores diversos solos o junto con su coloración, así como su olor; o en el que inevitablemente se induce el deterioro.

A continuación se explica la presente invención con más detalle con referencia a los ejemplos y ejemplos de referencia.

Ejemplo 1

<Composición en partículas de glicosil hesperetina>

Se calentaron cuatro partes en masa de solución acuosa de hidróxido de sodio 1 N a 80°C y se añadieron una parte en masa de hesperidina y siete partes en masa de dextrina (equivalente de dextrosa (ED) de 20), seguido de disolución del contenido en el mezcla en condiciones de agitación durante 30 min, ajuste de la solución a pH 9,0, adición de 30 unidades/g de dextrina de una CGTasa, derivada de la cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus (FERM BP-11273) depositada el 30 de julio de 1973 y solicitada en el Depositario de Organismos de Patentes Internacionales en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industriales Avanzadas, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi , Ibaraki-ken, 305-8566 Japón, y se sometieron a una reacción enzimática durante 18 horas mientras se mantenía el pH a 6,9 y la temperatura a 50°C para convertir aproximadamente 70% de la hesperidina en a-glicosil hesperidina. A la solución de reacción enzimática resultante se le añadió 0,05% de pirosulfito de sodio como agente reductor, seguido de calentamiento de la solución a 100°C durante 30 min, inactivando la enzima que quedaba en la solución, añadiendo "GLUCOZYME", un nombre de producto de una glucoamilasa, comercializado por Nagase ChemteX Corporation, Osaka, Japón, en una cantidad de 100 unidades por gramo de sólidos de la solución de reacción enzimática, y haciendo reaccionar enzimáticamente la mezcla resultante durante cinco horas mientras se mantenía el pH a 5,0 y la temperatura a 55°C para formar a-glucosil hesperidina. La solución de reacción enzimática resultante se calentó para inactivar la enzima restante y se filtró, seguido de la alimentación del producto filtrado resultante a una columna empaquetada con "DIAION HP-10", un nombre de producto de un adsorbente sintético poroso, comercializado por Mitsubishi Chemical Corporation, Tokio. Japón, a una velocidad espacial (VE) de dos. Como resultado, la a-glucosil hesperidina y la hesperidina intacta en la solución se adsorbieron sobre el adsorbente sintético poroso, pero la D-glucosa restante, las sales y similares se eluyeron de la columna sin adsorción. Después de eso, la columna se alimentó con agua refinada para su lavado y a continuación, se alimentó con una solución acuosa de etanol mientras se aumentaba gradualmente la concentración de etanol para recolectar las fracciones que contenían a-glucosil hesperidina, seguido de la reunión de las fracciones, concentración de las fracciones reunidas a vacío, y pulverización del producto concentrado para obtener una composición de glicosil hesperetina en partículas de color amarillo pálido con un rendimiento de aproximadamente 70%, d.s.b., con respecto a la masa sólida del material de hesperidina. La composición de glicosil hesperetina en partículas resultante contenía 80,0% de a-glucosil hesperidina, 12,3% de hesperidina y 7,7% de otros ingredientes.

El producto así obtenido tenía un contenido de furfural de 12 ppb, un contenido de 4-VA de 2 ppb, un grado de coloración de 0,19 y una conductividad eléctrica de aproximadamente 6 pS/cm. Asimismo, el producto contenía calcio, potasio, magnesio y sodio en cantidades respectivas de aproximadamente 0,4 ppm, aproximadamente 0,05 ppm, aproximadamente 0,1 ppm y aproximadamente 0,1 ppm.

En comparación con los productos convencionales, el producto anterior tiene ventajosamente rasgos característicos: tiene una reducción significativa de sabores diversos y una clara reducción de la coloración y del olor, y los sabores diversos se reducen significativamente y la coloración y el olor también se reducen de manera eficaz y clara incluso cuando se calienta durante 30 min en condiciones de temperatura relativamente alta de 90 a 100°C. En consecuencia, los productos alimenticios, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas y materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, o productos de plástico, todos los cuales contienen el producto, tienen una reducción significativa de sabores diversos y tienen una clara reducción de la coloración y del olor como beneficios ventajosos, incluso cuando se mantienen o almacenan a una temperatura dentro o por debajo del intervalo de temperatura anterior durante varias decenas de minutos a varios meses, en comparación con el caso en el que se utilizan productos convencionales. De manera similar a los productos convencionales, el producto se puede utilizar ventajosamente como agente enriquecido en vitamina P, además de como antioxidante natural, estabilizador, agente de mejora de la calidad, preventivo, agente terapéutico o agente absorbente de ultravioleta altamente seguro en varias composiciones tales como productos alimenticios, artículos comestibles de lujo, piensos, cebos, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas y materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, productos de plástico, etc.

Ejemplo 2

<Composición en partículas de glicosil hesperetina>

Se calentaron a 80°C cuatro partes en masa de solución acuosa de hidróxido de sodio 1 N y, mientras se mantenía la temperatura, se añadieron sucesivamente a la solución una parte en masa de hesperidina, cuatro partes en masa de dextrina (ED 10) y 0,06 parte en masa de sulfito de sodio, seguido de disolución del contenido en la mezcla mientras se agitaba durante 30 min, neutralización de la solución con una solución de ácido clorhídrico 0,01 N, adición de 20 unidades/g de dextrina de una CGTasa, derivada la Cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus (FERM BP-11273) depositada en el Depositario de Organismos de Patentes Internacionales en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industriales Avanzadas, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japón, y mantenimiento de la mezcla a pH 6,0 y 75°C durante 24 horas en condiciones de agitación para efectuar una reacción enzimática. Se tomaron muestras de la solución de reacción enzimática resultante para su análisis en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), revelando que aproximadamente 69% de la hesperidina se convirtió en a-glicosil hesperidina. A la solución de reacción enzimática se le añadió pirosulfito de sodio como agente reductor para proporcionar una concentración de 0,03%, se calentó a 90°C durante 120 min, se le añadieron 50 unidades/g del producto intermedio anterior que contenía a-glicosil hesperidina y se sometió a una reacción enzimática durante 10 horas manteniendo el pH a 5,0 y la temperatura a 55°C para formar a-glucosil hesperidina. La solución de reacción enzimática resultante se calentó para inactivar la enzima restante y se filtró, seguido de la alimentación del producto filtrado resultante a una columna empaquetada con "DIAION HP-10", un nombre de producto de un adsorbente sintético poroso, comercializado por Mitsubishi Chemical Corporation, Tokio, Japón, a VE de 2. Como resultado, la a-glucosil hesperidina y la hesperidina intacta en la solución se adsorbieron sobre el adsorbente sintético poroso, pero los sacáridos, sales y similares restantes se eluyeron de la columna sin adsorción. Después de eso, la columna se alimentó con agua refinada para su lavado y a continuación, se alimentó con una solución acuosa de etanol mientras se aumentaba gradualmente la concentración de etanol para recolectar las fracciones que contenían a-glucosil hesperidina, seguido de la reunión de las fracciones, concentración de las fracciones combinadas a vacío, y pulverización del producto concentrado para obtener una glicosil hesperetina en partículas de color amarillo pálido con un rendimiento de aproximadamente 68%, d.s.b., con respecto a la masa sólida del material de hesperidina. La composición de glicosil hesperetina en partículas resultante contenía 77,0% de a-glucosil hesperidina, 15,5% de hesperidina y 7,5% de otros ingredientes.

El producto así obtenido tenía un contenido de furfural de 11 ppb, un contenido de 4-VA de 1,5 ppb, un grado de coloración de 0,14 y una conductividad eléctrica de aproximadamente 4 pS/cm. Asimismo, el producto contenía calcio, potasio, magnesio y sodio en cantidades respectivas de aproximadamente 0,4 ppm, aproximadamente 0,06 ppm, aproximadamente 0,1 ppm y aproximadamente 0,1 ppm.

En comparación con los productos convencionales, el producto anterior tiene ventajosamente rasgos característicos: tiene una reducción significativa de sabores diversos y una clara reducción de la coloración y del olor, y los sabores diversos del mismo se reducen significativamente y la coloración y el olor se reducen de manera eficaz y clara incluso cuando se calienta durante 30 min en condiciones de temperatura relativamente alta de 90 a 100°C. En consecuencia, los productos alimenticios, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas y materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, o productos de plástico, todos los cuales contienen el producto, tienen una reducción significativa de sabores diversos y tienen una clara reducción de la coloración y del olor como beneficios ventajosos, cuando se mantienen o almacenan a una temperatura dentro o por debajo del intervalo de temperatura anterior durante varias decenas de minutos a varios meses, en comparación con los productos convencionales. De manera similar a los productos convencionales, el producto se puede utilizar ventajosamente como agente enriquecido en vitamina P, además de como antioxidante natural, estabilizador, agente de mejora de la calidad, preventivo, agente terapéutico o agente absorbente de ultravioleta altamente seguro en varias composiciones tales como productos alimenticios, artículos comestibles de lujo, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas y materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, productos de plástico, etc.

Ejemplo 3

<Composición en partículas de glicosil hesperetina>

Se calentaron a 80°C cuatro partes en masa de solución acuosa de hidróxido de sodio 1 N y, mientras se mantenía la temperatura, se añadieron sucesivamente a la solución 0,1 partes en masa de sulfito de sodio, una parte en masa de hesperidina y cuatro partes en masa de dextrina (ED 10), seguido de disolución del contenido en la mezcla mientras se agitaba durante 30 min, neutralización de la solución resultante con una solución de ácido clorhídrico 0.01 N, adición rápida de 20 unidades/g de dextrina de una CGTasa, derivada de la Cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus (FERM BP-11273) depositada en el Depositario de Organismos de Patentes Internacionales en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industriales Avanzadas, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japón, y mantenimiento de la mezcla a pH 6,0 y 75°C durante 24 horas en condiciones de agitación para efectuar una reacción enzimática, con lo que aproximadamente 72% de la hesperidina se convirtió en a-glicosil hesperidina. La solución de reacción enzimática así obtenida se calentó para inactivar la enzima restante y se filtró, seguido de la alimentación del filtrado resultante a una columna empaquetada con "DIAION HP-20", un nombre de producto de un adsorbente sintético poroso, comercializado por Mitsubishi Chemical Corporation, Tokio, Japón, a VE de 2. Como resultado, la a-glicosil hesperidina y la hesperidina intacta en la solución se adsorbieron sobre el adsorbente sintético poroso, pero la D-glucosa restante, las sales y similares se eluyeron de la columna sin adsorción. Después de eso, la columna se alimentó con agua refinada para su lavado y a continuación, se alimentó con una solución acuosa de etanol mientras se aumentaba gradualmente la concentración de etanol para recolectar las fracciones que contenían a-glicosil hesperidina, seguido de la reunión de las fracciones, concentración de las fracciones reunidas a vacío, y pulverización del producto concentrado para obtener una glicosil hesperetina en partículas de color amarillo pálido con un rendimiento de aproximadamente 71%, d.s.b., con respecto a la masa sólida del material de hesperidina. La composición de glicosil hesperetina en partículas así obtenida contenía 76,0% de a-glicosil hesperidina, 18,5% de hesperidina y 5,5% de otros ingredientes.

El producto así obtenido tenía un contenido de furfural de 10 ppb, un contenido de 4 VA de 3,0 ppb, un grado de coloración de 0,17 y una conductividad eléctrica de aproximadamente 4 pS/cm. Asimismo, el producto contenía calcio, potasio, magnesio y sodio en cantidades respectivas de aproximadamente 0,3 ppm, aproximadamente 0,04 ppm, aproximadamente 0,1 ppm y aproximadamente 0,05 ppm.

En comparación con los productos convencionales, el producto anterior tiene ventajosamente rasgos característicos: tiene una reducción significativa de sabores diversos y una clara reducción de la coloración y del olor, y los sabores diversos del mismo se reducen significativamente y la coloración y el olor se reducen de manera eficaz y clara incluso cuando se calienta durante 30 min en condiciones de temperatura relativamente alta de 90 a 100°C. En consecuencia, los productos alimenticios, cosméticos, productos farmacéuticos como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas y materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, o productos de plástico, todos los cuales contienen el producto, tienen una reducción significativa de sabores diversos y tienen una clara reducción de la coloración y del olor como beneficios ventajosos, cuando se mantienen o almacenan a una temperatura dentro o por debajo del intervalo de temperatura anterior durante varias decenas de minutos a varios meses, en comparación con los productos convencionales. De manera similar a los productos convencionales, el producto se puede utilizar ventajosamente como un agente enriquecido en vitamina P, además de como antioxidante natural, estabilizador, agente de mejora de la calidad, preventivo, agente terapéutico o agente absorbente de ultravioleta altamente seguro en varias composiciones tales como productos alimenticios, artículos comestibles de lujo, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes anti-enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas y materiales industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, productos de plástico, etc.

Ejemplo 4

<Composición en partículas de glicosil hesperetina>

Se añadieron una parte en masa de hesperidina, 10 partes en masa de dextrina (ED 8) y 0,05 partes en masa de pirosulfito de sodio como agente reductor a 50 partes en masa de agua. La mezcla resultante se calentó a pH 9,5 y 90°C durante 70 min, se le añadieron 30 unidades/g de dextrina de una CGTasa, derivada de la Cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus (FERM BP-11273) depositada en el Depositario de Organismos de Patentes Internacionales en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industriales Avanzadas, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japón, se mantuvo durante 40 horas mientras se mantenía el pH a 8,2 y la temperatura a 65°C bajo condiciones de agitación, se añadió pirosulfito de sodio como agente reductor para proporcionar 005% a la solución de reacción enzimática inmediatamente antes de completar la reacción enzimática, se calentó a 85°C para inactivar la enzima restante, se añadieron 100 unidades/g de sólidos de la solución de "GLUCOZYME", una muestra de glucoamilasa, comercializada por Nagase ChemteX Corporation, Osaka, Japón, y se hizo reaccionar durante cinco horas manteniendo el pH en 5,0 y la temperatura a 55°C para formar a-glucosil hesperidina. La solución de reacción enzimática así obtenida se calentó para inactivar la enzima restante. A la solución de reacción enzimática resultante se le añadieron 0,5 partes en peso de "HESPERIDINASA SOLUBLE <Tanabe> Núm. 2", una preparación de hesperidinasa, comercializada por Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Osaka, Japón, se ajustó a pH 4 y se sometió a una reacción enzimática a 55°C durante 24 horas. A la solución de reacción enzimática resultante se le añadieron 0,01 partes en masa de pirosulfito de sodio, se calentó para inactivar la enzima restante y se filtró, seguido de la alimentación del producto filtrado a una columna empaquetada con "DIAION HP-10", un nombre de producto de un adsorbente sintético poroso, comercializado por Mitsubishi Chemical Corporation, Tokio, Japón, a VE de 2. Como resultado, la a-glucosil hesperidina, la 7-O-pglucosil hesperetina y la hesperidina intacta en la solución se adsorbieron sobre el adsorbente sintético poroso, pero la D-glucosa restante, las sales y similares se eluyeron de la columna sin adsorción. Después de eso, la columna se alimentó con agua refinada para su lavado y a continuación, se alimentó con una solución acuosa de etanol mientras se aumentaba gradualmente la concentración de etanol para recolectar fracciones que contenían a-glucosil hesperidina, seguido de la reunión de las fracciones, concentración de las fracciones reunidas a vacío, y pulverización del producto concentrado para obtener una composición de glicosil hesperetina en partículas de color amarillo pálido con un rendimiento de aproximadamente 70%, d.s.b., con respecto a la masa sólida del material de hesperidina. La composición de glicosil hesperetina en partículas así obtenida contenía 81,9% de a-glucosil hesperidina, 0,5% de hesperidina, 8,9% de 7-O-p-glucosil hesperetina y 8,7% de otros ingredientes.

El producto así obtenido tenía un contenido de furfural de 9 ppb, un contenido de 4-VA de 2,0 ppb, un grado de coloración de 0,16 y una conductividad eléctrica de aproximadamente 4 pS/cm. Asimismo, el producto contenía calcio, potasio, magnesio y sodio en cantidades respectivas de aproximadamente 0,3 ppm, aproximadamente 0,03 ppm, aproximadamente 0,05 ppm y aproximadamente 0,05 ppm.

En comparación con los productos convencionales, el producto anterior tiene características ventajosas: tiene una reducción significativa de sabores diversos y una clara reducción de la coloración y del olor, y también los sabores diversos se reducen significativamente y la coloración y el olor se reducen de manera eficaz y clara incluso cuando se calienta durante 30 min en condiciones de temperatura relativamente alta de 90 a 100°C. En consecuencia, los productos alimenticios, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas e ingredientes industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, o productos de plástico, todos los cuales contienen el producto, tienen una reducción significativa de sabores diversos y tienen una clara reducción de la coloración y del olor como beneficios ventajosos, cuando se mantienen o almacenan a una temperatura dentro o por debajo del intervalo de temperatura anterior durante varias decenas de minutos a varios meses, en comparación con los productos convencionales. De manera similar a los productos convencionales, el producto se puede utilizar ventajosamente como agente enriquecido en vitamina P, además de como antioxidante natural, estabilizador, agente de mejora de la calidad, preventivo, agente terapéutico o agente absorbente de ultravioleta altamente seguro en varias composiciones tales como productos alimenticios, artículos comestibles de lujo, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes anti-enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas e ingredientes industriales, piensos, cebos, ropa, productos diversos, incluidos los artículos de primera necesidad, productos de plástico, etc. Ejemplo 5

<Composición en partículas de glicosil hesperetina>

Se disolvieron cincuenta partes en masa de hesperidina y una parte en masa de hiposulfito de sodio como agente reductor calentando en 90 partes en masa de solución acuosa de hidróxido de sodio 0,25 N a 80°C. Se añadieron ciento cincuenta partes en masa de dextrina con ED 8 y se disolvieron en la solución anterior, ajustando a continuación la solución resultante a pH 9,0, añadiendo de 15 unidades de una CGTasa, derivada de la Cepa Tc-91 de Geobacillus stearothermophilus (FERM BP-11273) depositada en el Depositario de Organismos de Patentes Internacionales en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industriales Avanzadas, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japón, a la solución por una parte en masa de la dextrina, ajustando de la mezcla a pH 8,3 mientras se calentaba a 60°C, y sometiendo la mezcla resultante a una reacción enzimática durante seis horas. Posteriormente, la mezcla de reacción se ajustó a pH 7,0, se calentó a 68°C y se hizo reaccionar enzimáticamente durante 40 horas. Una vez completada la reacción enzimática, la mezcla de reacción enzimática resultante se calentó para inactivar las enzimas restantes y se filtró para obtener una solución de reacción enzimática. Un análisis de HPLC de la solución de reacción enzimática reveló que 72% de hesperidina en la solución antes de la reacción enzimática se convirtió en a-glucosil hesperidina y 28% restante de hesperidina permaneció intacto. La solución de reacción enzimática se mezcló con dos partes en masa de "Hesperidinasa soluble <TANABE> 2", un nombre de producto de hesperidinasa como a-L-ramnosidasa, comercializado por Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Tokio, Japón, ajustado a pH 4, se hizo reaccionar enzimáticamente a 55°C durante 24 horas, se le añadió una parte en masa de "GLUCOZYME", un nombre de producto de una glucoamilasa, comercializada por Nagase ChemteX Corporation, Osaka, Japón, y se hizo reaccionar de nuevo enzimáticamente a 55°C durante 24 horas. Una vez completada la reacción enzimática, la solución de reacción enzimática resultante se calentó para inactivar las enzimas restantes, se alimentó a una columna empaquetada con "AMBERLITE XAD-7", un nombre de producto de una resina adsorbente porosa con una polaridad media, comercializada por Rohm. & Hass Company, Filadelfia, EE. UU., seguido de un lavado de la columna con agua y elución de los ingredientes adsorbidos en la resina con una solución acuosa de etanol al 80% v/v. Después de eliminar el etanol en el eluato, el eluato resultante se liofilizó para obtener una composición de glicosil hesperetina en partículas que contenía 82,0% de a-glucosil hesperidina, 8,0% de 7-O-p-glucosil hesperetina, 1,0% de hesperidina y 9,0% de otros ingredientes.

El producto así obtenido tenía un contenido de furfural de 10 ppb, un contenido de 4 VA de 1,5 ppb, un grado de coloración de 0,15 y una conductividad eléctrica inferior a 10 pS/cm. Asimismo, el producto contenía calcio, potasio, magnesio y sodio en cantidades respectivas de aproximadamente 0,4 ppm, aproximadamente 0,04 ppm, aproximadamente 0,1 ppm y aproximadamente 0,2 ppm.

En comparación con los productos convencionales, el producto anterior tiene ventajosamente rasgos característicos: tiene una reducción significativa de sabores diversos y una clara reducción de la coloración y del olor, y también los sabores diversos se reducen significativamente y la coloración y el olor se reducen de manera eficaz y clara incluso después de calentar durante 30 min en condiciones de temperatura relativamente alta de 90 a 100°C. En consecuencia, los productos alimenticios, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas e ingredientes industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, o productos de plástico, todos los cuales contienen el producto, tienen una reducción significativa de sabores diversos y tienen una clara reducción de la coloración y del olor como beneficios ventajosos, cuando se mantienen o almacenan a una temperatura dentro o por debajo del intervalo de temperatura anterior durante varias decenas de minutos a varios meses, en comparación con los productos convencionales. De manera similar a los productos convencionales, el producto se puede utilizar ventajosamente como agente enriquecido en vitamina P, además de como antioxidante natural, estabilizador, agente de mejora de la calidad, preventivo, agente terapéutico o agente absorbente de ultravioleta altamente seguro en varias composiciones tales como productos alimenticios, artículos comestibles de lujo, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes anti-enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas e ingredientes industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, productos de plástico, etc.

Ejemplo 6

<Composición en partículas de glicosil hesperetina>

Excepto por la adición de 0,001% de hiposulfito de potasio como agente reductor a una solución de reacción enzimática, se obtuvo una composición de glicosil hesperetina en partículas de color amarillo pálido de manera similar a la del Ejemplo 1 con un rendimiento de aproximadamente 69%, d.s.b, frente a la masa sólida del material de hesperidina. La composición de glicosil hesperetina en partículas contenía 79,5% de a-glucosil hesperidina, 13,8% de hesperidina y 6,7% de otros ingredientes.

El producto así obtenido tenía un contenido de furfural de 180 ppb, un contenido de 4 VA de 20 ppb, un grado de coloración de 0,23 y una conductividad eléctrica de menos de 10 pS/cm. Asimismo, el producto contenía calcio, potasio, magnesio y sodio en cantidades respectivas de aproximadamente 0,5 ppm, aproximadamente 0,08 ppm, aproximadamente 0,1 ppm y aproximadamente 0,3 ppm.

Aunque es inferior a las composiciones de glicosil hesperetina en partículas obtenidas en los Ejemplos 1 a 5, el producto anterior tiene características ventajosas en comparación con los productos convencionales: tiene una reducción significativa de sabores diversos y una clara reducción de la coloración y del olor, y también los sabores diversos se reducen significativamente y la coloración y el olor se reducen de forma clara y eficaz incluso después de haber sido calentado durante 30 minutos en condiciones de temperatura relativamente alta de 90 a 100°C. En consecuencia, los productos alimenticios, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas e ingredientes industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, o productos de plástico, todos los cuales contienen el producto, tienen una reducción significativa de sabores diversos y tienen una clara reducción de la coloración y del olor como beneficios ventajosos, cuando se mantienen o almacenan a una temperatura dentro o por debajo del intervalo de temperatura anterior durante varias decenas de minutos a varios meses, en comparación con los productos convencionales. De manera similar a los productos convencionales, el producto se puede utilizar ventajosamente como un agente enriquecido en vitamina P, además de como antioxidante natural, estabilizador, agente de mejora de la calidad, preventivo, agente terapéutico o agente absorbente de ultravioleta altamente seguro en varias composiciones tales como productos alimenticios, artículos comestibles de lujo, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materias primas e ingredientes industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, productos de plástico, etc.

Ejemplo 7

<Composición en partículas de glicosil hesperetina>

Excepto por la sustitución del hiposulfito de potasio por hidrogenosulfito de sodio, se obtuvo una composición de glicosil hesperetina en partículas de color amarillo pálido de forma similar a la del Ejemplo 6 con un rendimiento de aproximadamente 65%, d.s.b., frente a la masa sólida del material de hesperidina. La composición de glicosil hesperetina en partículas así obtenida contenía 77,2% de a-glucosil hesperidina, 16,5% de hesperidina y 6,3% de otros ingredientes.

El producto así obtenido tenía un contenido de furfural de 191 ppb, un contenido de 4-VA de 28,7 ppb, un grado de coloración de 0,23 y una conductividad eléctrica de menos de 10 pS/cm. Asimismo, el producto contenía calcio, potasio, magnesio y sodio en cantidades respectivas de aproximadamente 0,5 ppm, aproximadamente 0,07 ppm, aproximadamente 0,09 ppm y aproximadamente 0,4 ppm.

Aunque el producto es inferior a las composiciones de glicosil hesperetina en partículas obtenidas en los ejemplos 1 a 5, tiene características ventajosas en comparación con los productos convencionales: tiene una reducción significativa de sabores diversos y una clara reducción de la coloración y del olor, y también los sabores diversos se reducen significativamente y la coloración y el olor se reducen de forma clara y eficaz incluso después de calentar durante 30 minutos en condiciones de temperatura relativamente alta de 90 a 100°C. En consecuencia, los productos alimenticios, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materiales e ingredientes industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, o productos de plástico, todos los cuales, al contener el producto, tienen una reducción significativa de sabores diversos y tienen una clara reducción de la coloración y del olor como beneficios ventajosos, cuando se mantienen o almacenan a una temperatura dentro o por debajo del intervalo de temperatura anterior durante varias decenas de minutos a varios meses, en comparación con los productos convencionales. De manera similar a los productos convencionales, el producto se puede utilizar ventajosamente como un agente enriquecido en vitamina P, además de como antioxidante natural, estabilizador, agente de mejora de la calidad, preventivo, agente terapéutico o agente absorbente de ultravioleta altamente seguro en varias composiciones tales como productos alimenticios, artículos comestibles de lujo, cosméticos, productos farmacéuticos tales como agentes para enfermedades susceptibles, cuasifármacos, productos químicos, materiales e ingredientes industriales, piensos, cebos, ropa, artículos diversos, incluidos productos básicos, productos de plástico, etc.

Ejemplo 8 (no de acuerdo con la presente invención)

<Método para reducir los sabores diversos de productos que contienen glicosil-hesperetina>

Se obtuvo una glicosil hesperetina en partículas añadiendo sulfito de sodio, hiposulfito de sodio, hiposulfito de potasio o pirosulfito de sodio a la glicosil hesperetina en partículas descrita más adelante, obtenida en el Ejemplo de Referencia 1, en una cantidad de 0,03%, d.s.b, mezclando la mezcla hasta homogeneidad, calentando la mezcla resultante y a continuación, purificando el resultante.

Este método es una técnica bastante sencilla consistente en la adición solamente de cualquiera de los agentes reductores anteriores a la glicosil hesperetina en partículas obtenida en el Ejemplo de Referencia 1, sin embargo, tiene la ventaja de tener una reducción significativa de sabores diversos inherentes a los productos convencionales. Dado que las partículas de glicosil hesperetina obtenidas por este método no solo tienen una reducción significativa de sabores diversos, sino que tienen una clara reducción de la coloración y del olor, el sabor diverso inducible por el producto se reduce significativamente, y la coloración y el olor que también son inducibles por el producto se reducen eficazmente y claramente incluso cuando se incorporaron a productos alimenticios y a continuación, se trataron mediante calentamiento o se almacenaron en forma de solución en condiciones de calentamiento durante un período de tiempo relativamente largo.

Ejemplo 9

<Edulcorante mixto>

Se obtuvo un edulcorante mixto líquido enriquecido en vitamina P sometiendo 100 partes en masa de un azúcar isomerizado, dos partes en masa de sacarosa y una parte en masa de una composición de glicosil hesperetina en partículas obtenida por el método del Ejemplo 1, a tratamiento térmico a 80°C durante 30 minutos.

El producto es un edulcorante mixto líquido enriquecido con vitamina P que tiene una reducción eficaz de los sabores diversos, la coloración y el olor característicos de los productos convencionales. En consecuencia, siempre que los productos alimenticios se cocinen con el producto, no deben afectar los sabores diversos desfavorables, la coloración y el olor inducidos por el producto, no se deteriora el sabor, el aroma y el tono de color de los materiales alimenticios utilizados como mérito.

Ejemplo 10

<Caramelo duro>

Se obtuvo un caramelo duro enriquecido en vitamina P concentrando una solución de 20 partes en masa de agua y 10 partes en masa de "TREHA", una marca registrada de a,a-trehalosa, comercializada por Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japón, a vacío a 155°C hasta obtener un contenido de humedad de aproximadamente dos por ciento o menos; enfriando el concentrado hasta 120°C; mezclando el resultante con 0,5 partes en masa de ácido cítrico, 0,01 partes en masa de una composición de glicosil hesperetina en partículas obtenida por el método del Ejemplo 2, y una cantidad adecuada de aroma de limón; y dando forma y empaquetando la mezcla resultante de manera convencional para obtener el producto del título.

A diferencia de los caramelos duros preparados con productos convencionales, el producto tiene una reducción eficaz de los sabores diversos, la coloración y el olor característicos de dichos caramelos duros convencionales y, por lo tanto, es un caramelo duro enriquecido en vitamina P sin deterioro del sabor a limón y la transparencia del mismo.

Ejemplo 11

<Formulación encapsulada>

Se obtuvo una formulación encapsulada con un peso neto de 150 mg por cápsula mezclando hasta homogeneidad 10 partes en masa de monohidrato de acetato de calcio, 50 partes en masa de trihidrato de L-lactato magnesio, 57 partes en masa de maltosa, 20 partes en masa de una composición de glicosil hesperetina en partículas obtenida por el método del Ejemplo 3, y l2 partes en masa de un compuesto de inclusión de Y-ciclodextrina que contiene 20% de ácido eicosapentaenoico, sometiendo la mezcla resultante a un granulador y encapsulando el resultante en una cápsula de gelatina de una manera convencional.

Incluso después de reposar a temperatura ambiente o más durante un período de tiempo relativamente largo, el producto se puede utilizar ventajosamente, por ejemplo, como agente reductor del colesterol en sangre de alta calidad, inmunoactivador o agente embellecedor de la piel como agente profiláctico o terapéutico para enfermedades susceptibles o como producto alimenticio que promueve la salud, todos los cuales están sustancialmente libres de incremento o deterioro de sabores diversos, coloración u olor inducidos por el producto.

Ejemplo 12

<Aditivo de baño>

Se obtuvo un aditivo de baño mezclando 21 partes en masa de DL-lactato de sodio, ocho partes en masa de piruvato de sodio, cinco partes en masa de una composición de glicosil hesperetina en partículas obtenida mediante el método del Ejemplo 4, y cantidades adecuadas de un colorante y un aroma.

El producto se diluye con agua tibia en una bañera de 100 a 10.000 veces. Incluso después de un lapso de una hora o más desde la adición del producto a un agua tibia circulante en la bañera, el producto ni aumenta sustancialmente ni cambia la coloración y el olor inherentes al producto, en comparación con aquellos inmediatamente después de su adición al agua tibia, además de no deteriorar la fragancia del aroma contenido en el producto, por lo que el producto es un aditivo de baño de alta calidad.

Ejemplo 13

<Loción lechosa>

Se disolvieron media parte en masa de polioxietilen behenil éter, una parte en masa de tetraoleato de polioxietilensorbitol, una parte en masa de monoestearato de glicerilo lipófilo, 0,5 partes en masa de ácido pirúvico, 0,5 partes en masa de alcohol behenílico, una parte en masa de aceite de aguacate, una parte en masa de una composición de glicosil hesperetina en partículas obtenida por el método del Ejemplo 1, y cantidades adecuadas de vitamina E y un antiséptico calentando de la manera habitual. A la solución resultante se le añadió una parte en masa de L-lactato de sodio, cinco partes en masa de 1,3-butilenglicol, 0,1 partes en masa de polímero de carboxivinilo y 85,3 partes en masa de agua refinada, seguido de la emulsión de la mezcla con un homogeneizador, añadiendo una cantidad adecuada de aroma al producto homogeneizado y mezclando el resultante para obtener una loción lechosa.

Incluso después de permanecer a temperatura ambiente o en condiciones de temperatura ligeramente más alta que durante un período de tiempo relativamente largo, el producto es una loción lechosa de alta calidad, que está sustancialmente libre de cualquier incremento o deterioro de sabores diversos, coloración y olor inducible por el producto, además de estar libre de deterioro de la fragancia del aroma incorporado.

Ejemplo 14

<Agente enriquecido en vitamina P>

A una parte en masa de una composición de glicosil hesperetina en partículas obtenida por el método del Ejemplo 4, se le añadieron uno o más de sulfito de sodio, hiposulfito de sodio, hiposulfito de potasio y pirosulfito de sodio en una cantidad total de 0,0005 partes en masa; y mezclado hasta homogeneidad para obtener 15 tipos diferentes de agentes enriquecidos con vitamina P como complementos alimenticios saludables.

Incluso después de permanecer a temperatura ambiente o condiciones de temperatura relativamente más altas durante varias decenas de minutos a varios meses y a continuación, añadirlas a bebidas tales como té verde, té negro, café y cacao antes de beberlas, todos los productos están sustancialmente libres de cualquier incremento o deterioro de sabores diversos, coloración y olores inducibles por las mismas, lo que significa que son agentes enriquecidos en vitamina P con estabilidad de almacenamiento y termoestabilidad mejoradas.$$$

Ejemplo 15

<Alimentos embellecedores>

Se mezclaron agitando diez partes en masa de cualquiera de las composiciones de glicosil hesperetina en partículas obtenidas en los Ejemplos 1 a 7, tres partes en masa de sacarosa, una parte en masa de maltitol y 15 partes en masa de dextrina, y se colocaron alícuotas de cinco gramos de la mezcla resultante en recipientes de envasado de tipo barra, protegidos contra la luz y a prueba de humedad, para obtener ocho tipos diferentes de alimentos embellecedores particulados de la presente invención.

Dado que los productos tienen una reducción eficaz de los sabores diversos, la coloración y el olor, se pueden ingerir por vía oral a diario sin molestias. Se pueden tomar por vía oral a diario de tal manera que se añaden uno o dos paquetes de cada uno de ellos a diversas bebidas tales como agua, tés, tés negros y cafés, así como otros productos alimenticios.

Ejemplo 16

<Alimentos embellecedores>

Se obtuvieron quince tipos diferentes de alimentos cosméticos líquidos de acuerdo con la presente invención mezclando mediante agitación dos partes en masa de cualquiera de los 15 tipos diferentes de agentes enriquecidos en vitamina P obtenidos en el Ejemplo 14, dos partes en masa de maltosa, 20 partes en masa de agua refinada y una cantidad adecuada de un agente de control del pH; ajustando la mezcla resultante a pH 7,2; sometiendo la mezcla a filtración por membrana; e inyectando asépticamente el producto filtrado en recipientes asépticos para obtener 15 tipos diferentes de alimentos embellecedores líquidos de acuerdo con la presente invención.

Dado que los productos tienen una reducción de sabores diversos, coloración y olor, se pueden ingerir por vía oral sin ninguna molestia. Se pueden tomar por vía oral a diario en una cantidad de 50 a 200 mL/día para mantener la piel en condiciones saludables.

<Ejemplo de Referencia 1>

<Glucosil hesperetina en partículas>

Se obtuvo una glicosil hesperetina en partículas de manera similar al Ejemplo 1, excepto que no se utilizó hiposulfito de sodio como agente reductor utilizado en el método para producir la glicosil hesperetina en partículas del Ejemplo 1, como método para producir una glicosil hesperetina en partículas convencional. La glicosil hesperetina en partículas, obtenida en este ejemplo, contenía 77,0% de a-glucosil hesperidina, 15,5% de hesperidina y 7,5% de otros ingredientes.

El producto tenía un contenido de furfural de 310 ppb, un contenido de 4-VA de 40 ppb, un grado de coloración de 0,24 y una conductividad eléctrica de aproximadamente 11 pS/cm. Asimismo, el producto contenía calcio, potasio, magnesio y sodio en cantidades respectivas de aproximadamente 3 ppm, aproximadamente 0,2 ppm, aproximadamente 0,4 ppm y aproximadamente 1 ppm.

La glicosil hesperetina en partículas así obtenida se disolvió en una cantidad adecuada de agua y se probó, revelando que tenía sabores diversos y coloración característicos de los productos convencionales e incluso tenía un fuerte olor desfavorable.

Por consiguiente, la composición de glicosil hesperetina preparada sin utilizar ninguno de los agentes reductores utilizados en la práctica de la presente invención, fue aparentemente inferior a la composición de glicosil hesperetina según la presente invención en términos de, al menos, sabores diversos, coloración y olor.

Aplicabilidad industrial

La composición de glicosil hesperetina de la presente invención, que tiene una reducción significativa de sabores diversos y una clara reducción de la coloración y del olor en comparación con los productos convencionales, se puede proporcionar de manera estable a escala industrial ya un coste relativamente menor; y por lo tanto se utiliza fácilmente sin dificultad en los campos donde los productos convencionales no se podrían utilizar o serían problemáticos debido a sus característicos sabores diversos junto con o sin coloración, así como olor.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de glicosil hesperetina, que comprende, como glicosil hesperetina, a-glicosil hesperidina y una o ambas de hesperidina y 7-O-p-glucosil hesperetina en una cantidad del 90% o más en masa, pero menos de 100% en masa, en una base sólida seca, en donde el contenido de a-glucosil hesperidina es de 90% en masa o menos, en una base sólida seca, y en la que el contenido de furfural medido en el análisis de GC/MS es inferior a 200 ppb, en una base sólida seca.

2. La composición de glicosil hesperetina de la reivindicación 1, en donde el contenido de 4-metoxiestireno medido en el análisis GC/MS es menos de 30 ppb, en una base sólida seca.

3. La composición de glicosil hesperetina de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el contenido de aglucosil hesperidina es de 60 al 90% en masa, en una base sólida seca.

4. Un método para producir la composición de glicosil hesperetina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una solución acuosa que comprende hesperidina y un producto de la hidrólisis parcial del almidón;

(b) permitir que una glicosiltransferasa actúe sobre la solución acuosa resultante para formar glicosil hesperetina; y

(c) recoger la glicosil hesperetina formada para obtener la composición de glicosil hesperetina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,

donde una o más de las etapas (a) a (c) se llevan a cabo en presencia de un agente reductor inorgánico en una cantidad de 0,001 a 0,5% en masa con respecto a la masa de la solución de reacción enzimática obtenida después de la etapa (b).

5. El método de la reivindicación 4, en donde dicho agente reductor inorgánico es sulfito.