ES2847305T3 - Terapias inmunooncolíticas - Google Patents

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Abstract

Un virus de la vaccinia oncolítico, que comprende un ácido nucleico que codifica para 15- hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH) o un dominio funcional que tiene actividad 15-PGDH, en el que el virus de la vaccinia oncolítico es negativo para timidina cinasa.

Description

DESCRIPCIÓN
Terapias inmunooncolíticas
1. Introducción
La presente invención se refiere a virus de la vaccinia oncolíticos que se han modificado para fomentar la inmunidad antitumoral y/o reducir la respuesta de anticuerpos del huésped contra el virus.
2. Antecedentes de la invención
Los virus oncolíticos (OV) son virus con replicación natural o modificada por ingeniería para ser selectivos para las células tumorales1-3 Se ha examinado una variedad de diferentes estructuras principales virales como OV, incluyendo cepas del virus de la vaccinia (VV).4-11 Al menos tres vectores de la vaccinia oncolíticos independientes han completado la prueba en fase I, incluyendo la cepa vvDD.67 El OV del VV, JX-594412 (Jennerex), ha demostrado recientemente respuestas muy alentadoras en ensayos en fase II para el carcinoma hepatocelular (CHC), incluyendo la administración de tumores sistémicos1314. Además, se han notificado resultados en fase III alentadores para el OV del virus del herpes VHS (T-Vec, Amgen1516) en la terapia del melanoma (el 16 % de respuestas, en comparación con el 2 % en la rama de control). Como tal, el verdadero potencial de los OV en el tratamiento de cáncer ha comenzado a revelarse (más allá del de la cepa de adenovirus ONYX-015 (H-101) original1718 que sigue siendo la única terapia con OV aprobada en cualquier mercado19).
A pesar de esta promesa, las respuestas completas con OV siguen siendo raras. De manera significativa, las cepas de OV de primera y segunda generación se diseñaron principalmente para destruir células tumorales mediante la replicación selectiva que conduce directamente a lisis celular. Además, tanto JX-594 como T-Vec expresan un transgén de citocina (GM-CSF) que se esperaría que estimulara los linfocitos del huésped.12142021 Los estudios preclínicos han demostrado la importancia crítica de la respuesta inmunitaria en la actividad terapéutica del VV oncolítico, (i) siendo los ratones uniformemente resistentes a la reexposición tras una respuesta completa después de la terapia con VV, lo que indica un requisito absoluto para la inducción de inmunidad adaptativa antitumoral22; (ii) demostrando los efectos de la vacuna de VV un mayor beneficio terapéutico que las vacunas de DC equivalentes23; (iii) produciendo la infección por VV del tumor un perfil de citocinas distintivo (la 'constante inmunológica de rechazo'24); (iv) reduciendo la terapia con VV el número de células inmunosupresoras en el tumor (MDSC, T-reg y macrófagos M2)25; (v) pudiendo erradicar la respuesta inmunitaria provocada por la terapia con VV el tumor residual y las metástasis mucho después de que el virus se haya aclarado, lo que proporciona una vigilancia inmunitaria a largo plazo para prevenir la recidiva222526; y (vi) en algunos estudios parece que la replicación viral robusta no es realmente necesaria para el efecto terapéutico2728. Por tanto, los efectos inmunoterápicos de los OV, en particular del VV, son al menos tan importantes como los efectos directamente oncolíticos y que estos vectores probablemente deberían considerarse principalmente como inmunoterapias.
En particular, los vectores clínicos actuales no se diseñaron como agentes inmunoterápicos (más allá de la expresión de citocinas individuales) y esta área ha permanecido relativamente poco explorada. Como tal, existe un enorme potencial no aprovechado para potenciar los vectores oncolíticos mediante la optimización de sus interacciones con el sistema inmunitario del huésped y crear vectores capaces de la vacunación in situ contra antígenos tumorales relevantes. Alternativamente, la mayoría de los enfoques terapéuticos tradicionales de vacunas contra el cáncer han tenido un éxito limitado en la clínica, especialmente contra tumores más grandes, a pesar de evidencias de una inmunización exitosa29'31. Por tanto, también se necesitan nuevos enfoques de vacunas, que idealmente medien la inducción de respuestas contra antígenos relevantes en cada tumor, superen la supresión incluso dentro de tumores grandes y potencien la migración de células T a las dianas tumorales.
3. Sumario de la invención
Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un virus de la vaccinia oncolítico según la reivindicación 1 en el presente documento.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica según la reivindicación 4 en el presente documento.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un virus de la vaccinia oncolítico para su uso en el tratamiento de cáncer según la reivindicación 5 en el presente documento.
La presente descripción se refiere a virus de la vaccinia “inmunooncolíticos” que se han modificado para fomentar la inmunidad antitumoral y/o reducir la respuesta inmunitaria y de anticuerpos del huésped contra el virus. Se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de una inhibición mejorada del crecimiento tumoral por el virus de la vaccinia oncolítico que se ha tratado con un agente que reduce la cantidad de glicosilación y/o tratado con una enzima sialidasa (que se cree que reduce la activación de TLR2 y disminuye la respuesta de anticuerpos del huésped contra el virus); y/o porta modificaciones o deleciones del ácido nucleico genómico viral que codifica para un producto que reduce la inmunidad de las células T (proteína de unión a interleucina-18 viral); y/o porta un ácido nucleico que codifica para un producto que (i) potencia la inducción de linfocitos T citotóxicos (TRIF) y/o (ii) reduce las células supresoras derivadas de mieloides tumorales (MDSC) al reducir la prostaglandina E2. Por consiguiente, la presente descripción proporciona virus de la vaccinia inmunooncolíticos y métodos para usarlos en el tratamiento de cánceres.
4. Breve descripción de las figuras
FIGURA 1A-C. (A) El virus WR.AC12L mostró selectividad tumoral in vivo en relación con el virus parental WR. Los ratones C57BL/6 que portaban tumores CMT-93 se trataron por vía i.v. con 5e8 UFP de virus, y los ratones se sacrificaron en tiempos predeterminados después de la terapia. Las UFP virales se cuantificaron en diferentes tejidos necrópsicos después de la homogeneización. (B) Efectos antitumorales potenciados de WR.AC12L. Los ratones que portaban tumores subcutáneos CMT-93 se trataron por vía i.v. con una única dosis (1e8 UFP) de virus y se siguió la supervivencia (definida como el tiempo hasta que el volumen tumoral alcanzó 1000 mm3 tal como se determina mediante la medición con compás calibrador). (C) Producción de IFN-y (como marcador de la producción de células T efectoras) a partir de esplenocitos recuperados de ratones tratados previamente con el virus indicado y después de la exposición ex vivo a WR.
FIGURA 2A-E. Desglicosilación de la envoltura del virus de la vaccinia. (A) Inmunotransferencia que muestra la desglicosilación de la proteína de la envoltura del virus de la vaccinia. Los virus WR y WR desglicosilado purificados se rompieron y se transfirieron usando un anticuerpo anti-B5R. La disminución del peso de la proteína corresponde a la desglicosilación de la proteína B5R. (B) La desglicosilación de la envoltura del virus no tiene ningún efecto sobre la infectividad por el virus de la vaccinia. Se infectaron diferentes líneas de células tumorales de ratón con TK- o su versión desglicosilada a una MOI de 1, y se midió la expresión de luciferasa viral 3 horas después de la infección mediante obtención de imágenes por bioluminiscencia. Se representan gráficamente los valores medios DE de 3 experimentos independientes. (C) La desglicosilación reduce la activación de TLR2 in vitro. Las células HEK293 que expresan TLR2 de ratón se transfectaron con pNiFty (plásmido indicador de señalización de TLR-). 24 horas después de la transfección, las células se infectaron a una MOI de 1 con WR o WR desglicosilado y se cuantificó la activación de TLR2 24 horas después de la infección mediante obtención de imágenes por bioluminiscencia. Se representan gráficamente las medias DE de 3 experimentos independientes (realizados por cuadriplicado). (D) La fosforilación de STAT3 se agota en los linfocitos esplénicos de ratones inyectados con vaccinia desglicosilada. El porcentaje de linfocitos pSTAT1-pSTAT3+ se determinó mediante citometría de flujo. Se usaron PBS y PAM(3)CSK(4) como controles. Se representan gráficamente los valores de los ratones individuales y las medias ± EEM de los diferentes tratamientos. (E) La desglicosilación de la envoltura de vaccinia aumenta la expresión génica viral de los tumores in vivo. Se aleatorizaron ratones BALB/c que albergaban xenoinjertos subcutáneos de células Renca (adenocarcinoma renal de ratón) y se les inyectó una única dosis intravenosa de 1x108 UFP por ratón de TK-o TK- desglicosilado. La cinética de la expresión génica viral desde el interior del tumor se controló mediante obtención de imágenes por bioluminiscencia de la expresión de luciferasa viral. Se representan gráficamente los valores medios de 12-13 animales DE. *, P<0,05 significativo en comparación con PBS o control. #, P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK- o WR. ,^ P<0,05 significativo en comparación con el grupo PAM(3)CSK(4).
FIGURA 3A-D. La ablación de la activación de TLR2 mediante desglicosilación conduce a efectos terapéuticos aumentados. (A) El tratamiento de la cepa de vaccinia WR con una enzima sialidasa (DS) da como resultado la pérdida de la activación de la ruta de señalización de TLR2 en un modelo in vitro (activación de NF-kB en células HEK293 transfectadas para expresar TLR2). (B) El virus DS WR mostró una administración sistémica significativamente potenciada a los tumores de ratón (tumores subcutáneos 4T1 en ratones BALB/c con el virus administrado por vía intravenosa y la expresión del transgén de luciferasa viral en el tumor determinada 24 h más tarde mediante obtención de imágenes por bioluminiscencia (los tejidos no tumorales N.B. no mostraron diferencia en la captación viral). (C) El efecto antitumoral en el mismo modelo demostró una ventaja terapéutica del virus DS. (D) La pérdida de la activación de TLR2 (en un ratón transgénico con inactivación de TLR2) después de la infección con vaccinia conduce a una inducción significativamente reducida de anticuerpo neutralizante antiviral (anticuerpo neutralizante medido como la capacidad de diferentes diluciones de suero de ratón recogido 14 días después del tratamiento con WR para prevenir la expresión del transgén de luciferasa viral después de mezclar con WR.TK-Luc+ e infección de una capa de células BSC-1).
FIGURA 4A-C. (A) Diagrama esquemático que representa el constructo del virus TK-TRIF y un diagrama esquemático que representa el constructo del virus TK-DAI. (B) Se usaron ensayos ELISA para determinar concentraciones de TRIF en células infectadas con TK- y TK-TRIF. (C) Inmunotransferencia de tipo Western que muestra la expresión de DAI a partir de la referencia TK-DAi.
FIGURA 5A-C. (A) La expresión de TRIF a partir de vaccinia potencia la producción de IFN de tipo I in vitro, incluso más allá de la de la cepa B18R. (B) La expresión de TRIF aumentó la producción de CTL in vivo. (C) Efecto terapéutico potenciado adicional in vivo después de una única administración por vía intravenosa de 1e8 UFP de virus a ratones BALB/c que portaban tumores Renca subcutáneos.
FIGURA 6A-D. El virus de la vaccinia oncolítico que expresa la proteína TRIF de ratón aumentó la activación de las rutas que responden a TLR y la liberación de quimiocinas y citocinas proinflamatorias. (A-B) Activación de las vías de NF-k B (A) e IRF3 (B) después de la infección con TK-TRIF y TK-DAI. Se usaron ensayos ELISA para determinar las concentraciones de pIKKp e IRF3 en extractos citoplásmicos y nucleares, respectivamente, de células 4T1 o MEF infectadas con TK-, TK-TRIF o TK-DAI con una MOI de 1. Los análisis se realizaron 24 horas después de la infección. Los datos se obtuvieron por cuadriplicado a partir de 2 experimentos independientes, y se representan gráficamente como cambio en veces frente a TK- DE. La línea discontinua indica el nivel de activación de TK-. (C) Liberación de citocinas y quimiocinas in vitro después de la infección por TK-TRIF y TK-DAI. Las concentraciones de IL-6, IP-10, TNF -a e IFN-p en el sobrenadante de células Renca, 4T1, MC38 y MEF se evaluaron mediante el ensayo Luminex 24 horas después de la infección con TK-, TK-TRIF o TK-DAI (m O i de 1). Los datos se representan como cambio en veces frente a TK- DE (2 experimentos independientes). La línea discontinua indica concentraciones de TK-. (D) Concentración intratumoral in vivo de citocinas y quimiocinas. Se aleatorizaron ratones BALB/c con xenoinjertos subcutáneos Renca establecidos y se les inyectó una única dosis intravenosa de 1x108 UFP por ratón de TK- o TK-TRIF. Se representa el cambio en veces frente a TK- de 4-5 ratones DE. La línea discontinua indica concentraciones de TK-. *, P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-. #, P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-DAI.
FIGURA 7A-E. Se usaron ensayos ELISA para determinar la concentración de NF-k B (A), HMGB1 (B) y Hsp-70 (C) en células infectadas con TK-, TK-TRIF o TK-DAI con una MOI de 1. Los análisis se realizaron 24 horas después de la infección. Los datos se obtuvieron y se representaron gráficamente como cambio en veces frente a TK- DE. La línea discontinua indica el nivel de activación de TK-. Se analizó el nivel de células T cooperadoras (D) y células T reguladoras (E) en respuesta a la infección con el virus TK- o TK-TRIF.
FIGURA 8A-D. Replicación y actividad antitumoral de TK-TRIF y TK-DAI. (A) Producción viral de TK-TRIF y TK-DAI en células tumorales de ratón. Se infectaron diferentes líneas de células tumorales con una MOI de 1 y se midió la producción de virus mediante ensayo de placa en diferentes puntos de tiempo. La producción viral se evaluó por cuadruplicado para cada línea celular, mediante la realización de dos experimentos independientes. Se representan gráficamente las medias DE. (B) Citotoxicidad comparativa de TK-TRIF y TK-DAI. Las células se infectaron con los virus indicados en dosis que oscilaban entre 75 y 0,00025 UFP/célula. Se muestran los valores de CE50 (MOI requerida para provocar una reducción del 50 % en la viabilidad del cultivo celular) el día 4 después de la infección. Se cuantificaron cuatro réplicas diferentes para cada línea celular y se representa la media de cada MOI. (C-D) Expresión génica viral y eficacia antitumoral in vivo. Se implantaron xenoinjertos Renca o MC38 en ratones BALB/c o C57BL/6, respectivamente, y se inyectaron los ratones con PBS o 1x108 UFP de TK-, TK-TRIF o TK-DAI a través de la vena de la cola. Se midieron la expresión de luciferasa viral en los tumores (C) y los volúmenes tumorales (D) en los puntos de tiempo indicados. n = 12-15 ratones/grupo EE. *, P<0,05 significativo en comparación con el grupo PBS. #, P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-. ,^ P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-DAI.
FIGURA 9A-F. (A) Expresión génica viral de TK-TRIF y TK-DAI en células tumorales de ratón. Se infectaron diferentes líneas de células tumorales con una MOI de 1 y se cuantificó la expresión de luciferasa viral mediante obtención de imágenes por bioluminiscencia en diferentes puntos de tiempo. La expresión de luciferasa se evaluó por cuadruplicado para cada línea celular, realizando dos experimentos independientes. Se representan gráficamente las medias DE. (B) Porcentaje de células apoptóticas después de la infección con TK-TRIF y TK-DAI. Se infectó un panel de líneas de células tumorales de ratón con los virus indicados usando una MOI de 1. A las 48 horas después de la infección, se determinó el porcentaje de células nectróticas y apoptóticas mediante citometría de flujo mediante tinción con PI y anexina V. Se realizaron dos experimentos independientes y se representan gráficamente las medias DE. (C-D) TK-TRIF mejora la eficacia antitumoral de TK-GMCSF en un modelo mamario semiortotópico. Se implantaron células 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria de ratones BALB/c y, una vez que se estableció el tumor, se inyectaron los ratones PBS o 1x108 UFP de TK-, TK-TRIF o TK-GMCSF a través de la vena de la cola. Se midieron la expresión de luciferasa viral desde el interior de los tumores (C) y los volúmenes tumorales (D) en los puntos de tiempo indicados. n = 12-14 ratones/grupo EE. (E-F) TK-TRIF mejora la supervivencia de ratones que portan tumores. Se trataron ratones BALB/c o C57BL/6 que albergaban xenoinjertos Renca (E) o MC38 (F), respectivamente, como en la figura 3d y el punto final se estableció en un volumen tumoral de >750 mm3. Se representan gráficamente las curvas de supervivencia de Kaplan-Meyer. n = 12-15 ratones/grupo. *, P<0,05 significativo en comparación con PBS o control. #, P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-. ,^ P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-GMCSF. o, P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-DAI.
FIGURA 10A-E. (A) Variación del peso corporal después de la administración intravenosa de TK-TRIF desglicosilado. Se inyectaron los ratones BALB/C por vía intravenosa con 1 * 108 UFP por ratón de TK-, TK-TRIF o TK-TRIF desglicosilado. En el grupo de control se usó la administración de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los ratones inyectados con TK- presentaron una reducción de más del 10 % en el peso corporal el día 6 después de la inyección del virus, mientras que los ratones inyectados con TK-TRIF y TK-TRIF desglicosilado presentaron un perfil de peso similar al de los inyectados con PBS. (B) Expresión génica viral in vivo después de la administración de TK-TRIF desglicosilado. Se implantaron tumores Renca en ratones BALB/c y se inyectaron los ratones con PBS o 1x108 ufp de TK-, TK-TRIF o TK-TRIF desglicosilado a través de la vena de la cola. Se midió la expresión de luciferasa viral desde el interior de los tumores en los puntos de tiempo indicados. n = 12-14 ratones/grupo EE. (C-D) Supervivencia de ratones que portaban tumores tratados con TK-TRIF desglicosilado. Se establecieron xenoinjertos (C-D) Renca (C) o MC38 (D) en ratones BALB/C o C57BL/6, respectivamente, y se trataron con una única dosis intravenosa de 1x108 UFP de los virus indicados o PBS. El punto final se estableció en un volumen tumoral >750 mm3 y se representan gráficamente las curvas de supervivencia de Kaplan-Meyer. n = 12­ 15 ratones/grupo. (E) TK-TRIF desglicosilado mejoró la supervivencia en comparación con el tratamiento con TK-GMCSF. Los ratones (BALB/c que albergaban tumores Renca subcutáneos) se trataron mediante una inyección de PBS en la vena de la cola o una única dosis de 1x108 ufp de TK-GMCSF o TK-TRIF desglicosilado (n = 10-12 por grupo). Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meyer se obtuvieron después de establecer un punto final >750 mm3 para el volumen tumoral. *, P<0,05 significativo en comparación con el grupo PBS. #, P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-. ,^ P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-desglicosilado. o, P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-TRIF. ^ , P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-GMCSF.
FIGURA 11A-F. La combinación de desglicosilación de la envoltura y expresión de TRIF de ratón impulsó las respuestas celulares antitumorales y mostró una potente eficacia antitumoral. (A-B) Respuestas inmunitarias celulares al virus de la vaccinia y células tumorales evaluadas mediante ensayo ELISpot de IFN-y. El día 7 después de la administración del virus, se recogieron los bazos de ratones inyectados por vía intravenosa con 1x108 UFP de los virus indicados o PBS (ratones BALB/c que portaban xenoinjertos Renca) y se evaluó la cantidad de CTL que reconocen el virus de la vaccinia (A) o células Renca (B). Se representan los valores de los ratones individuales y las medias ± EEM. (C) Títulos de anticuerpos neutralizantes en suero. Se realizó un ensayo de neutralización para determinar los niveles de anticuerpos anti-vaccinia circulantes para ratones inyectados con 1x108 UFP de TK-, TK-TRIF o TK-TRIF desglicosilado. Los títulos de AcN se determinaron mediante la mayor dilución de suero que dio como resultado al menos un 50 % de inhibición de la infección. Se representan los valores de los ratones individuales y las medias ± EEM. (D-E) Actividad antitumoral in vivo en diferentes modelos. Se trataron xenoinjertos tumorales en BALB/c que portaban Renca (D) o en C57BL/6 que portaban MC38 (E) con una única dosis intravenosa de los virus indicados (1 x 108 UFP/ratón). El crecimiento tumoral se siguió mediante mediciones con compás calibrador. Se representan las medias de 12-15 ratones por grupo EE. (F) TK-TRIF desglicosilado presentó mayor actividad antitumoral que TK-GMCSF. Se inyectaron por vía intravenosa ratones BALB/c que albergaban xenoinjertos Renca con una dosis de 1x108 UFP/ratón de TK-GMCSF o TK-TRIF desglicosilado. Se representa gráficamente el volumen tumoral relativo después de la administración del virus (n = 12-15 ratones/grupo EE). *, P<0,05 significativo en comparación con el grupo PBS. #, P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-. ,^ P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK- desglicosilado. o, P<0,05 significativo en comparación con el grupo TK-TRIF.
FIGURA 12A-C. (A) La cepa de vaccinia WR con tratamiento con DS, deleción de C12L y expresión de mTRIF (denominada UPCI-1812) mostró efectos antitumorales potenciados en ratones BALB/c que portaban tumores 4T1 en relación con las cepas clínicas actuales WR.TK-GM-CSF+ (como modelo de la cepa JX-594). El virus UPCI-1812 también mostró una mayor producción de citocinas inmunoterápicas en el microentorno tumoral, incluyendo (B) interferón gamma y (C) interleucina-12.
FIGURA 13A-C. (A) Se analizó la supervivencia de diversas líneas de células tumorales tras la infección viral con TK-. (B) Expresión génica viral en tumores derivados de ratones BALB/c y C57BL/6 implantados con determinadas líneas de células tumorales, y volumen de tumores obtenidos de BALB/c y C57BL/6 implantados con determinadas líneas de células tumorales e infectados con TK-. (C) Detección de Sp6 fosforilada en células mieloides en tumores derivados de ratones BALB/c y C57BL/6 implantados con determinadas líneas de células tumorales y tratados con TK-.
FIGURA 14A-B. (A) Se trataron ratones que no portaban tumor o que portaban tumores subcutáneos derivados de células LLC o B16 (50-100 mm3) con una única inyección intravenosa de 1x107 UFP de WR.TK-. Los ratones (n = 3 por grupo y tiempo) se sacrificaron en los tiempos indicados y se recuperaron los bazos y el suero. Los esplenocitos se fijaron y permeabilizaron rápidamente (según el protocolo previamente publicado) y luego se tiñeron para Phosflow para detectar la activación de las rutas de señalización. Esto se realizó para células T reguladoras (CD3+CD4+CD8-FoxP3+CD25+), con pSTAT5, pS6 y Ki67 analizados; para células T CD4 (CD3+CD4+CD8-FOXP3-), con pS6, Ki67, CD44 y CD62L analizados; y para células T CD8 (CD3+CD4-CD8+FoxP3-), con pS6, Ki67, CD44 y CD62L analizados. (B) También se examinaron los niveles de anticuerpos neutralizantes antivirales en el suero.
FIGURA 15A-B. (A) Concentración de células T reguladoras y células MDSC en diversos modelos tumorales de ratón infectados con TK-. (B) Concentración de células T reguladoras, células MDSC y células T CD8+ en modelos tumorales de ratón 4T1 y MC38 infectados con TK-.
FIGURA 16A-B. (A) Se muestran estrategias de selección para la detección de MDSC (izquierda) y células T y T-reg (derecha) para esplenocitos o células recuperadas de tumores desagregados. (B) Se muestran los niveles de MDSC y T-reg en el bazo para ratones que portaban diferentes tumores.
FIGURA 17A-C. (A) La cepa de vaccinia TK- muestra una capacidad muy escasa para aumentar la mediana de la supervivencia (en relación con el control de PBS) en modelos tumorales de ratón que muestran altos niveles de MDSC al inicio. Además, la terapia viral con TK- puede reducir los niveles de (B) T-reg en los tumores tratados, pero no tiene ningún impacto en los niveles de (C) MDSC.
FIGURA 18. Análisis de la respuesta inmunitaria en ratones implantados con células tumorales MC38 tras el tratamiento con las cepas inmunogénicas de vaccinia, GM-CSF, WR.TK-GM-CSF, WR.B18R-IFNa , WR.B18R-IFNp+ y WR.B18R-IFNy en comparación con la respuesta inmunitaria provocada por la infección por TK-.
FIGURA 19. Análisis de la respuesta inmunitaria en ratones implantados con células tumorales 4T1 tras el tratamiento con las cepas inmunogénicas de vaccinia, GM-CSF, WR.TK-GMCSF y WR.B18R-IFNP+ en comparación con la respuesta inmunitaria provocada por la infección por TK-.
FIGURA 20. Expresión de COX2 y HPGD tras la expresión de WR-TK-HPGD o tratamiento del inhibidor de Cox 2, celecoxib. Se detectó beta-actina como control de carga. La expresión de PGE2 se determinó en células Renca tras la infección con WR-TK-HPGD o WR TK- o el tratamiento con celecoxib.
FIGURA 21A-D. La expresión de HPGD de vaccinia oncolítica redujo MDSC en el tumor y sensibiliza a los tumores resistentes a la terapia viral. (A) Efecto de la expresión de HPGD sobre los niveles de T-reg y MDSC en el tumor. Los ratones que portaban tumores Renca se trataron con inyección de dosis bajas intratumorales (1x107 UFP) del virus indicado, y los ratones se sacrificaron en los tiempos indicados, se recuperaron los tumores, se desagregaron y se analizaron mediante citometría de flujo como antes. La expresión de HPGD reduce los niveles de MDSC y T-reg (*p<0,05 en comparación con el control). (B) Actividad terapéutica potenciada de WR.TK-.HPGD+. Los ratones que portaban tumores Renca o MC38 subcutáneos se trataron con una única inyección intratumoral de PBS o 1x107 UFP o WR.TK- o WR.TK-HPGD+ y el posterior crecimiento tumoral se siguió mediante medición con compás calibrador (n = 15 por grupo; WR.TK-HPGD+ retrasó significativamente (p<0,05) el crecimiento tumoral desde el día 3 (RENCA) o el día 7 (MC38) en comparación con WR.TK- y dio como resultado 3 respuestas completas para RENCA y 2 para MC38. Ningún ratón de ningún otro grupo mostró una CR). (C) Comparación del crecimiento tumoral y la expresión génica viral para el tratamiento con WR.TK-.HPGD+. Se representa gráficamente el crecimiento tumoral para ratones individuales con tumores Renca y tratados con WR.TK-HPGD+, en comparación con el control de PBS (barra gris) y se dividen en con buena respuesta al tratamiento (línea continua) y con la mejor respuesta al tratamiento (línea discontinua). La señal de bioluminiscencia (expresión génica viral) del tumor en los días 1 y 5 se normalizó con respecto al volumen tumoral y se mostró tanto para los animales con buena respuesta al tratamiento como para los animales con la mejor respuesta al tratamiento. (D) La expresión de HPGD no reduce la expresión génica viral. Se muestra la expresión del gen de luciferasa viral desde el interior del tumor a las 24 h después del tratamiento con WR.TK- o WR.TK-HPGD+.
FIGURA 22. Volumen tumoral en función de los días después del tratamiento con control de PBS (CTL; círculo), Western Reserve VV negativa para timidina cinasa (WR TK-; cuadrado) o Western Reserve VV negativa para timidina cinasa (TK-) que lleva HPGD (WR TK- HPGD, triángulo) (HPGD es el equivalente murino de la proteína 15-PGDH humana).
FIGURA 23A-D. Porcentaje de MDSC en (A) bazo de ratones infectados con WR TK-; (B) bazo de ratones infectados con WR TK- HPGD; (C) tumor de ratones infectados con WR TK-; y (D) tumor de ratones infectados con WR TK- HPGD.
FIGURA 24A-D. La expresión de HPGD potenció la respuesta inmunitaria y altera el tráfico de células inmunitarias al tumor. (A) Perfiles de citocinas y quimiocinas en el tumor después de diferentes tratamientos. Los ratones que portaban tumores RENCA se trataron tal como se indica con 1x107 UFP de diferentes cepas virales IT y se sacrificaron a los 3 días. Los homogeneizados tumorales se procesaron en ensayos Luminex para cuantificar diferentes citocinas y quimiocinas (*p<0,05). (B) La respuesta de CTL antitumorales se aumenta con la expresión de HPGD. Los esplenocitos recogidos de ratones que portaban tumor RENCA 7 días después de los tratamientos indicados se cuantificaron para determinar la respuesta de CTL antitumorales determinada mediante ELISPOT (*p<0,06). (C) Alteraciones sistémicas en los niveles de quimiocinas después de diferentes tratamientos. El suero recogido de ratones que portaban tumor RENCA 3 días después de los tratamientos indicados se cuantificaron para determinar los niveles de quimiocinas mediante ELISA (p<0,05). (D) Las células inmunitarias activadas se seleccionan como diana preferentemente tumores infectados con virus que expresa HPGD. A los ratones se les implantaron tumores RENCA bilaterales y, cuando estos alcanzaron 50-100 mm3, se les inyectó con 1x107 UFP de WR.TK- en un flanco y WR.TK-HPGD+ en el flanco opuesto, después de 24 h se administraron 1x107 células T NK (CIK) activadas y marcadas con Cy5.5 mediante inyección en la vena de la cola. 24 h después, se obtuvieron imágenes de los ratones por bioluminiscencia (expresión génica viral) y fluorescencia (tráfico de células T NK a los tumores) (*p<0,05). Se muestra un ejemplo representativo de obtención de imágenes por fluorescencia.
FIGURA 25. Expresión de COX2 en tumores infectados con WR.TK- en comparación con tumores no tratados. FIGURA 26A-B. (A) Supervivencia de diversas líneas celulares tras la infección con TK-. (B) Producción viral y expresión génica de TK- en diversas líneas de células tumorales.
La figura 27 representa la expresión génica viral de modelos tumorales de ratón MC-38, LLC y AB12 infectados con TK- el día 4 o el día 5 después de la infección.
FIGURA 28. Crecimiento tumoral en función de los días después del tratamiento con PBS o infección con WR.TK TRIF+- desglicosilado (UPCI-1812), HPGD que porta Western Reserve TK-(VV-HPGD) o UPCI-1812 combinado con expresión de HPGD.
FIGURA 29. La producción de EEV potenciada (mutación A34R K151E) conduce a un anticuerpo neutralizante antiviral reducido (14 días después de la administración por vía i.p. de WR o EEV).
FIGURA 30. Dominios TRIF. En la secuencia de aminoácidos de TRIF humano hay tres dominios de unión a TRAF y el dominio RHIM que se une a RIP1.
5. Descripción detallada
Para mayor claridad de la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada se divide en las siguientes subsecciones:
(i) mutaciones de la estructura principal viral;
(ii) modificación de la glicosilación viral;
(iii) modificación que fomenta la respuesta de células T;
(iv) modificación que inhibe la inmunosupresión;
(v) modificación que potencia la diseminación y la actividad del virus;
(vi) virus modificados;
(vii) métodos de tratamiento; y
(viii) kits.
El término “homología”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al grado de homología entre secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos tal como se determina usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, pero sin limitarse a, software tal como BLAST o FASTA.
5.1 Mutaciones de la estructura principal viral
En determinadas descripciones, un VV contiene una o más mutaciones de su genoma que favorecen la replicación del virus en una célula cancerosa y/o la inducción aumentada de una respuesta inmunitaria de linfocitos T citotóxicos (CTL). Una mutación puede ser una inserción, deleción o sustitución de uno o más ácidos nucleicos del virus nativo. En descripciones particulares, la mutación da como resultado la expresión de la proteína de unión a interleucina-18 (“IL-18BP”) funcional disminuida. Como ejemplos, (i) la mutación puede dar como resultado una proteína con una unión más débil a IL-18 que la proteína del v V nativa; (ii) la mutación puede dar como resultado la expresión de una proteína truncada con actividad funcional disminuida o ausente; o (iii) la mutación puede delecionar el gen IL-18BP. En un ejemplo específico, la mutación puede ser una deleción de C12L (por ejemplo, véase Symons et al., 2002, J. Gen. Virol. 83:2833-2844). En determinadas descripciones, la deleción de C12l puede ser una deleción completa o parcial de C12L. Por ejemplo, y no a modo de limitación, una deleción parcial de C12L puede incluir una mutación que dé como resultado la deleción de al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 % o al menos aproximadamente el 40 % o más de la secuencia de aminoácidos de la proteína C12L.
En descripciones adicionales, la estructura principal viral puede contener, independientemente o además de una o más de las mutaciones en (incluyendo la deleción de) el ácido nucleico que codifica para IL-18BP descritas anteriormente, una mutación en el ácido nucleico que codifica para B8R (proteína de unión a IFN gamma; por ejemplo, véase Symons et al., 1995, Cell. 81(4):551-60), B18R (proteína de unión a IFN de tipo I; por ejemplo, véase Colamonici et al., 1995, J. Biol. Chem. 270(27):15974-8), A35R (inhibidor de la presentación del CMH II; por ejemplo, véase Rehm et al., 2010, Virology. 397(1):176-86 y Roper et al., 2006, J. Virol. 80(1):306-13), B15R (proteína de unión a IL-1P; por ejemplo, véase Alcami et al., 1992, Cell. 71(1):153-67), proteínas de unión a quimiocinas (B29R, G3R, H5R), inhibidor de STAT1 (H1L); inhibidores de ARNbc o PKR tales como E3L (por ejemplo, véase Chang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89(11):4825-9) o K3L (por ejemplo, véase Davies et al., 1993, J. Virol. 67(3):1688-92 y Langland et al., 2002, Virology. 299(1):133-41); proteínas similares a Bcl-2 (tales como N1, N2, B14, F1, C6, A46 y K7), o una combinación de las mismas.
5.2 Modificación de la glicosilación viral
En determinadas descripciones, un VV se trata con un agente que modifica la glicosilación. Por ejemplo, a una célula que produce el Vv puede administrársele un inhibidor de glicosilación y/o cultivarse en presencia de un inhibidor de glicosilación, o puede tratarse un VV con un agente que reduce o elimina o modifica la glicosilación. En determinadas descripciones, un VV puede someterse a un tratamiento con ácido para reducir la glicosilación del virus. En determinadas descripciones, el VV de la presente descripción puede producirse en una línea celular que no tiene función de glicosilación, por ejemplo, debido a mutaciones en una o más enzimas de glicosilación.
En determinadas descripciones, el VV tratado con un agente que reduce o elimina o modifica la glicosilación, por ejemplo, un virus desglicosilado, puede tener menos de aproximadamente el 90 %, menos de aproximadamente el 80 %, menos de aproximadamente el 70 %, menos de aproximadamente el 60 %, menos de aproximadamente el 50 %, menos de aproximadamente el 40 %, menos de aproximadamente el 30 %, menos de aproximadamente el 20 % o menos de aproximadamente el 10 % de la glicosilación de un VV que no se trató con un agente que modifica la glicosilación.
En descripciones particulares, un VV de la presente descripción puede tratarse con una enzima sialidasa que reduce o elimina los residuos de ácido siálico de la superficie viral (por ejemplo, envoltura). En algunas descripciones, el VV se trata con una enzima sialidasa antes de la administración a un sujeto. En una descripción específica, la enzima sialidasa es la enzima Sialidase A (Glyko Sialidase A, código WS0042), por ejemplo, como parte del kit de desglicosilación enzimática Glycopro (código de producto: GK80110, Prozyme). En determinadas descripciones, el VV puede tratarse con Sialidase A en combinación con N-glicanasas y O-glicanasas. También pueden usarse otras enzimas que eliminan el ácido siálico o que escinden los residuos de glicosilo del virus según la descripción, incluyendo, pero sin limitarse a, las neuraminidasas, PNGasas (por ejemplo, PNGasa A o PNGasa F), p1-4 galactosidasa, p-N-acetilglucosaminidasa, o el uso de tratamientos químicos tales como la b-eliminación o álcali o hidrazinoílos.
Sin estar vinculado a una teoría en particular, se cree que la reducción de la glicosilación, por ejemplo, mediante el tratamiento con sialidasa del virus de la vaccinia, reduce la activación de TLR2 y, por tanto, retrasa la activación inmunitaria sistémica durante el periodo de administración viral y/o reduce la producción de anticuerpos neutralizantes antivirales.
5.3 Modificaciones que fomentan la respuesta de células T
En determinadas descripciones, un VV se modifica para incluir uno o más ácidos nucleicos que codifican para un péptido o una proteína que fomenta una respuesta de células T. En determinadas descripciones, el péptido o la proteína que fomenta una respuesta de células T puede fomentar la expresión de una o más citocinas proinflamatorias. Por ejemplo, y no a modo de limitación, las citocinas proinflamatorias pueden incluir IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFN-a, IFN-p, IFN-y, CCL5 e IP-10.
Los ejemplos de un péptido o una proteína que fomenta una respuesta de células T incluyen IFN-p que induce el adaptador que contiene el dominio Toll/IL-1R (“TRIF”) o un dominio funcional del mismo. En determinadas descripciones, el ácido nucleico puede codificar para un TRIF humano que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en UniProtKB, n.° Q8IUC6, o una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 90 por ciento, al menos aproximadamente el 95 por ciento o al menos aproximadamente el 98 por ciento homóloga a la misma, o un TRIF murino que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en UniProtKB, n.° Q80UF7, o una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 90 por ciento, al menos aproximadamente el 95 por ciento o al menos aproximadamente el 98 por ciento homóloga a la misma.
En determinadas descripciones, el ácido nucleico puede codificar para uno o más dominios TRIF tal como se muestra en la figura 30. En determinadas descripciones, el ácido nucleico que codifica para un péptido o una proteína que fomenta una respuesta de células T, por ejemplo, TRIF, puede clonarse en el locus del gen de la timidina cinasa (TK) del virus tal como se muestra en la figura 4A. El ácido nucleico que codifica para un péptido o una proteína que fomenta una respuesta de células T puede unirse operativamente a cualquier promotor que pueda dar como resultado la expresión del ácido nucleico. Tal como se usa en el presente documento, “unido operativamente” significa que un promotor está en una orientación y/o ubicación funcional correcta en relación con una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio de la transcripción y/o la expresión de esa secuencia. En determinadas descripciones, el promotor es un promotor de vaccinia y/o un promotor de vaccinia sintético. En determinadas descripciones, el promotor es el promotor de vaccinia sintético pSE/L. En determinadas descripciones, el ácido nucleico que codifica para un péptido o una proteína que fomenta una respuesta de células T está unido operativamente al promotor p7.5 viral.
En otras descripciones, el ácido nucleico puede codificar para el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (“GM-CSF”), IL-12, IFN-y o IL-18. En determinadas descripciones, pueden incorporarse más de uno de tales ácidos nucleicos en el VV.
5.4 Modificaciones que inhiben la inmunosupresión
En determinadas descripciones, un VV se modifica para incluir uno o más ácidos nucleicos que codifican para un péptido o una proteína o un ácido ribonucleico o microARN que inhibe o reduce la inmunosupresión. Los ejemplos de mediciones de inmunosupresión incluyen: el nivel de células supresoras derivadas de mieloides (“MDSC”); el nivel de macrófagos M2; y el nivel de células T cooperadoras frente a células T reguladoras supresoras. En descripciones particulares, el ácido nucleico codifica para un péptido o una proteína o un ácido ribonucleico o microARN que reduce la actividad de prostaglandina E2 (“un antagonista de PGE2”). En descripciones específicas, el ácido nucleico codifica para un péptido y/o una proteína que es un antagonista de PGE2 (tal como se usa ese término en el presente documento) que degrada PGE2. En un ejemplo específico, la proteína que degrada PGE2 es 15-PGDH (humana) o HPGD (ratón). Por ejemplo, y no a modo de limitación, 15-PGDH puede tener una secuencia de aminoácidos tal como se expone en UniProtKB, n.° P15428, o una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 90 por ciento, al menos aproximadamente el 95 por ciento o al menos aproximadamente el 98 por ciento homóloga a la misma, y un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH puede tener una secuencia de ácido nucleico tal como se expone en GenBank, n.° de registro U63296.1, o una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente el 90 por ciento, al menos aproximadamente el 95 por ciento o al menos aproximadamente el 98 por ciento homóloga a la misma. En descripciones adicionales, un ácido nucleico que codifica para una versión secretada y solubilizada del receptor extracelular para PGE2 puede incluirse en el VV, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para EP1, EP2, EP3 y/o Ep4, donde EP3 y 4 tienen mayor afinidad. En determinadas descripciones, el uno o más péptidos o proteínas que inhiben o reducen la inmunosupresión pueden dar como resultado la expresión reducida de una o más quimiocinas supresoras tales como, pero sin limitarse a, CXCL12. En determinadas descripciones, el uno o más péptidos o proteínas que inhiben o reducen la inmunosupresión pueden dar como resultado la expresión aumentada de una o más quimiocinas de activación inmunitaria tales como, pero sin limitarse a, CXCL9, CXCL10 y CCL5.
En determinadas descripciones, el ácido nucleico que codifica para un antagonista de PGE2 puede clonarse en el locus del gen de la timidina cinasa (TK) del virus. El ácido nucleico que codifica para un péptido o una proteína antagonista de PGE2 puede unirse operativamente a cualquier promotor que pueda dar como resultado la expresión del ácido nucleico. En determinadas descripciones, el ácido nucleico que codifica para un péptido o una proteína antagonista de PGE2 está unido operativamente al promotor p7.5 viral. En determinadas descripciones, el promotor es un promotor de vaccinia y/o un promotor de vaccinia sintético. En determinadas descripciones, el promotor es el promotor de vaccinia sintético pSE/L. En determinadas descripciones, el virus puede incluir un ácido nucleico que codifica para un antagonista de PGE2 y un ácido nucleico que codifica para un péptido o una proteína que fomenta una respuesta de células T que están ambos unidos operativamente a un promotor, por ejemplo, el promotor p7.5 viral, y clonados en el locus del gen de la timidina cinasa (TK) del virus.
En descripciones adicionales, un virus inmunooncolítico de la descripción puede administrarse junto con un agente que inhibe o reduce MDSC, incluyendo, por ejemplo, pero no a modo de limitación, un anticuerpo que selecciona como diana un marcador de superficie de MDSC tal como un anticuerpo anti-CD33 o una región variable del mismo; un anticuerpo anti-CD11b o una región variable del mismo; un inhibidor de COX2, por ejemplo, celecoxib; sunitinib y/o ácido todo trans-retinoico (por ejemplo, véase Najjar y Finke, 2013, Frontiers in Oncology, 3(49) 1-9).
5.5 Modificaciones que potencian la diseminación y la actividad del virus
En determinadas descripciones, un VV se modifica para potenciar la diseminación y/o la actividad del virus. En descripciones particulares, un VV se modifica para aumentar la cantidad de la forma envuelta extracelular del virus que se produce, por ejemplo, mediante la introducción de una o más de las siguientes mutaciones: A34R Lys151 por Glu; deleción completa o parcial de B5R; mutación/deleción de A36R y/o mutación/deleción de A56R. En determinadas descripciones, un VV se modifica para incluir una deleción completa o parcial de B5R.
5.6 Virus modificados
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV inmunooncolítico que comprende una o más, o dos o más, o tres o más, o cuatro o más, de las siguientes modificaciones, tal como se describió en las secciones anteriores:
(i) una mutación de la estructura principal viral;
(ii) una modificación de la glicosilación viral;
(iii) una modificación que fomenta la respuesta de células T;
(iv) una modificación que inhibe la inmunosupresión; y/o
(v) una modificación que potencia la diseminación y la actividad del virus.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que comprende una modificación de la glicosilación viral y una o más de las siguientes modificaciones, tal como se describió en las secciones anteriores:
(i) una mutación de la estructura principal viral;
(ii) una modificación que fomenta la respuesta de células T;
(iii) una modificación que inhibe la inmunosupresión; y/o
(iv) una modificación que potencia la diseminación y la actividad del virus.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped y comprende o porta o contiene una o más de las siguientes modificaciones, tal como se describió en las secciones anteriores:
(i) una mutación de la estructura principal viral;
(ii) una modificación que fomenta la respuesta de células T;
(iii) una modificación que inhibe la inmunosupresión; y/o
(iv) una modificación que potencia la diseminación y la actividad del virus.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación) en relación con el virus no modificado y comprende o porta o contiene una o más de las siguientes modificaciones, tal como se describió en las secciones anteriores:
(i) una mutación de la estructura principal viral;
(ii) una modificación que fomenta la respuesta de células T;
(iii) una modificación que inhibe la inmunosupresión; y/o
(iv) una modificación que potencia la diseminación y la actividad del virus.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación antes de la administración a un huésped o que de otro modo tiene glicosilación reducida en relación con el virus no modificado.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con sialidasa antes de la administración a un huésped o que de otro modo tiene residuos de ácido siálico reducidos en relación con el virus no modificado.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que comprende o porta o contiene un ácido nucleico que codifica para TRIF.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que comprende o porta o contiene un ácido nucleico que codifica para un antagonista de PGE2 (por ejemplo, 15-PGDH o HPGD).
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que comprende una o más modificaciones que potencian la diseminación y la actividad del virus seleccionadas del grupo de una mutación A34R Lys151 por Glu; deleción completa o parcial de B5R; mutación/deleción de A36R y/o mutación/deleción de A56R.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que comprende una o más modificaciones de la estructura principal del virus seleccionadas del grupo de una mutación que reduce la expresión de IL-18BP funcional (por ejemplo, deleción de C12L), deleción de B8R, deleción de B18R, deleción de A35R o una combinación de las mismas.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida en relación con el virus no modificado y comprende o porta o contiene además un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado y comprende o porta o contiene además un ácido nucleico que codifica para un antagonista de PGE2 (por ejemplo, 15-PGDH o HPGD).
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado y comprende o porta o contiene además un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo y/o un ácido nucleico que codifica para un antagonista de PGE2 (por ejemplo, 15-PGDH o HPGD),
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado y comprende además una o más modificaciones que potencian la diseminación y la actividad del virus seleccionadas del grupo de una mutación A34R Lys151 por Glu; deleción completa o parcial de B5R; mutación/deleción de A36R y/o mutación/deleción de A56R. En determinadas descripciones, la presente descripción proporciona un VV desglicosilado que comprende una deleción completa o parcial de B5R.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado y comprende además una o más modificaciones de la estructura principal del virus seleccionadas del grupo de una mutación que reduce la expresión de IL-18BP funcional (por ejemplo, deleción de C12L), deleción de B8R, deleción de B18r , deleción de A35R o una combinación de las mismas. En determinadas descripciones, la presente descripción proporciona un VV desglicosilado que comprende una deleción de C12L.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado y comprende además una o más modificaciones de la cadena principal del virus seleccionadas del grupo de una mutación que reduce la expresión de IL-18BP funcional (por ejemplo, deleción de C12L), deleción de B8R, deleción de B18r , deleción de A35R o una combinación de las mismas, y comprende además una o más modificaciones que potencian la diseminación y la actividad del virus seleccionadas del grupo de una mutación A34R Lys151 por Glu; deleción completa o parcial de B5R; mutación/deleción de A36R y/o mutación/deleción de A56R. En determinadas descripciones, la presente descripción proporciona un VV desglicosilado que comprende una deleción de C12L y una deleción de B5R.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado y comprende o porta o contiene además un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo, y comprende además una o más modificaciones de la estructura del virus seleccionadas del grupo de una mutación que reduce la expresión de IL-18BP funcional (por ejemplo, deleción de C12L), deleción de B8R, deleción de B18R, deleción de A35R o una combinación de las mismas. En determinadas descripciones, el virus comprende la deleción de C12L. En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado y comprende o porta o contiene además un ácido nucleico que codifica para un antagonista de PGE2 (por ejemplo, 15-PGDH o HPGD), y comprende además una o más modificaciones de la estructura principal del virus seleccionadas del grupo de una mutación que reduce la expresión de IL-18BP funcional (por ejemplo, deleción de C12L), deleción de B8R, deleción de B18R, deleción de A35R o una combinación de las mismas.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV TK- que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado y comprende o porta o contiene además un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo y un ácido nucleico que codifica para un antagonista de PGE2 (por ejemplo, 15-PGDH o HPGD), y comprende además una o más modificaciones de la estructura del virus seleccionadas del grupo de una mutación que reduce la expresión de IL-18BP funcional (por ejemplo, deleción de C12L), deleción de B8R, deleción de B18R, deleción de a 35R o una combinación de las mismas.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado y comprende o porta o contiene además un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo, y comprende además una o más modificaciones que potencian la diseminación y la actividad del virus seleccionadas del grupo de una mutación A34R Lys151 por Glu; deleción completa o parcial de B5R; mutación/deleción de A36R y/o mutación/deleción de A56R.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado y comprende o porta o contiene además un ácido nucleico que codifica para un antagonista de PGE2 (por ejemplo, 15-PGDH o HPGD), y comprende además una o más modificaciones que potencian la diseminación y la actividad del virus seleccionadas del grupo de una mutación A34R Lys151 por Glu; deleción completa o parcial de B5R; mutación/deleción de a 36R y/o mutación/deleción de A56R.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado y comprende o porta o contiene además un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo y un ácido nucleico que codifica para un antagonista de PGE2 (por ejemplo, 15-PGDH o HPGD), y comprende además una o más modificaciones que potencian la diseminación y la actividad del virus seleccionadas del grupo de una mutación A34R Lys151 por Glu; deleción completa o parcial de B5R; mutación/deleción de A36R y/o mutación/deleción de A56R.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV que se trata con un agente que reduce la cantidad de glicosilación (por ejemplo, sialilación) antes de la administración a un huésped o que de otra manera tiene glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado y comprende o porta o contiene además un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo y un ácido nucleico que codifica para un antagonista de PGE2 (por ejemplo, 15-PGDH o HPGD), y comprende además una o más modificaciones que potencian la diseminación y la actividad del virus seleccionadas del grupo de una mutación A34R Lys151 por Glu; deleción completa o parcial de B5R; mutación/deleción de A36R y/o mutación/deleción de A56R y comprende una o más modificaciones de la estructura del virus seleccionadas del grupo de una mutación que reduce la expresión de IL-18BP funcional (por ejemplo, deleción de C12L), deleción de B8R, deleción de B18R, deleción de A35R o una combinación de las mismas. En determinadas descripciones, el virus comprende la deleción de C12L. En determinadas descripciones, el VV puede comprender la deleción de C12L y la deleción de B5R.
Las modificaciones descritas anteriormente pueden producirse en un VV (virus de la vaccinia) que se conoce en la técnica. Los ejemplos incluyen; cepa Western Reserve, cepa Copenhagen; cepa Wyeth (NYCBOH); cepa Tian Tian; o cepa USSR (y véanse las referencias 1 y 2, a continuación). La cepa base de v V modificada tal como se expone en el presente documento puede comprender por sí misma una o más mutaciones en relación con su cepa parental, por ejemplo, pero sin limitarse a, una o más de las siguientes: deleción en TK (es decir, indicado en el presente documento como “TK-”); deleción en VGF; deleción de SPI-1; y/o deleción de SPI-2.
En determinadas descripciones, la presente descripción proporciona un VV con las siguientes modificaciones:
(i) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado;
(ii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; y/o
(iii) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV con las siguientes modificaciones:
(i) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado;
(ii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo;
(iii) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo; y/o
(iv) una deleción de C12L.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV con las siguientes modificaciones:
(i) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado;
(ii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo;
(iii) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo;
(iv) una deleción de C12L; y/o
(v) una deleción de B5R.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV con las siguientes modificaciones:
(i) una deleción de TK;
(ii) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado;
(iii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; y/o
(iv) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV con las siguientes modificaciones:
(i) una deleción de TK;
(ii) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado;
(iii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo;
(iv) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo; y/o
(v) una deleción de C12L.
En algunas descripciones, la presente descripción proporciona un VV con las siguientes modificaciones:
(i) una deleción de TK;
(ii) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado;
(iii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo;
(iv) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo;
(v) una deleción de C12L; y/o
(vi) una deleción de B5R.
5.7 Métodos de tratamiento
La presente descripción proporciona un método para reducir el crecimiento de una célula cancerosa, que comprende administrar, a la célula cancerosa de un sujeto, una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico, tal como se describió anteriormente. La reducción del crecimiento de una célula cancerosa puede manifestarse, por ejemplo, mediante la muerte celular o una tasa de replicación más lenta o tasa de crecimiento reducida de un tumor que comprende la célula o una supervivencia prolongada de un sujeto que contiene la célula cancerosa.
Un “sujeto” o “paciente”, tal como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a un sujeto humano o no humano. Los ejemplos de sujetos no humanos incluyen primates no humanos, perros, gatos, ratones, ratas, cobayas, conejos, cerdos, aves, caballos, vacas, cabras, ovejas, etc.
La presente descripción proporciona un método para reducir el crecimiento de un tumor, que comprende administrar, al tumor, una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico, tal como se describió anteriormente. La reducción del crecimiento de un tumor puede manifestarse, por ejemplo, mediante una tasa de crecimiento reducida o una supervivencia prolongada de un sujeto que contiene el tumor.
La presente descripción proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene un cáncer, que comprende administrar, al sujeto, una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico, tal como se describió anteriormente.
Una “cantidad eficaz” en un método de este tipo incluye una cantidad que reduce la tasa de crecimiento o la diseminación del cáncer o que prolonga la supervivencia del sujeto. En determinadas descripciones, una cantidad eficaz puede incluir una cantidad que es suficiente para producir un efecto anticancerígeno en un sujeto.
Un “efecto anticancerígeno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una o más de una reducción de la masa de células cancerosas agregada, una reducción de la tasa de crecimiento de células cancerosas, una reducción de la proliferación de células cancerosas, una reducción de la masa tumoral, una reducción del volumen tumoral, una reducción de la proliferación de células tumorales, una reducción de la tasa de crecimiento tumoral y/o una reducción de la metástasis tumoral.
En determinadas descripciones, la presente descripción proporciona un método para producir un efecto anticancerígeno en un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar, al sujeto, una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico, tal como se describió anteriormente.
En descripciones específicas, la cantidad de VV administrada (por ejemplo, dosis) puede estar entre aproximadamente 103 y 1011 unidades formadoras de placas (UFP), o entre aproximadamente 105 y 1010 UFP, o entre aproximadamente 105 y 108 UFP, o entre aproximadamente 105 y 1011 UFP, o entre aproximadamente 108 y 1011 UFP. Véase también Thorne y Kirn, 2009, Nat Rev Cancer 9: 64-71. Obsérvese que en el presente documento, 10X se expresa alternativamente como 1eX. En determinadas descripciones, el virus oncolítico puede administrarse en una sola dosis o puede administrarse en múltiples dosis. En determinadas descripciones en las que el virus se administra en múltiples dosis, las dosis pueden administrarse secuencialmente, por ejemplo, a intervalos diarios, semanales o mensuales, o en respuesta a una necesidad específica del sujeto.
En determinadas descripciones, el virus inmunooncolítico puede administrarse en una composición farmacéutica, en la que el virus está presente en una cantidad eficaz y se combina con un portador farmacéuticamente aceptable. “Farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, incluye cualquier portador que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica de los principios activos y/o que no sea tóxico para el paciente al que se administra. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes y disoluciones estériles. Los ejemplos adicionales de portadores farmacéuticamente compatibles pueden incluir geles, materiales de matriz bioadsorbibles, elementos de implantación que contienen el v V oncolítico o cualquier otro vehículo, medio o material de administración o dispensación adecuado. Tales portadores pueden formularse mediante métodos convencionales y pueden administrarse al sujeto en una cantidad eficaz.
Los VV de la presente descripción pueden producirse mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. En determinadas descripciones, el VV puede propagarse en células huésped adecuadas, aislarse de las células huésped y almacenarse en condiciones que fomenten la estabilidad e integridad del virus, de manera que se minimice la pérdida de infectividad con el tiempo. Por ejemplo, el VV puede almacenarse mediante congelación o secado, tal como mediante liofilización. En determinadas descripciones, antes de la administración, el VV almacenado puede reconstituirse (si se seca para su almacenamiento) y diluirse en un portador farmacéuticamente aceptable para su administración.
El virus oncolítico puede administrarse al sujeto usando métodos de administración convencionales. En determinadas descripciones, el virus oncolítico puede administrarse por vía sistémica. Alternativa o adicionalmente, el virus oncolítico puede administrarse mediante inyección en el sitio del cáncer, por ejemplo, sitio del tumor. Por ejemplo, y no a modo de limitación, la vía de administración puede ser inhalación, intranasal, intravenosa, intraarterial, intratecal, intratumoral, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, tópica, intradérmica, regional local, administración oral o combinaciones de las mismas. En determinadas descripciones, el virus oncolítico puede administrarse al paciente a partir de una fuente implantada en el paciente. En determinadas descripciones, la administración del virus oncolítico puede producirse mediante infusión continua durante un periodo de tiempo seleccionado. En determinadas descripciones, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse directamente al sitio del tumor, por ejemplo, mediante inyección intratumoral directa.
Los cánceres que pueden tratarse mediante terapia con VV inmunooncolítico incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinoma, osteosarcoma, carcinoma de cuello uterino, melanoma, carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovario, leucemia, linfoma, carcinoma renal, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, carcinoma de colon, cáncer de duodeno, glioblastoma multiforme, astrocitoma y sarcoma.
En determinadas descripciones, el tratamiento que usa un VV inmunooncolítico, tal como se describió anteriormente, puede usarse solo o en combinación con uno o más antineoplásicos. Un “antineoplásico”, tal como se usa en el presente documento, puede ser cualquier molécula, compuesto, sustancia química o composición que tenga un efecto anticancerígeno. Los antineoplásicos incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterápicos, agentes radioterápicos, citocinas, inhibidores de puntos de control inmunitarios, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis, anticuerpos anticancerígenos y/o agentes anti-cinasas dependientes de ciclinas.
En determinadas descripciones, el tratamiento que usa un VV inmunooncolítico puede usarse solo o en combinación con uno o agentes inmunomoduladores. Un agente inmunomodulador puede incluir cualquier compuesto, molécula o sustancia que puede suprimir la inmunidad antiviral asociada con un tumor o cáncer. En determinadas descripciones, el agente inmunomodulador puede suprimir la inmunidad innata y/o la inmunidad adaptativa al virus oncolítico. Los ejemplos de agentes inmunomoduladores incluyen un anticuerpo anti-CD33 o una región variable del mismo, un anticuerpo anti-CD11b o una región variable del mismo, un inhibidor de COX2, por ejemplo, celecoxib, citocinas tales como IL-12, GM-CSF, IL-2, IFNp e IFNy, y quimiocinas tales como MIP-1, MCP-1 e IL-8. En determinadas descripciones, el agente inmunomodulador incluye inhibidores de puntos de control inmunitarios tales como, entre otros, anticuerpos anti-CTLA4, anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PDL1 y agonistas de TLR (por ejemplo, poli I:C).
“En combinación con”, tal como se usa en el presente documento, significa que el VV inmunooncolítico y el uno o más agentes se administran a un sujeto como parte de un régimen o plan de tratamiento. En determinadas descripciones, el uso combinado no requiere que el VV inmunooncolítico y el uno o más agentes se combinen físicamente antes de la administración o que se administren durante el mismo periodo de tiempo. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el VV inmunooncolítico y el uno o más agentes pueden administrarse simultáneamente al sujeto que está tratándose, o pueden administrarse al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden o en diferentes momentos.
En determinadas descripciones, un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer incluye administrar, al sujeto, una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico que comprende: (i) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado; (ii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; y (iii) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo.
En determinadas descripciones, un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer incluye administrar, al sujeto, una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico que comprende: (i) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado; (ii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; (iii) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo; y (iv) una deleción de C12L.
En determinadas descripciones, un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer incluye administrar, al sujeto, una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico que comprende: (i) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado; (ii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; (iii) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo; (iv) una deleción de C12L; y (v) una deleción de B5R.
En determinadas descripciones, un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer incluye administrar, al sujeto, una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico que comprende: (i) una deleción de TK; (ii) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado; (iii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; y (iv) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo.
En determinadas descripciones, un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer incluye administrar, al sujeto, una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico que comprende: (i) una deleción de t K; (ii) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado; (iii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; (iv) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo; y (v) una deleción de C12L.
En determinadas descripciones, un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer incluye administrar, al sujeto, una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico que comprende: (i) una deleción de t K; (ii) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado; (iii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; (iv) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo; (v) una deleción de C12L; y (vi) una deleción de B5R.
En determinadas descripciones, los métodos de la presente descripción pueden incluir además administrar, al sujeto, una cantidad eficaz de uno o más agentes. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el agente puede ser un antineoplásico y/o un agente inmunomodulador, tal como se describió anteriormente.
5.8 Kits
La presente descripción proporciona además kits que proporcionan un VV inmunooncolítico tal como se describió anteriormente. En determinadas descripciones, un kit de la presente descripción puede incluir un VV inmunooncolítico o una composición farmacéutica que comprende un VV inmunooncolítico tal como se describió anteriormente. En determinadas descripciones, un kit de la presente descripción puede incluir además uno o más componentes, tales como instrucciones de uso, dispositivos y reactivos adicionales, y componentes tales como tubos, recipientes y jeringas, para realizar los métodos dados a conocer anteriormente. En determinadas descripciones, un kit de la presente descripción puede incluir además uno o más agentes, por ejemplo, antineoplásicos y/o agentes inmunomoduladores, que pueden administrarse en combinación con un VV inmunooncolítico.
En determinadas descripciones, un kit de la presente descripción puede incluir instrucciones de uso, un dispositivo para administrar el VV inmunooncolítico a un sujeto, o un dispositivo para administrar un agente o compuesto adicional a un sujeto. Por ejemplo, y no a modo de limitación, las instrucciones pueden incluir una descripción del VV inmunooncolítico y, opcionalmente, otros componentes incluidos en el kit, y métodos de administración, incluyendo métodos para determinar el estado adecuado del sujeto, la cantidad de dosificación adecuada y el método de administración adecuado para administrar el VV inmunooncolítico. Las instrucciones también pueden incluir una guía para monitorizar al sujeto durante la duración del tratamiento.
En determinadas descripciones, un kit de la presente descripción puede incluir un dispositivo para administrar el VV inmunooncolítico a un sujeto. Cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos en la técnica para administrar medicamentos y composiciones farmacéuticas puede incluirse en los kits proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, y no a modo de limitación, tales dispositivos incluyen una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, un dispositivo de inyección sin aguja, un inhalador y un dispensador de líquido tal como un cuentagotas. En determinadas descripciones, un VV inmunooncolítico que va a administrarse por vía sistémica, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, puede incluirse en un kit con una aguja hipodérmica y una jeringa.
En determinadas descripciones, un kit de la presente descripción incluye una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico que comprende: (i) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado; (ii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; y (iii) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo.
En determinadas descripciones, un kit de la presente descripción incluye una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico que comprende: (i) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado; (ii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; (iii) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo; y (iv) una deleción de C12L. En determinadas descripciones, un kit de la presente descripción incluye una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico que comprende: (i) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con el virus no modificado; (ii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; (iii) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo; (iv) una deleción de C12L; y (v) una deleción de B5R.
En determinadas descripciones, un kit de la presente descripción incluye una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico que comprende: (i) una deleción de TK; (ii) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado; (iii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; y (iv) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo. En determinadas descripciones, un kit de la presente descripción incluye una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico que comprende: (i) una deleción de TK; (ii) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado; (iii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; (iv) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo; y (v) una deleción de C12L.
En determinadas descripciones, un kit de la presente descripción incluye una cantidad eficaz de un VV inmunooncolítico que comprende: (i) una deleción de TK; (ii) una envoltura con glicosilación reducida (por ejemplo, sialilación reducida) en relación con un virus no modificado; (iii) un ácido nucleico que codifica para TRIF o un dominio funcional del mismo; (iv) un ácido nucleico que codifica para 15-PGDH o un dominio funcional del mismo; (v) una deleción de C12L; y (vi) una deleción de B5R.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la divulgación, pero no deben interpretarse como limitativos del alcance de la misma.
6. Ejemplo 1: efecto de la mutación de C12L de la estructura principal
Se modificó el virus de la vaccinia (VV) negativo para timidina cinasa (“TK-”) Western Reserve para delecionar C12L. La cepa de vaccinia Western Reserve se obtuvo de BEI Resources (Manassas, VA), y todos los virus de la vaccinia recombinantes usados o construidos se basaron en esta cepa.
Se construyó un mutante de deleción de virus que carecía del 40 % de la ORF de C12L usando selección dominante transitoria (Falkner y Moss, 1990, J Virol. 64(6):3108-3111). Las células se infectaron con vaccinia WR silvestre y se transfectaron simultáneamente con un plásmido que contenía las regiones 3' y 5' del gen C12L. Se permitió que se produjera la recombinación y se usó un marcador seleccionable para determinar los acontecimientos de recombinación. Los virus se titularon mediante ensayo de placa en células BSC-1, se fabricaron y purificaron tal como se describió anteriormente para su uso in vivo (Sampath, P et al. (2013) Mol. Ther., 21: 620-628).
Se administraron 5 x 108 unidades formadoras de placas (“UFP”) de o bien virus WR no modificado o bien virus que llevaban la deleción de C12L (WRAC12L) a ratones C57BL/6 que portaban un tumor CMT-93. Para someter a prueba la especificidad tumoral del virus, se evaluó la cantidad de virus en el cerebro, hígado, pulmón y tumor a los 1, 3 y 10 días después de la infección. Los resultados, en la figura 1A, muestran que aunque se encontraron cantidades aproximadamente equivalentes de virus WR y WRAC12L en el hígado, pulmón y tumor 1 día después de la infección, a los diez días se encontró muy poco virus WRAC12L en tejido no tumoral en relación con la cantidad encontrada en el tumor, siendo el diferencial en la expresión tumoral/no tumoral mucho menor para el virus WR no modificado.
Para evaluar el efecto de la mutación de C12L sobre la supervivencia, se trataron por vía intravenosa ratones C57BL/6 (adquiridos de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) que portaban tumores CMT-93 subcutáneos con una única dosis de 1x108 de UFP de virus WR o WRAC12L, y luego se monitorizaron. Aunque todos los ratones que recibieron el virus WR habían muerto antes de los 60 días posteriores a la infección, después de 70 días el 50 por ciento de los animales WRAC12L seguían vivos (figura 1B).
Los animales se inmunizaron en primer lugar con WR o WRAC12L, y las células T de estos ratones (o ratones de control) se mezclaron con WR y se determinaron los niveles de producción de IFN-y resultantes mediante ELISA. Los resultados se muestran en la figura 1C e indican que la deleción de C12L dio como resultado una mayor producción de esplenocitos productores de CTL o IFN-y.
7. Ejemplo 2. Efecto del tratamiento de desglicosilación
Para someter a prueba el efecto de la modificación de la glicosilación de proteínas de la superficie viral, WR TK- VV, se eliminaron glicanos ligados a N y ligados a O simples, por ejemplo, ácido siálico, de la envoltura viral usando Sialidase A (Glyko Sialidase A, código WS0042) o un cóctel de N-glicanasas y O-glicanasas y Sialidase A (kit de desglicosilación enzimática Glycopro, código de producto: GK80110, Prozyme). El protocolo no desnaturalizante para la desglicosilación de un virus era tomar (i) 20 |il de reserva de virus; (ii) añadir 17 |il de agua desionizada; (iii) añadir 10 ul de tampón de reacción 5X; (iv) añadir 1 ul de cada uno de N-glicanasa, Sialidase A y O-glicanasa (o cualquier enzima usada sola con 19 ul de agua desionizada); y (v) incubar a 37 °C durante 16 horas antes de su uso. La desglicosilación del virus se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western (figura 2A).
Se evaluó el efecto de la desglicosilación sobre la infectividad del virus en diferentes líneas de células tumorales de ratón infectadas con TK-(“WR” o “WR.TK-”) o su versión desglicosilada (“TK-deglyc”, “WR deglyc” y “DS WR.TK-”) a una MOI de 1. Se obtuvieron las líneas celulares HeLa (adenocarcinoma de cuello uterino humano), Bsc-1 (células de riñón normales de mono verde), 143B (osteosarcoma humano), CV-1 (fibroblastos de riñón de mono verde), Renca (adenocarcinoma renal murino) y 4T1 (cáncer de mama murino) de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA). Las células HEK293-mTLR2 se adquirieron de InvivoGen (San Diego, CA). Las líneas MC38 (adenocarcinoma de colon murino) y MEF (fibroblastos embrionarios murinos) fueron, respectivamente, un amable obsequio del Dr. David Bartlett y el Dr. Robert Sobol (Centro de Cáncer de la Universidad de Pittsburgh). Todas las líneas celulares se mantuvieron en los medios de cultivo recomendados que contenían suero bovino fetal al 5-10 % y antibióticos a 37 °C, el 5 % de CO2. La infectividad viral se determinó analizando la expresión génica viral. La expresión génica viral se midió 3 horas después de la infección mediante obtención de imágenes por bioluminiscencia de la expresión de luciferasa in vitro. Para las células cultivadas, se añadieron 10 |il de D-luciferina 30 mg/ml (GoldBio, St Louis, MO) a 1 ml de medio de cultivo. Tal como se observa en la figura 2B, la desglicosilación de la envoltura del virus no tuvo ningún efecto sobre la infectividad del virus.
El efecto de la desglicosilación sobre la activación de TLR2 se evaluó en un sistema de modelo que mide la activación de NF-k B en células HEK293 modificadas por ingeniería para expresar TLR2 (HEK293/mTLR2) y transfectadas con pNiFty, un plásmido indicador de señalización de TLR. Se obtuvo pNiFty (plásmido indicador de señalización de TLR-luciferasa) de InvivoGen y se transfectó en células HEK293/mTLR2 usando el reactivo de transfección FuGENE HD (Promega, Madison, Wl). Se infectaron células HEK293/mTLR2 a una MOI de 1 con virus WR o WR desglicosilado y se cuantificó la activación de TLR224 horas después de la infección mediante obtención de imágenes por bioluminiscencia. Tal como se muestra en la figura 2C, la desglicosilación del virus dio como resultado una menor activación de TLR2 in vitro en comparación con el virus que no estaba desglicosilado. Además, y tal como puede observarse en la figura 3A, el virus desglicosilado se asoció con una activación de TLR2 sustancialmente menor que el virus WR.
El virus desglicosilado también mostró una mayor captación por parte de los tumores. Para estos experimentos, el gen de luciferasa bajo el control del promotor de vaccinia sintético pE/L (Chakrabarti et al. (1997). Biotechniques 23: 1094-1097) se incorporó en el virus de la vaccinia WR.TK- o DS w R.TK-(“WR.TK-Luc+” y “DS WR.t K-Luc+”, respectivamente), y se introdujo por vía intravenosa en ratones BALB/c (adquiridos de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)) que portaban tumor subcutáneo 4T1. La expresión génica viral en el tumor pudo medirse entonces mediante obtención de imágenes por bioluminiscencia de la expresión de luciferasa in vivo. Para los modelos animales, se inyectó una dosis de 4,5 mg de D-luciferina por vía intraperitoneal por ratón antes de la obtención de imágenes. Se usó un modelo IVIS 2000 (PerkinElmer, Waltham, MA) para la obtención de imágenes y las imágenes se analizaron con el software LivingImage (PerkinElmer).
La figura 3B muestra que, 24 horas después de la infección, hubo una expresión significativamente mayor del virus DS WR.TK-Luc+ en el tumor en relación con su homólogo glicosilado. Esta diferencia en la captación no se observó en tejidos no tumorales. La figura 3C muestra que la infección por virus desglicosilado da como resultado un volumen tumoral más pequeño. Además, se aleatorizaron ratones BALB/c que albergaban xenoinjertos subcutáneos de células Renca (adenocarcinoma renal de ratón) y se les inyectó una única dosis intravenosa de 1x108 UFP por ratón de virus TK- o TK- desglicosilado. La cinética de la expresión génica viral desde el interior del tumor se controló mediante obtención de imágenes por bioluminiscencia de la expresión de luciferasa viral. Tal como se muestra en la figura 2E, la desglicosilación de la envoltura viral aumentó la expresión génica en tumores in vivo.
Se analizó el efecto de la desglicosilación del virus sobre la presencia de linfocitos pSTAT1-pSTAT3+ en ratones C57BL/6 inyectados por vía intravenosa con 1x107 UFP del virus WR o WR desglicosilado. Se recogieron los bazos de los ratones C57BL/6 1 hora después de la inyección de los virus indicados y se aislaron los esplenocitos, se fijaron en PFA al 1,6 % y se permeabilizaron con metanol. Se realizaron análisis de inmunotinción intracelular de dos colores usando un citómetro de flujo LSRFortessa (BD Biosciences, San José, California). Los esplenocitos se tiñeron usando anticuerpos anti-pSTAT1 de ratón PacificBlue y anti-pSTAT3 de ratón AlexaFluor647 (BD Biosciences). El porcentaje de linfocitos pSTAT1-pSTAT3+ se determinó mediante citometría de flujo, y se usaron PBS y PAM(3)CSK(4) como controles. La figura 2D muestra que la fosforilación de STAT3 se agotó en los linfocitos esplénicos de ratones inyectados con virus de la vaccinia desglicosilado.
Para determinar la respuesta inmunitaria contra el virus in vivo, se realizaron ensayos de anticuerpos neutralizantes. En resumen, se obtuvo suero que contenía anticuerpos de ratones tratados tal como se indica el día 14 después de la inyección del virus y se usaron diluciones en serie del suero (comenzando en 1/20) para neutralizar 1000 UFP del virus de la vaccinia t K-. Se sembraron en placa 2x104 células HeLa por pocillo en 96 pocillos y se infectaron con una mezcla de suero-virus. El día 4 después de la infección, las placas se lavaron con PBS y se cuantificó la absorbancia después de teñir los cultivos usando un kit de ensayo de proliferación celular no radiactiva (Promega, Madison, WI).
Los valores de CI50 (dilución del suero requerida para neutralizar el virus de la vaccinia que puede inducir el 50 % de la inhibición celular) se estimaron a partir de curvas de respuesta frente a dosis mediante regresión no lineal convencional, usando una ecuación de Hill adaptada. Tal como se muestra en la figura 3D, la cantidad de anticuerpo neutralizante contra el virus es mayor en ratones C57BL/6 silvestres que en ratones que portaban una mutación inactivada de TLR2. Por consiguiente, una activación de TLR2 más baja asociada con el virus desglicosilado puede estar asociada con una menor producción de anticuerpos antivirales y una respuesta antitumoral mejorada.
8. Ejemplo 3. Efecto de la expresión de TRIF
Se introdujo un ácido nucleico que codifica para TRIF murino en el virus WR.TK- y se evaluó su efecto sobre las células T. Se expresó TRIF desde el interior del locus de timidina cinasa, expresado a partir del promotor viral temprano/tardío p7.5 de vaccinia (“TK-TRIF” o “WR.TK-.TRIF”; figura 4A). Se generó un virus WR.TK- que tenía un ácido nucleico que codifica para DAI murino (DLM-1/ZBP1) expresado a partir de p7.5 y clonado en el locus del gen de la timidina cinasa viral (“TK-DAI”; figura 4A).
Se realizó un ELISA para confirmar la expresión de TRIF del virus TK-TRIF (figura 4B). Para el ELISA, se usó un kit de ELISA para TRIF de ratón para determinar la concentración de TRIF en el sobrenadante o los extractos celulares de células infectadas a una MOI de 1 (UFP/célula) con TK-TRIF. Tal como se muestra en la figura 4B, el virus TK-TRIF expresó específicamente TRIF en comparación con TK-. Se usó inmunotransferencia de tipo Western para confirmar la expresión de DAI del virus TK-DAi (figura 4C). Para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western, los cultivos celulares se sembraron en placas de 6 pocillos y se infectaron a una MOI de 5 (UFP/célula) y, 24 horas después de la infección, se incubaron extractos de proteínas de células completas en tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology Inc, Danvers, MA) durante 1 hora a 4 °C. Las muestras clarificadas (15 |i g/carril) se separaron mediante un gel SDS-PAGE al 10 % y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La proteína DAI de ratón se detectó mediante membranas de inmunotransferencia usando un anticuerpo primario policlonal anti-DAI (conejo, Abcam, Cambridge, MA) y un anticuerpo anti-IgG de conejo policlonal conjugado con HRP (cabra, Thermo Scientific, Waltham, MA). Se usaron un anticuerpo monoclonal anti-p actina de ratón (SantaCruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) y un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa (cabra, Thermo Scientific) para la inmunotransferencia de p-actina como control de carga. Tal como se muestra en la figura 4C, el virus TK-DAI expresó específicamente DAI en comparación con TK-.
Tal como se muestra en la figura 5A, la expresión de TRIF dio como resultado un aumento en la producción de interferón de tipo I por los linfocitos in vitro. La expresión de TRIF también aumentó la producción de CTL in vivo, tal como se muestra mediante el ensayo ELISpot (figura 5B). Para los ensayos ELISpot, se prepararon esplenocitos de ratones. Los esplenocitos se mezclaron con células tumorales o esplenocitos previamente infectados con virus de la vaccinia inactivado por UV en una proporción de 5:1. Se usaron esplenocitos indiferenciados de cada ratón como control. Para los ensayos se usaron placas de filtro de membrana de 96 pocillos (EMD Millipore, Billerica, MA) recubiertas con 15 |i g/ml de anticuerpo monoclonal anti-IFN-y de ratón AN18 (Mabtech, Inc., Cincinnati, OH). Las células se mantuvieron durante 48 horas a 37 °C y las manchas se detectaron usando 1 |i g/ml de anticuerpo anti-IFN-y de ratón biotinilado R4-6A2-biotina (Mabtech). Las placas se desarrollaron usando un kit ABC y un kit de sustrato AEC para peroxidasa (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Las manchas específicas se contaron y analizaron usando un analizador ImmunoSpot y software (CTL, Shaker Heights, OH).
Se realizó el análisis de la liberación de citocinas y quimiocinas in vitro e in vivo 24 horas después de la infección de TK-, TK-TRIF o TK-DAI (MOI de 1) mediante un ensayo Luminex. Para los sobrenadantes de cultivo celular, se usaron un kit de panel de citocinas de ratón Miliplex (5-plex) de Milipore (Billerica, MA) y un kit de ensayo de ratón 2-plex de Panomics (Redwood City, CA). Para los lisados tumorales, se usó un kit de panel citocinas de ratón 20-plex de Invitrogen (Carlsbad, CA) para determinar las concentraciones en los tumores recogidos el día 4 después de la administración del virus de la vaccinia. Los tumores se homogeneizaron usando tubos Lysing Matrix D y un instrumento FastPrep-24. Tal como se muestra en las figuras 6A y C, las concentraciones de plKKp, IL-6, IP-10, TNF -a e IFN-p aumentaron significativamente tras la infección con TK-TRIF en comparación con TK- en diferentes líneas de células tumorales en comparación con TK-. Además, se analizaron los ratones BALB/c con xenoinjertos subcutáneos Renca establecidos inyectados con una única dosis intravenosa de 1x108 UFP por ratón de TK- o TK-TRIF para determinar la concentración intratumoral in vivo de citocinas y quimiocinas. 4 días después de la inyección, se recogieron los tumores y se determinó la concentración de diversas citocinas y quimiocinas en los lisados tumorales mediante ensayos luminex o ELISA. La figura 6D muestra que las concentraciones intratumorales de INF-y, IL-12, IP-10, TNF-a , IL-1 p, GM-CSF y KC aumentaron significativamente en respuesta a TK-TRIF en comparación con TK-.
Se analizó la activación de las rutas de NF-k B e IRF3 después de la infección con TK-TRIF y TK-DAI. Se usaron ensayos ELISA para determinar las concentraciones de plKKp e IRF3 en extractos citoplásmicos y nucleares, respectivamente, de células 4T1 o MEF infectadas con TK-, TK-TRIF o TK-DAI a una MOI de 1. Tal como se muestra en la figura 6A y B, TK-TRIF aumentó la activación de las rutas de señalización de NF-k B e IRF3 tal como se observa por un aumento en la concentración de la expresión de plKKp e IRF324 horas después de la infección. La figura 7A muestra que la fosforilación de NF-k B aumentó después de la infección de TK-TRIF y TK-DAI. HMGB1 y Hsp-70, que funcionan como reguladores de NF-k B, también mostraron una expresión alterada después de la infección por TK-TRIF (figura 7B y 7C). Se analizó la presencia de células T cooperadoras CD4+ y linfocitos T citotóxicos CD8+ después de la infección con TK-, TK-TRIF. Tal como se muestra en la figura 7D y E, el número de linfocitos T citotóxicos y células T cooperadoras fue mayor en ratones infectados con TK-TRIF.
El análisis de la replicación y la actividad antitumoral de TK-TRIF se realizó en diferentes células tumorales de ratón. Se infectaron diversas líneas de células tumorales con una MOI de 1 y se midió la producción de virus mediante ensayo de placa ELISpot, tal como se describió anteriormente, en diferentes puntos de tiempo. Tal como se muestra en la figura 8A, la producción viral tanto de TK-TIRF como de TK-DAI fue significativamente menor en las células Renca resistentes en comparación con TK-, pero la producción viral de TK-TIRF y TK-DAI en las células MC38 y 4T1 fue a niveles similares a TK-(véase también la figura 9A).
Se realizaron análisis adicionales de la expresión viral en tumores y los volúmenes tumorales en ratones BALB/c o C57BL/6 implantados con xenoinjertos Renca o MC38, respectivamente, y ratones BALB/c implantados con xenoinjertos 4T1. Se inyectaron ratones BALB/c o C57BL/6 con PBS o 1x108 UFP de TK-, TK-TRIF o TK-DAI a través de la vena de la cola. Para el modelo semiortotópico 4T1, se implantaron 2x105 células 4T1 en la almohadilla de grasa de la glándula mamaria de ratones hembra BALB/C. La figura 8C muestra que la expresión génica viral de TK-TRIF y TK-DAI estaba en un nivel más bajo en tumores de xenoinjertos Renca o MC38 implantados en ratones BALB/c o C57BL/6, respectivamente, en comparación con la expresión génica viral de TK-. La figura 9C muestra que la producción viral y la expresión viral de TK-DAI y TK-TRIF se redujeron en tumores en comparación con la expresión viral del virus TK- o TK- que expresa GM-CSF (“TK-GMCSF”). Se trataron ratones BALB/c con tumores Renca implantados por vía subcutánea con una dosis por vía i.v. de 1x108 UFP una vez que los tumores alcanzaron 50-100 mm3 Los virus usados fueron WR.TK- y WR.TK-TRIF+ (o control de PBS). La respuesta tumoral posterior se siguió mediante medición con compás calibrador y se observó una reducción en el crecimiento tumoral en ratones infectados con TK-TRIF (figura 5C y figura 8D). Se observó una respuesta similar en ratones implantados con tumores MC38 (figura 8D) y tumores 4T1 en comparación con tumores infectados con TK-GMCSF (figura 9D). La citotoxicidad del virus modificado en comparación con TK- se determinó realizando ensayos de citotoxicidad. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron sembrando 2x104 células por pocillo en placas de 96 pocillos en DMEM con FBS al 5 %. Las células se infectaron con diluciones en serie comenzando con una MOI de 75 y, el día 4 después de la infección, las placas se lavaron con PBS y se cuantificó la absorbancia después de teñir los cultivos usando un kit de ensayo de proliferación celular no radiactiva (Promega, Madison, WI). Los valores de CI50 (UFP por célula necesarios para producir una inhibición del 50 %) se estimaron a partir de curvas de respuesta frente a dosis mediante regresión no lineal convencional, usando una ecuación de Hill adaptada. La figura 8B muestra la citotoxicidad comparativa de TK-TRIF y TK-DAI en células infectadas con los virus indicados a dosis que oscilan entre 75 y 0,00025 UFP/célula. La modificación del virus TK- para expresar TRIF o DAI no dio como resultado ningún cambio en la citotoxicidad en comparación con TK-. La determinación del número de células apoptóticas mediante tinción con anexina V, tal como se muestra en la figura 9B, indica que la infección de las células Renca y 4T1 dio como resultado un aumento de las células apoptóticas. Evaluación de la apoptosis/necrosis de las líneas celulares, las células se infectaron con una MOI de 1 con los virus indicados y se tiñeron usando un kit de detección de apoptosis FITC con anexina V (Abcam, Cambridge, MA) 48 horas después de la infección. Los análisis se realizaron usando un citómetro de flujo Accuri C6 (BD Biosciences).
Se realizaron experimentos para determinar si TK-TRIF afecta a la supervivencia de ratones con xenoinjertos Renca o MC38 en comparación con ratones tratados con TK- o PBS. Se establecieron xenoinjertos Renca o MC38 en ratones BALB/C o C57BL/6, respectivamente, y se trataron con una única dosis intravenosa de 1x108 UFP de los virus indicados o PBS. Tal como se muestra en la figura 9E y F, TK-TRIF mejoró significativamente la supervivencia en comparación con el tratamiento con TK-.
9. Ejemplo 4. Efecto de la desglicosilación y expresión de TRIF combinadas.
El virus TK- modificado para expresar TRIF, tal como se comentó anteriormente en el punto 6.3, se desglicosiló (“TK-TRIF deglyc”) para analizar el efecto que una combinación de este tipo tendría sobre las respuestas celulares antitumorales y la eficacia antitumoral del virus.
Para determinar la toxicidad del virus que expresa TK-TRIF, se analizó el peso corporal de los ratones BALB/C inyectados por vía intravenosa con PBS como control o 1*108 UFP por ratón de TK-, TK-TRIF o TK-TRIF desglicosilado. La figura 10A muestra que los ratones inyectados con TK- presentaron una reducción de más del 10 % en el peso corporal el día 6 después de la inyección del virus, mientras que los ratones inyectados con TK-TRIF y TK-TRIF deglyc presentaron un perfil de peso similar al de los inyectados con PBS, lo que indica que TK-TRIF y TK-TRIF deglyc son menos tóxicos que TK-.
Se analizó la expresión génica viral de TK-TRIF-deglyc en in vivo, en comparación con TK- y TK-TRIF. Se implantaron tumores Renca en ratones BALB/c, y se inyectaron los ratones con PBS o 1x108 UFP de TK-, TK-TRIF o TK-TRIF deglyc a través de la vena de la cola. La expresión génica viral se determinó detectando la expresión de luciferasa viral desde el interior de los tumores y se midió en los puntos de tiempo indicados. La figura 10B muestra que 24 horas después de la infección, hubo menos expresión de TK-TRIF y TK-TRIF deglyc en los tumores en comparación con TK-.
Se realizaron experimentos para determinar si TK-TRIF o TK-TRIF deglyc afectaba a la supervivencia de ratones con xenoinjertos Renca o MC38 en comparación con ratones tratados con TK- o PBS. Se establecieron xenoinjertos Renca o MC38 en ratones BALB/C o C57BL/6, respectivamente, y se trataron con una única dosis intravenosa de 1x108 UFP de los virus indicados o PBS. Tal como se muestra en la figura 10C y D, TK-TRIF y TK-TRIF deglyc mejoraron significativamente la supervivencia de los ratones en comparación con el tratamiento con TK-. Además, TK-TRIF deglyc mejoró la supervivencia de ratones con tumores Renca en comparación con el tratamiento con TK-GMCSF (figura 10E).
Las respuestas inmunitarias celulares al virus de la vaccinia y las células tumorales se evaluaron mediante el ensayo ELISpot de IFN-y, tal como se describió anteriormente en la sección 6.3. El día 7 después de la administración del virus, se recogieron los bazos de los ratones inyectados por vía intravenosa con 1x108 UFP de los virus indicados o PBS (ratones BALB/c que portaban xenoinjertos Renca) y se evaluó la cantidad de CTL que reconocen el virus de la vaccinia o células Renca. La figura 11A muestra que la desglicosilación y expresión de TRIF dio como resultado un aumento significativo en la producción de CTL que reconocen el virus de la vaccinia in vivo, en comparación con las modificaciones solas, por ejemplo, TK-TRIF o TK-deglyc. En particular, el virus desglicosilado que expresa TRIF dio como resultado un aumento en la producción de CTL que fue mayor que los aumentos en la producción de CTL observados por las modificaciones individuales. Además, la figura 11B muestra que la desglicosilación y expresión de TRIF dio como resultado un aumento en la cantidad de producción de CTL que reconocen células RENCA in vivo, en comparación con las modificaciones solas, por ejemplo, TK-TRIF o TK-deglyc.
Se realizó un ensayo de neutralización para determinar los niveles de anticuerpos anti-vaccinia circulantes para ratones inyectados con 1x108 UFP de TK-, TK-TRIF o TK-TRIF desglicosilado. Los títulos de AcN se determinaron mediante la mayor dilución de suero que dio como resultado al menos una inhibición del 50 % de la infección. La figura 11C muestra que la cantidad de anticuerpo neutralizante es mayor en ratones C57BL/6 silvestres infectados con TK- en comparación con ratones infectados con TK-TRIF, TK-deglyc o TK-TRIF-deglyc. Los ratones infectados con TK-TRIF-deglyc mostraron la mayor reducción en la cantidad de anticuerpo neutralizante en el suero.
Se analizó el efecto del virus desglicosilado que expresa TRIF sobre el crecimiento tumoral en ratones BALB/c que portaban Renca o ratones C57BL/6 que portaban xenoinjertos tumorales MC38. Para los xenoinjertos tumorales Renca o MC38, las líneas de células tumorales se implantaron por vía subcutánea a 5x105 células por ratón en ratones BALB/c o C57BL/6, respectivamente. Cuando el tumor alcanzó -50-100 mm3, los ratones se trataron con una única dosis intravenosa de los virus indicados (1x108 UFP/ratón) en la vena de la cola. El crecimiento tumoral se controló mediante medición con compás calibrador y se definió mediante la ecuación V (mm3) = rc/6 X W2 X L, en la que W y L son la anchura y la longitud del tumor, respectivamente. Los datos se expresaron como tamaño tumoral relativo al comienzo de la terapia, que se estableció como el 100 %. Sorprendentemente, el virus TK-TRIF desglicosilado dio como resultado una mayor reducción del tamaño del tumor de los ratones que portaban xenoinjerto RENCA y MC38 en comparación con el efecto aditivo de las modificaciones individuales combinadas o el virus TK-(figuras 11D y E). Además, TK-TRIF desglicosilado presentó una actividad antitumoral mejorada en comparación con TK-GMCSF, tal como se observa por una reducción significativa del tamaño tumoral en ratones BALB/c que albergaban xenoinjertos Renca (figura l lF ) o tumores subcutáneos 4T1 en ratones BALB/c (figura 9D). Por consiguiente, el virus de la vaccinia TK- desglicosilado que expresa TRIF presenta una respuesta antitumoral significativamente mejorada y da como resultado una reducción en la producción de anticuerpos antivirales.
10. Ejemplo 5. Efecto de la expresión de TRIF, desialilación y deleción de C12L combinadas en UPCI-1812
Las modificaciones anteriores, concretamente, la deleción de C12L, la desialilación y la introducción de TRIF, se incorporaron juntas para crear una nueva cepa de VV, UPCI-1812, y se evaluó el efecto de este virus triplemente modificado para determinar sus efectos terapéuticos e inmunológicos. Tal como se muestra en la figura 12A, la infección por UPCI-1812 dio como resultado una supervivencia significativamente mejor que el WR.TK- que codifica para GM-CSF. En relación con el virus desializado con la deleción de C12L (“vvDD”), UPCI-1812 produjo niveles significativamente más altos de interferón gamma (IFN-y) (figura 12B) e interleucina-12 (IL-12) (figura 12C).
11. Ejemplo 6. Efecto de la selección como diana de PGE2
Las terapias virales oncolíticas finalmente han comenzado a demostrar eficacia clínica en estudios aleatorizados que destacan el potencial real de la plataforma. Sin embargo, entre la generación actual de vectores clínicos, los más exitosos han expresado una citocina activadora inmunitaria (GM-CSF), lo que refuerza una gran cantidad de datos preclínicos que indican que la respuesta inmunitaria es un mediador clave de la eficacia viral. Sin embargo, a pesar de esta observación, todavía no está claro cómo o por qué algunos pacientes responden bien y otros parecen resistentes a la viroterapia oncolítica.
Se realizaron experimentos iniciales para correlacionar la sensibilidad in vitro de una línea de células tumorales a la infección viral y la replicación con respuestas in vivo de la misma línea celular cuando se usa para formar tumores singénicos en ratones inmunocompetentes. Se analizaron in vitro 14 líneas de células tumorales de ratón diferentes de diferentes tipos de tumores y cepas de ratón infectando las líneas celulares con TK-(figura 26A). Se observó producción viral y expresión génica viral en las 14 líneas de células tumorales de ratón diferentes. La producción viral se analizó sembrando 2x105 células en placas de 24 pocillos, seguido por infección a una MOI de 1 (UFP/célula) con los virus de la vaccinia indicados. Cuatro horas después de la infección, los cultivos se lavaron dos veces con PBS y se incubaron en medio libre de virus recién preparado. En los puntos de tiempo indicados después de la infección, los cultivos se recogieron y se congelaron-descongelaron tres veces para obtener el extracto celular (CE). Los títulos virales se determinaron mediante ensayo de placa en células BSC-1.
Siete de las 14 líneas se sometieron a prueba adicionalmente in vivo usando inyección intratumoral directa de TK-(figura 13A y B y figura 26A y B). Se usó inyección intratumoral directa para reducir la variabilidad que puede producirse debido a diferencias en la administración viral. Tal como se muestra en la figura 13A y B, no se observó correlación directa entre la replicación viral o la muerte celular mediada por virus y el efecto antitumoral in vivo, lo que indica que factores distintos de la actividad oncolítica directa median los efectos antitumorales.
Durante estos experimentos se usó la vaccinia oncolítica que expresa luciferasa para permitir el análisis de la expresión génica viral a lo largo del tiempo en ratones individuales (como sustituto de la replicación y persistencia viral) y permitir comparaciones con la respuesta posterior. Dos patrones distintos parecieron surgir de los datos. Para los modelos tumorales más resistentes, definidos como la terapia viral que aumenta la supervivencia global en menos de 2 semanas, tal como se observa con Renca, B16, PAN02 y 4T1, pudo establecerse una correlación directa dentro de cada modelo tumoral individual, de modo que el nivel de expresión génica viral a las 24 h correspondía a la respuesta posterior (figura 13B). Por tanto, aunque la replicación in vitro no se correlaciona con la actividad in vivo al comparar modelos tumorales (supuestamente debido a la influencia de factores tales como ECM y células no tumorales en el tumor), dentro de cualquier modelo tumoral individual existe una correlación entre la expresión génica viral temprana y la respuesta posterior. Sin estar vinculado a una teoría particular, parece que la replicación viral y la actividad oncolítica directa es el mediador clave de la respuesta limitada en los modelos tumorales más resistentes. Sin embargo, se observó un patrón diferente en los tumores que respondieron bien a la terapia viral, que incluye los modelos tumorales AB12, LLC, MC38. En estos modelos, los pacientes que mejor responden al tratamiento dentro de cada modelo demostraron un aclaramiento rápido y robusto del virus después de la infección inicial y la replicación temprana (figura 13B y figura 27). Este fuerte aclaramiento sugiere la inducción de una fuerte respuesta inmunitaria para potenciar los efectos oncolíticos directos virales en los modelos tumorales que mejor responden al tratamiento.
Con el fin de examinar esta observación con más detalle, inicialmente se eligieron dos modelos tumorales con el mismo contexto genético que mostraban respuestas comparables después del tratamiento viral in vivo, pero uno de los cuales (LLC) mostró indicaciones de una inducción inmunitaria robusta (aclaramiento viral temprano) y destrucción celular mediada por virus limitada in vitro (figura 13B y figura 26A y B). El otro (B16) era más sensible a la destrucción viral in vitro, y cualquier respuesta in vivo parecía correlacionarse con la expresión génica viral temprana (figura 13B y figura 26A y B). Se comparó un examen completo de la activación de marcadores inmunitarios sistémicos después de la infección viral entre ratones sin tumores, ratones con tumores B16 y ratones con tumores LLC. Estos incluían marcadores de activación de señalización innata temprana tales como pS6, pSTAT1, pSTAT3, pSTAT5 en diferentes poblaciones de células (figura 13C y figura 14A), marcadores de proliferación de células T tales como pS6 y Ki67 (figura 14A) y marcadores de activación tales como CD44 y CD62L (figuras 14A) y respuestas de anticuerpos neutralizantes (figuras 14D). Se observaron diferencias menores en la respuesta inmunitaria sistémica a la terapia viral entre animales que portaban tumores y que no portaban tumores, con la única excepción de la fosforilación de S6 en algunas células mieloides poco después de la infección (figura 13C). Se observó que los niveles de pS6 estaban reducidos en animales que portaban tumores, pero la reducción de la activación inmunitaria fue más pronunciada en los ratones que portaban tumores B16 (figura 13C y figura 14A). Esto se verificó en otros modelos tumorales, confirmándose de nuevo que los niveles de pS6 se redujeron en los modelos tumorales más resistentes (incluyendo 4T1 y RENCA), lo que indica un defecto en la respuesta de células dendríticas (DC) que puede mediar la resistencia en estos ratones (figura 13C).
Como se observaron pequeñas diferencias en la respuesta inmunitaria sistémica, se examinaron los efectos de una inmunosupresión más localizada dentro del tumor. Diferentes células inmunitarias están asociadas con un fenotipo supresor, incluyendo células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y células T reguladoras (T-reg) (y macrófagos M2). Se analizó el nivel de estos diferentes tipos de células tanto en el bazo como en el tumor de todos los modelos tumorales en comparación con los animales sin tratar. Para la evaluación de poblaciones inmunitarias en tumores, los tumores se recogieron de ratones tratados tal como se indica, y se desagregaron mecánicamente y se digirieron con una mezcla de triple enzima (colagenasa tipo IV, ADNasa tipo IV e hialuronidasa tipo V (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)). Se realizaron análisis de inmunotinción de la superficie celular de cuatro colores usando un citómetro de flujo Gallios (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Las células desagregadas del tumor se tiñeron usando anticuerpo antiCD3 de ratón PE-Cy7 (BD Biosciences, San José, CA), anticuerpo anti-CD4 de ratón FITC, anticuerpo anti-CD8 de ratón PerCP-Cy5.5 y anticuerpo anti-CD25 de ratón PE (eBioscience, San Diego, CA).
El nivel de MDSC encontrado en el tumor para diferentes modelos tumorales se correlacionó estrechamente con la resistencia o sensibilidad de ese modelo a la terapia viral (figura 15A y B y figura 16). Por ejemplo, Renca, que muestra resistencia a la terapia viral, dio como resultado tumores con altos niveles de MDSC. La figura 17A muestra el número de MDSC en tumores no tratados en función del aumento de la supervivencia después del tratamiento intravenoso con 1e8 UFP de WR.TK- para varios sistemas de modelos tumorales. Las cepas de vaccinia muestran una capacidad muy escasa para aumentar la supervivencia en modelos tumorales de ratón que muestran altos niveles de MDSC al inicio. Se implantaron células de cada una de las líneas celulares de modelo tumoral enumeradas (figura 17A) en ratones inmunocompetentes singénicos. A continuación, se sacrificaron los ratones con el fin de determinar el nivel inicial promedio de MDSC en los tumores resultantes para cada modelo o se trataron los ratones con WR.TK-(o control de PBS) (1e8 UFP administradas por vía intratumoral) y se determinó el aumento de la esperanza de vida (para una supervivencia del 50 %) después del tratamiento (en días). El gráfico representa “números relativos de MDSC en tumores al inicio” frente a “mediana del aumento de la supervivencia después del tratamiento con WR.TK-(en relación con el control no tratado)”. Más MDSC en el nivel inicial del estudio se correlacionó con una eficacia reducida de la terapia.
Se examinaron cambios adicionales que se produjeron en el tumor después de la terapia viral y se observó que para múltiples modelos tumorales, tales como 4T1, RENCA y MC38, la adición de la terapia con vaccinia dio como resultado una pérdida de T-reg, pero que los niveles de MDSC no se vieron afectados y continuaron aumentando con el tiempo, tal como hicieron en los grupos de control (figura 15A y B y figura 16A y B). La terapia viral redujo los niveles de T-reg en los tumores tratados, pero no tuvo ningún impacto en los niveles de MDSc . En el modelo tumoral Renca (implantado por vía subcutánea en ratones BALB/c), se determinó el número relativo de T-reg o MDSC en el tumor/mg de tumor en diferentes momentos antes o después del tratamiento con WR.TK-(1e8 UFP administradas por vía intratumoral) (figuras 17B y C). Por tanto, parece que la incapacidad de la vaccinia oncolítica para seleccionar como diana MDSC redujo su actividad terapéutica en algunos tumores en los que los niveles de MDSC son altos. En los tumores con niveles de fondo bajo de MDSC (MC38), también se encontró que la terapia viral aumentaba el nivel de células T CD8+ en el tumor, mientras que los modelos tumorales más resistentes (4T1) no mostraron ningún aumento (figura 15B).
Se realizó el análisis de la cepa de vaccinia inmunogénica GM-CSF, que expresa el factor estimulante de colonias de citocinas (CSF). Se ha demostrado previamente que GM-CSF da como resultado respuestas clínicas más drásticas y también se ha asociado con la proliferación de MDSC. Las figuras 18 y 19 muestran que, aunque las cepas de vaccinia más inmunogénicas (WR.TK-GMCSF y WR.B18R-IFNP+) potenciaron adicionalmente algunos aspectos de la respuesta inmunitaria en los modelos tumorales sensibles, tales como la reducción de los niveles de T-reg y el aumento de los niveles de células T CD8+ adicionales, no se observó tal ventaja en los modelos tumorales por lo demás resistentes. Sin estar vinculado a una teoría particular, parece que la principal diferencia entre tumores sensibles y resistentes se relaciona con la incapacidad del virus para inducir un efecto inmunoterápico robusto en tumores con altos niveles de inmunosupresión mediada por MDSC dentro del microentorno tumoral.
Informes recientes han identificado la producción de prostaglandina PGE2 mediada por COX2 como un determinante clave de la infiltración de MDSC y el mantenimiento del fenotipo de MDSC. Se usaron dos enfoques para seleccionar como diana esta ruta. Un enfoque fue mediante la aplicación de un inhibidor de COX2. El segundo enfoque fue la expresión de la enzima HPGD que degrada las prostaglandinas directamente de los vectores virales. Se introdujo un ácido nucleico que codifica para la hidroxiprostaglandina deshidrogenasa 15 (HPGD), una enzima de ratón que degrada la PGE2, en WR.TK- mediante inserción en el locus de timidina cinasa mediante recombinación homóloga y bajo el control del promotor p7.5 viral (“TK-HPGD “o “WR.TK-.HPGD”). Tal como se muestra en la figura 20, HPGD se expresó específicamente a partir de TK-HPGD y redujo significativamente los niveles de PGE2 en células Renca infectadas con TK-HPGD. Tal como se muestra en la figura 25, parece que la infección con WR.TK-puede alterar la expresión de COX2 en los tumores localmente en el sitio de la infección, sin producir niveles significativos de expresión de COX2 en general en el tumor, o el virus puede replicarse selectivamente en regiones con niveles bajos de COX2. Los experimentos iniciales in vitro e in vivo determinaron que incluso a niveles tóxicos, los inhibidores de COX2 no pudieron reducir los niveles de PGE2 a un nivel cercano al alcanzado con la expresión de HPGD (figura 20).
A continuación, se sometió a prueba la vaccinia oncolítica que expresa HPGD en varios modelos tumorales de ratón. Se observó que el número de células MDSC en el tumor se redujo rápida y significativamente en el bazo y en los tumores después del tratamiento con WR-TK-HPGD solamente (figura 21 y figura 23A-D). También se encontró que la inclusión de HPGD reduce MDSC en el tumor y el bazo en relación con el virus WR.TK- no modificado. Esto era específico de los tumores, sin que se observara toxicidad sistémica (figura 21A). Curiosamente, TK-HPGD también indujo una reducción más rápida y robusta en los números de T-reg en el tumor. Tal como se muestra en la figura 21B y C y en la figura 22, la infección por WR-TK-HPGD se correlacionó con un efecto terapéutico potenciado en varios modelos tumorales de ratón in vivo y dio como resultado volúmenes tumorales más bajos. Cabe destacar que el modelo tumoral que anteriormente era más resistente a la terapia viral, RENCA, que mostraba un fenotipo “solamente oncolítico” y niveles iniciales altos de MDSC, mostró sorprendentemente el mayor aumento en el beneficio terapéutico después de la expresión de HPGD (figura 21B).
Los patrones de expresión génica viral también se compararon para WR.TK- y WR.TK-HPGD en el tumor RENCA. Se observó que, mientras que para WR.TK- se observó un fenotipo “solamente oncolítico” (una mayor expresión génica en el día 1 se correlacionó con el mayor beneficio terapéutico), WR.TK-HPGD+ mostró el fenotipo “oncolítico e inmunoterápico” con los pacientes que mejor responden al tratamiento mostrando un aclaramiento robusto y rápido del virus el día 5 (figura 21D). Sin estar vinculado a una teoría particular, parece que la expresión de HPGD puede devolver la actividad inmunoterápica del vector en estos modelos más resistentes y, por tanto, puede sensibilizar a los tumores por lo demás resistentes a la terapia viral oncolítica. Esto fue a pesar de que no hubo pérdida general en el potencial oncolítico de la expresión de HPGD.
Se realizaron análisis de los mecanismos que median las ventajas terapéuticas observadas con WR.TK-HPGD+.
3 días después del tratamiento, momento en el que los niveles de MDSC y T-reg ya se habían reducido drásticamente en el entorno del tumor, se observó que sólo se produjeron cambios modestos en los niveles de citocinas y quimiocinas en el tumor (figura 24A). Sin embargo, el nivel de quimiocinas en el suero cambió notablemente (figura 24B). En particular, las quimiocinas asociadas con la atracción de células T activadas, incluyendo CCL5, se regularon por incremento, mientras que CXCL12 (sdf-1, asociado con un fenotipo inmunosupresor y un mal pronóstico) se redujo drásticamente (figura 24A y B). Este cambio en el efecto de las quimiocinas sistémicas puede ser responsable de mediar los cambios en el repertorio de células inmunitarias en el tumor. Esto se examinó adicionalmente usando un ensayo de tumor bilateral, en el que un tumor se inyectó con WR.TK- y el tumor del flanco opuesto se inyectó con WR.TK-HPGD. Se observó que las células T activadas se dirigían significativamente más hacia el tumor que expresa HPGD (figura 24D). Además, en puntos de tiempo posteriores, se observó que la expresión de WR.TK-HPGD dio como resultado niveles drásticamente aumentados de CTL que seleccionan como diana tumores en el bazo. Estos datos indican que la expresión de HPGD actúa no solo para limitar el entorno supresor dentro del tumor, sino que también potencia la atracción de las células T, lo que conduce a una respuesta inmunitaria adaptativa antitumoral más robusta. Además, la incorporación de HPGD en UPCI-1812 dio como resultado un virus que inhibió el crecimiento tumoral significativamente más que UPCI-1812 (“combinado”; figura 28). Tal como se muestra en la figura 28, el virus combinado dio como resultado una mayor reducción del crecimiento tumoral que el efecto aditivo del virus UPCI-1812 y el virus VV-HPGD. La selección como diana de PGE2 mediada por virus pudo superar la inmunosupresión localizada que condujo a cambios profundos en el microentorno tumoral y dio como resultado la sensibilización de tumores previamente resistentes a la terapia viral.
13. Ejemplo 7. Modificación que aumenta la actividad y la diseminación
La figura 29 muestra el nivel de anticuerpo neutralizante anti-vaccinia presente en el suero de ratones vacunados con (1e4 UFP) de o bien WR o bien WR con una mutación puntual que potencia EEV en el gen viral A34R (Lys151 por Glu). La cepa mutante A34R produce menos anticuerpo neutralizante anti-vaccinia en comparación con WR-.
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Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un virus de la vaccinia oncolítico, que comprende un ácido nucleico que codifica para 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH) o un dominio funcional que tiene actividad 15-PGDH, en el que el virus de la vaccinia oncolítico es negativo para timidina cinasa.
2. El virus de la vaccinia oncolítico según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico que codifica para 15-PGDH se clona en el locus de timidina cinasa.
3. El virus de la vaccinia oncolítico según la reivindicación 1 o 2, en el que el virus de la vaccinia oncolítico es una cepa Western Reserve.
4. Una composición farmacéutica, que comprende un virus oncolítico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un portador farmacéuticamente aceptable.
5. El virus oncolítico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o la composición farmacéutica según la reivindicación 4, para su uso en el tratamiento de cáncer.
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