ES2846833T3

ES2846833T3 - Ligandos de obtención de imágenes de tau por PET

Info

Publication number: ES2846833T3
Application number: ES17742717T
Authority: ES
Inventors: José Ignacio Andres-Gil; Guy Maurits R Bormans; Lieven Denis Herwig Declercq; Katleen Fierens; Joseph Elisabeth Leenaerts; Diederik Willem Elisabeth Moechars; Frederik Jan Rita Rombouts; Hartmuth Kolb; Wei Zhang
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2016-07-18
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2021-07-29
Anticipated expiration: 2037-07-14
Also published as: EP3484528A1; US20220024896A1; JP6946412B2; EP3484528B1; JP2019528249A; IL264250A; US11168068B2; DK3484528T3; IL264250B1; IL264250B2; US20190284165A1

Abstract

Un compuesto según la Formula (I') **(Ver fórmula)** en la que R2 es metilo, y bien R1 es 18F y R3 es H, o bien R1 es H y R3 es 18F; o R1 y R3 son ambos H, y R2 se selecciona del grupo que consiste en -alquilC1-4-18F, -OalquilC1-4-18F y -NR4-alquilC1-4- 18F, en donde R4 es H o metilo; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

Description

DESCRIPCIÓN

Ligandos de obtención de imágenes de tau por PET

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a nuevos ligandos de tau radiomarcados selectivos que son útiles para la obtención de imágenes y la cuantificación de agregados de tau, usando tomografía de emisión positrónica (PET). La invención también se dirige a composiciones que comprenden estos compuestos, a procedimientos para preparar estos compuestos y composiciones, al uso de estos compuestos y composiciones para obtener imágenes de un tejido o un sujeto, in vitro o in vivo, y a precursores de dichos compuestos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa asociada al envejecimiento. Los pacientes de AD sufren déficits cognitivos y pérdida de memoria, así como problemas conductuales tales como ansiedad. Más de 90% de los afectados por AD tienen una forma esporádica del trastorno mientras que menos de 10% de los casos son familiares o hereditarios. En los Estados Unidos, aproximadamente una de cada diez personas de 65 años tiene AD, mientras que a los 85, uno de cada dos individuos está afectado por AD. La esperanza de vida media desde el diagnóstico inicial es 7-10 años, y los pacientes con AD requieren cuidado intensivo bien en una residencia de ancianos o bien por miembros de la familia. Con el número creciente de ancianos en la población, la AD es un problema médico creciente. Las terapias disponibles actualmente para la AD solamente tratan los síntomas de la enfermedad pero no la patología subyacente que provoca la enfermedad.

Las características patológicas distintivas en el cerebro de pacientes con AD son ovillos neurofibrilares que están generados por agregados de proteína tau hiperfosforilada y placas de amiloide que se forman mediante la agregación de péptido amiloide beta. Aunque el trastorno neurodegenerativo más predominante es la AD, la proteína tau agregada también es una característica de otras enfermedades neurodegenerativas conocidas como "tauopatías", que adicionalmente pero no exclusivamente incluyen demencia debida solo a ovillos (TD), enfermedad por granos argirofílicos (AGD), parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal (CBD), enfermedad de Pick (PiD) y demencia frontotemporal y parkinsonismo ligados al cromosoma 17 (FTDP-17). La heterogeneidad de estos trastornos está estrechamente relacionada con la amplia gama de isoformas de tau humanas y modificaciones postraduccionales. Los agregados de tau pueden aparecer ultraestructuralmente como filamentos helicoidales apareados (PHF), filamentos lineales (SF), filamentos arrollados aleatoriamente (RCF) o filamentos retorcidos (TF); esta variabilidad se traduce en polimorfismo. Se ha establecido una correlación de los ovillos neurofibrilares con el nivel de deterioro cognitivo en la AD y/o la posibilidad de desarrollar AD. Sin embargo, el diagnóstico todavía solo se puede realizar post mortem por medio de biopsia/autopsia. Los exámenes basados en los antecedentes y la prueba estadística de memoria requieren una clara evidencia de deterioro o demencia, y a menudo son inexactos o poco sensibles, y la medida de péptidos Ap y proteínas tau totales en fluido cerebroespinal mediante punción lumbar es invasiva y propensa a efectos adversos. Aparte de la complejidad intrínseca de la AD, el desarrollo de una cura se ha visto obstaculizado por la falta de herramientas fiables para el diagnóstico temprano, la estadificación y el control preciso de la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, todavía existe una necesidad de identificar un medio para realizar el diagnóstico y/o el control de la progresión de la enfermedad. La obtención de imágenes de agregados de tau puede proporcionar este medio, particularmente cuando surjan tratamientos anti-tau.

La tomografía de emisión positrónica (PET) es una técnica de obtención de imágenes no invasiva que ofrece la más alta resolución espacial y temporal de todas las técnicas nucleares de obtención de imágenes y tiene la ventaja añadida de que puede permitir la cuantificación verdadera de concentraciones de trazador en tejidos. Usa radionúclidos emisores de positrones para la detección.

Se han presentado hasta ahora varios radiotrazadores de tomografía de emisión positrónica para obtener imágenes de agregados de tau (para una revisión, véase, a modo de ejemplo, Ariza y cols. J. Med. Chem. 2015, 58, 4365-4382). "Preclinical Characterization of 18F-MK-6240, a promising PET Tracer for in Vivo Quantification of Human Neurofibrillary Tangles" en J. Nucl. Med 2016; 57: 1599-1610 divulgan 6-fluoro-3-(1H-pirrolo[2,3-c]piridin-1-il)isoquinolin-5-amina que se une con alta afinidad a homogenados de la corteza cerebral humana con AD que contienen abundantes NFT, pero se une pobremente a homogenados cerebrales on AD pobres en NFT ricos en placas de amiloide. Se observa una desfluoración moderada con 18F-MK-6240 como absorción craneal. El artículo "Radiopharmaceuticals for positron emission tomography investigations of Alzheimer's disease" en Eur. J. Nucl. Med. Imaging 2010; 37(8): 1575 1593 presenta un compuesto de isoquinolina [11C]PK11195 que se une a receptores de benzodiacepina corticales periféricos en microglia activada y que se presentaba también en "Carbon 11 -labeled Pittsburgh compound B and carbon 11 -labeled (R)-PK11195 positron emission tomographic imaging in Alzheimer's disease en Arch. Neurol. 2009; 66(1): 60 67 que caía para mostrar cualesquiera diferencias en la retención cerebral entre pacientes y voluntarios sanos. Se mostró que la obtención de imágenes por PET del cerebro humano con el compuesto de quinolina 18F-THK5351 que tiene alta afinidad hacia PHF se confundía por la unión fuera de objetivo a la enzima monoamina oxidasa MAO-B (Alzheimer's Research & Therapy 2017; 9;25 DOI 10.1186/s13195-017-0253-y).

Sigue existiendo una necesidad de proporcionar radiotrazadores de tomografía de emisión positrónica mejorados selectivos para obtener imágenes de agregados de tau con un buen equilibrio de propiedades incluyendo, pero no limitadas a, alta afinidad y selectividad hacia agregados de tau, unión reversible, permeabilidad, perfil farmacocinético cerebral adecuado, es decir, una distribución rápida por todo el cerebro, depuración rápida, unión inespecífica mínima y accesibilidad sintética.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar compuestos de isoquinolin-6-amina útiles como radiotrazadores de PET para tau. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto que

que

al menos un átomo es radiactivo, y en la que

R2 es metilo, y bien R1 es F y R3 es H, o bien R1 es H y R3 es F; o

R1 y R3 son ambos H, y R2 se selecciona del grupo que consiste en -alquilC1-4-F, -OalquilC1-4-F y -NR4-alquilC1-4-F, en donde R4 es H o metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

En particular, la presente invención se refiere a un compuesto de Fórmula (I')

que

R2 es metilo, y bien R1 es 18F y R3 es H, o bien R1 es H y R3 es 18F; o

R1 y R3 son ambos H, y R2 se selecciona del grupo que consiste en -alquilC^1-4-18F, -OalquilC^1-4-18F, y -NR4-alquilC1-4-18F, en donde R4 es H o metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

En otro aspecto, la invención se refiere a compuestos precursores para la síntesis de los compuestos de Fórmula (I) o (I'), según se definen previamente. Así, la presente invención también se refiere a un compuesto de Fórmula (P-1)

que

R2 es metilo, y bien R1 se selecciona del grupo que consiste en Br, -NO², -[N(CH3)3]+ y 4-CH3-Ph-SO2-O- y R3 es H, o bien R1 es H y R3 se selecciona del grupo que consiste en Br, -NO², -[N(c H3)3]+ y 4-CH3-Ph-SO2-O-; o

R1 y R3 son ambos H, y R2 se selecciona del grupo que consiste en -alquilC1-4-Br, -alquilC1-4-I, -alquilC1-4-O-SO2CH3, 4-CH3-Ph-SO2-O-alquilC1-4-, -alquilC1-4-OH, -OalquilC1-4-Br, -OalquilC1-4-I, -OalquilC1-4-O-SO2CH3, 4-CH3-Ph-SO2-O-alquilC1-4-O-, -OalquilC1-4-OH, -NR4-alquilC1-4-Br, -NR4-alquilC1-4-I, -NR4-alquilC1-4-O-SO2CH3, 4-CH3-Ph-SO2-O-alquilC1-4-NR4- y -NR4-alquilC1-4-OH, en donde R4 es H o metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

En los compuestos de Fórmula (P-1), cuando cualquiera de R1 o R3 sean -[N(CH3)3]+, contraiones aniónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, trifluoroacetato (-[OC(O)CF3]-), un sulfonato orgánico (p. ej. alquilC1-4-sulfonato o fenilsulfonato en el que el fenilo puede estar opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C^1-4, halo, o un grupo nitro) y tartrato. Ejemplos particulares de alquilC^1-4-sulfonato incluyen metanosulfonato (mesilato), 4-metilbencenosulfonato (tosilato), 4-bromobencenosulfonato y 4-nitrobencenosulfonato. En particular, el contraión aniónico se selecciona de trifluoroacetato, tosilato y mesilato.

La invención también se refiere a los materiales de referencia de compuestos de Fórmula (I) o (I'), correspondientes a los compuestos no radiomarcados correspondientes, en la presente denominados compuestos de Fórmula [19F]-(I)

que

R2 es metilo, y bien R1 es F y R3 es H, o bien R1 es H y R3 es F; o

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En particular, dicha composición farmacéutica es una composición farmacéutica de diagnóstico. Dicha composición farmacéutica es en particular una solución estéril. Así, es ilustrativa de la invención una solución estéril que comprende un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), según se describe en la presente.

La invención se refiere además al uso de un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), como un agente de obtención de imágenes. Ejemplifica la invención un uso de un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), según se describe en la presente, para, o un método para, obtener imágenes de un tejido o un sujeto, in vitro o in vivo.

En particular, la invención se refiere a un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), para el uso en la unión a y la obtención de imágenes de agregados de tau en pacientes que sufren, o se sospecha que sufren, una tauopatía. Tauopatías particulares son, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, demencia debida solo a ovillos (TD), enfermedad por granos argirofílicos (AGD), parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal (CBD), enfermedad de Pick (PiD) y demencia frontotemporal y parkinsonismo ligados al cromosoma 17 (FTDP-17). En particular, la tauopatía es enfermedad de Alzheimer.

La invención se refiere además a un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), para la obtención de imágenes diagnóstica de agregados de tau en el cerebro de un sujeto, y al uso del compuesto de Fórmula (I), en particular el compuesto de Fórmula (I'), en la unión a y la obtención de imágenes de agregados de tau en pacientes que sufren, o se sospecha que sufren, una tauopatía. Tauopatías particulares son, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, demencia debida solo a ovillos (TD), enfermedad por granos argirofílicos (AGD), parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal (CBD), enfermedad de Pick (PiD) y demencia frontotemporal y parkinsonismo ligados al cromosoma 17 (FTDP-17). En particular, la tauopatía es enfermedad de Alzheimer.

La invención también se refiere a un método para obtener imágenes de un tejido o un sujeto, que comprende poner en contacto con o proporcionar o administrar una cantidad detectable de un compuesto de Fórmula (I) marcado, en particular un compuesto de Fórmula (I') marcado, según se describe en la presente, a un tejido, o a un sujeto, y detectar el compuesto de Fórmula (I), en particular el compuesto de Fórmula (I').

Ejemplifica adicionalmente la invención un método para obtener imágenes de un tejido, o un sujeto, que comprende poner en contacto con o proporcionar a un tejido, o un sujeto, un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), según se describe en la presente, y obtener imágenes del tejido, o el sujeto, con un sistema de obtención de imágenes de tomografía de emisión positrónica.

Adicionalmente, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un compuesto de Fórmula (I'-a) o (I'-b), denominado en particular posteriormente en la presente (I'-a1), (I'-a2), (I'-b1), (I'-b2), (I'-b3), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos según se describen en la presente, que comprende

(a) la etapa de hacer reaccionar un compuesto de Fórmula (P-a1) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos, según se definen en la presente, con una fuente de fluoruro 18F- bajo condiciones adecuadas, o

(b) la etapa de hacer reaccionar un compuesto de Fórmula (P-a2) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos, según se definen en la presente, con una fuente de fluoruro 18F- bajo condiciones adecuadas, o

(c) la etapa de hacer reaccionar un compuesto de Fórmula (P-b1) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, según se definen en la presente, con un reactivo activador tal como cloruro de metanosulfonilo o cloruro de 4-toluenosulfonilo en presencia de una base tal como trietilamina o W,W-diisopropiletilamina (DIPEA), y posteriormente hacer reaccionar el metanosulfonato o 4-toluenosulfonato resultante con una fuente de fluoruro 18F- bajo condiciones adecuadas, o

(d) la etapa de hacer reaccionar un compuesto de Fórmula (P-b2) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, según se definen en la presente, con un reactivo activador tal como cloruro de metanosulfonilo o cloruro de 4-toluenosulfonilo en presencia de una base tal como trietilamina o DIPEA, y posteriormente hacer reaccionar el metanosulfonato o 4-toluenosulfonato resultante con una fuente de fluoruro 18F- bajo condiciones adecuadas, o

(e) la etapa de hacer reaccionar un compuesto de Fórmula (P-b3) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, según se definen en la presente, con un reactivo activador tal como cloruro de metanosulfonilo o cloruro de 4-toluenosulfonilo en presencia de una base tal como trietilamina o DIPEA, y posteriormente hacer reaccionar el metanosulfonato o 4-toluenosulfonato resultante con una fuente de fluoruro 18F- bajo condiciones adecuadas.

Condiciones típicas para la activación de los precursores de Fórmulas (P-b1), (P-b2) y (P-b3) incluyen, a modo de ejemplo, cloruro de metanosulfonilo como agente activador, dimetilsulfóxido (DMSO) seco como disolvente, a temperatura ambiente durante un período suficiente para conducir la reacción hasta la finalización, típicamente, 10 minutos. El experto entenderá que cuando R4 sea H en (P-b3), la preparación del compuesto de Fórmula (I'-b3) incluirá las etapas adicionales de proteger la funcionalidad amina con un grupo protector adecuado, tal como, por ejemplo, terc-butiloxicarbonilo (Boc) o un grupo protector de amina adecuado alternativo, y posteriormente escindir este grupo protector, usando típicamente ácido trifluoroacético (TFA) cuando el grupo protector sea Boc.

Una fuente adecuada de 18F- es, por ejemplo 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano-fluoruro-[18F] potásico (1:1) (también denominada [18F]KF.K222). Condiciones adecuadas incluyen las apropiadas para sustitución nucleófila conocidas en la técnica, por ejemplo, usando DMSO o DMF como disolvente, en particular DMSO, bajo calentamiento convencional o irradiación de microondas (p. ej. 50 W), por ejemplo a aproximadamente 90-160°C, o a aproximadamente 120-160°C, en particular a aproximadamente 90 o 160°C, durante un período suficiente para permitir que la reacción avance hasta la terminación, por ejemplo 10 min. cuando la reacción se realiza bajo irradiación de microondas.

(a)

(b)

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra una autorradiografía (ARG) in vitro que usa [18F]Co. No. 1 (7,4 kBq / 500 pl / corte) sobre un corte de la corteza visual de un paciente con a D (fase de Braak VI) (A). Los cortes adyacentes se inmunotiñeron para una patología por tau (B, AT8) y para una patología por amiloide beta (C, 4G8).

La Figura 2 muestra una comparación entre la ARG mostrada en la Fig. 1 (A) y cortes cerebrales humanos con AD adyacentes incubados con [18F]Co. No. 1 (7,4 kBq / 500 pl / corte) en presencia de compuesto de referencia auténtico Co. No. 1 (B) o T808 (C) a 1 pmol/l.

La Figura 3 muestra la incubación con [3H]Co. No. 110 nM sobre tejido (estriado) de los núcleos basales (A), seguida por tratamiento con Co. No. 110 pM (B) o THK5351 10 pM (C). La Figura 3D muestra la incubación con [3H]Co. No.

1 10 nM sobre tejido humano con AD (corteza parietal-temporal, fase de Braak VI) que tiene patología por tau y amiloide confirmada mediante IHC según se muestra en la Figura 4. La Figura 3E muestra la incubación con [3H]Co. No. 110 nM sobre tejido humano con AD (circunvolución lateral-occipital, fase de Braak 0), con patología por amiloide confirmada pero no patología por tau mediante IHC según se muestra en la Figura 5. La Figura 3F muestra la incubación con [3H]THK5351 10 nM sobre tejido de núcleos basales humanos, y el tratamiento con Co. No. 110 pM (G) o THK5351 10 pM (H). La Figura 3I muestra la incubación con [3H]THK-5351 sobre tejido humano con AD (corteza parietal-temporal, fase de Braak VI) con patología por tau y amiloide confirmada según se muestra en la Figura 4. La Figura 3J muestra la incubación con [3H]THK5351 10 nM sobre tejido humano con AD (circunvolución lateral-occipital, fase de Braak 0) con patología por amiloide confirmada pero no patología por tau según se muestra en la Figura 5. La Figura 3K muestra la incubación con [3H]-AV-45 3 nM sobre núcleos basales humanos (K), conteniendo el susodicho tejido humano con AD patología tanto por amiloide como por tau (L) y conteniendo el susodicho tejido humano con AD patología por amiloide, pero no por tau (M).

La Figura 4 muestra ICH de 4G8 y AT8 de patología por amiloide y tau en cortes cerebrales con AD procedentes de la región de la corteza parietal-temporal del mismo paciente que los cortes usados para las imágenes de la Figura 3.

La Figura 5 muestra un corte cerebral con AD (circunvolución lateral-occipital, mujer) respecto al usado en la Figura 3E y la Figura 3J. La presencia de placas de amiloide p (A, B) y ausencia de ovillos de tau (C, D) se confirmó con inmunohistoquímica usando los anticuerpos 4G8 y AT8, respectivamente.

La Figura 6 muestra la confirmación por IHC de la expresión de MAO-B (izquierda) y MAO-A (derecha) en el tejido de núcleos basales humanos usado para la unión in vitro mostrada en la Figura 3.

La Figura 7 muestra la incubación con 0,2 mCi/ml de [18F]Co. No. 1 sobre cortes de tejido humano con AD (corteza parietotemporal, fase de Braak VI) (A), y tratamiento con clorgilina 10 pM (B), deprenilo 10 pM (C) y Co. No. 110 pM (D).

La Figura 8 muestra la IHC de AT8 y 4G8 de patología por tau y amiloide, respectivamente, en cortes cerebrales con AD (corteza parietal-temporal, fase de Braak VI) adyacentes con respecto a las mencionadas en la Figura 7.

La Figura 9 muestra las curvas de tiempo-actividad por pPET expresadas como valores de absorción estandarizados (SUV) para [18F]Co. No. 1 y la Figura 10 muestra las curvas de tiempo-actividad por pPET para [18F]T807 (C) en todo el cerebro de tres ratas Wistar hembra. Se muestran tres estudios separados: un escaneo de referencia (solo trazador), un experimento anterior al tratamiento (Co. No. 1 o T807 frío, 10 mg/kg inyectados subcutáneamente 60 min. antes de la inyección del radiotrazador), y un estudio de seguimiento (Co. No. 1 o T807 frío, 1 mg/kg inyectado intravenosamente 30 min. después de la inyección del radiotrazador).

La Figura 11 muestra curvas de % de SUVmáx de curvas de tiempo-actividad por PET en animales pequeños de [18F]Co. No. 1 y [18F]T807 en todo el cerebro de una rata Wistar.

La Figura 12 muestra curvas de tiempo-actividad por pPET para [18F]Co. No. 1 y la Figura 13 muestra curvas de tiempo-actividad por pPET para [18F]T807 en el cerebro entero, el cuerpo calloso, el cerebelo, la corteza entorrinal y el cráneo de un mono Rhesus.

La Figura 14 muestra curvas de % de SUVmáx de curvas de tiempo-actividad por pPET en animales pequeños de [18F]Co. No. 1 y [18F]T807 en todo el cerebro de un mono Rhesus.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En una realización, el compuesto de Fórmula (I) es en particular un compuesto de Fórmula (I-a)

en la que al menos un átomo es radiactivo, y en la que R1 es F y R3 es H, o R1 es H y R3 es F; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

Más en particular, el compuesto de Fórmula (I) es un compuesto de Fórmula (I'-a)

R1 es 18F y R3 es H, o R1 es H y R3 es 18F;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

En otra realización, el compuesto de Fórmula (I) es en particular un compuesto de Fórmula (I-b)

en la que

al menos un átomo es radiactivo, y en la que R2 se selecciona del grupo que consiste en -alquilC1-4-F, -OalquilC1-4-F, y -NR4-alquilC1-4-F, en donde R4 es H o metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos

Más en particular, el compuesto de Fórmula (I) es un compuesto de Fórmula (I'-b)

en la que

R2 se selecciona del grupo que consiste en -alquilC1-4-"F, -OalquilC1-4-18F, y -NR4-alquilC1-4-18F, en donde R4 es H o metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

En una realización, el compuesto de Fórmula (I), en particular de Fórmula (I'), es

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

En otra realización particular, el compuesto precursor para la síntesis del compuesto de Fórmula (I) o (I'), según se definen previamente, es en particular un compuesto de Fórmula (P-1)

que

R2 es metilo, y bien R1 se selecciona del grupo que consiste en Br, -NO², -[N(CH3)3]+ y 4-Me-Ph-SO2-O-, y R3 es H, o bien R1 es H y R3 se selecciona del grupo que consiste en Br, -NO², -[N(c H3)3]+ y 4-Me-Ph-SO2-O-; o

R1 y R3 son ambos H, y R2 se selecciona del grupo que consiste en -alquilC1-4-OH, -OalquilC1-4-OH y -NR4-alquilC1-4-OH, en donde R4 es H o metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

La invención también se refiere al material de referencia correspondiente al compuesto 1 no radiomarcado, correspondiente al [19F]-compuesto

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

En otra realización particular, el compuesto de Fórmula [19F]-(I) es en particular un compuesto de Fórmula [19F]-(I-a)

en la que

R1 es F y R3 es H, o R1 es H y R3 es F;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

En otra realización particular, el compuesto de Fórmula [19F]-(I) es en particular un compuesto de Fórmula (I-b)

en la que

R2 se selecciona del grupo que consiste en -alquilC1-4-F, -OalquilC1-4-F y -NR4-alquilC1-4-F, en donde R4 es H o metilo; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

[19F]-Co. No. 1 ha mostrado una potente unión (pIC508,24) a agregados de tau humanos extraídos en un ensayo de desplazamiento de radiomarcador usando un análogo de tritio elaborado internamente del compuesto T-808 (T-808 es desarrollado por Siemens, véase, por ejemplo, J. Alzheimers Dis. 2014, 38, 171-184), y que se denomina en la presente [3H]-T808. Además, Co. No. 1 muestra una unión débil a agregados de amiloide beta humanos extraídos (pIC505,18) en un ensayo de desplazamiento de radiomarcador usando un análogo elaborado internamente de florbetapir (también conocido como Amyvid® de Eli Lilly y Co., o AV-45, véase, por ejemplo, J. Nucí. Med. 2010, 51, 913-920), y que se denomina en la presente [3H]-AV-45. Una descripción de los protocolos se proporciona en la presente más adelante.

[3H]-T808 se obtuvo al someter una solución del precursor bromado (1 eq.) en metanol a tritiación catalítica sobre paladio sobre carbono (5%) en presencia de diisopropiletilamina (5 eq.) a temperatura ambiente. El precursor bromado se obtuvo mediante la bromación de T808 con N-bromosuccinimida (1 eq.) en acetonitrilo.

[3H]-AV-45 se obtuvo mediante intercambio de tritio catalizado por iridio (catalizador de Crabtree) de AV-45 disuelto en diclorometano.

[3H]-T808 [■'HJ-AV-45

Como ya se mencionó, el compuesto de Fórmula (I), en particular el compuesto de Fórmula (I'), y composiciones que comprenden el compuesto de Fórmula (I), en particular el compuesto de Fórmula (I'), se pueden usar para obtener imágenes de un tejido, o un sujeto, in vitro o in vivo. En particular, la invención se refiere a un método para obtener imágenes de o cuantificar agregados de tau en un tejido, o un sujeto, in vitro o in vivo.

En particular, el método de obtención de imágenes de agregados de tau comprende proveer a un sujeto, en particular un paciente, de una cantidad detectable de un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I').

Además, la invención se refiere a un método para obtener imágenes de depósitos de agregados de tau que comprende las etapas de proveer a un sujeto de una cantidad detectable de un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), dejar un tiempo suficiente para que el compuesto de Fórmula (I), en particular el compuesto de Fórmula (I'), se asocie con depósitos de agregados de tau, y detectar el compuesto asociado con depósitos de agregados de tau.

Cuando el método se realiza in vivo, el compuesto de Fórmula (I), en particular el compuesto de Fórmula (I'), se puede administrar intravenosamente, por ejemplo, mediante inyección con una jeringa o por medio de un conducto intravenoso periférico, tal como un catéter corto. El compuesto de Fórmula (I), en particular el compuesto de Fórmula (I'), o una solución estéril que comprende un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), se puede administrar en particular mediante administración intravenosa en el brazo, en una vena identificable, en particular en el dorso de la mano o en la vena cubital mediana en el codo.

Así, en una realización particular, la invención se refiere a un método para obtener imágenes de un sujeto, que comprende la administración intravenosa de un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), según se definen en la presente, o una composición, en particular, una formulación estéril, que comprende un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), al sujeto, y obtener imágenes del sujeto con un sistema de obtención de imágenes por tomografía de emisión positrónica.

En una realización adicional, la invención se refiere a un método para cuantificar depósitos de agregación de tau en un sujeto, que comprende la administración intravenosa de un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), o una composición que comprende un compuesto de Fórmula (I), en particular un compuesto de Fórmula (I'), al sujeto, y obtener imágenes con un sistema de obtención de imágenes por tomografía de emisión positrónica.

El compuesto se proporciona a un sujeto en una cantidad detectable y, después de que haya pasado un tiempo suficiente para que el compuesto se asocie con los depósitos de agregación de tau, el compuesto marcado se detecta no invasivamente.

DEFINICIONES

Según se usa en la presente, el término "composición" está destinado a abarcar un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que resulte, directamente o indirectamente, de combinaciones de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas. El termino "alquilC1-4" indicará un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene 1, 2, 3 o 4 átomos de carbono, respectivamente p. ej. metilo, etilo, 1 -propilo, 2-propilo, butilo y similares.

Las sales por adición de los compuestos según la invención también pretender estar abarcadas dentro del alcance de esta invención.

Sales aceptables de los compuestos de la invención son aquellas en las que el contraión es farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, sales de ácidos y bases que no sean farmacéuticamente aceptable también pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable. Todas las sales, ya sean farmacéuticamente aceptables o no, se incluyen dentro del ámbito de la presente invención. Se define que las sales farmacéuticamente aceptables comprenden las formas de sal por adición de ácido atóxicas terapéuticamente activas que los compuestos según la invención son capaces de formar. Dichas sales se pueden obtener al tratar la forma de base de los compuestos según la invención con ácidos apropiados, por ejemplo ácidos inorgánicos, por ejemplo un ácido halohídrico, en particular ácido clorhídrico, ácidos bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico y ácido fosfórico; ácidos orgánicos, por ejemplo ácido acético, ácido hidroxiacético, ácido propanoico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido ciclámico, ácido salicílico, ácido p-aminosalicílico y ácido pamoico.

A la inversa, dichas formas salinas se pueden convertir en la forma de base libre mediante el tratamiento con una base apropiada.

Además, algunos de los compuestos de la presente invención pueden formar solvatos con agua (es decir, hidratos) o disolventes orgánicos comunes, y estos solvatos también están destinados a estar abarcados dentro del alcance de esta invención.

El término "sujeto", según se usa en la presente, se refiere a un ser humano, que es o ha sido el objeto de tratamiento, observación o experimento. A menos que se indique otra cosa, "sujeto" incluye seres humanos asintomáticos, seres humanos presintomáticos y pacientes humanos.

PREPARACIÓN

Los compuestos según la invención se pueden preparar generalmente mediante una sucesión de etapas, cada una de las cuales es conocida por los expertos. En particular, los compuestos se pueden preparar según los siguientes métodos de síntesis.

Los compuestos de Fórmula [19F]-(I-a) o [19F]-(I-b) que se divulgan en la presente se pueden preparar mediante una reacción de 6-bromoisoquinolina con un compuesto de 2-aminopiridina apropiado de Fórmula (II-a) en la que todas las variables son como se describen en la presente para [19F]-(I)

bajo condiciones de aminación de Buchwald-Hartwig, en donde todas las variables son como se describen en la presente para [19F]-(I) o, alternativamente, mediante una reacción de un compuesto de Fórmula (II-a') en la que R1 es -NO²y R3 es H, o R1 es H y R3 es -NO², con una fuente de fluoruro, tal como KF, en un disolvente inerte a la reacción, tal como DMSO, bajo condiciones térmicas,

o, alternativamente, mediante una reacción de isoquinolin-6-amina con un compuesto de 2-cloropiridina apropiado de Fórmula (II-b) en la que todas las variables son como se describen en la presente para [19F]-(I)

bajo condiciones de aminación de Buchwald-Hartwig.

El compuesto de Fórmula (II-a') se puede preparar, por ejemplo, mediante la reacción de ¡soquinolin-6-amina con 6-bromo-3-met¡l-2-n¡trop¡rid¡na o 2-bromo-5-met¡l-4-n¡trop¡r¡d¡na bajo condiciones de aminación de Buchwald-Hartwig.

APLICACIONES

Los compuestos según la presente invención encuentran diversas aplicaciones para obtener imágenes de tejidos, o un sujeto, tanto in vitro como in vivo. Así, a modo de ejemplo, se pueden usar para cartografiar la distribución diferencial de depósitos de agregados de tau en sujetos de diferente edad y sexo. Además, permiten explorar la distribución diferencial de depósitos de agregados de tau en sujetos afectados por diferentes enfermedades o trastornos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, pero también otras enfermedades provocadas por depósitos de agregados de tau, es decir, otras tauopatías.

Así, un exceso de distribución puede ser provechoso en el diagnóstico, el hallazgo de casos, la estratificación de poblaciones de sujetos y el control de la progresión de enfermedades en sujetos individuales, particularmente cuando estén disponibles tratamientos, p. ej. anticuerpos, anti-tau. Puesto que el radioligando se administra en cantidades vestigiales, es decir en cantidades detectables para la obtención de imágenes por PET, no se puede atribuir un efecto terapéutico a la administración de los radioligandos según la invención.

PARTE EXPERIMENTAL

QUÍMICA

Según se usa en la presente, el término "ACN o MeCN" significa acetonitrilo, "ac." significa acuoso, "tBuOH" significa terc-butanol, "DCM" significa diclorometano, "DIPE" significa éter diisopropílico, "DIPEA" significa N,N-diisopropiletilamina, "DMF" significa N,N-dimetilformamida, "DMSO" significa dimetilsulfóxido, "Et²O" significa éter dietílico, "EtOAc" significa acetato de etilo, "h" significa horas, "HPLC" significa cromatografía de líquidos de alta resolución, "LCMS" significa cromatografía de líquidos/espectrometría de masas, "MeOH" significa metanol, "min." significa minutos, "p.f." significa punto de fusión, "org." significa orgánico, "Pd2(dba)3" significa tr¡s(d¡benc¡l¡denacetona)d¡palad¡o(0),"prep." significa preparativa, "mr/MR" significa mezcla de reacción, "ta/TA" significa temperatura ambiente", "Rt" significa tiempo de retención (en minutos), "sat." significa saturado, "sol." significa solución, "TFA" significa ácido trifluoroacético, "THF" significa tetrahidrofurano, "XantPhos" significa 4,5-bis(d¡fen¡lfosfino)-9,9-d¡met¡lxanteno.

La cromatografía en capa fina (TLC) se llevó a cabo sobre placas de gel de sílice 60 F254 (Merck) usando disolventes de calidad para reactivos. La cromatografía en columna abierta se realizó sobre gel de sílice, malla 230-400 de tamaño de partícula y un tamaño de poro de 60 Á (Merck) bajo técnicas estándar. La cromatografía en columna de desarrollo rápido automatizada se realizó usando cartuchos desechables listos para conectar adquiridos de Grace (cartuchos GraceResolv™) o Teledyne ISCO (cartuchos RediSep®), sobre gel de sílice irregular, tamaño de partícula 35-70 pm en un aparato ISCO CombiFlash o Biotage Isolera™ Spektra.

Resonancia magnética nuclear (NMR): Para un número de compuestos, los espectros de 1H NMR se registraron en un espectrómeto bien Bruker Ultrashield AV300, bien Bruker d Px 360MHz n Mr o bien Bruker Avance III 400MHz NMR con secuencias pulsátiles estándar, que funcionan a 300 MHz, 360 MHz y 400 MHz, respectivamente. Las muestras se disolvieron en DMSO-afe o CDCl3 y se transfirieron en tubos de NMr de 5 mm para la medida. Los desplazamientos químicos (5) se presentan en partes por millón (ppm) con respecto al tetrametilsilano (TMS), que se usó como patrón interno.

Las purificaciones por HPLC se llevaron a cabo en un sistema semipreparativo GILSON, que funcionaba mediante el programa Trilution, equipado con una columna Phenomenex Gemini C18100A (100 mm de largo x 30 mm de diámetro interno; partículas de 5 pm) a TA°C, con un caudal de 40 ml/min usando una elución en gradiente en 20 min. según se indica en los protocolos sintéticos. El volumen de inyección era 8000 pl. La frecuencia de adquisición se fijó a 284 nm para el detector doble de UV.

Varios métodos para preparar los compuestos de esta invención se ilustran en los siguientes ejemplos, que están destinados a ilustrar pero no a limitar el alcance de la presente invención. A menos que se apunte otra cosa, todas las materias primas se obtuvieron a partir de proveedores comerciales y se usaron sin purificación adicional.

A. SÍNTESIS DE PRODUCTOS INTERMEDIOS

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 1

Se añadió tetrametilestaño (0,736 ml, 5,309 mmol) a una mezcla de 5-bromo-4-fluoropiridin-2-amina (0,338 g, 1,77 mmol, CAS 944401-69-8), cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II) (0,062 g, 0,0885 mmol) y LiCl (0,300 g, 7,078 mmol) en 10 ml de DMF. Esta mezcla se cerró herméticamente en un tubo después de desgasificar con nitrógeno. A continuación, la mezcla se agitó a 120°C durante 18 horas, después de lo cual se diluyó con agua. Posteriormente, se añadió una solución acuosa saturada de KF y la capa ac. se extrajo con EtOAc. Las capas org. combinadas se secaron (MgSO4), se filtraron y los disolventes se evaporaron a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; DCM/MeOH, de 100/0 a 95/5). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío proporcionando el producto intermedio 1 (0,190 g, 79%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 2

Método 1: Se añadieron 2-bromo-5-metil-4-nitropiridina (23,0 g, 105,9 mmol), Xantphos (2,45 g, 4,24 mmol), Pd2(dba)3 (1,94 g, 2,12 mmol), tBuOK (16,6 g, 148,3 mmol) bajo nitrógeno a una solución agitada de 6-aminoisoquinolina (18,3 g, 127,1 mmol) en tolueno (400 ml). Se burbujeó nitrógeno a través de la mezcla durante 5 min, y a continuación el vial se cerró herméticamente y se calentó a 100°C durante 2 h. La mezcla se filtró, y la torta filtrante se lavó con EtOAc hasta que se extraía todo el producto. Se añadió agua al filtrado y la capa org. se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró. El residuo se recogió en agua, se trituró durante 1 h, se filtró y se secó a vacío a 55°C. El solido pardo resultante (disuelto en MeOH a pH 4) se purificó a través de HPLC prep. (fase estacionaria: RP XBridge Prep C18 OBD-10^m, 50 x 150 mm, fase móvil: solución de NH4OAc al 0,5% en agua CH³CN al 10%, MeOH). Las fracciones puras se combinaron y el componente orgánico del eluyente se evaporó. Se formaba un precipitado rojo que se filtró, se lavó con agua y se secó. El precipitado resultante se agitó en DCM/MeOH/NaOH 1 N (2 l/0,2 l/1 l) hasta que se disolvía todo, y la capa org. se separó. La capa ac. se extrajo con DCM. Las capas org. combinadas se secaron (MgSO4), se filtraron y se evaporaron. El residuo se trituró en una mezcla bifásica de éter y agua, se filtró y se secó a vacío durante 2 días a 50°C y 4 h en un liofilizador a ta para dar el producto intermedio 2 como cristales de color naranja (6,11 g, 18%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 2,40 (s, 3 H) 7,50 (s, 1 H) 7,62 - 7,71 (m, 2 H) 8,01 (d, J=9,0 Hz, 1 H) 8,36 (d, J=5,7 Hz, 1 H) 8,45 (s, 2 H) 9,09 (s, 1 H) 9,97 (s, 1H)

Método 2: Se añadieron 2-bromo-5-metil-4-nitropiridina (11,47 g, 52,85 mmol), Xantphos (0,611 g, 1,057 mmol), Pd2(dba)3 (0,484 g, 0,529 mmol) y tBuOK (8,30 g, 74,00 mmol) a una solución agitada de 6-aminoisoquinolina (7,62 g, 52,85 mmol) en 200 ml de tolueno. Se burbujeó nitrógeno a través de la mezcla durante 5 min, y a continuación el vial se cerró herméticamente y se calentó a 100°C durante 2 h, y de nuevo durante 3 h a 110°C. Se añadió EtOAc a la mezcla, después de lo cual se agitó durante 30 min. Posteriormente, la mezcla se filtró sobre dicalite, y la torta filtrante se lavó con EtOAc hasta que todo el producto se extraía. Se añadió agua al filtrado y la capa org. se separó. La capa ac. se extrajo con EtOAc hasta que no quedaba producto (control por LCMS). Las capas org. combinadas se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. El residuo se recogió en agua/DIPE, se trituró durante la noche, se filtró y se secó a vacío a 55°C dando el producto intermedio 2 (10,5 g, 71%, puro al 57%), que se usó como tal para la siguiente etapa de reacción.

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 3

Se añadió trimetilboroxina (0,256 ml, 1,83 mmol) a una solución agitada de 5-bromo-6-fluoropiridin-2-amina (0,291 g, 1,52 mmol, CAS 944401-65-4), tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) (0,176 g, 0,152 mmol) y Cs2CO3 (0,993 g, 3,047 mmol) en 1,4-dioxano (5,3 ml) mientras se burbujeaba nitrógeno. La reacción se agitó a 105°C durante 16 h bajo nitrógeno. Se añadieron agua y EtOAc. Las fases se separaron y la fase orgánica se secó sobre MgSO⁴, se filtró y se evaporó. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en heptano, de 0/100 a 50/50). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío para dar el producto intermedio 3 como un sólido amarillo (0,151 g, 79%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 4

Se añadió gota a gota Deoxo-Fluor® (50% en tolueno, 1,67 ml, 3,807 mmol) a una solución de 2-cloro-5-(2-fluoroetil)piridina (0,400 g, 2,538 mmol, CAS 117528-28-6) en DCM seco (15 ml) a 0°C. Después de 1 min, el baño frío se retiró y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se diluyó con NaHCO³ac. sat. y se extrajo con DCM. La capa orgánica se lavó con agua, se secó con (MgSO4), se filtró y los disolventes se evaporaron a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en heptano de 0/100 a 70/30). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío dando el producto intermedio 4 (0,193 g, 45%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 5

Se añadió NaOH (0,064 g, 1,599 mmol) a una mezcla de ácido [(6-cloropiridin-3-il)oxi]acético (0,300 g, 1,599 mmol, CAS 234109-28-5) en una mezcla de CH³CN (4 ml) y agua (4 ml). La mezcla se calentó a 85°C durante 1 h. El disolvente se concentró a vacío proporcionando el producto intermedio 5 (335 mg, 95%) como un sólido blanco, que se usó como tal en la siguiente etapa.

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 6

Se añadió Selectfluor® (1,116 g, 3,15 mmol) a una solución del producto intermedio 5 (0,314 g, 1,5 mmol) en una mezcla de agua (7,5 ml) y CH³CN (7,5 ml) previamente desgasificada. Se añadió hexahidrato de tris(2,2'-bipiridil)diclororrutenio(II) (0,056 g, 0,075 mmol). La reacción se irradió mediante una lámpara suspendida de luz visible de 500 W, colocada a 30 cm de la reacción, durante 1 h. Después de apagar la luz, se vertieron agua y éter dietílico sobre el medio de reacción. Las dos fases se separaron y la acuosa se extrajo con Et²O. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y el disolvente se evaporó bajo presión reducida. El producto en bruto se filtró sobre gel de sílice con Et²O como eluyente y se concentró a vacío para dar el producto intermedio 6 como un sólido oleoso beige (0,167 g, 54%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 7

Una solución agitada de 5-amino-2-clorop¡r¡dina (1,00 g, 7,778 mmol) en THF (27 ml) se enfrió hasta 0°C y a continuación se añadieron a la solución cloruro de 2-nitrobencenosulfonilo (1,72 g, 7,778 mmol) y piridina (0,942 ml, 11,668 mmol). La mezcla resultante se dejó calentar hasta ta y se agitó durante 3 horas. Se añadieron a 0°C cloruro de 2-nitrobencenosulfonilo (0,52 g, 2,334 mmol) y piridina (0,314 ml, 3,889 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante la noche. A continuación, se añadió agua a la mezcla y la capa ac. se extrajo con EtoAc. El extracto se lavó con NaHCO3 ac. saturado y salmuera. La capa org. se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en heptano, de 0/100 a 10/90). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío para dar el producto intermedio 7 (2,22 g, 91%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 8

El producto intermedio 7 (1,1 g, 3,506 mmol) y 4-metilbencenosulfonato de 2-fluoroetilo (0,918 g, 4,208 mmol, CAS 383-50-6) se disolvieron en DMF (10,6 ml). Se añadió Cs2CO3 (1,942 g, 5,961 mmol) bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla se calentó hasta 85°C durante la noche. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la suspensión de color pardo oscuro se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc. La capa org. se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El producto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en heptano, de 0/100 a 20/80). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío proporcionando el producto intermedio 8 (0,687 g, 54%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 9

El producto intermedio 7 (0,700 g 2,231 mmol) y 4-metilbencenosulfonato de 3-fluoropropilo (0,674 g, 2,901 mmol, CAS 312-68-5) se disolvieron en DMF (6,7 ml). Se añadió Cs2CO3 (1,45 g, 4,463 mmol) y la mezcla se calentó hasta 85°C durante la noche bajo atmósfera de nitrógeno. Se añadieron 4-metilbencenosulfonato de 3-fluoropropilo (0,363 g, 1,562 mmol) y Cs2CO3 (0,727 g, 2,231 mmol) y la mezcla se calentó a 85°C durante la noche. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la suspensión de color pardo claro se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El producto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en heptano, de 0/100 a 15/85). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío dando el producto intermedio 9 (0,395 g, 42%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 10

Se añadieron a 0°C LiOH.hbO (0,491 g, 11,46 mmol) y 2-mercaptoetanol (0,164 ml, 2,33 mmol) a una solución agitada del producto intermedio 8 (0,687 g 1,91 mmol) en 11,6 ml de DMF. La mezcla de reacción se agitó a ta durante 2 horas. Se añadió agua y la mezcla se extrajo con EtOAc. El extracto se lavó con agua y se secó sobre MgSO4. La concentración bajo presión reducida daba residuos oleosos. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (gel de sílice, EtOAc en heptano, de 0/100 a 30/70). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío para dar el producto intermedio 10 como un aceite amarillo (0,276 g, 83%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 11

El producto intermedio 10 (0,200 g, 1,145 mmol) se añadió a una solución agitada de NaH (dispersión al 60% en aceite mineral, 0,069 g, 1,718 mmol) en DMF (9,2 ml) a 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de agitarse durante 30 min. a esta temperatura, se añadió CH³I (0,134 ml, 1,833 mmol) y la agitación se continuó durante la noche a ta. Se añadió NaH (dispersión al 60% en aceite mineral, 0,032 g, 0,802 mmol) a 0°C y la mezcla se agitó 30 min. Se añadió CH³I (0,032 ml, 0,573 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 2 h. La mezcla se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc. La capa org. se secó (MgSO4), se filtró y se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (EtOAc en heptano de 0/100 a 15/85). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío para dar el producto intermedio 11 (0,137 g, 63%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 12

Se añadió NaH (dispersión al 60% en aceite mineral, 0,178 g, 4,46 mmol) a una solución agitada de (6-cloropiridin-3-il)carbamato de ferc-butilo (1,36 g, puro al 75%, 4,46 mmol, CAS 171178-45-3) en DMF seca (7 ml) a 0°C bajo N². La mezcla se agitó a 0°C durante 15 min. A continuación, se añadió 1-bromo-3-fluoropropano (0,491 ml, 5,353 mmol) a 0°C y la mezcla se dejó calentar hasta ta y se agitó durante la noche. Se añadieron más 1-bromo-3-fluoropropano (0,327 ml, 3,568 mmol) y NaH (dispersión al 60% en aceite mineral, 0,178 g, 4,46 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 4 h. Se añadieron 1-bromo-3-fluoropropano (0,818 ml, 8,921 mmol) y NaH (dispersión al 60% en aceite mineral, 0,178 g, 4,46 mmol) adicionales y la mezcla se agitó a ta durante la noche. La mezcla de reacción se recogió con DCM y se lavó con una solución saturada de NH4Cl. La capa orgánica se separó, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en heptano 40% a 100%). Las fracciones deseadas se recuperaron y los disolventes se evaporaron a vacío para dar el producto intermedio 12 como un aceite incoloro (1,71 g, puro al 75%, rendimiento cuantitativo).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 13

Método 1: Se añadió TFA (4 ml, 53,3 mmol) a una mezcla del producto intermedio 12 (1,71 g, 5,33 mmol, puro al 75%) en 20 ml de DCM a 0°C y a continuación la mezcla se agitó a ta durante 150 min. Posteriormente, la mezcla se diluyó con DCM y se lavó con una sol. ac. sat. de NaHCO3. La capa org. se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar el producto intermedio 13 (1,91 g, puro al 53%, cuantitativo), que se usó como tal.

Método 2: Se añadieron a 0°C LDH.H²O (0,239 g, 5,58 mmol) y 2-mercaptoetanol (0,798 ml, 1,134 mmol) a una solución agitada del producto intermedio 7 (0,395 g, 0,93 mmol) en DMF (5,6 ml). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 2 h, después de lo cual se extrajeron con EtOAc. Las capas org. combinadas se lavaron con agua, se secaron sobre MgSO4 y se filtraron. La concentración bajo presión reducida daba un residuo oleoso que se purificó mediante cromatografía de desarrollo rápido (gel de sílice, EtOAc en heptano, de 0/100 a 30/70). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío para dar el producto intermedio 13 como un aceite amarillo (0,168 g, 96%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 14

Método 1: Se añadió formaldehído (37% en agua, 2,185 ml, 29,162 mmol) a una solución del producto intermedio 13 (obtenido a partir del método 1, 1,91 g, 9,721 mmol, puro al 53%) en una mezcla de ácido acético (0,835 ml) y MeOH (20 ml). A continuación, se añadió NaBHaCN (1,83 g, 29,162 mmol) en porciones. La mezcla se agitó a ta durante la noche (15 h). Se añadió una sol. sat. de NaHCO3 y la mezcla se extrajo con EtOAc. Las capas org. se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en heptano, de 0/100 a 80/20). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío para dar el producto intermedio 14 (0,687 g, 63%) como un aceite incoloro.

Método 2: Se añadió el producto intermedio 13 (obtenido a partir del método 2, 0,172 g, 0,912 mmol) a una solución agitada de NaH (dispersión al 60% en aceite mineral, 0,055 g, 1,368 mmol) en DMF (7,3 ml) a 0°C bajo atmósfera de nitrógeno. Después de agitarse durante 30 min. a esta temperatura, se añadió CH³I (0,107 ml, 1,459 mmol) y se agitó durante la noche a ta. La mezcla se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se filtró, se secó y se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (EtOAc en heptano, de 0/100 a 10/90). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío para dar el producto intermedio 14 (0,143 g, 77%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 15

Se disolvieron 2-cloro-5-hidroxipiridina (0,300 g 2,316 mmol) y 4-metilbencenosulfonato de 2-fluoroetilo (0,505 g, 2,316 mmol, CAS 383-50-6) en DMF (7 ml). Se añadió Cs2CO3 (1,132 g, 3,474 mmol) bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla se calentó hasta 85°C durante 5 h. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la suspensión de color pardo oscuro se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc. Las capas org. se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El producto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en heptano de 0/100 a 35/65). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío proporcionando el producto intermedio 15 (0,374 g, 92%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 16

Se disolvieron 2-cloro-5-hidroxipiridina (0,300 g, 2,316 mmol) y 4-metilbencenosulfonato de 3-fluoropropilo (0,538 g, 2,316 mmol, CAS 312-68-5) en DMF (7 ml). Se añadió Cs2CO3 (1,132 g, 3,474 mmol) bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla se calentó hasta 85°C durante 5 h. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la suspensión de color pardo oscuro se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El producto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en heptano, de 0/100 a 30/70). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío proporcionando el producto intermedio 16 (0,408 g, 93%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 17

Se añadieron K³PO⁴(1,70 g, 7,99 mmol), Pd2(dba)3 (0,152 g, 0,166 mmol) y Xantphos (0,161 mg, 0,277 mmol) a una solución de 2,5-dibromopiridina (0,738 g, 3,052 mmol, CAS 624-28-2) en THF seco (20 ml) mientras se burbujeaba nitrógeno a través de la mezcla. Después de 10 min, se añadió 6-aminoisoquinolina (0,400 g, 2,774 mmol, CAS 23687 26-5) y la mezcla se agitó a ta durante 10 min. A continuación, la mezcla se calentó a 100°C durante 16 h. Después de enfriar hasta ta, la mezcla se lavó con NaHCO3 ac. sat. y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en heptano de 0/100 a 75/25). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío proporcionando el producto intermedio 17 (0,680 g, puro al 80%, 65% de rendimiento).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 18

mezcla de isómero E (principal) y Z (secundario)

El producto intermedio 17 (0,680 g, 1,812 mmol) en 1,4-dioxano (10,2 ml) se desgasificó durante 10 min. Se añadieron 2-[2-etoxivinil]-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (0,538 g, 2,719 mmol, CAS 1201905-61-4, preparado según el procedimiento descrito en el documento WO2012010538, mezcla 2:1 de E y Z), Pd(OAc)²(0,020 g 0,0906 mmol), X-Phos (0,095 g, 0,199 mmol) y Cs2CO3 (0,886 g, 2,719 mmol) seguido por agua desgasificada (1,1 ml). La mezcla se desgasificó durante otros 10 min. y se agitó a 80°C durante 6 h. A continuación, la mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc. La fase org. se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en heptano de 0/100 a 100/0). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío proporcionando el producto intermedio 18 (0,510 g, 91%, mezcla de E y Z).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 19

Se añadió HCl (2 M en agua, 3,939 ml, 7,877 mmol) a una mezcla del producto intermedio 18 (0,510 g, 1,75 mmol) en THF (5,3 ml). La mezcla se agitó a 60°C durante la noche. Se añadió NaHCO3 sat. hasta pH 7. La mezcla se extrajo con EtOAc. La capa org. se separó, se secó (MgSO4), se filtró y los disolventes se evaporaron a vacío proporcionando el producto intermedio 19. El producto se usó como tal en la siguiente etapa (0,378 g, 82%).

PREPARACIÓN DEL PRODUCTO INTERMEDIO 20

Se añadió NaBH (0,054 g, 1,436 mmol) a una solución del producto intermedio 19 en MeOH (4,5 ml) a 0°C. La mezcla se agitó a ta durante 30 min. Se añadió agua y la mezcla se extrajo con EtOAc. La capa org. se separó, se secó (MgSO4), se filtró y los disolventes se evaporaron a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; MeOH en DCM de 0/100 a 10/90). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío proporcionando el producto intermedio 20 (0,135 g, 35%).

B. PREPARACIÓN DE COMPUESTOS DE FÓRMULA [19F](I)

PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 1

Método 1: Se añadieron K³PO⁴(0,872 g, 4,11 mmol), Pd²(dba)³(0,078 g, 0,0856 mmol) y Xantphos (0,083 g, 0,143 mmol) a una solución de 6-bromoisoquinolina (0,327 g, 1,57 mmol) en DMF seca (15 ml) mientras se burbujeaba nitrógeno a través de la mezcla. Después de 10 min, se añadió el producto intermedio 1 (0,180 g, 1,427 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 10 min. A continuación, la mezcla se calentó a 100°C durante 16 h. Después de enfriar hasta ta, la mezcla se lavó con NaHCO3 sat. y se extrajo con EtOAc. La capa org. se secó sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; DCM/MeOH, de 100/0 a 95/5). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío. El producto se purificó adicionalmente mediante una fase inversa de 70% de H²O (NH⁴HCO³25 mM) - 30% de MeCN-MeOH a 27% de H²O (NH⁴HCO³25 mM) - 73% de MeCN-MeOH. Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío. El producto se trituró con DIPE para dar el compuesto 1 como un sólido blanco (0,150 g, 41%).

Método 2: Se añadió KF (10,2 g, 175,7 mmol) al producto intermedio 2 (obtenido a partir del método 2, 9,85 g, 35,14 mmol) en DMSO (236 ml). La mezcla resultante se agitó durante 16 h a 160°C, después de lo cual la LCMS mostraba una conversión completa. Se añadieron agua y DCM, la mezcla bifásica se removió y a continuación se filtró sobre dicalite®. La capa org. se separó y la capa ac. se extrajo con DCM. Las capas org. combinadas se secaron (MgSO4), se filtraron y se evaporaron hasta sequedad. El residuo pardo rojizo se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido sobre 120 g de gel de sílice usando un gradiente (heptano/EtOAc, 1:0 a 0:1). Las fracciones de producto se evaporaron hasta sequedad proporcionando un sólido pardo. Se realizó una purificación a través de HPLC prep. (fase estacionaria: RP XBridge Prep C18 OBD-10gm, 50 x 150 mm, fase móvil: solución de NH⁴HCO³al 0,25% en agua, MeOH) dando el compuesto 1 como cristales blancos (1,38 g, 15,5%) después de la evaporación del eluyente, la suspensión en agua, la filtración, el lavado con heptano y el secado a vacío. 1H NMR (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 2,17 (s, 3 H) 6,75 (d, J=11,9 Hz, 1 H) 7,62 (d, J=5,7 Hz, 1 H) 7,66 (dd, J=8,9, 2,1 Hz, 1 H) 7,97 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 8,20 (d, J=11,2 Hz, 1 H) 8,33 (d, J=5,7 Hz, 1 H) 8,42 (d, J=1,8 Hz, 1 H) 9,06 (s, 1 H) 9,61 (s, 1 H)

PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 2

Se añadieron K³PO⁴(0,462 g, 2,175 mmol), Pd2(dba)3 (0,041 g, 0,0453 mmol) y Xantphos (0,044 g, 0,0755 mmol) a una solución del producto intermedio 3 (0,100 g, 0,793 mmol) en THF seco mientras se burbujeaba nitrógeno a través de la mezcla. Después de 10 min, se añadió 6-bromoisoquinolina (0,157 g, 0,755 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 10 min. A continuación, la mezcla se calentó a 100°C durante 16 h. Después de enfriar hasta ta, la mezcla se lavó con NaHCO3 ac. sat. y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; DCM/MeOH, 100/0 a 95/5). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío. El residuo se purificó mediante h Pl C preparativa ((HCOOH al 0,1%)/NH4HCO3 25 mM); de 70/30 a 27/73). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío dando el compuesto 2 (0,0238 g, 12%). 1H NMR (300 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 2,24 (s, 3 H) 6,72 - 6,86 (m, 2 H) 7,40 - 7,60 (m, 3 H) 7,89 (d, J=8,7 Hz, 1 H) 7,93 (s an, 1 H) 8,44 (d, J=5,8 Hz, 1 H) 9,10 (s an, 1 H)

PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 3

Se añadieron K³PO⁴(0,300 g, 1,415 mmol), Pd2(dba)3 (0,027 g, 0,0295 mmol) y Xantphos (0,028 g, 0,0491 mmol) a una solución del producto intermedio 4 (0,080 g, 0,491 mmol) en THF seco (5 ml) mientras se burbujeaba nitrógeno a través de la mezcla. Después de 10 min, se añadió isoquinolin-6-amina (0,074 g, 0,516 mmol, CAS 23687-26-5) y la mezcla se agitó a ta durante 10 min. A continuación, la mezcla se calentó a 90°C durante 16 h. Después de enfriar hasta ta, la mezcla se lavó con NaHCO3 sat. y se extrajo con EtOAc. La capa org. se secó sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; MeOH en DCM, de 0/100 a 3/97). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío. El producto se purificó adicionalmente mediante HPLC preparativa ((HCOOH al 0,1%) / ACN: MeOH 1:1); de 95/5 a 63/37). Las fracciones deseadas se recogieron, se concentraron a vacío para dar el compuesto 3 (0,051 g, 38%). 1H NMR (300 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 2,98 (dt, J=24,7, 6,2 Hz, 2 H) 4,64 (dt, J=47,0, 6,3 Hz, 2 H) 6,82 (s an, 1 H) 6,98 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 7,43 - 7,56 (m, 3 H) 7,89 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 7,98 (s, 1 H) 8,22 (s, 1 H) 8,43 (d, J=5,8 Hz, 1 H) 9,10 (s, 1 H).

El compuesto 3 también se puede elaborar alternativamente a partir del producto intermedio 20, por ejemplo, mediante la formación del metanosulfonato o 4-toluenosulfonato correspondiente seguido por desplazamiento con una fuente de fluoruro.

PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 4

Se añadieron K³PO⁴(0,481 g, 2,264 mmol), Pd2(dba)3 (0,043 g, 0,0472 mmol) y Xantphos (0,045 g, 0,0786 mmol) a una solución del producto intermedio 6 (0,127 g, 0,786 mmol) en THF (6 ml) mientras se burbujeaba nitrógeno. Después de 10 min, se añadió isoquinolin-6-amina (0,125 g, 0,865 mmol, CAS 23687-26-5) y la mezcla se agitó a ta durante 10 min. A continuación, la mezcla se calentó a 90°C durante 16 h. Después de enfriar hasta ta, la mezcla se lavó con NaHCO3 sat. y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en heptano de 5/95 a 100/0). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío. El producto se purificó mediante HPLC preparativa ((de 59% de H²O (NH⁴HCO³25 mM) - 41% de MeCN-MeOH a 17% de H²O (NH⁴HCO³25 mM) - 83% de MeCN-MeOH). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío. El producto se trituró con n-pentano para dar el compuesto 4 como un sólido beige (0,075 g, 34%). 1H NMR (300 MHz, CLOROFORMO-d) 5 ppm 5,69 (d, J=54,6 Hz, 2 H) 6,80 (s an, 1 H) 7,00 (d, J=8,9 Hz, 1 H) 7,39 - 7,47 (m, 1 H) 7,54 (d, J=5,8 Hz, 1 H) 7,89 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 7,97 (s, 1 H) 8,22 (d, J=2,1 Hz, 1 H) 8,43 (d, J=5,8 Hz, 1 H) 9,09 (s, 1 H)

PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 5

Se añadieron K³PO⁴(0,294 g, 1,386 mmol), Pd2(dba)3 (0,026 g, 0,0289 mmol) y Xantphos (0,028 g, 0,0481 mmol) a una solución del producto intermedio 10 (0,084 g, 0,481 mmol) en THF (4 ml) mientras se burbujeaba nitrógeno. Después de 10 min, se añadió isoquinolin-6-amina (0,069 g 0,481 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 10 min. A continuación, la mezcla se calentó a 100°C durante 16 h. Se añadieron Pd2(dba)3 (0,026 g, 0,0289 mmol) y Xantphos (0,028 g, 0,0481 mmol) mientras se burbujeaba nitrógeno, y la mezcla se calentó adicionalmente a 100°C durante la noche. Se añadieron Pd2(dba)3 (0,026 g, 0,0289 mmol) y Xantphos (0,028 g, 0,0481 mmol) mientras se burbujeaba nitrógeno, y la mezcla se calentó adicionalmente a 100°C durante la noche. La mezcla se lavó con NaHCO3 ac. sat. y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en DCM de 0/100 a 50/50). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío. El producto se purificó adicionalmente mediante HPLC preparativa (de 75% de [NH⁴HCO³25 mM] - 25% de [ACN: MeOH 1:1] a 38% de [NH⁴HCO³25 mM] - 62% de [ACN: MeOH 1:1]). Las fracciones deseadas se recogieron y el disolvente se evaporó. El producto se trituró con Et²O y se filtró para dar el compuesto 5 (0,042 g, 31%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3,34 - 3,48 (m, 2 H) 4,58 (dt, J=47,6, 4,8 Hz, 2 H) 5,63 (t an, J=5,9 Hz, 1 H) 6,86 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 7,11 (dd, J=8,8, 2,7 Hz, 1 H) 7,47 - 7,57 (m, 2 H) 7,78 (d, J=2,5 Hz, 1 H) 7,87 (d, J=8,9 Hz, 1 H) 8,21 - 8,31 (m, 2 H) 8,96 (s, 1H) 9,12 (s, 1H)

PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 6

Se añadieron K³PO⁴(0,444 g, 2,092 mmol), Pd2(dba)3 (0,040 g, 0,0436 mmol) y Xantphos (0,042 g, 0,0726 mmol) a una solución del producto intermedio 11 (0,137 g, 0,726 mmol) en THF (6 ml) mientras se burbujeaba nitrógeno. Después de 10 min, se añadió isoquinolin-6-amina (0,105 g, 0,726 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 10 min. A continuación, la mezcla se calentó a 100°C durante 16 h. Se añadieron más Pd2(dba)3 (0,026 g, 0,0289 mmol) y Xantphos (0,028 g, 0,0481 mmol) mientras se burbujeaba nitrógeno a través de la mezcla, después de lo cual se calentó adicionalmente a 100°C durante la noche. La mezcla se lavó con NaHCO3 ac. sat. y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y el disolvente se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en DCM de 0/100 a 65/35). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío. El producto se purificó adicionalmente mediante HPLC preparativa (de 70% de [NH⁴HCO³25 mM] - 30% de [ACN: MeOH 1:1] a 27% de [NH⁴HCO³25 mM] - 73% de [ACN: MeOH 1:1]). Las fracciones deseadas se recogieron y el disolvente se evaporó. El producto se trituró con Et²O y se filtró para dar el compuesto 6 (0,092 g, 43%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 2,93 (s, 3 H) 3,62 (dt, J=26,7, 4,6 Hz, 2 H) 4,60 (dt, J=47,7, 4,7 Hz, 2 H) 6,93 (d, J=9,1 Hz, 1 H) 7,28 (dd, J=9,0, 2,7 Hz, 1 H) 7,46 - 7,60 (m, 2 H) 7,82 - 7,94 (m, 2 H) 8,27 (d, J=5,8 Hz, 1 H) 8,34 (s, 1 H) 8,97 (s, 1 H) 9,21 (s, 1 H)

PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 7

HCI

Se añadieron K³PO⁴(0,544 g, 2,565 mmol), Pd2(dba)3 (0,049 g, 0,0534 mmol) y Xantphos (0,052 g, 0,0891 mmol) a una solución del producto intermedio 13 (0,168 g, 0,891 mmol) en THF (6 ml) mientras se burbujeaba nitrógeno. Después de 10 min, se añadió isoquinolin-6-amina (0,128 g, 0,891 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 10 min. A continuación, la mezcla se calentó a 100°C durante 16 h. Se añadieron bajo flujo de nitrógeno más Pd2(dba)3 (0,049 g, 0,0534 mmol) y Xantphos (0,052 g, 0,0891 mmol) y la mezcla se calentó de nuevo a 100°C durante la noche. Se añadieron bajo flujo de nitrógeno Pd2(dba)3 (0,049 g, 0,0534 mmol) y Xantphos (0,052 g, 0,0891 mmol) y la mezcla se calentó de nuevo a 100°C durante 6 h. La mezcla se lavó con NaHCO3 sat. y se extrajo con EtOAc. Las capas org. se secaron sobre MgSO4, se filtraron y el disolvente se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en DCM de 0/100 a 45/55). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío. El producto se purificó mediante HPLC preparativa (de 75% de [NH⁴HCO³25 mM] - 25% de [ACN: MeOH 1:1] a 0% de [NH⁴HCO³25 mM] - 100% de [ACN: MeOH 1:1]). Las fracciones deseadas se recogieron y el disolvente se evaporó. El residuo se disolvió en DCM y se añadió HCl (5 M en 2-propanol) y la mezcla resultante se concentró a vacío. El residuo se trituró con Et²O y se filtró para dar el compuesto 7 como un sólido naranja (0,066 g, 22% de rendimiento). 1H NMR (300 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 1,83 - 2,05 (m, 2 H) 3,17 (t an, J=6,8 Hz, 2 H) 4,58 (dt, J=47,4, 5,8 Hz, 2 H) 5,83 (s an, 1 H) 7,00 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 7,12 (dd, J=8,7, 2,7 Hz, 1 H) 7,77 (dd, J=9,2, 1,2 Hz, 1 H) 7,81 (d, J=2,5 Hz, 1 H) 7,99 (d, J=6,9 Hz, 1 H) 8,20 (d, J=9,1 Hz, 1 H) 8,28 (d, J=6,6 Hz, 1 H) 8,42 (s, 1 H) 9,30 (s, 1 H) 10,08 (s, 1 H)

PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 8

Se añadieron K³PO⁴(0,431 g, 2,032 mmol), Pd2(dba)3 (0,039 g, 0,0423 mmol) y Xantphos (0,041 g, 0,0706 mmol) a una solución del producto intermedio 14 (0,143 g, 0,706 mmol) en THF (5,9 ml) mientras se burbujeaba nitrógeno a través de la mezcla. Después de 10 min, se añadió isoquinolin-6-amina (0,102 g, 0,706 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 10 min. A continuación, la mezcla se calentó a 100°C durante 16 h. Se añadieron Pd2(dba)3 (0,039 g, 0,0423 mmol) y Xantphos (0,041 g, 0,0706 mmol) adicionales mientras se burbujeaba nitrógeno a través de la mezcla, después de lo cual se calentó a 100°C durante la noche. Se añadieron Pd2(dba)3 (0,039 g, 0,0423 mmol) y Xantphos (0,041 g, 0,0706 mmol) adicionales mientras se burbujeaba nitrógeno, y la mezcla se calentó a 100°C durante 6 h. La mezcla se lavó con NaHCO³sat. y se extrajo con EtOAc. La capa org. se secó sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (sílice; EtOAc en DCM de 0/100 a 20/80). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío. El producto se purificó adicionalmente mediante HPLC preparativa (de 75% de [NH⁴HCO³25 mM] - 25% de [ACN: MeOH 1:1] a 0% de [NH⁴HCO³25 mM] - 100% de [ACN: MeOH 1:1]). Las fracciones deseadas se recogieron y el disolvente se evaporó. El producto en bruto se disolvió en DCM, se añadió HCl (5 N en 2-propanol) y la mezcla se concentró a vacío. El residuo se trituró con Et²O y se filtró para dar el compuesto 8 como un sólido naranja (0,058 g, 23%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 1,78 - 2,02 (m, 2 H) 2,92 (s, 3 H) 3,45 (t an, J=7,1 Hz, 2 H) 4,52 (dt, J=47,4, 5,7 Hz, 2 H) 7,09 (d, J=8,9 Hz, 1 H) 7,29 (dd, J=9,0, 3,0 Hz, 1 H) 7,81 (dd, J=8,8, 1,2 Hz, 1 H) 7,91 (d, J=2,6 Hz, 1 H) 7,98 (d, J=6,6 Hz, 1 H) 8,21 (d, J=9,1 Hz, 1 H) 8,29 (d, J=6,7 Hz, 1 H) 8,51 (s, 1 H) 9,32 (s, 1 H) 10,20 (s, 1 H).

PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 9

Se añadieron K³PO⁴(0,449 g, 2,117 mmol), Pd2(dba)3 (0,040 g, 0,0441 mmol) y Xantphos (0,043 g, 0,0735 mmol) a una solución del producto intermedio 15 (0,142 g, 0,809 mmol) en THF (4 ml) mientras se burbujeaba nitrógeno a través de la mezcla. Después de 10 min, se añadió isoquinolin-6-amina (0,106 g, 0,735 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 10 min. A continuación, la mezcla se calentó a 100°C durante 16 h. Después de enfriar hasta ta, la mezcla se lavó con NaHCO3 ac. sat. y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y el disolvente se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido (gel de sílice; EtOAc en heptano, de 0/100 a 40/60). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío. El producto se trituró con éter diisopropílico y se filtró para dar el compuesto 9 como un sólido beige (0,116 g, 55%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 4,28 (dt an, J=30,2, 3,3 Hz, 2 H) 4,75 (dt an, J=47,9, 3,3 Hz, 2 H) 6,99 (d, J=8,9 Hz, 1 H) 7,43 (dd, J=8,9, 2,7 Hz, 1 H) 7,52 - 7,68 (m, 2 H) 7,93 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 8,07 (d, J=2,5 Hz, 1 H) 8,30 (d an, J=5,6 Hz, 1 H) 8,42 (s, 1 H) 9,02 (s, 1 H) 9,44 (s, 1 H)

PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 10

HCl

Se añadieron K³PO⁴(0,449 g, 2,117 mmol), Pd2(dba)3 (0,040 g 0,0441 mmol) y Xantphos (0,043 g, 0,0735 mmol) a una solución del producto intermedio 16 (0,153 g, 0,809 mmol) en THF (4 ml) mientras se burbujeaba nitrógeno a través de la mezcla. Después de 10 min, se añadió isoquinolin-6-amina (0,106 g, 0,735 mmol) y la mezcla se agitó a ta durante 10 min. A continuación, la mezcla se calentó a 100°C durante 16 h. La mezcla se lavó con NaHCO3 ac. sat. y se extrajo con EtOAc. Las capas org. combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y el disolvente se evaporó a vacío. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna de desarrollo rápido; (sílice; EtOAc en heptano, de 0/100 a 35/65). Las fracciones deseadas se recogieron y se concentraron a vacío. El residuo se disolvió en DCM, se añadió HCl (5 N en 2-propanol) y la mezcla se concentró a vacío. El residuo se trituró con DIPE y se filtró para dar el compuesto 10 como un sólido amarillo (0,147 g, 47%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 2,00 - 2,23 (m, 2 H) 4,16 (t, J=6,2 Hz, 2 H) 4,63 (dt, J=47,3, 5,8 Hz, 2 H) 7,18 (d, J=8,9 Hz, 1 H) 7,51 (dd, J=8,9, 3,0 Hz, 1 H) 7,91 (dd, J=9,2, 1,4 Hz, 1 H) 8,07 (d, J=6,7 Hz, 1 H) 8,13 (d, J=2,7 Hz, 1 H) 8,28 (d, J=9,1 Hz, 1 H) 8,34 (d, J=6,6 Hz, 1 H) 8,63 (s, 1 H) 9,41 (s, 1 H) 10,44 (s, 1 H)

C. RADIOSÍNTESIS

MATERIALES Y MÉTODOS

GENERAL

El material de referencia no radiactivo para T808 fue sintetizado por Janssen Research & Development (una división de Janssen Pharmaceutica NV, Beerse, Bélgica) siguiendo informes de la bibliografía (Declercq L., Celen S., Lecina J. y cols. Molecular Imaging 2016, 15,1-151). Todos los productos químicos y reactivos se adquirieron de fuentes comerciales y se usaron sin purificación adicional. El análisis por HPLC se realizó en un sistema de HPLC LaChrom Elite (Hitachi, Darmstadt, Alemania) conectado a un detector UV graduado a 254 nm. Para el análisis de compuestos radiomarcados, el eluato de HPLC, después de pasar a través del detector UV, se dejó sobre un detector de centelleo de NaI de 7,6 cm (3 pulgadas) (T1) conectado a un analizador de un solo canal (GABI box; Raytest, Straubenhardt, Alemania). Los datos se adquirieron y se analizaron usando sistemas de adquisición de datos GINA Star (Raytest).

TRITIACIÓN CO. NO. 1

El Co. No. 1 (1,74 mg, 6,87 |jmol) y hexafluorofosfato de (1,2,5,6-q)-1,5-ciclooctadieno](piridin)(triciclohexilfosfina)iridio(I), también denominado catalizador de Crabtree (7,72 mg, 9,59 ^mol) se disolvieron en CH²CL (0,6 ml). La solución de color naranja brillante se desgasificó tres veces en una tubería de tritiación RC Tritec y a continuación se agitó bajo una atmósfera de gas tritio (8,9 Ci) durante 3,5 h a temperatura ambiente. La presión máxima alcanzada durante la reacción era 882 mbar. Después de la reacción, el disolvente se retiró bajo vacío. El tritio lábil se cambió al añadir metanol (0,8 ml), agitar la solución y retirar el disolvente de nuevo bajo vacío. Este procedimiento se repitió tres veces para proporcionar un producto en bruto sólido secado.

El producto en bruto se purificó mediante un método de HPLC: columna Macherey Nagel Nucleodur Gravity C18, 5 |jm, 8 x 150 mm; fase móvil A: agua con 0,1% de TFA, B: acetonitrilo con 0,1% de TFA; isocrática al 27% de B; caudal 3,1 ml/min, 230 nm y 254 nm, 20°C. Después de la HPLC, el pH de las fracciones de producto recogidas se graduó hasta neutralidad con una solución acuosa de NaHCO3 (10%). El volumen de la mezcla se redujo en un evaporador giratorio. A continuación, el producto se extrajo con un cartucho Phenomenex StrataX (3 ml, 100 mg), que se eluyó con etanol (5 ml). El producto recibido se purificó adicionalmente mediante HPLC bajo condiciones básicas: Macherey Nagel Nucleodur Sphinx RP, 5 ^m, 8 x 150 mm; fase móvil A: NH4OAc 10 mM con 0,05% de NH⁴OH, B: acetonitrilo; isocrática al 46,5% de B; caudal 3,1 ml/min, 230 nm y 254 nm, 20°C. El volumen de las fracciones de producto recogidas se redujo en un evaporador giratorio. A continuación, el producto se extrajo con un cartucho Phenomenex StrataX (3 ml, 100 mg), que se eluyó con etanol (5 ml).

Se determinó que la pureza radioquímica del [3H] Co. No. 1 era >99% mediante el siguiente método de HPLC: Columna: Macherey Nagel Nucleodur Sphinx RP (5 ^m), 4,6 x 150 mm, Temperatura de la columna: 30°C, Fase móvil A: NH4OAc 10 mM con 0,05% v/v de NH⁴OH en agua, Fase móvil B: Acetonitrilo, Caudal: 1,0 ml/min, Volumen de inyección: 5 ^l, Longitud de onda de detección: UV a 254 nm, Gradiente de elución: Gradiente de 5% de B a 95% de B en 0 - 20 min; isocrático al 95% de B en 20 - 25 min; gradiente de 95% de B a 5% de B en 25-25,5 min. El detector del flujo de radiactividad era un Berthold LB 513 con cóctel Zinsser Quickszint Flow 302 a un caudal de 3,0 ml/min.

La actividad específica se determinó para 57,7 mCi/mmol mediante espectrometría de masas. Condiciones de LCMS: columna Agilent Zorbax SB C18 (1,8 ^m) 2,1 x 50 mm; Fase móvil A: agua ácido fórmico al 0,1%, B: MeCN ácido fórmico al 0,1%; 0 min. 5% de B; 0,2 min. 5% de B; 5 min. 80% de B; Caudal 0,6 ml/min; Inyección 1,0 ^l (1,06 |jC¡, 39,2 KBq), Detección UV 225 nm; Temperatura 60°C.

RADIOFLUORACIÓN CO. NO. 1 (N = 6)

Se produjo fluoruro-18 ([18F]F') mediante una reacción nuclear de 18O(p,n)18F en un ciclotrón Cyclone 18/9 (Ion Beam Applications, Louvain-la-Neuve, Bélgica) mediante irradiación de 2 ml de 18O-H²O (Rotem HYOX18, Rotem Industries, Beer Sheva, Israel) enriquecido al 97%, con protones 18-MeV. Después de la irradiación, el [18F]F- se atrapó en un cartucho de intercambio aniónico SepPak Light Accell plus QMA (forma CO³2-, Waters, Milford, MA, EE.UU. de A.) y se eluyó con una mezcla de Kryptofix 2.2.2 (K-222, 27,86 mg) y K²CO³(2,46 mg) disueltos en CH³CN/H²O (0,75 ml; 95:5 v/v). Después de la evaporación del disolvente con una corriente de helio a 80°C y 35 W (cavidad de microondas), se añadió CH³CN anhidro (1 ml), y el [18F]F- se secó adicionalmente bajo las mismas condiciones. Una solución de 0,50 mg del precursor nitrogenado en 0,25 ml de DMSO se añadió al residuo de [18F]F-/K2CO3/K-222 secado y la mezcla se calentó a 160°C y 50 W durante 10 min. en una cavidad de microondas. La mezcla de radiomarcaje en bruto se diluyó con 0,6 ml de tampón preparativo (Na2HPO40,01 M pH 7,4 y EtOH (60:40 v/v)) y se purificó usando HPLC en fase inversa (RP-HPLC) en una columna XBridge C¹⁸(5 pm, 4,6 mm x 150 mm; Waters, Milford, EE.UU. de A.) eluida con una mezcla de Na2HPO4 pH 7,4 y EtOH (60:40 v/v) a un caudal de 0,8 ml/min y con detección UV a 254 nm. El [18F]Co. No. 1 se eluía en 27 min. La solución de radiotrazador purificado se diluyó con solución salina para obtener una concentración en etanol <10%, adecuada para inyección intravenosa. La solución se hizo pasar posteriormente a través de un filtro de 0,22 pm (Millex-GV, Millipore, Billerica, MA, EE.UU. de A.) para obtener un producto estéril. El control de calidad se realizó usando RP-HPLC en una columna XBridge (C¹⁸, 3,5 pm, 3,0 mm x 100 mm; Waters, Milford, EE.UU. de A.) eluida con una mezcla de Na2HPO40,01 M pH 7,4 y CH³N (68:32 v/v) a un caudal de 0,8 ml/min. La detección UV se realizó a 254 nm. El [18F]Co. No. 1 se eluía en 8 min. El [18F]Co. No. 1 se obtuvo con un rendimiento radioquímico medio corregido para la desintegración de 12%, respectivamente, (relativo a la radiactividad de [18F]F- en el cromatograma preparativo, n = 6). Su pureza adicional se examinó usando HPLC en una columna C¹⁸analítica y era mayor de 99%. El [18F]Co. No. 1 se obtuvo con un tiempo de síntesis total de 60 min, y se recogió con una radiactividad específica media de 85 GBq/pmol al final de la síntesis (EOS, n = 6).

D. PARTE ANALÍTICA

PUNTOS DE FUSIÓN

Los valores son bien valores máximos o bien intervalos de fusión, y se obtienen con incertidumbres experimentales que están asociadas comúnmente con este método analítico.

Para un número de compuestos, los puntos de fusión se determinaron con un DSC823e (Mettler-Toledo) (indicado como DSC). Los puntos de fusión se midieron con un gradiente de temperatura de 10°C/minuto. La temperatura máxima era 300°C.

Para un número de compuestos, los puntos de fusión se determinaron en tubos capilares abiertos en un Mettler Toledo MP50. Los puntos de fusión se midieron con un gradiente de temperatura de 10°C/minuto. La temperatura máxima era 300°C. Los datos de puntos de fusión se leyeron de una pantalla digital y se comprobaron a partir de un sistema de videograbación.

MÉTODOS DE LC/MS

La medida por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se realizó usando una bomba de LC, una serie de diodos (DAD) o un detector UV y una columna según se especifique en los métodos respectivos. Si es necesario, de incluían detectores adicionales (véase la tabla de los métodos posteriores).

El flujo procedente de la columna se llevó al espectrómetro de masas (MS) que se configuró con una fuente de iones a presión atmosférica. Está dentro del conocimiento de los expertos la graduación de los parámetros de ajuste (p. ej., intervalo de escaneo, tiempo de permanencia...) a fin de obtener iones que permitan la identificación del peso molecular (MW) monoisotópico nominal del compuesto. La adquisición de datos se realizó con un programa informático apropiado. Los compuestos se describen por sus tiempos de retención (Rt) experimentales e iones. Si no se especifica otra cosa en la tabla de datos, el ion molecular presentado corresponde a la [M+H]+ (molécula protonada) y/o [M-H]-(molécula desprotonada). En caso de que el compuesto no sea directamente ionizable, se especifica el tipo de aducto (es decir [M+NH4]+, [M+HCOO]-, etc...). Para moléculas con múltiples patrones isotópicos (Br, Cl), el valor presentado es el obtenido para la masa isotópica más baja. Todos los resultados se obtuvieron con incertidumbres experimentales que están asociadas comúnmente con el método usado. Posteriormente en la presente, "SQD" significa detector cuadrupolar simple, "MSD" detector selectivo de masas, "TA" temperatura ambiente, "BEH" híbrido de etilsiloxano/sílice con puente, "DAD" detector de serie de diodos, "HSS" sílice de alta resistencia.

Tabla 1a. Códigos del método de LCMS (flujo expresado en ml/min; temperatura de la columna (T) en °C; tiempo de marcha en minutos

Tabla 1b. Datos de LCMS analíticos - Rt significa tiempo de retención (en minutos), [M+H]+ significa la masa protonada del com uesto, método se refiere al método usado ara el análisis or LC MS.

* de 30 a 300°C a 10°C/min 50 ml de N²

DETERMINACIONES DE CHN Y DETERMINACIONES DE AGUA

Para un número de compuestos, la cantidad de carbono, hidrógeno y nitrógeno (CHN) en (% p/p) se determinó mediante combustión instantánea dinámica en un analizador EA 1108 CHN a partir de instrumentos Fisons.

Para un número de compuestos, el agua (% p/p) se determinó con un higrómetro CA-02 (Mitsubishi) El principio culombimétrico se aplica a la valoración de Karl Fischer.

Tabla 1c. Determinaciones de CHN y agua.

E. PARTE BIOLÓGICA

MATERIALES Y MÉTODOS

GENERAL

La cuantificación de la radiactividad en muestras de biodistribución y estudios de radiometabolitos se realizó usando un contador y automático equipado con un cristal de pocillo de NaI(Tl) de 7,6 cm (3 pulgadas) acoplado a un analizador de múltiples canales, montado en un cambiador de muestras (Wallac 2480 Wizard 3q, Wallac, Turku, Finlandia). Los valores se corrigen para la radiación de fondo, la desintegración física y el tiempo muerto del contador. Se alojaron roedores en jaulas ventiladas individualmente en un equipo de humedad controlada termorregulado (~22°C) bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h - 12 h, con acceso a alimento y agua a voluntad. Todos los experimentos con animales se efectuaron según el código belga de práctica para el cuidado y uso de animales, después de la aprobación del comité ético universitario para animales.

AISLAMIENTO DE TAU Y PLACAS DE AMILOIDE AGREGADAS DE CEREBRO HUMANO CON AD

Se prepararon fracciones de tau agregadas enriquecidas según una versión ligeramente modificada del protocolo descrito por Greenberg y Davies (Greenberg S.G., Davies P. A preparation of Alzheimer paired helical filaments that displays distinct ^tproteins by polyacrilamide gel electrophoresis. Proc. Natl. Acad. Sci. 1990; 87: 5827-5831) usando tejido cerebral humano con AD (corteza occipital con alta carga de fibrillas de tau). Brevemente, se homogeneizaron muestras cerebrales con AD humanas (~10 g) con 10 volúmenes de tampón de homogeneización (Tris 10 mM, NaCl 800 mM, EGTA 1 mM, sacarosa al 10%, pH 7,4 que contiene fosfatasa PhosSTOP e inhibidor de proteasa libre de EDTA cOmplete (Roche, Vilvoorde, Bélgica)) frío sobre hielo. Después de la centrifugación a 27.000 x g durante 20 min. a 4°C, el sobrenadante se recuperó y se añadieron N-lauroilsarcosina al 1% (p/v) y 2-mercaptoetanol al 1% (v/v). El sobrenadante de N-lauroilsarcosina/2-mercaptoetanol se incubó durante 2 h a 37°C mientras se batía en una batidora orbital. Posteriormente, la ultracentrifugación a 108.000 x g durante 1,5 h a temperatura ambiente enriquecía la tau agregada en la pella. El sobrenadante se retiró y la pella se enjuagó cuidadosamente dos veces con una pequeña cantidad de TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4). Finalmente, la pella de tau agregada se recuperó en TBS y se resuspendió para asegurar la homogeneidad de la muestra. Partes alícuotas pequeñas se almacenaron a -80°C.

Se prepararon preparaciones de amiloide p agregado enriquecido a partir de muestras de cerebro humano con AD (10 g - corteza occipital con alta carga de placas de amiloide) que se homogeneizaban con 7 veces el volumen de tampón de homogeneización (sacarosa 250 mM, base de Tris 20 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM y fosfatasa PhosSTOP e inhibidor de proteasa libre de EDTA cOmplete) frío sobre hielo. Después de la centrifugación a 27.000 x g durante 20 min. a 4°C, el residuo celular se recogió. El sobrenadante que contenía placas de amiloide se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -80°C.

ENSAYOS DE UNIÓN COMPETITIVA DE RADIOLIGANDOS IN VITRO

Los ensayos de unión competitiva a radioligandos miden la unión de un ligando de referencia radiomarcado en presencia de un intervalo de respuesta a la dosis-concentración de compuestos de prueba.

Brevemente, preparaciones de tau agregada se diluyeron hasta 100 pg de proteína/ml en tampón de PBS con etanol al 5%. En un formato de 96 pocillos, se añadió 3H-T808 (actividad específica; 32,97 Ci/mmol) en una concentración final de 10 nM a cantidades crecientes de compuesto de prueba en presencia de 20 pg de proteína de la preparación de tau agregada. La unión inespecífica se definía como el número de cuentas remanentes en presencia de tioflavina T 50 pM (aglutinante de láminas beta común). Después de 2 h de incubación a temperatura ambiente, el ligando no unido se retira mediante la filtración de las mezclas de unión sobre filtros de vidrio GF/B usando un instrumento de recogida Filtermate 96 (Perkin Elmer, Zaventem, Bélgica). Los filtros se lavaron tres veces con tampón de PBS que contenía 20% de etanol. Después del secado durante la noche de la placa filtrante, se añadió líquido Microscint O (Perkin Elmer) y la cantidad de ligando radiomarcado unido a las fibrillas se mide mediante recuento de centelleo de líquido en un instrumento Topcount (Packard Instrument Company, Connecticut, EE. UU. de A.).

Se determinaron valores para la concentración inhibidora semimáxima (IC⁵⁰) a partir de curvas de desplazamiento de al menos dos experimentos independientes usando el programa GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA).

Para determinar la unión del compuesto a amiloide p agregado, se puso en marcha un ensayo similar pero con algunas pequeñas modificaciones. Brevemente, preparaciones de amiloide se diluyeron hasta 150 gg de proteína/ml en Tris 50 mM con BSA al 0,1% y etanol al 5%. Se añadió 3H-AV-45 (florbetapir - actividad específica; 45,95 Ci/mmol) en una concentración final de 10 nM a cantidades crecientes de compuesto de prueba en presencia de 30 gg de proteína de preparación de placas de amiloide. La unión inespecífica se determinó en presencia de tioflavina T 500 gM. Después de 150 min. de incubación a temperatura ambiente, las mezclas de unión se filtraron sobre filtro de vidrio de GF/B. Los filtros se lavaron tres veces con tampón de PBS que contiene 20% de etanol. Las etapas posteriores eran idénticas a las descritas para las preparaciones de tau agregada.

[19F]-Co. No. 1 mostraba una unión potente (pICsü 8,24, correspondiente a una Ki de 2,4 nM) a tau humana extraída usando [3H]-T808 y una unión débil a agregados de amiloide beta humano extraídos (pICsü 5,18, correspondiente a una Ki de 3,2 gM) usando [3H]-AV-45 en este ensayo de desplazamiento de radiomarcador.

IMMUNOHISTOQUÍMICA (IHC): CEREBRO HUMANO M&M

Bloques de cerebro humano con AD (fase de Braak V-VI) se congelaron instantáneamente, se cortaron en rodajas con un criostato (20 gm de grosor) y se almacenaron a -80°C hasta que se usaron para la immunohistoquímica. Las rodajas se secaron, se fijaron en formalina y se incubaron con peróxido de hidrógeno (DAKO, S2023) durante 5 minutos y reactivo de bloqueo (PBS1x T riton X-100 al 0,05%) durante 1 hora. Se aplicó a las rodajas durante 1 hora anticuerpo anti-amiloide o anti-tau [(4G8, Covance, SIG-38220), dilución 1/500 en diluyente de anticuerpo con componentes reductores de fondo (DAKO, S3022) o (At 8 (Bierna y cols., EMBO J. 1992, 11 (4):1593-7), en las propias instalaciones, concentración de reserva 1 mg/ml), 0,2 gg/ml en diluyente de anticuerpo con componentes reductores de fondo (DAKO, S3022)]. El tejido estriado se inmunomarcó con anticuerpos anti-MAO-B y anti-MAO-A (1:100, Thermo Fisher) para confirmar la expresión de MAO.

Después del lavado intensivo, las rodajas se incubaron con anticuerpo secundario contra inmunoglobulinas de ratón conjugado a HRP (Envision, DAKO, K4000), seguido por marcaje con DAB cromogénico (DAKO, K3468). Después de teñir por contraste con hematoxilina, las rodajas se deshidrataron y se montaron con medio orgánico de montaje (Vectamount, Vector labs, H-5000). La Figura 1c muestra la patología de amiloide p en cerebro con AD según se detectaba con IHC de 4G8 y la Figura 1 b muestra la patología de tau en cerebro con AD según se detecta con IHC de AT8.

ESTUDIOS AUTORRADIOGRÁFICOS

a) Rodajas de 10 gm congeladas secadas al aire de la corteza visual de un paciente con AD (mujer de 68 años con fase Braak V - VI) se incubaron durante 60 min. con [18F]Co. No. 1 (7,4 kBq/500 gl por rodaja) y posteriormente se lavaron con mezclas de PBS y etanol según se describe en otras partes (Xia C. F., Arteaga J., Chen G., y cols. Alzheimer's Dement. 2013, 1-11). Para evaluar la especificidad de unión, las rodajas se incubaron con trazador en presencia de 1 gM de T808 o Co. No. 1 auténtico. Después del secado, las rodajas se expusieron a una pantalla de almacenamiento de fósforo (pantalla de superresolución, Perkin Elmer). Las pantallas se leyeron en un sistema Cyclone Plus (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU. de A.) y se analizaron usando el programa Optiquant. Los resultados se expresan como unidades de luz digitales por mm cuadrado (DLU/mm2). Rodajas de AD adyacentes se inmunotiñeron con anticuerpos anti-tau (AT8) y anti-Ap (4G8), para correlacionar con la unión a [18F]Co. No. 1.

La autorradiografía digital con [18F]Co. No. 1 sobre rodajas con AD humanas mostraba una unión alta y selectiva a regiones corticales ricas en tau (Figura 1, A). La inmunohistoquímica con anticuerpos para tau y Ap, realizada sobre rodajas adyacentes, identificaba numerosos depósitos de NFT y placas neuríticas, confirmando la colocalización de la unión al trazador con NFTs (Figura 1, respectivamente, B y C). Para evaluar la especificidad de la unión del trazador a estos NFTs, se realizaron estudios de bloqueo con compuesto de referencia auténtico Co. No. 1 y el compuesto de referencia estructuralmente no relacionado T808 (Figura 2). El autobloqueo de Co. No. 1 frío daba como resultado 99% de inhibición, lo que demuestra que la unión de [18F]Co. No. 1 es específica. La unión de [18F]Co. No. 1 se redujo con 99% en presencia de T808 1 gM, indicando la unión específica a tau, ya que T808 se presentaba con alta afinidad (Kd = 22 nM) para tau agregada y alta selectividad para tau sobre agregados de Ap (27 veces) (Zhang W., Arteaga J., Cashion D. K. y cols. J Alzheimers Dis. 2012, 31(3), 601-612).

b) [3H]-Co. No. 1 se une a rodajas congeladas de cerebro con AD que contiene patología de tau y Ap, pero no se une a tejido con AD negativo a patología de tau que contiene solamente placas de Ap (Figura 3D, E). El trazador se probó en 10 nM y en este estudio no se investigaron concentraciones superiores. De forma importante, [3H]-Co. No. 1 tampoco muestra unión a tejido humano rico en MAO (cuerpo estriado) (Figura 3A). Estos datos apoyan que el presente compuesto es selectivo para patología de tau sobre patología de Ap y MAO.

En comparación, se usaron el trazador de tau [3H]-THK-5351 y el trazador de Ap [3H]-AV-45 ya que se sabe que THK-5351 también se une a MAO. Estos experimentos muestran que 10 nM de [3H]-THK-5351 se unen a tejido humano rico en MAO y esta unión se puede autobloquear mediante THK-5351 10 pM (frío), pero también mediante Co. No. 1 10 pM (frío) (Figura 3F-H). Esto indica que Co. No. 1 en concentraciones superiores se puede unir a MAO.

[3H]-THK5351 también se une a tejido con AD que contiene solamente placas de Ap (negativo a tau) y así confirma la baja selectividad de THK-5351 (Figura 3I, J).

[3H]-AV-45 (selectivo para placas de Ap) se une a tejidos humanos con patología tanto de tau y de Ap (Ap+/tau+, Tejido #28391) como patología de Ap solamente (Ap+/tau-, Tejido #92/050) según se espera (Figura 3L-M). Como un control para los tejidos humanos con AD (Tejido #28391: Figura 4, Tejido #92/050: Figura 5) y tejido estriado (Figura 6) usados en este estudio, se realizó inmunohistoquímica. Los tejidos humanos con AD (#28391; #92/050) se inmunomarcaron con 4G8 (anticuerpo antiamiloide) y AT8 (anticuerpo antitau) y demuestran claramente que las rodajas procedentes del #28391 son Ap+/tau+, mientras que las rodajas procedentes del #92/050 son Ap+/tau- (Figura 4 y 5). Por otra parte, la expresión de MAO-B y MAO-A en el tejido estriado humano (#S96/037) se confirmó usando inmunohistoquímica (Figura 6). Estos datos apoyan las conclusiones extraídas de la unión in vitro observada en la Figura 3.

c) La unión de [18F] Co. No. 1 a tejido humano con AD se evaluó en presencia de aglutinantes de MAO presentados. Como se puede observar en la Figura 7, 0,2 mCi/ml de [18F] Co. No. 1 mostraban una unión fuerte a patología de tau en estas rodajas con AD humana (Figura 7A). Este patrón de unión se mantenía cuando la muestra se incubaba con 10 pM de clorgilina, un aglomerante de MAO irreversible fuerte con selectividad moderada para el subtipo A (Figura 7B), o selegilina 10 pM (=deprenilo), un aglutinante de MAO-B irreversible fuerte (Figura 7C). La unión de [18F] Co. No.

1 podría ser totalmente bloqueada con 10 pM de Co. No. 1 auténtico (Figura 7D). Rodajas con AD adyacentes se inmunotiñeron con anticuerpos anti-tau (AT8) y anti-Ap (4G8) para correlacionarse con la unión de [18F]Co. No. 1 (Figura 8).

ESTUDIOS DE OBTENCIÓN DE IMÁGENES CON MICROPET

RATAS WISTAR

Se adquirió un escaneo de pPET dinámico de 120 min. con [18F]Co. No. 1 o [18F]T807 en un escáner de pPET Focus 220 (Concorde Microsystems, Knoxville, TN, EE. UU. de A.) en tres ratas Wistar hembra simultáneamente. Las ratas se mantuvieron bajo anestesia con gas durante todo el procedimiento (isoflurano al 2,5% en O²en un caudal de 1 l/min). Los escaneos se adquirieron en modo de lista y los datos de adquisición se sometieron a rebinarización de Fourier en 24 espacios de tiempo (4 x 15 s, 4 x 60 s, 5 x 180 s, 8 x 300 s, 3 x 600 s). Los datos, que se reconstruían a posteriori al máximo 3D (3D-MAP), se alinearon manualmente con una plantilla de 18F-FDG de cerebro de rata en coordinados de Paxinos usando una transformación afín, para permitir el análisis de volúmenes de interés (VOIs) predefinidos (Casteels C., y cols. J. Nucl. Med. 2006, 47, 1858-1866). Se generaron curvas de tiempo-actividad (TACs) de todo el cerebro usando VOIs con el programa PMOD (v 3.2, PMOD Technologies, Zúrich, Suiza). La concentración de radiactividad en el cerebro se expresó como valor de absorción estandarizado (SUV, calculado como (radiactividad en Bq en el cerebro/ml) / (dosis inyectada total (Bq)/peso corporal en g)) como una función del tiempo después de la inyección del trazador. Los escaneos se iniciaron inmediatamente después de la inyección IV de aproximadamente 50 MBq de radiotrazador (n = 3 / trazador). Para estudios de pretratamiento y desplazamiento, se disolvió compuesto de referencia Co. No. 1 o T807 frío en una mezcla de 5% de DMSO, 5% de Tween 80 y 40% de (2-hidroxipropil)-pciclodextrina, se filtró a través de un filtro de membrana de 0,22 pm (Millex-GV, Millipore) antes de la inyección. El pretratamiento (n = 1) se realizó mediante una inyección subcutánea (SC) de 10 mg/kg de Co. No. 1 o T807, 60 min. antes de la inyección del radiotrazador. El desplazamiento (n = 1) se realizó mediante la inyección IV de 1 mg/kg de Co. No. 1 o T807 30 min. después de la inyección del radiotrazador. Las imágenes de pPET se compararon con un escaneo basal (n = 1), adquirido en una rata no tratada.

Los resultados del estudio basal, de pretratamiento y de seguimiento de 120 min. de [18F]Co. No. 1 y el compuesto patrón [18F]T807 se muestran en las Figuras 9-11 (curvas de tiempo-actividad, TACs y % de SUVmáx). Las TACs de los escaneos basales de [18F]Co. No. 1 (Figura 9) mostraban una alta absorción cerebral inicial con un valor de SUV de alta intensidad en el cerebro de ~2,0, en comparación con ~1,8 para [18F]T807 (Figura 10). Se observó la absorción en los últimos puntos temporales para ambos compuestos. [18F]Co. No. 1 tenía una velocidad de depuración cerebral más rápida (valor de SUV de 0,2 a 60 min. después de la inyección) en comparación con [18F]T807 (valor de SUV de 0,4 a 60 min. después de la inyección) según se muestra en las curvas de % de SUVmáx (Figura 11). No se observaba efecto de autobloqueo o autoseguimiento para [18F]Co. No. 1, indicando ausencia de unión no relacionada con tau específica en el cerebro (Figura 9). Se registraba una absorción cerebral inferior durante el escaneo basal de [18F]T807, en comparación con el estudio de pretratamiento, probablemente provocada por la saturación de enzimas metabólicas y/o proteínas plasmáticas (Figura 10). Se observaba un efecto similar 40 min. después de la inyección en el estudio de seguimiento.

ESTUDIOS DE OBTENCIÓN DE IMÁGENES CON MICROPET

MONO RHESUS

Se realizó un escaneo de gPET dinámico de 120 min. con [18F]Co. No.1 o [18F]T807 con un escáner de gPET Focus 220 en un mono Rhesus (Macaca mulatta de 6 años, 7,6 kg), que se sedó con ketamina (Ketalar®) y xilazina (Rompun®) a través de inyección intramuscular (IM). Durante el escaneo, el mono recibía repetidamente una dosis adicional ketamina/xilazina a través de inyección IV. Se comprobaron la saturación de O²en sangre, la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca durante todo el experimento. La cabeza del animal se centró en el campo de visión del escáner de gPET. Los escaneos se adquirieron en modo de lista y se sometieron a rebinarización de Fourier en 24 espacios de tiempo (4 x 15 s, 4 x 60 s, 5 x 180 s, 8 x 300 s, 3 x 600 s). Los datos se reconstruyeron usando una reconstrucción iterativa a posteriori al máximo 3D (3D-MAP). Se generaron TACs de todo el cerebro usando VOIs con el programa PMOD. La concentración de radiactividad en el cerebro se expresa como SUV como una función del tiempo después de la inyección del trazador. Los escaneos se iniciaron inmediatamente después de la inyección IV de 185 MBq de [18F]Co. No. 1 o [18F]T807 a través de la vena safena de la pata derecha. Para el estudio de pretratamiento, se disolvió compuesto de referencia Co. No. 1 frío en una mezcla de 10% de DMSO y 40% de (2-hidroxipropil)-p-ciclodextrina, se filtró a través de un filtro de membrana de 0,22 gm (Millex-GV, Millipore) antes de la inyección. El pretratamiento (n = 1) se realizó mediante coinyección IV de 1 mg/kg de solución fría de Co. No. 1 y radiotrazador. Las imágenes de gPET se compararon con un escaneo basal (n = 1), adquirido en el mono no tratado.

Los resultados del escaneo basal de 120 min. de [18F]Co. No. 1 y [18F]T807 se muestran en las Figuras 12-14 (TACs y %SUVmáx). Las TACs del escaneo basal de [18F]Co. No. 1 en el cerebro muestran una alta absorción inicial (valor de SUV de ~ 5,4 en todo el cerebro) con una depuración rápida (Figura 12). Las TACs del escaneo basal de [18F]T807 en el cerebro muestran una absorción cerebral (valor de SUV de ~1,3) y una depuración inicial más lenta (Figura 13). Se registraba una distribución homogénea de [18F]Co. No. 1 en todas las regiones cerebrales observadas, sin incremento de absorción en el cuerpo calloso. Las TACs en el lado del cráneo muestran que no se observaba absorción ósea de 18F-fluoruro libre 120 min. después de la inyección, puesto de la señal de SUV no se incrementaba como una función del tiempo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto según la Formula (I')

que

R2 es metilo, y bien R1 es 18F y R3 es H, o bien R1 es H y R3 es 18F; o

R1 y R3 son ambos H, y R2 se selecciona del grupo que consiste en -alquilC^1-4-18F, -OalquilC^1-4-18F y -NR4-alquilC1-4-18F, en donde R4 es H o metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

2. El compuesto según la reivindicación 1, en donde el compuesto es

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

3. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 1 o 2, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

4. La composición farmacéutica según la reivindicación 3, en donde esta composición es una solución estéril.

5. Un compuesto según la reivindicación 1 o 2, o una composición farmacéutica según la reivindicación 3 o 4, para el uso en la unión a y la obtención de imágenes de agregados de tau.

6. Un compuesto según la reivindicación 1 o 2, o una composición farmacéutica según la reivindicación 3 o 4, para el uso en la obtención de imágenes diagnóstica de agregados de tau en el cerebro de un sujeto.

7. Un compuesto según la reivindicación 1 o 2, o una composición farmacéutica según la reivindicación 3 o 4, para el uso en la unión a y la obtención de imágenes de agregados de tau en un paciente que sufre, o se sospecha que sufre, una tauopatía.

8. Uso de un compuesto según la reivindicación 1 o 2, o una composición farmacéutica según la reivindicación 3 o 4, para la unión a y la obtención de imágenes de agregados de tau.

9. Un procedimiento para la preparación de un compuesto según la reivindicación 1, que comprende la etapa de hacer reaccionar (a) un compuesto de Fórmula (P-a1) o (b) un compuesto de Fórmula (P-a2), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos, según la reivindicación 1, con una fuente de fluoruro 18F- bajo condiciones adecuadas, o (c) un compuesto de Fórmula (P-b1) o (d) un compuesto de Fórmula (P-b2) o (e) un compuesto de Fórmula (P-b3), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos, según la reivindicación 1, con un reactivo activador tal como cloruro de metanosulfonilo o cloruro de 4-toluenosulfonilo en presencia de una base, y posteriormente hacer reaccionar el metanosulfonato o 4-toluenosulfonato resultante con una fuente de fluoruro 18F- bajo condiciones adecuadas

en donde R1, R3 y R4 son según la reivindicación 1.

10. Un compuesto según la Fórmula (P-1)

que

R2 es metilo, y bien R1 se selecciona del grupo que consiste en Br, -NO², -[N(CH3)3]+ y 4-CH3-Ph-SÜ2-O- y R3 es H, o bien R1 es H y R3 se selecciona del grupo que consiste en Br, -NO², -[N(c H3)3]+ y 4-CH3-Ph-SO2-O-; o

R1 y R3 son ambos H, y R2 se selecciona del grupo que consiste en -alquilCi-4-Br, -alquilCi-4-I, -alquilCi-4-O-SO2CH3, 4-CH3-Ph-SO2-O-alquilCi-4-, -alquilC1-4-OH, -OalquilC1-4-Br, -OalquilC1-4-I, -OalquilC1-4-O-SO2CH3, 4-CH3-Ph-SO2-O-alquilC1-4-O-, -OalquilC1-4-OH, -NR4-alquilC1-4-Br, -NR4-alquilC1-4-I, -NR4-alquilC1-4-O-SO2CH3, 4-CH3-Ph-SO2-O-alquilC1-4-NR4- y -NR4-alquilC1-4-OH, en donde R4 es H o metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

11. Un compuesto según la reivindicación 10, en donde el compuesto es

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

12. Un compuesto que tiene la fórmula [19F]-(I)

R2 es metilo, y bien R1 es F y R3 es H, o bien R1 es H y R3 es F; o

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

13. Un compuesto según la reivindicación 12, en donde el compuesto es

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

14. Un compuesto que tiene la fórmula [19F]-(I)

en la que

R2 es metilo, y bien R1 es F y R3 es H, o bien R1 es H y R3 es F; o

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables o uno de sus solvatos.

15. Un compuesto que tiene la fórmula