ES2836303T3 - Nanopartículas terapéuticas purificadas y métodos de preparación de las mismas - Google Patents

Abstract

Nanopartículas terapéuticas purificadas, que comprenden paclitaxel y seroalbúmina humana, en las que la relación en peso de la seroalbúmina humana (HSA) con respecto a paclitaxel en las nanopartículas terapéuticas se selecciona de 0,03:1, 0,04:1, 0,05:1, 0,06:1, 0,07:1, 0,08:1, 0,09:1, 0,10:1, 0,11:1, 0,12:1, 0,13:1, 0,14:1, 0,15:1, 0,16:1, 0,17:1, 0,18:1, 0,19:1, 0,2:1, 0,21:1, 0,22:1, 0,23:1, 0,24:1, 0,25:1, 0,26:1, 0,27:1, 0,28:1, 0,29:1, 0,3:1, 0,31:1, 0,32:1, 0,33:1, 0,34:1, 0,35:1, 0,36:1, 0,37:1, 0,38:1, 0,39:1, 0,4:1, 0,41:1, 0,42:1, 0,43:1, 0,44:1, 0,45:1, 0,46:1, 0,47:1, 0,48:1, 0,49:1, 0,5:1, 0,51:1, 0,52:1, 0,53:1, 0,54:1, 0,55:1, 0,56:1, 0,57:1, 0,58:1, 0,59:1, 0,6:1, 0,65:1, 0,70:1, 0,75:1, 0,8:1, 0,85:1, 0,9:1, 0,95:1 o del intervalo entre cualquiera de las dos relaciones anteriores, en las que las nanopartículas contienen menos del 10 % de HSA libre (en peso).

Description

DESCRIPCIÓN

Nanopartículas terapéuticas purificadas y métodos de preparación de las mismas

Campo técnico

La presente divulgación se refiere al campo farmacéutico, y más particularmente, a nanopartículas que comprenden seroalbúmina humana y un fármaco hidrófobo, y al método de preparación de las mismas, e incluso más particularmente, a nanopartículas de albúmina que comprenden propiedades físicas específicas y al método de preparación de las mismas.

Antecedentes

Como fármaco contra el cáncer, el paclitaxel actúa como un inhibidor de los microtúbulos durante la mitosis y desempeña un papel importante en la polimerización y estabilización de los microtúbulos intracelulares. En el estadio de la mitosis, el paclitaxel inhabilita la separación de los microtúbulos, de modo que entre la fase G2 y M, las células se bloquean. Como resultado, el paclitaxel hace que las células tumorales de división rápida se detengan en la fase de la mitosis, conduciendo a la muerte de las células debido a la obstaculización de la replicación. El paclitaxel tiene una actividad clínica importante en varios cánceres (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón y cáncer de vejiga, etc.).

Sin embargo, debido a su escasa solubilidad en agua, la aplicación de paclitaxel en el cuerpo humano es limitada. Para que el paclitaxel sea adecuado para inyección intravenosa, Bristol-Myers Squibb (BMS) ha desarrollado TAXOL®, en el que se añade un aceite de ricino de polioxietilenado tensioactivo (CREMOPHOR® EL) y alcohol anhidro conjuntamente como codisolvente para mejorar la solubilidad del paclitaxel. El Taxol tiene una actividad significativa en el cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de esófago y cáncer de cabeza y cuello. Sin embargo, se ha demostrado que el Taxol puede inducir toxicidad relacionada con la terapia y toxicidad aguda y acumulativa significativa, tal como mielosupresión, neutropenia febril e hipersensibilidad, etc. Estos efectos secundarios están relacionados con el aceite de ricino polioxietilenado tensioactivo utilizado (Anantbhushan et al., Asia Pac J Clin Oncol. 2013; 9:176-181). Basándose en informes de investigación clínica y en datos de seguridad posteriores a la comercialización, una frecuencia global de hipersensibilidad inducida por Taxol, es de aproximadamente un 39 %. En la actualidad, cuando se utiliza Taxol, para aliviar los efectos secundarios debidos al tensioactivo, a los pacientes se les administra antihistamínicos y esteroides con anticipación.

Para mejorar la solubilidad en agua del paclitaxel, los investigadores también realizan modificaciones estructurales utilizando grupos funcionales que pueden proporcionar una mayor solubilidad en agua, por ejemplo, derivados de sulfonato (Kingston et al., patente de Estados Unidos 5059699 (1991)), y derivados de éster de aminoácidos (Mathew et al., J. Med. Chem. 35:145-151 (1992)). Estos grupos muestran actividades biológicas obvias después de la modificación. Sin embargo, estas modificaciones pueden inducir efectos secundarios no deseados o reducir la eficacia farmacéutica además del aumento del coste de las formulaciones farmacéuticas.

Para evitar los efectos adversos de CREMOPHOR® EL en las formulaciones de paclitaxel, se desarrolló otro sistema de suministro de fármacos que no contiene ningún agente emulsionante ni tensioactivo. Dicho sistema está en forma de micropartículas o nanopartículas y contiene albúmina, una parte de la cual forma complejos con paclitaxel. Por ejemplo, dicho sistema se describe en Li Chunlei et al: "Direct comparison of two albumin-based paclitaxel-loaded nanoparticle formulations: Is the crosslinked version more advantageous?", International Journal of Pharmaceutics, vol. 468, n.° 1 (2014-04), páginas 15-25) y en la solicitud de patente internacional n.° WO 2011/153010 de Abraxis Biosciences LLC. Sin embargo, este sistema todavía tiene muchas desventajas. Por ejemplo, la formulación requiere una gran cantidad de seroalbúmina humana (HSA, human serum albumin), que puede causar alergia. la HSA se sigue obteniendo de sangre humana y tiene riesgos potenciales de seguridad debido a posibles contaminaciones durante la extracción y la conservación de la sangre. Además, la HSA es relativamente costosa y puede escasear en determinadas regiones.

Sumario

La presente divulgación proporciona nanopartículas terapéuticas purificadas, composiciones que comprenden dichas nanopartículas, métodos para preparar dichas nanopartículas o composiciones, y métodos de uso de dichas nanopartículas o composiciones como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona nanopartículas terapéuticas purificadas que comprenden un principio activo y seroalbúmina humana, en las que la relación en peso de la seroalbúmina humana (HSA) con respecto al principio activo en las nanopartículas terapéuticas se selecciona de 0,03:1, 0,04:1, 0,05:1,0,06:1, 0,07:1, 0,08:1, 0,09:1,0,10:1, 0,11:1, 0,12:1,0,13:1, 0,14:1, 0,15:1,0,16:1,0,17:1, 0,18:1, 0,19:1,0,2:1,0,21:1,0,22:1, 0,23:1,0,24:1, 0,25:1, 0,26:1,0,27:1,0,28:1,0,29:1, 0,3:1, 0,31:1, 0,32:1, 0,33:1, 0,34:1, 0,35:1, 0,36:1, 0,37:1, 0,38:1, 0,39:1, 0,4:1, 0,41:1, 0,42:1,0,43:1,0,44:1,0,45:1, 0,46:1, 0,47:1, 0,48:1, 0,49:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1 o del intervalo entre cualquiera de las dos relaciones anteriores, en las que las nanopartículas contienen menos del 10 % de HAS libre (en peso).

En determinadas realizaciones, las nanopartículas contienen como máximo un 5 % de HSA libre (en peso).

En determinadas realizaciones, el principio activo tiene las propiedades de ser insoluble o ligeramente soluble en agua, aunque soluble o libre soluble en un disolvente orgánico.

El principio activo es paclitaxel.

En determinadas realizaciones, el disolvente orgánico es un disolvente puro que tiene baja solubilidad en agua y bajo punto de ebullición o su mezcla con alcoholes de pequeño peso molecular.

En determinadas realizaciones, el principio activo está encapsulado en la seroalbúmina humana.

En determinadas realizaciones, el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas se selecciona de: 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 nm, o del intervalo entre cualquiera de dos valores numéricos anteriores. La presente divulgación proporciona nanopartículas terapéuticas purificadas que comprenden un principio activo y seroalbúmina humana, en las que el principio activo está encapsulado en la seroalbúmina humana; la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto al principio activo es de 0,03:1 a 0,7:1; el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas es de 50 nm a 190 nm; y las nanopartículas carecen sustancialmente de HSA libre que no está incorporada en las nanopartículas.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica, que comprende las nanopartículas terapéuticas purificadas proporcionadas en el presente documento, en la que la composición carece sustancialmente de HSA libre que no está incorporada en las nanopartículas.

En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica está en forma de líquido o polvo liofilizado.

En determinadas realizaciones en las que la composición farmacéutica está en forma de polvo liofilizado, este comprende uno o más excipientes de liofilización, tales como manitol, sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa, dextrano o una mezcla de los mismos.

En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica contiene como máximo un 5 % de HSA libre (en peso). En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para preparar las nanopartículas terapéuticas purificadas proporcionadas en el presente documento. Comprendiendo el método:

1) disolver paclitaxel en un disolvente orgánico para formar una fase oleaginosa y disolver seroalbúmina humana en agua para formar una fase acuosa;

2) formar una emulsión de aceite en agua utilizando las fases oleaginosa y acuosa anteriores;

3) eliminar el disolvente orgánico en la emulsión para obtener una suspensión que contenga las nanopartículas terapéuticas; y

4) eliminar de la suspensión la HSA libre que no esté incorporada en las nanopartículas para obtener nanopartículas terapéuticas purificadas.

En determinadas realizaciones, el disolvente orgánico se selecciona de uno o más de cloroformo y etanol.

En determinadas realizaciones, el método comprende adicionalmente: entre las etapas 3) y 4), una etapa de dializar la suspensión de la etapa 3) con una solución acuosa para eliminar el disolvente orgánico restante de la suspensión. En determinadas realizaciones, la solución acuosa es agua.

En determinadas realizaciones, dicha separación en la etapa 4) se realiza utilizando un método seleccionado de: centrifugación, diálisis y cromatografía de exclusión.

En un aspecto relacionado, la presente divulgación proporciona un método para preparar la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, que comprende:

1) disolver paclitaxel en un disolvente orgánico para formar una fase oleaginosa y disolver seroalbúmina humana en agua para formar una fase acuosa;

2) formar una emulsión de aceite en agua utilizando las fases oleaginosa y acuosa anteriores;

3) eliminar el disolvente orgánico en la emulsión para obtener una suspensión que contenga las nanopartículas terapéuticas;

4) eliminar la HSA libre que no esté incorporada en las nanopartículas para obtener nanopartículas terapéuticas purificadas;

5) resuspender las nanopartículas terapéuticas purificadas en una solución que contenga excipiente; y

6) liofilizar opcionalmente la resuspensión de las nanopartículas terapéuticas purificadas para obtener la composición farmacéutica.

En determinadas realizaciones, el método comprende adicionalmente: entre las etapas 3) y 4), una etapa de dializar la suspensión de la etapa 3) con una solución acuosa para eliminar el disolvente orgánico restante de la suspensión. En determinadas realizaciones, la solución acuosa es agua.

En otro aspecto relacionado, la presente divulgación proporciona un método para preparar la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, que comprende:

1) disolver paclitaxel en un disolvente orgánico para formar una fase oleaginosa y disolver seroalbúmina humana en agua para formar una fase acuosa;

2) formar una emulsión de aceite en agua utilizando las fases oleaginosa y acuosa anteriores;

3) eliminar el disolvente orgánico en la emulsión para obtener una suspensión que contenga las nanopartículas terapéuticas;

4) dializar la suspensión obtenida después de la eliminación del disolvente orgánico mediante una solución que contenga un excipiente para eliminar la HSA libre que no esté incorporada en las nanopartículas; y

5) opcionalmente, liofilizar la suspensión dializada para obtener la composición farmacéutica.

En determinadas realizaciones, el método comprende adicionalmente: entre las etapas 3) y 4), una etapa de dializar la suspensión de la etapa 3) con una solución acuosa para eliminar el disolvente orgánico restante de la suspensión. En determinadas realizaciones, la solución acuosa es agua.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer, que comprende: administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica, que comprende las nanopartículas terapéuticas proporcionadas en el presente documento, en las que la composición comprende además HSA como excipiente de liofilización.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Imagen de microscopía electrónica de barrido de la muestra del Ejemplo 5.

Fig. 2. Imagen de microscopía electrónica de barrido de las nanopartículas preparadas utilizando la muestra del Ejemplo 5.

Fig. 3. Patrón de difracción de rayos X de paclitaxel.

Fig. 4. Patrón de difracción de rayos X de polvo liofilizado de albúmina.

Fig. 5. Patrón de difracción de rayos X de las nanopartículas de paclitaxel-albúmina correspondientes al Ejemplo 2. Fig. 6. Patrón de difracción de rayos X de las nanopartículas de paclitaxel-albúmina correspondientes al Ejemplo 4. Fig. 7. Patrón de difracción de rayos X de las nanopartículas de paclitaxel-albúmina correspondientes al Ejemplo 6. Fig. 8. Patrón de difracción de rayos X de las nanopartículas de paclitaxel-albúmina correspondientes al Ejemplo 8.

Fig. 9. Perfiles de liberación in vitro de nanopartículas purificadas de diversas formulaciones.

Fig. 10. Perfiles de liberación in vitro de nanopartículas purificadas y formulaciones tradicionales.

Fig. 11. Perfiles farmacocinéticos de nanopartículas purificadas y formulaciones tradicionales en perros.

Fig. 12. La concentración de albúmina influye en el efecto inhibidor de los fármacos en células MCF-7.

Fig. 13. La concentración de albúmina influye en el efecto inhibidor de los fármacos en células SPC-A-1.

Fig. 14. La concentración de albúmina influye en la captación de fármacos por parte de las células endoteliales vasculares humanas EA.hy 926.

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona nanopartículas terapéuticas purificadas que contienen HSA, composiciones que comprenden dichas nanopartículas y métodos de preparación o uso de dichas nanopartículas y composiciones.

Las nanopartículas terapéuticas purificadas o las composiciones que comprenden dichas nanopartículas, tienen una o más de las siguientes propiedades superiores:

(1) En comparación con composiciones previamente conocidas que comprenden nanopartículas que contienen HSA, las nanopartículas terapéuticas purificadas o sus composiciones, reducen las reacciones alérgicas en los sujetos a los que se administran las nanopartículas o las composiciones (véanse, por ejemplo, los Ejemplos, 25, 27 y 61). Sin desear quedar ligado a hipótesis alguna, se propone que la reducción de las reacciones alérgicas puede ser el resultado de la reducción de la cantidad de polímeros de HSA en las nanopartículas purificadas o sus composiciones. Los presentes inventores descubrieron que durante la preparación de las nanopartículas, una parte de los monómeros de HSA formaron polímeros de HSA, causando reacciones alérgicas más graves (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 32 y 60). La purificación de las nanopartículas de la preparación inicial elimina la mayor parte de la HSA libre que no se está incorporada en las nanopartículas, incluyendo polímeros de HSA libre.

(2) En comparación con composiciones previamente conocidas que comprenden nanopartículas que contienen HSA, ciertas composiciones que comprenden nanopartículas terapéuticas purificadas proporcionadas en el presente documento son más estables (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 62 y 63). Esto es inesperado en vista de la reducción significativa en la relación de la HSA con respecto a los principios activos en las nanopartículas purificadas y composiciones de la presente divulgación y en vista de la creencia en la técnica de que para estabilizar composiciones que comprendan nanopartículas sea importante o necesaria una gran cantidad de HsA.

(3) Si se mantienen los perfiles de liberación in vitro, las dosis máximas toleradas, las propiedades farmacocinéticas y la eficacia en los estudios con animales (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 22 y 26-31), las nanopartículas terapéuticas purificadas o sus composiciones, proporcionadas en el presente documento, son más fáciles de suministrar a las células diana humanas y de que éstas las absorban (por ejemplo, células tumorales humanas y células endoteliales vasculares humanas) y logran mejores efectos deseables en esas células (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 58 y 59).

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente divulgación.

Aunque los intervalos numéricos y los valores aproximados de los parámetros se dan en un amplio intervalo de la presente divulgación, todos los números de los ejemplos específicos se describen con la mayor precisión posible. Sin embargo, existe cierto error en cualquier valor numérico esencialmente, que puede resultar de la desviación estándar durante la medición de cada uno de ellos. Además, debe entenderse que todos los intervalos desvelados en el presente documento abarcan todos y cada uno de los posibles subintervalos contenidos en el mismo. Por ejemplo, debe entenderse que el intervalo "de 1 a 10", descrito en el presente documento, abarca todos y cada uno de los posibles subintervalos entre el valor mínimo 1 y el valor máximo 10 (incluidos los extremos); es decir, todos los subintervalos que comienzan desde el valor mínimo de 1 o mayor, por ejemplo, de 1 a 6,1, y todos los subintervalos que finalizan en el valor máximo de 10 o menor, por ejemplo, de 5,5 a 10.

Además, cabe señalar que, a menos que se indique lo contrario de forma clara y explícita, la forma singular incluye el referente plural, tal y como se usa en la presente divulgación. A menos que en el contexto se indique claramente lo contrario, el término "o" y el término "y/o", se utilizan indistintamente.

El término "nanopartícula", utilizado en el presente documento, se refiere a la partícula con al menos una dimensión (por ejemplo, 1,2 o 3 dimensiones) a nanoescala, por ejemplo, al nivel de aproximadamente 1 nm, aproximadamente 10 nm o aproximadamente 100 nm.

El término "aproximadamente" significa más o menos del 10 % de un valor particular. Por ejemplo, "aproximadamente 50 nm" se refiere a de 45 nm a 55 nm.

La expresión "nanopartícula terapéutica", utilizada en el presente documento, se refiere a las nanopartículas que pueden utilizarse para el tratamiento o la prevención de enfermedades, en las que las enfermedades, por ejemplo cánceres, se seleccionan preferentemente de cáncer de hígado, cáncer de próstata y cáncer de pulmón.

La expresión "monómero de seroalbúmina humana" o "monómero de HSA", utilizada en el presente documento, se refiere a la globulina soluble en agua compuesta por 585 aminoácidos y el peso molecular aproximado es de aproximadamente 66000 Dalton. Es la proteína más abundante en el plasma sanguíneo humano. El tiempo de retención del monómero de seroalbúmina humana es el más largo en

la cromatografía de exclusión por tamaño y representa la mayor parte de los productos normales de la albúmina humana. La HSA tiene múltiples sitios de unión hidrófobos que pueden unirse a un conjunto diverso de fármacos, especialmente compuestos hidrófobos neutros y cargados negativamente.

La expresión "polímero de seroalbúmina humana" o "polímero de HSA" utilizada en el presente documento, se refiere a la suma de polímeros polimerizados por el monómero de seroalbúmina humana, incluyendo dímeros, trímeros y polímeros. El tiempo de retención del polímero de seroalbúmina humana en la cromatografía de exclusión por tamaño es más corto que el de los monómeros de HSA. Los polímeros HSA están presentes solo en una pequeña cantidad (normalmente<5 %) en los productos de albúmina humana.

La HSA se acumula en diversos tumores en crecimiento y las células tumorales la utilizan como fuente de captación de energía y aminoácidos. La gp60 (albondina) se hiperexpresa en el endotelio de los vasos sanguíneos y se une a la HSA para transportarla al tejido subyacente mediante transcitosis. La gp60 no se expresa en las células tisulares y no participa en el transporte de la HSA en las células tisulares. La SPARC (siglas del inglés secreted protein, acidic and rich in cysteine, proteína secretada, ácida y rica en cisteína), tiene las secuencias de aminoácidos homólogas con gp60 y puede unirse a los anticuerpos de HSA y gp60. La SPARC se sobreexpresa en múltiples tipos de tumores y muchos estudios han puesto de manifiesto que se correlaciona con la captación de HSA por parte de las células tisulares. Hay investigaciones que sugieren que los fármacos unidos a la HSA también atraviesan la barrera endotelial del tejido tumoral y que se internalizan en las células tumorales a través de la vía de transporte transmembrana Gp60-SPARC.

Las expresiones "nanopartículas sustancialmente puras" o "nanopartículas purificadas", utilizadas en el presente documento, se refieren a nanopartículas compuestas por seroalbúmina humana y un principio activo, en las que menos del 10 % de HSA (por ejemplo, menos del 9 %, menos del 8 %, menos del 7 %, menos del 6 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 %, menos del 1 %, menos del 0,5 % o menos del 0,1 %) es HSA libre.

De manera similar, las expresiones "carece sustancialmente de seroalbúmina humana libre" o "carece sustancialmente de HSA libre", utilizadas en el presente documento, se refieren a tener menos del 10 % de HSA libre (por ejemplo, menos del 9 %, menos del 8 %, menos del 7 %, menos del 6 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 %, menos del 1 %, menos de 0,5 % o menos de 0,1 %)

Las expresiones "seroalbúmina humana libre" o "HSA libre", utilizadas en el presente documento, se refieren a HSA que no está incorporada en nanopartículas. La cantidad de HSA libre en las nanopartículas o en sus composiciones, puede medirse mediante métodos conocidos en la técnica o mediante un método proporcionado en la presente divulgación, tal como en los Ejemplos 11 y 17-19.

La expresión "principio activo", utilizada en el presente documento, se refiere al principio farmacéutico activo. En particular, el principio activo se refiere a cualquier sustancia o entidad que pueda desempeñar un papel terapéutico (por ejemplo, el tratamiento, la prevención, el alivio o la supresión de cualquier enfermedad y/o trastorno).

La expresión "factor de diálisis", utilizada en el presente documento, se refiere a la relación de volumen de dializado consumido con respecto a una solución de muestra en un proceso de diálisis en el que el volumen de la solución de muestra se mantiene constante.

La expresión "excipiente de liofilización", utilizada en el presente documento, se refiere a compuestos añadidos a una composición farmacéutica que comprende nanopartículas terapéuticas purificadas para conservar dicha nanopartícula durante el proceso de liofilización.

Los términos, "tratar" y "tratamiento", se refieren a la gestión médica de una enfermedad, un trastorno o una afección de un sujeto (es decir, un paciente) (véase, por ejemplo, Stedman's Medical Dictionary). La expresión "tratamiento de un cáncer" se refiere a reducir el número de síntomas de cáncer, disminuir la gravedad de uno o más síntomas o retrasar la progresión de un cáncer.

Una "dosis terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico específico, se refiere a la cantidad de agente que es suficiente para reducir la gravedad de uno o más síntomas de cáncer, eliminar o retrasar su aparición o reincidencia, de una manera estadísticamente significativa.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona nanopartículas terapéuticas purificadas que comprenden un principio activo y HSA.

En algunas realizaciones, la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto al principio activo en las nanopartículas terapéuticas se selecciona del grupo que consiste en 0,03:1, 0,04:1, 0,05:1, 0,06:1, 0,07:1, 0,08:1, 0,09:1,0,10:1, 0,11:1, 0,12:1,0,13:1, 0,14:1, 0,15:1,0,16:1,0,17:1, 0,18:1, 0,19:1,0,2:1,0,21:1,0,22:1, 0,23:1,0,24:1, 0,25:1, 0,26:1,0,27:1,0,28:1,0,29:1, 0,3:1, 0,31:1, 0,32:1, 0,33:1, 0,34:1, 0,35:1, 0,36:1, 0,37:1, 0,38:1, 0,39:1, 0,4:1, 0,41:1,0,42:1, 0,43:1, 0,44:1,0,45:1, 0,46:1, 0,47:1,0,48:1,0,49:1, 0,5:1, 0,51:1,0,52:1,0,53:1,0,54:1, 0,55:1,0,56:1, 0,57:1, 0,58:1, 0,59:1, 0,6:1, 0,65:1, 0,70:1, 0,75:1, 0,8:1, 0,85:1, 0,9:1, 0,95:1 o del intervalo entre cualquiera de las dos relaciones anteriores.

En algunas realizaciones específicas, la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto al principio activo se selecciona del grupo que consiste en 0,03:1, 0,04:1, 0,05:1, 0,06:1, 0,07:1, 0,08:1, 0,09:1, 0,10:1, 0,11:1, 0,12:1, 0,13:1,0,14:1, 0,15:1, 0,16:1,0,17:1, 0,18:1, 0,19:1,0,2:1,0,21:1,0,22:1, 0,23:1,0,24:1,0,25:1,0,26:1, 0,27:1,0,28:1, 0,29:1, 0,3:1, 0,31:1, 0,32:1, 0,33:1, 0,34:1, 0,35:1, 0,36:1, 0,37:1, 0,38:1, 0,39:1, 0,4:1, 0,41:1, 0,42:1, 0,43:1, 0,44:1, 0,45:1, 0,46:1, 0,47:1, 0,48:1, 0,49:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1 o del intervalo entre cualquiera de las dos relaciones anteriores, por ejemplo, de 0,03:1 a 0,19:1 o de 0,21:1 a 0,9:1.

Más particularmente, en determinadas realizaciones, la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto al principio activo es de 0,043:1, 0,071:1, 0,13:1, 0,15:1, 0,16:1, 0,17:1, 0,18:1, 0,24:1 o 0,57:1 o del intervalo entre cualquiera de las dos relaciones anteriores, por ejemplo, de 0,043:1 a 0,071:1, de 0,043:1 a 0,13:1, de 0,043:1 a 0,15:1, de 0,043:1 a 0,16:1, de 0,043:1 a 0,17:1, de 0,043:1 a 0,18:1, de 0,043:1 a 0,24:1, de 0,043:1 a 0,57:1, de 0,071:1 a 0,13:1, de 0,071:1 a 0,15:1, de 0,071:1 a 0,16:1, de 0,071:1 a 0,17:1, de 0,071:1 a 0,18:1, de 0,071:1 a 0,24:1, de 0,071:1 a 0,57:1, de 0,13:1 a 0,15:1, de 0,13:1 a 0,16:1, de 0,13:1 a 0,17:1, de 0,13:1 a 0,18:1, de 0,13:1 a 0,24: 1, de 0,13:1 a 0,57:1, de 0,15:1 a 0,16:1, de 0,15:1 a 0,17:1, de 0,15:1 a 0,18:1, de 0,15:1 a 0,24:1, de 0,15:1 a 0,57:1, de 0,16:1 a 0,17:1, de 0,16:1 a 0,18:1, de 0,16:1 a 0,24:1, de 0,16:1 a 0,57:1, de 0,17:1 a 0,18:1, de 0,17:1 a 0,24:1, de 0,17:1 a 0,57:1, de 0,18:1 a 0,24:1, de 0,18:1 a 0,57:1 o de 0,24:1 a 0,57:1.

En algunas realizaciones, el principio activo adecuado para la encapsulación dentro de la seroalbúmina humana es insoluble o ligeramente soluble en agua y soluble o libremente soluble en un disolvente orgánico. El disolvente orgánico puede ser un disolvente puro con baja solubilidad en agua (por ejemplo, una solubilidad en agua inferior al 6 %) y bajo punto de ebullición (es decir, un punto de ebullición inferior a 80°°C) o su mezcla del disolvente puro descrito anteriormente con alcoholes de pequeño peso molecular, incluido etanol, terc-butanol, isopropanol, etc. Los disolventes orgánicos específicos incluyen, pero sin limitación, cloroformo, diclorometano, etc.

Los principios activos alternativos adecuados para la presente divulgación que no forman parte de la invención reivindicada son los taxanos, incluyendo, pero sin limitación, docetaxel, cabazitaxel, derivados hidrófobos de docetaxel (por ejemplo, 2'-O-hexanoildocetaxel y 2'-benzoildocetaxel); o macrólidos, incluyendo, pero sin limitación, rapamicina y sus derivados (por ejemplo, temsirolimus y everolimus), epotilona B y sus derivados, tanespimicina y sus derivados; o camptotecinas, incluyendo, pero sin limitación, 10-hidroxi camptotecina, SN-38 y sus derivados; o antibióticos de antraciclina, incluyendo, pero sin limitación, aclacinomicina y pirarrubicina; u otros principios activos, incluida la colchicina y sus derivados, dímero de tiocolchicina, amiodardona, liotironina, ciclosporina, exemestano, flutamida, fulvestrant, romidepsina, semustina, ibuprofeno, ciclosporina, propofol, vinblastina, etc. En algunas realizaciones, el principio activo es docetaxel En algunas otras realizaciones, el principio activo se selecciona de docetaxel, rapamicina y sus derivados, exemestano, flutamida, fulvestrant, etc.

Principios activos alternativos que no se encuentran dentro del ámbito de la invención reivindicada incluyen, pero sin limitación: agentes quimioterapéuticos, agentes radioterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos y agentes térmicamente terapéuticos, etc. Por ejemplo, aminoglutetimida, azatioprina, sulfato de bleomicina, busulfán, carmustina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, ciclosporina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, amicina, etopósido, fluorouracilo, interferón-a, lomustina, mercaptopurina, metotrexato, mitotano, clorhidrato de procarbazina, tioguanina, sulfato de vinblastina y sulfato de vincristina.

En algunas realizaciones, el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas se selecciona de 30, 50, 70, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 nm, o del intervalo entre cualquiera de dos valores numéricos anteriores. El experto en la materia debe entender que el tamaño de partícula puede determinarse utilizando cualquier método apropiado que exista o que aparezca en el futuro, que incluya, pero sin limitación, un método de sedimentación, un método de tamizado, una observación microscópica o un medidor de partículas láser. También debe entenderse que cuando las nanopartículas terapéuticas desveladas en la presente divulgación comprenden partículas múltiples, no todas las nanopartículas terapéuticas deben tener el mismo tamaño de partícula, y también estarán incluidas en el ámbito de la presente divulgación, siempre que su tamaño medio de partícula (es decir, el diámetro medio de partícula) se encuentre en el intervalo anterior. En algunas realizaciones específicas, el tamaño de partícula se determina mediante un medidor de partículas láser; y el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas se selecciona de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 nm, o del intervalo entre cualquiera de dos valores numéricos anteriores.

En algunos aspectos, los tamaños de partícula de las nanopartículas están en un intervalo específico, por ejemplo, de 30 nm a 200 nm, preferentemente, de 50 nm a 190 nm. Preferentemente, el tamaño de partícula es sustancialmente uniforme.

En una realización específica, se proporcionan nanopartículas terapéuticas purificadas, que comprenden paclitaxel y seroalbúmina humana, en las que el paclitaxel está encapsulado en seroalbúmina humana; y la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto a paclitaxel es de 0,043:1, y el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas es de 140 nm.

En otra realización específica, se proporcionan nanopartículas terapéuticas purificadas, que comprenden paclitaxel y seroalbúmina humana, en las que el paclitaxel está encapsulado en seroalbúmina humana; y la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto a paclitaxel es de 0,071:1, y el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas es de 134 nm.

En otra realización específica, se proporcionan nanopartículas terapéuticas purificadas, que comprenden paclitaxel y seroalbúmina humana, en las que el paclitaxel está encapsulado en seroalbúmina humana; y la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto a paclitaxel es de 0,13:1, y el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas es de 125 nm.

En otra realización específica, se proporcionan nanopartículas terapéuticas purificadas, que comprenden paclitaxel y seroalbúmina humana, en las que el paclitaxel está encapsulado en seroalbúmina humana; y la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto a paclitaxel es de 0,15:1, y el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas es de 136 nm.

En otra realización específica, se proporcionan nanopartículas terapéuticas purificadas, que comprenden paclitaxel y seroalbúmina humana, en las que el paclitaxel está encapsulado en seroalbúmina humana; y la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto a paclitaxel es de 0,16:1, y el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas es de 133 nm.

En otra realización específica, se proporcionan nanopartículas terapéuticas purificadas, que comprenden paclitaxel y seroalbúmina humana, en las que el paclitaxel está encapsulado en seroalbúmina humana; y la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto a paclitaxel es de 0,17:1, y el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas es de 136 nm.

En otra realización específica, se proporcionan nanopartículas terapéuticas purificadas, que comprenden paclitaxel y seroalbúmina humana, en las que el paclitaxel está encapsulado en seroalbúmina humana; y la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto a paclitaxel es de 0,18:1, y el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas es de 138 nm.

En otra realización específica, se proporcionan nanopartículas terapéuticas purificadas, que comprenden paclitaxel y seroalbúmina humana, en las que el paclitaxel está encapsulado en seroalbúmina humana; y la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto a paclitaxel es de 0,24:1, y el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas es de 141 nm.

En otra realización específica, se proporcionan nanopartículas terapéuticas purificadas, que comprenden paclitaxel y seroalbúmina humana, en las que el paclitaxel está encapsulado en seroalbúmina humana; y la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto a paclitaxel es de 0,57:1, y el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas es de 145 nm.

En una alternativa, no dentro del ámbito de la invención reivindicada, se proporcionan nanopartículas terapéuticas purificadas, que comprenden docetaxel y seroalbúmina humana, en las que el docetaxel está encapsulado en la seroalbúmina humana; y la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto a docetaxel es de 0,1:1, y el tamaño de partícula de las nanopartículas terapéuticas está en el intervalo de 110 nm a 150 nm.

Las nanopartículas terapéuticas purificadas de la presente divulgación carecen sustancialmente de HSA libre. En determinadas realizaciones, las nanopartículas terapéuticas purificadas contienen como máximo un 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o un 0,1 % en peso de HSA libre (es decir, como máximo un 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o un 0,1 % del total de HSA en las nanopartículas terapéuticas purificadas es HSA libre que no se une a un principio activo y que no se incorpora a las nanopartículas.

En determinadas realizaciones, Las nanopartículas terapéuticas purificadas consisten esencialmente en un principio activo y HSA, donde sustancialmente toda la HSA (es decir, más del 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 99,9 % de la HSA) se une al principio activo.

En determinadas realizaciones, las nanopartículas terapéuticas purificadas comprenden una cantidad mínima (por ejemplo, menos de 0,05, 0,04, 0,03, 0,02 o 0,01 mg/ml, o menos de 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05 o 0,01 pg/ml) de uno o más disolventes orgánicos utilizados en la preparación de dichas nanopartículas.

En determinadas realizaciones, las nanopartículas terapéuticas purificadas no contienen ningún tensioactivo.

En determinadas realizaciones, las nanopartículas purificadas proporcionadas en el presente documento tienen un potencial zeta relativamente alto, tal como de -20 a -45 o de -25 a -40.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende nanopartículas terapéuticas purificadas proporcionadas en el presente documento y que carece sustancialmente de HSA libre que no se incorpora en las nanopartículas. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende menos del 10%, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % de HSA libre.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se proporciona en forma de líquido, incluyendo, pero sin limitación, la forma adecuada para inyección a un sujeto. En una realización específica, la composición farmacéutica se prepara en forma de inyección.

En algunas otras realizaciones, la composición farmacéutica se proporciona en forma de sólido, incluyendo, pero sin limitación, polvo seco o polvo liofilizado.

En determinadas realizaciones específicas, la nanopartícula o la composición farmacéutica de la presente divulgación carece de deferoxamina o de su sal, por ejemplo, mesilato de deferoxamina.

En determinadas realizaciones específicas, las nanopartículas purificadas o las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación carecen de estabilizador adicional.

Cuando se proporciona en forma líquida, la composición farmacéutica comprende las nanopartículas terapéuticas de la presente divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las nanopartículas terapéuticas se suspenden en el vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero sin limitación, una solución tampón, un agente conservante, agua para inyección, solución salina normal y una solución isotónica. En algunas realizaciones específicas, la concentración del principio activo de las nanopartículas terapéuticas es de 1 a 10 mg/ml (por ejemplo, de 5 mg/ml) en la composición farmacéutica en forma líquida.

Cuando se proporciona en forma sólida, la composición farmacéutica comprende, consiste esencialmente en o consiste en: las nanopartículas terapéuticas de la presente divulgación y un excipiente de liofilización. En algunas realizaciones específicas, el excipiente de liofilización se selecciona de uno o más de manitol, sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa y dextrano. En determinadas realizaciones específicas, las nanopartículas terapéuticas se suspenden en una solución de excipiente de liofilización con la concentración de 5 % a 10 %, y posteriormente la solución se liofiliza para obtener una composición farmacéutica en forma de polvo liofilizado. En realizaciones particulares, la solución de excipiente de liofilización se selecciona de una o más de una solución de manitol al 5 %, solución de sacarosa al 10 %, solución de dextrano al 5 %, solución de lactosa al 10 %, solución de trehalosa al 10 % y solución de maltosa al 10 %. En algunas realizaciones específicas, el contenido de las nanopartículas terapéuticas en la composición farmacéutica en forma sólida es de 4,8 % a 10 % en peso.

También se proporciona el método para preparar las nanopartículas terapéuticas purificadas de la presente divulgación, que comprende: (1) preparar una suspensión que contenga nanopartículas terapéuticas mezclando un principio activo con seroalbúmina humana, y (2) purificar nanopartículas de la suspensión para obtener nanopartículas terapéuticas sustancialmente puras.

En otro aspecto, la presente divulgación también proporciona nanopartículas terapéuticas obtenidas mediante el método proporcionado en el presente documento.

En otro aspecto, se proporciona un método para preparar nanopartículas terapéuticas purificadas. Comprendiendo el método:

1) disolver paclitaxel en disolvente orgánico para formar una fase oleaginosa, y disolver seroalbúmina humana en agua para formar una fase acuosa;

2) formar una emulsión de aceite en agua utilizando la fase oleaginosa y la fase acuosa;

3) eliminar el disolvente orgánico en la emulsión para obtener una suspensión que contenga las nanopartículas terapéuticas;

4) eliminar de la suspensión la HSA libre que no esté incorporada en las nanopartículas para obtener nanopartículas terapéuticas purificadas.

Basándose en las propiedades del principio activo, el experto en la materia puede seleccionar el (los) disolvente(s) orgánico(s) apropiado(s). En algunas realizaciones específicas, el disolvente orgánico adecuado es cloroformo, etanol o una mezcla de cloroformo y etanol. En algunas realizaciones específicas, la relación de volumen entre el cloroformo y el etanol está en el intervalo de 1:1 a 20:1, y por ejemplo, se selecciona de 1:1, 4:1, 9:1 y 11:1. En algunas realizaciones específicas, la concentración de la seroalbúmina humana en la fase acuosa está en el intervalo de 2 % a 10 % (p/v); por ejemplo, se selecciona de 2 %, 4 %, 5 % y 10 %. En algunas realizaciones, la relación entre el principio activo y el disolvente orgánico en la fase oleaginosa está en el intervalo de 0,3 a 7,5 g/15 a 20 ml. En algunas realizaciones específicas, la relación entre el principio activo y el solvente orgánico en la fase oleaginosa se selecciona de: 0,3 g/15 ml, 0,6 g/15 ml, 1 g/20 ml, 1,25 g/15 ml, 1,8 g/15 ml, 2 g/15 ml, 2,5 g/15 ml, 3 g/20 ml, 3 g/15 ml, 5 g/15 ml, 7,5 g/15 ml, o del intervalo entre cualquiera de dos valores numéricos anteriores.

Cuando se forma una emulsión de aceite en agua con la fase oleaginosa y la fase acuosa, la relación de volumen entre las dos fases se selecciona de 1:10 a 1:100. En algunas realizaciones, la relación de mezcla de la fase oleaginosa y la fase acuosa es de 3:100 o de 1:25. Utilizando el procedimiento conocido en la técnica, se forma una emulsión de aceite en agua, que incluye, pero sin limitación, homogeneización. En realizaciones particulares, para obtener una emulsión de aceite en agua, la mezcla de la fase oleaginosa y la fase acuosa se emulsiona utilizando un dispersor de alta cizalla, y posteriormente, se homogeneiza utilizando un homogeneizador de alta presión. En realizaciones particulares, para obtener una emulsión de aceite en agua, la mezcla de la fase oleaginosa y la fase acuosa se emulsiona durante 2-10 min utilizando un dispersor de alta cizalla, y posteriormente, se homogeneiza utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi.

El disolvente orgánico puede eliminarse de la emulsión utilizando cualquier procedimiento apropiado. En algunas realizaciones, el disolvente orgánico se elimina de la emulsión mediante evaporación rotatoria al vacío. En realizaciones particulares, el disolvente orgánico se elimina de la emulsión utilizando un evaporador rotatorio a 40 °C a una presión de 40 mbar. Después de eliminar el disolvente orgánico, la suspensión resultante comprende las nanopartículas terapéuticas de la presente divulgación. Sin embargo, un exceso de albúmina, que no participa en la formación de la nanopartícula, también está contenido en la suspensión.

El exceso de albúmina libre se elimina adicionalmente de la suspensión para obtener nanopartículas terapéuticas purificadas de la presente divulgación que carezcan sustancialmente de HSA libre. En algunas realizaciones, esto se lleva a cabo mediante centrifugación, diálisis o cromatografía de exclusión. En realizaciones particulares, la suspensión puede utilizarse directamente para eliminar la HSA libre después de eliminar el disolvente orgánico. Como alternativa, se puede conservar para su uso posterior.

Dado que la infusión intravenosa es la vía de administración deseable para las nanopartículas terapéuticas de la presente divulgación, el producto debe estar esterilizado. La termoesterilización no es aplicable en la presente divulgación, ya que tanto las nanopartículas como la seroalbúmina humana son sensibles a la temperatura. Por tanto, entre los procedimientos de esterilización viables figuran la producción aséptica o la filtración por esterilización. En estos casos, después de eliminar el disolvente orgánico, la suspensión se esteriliza haciéndola pasar a través de un filtro, y posteriormente, se liofiliza para obtener un sólido. El sólido obtenido se resuspende en una solución de cloruro de sodio. En algunas realizaciones, el sólido se resuspende en una solución de cloruro de sodio al 0,9 % para alcanzar una concentración de paclitaxel de aproximadamente 5 mg/ml.

Cuando las nanopartículas terapéuticas se purifican mediante centrifugación, la eliminación de la HSA libre se realiza a 21 000 x g durante 60 min o a condiciones equivalentes.

Cuando las nanopartículas terapéuticas se purifican mediante diálisis, la suspensión obtenida en la etapa 3), que contiene las nanopartículas, se dializa utilizando una membrana de ultrafiltración para eliminar la HSA libre. En realizaciones particulares, el líquido de las nanopartículas obtenido según el procedimiento de la presente divulgación, se dializa en un mismo volumen de solución de manitol al 5 % utilizando una membrana de ultrafiltración de celulosa regenerada con un peso molecular límite de 300 K y siendo el factor de diálisis de 5.

Cuando las nanopartículas terapéuticas se purifican utilizando cromatografía de exclusión, las nanopartículas terapéuticas se separan de la HSA libre utilizando una columna cromatográfica de exclusión. En realizaciones particulares, la suspensión obtenida en la etapa 3), que contiene las nanopartículas, se aplica sobre una columna de sefarosa y se recoge el pico de elución correspondiente a las nanopartículas terapéuticas.

En determinadas realizaciones, el procedimiento comprende además, entre las etapas 3) y 4), una etapa de dializar la suspensión de la etapa 3) con una solución acuosa (por ejemplo, con agua o con una solución de manitol al 5 %, solución de sacarosa al 10 %, solución de dextrano al 5 %, solución de lactosa al 10 %, solución de trehalosa al 10 % y solución de maltosa al 10 %, etc.) para eliminar el disolvente orgánico restante de la suspensión. Por ejemplo, la suspensión puede dializarse en agua o en una solución acuosa utilizando una membrana de ultrafiltración que deja pasar el disolvente orgánico pero no la HSA ni las nanopartículas (por ejemplo, una membrana de ultrafiltración de celulosa con un peso molecular límite de 30 K). Sin desear quedar ligado a teoría alguna, la eliminación o reducción del disolvente orgánico restante antes de la eliminación de la HSA libre de la suspensión que contiene las nanopartículas, puede mejorar la estabilidad de las nanopartículas purificadas o de sus composiciones.

En otro aspecto, también se proporciona un procedimiento para preparar una composición farmacéutica que comprende las nanopartículas terapéuticas. Comprendiendo el método:

1) disolver paclitaxel en disolvente orgánico para formar una fase oleaginosa, y disolver seroalbúmina humana en agua para formar una fase acuosa;

2) formar una emulsión de aceite en agua utilizando la fase oleaginosa y la fase acuosa;

3) eliminar el disolvente orgánico en la emulsión para obtener una suspensión que contenga las nanopartículas terapéuticas;

4) eliminar la HSA libre que no esté incorporada en las nanopartículas para obtener nanopartículas terapéuticas purificadas;

5) resuspender las nanopartículas terapéuticas purificadas en una solución que contenga un vehículo farmacéuticamente aceptable para obtener la composición farmacéutica; y

6) liofilizar opcionalmente la resuspensión de las nanopartículas terapéuticas purificadas donde la composición farmacéutica se encuentra en forma sólida.

Las etapas 1) y 4) de este procedimiento son las mismas que las descritas con respecto al procedimiento de preparación de nanopartículas terapéuticas purificadas. Además, en determinadas realizaciones, el procedimiento comprende, entre las etapas 3) y 4), una etapa de dializar la suspensión de la etapa 3) con una solución acuosa para eliminar el disolvente orgánico restante de la suspensión, también como se describe con respecto al procedimiento de preparación de nanopartículas terapéuticas purificadas.

En algunas realizaciones, la solución que contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable, es la solución que contiene un excipiente de liofilización. En algunas realizaciones específicas, el excipiente de liofilización se selecciona de uno o más de manitol, sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa y dextrano. En algunas otras realizaciones específicas, el excipiente de liofilización es HSA. En realizaciones específicas, las nanopartículas terapéuticas se suspenden en una solución de excipiente de liofilización a una concentración del 5 % al 10 %.

Opcionalmente, la composición farmacéutica se prepara en polvo liofilizado después de la liofilización. En realizaciones particulares, la solución de excipiente de liofilización se selecciona de una o más de una solución de manitol al 5 %, solución de sacarosa al 10 %, solución de dextrano al 5 %, solución de lactosa al 10 %, solución de trehalosa al 10 %, solución de maltosa al 10 % y solución de seroalbúmina humana al 10 %.

En algunas realizaciones específicas, el contenido de las nanopartículas terapéuticas en la composición farmacéutica en forma líquida es de 0,1 % a 30 %, y preferentemente, de 0,2 % a 10 %, y más preferentemente, de 0,5 % a 5 %, por ejemplo, 1 %. En algunas realizaciones específicas, el contenido de paclitaxel en la composición farmacéutica en forma líquida de la presente divulgación es de 0,1 a 100 mg/ml, y preferentemente, de 0,5 a 50 mg/ml, y más preferentemente, de 1 a 20 mg/ml, por ejemplo, 5 mg/ml.

En determinadas realizaciones, el contenido de las nanopartículas terapéuticas en la composición farmacéutica en forma sólida es de 0,1 % a 80 % en peso, y preferentemente, de 0,5 % a 50 %, y más preferentemente, de 1 % a 30 %, por ejemplo, de 2 % a 10 %.

En algunas realizaciones específicas, el contenido de paclitaxel en la composición farmacéutica en forma líquida es de 0,1 % a 80 % en peso, y preferentemente, de 0,5 % a 50 %, y más preferentemente, de 1 % a 30 %, por ejemplo, de 2 % a 10 %.

Como alternativa, la composición farmacéutica de la presente divulgación puede prepararse utilizando otro procedimiento de diálisis. Comprendiendo el método:

1) disolver paclitaxel en disolvente orgánico para formar una fase oleaginosa y disolver seroalbúmina humana en agua para formar una fase acuosa;

2) formar una emulsión de aceite en agua utilizando las fases oleaginosa y acuosa anteriores;

3) eliminar el disolvente orgánico en la emulsión para obtener una suspensión que contenga las nanopartículas terapéuticas;

4) dializar la suspensión obtenida después de la eliminación del disolvente orgánico mediante una solución que contenga un vehículo farmacéuticamente aceptable para eliminar la HSA libre que no está incorporada en las nanopartículas; y

5) opcionalmente, liofilizar la suspensión dializada cuando la composición farmacéutica se prepara en forma sólida.

Las etapas 1) y 4) de este procedimiento son las mismas que las descritas con respecto al procedimiento de preparación de nanopartículas terapéuticas purificadas cuando se utiliza diálisis para eliminar la h Sa libre. Además, en determinadas realizaciones, el procedimiento comprende, entre las etapas 3) y 4), una etapa de dializar la suspensión de la etapa 3) con una solución acuosa para eliminar el disolvente orgánico restante de la suspensión, también como se describe con respecto al procedimiento de preparación de nanopartículas terapéuticas purificadas.

En algunas realizaciones, como dializado, se utiliza una solución que contenga un vehículo farmacéuticamente aceptable, que es la solución que contiene el excipiente de liofilización. En algunas realizaciones específicas, el excipiente de liofilización se selecciona de uno o más de manitol, sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa y dextrano.

En realizaciones específicas, las nanopartículas terapéuticas se suspenden en una solución de excipiente de liofilización con una concentración del 5 % al 10 %. Opcionalmente, la composición farmacéutica se prepara en polvo liofilizado después de la liofilización.

En realizaciones particulares, la solución de excipiente de liofilización se selecciona de una o más de una solución de manitol al 5 %, solución de sacarosa al 10 %, solución de dextrano al 5 %, solución de lactosa al 10 %, solución de trehalosa al 10 %, solución de maltosa al 10 % y solución de seroalbúmina humana al 10 %. En algunas realizaciones, la diálisis se realiza utilizando una membrana de ultrafiltración con un peso molecular límite de 300 k.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para utilizar las nanopartículas terapéuticas purificadas o sus composiciones. Dado que las presentes nanopartículas purificadas o sus composiciones, son medios eficaces para suministrar diversos principios activos, éstas pueden utilizarse para tratar cualquier enfermedad o trastorno que responda a los principios activos. Por ejemplo, las nanopartículas terapéuticas purificadas o sus composiciones pueden utilizarse en el tratamiento del cáncer, tal como el cáncer de hígado, cáncer de próstata y cáncer de pulmón. Otras enfermedades o trastornos que pueden tratarse incluyen cáncer de mama, mieloma múltiple, rechazo de trasplante, cáncer de colon, linfoma, fiebre, etc.

En un aspecto particular, la presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento. En realizaciones específicas, el sujeto es un mamífero, incluyendo, pero sin limitación, un ser humano, un animal canino, un ratón y una rata.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica puede determinarse o ajustarse dependiendo de diversos factores, incluidos los agentes terapéuticos o las composiciones farmacéuticas específicos, las vías de administración, el estado del sujeto, es decir, la fase de la enfermedad, la gravedad de los síntomas causados por la enfermedad, el estado de salud general, así como la edad, género y peso, y otros factores evidentes para un experto en la técnica médica. De manera similar, la dosis del agente terapéutico para tratar una enfermedad o un trastorno puede determinarse según los parámetros que entiende un experto en la técnica médica. Las dosis óptimas generalmente pueden determinarse utilizando modelos y/o ensayos clínicos de experimentación.

La composición farmacéutica puede administrarse a través de cualquier vía adecuada, por ejemplo, por administración oral, nasal, intracutánea, subcutánea, intramuscular o intravenosa.

En otro aspecto, en la presente divulgación también se proporciona un kit farmacéutico, que comprende nanopartículas terapéuticas purificadas o una composición farmacéutica de las mismas proporcionada en el presente documento. Si fuera necesario, el kit farmacéutico también incluye instrucciones, una caja y un recipiente que contiene las nanopartículas terapéuticas o la composición farmacéutica.

Ejemplos

Con los siguientes Ejemplos se pretende ilustrar mejor las nanopartículas terapéuticas y la composición farmacéutica desveladas en el presente documento, y no limitar ningún aspecto de la presente divulgación.

Ejemplo 1

Se disolvieron 3 g de paclitaxel (CAS: 33069-62-4, Yunnan Hande Bio-Tech Co., Ltd) en 20 ml de cloroformo/etanol (9:1, v/v) y se añadieron a 500 ml de solución de seroalbúmina humana (5 % p/v) (CAS: 70024-90-7, Guangdong Shuanglin Biopharmaceutical. Co., Ltd.). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Modelo F22E, Fluko Co., Ltd., Shanghai) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión (Modelo M110-EH30K, MFIC Company, EE.UU.) a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio (Modelo R-210, Buchi Company, Suiza) para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de paclitaxel-albúmina se generaron así con un diámetro medio de 136 nm y la suspensión era translúcida.

La suspensión se puede filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm (Sartorius AG, Alemania). No hubo variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración y no se observaron cambios significativos después de la conservación durante 48 h a temperatura ambiente. La suspensión se dividió en alícuotas y se liofilizó durante 24 h en un liofilizador (Modelo LD-85S, Millrock, EE.UU.) para obtener una torta blanquecina estable.

Ejemplo 2

Se disolvieron 0,32 g de paclitaxel (CAS: 33069-62-4, Yunnan Hande Bio-Tech Co., Ltd) en 15 ml de cloroformo/etanol (11:1, v/v), y se añadieron a 500 ml de solución de seroalbúmina humana (4 % p/v) (CAS: 70024-90-7, Guangdong Shuanglin Biopharmaceutical. Co., Ltd.). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Modelo F22E, Fluko Co., Ltd., Shanghai) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión (Modelo M110-EH30K, MFIC Company, EE.UU.) a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio (Modelo R-210, Buchi Company, Suiza) para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de paclitaxel-albúmina se generaron así con un diámetro medio de 145 nm y la suspensión era translúcida.

La suspensión se puede filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm (Sartorius AG, Alemania). No hubo variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración y no se observaron cambios significativos después de la conservación durante 48 h a temperatura ambiente. La suspensión se dividió en alícuotas y se liofilizó durante 24 h en un liofilizador (Modelo LD-85S, Millrock, EE.UU.) para obtener una torta blanquecina estable.

Ejemplo 3

Se disolvieron 0,63 g de paclitaxel (CAS: 33069-62-4, Yunnan Hande Bio-Tech Co., Ltd) en 15 ml de cloroformo/etanol (11:1, v/v) y se añadieron a 500 ml de solución de seroalbúmina humana (4 % p/v) (CAS: 70024-90-7, Guangdong Shuanglin Biopharmaceutical. Co., Ltd.). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión (Modelo M110-EH30K, MFIC Company, EE.Uu .) a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio (Modelo R-210, Buchi Company, Suiza) para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de paclitaxel-albúmina se generaron así con un diámetro medio de 141 nm y la suspensión era translúcida.

La suspensión se puede filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm (Sartorius AG, Alemania). No hubo variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración y no se observaron cambios significativos después de la conservación durante 48 h a temperatura ambiente. La suspensión se dividió en alícuotas y se liofilizó durante 24 h en un liofilizador (Modelo LD-85S, Millrock, EE.UU.) para obtener una torta blanquecina estable.

Ejemplo 4

Se disolvieron 1,25 g de paclitaxel (CAS: 33069-62-4, Yunnan Hande Bio-Tech Co., Ltd) en 15 ml de cloroformo/etanol (11:1, v/v), y se añadieron a 500 ml de solución de seroalbúmina humana (4 % p/v) (CAS: 70024-90-7, Guangdong Shuanglin Biopharmaceutical. Co., Ltd.). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Modelo F22Z, Fluko Co., Ltd., Shanghai) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión (Modelo M110-EH30K, MFIC Company, EE.UU.) a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio (Modelo R-210, Buchi Company, Suiza) para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de paclitaxel-albúmina se generaron así con un diámetro medio de 138 nm y la suspensión era translúcida.

La suspensión se puede filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm (Sartorius AG, Alemania). No hubo variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración y no se observaron cambios significativos después de la conservación durante 48 h a temperatura ambiente. La suspensión se dividió en alícuotas y se liofilizó durante 24 h en un liofilizador (Modelo LD-85S, Millrock, EE.UU.) para obtener una torta blanquecina estable.

Ejemplo 5

Se disolvieron 1,88 g de paclitaxel (CAS: 33069-62-4, Yunnan Hande Bio-Tech Co., Ltd) en 15 ml de cloroformo/etanol (11:1, v/v), y se añadieron a 500 ml de solución de seroalbúmina humana (4 % p/v) (CAS: 70024-90-7, Guangdong Shuanglin Biopharmaceutical. Co., Ltd.). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión (Modelo M110-EH30K, MFIC Company, EE.Uu .) a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio (Modelo R-210, Buchi Company, Suiza) para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de paclitaxel-albúmina se generaron así con un diámetro medio de 133 nm y la suspensión era translúcida.

La suspensión se puede filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm (Sartorius AG, Alemania). No hubo variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración y no se observaron cambios significativos después de la conservación durante 48 h a temperatura ambiente. La suspensión se dividió en alícuotas y se liofilizó durante 24 h en un liofilizador (Modelo LD-85S, Millrock, EE.UU.) para obtener una torta blanquecina estable.

Ejemplo 6

Se disolvieron 2,5 g de paclitaxel (CAS: 33069-62-4, Yunnan Hande Bio-Tech Co., Ltd) en 15 ml de cloroformo/etanol (11:1, v/v), y se añadieron a 500 ml de solución de seroalbúmina humana (4 % p/v) (CAS: 70024-90-7, Guangdong Shuanglin Biopharmaceutical. Co., Ltd.). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión (Modelo M110-EH30K, MFIC Company, EE.Uu .) a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio (Modelo R-210, Buchi Company, Suiza) para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de paclitaxel-albúmina se generaron así con un diámetro medio de 125 nm y la suspensión era translúcida.

La suspensión se puede filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm (Sartorius AG, Alemania). No hubo variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración y no se observaron cambios significativos después de la conservación durante 48 h a temperatura ambiente. La suspensión se dividió en alícuotas y se liofilizó durante 24 h en un liofilizador (Modelo LD-85S, Millrock, EE.UU.) para obtener una torta blanquecina estable.

Ejemplo 7

Se disolvieron 5 g de paclitaxel (CAS: 33069-62-4, Yunnan Hande Bio-Tech Co., Ltd) en 15 ml de cloroformo/etanol (11:1, v/v), y se añadieron a 500 ml de solución de seroalbúmina humana (4 % p/v) (CAS: 70024-90-7, Guangdong Shuanglin Biopharmaceutical. Co., Ltd.). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión (Modelo M110-EH30K, MFIC Company, EE.Uu .) a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio (Modelo R-210, Buchi Company, Suiza) para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de paclitaxel-albúmina se generaron así con un diámetro medio de 134 nm y la suspensión era translúcida.

La suspensión se puede filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm (Sartorius AG, Alemania). No hubo variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración y no se observaron cambios significativos después de la conservación durante 48 h a temperatura ambiente. La suspensión se dividió en alícuotas y se liofilizó durante 24 h en un liofilizador (Modelo LD-85S, Millrock, EE.UU.) para obtener una torta blanquecina estable.

Ejemplo 8

Se disolvieron 7,5 g de paclitaxel (CAS: 33069-62-4, Yunnan Hande Bio-Tech Co., Ltd) en 15 ml de cloroformo/etanol (11:1, v/v), y se añadieron a 500 ml de solución de seroalbúmina humana (4 % p/v) (CAS: 70024-90-7, Guangdong Shuanglin Biopharmaceutical. Co., Ltd.). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión (Modelo M110-EH30K, MFIC Company, EE.Uu .) a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio (Modelo R-210, Buchi Company, Suiza) para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de paclitaxel-albúmina se generaron así con un diámetro medio de 140 nm y la suspensión era translúcida.

La suspensión se puede filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm (Sartorius AG, Alemania). No hubo variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración y no se observaron cambios significativos después de la conservación durante 48 h a temperatura ambiente. La suspensión se dividió en alícuotas y se liofilizó durante 24 h en un liofilizador (Modelo LD-85S, Millrock, EE.UU.) para obtener una torta blanquecina estable.

Ejemplo 9

Se disolvieron 1 g de paclitaxel (CAS: 33069-62-4, Yunnan Hande Bio-Tech Co., Ltd) en 20 ml de cloroformo/etanol (4:1, v/v), y se añadieron a 500 ml de solución de seroalbúmina humana (2 % p/v) (CAS: 70024-90-7, Guangdong Shuanglin Biopharmaceutical. Co., Ltd.). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión (Modelo M110-EH30K, MFIC Company, EE.Uu .) a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio (Modelo R-210, Buchi Company, Suiza) para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de paclitaxel-albúmina se generaron así con un diámetro medio de 136 nm y la suspensión era translúcida.

La suspensión se puede filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm (Sartorius AG, Alemania). No hubo variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración y no se observaron cambios significativos después de la conservación durante 48 h a temperatura ambiente. La suspensión se dividió en alícuotas y se liofilizó durante 24 h en un liofilizador (Modelo LD-85S, Millrock, EE.UU.) para obtener una torta blanquecina estable.

Ejemplo 10. Procedimientos de determinación del contenido de seroalbúmina humana y paclitaxel

El contenido de seroalbúmina humana se determinó mediante HPLC. La seroalbúmina humana se determinó a una longitud de onda de 228 nm en una HPLC equipada con una columna de gel Tosohaas TSK G3000 SWXL y un detector UV (1260VWD G1314B, Agilent Technologies), con una fase móvil de solución de fosfato de hidrógeno dipotásico 0,1 mol/l y un volumen de inyección de 10 pl. El contenido de albúmina se calculó utilizando el método estándar externo.

Preparación de las soluciones de ensayo: las soluciones de ensayo se prepararon diluyendo la solución para la determinación utilizando una solución de cloruro de sodio al 0,9 % hasta una concentración de albúmina inferior a 3 mg/ml.

El contenido de paclitaxel se determinó mediante HPLC. El paclitaxel se determinó a una longitud de onda de 228 nm en una HPLC equipada con una columna de fase inversa C18 y un detector UV (1260VWD G1314B, Agilent technologies), con una fase móvil de acetonitrilo-agua (1:1, v/v) y un volumen de inyección de 10 pl. El contenido de paclitaxel se calculó utilizando el método estándar externo.

Preparación de las soluciones de ensayo: las soluciones de ensayo se prepararon diluyendo la solución para la determinación utilizando acetonitrilo hasta la disolución completa de paclitaxel, siendo la concentración de 20­ 200 pg/ml.

Ejemplo 11

El producto obtenido en el Ejemplo 1 se reconstituyó en una solución de cloruro de sodio al 0,9 % para obtener la muestra 1, siendo el contenido de paclitaxel de 5 mg/ml. Posteriormente, la muestra 1 se diluyó con plasma sanguíneo simulado que contenía albúmina al 5 %, de modo que el contenido de paclitaxel pudo alcanzar los 20 pg/ml para obtener la muestra 2 (las partículas se disgregaron completamente en tal estado, y no había partículas unidas a paclitaxel-seroalbúmina humana). Durante diversas duraciones, 1 ml de muestra 1 y 1 ml de muestra 2, se centrifugaron a 21 000 x g, respectivamente. Las concentraciones de paclitaxel y de seroalbúmina en el sobrenadante se determinaron utilizando los métodos mencionados en el Ejemplo 10, y los resultados se enumeran en la tabla 1.

T l 1. n n r i n li x l r l min n l r n n if r n r i n nrif r n

Se sugirió que en la muestra completamente disgregada (Muestra 2) no se generaba precipitación después de la centrifugación. No se observaron variaciones significativas de las concentraciones de paclitaxel y albúmina en el sobrenadante en las diferentes duraciones de centrifugación, es decir, no había cristales de paclitaxel ni partículas pesadas en la solución.

Se produjo un precipitado en el fondo después de la centrifugación en la muestra no disgregada (Muestra 1). La concentración de paclitaxel en el sobrenadante disminuyó con el tiempo de centrifugación y finalmente alcanzó el equilibrio. La concentración de albúmina aumentó ligeramente con el tiempo y finalmente alcanzó el equilibrio (el volumen del sobrenadante era aproximadamente el 90 % del volumen total). En conclusión, las nanopartículas de la muestra pueden aislarse y purificarse mediante centrifugación.

Después de centrifugar durante 60 min, la concentración de paclitaxel en el sobrenadante alcanzó el equilibrio. Por tanto, las partículas de paclitaxel-albúmina pueden aislarse a 21000 x g durante 60 min.

Ejemplo 12. Preparación de las nanopartículas

Utilizando el método de centrifugación mencionado en el Ejemplo 11, se aislaron partículas de las muestras obtenidas en el Ejemplo 1-9. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se desecharon y los precipitados así obtenidos eran las nanopartículas de paclitaxel-albúmina, que se denominaron partícula 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, correspondiente al ejemplo 1-9.

Ejemplo 13. Observación mediante microscópica electrónica de barrido sobre la morfología de las partículas antes y después de la separación

El polvo liofilizado de la muestra obtenida en el Ejemplo 5, y el precipitado del Ejemplo 5 obtenido en el Ejemplo 12 (partícula 5), se observaron con un microscopio electrónico de barrido (S-4800, Hitachi). A partir del resultado de la Fig. 1 puede apreciarse que una pequeña cantidad de partículas de la muestra del Ejemplo 5 se embebió en el agente de soporte formado por una gran cantidad de albúmina. Mientras que para la Partícula 5, estas partículas existían de forma independiente (Véase la Fig. 2). Por tanto, se puede confirmar que el precipitado obtenido mediante el procedimiento de separación del Ejemplo 11 era nanopartículas puras o sustancialmente puras.

Ejemplo 14. La relación entre la albúmina y el paclitaxel en la partícula

Las nanopartículas de paclitaxel-albúmina (correspondientes al Ejemplo 1-9) obtenidas en el Ejemplo 12, se resuspendieron respectivamente en 1 ml de solución de cloruro de sodio al 0,9 %. Cada uno de los contenidos de paclitaxel y albúmina en las muestras, se determinaron utilizando el procedimiento del Ejemplo 10, y los resultados son los siguientes:

Tabla 2. La relación entre la albúmina y el paclitaxel en diversas nanopartículas purificadas obtenidas después de la centrifu ación

Los resultados anteriores han sugerido que las relaciones entre la albúmina y el paclitaxel en las nanopartículas purificadas de los productos obtenidos utilizando diferentes procesos de formulación, eran diferentes y tenían cierta regularidad. También puede apreciarse que el aumento de la concentración de paclitaxel en la fase oleaginosa era inversamente proporcional al contenido de albúmina.

Ejemplo 15. Preparación de nanopartículas purificadas utilizando diálisis

La diálisis se realizó en el mismo volumen que las muestras preparadas en el Ejemplo 2, Ejemplo 5 y Ejemplo 8 después de reconstituirse con agua para inyección frente a la solución de diálisis de manitol al 5 % utilizando una membrana de ultrafiltración de celulosa regenerada (PXC300C50, Millipore) con el peso molecular límite de 300 K, y siendo el factor de diálisis de 5. Los contenidos de paclitaxel y albúmina en las muestras, se determinaron después de la diálisis utilizando el procedimiento del Ejemplo 10, y los resultados son los siguientes:

Tabla 3. Relaciones entre la albúmina y el paclitaxel en las nanopartículas purificadas de diversas formulaciones obtenidas or diálisis

Los resultados anteriores han indicado una relación en peso sustancialmente similar entre la albúmina y el paclitaxel en las partículas obtenidas por diálisis utilizando una membrana de ultrafiltración, en comparación con las partículas obtenidas por centrifugación. Como resultado, para aislar las partículas en la suspensión del exceso de albúmina y para reemplazar la solución que rodea las partículas, también puede utilizarse diálisis utilizando una membrana de ultrafiltración.

Ejemplo 16. Preparación de nanopartículas purificadas en una columna cromatográfica

En una columna de vidrio con un diámetro de 10 mm (O 10 mm*230 mm, Beijing Mancang Technology Ltd.) se rellenaron 20 ml de gel de Sepharose 4B. La columna se equilibró con una solución de cloruro de sodio al 0,9 % hasta 3 veces los volúmenes de la columna. Muestras de 1 ml preparadas en el Ejemplo 2, Ejemplo 5 y Ejemplo 8, se cargaron en la parte superior de la columna de gel y se eluyeron utilizando una solución de cloruro de sodio al 0,9 %, respectivamente. El efluente se controló en línea utilizando un detector de UV a la longitud de onda de 280 nm. El efluente correspondiente al primer pico del cromatograma era una suspensión ligeramente turbia, que se recogió para la determinación del paclitaxel y de la albúmina. El registro continuó hasta que finalizó el segundo pico. Ambos picos estaban bien separados, lo que indicaba que las partículas y la albúmina libre podían separarse eficazmente utilizando la columna de gel de Sepharose 4B. Los contenidos de paclitaxel y albúmina en las partículas, se determinaron utilizando el método del Ejemplo 10, y los resultados son los siguientes:

Tabla 4. Relaciones entre la albúmina y el paclitaxel en las nanopartículas purificadas de diversas formulaciones obtenidas or se aración en una columna cromato ráfica

Los resultados anteriores indicaron una relación en peso sustancialmente similar entre la albúmina y el paclitaxel en las partículas obtenidas por separación en una columna de gel, en comparación con las partículas obtenidas por centrifugación y diálisis. Como resultado, la separación en columna de gel también puede utilizarse para aislar las partículas en la suspensión del exceso de albúmina.

Ejemplo 17. Determinación del contenido de albúmina libre en las nanopartículas purificadas preparadas por diálisis utilizando centrifugación

La suspensión de partículas obtenida por diálisis en el Ejemplo 15 se aisló adicionalmente por centrifugación en las condiciones del Ejemplo 11. Después de que se precipitaran todas las partículas en el fondo del tubo de centrífuga, se determinó la concentración de albúmina en el sobrenadante y los resultados se enumeran en la Tabla 5.

Tabla 5. Variación de la concentración de albúmina en las nanopartículas purificadas de diversas formulaciones obtenidas or diálisis antes des ués de la centrifu ación

ND significa más bajo que el límite de determinación, es decir, no detectado.

A partir de los resultados anteriores puede apreciarse que en la suspensión de nanopartículas de paclitaxel-albúmina obtenida por diálisis, la proporción de albúmina libre era bastante baja, y que la mayor parte de la albúmina se unía al paclitaxel para formar nanopartículas.

Ejemplo 18. Determinación del contenido de albúmina libre en las nanopartículas purificadas preparadas mediante separación cromatográfica en columna utilizando centrifugación

La suspensión de partículas obtenida mediante separación cromatográfica en columna en el Ejemplo 16, se sometió adicionalmente a centrifugación en las condiciones del Ejemplo 11. Después de que se precipitaran todas las partículas en el fondo del tubo de centrífuga, se determinó la concentración de albúmina en el sobrenadante y los resultados se enumeran en la Tabla 6.

Tabla 6. Variación de la concentración de albúmina en las nanopartículas purificadas de diversas formulaciones obtenidas mediante se aración cromato ráfica en columna antes des ués de la centrifu ación

ND significa más bajo que el límite de determinación, es decir, no detectado.

A partir de los resultados anteriores puede apreciarse que en la suspensión de nanopartículas de paclitaxel-albúmina obtenida por separación cromatográfica en columna, casi no había albúmina libre, y que la mayor parte de la albúmina estaba unida al paclitaxel para formar nanopartículas.

Ejemplo 19. Determinación del contenido de albúmina libre en las nanopartículas purificadas preparadas mediante centrifugación utilizando separación cromatográfica en columna

Se obtuvo una suspensión de partículas resuspendiendo las nanopartículas de paclitaxel-albúmina obtenidas en el Ejemplo 12 en una solución de cloruro de sodio al 0,9%, y las nanopartículas purificadas y la albúmina libre (si la hubiera) se separaron entre sí utilizando una columna de Sepharose 4B como se menciona en el Ejemplo 16. Durante la elución, se controló la curva de absorbancia de UV. Después de que las partículas eluyeran completamente, se recogió el siguiente eluyente, en el que se determinó la concentración de albúmina. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Variación de la concentración de albúmina en las nanopartículas purificadas de diversas formulaciones obtenidas mediante centrifu ación antes des ués de la se aración cromato ráfica en columna

ND significa más bajo que el límite de determinación, es decir, no detectado.

A partir de los resultados anteriores puede apreciarse que en la suspensión de nanopartículas de paclitaxel-albúmina obtenida por centrifugación, casi no había albúmina libre, y que la mayor parte de la albúmina estaba unida al paclitaxel para formar nanopartículas. En el Ejemplo 17, 18 y 19, puede demostrarse mediante las pruebas observadas en tres medidas de aislamiento, que las nanopartículas purificadas pueden obtenerse mediante las tres medidas con casi ninguna albúmina libre.

Ejemplo 20. Determinación del tamaño de las partículas y de su potencial

Cada una de las nanopartículas de paclitaxel-albúmina obtenidas en el Ejemplo 12 (correspondientes al Ejemplo 1-9) se resuspendieron en agua purificada. El tamaño de las partículas y el potencial zeta de las nanopartículas purificadas, se detectaron utilizando el medidor de partículas láser Malven NANO-ZS, y los resultados se enumeran a continuación: Tabla 8. Tamaño de partícula y potencial de las nanopartículas purificadas después de la centrifugación

A partir de los resultados anteriores puede apreciarse que el tamaño medio de partícula de las nanopartículas purificadas obtenidas después de la centrifugación, fue sustancialmente el mismo que su tamaño medio de partícula inicial, y que el potencial zeta seguía siendo relativamente alto, de modo que la carga pueda emplearse para estabilizar la suspensión de partículas.

Ejemplo 21. Patrón de difracción de rayos X

La forma cristalina de la sustancia farmacológica de paclitaxel y del polvo de albúmina liofilizada, se determinó en un instrumento de difracción de rayos X y los resultados se muestran en las Figuras 3 y 4. Tal como se muestra, la sustancia farmacológica de paclitaxel era un polvo cristalino y el polvo de albúmina liofilizada era un polvo amorfo. Las nanopartículas purificadas representativas obtenidas en el Ejemplo 12 (correspondientes a los Ejemplos 2, 4, 6 y 8) se liofilizaron en un liofilizador para obtener un polvo sólido, cuya forma cristalina se detectó en un instrumento de difracción de rayos X, y los resultados se muestran en las Figuras 5, 6, 7 y 8. A partir del patrón de difracción de rayos X, puede apreciarse que la relación entre la albúmina y el paclitaxel en las partículas, estaba en el intervalo de 0,043:1 a 0,57:1, y que tanto la albúmina como el paclitaxel estaban en forma amorfa, que era significativamente diferente a la de la sustancia farmacológica de paclitaxel y ligeramente diferente a la del polvo de albúmina liofilizado.

Ejemplo 22. Liberación de paclitaxel de las partículas

Utilizando el procedimiento de separación de partículas establecido en el Ejemplo 11, el componente libre puede separarse eficazmente del componente en forma de nanopartículas. En consecuencia, utilizando dicho procedimiento, la liberación de paclitaxel de las partículas puede detectarse a diferentes concentraciones y a continuación se muestra el procedimiento específico:

Para las nanopartículas de paclitaxel-albúmina obtenidas en el Ejemplo 12 (correspondientes al Ejemplo 1-9, respectivamente), se seleccionaron nanopartículas purificadas representativas (correspondientes a los Ejemplos 2, 4, 6 y 8, y denominadas Partículas 2, 4, 6 y 8) y basándose en la relación entre la albúmina y el paclitaxel, se añadió una solución de cloruro de sodio al 0,9 %, para formar una solución madre con una concentración de paclitaxel de 5 mg/ml. La solución madre y la solución de plasma sanguíneo simulado se conservaron a 37°°C. La solución madre se diluyó utilizando una solución de plasma sanguíneo simulado para obtener una serie de soluciones de paclitaxel con concentraciones de 5000, 1000, 200, 150, 100, 80, 50, 30 y 10 pg/ml.

Determinación de la tasa de liberación: se determinaron las concentraciones de paclitaxel de las soluciones de muestra preparadas y, al mismo tiempo, también se determinaron las concentraciones de paclitaxel de los sobrenadantes después de la centrifugación a 21 000 x g durante 60 min utilizando 1 ml de cada muestra. La relación de liberación de paclitaxel a cada concentración se calculó dividiendo la concentración de paclitaxel en el sobrenadante entre la concentración antes de la centrifugación, y las curvas de liberación se representaron gráficamente y se muestran en la Figuras 9 y 10. A partir de la curva de liberación puede apreciarse que la relación entre la albúmina y el paclitaxel en las partículas estaba en el intervalo de 0,043:1 a 0,057:1, y que los comportamientos de liberación de paclitaxel para las partículas, eran sustancialmente iguales, todos los cuales se correlacionaron con la concentración.

Ejemplo 23. Preparación de composiciones que contienen nanopartículas terapéuticas

Procedimiento 1 (Centrifugación-Resuspensión): las nanopartículas terapéuticas obtenidas en el Ejemplo 12, correspondientes al Ejemplo 1-9 (denominadas Partícula 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9), se resuspendieron en una solución de manitol al 5 %, solución de sacarosa al 10 %, solución de dextrano al 5 %, solución de lactosa al 10 %, solución de trehalosa al 10 %, solución de maltosa al 10 %, solución de seroalbúmina humana al 10 %, respectivamente, para establecer concentraciones de paclitaxel de 5 mg/ml. Las resuspensiones se filtraron a través de un filtro estéril de 0,22 pm, y no se observó ninguna variación significativa del tamaño de las partículas en el filtrado. Las suspensiones se liofilizaron en un liofilizador para obtener respectivamente las composiciones que contenían las nanopartículas farmacéuticas.

Procedimiento 2 (Diálisis): cada una de las muestras obtenidas en el Ejemplo 1-9 se reconstituyó para preparar suspensiones con la concentración de paclitaxel de 5 mg/ml. Posteriormente, las suspensiones se dializaron utilizando una membrana de ultrafiltración de 300 kDa respectivamente mediante una solución de manitol al 5 %,

solución de sacarosa al 10 %, solución de dextrano al 5 %, solución de lactosa al 10 %, solución de maltosa al 10 %, solución de trehalosa al 10 % y solución de seroalbúmina humana al 10 %. Después de dializar hasta 5 veces el volumen inicial, se reemplazó toda la seroalbúmina humana libre en las suspensiones. Las suspensiones se filtraron a través de un filtro estéril de 0,22 pm y no se observó ninguna variación significativa del tamaño de las partículas en el filtrado. Las suspensiones se liofilizaron en un liofilizador para obtener respectivamente las composiciones que contenían las nanopartículas terapéuticas.

Ejemplo 24

Cada una de las composiciones que contenían las nanopartículas terapéuticas obtenidas en el Procedimiento 1 (Centrifugación-Resuspensión) y el Procedimiento 2 (Diálisis) en el Ejemplo 23, se reconstituyeron en agua para inyección para establecer una concentración de paclitaxel de 5 mg/ml. Se observó estabilidad en cada solución y se determinó la estabilidad a las 12 horas a temperatura ambiente. Tal como se muestra, los lioprotectores convencionales pueden desempeñar un papel protector para las nanopartículas de paclitaxel u-albúmina purificadas. Los resultados se muestran en las Tablas 9 y 10:

__________Tabla 9. Estabilidad de las composiciones obtenidas mediante Centrifugación-Resuspensión_______ Partículas

contenidas en Partícula Partícula Partícula Partícula Partícula Partícula Partícula Partícula Partícula la 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tabla 10. Estabilidad de las composiciones obtenidas mediante diálisis

Tal como se muestra, la estabilidad de las partículas puede conservarse reemplazando la albúmina que rodea a las partículas utilizando Centrifugación-Resuspensión (procedimiento 1) y diálisis (procedimiento 2).

Ejemplo 25. Estudio de sensibilización en cobayas

En este experimento, el producto del Ejemplo 6 y la formulación de manitol al 5 % que comprende la Partícula 6 del Ejemplo 24, se seleccionaron como fármaco de ensayo, en el que las concentraciones de paclitaxel en las formulaciones se enumeran en la siguiente tabla. Las dosis de sensibilización se seleccionaron como 3 mg por cobaya y 1,25 mg cobaya. La sensibilización se realizó mediante inyección intraperitoneal una vez cada dos días, durante un total de 3 inyecciones. Al mismo tiempo, también se estableció un grupo de control positivo (ovoalbúmina al 0,2 %) y un grupo de control negativo (inyección de cloruro de sodio al 0,9 %). El régimen de dosificación detallado se enumera en la siguiente tabla.

Tabla 11. Protocolo del estudio de sensibilización en cobayas

Número Concentración Sensibilización Excitación Grupo de de fármaco Volumen de Dosis de Volumen de Dosis de animales (mg/ml) administración administración administración administración (ml/cobaya) (ml/cobaya) (ml/cobaya) (ml/cobaya) Grupo de

control 6 0,5 1

negativo

Grupo de

control 6 2 0,5 1 1 2 positivo

Dosis baja del

producto del 6 2,5 0,5 1,25 1 2,5 Ejemplo 6

Dosis alta del

producto del 6 6 0,5 3 1 6 Ejemplo 6

^{Dosis baja de} 6 25 05 1 25 1 2 5_{partícula 6}

Dosis alta de

partícula 6 ^{6 6 0,5 3 1 6}

Método de administración para la sensibilización: el lomo de la cobaya se sostenía firmemente con la mano izquierda en forma de copa, permitiendo que la piel abdominal se estirase al inmovilizar a la cobaya. Se levantó el abdomen de la cobaya y se bajó la cabeza. Después de desinfectar el lugar de la inyección con una toallita con alcohol, la aguja de una jeringa desechable de 2 ml sostenida con la mano derecha se introdujo en la piel de la cobaya. La aguja se insertó en el lugar 1 mm a la izquierda de la línea media de la parte inferior del abdomen. Al llegar a la parte subcutánea, la aguja se insertó hacia adelante de 5 mm a 10 mm más y, posteriormente, se introdujo en la cavidad abdominal en un ángulo de 45°. Después de fijar la aguja, la solución farmacéutica se inyectó lentamente. Después de la inyección, sobre el pinchazo, se presionó una toallita de algodón seca para impedir la salida del producto farmacéutico. Después de 3 veces de sensibilización, las cobayas del grupo de formulación del Ejemplo 6 (3 mg/cobaya) se demacraron y murieron. No se observó ninguna anomalía en otros grupos.

Excitación de alergia: la excitación se realizó mediante inyección intravenosa, y se llevó a cabo 10 d después de la última sensibilización siendo las dosis de 6 mg/animal y de 2,5 mg/animal.

Método de administración para la excitación: la inyección se realizó en la vena metatarsiana lateral de la cobaya inmovilizada por un auxiliar. El operario sujetó las patas traseras para inmovilizar el cuerpo del animal. La vena se comprimió y las patas quedaron estiradas. Se rasuró el pelo en el lugar de la inyección (o se cortó la piel en el lugar de la inyección). Después de la esterilización con toallitas con alcohol, puede verse una vena metatarsiana lateral gruesa. La aguja de una jeringa desechable de 1 ml se introdujo en el vaso sanguíneo en dirección al corazón con la mano derecha. Después de la inyección, sobre el pinchazo, se presionó una toallita de algodón seca para impedir el sangrado.

La reacción de cada animal y el momento en que aparecieron o desaparecieron los síntomas de alergia se observaron inmediatamente después de la excitación durante 30 min. La duración máxima de la observación fue de 3 h. Los resultados de la reacción alérgica se enumeran en la Tabla 14.

Tabla 12. Síntomas de la reacción alérgica

0 Normal 7 Taquipnea 14 Alteración de la marcha 1 Disforia 8 Micción 15 Brincos

2 Piloerección 9 Defecación 16 Jadeo

3 Temblor 10 Lagrimeo 17 Convulsiones

4 ^{Rascado de} a 18 Giros _hoci 11 Disne_co

5 Estornudos 12 ^Respiración 19 Respiración de Cheyne-_sibilante Stokes

6 Tos 13 Peliosis 20 Muerte

Tabla 13. Criterios de evaluación de la reacción alérgica sistémica

Síntoma Grado Resultado

0 - Reacción alérgica negativa

1-4 ^{Reacción alérgica débilmente}

_positiva

5-10 + Reacción alérgica positiva

_11-19 + Reacción alérgica fuertemente

positiva

20 Reacción alérgica extremadamente

positiva

Tabla 14. Resultados de anafilaxia activa de la cobaya

Grupo ^{Número de Nivel de reacción Tasa} _{animales 1 2 3 4 5 6 positiva} Grupo de control negativo 6 - - - -Grupo de control positivo 6 + + ++ + + Dosis baja de producto del + + Ejemplo 6 6 + +

Dosis alta de producto del 6 / / / / / / ND*_{Ejemplo 6}

Dosis baja de Partícula 6 6 - - - - - - -Dosis alta de partícula 6 6 - - - significa que el animal quedó demacrado y murió después de la sensibilización

Los resultados de anafilaxia activa en cobayas han sugerido que la formulación de nanopartículas que contiene un exceso de albúmina tiene una mayor sensibilización, mientras que la formulación que contiene nanopartículas purificadas puede disminuir significativamente la reacción alérgica.

Ejemplo 26. Estudio farmacocinético en perros

En este experimento, el producto del Ejemplo 6 y la formulación de manitol al 5 % que comprende la Partícula 6 del Ejemplo 24, se seleccionaron como fármaco de ensayo, en el que la concentración de paclitaxel en las formulaciones era de 5 mg/ml. Para los estudios farmacocinéticos in vivo de ambas formulaciones se utilizaron perros Beagle. En cada grupo, se sometieron a ensayo 3 perros Beagle con una dosis de administración de 5 mg/kg y un tiempo de administración de 30 min. Se extrajeron 2 ml de sangre de la vena cefálica de la extremidad anterior de los perros beagle inmediatamente antes de la administración (0 h), 15 min en el proceso de infusión (0,25 h desde la administración), en el momento de la retirada de la aguja (0,5 h desde la administración) y 0,58, 0,75, 1,0, 1,5, 2,5, 3,5, 4,5, 6,5, 8,5, 24,5 h después de la administración, y cada muestra de sangre se colocó en un tubo de heparina, se agitó hasta la homogeneidad y se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min para obtener el plasma. La concentración de paclitaxel en plasma se determinó mediante HPLC/MS/MS, y la concentración de fármaco se representó gráficamente frente al tiempo (véase la figura 11). A partir de la gráfica de concentración de fármaco frente al tiempo, puede apreciarse que ambas formulaciones tenían casi los mismos comportamientos in vivo, de manera que no hubo impacto debido al exceso de albúmina en los comportamientos in vivo de las partículas.

Ejemplo 27. Síntomas alérgicos durante el estudio farmacocinético en perros

En el estudio farmacocinético en perros realizado en el Ejemplo 26, se observaron reacciones adversas durante la administración de ambas formulaciones. En el grupo de muestra del Ejemplo 6, aparecieron diversos grados de reacciones alérgicas obvias en 3 perros, incluyendo principalmente lucha violenta, hipersalivación, eritema alrededor de la boca, y en animales de experimentación individuales, se produjeron vómitos e incontinencia urinaria durante la administración. Mientras que en el grupo de muestra de la Partícula 6, apareció solo una ligera lucha, salivación y eritema alrededor de la boca en parte de los animales y los síntomas eran leves. Por consiguiente, la formulación de nanopartículas purificadas fue capaz de aliviar significativamente las reacciones alérgicas del fármaco.

Ejemplo 28

Para determinar la dosis máxima tolerada, se investigaron las siguientes muestras, incluyendo dichas muestras la composición que comprende las nanopartículas terapéuticas, utilizando manitol como lioprotector, (obtenidas del Método 1 del Ejemplo 24, correspondientes a las nanopartículas de los Ejemplos 2, 6 y 8, y denominadas Partícula 2, Partícula 6 y Partícula 8 a continuación), el producto del Ejemplo 6 y Taxol® preparado con Cremophor.

Basándose en la recomendación del NCI de EE.UU., se realizaron modificaciones en el método de experimentación para determinar la dosis máxima tolerada de toxicidad aguda mediante la administración de una sola dosis. Para la Partícula 2, la Partícula 6 y la Partícula 8, y el polvo liofilizado del Ejemplo 6, se seleccionaron 400 mg/kg como la dosis máxima de administración, y la dosis de administración se redujo en una proporción de 1,2, es decir, una serie de dosis de 400, 333, 278, 231 y 193 mg/kg. Para TAXOL®, se seleccionaron 48 mg/kg como la dosis máxima de administración y la dosis de administración también se redujo en una proporción de 1,2, es decir, una serie de dosis de 48, 40, 33,3, 27,8, 23,1 y 19,3 mg/kg. En cada grupo de dosis, se asignaron 3 ratones macho KM. Las condiciones generales y las variaciones de peso corporal de los animales se observaron durante 10 días después de la administración. Si no moría ningún animal, no se producía ninguna respuesta tóxica irreversible, o no aparecía más del 15 % de pérdida de peso corporal durante 3 días continuos en comparación con la de antes del experimento durante la observación, la dosis máxima de administración se consideró como la dosis máxima tolerada para la administración única.

Los resultados indicaron que la dosis máxima tolerada de TAXOL® fue 33,3 mg/kg. En todos los grupos de administración, durante la administración de TAXOL®, los ratones lucharon con violencia y después de la administración se produjo coma y respiración acelerada. En los grupos que recibieron dosis de 40 mg/kg y 48 mg/kg, hubo casos de muerte. En los demás grupos de dosis, los ratones se recuperaron gradualmente después de la administración. La gravedad de los síntomas de toxicidad y el tiempo requerido para la recuperación se correlacionaron con la dosis de administración. Las dosis máximas toleradas para el Ejemplo 6 y la Partícula 2, la partícula 6 y la partícula 8, fueron todas de 193 mg/kg. Los síntomas adversos de los ratones en los grupos de dosis superiores a 193 mg/kg incluyeron principalmente pérdida de peso corporal, suciedad alrededor del ano, debilidad/parálisis de las extremidades traseras y muerte. La gravedad de los síntomas adversos aumentó con el aumento de la dosis de administración. No hubo ninguna diferencia evidente entre las toxicidades en los ratones de la Partícula 2, la Partícula 6, la Partícula 8 y el producto del Ejemplo 6. Sin embargo, todas las toxicidades anteriores fueron menores que las de TAXOL® preparado con Cremophor.

Ejemplo 29. Efecto inhibidor sobre el tumor H22 de cáncer de hígado en ratones

Para determinar el efecto inhibidor sobre el tumor H22 de cáncer de hígado en ratones, se estudiaron la Partícula 2, Partícula 6, Partícula 8, el producto del Ejemplo 6 y Taxol® preparado con Cremophor.

Los animales se dividieron en función del peso corporal. Por vía subcutánea, se inocularon células ascíticas de cáncer de hígado H22 en el tejido subcutáneo en la región axilar de las extremidades anteriores de ratones macho KM siendo el volumen de inoculación de 0,2 ml, que contenía aproximadamente 1,0 x 106 células. Los animales se dividieron igualmente en 6 grupos según el tiempo de inoculación.

Las administraciones intravenosas únicas de la Partícula 2, la Partícula 6, la Partícula 8, el producto del Ejemplo 6 y el Taxol®, se realizaron a la dosis máxima tolerada por los ratones 24 h después de la inoculación, es decir, las dosis de administración de la Partícula 2, la Partícula 6, la Partícula 8 y el producto del Ejemplo 6, fueron de 193 mg/kg y la dosis de administración de Taxol® fue de 33,3 mg/kg. En el grupo de control no tratado, se utilizó una inyección de cloruro de sodio al 0,9 % para la administración intravenosa única. El día 12 después de la administración, los ratones se sacrificaron por asfixia con CO2, y la masa tumoral se extrajo y se pesó. La tasa de inhibición tumoral (%) puede calcularse según la siguiente ecuación: Tasa de inhibición tumoral = (1 - peso tumoral medio en los grupos de ensayo / peso tumoral medio en el grupo de control) x 100 %. Los resultados de experimentación se analizaron estadísticamente mediante ANOVA unidireccional utilizando el programa informático estadístico SPSS 19.0.

En la Tabla 15 se enumeran los resultados de experimentación. Para la administración intravenosa única de los ratones a la dosis máxima tolerada, el crecimiento del tumor H22 se inhibió significativamente en todos los grupos. No hubo diferencias entre los grupos en el efecto inhibidor del tumor de la Partícula 2, la Partícula 6, la Partícula 8 y el producto del Ejemplo 6, sobre el tumor H22. La tasa de inhibición tumoral de la partícula 2, Partícula 8 y el producto del Ejemplo 6 fue significativamente más alta que la de TAXOL®.

Tabla 15. Efecto sobre el peso corporal de ratones portadores de tumor H22 n = 10, x ±dt

Ejemplo 30. Efecto inhibidor sobre el tumor RM-1 de cáncer de próstata de ratones

Para determinar el efecto inhibidor sobre el tumor RM-1 de cáncer de próstata en ratones, se estudió la Partícula 2, Partícula 6, Partícula 8, el producto del Ejemplo 6 y el TAXOL® preparado con Cremophor.

Se recogieron las células tumorales RM-1 en la fase de crecimiento logarítmico y se ajustó el número de células a 2,5 x 106 células/ml. La suspensión de células tumorales se inoculó en el tejido subcutáneo en la región axilar de las extremidades anteriores de ratones macho C75 de 7 a 8 semanas de vida, siendo el volumen de inoculación de 0,2 ml, que contenía aproximadamente 5 x 105 células. Después de la inoculación, con un microscopio óptico se realizó un recuento de la suspensión restante de células tumorales, siendo el número de células tumorales vivas> 95 %. Los ratones se dividieron en 6 grupos basándose en el tiempo de inoculación.

Las administraciones intravenosas únicas de la Partícula 2, la Partícula 6, la Partícula 8, el producto del Ejemplo 6 y el Taxol®, se realizaron a la dosis máxima tolerada por los ratones 72 h después de la inoculación, es decir, las dosis de administración de la Partícula 2, la Partícula 6, la Partícula 8 y el producto del Ejemplo 6, fueron de 193 mg/kg y la dosis de administración de Taxol® fue de 33,3 mg/kg. En el grupo de control no tratado, se utilizó una inyección de cloruro de sodio al 0,9 % para la administración intravenosa única. Después del crecimiento del tumor, el diámetro se midió utilizando un calibrador Vernier y el efecto antitumoral del fármaco se observó de forma dinámica. El volumen tumoral (VT) puede calcularse de la siguiente manera: V = 1/2xaxb2, en la que a y b se refieren a la longitud y a la anchura del tumor, respectivamente. El volumen tumoral puede calcularse basándose en los resultados. La tasa de inhibición del volumen tumoral (%) puede calcularse según la siguiente ecuación: Tasa de inhibición tumoral = (1 -peso tumoral medio en los grupos de administración / peso tumoral medio en el grupo de control) x 100 %. Los resultados de experimentación se analizaron utilizando el programa informático estadístico SPSS 19.0. La variación del volumen tumoral entre medidas con el tiempo se analizó mediante Análisis de Medidas Repetidas, y la variación del volumen tumoral entre grupos entre cada medida se analizó mediante Multivariante.

En la Tabla 16 se enumeran los resultados de experimentación. Se realizaron administraciones intravenosas únicas a la dosis máxima tolerada 3 días después de la inoculación de las células tumorales RM-1 de cáncer de próstata. En comparación con el grupo de control no tratado, se observó un efecto inhibidor significativo sobre el crecimiento del tumor RM-1 de cáncer de próstata de ratones para la Partícula 2, la Partícula 6, la Partícula 8 y el producto del Ejemplo 6, y no se observó ningún efecto inhibidor sobre el tumor para Taxol® preparado con Cremophor. No se observaron diferencias significativas en el efecto inhibidor de la Partícula 2, Partícula 6, Partícula 8 y el producto del Ejemplo 6 sobre el tumor RM-1 de los ratones. Sin embargo, en comparación con Taxol®, todas las formulaciones anteriores tuvieron un efecto inhibidor significativo sobre el crecimiento del tumor.

Tabla 16. Efecto inhibidor sobre el tumor RM-1 de cáncer de próstata de ratones n = 10, x±dt

Ejemplo 31:

Efecto inhibidor sobre el tumor en ratones con cáncer de pulmón Lewis

Para determinar el efecto inhibidor sobre el tumor en ratones con cáncer de pulmón de Lewis, se estudió la Partícula 2, Partícula 6, Partícula 8, el producto del Ejemplo 6 y TAXOL® preparado con Cremophor.

Se recogieron células tumorales de Lewis en la fase de crecimiento logarítmico y se ajustó el número de células a 2,5 x 106 células/ml. La suspensión de células tumorales se inoculó en el tejido subcutáneo en la región axilar de las extremidades anteriores de ratones macho C57 de 7 a 8 semanas de vida, siendo el volumen de inoculación de 0,2 ml, que contenía aproximadamente 5 x 105 células.

La clasificación, la administración, la observación de los indicadores y el procedimiento estadístico, fueron los mismos que los del Ejemplo 18.

En la Tabla 17 se enumeran los resultados de experimentación. Se realizaron administraciones intravenosas únicas a la dosis máxima tolerada 3 días después de la inoculación de las células tumorales de ratones con cáncer de pulmón Lewis. En comparación con el grupo de control no tratado, se observó un efecto inhibidor significativo sobre el crecimiento del tumor de los ratones con cáncer de pulmón Lewis para la Partícula 2, la Partícula 6, la Partícula 8 y el producto del Ejemplo 6, y no se observó ningún efecto inhibidor sobre el tumor para Taxol® preparado con Cremophor. No se observaron diferencias significativas en el efecto inhibidor de la Partícula 2, Partícula 6, Partícula 8 y el producto del Ejemplo 6, sobre el tumor de los ratones con cáncer de pulmón de Lewis. Sin embargo, en comparación con Taxol®, todas las formulaciones anteriores tuvieron un efecto inhibidor significativo sobre el crecimiento del tumor.

Ejemplo 32

Como producto farmacéutico disponible en el comercio, la seroalbúmina humana no debe contener más del 5 % del polímero según su estándar de calidad, ya que el polímero de albúmina puede inducir una reacción alérgica. El procedimiento de determinación de albúmina en el Ejemplo 10 puede distinguir el monómero de albúmina del polímero. El contenido de polímero de albúmina y paclitaxel se detectó en las composiciones del Ejemplo 1-9 (denominadas formulación inicial) y en las composiciones obtenidas del Procedimiento 1 del Ejemplo 24, respectivamente utilizando manitol y seroalbúmina humana como lioprotector (correspondiente al Ejemplo 1-9), basándose en el procedimiento de determinación de la albúmina y el paclitaxel del Ejemplo 10, y el contenido de polímero de albúmina se calculó por 1 mg de paclitaxel. Los resultados se muestran en la Tabla 18.

Tabla 18. Cantidad relativa de olímero de albúmina aclitaxel en diversas formulaciones

Los resultados han sugerido que el contenido de polímero de albúmina en el producto preparado directamente utilizando el procedimiento de la técnica anterior (Homogeneización), fue significativamente mayor que el contenido de albúmina añadida posteriormente en la composición mediante el procedimiento de preparación de la presente divulgación. Esto fue el resultado del polímero de albúmina recientemente generado en el proceso de homogeneización o proceso de evaporación de la técnica anterior. Sin embargo, el contenido de polímero de albúmina en la formulación que comprende el protector de manitol fue menor, dado que solo se incluyó una cantidad muy pequeña de albúmina en la formulación, de modo que la cantidad total fue menor que la cantidad de polímero en la formulación inicial.

Ejemplo 33. Recuperación de albúmina para la preparación de nanopartículas

El dializado resultante de la diálisis de Ejemplo 15 se recogió y se concentró hasta un contenido de albúmina de aproximadamente 4 % utilizando una membrana de ultrafiltración de celulosa regenerada con un peso molecular límite de 10 K. El concentrado se dializó en un mismo volumen con agua purificada. Después de dializar a un volumen de 5 veces, se pudo recuperar una solución de albúmina al 4 %.

Según el método del Ejemplo 5, utilizando la solución de albúmina recuperada, se prepararon nanopartículas de paclitaxel-albúmina. Por consiguiente, el diámetro medio de las nanopartículas de paclitaxel-albúmina preparadas era de 134 nm y la suspensión era translúcida, que era similar al producto obtenido en el Ejemplo 5.

La suspensión se puede filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm. No hubo ninguna variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración, y no se observaron cambios significativos en la suspensión después de una conservación durante 48 horas a temperatura ambiente. La suspensión se dividió en alícuotas y se liofilizó durante 24 h en un liofilizador para obtener una torta blanquecina estable.

Ejemplo 34 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de docetaxel-albúmina purificadas

Se disolvieron 3 g de docetaxel en 15 ml de cloroformo/etanol (1:1, v/v) y se añadieron a 500 ml de solución de seroalbúmina humana (4 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de docetaxel-albúmina se generaron por tanto con un diámetro medio de 110-150 nm, y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de docetaxel-albúmina resultante mediante el procedimiento de centrifugación mencionado en el Ejemplo 11 a 21 000 x g durante 60 min. El sobrenadante se desechó y se recogieron las nanopartículas purificadas. Las nanopartículas purificadas se resuspendieron en una solución de manitol al 5 %. La resuspensión se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de docetaxel en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 50 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 48 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y el docetaxel en el producto, la relación entre la albúmina y el docetaxel puede calcularse como de 0,1:1.

Ejemplo 35 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de 2'-O-hexanoildocetaxel albúmina purificadas

Se disolvieron 695 mg de 2'-O-hexanoildocetaxel en 6 ml de cloroformo/etanol (10:1, v/v) y se añadieron a 102 ml de solución de seroalbúmina humana (10 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20 000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de 2'-O-hexanoildocetaxel albúmina se generaron por tanto con un diámetro medio de 75-100 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de 2'-O-hexanoildocetaxel albúmina resultante mediante el procedimiento de diálisis frente a una solución de manitol al 5 % mencionada en el Ejemplo 15. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo ninguna variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de 2'-O-hexanoildocetaxel en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 50 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 48 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y el 2'-O-hexanoildocetaxel en el producto, la relación entre la albúmina y el 2'-O-hexanoildocetaxel puede calcularse como de 0,27:1.

Ejemplo 36 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas purificadas de 2'-benzoil docetaxel albúmina

Se disolvieron 226 mg de 2'-benzoil docetaxel en 2 ml de cloroformo/etanol (9:1, v/v) y se añadieron a 35 ml de solución de seroalbúmina humana (5 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 18000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de 2'-benzoil docetaxel albúmina se generaron por tanto con un diámetro medio de 30-60 nm, y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de 2'-benzoil docetaxel albúmina resultante mediante el procedimiento de separación cromatográfica en columna mencionado en el Ejemplo 16. Como dializado se utilizó una solución de lactosa al 10 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo ninguna variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de 2'-benzoil docetaxel en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 50 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 65 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y el 2'-benzoil docetaxel en el producto, la relación entre la albúmina y el 2'-benzoil docetaxel puede calcularse como de 0,95:1.

Ejemplo 37 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de rapamicina albúmina purificadas

Se disolvieron 166 mg de rapamicina en 1 ml de cloroformo/etanol (11:1, v/v) y se añadieron a 37 ml de solución de seroalbúmina humana (5 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de rapamicina se generaron por tanto con un diámetro medio de 50-85 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de rapamicina albúmina resultante mediante el procedimiento de separación cromatográfica en columna mencionado en el Ejemplo 16. Como dializado se utilizó una solución de dextrano al 5 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo ninguna variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de rapamicina en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 10 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 48 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y la rapamicina en el producto, la relación entre la albúmina y la rapamicina puede calcularse como de 0,63:1.

Ejemplo 38 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de temsirolimus albúmina purificadas

Se disolvieron 101 mg de temsirolimus en 0,5 ml de cloroformo/etanol (7:1, v/v) y se añadieron a 19,5 ml de solución de seroalbúmina humana (5 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de temsirolimus se generaron por tanto con un diámetro medio de 80-115 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de las nanopartículas de temsirolimus albúmina resultantes mediante el procedimiento de centrifugación mencionado en el Ejemplo 11 a 21 000 x g durante 60 min. El sobrenadante se desechó y se recogieron las nanopartículas purificadas. Las nanopartículas purificadas se resuspendieron en una solución de manitol al 5 %. La resuspensión se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de temsirolimus en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 10 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 48 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y el temsirolimus en el producto, la relación entre la albúmina y el temsirolimus puede calcularse como de 0,16:1.

Ejemplo 39 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de everolimus albúmina purificadas

Se disolvieron 78 mg de everolimus en 1 ml de cloroformo/etanol (9:1, v/v) y se añadieron a 22 ml de solución de seroalbúmina humana (8 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de everolimus se generaron por tanto con un diámetro medio de 80-110 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de everolimus albúmina resultante mediante el procedimiento de diálisis mencionado en el Ejemplo 15 frente a dextrano al 5 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo ninguna variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de everolimus en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 10 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 60 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y el everolimus en el producto, la relación entre la albúmina y el everolimus puede calcularse como de 0,32:1.

Ejemplo 40 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de romidepsina albúmina purificadas

Se disolvieron 113 mg de romidepsina en 2 ml de cloroformo/etanol (8:1, v/v) y se añadieron a 35 ml de solución de seroalbúmina humana (10 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las 2 nanopartículas de romidepsina se generaron por tanto con un diámetro medio de 120-150 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de romidepsina albúmina resultante mediante el procedimiento de separación cromatográfica en columna mencionado en el Ejemplo 16. Como dializado se utilizó una solución de sacarosa al 10 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo ninguna variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de romidepsina en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 50 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 48 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y la romidepsina en el producto, la relación entre la albúmina y la romidepsina puede calcularse como de 0,25:1.

Ejemplo 41 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de pirarrubicina albúmina purificadas

Se disolvieron 147 mg de pirarrubicina en 0,75 ml de cloroformo/etanol (5:1, v/v) y se añadieron a 19,5 ml de solución de seroalbúmina humana (5 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las 2 nanopartículas de pirarrubicina se generaron por tanto con un diámetro medio de 100-120 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de pirarrubicina albúmina resultante mediante el procedimiento de diálisis frente a una solución de manitol al 5 % mencionada en el Ejemplo 15. Las nanopartículas purificadas obtenidas se filtraron a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de pirarrubicina en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 10 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 48 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y la pirarrubicina en el producto, la relación entre la albúmina y la pirarrubicina puede calcular como de 0,47:1.

Ejemplo 42 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de aclacinomicina albúmina purificadas

Se disolvieron 135 mg de aclacinomicina en 2 ml de cloroformo/etanol (8:1, v/v) y se añadieron a 25 ml de solución de seroalbúmina humana (8 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de aclacinomicina se generaron por tanto con un diámetro medio de 80-150 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de aclacinomicina albúmina resultante mediante el procedimiento de separación cromatográfica en columna mencionado en el Ejemplo 16. Como dializado se utilizó una solución de manitol al 5 %. La resuspensión se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de aclacinomicina en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 10 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 48 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y la aclacinomicina en el producto, la relación entre la albúmina y la aclacinomicina puede calcularse como de 0,13:1.

Ejemplo 43 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de cabazitaxel albúmina purificadas

Se disolvieron 289 mg de cabazitaxel en 3 ml de cloroformo/etanol (10:1, v/v) y se añadieron a 67 ml de solución de seroalbúmina humana (5 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de cabazitaxel se generaron por tanto con un diámetro medio de 65-85 nm, y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de cabazitaxel albúmina resultante mediante diálisis de un mismo volumen mencionado en el Ejemplo 15 frente a manitol al 5 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de cabazitaxel en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 50 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 55 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y el cabazitaxel en el producto, la relación entre la albúmina y el cabazitaxel puede calcularse como de 0,27:1.

Ejemplo 44 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de amiodardona albúmina purificadas

Se disolvieron 90 mg de amiodardona en 2 ml de cloroformo/etanol (11:1, v/v) y se añadieron a 58 ml de solución de seroalbúmina humana (8 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las 2 nanopartículas de amiodardona se generaron por tanto con un diámetro medio de 70-105 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de amiodardona albúmina resultante mediante el procedimiento de centrifugación mencionado en el Ejemplo 11 a 21 000 x g durante 60 min. El sobrenadante se deshechó y se recogieron las nanopartículas purificadas. Las nanopartículas purificadas se resuspendieron en solución de dextrano al 5 %. La resuspensión se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de amiodardona en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 10 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 57 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y la amiodardona en el producto, la relación entre la albúmina y la amiodardona puede calcularse como de 0,43:1.

Ejemplo 45 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de liotironina albúmina purificadas

Se disolvieron 93 mg de liotironina en 2 ml de cloroformo/etanol (9:1, v/v) y se añadieron a 46 ml de solución de seroalbúmina humana (8 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las 2 nanopartículas de liotironina se generaron por tanto con un diámetro medio de 85-125 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de liotironina albúmina resultante mediante el procedimiento de centrifugación mencionado en el Ejemplo 11 a 21 000 x g durante 60 min. El sobrenadante se deshechó y se recogieron las nanopartículas purificadas. Las nanopartículas purificadas se resuspendieron en una solución de manitol al 5 %. La resuspensión se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de liotironina en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 10 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 50 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y la liotironina en el producto, la relación entre la albúmina y la liotironina puede calcularse como de 0,39:1.

Ejemplo 46 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de epotilona B albúmina purificadas

Se disolvieron 127 mg de epotilona B en 2 ml de cloroformo/etanol (10:1, v/v) y se añadieron a 52 ml de solución de seroalbúmina humana (5 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de Epotilona B se generaron por tanto con un diámetro medio de 80-115 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de Epotilona B albúmina resultante mediante diálisis de un mismo volumen frente a manitol al 5 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de Epotilona B en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 10 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 65 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y la epotilona B en el producto, la relación entre la albúmina y la epotilona B puede calcularse como de 0,14:1.

Ejemplo 47 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de 10-hidroxi camptotecina albumina purificadas

Se disolvieron 93 mg de 10-hidroxi camptotecina en 2 ml de cloroformo/etanol (10:1, v/v) y se añadieron a 48 ml de solución de seroalbúmina humana (5 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20 000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de 10-hidroxicamptotecina se generaron por tanto con un diámetro medio de 100-135 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de 10-hidroxi-camptotecina albúmina resultante mediante el procedimiento de centrifugación mencionado en el Ejemplo 11 a 21 000 x g durante 60 min. El sobrenadante se deshechó y se recogieron las nanopartículas purificadas. Las nanopartículas purificadas se resuspendieron en una solución de manitol al 5 %. La resuspensión se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de 10-hidroxi-camptotecina en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 20 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 72 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y la 10-hidroxi camptotecina en el producto, la relación entre la albúmina y la 10-hidroxi camptotecina puede calcularse como de 0,26:1.

Ejemplo 48 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de ciclosporina albúmina purificadas

Se disolvieron 148 mg de ciclosporina en 1,5 ml de cloroformo/etanol (11:1, v/v) y se añadieron a 18,5 ml de solución de seroalbúmina humana (4 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de ciclosporina se generaron por tanto con un diámetro medio de 100-135 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de ciclosporina albúmina resultante mediante el procedimiento de separación cromatográfica en columna mencionado en el Ejemplo 16. Como dializado se utilizó lactosa al 10 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de ciclosporina en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 50 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 72 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y la ciclosporina en el producto, la relación entre la albúmina y la ciclosporina puede calcularse como de 0,26:1.

Ejemplo 49 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de tanespimicina albúmina purificadas

Se disolvieron 88 mg de tanespimicina en 2 ml de cloroformo/etanol (8:1, v/v) y se añadieron a 18,5 ml de solución de seroalbúmina humana (10 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de tanespimicina se generaron por tanto con un diámetro medio de 85-105 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de tanespimicina albúmina resultante mediante el procedimiento de separación cromatográfica en columna mencionado en el Ejemplo 16. Como dializado se utilizó lactosa al 5 %. La suspensión de nanopartículas purificada se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de tanespimicina en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 50 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 72 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y la tanespimicina en el producto, la relación entre la albúmina y la tanespimicina puede calcularse como de 0,62:1.

Ejemplo 50 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de propofol albúmina purificadas

Se disolvieron 603 mg de propofol en 6 ml de cloroformo y se añadieron a 73 ml de solución de seroalbúmina humana (10 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de propofol se generaron por tanto con un diámetro medio de 70­ 115 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de propofol albúmina resultante mediante el procedimiento de centrifugación mencionado en el Ejemplo 11 a 21 000 x g durante 60 min. El sobrenadante se deshechó y se recogieron las nanopartículas purificadas. Las nanopartículas purificadas se resuspendieron en solución de lactosa al 10 %. La resuspensión se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de propofol en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 50 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 72 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y el propofol en el producto, la relación entre la albúmina y el propofol puede calcularse como de 0,58:1.

Ejemplo 51 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de sulfato de vinblastina albúmina purificadas

Se disolvieron 1,25 g de sulfato de vinblastina en 10 ml de cloroformo/isopropanol (10:1, v/v) y se añadieron a 202 ml de solución de seroalbúmina humana (5 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20 000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de sulfato de vinblastina se generaron por tanto con un diámetro medio de 90-130 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de sulfato de vinblastina albúmina resultante mediante diálisis de un mismo volumen frente a manitol al 5 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de sulfato de vinblastina en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 50 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 72 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y el sulfato de vinblastina en el producto, la relación entre la albúmina y el sulfato de vinblastina puede calcularse como de 0,23:1.

Ejemplo 52 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de exemestano albúmina purificadas

Se disolvieron 155 mg de exemestano en 3 ml de cloroformo/etanol (6:1, v/v) y se añadieron a 27 ml de solución de seroalbúmina humana (5 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de exemestano se generaron por tanto con un diámetro medio de 70-100 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de exemestano albúmina resultante mediante diálisis de un mismo volumen frente a manitol al 5 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de exemestano en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 50 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 72 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y el exemestano en el producto, la relación entre la albúmina y el exemestano puede calcularse como de 0,19:1.

Ejemplo 53 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de flutamida albúmina purificadas

Se disolvieron 189 mg de flutamida en 2 ml de cloroformo/terc-butanol (6:1, v/v) y se añadieron a 38 ml de solución de seroalbúmina humana (8 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de flutamida se generaron por tanto con un diámetro medio de 100-120 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de flutamida albúmina resultante mediante el procedimiento de separación en columna cromatográfica mencionado en el Ejemplo 16. Como dializado se utilizó una solución de dextrano al 5 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de flutamida en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 50 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 60 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y la flutamida en el producto, la relación entre la albúmina y la flutamida puede calcularse como de 0,35:1.

Ejemplo 54 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de fulvestrant albúmina purificadas

Se disolvieron 350 mg de fulvestrant en 3 ml de diclorometano/etanol (6:1, v/v) y se añadieron a 67 ml de solución de seroalbúmina humana (5 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de fulvestrant se generaron por tanto con un diámetro medio de 105-150 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de fulvestrant albúmina resultante mediante el procedimiento de separación cromatográfica en columna mencionado en el Ejemplo 16. Como dializado se utilizó lactosa al 10 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de fulvestrant en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 20 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 60 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y el fulvestrant en el producto, la relación entre la albúmina y el fulvestrant puede calcularse como de 0,29:1.

Ejemplo 55 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de semustina albúmina purificadas

Se disolvieron 650 mg de semustina en 5 ml de cloroformo/etanol (6:1, v/v) y se añadieron a 89 ml de solución de seroalbúmina humana (4 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de semustina se generaron por tanto con un diámetro medio de 85-120 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de semustina albúmina resultante mediante el procedimiento de centrifugación mencionado en el Ejemplo 11 a 21 000 x g durante 60 min. El sobrenadante se deshechó y se recogieron las nanopartículas purificadas. Las nanopartículas purificadas se resuspendieron en una solución de manitol al 5 %. La resuspensión se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de semustina en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 20 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 70 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y la semustina en el producto, la relación entre la albúmina y la semustina puede calcularse como de 0,58:1.

Ejemplo 56 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de dímero de tiocolchicina albúmina purificadas

Se disolvieron 456 mg de dímero de tiocolchicina en 5 ml de cloroformo/etanol (9:1, v/v) y se añadieron a 58 ml de solución de seroalbúmina humana (8 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20 000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de dímero de tiocolchicina se generaron por tanto con un diámetro medio de 65-90 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de dímero de tiocolchicina albúmina resultante mediante el procedimiento de separación en columna cromatográfica mencionado en el Ejemplo 16. Como dializado se utilizó lactosa al 10 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de dímero de tiocolchicina en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 20 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 70 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y el dímero de tiocolchicina en el producto, la relación entre la albúmina y el dímero de tiocolchicina puede calcularse como de 0,37:1.

Ejemplo 57 (no dentro del ámbito de la invención reivindicada). Preparación de partículas de dímero de ibuprofeno albúmina purificadas

Se disolvieron 348 mg de ibuprofeno en 3 ml de diclorometano/etanol (11:1, v/v) y se añadieron a 62 ml de solución de seroalbúmina humana (5 % p/v). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de ibuprofeno se generaron por tanto con un diámetro medio de 65-95 nm y la suspensión era translúcida.

Las nanopartículas se aislaron de la suspensión de nanopartículas de ibuprofeno albúmina resultante mediante el procedimiento de separación cromatográfica en columna mencionado en el Ejemplo 16. Como dializado se utilizó dextrano al 5 %. La suspensión de nanopartículas purificada obtenida se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm y en el filtrado no hubo variación significativa del tamaño de partícula. El contenido de ibuprofeno en la solución se determinó utilizando HPLC. Basándose en el contenido, posteriormente, la solución se dividió en alícuotas en viales a una cantidad de 20 mg por vial. Los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron durante 50 h.

Cuando el producto liofilizado se reconstituyó en agua para inyección, la torta resultante se disolvió rápidamente, la suspensión era translúcida y no se observó variación significativa del tamaño de partícula. Después de la determinación del contenido de la seroalbúmina humana y el ibuprofeno en el producto, la relación entre la albúmina y el ibuprofeno puede calcularse como de 0,19:1.

Ejemplo 58 La concentración de albúmina influye en el efecto inhibidor de los fármacos sobre las células tumorales humanas

Células SPC-A-1 de cáncer de pulmón humano y células MCF-7 de cáncer de mama se sembraron en una placa de 96 pocillos, se cultivaron durante la noche y se hicieron adherentes a los pocillos. Después, el medio se cambió a medio sin suero para privar a las células. El producto del Ejemplo 6, la partícula 6 y Abraxano se añadieron a las células a concentraciones finales de 160, 320 y 640 pg/ml (concentración de paclitaxel) durante 24 horas a 37 °C. Se comparó la tasa de inhibición celular de diferentes grupos de dosificación mediante el procedimiento de MTT, y los resultados se muestran en la siguiente tabla y en las Figuras 12 y 13. Por otra parte, también se trazó una curva de tasa de inhibición-concentración de fármaco. Como se muestra en la curva de tasa de inhibición-concentración de fármaco, la tasa de inhibición de la partícula 6 fue significativamente mayor que la de los otros dos grupos, y no hubo ninguna diferencia significativa entre el Ejemplo 6 y el Abraxano. Eso significa que la albúmina redundante reducirá el efecto de inhibición del paclitaxel en las células tumorales.

Tabla 19. Tasa de inhibición celular de diferentes tratamientos

Células MCF-7

Células SPC-A-1

Ejemplo 59 La concentración de albúmina influye en la captación de fármacos por parte de las células endoteliales vasculares humanas

En una placa de 6 pocilios, se sembraron células endoteliales vasculares umbilicales humanas EA.hy 926 a una densidad de 8 x 105 Antes de añadir los fármacos, el medio se cambió a medio sin suero. Los fármacos se dividieron en 5 grupos, el grupo A era la partícula 6, el B el producto del Ejemplo 6, el C era Abraxano, el D era la partícula 6 monómero de HSA al 0,5 %, el E era la partícula 6 polímero de h Sa al 0,5 %.

Se añadieron diferentes grupos de fármaco a las células a concentraciones finales de 50, 100 y 200 pg/ml (concentración de paclitaxel) durante 2 horas a 37 °C. Después de 2 horas, las células se lavaron 3 veces con PBS, y después, se añadieron 500 ul de TritonX-100 al 5 % a cada pocillo para causar la lisis de las células. La concentración de paclitaxel en la lisis celular se detectó mediante el procedimiento mencionado en el ejemplo 10, y los resultados se muestran en la siguiente tabla y en la figura 14. Los resultados muestran que la captación celular de paclitaxel del grupo A fue mayor que la del grupo B y el grupo C, y que no hubo diferencias significativas entre los grupos B y C. Adicionalmente, en el grupo D la captación fue mayor que en el grupo E. Esto significa que una mayor concentración de HSA impidió la captación del fármaco por parte de las células endoteliales vasculares, y en comparación con el monómero, el polímero de HSA impediría más la captación celular.

Tabla 20. Concentración de fármaco en células de diferente tratamiento

Ejemplo 60

Los contenidos de albúmina y paclitaxel (PTX) y la relación de polímero en la seroalbúmina humana utilizada, producto obtenido en el Ejemplo 6, y la correspondiente nanopartícula 6, se determinaron utilizando el procedimiento del Ejemplo 10. Los resultados se muestran en la siguiente tabla.

Tabla 21. Contenido de olímero de albúmina Poli-HSA

Los resultados han revelado que la relación de poli-HSA aumentó significativamente durante el proceso de preparación de las nanopartículas de paclitaxel albúmina. Sin embargo, en el producto preparado mediante el procedimiento de preparación de la presente divulgación, la cantidad de poli-HSA en peso unitario se reduce significativamente debido a la disminución del contenido total de albúmina.

La cantidad de polímero en una solución de albúmina se incrementó mediante diálisis utilizando una membrana de ultrafiltración de celulosa regenerada (PXC100C50, Millipore) con el peso molecular límite de 100 K. La relación de polímero de albúmina se detectó utilizando el procedimiento del Ejemplo 10, y el contenido de albúmina se determinó mediante el procedimiento de Kjeldahl para impedir la desviación producida por las diferentes respuestas contra posibles polímeros del procedimiento de HPLC.

Tabla 22. El contenido de polímero de albúmina en HSA antes^ después de la diálisis

A partir del resultado puede apreciarse que mediante un proceso de diálisis puede obtenerse una solución de albúmina con una cantidad mayoritaria de polímero.

Ejemplo 61 Estudio de sensibilización de poli-HSA en cobayas

En este experimento, la HSA y la poli-HSA obtenidas en el Ejemplo 60 se seleccionaron como fármaco de ensayo. Las dosis se seleccionaron como 1 mg por cobaya y 0,3 mg por cobaya. La sensibilización se realizó mediante inyección intraperitoneal una vez cada dos días, durante un total de 3 inyecciones. Al mismo tiempo, también se estableció un grupo de control positivo (ovoalbúmina al 0,2 %) y un grupo de control negativo (inyección de cloruro de sodio al 0,9 %). El régimen de dosificación detallado se enumera en la siguiente tabla.

Tabla 23. Protocolo del estudio de sensibilización en coba as

Método de administración para la sensibilización: el lomo de la cobaya se sostenía firmemente con la mano izquierda en forma de copa, permitiendo que la piel abdominal se estirase al inmovilizar a la cobaya. Se levantó el abdomen de la cobaya y se bajó la cabeza. Después de desinfectar el lugar de la inyección con una toallita con alcohol, la aguja de una jeringa desechable de 2 ml sostenida con la mano derecha se introdujo en la piel de la cobaya. La aguja se insertó en el lugar 1 mm a la izquierda de la línea media de la parte inferior del abdomen. Al llegar a la parte subcutánea, la aguja se insertó hacia adelante de 5 mm a 10 mm más y, posteriormente, se introdujo en la cavidad abdominal en un ángulo de 45°. Después de fijar la aguja, la solución farmacéutica se inyectó lentamente. Después de la inyección, sobre el pinchazo, se presionó una toallita de algodón seca para impedir la salida del producto farmacéutico.

Excitación de alergia: la excitación se realizó mediante inyección intravenosa, y se llevó a cabo 10 d después de la última sensibilización siendo las dosis de 2 mg/animal y de 0,6 mg/animal.

Método de administración para la excitación: la inyección se realizó en la vena metatarsiana lateral de la cobaya inmovilizada por un auxiliar. El operario sujetó las patas traseras para inmovilizar el cuerpo del animal. La vena se comprimió y las patas quedaron estiradas. Se rasuró el pelo en el lugar de la inyección (o se cortó la piel en el lugar de la inyección). Después de la esterilización con toallitas con alcohol, puede verse una vena metatarsiana lateral gruesa. La aguja de una jeringa desechable de 1 ml se introdujo en el vaso sanguíneo en dirección al corazón con la mano derecha. Después de la inyección, sobre el pinchazo, se presionó una toallita de algodón seca para impedir el sangrado.

La reacción de cada animal y el momento en que aparecieron o desaparecieron los síntomas de la alergia se observaron inmediatamente después de la excitación durante 30 min. La duración máxima de la observación fue de 3 h. Los resultados de la reacción alérgica se enumeran en la siguiente tabla.

Tabla 24. Síntomas de la reacción alér ica

Tabla 25. Criterios de evaluación de la reacción alér ica sistémica

Tabla 26. Resultados de anafilaxia activa de la coba a

Los resultados muestran que las muestras que contienen más poli-HSA tenían una mayor sensibilización al mismo nivel de contenido total de HSA.

Ejemplo 62

Se disolvieron 2,5 g de paclitaxel (CAS: 33069-62-4, Yunnan Hande Bio-Tech Co., Ltd) en 15 ml de cloroformo/etanol (11:1, v/v), y se añadieron a 500 ml de solución de seroalbúmina humana (4 % p/v) (CAS: 70024-90-7, Guangdong Shuanglin Biopharmaceutical. Co., Ltd.). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión (Modelo M110-EH30K, MFIC Company, EE.Uu .) a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio (Modelo R-210, Buchi Company, Suiza) para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de paclitaxel-albúmina se generaron por tanto con un diámetro medio de 129 nm y la suspensión era translúcida. La suspensión se puede filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm (Sartorius Ag , Alemania). No hubo variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración y no se observaron cambios significativos después de la conservación durante 48 h a temperatura ambiente.

Las nanopartículas purificadas se aislaron respectivamente mediante centrifugación en el Ejemplo 11, mediante diálisis en el Ejemplo 15 y mediante separación cromatográfica en columna en el Ejemplo 16. Los resultados mostraron que la suspensión se volvió turbia y precipitó durante la diálisis. Por tanto, no se pudieron obtener nanopartículas purificadas mediante este procedimiento. Mientras que las nanopartículas purificadas obtenidas por centrifugación y separación cromatográfica en columna fueron turbias y precipitaron en 60 min.

Ejemplo 63

Se disolvieron 2,5 g de paclitaxel (CAS: 33069-62-4, Yunnan Hande Bio-Tech Co., Ltd) en 15 ml de cloroformo/etanol (11:1, v/v), y se añadieron a 500 ml de solución de seroalbúmina humana (4 % p/v) (CAS: 70024-90-7, Guangdong Shuanglin Biopharmaceutical. Co., Ltd.). La mezcla se emulsionó durante 2 min utilizando un dispersor de alta cizalla (Fluko FZ-20) para obtener una emulsión primaria. Después, la emulsión primaria se homogeneizó utilizando un homogeneizador de alta presión (Modelo M110-EH30K, MFIC Company, EE.UU.) a una presión de 10000-20000 psi para obtener una nanoemulsión. Posteriormente, la nanoemulsión se transfirió a un evaporador rotatorio (Modelo R-210, Buchi Company, Suiza) para eliminar el disolvente orgánico de la solución mediante evaporación al vacío a 40 mbar y a 40°°C en un baño de María. Las nanopartículas de paclitaxel-albúmina se generaron por tanto con un diámetro medio de 128 nm y la suspensión era translúcida. La suspensión se puede filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm (Sartorius AG, Alemania). No hubo variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración y no se observaron cambios significativos después de la conservación durante 48 h a temperatura ambiente.

La diálisis se realizó en un mismo volumen que las muestras preparadas frente a agua purificada utilizando una membrana de ultrafiltración de celulosa regenerada (PXC300C50, Millipore) siendo el peso molecular límite de 30 K y el factor de diálisis de 5.

Las nanopartículas purificadas se aislaron respectivamente mediante centrifugación en el Ejemplo 11, mediante diálisis en el Ejemplo 15 y mediante separación cromatográfica en columna en el Ejemplo 16. Las suspensiones translúcidas resultantes de los 3 procedimientos eran estables y se podían filtrar con facilidad a través de un filtro estéril de 0,22 pm (Sartorius AG, Alemania). No hubo variación significativa del tamaño de partícula después de la filtración y no se observaron cambios significativos después de la conservación durante 48 h a temperatura ambiente

Comparando los Ejemplos 62 y 63, en el Ejemplo 63 se llevó a cabo un proceso adicional de diálisis del mismo volumen contra agua purificada para eliminar los disolventes residuales. La eliminación de los disolventes residuales mejoró la estabilidad de la suspensión de las nanopartículas purificadas.

Análisis:

Las formulaciones de la técnica anterior tienen una alta relación de albúmina con respecto a un principio activo (por ejemplo, 9:1). Los presentes inventores han descubierto inesperadamente que en dicha formulación, la mayor parte de la albúmina actúa solo como agente protector o de soporte en el producto liofilizado. La mayoría de las moléculas de fármaco (por ejemplo, paclitaxel) están encapsuladas en las nanopartículas y la albúmina que no forma partículas carece sustancialmente de moléculas de fármaco. En formulaciones de la técnica anterior, la mayoría de las moléculas de seroalbúmina humano no están unidas a las moléculas de fármaco.

Después de la administración, las partículas de las formulaciones de la técnica anterior se disgregan rápidamente y se forman complejos entre las moléculas de fármaco y la seroalbúmina humana endógena. Por consiguiente, el exceso de seroalbúmina humana en las formulaciones de la técnica anterior no contribuye a la eficacia de las formulaciones (véase el Ejemplo 26), sino que causa riesgos de seguridad debido a su agregación e inmunogenicidad (véanse los Ejemplos 32, 25 y 27). Adicionalmente, la albúmina extra puede competir con el complejo fármaco-albúmina para unirse al receptor de gp60, disminuyendo así la captación del fármaco por parte de las células endoteliales vasculares (véase el Ejemplo 59). Por otra parte, después de unirse a la poli-HSA formada en el proceso de preparación, es posible que el receptor de gp60 no pueda transcitarse eficazmente, impidiendo así que se libere el receptor. Esto puede inhibir aún más la captación del fármaco por parte de las células endoteliales y, por tanto, disminuir la concentración eficaz de los fármacos.

Basándose en los descubrimientos anteriores, las nanopartículas purificadas de la presente divulgación tienen una relación de albúmina con respecto a principio activo inferior. Los presentes inventores han confirmado que para formar nanopartículas estables con moléculas de fármaco solo se requería una pequeña cantidad de seroalbúmina humana. La reducción de seroalbúmina humana en las nanopartículas purificadas y en sus composiciones, proporcionadas en el presente documento, reduce las reacciones adversas asociadas a la agregación e inmunogenicidad de la seroalbúmina humana.

Después de la administración, las nanopartículas purificadas proporcionadas en el presente documento, pudieron disgregarse rápidamente y unirse a la albúmina endógena para la circulación in vivo. En comparación con la formulación de la técnica anterior, no se observaron diferencias significativas en términos de seguridad y eficacia en estudios con animales. Sin embargo, las nanopartículas purificadas y sus composiciones, proporcionadas en el presente documento, mejoraron la captación por parte de las células endoteliales vasculares humanas así como el suministro y la eficacia de los principios activos de las nanopartículas a las células diana humanas o en ellas.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Nanopartículas terapéuticas purificadas, que comprenden paclitaxel y seroalbúmina humana, en las que la relación en peso de la seroalbúmina humana (HSA) con respecto a paclitaxel en las nanopartículas terapéuticas se selecciona de 0,03:1, 0,04:1, 0,05:1, 0,06:1, 0,07:1, 0,08:1, 0,09:1, 0,10:1, 0,11:1, 0,12:1, 0,13:1, 0,14:1, 0,15:1, 0,16:1, 0,17:1, 0,18:1, 0,19:1,0,2:1, 0,21:1, 0,22:1, 0,23:1, 0,24:1, 0,25:1, 0,26:1, 0,27:1, 0,28:1, 0,29:1, 0,3:1, 0,31:1, 0,32:1, 0,33:1, 0,34:1,0,35:1, 0,36:1, 0,37:1,0,38:1, 0,39:1, 0,4:1,0,41:1,0,42:1,0,43:1, 0,44:1,0,45:1,0,46:1,0,47:1, 0,48:1,0,49:1, 0,5:1, 0,51:1, 0,52:1, 0,53:1, 0,54:1, 0,55:1, 0,56:1, 0,57:1, 0,58:1, 0,59:1, 0,6:1, 0,65:1, 0,70:1, 0,75:1, 0,8:1, 0,85:1, 0,9:1, 0,95:1 o del intervalo entre cualquiera de las dos relaciones anteriores, en las que las nanopartículas contienen menos del 10 % de HSA libre (en peso).

2. Las nanopartículas terapéuticas según la reivindicación 1, en las que la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto a paclitaxel se selecciona de 0,10:1,0,11:1, 0,12:1, 0,13:1, 0,14:1, 0,15:1, 0,16:1, 0,17:1, 0,18:1, 0,19:1, 0,2:1, 0,21:1, 0,22:1, 0,23:1, 0,24:1, 0,25:1, 0,26:1, 0,27:1, 0,28:1, 0,29:1, 0,3:1, 0,31:1, 0,32:1, 0,33:1, 0,34:1, 0,35:1, 0,36:1, 0,37:1,0,38:1,0,39:1,0,4:1, 0,41:1, 0,42:1, 0,43:1, 0,44:1, 0,45:1, 0,46:1, 0,47:1, 0,48:1, 0,49:1, 0,5:1, 0,6:1 o del intervalo entre cualquiera de las dos relaciones anteriores.

3. Las nanopartículas terapéuticas según la reivindicación 1, en las que las nanopartículas contienen como máximo un 5 % de HSA libre (en peso).

4. Las nanopartículas terapéuticas según la reivindicación 1, en las que el paclitaxel está encapsulado en la seroalbúmina humana.

5. Las nanopartículas terapéuticas según la reivindicación 1, en las que la relación en peso de la seroalbúmina humana con respecto a paclitaxel es de 0,03:1 a 0,7:1; el tamaño medio de partícula de las nanopartículas terapéuticas es de 50 nm a 190 nm.

6. Una composición farmacéutica, que comprende las nanopartículas terapéuticas según la reivindicación 1, en la que la composición contiene menos del 10 % de HSA libre (en peso).

7. La composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que la composición farmacéutica está en forma de polvo líquido o liofilizado.

8. La composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que la composición farmacéutica también comprende un excipiente de liofilización cuando la composición farmacéutica está en forma de polvo liofilizado.

9. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, en la que el excipiente de liofilización se selecciona de uno o más de manitol, sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa y dextrano.

10. La composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que la composición contiene como máximo un 5 % de HSA libre (en peso).

11. Un procedimiento para preparar las nanopartículas terapéuticas purificadas según la reivindicación 1, que comprende:

1) disolver paclitaxel en un disolvente orgánico para formar una fase oleaginosa y disolver seroalbúmina humana en agua para formar una fase acuosa;

2) formar una emulsión de aceite en agua utilizando las fases oleaginosa y acuosa anteriores;

3) eliminar el disolvente orgánico en la emulsión para obtener una suspensión que contenga las nanopartículas terapéuticas; y

4) eliminar de la suspensión la HSA libre que no esté incorporada en las nanopartículas para obtener nanopartículas terapéuticas purificadas.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, en la que el disolvente orgánico se selecciona de uno o más de cloroformo y etanol.

13. El procedimiento según la reivindicación 11, que comprende adicionalmente: entre las etapas 3) y 4), una etapa de dializar la suspensión de la etapa 3) con una solución acuosa para eliminar el disolvente orgánico restante de la suspensión.

14. El procedimiento según la reivindicación 13, en la que la solución acuosa es agua.

15. El procedimiento según la reivindicación 11, en la que dicha separación en la etapa 4) se realiza utilizando un procedimiento seleccionado de: centrifugación, diálisis y cromatografía de exclusión.

16. Un procedimiento para preparar la formulación farmacéutica según la reivindicación 6, que comprende:

1) disolver paclitaxel en un disolvente orgánico para formar una fase oleaginosa y disolver seroalbúmina humana en agua para formar una fase acuosa;

2) formar una emulsión de aceite en agua utilizando las fases oleaginosa y acuosa anteriores;

3) eliminar el disolvente orgánico en la emulsión para obtener una suspensión que contenga las nanopartículas terapéuticas;

4) eliminar la HSA libre que no esté incorporada en las nanopartículas para obtener nanopartículas terapéuticas purificadas;

5) resuspender las nanopartículas terapéuticas purificadas en una solución que contenga excipiente; y

6) liofilizar opcionalmente la resuspensión de las nanopartículas terapéuticas purificadas para obtener la composición farmacéutica.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, que comprende adicionalmente: entre las etapas 3) y 4), una etapa de dializar la suspensión de la etapa 3) con una solución acuosa para eliminar el disolvente orgánico restante de la suspensión.

18. El procedimiento según la reivindicación 17, en la que la solución acuosa es agua.

19. Un procedimiento para preparar la formulación farmacéutica según la reivindicación 6, que comprende:

1) disolver paclitaxel en un disolvente orgánico para formar una fase oleaginosa y disolver seroalbúmina humana en agua para formar una fase acuosa;

2) formar una emulsión de aceite en agua utilizando las fases oleaginosa y acuosa anteriores;

3) eliminar el disolvente orgánico en la emulsión para obtener una suspensión que contenga las nanopartículas terapéuticas;

4) dializar la suspensión obtenida después de la eliminación del disolvente orgánico mediante una solución que contenga un excipiente para eliminar la HSA libre que no esté incorporada en las nanopartículas; y

5) opcionalmente, liofilizar la suspensión dializada para obtener la composición farmacéutica.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, que comprende adicionalmente: entre las etapas 3) y 4), una etapa de dializar la suspensión de la etapa 3) con una solución acuosa para eliminar el disolvente orgánico restante de la suspensión.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en la que la solución acuosa es agua.

22. La composición farmacéutica según la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento del cáncer.