ES2827429T3 - Composiciones antimicrobianas - Google Patents

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Melanie Heudre
Francois-Xavier Pierre
Xavier Mesnier
Anne PASSEMARD
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Abstract

Una composición que comprende extracto de hesperidina puro y un extracto de Lamiaceae desodorizado que comprende diterpenos fenólicos, en donde el extracto de hesperidina puro contiene de 80% a 99% de hesperidina y la mayoría de los componentes volátiles del aceite se han eliminado del extracto de Lamiaceae.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones antimicrobianas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones que comprenden extracto de hesperidina puro y un extracto de Lamiaceae desodorizado, en donde el extracto de hesperidina puro contiene de 80% a 99% de hesperidina y la mayoría de los componentes de aceite volátiles se han eliminado del extracto de Lamiaceae para prolongar el color y/o la estabilidad microbiana de los alimentos y, en particular, a composiciones que prolongan el color y/o la estabilidad microbiana de los alimentos que incluyen, pero no se limitan a carne, pescado o aves de corral (frescos/sin procesar y procesados). Estas composiciones que son eficaces para prolongar el color y la estabilidad microbiológica de los alimentos.
Antecedentes de la invención
La seguridad alimentaria y la prevención del deterioro de los alimentos es una preocupación constante en todo el mundo, en particular en la industria cárnica. El deterioro de los alimentos es un problema económico importante para un fabricante de alimentos. Los fabricantes de alimentos necesitan proteger la salud y la seguridad del público suministrando productos que sean seguros para comer. Dichos alimentos deben tener una vida útil garantizada, ya sea en almacenamiento refrigerado o a temperatura ambiente. Los consumidores prefieren alimentos de buena calidad y buen sabor. Esto es difícil de lograr con conservantes químicos, regímenes de calentamiento rigurosos y otras medidas de procesamiento. La seguridad y protección de los alimentos se logra mejor con un sistema de conservación múltiple que utiliza un enfoque combinado de procesamiento más suave y conservantes naturales. Los microorganismos transmitidos por los alimentos también son menos capaces de adaptarse y crecer en alimentos conservados con diferentes medidas conservantes.
Existe mucha preocupación por la protección de los alimentos y el crecimiento de organismos que deterioran los alimentos, tales como Listeria monocytogenes. Esta especie en particular es uno de los microorganismos de deterioro más problemáticos de la carne. Las características fisiológicas inusuales, tales como la resistencia excepcional a los antimicrobianos, son en gran parte responsables de su capacidad para causar deterioro. Además, los organismos que producen el deterioro a veces pueden adaptarse a diferentes conservantes y condiciones de almacenamiento, por lo que una combinación de medidas conservantes puede tener más éxito que medidas individuales.
Existe una necesidad creciente de desarrollar sistemas conservantes económicos, naturales y efectivos para satisfacer la demanda pública de productos convenientes, naturales, seguros, saludables y de buena calidad con una vida útil garantizada. Los materiales antimicrobianos, tales como los derivados de plantas, se pueden utilizar como conservantes en los alimentos para ayudar a satisfacer esta necesidad. Estos extractos de plantas se considera que son deseables porque se consideran naturales. Además, desde un punto de vista regulatorio, debido al uso de hace mucho tiempo, los extractos de plantas generalmente tienen el estado GRAS (generalmente considerado seguro). También existe un deseo continuo de proporcionar protección microbiana utilizando cantidades menores de materiales antimicrobianos. Por tanto, existe la necesidad de proporcionar nuevos materiales antimicrobianos o nuevas combinaciones más eficaces de materiales antimicrobianos.
A pesar de sus orígenes naturales, es deseable que los productos antimicrobianos de origen vegetal se utilicen en las cantidades más bajas posibles. Esto es deseable no solo por razones de coste sino también para satisfacer el deseo del consumidor de minimizar la cantidad de "aditivos" en los productos alimenticios. Además, muchos materiales vegetales tienen un sabor asociado. Por tanto, en muchas aplicaciones alimentarias exigentes es ventajosa la reducción de la cantidad de protector de origen vegetal.
Los fabricantes de carne están buscando formas que les permitan abastecer a los puntos de venta al por menor desde centros de procesamiento centralizados eficientes y rentables. Se requiere una mayor vida útil con respecto al deterioro (seguridad del consumidor) para que esto sea posible, ya que la carne se abre paso a través de canales de distribución más largos desde el productor hasta el minorista y al consumidor.
La vida útil del color es importante para la aceptación del consumidor. Los consumidores juzgan la frescura de la carne por la presencia del pigmento rojo brillante oximioglobina. La oximioglobina en la carne fresca disminuye con el tiempo durante el almacenamiento a medida que cambia al pigmento marrón estable, la metmioglobina. Aunque el pigmento oximioglobina se desvanece durante el almacenamiento en la oscuridad, por ejemplo, en un armario de carne, la pérdida de pigmento es más pronunciada en las vitrinas refrigeradas, iluminadas de los establecimientos minoristas. Además, la pérdida de pigmento es principalmente de naturaleza cosmética, tiene graves consecuencias económicas. Los consumidores que buscan los cortes de aspecto más frescos evitan comprar carne que contenga incluso pequeñas cantidades de metmioglobina marrón.
La vida útil asociada con el deterioro microbiano es un problema grave. La responsabilidad potencial asociada con los brotes de enfermedades transmitidas por los alimentos por la venta de carne contaminada con microbios es enorme. La industria cárnica y los puntos de venta al por menor asociados están buscando formas de garantizar la seguridad de los consumidores evitando la contaminación microbiana durante todo el procedimiento de fabricación. Las mejoras del procedimiento, como el lavado de canales y el procesamiento a baja temperatura cuidadosamente controlado, son ahora rutinarios en la industria. Un método para aumentar la vida útil asociada con el deterioro microbiano es envasar los alimentos, p. ej. carne, utilizando envasado en atmósfera modificada (MAP).
Existe una necesidad en la industria de métodos y procedimientos antimicrobianos que los consumidores perciban como más naturales. La actividad antimicrobiana de la composición que comprende extracto de Lamiaceae y hesperidina ha sido el principal objeto de estudio. La mayor parte de la técnica anterior indica que la actividad antimicrobiana de las hierbas se centra en los componentes volátiles de aceite esencial.
P. M. Davidson y A. S. Naidu (en Natural Food Antimicrobial Systems, A. S. Naidu, ed., 2000, CRC Press, Boca Raton, páginas 265-294) revisan las propiedades antimicrobianas de los compuestos fitofenólicos de los aceites esenciales de especias, hierbas, granos comestibles y semillas. Los autores enseñan que los efectos antimicrobianos de las especias y hierbas se deben principalmente a la presencia de compuestos fenólicos en las fracciones de aceite esencial y que algunos monoterpenos también parecen mostrar cierta actividad. El carvacrol, p-cimeno y timol se identifican como los principales componentes volátiles del orégano, tomillo y ajedrea que probablemente explican la actividad observada. Se ha sugerido que los agentes antimicrobianos activos del romero son borneol, alcanfor, 1,8-cineol, alfa pineno, canfeno, verbenona y acetato de bornilo. Se ha sugerido que el componente activo de la salvia es la tuyona. Se ha mostrado que las concentraciones letales mínimas de aceites esenciales del aceite de tomillo oscilan entre 225-900 ppm en cultivos. Estas concentraciones de aceites esenciales en los alimentos causarían importantes problemas de sabor. Dado que los experimentos de cultivo subestiman la concentración necesaria para la eficacia en los alimentos, es probable que los problemas de sabor en los alimentos sean más graves de lo que sugieren incluso las cifras en cultivos. En otra parte de esta referencia, las concentraciones inhibitorias mínimas de aceites esenciales se establecían como 1-2% para romero, 0.12-2% para tomillo, 0.12-2% para hierbabuena, 0.5-2% para salvia, 0.5-2% para menta y 0.12-2% para el orégano. En el resumen, los autores afirman que las concentraciones de compuestos antimicrobianos en hierbas y especias son demasiado bajas para ser usadas eficazmente sin efectos adversos sobre las características sensoriales de un alimento.
Y. Kimura et al. en la patente de EE.UU. N° 4,380,506, enseñan un procedimiento para producir un conservante que tiene actividad antioxidante y antimicrobiana. El procedimiento implica dividir un extracto de especies de hierbas entre disolventes polares y no polares. Algunos de los extractos divididos mostraron actividad antimicrobiana contra microorganismos Bacillus subtilis Gram positivos en medios de cultivo. El único criterio de sabor ensayado por Kimura et al. fue el amargor. Kimura et al. guardaban silencio en cuanto a la percepción del sabor del aceite esencial. Kimura et al. no desodorizaban el extracto, lo que significa que el extracto contenía aceites esenciales y afectaban al sabor de la carne. Este impacto en el sabor enseña a no usar extractos de romero obtenidos mediante el procedimiento enseñado por Kimura et al.
D. Ninkov (documento WO 01/15680) enseña que las composiciones farmacéuticas se pueden preparar combinando extractos de aceites esenciales de plantas de la familia Lamiaceae con un ácido orgánico. Ninkov enseña que la actividad antimicrobiana de la composición farmacéutica se debe a la presencia de fenoles orgánicos tales como isopropil-o-cresol en el extracto de aceite de la planta.
K. Shetty y R. G. Labbe, (Asia Pacific J. Clin. Nutr. (1998), 7 (3/4), páginas 270-276., describen el trabajo para clonar plantas de Lamiacae para producir niveles mejorados de componentes de aceites esenciales tales como carvacrol y timol. Estos componentes de aceites esenciales tienen algunas propiedades antimicrobianas, pero su uso comercial se ve impedido por los fuertes sabores impartidos a los alimentos por estos compuestos volátiles.
J. Campo, M. Amiot y C. Nguyen-the (2000, Journal o f Food Protection 63, páginas 1359-1368) enseñan que el extracto de romero tiene propiedades antimicrobianas en estudios de cultivos. Las concentraciones inhibitorias mínimas variaron con la especie de bacteria que se estaba ensayando, pero oscilaron entre 0.06 y 1%. Estos investigadores sugieren que el extracto de romero puede resultar prometedor en alimentos con bajo contenido de grasas y proteínas, frente a organismos Gram positivos. En realidad, no se estudió ningún sistema alimentario en esta referencia. Esta referencia no estudió específicamente Listeria.
E. Down, et al., "Comparison of Vitamin E, Natural Antioxidants and Antioxidant Combinations on the Lean Color and Retail Case-Life of Ground Beef Patties", publicado en octubre, 1999, describe el efecto del extracto de romero en combinación con otros antioxidantes naturales y suplementos dietéticos de vitamina E sobre la vida del color de la carne de vacuno triturada sin MAP. Esta referencia no enseña cómo extender la vida útil microbiana de la carne. Los autores no pudieron demostrar una mejora del color rojo de la carne usando romero, ya que la conservación del color rojo en la carne con un antioxidante natural que contenía romero no podía diferir estadísticamente del control. El color rojo del control se altera dentro del período comercialmente deseable. La pérdida de tanto del color rojo en el control, así como en la carne con el romero de esta referencia enseña a no usar el extracto de romero como agente de estabilidad capaz de conservar el color rojo de la carne.
Ahn et al. "Effects of plant extracts on microbial growth, color change, and lipid oxidation in cooked beef", Food Microbiol., Vol. 24, número 1, (2007): 7-14, muestran que el extracto de romero, o la oleorresina de romero, cuyo contenido en diterpenos fenólicos no se conoce, tiene un efecto antilisteriano. En esta referencia, el extracto de semilla de uva y el extracto de corteza de pino tenían un mayor efecto antilisteriano que el romero, lo que enseña a no usar el extracto de romero como principal producto natural antilisteriano en la carne. Además, Ahn et al. 2007 han mostrado que la adición de extracto de romero a la carne deterioraba significativamente el color rojo de la carne, en comparación con el control que perdía menos del color rojo o en comparación con el extracto de uva que mejoró significativamente la conservación del color rojo de la carne. Por tanto, Ahn et al. 2007 enseñan a no utilizar extracto de romero como agente de estabilidad capaz de preservar el color rojo de la carne.
Los estudios de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2004/131709 muestran que el extracto de romero solo, Herbalox® Seasoning, en el que se han eliminado la mayoría de los componentes volátiles del aceite, muestra muy poco o ningún efecto antimicrobiano. Esta referencia no enseña cómo extender la vida útil de la carne frente a bacterias Gram positivas, más precisamente antilisteriano.
Además, los antimicrobianos derivados de plantas de cítricos descritos en la técnica anterior son ácidos no flavonoides. Por ejemplo, las patentes anteriores dirigidas a compuestos de cítricos se refieren esencialmente a ácidos. El documento KR20040001441 describe el jugo de naranja como un supresor del crecimiento de gérmenes. Sin embargo, solo podría usarse menos de aproximadamente 1/50 parte del jugo descrito en KR20040001441 en la carne sin percibir la carne como agria. Dado que la carne sólo absorbe hasta 7.2% de la solución rica en ácido cítrico, los niveles finales de hesperidina absorbida por la carne corresponderían entonces a menos de 0.48%*1/50*7.2%= ~0.0007%. Esta referencia no enseña si la hesperidina podría tener un efecto antilisteriano en la carne.
Lorente, José et al. "Chemical guide parameters for Spanish lemon (Citrus limon (L.) Burm) juices". Food chemistry 162 (2014): 186-191 describe que el jugo de cítricos tiene una acidez valorable de 52.4 g/l, siendo el ácido cítrico el componente principal. Según Lorente et al. (2014) en dicho jugo, los niveles de hesperidina en comparación con la acidez valorable son más bajos en más de dos órdenes de magnitud (257 a 484.8 mg/l), lo que corresponde de 0.26 a 0.48% en p/v de hesperidina. Añadir una composición tan ácida a la carne afectaría el sabor de la carne ya en niveles bajos.
Aktas, Nesimi y Mükerrem Kaya. "The influence of marinating with weak organic acids and salts on the intramuscular connective tissue and sensory properties of beef". European Food Research and Technology 213.2 (2001): 88-94 muestran que la adición de una solución de ácido débil al 1% (que incluye ácido cítrico) a la carne confiere a la carne el sabor agrio. También muestran que cuando se marina en proporciones 1:1 p/v (carne/marinado) la carne gana un peso como máximo de 7.2% después del marinado en marinados que contienen ácido cítrico.
En el documento WO 2012/112337, se describe que los flavonoides, incluida la hesperidina, pueden proporcionar alguna actividad antimicrobiana activa sin informar sobre la naturaleza de los microbios, si son bacterias, si son bacterias Gram positivas o si son Listeria. El documento WO 2012/112337 enseña que los compuestos antimicrobianos activos son ácidos.
Moulehi, Ikram wt al. "Variety and ripening impact on phenolic composition and antioxidant activity of mandarin (Citrus reticulate Blanco) and bitter orange (Citrus aurantium L.) seeds extracts”. Industrial Crops and Products 39 (2012): 74­ 80 describen que los extractos de semillas de cítricos contienen flavonoides totales de 1.31 a 2.52 mg de catequinas equivalentes/g de DW. Dado que la hesperidina representa <16% del total de flavonoides del extracto de semillas de cítricos, esto significa que la hesperidina está presente en un ~0.032% en el extracto de semillas de cítricos DW.
Mandalari, G. et al. "Antimicrobial activity of flavonoids extracted from bergamot (Citris bergamia Risso) peel, a byproduct of the essential oil industry". Journal o f Applied Microbiology 103.6 (2007): 2056-2064 describen que in vitro, los extractos de cítricos ricos en flavonoides inhiben el crecimiento de bacterias Gram negativas únicamente y no tienen ningún efecto sobre el crecimiento de bacterias Gram positivas, y no tienen ningún efecto sobre el crecimiento de Listeria. Mandalari et al. (2007) muestran que la neohesperidina en forma pura no tiene efecto sobre el crecimiento in vitro de Listeria.
Fernandez-Lopez, J., et al. "Antioxidant and antibacterial activities of natural extracts: application in beef meatballs ". Meat science 69.3 (2005): 371-380, muestran que la carne complementada con extractos de cítricos que contienen flavonoides, el principal de los cuales es la hesperidina no tiene ningún efecto sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes. Por ejemplo, Fernandez-Lopez et al. (2005) muestran que tales extractos ejercen efectos antimicrobianos sobre otras cepas bacterianas, incluyendo Listeria innocua, pero no en Listeria monocytogenes.
Las enseñanzas de Mandalari et al. y Fernandez-Lopez et al. enseñan a no usar hesperidina como compuesto antilisteriano y no resulta evidente el uso de ninguno o de una combinación de flavonoides de un extracto de cítricos contra Listeria monocytogenes en la carne. Por ejemplo, Mandalari et al. (2007) enseñan a no usar hesperidina como compuesto antilisteriano y no resulta obvio que un flavonoide purificado pudiera tener un efecto antilisteriano.
Los extractos de Punica ricos en ácido elágico no tienen efectos antimicrobianos en la carne cruda en MAP. Por ejemplo, Hayes et al. (Hayes, J. E., Stepanyan, V., Allen, P., O'Grady, M. N. y Kerry, J. p. 2010). "Effect of lutein, sesamol, ellagic acid and olive leaf extract on the quality and shelf-life stability of packaged raw minced beef patties", Meat science, 84 (4), 613-620.) (en adelante "Hayes et al") enseñan que el ácido elágico (uno de los compuestos activos del extracto de Punica) no tiene efecto antimicrobiano en la carne de vacuno cruda en MAP almacenada en frío y cuando se aplica en 300 ppm. Hayes et al. enseñan que el ácido elágico no mejoraba la conservación del color rojo de la carne de vaca cruda en MAP almacenada en frío y cuando se aplicaba en 300 ppm o 600 ppm. Hayes et al.
enseñan a no usar concentraciones inferiores a 300 ppm en ácido elágico para obtener un efecto antimicrobiano. Hayes et al., enseñan a no usar ácido elágico para mejorar el color rojo de la carne.
El problema general de mejorar la vida útil de la carne fresca sin afectar al sabor sigue siendo prevenir el crecimiento de patógenos y organismos que producen deterioro y conservar el color rojo de la carne durante el período de almacenamiento comercialmente deseable.
El documento US2014/322147 describe composiciones antimicrobianas y métodos para producir un efecto antimicrobiano en los que se usa un extracto de cítrico tal como Biosecur® en combinación con alcohol bencílico y uno o más agentes adicionales seleccionados del grupo que consiste en lauroil-arginato/laurato de glicerilo y aceites esenciales o constituyentes de los mismos tales como aceite de galanga, aceite de tomillo, timol, aceite de hojas de canela, aceite de corteza de canela, aceite de limoncillo, aceite de naranja, aceite de pino, aceite de madera de cedro, aceite de hoja de curry y aceite de romero.
El documento WO2012/028928 describe un método para proteger el color de la carne y los productos cárnicos, que comprende la etapa de poner en contacto la carne o el producto cárnico con una composición que comprende un extracto de acerola. La composición puede comprender además un extracto de una planta de la familia Labiatae, que puede ser extracto de romero, remolacha o una combinación de los mismos.
Sumario de la invención
Según la presente invención, que está definida por las reivindicaciones, las composiciones comprenden un extracto de Lamiaceae (romero) desodorizado que comprende diterpenos fenólicos en donde se han eliminado del extracto la mayoría de los componentes del aceite volátiles; y un extracto de hesperidina puro, en donde el extracto de hesperidina puro contiene de 80% a 99% de hesperidina.
Otros aspectos de la presente invención se refieren al uso de la composición con un alimento que incluye, pero no se limita a carne fresca, aves de corral y pescado, y que comprende los componentes de una composición de esta descripción, a un producto alimenticio envasado y a un método de envasado de alimentos. También forman parte de la presente invención los usos no terapéuticos de la composición como composición antimicrobiana, antibacteriana y antifúngica.
La presente invención, en otra forma de la misma, se refiere a un alimento que incluye pero no se limita a carne, aves de corral y pescado, incluyendo carne, aves de corral y pescado frescos o sin procesar y carne, aves de corral y pescado procesados, que contiene una composición que comprende hesperidina pura y un extracto de Lamiacea desodorizado que comprende diterpenos fenólicos, en donde el extracto de hesperidina puro contiene de 80% a 99% de hesperidina y una mayoría de los componentes del aceite volátiles se han eliminado del extracto de Lamiaceae.
La presente invención en otra forma de la misma se refiere a un método para envasar alimentos. El método incluye aplicar o incorporar en un alimento que incluye, pero no se limita a carne, pescado o aves de corral frescos o sin procesar, así como carne, pescado y aves de corral procesados, una composición que comprende hesperidina pura y un extracto de Lamiaceae desodorizado que comprende diterpenos fenólicos en donde el extracto de hesperidina pura contiene de 80% a 99% de hesperidina y una mayoría de los componentes volátiles del aceite se han eliminado del extracto de Lamiaceae. El método, opcionalmente, incluye además envasar el alimento en una atmósfera que contiene 20% o más de oxígeno. En otras realizaciones alternativas, la cantidad de oxígeno puede ser de hasta 70% de oxígeno. El producto alimenticio envasado puede comprender un alimento, p. ej. carne, pescado o aves de corral frescos/sin procesar o carne, pescado o aves de corral procesados, envasados en un entorno atmosférico estándar.
La presente invención en otra forma de la misma se refiere a un método para envasar alimentos. El método incluye aplicar o incorporar a un alimento que incluye, pero no se limita a carne, pescado o aves de corral (frescos/sin procesar y procesados), una composición que comprende hesperidina pura y un extracto de Lamiaceae desodorizado que comprende diterpenos fenólicos donde el extracto de hesperidina puro contiene de 80% a 99% de hesperidina y una mayoría de los componentes volátiles del aceite se han eliminado del extracto de Lamiaceae y el alimento se envasa en un entorno que incluye 20% o más de oxígeno.
En una forma, la presente invención se dirige a la presencia de hesperidina que tiene una concentración de al menos 80% hasta 99%, preferiblemente 95% y añadida en 56-5380 ppm en combinación con extracto de romero como se ha definido antes, en los alimentos para inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes.
La composición antibacteriana de la invención es eficaz contra bacterias Gram positivas seleccionadas del grupo que consiste en Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Enterococcus hirae y Mycobacterium bovis. La composición también es eficaz contra bacterias Gram negativas seleccionadas del grupo que consiste en Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhimirium y Enterobacter cloacae.
La composición de la invención es eficaz contra levaduras, incluyendo Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans.
El extracto de romero de acuerdo con la presente invención mejora la conservación del color rojo de la carne y prolonga la vida útil microbiana sin afectar al sabor de la carne. Los estudios de los autores de la presente invención en sistemas cárnicos reales utilizan un extracto de romero desodorizado: un extracto del que se ha eliminado la mayoría de los componentes volátiles del aceite esencial y que no afecta al sabor de la carne. Cuando se combina con extracto de hesperidina, inesperadamente, se observan efectos sinérgicos antilisterianos y sinérgicos de conservación del color, sin ningún impacto en el sabor de los alimentos.
El presente método y composición pueden proporcionar formas para que los proveedores de alimentos de cualquier producto alimenticio o bebida, incluidos los fabricantes de carne, proporcionen a los minoristas productos desde centros de procesamiento centrales económicos y rentables. El presente método y composición pueden prolongar la vida útil de los alimentos, incluida la carne, pescado y aves de corral frescos y procesados, y proporcionar alimentos que tengan una vida útil microbiana y del color prolongada en una atmósfera que contenga 70% o más de oxígeno y 30% o más de CO2. El método, de acuerdo con esta descripción, que usa combinaciones de extractos, puede usarse para mejorar la conservación del color de la carne, bloquear el crecimiento de Listeria en los alimentos, incluidas las carnes, pescados y aves de corral (frescos/sin procesar y procesados) y permitir el uso de concentraciones inhibidoras más bajas, pero más efectivas, de extractos de plantas, sin impactos negativos en el sabor.
El presente método es particularmente adecuado para usar con carnes envasadas en atmósfera modificada (MAP). Las carnes MAP se envasan en materiales impermeables al gas que mantienen una atmósfera sobre el producto. Se usan a menudo mezclas de oxígeno y dióxido de carbono en carnes MAP. Las mezclas de estos gases funcionan muy bien con el presente método.
En marcado contraste con el presente método y composición, la técnica anterior enseña que los extractos de cítricos que contienen hesperidina no tienen ningún efecto sobre el crecimiento de Listeria in vitro ni en un alimento que incluya carne. Los flavonoides puros tales como la hesperidina o la neohesperidina no tienen ningún efecto sobre el crecimiento de Listeria in vitro, ni en carne. Mandalari et al. (2007) describen que in vitro, los extractos de cítricos ricos en flavonoides inhiben el crecimiento de bacterias Gram negativas únicamente y no tienen ningún efecto sobre el crecimiento de bacterias Gram positivas, y no tienen efecto sobre el crecimiento de Listeria. Mandalari et al. (2007) muestran que la neohesperidina en forma pura no tiene ningún efecto sobre el crecimiento de Listeria in vitro.
Fernandez-Lopez et al. (2005) muestran que la carne complementada con extractos de cítricos que contienen flavonoides, el principal de los cuales es la hesperidina no tiene ningún efecto sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes. Fernandez-Lopez et al. (2005) muestran que tales extractos ejercen efectos antimicrobianos sobre otras cepas bacterianas, incluida Listeria innocua, pero no sobre Listeria monocytogenes.
Las enseñanzas de Mandalari et al. y Fernandez-Lopez et al. enseñan a no usar la hesperidina como compuesto antilisteriano y no resulta evidente el uso de ningún flavonoide o combinación de flavonoides de un extracto cítrico contra Listeria monocytogenes en alimentos. Además, las enseñanzas de Mandalari et al. enseñan a no usar la hesperidina como compuesto antilisteriano y no hace evidente que un flavonoide purificado podría tener un efecto antilisteriano.
La presente invención muestra que cuando la hesperidina se concentra al menos del 80% hasta el 99%, preferentemente al 95%, inhibe el crecimiento de Listeria monocytogenes en la carne. La técnica anterior enseña o al menos sugiere que la hesperidina no tiene efecto sobre el crecimiento de Listeria en alimentos, incluida la carne. Los autores de la presente invención descubrieron sorprendentemente que la hesperidina se puede usar en un producto alimenticio/comestible, tal como carne (p. ej., carne picada) para extender su vida útil microbiana, de color y de sabor. Cuando se usa hesperidina sola, se requiere que la hesperidina se use en concentraciones más altas para asegurar efectos antilisterianos adecuados. Sorprendente e inesperadamente, la adición de extractos de plantas que comprenden diterpenos fenólicos a la hesperidina mejora sinérgicamente los efectos antilisterianos y permite el uso de dosis más bajas de cada extracto.
Además, sorprendentemente, se ha descubierto que los extractos de hesperidina y Lamiaceae conservan el color en la carne picada MAP de una manera sinérgica. En muestras de carne picada almacenadas seis (6) días en condiciones frías, la hesperidina más el extracto de romero exceden el efecto aditivo conservante del color de la hesperidina o el romero solos.
La técnica anterior está repleta de afirmaciones de que los extractos que contienen hesperidina no tienen efecto inhibidor sobre organismos Listeria monocytogenes. Sorprendentemente, los autores de la presente invención encontraron evidencia de que la hesperidina en presencia de altas concentraciones de oxígeno inhibe Listeria monocytogenes, organismo Gram positivo. La combinación de hesperidina y atmósfera con alto contenido de oxígeno inhibe Listeria monocytogenes, organismo Gram positivo aislado como principal organismo del deterioro de la carne de vacuno picada. Aún más sorprendente, las combinaciones de romero y hesperidina muestran una inhibición sinérgica de estos Listeria monocytogenes, organismos Gram positivos, en atmósferas con alto contenido de oxígeno.
Las combinaciones de extracto de Lamiaceae que contiene diterpenos fenólicos y hesperidina, conservan el color de la carne, pescado y aves de corral (frescos/sin procesar y procesados) en presencia de oxígeno de manera sinérgica.
La hesperidina sola en ciertas concentraciones no conserva la vida del color de la carne roja fresca y da como resultado una característica organoléptica inaceptable. La combinación de extracto de romero y hesperidina actúa de forma sinérgica para extender la vida del color de la carne picada en condiciones de almacenamiento en frío. La combinación no es solo aditiva, sino que es sinérgica, porque supera el efecto aditivo de la hesperidina sola y el romero solo.
La adición de extracto de Lamiaceae que comprende diterpenos fenólicos a la hesperidina produce una composición de sabor aceptable que es eficaz para conservar el color e inhibir el crecimiento de microorganismos en la carne, pescado y aves de corral (tanto frescos/sin procesar como procesados).
La hesperidina sola suprime el crecimiento de Listeria en los alimentos, incluida la carne. Sorprendentemente, las combinaciones de extracto de Lamiaceae, preferiblemente extracto de romero y hesperidina, como se ha descrito previamente, son más efectivas para suprimir el crecimiento de bacterias Gram positivas, preferiblemente Listeria monocytogenes, que el extracto de Lamiaceae o la hesperidina, solos.
La combinación de extracto de Lamiaceae y hesperidina, como se ha descrito previamente en presencia de oxígeno, no afecta al sabor de la carne picada en un envase después de un período de almacenamiento comercialmente deseable. Ni el extracto de Lamiaceae que contiene diterpenos fenólicos ni la hesperidina sola, ni el oxígeno solo, o una combinación de dos de estos factores por sí solos, conserva el color tan bien como la combinación de los tres al final de un período de almacenamiento comercialmente deseable, sin afectar al sabor.
Sorprendentemente, la adición de extractos de plantas que comprenden diterpenos fenólicos a la hesperidina mejora sinérgicamente los efectos antilisterianos y permite el uso de dosis más bajas de cada extracto.
Además, sorprendentemente, se ha descubierto que los extractos de hesperidina y Lamiaceae conservan el color en la carne de vacuno picada MAP de una manera sinérgica. En muestras de carne de vacuno picada almacenada cinco (5) días en condiciones frías, la hesperidina más el extracto de romero exceden el efecto aditivo conservante del color de la hesperidina o el romero solos.
Para mantener el número de aditivos dentro de límites razonables con respecto a la carne, el pescado o las aves de corral, es conveniente utilizar extractos botánicos que tengan la propiedad de inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes, y, más particularmente, es ventajoso combinar extractos botánicos que proporcionen efectos antilisterianos sinérgicos y que conserven el color rojo de la carne sin afectar el sabor de la carne. Ventajosamente, las formulaciones de diferentes extractos botánicos, de acuerdo con esta descripción, funcionan sinérgicamente para aumentar la actividad antilisteriana total y para conservar el color rojo de la carne sin afectar al sabor de la carne, de los extractos combinados, que son superiores a la suma de sus contribuciones individuales.
Los métodos y composiciones de acuerdo con la presente descripción presentan un efecto sinérgico, como se introdujo anteriormente y se discutirá con más detalles a continuación. Se observa que, en contraste con el efecto sinérgico de los métodos y composiciones de acuerdo con la presente descripción, cuando dos compuestos provocan la misma respuesta manifiesta, independientemente del mecanismo de acción y el efecto combinado es la suma algebraica de sus efectos individuales, se dice que los compuestos presentan una suma (Levine et al., 1996). Sin embargo, en la sinergia, el efecto conjunto de dos compuestos es mayor que la suma algebraica de sus efectos individuales.
La técnica de Levine et al. (1996) se ha utilizado para evaluar los efectos biológicos de combinaciones de compuestos. Como se muestra en la Figura 1 (identificada como "Técnica anterior" y tomada de Basic Principles of Pharmacology, Universidad de Tulane), gráfico superior, los efectos de la combinación de compuestos ilustran que cuando dos compuestos con mecanismos similares se administran juntos, normalmente producen efectos aditivos. Esto también se conoce como suma. Sin embargo, si el efecto de dos compuestos excede la suma de sus efectos individuales, este es un efecto inesperado denominado sinergia.
Por analogía, se produce una respuesta sinérgica con respecto a medias dosis, como se ilustra en el gráfico inferior de la Figura 1, si la combinación de la mitad de la dosis del compuesto A y B produce una respuesta mayor que A o B solos.
Los expertos en la técnica de las formulaciones antimicrobianas para matrices alimentarias, tales como la carne, saben que la sinergia antimicrobiana en la carne no es predecible. No se pudo describir una sola sinergia para diferentes combinaciones entre tres extractos botánicos naturales. Gutiérrez, J., Barry-Ryan, C. y Bourke, P. (2008). "The antimicrobial efficacy of plant essential oil combinations and interactions with food ingredients”. International Journal of food microbiology,, 124 (1), 91-97). Los efectos sinérgicos de combinaciones rara vez se han descrito para combinaciones entre extractos sintéticos y naturales (véase, p. ej., el documento WO 2013/169231).
Una ventaja de algunas composiciones y métodos, de acuerdo con esta descripción, se logra mediante un procedimiento que elimina los compuestos volátiles por desodorización. El procedimiento de desodorización elimina compuestos volátiles que incluyen borneol, alcanfor, 1,8-cineol, alfa pineno, canfeno, verbenona y acetato de bornilo.
Una ventaja adicional, de acuerdo con algunos aspectos de los presentes métodos, sistemas y composiciones de esta descripción, se logra mediante una combinación de hesperidina con extracto de Lamiaceae. Además, a diferencia del procedimiento descrito en la patente de EE.UU. N° 4,380,506, los métodos, de acuerdo con esta descripción, no requieren el procedimiento de reparto y los métodos evitan el uso de gastos de procesamiento adicionales.
Una ventaja adicional de acuerdo con un aspecto del presente método y sistema es una composición que reduce la concentración de compuestos volátiles a un nivel bajo para no afectar al sabor de un producto alimenticio al que se aplica una composición, tal como carne, no afectando, por lo tanto, al sabor de la carne.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 está adaptada de "Basic Principles of Pharmacology", (Universidad de Tulane), en la que la parte superior es "Suma: los compuestos A y B producen efectos iguales, y sus efectos son aditivos cuando se combinan" y la parte inferior es "Sinergia: La combinación de la mitad de la dosis del compuesto A y el compuesto B produce una respuesta mayor que A o B solos ".
La figura 2 es un gráfico que muestra el crecimiento de Listeria monocytogenes en carne de acuerdo con la presente invención.
La Figura 3 es un gráfico que muestra los efectos sinérgicos antilisterianos de combinaciones de hesperidina y extracto de romero de acuerdo con la presente invención.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la superficie de respuesta antimicrobiana de diferentes combinaciones de extracto de romero y hesperidina que inhiben y disminuyen el crecimiento de Listeria monocytogenes, de acuerdo con la presente invención.
La figura 5 es un diagrama de barras que muestra los valores de color rojo de la carne de acuerdo con la presente invención con respecto a combinaciones de extracto de romero y hesperidina de acuerdo con la presente invención. La figura 6 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento de Listeria monocytogenes por extractos de plantas en carne de vacuno picada.
La figura 7 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento de Listeria monocytogenes por extractos de plantas en carne de vacuno picada a 8°C el día 9.
La Figura de referencia 8 es un gráfico que muestra Listeria monocytogenes en salchichas de ave de corral.
La figura 9 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento de Listeria en salchichas de ave de corral por una combinación de extractos de R/P de acuerdo con la presente invención.
La figura 10 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento de Listeria en salchichas de ave de corral por la combinación de extractos de R/H.
La figura 11 es un gráfico que muestra Listeria monocytogenes en salchicha de cerdo (control).
La Figura de referencia 12 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento de Listeria en salchichas de cerdo por una combinación de extractos de R/P.
La figura 13 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento de Listeria en salchicha de cerdo por una combinación de extractos de R/H.
La figura 14 es un gráfico que muestra el crecimiento de Listeria monocytogenes en salmón ahumado (control). La Figura de referencia 15 es un gráfico que muestra la inhibición de Listeria monocytogenes en salmón ahumado el día 30 de crecimiento.
La figura 16 es un gráfico que muestra la inhibición de Listeria monocytogenes en salmón ahumado el día 30 de crecimiento.
Descripción detallada de la invención
Las composiciones de acuerdo con esta descripción comprenden un extracto de Lamiaceae desodorizado que comprende diterpenos fenólicos y un extracto de hesperidina puro, en donde el extracto de hesperidina puro contiene de 80% a 99% de hesperidina y se han eliminado la mayoría de los componentes del aceite volátiles del extracto de Lamiaceae y métodos para utilizar las composiciones para prolongar la vida útil de alimentos que incluyen carne, pescado y aves de corral (tanto frescos/sin procesar como procesados) sin afectar al sabor.
También se describen en el presente documento a título informativo (ya que son comparativas) las composiciones que comprenden extracto de Lamiaceae y extracto de Púnica y métodos para usar estas composiciones para prolongar la vida útil de alimentos que incluyen carne, pescado y aves de corral (tanto frescos/sin procesar como procesados) sin afectar al sabor.
Los presentes métodos y composiciones se basan en el descubrimiento de que los extractos de romero ricos en diterpenos fenólicos, en combinación con hesperidina, conservan el color rojo de la carne durante un período comercialmente significativo. Los autores de la presente invención descubrieron que el tratamiento de la carne con hesperidina pura, que es un flavonoide, extraída de cáscaras de cítricos y luego purificada, previene el crecimiento de Listeria monocytogenes en la carne. Los extractos de Lamiaceae que comprenden diterpenos fenólicos en combinación con hesperidina proporcionaron de manera sinérgica soluciones novedosas para suprimir el crecimiento de microorganismos durante un período comercialmente deseable y para conservar el color rojo de la carne sin afectar al sabor de la carne. Se ha encontrado que las composiciones de la invención inhiben el crecimiento de microorganismos Gram positivos. Se ha encontrado que las composiciones de la invención inhiben el crecimiento de Listeria. Se ha encontrado que las composiciones de la invención inhiben el crecimiento de Listeria monocytogenes.
Combinaciones que comprenden: extractos de plantas normalizados en diterpenos fenólicos, ácido carnósico y carnosol, y hesperidina, que se habrían utilizado para prevenir de manera sinérgica el crecimiento de Listeria monocytogenes en alimentos que incluyen carne, pescado y aves de corral (tanto frescos/sin procesar como procesados), sin afectar al sabor de los alimentos y que mejoran de manera sinérgica la conservación del color de los alimentos (p. ej., el color de la carne), no se podrían obtener de la técnica anterior.
Nada en la técnica anterior sobre el uso antimicrobiano de la combinación de romero u otros extractos de Lamiaceae que comprenden diterpenos fenólicos con hesperidina anticipa o hace obvios los presentes métodos y composiciones. La técnica anterior se centra en el uso de aceites esenciales de hierbas o en el uso de ácidos orgánicos, tales como el ácido cítrico. Los extractos de romero usados en la presente descripción se procesan de una manera que los hace esencialmente exentos del aceite esencial natural y ricos en diterpenos fenólicos.
La técnica anterior no anticipa ni hace evidente la combinación sinérgica de extractos de Lamiaceae ricos en diterpenos fenólicos y hesperidina. La técnica anterior no anticipa ni hace evidente el efecto antimicrobiano sorprendentemente beneficioso de la combinación de extractos de Lamiaceae que comprenden diterpenos fenólicos con con hesperidina, sobre organismos Gram positivos: Listeria monocytogenes. La técnica anterior no anticipa ni hace evidente el efecto de conservación del color sorprendentemente beneficioso de la combinación de extractos de Lamiaceae que comprenden diterpenos fenólicos con hesperidina.
La técnica anterior no anticipa ni hace evidente la ausencia del impacto en el sabor de los alimentos de la combinación de extractos de Lamiaceae que comprenden diterpenos fenólicos con hesperidina.
Otros flavonoides que tienen el mismo efecto incluyen, pero no se limitan a: narigina, isocurametina, neohesperidina, hesperidina, poncirina, nobiletina y tangeretina.
Definiciones
La siguiente es una lista de definiciones utilizadas a lo largo de esta descripción:
"Cantidad eficaz" es la cantidad necesaria con el fin de lograr un efecto específico, de acuerdo con lo que un experto en la técnica podría determinar fácilmente mediante experimentación rutinaria. Por ejemplo, con respecto a la presente descripción, una cantidad eficaz de una composición que comprende hesperidina y un extracto de Lamiaceae para aplicar a un producto alimenticio o alimento, p. ej. carne, pescado y aves de corral (tanto frescos/sin procesar como procesados), para extender la longevidad de los alimentos, p. ej. del color rojo a la carne fresca, pescado y aves de corral, es una cantidad que se determina para proporcionar longevidad al color rojo en función de parámetros conocidos que incluyen, pero no se limitan a la concentración de hesperidina y un extracto de Lamiaceae, el volumen y/o el área superficial de la carne, pescado y aves de corral, y las condiciones ambientales atmosféricas de la carne, pescado y aves de corral. Del mismo modo, las cantidades eficaces de romero/Púnica para (comparativamente y para información) extender la longevidad del color rojo a la carne, pescado y aves de corral se determinan de manera similar.
"Alimento", "producto alimenticio" y "comestible" se refieren a productos que comen las personas o los animales. Los alimentos, productos alimenticios y comestibles incluyen, pero no se limitan a carne, pescado y aves de corral frescos y/o sin procesar y carne, pescado y aves de corral procesados.
"Carne, pescado y aves de corral frescos" significa carne, pescado y aves de corral, canales enteras, partes cortadas de los mismos y partes trituradas de los mismos. La carne, pescado y aves de corral frescos incluyen tanto carne, pescado y aves de corral sin procesar como carne, pescado y aves de corral que incluyen aditivos tales como polifosfatos, sal, agua, sabores, caldos, proteínas añadidas, azúcar, almidones y similares que se incorporan a la carne, pescado o aves de corral. Es importante distinguir la carne, pescado o aves de corral frescos que pueden contener estos ingredientes, de la carne, pescado y aves de corral "procesados", que incluyen carne, pescado y aves de corral curados, que pueden contener los mismos ingredientes, pero también contienen uno o más de los siguientes: eritorbatos, ácido eritórbico, ascorbatos, ácido ascórbico, nitritos, nitratos o cultivos. La carne, pescado y aves de corral frescos deben distinguirse de, y como opuesto a, y no incluyen la carne, pescado o aves de corral curados, conocidos como carne, pescado y aves de corral procesados.
"Hesperidina" significa un compuesto extraído de la naturaleza o sintetizado.
"Extracto de Lamiaceae" significa extracto de una planta de la familia Lamiaceae, preferiblemente romero, salvia, orégano, tomillo, mentas y los siguientes géneros: Salvia, Rosmarinus, Lepechinia, Oreganum, Thymus, Hyssopus y mezclas de los mismos. El más preferido es el romero.
"Carne, pescado y aves de corral" significa tanto a) carne, pescado y aves de corral procesados como b) carne, pescado y aves de corral sin procesar.
"Diterpenos fenólicos" significa ácido carnósico, carnosol, carnosato de metilo y otros derivados fenólicos del diterpeno (rosmanol, isorosmanol, 11,12-di-O-metilisorosmanol, ácido 12-O-metilcarnósico, éter de rosmanol-9-etílico, circimaritina, producto monooxidado metilado del ácido carnósico, genkwanina, epirosmanol, epiisorosmanol, derivado del ácido carnósico, éter etílico de epirosmanol, criptotansinona) y mezclas de los mismos.
"Procesados" tales como "productos alimenticios procesados" y "carne, pescado y aves de corral procesados" son productos que resultan del procesamiento de alimentos, tales como carne, pescado o aves de corral, o del procesamiento posterior de dichos productos procesados, de modo que la superficie cortada muestre que el producto ya no tiene las características de carne, pescado o aves de corral frescos. Procesamiento significa cualquier acción que altere sustancialmente el producto inicial, incluyendo el calentamiento, ahumado, curado, maduración, secado, marinado, extracción, extrusión o una combinación de esos procesos. Los procesos incluyen procesos sin tratamiento térmico y con tratamiento térmico.
"Extracto de Púnica" significa extracto de una planta del género Púnica, preferiblemente Púnica granatum y Púnica protoPunica, y mezclas de los mismos. El más preferido es Púnica granatum. Estos no forman parte de la invención.
"Extracto de hesperidina puro" significa un extracto de hesperidina que tiene una concentración de al menos 80% de hesperidina.
"Sin procesar" (tal como carne, pescado y aves de corral) significa que no se ha sometido a ningún tratamiento que de como resultado un cambio sustancial en el estado original de los productos alimenticios (p. ej., carne, pescado y aves de corral). Sin embargo, los productos alimenticios se pueden haber, por ejemplo, dividido, partido, separado, deshuesado, picado, despellejado, pelado, mondado, triturado, cortado, limpiado, recortado, ultracongelado, congelado refrigerado, molido o descascarillado, envasado o desempaquetado. Los productos alimenticios sin procesar, que incluyen carne, pescado y aves de corral, incluyen carne, pescado y aves de corral crudos sin tratar, así como carne, pescado y aves de corral frescos que se han desmenuzado o picado, a los que se les han añadido condimentos o aditivos alimentarios o que han sufrido un procesamiento insuficiente para modificar la fibra muscular interna de la carne, pescado o aves de corral y por lo tanto eliminar las características de la carne fresca, pescado o aves de corral.
En el desarrollo del presente método y composición, se descubrió que la hesperidina tiene un efecto antilisteriano en la carne cuando se prepara dentro de ciertos intervalos de concentraciones.
En el desarrollo del presente método y composición, se descubrió que el extracto de romero que comprende diterpenos fenólicos combinado con hesperidina o con extracto de Púnica tiene un efecto superior en la supresión del crecimiento de Listeria monocytogenes en la carne que cuando los extractos se aplican solos.
En el desarrollo del presente método y composición, se descubrió que ciertas mezclas de extractos de romero combinados con hesperidina o con extracto de Púnica (comparativo) que comprende punicalaginas y ácido elágico, proporcionan un efecto sinérgico antilisteriano cuando se preparan dentro de ciertos intervalos de relaciones de concentración.
En el desarrollo del presente método y composición, se descubrió que el extracto de romero que comprende diterpenos fenólicos combinado con hesperidina o con extracto de Púnica (comparativo) tiene un efecto superior en la conservación del color rojo en la carne que cuando se aplican extractos solos.
En el desarrollo del presente método y composición, se descubrió que ciertas mezclas de extractos de romero combinados con hesperidina o con extracto de Púnica que comprende punicalaginas y ácido elágico (comparativo), proporcionan un efecto sinérgico de conservación del color rojo en la carne cuando se preparan dentro de ciertos intervalos de relaciones de concentración.
Mezclas de extractos ricos en diterpenos fenólicos y hesperidina o extracto de Púnica comparativo
Los diterpenos fenólicos, tales como el ácido carnósico o el carnosol, se encuentran específicamente en las Lamiaceae. Hasta la fecha, el ácido carnósico se ha identificado solo en unas pocas especies, todas exclusivas de las Lamiaceae. Según el conocimiento de los autores de la invención, solo siete de los setenta (70) géneros de la tribu Mentheae contienen ácido carnósico: Salvia (Brieskorn y Dumling, 1969), Rosmarinus (Luis y Johnson, 2005), Lepechinia (Bruno et al., 1991), Oreganum (Hossain et al., 2010) y Thymus (Achour et al., 2012). Puede estar presente en Hyssopus donde se identificó uno de sus posibles derivados, rosmanol-9-etil éter (7) (Djarmati et al., 1991). El ácido carnósico también se encuentra como un compuesto menor en un género de la tribu Ocimeae, Ocimum (Jayasinghe et al., 2003). Brieskorn, C.H., Dumling, H.J., 1969. "Carnosolsaure, der wichtige antioxydativ wirksame Inhaltsstoff des Rosmarin-und Salbeiblattes". Zeitschrift fur Lebensmittel-Untersuchung und Forschung 141, 10-16; Luis, J.C., Johnson, C.B., 2005; Bruno, Maurizio et al. "Abietane diterpenoids from Lepechinia meyeni and Lepechinia hastata".
Phytochemistry 30.7 (1991): 2339-2343; Hossain, Mohammad B. et al. "Characterization of phenolic composition in Lamiaceae spices by LC-eS i-MS/MS.” Journal o f agricultura! and food chemistry 58.19 (2010): 10576-10581; Achour, S., Khelifi, E., Attia, Y., Ferjani, E., Noureddine Hellah A., 2012. "Concentration of Antioxidant Polyphenols from Thymus capitatus extracts by Membrane Process Technology". Journal o f food science 77, C703-C709; Djarmati, Z., Jankov, R.M., Schwirtlich, E., Djulinac, B., Djordejevic, A., 1991. "High antioxidant activity of extracts obtained from sage by supercritical CO2 extracton". Journal o f the American O il Chemists Society 68, 731 -734; Jayasinghe, C., Gotoh, N., Aoki, T., Wada, S., 2003. "Phenolic composition and antioxidant activity of sweet basil (Ocimum basilicum L.)". Journal of agricultural and food chemistry 51, 4442-4449. "Seasonal variations of rosmarinic and carnosic acids in rosemary extracts. Analysis of their in vitro antiradical activity". Spanish Journal o f Agricultural Research 3, 106-112.
Aquí estos diterpenos fenólicos se extrajeron del romero con el objetivo de extraer y concentrar esencialmente diterpenos fenólicos: 44-85%. A continuación, el extracto obtenido se desodorizó para eliminar los aceites esenciales y compuestos volátiles que afectan al sabor de los alimentos.
Extracto de romero
Las hojas de romero (Rosmarinus officinalis) se pueden extraer con varios disolventes y producen extractos que son ricos en diferentes compuestos. Por ejemplo, los extractos acuosos son bastante ricos en ácido rosmarínico, mientras que las extracciones que utilizan disolventes orgánicos dan lugar a extractos ricos en diterpenos fenólicos como el ácido carnósico y el carnosol. El procedimiento detallado para preparar la composición del extracto de romero se describió en la patente de EE.UU. N° 5,859,293 y en el documento Wo 96/34534.
La hoja de romero se extrajo con acetona a temperatura ambiente. Una vez completada la extracción, el extracto de acetona se filtró para separar la solución de la hoja de romero y se concentró a presión reducida para preparar un extracto natural concentrado. En este momento, el extracto concentrado se puede secar directamente en un horno con vacío con calor suave para hacer un extracto en polvo, que es una composición que comprende aproximadamente 15%-30% de ácido carnósico y 1%-3% de carnosol. Alternativamente, al extracto natural concentrado, se añadió carbonato de sodio acuoso (NaHCO3) para disolver el ácido carnósico y otros ácidos orgánicos, mientras que las sustancias insolubles básicas se separaron por precipitación.
La solución se filtró para separarla del sólido y el filtrado se concentró adicionalmente a presión reducida. Una vez que se alcanza la concentración final, se añadió ácido fosfórico (H3PO4) y las sustancias insolubles en ácido (incluyendo ácido carnósico, carnosol y derivados carnósicos) se precipitaron de la solución concentrada. Se usa carbón activo durante el procedimiento para decolorar el extracto de romero en solución antes de la filtración. Mediante filtrado, el sólido precipitado se separó posteriormente del líquido y se enjuagó con agua para eliminar las impurezas.
Por último, el sólido se secó en un horno con vacío y luego se molió hasta polvo para hacer una composición que contenía aproximadamente 40-65% de ácido carnósico, 2-10% de carnosol y 2-10% de ácido 12-O-metilcarnósico. El extracto usado aquí contenía >48% de ácido carnósico carnosol. Se realizó una última etapa para desodorizar el extracto de romero. Correspondía a una posterior extracción del sólido anterior con una mezcla de acetona/hexano. El propósito de esta etapa era la eliminación de moléculas grasas y de compuestos volátiles. El filtrado se concentró a presión reducida y se formuló directamente en vehículo líquido.
Dentro de la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, este extracto normalizado en diterpenos fenólicos, ácido carnósico y carnosol, se denominará romero, o extracto de romero o romero (polvo) o romero (líquido).
Extracción de hesperidina
Frutos inmaduros secos (citrus aurantium L.) se expusieron a un vapor con el fin de eliminar las pectinas antes de la extracción con agua. Posteriormente, se añadieron hidróxido de sodio e hidróxido de calcio a la solución para estabilizar el valor de pH. Después de la etapa de filtración, se indujo una acidificación del filtrado usando HCl. Tras esta etapa, precipita la hesperidina, se retira la solución líquida y se seca el precipitado. El producto final (hesperidina pura) contiene de 90% a 99% de hesperidina, preferiblemente más de 95% de hesperidina medido por HPLC.
Los extractos obtenidos contienen esencialmente hesperidina (>80%) y se considera que son puros. A lo largo de esta descripción, este extracto normalizado en hesperidina de >95%, se denominará hesperidina o hesperidina (polvo) o hesperidina (líquido).
Preparación de productos y mezclas de extracto de romero/hesperidina y extracto de romero
Los extractos de plantas y sus combinaciones se secaron en polvos. Se utilizó maltodextrina con el fin de asegurar el proceso de secado adecuado de las combinaciones de extractos. Las maltodextrinas son excipientes o vehículos comúnmente usados para procesos de secado.
Las maltodextrinas se definen como productos de hidrólisis del almidón con un equivalente de dextrosa inferior a 20. El equivalente de dextrosa (valor DE) es una medida del poder reductor de los oligosacáridos derivados del almidón expresado como porcentaje de D-glucosa en la materia seca del hidrolizado y es el valor inverso del grado medio de polimerización (DP) de unidades de glucosa anhidra. Como productos de hidrólisis del almidón, las maltodextrinas contienen amilosa lineal y productos de degradación de amilopectina ramificada, por lo que se consideran polímeros de D-glucosa unidos por enlaces a-(1,4) y a-(1,6).
Aunque las maltodextrinas derivan de un compuesto natural (almidón), su estructura es diferente de la estructura inicial de la molécula natural de la que derivan (almidón). Esta diferencia es inducida por el proceso de hidrólisis. Por tanto, la estructura de la maltodextrina no se encuentra en la naturaleza.
Otros posibles excipientes o vehículos incluyen maltodextrina, goma arábiga, dextrosa, sal, mono y diglicéridos de ácidos grasos, MPG, polisorbato 80, aceite vegetal, mono y diglicéridos de ácidos grasos, jarabe de glucosa, glicerina, agua y alcohol.
Las composiciones se añadieron a la carne de vacuno picada cruda con 15% de grasa.
En el curso del trabajo que condujo al presente método y composición, se ensayaron mezclas de extracto de romero y de hesperidina, en una serie de proporciones de concentraciones variables, para determinar su eficacia antilisteriana utilizando los métodos microbiológicos clásicos. El recuento bacteriano en todas las muestras aquí estudiadas se realizó en el medio Aloa de acuerdo con el método normalizado (NF EN ISO 11-290). El crecimiento de Listeria monocytogenes se evaluó en carne sin ningún agente antilisteriano y sin ningún extracto vegetal (control). Los datos de crecimiento de listeria en una carne de control se representan en la Figura 2. Se observará que después de 6 días de crecimiento, Listeria crecía levemente, solo en 0.29 log UFC/ml. Después de 9 días de crecimiento, Listeria crecía 2.42 log UFC/ml. Los experimentos en carne se llevaron a cabo en envases de atmósfera modificada (MAP) que contenían más de 20% de O2, más precisamente 70% de O2 y 30% de CO2.
Después de la fabricación de la carne, se tomó una muestra de un lote de carne inmediatamente después del proceso de picado y se transportó en condiciones refrigeradas al laboratorio. En el laboratorio, se tomaron muestras de la carne en muestras de 2 kg y se acondicionaron al vacío a -20°C, 24 h antes de la experimentación, las muestras de carne de 2 kg se transfirieron a 2-4°C y se mantuvieron a esta temperatura durante 24 h ± 3 h hasta la temperatura en el centro alcanzó -1°C.
En esta etapa se inoculó Listeria monocytogenes en las muestras de carne de 2 kg en un laboratorio de bioseguridad de nivel 3 para evitar la contaminación por otros microorganismos. Cualquier complementación adicional a la carne se llevó a cabo en dicho laboratorio. T ras la homogeneización del inóculo a 4°C, las muestras de carne de 2 kg inoculadas se complementaron con extractos de plantas y se homogeneizaron. Los extractos de plantas estaban en forma de polvo y se añadieron como tal a la carne. Para mantenerlos como polvos secos, los extractos de plantas se complementaron con maltodextrina antes del proceso de secado.
Los extractos de plantas se podían añadir como líquidos lipófilos o hidrófilos, o combinaciones de los mismos, a la carne. Para ello, el extracto de planta lipófilo o hidrófilo tiene que ser solubilizado o líquido, los extractos no secos se pueden utilizar directamente sin someterse a la etapa de secado.
Inmediatamente después de la complementación con extractos de plantas y la homogeneización, se colocaron juntas en bandejas dos piezas de 100 g de carne picada así formada. Las piezas de carne de control, sin tratamiento con extracto, siguieron el mismo procedimiento.
A continuación, las bandejas se acondicionaron en atmósfera modificada de 20% o más de oxígeno, preferiblemente 70% de O2 y 30% CO2 a 4 o a 8°C. La carne envasada se almacenó en la oscuridad durante una cantidad de tiempo determinada.
Se llevaron a cabo una serie de experimentos que implicaban extractos de romero y hesperidina, extractos de romero y Púnica, compuestos antilisterianos típicos (lactato de sodio o acetato de sodio) y control sin tratar. Las mezclas o extractos solos de romero y de hesperidina se añadieron a la carne al 1.18%. Las mezclas o extractos solos de romero y de Púnica se añadieron a la carne al 0.48%. Los compuestos antilisterianos típicos, lactato de sodio y acetato de sodio, se añadieron en concentraciones clásicas de 25 g/kg y 3 g/kg, respectivamente, en experimentos separados.
Se prepararon combinaciones de extractos y se añadieron a la carne de acuerdo con las siguientes proporciones y dosis antes del ensayo:
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Inmediatamente después de la complementación y la homogeneización, se colocaron en bandejas dos piezas de 100 g de carne picada en forma de hamburguesas. Después, las bandejas se acondicionaron en una atmósfera modificada que contenía 70% O2 y 30% CO2 y se almacenaron a 8°C hasta el análisis del crecimiento de Listeria y de las características organolépticas, incluido el color rojo. Tales análisis se realizaron el 0, 6° y 9° día de almacenamiento.
El crecimiento de Listeria monocytogenes se evaluó en la carne en condiciones refrigeradas para cada extracto o compuesto y sus combinaciones. El crecimiento de Listeria monocytogenes se midió al comienzo del experimento, a 2/3 de la vida útil comercial (6 días) y en el punto de tiempo correspondiente a la duración comercial de la vida útil (9 días). Se calcularon los valores logarítmicos del crecimiento de Listeria (log UFC/ml) para cada experimento y tratamiento. Se calcularon las diferencias de los valores logarítmicos del crecimiento de Listeria (log UFC/ml) entre la carne tratada con extractos de plantas y el control sin tratar para obtener un resultado final. Cuanto más negativo era el valor obtenido, mayor era el efecto antilisteriano del extracto o de la combinación de extractos. En microbiología en la ciencia de la carne, para un tiempo determinado, los valores se consideran significativos entre dos series cuando se observa una diferencia de 0.5 Log10 UFC-g-1 (Chaillou et al., 2014); (Guide pour la validation de méthodes d'essais microbiologiques et revaluation de leur incertitude de mesure dans les domaines de la microbiologie alimentaire et de l'environnement), Schweizerische Eidgenossenschaft, Confédération suisse, Département fédéral de l'économie, de la formación et de la recherche DEFR, Documento N° 328, abril de 2013, Rev.03). En microbiología, se observará que un tratamiento tiene un efecto antibacteriano significativo si su efecto supera los -0.5 log UFC/ml en comparación con el control no tratado.
Durante el crecimiento de listeria, se vigiló el color de la carne y se tomaron imágenes inmediatamente después de la adición del extracto (el día 0) y el 6° día de crecimiento). Las imágenes se tomaron en condiciones de luz estandarizadas y usando un sistema llamado "PackShot Creator". De hecho, este equipo profesional consiste en una caja de luz optimizada que contiene cuatro tubos fluorescentes que difunden luz homogénea, lo que da como resultado imágenes tomadas siempre en las mismas condiciones, con reflexión mínima.
Cada imagen que representa la "muestra" en una escala de tiempo diferente se cargó en el programa de análisis de imágenes de código abierto ImageJ. El software se usa comúnmente en la industria alimentaria para medir diferentes parámetros alimentarios, como el color o la densidad (Reineke et al. "The Influence of Sugars on Pressure Induced Starch Gelatinization", Procedía Food Science, 1,2011,2040-3046; Kelkar et al. "Developing novel 3D measurement techniques and prediction method for food density determination, Procedia Food Science, 1, 2011,483-491). Con el fin de obtener valores representativos del color rojo, se utilizó la unidad de color rojo (R) de las tres unidades de color rojo (R) verde (G) y azul (B) del modelo RGB, y se midió el color de cada píxel de una línea que se dibujó a lo largo de la muestra. Se utilizó el complemento de gráfico de perfil RGB incorporado para determinar los diferentes valores de color de cada píxel a lo largo de esta línea, en particular los valores del color rojo. Los resultados se presentan como una variación del valor de color diferente en función del número de píxeles a lo largo de esta línea. Los resultados se analizaron estadísticamente en busca de diferencias significativas mediante la prueba ANOVA a p <0.05. Por lo tanto, por muestra, se analizaron más de 1000 píxeles.
Con el fin de evaluar el efecto de los extractos de plantas sobre el color de la carne, se comparó el color rojo de la carne tratada con un control sin tratar. El efecto se calculó mediante [color rojo en la carne con extracto] - [color rojo en la carne de control (sin extracto)]. Efecto negativo significa que la adición de extractos no conserva el color rojo de la carne. El efecto positivo significa que la adición de extractos mejora el color rojo de la carne en comparación con el control.
Mezclas de romero y hesperidina
Crecimiento de Listeria monocytogenes en carne cruda
Los resultados de dichos ensayos el 6° y 9° día se presentan en la Figura 6 y la Figura 7. Los datos son medias de 2 a 6 repeticiones. Los datos representan diferencias logarítmicas en el crecimiento de L. monocytogenes en carne tratada en comparación con controles inoculados (carne no tratada). Los datos se analizaron estadísticamente para determinar su significación a p <0.05 utilizando ANOVA. Letras diferentes indican diferencias significativas para p <0.05.
Los resultados de dichos ensayos el 6° día usando extracto de romero y/o hesperidina se exponen en la siguiente Tabla 1.
Tabla 1:
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Se observará que con dicha duración tan corta (seis (6) días de crecimiento en condiciones de frío), la diferencia en el crecimiento de Listeria en la carne tratada con extractos de plantas en comparación con la carne no tratada, expresada en log, no alcanzaba -0.5 log, lo que significa que, en tan poco tiempo de crecimiento, no se pudieron apreciar los efectos antilisterianos. Se observará que con una duración tan corta (seis (6) días de crecimiento en condiciones frías), Listeria monocytogenes creció en la carne de control solo en 0.29 log UFC/ml (Figura 2).
Se observará que cuando se combinan, el efecto medido de la combinación de extracto de romero y de hesperidina no corresponde a un efecto sinérgico en las concentraciones anteriores después de 6 días de crecimiento ya que el efecto combinatorio es inesperadamente antagonista.
Cuando las concentraciones se redujeron a la mitad, se obtuvieron los siguientes efectos esperados calculados a partir de la tabla anterior y los efectos medidos y se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2:
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Se observará que con una duración tan corta (6 días de crecimiento en condiciones frías), la diferencia en el crecimiento de Listeria en la carne tratada con extractos de plantas en comparación con la carne sin tratar, expresada en log, no alcanzó -0.5 log, lo que significa que, en tan poco tiempo de crecimiento, no se pudieron apreciar los efectos antilisterianos. Se observará que con una duración tan corta (6 días de crecimiento en condiciones frías), Listeria monocytogenes crecía en la carne de control solo en 0.29 log UFC/ml (Figura 2).
Sin embargo, se observará que, en la Tabla 2 anterior, la hesperidina aplicada en media dosis sola tiene sorprendentemente un efecto antilisteriano mayor que con la dosis completa. El efecto no esperado está indicado por un asterisco. Por otro lado, los efectos de media dosis de romero y de la combinación de media dosis de romero y la dosis completa de hesperidina fueron antagónicos a lo que se esperaba. Finalmente, los efectos de la combinación de media dosis de romero y media dosis de hesperidina y de la combinación de dosis completa de romero y media dosis de hesperidina permanecieron dentro del intervalo de suma, como se esperaba.
Los resultados de dichos ensayos el 9° día usando extracto de romero y/o hesperidina se exponen en la siguiente Tabla 3.
Tabla 3:
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Se observará que después de nueve (9) días de crecimiento en condiciones frías, la diferencia en el crecimiento de Listeria expresada en log UFC/ml excedía -0.5 log UFC/ml, lo que significa que los efectos antilisterianos de todos los extractos y sus concentraciones y combinaciones presentados en la tabla anterior podrían apreciarse dentro del período comercialmente deseable.
Tabla 4:
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Después de nueve (9) días de crecimiento en la carne, los extractos solos o sus combinaciones en todas las concentraciones ensayadas inhibieron el crecimiento de Listeria monocytogenes en más de 0.5 log, lo que significa que tenían un efecto antilisteriano en la carne.
Inesperadamente en vista de la técnica anterior y en vista de los datos in vitro, la hesperidina tenía un efecto antilisteriano en todas las concentraciones ensayadas. Además, inesperadamente, el extracto de romero o la hesperidina solos tenían un mayor efecto antilisteriano cuando se usaban a la mitad de las concentraciones en comparación con las concentraciones completas. Aún más, inesperadamente, el extracto de romero combinado con hesperidina en medias concentraciones tenía un efecto antilisteriano mayor que cada extracto solo a la concentración completa. Esta es sinergia (Figura 3).
Se analizaron diferentes concentraciones y sus superficies de respuesta utilizando un diseño experimental factorial de metodologías de superficies de respuesta de que se diseñó en tres niveles. Estos resultados se muestran en la Figura 4. Indican los siguientes intervalos de concentración que proporcionan una respuesta antilisteriana en la carne que se determina como: [(log (UFC/ml) en carne tratada con extractos de plantas) - (log (UFC/ml) carne de control (sin tratamiento))] <0.5 como se proporciona en la Tabla 5.
Tabla 5:
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Se observará que para asegurar el efecto antilisteriano, se puede añadir cualquiera de las concentraciones de extractos anteriores (Tabla 5) en combinación o sola a la carne. El porcentaje total de extracto añadido, solo o en combinación, a la carne no superó el 1.18%.
Durante el crecimiento de listeria, se controló el color de la carne y se tomaron imágenes inmediatamente después de la adición del extracto (el día 0) y el 6° día de crecimiento).
Cada imagen que representa la "muestra" en una escala de tiempo diferente se cargó en el programa de análisis de imágenes de código abierto ImageJ. El software se utiliza habitualmente en la industria alimentaria para medir diferentes parámetros alimentarios tales como el color o la densidad (Reineke et al. 2011; Kelkar et al. 2011. Con el fin de obtener valores representativos de las tres unidades de color rojo (R), verde (G) y azul (B) de los modelos RGB, se trazó una línea a lo largo de la muestra. Se usó el complemento de gráfico de perfil RGB incorporado para determinar los diferentes valores de color de cada píxel a lo largo de esta línea. Los resultados se presentan como variación de los diferentes valores del color en función del número de píxeles a lo largo de esta línea. Los resultados se analizaron estadísticamente para detectar diferencias significativas usando la prueba ANOVA para p <0.05. Por muestra, se analizaron más de 1000 píxeles.
Color rojo de la carne cruda
El color de la carne fue valorado por un panel de análisis sensorial. Este panel distinguía el color de la carne entre tonos rojo brillante, rojo, marrón y verde. Todas las muestras de carne eran de color rojo brillante el día 0 de los experimentos.
El 6° día, la valoración general del panel describió el color de diferentes muestras de carne sometidas a diferentes tratamientos de carne de la siguiente manera:
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Durante el crecimiento de listeria, se controló el color de la carne complementada o no con extractos de plantas y se tomaron imágenes inmediatamente después de la adición del extracto (el día 0) y el 6° día de crecimiento).
Los resultados de dicho control el 6° día usando extracto de romero y hesperidina solos o en combinación se exponen en la siguiente Tabla 6:
Tabla 6:
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El extracto de romero y la hesperidina de concentración completa tienen efectos sobre el color rojo de la carne después de 6 días de crecimiento en la carne. El efecto se calculó utilizando: [color rojo de la carne con extracto] - [color rojo de la carne de control (sin extracto)]
Contrariamente a los informes de la técnica anterior, inesperadamente, el extracto de romero conservaba mejor el color rojo de la carne en comparación con el control. La hesperidina tenía un efecto ligeramente menor pero similar.
El efecto de la combinación permanece dentro del intervalo adicional y, por lo tanto, no se encontró que fuera sinérgico en estas concentraciones.
La combinación de extractos en comparación con el control mejora significativamente la conservación del color rojo más que cada extracto solo.
Tabla 7:
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La Figura 5 muestra que cuando la concentración de hesperidina añadida a la carne se reduce a la mitad, disminuye significativamente la conservación del color rojo de la carne en comparación con el control.
La adición de romero mejoraba significativamente la conservación del color de la carne en comparación con la carne de control sin tratar. Inesperadamente, la reducción a la mitad de la concentración de romero provocó un efecto mayor en la conservación del color rojo de la carne que la concentración completa de romero. Además, inesperadamente, la reducción a la mitad de la concentración de hesperidina no produjo un efecto de conservación del color rojo como se esperaba, sino que, a esta concentración, la hesperidina deterioraba la conservación del color rojo en comparación con el control. Además, inesperadamente, el efecto sobre la conservación del color rojo de la carne de la combinación de concentración completa de romero y media concentración de hesperidina superó los efectos de suma esperados del romero en concentración completa o de la hesperidina en concentración reducida a la mitad. Esto es sinergia.
Además, inesperadamente, el efecto sobre la conservación del color rojo de la carne de la combinación de media concentración de romero y media concentración de hesperidina, superó los efectos de suma esperados de media concentración de romero o concentración de hesperidina reducida a la mitad solos. Esto es sinergia.
En cuanto al extracto de romero a la mitad de la concentración y la hesperidina a la concentración completa, su efecto de combinación permaneció dentro del intervalo de suma y, por lo tanto, no se encontró que fuera sinérgico.
La Figura 5 muestra que todas las combinaciones entre romero y hesperidina en cualquier concentración presentada aquí mejoraron significativamente la conservación del color rojo de la carne en comparación con el control y en comparación con compuestos antilisterianos típicos tales como el acetato de sodio y el lactato de sodio.
Experimentos in vitro que incluyen ejemplos de referencia utilizando Punica:
Actividades antimicrobianas de extractos de romero, Punica y hesperidina solos y en combinación: se prepararon extractos de plantas de romero, hesperidina, Punica y sus combinaciones romero/hesperidina, romero/Punica al 10% en DMSO50% final de acuerdo con el siguiente protocolo en el que se prepararon combinaciones de extractos, se completaron hasta 100% con maltodextrina y se añadieron a las soluciones de ensayo de acuerdo con las siguientes proporciones y dosis antes del ensayo.
Tabla 8:
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Tabla 9:
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Preparación de la solución de trabajo/ensayo
Se mezclaron 200 mg del extracto (combinación) con 1 ml de DMSO al 100%, se agitaron con vórtice, se sometieron a ultrasonidos durante 10 min a una potencia de 100%, 45 kHz, modo normal, se agitaron bien con vórtice, se volvieron a someter a ultrasonidos y se diluyeron 1:2 en agua estéril a una concentración final de 100 mg/ml en DMSO50% final.
Estas preparaciones con 100 mg/ml se prepararon en un tubo Eppendorf estéril de 5 ml. Se tomó una muestra antes de preparar placas de Concentración bactericida mínima (MBC). MBC, concentración fungicida mínima (MFC) y concentración inhibitoria mínima (MIC).
Principio
La concentración bactericida mínima (MBC) es la concentración de muestra más baja requerida para matar al menos 99.99% del inóculo (-4log 10). La concentración bactericida mínima (MBC) es la concentración más baja de un agente antibacteriano necesaria para matar una bacteria particular. Se puede determinar a partir de ensayos de concentración inhibitoria mínima (MIC) por dilución en caldo mediante subcultivo en placas de agar que no contienen el agente de ensayo. La MBC se identifica determinando la concentración más baja de agente antibacteriano que reduce la viabilidad del inóculo bacteriano inicial en >99.9%. La MBC es complementaria a la MIC; mientras que el ensayo de MIC demuestra el nivel más bajo de agente antimicrobiano que inhibe el crecimiento, la MBC demuestra el nivel más bajo de agente antimicrobiano que da como resultado la muerte microbiana. Esto significa que incluso si una MIC en particular muestra inhibición, sembrar en placas las bacterias en agar podría dar como resultado la proliferación de organismos porque el antimicrobiano no causara la muerte. Los agentes antibacterianos generalmente se consideran bactericidas si la MBC no es más de cuatro veces la MIC. Este ensayo se basaba en el recuento de microorganismos en pocillos que mostraban poco o ningún crecimiento visualmente y luego se sembraban en placa. Muestras preparadas en DMSO50% final al 10% se ensayaron en concentraciones de 2.5, 0.5 y 0.1%, frente a un control de DMSO equivalente (respectivamente 12.5, 2.5 y 0.5%).
En el caso de la levadura, las concentraciones fungicidas mínimas (CMF) se realizaron como WCD. En el caso de la cepa A. brasiliensis, un hongo, la mera presencia de crecimiento se interpretó como ausencia de actividad fungicida. La concentración inhibitoria mínima (MIC) es la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo después de un período de incubación adaptado. Las concentraciones inhibitorias mínimas se utilizan típicamente para determinar la potencia de nuevos agentes antimicrobianos, tales como extractos de plantas o sus combinaciones. La concentración inhibitoria mínima o MIC es la concentración más baja que es suficiente para inhibir el crecimiento microbiano mediante extractos ensayados aquí. Este ensayo se basa en la observación visual de los pocillos que contienen la cepa microbiana que se estudia con o sin (control) extractos ensayados. La duración y las condiciones de crecimiento microbiano se llevaron a cabo de acuerdo con métodos clásicos bien conocidos por un experto en la técnica.
Los ensayos se realizaron en las siguientes cepas bacterianas E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella entérica ser typhimurium, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Streptococcus mutans, Clostridium perfringens, Enterococcus hirae, Enterobacter cloacae, Moraxella bovis y dos levaduras Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans y moho Aspergillus brasiliensis. La evaluación de la actividad bactericida y fungicida se llevó a cabo según el procedimiento interno en medios ricos en nutrientes, con un inóculo calibrado de 105-106 UFC/ml para bacterias y levaduras y 105 esporas/ml para A. brasiliensis.
Antes de la evaluación antimicrobiana de los extractos, se verificó la esterilidad de los extractos mediante cultivo en placa. La ausencia de cualquier crecimiento microbiano era obligatoria. Los cultivos microbianos se llevaron a cabo de forma clásica como se resume en la Tabla 10.
Tabla 10. Condiciones de crecimiento y colecciones de microorganismos
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Resultados
Tabla 11: Las concentraciones de MBC y MFC (0.1; 0.5 o 2.5%) de romero (R), Púnica (P), romero/Púnica (R/P) y romero/hesperidina (R/H) como efectivos contra los microorganismos aquí presentados.
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Tabla 12: Efectos inesperados/sinérgicos de MBC y MFC de R y P (% en la solución de ensayo)
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Inesperadamente, el efecto anti-salmonella de la combinación comparativa de romero y extractos de Púnica, superaban sus efectos esperados de suma cuando los extractos se aplicaban solos. De hecho, se hubiera esperado que para lograr el mismo efecto anti-salmonella y disminuir el crecimiento microbiano en 4 log, la MBC se habría reducido como mucho a la mitad cuando los extractos se combinaban en comparación con la MBC cuando los extractos se aplicaban solos. Sorprendentemente, aquí, la MBC se redujo entre 2.5 y 5 veces. Esto es sinergia.
Obsérvese que la hesperidina en combinación con el romero no tenía ningún efecto bactericida in vitro en Listeria monocytogenes incluso a las concentraciones más altas aquí ensayadas: 2.5%.
Sin embargo, sorprendentemente, dicha combinación de extractos inhibió de manera significativa y eficiente el crecimiento de Listeria monocytogenes en productos cárnicos de manera sinérgica.
Se podrían hacer observaciones similares al comparar los efectos de la hesperidina in vitro, como se describe en el estado de la técnica contra el crecimiento de Listeria monocytogenes, y en carne (este estudio). De hecho, aunque la hesperidina in vitro no tenía efectos antilisterianos, inhibía el crecimiento de Listeria en la carne de vacuno.
Uso de extractos de romero/Púnica (comparativo) y de romero/hesperidina en matrices de carne/aves de corral/pescado
Métodos de procesamiento, incorporación de extractos, contaminación por Listeria e inhibición del crecimiento
Las salchichas de cerdo y las aves de corral frescos se produjeron de acuerdo con recetas convencionales utilizadas por la industria. En lo que se refiere a pescados y mariscos, aquí ilustrados por el salmón ahumado, su procesamiento también se hizo según los procedimientos industriales.
Lotes de carne/aves de corral/pescado
Siempre que fue posible, para superar la variabilidad de las materias primas en términos de pH y flora endógena (tasa y naturaleza de la flora constituyente) para cada carne/categoría, el procesamiento se llevó a cabo en 3 lotes de materias primas provenientes de diferentes granjas (salmón)/proveedores de carne/aves de corral/pescado. Los extractos de plantas o sus combinaciones se incorporaron al comienzo de cada receta, junto con los ingredientes básicos del procesamiento. Los extractos de plantas o sus combinaciones se incorporaron en matrices de alimentos en 1-3 concentraciones diferentes, como se explica en las Tablas 14, 15, 17, 18, 20 y 21 a continuación.
En lo que respecta a cada categoría de productos, se ensayaron controles, es decir, productos que no comprenden extractos de plantas.
Naturaleza y origen de las cepas de Listeria monocytogenes/condiciones de preparación bacteriana
Se estudiaron dos cepas de Listeria monocytogenes en mezcla (50/50) de acuerdo con el Procedimiento operativo estándar NF V01 -009 y en relación con cualquier producto de carne/aves de corral/pescado. En cuanto a los ensayos en productos cárnicos: se usaron la cepa de referencia CIP 7838 (serovar 4b) y una denominada cepa de campo aislada de cerdo (colección ADIV) serotipo 1/2a, la que predomina en más de 50% en la carne de cerdo fresca.
En lo que respecta a la carne de aves de corral, la cepa de referencia 7838 se acopló a una cepa de Listeria monocytogenes aislada de la canal de aves de corral (colección ADIV; serotipo 1 /2b). En cuanto a los ensayos en salmón: la cepa de referencia CIP 7838 se mezcló con una cepa aislada de salmón que fue donada a ADIV por un socio de su red. En lo que respecta a cualquier matriz alimentaria aquí estudiada, las dos cepas se prepararon e inocularon de acuerdo con las directrices de los Procedimientos operativos estándar NF V01-009 (Versión 2014).
Cepas congeladas, conservadas como criobolas (-80°C), se revivieron y cultivaron individualmente. Cada cepa se revivió trasplantando 0.1 ml en 10 ml de medio de cultivo BHI (durante 24 horas a 30°C). Dos subcultivos sucesivos han dado como resultado un precultivo de cada cepa. Posteriormente, cada cepa se volvió a cultivar durante 24 horas a 30°C. El último cultivo se utilizó en la contaminación del producto de la matriz (al final de la fase exponencial o fase estacionaria temprana). Después de dos centrifugaciones sucesivas, los sedimentos se suspendieron en 10 ml de agua de peptona tamponada (BPW), se realizaron recuentos en medio BHI y la solución bacteriana se mantuvo a 0°C durante 24 horas antes de la inoculación. Después de leer el crecimiento bacteriano, las concentraciones se ajustaron para inocular el producto de la matriz alimentaria con la mezcla de las dos cepas (50/50) con 2-3 log ufc/g.
Método de inoculación
Como se especifica en NF V01-009, el modo de inoculación de los productos debe coincidir con la realidad de la contaminación industrial. Por lo tanto, las salchichas (cerdo o aves de corral) se infectaron por inoculación en la masa de la mezcla de carne para simular contaminación de la carne. Como la contaminación del salmón ahumado ocurre durante la manipulación de materias primas o al cortar/envasar, aquí se aplicó la contaminación de la superficie de las rodajas de salmón.
El método de inoculación en la superficie de los productos ha sido desarrollado por ADIV y proporciona un peso exacto del inóculo, calculado de manera que se obtenga la concentración deseada en la superficie de los productos.
Independientemente del método de inoculación (molido o superficial), con el fin de mantener la adecuada actividad de agua de los productos alimenticios, se calculó el volumen acuoso que se debe añadir a la matriz alimentaria de manera que no supere una relación peso/volumen de 1/100 (NF V01-009).
Elaboración de productos de carne/aves de corral/pescado e incorporación de extractos
Salchichas de cerdo
Las salchichas de cerdo se elaboraron según un procedimiento convencional, de conformidad con el código de prácticas, a partir de magro de cerdo (86%) y grasa de cerdo (14%). La mezcla de carne inicial destinada a la elaboración de salchichas se obtuvo moliendo/picando la grasa y las partes magras de la carne de cerdo a baja temperatura a través de una rejilla (rejilla de 6 mm). Luego, se añadieron extractos de plantas ensayados aquí cuando fue aplicable, de acuerdo con la Tabla 15 y la Tabla 16. Después de la homogeneización, la mezcla se embutió en tripas naturales (menús oveja, 24/26 de diámetro).
Contaminación/envasado
Para un lote dado, se preparó una mezcla de carne de 42 kg y luego se dividió en diferentes conjuntos de 5 kg cada uno para la producción de series de ensayo. Se añadieron cinco (5) kg de mezcla de carne a una mezcla preparada que no contenía ningún agente antimicrobiano ni aditivo (Mix Fraiche 230 South a 23 g/kg) y 50 g de agua/kg. Después de homogeneización, la mezcla así obtenida se dividió en partes. Una parte sin contaminación artificial por listeria se puso en bandejas (6 salchichas por bandeja) que se envasaron en condiciones MAP (70% de O2/ 30% de CO2) con un escenario de tiempo de conservación de 1/3 del tiempo de conservación a 4°C y 2/3 del tiempo de conservación a 8°C. La otra parte se contaminó artificialmente mediante Listeria monocytogenes a una tasa promedio de 3 log ufc/g (inoculación en la masa de carne molida) antes de ser envasadas y conservadas como se describe anteriormente. Las muestras de carne contaminada que no contenían extractos de plantas se denominaron control.
Seguimiento analítico durante la conservación
Se realizaron análisis microbiológicos en D0 y JDLC (D14) y se referían al recuento de Listeria monocytogenes, la flora acidificante mesófila total (FAM) y la flora láctica. En cada punto de análisis, se realizó un único lote repetido mediante el análisis de una bandeja (n = 3 para los 3 lotes).
Elaboración de salchichas de aves de corral
Las salchichas de aves de corral se produjeron de acuerdo con las mismas condiciones experimentales descritas para las salchichas de cerdo. La única diferencia está en la naturaleza de las materias primas utilizadas y la naturaleza de los compuestos que pueden haberse añadido. De hecho, en este caso, el magro se realizó utilizando partes superiores de muslos de pollo al 85% y grasa representada por la piel.
La mezcla de carne molida no incluía ningún antimicrobiano clásico, pero contenía una mezcla de la que se eliminaba cualquier ingrediente que tuviera actividad antimicrobiana o antioxidante (Mix Chipo Flight 310 a 31 g/kg). La mezcla así preparada comprendía extractos de plantas o no (controles) y seguía las mismas condiciones experimentales y análisis de listeria/bacterianos descritos para la carne de cerdo.
Preparación e inoculación de salmón ahumado
La fabricación de salmón ahumado se llevó a cabo de acuerdo con procedimientos clásicos bien conocidos y disponibles para un experto en la técnica. Como para los productos de carne, durante la misma semana se hicieron tres lotes distintos de salmón de tres orígenes distintos. Los productos se envasaron en rodajas en bandejas al vacío (aproximadamente 200 g por bandeja) en el sitio industrial antes de la inoculación y análisis de Listeria/bacterias.
A los pescados ensayados, es decir, salmón ahumado, se les incorporaron combinaciones de extractos de romero y hesperidina, y extractos de romero y Púnica de acuerdo con las proporciones y concentraciones descritas en las Tablas 20 y 21. El salmón se pesó y luego se inoculó en la superficie por pulverización, con la mezcla de las dos cepas (50/50) a una tasa promedio de 3 ± 0.5 log/g. Después de la inoculación, las placas se envasaron nuevamente al vacío y se almacenaron a 8°C durante 30 días. El crecimiento de Listeria se controló tras la inoculación (día 0) y el día 30 de crecimiento. Los controles no inoculados se mantuvieron en almacenamiento en frío para todas las matrices de carne/aves de corral/pescado ensayados aquí con fines comparativos.
El pH, la flora acidificante mesófila total y la flora láctica se midieron a lo largo de todos los experimentos en carne de vacuno, cerdo, aves de corral o pescado. La presencia de extractos botánicos ensayados aquí en estas matrices de alimentos no tuvo un impacto significativo en el pH, la flora acidificante mesófila total, la flora láctica.
Ejemplo: efectos antimicrobianos de R/P (comparativo) y R/H en salchichas de aves de corral
Se aplicó un método clásico, disponible para los expertos en la técnica y basado en el protocolo descrito para la carne de vacuno picada más arriba, a las salchichas de aves de corral procesadas.
Como se describió antes brevemente, se inoculó Listeria monocytogenes en tres lotes diferentes de carne de aves de corral fresca procesada en salchichas, que comprenden combinaciones de extractos R/P y R/H en diferentes concentraciones. Los controles no comprendían extractos de plantas. Las muestras de carne de aves de corral fresca se mantuvieron en condiciones frías y se midió el crecimiento de Listeria el día 14.
Tabla 13: Carga inicial de Listeria por lote de salchichas de aves de corral
Figure imgf000023_0003
Los extractos se prepararon de la siguiente manera: La mitad de las cantidades de R (0.5 R) y la mitad de las cantidades de H (0.5H) o la mitad de las cantidades de los extractos de P (0.5P) como se han definido anteriormente, se mezclaron entre sí y la mezcla se completó hasta 100% mediante maltodextrina. Estas mezclas en polvo se añadieron a la carne fresca de aves de corral al procesarlas en salchichas en las proporciones descritas en las Tablas 14 y 15. Las Tablas 14 y 15 también indican los contenidos finales en los extractos y compuestos de los extractos en % y en ppm, en el extracto y en la matriz de carne.
Obsérvese que 0.5% de 0.5R 0.5H correspondería a las cantidades en compuestos de los extractos denominados 0.5R 0.5H que se ensayaron en carne de vacuno picada. Además, obsérvese que 0.3% de 0.5R 0.5P correspondería a las cantidades en los compuestos de los extractos denominados 0.5R 0.5P que se ensayaron en la carne de vacuno picada. Todos los datos obtenidos se analizaron y expresaron (es decir, delta log, etc.) de acuerdo con las explicaciones comunicadas con respecto a la carne de vacuno picada.
Tabla 14:
Figure imgf000023_0001
Tabla 15:
Figure imgf000023_0002
Resultados:
L. monocytogenes ha crecido claramente en la carne de control (Fig. 8). Cuando se añadieron combinaciones de extractos a la carne, inhibieron eficientemente el crecimiento de Listeria (Figura 9 y Figura 10). Estos datos confirman los datos encontrados en la carne de vacuno picada que demostraron claramente un efecto antilisteriano sinérgico de extractos de romero y hesperidina, y de romero y Púnica (comparativo).
Ejemplo: efectos antimicrobianos de R/P (comparativo) y R/H en salchichas de cerdo
El método clásico, disponible para los expertos en la técnica y basado en el protocolo descrito para la carne de vacuno picada anterior, se aplicó a las salchichas de cerdo procesadas.
Brevemente, se inoculó Listeria monocytogenes en tres lotes diferentes de carne de cerdo fresca procesada en salchichas, que comprenden combinaciones de extractos de R/P y R/H en diferentes concentraciones. Los controles no comprendían extractos de plantas. Las muestras de carne de cerdo fresca se mantuvieron en condiciones frías (8°C) y se midió el crecimiento de Listeria el día 14.
Tabla 16: Carga inicial de Listeria por lote
Figure imgf000024_0002
Los extractos se prepararon de la siguiente manera: La mitad de las cantidades de R (0.5 R) y la mitad de las cantidades de H (0.5H) o la mitad de las cantidades de extractos de P (0.5P) como se han definido anteriormente, se mezclaron entre sí de acuerdo con la Tabla 15 y, la mezcla se completó hasta 100% mediante maltodextrina. Estas mezclas en polvo se añadieron a la carne de cerdo fresca al procesarla en salchichas en las proporciones descritas en las Tablas 17 y 18. Las Tablas 17 y 18 también indican los contenidos finales en extractos y compuestos de los extractos en % y en ppm, en el extracto y en la matriz de carne.
Obsérvese que 0.5% de 0.5R 0.5H correspondería a las cantidades en compuestos de los extractos denominados 0.5R 0.5H que se ensayaron en carne de vacuno picada. También obsérvese que 0.3% de 0.5R 0.5P correspondería a las cantidades en compuestos de los extractos denominados 0.5R 0.5P que se ensayaron en carne de vacuno picada. Todos los datos obtenidos se analizaron y expresaron (es decir, delta log, etc.) de acuerdo con las explicaciones dadas anteriormente con respecto a la carne de vacuno picada.
Tabla 17:
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Tabla 18:
Figure imgf000025_0002
Resultados:
L. monocytogenes claramente ha crecido en la carne de control (Figura 11). Cuando se añadieron combinaciones de extractos a la carne, inhibieron eficientemente el crecimiento de Listeria en todas las concentraciones ensayadas aquí (Figura 12 y Figura 13). Estos datos confirman los datos encontrados en la carne de vacuno picada que demostraron claramente un efecto antilisteriano sinérgico de extractos de romero y hesperidina, y de romero y Púnica (comparativos).
A los salmones ahumados se les aplicó el método clásico, disponible para los expertos en la técnica y basado en el protocolo descrito para la carne de vacuno picada más arriba.
Como se ha descrito antes brevemente, en tres lotes diferentes de salmón ahumado, que comprendían combinaciones de extractos de R/P y R/H en diferentes concentraciones se inoculó Listeria monocytogenes. Los controles no comprendían extractos de plantas. Las muestras de salmón ahumado se mantuvieron en condiciones frías y el crecimiento de Listeria se midió el día 14.
La carga inicial de Listeria por lote de salchichas de aves de corral era como se presenta en la Tabla 19:
Tabla 19: Carga inicial de Listeria en salmón ahumado
Figure imgf000026_0003
Tabla 20:
Figure imgf000026_0001
Tabla 21:
Figure imgf000026_0002
Obsérvese que 0.3% de 0.5R 0.5P corresponde a las mismas proporciones y dosis de combinación de extractos añadida en la carne de vacuno picada y denominado 0.5R 0.5P.
Resultados:
L. monocytogenes claramente ha crecido en salmón ahumado de control (Figura 14). Cuando se añadieron combinaciones de extractos a la carne, inhibieron eficientemente el crecimiento de Listeria (Figura 15 y Figura 16). Estos datos confirman los datos encontrados en la carne de vacuno picada que demostraron claramente un efecto antilisteriano sinérgico de extractos de romero y hesperidina, y de romero y Púnica (comparativos).
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Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende extracto de hesperidina puro y un extracto de Lamiaceae desodorizado que comprende diterpenos fenólicos, en donde el extracto de hesperidina puro contiene de 80% a 99% de hesperidina y la mayoría de los componentes volátiles del aceite se han eliminado del extracto de Lamiaceae.
2. Una composición según la reivindicación 1, en donde los diterpenos fenólicos se seleccionan de ácido carnósico y carnosol y mezclas de los mismos, y la relación en peso de extracto de hesperidina a Lamiaceae está entre 0.16 y 240.
3. Una composición según la reivindicación 1 o 2, en donde el extracto de Lamiaceae se selecciona de extracto de romero, extracto de orégano, extracto de tomillo, extracto de salvia, extracto de menta, extracto de Salvia, extracto de Rosmarinus, extracto de Lepechinia, extracto de Oreganum, extracto de Thymus, extracto de Hyssopus y mezclas de los mismos.
4. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además un vehículo seleccionado de maltodextrina, goma arábiga, dextrosa, sal, mono y diglicéridos de ácidos grasos, MPG, polisorbato 80, dextrosa, aceite vegetal, jarabe de glucosa, glicerina, monooleato de decaglicerol, ésteres de ácido graso, alcohol bencílico, alcohol etílico, propileno, glicol, polisorbatos, sorbitanos, trioleato de sorbitán, triglicéridos cápricos/caprílicos y combinaciones de los mismos, en donde opcionalmente el vehículo de maltodextrina tiene una estructura distinta de un almidón a partir del cual se origina la maltodextrina.
5. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición está en forma de un polvo seco o un líquido.
6. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición comprende uno o más saborizantes y adyuvantes.
7. Un producto alimenticio que comprende un alimento y una composición de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
8. Un producto alimenticio según la reivindicación 7, en donde el alimento se envasa en una atmósfera que comprende 20% o más de oxígeno o el alimento se envasa en un entorno atmosférico estándar.
9. Un producto alimenticio de la reivindicación 7 u 8, en donde el alimento se selecciona del grupo que consiste en carne, aves de corral y pescado, en donde opcionalmente la carne, aves de corral y pescado son carne, aves de corral y pescado frescos.
10. Un producto alimenticio según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde el extracto de Lamiaceae comprende 12 ppm o más de diterpeno fenólico de Lamiaceae seleccionado de ácido carnósico, carnosol y mezclas de los mismos, y 56 ppm o más de hesperidina.
11. Un producto alimenticio según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que contiene entre 12 y 170 ppm de diterpeno fenólico de Lamiaceae y entre 56 y 5381 ppm de hesperidina.
12. Un método para procesar un alimento que comprende:
aplicar a o incorporar en un alimento, una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende opcionalmente envasar el alimento en una atmósfera que contenga 20% o más de oxígeno.
13. Un método según la reivindicación 12, en donde el alimento se selecciona del grupo que consiste en carne, pescado o aves de corral frescos.
14. Un método según la reivindicación 12 o 13, en donde la aplicación a o incorporación en un producto alimenticio comprende aplicar la composición, en forma de un polvo seco, al alimento.
15. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde una única composición que comprende tanto el extracto de Lamiaceae como la hesperidina o se incorpora en el alimento, se aplica o se incorpora en un producto alimenticio.
16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en donde el extracto de Lamiaceae comprende un diterpeno fenólico de Lamiaceae seleccionado de ácido carnósico, carnosol y mezclas de los mismos.
17. Un método según la reivindicación 16, en donde la relación en peso de compuestos de Lamiaceae a hesperidina está entre 0.004 y 240.
18. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, en donde el método inhibe, disminuye y/o limita el crecimiento bacteriano en un producto alimenticio, opcionalmente en donde el crecimiento bacteriano inhibido, disminuido y/o limitado es la listeria.
19. El uso no terapéutico de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, como composición antimicrobiana.
20. El uso no terapéutico de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, como composición antibacteriana.
21. El uso no terapéutico según la reivindicación 20, en donde la composición es efectiva contra bacterias Gram positivas seleccionadas del grupo que consiste en Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Enterococcus hirae y Mycobacterium bovis o es efectiva contra bacterias Gram negativas seleccionadas del grupo que consiste en Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhimurium y Enterobacter cloacae.
22. El uso no terapéutico de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, como una composición antifúngica/antilevadura.
23. El uso no terapéutico según la reivindicación 22, en donde la composición es eficaz contra levaduras seleccionadas del grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans.
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