ES2820577T3 - Método para preparar células madre de pluripotencia inducida a partir de células madre mesenquimales utilizando una fracción de florotaninos - Google Patents

Método para preparar células madre de pluripotencia inducida a partir de células madre mesenquimales utilizando una fracción de florotaninos Download PDF

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Abstract

Uso de una composición de medio de cultivo que comprende de 20 a 150 μg/ml de una fracción de florotaninos que es un compuesto de bieckol representado por la siguiente fórmula química 1 o sales del mismo para desdiferenciar las células madre mesenquimales en células madre de pluripotencia inducida. **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Método para preparar células madre de pluripotencia inducida a partir de células madre mesenquimales utilizando una fracción de florotaninos
Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición de medio de cultivo de células madre de pluripotencia inducida de células madre mesenquimales que contiene una fracción de florotaninos extraída de algas pardas, y a un método para preparar células madre de pluripotencia inducida utilizando dicha composición.
Antecedentes de la técnica
Las células madre son células que se pueden diferenciar en diferentes células que configuran un tejido del organismo y que colectivamente se denominan células indiferenciadas antes de la diferenciación, que se pueden obtener de cada tejido de un embrión, un feto y un adulto. Las células madre se pueden clasificar por varios métodos. Uno de los métodos más comunes se basa en un objeto con células madre aisladas, y las células madre se pueden dividir en células madre embrionarias (células ES) aisladas del embrión y células madre adultas aisladas del adulto. Otra clasificación común sigue la capacidad de diferenciación de las células madre, y las células madre se pueden dividir en células madre pluripotentes, multipotentes y unipotentes. Las células madre pluripotentes se denominan células madre con multifunciones, que se pueden diferenciar en tres capas germinales que configuran un cuerpo vivo y, en general, las células madre embrionarias corresponden a estas.
Las células madre adultas se pueden clasificar en células madre multipotentes o unipotentes. Las células madre adultas representativas incluyen células madre mesenquimales (MSC) y células madre hematopoyéticas (HSC). Es sabido que las MSC se diferencian en condroblastos, osteoblastos, adipocitos, miocitos y neuronas, y las HSC se diferencian en células sanguíneas de la sangre, que incluyen los glóbulos rojos, los glóbulos blancos, las plaquetas y similares. Las células madre adultas se pueden obtener a partir de la médula ósea, la sangre, el cerebro, la piel, etc. que tienen menos problemas éticos, pero tienen una multipotencia limitada en comparación con las células madre embrionarias.
Por otro lado, las células madre pluripotentes se denominan células madre multifuncionales que se pueden diferenciar en tres capas germinales que configuran un cuerpo vivo para ser diferenciadas en todas las células o tejidos de órganos del cuerpo humano y, en general, las células madre embrionarias corresponden a las mismas. Las células madre embrionarias son células madre pluripotentes que tienen una potencia que se puede diferenciar en células de todos los tejidos que configuran un objeto, pero tienen serios problemas éticos porque los embriones se destruyen en el proceso de preparación de las células.
Como alternativa para resolver los problemas, se han intentado varios métodos para preparar células madre pluripotentes personalizadas similares a las células madre embrionarias mediante la desdiferenciación de células derivadas de adultos. Es sabido que las células madre embrionarias humanas se obtienen de los embriones que se pueden generar en el organismo humano y, por lo tanto, existen muchos problemas éticos, pero las células madre embrionarias tienen una excelente proliferación celular y multipotencia en comparación con las células madre adultas. Las células madre adultas se pueden obtener de la médula ósea, la sangre, el cerebro, la piel, etc. que tienen menos problemas éticos, pero tienen una multipotencia limitada en comparación con las células madre embrionarias.
Como método representativo, existen métodos, por ejemplo, una fusión con células madre embrionarias, una transferencia nuclear de células somáticas, una reprogramación por factor genético y similares. La fusión con células madre embrionarias tiene un problema en términos de estabilidad celular porque las células inducidas tienen además dos pares de genes, y la transferencia nuclear de células somáticas tiene un problema porque se requieren muchos óvulos y la eficiencia es demasiado baja. Además, la reprogramación por factores genéticos es un método que utiliza virus que contienen oncogenes para inducir la desdiferenciación mediante la inserción de genes específicos y, por lo tanto, tiene un alto riesgo de aparición de cáncer, y también, tiene un problema en cuanto al desarrollo de agentes terapéuticos celulares debido a la baja eficiencia y la dificultad en un aspecto metódico.
Para obtener satisfactoriamente una gran cantidad de células madre pluripotentes, es muy importante una composición de cultivo para el cultivo de células mononucleares derivadas de cordón umbilical aislado, y por lo tanto se requieren investigaciones para preparar una mayor cantidad de células madre pluripotentes mediante un método de inducción con alta eficiencia.
Paralelamente, en la Publicación de Patente de Corea No. 2009-0043115, se describe una composición para tratar o prevenir enfermedades atópicas utilizando Ecklonia cava de algas pardas, y en la Publicación de Patente de Corea No. 2012-0126148, se describe una composición de tinte para el cabello para teñir por oxidación.
Los presentes inventores desarrollan satisfactoriamente una composición de medio de cultivo para la desdiferenciación de células madre de pluripotencia inducida utilizando un extracto de Ecklonia cava (Publicación de Patente de Corea No. 2015-0050823). Sin embargo, todavía no se conoce qué componente del extracto de Ecklonia cava tiene un efecto de desdiferenciación de las células madre de pluripotencia inducida.
Los detalles descritos en los antecedentes son sólo para mejorar la comprensión de los antecedentes de la presente invención y, por lo tanto, pueden contener información que no forme parte de la técnica anterior que ya sea conocida en este país por los expertos en la técnica.
Divulgación
Problema técnico
Los presentes inventores hicieron esfuerzos para encontrar un método para inducir la pluripotencia de células madre con alta eficiencia con el fin de comercializar el desarrollo de agentes terapéuticos celulares con alta estabilidad y alta eficiencia de producción. Como resultado, los inventores verificaron que cuando se añadían en el medio de cultivo celular algunos compuestos extraídos y aislados de algas pardas como una sustancia natural estable, se podían preparar las células madre de pluripotencia inducida con estabilidad y alta eficiencia utilizando células madre mesenquimales, y por lo tanto, completaron la presente divulgación.
La presente divulgación se dirige a proporcionar una composición de medio de cultivo para desdiferenciar las células madre mesenquimales que contienen una fracción de florotaninos en células madre de pluripotencia inducida.
La presente divulgación se dirige también a proporcionar un método para preparar células madre de pluripotencia inducida que comprende la desdiferenciación de las células madre pluripotentes en células madre de pluripotencia inducida en un medio que contiene una fracción de florotaninos. Además, la presente divulgación se dirige también a proporcionar una composición terapéutica celular que incluye células madre de pluripotencia inducida preparadas por el método de preparación. Otros objetos y ventajas de la presente divulgación son más claros por la descripción detallada de la divulgación, las reivindicaciones y los dibujos que se describen más adelante.
Solución técnica
Un aspecto de la presente divulgación proporciona una composición de medio de cultivo que contiene una fracción de florotaninos para desdiferenciar las células madre mesenquimales en células madre de pluripotencia inducida.
Preferiblemente, la fracción de florotaninos puede ser un compuesto de bieckol representado por la siguiente fórmula química 1 o sales del mismo.
[Fórmula química 1]
Figure imgf000003_0001
Preferiblemente, la fracción de florotaninos se puede extraer y aislar a partir de un tipo de algas pardas seleccionado del grupo que consiste en Ecklonia cava, Dictyopteris prolifera Okamura, Dictyota dichotoma Lamouroux, Sargassum horneri C. Agardh, Sargassum patens C. Agardh e Ishige okamurae Yendo, o se puede sintetizar artificialmente.
Preferiblemente, la fracción de florotaninos se puede extraer y aislar de Ecklonia cava.
Preferiblemente, la fracción de florotaninos se puede incluir en un medio seleccionado del grupo que consiste en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco), MEM (medio esencial mínimo), BME (medio basal de Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, a-MEM (medio esencial mínimo alfa), G-MEM (medio esencial mínimo de Glasgow), IMDM (medio de Dulbecco modificado por Iscove), medio 5A de McCoy, medio completo AminoMaxII y medio MesenCult-XF.
Preferiblemente, la fracción de florotaninos se puede incluir en una cantidad de 10 a 500 pg/ml con respecto a la composición del medio.
Preferiblemente, la composición del medio puede incluir adicionalmente 1 a 10 % v/v de agua energética.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método para preparar células madre de pluripotencia inducida que comprende: añadir una fracción de florotaninos a un medio de cultivo celular; y desdiferenciar las células madre mesenquimales en células madre de pluripotencia inducida en el medio.
Preferiblemente, la fracción de florotaninos puede ser un compuesto de bieckol representado por la siguiente fórmula química 1 o sales del mismo.
[Fórmula química 1]
Figure imgf000004_0001
Preferiblemente, otro aspecto más de la presente divulgación proporciona una composición terapéutica celular que contiene las células madre de pluripotencia inducida preparadas por el método.
Efectos ventajosos
Las características y ventajas de la presente divulgación son las siguientes.
(i) La presente divulgación proporciona una composición de medio de cultivo para la desdiferenciación de células madre de pluripotencia inducida mediante el uso de una fracción de florotaninos extraída de algas pardas.
(ii) Además, la presente divulgación proporciona un método para preparar células madre de pluripotencia inducida utilizando la composición del medio.
(iii) Las células madre de pluripotencia inducida se pueden preparar eficazmente utilizando células madre mesenquimales mediante el uso de la composición del medio de la presente divulgación, y las células madre de pluripotencia inducida preparadas se pueden diferenciar en varias células y, por lo tanto, pueden ser útiles como un agente terapéutico celular. .
Descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra una condición para aislar una fracción de un extracto de Ecklonia cava .
La Figura 2 ilustra un resultado del espectro de masas de 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol representado por la fórmula química 1.
La Figura 3 ilustra un resultado del espectro de 1H-NMR del 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol representado por la fórmula química 1.
La Figura 4 ilustra un resultado del espectro de 13C-NMR de 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol representado por la fórmula química 1.
La Figura 5 ilustra un resultado del espectro de masas de dieckol representado por la fórmula química 2.
La Figura 6 ilustra un resultado del espectro de 1H-NMR de dieckol representado por la fórmula química 2.
La Figura 7 ilustra un resultado del espectro de 13C-NMR de dieckol representado por la fórmula química 2.
La Figura 8 ilustra un resultado del espectro de masas de florofucofuroeckol-A (PFF-A) representado por la fórmula química 3.
La Figura 9 ilustra un resultado del espectro de 1H-NMR de florofucofuroeckol-A (PFF-A) representado por la fórmula química 3.
La Figura 10 ilustra un resultado del espectro de 13C-NMR de florofucofuroeckol-A (PFF-A) representado por la fórmula química 3.
La Figura 11 ilustra un resultado del espectro de masas de 974-A representado por la fórmula química 4.
La Figura 12 ilustra un resultado del espectro de 1H-NMR de 974-A representado por la fórmula química 4.
La Figura 13 ilustra un resultado del espectro de 13C-NMR de 974-A representado por la fórmula química 4. La Figura 14 ilustra un resultado del espectro de masas de 974-B representado por la fórmula química 4.
La Figura 15 ilustra un resultado del espectro de 1H-NMR de 974-B representado por la fórmula química 5.
La Figura 16 ilustra un resultado del espectro de 13C-NMR de 974-B representado por la fórmula química 5.
La Figura 17 ilustra la formación de colonias de células madre de pluripotencia inducida según la concentración mediante el tratamiento de una fracción de florotaninos de un extracto de Ecklonia cava utilizando un método (Ejemplo experimental 1-1) de la presente divulgación.
La Figura 18 verifica que las células inducidas por el método de la presente divulgación (Ejemplo experimental 1-1) son células madre pluripotentes utilizando la expresión de SSEA-4 y fosfatasa alcalina que son proteínas específicas de células madre pluripotentes.
La Figura 19 verifica que las células inducidas por el método de la presente divulgación (Ejemplo experimental 1-1) son células madre pluripotentes utilizando la expresión de OCT4 y SOX2 que son genes específicos de células madre pluripotentes.
La Figura 20 ilustra la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas según la concentración mediante el tratamiento de un compuesto en una fracción de florotaninos utilizando un método (Ejemplo experimental 1 -2) de la presente divulgación.
La Figura 21 verifica que las células inducidas por el método de la presente divulgación (Ejemplo experimental 1-2) son células madre pluripotentes utilizando la expresión de SSEA-4 y fosfatasa alcalina que son proteínas específicas de células madre pluripotentes.
La Figura 22 verifica que las células inducidas por el método de la presente divulgación (Ejemplo experimental 1-2) son células madre pluripotentes utilizando la expresión de OCT4 y SOX2 que son genes específicos de células madre pluripotentes.
Modos de la invención
Según un aspecto de la presente divulgación, la presente divulgación proporciona una composición de medio de cultivo que contiene una fracción de florotaninos extraída y aislada de algas pardas para desdiferenciar las células madre mesenquimales en células madre de pluripotencia inducida.
En la presente invención se hizo un esfuerzo para encontrar un método para inducir la pluripotencia en células madre con alta eficiencia con el fin de comercializar el desarrollo de agentes terapéuticos celulares con estabilidad y alta eficiencia de producción sin el problema ético de la destrucción de embriones. Como resultado, se verifica que cuando una fracción de florotaninos aislada de un extracto de algas pardas como un extracto natural estable, preferiblemente un extracto de Ecklonia cava, se añade a un medio de cultivo celular, sorprendentemente, se pueden preparar con alta eficiencia las células madre de pluripotencia inducida.
Según un aspecto ejemplar de la presente divulgación, el extracto de algas pardas puede ser un extracto de algas pardas en agua, un extracto de algas pardas en etanol, un extracto de algas pardas en metanol o un extracto de algas pardas utilizando una mezcla de dos o más disolventes seleccionados de agua, etanol y metanol.
Según el aspecto ejemplar de la presente divulgación, el extracto de algas pardas en agua se puede preparar extrayendo las algas pardas con agua de 40 a 100 °C durante 2 a 48 horas. El extracto de algas pardas en etanol se puede preparar extrayendo las algas pardas con etanol a concentración del 35 al 80 % de 20 a 60 °C durante 2 a 36 horas. Además, el extracto de algas pardas en metanol se puede preparar extrayendo las algas pardas con metanol a concentración del 35 al 80 % de 20 a 60 °C durante 2 a 36 horas.
La Ecklonia cava entre las algas pardas incluidas en la composición del medio de la presente divulgación es un alga perenne de una planta parda laminariacea de las laminariales que vive principalmente en la costa sur, la costa de la isla de Jeju y la costa de la isla de Ulleungdo, principalmente se convierte en alimento para abulones, turbantes y similares, y se utiliza como la principal materia prima para fabricar alginato o yoduro de potasio o como alimento.
El extracto de Ecklonia cava incluido en la presente divulgación se puede extraer utilizando agua y disolventes orgánicos que incluyen (a) alcohol inferior que tiene de 1 a 4 carbonos anhidro o que contiene agua (metanol, etanol, propanol, butanol, n-propanol, isopropanol , n-butanol, etc.), (b) un disolvente mixto del alcohol inferior y agua, (c) acetona, (d) acetato de etilo, (e) cloroformo, (f) 1,3-butilenglicol, (g) hexano, (h) éter dietílico y similares, y preferiblemente, se puede extraer utilizando un disolvente mixto de metanol o etanol y agua. En el caso de extraer el extracto de Ecklonia cava utilizando el disolvente mixto, el contenido de metanol o etanol puede ser de 50 a 80 % v/v. Sin embargo, la presente divulgación no se limita necesariamente a esto.
El florotanino aislado del extracto de algas pardas es un compuesto a base de polifenoles que contiene floroglucinol como unidad constituyente básica. El florotanino se encuentra en una gran cantidad de plantas marinas, en particular, las algas pardas en la naturaleza, y se ha publicado que el florotanino tiene varios efectos útiles tales como un efecto antibacteriano, un efecto antioxidante, una actividad hepatoprotectora, una actividad inhibidora de elastasa, una actividad inhibidora de la hialuronidasa, un efecto de protección cardiovascular y una actividad antiviral.
En la presente divulgación, en particular, a partir de la fracción de florotaninos del extracto de Ecklonia cava se aíslan e identifican un compuesto de bieckol representado por la siguiente fórmula química 1, un compuesto de dieckol representado por la siguiente fórmula química 2, un compuesto de florofucofuroeckol representado por la siguiente fórmula química 3, un compuesto basado en eckol representado por la siguiente fórmula química 4 y un compuesto basado en eckol representado por la siguiente fórmula química 5, y se verifica la capacidad de expresión de células madre de pluripotencia inducida de los mismos. Cuando el compuesto de bieckol representado por la siguiente fórmula química 1 entre los compuestos se añade al medio de cultivo celular, se verifica que las células madre de pluripotencia inducida se pueden preparar con alta eficacia.
[Fórmula química 1]
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
Más particularmente, la fórmula química 1 representa 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol, la fórmula química 2 representa dieckol, la fórmula química 3 representa florofucofuroeckol-A (PFF- A), la fórmula química 4 representa 974-A, y la fórmula química 5 representa 974-B, y en la presente divulgación, los compuestos se pueden añadir al medio de cultivo celular solos o en combinaciones de los mismos.
Con el término "células madre embrionarias" utilizado en la presente divulgación se denominan las células que tienen pluripotencia como células que son aisladas y cultivadas a partir de una masa celular interna de blastocistos en los primeros días de su desarrollo después de la fertilización. Con el término "células madre pluripotentes" utilizado en la presente divulgación se denominan las células madre que tienen pluripotencia que se pueden diferenciar en tres capas germinales que configuran el adulto, es decir, un endodermo, un mesodermo y un ectodermo.
El término "diferenciación" utilizado en la presente divulgación significa que mientras que las células se dividen, proliferan y crecen, las estructuras o funciones de las mismas se especializan, es decir, las formas o funciones se cambian con el fin de realizar las tareas que son asignadas a las células, tejidos, y similares de un organismo.
El término "agente terapéutico celular" de la presente divulgación, como un fármaco utilizado para tratar, diagnosticar y prevenir utilizando células y tejidos preparados a través del aislamiento de un ser humano, del cultivo y de una manipulación específica, significa un fármaco utilizado para tratar, diagnosticar y prevenir mediante una serie de acciones tales como la proliferación y el cribado de células homogéneas o heterogéneas para restaurar las funciones de células o tejidos, cambiando una característica biológica de las células por otro método, y similares. El agente terapéutico celular se clasifica en gran medida en un agente terapéutico de células somáticas, un agente terapéutico de células madre según la diferenciación de las células, y la presente divulgación se refiere particularmente al agente terapéutico de células madre.
Las células madre mesenquimales de la presente divulgación son células aisladas de células madre embrionarias o de células madre adultas derivadas de mamíferos, preferiblemente células madre mesenquimales derivadas de cordón umbilical, y más preferiblemente células madre mesenquimales derivadas de cordón umbilical humano. Las células madre se pueden extraer y obtener del cordón umbilical que conecta la placenta y el feto en el cuerpo humano. La extracción de las células madre mesenquimales del cordón umbilical se puede realizar utilizando varios métodos y, por ejemplo, el cordón umbilical se extrae del cuerpo humano para ser lavado con DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) hasta que no fluya la sangre y el cordón umbilical lavado se trocea con una cuchilla quirúrgica y se incuba a 37 °C para obtener una solución que contiene células mononucleares.
El término "medio" utilizado en la presente divulgación significa una mezcla para cultivar o diferenciar células tales como las células madre in vitro, que contiene los elementos necesarios para el crecimiento y proliferación de las células, incluyendo azúcares, aminoácidos, diversos nutrientes, suero, factores de crecimiento, minerales y similares.
En la técnica están comercializados varios medios y se pueden preparar artificialmente y utilizar. Como medios comercializados, se incluyen DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco), MEM (medio esencial mínimo), BME (medio basal de Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, a-MEM (medio esencial mínimo alfa), G-MEM (medio esencial mínimo de Glasgow), IMDM (Medio de Dulbecco modificado por Iscove), AmnioMax, medio completo AminoMaxIl (Gibco, Newyork, USA.), medio MesenCult-XF. y similares, y se pueden utilizar como medio básico incluido en una composición de medio de cultivo además del medio que se puede preparar artificialmente.
Se pueden añadir al medio básico los componentes de suero añadidos generalmente (por ejemplo, suero fetal bovino (FBS)), antibióticos (por ejemplo, penicilina y estreptomicina) y similares. La concentración del componente de suero o del componente de antibióticos que se añade al medio básico se puede modificar dentro de un intervalo que pueda lograr el efecto de la presente divulgación, y preferiblemente, se pueden añadir FBS al 10 %, penicilina a 100 unidades/ml, estreptomicina a 50 pg/ml y similares.
Paralelamente, la concentración del compuesto añadido al DMEM se puede modificar dentro de un intervalo que pueda lograr el efecto de la presente divulgación.
Además, el medio de la presente divulgación puede incluir adicionalmente una mezcla de nutrientes. La mezcla de nutrientes es una mezcla que contiene varios aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas y similares que generalmente se utilizan en un cultivo celular y puede utilizar una mezcla de nutrientes que se prepara mezclando los aminoácidos, las vitaminas, las sales inorgánicas y similares o ya preparada comercialmente. La mezcla de nutrientes preparada comercialmente puede incluir por ejemplo M199, MCDB110, MCDB202, MCDB302 y similares, pero no se limita a ellos.
Además, el medio de la presente divulgación puede incluir adicionalmente agua energética para la inducción y estabilización de las células madre pluripotentes. El agua energética se añade preferiblemente de 0.05 a 20 % v/v y más preferiblemente de 0.1 a 10 % v/v.
La composición del medio de la presente divulgación es un medio específico para la inducción de células madre pluripotentes y se puede lograr añadiendo al medio básico una fracción de florotaninos aislada del extracto de algas pardas, y puede incluir una fracción de florotaninos aislada de un extracto de Ecklonia cava preferiblemente a una concentración de 1 a 1000 pg/ml y más preferiblemente a una concentración de 10 a 50 pg/ml con respecto a la composición total del medio.
Además, se puede utilizar al menos un tipo seleccionado de un grupo que consiste en 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol de la fórmula química 1, dieckol de la fórmula química 2, florofucofuroeckol-A (PFF-A) de la fórmula química 3, 974-A de la fórmula química 4 y 974-B de la fórmula química 5, a una concentración de 10 a 200 pg/ml, más preferiblemente de 20 a 150 pg/ml con respecto a la composición total del medio.
Según otro aspecto de la presente divulgación, la presente divulgación proporciona un método para preparar células madre de pluripotencia inducida que incluye: añadir una fracción de florotaninos aislada de un extracto de Ecklonia cava a un medio de cultivo celular; y desdiferenciar en el medio las células madre mesenquimales en células madre de pluripotencia inducida.
En este caso, las células mononucleares derivadas del cordón umbilical se añaden a la composición del medio básico que contiene 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol o una mezcla que contiene 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol y se pueden incubar en un incubador en condiciones de humedad del 95 %, 37 °C, y 5 % de CO2.
En un aspecto ejemplar de la presente divulgación, las células mononucleares derivadas del cordón umbilical se incuban en el incubador en las condiciones indicadas y entonces se retira el sobrenadante celular después de 5 días, y las células se incuban reemplazando el medio cada 3 a 4 días. Cuando las células madre se incuban utilizando la composición del medio de cultivo que contiene 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol, se observa inducción de células madre pluripotentes según la concentración de 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol. Se utiliza un medio DMEM F-12 como grupo de control y se utiliza un medio que contiene -O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol en el medio DMEM F-12 como grupo experimental y se incuban las células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano en el medio tratado para cada concentración.
Como resultado, se puede ver que cuando las células madre mesenquimales se incuban en la composición del medio de la presente divulgación, se forman colonias tales como células madre pluripotentes. Las células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano forman colonias de células madre en el medio de la presente divulgación a los 10 a 14 días. Es decir, se puede ver que la composición del medio de cultivo de la presente divulgación forma colonias de células madre pluripotentes a partir de las células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (véase las figuras 17 a 19).
Según otro aspecto más de la presente divulgación, la presente divulgación proporciona células madre de pluripotencia inducida preparadas por el método de preparación.
Las células madre de pluripotencia inducida de la presente divulgación tienen la misma diferenciación que las células madre embrionarias y son casi iguales que las células madre embrionarias incluso en las formas de las células. Según el aspecto ejemplar de la presente divulgación, se examina si se expresa o no un gen específico (Nanog, Oct4, Sox2, Klf) y una proteína (SSEA-4) de las células madre embrionarias y, como resultado, se puede ver que el gen y la proteína se expresan en las células madre pluripotentes inducidas por la presente divulgación igual que en las células madre embrionarias (véase la figura 19).
Según otro aspecto más de la presente divulgación, la presente divulgación proporciona una composición terapéutica celular que contiene las células madre de pluripotencia inducida preparadas por el método de preparación.
Se puede ver que las células madre de pluripotencia inducida de la presente divulgación tienen la misma pluripotencia que las células madre embrionarias y, según el aspecto ejemplar de la presente divulgación, tienen pluripotencia que se puede diferenciar en un ectodermo, un mesodermo y un endodermo.
Por consiguiente, las células madre de pluripotencia inducida de la presente divulgación se pueden usar como un agente terapéutico celular eficaz.
La composición de la presente divulgación se puede administrar por cualquier vía de administración, en particular, un método tal como administración en la cavidad peritoneal o torácica, administración subcutánea, administración intravenosa o endovascular, administración intramuscular, administración local por inyección o similares.
En la presente divulgación, la composición se puede administrar en una forma tal como inyecciones, suspensiones y emulsiones sobre la base de un método general, y si es necesario, se puede suspender en un adyuvante tal como un adyuvante completo de Freund o se puede administrar junto con un material que tiene una actividad adyuvante tal como BCG. La composición se esteriliza o puede contener adyuvantes que incluyen estabilizantes, humectantes o aceleradores de emulsión, sales o tampones para ajustar la presión osmótica y similares y otras sustancias terapéuticamente valiosas, y se puede preparar por un método general de mezcla, granulación o recubrimiento.
La composición terapéutica celular según la presente divulgación puede contener vehículos o aditivos farmacéuticamente aceptables y puede contener diluyentes (por ejemplo, dextrosa, sorbitol, celulosa, glicina, lactosa, sacarosa y manitol), aglutinantes (por ejemplo, silicato de aluminio y magnesio, pasta de almidón, tragacanto, carboximetilcelulosa de sodio), disgregantes (por ejemplo, almidón, agar, ácido algínico o sus sales de sodio), o una mezcla hirviente y/o agentes absorbentes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes y agentes colorantes, además de los ingredientes activos. .
La composición terapéutica celular según la presente divulgación se puede aplicar para la artritis, trastornos neurológicos, trastornos endocrinos, enfermedades hepáticas y similares y tiene la posibilidad de ser un agente terapéutico alogénico para el ser humano según los resultados de los ensayos clínicos posteriores para el ser humano.
De aquí en adelante, la presente divulgación se describirá con más detalle a través de ejemplos. Sin embargo, la presente divulgación no se limita a los aspectos de los ejemplos descritos a continuación, sino que se puede implementar de diversas formas. Los siguientes aspectos ejemplares se describen con el fin de permitir que los expertos en la técnica realicen y practiquen la divulgación.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de la fracción de florotaninos y compuestos de las fórmulas químicas 1 a 5
Ejemplo 1 -1: Preparación de la fracción de florotaninos a partir del extracto de Ecklonia cava
Las muestras de plantas medicinales utilizadas en un experimento se compraron en la isla de Jeju, recibieron una evaluación de los expertos y se utilizaron en el experimento. Se añadieron 100 g de una muestra de plantas medicinales secas a 1 L de metanol al 70 %, se extrajeron a reflujo durante 16 horas y se filtraron utilizando un filtro. Se concentró el filtrado en un evaporador rotatorio de descompresión y se liofilizó inmediatamente para preparar un extracto de Ecklonia cava
Se disolvieron 5 g del extracto de Ecklonia cava en 500 pl de metanol, se absorbieron en una resina C4 (Sepia tech), se secaron por descompresión a 30 °C utilizando un evaporador rotatorio a vacío y se dividieron para cada disolvente utilizando Diaion HP-20 para pequeñas fracciones. Se aplicó un gradiente y se prepararon disolventes de metanol con concentraciones de 0 %, 25 %, 50 %, 75 % y 100 % para realizar la fracción. Se separaron 5 fracciones pequeñas y se verificó un perfil de HPLC (véase la figura 1). Se seleccionó la fracción que tenía el pico de HPLC más alto entre las cinco fracciones pequeñas.
Ejemplo 1-2: Aislamiento y purificación de la fracción de florotaninos
Las fracciones obtenidas en el Ejemplo 1 -1 se aplicaron a una columna C-18 de HPLC de fase inversa en condiciones de gradiente de disolvente durante 60 min, acetonitrilo 10 min, acetonitrilo de 20 a 55 % 40 min y acetonitrilo de 55 a 100 % 10 min utilizando una columna C18 (equipo Phenomenex Luna C18, 10 pm, 21.2 x 250 mm) y utilizando disolventes de acetonitrilo que contenían 0.02 % de TFA y agua a un caudal de 10 ml/min y UV 243 nm para ser aisladas en picos C (tiempo de retención 25 min), E (tiempo de retención 33 min), G (tiempo de retención 37.5 min), H (tiempo de retención 38 min) e I (tiempo de retención 38.5 min). Una fracción desde el tiempo de retención 0 hasta el pico C se llamó c, una fracción entre el pico C y el pico E se llamó D, una fracción entre los picos E y G se llamó F, y una fracción después del pico I se llamó J.
Cada pico se purificó utilizando una columna C18 (equipo Phenomenex Luna C18, 10 pm, 21.2 x 250 mm), utilizando disolventes de acetonitrilo que contenían 0.02 % de TFA, metanol y agua a un caudal de 4 ml/min y UV 230 nm cada uno en condiciones isocráticas. En condiciones isocráticas de acetonitrilo al 28 %, se purificaron el pico E (tiempo de retención 10 min), el pico G (tiempo de retención 22 min), el pico H (tiempo de retención 23 min) y el pico I (tiempo de retención 27 min), respectivamente.
Sin embargo, como resultado del análisis después de la purificación, se verificó que en el pico C, se mezclaban dos sustancias, y entonces se volvieron a aislar las dos sustancias en C-1 (tiempo de retención 10 min) y C-2 (tiempo de retención 13.5 min) en condiciones isocráticas de metanol al 26 %.
Ejemplo 1-3: Análisis estructural de un compuesto a base de polifenoles
El peso molecular y la fórmula molecular del compuesto purificado en el Ejemplo 1-2 se determinaron utilizando cromatografía de líquidos de alta resolución con cromatografía de masas (HPLC-MS) y la identificación estructural del compuesto se realizó analizando los espectros de 1H NMR y 13C-NMR a través de resonancia magnética nuclear (NMR).
Como resultado, se identificó que la fórmula química 1 era 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol, la fórmula química 2 era dieckol, la fórmula química 3 era florofucofuroeckol-A, la fórmula química 4 era 974-A, la fórmula química 3 era 974-B. La estructura del compuesto a base de polifenoles aislado se ilustró en la siguiente Tabla 1 y las características estructurales de cada compuesto fueron las siguientes.
Tabla 1
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[Fórmula química 1]: 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol
1) Peso molecular: 866.65
2) Fórmula molecular: C42H26O21
3) 1H NMR (400 MHz, DMSO) 59.28, 9.25, 9.14, 9.09, 9.06, 9.04, 8.95, 8.66, 8.61,6.09, 6.07, 6.05, 5.91 (d, J=2.0Hz, 1H), 5.84, 5.80,5, 5.75 (d, J=2.0Hz, 1H).
4) 13C NMR (100 MHz, DMSO) 5 160.6, 160.5, 158.9, 158.9, 154.8, 151.5, 151.4, 151.2, 147.4, 146.5, 144.6, 144.6, 141.7, 141.6, 141.5, 141.5, 137.4, 137.4, 125.0, 123.9, 123.0, 123.0, 122.8, 122.3, 122.3, 99.9, 99.8, 98.1,98.1,98.0, 96.2, 96.2, 96.1,95.0, 94.3, 94.1.
La Figura 2 ilustra un espectro de masas del 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol. Además, las figuras 3 y 4 ilustran un espectro de 1H-NMR y un espectro de 13C-NMR del 2-O-(2,4,6-trihidroxifenil)-6,6'-bieckol, respectivamente, y las cifras indicadas en cada pico corresponden a las cifras indicadas en las fórmulas químicas de las figuras 3 y 4. [Fórmula química 2]: Dieckol
1) Peso molecular: 742.08
2) Fórmula molecular: C36H22O18
3) 1H NMR (400 MHz, MeOD) 56.16 (s, 1H), 6.14 (s, 1H), 6.10 (s, 2H), 6.07(d, J = 2.9 Hz, 1H), 6.06 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 5.99 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.96 (d, J = 2.8 Hz, 1H).
4) 13C NMR (125 MHz, MeOD) 5 162.70, 160.95, 160.91, 158.63, 156.82, 155.34, 153.22, 148.17, 148.13, 147.97, 147.75, 145.11, 144.95, 144.22, 144.13, 139.46, 139.29, 127.22, 126.98, 126.42, 126.37, 125.66, 125.40, 125.34, 100.65, 100.51, 100.25, 100.14, 98.44, 96.99, 96.63, 96.55, 96.15.
La Figura 5 ilustra un espectro de masas del dieckol. Además, las figuras. 6 y 7 ilustran un espectro de 1H-NMR y un espectro de 13C-NMR del dieckol, respectivamente, y las cifras indicadas en cada pico corresponden a las cifras indicadas en las fórmulas químicas de las figuras. 6 y 7.
[Fórmula química 3]: florofucofuroeckol-A
1) Peso molecular: 602.07
2) Fórmula molecular: C30H18O14
3) 1H NMR (400 MHz, MeOD) 56.63 (s, 1H), 6.40 (s, 1H), 6.26 (s, 1H), 5.96 (d, J=2.1 Hz,2H), 5.955.93 (t.like,1 H), 5.92 (t,J=2.1 Hz,1 H), 5.88(d,J=2.1 Hz,2H).
4) 13C NMR (125 MHz, MeOD) 5 161.87, 161.84, 160.18, 153.15, 151.73, 151.15, 148.31, 148.21, 145.97, 143.92, 138.37, 135.29, 128.04, 124.94, 124.64, 122.27, 105.29, 99.91,99.28, 97.69, 97.57, 96.18, 95.35, 95.29.
La Figura 8 ilustra un espectro de masas de florofucofuroeckol-A (PFF-A). Además, las figuras 9 y 10 ilustran un espectro de 1H-NMR y un espectro de 13C-NMR del PFF-A, respectivamente, y las cifras indicadas en cada pico corresponden a las cifras indicadas en las fórmulas químicas de las figuras 9 y 10.
[Fórmula química 4]: 974-A
1) Peso molecular: 974.73
2) Fórmula molecular: C48H30O23
3) 1H NMR (400 MHz, MeOD) 5 6.63 (s, 1H), 6.40 (s, 1H), 6.25 (s, 1H), 6.20 (d, J=2.3Hz,1H), 6.18 (d,J=2.3Hz,1H), 6.12 (d,J=2.3Hz,1H, 6.04 (d,J=2.8Hz,1H), 5.92 (s,2H), 5.925.91 (m,1H), 5.90 (d,J=2.3Hz,1H), 5.87 (d,J=2.1Hz,2H), 5.74 (d,J=2.8Hz,1H).
4) 13C NMR (125 MHz, MeOD) 5 163.16, 162.88, 161.83, 160.16, 159.64, 159.54, 159.14, 159.09, 156.55, 156.49, 156.48, 153.85, 153.35, 152.26, 151.92, 151.77, 151.18, 148.21, 147.78, 145.82, 144.31, 138.15, 135.16, 127.62, 124.93, 124.90, 124.25, 124.22, 122.27, 119.40, 118.15, 105.22, 105.21, 102.62, 102.44, 99.91,99.24, 98.61, 98.32, 97.68, 97.57, 96.34, 96.11,95.28, 95.20, 94.37, 94.18.
La Figura 11 ilustra un espectro de masas del 974-A. Además, las figuras 12 y 13 ilustran un espectro de 1H-NMR y un espectro de 13C-NMR del 974-A, respectivamente, y las cifras indicadas en cada pico corresponden a las cifras indicadas en las fórmulas químicas de las figuras 12 y 13.
[Fórmula química 5]: 974-B
1) Peso molecular: 947.73
2) Fórmula molecular: C48H30O23
3) 1H NMR (400 MHz, MeOD) 56.69 (s, 1H), 6.38 (s, 1H), 6.21 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.19 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.17 (s, 1H), 6.14 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.05 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.00 (s, 2H), 5.91 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 5.89 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.87 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 5.76 (d, J = 2.8 Hz, 1H).
4) 13C NMR (125 MHz, MeOD) 5 161.85, 160.16, 159.64, 159.53, 159.19, 158.97, 157.45, 156.81, 156.63, 156.47, 153.79, 152.65, 152.22, 151.95, 151.66, 150.89, 148.32, 147.03, 143.86, 142.83, 138.07, 137.95, 127.35, 125.23, 124.65, 124.01, 123.93, 122.11, 109.85, 106.33, 102.68, 102.49, 99.62, 99.47, 98.61, 98.32, 97.61, 97.56, 96.45, 95.28, 95.13, 94.23, 92.83.
La Figura 14 ilustra un espectro de masas del 974-B. Además, las figuras 15 y 16 ilustran un espectro de 1H-NMR y un espectro de 13C-NMR del 974-B, respectivamente, y las cifras indicadas en cada pico corresponden a las cifras indicadas en las fórmulas químicas de las figuras 15 y 16.
Ejemplo 2: Aislamiento e incubación de células madre mesenquimales procedentes de cordón umbilical humano
Ejemplo 2-1: Extracción de cordón umbilical humano
Se recogió el tejido de cordón umbilical inmediatamente después del nacimiento. La muestra se lavó primero antes de ser transferida al laboratorio y después se transfirió inmediatamente a un frasco de vidrio estéril de 500 ml que contenía un medio F-12 al que se había añadido un medio de transferencia (50 Mg/ml de penicilina y 50 Mg/ml de estreptomicina (adquirido de Invitrogen)). En el laboratorio, se extrajeron las células madre en una cabina de flujo laminar de clase 100 en condiciones estériles. La muestra se transfirió primero a un recipiente de acero inoxidable. Se lavó la muestra con PBS varias veces y después se cortó la muestra de tejido de cordón umbilical con una longitud de 2 cm y se transfirió a una placa de cultivo celular con un diámetro de 10 cm, y allí, se lavó adicionalmente y se trató con etanol al 70 % para anti-infección, y después se lavó varias veces con PBS añadido con una mezcla de antibióticos (50 Mg/ml de penicilina y 50 Mg/ml de estreptomicina (adquirido de Invitrogen) hasta que la solución estuvo limpia.
Ejemplo 2-2: Aislamiento e incubación de células madre procedentes de cordón umbilical humano
Para aislar la gelatina de Wharton (un sustrato del cordón umbilical) procedente de los vasos sanguíneos del cordón umbilical y otros elementos internos, se realizó primero el corte del tejido de cordón umbilical. La gelatina de Wharton aislada después de retirar los vasos sanguíneos se cortó en pequeños trozos con un tamaño (0.5 cm x 0.5 cm) para la extracción de células. El explante se realizó añadiendo los trozos de la gelatina de Wharton del cordón umbilical a diferentes placas de cultivo de tejidos que tenían condiciones de cultivo celular adecuadas para la extracción de células madre epiteliales o células madre mesenquimales.
Para el aislamiento/incubación de las células madre mesenquimales, se sumergió el tejido explantado en 5 ml de DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) F-12 (Gibco) añadido con suero fetal bovino al 10 % (FBS, Hyclone), FBS al 10 %, penicilina a 100 unidades/ml y estreptomicina a 50 Mg/ml, y se mantuvo a 37 °C en un incubador de células con dióxido de carbono. El medio fue reemplazado cada 3 o 4 días. Se monitorizó el crecimiento de las células mediante un microscopio óptico. Las células expandidas se trataron con tripsina (tripsina al 0.125 %/ EDTA al 0.05 %) para una expansión adicional y refrigeración (utilizando DMEM/FBS al 10 %).
El medio fue reemplazado cada 3 o 4 días. Se monitorizó el crecimiento de las células del tejido explantado mediante un microscopio óptico.
Para la extracción de las células madre mesenquimales, se resuspendieron los sedimentos de las células y se contaron en el medio DMEM F-12 (Gibco), FBS al 10 %, penicilina a 100 unidades/ml y estreptomicina a 50 Mg/ml y se inocularon en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm a una densidad de 1 x 106 células/placa. El medio fue reemplazado cada 3 o 4 días. Se monitorizó el crecimiento y la formación de colonias de las células mediante un microscopio óptico. Al alcanzar aproximadamente el 90 % del número de células (confluencia), se subcultivaron las células como se ha descrito antes.
Ejemplo experimental 1: Inducción de células madre pluripotentes a partir de células madre mesenquimales
Ejemplo experimental 1-1: Preparación de células madre pluripotentes de células madre mesenquimales derivadas de humanos según la concentración de la fracción de florotaninos
Se realizó un experimento para medir la capacidad de inducción de células madre pluripotentes a partir de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano según la concentración de la fracción de florotaninos preparada en el Ejemplo 1-1 . En un grupo de control, se utilizaron como medio básico (normal), DMEM F-12 (Gibco) como medio dedicado de las MSC, FBS al 10 %, penicilina a 100 unidades/ml y estreptomicina a 50 Mg/ml y en un grupo experimental, se utilizaron células madre mesenquimales derivadas de humanos que se sometieron a tres subcultivos y se añadieron al medio fracciones de florotaninos con concentraciones de 1 Mg/ml, 20 Mg/ml, 50 Mg/ml, 100 Mg/ml, 400 Mg/ml, 800 Mg/ml y 1000 Mg/ml y 0.1 % v/v de agua energética (agua purificada desionizada que contenía SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O y LiO, STC). Se aislaron y se lavaron las células madre mesenquimales derivadas de cordón umbilical humano y se inocularon células mononucleares en una placa de 6 pocillos con 1 x 104 células y se mantuvieron e incubaron a 37 °C y 5 % de CO2.
Con respecto a las células madre pluripotentes inducidas por el método de la presente divulgación, se analizó si expresan o no el antígeno embrionario específico de la etapa 4 (SSEA-4), la fosfatasa alcalina (AP), OCT4 y SOX2 como proteínas específicas de las células madre embrionarias utilizando anticuerpos de las mismas y un método de tinción inmunoquímica. Durante el proceso de tinción, las células se fijaron primero utilizando paraformaldehído al 4 % y se lavaron con PBS y se bloquearon con una solución de BSA al 1 %. Se trataron las células con anticuerpos primarios contra OCT4, SOX2 y SSEA-4 y se hicieron reaccionar a 4 °C durante 18 horas, y después se lavaron con PBS, se trataron con anticuerpos secundarios con fluorescencia (FITC) contra los anticuerpos primarios y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavaron las células con PBS y después se analizó la expresión utilizando un microscopio confocal. BF significa un campo brillante y el segundo dibujo ilustra el resultado de tinción para la expresión de proteínas, y el tercer dibujo ilustra los dos dibujos combinados (véanse las figuras 19A, 19B, 20A y 20B). La tinción de AP se realizó con un colorante de sustrato fluorogénico permeable a las células con fosfatasa alcalina, el colorante fluorogénico de AP se diluyó en una solución de cultivo DMEM F-12 para ser tratado en colonias, y después se hizo reaccionar durante 20 a 30 min, se lavó dos veces con solución de cultivo DMEM F-12, y se analizó la expresión utilizando un microscopio confocal, y el resultado se ilustra en la figura 17.
Como resultado, en el grupo experimental, sólo cuando la concentración de la fracción de florotaninos fue de 10 a 500 pg/ml, se observó que se formaban las colonias a los 10 días (véase la figura 17) y se verificó que solamente las colonias que eran las células madre pluripotentes se tiñeron por OCT4, SOX2, SSEA-4 y AP como marcadores específicos de células madre pluripotentes (véanse las figuras 18 y 19).
Ejemplo experimental 1-2: Preparación de células madre pluripotentes de células madre mesenquimales derivadas de seres humanos según la concentración de compuesto en la fracción de florotaninos
Se realizó un experimento para medir la capacidad de inducción de células madre pluripotentes a partir de células madre mesenquimales derivadas de seres humanos según la concentración de compuesto 1 entre los compuestos aislados en el Ejemplo 1-2. En un grupo de control, se utilizaron como medio básico (normal) DMEM F-12 (Gibco) como medio dedicado de las MSC, FBS al 10 %, penicilina a 100 unidades/ml y estreptomicina a 50 pg/ml, y en un grupo experimental, se utilizaron células madre mesenquimales derivadas de cordón umbilical humano que se sometieron a tres subcultivos, y se añadieron al medio el compuesto 1 de bieckol representado por la fórmula química 1 a concentraciones de 1 pg/ml, 20 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 400 pg/ml, 800 pg/ml y 1000 pg/ml y 0.1 % v/v de agua energética (agua desionizada purificada que contiene SiO2, ALO3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O, y LiO, STC). Se aislaron y se lavaron las células madre mesenquimales derivadas de cordón umbilical humano y se inocularon células mononucleares en una placa de 6 pocillos con 1 x 104 células y se mantuvieron e incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 .
Con respecto a las células madre de pluripotencia inducida, se analizó si expresan o no antígeno embrionario específico de la etapa 4 (SSEA-4), la fosfatasa alcalina, OCT4 y SOX2 como proteínas específicas de las células madre embrionarias utilizando anticuerpos de las mismas y un método de tinción inmunoquímica. Durante el proceso de tinción, las células se fijaron primero utilizando paraformaldehído al 4 % y se lavaron con PBS y se bloquearon con una solución de BSA al 1 %. Se trataron las células con anticuerpos primarios contra OCT4, SOX2 y SSEA-4 y se hicieron reaccionar a 4 °C durante 18 horas, y después se lavaron con PBS, se trataron con anticuerpos secundarios con fluorescencia (FITC) contra los anticuerpos primarios y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavaron las células con PBS y después se analizó la expresión utilizando un microscopio confocal, y el resultado se ilustró en la figura 20. BF significa un campo brillante y el segundo dibujo ilustra el resultado de tinción para la expresión de proteínas, y el tercer dibujo ilustra los dos dibujos combinados (véanse las figuras 21A, 21B, 22A y 22B).
La tinción de AP se realizó con un colorante de sustrato fluorogénico permeable a las células con fosfatasa alcalina, el colorante fluorogénico de AP se diluyó en una solución de cultivo DMEM F-12 para ser tratado en colonias, y después se hizo reaccionar durante 20 a 30 min, se lavó dos veces con solución de cultivo DMEM F-12, y se analizó la expresión utilizando un microscopio confocal, y el resultado se ilustra en la figura 22B.
Como resultado, en el grupo experimental, sólo cuando la concentración del compuesto 1 de bieckol representado por la fórmula química 1 fue de 50 pg/ml y 100 pg/ml, se observó que se formaban las colonias a los 14 días (véase la figura 20). ) y se verificó que solamente las colonias que eran las células madre pluripotentes se tiñeron por OCT4, SOX2, SSEA-4 y AP como marcadores específicos de células madre pluripotentes (véanse las figuras 21 y 22).

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Uso de una composición de medio de cultivo que comprende de 20 a 150 pg/ml de una fracción de florotaninos que es un compuesto de bieckol representado por la siguiente fórmula química 1 o sales del mismo para desdiferenciar las células madre mesenquimales en células madre de pluripotencia inducida.
[Fórmula química 1]
Figure imgf000014_0001
2. El uso de una composición de medio de cultivo de la reivindicación 1, en donde la fracción de florotaninos se extrae y se aísla de un tipo de alga parda seleccionado del grupo que consiste en Ecklonia cava, Dictyopteris prolifera Okamura, Dictyota dichotoma Lamouroux, Sargassum horneri C. Agardh, Sargassum patens C. Agardh e Ishige okamurae Yendo, o se sintetiza artificialmente.
3. El uso de una composición de medio de cultivo de la reivindicación 1, en donde la fracción de florotaninos se incluye en un medio seleccionado del grupo que consiste en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco), MEM (medio esencial mínimo), BME (medio basal de Eagle), RPMI. 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, a-MEM (medio esencial mínimo alfa), G-MEM (medio esencial mínimo de Glasgow), IMDM (medio de Dulbecco modificado por Iscove), Medio 5A de McCoy, medio completo AminoMax II y medio MesenCult-XF.
4. El uso de una composición de medio de cultivo de la reivindicación 1, en donde la composición del medio de cultivo comprende además 1 a 10 % v/v de agua desionizada purificada que contiene SiO2, Al2Ü3, TiO3, Fe2Ü3, CaO, Na2O, K2O y LiO.
5. Un método para preparar células madre de pluripotencia inducida, comprendiendo el método: añadir de 20 a 150 pg/ml de una fracción de florotaninos que es un compuesto de bieckol representado por la siguiente fórmula química 1 o sales del mismo en un medio de cultivo celular; y desdiferenciar las células madre mesenquimales en células madre de pluripotencia inducida en el medio
[Fórmula química 1]
Figure imgf000014_0002
6. El método de la reivindicación 5, en donde la fracción de florotaninos se extrae y se aísla de un tipo de alga parda seleccionado del grupo que consiste en Ecklonia cava, Dictyopteris prolifera Okamura, Dictyota dichotoma Lamouroux, Sargassum horneri C. Agardh, Sargassum patens C. Agardh e Ishige okamurae Yendo, o se sintetiza artificialmente.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6700175B2 (ja) 2013-11-01 2020-05-27 ビービーエイチシー・カンパニー・リミテッドＢｂｈｃ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 間葉系幹細胞から誘導多能性幹細胞を製造する方法及びその方法によって製造された誘導多能性幹細胞
KR101966315B1 (ko) * 2017-04-26 2019-04-08 제주대학교 산학협력단 감태 추출물과 괭생이모자반 추출물을 이용한 면역억제용 조성물
CN113194743A (zh) * 2018-12-05 2021-07-30 博塔医疗株式会社 包含褐藻多酚作为有效成分的用于改善食物香味的组合物
WO2021145742A1 (ko) * 2020-01-17 2021-07-22 주식회사 만나스 플로로탄닌을 유효성분으로 포함하는 운동 기능 개선용 조성물
CN111557869A (zh) * 2020-06-19 2020-08-21 湖北楚天香妆生物科技有限公司 昆布提取物的应用
CN114438037B (zh) * 2022-01-25 2024-06-04 深圳市乐土生物医药有限公司 一种制备诱导性间充质干细胞的方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5818874A (ja) * 1981-07-28 1983-02-03 Shin Kobe Electric Mach Co Ltd 鉛蓄電池の製造法
JP2932660B2 (ja) 1990-10-09 1999-08-09 松下電器産業株式会社 スクリーン印刷用スキージ装置
JP4146146B2 (ja) 2002-03-25 2008-09-03 熊本県 フロロタンニン類を主成分とする抗菌剤
US7910755B2 (en) * 2004-09-29 2011-03-22 Harbor Biosciences, Inc. Stem cell expansion and uses
BRPI0716762A2 (pt) * 2006-09-13 2013-09-24 Abbott Lab melhorias da cultura celular
WO2009157610A1 (en) * 2008-06-26 2009-12-30 Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation Selenium dedifferentiated cell, preparation method and usage thereof
JP2010030917A (ja) * 2008-07-25 2010-02-12 Guraiko Materials:Kk 肝炎予防剤又は肝炎治療剤
KR101166257B1 (ko) * 2009-06-16 2012-07-19 한국생명공학연구원 미분화 다능성줄기세포의 제작, 유지 및 증식을 위한 뉴로펩타이드 ｙ를 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 다능성줄기세포의 배양 방법
CN103210082A (zh) * 2010-09-15 2013-07-17 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 扩增胰岛β细胞和使其再分化的方法
KR101807704B1 (ko) * 2011-04-12 2017-12-13 차의과학대학교 산학협력단 역분화-증진제를 이용한 역분화 만능 줄기세포의 제조방법
US20150072416A1 (en) * 2012-05-29 2015-03-12 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotech Metabolite for improving production, maintenance and proliferation of pluripotent stem cells, composition comprising the same, and method of culturing pluripotent stem cell using the same
KR101542849B1 (ko) * 2013-11-01 2015-08-10 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 간세포로 분화시키는 방법
KR101544195B1 (ko) * 2013-11-01 2015-08-12 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포
KR101542850B1 (ko) * 2013-11-01 2015-08-10 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 지방세포로 분화시키는 방법
KR101542847B1 (ko) * 2013-11-01 2015-08-10 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 신경세포로 분화시키는 방법
KR101542846B1 (ko) * 2013-11-01 2015-08-10 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 연골세포로 분화시키는 방법
KR101542848B1 (ko) * 2013-11-01 2015-08-10 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 골아세포로 분화시키는 방법

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