JP2017516455A - フロロタンニン分画物を用いた中間葉幹細胞から誘導多能性幹細胞を製造する方法 - Google Patents

フロロタンニン分画物を用いた中間葉幹細胞から誘導多能性幹細胞を製造する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、カジメ、ヘラヤハズ、アミジグサ、アカモク及びイシゲからなる群から選択された１種の褐藻類から抽出及び分離したフロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物を含む誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の逆分化用培地組成物に関するものである。また、本発明は前記培地組成物を用いた誘導多能性幹細胞の製造方法に関するものである。本発明による培地組成物を用いれば、中間葉幹細胞を用いて安全かつ容易に誘導多能性幹細胞を効率的に製造することができ、製造された多能性幹細胞は多様な細胞への分化が可能であるため、細胞治療剤として有用に用いることができる。

Description

本発明は、褐藻類から抽出したフロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物を含む中間葉幹細胞多能性幹細胞の誘導培地組成物、及び、それを利用して誘導多能性幹細胞を製造する方法に関するものである。
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、生物組織を構成するさまざまな細胞に分化されうる細胞であって、胚芽、胎児及び成体の各組織から得ることができる分化する前段階の未分化細胞を総称する。このような幹細胞は、さまざまな方法で分類することができる。その中で最も一般的に使用される方法の一つは、幹細胞が分離された個体によるもので、胚芽（ｅｍｂｒｙｏ）から分離された胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＥＳ ｃｅｌｌ）と成体で分離された成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ）に分けることができる。別の一般的な分類は、幹細胞の分化能によるもので、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）及び単分化能（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）幹細胞に分けることができる。多能性幹細胞とは、生体を構成する３つの胚葉（ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）のすべてに分化されうる多機能性を持つ幹細胞を指し、一般的に胚性幹細胞がこれに該当する。
成体幹細胞は、多分化能又は単分化能幹細胞に区分することができる。代表的な成体幹細胞は、中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ； ＭＳＣｓ）と造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ； ＨＳＣｓ）がある。中間葉幹細胞は、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｂｌａｓｔ）、骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、筋肉細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）、神経細胞（ｎｅｕｒｉｏｎ）に分化し、造血幹細胞には、赤血球、白血球、血小板など、主に血液内の血球細胞に分化することが知られている。成体幹細胞は、骨髄、血液、脳、皮膚などから得ることができ、倫理的な問題が少ないが、胚性幹細胞に比べて限られた分化能力（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を持っている。
一方、多能性幹細胞は、生体を構成する３つの胚葉（ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）のすべてに分化され得、人体のすべての細胞や臓器の組織に分化することができる多機能性を持った幹細胞を指し、一般的に胚性幹細胞がこれに該当する。胚性幹細胞は、一つの個体を構成するすべての組織の細胞に分化されうる潜在力を持つ多能性幹細胞であるが、細胞の製造過程で胚芽の破壊という深刻な倫理的問題が存在する。
このような問題点を克服するための代案として、成体に由来する細胞を逆分化させて胚性幹細胞と類似するカスタマイズ多能性幹細胞を製造するためのいろいろな方法が試みられてきた。ヒト胚性幹細胞は、ヒトの生命体として発生しうる胚芽から作られるため、多くの倫理的な問題があるが、成体幹細胞に比べて細胞増殖及び分化能力に優れていることが知られている。成体幹細胞は、骨髄、血液、脳、皮膚などから得られ、倫理的な問題が少ないが、胚性幹細胞に比べて限られた分化能力（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を持っている。
代表的な方法として細胞融合法（ｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ＥＳ ｃｅｌｌ）、体細胞核置換法（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、特定因子注入法（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｅ ｆａｃｔｏｒ）などがある。細胞融合法は、誘導された細胞が２組の遺伝子をさらに持っており、細胞の安定性の面で問題があり、体細胞核置換法は、卵子が大量に必要であり、効率も非常に低いという点で問題がある。そして、特定因子注入法は、特定の遺伝子を挿入して逆分化を誘導するために発癌遺伝子を含むウイルスを利用する方法で癌発生の危険性が高く、低効率と方法的な側面からの難易度により、細胞治療剤の開発可能性の面で問題となっている。
多能性幹細胞を成功的に、そして多量に得るためには、分離された臍帯由来単核細胞を培養する段階での培養組成物が非常に重要であるところ、より多くの量で、高効率の誘導方法で多能性幹細胞を製造するための研究が必要な状態である。
一方、韓国公開特許第２００９−００４３１１５号では、褐藻類のカジメを利用して、アトピー性疾患の治療又は予防のための組成物を開示しており、韓国公開特許第２０１２−０１２６１４８号では、酸化染色用染毛剤組成物を開示している。
本発明者らはカジメ抽出物を利用して、誘導多能性幹細胞逆分化用培地組成物を成功的に開発にしたことがある（韓国公開特許第２０１５−００５０８２３号）。しかし、カジメ抽出物のどの成分が誘導多能性幹細胞逆分化効果を持つのかは、まだ明らかにされていない。
前記した背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解を増進するためのものにすぎないのであって、この技術分野において通常の知識を有する者には既に知られた従来技術に該当することを認めるものと受けとられてはならないだろう。
本発明者らは、安全性と生産効率の高い細胞治療剤の開発の実用化のために、多能性幹細胞を高効率に誘導する方法を探そうと努めた。その結果、安全な天然物質である褐藻類から抽出及び分離された一部の化合物が細胞培養培地に添加された場合、中間葉幹細胞を利用して、安全かつ高効率で誘導多能性幹細胞を製造できることを確認することにより、本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、フロロタンニン分画物を含む中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に逆分化するための培地組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、フロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物が含まれた培地で中間葉幹細胞を誘導多能性幹細胞に逆分化させる段階を含む誘導多能性幹細胞の製造方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、前記製造方法で製造された誘導多能性幹細胞を含む細胞治療用組成物を提供することにある。本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。
前記の課題は、フロロタンニン分画物を含む、中間葉幹細胞を誘導多能性幹細胞に逆分化するための培地組成物によって達成される。
好ましくは、前記フロロタンニン分画物は、以下の化学式１で示したバイエコール化合物又はその塩でありうる。
好ましくは、前記フロロタンニン分画物は、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ヘラヤハズ（Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒｉｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ Ｏｋａｍｕｒａ）、アミジグサ（Ｄｉｃｔｙｏｔａ ｄｉｃｈｏｔｏｍａ Ｌａｍｏｕｒｏｕｘ）、アカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ Ｃ． Ａｇａｒｄｈ）、ヤツマタモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ． Ａｇａｒｄｈ）及びイシゲ（Ｉｓｈｉｇｅ ｏｋａｍｕｒａｅ Ｙｅｎｄｏ）からなる群から選択された１種の褐藻類から抽出及び分離したもの、又は人工的に合成されたものでありうる。
また、好ましくは、前記フロロタンニン分画物は、カジメから抽出及び分離したものでありうる。
また、好ましくは、前記フロロタンニン分画物は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭａｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地、ＡｍｉｎｏＭａｘII ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ及びＭｅｓｅｎＣｕｌｔ−ＸＦ Ｍｅｄｉｕｍで構成された群から選択される培地に含まれうる。
好ましくは、前記フロロタンニン分画物は、培地組成物基準１０〜５００μｇ/ｍｌ含まれうる。
また、好ましくは、前記培地組成物は、エネルギーウォーター１〜１０ｖ／ｖ％をさらに含むことができる。
また、本発明の課題は、フロロタンニン分画物を細胞培養培地に添加する段階；及び前記培地で中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に逆分化させる段階を含む誘導多能性幹細胞の製造方法によって達成される。
好ましくは、前記フロロタンニン分画物は、以下の化学式１で示されるバイエコール化合物又はその塩でありうる。
また、好ましくは、前記で製造された誘導多能性幹細胞を含む細胞治療用組成物を提供する。
本発明の特徴及び利点を要約すると次の通りである：
（ｉ）本発明は、褐藻類から抽出したフロロタンニン分画物を用いて、誘導多能性幹細胞逆分化用培地組成物を提供する。
（ｉｉ）また、本発明は、前記培地組成物を用いた誘導多能性幹細胞の製造方法を提供する。
（ｉｉｉ）本発明による培地組成物を使用すると、中間葉幹細胞を用いて誘導多能性幹細胞を効率的に製造することができ、製造された多能性幹細胞は、さまざまな細胞への分化が可能なので、細胞治療剤として有用に使用することができる。
カジメ抽出物から分画物の分離条件を示した図面である。 化学式１で表示される２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌのＭａｓｓスペクトルの結果を示した図面である。 化学式１で表示される２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を示した図面である。 化学式１で表示される２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの結果を示した図面である。 化学式２で表示されるＤｉｅｃｋｏｌのＭａｓｓスペクトルの結果を示した図面である。 化学式２で表示されるＤｉｅｃｋｏｌの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を示した図面である。 化学式２で表示されるＤｉｅｃｋｏｌの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの結果を示した図面である。 化学式３で表示されるＰＦＦ−Ａ（Ｐｈｌｏｒｏｆｕｃｏｆｕｒｏｅｃｋｏｌ−Ａ）のＭａｓｓスペクトルの結果を示した図面である。 化学式３で表示されるＰＦＦ−Ａ（Ｐｈｌｏｒｏｆｕｃｏｆｕｒｏｅｃｋｏｌ−Ａ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を示した図面である。 化学式３で表示されるＰＦＦ−Ａ（Ｐｈｌｏｒｏｆｕｃｏｆｕｒｏｅｃｋｏｌ−Ａ）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの結果を示した図面である。 化学式４で表示される９７４−ＡのＭａｓｓスペクトルの結果を示した図面である。 化学式４で表示される９７４−Ａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を示した図面である。 化学式４で表示される９７４−Ａの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの結果を示した図面である。 化学式４で表示される９７４−ＢのＭａｓｓスペクトルの結果を示した図面である。 化学式５で表示される９７４−Ｂの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を示した図面である。 化学式５で表示される９７４−Ｂの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの結果を示した図面である。 本発明の方法（実験例１−１）でカジメ抽出物のフロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物を処理して濃度により誘導された多能性幹細胞コロニー形成を示した図面である。 本発明の方法で誘導された細胞（実験例１−１）を多能性幹細胞特異的タンパク質であるＳＳＥＡ−４とＡｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの発現を利用して、多能性幹細胞であることを確認した図面である。 本発明の方法で誘導された細胞（実験例１−１）を多能性幹細胞特異的遺伝子であるＯＣＴ４とＳＯＸ２の発現を利用して、多能性幹細胞であることを確認した図面である。 本発明の方法（実験例１−２）でフロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物中の化合物を処理して濃度により誘導された多能性幹細胞コロニー形成を示した図面である。 本発明の方法で誘導された細胞（実験例１−２）を多能性幹細胞特異的タンパク質であるＳＳＥＡ−４とＡｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの発現を利用して、多能性幹細胞であることを確認した図面である。 本発明の方法で誘導された細胞（実験例１−２）を多能性幹細胞特異的遺伝子であるＯＣＴ４とＳＯＸ２の発現を利用して、多能性幹細胞であることを確認した図面である。
本発明の一態様によれば、本発明は、褐藻類から抽出及び分離されたフロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物を含む中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に逆分化するための培地組成物を提供する。
本発明者らは、胚芽を破壊する倫理的問題なく、安全性と生産効率の高い細胞治療剤の開発の実用化のための多能性幹細胞を高効率で誘導する方法を探そうと努めた。その結果、安全な天然抽出物である褐藻類抽出物、好ましくはカジメ抽出物から分離したフロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物を細胞培養培地に添加する場合、驚くべきことに、高効率で誘導多能性幹細胞を製造することができることを確認した。
本発明の一実施例によれば、前記褐藻類抽出物は、褐藻類水抽出物、褐藻類エタノール抽出物、褐藻類メタノール抽出物又は水、エタノール及びメタノールから選択されるいずれか２以上の溶媒の混合溶媒による褐藻類抽出物でありうる。
本発明の一実施例によれば、褐藻類水抽出物は、４０〜１００℃の水で２〜４８時間の間、褐藻類を抽出して製造することができる。褐藻類エタノール抽出物は、褐藻類を３５〜８０％のエタノールで２０〜６０℃で２〜３６時間の間抽出して製造することができる。また、前記褐藻類メタノール抽出物は、褐藻類を３５％〜８０％のメタノールで２０〜６０℃で２〜３６時間の間抽出して製造することができる。
本発明の培地組成物に含まれる褐藻類のうちカジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）は、主に南海岸、済州島の海岸一帯及び鬱陵島の海岸一帯に生息する褐藻植物コンブ目コンブ科の多年生海藻類で、主にアワビやサザエなどの餌となり、アルギン酸やヨウ化カリウムを作る主な原料、又は食用として利用することもある。
本発明が含まれるカジメ抽出物は、水、（ａ）炭素数１〜４の無水又は含水低級アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ノーマル−プロパノール、イソ−プロパノール及びノーマル−ブタノールなど）、（ｂ）前記低級アルコールと水との混合溶媒、（ｃ）アセトン、（ｄ）酢酸エチル、（ｅ）クロロホルム、（ｆ）１，３−ブチレングリコール、（ｇ）ヘキサン、（ｈ）ジエチルエーテルなどの有機溶媒を用いて抽出することができ、好ましくは、メタノール又はエタノールと水との混合溶媒を用いて抽出することができる。混合溶媒を用いて抽出する場合、メタノール又はエタノールの含量は、５０〜８０ｖ／ｖ％が好ましい。しかし、必ずしもこれに限定されるものではない。
褐藻類抽出物から分離されたフロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）は、フロログルシノール（ｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌ）を基本構成単位とするポリフェノール系化合物である。フロロタンニンは、自然界では、海洋植物、特に褐藻類で多く発見されるが、このようなフロロタンニンは抗菌効果、抗酸化効果、肝保護活性、エラスターゼ阻害活性、ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性、心血管保護効果、抗ウイルス活性などのいろいろ有用な効果が報告されているだけである。
本発明では、特にカジメ抽出物のフロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物から、下記化学式１で表示されるバイエコール化合物、化学式２で表示されるダイエコール化合物、化学式３で表示されるフロロフコフロエコールＡ化合物、化学式４で表示されるエコール系化合物、及び化学式５で表示されるエコール系化合物を分離及び同定し、それらの誘導多能性幹細胞の発現能を確認した。前記化合物の中で、化学式１で表示されるバイエコール化合物を細胞培養培地に添加する場合、高効率で誘導多能性幹細胞を製造できることを確認した。

より具体的には、前記化学式１は、２−Ｏ−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−６，６’−バイエコール（２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌ）であり、化学式２はダイエコール（Ｄｉｅｃｋｏｌ）であり、化学式３はフロロフコフロエコール（ＰＦＦ−Ａ、Ｐｈｌｏｒｏｆｕｃｏｆｕｒｏｅｃｋｏｌ−Ａ）であり、化学式４は９７４−Ａ、化学式５は９７４−Ｂに表示され、本発明では、これらを単独又は複合抽出して、細胞培養培地に添加することができる。
本発明で使用される用語「胚性幹細胞」は、受精後の発生初期の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の内細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）から分離して培養した細胞で多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を持つ細胞を指す。本発明で使用される用語「多能性幹細胞」は、生体を構成する３つの胚葉（ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）、すなわち、内胚葉（ｅｎｄｏｄｅｒｍ）、中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍ）、外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍ）のすべてに分化することができる多能性を持つ幹細胞を指す。
本発明で使用される用語「分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」は、細胞が分裂増殖して成長する間に、互いに構造や機能が特殊化する現象、すなわち、生物の細胞、組織などがそれぞれに与えられた仕事を遂行するために形態や機能が変わっていくことをいう。
本発明で使用される用語「細胞治療剤」は、人から分離、培養及び特殊な操作を通じて製造された細胞及び組織に治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品で、細胞もしくは組織の機能を復元させるために、同種、又は異種細胞を体外で増殖、選別したり、他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為を通じて治療、診断、及び予防の目的で使用される医薬品を指す。細胞治療剤は、細胞の分化程度により大きく体細胞治療剤、幹細胞治療剤として分類され、本発明は、特に幹細胞治療剤に関するものである。
本発明の中間葉幹細胞は、哺乳動物由来の胚性幹細胞又は成体幹細胞から分離した細胞で、好ましくは、臍帯由来の中間葉幹細胞であり、より好ましくは、人体臍帯由来の中間葉幹細胞である。前記幹細胞は、人体で胎盤と胎児を連結する臍帯から採取して得ることができる。臍帯から中間葉幹細胞の採取は、様々な方法を用いて、これを行うことができ、例えば、人体から臍帯を採取し、ＤＰＢＳで血液が出なくなるまで洗浄し、洗浄した臍帯を手術用メスで刻んで３７℃でインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させて単核細胞が含有された溶液を得ることができる。
本発明で使用される用語「培地」は、糖、アミノ酸、各種栄養物質、血清、成長因子、無機質などの細胞の成長及び増殖などに不可欠な要素を含む生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における幹細胞などの細胞の培養又は分化のための混合物をいう。
当業界では、様々な培地が市販されており、人為的に製造して使用することもできる。市販されている培地には、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ Ｆ−１２、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＰＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＡｍｎｉｏＭａｘ、ＡｍｉｎｏＭａｘII ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗｙｏｒｋ、ＵＳＡ）、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ−ＸＦ Ｍｅｄｉｕｍなどがあり、人為的に製造することができる培地とともに、本発明の培地組成物に含まれる基本培地として使用することができる。
前記基本培地には、通常的に添加される血清成分（例えば、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ））及び抗生剤（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）などを添加することができる。前記基本培地に添加される血清成分又は抗生剤成分の濃度は、本発明の効果を達成できる範囲内で変化し得、好ましくは、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／mlペニシリン、５０μg／mlストレプトマイシンなどを添加することができる。
一方、前記ＤＭＥＭに添加される化合物の濃度は、本発明の効果を達成することができる範囲内で変化し得る。
また、本発明の培地は、栄養混合物（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ）をさらに含むことができる。前記栄養混合物は、細胞培養に一般的に使用される各種アミノ酸、ビタミン、無機塩などを含む混合物で、前記アミノ酸、ビタミン、無機塩などを混合して製造したり、商業的に製造された栄養混合物を使用することができる。商業的に製造された栄養混合物はＭ１９９、ＭＣＤＢ１１０、ＭＣＤＢ２０２、ＭＣＤＢ３０２などが例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明の培地は、多能性幹細胞の誘導と安定化のためにエネルギーウォーターをさらに含むことができる。前記エネルギーウォーターは０．０５〜２０ｖ／ｖ％で追加することが好ましく、より好ましくは０．１〜１０ｖ／ｖ％で追加する。
本発明の培地組成物は、多能性幹細胞の誘導に特異的な培地で、前記基本培地に褐藻類抽出物から分離されたフロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物を添加することによって達成することができ、好ましくは、全体の培地組成物基準１〜１，０００μg／ml濃度で、より好ましくは１０〜５００μg／ml濃度でカジメ抽出物から分離されたフロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物を含むことができる。
併せて、前記化学式１は、２−Ｏ−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−６，６’−バイエコール（２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌ）、化学式２はダイエコール（Ｄｉｅｃｋｏｌ）、化学式３はフロロフコフロエコール（ＰＦＦ−Ａ、Ｐｈｌｏｒｏｆｕｃｏｆｕｒｏｅｃｋｏｌ−Ａ）、化学式４は９７４−Ａ、及び化学式５は９７４−Ｂからなる群から選択された１種以上を全培地組成物基準１０〜２００μg／ml濃度で、より好ましくは２０〜１５０μg／ml濃度で使用することができる。
本発明の別の態様によると、本発明は、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）抽出物から分離されたフロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物を細胞培養培地に添加する段階；及び前記培地で中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に逆分化させる段階を含む誘導多能性幹細胞の製造方法を提供する。
この時、培養は臍帯由来単核細胞を２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌ又は２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌを含む混合を基本培地組成物に入れて湿度９５％、３７℃、５％ＣＯ２の条件の培養器で培養することができる。
本発明の一実施例では、前記条件の培養器に培養した後、５日後に浮く細胞を除去し、３〜４日ごとに培地を交換して培養した。２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌを含む培養培地組成物を用いて幹細胞を培養したとき、２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌ、の濃度により多能性幹細胞の誘導を観察した。 ＤＭＥＭ Ｆ−１２培地を対照群とし、ＤＭＥＭ Ｆ−１２に２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌを含む培地を実験群とし、濃度別に処理してヒト臍帯由来の中間葉幹細胞を培養した。
その結果、本発明の培地組成物で培養したとき、多能性幹細胞のようなコロニーを形成することを確認することができた。ヒト臍帯由来の中間葉幹細胞は、本発明の培地で１０〜１４日目に幹細胞コロニーが形成された。つまり、本発明の培養培地組成物は、ヒト臍帯由来の中間葉幹細胞から多能性幹細胞コロニーを形成したことを確認することができた（図１７〜図１９）。
本発明の別の態様によると、本発明は、前記製造方法で製造された誘導多能性幹細胞を提供する。
本発明の誘導多能性幹細胞は、胚性幹細胞と同じ分化能を有し、細胞の形状においても、胚性幹細胞とほぼ同一である。本発明の一実施例によれば、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ）及びタンパク質（ＳＳＥＡ−４）の発現有無を調査した結果、本発明によって誘導された多能性幹細胞から胚性幹細胞と同様に、前記遺伝子及びタンパク質が発現されることを確認した（図１９）。
本発明の別の態様によると、本発明は、前記方法で製造された誘導多能性幹細胞を含む細胞治療用組成物を提供する。
本発明の誘導多能性幹細胞は、胚性幹細胞と同じ多能性分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有し、本発明の一実施例によれば、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉に分化することができる多能性を有することが確認できた。
したがって、本発明の誘導多能性幹細胞は、効果的な細胞治療剤として使用することができる。
本発明の組成物は、任意の投与経路によって、具体的には、腹腔又は胸腔投与、皮下投与、静脈又は動脈の血管内投与、筋肉内投与、注射による局所投与などの方法によって投与可能である。
本発明において、前記組成物は、通常の方法に基づいて注射剤、懸濁剤、乳化剤などの形態で投与することができ、必要に応じてフロイント完全補助剤などの補助剤に懸濁されたり、又はＢＣＧのような補助剤活性を有する物質とともに投与することも可能である。前記組成物は、滅菌されたり、安定化剤、水和剤又は乳化促進剤、浸透圧調節のための塩又は緩衝剤などの補助剤及びその他治療的に有用な物質を含有することができ、通常の混合、顆粒化又はコーティング方法によって製造されうる。
本発明による細胞治療用組成物は、薬剤学的に許容可能な担体や添加剤を含有することがあるが、有効成分以外に、希釈剤（例えば、デキストロース、ソルビトール、セルロース、グリシン、ラクトース、スクロース、マンニトール）、結合剤（例えば、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、トラガカンス、ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、崩壊剤（例えば、澱粉、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩）、又は沸騰混合物及び／又は吸収剤、甘味剤、香味剤及び着色剤を含有することができる。
本発明の細胞治療用組成物は、関節炎、神経系疾患、内分泌疾患、肝疾患などに適用が可能であり、今後の人に対する臨床試験の結果によっては、人に対する同種細胞治療剤としての可能性もある。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ひたすら本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明のことである。
実施例１：フロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物及び化学式１〜５の化合物の製造
実施例１−１：カジメ抽出物からフロロタンニン分画物の製造
実験に使用された生薬試料は、済州島で購入して専門家の正確な鑑定を経た後、実験に使用した。乾燥された生薬試料１００ｇを７０％メタノール１Lに入れ、１６時間還流抽出し、ろ紙を使用してろ過した。ろ液を回転減圧蒸発器で濃縮させ、すぐに凍結乾燥してカジメ抽出物を製造した。
前記カジメ抽出物５ｇをメタノール５００μｌに溶解させた後、Ｃ４ ｒｅｓｉｎ（Ｓｅｐｉａ ｔｅｃｈ）に吸着させて回転真空濃縮機（Ｒｏｔａｒｙ Ｖａｃｕｕｍ Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を使用して、３０℃で減圧乾燥した後、小分画を分割するためＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０を用いて、溶媒別分画を実施した。 Ｇｒａｄｉｅｎｔを加え０％、２５％、５０％、７５％及び１００％の濃度を有するメタノール溶媒を準備して分画を行った。５つの小分画を分けた後、ＨＰＬＣ ｐｒｏｆｉｌｅを確認した（図１参照）。５つのうちＨＰＬＣピークが最も高い分画物を選択した。
実施例１−２：フロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物を分離、精製
実施例１−１で得られた分画物をＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８機器、１０μｍ、２１．２×２５０ｍｍ）を使用して流速１０ｍｌ／ｍｉｎ、ＵＶ２４３ｎｍで０．０２％ＴＦＡを含むアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）及び水（ｗａｔｅｒ）の溶媒を使用して、２０％アセトニトリル１０分、２０〜５５％アセトニトリル４０分、５５〜１００％アセトニトリル１０分、計６０分の溶媒ｇｒａｄｉｅｎｔ条件を持つＣ−１８逆相ＨＰＬＣに適用してｐｅａｋ Ｃ（ＲＴ２５ｍｉｎ）、Ｅ（ＲＴ３３ｍｉｎ）、Ｇ（ＲＴ３７．５ｍｉｎ）、Ｈ（ＲＴ３８ｍｉｎ）、Ｉ（ＲＴ３８．５ｍｉｎ）を分離し、ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ０分からｐｅａｋ Ｃの間をＢ、ｐｅａｋ Ｃとｐｅａｋ Ｅの間をＤ、ｐｅａｋ ＥとＧの間をＦと命名しｐｅａｋ Ｉ以後にｆｒａｃｔｉｏｎはＪと命名した。
各ｐｅａｋの精製は、Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８機器、１０μｍ、２１．２×２５０ｍｍ）を使用し、流速４ｍｌ／ｍｉｎ、ＵＶ２３０ｎｍで０．０２％ＴＦＡを含むアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）やメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）そして水（ｗａｔｅｒ）の溶媒を使用し、それぞれｉｓｏｃｒａｔｉｃ条件で精製を実施した。アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）２８％ｉｓｏｃｒａｔｉｃ条件でｐｅａｋ Ｅ（ＲＴ１０ｍｉｎ）、ｐｅａｋ Ｇ（ＲＴ２２ｍｉｎ）、ｐｅａｋ Ｈ（ＲＴ２３ｍｉｎ）、ｐｅａｋ Ｉ（ＲＴ２７ｍｉｎ）でそれぞれ精製を行った。
しかし、ｐｅａｋ Ｃは精製後の分析結果、物質が２つ混ざっていることを確認し、メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）２６％ｉｓｏｃｒａｔｉｃ条件で２つの物質をＣ−１（ＲＴ１０ｍｉｎ）、Ｃ−２（ＲＴ１３．５ｍｉｎ）再分離した。
実施例１−３：ポリフェノール系化合物の構造解析
実施例１−２で精製された化合物をＨＰＬＣ−ＭＳ分析器（Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍａｓｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を使用して分子量及び分子式を決定し、化合物の構造同定は、核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）を通じて１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを分析することにより、行われた。
その結果、化学式１は、２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌ、化学式２はＤｉｅｃｋｏｌ、化学式３はＰｈｌｏｒｏｆｕｃｏｆｕｒｏｅｃｋｏｌ−Ａ、化学式４は９７４−Ａ、化学式５は９７４−Ｂに同定した。分離したポリフェノール系化合物の構造は、下記表１に示し、各化合物の構造的特徴は、下記の通りである。
［表１］
［化学式１］２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌ
１）分子量：８６６．６５
２）分子式：Ｃ４２Ｈ２６Ｏ２１
３）１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ９．２８、９．２５、９．１４、９．０９、９．０６、９．０４、８．９５、８．６６、８．６１、６．０９、６．０７、６．０５、５．９１（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．８４、５．８０、δ、５．７５（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）。
４）１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ｄｍｓｏ）δ１６０．６、１６０．５、１５８．９、１５８．９、１５４．８、１５１．５、１５１．４、１５１．２、１４７．４、１４６．５、１４４．６、１４４．６、１４１．７、１４１．６、１４１．５、１４１．５、１３７．４、１３７．４、１２５．０、１２３．９、１２３．０、１２３．０、１２２．８、１２２．３、１２２．３、９９．９、９９．８、９８．１、９８．１、９８．０、９６．２、９６．２、９６．１、９５．０、９４．３、９４．１。
図２は、前記２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌのＭａｓｓスペクトルを示す。また、図３と図４は、それぞれ前記２−Ｏ−（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−６，６’−ｂｉｅｃｋｏｌの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示し、各ピーク（ｐｅａｋ）に記載された数字は、図３及び４の化学式に記載された数字に対応される。
［化学式２］ Ｄｉｅｃｋｏｌ
１）分子量：７４２．０８
２）分子式：Ｃ３６Ｈ２２Ｏ１８
３）１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ６．１６（ｓ、１Ｈ）、６．１４（ｓ、１Ｈ）、６．１０（ｓ、２Ｈ）、６．０７（ｄ、Ｊ＝２．９Ｈｚ、１Ｈ）、６．０６（ｄ、Ｊ＝２．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．９９（ｄ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．９６（ｄ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）。
４）１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ１６２．７０、１６０．９５、１６０．９１、１５８．６３、１５６．８２、１５５．３４、１５３．２２、１４８．１７、１４８．１３、１４７．９７、１４７．７５、１４５．１１、１４４．９５、１４４．２２、１４４．１３、１３９．４６、１３９．２９、１２７．２２、１２６．９８、１２６．４２、１２６．３７、１２５．６６、１２５．４０、１２５．３４、１００．６５、１００．５１、１００．２５、１００．１４、９８．４４、９６．９９、９６．６３、９６．５５、９６．１５。
図５は、前記ＤｉｅｃｋｏｌのＭａｓｓスペクトルを示す。また、図６と７は、それぞれ前記Ｄｉｅｃｋｏｌの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示し、各ピーク（ｐｅａｋ）に記載された数字は、図６及び７の化学式に記載された数字に対応される。
［化学式３］ｐｈｌｏｒｏｆｕｃｏｆｕｒｏｅｃｋｏｌ−Ａ
１）分子量：６０２．０７
２）分子式：Ｃ３０Ｈ１８Ｏ１４
３）１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ６．６３（ｓ、１Ｈ）、６．４０（ｓ、１Ｈ）、６．２６（ｓ、１Ｈ）、５．９６（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、２Ｈ）、５．９５５．９３（ｔ.ｌｉｋｅ、１Ｈ）、５．９２（ｔ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．８８（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、２Ｈ）。
４）１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ１６１．８７、１６１．８４、１６０．１８、１５３．１５、１５１．７３、１５１．１５、１４８．３１、１４８．２１、１４５．９７、１４３．９２、１３８．３７、１３５．２９、１２８．０４、１２４．９４、１２４．６４、１２２．２７、１０５．２９、９９．９１、９９．２８、９７．６９ 、９７．５７、９６．１８、９５．３５、９５．２９。
図８は、前記ＰＦＦ−ａ（Ｐｈｌｏｒｏｆｕｃｏｆｕｒｏｅｃｋｏｌ−Ａ）のＭａｓｓスペクトルを示す。また、図９と１０は、それぞれ前記ＰＦＦ−ａ（Ｐｈｌｏｒｏｆｕｃｏｆｕｒｏｅｃｋｏｌ−Ａ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示し、各ピーク（ｐｅａｋ）に記載された数字は、図９及び１０の化学式に記載された数字に対応される。
［化学式４］９７４−Ａ
１）分子量：９７４．７３
２）分子式：Ｃ４８Ｈ３０Ｏ２３
３）１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ６．６３（ｓ、１Ｈ）、６．４０（ｓ、１Ｈ）、６．２５（ｓ、１Ｈ）、６．２０
（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．１８（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．１２（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ、６．０４（ｄ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．９２（ｓ、２Ｈ）、５．９２５．９１（ｍ、１Ｈ）、５．９０（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．８７（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、２Ｈ）、５．７４（ｄ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）。
４）１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ１６３．１６、１６２．８８、１６１．８３、１６０．１６、１５９．６４、１５９．５４、１５９．１４、１５９．０９、１５６．５５、１５６．４９、１５６．４８、１５３．８５、１５３．３５、１５２．２６、１５１．９２、１５１．７７、１５１．１８、１４８．２１、１４７．７８、１４５．８２ 、１４４．３１、１３８．１５、１３５．１６、１２７．６２、１２４．９３、１２４．９０、１２４．２５、１２４．２２、１２２．２７、１１９．４０、１１８．１５、１０５．２２、１０５．２１、１０２．６２、１０２．４４、９９．９１、９９．２４、９８．６１、９８．３２、９７．６８、９７．５７、９６．３４、９６．１１、９５．２８、９５．２０、９４．３７、９４．１８。
図１１は、前記９７４−ＡのＭａｓｓスペクトルを示す。また、図１２と１３は、それぞれ前記９７４−Ａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示し、各ピーク（ｐｅａｋ）に記載された数字は、図１２及び１３の化学式に記載された数字に対応される。
［化学式５］９７４−Ｂ
１）分子量：９４７．７３
２）分子式：Ｃ４８Ｈ３０Ｏ２３
３）１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ６．６９（ｓ、１Ｈ）、６．３８（ｓ、１Ｈ）、６．２１（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．１９（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．１７ （ｓ、１Ｈ）、６．１４（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．０５（ｄ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．００（ｓ、２Ｈ）、５．９１（ｔ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．８９ （ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．８７（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、２Ｈ）、５．７６（ｄ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）。
４）１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ１６１．８５、１６０．１６、１５９．６４、１５９．５３、１５９．１９、１５８．９７、１５７．４５、１５６．８１、１５６．６３、１５６．４７、１５３．７９、１５２．６５、１５２．２２、１５１．９５、１５１．６６、１５０．８９、１４８．３２、１４７．０３、１４３．８６、１４２．８３ 、１３８．０７、１３７．９５、１２７．３５、１２５．２３、１２４．６５、１２４．０１、１２３．９３、１２２．１１、１０９．８５、１０６．３３、１０２．６８、１０２．４９、９９．６２、９９．４７、９８．６１、９８．３２、９７．６１、９７．５６、９６．４５、９５．２８、９５．１３、９４．２３、９２．８３。
図１４は、前記９７４−ＢのＭａｓｓスペクトルを示す。また、図１５と１６は、それぞれ前記９７４−Ｂの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示し、各ピーク（ｐｅａｋ）に記載された数字は、図１５及び１６の化学式に記載された数字に対応される。
実施例２：人体臍帯における中間葉幹細胞の分離及び培養
実施例２−１：人体臍帯採取
臍帯組織は出産直後すぐに収集される。試料が実験室に移される前に、まずきれいに洗った直後に移送用培地（５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン、５０μ/ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入））が添加されたＦ−１２培地が入っている５００ｍｌの滅菌ガラスびんに移される。実験室では、滅菌状態下でｃｌａｓｓ １００のフローフードで幹細胞の抽出が行われる。試料は、まず滅菌ステンレス鋼の容器に移される。ＰＢＳは、数回洗浄した後、臍帯組織試料は、その後２cmの長さに切って１０cm直径の細胞培養皿に移され、ここでさらに洗浄及び７０％エタノールで抗感染処理し、抗生剤の混合物（５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン、５０μ/ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入））が添加されたＰＢＳで前記溶液がきれいになるまで数回洗浄する。
実施例２−２：人体臍帯における幹細胞分離及び培養
臍帯の血管及び他の内部要素からワルトンゼリー（臍帯の基質）を分離するために臍帯組織の切開がまず行われる。血管を除去した後、分離されたワルトンゼリーは、細胞の抽出のために小さな断片（０．５cm×０．５cm）のサイズにカットされる。外植（ｅｘｐｌａｎｔ）は、上皮幹細胞又は中間葉幹細胞の抽出に適した細胞培養条件が揃っているそれぞれ異なる組織培養皿に臍帯ワルトンゼリーの断片を入れて実行される。
中間葉細胞の分離／培養のために、前記の外植された組織は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）が添加された５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、５０μ/ｍｌストレプトマイシンに浸され二酸化炭素細胞培養器で３７℃に維持された。培地は３日又は４日ごとに交換された。細胞の成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）は、光学顕微鏡でモニタリングされた。伸長する細胞は、さらなる拡張及び冷凍保管（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ利用）のためにトリプシン処理（０．１２５％トリプシン／０．０５％ ＥＤＴＡ）した。
前記培地は、３日又は４日ごとに交換された。外植された組織からの細胞の伸長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）は、光学顕微鏡でモニタリングされた。
中間葉幹細胞の抽出のために、細胞のペレットは、培地ＤＭＥＭ Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、５０μ/ｍｌストレプトマイシンに再懸濁及びカウントされ、１０cm組織培養皿に１×１０６細胞／皿の密度で接種された。前記培地は、３日又は４日ごとに交換された。細胞の成長（ｇｒｏｗｔｈ）及びクローン形成は、光学顕微鏡でモニタリングされた。約９０％の細胞数（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で、細胞は前記で説明したように、サブ−培養（ｓｕｂ−ｃｕｌｔｕｒｅ）された。
実験例１：中間葉幹細胞から多能性幹細胞誘導
実験例１−１：フロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物の濃度によるヒト由来中間葉幹細胞の多能性幹細胞の製造
実施例１−１で製造されたフロロタンニン分画物の濃度によるヒト臍帯由来幹細胞から多能性幹細胞の誘導能力を測定するための実験を実施した。対照群は、ＭＳＣの専用培地でＤＭＥＭ Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、５０μ/ｍｌストレプトマイシンを基本培地として使用し（Ｎｏｒｍａｌ）、実験群は、継代培養を第三の人間臍帯由来中間葉幹細胞を使用して培地に１μ/ｍｌ、２０μ/ｍｌ、５０μ/ｍｌ、１００μ/ｍｌ、４００μ/ｍｌ、８００μ/ｍｌ、１０００μ/ｍｌ濃度のフロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物とエネルギーウォーター（ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ３、Ｆｅ２Ｏ３、ＣａＯ、Ｎａ２Ｏ、Ｋ２Ｏ、ＬｉＯを含有する精製脱イオン水、エスティーシーナラ）０．１ｖ／ｖ％を添加した。ヒト臍帯由来中間葉幹細胞を分離して洗浄された単核球細胞を６ウェルプレート（ｄｉｓｈ）に１×１０４個の細胞を接種して、３７℃、５％ＣＯ２を維持して培養した。
本発明の方法によって誘導された多能性幹細胞に対して、胚性幹細胞の特異タンパク質であるＳＳＥＡ−４（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ４）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＰ）、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２の発現有無を、これに対する抗体を使用して免疫化学的染色法を使用して、タンパク質発現の有無を分析した。染色プロセスは、まず４％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を利用して細胞を固定した後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ溶液でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）をした。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ−４に対する１次抗体を処理して、４℃で１８時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄をし、１次抗体に対する蛍光（ＦＩＴＣ）が付いた２次抗体を処理して、室温で１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄をした後、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して発現の有無を分析した。ＢＦはｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄを意味し、第二の図は、それぞれのタンパク質の発現に対する染色結果を意味し、第三の図は、この２つの図を合わせて示している（図１９Ａ、１９Ｂ、２０Ａ、及び２０Ｂ）。ＡＰ染色は、細胞透過性Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ蛍光基質Ｄｙｅで染色を実施し、ＡＰ蛍光ＤｙｅをＤＭＥＭ Ｆ−１２培養液に希釈してコロニーに処理した後、２０〜３０分間反応させてＤＭＥＭ Ｆ−１２培養液で２回洗浄し、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して発現有無を分析し、その結果を図１７に示した。
その結果、実験群では、フロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物の濃度が１０〜５００μ/ｍｌの場合にのみ、１０日後にコロニーが形成されることが観察され（図１７）、多能性幹細胞特異的マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ−４、ＡＰがコロニーでのみ染色されて多能性幹細胞であることを確認した（図１８及び図１９）。
実験例１−２：フロロタンニン（ｐｈｌｏｒｏｔａｎｎｉｎ）分画物の中の化合物濃度によるヒト由来中間葉幹細胞の多能性幹細胞の製造
実施例１−２で分離された化合物のうち化合物１の濃度によるヒト臍帯由来幹細胞から多能性幹細胞の誘導能力を測定するための試験を実施した。対照群は、ＭＳＣの専用培地でＤＭＥＭ Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、５０μ/ｍｌストレプトマイシンを基本培地として使用し（Ｎｏｒｍａｌ）、実験群は、継代培養を第三のヒト臍帯由来中間葉幹細胞を使用して培地に化学式１で表示されるバイエコール化合物１μｇ/ｍｌ、２０μｇ/ｍｌ、５０μｇ/ｍｌ、１００μｇ/ｍｌ、４００μｇ/ｍｌ、８００μｇ/ｍｌ、１０００ μｇ/ｍｌの濃度とエネルギーウォーター（ＳｉＯ ２ 、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ３、Ｆｅ２Ｏ３、ＣａＯ、Ｎａ２Ｏ、Ｋ２Ｏ、ＬｉＯを含有する精製脱イオン水、エスティーシーナラ）０．１ｖ／ｖ％を添加した。ヒト臍帯由来中間葉幹細胞を分離して洗浄された単核球細胞を６ウェルプレート（ｄｉｓｈ）に１ ×１０４個の細胞を接種して、３７℃、５％ＣＯ２を維持して培養した。
前記で誘導された多能性幹細胞に対して胚性幹細胞の特異タンパク質であるＳＳＥＡ−４（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ４）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、の発現有無を、これに対する抗体を使用して、免疫化学的染色法を使用してタンパク質発現の有無を分析した。染色プロセスは、まず４％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を利用して細胞を固定した後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ溶液でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）をした。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ−４に対する１次抗体を処理して、４℃で１８時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄をし、１次抗体に対する蛍光（ＦＩＴＣ）が付いた２次抗体を処理して、室温で１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄をした後、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して発現の有無を分析し、その結果を図２０に示した。ＢＦはｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄを意味し、第二の図は、それぞれのタンパク質の発現に対する染色結果を意味し、第三の図は、この２つの図を合わせて示している（図２１Ａ、２１Ｂ、２２Ａ、及び２２Ｂ）。
ＡＰ染色は、細胞透過性Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ蛍光基質Ｄｙｅで染色を実施しＡＰ蛍光ＤｙｅをＤＭＥＭ Ｆ−１２培養液に希釈してコロニーに処理した後、２０〜３０分間反応させＤＭＥＭ Ｆ−１２培養液で２回洗浄し、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して発現の有無を分析し、その結果を図２２Ｂに示した。
その結果、実験群では、化学式１で示したバイエコール化合物の濃度が５０μｇ/ｍｌ及び１００μｇ/ｍｌの場合にのみ、１４日後にコロニーが形成されることが観察され（図２０）、多能性幹細胞特異的マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ−４、ＡＰがコロニーでのみ染色されて多能性幹細胞であることを確認した（図２１及び２２）。

Claims (9)

  1. フロロタンニン分画物を含む、中間葉幹細胞を誘導多能性幹細胞に逆分化するための培地組成物。
  2. 前記フロロタンニン分画物は、次の化学式１で示したバイエコール化合物又はその塩であることを特徴とする、請求項１に記載の培地組成物：
  3. 前記フロロタンニン分画物は、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ヘラヤハズ（Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒｉｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ Ｏｋａｍｕｒａ）、アミジグサ（Ｄｉｃｔｙｏｔａ ｄｉｃｈｏｔｏｍａ Ｌａｍｏｕｒｏｕｘ）、アカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ Ｃ． Ａｇａｒｄｈ）、ヤツマタモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ． Ａｇａｒｄｈ）及びイシゲ（Ｉｓｈｉｇｅ ｏｋａｍｕｒａｅ Ｙｅｎｄｏ）からなる褐藻類群から選択された１種の褐藻類から抽出及び分離したもの、又は人工的に合成されたものである、請求項１に記載の培地組成物。
  4. 前記フロロタンニン分画物は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、α −ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ'ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭａｃＣｏｙ'ｓ ５Ａ培地、ＡｍｉｎｏＭａｘII ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ及びＭｅｓｅｎＣｕｌｔ−ＸＦ Ｍｅｄｉｕｍで構成された群から選択される培地に含まれることを特徴とする請求項１に記載の培地組成物。
  5. 前記フロロタンニン分画物は、培地組成物基準１０〜５００μｇ/ｍｌ含まれることを特徴とする請求項１に記載の培地組成物。
  6. 前記培地組成物は、エネルギーウォーター１〜１０ｖ／ｖ％をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の培地組成物。
  7. フロロタンニン分画物を細胞培養培地に添加する段階；及び前記培地で中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に逆分化させる段階を含む誘導多能性幹細胞の製造方法。
  8. 前記フロロタンニン分画物は、次の化学式１で示したバイエコール化合物又はその塩であることを特徴とする、請求項７に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
  9. 前記フロロタンニン分画物は、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ヘラヤハズ（Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒｉｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ Ｏｋａｍｕｒａ）、アミジグサ（Ｄｉｃｔｙｏｔａ ｄｉｃｈｏｔｏｍａ Ｌａｍｏｕｒｏｕｘ）、アカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ Ｃ． Ａｇａｒｄｈ）、ヤツマタモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ． Ａｇａｒｄｈ）及びイシゲ（Ｉｓｈｉｇｅ ｏｋａｍｕｒａｅ Ｙｅｎｄｏ）からなる群から選択された１種の褐藻類から抽出及び分離したもの、又は人工的に合成されたものである、請求項７に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
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