ES2791007T3 - Composición de tinta para impresión por inyección - Google Patents

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De Castro Laia Francesch
Gomez Salvador Borros
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Abril Laia Vilar
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Abstract

La composición de la invención comprende: (a) polietilenglicol con un peso molecular que está comprendido entre 20000 (20K) y 50000 (50K), en una concentración comprendida entre el 0.5 y el 15 % en peso/volumen; (b) un tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n está comprendido entre 5 y 40, y dicho tensioactivo dicho tensioactivo estando en una concentración comprendida entre el 0.1 y el 2.0% en volumen/volumen; y (c) uno o más ingredientes seleccionados de entre un vehículo líquido, un aglutinante y un aditivo apto para impresión. La composición de la invención se usa en la impresión de moléculas con un interés biológico. Formula (I)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición de tinta para impresión por inyección
La presente invención está relacionada con la impresión por inyección y la biología molecular. En particular, la presente invención se refiere a una composición útil en la impresión, mediante inyección, de moléculas de interés biológico, tales como aminoácidos, péptidos y/o proteínas, en un sustrato.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La impresión por inyección de tinta (en inglés “inkjet printing”) es un método de impresión ampliamente utilizado en la impresión de textos e imágenes en superficies porosas.
En los últimos años, la tecnología de impresión por inyección se ha aplicado al campo de la biología, con el fin de desarrollar arrays de ácido nucleico o proteína.
Los chips de genes se generan, normalmente, usando plumillas de punta partida con las que se recoge una gota de solución diluida y se deposita en una lámina pretratada, con una resolución de aproximadamente 100 Dm. Así, el DNA se une covalentemente al sustrato. También se han descrito sistemas robóticos que permiten imprimir una librería de DNA en una serie de láminas. Adicionalmente, se han descrito impresoras convencionales para depositar DNA en membranas a 300 dpi, usando impresión de tipo “bubble-jet", sin aparente degradación del DNA, para imprimirlas en vidrio, en un array circular de antígenos en un CD de policarbonato para inmunoensayos, y en un array enzimático sobre filtros de papel. Una alternativa al depósito de oligonucléotidos es la impresión de los reactivos para la síntesis de un DNA de interés in situ, en cada gota que cae sobre la diapositiva. Para cumplir con los requisitos de química combinatoria, se ha desarrollado una impresora de inyección de válvula controlada que permite aplicar 48 reactivos diferentes de depósitos diferentes.
La tecnología de impresión por inyección también se ha aplicado en la fabricación de biosensores.
Los arrays de proteína son más problemáticos que los de ácido nucleico ya que el proceso de impresión y unión no debe causar una desnaturalización y pérdida de la función de la proteína.
Existen otras aplicaciones adicionales en la ingeniería de tejidos, así como en la modificación de las superficies poliméricas, lo que permite o evita la unión local de células. También se ha demostrado la impresión por inyección directa de células en suspensión.
Sin embargo, tal y como se ha indicado más arriba, una de las principales limitaciones del uso de la impresión por inyección aplicado al sector de la biología molecular es evitar la desnaturalización/pérdida de función del componente a imprimir (ya sea ácido nucleico, proteína, célula, etc).
Por otro lado, se debe tener en consideración que las composiciones destinadas a la impresión han de cumplir con unos parámetros de viscosidad y tensión superficial. La viscosidad de la tinta debe ser lo suficientemente baja como para dejar que el canal por el que se inyecta se rellene en unos 100 Ds. La tensión superficial, en cambio, debe ser lo suficientemente alta como para mantener la tinta en la boquilla sin gotear. Un aspecto principal en el diseño de una tinta es el problema de “la primera gota”.
Varias publicaciones han descrito composiciones de tinta con propiedades de impresión apropiadas. El documento JP2001139865 describe que las composiciones de tinta a base de agua que comprenden una quinacridona pueden mostrar una excelente estabilidad de almacenamiento, resistencia a la luz y al calor, y dar una imagen en color que tiene un tono de color claro. El documento JP2004195906 describe un método para la grabación por inyección de tinta que elimina manchas, especialmente elimina manchas entre colores mientras se satisface la impresión de alta velocidad, alta impermeabilidad y alta velocidad. El documento EP885940 describe una tinta de inyección acuosa que comprende agua, un colorante seleccionado de un tinte o un pigmento y un diol, así como un proceso de impresión por inyección de tinta multicolor que comprende (1) imprimir al menos una de las tintas de inyección de tinta acuosa que comprende el derivado diol anterior sobre un sustrato de impresión en cualquier secuencia deseada por un cabezal de impresión en un método de paso único o múltiple de acuerdo con señales de datos digitales y (2) opcionalmente aplicar calor al sustrato de impresión y a las tintas de las imágenes en cualquier etapa de dicho proceso de impresión por inyección de tinta incluyendo antes, durante y después de la impresión, así como sus combinaciones. Sin embargo, estas publicaciones no abordan el problema adicional de lograr la impresión eficiente de una biomolécula en un soporte particular.
La impresión de biomoléculas también se ha abordado en varias publicaciones. Adam B. et al., (Adam B. et al., “Molecular printing”, Nature Chemistry, vol. 1 (5), páginas 353-358) es una perspectiva sobre la evolución y las direcciones futuras de la impresión de moléculas. El documento WO2010135834 describe una composición sol-gel para imprimir biomoléculas. Pero del contenido de este documento está claro que dicha composición no es una composición de tinta.
Por lo tanto, a pesar de los avances realizados en la impresión por inyección aplicada al sector de la biología molecular, existe la necesidad de encontrar una composición que presente unos parámetros de tensión superficial y viscosidad adecuados para su uso en impresión, sin que se vea afectada negativamente ni la estabilidad de la molécula que se desea imprimir ni su unión al sustrato en el que se aplica.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores de la presente invención han desarrollado una composición de tinta apta para su uso en impresión y que soluciona los problemas referidos más arriba en el estado de la técnica.
Así, en un primer aspecto la presente invención proporciona una composición de tinta que comprende:
(a) polietilenglicol con un peso molecular que está comprendido entre 20000 (20K) y 50000 (50K), en una concentración comprendida entre el 0.5 y el 15 % en peso/volumen;
(b) un tensioactivo no iónico de fórmula general (I)
Figure imgf000003_0001
donde
n está comprendido entre 5 y 40
dicho tensioactivo estando en una concentración comprendida entre el 0.1 y el 2.0% en volumen/volumen; y
(c) uno o más ingredientes seleccionados de entre un vehículo líquido, un aglutinante y un aditivo apto para impresión.
En particular, los inventores han descubierto que una composición que incluye un polietilenglicol con un peso molecular en el rango entre 20-50K, en el rango de concentración comprendido entre el 0.5 y el 15 % en peso/volumen, permite: (a) ajustar la viscosidad a unos valores 10-13 mPas; (b) obtener una gota homogénea, siendo esférica (tal y como se observa en la FIG. 1); (c) incrementar la cinética del secado de la gota, y (d) minimizar efectos indeseables como por ejemplo el “coffee-ring effecf (ver FIG. 1 y FIG. 2). Este efecto es consecuencia de la evaporación de solvente en una gota y el desplazamiento hacia los bordes de las partículas del material funcional dando lugar a un anillo en lugar de una capa homogénea de tinta.
En una realización del primer aspecto, la presente invención proporciona una composición de tinta que comprende: (a) polietilenglicol con un peso molecular que está comprendido entre 20000 (20K) y 50000 (50K), en una concentración comprendida entre el 0.5 y el 15 % en peso/volumen;
(b) un tensioactivo no iónico de fórmula general (I)
Figure imgf000003_0002
donde
n está comprendido entre 5 y 40
dicho tensioactivo estando en una concentración comprendida entre el 0.1 y el 1.0% en volumen/volumen; y
(c) uno o más ingredientes seleccionados de entre un vehículo líquido, un aglutinante y un aditivo apto para impresión.
Adicionalmente, los inventores de la presente invención han descubierto que incorporando un tensioactivo no iónico de fórmula (I) en un rango de concentración comprendido entre el 0.1 y el 1.0 % volumen/volumen, se consigue ajustar la tensión superficial a unos 35 mN/m, la ideal para impresión por inyección. Además, tal y como se muestra más abajo, cuando la concentración del tensioactivo de fórmula general (I) supera el 1% en volumen, la calidad de la tinta empeora, generándose una especie de espuma que dificulta la formación adecuada de la gota para su inyección a través del orificio del inyector.
Por otro lado, tal y como se muestra más abajo, el efecto asociado a la inclusión del tensioactivo no iónico de fórmula general (I) no se observa con otro tensioactivo ampliamente utilizado en la formulación de composiciones para impresión, como el Tween 80 el cual, para los mismos valores de concentración, da lugar a una tinta con valores de tensión superficial por encima de 45 mN/m, es decir, fuera del rango óptimo para la impresión por inyección. Así, en el caso de usar Tween 80, sería necesaria la incorporación de otros tensioactivos para alcanzar los valores de tensión superficial adecuados para impresión, lo cual encarecería la preparación de la composición y, adicionalmente, pondría en peligro la estabilidad así como la eficacia de la unión de la molécula que se desea imprimir al sustrato.
Ventajosamente, con la inclusión de un tensioactivo no iónico de fórmula general (I) no se requieren otros tensioactivos para ajustar la tensión superficial de la composición, lo cual supone un gran avance respecto al uso del Tween 80.
Como se ha expuesto más arriba, en el campo de la impresión por inyección de moléculas con interés en el campo biológico, resulta crítico conseguir una composición que sea por un lado apta para impresión, lo que significa que ha de tener unos parámetros adecuados de tensión superficial y viscosidad, y, por otro lado, que respete tanto la estabilidad/actividad de la molécula que se desea imprimir como su anclaje al sustrato sobre el cual tiene lugar la impresión de la composición de la invención.
En este sentido, los inventores de la presente invención han comprobado que con una composición como la del primer aspecto, que incluye PEG en un determinado rango de peso molecular y concentración, así como el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) a una determinada concentración, se obtiene una composición apta para impresión por inyección sin que se vea afectada negativamente ni la estabilidad ni la unión de la molécula que se desea imprimir sobre un sustrato. En particular, los datos experimentales proporcionados más abajo ilustran cómo el marcador fluoresceína-5-tiosemicarbazida (ampliamente utilizando en el campo de la biología como marcador de biomoléculas en el desarrollo de biosensores) queda perfectamente anclado al sustrato funcionalizado (ver FIG. 3). Además, mediante microscopia de fluorescencia se comprueba que se mantiene la actividad fluorescente del marcador, una vez impreso en el sustrato, sin degradación apreciable de su intensidad (ver FIG. 3). Esto es indicativo de que la composición de la invención no afecta negativamente a la actividad de la molécula a ser impresa en el sustrato ni dificulta ni obstaculiza el anclaje de la misma al sustrato.
Otro aspecto destacable de la composición objeto de la presente invención es que no genera agregados, lo que confiere un perfil idóneo a la composición de la invención para ser usada en impresión.
Por todo lo anterior, la composición objeto de la presente invención supone un gran avance en la impresión por inyección aplicado al campo de la biotecnología.
En la presente invención, el término “polietilenglicol” (PEG), también conocido como óxido de polietileno o polioxietileno (POE), es un poliéter formado por un monómero de fórmula (II):
Figure imgf000004_0001
Tradicionalmente, el grado de polimerización se caracteriza por un valor K, que es función de la viscosidad. A mayor grado de polimerización, mayor valor de K. En una realización, el PEG tiene un peso molecular entre 25000 (25K) y 50000 (50K). En otra realización, el PEG tiene un peso molecular entre 20000 (20K) y 40000 (40K). En otra realización, el PEG tiene un peso molecular seleccionado del grupo que consiste en 20000 (20K), 25000 (25K), 35000 (35K), y 40000 (40K). Preferiblemente, el peso molecular del polietilenglicol es de 35000 (35K)
En otra realización, el PEG se encuentra en el rango de concentración peso/volumen comprendido entre el 5 y el 10%. En otra realización, el PEG se encuentra en una concentración peso/volumen entre 6 y 8%. En otra realización, el PEG se encuentra en una concentración peso/volumen del 7.5%.
En otra realización, el PEG es uno de peso molecular 35K y se encuentra en el rango de concentración peso/volumen comprendido entre el 0.5 y el 15%. En otra realización, el PEG es uno de peso molecular 35K y se encuentra en el rango de concentración peso/volumen comprendido entre el 5 y el 10%. En otra realización, el PEG es uno de peso molecular 35K y se encuentra en un rango de concentración peso/volumen comprendido entre el 6 y el 8 %. Preferiblemente, el PEG tiene un peso molecular de 35K y se encuentra a una concentración peso/volumen del 7.5% p/v.
En la presente invención, el tensioactivo no iónico de tipo alcohol alquilarilpoliéter de fórmula general (I) es también conocido comercialmente como Triton X ® (marca registrada de Union Carbide Co., Inc.). A modo ilustrativo y no limitativo, ejemplos de la serie Triton X son:
Figure imgf000005_0001
En una realización preferida, el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 (también conocido comercialmente como Triton X-100).
En otra realización, el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) está a una concentración volumen/volumen comprendida entre 0.5 y 2.0% v/v. En otra realización, el tensioactivo está a una concentración comprendida entre 0.5 y 1.5% v/v. Preferiblemente, el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) está a una concentración del 1.0 % v/v.
En otra realización, el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) está a una concentración volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 0.5% v/v. Preferiblemente, el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) está a una concentración del 0.1 % v/v.
En otra realización, el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 y se encuentra a una concentración volumen/volumen comprendida entre el 0.1 y el 2.0%. En otra realización, el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 y se encuentra en una concentración volumen/volumen comprendida entre el 0.5 y el 1.5%. En otra realización, el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 y se encuentra a una concentración volumen/volumen del 1.0%.
En otra realización, el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 y se encuentra a una concentración volumen/volumen comprendida entre el 0.1 y el 1.0%. En otra realización, el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 y se encuentra en una concentración volumen/volumen comprendida entre el 0.1 y el 0.5%. En otra realización, el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 y se encuentra a una concentración volumen/volumen del 0.1%.
En la presente invención la expresión “concentración en % peso/volumen (% p/v)” se calcula dividiendo los gramos de polietilenglicol añadidos respecto al volumen total de composición (expresados en mililitros) y multiplicando el valor resultante por 100.
En la presente invención la expresión “concentración en % volumen/volumen (% v/v)” se calcula dividiendo el volumen de tensioactivo no iónico respecto al volumen total de composición, estando expresados en las mismas unidades tanto el volumen de tensioactivo como el volumen total de composición, y multiplicando el valor resultante por 100.
En una realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende un PEG con un peso molecular de 35000 (35K) y el tensioactivo no iónico es uno donde n está comprendido entre 9 y 10.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 0.5 y 15%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % v/v comprendida entre 0.1 y 2.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 0.5 y 15%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % v/v comprendida entre 0.1 y 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 5 y 10%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 2.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 5 y 10%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 6 y 8%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 2.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 6 y 8%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración del 7.5% peso/volumen; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 2.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración del 7.5% peso/volumen; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 0.5 y 15%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % v/v comprendida entre 0.5 y 1.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 0.5 y 15%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % v/v comprendida entre 0.1 y 0.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 5 y 10%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.5 y 1.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 5 y 10%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 0.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 6 y 8%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.5 y 1.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 6 y 8%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 0.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración del 7,5% peso/volumen; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.5 y 1.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración del 7,5% peso/volumen; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 0.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 0.5 y 15%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 0.5 y 15%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 0.1%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 5 y 10%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 5 y 10%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 0.1%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 6 y 8%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 6 y 8%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 0.1%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen del 7,5%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen del 7,5%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 0.1%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención es una que comprende:
(a) polietilenglicol con un peso molecular de 20000, a una concentración en % peso/volumen del 10%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%; o alternativamente comprende:
(b) polietilenglicol con un peso molecular de 35000, a una concentración en % peso/volumen del 7.5%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%, o alternativamente comprende:
(c) polietilenglicol con un peso molecular de 40000, a una concentración en % peso/volumen del 5%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención es una que comprende:
(d) polietilenglicol con un peso molecular de 20000, a una concentración en % peso/volumen del 10%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 0.1%; o alternativamente comprende:
(e) polietilenglicol con un peso molecular de 35000, a una concentración en % peso/volumen del 7.5%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 0.1%, o alternativamente comprende:
(f) polietilenglicol con un peso molecular de 40000, a una concentración en % peso/volumen del 5%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 0.1%.
En una realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende una molécula seleccionada del grupo que consiste en biomolécula, un marcador de biomolécula y un marcador de biomolécula conjugado a una biomolécula.
En una realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende una biomolécula.
En otra realización, la biomolécula se encuentra en una concentración comprendida entre 0.1 y 1 mg de biomolécula por mL de composición.
En la presente invención el término “biomolécula” hace referencia a cualquier molécula generadas por un organismo vivo tales como: proteínas, vitaminas, ácidos nucleicos y carbohidratos, entre otras. Estas biomoléculas se pueden obtener aislándolas del organismo que las produce o bien pueden ser sintetizadas a escala de laboratorio mediante técnicas bien conocidas para el experto en la materia. Las biomoléculas referidas en la presente invención, adicionalmente, son utilizables en biosensores y en ingeniería de materiales. En una realización, la biomolécula es una proteína. En otra realización, la biomolécula es biotina.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende un marcador de biomolécula.
En la presente invención, el término “marcador de biomolécula” incluye cualquier etiqueta cromófora que permite el seguimiento o identificación de una determinada biomolécula. Ejemplos ilustrativos son los fluoróforos. El etiquetado fluorescente es un elemento clave para la detección y análisis de biomoléculas. Actualmente existe una gran cantidad y variedad de fluoróforos. Entre los empleados para el etiquetado de biomoléculas se encuentran el dansilo, la fluoresceína y la rodamina B.
En una realización, el marcador de biomolécula es un fluoróforo.
Cuando la composición de la presente invención incluye un fluoróforo, la composición resultante puede ser utilizada en el desarrollo de biosensores.
En otra realización, el fluoróforo es fluoresceína. En otra realización, dicha fluoresceína está modificada químicamente con un grupo tiosemicarbazida.
La composición del primer aspecto de la invención, junto con el PEG y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) incluye uno o más ingredientes seleccionados de entre un vehículo líquido, un aglutinante y un aditivo apto para impresión.
En la presente invención, el término “vehículo líquido” se entiende como el componente líquido de la composición, que determina su fluidez y sus propiedades de secado. Adicionalmente sirve para fijar la molécula al sustrato.
En una realización, el vehículo líquido es acuoso, es decir, que comprende agua. En otra realización, el vehículo líquido comprende agua y un disolvente orgánico soluble en agua. Ejemplos de disolventes orgánicos solubles en agua son alcoholes. En otra realización, el vehículo líquido comprende agua y un alcohol C1-C10. Ejemplos de alcoholes C1-C10 son: metanol, etanol, propanol, isopropanol, isobutanol, y terc-butanol, entre otros. Preferiblemente, el vehículo líquido es agua.
En la presente invención, el término “aditivo para impresión” se entiende como cualquier otra sustancia que es añadida a la composición de la invención para modificar alguna de sus propiedades. El experto en la materia puede seleccionar entre una amplia lista de aditivos para impresión, tales como tampones de pH, modificadores reológicos y agentes humectantes, entre otros.
En la presente invención, por “modificador reológico” se entiende una sustancia capaz de prevenir la sedimentación de la composición y prevenir salpicaduras de la tinta una vez impresa, entre otros.
En una realización, el aditivo para impresión es un tampón de pH. En otra realización, el tampón de pH se selecciona del grupo que consiste en: Tris-HCl (hidrocloruro de trietanolamina), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico), TAE (trishidroximetilaminometano/acido acético/EDTA), TBE (Tris-HCl/Borato/EDTA), y PBS (tampón fosfato alcalino). Preferiblemente, el tampón de pH es un tampón fosfato alcalino.
En una realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende un vehículo líquido y un aditivo para impresión. En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende agua (como vehículo líquido) y un aditivo para impresión. En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende un vehículo líquido y un tampón de pH (como aditivo para impresión). En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende agua (como vehículo líquido) y un tampón de pH (como aditivo para impresión). Preferiblemente, la composición del primer aspecto de la invención comprende agua (como vehículo líquido) y tampón fosfato alcalino (como aditivo para impresión).
En la presente invención se entiende por “aglutinante” cualquier sustancia que mantiene la cohesión entre el vehículo líquido y la molécula a ser impresa. Ejemplos ilustrativos y no limitativos de aglutinantes son el ácido poliacrílico, resinas acrílicas, y la polivinilpirrolidona.
La preparación de la composición del primer aspecto de la invención se puede llevar a cabo mezclando los diferentes componentes (polietilenglicol, tensioactivo no iónico, molécula de interés biológico, etc) en cualquier orden.
En una realización, la composición del primer aspecto de la invención se prepara mediante un procedimiento que comprende: (a) disolver el polietilenglicol en una solución acuosa; (b) adicionar el tensioactivo no iónico de fórmula general (I); y, opcionalmente, (c) adicionar la molécula de interés biológico.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención se prepara mediante un procedimiento que comprende: (a) disolver el polietilenglicol en una solución acuosa de un tampón de pH; (b) adicionar el tensioactivo no iónico de fórmula general (I); y, opcionalmente, (c) adicionar la molécula de interés biológico.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención se prepara mediante un procedimiento que comprende: (a) disolver el polietilenglicol en una solución acuosa de tampón fosfato alcalino; (b) adicionar el tensioactivo no iónico de fórmula general (I); y (c) adicionar la molécula de interés biológico.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición según se define más arriba, para la impresión por inyección de una molécula de interés biológico sobre un sustrato, dicha biomolécula siendo seleccionada del grupo que consiste en: una biomolécula, un marcador de biomolécula o una biomolécula conjugada a un marcador.
Impresoras basadas en tecnología térmica, piezoeléctrica, electrostática y acústica son comúnmente utilizadas para la impresión por inyección de tinta. Sin embargo, las dos primeras son las más comunes. Los sistemas de impresión basados en tecnología piezoeléctrica son favorecidos sobre la impresión térmica pues no requieren altas temperaturas necesarias para la impresión (200-300°C) lo cual evita la degradación del material funcional.
Entre las impresoras comerciales basadas en tecnología piezoeléctrica más conocidas en el mercado se encuentran Pixdro, Dimatix, Ceradrop.
Los parámetros tenidos en cuenta para la impresión basada en tecnología piezoeléctrica son: frecuencia de voltaje (firing voltaje), forma de onda (waveform), distancia sustrato a imprimir-boquilla de inyección, distancia entre gotas (drop spacing, drsp), y número de capas a aplicar.
En la presente invención, el término “sustrato” se entiende como cualquier material que puede ser imprimible y que está funcionalizado con un grupo a través del cual la molécula de interés impresa se une. Ejemplos ilustrativos y no limitativos de sustrato son sustratos metálicos (como sustratos de oro, silicio o vidrio) modificados con SAMs (monocapas autoensambladas) o sustratos poliméricos (poliestireno (PS) o polimetilmetacrilato (PMMA)). El experto en la materia decidirá, en función de la molécula que desee imprimir, qué tipo de grupo funcional es el más adecuado para incorporarlo al sustrato y así tenga lugar el anclaje de la molécula al sustrato. A modo ilustrativo y no limitativo, si se desea imprimir una molécula de naturaleza aminoacídica, el sustrato se puede funcionalizar con grupos maleimidas, biotina-avidina, grupos carboxílicos (-COOH), aldehidos (-CHO),y ésteres (-COOR, donde el radical R se selecciona de entre un radical C1-C10 alquilo y un radical anillo de 5-6 miembros, dichos miembros siendo seleccionados del grupo que consiste en -C-, -CH-, -CH2-, -O-, -N-, -NH-, y -S-, dicho anillo siendo un anillo aromático, saturado, o parcialmente saturado, y en donde, opcionalmente, uno o más miembros del anillo están sustituidos con uno o más radicales de halógeno). En una realización, el éster es uno donde R es -C6H5 o -C6F5. Alternativamente, en otra realización, el sustrato puede estar funcionalizado con grupos pentafluorofenilmetacrilato (PFM). En otra realización, el sustrato es poliestireno y está funcionalizado con PFM.
Procedimientos para llevar a cabo la funcionalización del soporte con el grupo funcional de interés son bien conocidos por el experto en la materia (cfr. Griesser H. J. et al., “Plasma Methods for the Generation of Chemically Reactive Surfaces for Biomolecule Immobilization and Cell Colonization - A Review”, Plasma Process. Polym., 2006, vol. 3, p.
392-418; Borrós S. et al., “Functionalized, Swellable Hydrogel Layers as a Platform for Cell Studies”, Advanced Functional Materials, 2009, vol. 19, p. 1276-1286; Forch R. “Reactions of Plasma-Polymerised Pentafluorophenyl Methacrylate with Simple Amines”, Plasma Processes and Polymers, 2010, vol. 7, p. 915-925). Por ejemplo, en el caso de querer funcionalizar un sustrato con PFM, se puede utilizar la técnica de “ injerto de plasma” o “polimerización por plasma”. En una realización, el sustrato es PS y está funcionalizado con PFM producido por injerto de plasma o polimerización por plasma
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un sustrato impreso con una composición según se define más arriba.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra “comprende” incluye el caso “consiste en”. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIG. 1: comportamiento de la evolución de gotas basadas en PEO-35K a un voltaje de eyección de 25V. Las imágenes estroboscópicas fotos fueron realizadas a los 20 |isec (a) y 60 |isec (b).
FIG. 2: Patrón generado tras la impresión de una tinta formulada en el ejemplo 1 utilizando dos motivos diferentes: a) Líneas drsp= 20pm y 2 capas b) puntos drsp= 25pm.
FIG. 3: micrografía de fluorescencia (Xex= 492 nm; Xem= 516 nm) de un patrón generado por la impresión de la composición de tinta formulada en el Ejemplo 1.
FIG. 4: micrografía de fluorescencia (Xex= 492 nm; Xem= 516 nm) de un patrón generado por la impresión de la composición de tinta formulada en el Ejemplo 6.
EJEMPLOS
- Protocolo para determinar la viscosidad de una composición de tinta.
Para determinar la viscosidad de las composiciones formuladas más abajo, se depositaron 450 pL de la composición sobre la plataforma de análisis de un reómetro Anton Paar. La tinta a analizar se puso en contacto con un plato cónico de 1 mm de diámetro a una distancia entre el plato cónico y la plataforma de análisis de 1mm. A continuación se aplicó un gradiente de cizalla (shear rate) entre 1102 y 1-105 s-1. En este rango el comportamiento de la tinta es newtoniano, es decir que la viscosidad de la tinta no se afecta con la fuerza de cizalla.
- Protocolo para determinar la tensión superficial de una composición de tinta.
Para determinar la tensión superficial de las composiciones formuladas más abajo, se llena una jeringa de dos cuerpos (B/BRAUM) provista de una aguja especialmente diseñada para análisis de tensión superficial con ~50 pL con la tinta formulada. La jeringa está acondicionada con un embolo especial que permite la formación de forma controlada en el extremo de la aguja de la gota a analizar. Un software especial calcula el radio de curvatura de la gota mediante la ecuación de Laplace-Young y determina la tensión superficial.
Ejemplo 1. Preparación de la biotinta 1
Se preparó una solución de PEG-35K (Aldrich) al 7.5 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.75 g de PEG-35K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.01 mL de Triton X100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizó durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 pL de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0.43 M en dimetilformamida (DMF, Sigma-Aldrich). La mezcla resultante se homogenizó durante 1min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la composición resultante se filtró sucesivamente con filtros de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0.45 pm y 0.2 pm de diámetro.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación 1 tenía una viscosidad de 11.20+ 1.1 mPas y una tensión superficial de 35.53+0.3 mN/m.
Ejemplo 2. Preparación de la biotinta 2
Se preparó una solución de PEG-20K (Aldrich) al 10.0 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.100 g de PEG-20K en 8 mL de una disolución acuosa de PbS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.01 mL de Triton X100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizó la mezcla resultante durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 pL de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0,43 M en dimetilformamida (DMF) y la mezcla se homogenizó durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la tinta resultante se filtró sucesivamente con filtros de PVDF de 0.45 pm y 0.2 pm de diámetro.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación tenía una viscosidad de 13.2+2,1 mPas y una tensión superficial de 35.81+0,7 mN/m.
Ejemplo 3. Preparación de la biotinta 3
Se preparó una solución de PEG-40K (Aldrich) al 5.0 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.5 g de PEG-40K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01M (Sigma-Aldrich). La solución de p Eg y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.01 mL de Triton x100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizó la mezcla durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 |iL de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0.43 M en dimetilformamida (DMF) y la mezcla resultante se homogenizó durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la tinta resultante se filtró sucesivamente con filtros de PVDF de 0.45 |im y 0.2 |im de diámetro.
Ejemplo 4: efecto del tensioactivo de fórmula (I)
A. Efecto de la concentración superior al 1%.
A partir de la composición de biotinta del ejemplo 1, se determinó el efecto que tenía sobre las propiedades de la misma, un incremento en el % de tensioactivo no iónico.
Para ello, se formularon 2 composiciones, partiendo de la descrita en el Ejemplo 1, en donde se incorporaron las siguientes cantidades de Triton X100 (tensioactivo no iónico de fórmula general (I), donde n es 9-10): 0.15mL y 0.20 mL en 10mL de disolución.
En el momento de homogenizar las diferentes composiciones se observó la formación de espuma.
Este fenómeno interfirió negativamente en la impresión de la tinta, ya que durante la impresión de la misma, en el interior de la recámara del sistema piezoeléctrico, se generó una gran cantidad de espuma, difícil de controlar, que dio lugar a la inyección de burbujas. En ningún caso fue posible la formación de gotas.
Por lo tanto, este ensayo demuestra que la cantidad de tensioactivo no iónico de fórmula general (I) es crítico para conseguir una composición adecuada para inyección, que dé lugar a una gota homogénea.
B. Efecto del tensioactivo Tween 80
Para el caso del Tween 80, se prepararon tintas como las descritas en los ejemplos 1 y 2 para cada polietilenglicol, sustituyendo la solución de Triton X-100 por una de Tween 80 (Sigma-Aldrich). Y variando la proporción de Tween 80 en un rango de 0.1 a 1%v/v.
B.1. Se preparó una solución de PEG-35K (Aldrich) al 7.5% peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.75 g de PEG-35K en 8 mL de una disolución acuosa de Pb S 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de p Eg y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron diferentes cantidades de Tween 80 (Sigma-Aldrich) en un rango de 0.1-1 mLy se homogenizó durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 |iL de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0.43 M en dimetilformamida (DMF). La mezcla resultante se homogenizó durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la tinta resultante se filtró sucesivamente con filtros de PVDF de 0.45 |im y 0.2|im de diámetro. Los resultados de tensión superficial se resumen en la Tabla 1:
Tabla 1
Figure imgf000011_0001
Como puede observarse, las formulaciones que incluían Tween 80 mostraban una tensión superficial aproximadamente un 40% superior al valor mostrado por la formulación de biotinta 1.
B.2. Se preparó una solución de PEG-20K (Aldrich) al 10% peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.1 g de PEG-20K en 8 mL de una disolución acuosa de PbS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PeG y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron diferentes cantidades de Tween 80 (Sigma-Aldrich) en un rango de 0.1-1 mLy se homogenizó durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 |iL de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0.43M en dimetilformamida (DMF). La mezcla resultante se homogenizó durante 1min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la tinta resultante se filtró sucesivamente con filtros de PVDF de 0.45 |im y 0.2|im de diámetro. Los resultados de tensión superficial se resumen en la Tabla 2:
Tabla 2
Figure imgf000012_0001
Como puede observarse, las formulaciones que incluían Tween 80 mostraban una tensión superficial al menos un 30% superior al valor mostrado por la formulación de biotinta 2.
Por lo tanto, los datos mostrados en esta sección muestran que la elección del tensioactivo de fórmula general (I) en el rango de concentración de 0.1 -1.0% en v/v, resulta crítico para ajustar de manera adecuada la tensión superficial de la tinta.
Ejemplo 5. Impresión de las biotintas
Con la ayuda de una jeringa, se llenó un cartucho de impresión (DMP 11610) con aproximadamente 0,5 mL de la biotinta formulada en el ejemplo 1. Se adaptó el sistema piezoeléctrico (el cual estaba provisto de inyectores de 10pL) y el sistema se dejó reposar durante 2h, permaneciendo los inyectores en posición hacia abajo. Posteriormente se colocó el cartucho en el holder de la impresora y mediante una cámara estroboscópica de la impresora DMP 11610 se observó el comportamiento de las gotas generadas en la boquilla de inyección y su comportamiento. Para llevar a cabo estas pruebas de impresión se ajusta el pulso de la boquilla del eyector y el voltaje de disparo. Para el pulso de la boquilla, se controla el tiempo de entrada, de permanencia y de salida de la gota en la cámara, estos son 3.584js, 10,688 js y 7,29 js respectivamente. El voltaje de disparo se ajusta a 25V (para PEG 35K y PEG 40K), y 21V (para PEG 20K). Se tomaron imágenes estroboscópicas a los 20 psec (a) y 60 psec (b) (FIG. 1 (a) y (b))
De las resultados obtenidos cabe destacar que la gota inyectada era homogénea y no había rastro del efecto coffeering. Además, se comprobó que la gota se secaba de manera inmediata, una vez inyectada. No se observó la formación de agregados, lo que confiere un perfil idóneo a la composición de la invención para ser usada en impresión.
Una vez establecidas las condiciones ideales de gota, se puso el sustrato que se quería imprimir (en este caso el sustrato es PS-PFM, suministrado por el grupo de ingeniería de materiales GEMAT, Instituto Químico de Sarria), sobre la plataforma de impresión y se estableció que la distancia mínima de separación entre el sustrato y el cartucho de impresión era de 1mm. Por último, se definió el motivo a imprimir, la distancia entre gotas (drop spacing) y el número de capas a imprimir. Para la impresión de líneas se escogió un drsp de 20 jm y se aplicaron dos capas de la biotinta. Para la impresión de puntos, se escogió un drsp. de 25 jm y se aplicó sólo una sola capa de la biotinta.
De esta manera, se imprimieron líneas horizontales con un espaciado de 20 jL entre gotas y aplicando dos capas de biotinta sobre el sustrato, obteniendo los resultados que se muestran en la FIG. 2.
De los resultados obtenidos cabe destacar que la gota inyectada era homogénea y no había rastro del efecto coffeering. Además, se comprobó que la gota se secaba de manera inmediata, una vez inyectada.
No se observó la formación de agregados, lo que confiere un perfil idóneo a la composición de la invención para ser usada en impresión.
Finalmente, se analizaron por microscopia de fluorescencia (Leika DMRA 2 equipado con un filtro específico I13 para fluorocromos) en el rango Xex= 492 nm; Xem= 516 nm, los sustratos impresos con la tinta formulada en el ejemplo I, generándose las imágenes de FIG. 3.
De los resultados que se muestran en FIG. 3, destaca, en primer lugar, que la molécula fluorescente queda anclada a la superficie del sustrato, lo que es indicativo de que ha tenido lugar la reacción entre los grupos amino primarios del marcador y los grupos PFM del sustrato para dar lugar a una amida. Esto es indicativo de que la composición de la invención no obstaculiza la unión de la molécula de interés al sustrato y que, por lo tanto, se supera la problemática del “efecto pantalla”.
De FIG. 3 también se observa que la línea impresa es de una elevada definición y resolución (40|jm).
Finalmente, se observó que la molécula anclada mantenía su propiedad fluorescente durante un largo periodo de tiempo. Esto es indicativo de que la composición de la invención no afecta negativamente a la estabilidad/actividad de la molécula impresa.
Ejemplo 6. Preparación de la biotinta 4
Se preparó una solución de PEG-35K (Aldrich) al 7.5 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.75 g de PEG-35K en 8 mL de una disolución acuosa de pBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.1 mL de Triton X100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizó la mezcla durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 |+L de una disolución de biotina (biotinyl-3,6,9-trioxaundecanediamine, Thermo Scientific) 0.042 M en PBS y la mezcla resultante se homogenizó durante 1min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación 4 tenía una viscosidad de 14.30+ 0.1 mPas y una tensión superficial de 36.10+0.02 mN/m.
Ejemplo 7. Preparación de la biotinta 5
Se preparó una solución de PEG-20K (Aldrich) al 10% peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 1 g de PEG-20K en 8 mL de una disolución acuosa de p Bs 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.1 mL de Triton X100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizó la mezcla durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 |+L de una disolución de biotina (biotinyl-3,6,9-trioxaundecanediamine, Thermo Scientific) 0.042 M en PBS y la mezcla resultante se homogenizó durante 1min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación 5 tenía una viscosidad de 10.10+ 0.1 mPa s y una tensión superficial de 36.45+0.05 mN/m.
Ejemplo 8. Impresión biotinta 4
Con la ayuda de una jeringa, se llenó un cartucho de impresión (DMP 11610) con aproximadamente 0,5 mL de la biotinta formulada en el ejemplo 6. Se adaptó el sistema piezoeléctrico (el cual estaba provisto de inyectores de 10pL) y el sistema se dejó reposar durante 2h, permaneciendo los inyectores en posición hacia abajo. Posteriormente se colocó el cartucho en el holder de la impresora y mediante una cámara estroboscópica de la impresora DMP 11610 se observó el comportamiento de las gotas generadas en la boquilla de inyección y su comportamiento. Para llevar a cabo estas pruebas de impresión se ajusta el pulso de la boquilla del eyector y el voltaje de disparo. Para el pulso de la boquilla, se controla el tiempo de entrada, de permanencia y de salida de la gota en la cámara, estos son 3.584js, 10,688jsy 7,29js respectivamente. El voltaje de disparo se ajusta a 27V.
De los resultados obtenidos cabe destacar que la gota inyectada era homogénea y no había rastro del efecto coffeering. Además, se comprobó que la gota se secaba de manera inmediata, una vez inyectada. No se observó la formación de agregados, lo que confiere un perfil idóneo a la composición de la invención para ser usada en impresión.
Una vez establecidas las condiciones ideales de gota, se puso el sustrato que se quería imprimir (en este caso el sustrato es PS-PFM, suministrado por el grupo de ingeniería de materiales GEMAT, Instituto Químico de Sarria), sobre la plataforma de impresión y se estableció que la distancia mínima de separación entre el sustrato y el cartucho de impresión era de 1mm. Por último, se definió el motivo a imprimir, la distancia entre gotas (drop spacing) y el número de capas a imprimir. Para la impresión de líneas se escogió un drsp de 20jm.
De esta manera, se imprimieron líneas horizontales con un espaciado de 20 jL entre gotas.
De los resultados obtenidos cabe destacar que la gota inyectada era homogénea y no había rastro del efecto coffeering. Además, se comprobó que la gota se secaba de manera inmediata, una vez inyectada.
No se observó la formación de agregados, lo que confiere un perfil idóneo a la composición de la invención para ser usada en impresión.
Una vez impresa la biotinta del ejemplo 6, los sustratos se incubaron en 20|jl de solución de Estreptavidina (FITC, Invitrogen) durante Iminuto y posteriormente se limpiaron con una solución de PBS 0.01M (Sigma Aldrich) y secado con un flujo de nitrógeno.
Finalmente, se analizaron por microscopia de fluorescencia Leika DMRA 2 equipado con un filtro específico I13 para fluorocromos en el rango Xex= 492 nm; Xem= 516 nm, los sustratos impresos con la tinta formulada en el ejemplo 6 generándose las imágenes de FIG. 4.
De los resultados que se muestran en FIG. 4, destaca, en primer lugar, que la molécula queda anclada a la superficie del sustrato, lo que es indicativo de que ha tenido lugar la reacción entre los grupos amino primarios del marcador y los grupos PFM del sustrato para dar lugar a una amida. Esto es indicativo de que la composición de la invención no obstaculiza la unión de la molécula de interés al sustrato y que, por lo tanto, se supera la problemática del “efecto pantalla”.
Ejemplo 9. Preparación de la biotinta 6
Se preparó una solución de PEG-35K (Aldrich) al 7.5 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.75 g de PEG-35K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.1 mL de Triton X100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizó durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 |iL de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0.43 M en dimetilformamida (DMF, Sigma-Aldrich). La mezcla resultante se homogenizó durante 1min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la composición resultante se filtró sucesivamente con filtros de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0.45 |im y 0.2 |im de diámetro.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación 6 tenía unos valores de viscosidad y tensión superficial ideales para la impresión por inyección.
Ejemplo 10. Preparación de la biotinta 7
Se preparó una solución de PEG-20K (Aldrich) al 10.0 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.100 g de PEG-20K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.1 mL de Triton X100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizó la mezcla resultante durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 |iL de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0,43 M en dimetilformamida (DMF) y la mezcla se homogenizó durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la tinta resultante se filtró sucesivamente con filtros de PVDF de 0.45 |im y 0.2 |im de diámetro.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación 7 tenía una viscosidad de 11.9 mPas y una tensión superficial de 36.70 mN/m.
Ejemplo 11. Preparación de la biotinta 8
Se preparó una solución de PEG-40K (Aldrich) al 5.0 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.5 g de PEG-40K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01M (Sigma-Aldrich). La solución de p Eg y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.1 mL de Triton x100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizó la mezcla durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 |iL de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0.43 M en dimetilformamida (DMF) y la mezcla resultante se homogenizó durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la tinta resultante se filtró sucesivamente con filtros de PVDF de 0.45 |im y 0.2 |im de diámetro.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación 8 tenía unos valores de viscosidad y tensión superficial ideales para la impresión por inyección.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Composición de tinta que comprende:
(a) polietilenglicol con un peso molecular que está comprendido entre 20000 (20K) y 50000 (50K), en una concentración comprendida entre el 0.5 y el 15 % en peso/volumen;
(b) un tensioactivo no iónico de fórmula general (I)
Figure imgf000015_0001
donde
n está comprendido entre 5 y 40
dicho tensioactivo estando en una concentración comprendida entre el 0.1 y el 2.0% en volumen/volumen; y (c) uno o más ingredientes seleccionados de entre un vehículo líquido, un aglutinante y un aditivo apto para impresión.
2. Composición de tinta según la reivindicación 1, en donde la concentración de tensioactivo está comprendida entre 0.1 y 1.0% v/v.
3. Composición de tinta según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende una molécula seleccionada del grupo que consiste en: una biomolécula, un marcador de biomolécula o una biomolécula conjugada a un marcador.
4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la concentración de polietilenglicol está comprendida entre 6 y 8 % en peso/volumen.
5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polietilenglicol tiene un peso molecular de 35.000 (35K) y la concentración está comprendida entre el 6 y el 8% en peso/volumen.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n tiene un valor comprendido entre 9 y 10.
7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el tensioactivo de fórmula general (I) está en una concentración comprendida entre el 0.1 y el 1.0% en volumen/volumen.
8. Composición según la reivindicación 7, en donde el tensioactivo de fórmula general (I) está en una concentración del 1.0% en volumen/volumen.
9. Composición según la reivindicación 7, en donde el tensioactivo de fórmula general (I) está en una concentración del 0.1% en volumen/volumen.
10. Composición de tinta según la reivindicación 1 que comprende:
(a) polietilenglicol con un peso molecular de 20000, a una concentración en % peso/volumen del 10%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%; o, alternativamente, comprende:
(b) polietilenglicol con un peso molecular de 35000, a una concentración en % peso/volumen del 7.5%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%, o, alternativamente, comprende:
(c) polietilenglicol con un peso molecular de 40000, a una concentración en % peso/volumen del 5%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%.
11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un vehículo líquido y un aditivo para impresión.
12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aditivo es un tampón de pH.
13. Composición según la reivindicación 12, en donde el tampón es un tampón fosfato alcalino.
14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el vehículo líquido es agua.
15. Uso de una composición según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para la impresión por inyección de una molécula sobre un sustrato, dicha molécula siendo seleccionada del grupo que consiste en: una biomolécula, un marcador de biomolécula o una biomolécula conjugada a un marcador.
16. Sustrato impreso con una composición según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
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