WO2014188029A1 - Composición de tinta para impresión por inyección - Google Patents

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WO2014188029A1
WO2014188029A1 PCT/ES2014/070329 ES2014070329W WO2014188029A1 WO 2014188029 A1 WO2014188029 A1 WO 2014188029A1 ES 2014070329 W ES2014070329 W ES 2014070329W WO 2014188029 A1 WO2014188029 A1 WO 2014188029A1
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general formula
printing
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PCT/ES2014/070329
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Inventor
Laura LÓPEZ GARCÍA
Oscar Hernán RAMÍREZ GUTIÉRREZ
Laia FRANCESCH DE CASTRO
Salvador BORRÓS GÓMEZ
Núria AGULLÓ CHALER
Joan GILABERT PORRES
Laia VILAR ABRIL
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Fundació Cetemmsa
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    • C09D11/30—Inkjet printing inks
    • C09D11/32—Inkjet printing inks characterised by colouring agents
    • C09D11/324—Inkjet printing inks characterised by colouring agents containing carbon black
    • C09D11/326—Inkjet printing inks characterised by colouring agents containing carbon black characterised by the pigment dispersant

Definitions

  • the present invention is related to injection printing and molecular biology.
  • the present invention relates to a composition useful in printing, by injection, of molecules of biological interest, such as amino acids, peptides and / or proteins, on a substrate.
  • Inkjet printing (in English "inkjet printing") is a printing method widely used in the printing of text and images on porous surfaces.
  • Gene chips are usually generated using split-tip pens with which a drop of diluted solution is collected and deposited on a pretreated sheet, with a resolution of approximately 100 ⁇ .
  • the DNA covalently binds to the substrate.
  • Robotic systems that allow printing a DNA library on a series of sheets have also been described.
  • one of the main limitations of the use of injection printing applied to the molecular biology sector is to avoid denaturation / loss of function of the component to be printed (either nucleic acid, protein , cell, etc).
  • compositions intended for printing must comply with parameters of viscosity and surface tension.
  • the viscosity of the ink should be low enough to allow the channel through which it is injected to fill in about 100 ⁇ .
  • the surface tension on the other hand, must be high enough to keep the ink in the nozzle without dripping.
  • a major aspect in the design of an ink is the "first drop" problem.
  • the inventors of the present invention have developed an ink composition suitable for use in printing and that solves the problems referred to above in the state of the art.
  • the present invention provides an ink composition
  • an ink composition comprising: (a) polyethylene glycol with a molecular weight that is between 20,000 (20K) and 50,000 (50K), at a concentration between 0.5 and 15% by weight / volume;
  • n is between 5 and 40
  • said surfactant being in a concentration between 0.1 and 2.0% by volume / volume;
  • compositions that includes a polyethylene glycol with a molecular weight in the range between 20-50K, in the concentration range between 0.5 and 15% by weight / volume, allows: (a) to adjust viscosity at values 10-13 mPa-s; (b) obtain a homogeneous drop, being spherical (as seen in FIG. 1); (c) increase the kinetics of drop drying, and (d) minimize undesirable effects such as the "coffee ring effecf (see FIG. 1 and FIG. 2). This effect is a consequence of solvent evaporation in a drop and displacement towards the edges of the functional material particles giving rise to a ring instead of a homogeneous layer of ink.
  • the present invention provides an ink composition comprising:
  • n is between 5 and 40
  • said surfactant being in a concentration between 0.1 and 1.0% by volume / volume;
  • the inventors of the present invention have discovered that by incorporating a non-ionic surfactant of formula (I) in a concentration range between 0.1 and 1.0% volume / volume, it is possible to adjust the surface tension to about 35 mN / m , the ideal for injection printing.
  • concentration of the surfactant of general formula (I) exceeds 1% by volume, the quality of the ink worsens, generating a kind of foam that hinders the proper formation of the drop for its injection through the injector hole.
  • the effect associated with the inclusion of the non-ionic surfactant of general formula (I) is not observed with another surfactant widely used in the formulation of compositions for printing, such as Tween 80 which , for the same concentration values, results in an ink with surface tension values above 45 mN / m, that is, outside the optimum range for injection printing.
  • Tween 80 the incorporation of other surfactants would be necessary to reach the surface tension values suitable for printing, which would make the preparation of the composition more expensive and, in addition, would jeopardize the stability as well as the effectiveness of the binding of the molecule to be printed on the substrate.
  • the inventors of the present invention have found that with a composition such as that of the first aspect, which includes PEG in a certain range of molecular weight and concentration, as well as the non-ionic surfactant of general formula (I) at a given concentration, a composition suitable for injection printing is obtained without negatively affecting the stability or binding of the molecule to be printed on a substrate.
  • the experimental data provided below illustrates how the fluorescein-5 thiosemicarbazide marker (widely used in the field of biology as a biomolecule marker in the development of biosensors) is perfectly anchored to the functionalized substrate (see FIG. 3).
  • composition object of the present invention does not generate aggregates, which gives an ideal profile to the composition of the invention for use in printing.
  • composition object of the present invention represents a great advance in the printing by injection applied to the field of biotechnology.
  • polyethylene glycol also known as polyethylene oxide or polyoxyethylene (POE)
  • PEG polyethylene glycol
  • POE polyoxyethylene
  • the degree of polymerization is characterized by a K value, which is a function of viscosity. The higher the degree of polymerization, the greater the value of K.
  • the PEG has a molecular weight between 25,000 (25K) and 50,000 (50K).
  • the PEG has a molecular weight between 20,000 (20K) and 40,000 (40K).
  • the PEG has a molecular weight selected from the group consisting of 20,000 (20K), 25,000 (25K), 35,000 (35K), and 40,000 (40K).
  • the molecular weight of the polyethylene glycol is 35000 (35K)
  • the PEG is in the weight / volume concentration range between 5 and 10%. In another embodiment, the PEG is in a weight / volume concentration between 6 and 8%. In another embodiment, the PEG is in a weight / volume concentration of 7.5%.
  • the PEG is one of 35K molecular weight and is in the weight / volume concentration range between 0.5 and 15%. In another embodiment, the PEG is one of 35K molecular weight and is in the weight / volume concentration range between 5 and 10%. In another embodiment, the PEG is one of 35K molecular weight and is in a range of weight / volume concentration between 6 and 8%. Preferably, the PEG has a molecular weight of 35K and is at a weight / volume concentration of 7.5% w / v.
  • the non-ionic alkylaryl polyether alcohol type surfactant of the general formula (I) is also commercially known as Triton X ® (registered trademark of Union Carbide Co., Inc.).
  • Triton X registered trademark of Union Carbide Co., Inc.
  • examples of the Triton X series are:
  • the nonionic surfactant of general formula (I) is one in which n is between 9 and 10 (also commercially known as Triton X-100).
  • the nonionic surfactant of general formula (I) is at a volume / volume concentration between 0.5 and 2.0% v / v. In another embodiment, The surfactant is at a concentration between 0.5 and 1.5% v / v. Preferably, the nonionic surfactant of general formula (I) is at a concentration of 1.0% v / v.
  • the nonionic surfactant of general formula (I) is at a volume / volume concentration between 0.1 and 0.5% v / v.
  • the nonionic surfactant of general formula (I) is at a concentration of 0.1% v / v.
  • the surfactant of general formula (I) is one in which n is between 9 and 10 and is at a volume / volume concentration between 0.1 and 2.0%. In another embodiment, the surfactant of general formula (I) is one in which n is between 9 and 10 and is in a volume / volume concentration between 0.5 and 1.5%. In another embodiment, the surfactant of general formula (I) is one in which n is between 9 and 10 and is at a volume / volume concentration of 1.0%.
  • the surfactant of general formula (I) is one in which n is between 9 and 10 and is at a volume / volume concentration between 0.1 and 1.0%. In another embodiment, the surfactant of general formula (I) is one in which n is between 9 and 10 and is in a volume / volume concentration between 0.1 and 0.5%. In another embodiment, the surfactant of general formula (I) is one in which n is between 9 and 10 and is at a volume / volume concentration of 0.1%.
  • concentration in% weight / volume (% w / v) is calculated by dividing the grams of polyethylene glycol added with respect to the total volume of composition (expressed in milliliters) and multiplying the resulting value by 100.
  • concentration in% volume / volume (% v / v) is calculated by dividing the volume of non-ionic surfactant with respect to the total volume of composition, both the volume of surfactant and the volume being expressed in the same units total composition, and multiplying the resulting value by 100.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises a PEG with a molecular weight of 35000 (35K) and the non-ionic surfactant is one where n is between 9 and 10.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 0.5 and 15%; and the nonionic surfactant of general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% v / v between 0.1 and 2.0%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 0.5 and 15%; and the nonionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% v / v between 0.1 and 1.0%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 5 and 10%; and the nonionic surfactant of general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume between 0.1 and 2.0%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 5 and 10%; and the non-ionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume between 0.1 and 1.0%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 6 and 8%; and the nonionic surfactant of general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume between 0.1 and 2.0%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume comprised between 6 and 8%; and the non-ionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume between 0.1 and 1.0%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration of 7.5% weight / volume; and the nonionic surfactant of general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume between 0.1 and 2.0%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration of 7.5% weight / volume; and the non-ionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume between 0.1 and 1.0%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 0.5 and 15%; and the nonionic surfactant of general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% v / v between 0.5 and 1.5%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 0.5 and 15%; and the nonionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% v / v between 0.1 and 0.5%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 5 and 10%; and the nonionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume between 0.5 and 1.5%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 5 and 10%; and the nonionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume between 0.1 and 0.5%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 6 and 8%; and the nonionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume between 0.5 and 1.5%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 6 and 8%; and the nonionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume between 0.1 and 0.5%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration of 7.5% weight / volume; and the nonionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume between 0.5 and 1.5%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration of 7.5% weight / volume; and the nonionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume between 0.1 and 0.5%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 0.5 and 15%; and the nonionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a volume / volume% concentration of 1.0%.
  • composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 0.5 and 15%; and the nonionic surfactant of general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume of 0.1%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 5 and 10%; and the nonionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a volume / volume% concentration of 1.0%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 5 and 10%; and the non-ionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume of 0.1%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 6 and 8%; and the nonionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a volume / volume% concentration of 1.0%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume between 6 and 8%; and the non-ionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume of 0.1%.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume of 7.5%; and the nonionic surfactant of the general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a volume / volume% concentration of 1.0%.
  • composition of the first aspect of the invention comprises PEG with a molecular weight of 35K, at a concentration in% weight / volume of 7.5%; and the nonionic surfactant of general formula (I), is one where n is between 9 and 10, and is at a concentration in% volume / volume of 0.1%.
  • composition of the first aspect of the invention is one comprising:
  • polyethylene glycol with a molecular weight of 35000, at a concentration in% weight / volume of 7.5%; and non-ionic surfactant of the general formula (I) where n 9-10, at a concentration in% volume / volume of 1.0%, or alternatively comprises:
  • composition of the first aspect of the invention is one comprising:
  • polyethylene glycol with a molecular weight of 35000, at a concentration in% weight / volume of 7.5%; and non-ionic surfactant of the general formula (I) where n 9-10, at a concentration in% volume / volume of 0.1%, or alternatively comprises:
  • the composition of the first aspect of the invention comprises a molecule selected from the group consisting of biomolecule, a biomolecule marker and a biomolecule marker conjugated to a biomolecule. In one embodiment, the composition of the first aspect of the invention comprises a biomolecule.
  • the biomolecule is in a concentration between 0.1 and 1 mg of biomolecule per ml of composition.
  • biomolecule refers to any molecule generated by a living organism such as: proteins, vitamins, nucleic acids and carbohydrates, among others. These biomolecules can be obtained by isolating them from the organism that produces them or they can be synthesized on a laboratory scale by techniques well known to the person skilled in the art.
  • the biomolecules referred to in the present invention additionally, are usable in biosensors and in materials engineering.
  • the biomolecule is a protein.
  • the biomolecule is biotin.
  • composition of the first aspect of the invention comprises a biomolecule marker.
  • biomolecule marker includes any chromophore label that allows the tracking or identification of a particular biomolecule.
  • Illustrative examples are fluorophores. Fluorescent labeling is a key element for the detection and analysis of biomolecules. There is currently a large amount and variety of fluorophores. Among the employees for biomolecule labeling are dansyl, fluorescein and rhodamine B.
  • the biomolecule marker is a fluorophore.
  • composition of the present invention includes a fluorophore
  • the resulting composition can be used in the development of biosensors.
  • the fluorophore is fluorescein.
  • said fluorescein is chemically modified with a thiosemicarbazide group.
  • composition of the first aspect of the invention, together with the PEG and the surfactant Non-ionic of general formula (I) includes one or more ingredients selected from a liquid carrier, a binder and an additive suitable for printing.
  • liquid vehicle is understood as the liquid component of the composition, which determines its fluidity and drying properties. Additionally it serves to fix the molecule to the substrate.
  • the liquid vehicle is aqueous, that is, it comprises water.
  • the liquid vehicle comprises water and a water soluble organic solvent.
  • water-soluble organic solvents are alcohols.
  • the liquid vehicle comprises water and a C1-C10 alcohol.
  • C1-C10 alcohols are: methanol, ethanol, propanol, isopropanol, isobutanol, and tert-butanol, among others.
  • the liquid vehicle is water.
  • the term "printing additive” is understood as any other substance that is added to the composition of the invention to modify any of its properties.
  • the person skilled in the art can select from a wide list of additives for printing, such as pH buffers, rheology modifiers and wetting agents, among others.
  • rheology modifier means a substance capable of preventing sedimentation of the composition and preventing splashing of the ink once printed, among others.
  • the printing additive is a pH buffer.
  • the pH buffer is selected from the group consisting of: Tris-HCI (triethanolamine hydrochloride), MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid), MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid) , TAE (trishydroxymethylaminomethane / acetic acid / EDTA), TBE (Tris-HCI / Borate / EDTA), and PBS (alkaline phosphate buffer).
  • the pH buffer is an alkaline phosphate buffer.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises a liquid carrier and an additive for printing.
  • the composition of the first aspect of the invention comprises water (as a liquid vehicle) and an additive for printing.
  • the composition of the first aspect of the invention It comprises a liquid carrier and a pH buffer (as an additive for printing).
  • the composition of the first aspect of the invention comprises water (as a liquid carrier) and a pH buffer (as an additive for printing).
  • the composition of the first aspect of the invention comprises water (as a liquid carrier) and alkaline phosphate buffer (as an additive for printing).
  • binder is understood as any substance that maintains the cohesion between the liquid vehicle and the molecule to be printed.
  • binders are polyacrylic acid, acrylic resins, and polyvinylpyrrolidone.
  • composition of the first aspect of the invention can be carried out by mixing the different components (polyethylene glycol, non-ionic surfactant, molecule of biological interest, etc.) in any order.
  • the composition of the first aspect of the invention is prepared by a process comprising: (a) dissolving the polyethylene glycol in an aqueous solution; (b) adding the nonionic surfactant of general formula (I); and, optionally, (c) add the molecule of biological interest.
  • composition of the first aspect of the invention is prepared by a process comprising: (a) dissolving the polyethylene glycol in an aqueous solution of a pH buffer; (b) adding the nonionic surfactant of general formula (I); and, optionally, (c) add the molecule of biological interest.
  • composition of the first aspect of the invention is prepared by a process comprising: (a) dissolving the polyethylene glycol in an aqueous solution of alkaline phosphate buffer; (b) adding the nonionic surfactant of general formula (I); and (c) add the molecule of biological interest.
  • the present invention provides the use of a composition as defined above, for injection printing of a molecule of biological interest on a substrate, said biomolecule being selected from the group consisting of: a biomolecule, a marker of biomolecule or a biomolecule conjugated to a marker.
  • a biomolecule being selected from the group consisting of: a biomolecule, a marker of biomolecule or a biomolecule conjugated to a marker.
  • Printers based on thermal, piezoelectric, electrostatic and acoustic technology are commonly used for inkjet printing. However, the first two are the most common. Printing systems based on piezoelectric technology are favored over thermal printing because they do not require high temperatures necessary for printing (200-300 ° C) which prevents degradation of the fuctional material.
  • the parameters taken into account for printing based on piezoelectric technology are: voltage frequency (firing voltage), waveform (waveform), distance substrate to print-injection nozzle, distance between drops (drop spacing, drsp), and number of layers to apply.
  • substrate is understood as any material that can be printable and that is functionalized with a group through which the molecule of printed interest binds.
  • substrate are metal substrates (such as gold, silicon or glass substrates) modified with SAMs (self-assembled monolayers) or polymeric substrates (polystyrene (PS) or polymethylmethacrylate (PMMA)).
  • SAMs self-assembled monolayers
  • PS polystyrene
  • PMMA polymethylmethacrylate
  • the substrate can be functionalized with maleimide groups, biotin-avidin, carboxylic groups (-COOH), aldehydes (-CHO), and esters (-COOR, where the radical R is selected from a C1-C10 alkyl radical and a 5-6 membered ring radical, said members being selected from the group consisting of -C-, -CH-, -CH2-, -O-, -N -, -NH-, and -S-, said ring being an aromatic, saturated, or partially saturated ring, and where, optionally, one or more ring members are substituted with one or more halogen radicals).
  • R is selected from a C1-C10 alkyl radical and a 5-6 membered ring radical, said members being selected from the group consisting of -C-, -CH-, -CH2-, -O-, -N -, -NH-, and -S-, said ring being an aromatic, saturated, or partially saturated ring, and
  • the ester is one where R is -C 6 H 5 or -C 6 F 5 .
  • the substrate may be functionalized with pentafluorophenylmethacrylate (PFM) groups.
  • PFM pentafluorophenylmethacrylate
  • the substrate is polystyrene and is functionalized with PFM.
  • the substrate is PS and is functionalized with PFM produced by plasma grafting or plasma polymerization.
  • the present invention provides a printed substrate with a composition as defined above.
  • FIG. 1 behavior of the evolution of drops based on PEO-35K at an ejection voltage of 25V.
  • the strobe images were taken at 20 ⁇
  • FIG. 3 fluorescence micrograph 516 nm) of a pattern generated by printing the ink composition formulated in Example 1.
  • FIG. 4 fluorescence micrograph 516 nm) of a pattern generated by printing the ink composition formulated in Example 6.
  • a two-body syringe (B / BRAUM) filled with a needle specially designed for surface tension analysis with -50 is filled with the formulated ink.
  • the syringe is conditioned with a special plunger that allows the formation of a controlled form at the end of the needle of the drop to be analyzed.
  • a special software calculates the radius of curvature of the drop using the Laplace-Young equation and determines the surface tension.
  • a solution of 7.5% weight / volume PEG-35K (Aldrich) was prepared by dissolving, in a beaker, 0.75 g of PEG-35K in 8 mL of an aqueous solution of PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich).
  • the PEG and PBS solution was homogenized by stirring using a magnetic stirrer (400 RPM, 10 min). Subsequently, 0.01 mL of Triton X100 (Sigma-Aldrich) was added and homogenized for an additional 5 min.
  • formulation 1 was found to have a viscosity of 11.20 + 1.1 mPa-s and a surface tension of 35.53 + 0.3 mN / m.
  • a 10.0% weight / volume solution of PEG-20K (Aldrich) was prepared by dissolving, in a beaker, 0.100 g of PEG-20K in 8 mL of a 0.01 M aqueous solution of PBS (Sigma-Aldrich). The PEG and PBS solution was homogenized by stirring using a magnetic stirrer (400 RPM, 10 min). Subsequently, 0.01 mL of Triton X100 (Sigma-Aldrich) was added and the resulting mixture was homogenized for a further 5 min.
  • the formulation was found to have a viscosity of 13.2 ⁇ 2, 1 mPa-s and a surface tension of 35.81 ⁇ 0.7 mN / m.
  • a 5.0% weight / volume solution of PEG-40K (Aldrich) was prepared by dissolving, in a beaker, 0.5 g of PEG-40K in 8 mL of an aqueous solution of PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). The PEG and PBS solution was homogenized by stirring using a magnetic stirrer (400 RPM, 10 min). Subsequently, 0.01 ml_ of Triton x100 (Sigma-Aldrich) was added and the mixture was homogenized for a further 5 min.
  • compositions were formulated, starting from the one described in Example 1, where the following amounts of Triton X100 (non-ionic surfactant of general formula (I), where n is 9-10) were incorporated: 0.15ml_ and 0.20 ml_ in 10ml_ of solution.
  • Triton X100 non-ionic surfactant of general formula (I), where n is 9-10
  • Tween 80 surfactant In the case of Tween 80, inks were prepared as described in examples 1 and 2 for each polyethylene glycol, replacing the Triton X-100 solution with one of Tween 80 (Sigma-Aldrich). And varying the proportion of Tween 80 in a range of 0.1 to 1% v / v.
  • a 7.5% weight / volume solution of PEG-35K (Aldrich) was prepared by dissolving, in a beaker, 0.75 g of PEG-35K in 8 mL of a 0.01 M aqueous solution of PBS (Sigma-Aldrich).
  • the PEG and PBS solution was homogenized by stirring using a magnetic stirrer (400 RPM, 10 min). Subsequently, different amounts of Tween 80 (Sigma-Aldrich) in a range of 0.1-1 mL were added and homogenized for an additional 5 min.
  • the formulations that included Tween 80 showed a surface tension approximately 40% higher than the value shown by the biotint 1 formulation.
  • a solution of 10% weight / volume PEG-20K (Aldrich) was prepared by dissolving, in a beaker, 0.1 g of PEG-20K in 8 mL of a 0.01 M aqueous solution of PBS (Sigma-Aldrich).
  • the PEG and PBS solution was homogenized by stirring using a magnetic stirrer (400 RPM, 10 min). Subsequently, different amounts of Tween 80 (Sigma-Aldrich) in a range of 0.1-1 mL were added and homogenized for an additional 5 min.
  • the formulations that included Tween 80 showed a surface tension at least 30% higher than the value shown by the biotint 2 formulation.
  • a print cartridge (DMP 1 1610) was filled with approximately 0.5 mL of the biotint formulated in Example 1.
  • the piezoelectric system (which was provided with 10pL injectors) was adapted and the system was allowed to stand for 2h, the injectors remaining in the down position. Subsequently, the cartridge was placed in the printer holder and the behavior of the drops generated in the injection nozzle and its behavior was observed by means of a strobe chamber of the DMP 1 1610 printer. To carry out these printing tests, adjust the ejector nozzle pulse and the firing voltage.
  • the time of entry, permanence and exit of the drop in the chamber is controlled, these are 3,584 ⁇ , 10,688 ⁇ s and 7.29 ⁇ respectively.
  • the trip voltage is set to 25V (for PEG 35K and PEG 40K), and 21V (for PEG 20K).
  • Strobe images were taken at 20 ⁇ (a) and ⁇ (b) (FIG. 1 (a) and (b)) From the results obtained it should be noted that the drop injected was homogeneous and there was no trace of the coffee-ring effect. In addition, it was found that the drop dried immediately, once injected. The formation of aggregates was not observed, which gives an ideal profile to the composition of the invention for use in printing.
  • the substrate to be printed was placed (in this case the substrate is PS-PFM, supplied by the GEMAT materials engineering group, Sarriá Chemical Institute), on the printing platform and it was established that the minimum separation distance between the substrate and the print cartridge was 1 mm. Finally, the reason to be printed, the distance between drops (drop spacing) and the number of layers to be printed were defined. For the printing of lines, a drsp of 20 ⁇ was chosen and two layers of the biotint were applied. For the printing of points, a drsp was chosen. of 25 ⁇ and only a single layer of the biotint was applied.
  • a solution of 7.5% weight / volume PEG-35K (Aldrich) was prepared by dissolving, in a beaker, 0.75 g of PEG-35K in 8 ml of an aqueous solution of 0.01 M PBS (Sigma-Aldrich).
  • the PEG and PBS solution was homogenized by stirring using a magnetic stirrer (400 RPM, 10 min). Subsequently 0.1 ml_ of Triton X100 (Sigma-Aldrich) was added and the mixture was homogenized for a further 5 min.
  • formulation 4 was found to have a viscosity of 14.30+ 0.1 mPa-s and a surface tension of 36.10 + 0.02 mN / m.
  • a solution of 10% weight / volume PEG-20K (Aldrich) was prepared by dissolving, in a beaker, 1 g of PEG-20K in 8 mL of a 0.01 M aqueous solution of PBS (Sigma-Aldrich). The PEG and PBS solution was homogenized by stirring using a magnetic stirrer (400 RPM, 10 min). Subsequently 0.1 mL of Triton X100 (Sigma-Aldrich) was added and the mixture was homogenized for a further 5 min.
  • formulation 5 was found to have a viscosity of 10.10+ 0.1 mPa-s and a surface tension of 36.45 + 0.05 mN / m.
  • a print cartridge (DMP 1 1610) was filled with approximately 0.5 mL of the biotint formulated in Example 6.
  • the piezoelectric system (which was provided with 10pL injectors) was adapted and the system was allowed to stand for 2h, the injectors remaining in the down position. Subsequently, the cartridge was placed in the printer holder and the behavior of the drops generated in the injection nozzle and its behavior was observed by means of a strobe chamber of the DMP 1 1610 printer.
  • adjust the ejector nozzle pulse and the firing voltage adjust the ejector nozzle pulse and the firing voltage. For the pulse of the nozzle, the time of entry, permanence and exit of the drop in the chamber is controlled, these are 3,584 ⁇ , 10,688 ⁇ s and 7.29 ⁇ respectively.
  • the trip voltage is set to 27V.
  • the substrate to be printed was placed (in this case the substrate is PS-PFM, supplied by the GEMAT materials engineering group, Sarriá Chemical Institute), on the printing platform and it was established that the minimum separation distance between the substrate and the print cartridge was 1 mm. Finally, the reason to be printed, the distance between drops (drop spacing) and the number of layers to be printed were defined. For the printing of lines a drsp of 20 ⁇ was chosen. In this way, horizontal lines were printed with a spacing of 20 ⁇ _ between drops.
  • the substrates were incubated in 20 ⁇ of Streptavidin solution (FITC, Invitrogen) for 1 minute and subsequently cleaned with a 0.01 M PBS solution (Sigma Aldrich) and dried with a nitrogen flow.
  • Streptavidin solution FITC, Invitrogen
  • a 7.5% weight / volume solution of PEG-35K (Aldrich) was prepared by dissolving, in a beaker, 0.75 g of PEG-35K in 8 mL of a 0.01 M aqueous solution of PBS (Sigma-Aldrich).
  • the PEG and PBS solution was homogenized by stirring using a magnetic stirrer (400 RPM, 10 min). Subsequently 0.1 mL of Triton X100 (Sigma-Aldrich) was added and homogenized for 5 min plus.
  • formulation 6 was found to have ideal viscosity and surface tension values for injection printing.
  • a 10.0% weight / volume solution of PEG-20K (Aldrich) was prepared by dissolving, in a beaker, 0.100 g of PEG-20K in 8 mL of a 0.01 M aqueous solution of PBS (Sigma-Aldrich). The PEG and PBS solution was homogenized by stirring using a magnetic stirrer (400 RPM, 10 min). Subsequently 0.1 mL of Triton X100 (Sigma-Aldrich) was added and the resulting mixture was homogenized for a further 5 min.
  • formulation 7 was found to have a viscosity of 1.9 mPa-s and a surface tension of 36.70mN / m.
  • a 5.0% weight / volume solution of PEG-40K (Aldrich) was prepared by dissolving, in a beaker, 0.5 g of PEG-40K in 8 mL of a 0.01 M aqueous solution of PBS (Sigma-Aldrich). The PEG and PBS solution was homogenized by stirring using a magnetic stirrer (400 RPM, 10 min). Subsequently 0.1 mL of Triton x100 (Sigma-Aldrich) was added and the mixture was homogenized for a further 5 min.
  • formulation 8 had ideal viscosity and surface tension values for injection printing.

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Abstract

La composición de la invención comprende: (a) polietilenglicol con un peso molecular que está comprendido entre 20000 (20K) y 50000 (50K), en una concentración comprendida entre el 0.5 y el 15 % en peso/volumen; (b) un tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n está comprendido entre 5 y 40, y dicho tensioactivo dicho tensioactivo estando en una concentración comprendida entre el 0.1 y el 2.0% en volumen/volumen; y (c) uno o más ingredientes seleccionados de entre un vehículo líquido, un aglutinante y un aditivo apto para impresión. La composición de la invención se usa en la impresión de moléculas con un interés biológico. Formula (I)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición de tinta para impresión por invección
La presente invención está relacionada con la impresión por inyección y la biología molecular. En particular, la presente invención se refiere a una composición útil en la impresión, mediante inyección, de moléculas de interés biológico, tales como aminoácidos, péptidos y/o proteínas, en un sustrato.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La impresión por inyección de tinta (en inglés "inkjet printing") es un método de impresión ampliamente utilizado en la impresión de textos e imágenes en superficies porosas.
En los últimos años, la tecnología de impresión por inyección se ha aplicado al campo de la biología, con el fin de desarrollar arrays de ácido nucleico o proteína.
Los chips de genes se generan, normalmente, usando plumillas de punta partida con las que se recoge una gota de solución diluida y se deposita en una lámina pretratada, con una resolución de aproximadamente 100 μηι. Así, el DNA se une covalentemente al sustrato. También se han descrito sistemas robóticos que permiten imprimir una librería de DNA en una serie de láminas. Adicionalmente, se han descrito impresoras convencionales para depositar DNA en membranas a 300 dpi, usando impresión de tipo "bubble-jef, sin aparente degradación del DNA, para imprimirlas en vidrio, en un array circular de antígenos en un CD de policarbonato para inmunoensayos, y en un array enzimático sobre filtros de papel. Una alternativa al depósito de oligonucléotidos es la impresión de los reactivos para la síntesis de un DNA de interés in situ, en cada gota que cae sobre la diapositiva. Para cumplir con los requisitos de química combinatoria, se ha desarrollado una impresora de inyección de válvula controlada que permite aplicar 48 reactivos diferentes de depósitos diferentes.
La tecnología de impresión por inyección también se ha aplicado en la fabricación de biosensores. Los arrays de proteína son más problemáticos que los de ácido nucleico ya que el proceso de impresión y unión no debe causar una desnaturalización y pérdida de la función de la proteína.
Existen otras aplicaciones adicionales en la ingeniería de tejidos, así como en la modificación de las superficies poliméricas, lo que permite o evita la unión local de células. También se ha demostrado la impresión por inyección directa de células en suspensión.
Sin embargo, tal y como se ha indicado más arriba, una de las principales limitaciones del uso de la impresión por inyección aplicado al sector de la biología molecular es evitar la desnaturalización/pérdida de función del componente a imprimir (ya sea ácido nucleico, proteína, célula, etc).
Por otro lado, se debe tener en consideración que las composiciones destinadas a la impresión han de cumplir con unos parámetros de viscosidad y tensión superficial. La viscosidad de la tinta debe ser lo suficientemente baja como para dejar que el canal por el que se inyecta se rellene en unos 100 με. La tensión superficial, en cambio, debe ser lo suficientemente alta como para mantener la tinta en la boquilla sin gotear. Un aspecto principal en el diseño de una tinta es el problema de "la primera gota".
Por lo tanto, a pesar de los avances realizados en la impresión por inyección aplicada al sector de la biología molecular, existe la necesidad de encontrar una composición que presente unos parámetros de tensión superficial y viscosidad adecuados para su uso en impresión, sin que se vea afectada negativamente ni la estabilidad de la molécula que se desea imprimir ni su unión al sustrato en el que se aplica.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores de la presente invención han desarrollado una composición de tinta apta para su uso en impresión y que soluciona los problemas referidos más arriba en el estado de la técnica.
Así, en un primer aspecto la presente invención proporciona una composición de tinta que comprende: (a) polietilenglicol con un peso molecular que está comprendido entre 20000 (20K) y 50000 (50K), en una concentración comprendida entre el 0.5 y el 15 % en peso/volumen;
(b) un tensioactivo no iónico de fórmula general (I)
donde
Figure imgf000005_0001
n está comprendido entre 5 y 40
dicho tensioactivo estando en una concentración comprendida entre el 0.1 y el 2.0% en volumen/volumen; y
(c) uno o más ingredientes seleccionados de entre un vehículo líquido, un aglutinante y un aditivo apto para impresión.
En particular, los inventores han descubierto que una composición que incluye un polietilenglicol con un peso molecular en el rango entre 20-50K, en el rango de concentración comprendido entre el 0.5 y el 15 % en peso/volumen, permite: (a) ajustar la viscosidad a unos valores 10-13 mPa-s; (b) obtener una gota homogénea, siendo esférica (tal y como se observa en la FIG. 1); (c) incrementar la cinética del secado de la gota, y (d) minimizar efectos indeseables como por ejemplo el "coffee- ring effecf (ver FIG. 1 y FIG. 2). Este efecto es consecuencia de la evaporación de solvente en una gota y el desplazamiento hacia los bordes de las partículas del material funcional dando lugar a un anillo en lugar de una capa homogénea de tinta.
En una realización del primer aspecto, la presente invención proporciona una composición de tinta que comprende:
(a) polietilenglicol con un peso molecular que está comprendido entre 20000 (20K) y 50000 (50K), en una concentración comprendida entre el 0.5 y el 15 % en peso/volumen;
(b) un tensioactivo no iónico de fórmula general (I)
Figure imgf000005_0002
donde
n está comprendido entre 5 y 40
dicho tensioactivo estando en una concentración comprendida entre el 0.1 y el 1.0% en volumen/volumen; y
(c) uno o más ingredientes seleccionados de entre un vehículo líquido, un aglutinante y un aditivo apto para impresión.
Adicionalmente, los inventores de la presente invención han descubierto que incorporando un tensioactivo no iónico de fórmula (I) en un rango de concentración comprendido entre el 0.1 y el 1.0 % volumen/volumen, se consigue ajusfar la tensión superficial a unos 35 mN/m, la ideal para impresión por inyección. Además, tal y como se muestra más abajo, cuando la concentración del tensioactivo de fórmula general (I) supera el 1 % en volumen, la calidad de la tinta empeora, generándose una especie de espuma que dificulta la formación adecuada de la gota para su inyección a través del orificio del inyector.
Por otro lado, tal y como se muestra más abajo, el efecto asociado a la inclusión del tensioactivo no iónico de fórmula general (I) no se observa con otro tensioactivo ampliamente utilizado en la formulación de composiciones para impresión, como el Tween 80 el cual, para los mismos valores de concentración, da lugar a una tinta con valores de tensión superficial por encima de 45 mN/m, es decir, fuera del rango óptimo para la impresión por inyección. Así, en el caso de usar Tween 80, sería necesaria la incorporación de otros tensioactivos para alcanzar los valores de tensión superficial adecuados para impresión, lo cual encarecería la preparación de la composición y, adicionalmente, pondría en peligro la estabilidad así como la eficacia de la unión de la molécula que se desea imprimir al sustrato.
Ventajosamente, con la inclusión de un tensioactivo no iónico de fórmula general (I) no se requieren otros tensioactivos para ajusfar la tensión superficial de la composición, lo cual supone un gran avance respecto al uso del Tween 80.
Como se ha expuesto más arriba, en el campo de la impresión por inyección de moléculas con interés en el campo biológico, resulta crítico conseguir una composición que sea por un lado apta para impresión, lo que significa que ha de tener unos parámetros adecuados de tensión superficial y viscosidad, y, por otro lado, que respete tanto la estabilidad/actividad de la molécula que se desea imprimir como su anclaje al sustrato sobre el cual tiene lugar la impresión de la composición de la invención.
En este sentido, los inventores de la presente invención han comprobado que con una composición como la del primer aspecto, que incluye PEG en un determinado rango de peso molecular y concentración, así como el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) a una determinada concentración, se obtiene una composición apta para impresión por inyección sin que se vea afectada negativamente ni la estabilidad ni la unión de la molécula que se desea imprimir sobre un sustrato. En particular, los datos experimentales proporcionados más abajo ilustran cómo el marcador fluoresceína-5- tiosemicarbazida (ampliamente utilizando en el campo de la biología como marcador de biomoléculas en el desarrollo de biosensores) queda perfectamente anclado al sustrato funcionalizado (ver FIG. 3). Además, mediante microscopía de fluorescencia se comprueba que se mantiene la actividad fluorescente del marcador, una vez impreso en el sustrato, sin degradación apreciable de su intensidad (ver FIG. 3). Esto es indicativo de que la composición de la invención no afecta negativamente a la actividad de la molécula a ser impresa en el sustrato ni dificulta ni obstaculiza el anclaje de la misma al sustrato.
Otro aspecto destacable de la composición objeto de la presente invención es que no genera agregados, lo que confiere un perfil idóneo a la composición de la invención para ser usada en impresión.
Por todo lo anterior, la composición objeto de la presente invención supone un gran avance en la impresión por inyección aplicado al campo de la biotecnología.
En la presente invención, el término "polietilenglicol" (PEG), también conocido como óxido de polietileno o polioxietileno (POE), es un poliéter formado por un monómero de fórmula (II):
Figure imgf000007_0001
Tradicionalmente, el grado de polimerización se caracteriza por un valor K, que es función de la viscosidad. A mayor grado de polimerización, mayor valor de K. En una realización, el PEG tiene un peso molecular entre 25000 (25K) y 50000 (50K). En otra realización, el PEG tiene un peso molecular entre 20000 (20K) y 40000 (40K). En otra realización, el PEG tiene un peso molecular seleccionado del grupo que consiste en 20000 (20K), 25000 (25K), 35000 (35K), y 40000 (40K). Preferiblemente, el peso molecular del polietilenglicol es de 35000 (35K)
En otra realización, el PEG se encuentra en el rango de concentración peso/volumen comprendido entre el 5 y el 10%. En otra realización, el PEG se encuentra en una concentración peso/volumen entre 6 y 8%. En otra realización, el PEG se encuentra en una concentración peso/volumen del 7.5%.
En otra realización, el PEG es uno de peso molecular 35K y se encuentra en el rango de concentración peso/volumen comprendido entre el 0.5 y el 15%. En otra realización, el PEG es uno de peso molecular 35K y se encuentra en el rango de concentración peso/volumen comprendido entre el 5 y el 10%. En otra realización, el PEG es uno de peso molecular 35K y se encuentra en un rango de concentración peso/volumen comprendido entre el 6 y el 8 %. Preferiblemente, el PEG tiene un peso molecular de 35K y se encuentra a una concentración peso/volumen del 7.5% p/v.
En la presente invención, el tensioactivo no iónico de tipo alcohol alquilarilpoliéter de fórmula general (I) es también conocido comercialmente como Tritón X ® (marca registrada de Union Carbide Co., Inc.). A modo ilustrativo y no limitativo, ejemplos de la serie Tritón X son:
Valor de n en el compuesto de fórmula general (I) i
Tritón X-114 j n = 7-8
Tritón X- 100 i n = 9-10
Tritón X-405 i n = 40
En una realización preferida, el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 (también conocido comercialmente como Tritón X-100).
En otra realización, el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) está a una concentración volumen/volumen comprendida entre 0.5 y 2.0% v/v. En otra realización, el tensioactivo está a una concentración comprendida entre 0.5 y 1.5% v/v. Preferiblemente, el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) está a una concentración del 1.0 % v/v.
En otra realización, el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) está a una concentración volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 0.5% v/v. Preferiblemente, el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) está a una concentración del 0.1 % v/v.
En otra realización, el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 y se encuentra a una concentración volumen/volumen comprendida entre el 0.1 y el 2.0%. En otra realización, el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 y se encuentra en una concentración volumen/volumen comprendida entre el 0.5 y el 1.5%. En otra realización, el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 y se encuentra a una concentración volumen/volumen del 1.0%.
En otra realización, el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 y se encuentra a una concentración volumen/volumen comprendida entre el 0.1 y el 1.0%. En otra realización, el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 y se encuentra en una concentración volumen/volumen comprendida entre el 0.1 y el 0.5%. En otra realización, el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n está comprendido entre 9 y 10 y se encuentra a una concentración volumen/volumen del 0.1 %.
En la presente invención la expresión "concentración en % peso/volumen (% p/v)" se calcula dividiendo los gramos de polietilenglicol añadidos respecto al volumen total de composición (expresados en mililitros) y multiplicando el valor resultante por 100.
En la presente invención la expresión "concentración en % volumen/volumen (% v/v)" se calcula dividiendo el volumen de tensioactivo no iónico respecto al volumen total de composición, estando expresados en las mismas unidades tanto el volumen de tensioactivo como el volumen total de composición, y multiplicando el valor resultante por 100.
En una realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende un PEG con un peso molecular de 35000 (35K) y el tensioactivo no iónico es uno donde n está comprendido entre 9 y 10.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 0.5 y 15%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % v/v comprendida entre 0.1 y 2.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 0.5 y 15%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % v/v comprendida entre 0.1 y 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 5 y 10%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 2.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 5 y 10%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 6 y 8%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 2.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 6 y 8%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración del 7.5% peso/volumen; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 2.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración del 7.5% peso/volumen; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 0.5 y 15%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % v/v comprendida entre 0.5 y 1.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 0.5 y 15%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % v/v comprendida entre 0.1 y 0.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 5 y 10%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.5 y 1.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 5 y 10%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 0.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 6 y 8%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.5 y 1.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 6 y 8%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 0.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración del 7,5% peso/volumen; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.5 y 1.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración del 7,5% peso/volumen; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen comprendida entre 0.1 y 0.5%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 0.5 y 15%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 0.5 y 15%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 0.1 %.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 5 y 10%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 5 y 10%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 0.1 %.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 6 y 8%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen comprendida entre 6 y 8%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 0.1 %.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen del 7,5%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende PEG con un peso molecular de 35K, a una concentración en % peso/volumen del 7,5%; y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I), es uno donde n está comprendido entre 9 y 10, y está a una concentración en % volumen/volumen del 0.1 %.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención es una que comprende:
(a) polietilenglicol con un peso molecular de 20000, a una concentración en % peso/volumen del 10%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%; o alternativamente comprende:
(b) polietilenglicol con un peso molecular de 35000, a una concentración en % peso/volumen del 7.5%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%, o alternativamente comprende:
(c) polietilenglicol con un peso molecular de 40000, a una concentración en % peso/volumen del 5%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención es una que comprende:
(a) polietilenglicol con un peso molecular de 20000, a una concentración en % peso/volumen del 10%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 0.1 %; o alternativamente comprende:
(b) polietilenglicol con un peso molecular de 35000, a una concentración en % peso/volumen del 7.5%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 0.1 %, o alternativamente comprende:
(c) polietilenglicol con un peso molecular de 40000, a una concentración en % peso/volumen del 5%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 0.1 %.
En una realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende una molécula seleccionada del grupo que consiste en biomolécula, un marcador de biomolécula y un marcador de biomolécula conjugado a una biomolécula. En una realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende una biomolécula.
En otra realización, la biomolécula se encuentra en una concentración comprendida entre 0.1 y 1 mg de biomolécula por ml_ de composición.
En la presente invención el término "biomolécula" hace referencia a cualquier molécula generadas por un organismo vivo tales como: proteínas, vitaminas, ácidos nucleicos y carbohidratos, entre otras. Estas biomoléculas se pueden obtener aislándolas del organismo que las produce o bien pueden ser sintetizadas a escala de laboratorio mediante técnicas bien conocidas para el experto en la materia. Las biomoléculas referidas en la presente invención, adicionalmente, son utilizables en biosensores y en ingeniería de materiales. En una realización, la biomolécula es una proteína. En otra realización, la biomolécula es biotina.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende un marcador de biomolécula.
En la presente invención, el término "marcador de biomolécula" incluye cualquier etiqueta cromófora que permite el seguimiento o identificación de una determinada biomolécula. Ejemplos ilustrativos son los fluoróforos. El etiquetado fluorescente es un elemento clave para la detección y análisis de biomoléculas. Actualmente existe una gran cantidad y variedad de fluoróforos. Entre los empleados para el etiquetado de biomoléculas se encuentran el dansilo, la fluoresceína y la rodamina B.
En una realización, el marcador de biomolécula es un fluoróforo.
Cuando la composición de la presente invención incluye un fluoróforo, la composición resultante puede ser utilizada en el desarrollo de biosensores.
En otra realización, el fluoróforo es fluoresceína. En otra realización, dicha fluoresceína está modificada químicamente con un grupo tiosemicarbazida.
La composición del primer aspecto de la invención, junto con el PEG y el tensioactivo no iónico de fórmula general (I) incluye uno o más ingredientes seleccionados de entre un vehículo líquido, un aglutinante y un aditivo apto para impresión.
En la presente invención, el término "vehículo líquido" se entiende como el componente líquido de la composición, que determina su fluidez y sus propiedades de secado. Adicionalmente sirve para fijar la molécula al sustrato.
En una realización, el vehículo líquido es acuoso, es decir, que comprende agua. En otra realización, el vehículo líquido comprende agua y un disolvente orgánico soluble en agua. Ejemplos de disolventes orgánicos solubles en agua son alcoholes. En otra realización, el vehículo líquido comprende agua y un alcohol C1-C10. Ejemplos de alcoholes C1-C10 son: metanol, etanol, propanol, isopropanol, isobutanol, y terc- butanol, entre otros. Preferiblemente, el vehículo líquido es agua.
En la presente invención, el término "aditivo para impresión" se entiende como cualquier otra sustancia que es añadida a la composición de la invención para modificar alguna de sus propiedades. El experto en la materia puede seleccionar entre una amplia lista de aditivos para impresión, tales como tampones de pH, modificadores reológicos y agentes humectantes, entre otros.
En la presente invención, por "modificador reológico" se entiende una sustancia capaz de prevenir la sedimentación de la composición y prevenir salpicaduras de la tinta una vez impresa, entre otros.
En una realización, el aditivo para impresión es un tampón de pH. En otra realización, el tampón de pH se selecciona del grupo que consiste en: Tris-HCI (hidrocloruro de trietanolamina), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), MES (ácido 2-(N- morfolino)etanosulfónico), TAE (trishidroximetilaminometano/acido acético/EDTA), TBE (Tris-HCI/Borato/EDTA), y PBS (tampón fosfato alcalino). Preferiblemente, el tampón de pH es un tampón fosfato alcalino.
En una realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende un vehículo líquido y un aditivo para impresión. En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende agua (como vehículo líquido) y un aditivo para impresión. En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende un vehículo líquido y un tampón de pH (como aditivo para impresión). En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención comprende agua (como vehículo líquido) y un tampón de pH (como aditivo para impresión). Preferiblemente, la composición del primer aspecto de la invención comprende agua (como vehículo líquido) y tampón fosfato alcalino (como aditivo para impresión).
En la presente invención se entiende por "aglutinante" cualquier sustancia que mantiene la cohesión entre el vehículo líquido y la molécula a ser impresa. Ejemplos ilustrativos y no limitativos de aglutinantes son el ácido poliacrílico, resinas acrílicas, y la polivinilpirrolidona.
La preparación de la composición del primer aspecto de la invención se puede llevar a cabo mezclando los diferentes componentes (polietilenglicol, tensioactivo no iónico, molécula de interés biológico, etc) en cualquier orden.
En una realización, la composición del primer aspecto de la invención se prepara mediante un procedimiento que comprende: (a) disolver el polietilenglicol en una solución acuosa; (b) adicionar el tensioactivo no iónico de fórmula general (I); y, opcionalmente, (c) adicionar la molécula de interés biológico.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención se prepara mediante un procedimiento que comprende: (a) disolver el polietilenglicol en una solución acuosa de un tampón de pH; (b) adicionar el tensioactivo no iónico de fórmula general (I); y, opcionalmente, (c) adicionar la molécula de interés biológico.
En otra realización, la composición del primer aspecto de la invención se prepara mediante un procedimiento que comprende: (a) disolver el polietilenglicol en una solución acuosa de tampón fosfato alcalino; (b) adicionar el tensioactivo no iónico de fórmula general (I); y (c) adicionar la molécula de interés biológico.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición según se define más arriba, para la impresión por inyección de una molécula de interés biológico sobre un sustrato, dicha biomolécula siendo seleccionada del grupo que consiste en: una biomolécula, un marcador de biomolécula o una biomolécula conjugada a un marcador. Impresoras basadas en tecnología térmica, piezoeléctrica, electrostática y acústica son comúnmente utilizadas para la impresión por inyección de tinta. Sin embargo, las dos primeras son las más comunes. Los sistemas de impresión basados en tecnología piezoeléctrica son favorecidos sobre la impresión térmica pues no requieren altas temperaturas necesarias para la impresión (200-300°C) lo cual evita la degradación del material fucional.
Entre las impresoras comerciales basadas en tecnología piezoeléctrica más conocidas en el mercado se encuentran Pixdro, Dimatix, Ceradrop.
Los parámetros tenidos en cuenta para la impresión basada en tecnología piezoeléctrica son: frecuencia de voltaje (firing voltaje), forma de onda (waveform), distancia sustrato a imprimir-boquilla de inyección, distancia entre gotas (drop spacing, drsp), y número de capas a aplicar.
En la presente invención, el término "sustrato" se entiende como cualquier material que puede ser imprimible y que está funcionalizado con un grupo a través del cual la molécula de interés impresa se une. Ejemplos ilustrativos y no limitativos de sustrato son sustratos metálicos (como sustratos de oro, silicio o vidrio) modificados con SAMs (monocapas autoensambladas) o sustratos poliméricos (poliestireno (PS) o polimetilmetacrilato (PMMA)). El experto en la materia decidirá, en función de la molécula que desee imprimir, qué tipo de grupo funcional es el más adecuado para incorporarlo al sustrato y así tenga lugar el anclaje de la molécula al sustrato. A modo ilustrativo y no limitativo, si se desea imprimir una molécula de naturaleza aminoacídica, el sustrato se puede funcionalizar con grupos maleimidas, biotina- avidina, grupos carboxílicos (-COOH), aldehidos (-CHO),y ésteres (-COOR, donde el radical R se selecciona de entre un radical C1-C10 alquilo y un radical anillo de 5-6 miembros, dichos miembros siendo seleccionados del grupo que consiste en -C-, -CH-, -CH2-, -O-, -N-, -NH-, y -S-, dicho anillo siendo un anillo aromático, saturado, o parcialmente saturado, y en donde, opcionalmente, uno o más miembros del anillo están sustituidos con uno o más radicales de halógeno). En una realización, el éster es uno donde R es -C6H5 o -C6F5. Alternativamente, en otra realización, el sustrato puede estar funcionalizado con grupos pentafluorofenilmetacrilato (PFM). En otra realización, el sustrato es poliestireno y está funcionalizado con PFM. Procedimientos para llevar a cabo la funcionalización del soporte con el grupo funcional de interés son bien conocidos por el experto en la materia (cfr. Griesser H. J. et al., "Plasma Methods for the Generation of Chemically Reactive Surfaces for Biomolecule Immobilization and Cell Colonization - A Review", Plasma Process. Polym., 2006, vol. 3, p. 392-418; Borros S. et al., "Functionalized, Swellable Hydrogel Layers as a Platform for Cell Studies", Advanced Functional Materials, 2009, vol. 19, p. 1276-1286; Fórch R. "Reactions of Plasma-Polymerised Pentafluorophenyl Methacrylate with Simple Amines", Plasma Processes and Polymers, 2010, vol. 7, p. 915-925). Por ejemplo, en el caso de querer funcionalizar un sustrato con PFM, se puede utilizar la técnica de "injerto de plasma" o "polimerización por plasma". En una realización, el sustrato es PS y está funcionalizado con PFM producido por injerto de plasma o polimerización por plasma
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un sustrato impreso con una composición según se define más arriba.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" incluye el caso "consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1 : comportamiento de la evolución de gotas basadas en PEO-35K a un voltaje de eyección de 25V. Las imágenes estroboscópicas fotos fueron realizadas a los 20 μεβο
Figure imgf000019_0001
FIG. 2: Patrón generado tras la impresión de una tinta formulada en el ejemplo 1 utilizando dos motivos diferentes: a) Líneas drsp= 20μηι y 2 capas b) puntos drsp= 25μΓΠ.
FIG. 3: micrografía de fluorescencia
Figure imgf000020_0001
516 nm) de un patrón generado por la impresión de la composición de tinta formulada en el Ejemplo 1.
FIG. 4: micrografía de fluorescencia
Figure imgf000020_0002
516 nm) de un patrón generado por la impresión de la composición de tinta formulada en el Ejemplo 6.
EJEMPLOS
- Protocolo para determinar la viscosidad de una composición de tinta.
Para determinar la viscosidad de las composiciones formuladas más abajo, se depositaron 450 de la composición sobre la plataforma de análisis de un reómetro Antón Paar. La tinta a analizar se puso en contacto con un plato cónico de 1 mm de diámetro a una distancia entre el plato cónico y la plataforma de análisis de 1 mm. A continuación se aplicó un gradiente de cizalla (shear rate) entre 1 - 102 y 1 -105 s' En este rango el comportamiento de la tinta es newtoniano, es decir que la viscosidad de la tinta no se afecta con la fuerza de cizalla.
- Protocolo para determinar la tensión superficial de una composición de tinta.
Para determinar la tensión superficial de las composiciones formuladas más abajo, se llena una jeringa de dos cuerpos (B/BRAUM) provista de una aguja especialmente diseñada para análisis de tensión superficial con -50 con la tinta formulada. La jeringa está acondicionada con un embolo especial que permite la formación de forma controlada en el extremo de la aguja de la gota a analizar. Un software especial calcula el radio de curvatura de la gota mediante la ecuación de Laplace-Young y determina la tensión superficial.
Ejemplo 1. Preparación de la biotinta 1
Se preparó una solución de PEG-35K (Aldrich) al 7.5 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.75 g de PEG-35K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizo mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.01 mL de Tritón X100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizo durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 μ\- de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0.43 M en dimetilformamida (DMF, Sigma- Aldrich). La mezcla resultante se homogenizo durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la composición resultante se filtró sucesivamente con filtros de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0.45 μηι y 0.2 μηι de diámetro.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación 1 tenía una viscosidad de 11.20+ 1.1 mPa-s y una tensión superficial de 35.53+0.3 mN/m.
Ejemplo 2. Preparación de la biotinta 2
Se preparó una solución de PEG-20K (Aldrich) al 10.0 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.100 g de PEG-20K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizo mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.01 mL de Tritón X100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizo la mezcla resultante durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 μ\- de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0,43 M en dimetilformamida (DMF) y la mezcla se homogenizo durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la tinta resultante se filtró sucesivamente con filtros de PVDF de 0.45 μηι y 0.2 μηι de diámetro.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación tenía una viscosidad de 13.2±2, 1 mPa-s y una tensión superficial de 35.81±0,7 mN/m.
Ejemplo 3. Preparación de la biotinta 3
Se preparó una solución de PEG-40K (Aldrich) al 5.0 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.5 g de PEG-40K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.01 ml_ de Tritón x100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizó la mezcla durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 μΙ_ de una disolución de fluoresceína-5- tiosemicarbazida (Fluka) 0.43 M en dimetilformamida (DMF) y la mezcla resultante se homogenizó durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 ml_. Finalmente, la tinta resultante se filtró sucesivamente con filtros de PVDF de 0.45 μηι y 0.2 μηι de diámetro.
Ejemplo 4: efecto del tensioactivo de fórmula (I)
A. Efecto de la concentración superior al 1 %.
A partir de la composición de biotinta del ejemplo 1 , se determinó el efecto que tenía sobre las propiedades de la misma, un incremento en el % de tensioactivo no iónico.
Para ello, se formularon 2 composiciones, partiendo de la descrita en el Ejemplo 1 , en donde se incorporaron las siguientes cantidades de Tritón X100 (tensioactivo no iónico de fórmula general (I), donde n es 9-10): 0.15ml_ y 0.20 ml_ en 10ml_ de disolución.
En el momento de homogenizar las diferentes composiciones se observó la formación de espuma.
Este fenómeno interfirió negativamente en la impresión de la tinta, ya que durante la impresión de la misma, en el interior de la recámara del sistema piezoeléctrico, se generó una gran cantidad de espuma, difícil de controlar, que dio lugar a la inyección de burbujas. En ningún caso fue posible la formación de gotas.
Por lo tanto, este ensayo demuestra que la cantidad de tensioactivo no iónico de fórmula general (I) es crítico para conseguir una composición adecuada para inyección, que dé lugar a una gota homogénea.
B. Efecto del tensioactivo Tween 80 Para el caso del Tween 80, se prepararon tintas como las descritas en los ejemplos 1 y 2 para cada polietilenglicol, sustituyendo la solución de Tritón X-100 por una de Tween 80 (Sigma-Aldrich). Y variando la proporción de Tween 80 en un rango de 0.1 a 1 %v/v.
B.1. Se preparó una solución de PEG-35K (Aldrich) al 7.5% peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.75 g de PEG-35K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron diferentes cantidades de Tween 80 (Sigma-Aldrich) en un rango de 0.1-1 mLy se homogenizó durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 μ\- de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0.43 M en dimetilformamida (DMF). La mezcla resultante se homogenizó durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la tinta resultante se filtró sucesivamente con filtros de PVDF de 0.45 μηι y 0.2μηι de diámetro. Los resultados de tensión superficial se resumen en la Tabla 1 :
Tabla 1
Figure imgf000023_0001
Como puede observarse, las formulaciones que incluían Tween 80 mostraban una tensión superficial aproximadamente un 40% superior al valor mostrado por la formulación de biotinta 1.
B.2. Se preparó una solución de PEG-20K (Aldrich) al 10% peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.1 g de PEG-20K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron diferentes cantidades de Tween 80 (Sigma-Aldrich) en un rango de 0.1-1 mLy se homogenizó durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 μ\- de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0.43M en dimetilformamida (DMF). La mezcla resultante se homogenizó durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la tinta resultante se filtró sucesivamente con filtros de PVDF de 0.45 μηι y 0.2μηι de diámetro. Los resultados de tensión superficial se resumen en la Tabla 2:
Tabla 2
Figure imgf000024_0001
Como puede observarse, las formulaciones que incluían Tween 80 mostraban una tensión superficial al menos un 30% superior al valor mostrado por la formulación de biotinta 2.
Por lo tanto, los datos mostrados en esta sección muestran que la elección del tensioactivo de fórmula general (I) en el rango de concentración de 0.1-1.0% en v/v, resulta crítico para ajusfar de manera adecuada la tensión superficial de la tinta.
Ejemplo 5. Impresión de las biotintas
Con la ayuda de una jeringa, se llenó un cartucho de impresión (DMP 1 1610) con aproximadamente 0,5 mL de la biotinta formulada en el ejemplo 1. Se adaptó el sistema piezoeléctrico (el cual estaba provisto de inyectores de 10pL) y el sistema se dejó reposar durante 2h, permaneciendo los inyectores en posición hacia abajo. Posteriormente se colocó el cartucho en el holder de la impresora y mediante una cámara estroboscópica de la impresora DMP 1 1610 se observó el comportamiento de las gotas generadas en la boquilla de inyección y su comportamiento. Para llevar a cabo estas pruebas de impresión se ajusta el pulso de la boquilla del eyector y el voltaje de disparo. Para el pulso de la boquilla, se controla el tiempo de entrada, de permanencia y de salida de la gota en la cámara, estos son 3.584με, 10,688μsy 7,29με respectivamente. El voltaje de disparo se ajusta a 25V (para PEG 35K y PEG 40K), y 21V (para PEG 20K). Se tomaron imágenes estroboscópicas a los 20μεβο (a) y δθεμεβο (b) (FIG. 1 (a) y (b)) De las resultados obtenidos cabe destacar que la gota inyectada era homogénea y no había rastro del efecto coffee-ring. Además, se comprobó que la gota se secaba de manera inmediata, una vez inyectada. No se observó la formación de agregados, lo que confiere un perfil idóneo a la composición de la invención para ser usada en impresión.
Una vez establecidas las condiciones ideales de gota, se puso el sustrato que se quería imprimir (en este caso el sustrato es PS-PFM, suministrado por el grupo de ingeniería de materiales GEMAT, Instituto Químico de Sarriá), sobre la plataforma de impresión y se estableció que la distancia mínima de separación entre el sustrato y el cartucho de impresión era de 1 mm. Por último, se definió el motivo a imprimir, la distancia entre gotas (drop spacing) y el número de capas a imprimir. Para la impresión de líneas se escogió un drsp de 20μηι y se aplicaron dos capas de la biotinta. Para la impresión de puntos, se escogió un drsp. de 25μηι y se aplicó sólo una sola capa de la biotinta.
De esta manera, se imprimieron líneas horizontales con un espaciado de 20μΙ_ entre gotas y aplicando dos capas de biotinta sobre el sustrato, obteniendo los resultados que se muestran en la FIG. 2.
De los resultados obtenidos cabe destacar que la gota inyectada era homogénea y no había rastro del efecto coffee-ring. Además, se comprobó que la gota se secaba de manera inmediata, una vez inyectada.
No se observó la formación de agregados, lo que confiere un perfil idóneo a la composición de la invención para ser usada en impresión.
Finalmente, se analizaron por microscopía de fluorescencia (Leika DMRA 2 equipado con un filtro específico 113 para fluorocromos) en el rango
Figure imgf000025_0001
516 nm, los sustratos impresos con la tinta formulada en el ejemplo I, generándose las imágenes de FIG. 3.
De los resultados que se muestran en FIG. 3, destaca, en primer lugar, que la molécula fluorescente queda anclada a la superficie del sustrato, lo que es indicativo de que ha tenido lugar la reacción entre los grupos amino primarios del marcador y los grupos PFM del sustrato para dar lugar a una amida. Esto es indicativo de que la composición de la invención no obstaculiza la unión de la molécula de interés al sustrato y que, por lo tanto, se supera la problemática del "efecto pantalla".
De FIG. 3 también se observa que la línea impresa es de una elevada definición y resolución (40μηι).
Finalmente, se observó que la molécula anclada mantenía su propiedad fluorescente durante un largo periodo de tiempo. Esto es indicativo de que la composición de la invención no afecta negativamente a la estabilidad/actividad de la molécula impresa.
Ejemplo 6. Preparación de la biotinta 4
Se preparó una solución de PEG-35K (Aldrich) al 7.5 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.75 g de PEG-35K en 8 ml_ de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.1 ml_ de Tritón X100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizó la mezcla durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 μΙ_ de una disolución de biotina (biotinyl-3,6,9-trioxaundecanediamine, Thermo Scientific) 0.042 M en PBS y la mezcla resultante se homogenizó durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación 4 tenía una viscosidad de 14.30+ 0.1 mPa-s y una tensión superficial de 36.10+0.02 mN/m.
Ejemplo 7. Preparación de la biotinta 5
Se preparó una solución de PEG-20K (Aldrich) al 10% peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 1 g de PEG-20K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizó mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.1 mL de Tritón X100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizó la mezcla durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 μΙ_ de una disolución de biotina (biotinyl-3,6,9- trioxaundecanediamine, Thermo Scientific) 0.042 M en PBS y la mezcla resultante se homogenizó durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación 5 tenía una viscosidad de 10.10+ 0.1 mPa-s y una tensión superficial de 36.45+0.05 mN/m.
Ejemplo 8. Impresión biotinta 4
Con la ayuda de una jeringa, se llenó un cartucho de impresión (DMP 1 1610) con aproximadamente 0,5 mL de la biotinta formulada en el ejemplo 6. Se adaptó el sistema piezoeléctrico (el cual estaba provisto de inyectores de 10pL) y el sistema se dejó reposar durante 2h, permaneciendo los inyectores en posición hacia abajo. Posteriormente se colocó el cartucho en el holder de la impresora y mediante una cámara estroboscópica de la impresora DMP 1 1610 se observó el comportamiento de las gotas generadas en la boquilla de inyección y su comportamiento. Para llevar a cabo estas pruebas de impresión se ajusta el pulso de la boquilla del eyector y el voltaje de disparo. Para el pulso de la boquilla, se controla el tiempo de entrada, de permanencia y de salida de la gota en la cámara, estos son 3.584με, 10,688μsy 7,29με respectivamente. El voltaje de disparo se ajusta a 27V.
De las resultados obtenidos cabe destacar que la gota inyectada era homogénea y no había rastro del efecto coffee-ring. Además, se comprobó que la gota se secaba de manera inmediata, una vez inyectada. No se observó la formación de agregados, lo que confiere un perfil idóneo a la composición de la invención para ser usada en impresión.
Una vez establecidas las condiciones ideales de gota, se puso el sustrato que se quería imprimir (en este caso el sustrato es PS-PFM, suministrado por el grupo de ingeniería de materiales GEMAT, Instituto Químico de Sarriá), sobre la plataforma de impresión y se estableció que la distancia mínima de separación entre el sustrato y el cartucho de impresión era de 1 mm. Por último, se definió el motivo a imprimir, la distancia entre gotas (drop spacing) y el número de capas a imprimir. Para la impresión de líneas se escogió un drsp de 20μηι. De esta manera, se imprimieron líneas horizontales con un espaciado de 20μΙ_ entre gotas.
De los resultados obtenidos cabe destacar que la gota inyectada era homogénea y no había rastro del efecto coffee-ring. Además, se comprobó que la gota se secaba de manera inmediata, una vez inyectada.
No se observó la formación de agregados, lo que confiere un perfil idóneo a la composición de la invención para ser usada en impresión.
Una vez impresa la biotinta del ejemplo 6, los sustratos se incubaron en 20μΙ de solución de Estreptavidina (FITC, Invitrogen) durante 1 minuto y posteriormente se limpiaron con una solución de PBS 0.01 M (Sigma Aldrich) y secado con un flujo de nitrógeno.
Finalmente, se analizaron por microscopía de fluorescencia Leika DMRA 2 equipado con un filtro específico 113 para fluorocromos en el rango
Figure imgf000028_0001
516 nm, los sustratos impresos con la tinta formulada en el ejemplo 6 generándose las imágenes de FIG. 4.
De los resultados que se muestran en FIG. 4, destaca, en primer lugar, que la molécula queda anclada a la superficie del sustrato, lo que es indicativo de que ha tenido lugar la reacción entre los grupos amino primarios del marcador y los grupos PFM del sustrato para dar lugar a una amida. Esto es indicativo de que la composición de la invención no obstaculiza la unión de la molécula de interés al sustrato y que, por lo tanto, se supera la problemática del "efecto pantalla".
Ejemplo 9. Preparación de la biotinta 6
Se preparó una solución de PEG-35K (Aldrich) al 7.5 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.75 g de PEG-35K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizo mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.1 mL de Tritón X100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizo durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 μΙ_ de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0.43 M en dimetilformamida (DMF, Sigma- Aldrich). La mezcla resultante se homogenizo durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la composición resultante se filtró sucesivamente con filtros de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0.45 μηι y 0.2 μηι de diámetro.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación 6 tenía unos valores de viscosidad y tensión superficial ideales para la impresión por inyección.
Ejemplo 10. Preparación de la biotinta 7
Se preparó una solución de PEG-20K (Aldrich) al 10.0 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.100 g de PEG-20K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizo mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.1 mL de Tritón X100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizo la mezcla resultante durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 μ\- de una disolución de fluoresceína-5-tiosemicarbazida (Fluka) 0,43 M en dimetilformamida (DMF) y la mezcla se homogenizo durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la tinta resultante se filtró sucesivamente con filtros de PVDF de 0.45 μηι y 0.2 μηι de diámetro.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación 7 tenía una viscosidad de 1 1.9 mPa-s y una tensión superficial de 36.70mN/m.
Ejemplo 11. Preparación de la biotinta 8
Se preparó una solución de PEG-40K (Aldrich) al 5.0 % peso/volumen disolviendo, en un vaso de precipitados, 0.5 g de PEG-40K en 8 mL de una disolución acuosa de PBS 0.01 M (Sigma-Aldrich). La solución de PEG y PBS se homogenizo mediante agitación usando un agitador magnético (400 RPM, 10 min). Posteriormente se adicionaron 0.1 mL de Tritón x100 (Sigma-Aldrich) y se homogenizo la mezcla durante 5 min más. A la solución resultante se le adicionaron 60 μΙ_ de una disolución de fluoresceína-5- tiosemicarbazida (Fluka) 0.43 M en dimetilformamida (DMF) y la mezcla resultante se homogenizó durante 1 min. La solución resultante se transfirió a un tubo tipo falcon y se enrasó con la solución tamponada de PBS 0.01 M hasta 10 mL. Finalmente, la tinta resultante se filtró sucesivamente con filtros de PVDF de 0.45 μηι y 0.2 μηι de diámetro.
Siguiendo los protocolos de arriba, se encontró que la formulación 8 tenía unos valores de viscosidad y tensión superficial ideales para la impresión por inyección.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Composición de tinta que comprende:
(a) polietilenglicol con un peso molecular que está comprendido entre 20000 (20K) y 50000 (50K), en una concentración comprendida entre el 0.5 y el 15 % en peso/volumen;
(b) un tensioactivo n
Figure imgf000031_0001
donde
n está comprendido entre 5 y 40
dicho tensioactivo estando en una concentración comprendida entre el 0.1 y el 2.0% en volumen/volumen; y
(c) uno o más ingredientes seleccionados de entre un vehículo líquido, un aglutinante y un aditivo apto para impresión.
2. Composición de tinta según la reivindicación 1 , en donde la concentración de tensioactivo está comprendida entre 0.1 y 1.0% v/v.
3. Composición de tinta según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende una molécula seleccionada del grupo que consiste en: una biomolécula, un marcador de biomolécula o una biomolécula conjugada a un marcador.
4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la concentración de polietilenglicol está comprendida entre 6 y 8 % en peso/volumen.
5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polietilenglicol tiene un peso molecular de 35.000 (35K) y la concentración está comprendida entre el 6 y el 8% en peso/volumen.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tensioactivo de fórmula general (I) es uno en el que n tiene un valor comprendido entre 9 y 10.
7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el tensioactivo de fórmula general (I) está en una concentración comprendida entre el 0.1 y el 1.0 % en volumen/volumen.
8. Composición según la reivindicación 7, en donde el tensioactivo de fórmula general (I) está en una concentración del 1.0% en volumen/volumen.
9. Composición según la reivindicación 7, en donde el tensioactivo de fórmula general (I) está en una concentración del 0.1 % en volumen/volumen.
10. Composición de tinta según la reivindicación 1 que comprende:
(a) polietilenglicol con un peso molecular de 20000, a una concentración en % peso/volumen del 10%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%; o, alternativamente, comprende:
(b) polietilenglicol con un peso molecular de 35000, a una concentración en % peso/volumen del 7.5%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%, o, alternativamente, comprende:
(c) polietilenglicol con un peso molecular de 40000, a una concentración en % peso/volumen del 5%; y tensioactivo no iónico de fórmula general (I) donde n= 9-10, a una concentración en % volumen/volumen del 1.0%.
1 1. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un vehículo líquido y un aditivo para impresión.
12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aditivo es un tampón de pH.
13. Composición según la reivindicación 12, en donde el tampón es tampón fosfato alcalino.
14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el vehículo líquido es agua.
15. Uso de una composición según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1- 14 para la impresión por inyección de una molécula sobre un sustrato, dicha molécula siendo seleccionada del grupo que consiste en: una biomolécula, un marcador de biomolécula o una biomolécula conjugada a un marcador.
16. Sustrato impreso con una composición según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
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