ES2785306T3 - Nuevos agentes de unión a HA - Google Patents

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Abstract

Una molécula de anticuerpo capaz de unirse a hemaglutinina (HA), que comprende: (a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende: una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68); una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69); y una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70); y (b) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende: una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-D-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:145); una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73).

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos agentes de unión a HA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente descripción se refiere a agentes de unión novedosos, por ejemplo, agentes peptídicos, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a la proteína hemaglutinina de virus de gripe y, en algunas realizaciones, neutralizan el virus y procedimientos para su uso.
ANTECEDENTES
[0002] La gripe es una enfermedad infecciosa causada por virus de ARN de la familia Orthomyxoviridae (los virus de gripe). Los virus de gripe se clasifican en función de la proteína central en tres géneros A, B y C, que se dividen adicionalmente en subtipos determinados por las glucoproteínas de envoltura viral hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Los virus de gripe A infectan una serie de especies de mamíferos y aves, mientras que las infecciones de tipo B y C se limitan en gran medida a los seres humanos. Sólo los tipos A y B causan enfermedades humanas de interés.
[0003] Las altas tasas de mutación y las frecuentes reasignaciones genéticas de los virus de gripe contribuyen a una gran variabilidad de los antígenos de HA y NA. Las mutaciones puntuales menores que causan pequeños cambios ("deriva antigénica") ocurren con relativa frecuencia. La deriva antigénica permite que el virus evada el reconocimiento inmunitario, lo que da como resultado brotes repetidos de gripe durante los años interpandémicos. Los principales cambios en el antígeno de HA ("deriva antigénica") son causados por la reasignación de material genético de diferentes subtipos de gripe A. Las derivas antigénicas que dan lugar a nuevas cepas pandémicas son acontecimientos raros, que se producen a través de la reasignación entre subtipos animales y humanos, por ejemplo, en cerdos coinfectados.
[0004] La gripe A se propaga por todo el mundo en epidemias estacionales, dando como resultado la muerte de entre 250.000 y 500.000 personas cada año, y hasta millones en algunos años de pandemia. En promedio, 41.400 personas murieron cada año en Estados Unidos entre 1979 y 2001 a causa de la gripe.
RESUMEN
[0005] Basándose en la descripción contenida en el presente documento, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo capaz de unirse a la hemaglutinina (HA), que comprende:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO: 68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69); y una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO: 70); y (b) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-D-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 145);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73).
[0006] En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada y una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera de la molécula de anticuerpo de la invención.
[0007] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención.
[0008] En aún un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula que comprende:
(a) un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada y un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera; o
(b) un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera.
[0009] En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para elaborar la molécula de anticuerpo de la invención, que comprende proporcionar una célula huésped de la invención y expresar los ácidos nucleicos en la célula huésped, produciendo así la molécula de anticuerpo.
[0010] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo de la invención para su uso en la prevención o tratamiento de una infección con un virus de gripe en un sujeto humano, opcionalmente en la que la gripe es gripe A, opcionalmente en la que el virus de gripe es: (i) una cepa del Grupo 1; (ii) una cepa del Grupo 2; (iii) una cepa H1, H3, H5, H7 o H9; o (iv) una cepa H1N1, H3N2 o H5N1.
[0011] En aún un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar un virus de gripe en una muestra biológica o determinar si un paciente está infectado con gripe, que comprende poner en contacto la muestra o una muestra del paciente con la molécula de anticuerpo de la invención, y detectar la unión de la molécula de anticuerpo a la muestra o un polipéptido en la muestra, detectando así el virus de gripe en la muestra o determinar si el paciente está infectado con gripe.
[0012] En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la molécula de anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0013] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un kit que comprende la molécula de anticuerpo de la invención; y un vehículo o tampón de administración farmacéuticamente aceptable, un dispositivo de administración, o ambos.
[0014] La presente invención y algunas realizaciones preferidas de la misma se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
[0015] La descripción se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de anticuerpos anti-HA humanos que comprenden propiedades funcionales y estructurales descritas en el presente documento, por ejemplo, anticuerpos que se unen a una región conservada o epítopo en el virus de gripe y usos de los mismos.
[0016] Por consiguiente, la descripción presenta agentes de unión, por ejemplo, moléculas o preparaciones de anticuerpo, o preparaciones aisladas de las mismas, que se unen a hemaglutinina (HA) de virus de gripe. En un ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, es de amplio espectro, y se une a más de una HA, por ejemplo, una HA de una o ambas cepas del Grupo 1 o del Grupo 2 de virus de gripe A y/o una o más cepas de virus de gripe B. Por lo tanto, en algunos casos, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se presenta en la descripción, puede tratar o prevenir la infección por un virus de gripe del Grupo 1 y un virus de gripe del Grupo 2. En otros casos, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se presenta en la descripción, puede tratar o prevenir la infección por un virus de gripe A y un virus de gripe B. Los agentes de unión, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, comparten suficiente similitud estructural con anticuerpos o regiones variables descritas en el presente documento de tal forma que poseen atributos funcionales de los anticuerpos descritos en el presente documento. En algunos ejemplos, la similitud estructural puede ser en términos de estructura tridimensional o secuencia lineal de aminoácidos, o ambas.
[0017] En un aspecto, la descripción presenta un agente de unión anti-hemaglutinina (anti-HA), por ejemplo, un agente de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, o preparación, o una preparación aislada de la misma, que comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades:
(a) no produce ningún mutante de escape según se determina por el fracaso de un título viral para recuperarse después de al menos 10, 9, 8, 7, 6 o 5 rondas de infecciones seriadas en cultivo celular con una mezcla de la molécula de anticuerpo y un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004;
(b) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67-11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114, o CR6261, por ejemplo, cuando se ensaya mediante el procedimiento descrito en (a);
(c) previene la infección por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 1, y por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 2;
(d) inhibe la actividad fusogénica de la HA diana;
(e) trata o previene la infección por un virus del Grupo 1, por ejemplo, cuando el virus es un virus H1, H5 o H9; y trata o previene la infección por un virus del Grupo 2, por ejemplo, cuando el virus es un virus H3 o H7;
(f) trata o previene la infección por las cepas de gripe A H1N1 y H3N2;
(g) es eficaz para la prevención o el tratamiento de la infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H1N1 y H3N2 cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg;
(h) trata o previene la infección por cepas H5N1 de gripe A;
(i) es eficaz para la prevención o el tratamiento de la infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H5N1 cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg;
(j) la concentración de molécula de anticuerpo requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe A es inferior a 10 pg/ml;
(k) trata o previene la infección por un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010;
(l) es eficaz para la prevención o el tratamiento de la infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, cuando se administra a 10 mg/kg, 6 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg;
(m) la concentración de molécula de anticuerpo requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, es inferior a 10 pg/ml;
(n) previene o minimiza una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o efectos de la misma en un sujeto;
(o) es eficaz para prevenir o minimizar una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o efectos de la misma en un sujeto cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg;
(p) se une a un epítopo que comprende o consiste en la interfaz trimérica de hemaglutinina; y
(q) se une a un epítopo distinto al unido por una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67­ 11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114, o CR6261, por ejemplo, según se determina mediante análisis estructural, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X o espectroscopia de RMN;
(r) en un ejemplo, se une a un epítopo, por ejemplo, tiene un epítopo que se superpone con o es el mismo que, de un anticuerpo descrito en el presente documento, por ejemplo, según se determina mediante análisis mutacional o análisis de estructura cristalina.
[0018] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, tiene una o más de las siguientes características: la molécula de anticuerpo anti-HA previene la infección por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 1, y por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 2; la concentración de la molécula de anticuerpo anti-HA requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe A es inferior a 10 pg/ml; o la molécula de anticuerpo anti-HA se une a un epítopo que comprende o consiste en la interfaz trimérica de hemaglutinina.
[0019] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, que se presenta en la descripción, trata o previene la infección por un virus del Grupo 1, tal como cuando el virus es un virus H1, H2, H5, H6, H8, H9, H12, H11, H13, H16, o H17; y trata o previene la infección por un virus del Grupo 2, como cuando el virus es un virus H3, H4, H7, H10 o H15.
[0020] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, que se presenta en la descripción, previene la infección por al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 subtipos de gripe del Grupo 1, y por al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 subtipos de gripe del Grupo 2.
[0021] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, que se presenta en la descripción, trata o previene la infección por uno o más de H1N1, H2N2, H5N1 y H9N2, y también trata o previene la infección por uno o más de H3N2 y H7N7.
[0022] En un ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une y, en algunos ejemplos, neutraliza:
al menos una cepa del clúster del Grupo 1 H1, por ejemplo, H1a o H1b, y al menos una cepa del clúster del Grupo 2 H3 o H7.
[0023] En un ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une y, en algunos ejemplos, neutraliza:
al menos una cepa del clúster del Grupo 1 H1, por ejemplo, H1a o H1b, y al menos una cepa de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010.
[0024] En un ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une y, en algunos ejemplos, neutraliza:
al menos una cepa del clúster del Grupo 2 H3 o H7, y al menos una cepa de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010.
[0025] En un ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une y, en algunos ejemplos, neutraliza:
al menos una cepa del clúster del Grupo 1 H1, por ejemplo, H1a o H1b, al menos una cepa del clúster del Grupo 2 H3 o H7, y al menos una cepa de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010.
[0026] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, que se presenta en la descripción, trata o previene la infección por uno o más virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010.
[0027] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo anti-HA no es una molécula de anticuerpo anti-HA descrita previamente en la técnica. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo anti-HA es distinta de uno o más o la totalidad de Ab 67-11 (solicitud provisional de EE.UU. N.° 61/645.453), FI6 (FI6, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier secuencia FI6 descrita específicamente en la solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813, la solicitud publicada de EE.UU. N.° 2011/0274702, el documento WO2013/011347 o Corti et al., Science 333:850-856, 2011, publicado en línea el 28 de julio de 2011; Las figuras 12A a 12C), FI28 (solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813), C179 (Okuno et al., J. Virol. 67:2552-1558, 1993), F10 (Sui et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 16:265, 2009), CR9114 (Dreyfus et al., Science. 2012; 337(6100):1343-1348; publicado en línea el 9 de agosto de 2012), o CR6261 (Ekiert et al., Science 324:246-251, 2009; publicado en línea el 26 de febrero de 2009).
[0028] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, neutraliza la infección con H1N1 y H3N2 in vitro. En otro aspecto, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti­ HA, neutraliza la infección con H1N1 y H3N2 in vivo.
[0029] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, neutraliza la infección con H5N1 in vitro. En otro aspecto, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, neutraliza la infección con H5N1 in vivo.
[0030] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, neutraliza la infección con un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, in vitro. En otro ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, neutraliza la infección con un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, in vivo.
[0031] En otro ejemplo, la concentración del agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, necesaria para la neutralización del 50 % del virus de gripe A es de 10 pg/ml o menos, tal como 9 pg/ml o menos, 8 pg/ml o menos, 7 pg/ml o menos, 6 pg/ml o menos, o 5 pg/ml o menos.
[0032] En otro aspecto, la concentración del agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti­ HA, necesaria para neutralizar al 60 % el virus de gripe A, neutralizar al 50 % el virus de gripe A, o neutralizar al 40 % el virus de gripe A es de 10 pg/ml o menos, tal como 9 pg/ml o menos, 8 pg/ml o menos, 7 pg/ml o menos, 6 pg/ml o menos, o 5 pg/ml o menos.
[0033] En aún otro ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, es eficaz para la prevención o el tratamiento de una infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H1N1 y H3N2, tal como cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 1,0 mg/kg o menos.
[0034] En aún otro ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, es eficaz para la prevención o el tratamiento de una infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H5N1, tal como cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 1,0 mg/kg o menos.
[0035] En otro ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, es eficaz para el tratamiento o prevención de un virus del Grupo 1, donde el virus del Grupo 1 es H1, H5 o H9, y en otro ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, es eficaz para el tratamiento o prevención de un virus del Grupo 2, donde el virus del Grupo 2 es H3 o H7.
[0036] En otro ejemplo, la concentración del agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti­ HA, necesaria para la neutralización del 50 % del virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, es de 10 pg/ml o menos, tal como 9 pg/ml o menos, 8 pg/ml o menos, 7 pg/ml o menos, 6 pg/ml o menos, o 5 pg/ml o menos.
[0037] En otro ejemplo, la concentración del agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti­ HA, necesaria para neutralizar al 60 % el virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, neutralizar al 50 % el virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, o neutralizar al 40 % el virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, es de 10 pg/ml o menos, tal como 9 pg/ml o menos, 8 pg/ml o menos, 7 pg/ml o menos, 6 pg/ml o menos, o 5 pg/ml o menos.
[0038] En otro aspecto, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, es un anticuerpo tetramérico de longitud completa, un anticuerpo monocatenario (scFv), un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, o un fragmento Fd. En otro ejemplo, la cadena pesada de la molécula de anticuerpo es una cadena pesada y1 y, aún en otro ejemplo, la cadena ligera de la molécula de anticuerpo es una cadena ligera k o una cadena ligera A. En aún otro ejemplo, la molécula de anticuerpo anti-HA que se presenta en la descripción es un anticuerpo IgG1.
[0039] En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o la totalidad de las siguientes propiedades a-f:
a) incluye, dos o todos los residuos de H3 HA1 N38, I278 y D291;
b) incluye el residuo de H3 HA2 N12;
c) no incluye uno, dos o ninguno de los residuos de H3 HA1 Q327, T328 y R329;
d) no incluye uno, dos, tres, cuatro o ninguno de los residuos de H3 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
e) incluye uno, dos o todos los residuos de H3 HA1 T318, R321 y V323; o
f) incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o todos los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, y E57.
[0040] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a; y b.
[0041] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: c; y d.
[0042] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a; y c o d.
[0043] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: b; y c o d.
[0044] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: c; y a o b.
[0045] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: d; y a o b.
[0046] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a, b, c y d.
[0047] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a, b, c, d, e y f.
[0048] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H3 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta al menos 2, 5, 10 o 100 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
a) los residuos de H3 HA1 N38, 1278 o D291;
b) el residuo de H3 HA2 N12;
c) los residuos de H3 HA1T318, R321 o V323; o
d) los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, o E57.
[0049] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H3 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta no más de 2 o 5 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
c) los residuos de H3 HA1 Q327, T328 o R329; o
d) los residuos de H3 HA2 G1, L2, F3, G4 o D46.
[0050] En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o la totalidad de las siguientes propiedades a-f:
aa) incluye uno, dos o todos los residuos de H1 HA1 H31, N279 y S292;
bb) incluye el residuo de H1 HA2 G12;
cc) no incluye uno o ninguno de los residuos de H1 HA1 Q328 y S329;
dd) no incluye uno, dos, tres, cuatro o ninguno de los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
ee) incluye uno, dos o ninguno de los residuos de H1 HA1 T319, R322 y 1324 que están unidos por Ab 044 y FI6; o
ff) incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o todos los residuos de H1 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57
[0051] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa; y bb.
[0052] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: cc; y dd.
[0053] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa; y cc o dd.
[0054] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: bb; y cc o dd.
[0055] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: cc; y aa o bb.
[0056] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: dd; y aa o bb.
[0057] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa, bb, cc y dd.
[0058] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa, bb, cc, dd, ee y ff.
[0059] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H1 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta al menos 2, 5, 10 o 100 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
aa) los residuos de H1 HA1 H31, N279 y S292;
bb) el residuo de H1 HA2 G12;
cc) los residuos de H1 HA1 T319, R322 y 1324; o
dd) los residuos de H1 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57.
En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H1 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta no más de 2 o 5 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
cc) los residuos de H1 HA1 Q328 y S329; o
dd) los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
[0060] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una, dos, tres o la totalidad de las siguientes propiedades:
a y aa;
b y bb;
c y cc;
d y dd.
[0061] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades c, cc, d y dd.
[0062] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, un agente de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos, o más del 60, 65, 70, 75, 80, 85, 87, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con una región variable de cadena pesada de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 2, figura 13 o figura 17; y
una región variable de cadena ligera que comprende al menos, o más del 60, 65, 70, 75, 80, 85, 87, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la región variable de cadena ligera de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 3, figura 14 o figura 17.
[0063] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada 25 (SEQ ID NO:25), o una región variable de cadena pesada relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento.
[0064] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera 52 (SEQ ID NO:52), 155 (SEQ ID NO:155) o 45 (SEQ ID NO:45), o una región variable de cadena ligera relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento.
[0065] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende:
una región variable de cadena pesada 25 (SEQ ID NO:25), o una región variable de cadena pesada relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento; y
una región variable de cadena ligera 52 (SEQ ID NO:52), 155 (SEQ ID NO:155) o 45 (SEQ ID NO:45), o una región variable de cadena ligera relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento.
[0066] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una, dos o la totalidad de la CDR1, CDR2 y CDR3, de la región variable de cadena pesada 25 (SEQ ID NO:25), o una región variable de cadena pesada relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento.
[0067] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una, dos o la totalidad de la CDR1, CDR2 y CDR3, de la región variable de cadena ligera 52 (SEQ ID NO:52), 155 (SEQ ID NO:155) o 45 (SEQ ID NO:45), o una secuencia relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento.
[0068] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende:
una región variable de cadena pesada que comprende una, dos o la totalidad de la CDR1, CDR2 y CDR3, de la región variable de cadena pesada 25 (SEQ ID NO:25), o una región variable de cadena pesada relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento; y
una región variable de cadena ligera que comprende una, dos o la totalidad de la CDR1, CDR2 y CDR3, de la región variable de cadena ligera 52 (SEQ ID NO:52), 155 (SEQ ID NO:155) o 45 (SEQ ID NO:45), o una región variable de cadena ligera relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento.
[0069] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de la figura 2 o la figura 13 o una región variable de cadena pesada relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento.
[0070] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera de la figura 3 o la figura 14 o una región variable de cadena ligera relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento.
[0071] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una, dos o la totalidad de una CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada de la figura 2 o la figura 13, o una secuencia relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento.
[0072] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una, dos o la totalidad de una CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena ligera de la figura 3 o la figura 14, o una secuencia relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento.
[0073] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una, dos o la totalidad de la HC CDR1, HC CDR2 y HC Cd R3, y una, dos o la totalidad de la LC CDR1, LC CDR2 y LC CDR3 de un anticuerpo descrito en la Tabla 3, o una secuencia relacionada estructural o funcionalmente como se describe en el presente documento.
[0074] En otro ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende la cadena ligera LC45 (SEQ ID NO:45). En aún otro ejemplo, el anticuerpo comprende la cadena ligera LC45 y la cadena pesada HC25 (SEQ ID NO: 25) o 24 (SEQ ID NO: 24). En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende la cadena ligera Ab032 (SEQ ID NO: 45) y la cadena pesada 25 (SEQ ID nO: 25). En aún otra realización, la molécula de anticuerpo comprende la cadena ligera LC52 (SEQ ID NO:52) y la cadena pesada HC25 (SEQ ID NO: 25).
[0075] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una o ambas de:
a) una o más regiones marco (FR) de cadena pesada descritas en el presente documento. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una o más o todas las secuencias FR1, FR2, FR3 o FR4 o FR que difieren, individual o colectivamente, en no más de 1, 2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de una cadena pesada descrita en el presente documento; y
b) una o más regiones marco (FR) de cadena ligera descritas en el presente documento. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una o más o todas las secuencias FR1, FR2, FR3 o FR4 o FR que difieren, individual o colectivamente, en no más de 1, 2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de una cadena ligera descrita en el presente documento.
[0076] En un ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA que se presenta en la descripción, o preparación, o preparación aislada de la misma, comprende
(a) un dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende una secuencia de al menos un 60, 70, 80, 85, 87, 90, 95, 97, 98 o un 99, por ejemplo, un 90 %, homóloga, con una secuencia consenso de cadena pesada proporcionada en el presente documento, por ejemplo, la secuencia consenso de cadena pesada proporcionada en la figura 2 o la figura 13, por ejemplo, la secuencia consenso de cadena pesada proporcionada en la figura 2, SEQ ID NO:161; y
(b) un dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende una secuencia de al menos un 60, 70, 80, 85, 87, 90, 95, 97, 98 o un 99, por ejemplo, un 95 %, homóloga, con una secuencia consenso de cadena ligera proporcionada en el presente documento, por ejemplo, la secuencia consenso de cadena ligera proporcionada en la figura 3 o la figura 14, por ejemplo, la secuencia consenso de cadena ligera proporcionada en la figura 3, SEQ ID NO:62.
[0077] Por ejemplo, en un ejemplo, la molécula de anticuerpo anti-HA que se presenta en la descripción comprende uno o ambos de:
(a) un dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO:161, o una secuencia al menos un 87 % idéntica a la SEQ ID NO:161; y
(b) un dominio variable de inmunoglobulina de cadena libera que comprende la secuencia de SEQ ID NO:62, o una secuencia al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO:62.
[0078] En otro ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende:
(a) un dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO:161, o una secuencia al menos un 87 % idéntica a la SEQ ID NO:161; y
(b) un dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID NO:62, o una secuencia al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO:62, en la que dicha molécula de anticuerpo:
(i) no produce ningún mutante de escape según se determina por el fracaso de un título viral para recuperarse después de al menos 10, 9, 8, 7, 6 o 5 rondas de infecciones seriadas en cultivo celular con una mezcla de la molécula de anticuerpo y un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo
1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010); y
(ii) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo,
Ab 67-11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114 o CR6261, tal como cuando se ensaya mediante el procedimiento descrito en (i).
[0079] En un ejemplo, la descripción presenta una molécula de anticuerpo que comprende una o ambas de:
(a) una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO:161, o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 161 en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16, por ejemplo, en no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores; y
(b) un dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID NO:62, o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:62 que difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores.
[0080] En un ejemplo, las diferencias de 1,2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoácidos, por ejemplo, diferencias de aminoácidos conservadores, en la región variable de inmunoglobulina de cadena pesada se encuentran en las regiones FR del dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada. En otro ejemplo, las diferencias de 1,
2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, diferencias de aminoácidos conservadores, en el dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera se encuentran en las regiones FR del dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera. En un ejemplo, las diferencias de aminoácidos en la región variable de inmunoglobulina de cadena pesada, o en la región variable de inmunoglobulina de cadena ligera, son cambios de aminoácidos conservadores.
[0081] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une a un epítopo, por ejemplo, tiene un epítopo que se superpone con o es el mismo que, de un anticuerpo descrito en el presente documento, por ejemplo, según se determina mediante análisis mutacional o análisis de estructura cristalina.
[0082] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una o ambas de:
a) una o más regiones marco (FR) de la secuencia consenso de cadena pesada descrita en el presente documento, por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una o más o la totalidad de FR1, FR2, FR3 o FR4, o secuencias que difieren, individual o colectivamente, en no más de 1, 2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de la secuencia consenso de cadena pesada descrita en el presente documento; y
b) una o más regiones marco (FR) de la secuencia consenso de cadena ligera descrita en el presente documento, por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una o más o la totalidad de FR1, FR2, FR3 o FR4, o secuencias que difieren, individual o colectivamente, en no más de 1, 2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de la secuencia consenso de cadena ligera descrita en el presente documento.
[0083] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une específicamente al antígeno de HA.
[0084] En otro aspecto, la descripción presenta un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, o preparación, o preparación aislada de la misma, que comprende una propiedad estructural o funcional de Ab 044.
[0085] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo compite con una molécula de anticuerpo de referencia, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento, para unirse a un sustrato, por ejemplo, una HA. La molécula de anticuerpo de referencia puede ser:
a) una molécula de anticuerpo que comprende:
i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69); y
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID No :70); y ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-D-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 145);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID nO:73).
b) una molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de: (i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; y (ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:52; o
c) Ab 044.
[0086] La HA puede ser de una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/o4/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La competencia entre la molécula de anticuerpo y una molécula de anticuerpo de referencia se puede determinar mediante la evaluación de la capacidad de una de las moléculas de anticuerpo o la molécula de anticuerpo de referencia para disminuir la unión de la otra a un sustrato, por ejemplo, HA, por ejemplo, HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar mediante los procedimientos en la técnica. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar, por ejemplo, mediante uno o más de:
a) análisis BIAcore;
b) ensayo ELISA; y
c) citometría de flujo.
[0087] La molécula de anticuerpo puede competir con el anticuerpo de referencia de modo que la unión del anticuerpo de referencia disminuya en un 50 % o más.
[0088] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo se une al mismo epítopo, o a una porción del mismo, al que se une la molécula de anticuerpo de referencia. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo no se une al mismo epítopo, o a una porción del mismo, al que se une la molécula de anticuerpo de referencia.
[0089] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo se une al mismo epítopo, o una porción del mismo, en la HA, al igual que una molécula de anticuerpo de referencia, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento. La molécula de anticuerpo de referencia puede ser:
a) una molécula de anticuerpo que comprende:
i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69); y
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70); y ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-D-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 145);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID nO:73).
b) una molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de: (i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; y (ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:52; o
c) Ab 044.
[0090] La HA puede ser HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La unión al mismo epítopo, o una porción del mismo, se puede mostrar mediante uno o más de:
a) análisis mutacional, por ejemplo, la unión a HA, o afinidad de unión por HA, disminuye o se suprime si un residuo muta;
b) análisis, por ejemplo, comparación, de la estructura cristalina de la molécula de anticuerpo y HA y la estructura cristalina de un anticuerpo de referencia y HA, por ejemplo, para determinar los puntos de contacto de cada uno; c) competencia de los dos anticuerpos por la unión a HA, por ejemplo, HA1 o HA5, de, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004; y
d) c) y uno o ambos de a) y b).
[0091] La competencia entre la molécula de anticuerpo y una molécula de anticuerpo de referencia se puede determinar mediante la evaluación de la capacidad de una de las moléculas de anticuerpo o la molécula de anticuerpo de referencia para disminuir la unión de la otra a un sustrato, por ejemplo, HA, por ejemplo, HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004.
[0092] La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar mediante los procedimientos en la técnica. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar, por ejemplo, mediante uno o más de:
a) análisis BIAcore;
b) ensayo ELISA; o
c) citometría de flujo.
[0093] La molécula de anticuerpo puede competir con el anticuerpo de referencia de modo que la unión del anticuerpo de referencia disminuya en un 50 % o más.
[0094] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 25;
y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 52.
[0095] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 25;
y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 52,
en la que cada HC CDR difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la CDR correspondiente de SEQ ID NO: 25, y cada LC CDR difiere en no más de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la CDR correspondiente de SEQ ID NO: 52.
[0096] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 25;
y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 52,
en la que la molécula de anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o la totalidad de:
(i) una HC CDR1 que comprende: S en la 1a posición y A en la 3a posición en la HC CDR1;
(ii) una HC CDR2 que comprende uno o ambos, por ejemplo, uno de: V en la 2a posición; o N en la 7(i) *S posición y Q en la 16a posición en la HC CDR2;
(iii) una HC CDR3 que comprende: R en la 3a posición (y opcionalmente, L en la 3a posición);
(iv) una LC CDR1 que comprende uno o ambos de, por ejemplo, uno de: I en la 3a posición; o D en la 6a posición en LC CDR1;
(v) una LC CDR2 que comprende uno, dos o tres de, por ejemplo, uno de: G en la 2a posición; Y en la 4a posición; o L en la 5a posición en la LC CDR2;
(vi) una LC CDR3 que comprende: S en la 9a posición en la LC CDR3;
[0097] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO:25 (o una secuencia que difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:52 (o una secuencia que difiere en no más de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma).
[0098] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma);
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia:
Q-S-I-T-F-D-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:145) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma).
[0099] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
a) LC CDR1-3, que colectivamente, difieren de AB 044 LC CDR1-3 en no más de, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores; y
b) hC CDR1-3, que colectivamente, difieren de AB 044 HC CDR1-3 en no más de, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4, aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores.
[0100] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:52.
[0101] En un ejemplo, el agente de unión es una molécula de anticuerpo que comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, o 3, por ejemplo, 1 o 2, aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1 o 2 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, que S y A no se cambien);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1, 2, o 3 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, ni V o ni N ni Q o ninguno de los tres V , N, y Q se cambien);
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que R no se cambie); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia:
Q-S-PT-F-D-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:145) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1 o 2 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, que 1 o D no se cambien);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1, 2 o 3 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, 1, 2 o la totalidad de G, Y, y L no se cambien);
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1 o ambos de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, S no se cambie).
[0102] En un ejemplo, una CDR de la cadena ligera o pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR (es decir, mientras que otros residuos en esa CDR pueden cambiarse, el residuo destacado, o la combinación de residuos, no se cambian). Por ejemplo, en un ejemplo, V o tanto N como Q, para la CDR2 de cadena pesada no se cambian.
[0103] En un ejemplo, una CDR de la cadena ligera y una CDR de la cadena pesada incluyen cada uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0104] En un ejemplo, cada una de dos CDR en la molécula de anticuerpo incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR. En algunos ejemplos, ambas están en la cadena ligera. En algunos ejemplos, ambas están en la cadena pesada.
[0105] En un ejemplo, cada una de las tres CDR en la cadena pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0106] En un ejemplo, cada una de las tres CDR en la cadena ligera incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0107] En un ejemplo, cada una de las seis CDR en la cadena pesada y ligera incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0108] En un ejemplo, el agente de unión es una molécula de anticuerpo que comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades:
(a) tanto S como A en la HC CDR1 están sin cambiar;
(b) V o tanto N como Q o los tres de V , N, y Q en la HC CDR2 están sin cambiar;
(c) R en la HC CDR3 está sin cambiar;
(d) Uno o ambos de I y D en la LC CDR1 están sin cambiar.
(e) 1, 2 o 3 de G, Y, y L en la LC CDR2 están sin cambiar; O
(f) S en la LC CDR3 está sin cambiar.
[0109] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o la totalidad de las 6 propiedades que se seleccionan de (a) a (f).
[0110] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una o más propiedades seleccionadas de (a), (b) y (c), y una cadena ligera que tiene una o más propiedades seleccionadas de (d), (e) y (f).
[0111] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69);
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-D-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 145);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73).
[0112] En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades: (i) no produce ningún mutante de escape según se determina por el fracaso de un título viral para recuperarse después de al menos 10, 9, 8, 7, 6 o 5 rondas de infecciones seriadas en cultivo celular con una mezcla de la molécula de anticuerpo y un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010); y (ii) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, tal como Ab 67-11, Fi6, Fi28, C179, F10, CR9114 o CR6261, tal como cuando se ensaya mediante el procedimiento descrito en (i).
[0113] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una o ambas de:
a) una o más regiones marco (FR) de la SEQ ID NO: 25, por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una o más o todas las FR1, FR2, FR3 o FR4, o secuencias que difieren individual o colectivamente en no más de 1, 2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de la SEQ ID NO: 25; y
b) una o más regiones marco (FR) de la SEQ ID NO: 52. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o más o todas las FR1, FR2, FR3 o FR4, o secuencias que difieren individual o colectivamente en no más de 1, 2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de la SEQ ID NO: 52.
[0114] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende además uno o más o la totalidad de:
una FR1 que comprende la secuencia Q-V-Q-L-L-E-T-G-G-G-L-V-K-P-G-Q-S-L-K-L-S-C-A-A-S-G-F-T-F-T (SEQ ID nO:74) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que T no se cambie); una Fr2 que comprende la secuencia W-V-R-Q-P-P-G-K-G-L-E-W-V-A (SEQ ID NO:75) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que W no se cambie, o que si se cambia, esta distinto de R); una FR3 que comprende la secuencia R-F-T-/-S-R-D-N-S-K-N-T-L-Y-L-Q-M-N-S-L-R-A-E-D-T-A-V-Y-Y-C-A-K (SEQ ID NO:76) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que uno, dos o tres de /, R, o L no se cambien, o que si / se cambia sea distinto de G, si R se cambia, sea distinto de P, o si L se cambia, sea distinto de A); y
una FR4 que comprende la secuencia W-G-Q-G-T-T-L-T-V-S-S (SEQ ID NO:77) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma) o W-G-Q-G-T-T-V-T-V-S-S(SEQ ID NO:171) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
(b) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende uno o más o la totalidad de:
una FR1 que comprende la secuencia D-I-Q-M-T-Q-S-P-S-S-L-S-A-S-V-G-D-R-V-T-I-T-C-R-S-S (SEQ ID NO:78) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que R no se cambie);
una FR2 que comprende la secuencia W-Y-Q-Q-K-P-G-K-A-P-K-L-L-I-Y (SEQ ID NO:79) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma);
una FR3 que comprende la secuencia G-V-P-S-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-T-L-T-IS-S-L-Q-P-E-D-F-A-T-Y-Y-C (SEQ ID NO:80) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que C no se cambie, o si se cambia, sea distinto de P); y
una FR4 que comprende la secuencia F-G-Q-G-T-K-V-E-I-K (SEQ ID NO:81) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma).
[0115] En una realización, una FR de la cadena ligera o pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR, (es decir, mientras que otros residuos en esa FR pueden cambiarse, el residuo destacado o la combinación de residuos, no se cambian). Por ejemplo, en una realización, dos o tres de /, R, o L para la FR3 de cadena pesada no se cambian.
[0116] En una realización, una FR de la cadena ligera y una FR de la cadena pesada incluyen, cada uno, uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR.
[0117] En una realización, cada una de dos FR en la molécula de anticuerpo incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR. En las realizaciones, ambas se encuentran en la cadena ligera. En las realizaciones, ambas se encuentran en la cadena pesada.
[0118] En una realización, cada una de FR2 y FR3 en la cadena pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR.
[0119] En una realización, cada una de FR1 y FR2 en la cadena pesada y ligera incluye uno de los residuos destacados para esa FR.
[0120] En una realización, todos los residuos destacados en las FR1-4 de cadena pesada están sin cambiar.
[0121] En una realización, todos los residuos destacados en las FR1-4 de cadena ligera están sin cambiar.
[0122] En una realización, todos los residuos destacados en FR1-4 de cadena pesada y ligera están sin cambiar.
[0123] En una realización, la secuencia de FR1 del segmento de región variable de cadena pesada es Q-V-Q-L-L-E-T-G-G-G-L-V-K-P-G-Q-S-L-K-L-S-C-A-A-S-G-F-T-F-I (SEQ ID NO:74).
[0124] En una realización, la secuencia de FR1 del segmento de región variable de cadena pesada es E-V-Q-L-L-E-S-G-G-G-L-V-K-P-G-Q-S-L-K-L-S-C-A-A-S-G-F-T-F-T (SEQ ID NO: 173).
[0125] En otro ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades: (a) no produce ningún mutante de escape según se determina por el fracaso de un título viral para recuperarse después de al menos 10, 9, 8, 7, 6 o 5 rondas de infecciones seriadas en cultivo celular con una mezcla de la molécula de anticuerpo y un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1 , por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010); (b) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti­ HA de referencia, por ejemplo, Ab 67-11, FI6, FI28, C179, o CR6261, por ejemplo, cuando se ensaya mediante el procedimiento descrito en (a); (c) se une con alta afinidad a una hemaglutinina (HA) de al menos 1,2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 1 y al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 2; (d) trata o previene la infección por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 1, y por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 2; (e) inhibe la actividad fusogénica de la HA diana; (f) trata o previene la infección por un virus del Grupo 1, en la que el virus es un virus H1, H5 o H9; y trata o previene la infección por un virus del Grupo 2, en la que el virus es un virus H3 o H7; (g) trata o previene la infección por las cepas de gripe A H1N1 y H3N2; (h) es eficaz para la prevención o el tratamiento de la infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H1N1 y H3N2 cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (i) trata o previene la infección por las cepas H5N1 de gripe A; (j) es eficaz para la prevención o el tratamiento de la infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H5N1 cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (k) se une con alta afinidad a una hemaglutinina (HA) de un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010; (l) trata o previene la infección por un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010; (m) es eficaz para la prevención o el tratamiento de una infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (n) la concentración de molécula de anticuerpo requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe A es inferior a 10 pg/ml; (o) la concentración de molécula de anticuerpo requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, es inferior a 10 pg/ml; (p) previene o minimiza una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o efectos de la misma en un sujeto; (q) es eficaz para prevenir o minimizar una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o efectos de la misma en un sujeto cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (r) se une a un epítopo que comprende o consiste en la interfaz trimérica de hemaglutinina; y (s) se une a un epítopo distinto al unido por una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67­ 11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114 o CR6261, por ejemplo, cuando se ensaya mediante un procedimiento descrito en el presente documento, por ejemplo, mediante competencia en un ensayo ELISA.
[0126] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une específicamente al antígeno de HA.
[0127] En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o la totalidad de las siguientes propiedades a-f:
a) incluye, dos o todos los residuos de H3 HA1 N38, I278 y D291;
b) incluye el residuo de H3 HA2 N12;
c) no incluye uno, dos o ninguno de los residuos de H3 HA1 Q327, T328 y R329;
d) no incluye uno, dos, tres, cuatro o ninguno de los residuos de H3 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
e) incluye uno, dos o todos los residuos de H3 HA1 T318, R321 y V323; o
f) incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o todos los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, y E57.
[0128] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a; y b.
[0129] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: c; y d.
[0130] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a; y c o d.
[0131] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: b; y c o d.
[0132] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: c; y a o b.
[0133] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: d; y a o b.
[0134] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a, b, c y d.
[0135] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a, b, c, d, e y f.
[0136] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H3 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta al menos 2, 5, 10 o 100 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
a) los residuos de H3 HA1 N38, 1278 o D291;
b) el residuo de H3 HA2 N12;
c) los residuos de H3 HA1 T318, R321 o V323; o
d) los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, o E57.
[0137] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H3 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta no más de 2 o 5 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
c) los residuos de H3 HA1 Q327, T328 o R329; o
d) los residuos de H3 HA2 G1, L2, F3, G4 o D46.
[0138] En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o la totalidad de las siguientes propiedades a-f:
aa) incluye uno, dos o todos los residuos de H1 HA1 H31, N279 y S292;
bb) incluye el residuo de H1 HA2 G12;
cc) no incluye uno o ninguno de los residuos de H1 HA1 Q328 y S329;
dd) no incluye uno, dos, tres, cuatro o ninguno de los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
ee) incluye uno, dos o ninguno de los residuos de H1 HA1 T319, R322 y 1324 que están unidos por Ab 044 y FI6; o
ff) incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o todos los residuos de H1 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57.
[0139] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa; y bb.
[0140] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: cc; y dd.
[0141] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa; y cc o dd.
[0142] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: bb; y cc o dd.
[0143] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: cc; y aa o bb.
[0144] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: dd; y aa o bb.
[0145] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa, bb, cc y dd.
[0146] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa, bb, cc, dd, ee y ff.
[0147] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H1 igual o inferior a 10'6, en la que dicha Kd aumenta al menos 2, 5, 10 o 100 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
aa) los residuos de H1 HA1 H31, N279 y S292;
bb) el residuo de H1 HA2 G12;
cc) los residuos de H1 HA1 T319, R322 y 1324; o
dd) los residuos de H1 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57.
[0148] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H1 igual o inferior a 10'6, en la que dicha Kd aumenta no más de 2 o 5 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
cc) los residuos de H1 HA1 Q328 y S329; o
dd) los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
[0149] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una, dos, tres o la totalidad de las siguientes propiedades:
a y aa;
b y bb;
c y cc;
d y dd.
[0150] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades c, cc, d y dd.
[0151] En otro aspecto, la descripción presenta un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, o preparación, o preparación aislada de la misma, que comprende una propiedad estructural o funcional de Ab 069.
[0152] En una realización, la molécula de anticuerpo compite con una molécula de anticuerpo de referencia, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento, para unirse a un sustrato, por ejemplo, una HA. La molécula de anticuerpo de referencia puede ser:
a) una molécula de anticuerpo que comprende:
i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G
(SEQ ID NO:69); y
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70); y ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-E-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 172);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73).
b) una molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de: (i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; y (ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:155; o
c) Ab 069.
[0153] La HA puede ser HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La competencia entre la molécula de anticuerpo y una molécula de anticuerpo de referencia se puede determinar mediante la evaluación de la capacidad de una de las moléculas de anticuerpo o la molécula de anticuerpo de referencia para disminuir la unión de la otra a un sustrato, por ejemplo, HA, por ejemplo, HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar mediante los procedimientos en la técnica. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar, por ejemplo, mediante uno o más de:
a) análisis BIAcore;
b) ensayo ELISA;
c) citometría de flujo.
[0154] La molécula de anticuerpo puede competir con el anticuerpo de referencia de modo que la unión del anticuerpo de referencia disminuya en un 50 % o más. En una realización, la molécula de anticuerpo se une al mismo epítopo, o a una porción del mismo, al que se une la molécula de anticuerpo de referencia. En una realización, la molécula de anticuerpo no se une al mismo epítopo, o a una porción del mismo, al que se une la molécula de anticuerpo de referencia.
[0155] En una realización, la molécula de anticuerpo se une al mismo epítopo, o una porción del mismo, en la HA, al igual que una molécula de anticuerpo de referencia, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento. La molécula de anticuerpo de referencia puede ser:
a) una molécula de anticuerpo que comprende:
i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G
(SEQ ID NO:69); y
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70); y ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-E-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 172);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73).
b) una molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de: (i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; y (ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:155; o
c) Ab 069.
[0156] La HA puede ser HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La unión al mismo epítopo, o una porción del mismo, se puede mostrar mediante uno o más de:
a) análisis mutacional, por ejemplo, unión o falta de la misma a HA mutante, por ejemplo, si un residuo está mutado; b) análisis, por ejemplo, comparación, de la estructura cristalina de la molécula de anticuerpo y HA y la estructura cristalina de un anticuerpo de referencia y HA, por ejemplo, para determinar los puntos de contacto de cada uno; c) competencia de los dos anticuerpos por la unión a HA, por ejemplo, HA1 o HA5, de, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004; o
d) (c) y uno o ambos de (a) y (b);
[0157] La competencia entre la molécula de anticuerpo y una molécula de anticuerpo de referencia se puede determinar mediante la evaluación de la capacidad de una de las moléculas de anticuerpo o la molécula de anticuerpo de referencia para disminuir la unión de la otra a un sustrato, por ejemplo, HA, por ejemplo, HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar mediante los procedimientos en la técnica. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar, por ejemplo, mediante uno o más de:
a) análisis BIAcore;
b) ensayo ELISA;
c) citometría de flujo. La molécula de anticuerpo puede competir con el anticuerpo de referencia de modo que la unión del anticuerpo de referencia disminuya en un 50 % o más.
[0158] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 25;
y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 155.
[0159] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 25;
y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 155,
en la que cada HC CDR difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la CDR correspondiente de SEQ ID NO: 25, y cada LC CDR difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la CDR correspondiente de SEQ ID NO: 155.
[0160] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 25;
y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 155,
en la que la molécula de anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o la totalidad de:
(i) una HC CDR1 que comprende: S en la 1a posición y A en la 3a posición en la HC CDR1;
(ii) una HC CDR2 que comprende uno o ambos, por ejemplo, uno de: V en la 2a posición; o N en la 7S posición y Q en la 16a posición en la HC CDR2;
(iii) una HC CDR3 que comprende: R en la 3a posición (y opcionalmente, L en la 3a posición);
(iv) una LC CDR1 que comprende uno o ambos de, por ejemplo, uno de: I en la 3a posición; o E en la 6a posición en LC CDR1;
(v) una LC CDR2 que comprende uno, dos o tres de, por ejemplo, uno de: G en la 2a posición; Y en la 4a posición; o L en la 5a posición en la LC CDR2;
(vi) una LC CDR3 que comprende: S en la 9a posición en la LC CDR3;
[0161] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO:25 (o una secuencia que difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:155 (o una secuencia que difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma).
[0162] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; y (b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:155.
[0163] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma);
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia:
Q-S-I-T-F-E-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 172) o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma).
[0164] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
a) LC CDR1-3, que colectivamente, difieren de AB 069 LC CDR1-3 en no más de, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores; y
b) hC CDR1-3, que colectivamente, difieren de AB 069 HC CDR1-3 en no más de, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4, aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores.
[0165] En un ejemplo, el agente de unión es una molécula de anticuerpo que comprende uno o ambos de: (a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, o 3, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1 o 2 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, que tanto S como A no se cambien);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1, 2, o 3 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, que V o tanto N como Q o los tres de V, N y Q no se cambien); una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma opcionalmente con la condición de que, R no se cambie); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia:
Q-S-I-T-F-E-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 172) o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1 o 2 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, I o E no se cambien); una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1, 2, o 3 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, 1, 2 o la totalidad de G, Y, y L no se cambien);
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que, al menos uno o ambos de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, S no se cambie).
[0166] En un ejemplo, una CDR de la cadena ligera o pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR (es decir, mientras que otros residuos en esa CDR pueden cambiarse, el residuo destacado, o la combinación de residuos, no se cambian).
[0167] En un ejemplo, una CDR de la cadena ligera y una CDR de la cadena pesada incluyen cada uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0168] En un ejemplo, cada una de dos CDR en la molécula de anticuerpo incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR. En algunos ejemplos, ambas están en la cadena ligera. En algunos ejemplos, ambas están en la cadena pesada.
[0169] En un ejemplo, cada una de las tres CDR en la cadena pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0170] En un ejemplo, cada una de las tres CDR en la cadena ligera incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0171] En un ejemplo, cada una de las seis CDR en la cadena pesada y ligera incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0172] En un ejemplo, el agente de unión es una molécula de anticuerpo que comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades:
(a) tanto S como A en la HC CDR1 están sin cambiar.
(b) V o tanto N como Q o los tres de V, N, y Q en la HC CDR2 están sin cambiar.
(c) R en la HC CDR3 está sin cambiar.
(d) uno o ambos de I y E en la LC CDR1 están sin cambiar.
(e) 1, 2 o 3 de G, Y, y L en la LC CDR2 están sin cambiar;
(f) S en la LC CDR3 está sin cambiar.
[0173] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o la totalidad de las 6 propiedades que se seleccionan de (a) a (f).
[0174] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una o más propiedades seleccionadas de (a), (b) y (c), y una cadena ligera que tiene una o más propiedades seleccionadas de (d), (e) y (f).
[0175] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69);
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID No :70); y (b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-E-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:172);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID No :72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID nO:73).
[0176] En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades: (i) no produce ningún mutante de escape según se determina por el fracaso de un título viral para recuperarse después de al menos 10, 9, 8, 7, 6 o 5 rondas de infecciones seriadas en cultivo celular con una mezcla de la molécula de anticuerpo y un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010); y (ii) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti­ HA de referencia, tal como Ab 67-11, Fi6, Fi28, C179, F10, CR9114 o CR6261, tal como cuando se ensaya mediante el procedimiento descrito en (i).
[0177] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una o ambas de:
a) una o más regiones marco (FR) de la SEQ ID NO: 25. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o más o todas las FR1, FR2, FR3 o FR4, o secuencias que difieren individual o colectivamente en no más de 1,2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de la SEQ ID NO: 25; y b) una o más regiones marco (FR) de la SEQ ID NO: 155. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o más o todas las FR1, FR2, FR3 o FR4, o secuencias que difieren individual o colectivamente en no más de 1,2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de la SEQ ID NO: 155.
[0178] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende además uno o más o la totalidad de:
una FR1 que comprende la secuencia Q-V-Q-L-L-E-T-G-G-G-L-V-K-P-G-Q-S-L-K-L-S-C-A-A-S-G-F-T-F-T (SEQ ID nO:74) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que T no se cambie); una Fr2 que comprende la secuencia W-V-R-Q-P-P-G-K-G-L-E-W-V-A (SEQ ID NO:75) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que W no se cambie, o que si se cambia, sea distinto de R); una FR3 que comprende la secuencia R-F-T-/-S-R-D-N-S-K-N-T-L-Y-L-Q-M-N-S-L-R-A-E-D-T-A-V-Y-Y-C-A-K (SEQ ID NO:76) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que uno, dos o tres de l R, o L no se cambien, o que si / se cambia, sea distinto de G, si R se cambia sea distinto de P, o si L se cambia, sea distinto de A); y
(b) el segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera comprende uno o más o la totalidad de
una FR1 que comprende la secuencia D-I-Q-M-T-Q-S-P-S-S-L-S-A-S-V-G-D-R-V-T-I-T-C-R-S-S (SEQ ID NO:78) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que R no se cambie);
una FR2 que comprende la secuencia W-Y-Q-Q-K-P-G-K-A-P-K-L-L-I-Y (SEQ ID NO:79) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma);
una FR3 que comprende la secuencia G-V-P-S-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-T-L-T-IS-S-L-Q-P-E-D-F-A-T-Y-Y-C (SEQ ID NO:80) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que C no se cambie, o si se cambia, sea distinto de P); y
una FR4 que comprende la secuencia F-G-Q-G-T-K-V-E-I-K (SEQ ID NO:81) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma).
[0179] En una realización, una FR de la cadena ligera o pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR, (es decir, mientras que otros residuos en esa FR pueden cambiarse, el residuo destacado o la combinación de residuos, no se cambian). Por ejemplo, en una realización, dos o tres de [, R, o L para la FR3 de cadena pesada no se cambian.
[0180] En una realización, una FR de la cadena ligera y una FR de la cadena pesada incluyen, cada uno, uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR.
[0181] En una realización, cada una de dos FR en la molécula de anticuerpo incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR. En las realizaciones, ambas se encuentran en la cadena ligera. En las realizaciones, ambas se encuentran en la cadena pesada.
[0182] En una realización, cada una de FR2 y FR3 en la cadena pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR.
[0183] En una realización, cada una de FR1 y FR2 en la cadena pesada y ligera incluye uno de los residuos destacados para esa FR.
[0184] En una realización, todos los residuos destacados en las FR1-4 de cadena pesada están sin cambiar.
[0185] En una realización, todos los residuos destacados en las FR1-4 de cadena ligera están sin cambiar.
[0186] En una realización, todos los residuos destacados en FR1-4 de cadena pesada y ligera están sin cambiar.
[0187] En otro ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades: (a) no produce ningún mutante de escape según se determina por el fracaso de un título viral para recuperarse después de al menos 10, 9, 8, 7, 6 o 5 rondas de infecciones seriadas en cultivo celular con una mezcla de la molécula de anticuerpo y un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1 , por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010); (b) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67-11, FI6, FI28, C179, o CR6261, por ejemplo, cuando se evalúa mediante el procedimiento descrito en (a); (c) se une con alta afinidad a una hemaglutinina (HA) de al menos 1,2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 1 y al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 2; (d) trata o previene la infección por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 1, y por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 2; (e) inhibe la actividad fusogénica de la HA diana; (f) trata o previene la infección por un virus del Grupo 1, en la que el virus es un virus H1, H5 o H9; y trata o previene la infección por un virus del Grupo 2, en la que el virus es un virus H3 o H7; (g) trata o previene la infección por las cepas de gripe A H1N1 y H3N2; (h) es eficaz para la prevención o el tratamiento de la infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H1N1 y H3N2 cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (i) trata o previene la infección por las cepas H5N1 de gripe A; (j) es eficaz para la prevención o el tratamiento de la infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H5N1 cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (k) se une con alta afinidad a una hemaglutinina (HA) de un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010; (l) trata o previene la infección por un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010; (m) es eficaz para la prevención o el tratamiento de una infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (n) la concentración de molécula de anticuerpo requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe A es inferior a 10 pg/ml; (o) la concentración de molécula de anticuerpo requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, es inferior a 10 pg/ml; (p) previene o minimiza una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o efectos de la misma en un sujeto; (q) es eficaz para prevenir o minimizar una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o efectos de la misma en un sujeto cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (r) se une a un epítopo que comprende o consiste en la interfaz trimérica de hemaglutinina; y (s) se une a un epítopo distinto al unido por una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67­ 11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114 o CR6261, por ejemplo, cuando se ensaya mediante un procedimiento descrito en el presente documento, por ejemplo, mediante competencia en un ensayo ELISA.
[0188] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une específicamente al antígeno de HA.
[0189] En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o la totalidad de las siguientes propiedades a-f:
a) incluye, dos o todos los residuos de H3 HA1 N38, I278 y D291;
b) incluye el residuo de H3 HA2 N12;
c) no incluye uno, dos o ninguno de los residuos de H3 HA1 Q327, T328 y R329;
d) no incluye uno, dos, tres, cuatro o ninguno de los residuos de H3 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
e) incluye uno, dos o todos los residuos de H3 HA1 T318, R321 y V323; o
f) incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o todos los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, y E57.
[0190] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a; y b.
[0191] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: c; y d.
[0192] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a; y c o d.
[0193] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: b; y c o d.
[0194] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: c; y a o b.
[0195] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: d; y a o b.
[0196] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a, b, c y d.
[0197] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a, b, c, d, e y f.
[0198] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H3 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta al menos 2, 5, 10 o 100 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
a) los residuos de H3 HA1 N38, 1278 o D291;
b) el residuo de H3 HA2 N12;
c) los residuos de H3 HA1 T318, R321 o V323; o
d) los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, o E57.
[0199] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H3 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta no más de 2 o 5 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
c) los residuos de H3 HA1 Q327, T328 o R329; o
d) los residuos de H3 HA2 G1, L2, F3, G4 o D46.
[0200] En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o la totalidad de las siguientes propiedades a-f:
aa) incluye uno, dos o todos los residuos de H1 HA1 H31, N279 y S292;
bb) incluye el residuo de H1 HA2 G12;
cc) no incluye uno o ninguno de los residuos de H1 HA1 Q328 y S329;
dd) no incluye uno, dos, tres, cuatro o ninguno de los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
ee) incluye uno, dos o ninguno de los residuos de H1 HA1 T319, R322 y 1324 que están unidos por Ab 044 y FI6; o
ff) incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o todos los residuos de H1 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57.
[0201] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa; y bb.
[0202] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: cc; y dd.
[0203] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa; y cc o dd.
[0204] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: bb; y cc o dd.
[0205] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: cc; y aa o bb.
[0206] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: dd; y aa o bb.
[0207] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa, bb, cc y dd.
[0208] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa, bb, cc, dd, ee y ff.
[0209] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H1 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta al menos 2, 5, 10 o 100 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
aa) los residuos de H1 HA1 H31, N279 y S292;
bb) el residuo de H1 HA2 G12;
cc) los residuos de H1 HA1 T319, R322 y 1324; o
dd) los residuos de H1 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57.
[0210] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H1 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta no más de 2 o 5 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
cc) los residuos de H1 HA1 Q328 y S329; o
dd) los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
[0211] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una, dos, tres o la totalidad de las siguientes propiedades:
a y aa;
b y bb;
c y cc;
d y dd.
[0212] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades c, cc, d y dd.
[0213] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades c, cc, d y dd.
[0214] En otro aspecto, la descripción presenta un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, o preparación, o preparación aislada de la misma, que comprende una propiedad estructural o funcional de Ab 032.
[0215] En una realización, la molécula de anticuerpo compite con una molécula de anticuerpo de referencia, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento, para unirse a un sustrato, por ejemplo, una Ha . La molécula de anticuerpo de referencia puede ser:
a) una molécula de anticuerpo que comprende:
i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G
(SEQ ID NO:69); y
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70); y ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-N-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 71);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73).
b) una molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de: (i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; y (ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:45; o
c) Ab 032.
[0216] La HA puede ser HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La competencia entre la molécula de anticuerpo y una molécula de anticuerpo de referencia se puede determinar mediante la evaluación de la capacidad de una de las moléculas de anticuerpo o la molécula de anticuerpo de referencia para disminuir la unión de la otra a un sustrato, por ejemplo, HA, por ejemplo, HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar mediante los procedimientos en la técnica. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar, por ejemplo, mediante uno o más de:
a) análisis BIAcore;
b) ensayo ELISA; y
c) citometría de flujo.
[0217] La molécula de anticuerpo puede competir con el anticuerpo de referencia de modo que la unión del anticuerpo de referencia disminuya en un 50 % o más.
[0218] En una realización, la molécula de anticuerpo se une al mismo epítopo, o a una porción del mismo, al que se une la molécula de anticuerpo de referencia. En una realización, la molécula de anticuerpo no se une al mismo epítopo, o a una porción del mismo, al que se une la molécula de anticuerpo de referencia.
[0219] En una realización, la molécula de anticuerpo se une al mismo epítopo, o una porción del mismo, en la HA, al igual que una molécula de anticuerpo de referencia, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento. La molécula de anticuerpo de referencia puede ser:
a) una molécula de anticuerpo que comprende:
i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G
(SEQ ID NO:69); y
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70); y ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-N-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 71);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73).
b) una molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de: (i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; y (ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:45; o
c) Ab 32.
[0220] La HA puede ser HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La unión al mismo epítopo, o una porción del mismo, se puede mostrar mediante uno o más de:
a) análisis mutacional, por ejemplo, la unión a HA, o afinidad de unión por HA, disminuye o se suprime si un residuo muta;
b) análisis, por ejemplo, comparación, de la estructura cristalina de la molécula de anticuerpo y HA y la estructura cristalina de un anticuerpo de referencia y HA, por ejemplo, para determinar los puntos de contacto de cada uno; c) competencia de los dos anticuerpos por la unión a HA, por ejemplo, HA1 o HA5, de, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004; y
d) (c) y uno o ambos de (a) y (b);
[0221] La competencia entre la molécula de anticuerpo y una molécula de anticuerpo de referencia se puede determinar mediante la evaluación de la capacidad de una de las moléculas de anticuerpo o la molécula de anticuerpo de referencia para disminuir la unión de la otra a un sustrato, por ejemplo, HA, por ejemplo, HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar mediante los procedimientos en la técnica. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar, por ejemplo, mediante uno o más de:
a) análisis BIAcore;
b) ensayo ELISA; y
c) citometría de flujo.
[0222] La molécula de anticuerpo puede competir con el anticuerpo de referencia de modo que la unión del anticuerpo de referencia disminuya en un 50 % o más.
[0223] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 25;
y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 45.
[0224] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 25;
y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 45,
en la que cada HC CDR difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la CDR correspondiente de SEQ ID NO: 25, y cada LC CDR difiere en no más de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la CDR correspondiente de SEQ ID NO: 45.
[0225] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 25;
y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 45,
en la que la molécula de anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o la totalidad de:
(i) una HC CDR1 que comprende: S en la 1a posición y A en la 3a posición en la HC CDR1;
(ii) una HC CDR2 que comprende uno o ambos, por ejemplo, uno de: V en la 2a posición; o N en la 7S posición y Q en la 16a posición en la HC CDR2;
(iii) una HC CDR3 que comprende: R en la 3a posición (y opcionalmente, L en la 3a posición);
(iv) una LC CDR1 que comprende: I en la 3a posición;
(v) una LC CDR2 que comprende uno, dos o tres de, por ejemplo, uno de: G en la 2a posición; Y en la 4a posición; o L en la 5a posición en la LC CDR2;
(vi) una LC CDR3 que comprende: S en la 9a posición en la LC CDR3;
[0226] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO:25 (o una secuencia que difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:155 (o una secuencia que difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma).
[0227] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; y (b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:155.
[0228] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma);
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia:
Q-S-I-T-FN-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:71) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma).
[0229] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
a) LC CDR1-3, que colectivamente, difieren de AB 032 LC CDR1-3 en no más de, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, por ejemplo, 1,2, 3 o 4 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores; y
b) hC CDR1-3, que colectivamente, difieren de AB 032 HC CDR1-3 en no más de, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4, aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores.
[0230] En un ejemplo, el agente de unión es una molécula de anticuerpo que comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, o 3, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1 o 2 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, que tanto S como A no se cambien);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, con la condición de que, por ejemplo, al menos 1, 2, o 3 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, que V o tanto N como Q o los tres de V, N, y Q no se cambien); una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que R no se cambie); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia: Q-S4-T-F-N-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 71) o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1 o 2 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, | no se cambie);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1, 2, o 3 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, 1, 2 o la totalidad de G, Y, y L no se cambien);
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos uno o ambos de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, S no se cambie).
[0231] En un ejemplo, una CDR de la cadena ligera o pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR (es decir, mientras que otros residuos en esa CDR pueden cambiarse, el residuo destacado, o la combinación de residuos, no se cambian).
[0232] En un ejemplo, una CDR de la cadena ligera y una CDR de la cadena pesada incluyen cada uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0233] En un ejemplo, cada una de dos CDR en la molécula de anticuerpo incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR. En algunos ejemplos, ambas están en la cadena ligera. En algunos ejemplos, ambas están en la cadena pesada.
[0234] En un ejemplo, cada una de las tres CDR en la cadena pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0235] En un ejemplo, cada una de las tres CDR en la cadena ligera incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0236] En un ejemplo, cada una de las seis CDR en la cadena pesada y ligera incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0237] En un ejemplo, el agente de unión es una molécula de anticuerpo que comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades:
(a) tanto S como A en la HC CDR1 están sin cambiar.
(b) V o tanto N como Q o los tres de V, N, y Q en la HC CDR2 están sin cambiar.
(c) R en la HC CDR3 está sin cambiar.
(d) I en la LC CDR1 está sin cambiar.
(e) 1, 2 o 3 de G, Y, y L en la LC CDR2 están sin cambiar;
(f) S en la LC CDR3 está sin cambiar.
[0238] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o la totalidad de las 6 propiedades que se seleccionan de (a) a (f).
[0239] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una o más propiedades seleccionadas de (a), (b) y (c), y una cadena ligera que tiene una o más propiedades seleccionadas de (d), (e) y (f).
[0240] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69);
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-N-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 71);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73).
[0241] En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades: (i) no produce ningún mutante de escape según se determina por el fracaso de un título viral para recuperarse después de al menos 10, 9, 8, 7, 6 o 5 rondas de infecciones seriadas en cultivo celular con una mezcla de la molécula de anticuerpo y un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010); y (ii) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, tal como Ab 67-11, Fi6, Fi28, C179, F10, CR9114 o CR6261, tal como cuando se ensaya mediante el procedimiento descrito en (i).
[0242] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una o ambas de:
a) una o más regiones marco (FR) de la SEQ ID NO: 25. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o más o todas las FR1, FR2, FR3 o FR4, o secuencias que difieren individual o colectivamente en no más de 1, 2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de la SEQ ID NO: 25; y
b) una o más regiones marco (FR) de la SEQ ID NO: 45. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o más o todas las FR1, FR2, FR3 o FR4, o secuencias que difieren individual o colectivamente en no más de 1, 2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de la SEQ ID NO: 45.
[0243] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende además uno o más o la totalidad de:
una FR1 que comprende la secuencia Q-V-Q-L-L-E-T-G-G-G-L-V-K-P-G-Q-S-L-K-L-S-C-A-A-S-G-F-T-F-T (SEQ ID NO:74) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que T no se cambie); una FR2 que comprende la secuencia W-V-R-Q-P-P-G-K-G-L-E-W-V-A (SEQ ID NO:75) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que W no se cambie, o que si se cambia, esta distinto de R); una FR3 que comprende la secuencia R-F-T-/-S-R-D-N-S-K-N-T-L-Y-L-Q-M-N-S-L-R-A-E-D-T-A-V-Y-Y-C-A-K (SEQ ID NO:76) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que uno, dos o tres de /, R, o L no se cambien, o que si / se cambia, sea distinto de G, si R se cambia, sea distinto de P, o si L se cambia sea distinto de A); y
una FR4 que comprende la secuencia W-G-Q-G-T-T-L-T-V-S-S (SEQ ID NO:77) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma) o W-G-Q-G-T-T-V-T-V-S-S (s Eq ID NO:171) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
(b) el segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera comprende uno o más o la totalidad de una FR1 que comprende la secuencia D-I-Q-M-T-Q-S-P-S-S-L-S-A-S-V-G-D-R-V-T-I-T-C-R-S-S (SEQ ID NO:78) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que R no se cambie);
una FR2 que comprende la secuencia W-Y-Q-Q-K-P-G-K-A-P-K-L-L-I-Y (SEQ ID NO:79) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma);
una FR3 que comprende la secuencia G-V-P-S-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-T-L-T-IS-S-L-Q-P-E-D-F-A-T-Y-Y-C (SEQ ID NO:80) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que C no se cambie, o si se cambia, sea distinto de P); y
una FR4 que comprende la secuencia F-G-Q-G-T-K-V-E-I-K (SEQ ID NO:81) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma).
[0244] En una realización, una FR de la cadena ligera o pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR, (es decir, mientras que otros residuos en esa FR pueden cambiarse, el residuo destacado o la combinación de residuos, no se cambian). Por ejemplo, en una realización, uno, dos o tres de /, R, o L para la FR3 de cadena pesada no se cambian.
[0245] En una realización, una FR de la cadena ligera y una FR de la cadena pesada incluyen, cada uno, uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR.
[0246] En una realización, cada una de dos FR en la molécula de anticuerpo incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR. En las realizaciones, ambas se encuentran en la cadena ligera. En las realizaciones, ambas se encuentran en la cadena pesada.
[0247] En una realización, cada una de FR2 y FR3 en la cadena pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR.
[0248] En una realización, cada una de FR1 y FR2 en la cadena pesada y ligera incluye uno de los residuos destacados para esa FR.
[0249] En una realización, todos los residuos destacados en las FR1-4 de cadena pesada están sin cambiar.
[0250] En una realización, todos los residuos destacados en las FR1-4 de cadena ligera están sin cambiar.
[0251] En una realización, todos los residuos destacados en FR1-4 de cadena pesada y ligera están sin cambiar.
[0252] En otro ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades: (a) no produce ningún mutante de escape según se determina por el fracaso de un título viral para recuperarse después de al menos 10, 9, 8, 7, 6 o 5 rondas de infecciones seriadas en cultivo celular con una mezcla de la molécula de anticuerpo y un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1 , por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010); (b) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67-11, FI6, FI28, C179, o CR6261, por ejemplo, cuando se evalúa mediante el procedimiento descrito en (a); (c) se une con alta afinidad a una hemaglutinina (HA) de al menos 1,2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 1 y al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 2; (d) trata o previene la infección por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 1, y por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 2; (e) inhibe la actividad fusogénica de la HA diana; (f) trata o previene la infección por un virus del Grupo 1, en la que el virus es un virus H1, H5 o H9; y trata o previene la infección por un virus del Grupo 2, en la que el virus es un virus H3 o H7; (g) trata o previene la infección por las cepas de gripe A H1N1 y H3N2; (h) es eficaz para la prevención o el tratamiento de la infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H1N1 y H3N2 cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (i) trata o previene la infección por las cepas H5N1 de gripe A; (j) es eficaz para la prevención o el tratamiento de la infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H5N1 cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (k) se une con alta afinidad a una hemaglutinina (HA) de un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010; (l) trata o previene la infección por un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010; (m) es eficaz para la prevención o el tratamiento de una infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (n) la concentración de molécula de anticuerpo requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe A es inferior a 10 pg/ml; (o) la concentración de molécula de anticuerpo requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, es inferior a 10 pg/ml; (p) previene o minimiza una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o efectos de la misma en un sujeto; (q) es eficaz para prevenir o minimizar una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o efectos de la misma en un sujeto cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (r) se une a un epítopo que comprende o consiste en la interfaz trimérica de hemaglutinina; y (s) se une a un epítopo distinto al unido por una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67­ 11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114 o CR6261, por ejemplo, cuando se ensaya mediante un procedimiento descrito en el presente documento, por ejemplo, mediante competencia en un ensayo ELISA.
[0253] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une específicamente al antígeno de HA.
[0254] En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o la totalidad de las siguientes propiedades a-f:
a) incluye uno, dos o todos los residuos de H3 HA1 N38, I278 y D291;
b) incluye el residuo de H3 HA2 N12;
c) no incluye uno, dos o ninguno de los residuos de H3 HA1 Q327, T328 y R329;
d) no incluye uno, dos, tres, cuatro o ninguno de los residuos de H3 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
e) incluye uno, dos o todos los residuos de H3 HA1 T318, R321 y V323; o
f) incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o todos los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, y E57.
[0255] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a; y b.
[0256] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: c; y d.
[0257] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a; y c o d.
[0258] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: b; y c o d.
[0259] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: c; y a o b.
[0260] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: d; y a o b.
[0261] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a, b, c y d.
[0262] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a, b, c, d, e y f.
[0263] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H3 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta al menos 2, 5, 10 o 100 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
a) los residuos de H3 HA1 N38, 1278 o D291;
b) el residuo de H3 HA2 N12;
c) los residuos de H3 HA1 T318, R321 o V323; o
d) los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, o E57.
[0264] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H3 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta no más de 2 o 5 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
c) los residuos de H3 HA1 Q327, T328 o R329; o
d) los residuos de H3 HA2 G1, L2, F3, G4 o D46.
[0265] En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o la totalidad de las siguientes propiedades a-f:
aa) incluye uno, dos o todos los residuos de H1 HA1 H31, N279 y S292;
bb) incluye el residuo de H1 HA2 G12;
cc) no incluye uno o ninguno de los residuos de H1 HA1 Q328 y S329;
dd) no incluye uno, dos, tres, cuatro o ninguno de los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
ee) incluye uno, dos o ninguno de los residuos de H1 HA1 T319, R322 y 1324 que están unidos por Ab 044 y FI6; o
ff) incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o todos los residuos de H1 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57.
[0266] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa; y bb.
[0267] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: cc; y dd.
[0268] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa; y cc o dd.
[0269] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: bb; y cc o dd.
[0270] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: cc; y aa o bb.
[0271] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: dd; y aa o bb.
[0272] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa, bb, cc y dd.
[0273] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa, bb, cc, dd, ee y ff.
[0274] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H1 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta al menos 2, 5, 10 o 100 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
aa) los residuos de H1 HA1 H31, N279 y S292;
bb) el residuo de H1 HA2 G12;
cc) los residuos de H1 HA1 T319, R322 y 1324; o
dd) los residuos de H1 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57.
[0275] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H1 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta no más de 2 o 5 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
cc) los residuos de H1 HA1 Q328 y S329; o
dd) los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
[0276] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una, dos, tres o la totalidad de las siguientes propiedades:
a y aa;
b y bb;
c y cc;
d y dd.
[0277] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades c, cc, d y dd.
[0278] En otro aspecto, la descripción presenta un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, o preparación, o preparación aislada de la misma, que comprende una propiedad estructural o funcional de Ab 031.
[0279] En una realización, la molécula de anticuerpo compite con una molécula de anticuerpo de referencia, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento, para unirse a un sustrato, por ejemplo, una Ha . La molécula de anticuerpo de referencia puede ser:
a) una molécula de anticuerpo que comprende:
i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G
(SEQ ID NO:69); y
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70); y
ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-N-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:71);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73).
b) una molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de: (i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 24; y (ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:45; o
c) Ab 031.
[0280] La HA puede ser HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La competencia entre la molécula de anticuerpo y una molécula de anticuerpo de referencia se puede determinar mediante la evaluación de la capacidad de una de las moléculas de anticuerpo o la molécula de anticuerpo de referencia para disminuir la unión de la otra a un sustrato, por ejemplo, HA, por ejemplo, HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar mediante los procedimientos en la técnica. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar, por ejemplo, mediante uno o más de:
a) análisis BIAcore;
b) ensayo ELISA; y
c) citometría de flujo.
[0281] La molécula de anticuerpo puede competir con el anticuerpo de referencia de modo que la unión del anticuerpo de referencia disminuya en un 50 % o más.
[0282] En una realización, la molécula de anticuerpo se une al mismo epítopo, o a una porción del mismo, al que se une la molécula de anticuerpo de referencia.
[0283] En una realización, la molécula de anticuerpo no se une al mismo epítopo, o a una porción del mismo, al que se une la molécula de anticuerpo de referencia.
[0284] En una realización, la molécula de anticuerpo se une al mismo epítopo, o una porción del mismo, en la HA, al igual que una molécula de anticuerpo de referencia, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento. La molécula de anticuerpo de referencia puede ser:
a) una molécula de anticuerpo que comprende:
i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G
(SEQ ID NO:69); y
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70); y ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-N-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:71);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID nO:73).
b) una molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de: (i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 24; y (ii) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:45; o
c) Ab 031.
[0285] La HA puede ser HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La unión al mismo epítopo, o una porción del mismo, se puede mostrar mediante uno o más de:
a) análisis mutacional, por ejemplo, la unión a HA, o afinidad de unión por HA, disminuye o se suprime si un residuo muta;
b) análisis, por ejemplo, comparación, de la estructura cristalina de la molécula de anticuerpo y HA y la estructura cristalina de un anticuerpo de referencia y HA, por ejemplo, para determinar los puntos de contacto de cada uno; c) competencia de los dos anticuerpos por la unión a HA, por ejemplo, HA1 o HA5, de, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004;
d) c) y uno o ambos de a) y b).
[0286] La competencia entre la molécula de anticuerpo y una molécula de anticuerpo de referencia se puede determinar mediante la evaluación de la capacidad de una de las moléculas de anticuerpo o la molécula de anticuerpo de referencia para disminuir la unión de la otra a un sustrato, por ejemplo, HA, por ejemplo, HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar mediante los procedimientos en la técnica. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar, por ejemplo, mediante uno o más de:
a) análisis BIAcore;
b) ensayo ELISA; y
c) citometría de flujo.
[0287] La molécula de anticuerpo puede competir con el anticuerpo de referencia de modo que la unión del anticuerpo de referencia disminuya en un 50 % o más.
[0288] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende uno o ambos de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 24;
y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 45.
[0289] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 24;
y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 45,
en la que, opcionalmente, cada HC CDR difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la CDR correspondiente de SEQ ID NO: 24, y cada LC CDR difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la CDR correspondiente de SEQ ID NO: 45.
[0290] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 25;
y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 45,
en la que la molécula de anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o la totalidad de:
(i) una HC CDR1 que comprende: S en la 1a posición y A en la 3a posición en la HC CDR1;
(ii) una HC CDR2 que comprende uno o ambos, por ejemplo, uno de: V en la 2a posición; o N en la 7S posición y Q en la 16a posición en la HC CDR2;
(iii) una HC CDR3 que comprende: R en la 3a posición (y opcionalmente, L en la 3a posición);
(iv) una LC CDR1 que comprende: I en la 3a posición;
(v) una LC CDR2 que comprende uno, dos o tres de, por ejemplo, uno de: G en la 2a posición; Y en la 4a posición; o L en la 5a posición en la LC CDR2;
(vi) una LC CDR3 que comprende: S en la 9a posición en la LC CDR3;
[0291] En un ejemplo, el agente de unión comprende una molécula de anticuerpo que comprende:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO:24 (o una secuencia que difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:45 (o una secuencia que difiere en no más de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma).
[0292] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 24; y (b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:45.
[0293] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-N-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:71) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO: 72) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma).
[0294] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
a) LC CDR1-3, que colectivamente, difieren de AB 031 LC CDR1-3 en no más de, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores; y
b) hC CDR1-3, que colectivamente, difieren de AB 031 HC CDR1-3 en no más de, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4, aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores.
[0295] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, o 3, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1 o 2 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, que tanto S como A no se cambien);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, con la condición de que, por ejemplo, al menos 1, 2, o 3 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, que V o tanto N y Q o los tres de V, N, y Q no se cambien); una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma opcionalmente con la condición de que, por ejemplo, R no se cambie); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-N-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 71) o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1 o 2 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, I no se cambie);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos 1, 2, o 3 de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, 1, 2 o la totalidad de G, Y, y L no se cambien);
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que al menos uno o ambos de los residuos destacados no se cambien, por ejemplo, S no se cambie).
[0296] En un ejemplo, una CDR de la cadena ligera o pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR (es decir, mientras que otros residuos en esa CDR pueden cambiarse, el residuo destacado, o la combinación de residuos, no se cambian).
[0297] En un ejemplo, una CDR de la cadena ligera y una CDR de la cadena pesada incluyen cada uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0298] En un ejemplo, cada una de dos CDR en la molécula de anticuerpo incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR. En algunos ejemplos, ambas están en la cadena ligera. En algunos ejemplos, ambas están en la cadena pesada.
[0299] En un ejemplo, cada una de las tres CDR en la cadena pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0300] En un ejemplo, cada una de las tres CDR en la cadena ligera incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0301] En un ejemplo, cada una de las seis CDR en la cadena pesada y ligera incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa CDR.
[0302] En un ejemplo, el agente de unión es una molécula de anticuerpo que comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades:
(a) tanto S como A en la HC CDR1 están sin cambiar.
(b) V o tanto N como Q o los tres de V, N, y Q en la HC CDR2 están sin cambiar.
(c) R en la HC CDR3 está sin cambiar.
(d) I en la LC CDR1 está sin cambiar.
(e) 1, 2 o 3 de G, Y, y L en la LC CDR2 están sin cambiar;
(f) S en la LC CDR3 está sin cambiar.
[0303] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o la totalidad de las 6 propiedades que se seleccionan de (a) a (f).
[0304] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene una o más propiedades seleccionadas de (a), (b) y (c), y una cadena ligera que tiene una o más propiedades seleccionadas de (d), (e) y (f).
[0305] En el ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69); y una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID No :70); y (b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-N-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:71);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73).
[0306] En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades: (i) no produce ningún mutante de escape según se determina por el fracaso de un título viral para recuperarse después de al menos 10, 9, 8, 7, 6 o 5 rondas de infecciones seriadas en cultivo celular con una mezcla de la molécula de anticuerpo y un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010); y (ii) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti­ HA de referencia, por ejemplo, Ab 67-11, Fi6, FI28, C179, F10, CR9114, o CR6261, por ejemplo, cuando se ensaya mediante el procedimiento descrito en (i).
[0307] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una o ambas de:
a) una o más regiones marco (FR) de la SEQ ID NO: 24. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o más o todas las FR1, FR2, FR3 o FR4, o secuencias que difieren individual o colectivamente en no más de 1, 2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de la SEQ ID NO: 24; y
b) una o más regiones marco (FR) de la SEQ ID NO: 45. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o más o todas las FR1, FR2, FR3 o FR4, o secuencias que difieren individual o colectivamente en no más de 1, 2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de la SEQ ID NO: 45.
[0308] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende además uno o más o la totalidad de:
una FR1 que comprende la secuencia E-V-Q-L-L-E-S-G-G-G-L-V-K-P-G-Q-S-L-K-L-S-C-A-A-S-G-F-T-F-T (SEQ ID nO:82) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que T no se cambie); una Fr2 que comprende la secuencia W-V-R-Q-P-P-G-K-G-L-E-W-V-A (SEQ ID NO:75) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que W no se cambie, o que si cambia, sea distinto de R); una FR3 que comprende la secuencia R-F-T-/-S-R-D-N-S-K-N-T-L-Y-L-Q-M-N-S-L-R-A-E-D-T-A-V-Y-Y-C-A-K (SEQ ID NO:76) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que uno, dos o tres de /, R, o L no se cambien, o que si / se cambia, sea distinto de G, si R se cambia, sea distinto de P, o si L se cambia, sea distinto de A); y
una FR4 que comprende la secuencia W-G-Q-G-T-T-L-T-V-S-S (SEQ ID NO:77) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma) o W-G-Q-G-T-T-V-T-V-S-S (s Eq ID NO: 171) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera comprende además una o más o la totalidad de:
una FR1 que comprende la secuencia D-I-Q-M-T-Q-S-P-S-S-L-S-A-S-V-G-D-R-V-T-I-T-C-R-S-S (SEQ ID NO:78) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que R no se cambie);
una FR2 que comprende la secuencia W-Y-Q-Q-K-P-G-K-A-P-K-L-L-I-Y (SEQ ID NO:79) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma);
una FR3 que comprende la secuencia G-V-P-S-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-T-L-T-IS-S-L-Q-P-E-D-F-A-T-Y-Y-C (SEQ ID NO:80) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma, opcionalmente con la condición de que C no se cambie, o si se cambia, sea distinto de P); y
una FR4 que comprende la secuencia F-G-Q-G-T-K-V-E-I-K (SEQ ID NO:81) (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2, 3, 4, o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma).
[0309] En una realización, una FR de la cadena ligera o pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR, (es decir, mientras que otros residuos en esa FR pueden cambiarse, el residuo destacado o la combinación de residuos, no se cambian). Por ejemplo, en una realización, dos o tres de [, R o L para la FR3 de cadena pesada no se cambian.
[0310] En una realización, una FR de la cadena ligera y una FR de la cadena pesada incluyen, cada uno, uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR.
[0311] En una realización, cada una de dos FR en la molécula de anticuerpo incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR. En las realizaciones, ambas se encuentran en la cadena ligera. En las realizaciones, ambas se encuentran en la cadena pesada.
[0312] En una realización, cada una de FR2 y FR3 en la cadena pesada incluye uno de los residuos destacados, o una de las combinaciones destacadas de residuos, para esa FR.
[0313] En una realización, cada una de FR1 y FR2 en la cadena pesada y ligera incluye uno de los residuos destacados para esa FR.
[0314] En una realización, todos los residuos destacados en las FR1-4 de cadena pesada están sin cambiar.
[0315] En una realización, todos los residuos destacados en las FR1-4 de cadena ligera están sin cambiar.
[0316] En una realización, todos los residuos destacados en FR1-4 de cadena pesada y ligera están sin cambiar.
[0317] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende:
(a) el segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada comprende una o más o la totalidad de una FR1 que comprende la secuencia E-V-Q-L-L-E-S-G-G-G-G-L-V-K-P-G-Q-S-L-K-L-S-C-A-S-G-F-T-F-7 (SEQ ID NO:82);
una FR2 que comprende la secuencia W-V-R-Q-P-P-G-K-G-L-E-W-V-A (SEQ ID NO:75);
una FR3 que comprende la secuencia R-F-T-I-S-R-D-N-S-K-N-T-L-Y-L-Q-M-N-S-L-R-A-E-D-T-A-V-Y-Y-C-A-K (SEQ ID NO:76); y
una FR4 que comprende la secuencia W-G-Q-G-T-T-L-T-V-S-S (SEQ ID NO:77) o W-G-Q-G-T-T-V-T-V-S-S (SEQ ID NO: 171); y
(b) el segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende una o más o la totalidad de
una FR1 que comprende la secuencia D-I-Q-M-T-Q-S-P-S-S-L-S-A-S-V-G-D-R-V-T-1-T-C-R-S-S (SEQ ID NO:78);
una FR2 que comprende la secuencia W-Y-Q-Q-K-P-G-K-A-P-K-L-L-I-Y (SEQ ID NO:79);
una FR3 que comprende la secuencia G-V-P-S-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-T-L-T-I-S-S-L-Q-P-E-D-F-A-T-Y-Y-C (SEQ ID NO:80); y
una FR4 que comprende la secuencia F-G-Q-G-T-K-V-E-I-K (SEQ ID NO:81).
[0318] En otra realización, la molécula de anticuerpo comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades: (a) no produce ningún mutante de escape determinado por el fracaso de un título viral para recuperarse después de al menos 10, 9, 8, 7, 6 o 5 rondas de infecciones seriadas en cultivo celular con una mezcla de la molécula de anticuerpo y un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010); (b) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67-11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114, o c R6261, por ejemplo, cuando se ensaya mediante el procedimiento descrito en (a); (c) se une con alta afinidad a una hemaglutinina (HA) de al menos 1,2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 1 y al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 2; (d) trata o previene la infección por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 1, y por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 2; (e) inhibe la actividad fusogénica de la HA diana; (f) trata o previene la infección por un virus del Grupo 1, en la que el virus es un virus H1, H5 o H9; y trata o previene la infección por un virus del Grupo 2, en la que el virus es un virus H3 o H7; (g) trata o previene la infección por las cepas de gripe A H1N1 y H3N2; (h) es eficaz para la prevención o el tratamiento de la infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H1N1 y H3N2 cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg; (i) trata o previene la infección por las cepas H5N1 de gripe A; (j) es eficaz para la prevención o el tratamiento de la infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H5N1 cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg; (k) se une con alta afinidad a una hemaglutinina (HA) de un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010; (l) trata o previene la infección por un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010; (m) es eficaz para la prevención o el tratamiento de una infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (n) la concentración de molécula de anticuerpo requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe A es inferior a 10 pg/ml; (o) la concentración de molécula de anticuerpo requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, es inferior a 10 pg/ml; (p) previene o minimiza una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o efectos de la misma en un sujeto; (q) es eficaz para prevenir o minimizar una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o efectos de la misma en un sujeto cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg; (r) se une a un epítopo que comprende o consiste en la interfaz trimérica de hemaglutinina; y (s) se une a un epítopo distinto al unido por una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67-11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114 o CR6261, por ejemplo, cuando se ensaya mediante un procedimiento descrito en el presente documento, por ejemplo, mediante competencia en un ensayo ELISA.
[0319] En otro aspecto, la descripción presenta una molécula de anticuerpo que comprende: (a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO:24 (o una secuencia que difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma); y (b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:45 (o una secuencia que difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la misma). En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades: (i) no produce ningún mutante de escape según se determina por el fracaso de un título viral para recuperarse después de al menos 10, 9, 8, 7, 6 o 5 rondas de infecciones seriadas en cultivo celular con una mezcla de la molécula de anticuerpo y un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004; y (ii) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, tal como Ab 67-11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114 o CR6261, tal como cuando se ensaya mediante el procedimiento descrito en (i).
[0320] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une específicamente al antígeno de HA.
[0321] En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o la totalidad de las siguientes propiedades a-f:
a) incluye uno, dos o todos los residuos de H3 HA1 N38, I278 y D291;
b) incluye el residuo de H3 HA2 N12;
c) no incluye uno, dos o ninguno de los residuos de H3 HA1 Q327, T328 y R329;
d) no incluye uno, dos, tres, cuatro o ninguno de los residuos de H3 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
e) incluye uno, dos o todos los residuos de H3 HA1 T318, R321 y V323; o
f) incluye 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o todos los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, y E57.
[0322] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a; y b.
[0323] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: c; y d.
[0324] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a; y c o d.
[0325] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: b; y c o d.
[0326] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: c; y a o b.
[0327] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: d; y a o b.
[0328] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a, b, c y d.
[0329] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a, b, c, d, e y f.
[0330] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H3 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta al menos 2, 5, 10 o 100 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
a) los residuos de H3 HA1 N38, I278 o D291;
b) el residuo de H3 HA2 N12;
c) los residuos de H3 HA1 T318, R321 o V323; o
d) los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, o E57.
[0331] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H3 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta no más de 2 o 5 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
c) los residuos de H3 HA1 Q327, T328 o R329; o
d) los residuos de H3 HA2 G1, L2, F3, G4 o D46.
[0332] En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o la totalidad de las siguientes propiedades a-f:
aa) incluye uno, dos o todos los residuos de H1 HA1 H31, N279 y S292;
bb) incluye el residuo de H1 HA2 G12;
cc) no incluye uno o ninguno de los residuos de H1 HA1 Q328 y S329;
dd) no incluye uno, dos, tres, cuatro o ninguno de los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
ee) incluye uno, dos o ninguno de los residuos de H1 HA1 T319, R322 y 1324 que están unidos por Ab 044 y FI6; o
ff) incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o todos los residuos de H1 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57.
[0333] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa; y bb.
[0334] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: cc; y dd.
[0335] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa; y cc o dd.
[0336] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: bb; y cc o dd.
[0337] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: cc; y aa o bb.
[0338] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: dd; y aa o bb.
[0339] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa, bb, cc y dd.
[0340] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa, bb, cc, dd, ee y ff.
[0341] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H1 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta al menos 2, 5, 10 o 100 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
aa) los residuos de H1 HA1 H31, N279 y S292;
bb) el residuo de H1 HA2 G12;
cc) los residuos de H1 HA1 T319, R322, e I324; o
dd) los residuos de H1 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57.
[0342] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H1 igual o inferior a 10-6, en la que dicha KD aumenta no más de 2 o 5 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
cc) los residuos de H1 HA1 Q328 y S329; o
dd) los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
[0343] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una, dos, tres o la totalidad de las siguientes propiedades:
a y aa;
b y bb;
c y cc;
d y dd.
[0344] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades c, cc, d y dd.
[0345] En otro aspecto, la descripción presenta un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, o preparación, o preparación aislada de la misma, que comprende una propiedad estructural o funcional de una o ambas de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera descritas en el presente documento.
[0346] En una realización, la molécula de anticuerpo compite con una molécula de anticuerpo de referencia, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento, para unirse a un sustrato, por ejemplo, una Ha . La molécula de anticuerpo de referencia puede ser:
a) una molécula de anticuerpo que comprende las CDR pesadas y ligeras de:
una región variable de cadena pesada de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 2, figura 13 o figura 17; y una región variable de cadena ligera de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 3, figura 14 o figura 17.
b) una molécula de anticuerpo que comprende: (i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4b , figura 2, figura 13 o figura 17; y (ii) un segmento de región variable de cadena ligera de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 3, figura 14 o figura 17; o
c) un anticuerpo descrito en el presente documento.
[0347] La HA puede ser HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La competencia entre la molécula de anticuerpo y una molécula de anticuerpo de referencia se puede determinar mediante la evaluación de la capacidad de una de las moléculas de anticuerpo o la molécula de anticuerpo de referencia para disminuir la unión de la otra a un sustrato, por ejemplo, HA, por ejemplo, HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar mediante los procedimientos en la técnica. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar, por ejemplo, mediante uno o más de:
a) análisis BIAcore;
b) ensayo ELISA; y
c) citometría de flujo. La molécula de anticuerpo puede competir con el anticuerpo de referencia de modo que la unión del anticuerpo de referencia disminuya en un 50 % o más. En una realización, la molécula de anticuerpo se une al mismo epítopo, o a una porción del mismo, al que se une la molécula de anticuerpo de referencia. En una realización, la molécula de anticuerpo no se une al mismo epítopo, o a una porción del mismo, al que se une la molécula de anticuerpo de referencia.
[0348] En una realización, la molécula de anticuerpo se une al mismo epítopo, o una porción del mismo, en la HA, al igual que una molécula de anticuerpo de referencia, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento. La molécula de anticuerpo de referencia puede ser:
a) una molécula de anticuerpo que comprende las CDR pesadas y ligeras de:
una región variable de cadena pesada de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 2, figura 13 o figura 17; y una región variable de cadena ligera de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 3, figura 14 o figura 17.
b) una molécula de anticuerpo que comprende: (i) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4b , figura 2, figura 13 o figura 17; y (ii) un segmento de región variable de cadena ligera de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 3, figura 14 o figura 17; o
c) un anticuerpo descrito en el presente documento.
[0349] La HA puede ser HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La unión al mismo epítopo, o una porción del mismo, se puede mostrar mediante uno o más de:
a) análisis mutacional, por ejemplo, la unión a HA, o afinidad de unión por HA, disminuye o se suprime si un residuo muta;
b) análisis, por ejemplo, comparación, de la estructura cristalina de la molécula de anticuerpo y HA y la estructura cristalina de un anticuerpo de referencia y HA, por ejemplo, para determinar los puntos de contacto de cada uno; c) competencia de los dos anticuerpos por la unión a HA, por ejemplo, HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004; y
d) (c) y uno o ambos de (a) y (b);
[0350] La competencia entre la molécula de anticuerpo y una molécula de anticuerpo de referencia se puede determinar mediante la evaluación de la capacidad de una de las moléculas de anticuerpo o la molécula de anticuerpo de referencia para disminuir la unión de la otra a un sustrato, por ejemplo, HA, por ejemplo, HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar mediante los procedimientos en la técnica. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar, por ejemplo, mediante uno o más de:
a) análisis BIAcore;
b) ensayo ELISA; y
c) citometría de flujo. La molécula de anticuerpo puede competir con el anticuerpo de referencia de modo que la unión del anticuerpo de referencia disminuya en un 50 % o más.
d) competencia de los dos anticuerpos por la unión a HA, por ejemplo, HA1 o HA5, de, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004; y
e) (c) y uno o ambos de (a) y (b).
[0351] La competencia entre la molécula de anticuerpo y una molécula de anticuerpo de referencia se puede determinar mediante la evaluación de la capacidad de una de las moléculas de anticuerpo o la molécula de anticuerpo de referencia para disminuir la unión de la otra a un sustrato, por ejemplo, HA, por ejemplo, HA1 o HA5, por ejemplo, de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. La reducción de la capacidad de unión se puede evaluar mediante los procedimientos en la técnica.
[0352] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o un 99 por ciento de homología con una cadena pesada de referencia de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 2, figura 13 o figura 17; y
una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o un 99 por ciento de homología con una cadena ligera de referencia de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 3, figura 14 o figura 17, en la que, opcionalmente, cada HC CDR difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la HC CDR correspondiente de su cadena pesada de referencia, y cada LC CDR difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2, por ejemplo, aminoácidos conservadores, de la CDR correspondiente en su cadena ligera de referencia.
[0353] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende: una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con una cadena pesada de la Tabla 3 y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la cadena ligera correspondiente de la Tabla 3.
[0354] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende: una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con una cadena pesada de la Tabla 4A y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la cadena ligera correspondiente de la Tabla 4A.
[0355] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende: una región variable de cadena pesada que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con una cadena pesada de la Tabla 4B y una región variable de cadena ligera que comprende al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento de homología con la cadena ligera correspondiente de la Tabla 4B.
[0356] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
una región variable de cadena pesada de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 2, figura 13 o figura 17; y
una región variable de cadena ligera de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 3, figura 14 o figura 17.
[0357] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende:
una región variable de cadena pesada de la Tabla 3 y la cadena ligera correspondiente de la Tabla 3;
una cadena pesada de la Tabla 4A y la cadena ligera correspondiente de la Tabla 4A; o
una cadena pesada de la Tabla 4B y la cadena ligera correspondiente de la Tabla 4B.
[0358] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de una secuencia de cadena pesada de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 2, figura 13 o figura 17 (o CDR que, individual o colectivamente, difieren de las mismas en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores)); y
(b) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de una secuencia de cadena ligera de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 3, figura 14 o figura 17 (o CDR que, individual o colectivamente, difieren de las mismas en no más de, 1, 2, 3, 4 o 5, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos conservadores).
[0359] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
CDR de una cadena pesada de la Tabla 3 y CDR de cadena ligera de la cadena ligera correspondiente de la Tabla 3.
[0360] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o ambas de:
CDR de una cadena pesada de la Tabla 4A y CDR de cadena ligera de la cadena ligera correspondiente de la Tabla 4A.
[0361] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende uno o ambos de:
CDR de una cadena pesada de la Tabla 4B y CDR de cadena ligera de la cadena ligera correspondiente de la Tabla 4B.
[0362] En algunos ejemplos, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende una o más o la totalidad de las siguientes propiedades: (i) no produce ningún mutante de escape según se determina por el fracaso de un título viral para recuperarse después de al menos 10, 9, 8, 7, 6 o 5 rondas de infecciones seriadas en cultivo celular con una mezcla de la molécula de anticuerpo y un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5n 1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010); (ii) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67-11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114, o c R6261, por ejemplo, cuando se ensaya mediante el procedimiento descrito en (i); y (iii) es diferente a Ab 67-11 y FI6.
[0363] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende uno o ambos de:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende una CDR1, una CDR2; y una CDR3 de una secuencia de cadena pesada de la figura 2, figura 13 o figura 17; y
(b) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de una secuencia de cadena ligera de la figura 3, figura 14 o figura 17.
[0364] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada de la figura 2 o la figura 17; y (b) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera de la figura 3 o la figura 17.
[0365] En una realización, la región variable de inmunoglobulina de cadena pesada comprende además un dipéptido de isoleucina-aspartato (Ile-Asp) en el extremo N. En otra realización, la región variable de inmunoglobulina de cadena ligera comprende adicionalmente un dipéptido Ile-Asp en el extremo N. En aún otra realización, tanto la región variable de inmunoglobulina de cadena pesada como la región variable de inmunoglobulina de cadena ligera o un anticuerpo que se presenta en la descripción comprenden además un dipéptido Ile-Asp en el extremo N. En otra realización, el dipéptido Ile-Asp está ausente de una o ambas cadenas pesada y ligera.
[0366] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, comprende además uno o más o todos los siguientes: (a) trata o previene la infección por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 1, y por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 subtipos de gripe del Grupo 2; (b) inhibe la actividad fusogénica de la HA diana; (c) trata o previene la infección por un virus del Grupo 1, en la que el virus es un virus H1, H5 o H9; y trata o previene la infección por un virus del Grupo 2, en la que el virus es un virus H3 o H7; (d) trata o previene la infección por las cepas de gripe A H1N1 y H3N2; (e) es eficaz para la prevención o el tratamiento de una infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H1N1 y H3N2 cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (f) trata o previene la infección por las cepas H5N1 de gripe A; (g) es eficaz para la prevención o el tratamiento de una infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con H5N1 cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (h) se une con alta afinidad a una hemaglutinina (HA) de un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010; (i) trata o previene la infección por un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010; (j) es eficaz para la prevención o el tratamiento de una infección, por ejemplo, en seres humanos o ratones, con un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg o 1 mg/kg; (k) la concentración de molécula de anticuerpo requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe A es inferior a 10 pg/ml; (l) la concentración de molécula de anticuerpo requerida para la neutralización del 50 % del virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010, es inferior a 10 pg/ml; (m) previene o minimiza una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o efectos de la misma en un sujeto; (n) es eficaz para prevenir o minimizar una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o efectos de la misma en un sujeto cuando se administra a 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg; (o) se une a un epítopo que comprende o consiste en la interfaz trimérica de hemaglutinina; y (p) se une a un epítopo distinto al unido por una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67-11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114 o CR6261, por ejemplo, cuando se ensaya mediante un procedimiento descrito en el presente documento, por ejemplo, mediante competencia en un ensayo ELISA.
[0367] En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una o ambas de:
a) una o más regiones marco (FR) de cadena pesada descritas en el presente documento. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una o más o todas las secuencias FR1, FR2, FR3 o FR4 que difieren, individual o colectivamente, en no más de 1, 2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de cadena pesada descritos en el presente documento; y
b) una o más regiones marco (Fr ) de cadena ligera descritas en el presente documento. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo comprende una o más o todas las secuencias FR1, FR2, FR3 o FR4 que difieren, individual o colectivamente, en no más de 1, 2, 3, 4 de 5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, residuos conservadores, de cadena ligera descritos en el presente documento.
[0368] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une específicamente al antígeno de HA.
[0369] En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o la totalidad de las siguientes propiedades a-f:
a) incluye uno, dos o todos los residuos de H3 HA1 N38, I278 y D291;
b) incluye el residuo de H3 HA2 N12;
c) no incluye uno, dos o ninguno de los residuos de H3 HA1 Q327, T328 y R329;
d) no incluye uno, dos, tres, cuatro o ninguno de los residuos de H3 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
e) incluye uno, dos o todos los residuos de H3 HA1 T318, R321 y V323; o
f) incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o todos los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, y E57.
[0370] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a; y b.
[0371] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: c; y d.
[0372] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a; y c o d.
[0373] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: b; y c o d.
[0374] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: c; y a o b.
[0375] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: d; y a o b.
[0376] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a, b, c y d.
[0377] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: a, b, c, d, e y f.
[0378] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H3 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta al menos 2, 5, 10 o 100 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
a) los residuos de H3 HA1 N38, I278 o D291;
b) el residuo de H3 HA2 N12;
c) los residuos de H3 HA1 T318, R321 o V323; o
d) los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, o E57.
[0379] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H3 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta no más de 2 o 5 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
c) los residuos de H3 HA1 Q327, T328 o R329; o
d) los residuos de H3 HA2 G1, L2, F3, G4 o D46.
[0380] En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o la totalidad de las siguientes propiedades a-f:
aa) incluye uno, dos o todos los residuos de H1 HA1 H31, N279 y S292;
bb) incluye el residuo de H1 HA2 G12;
cc) no incluye uno o ninguno de los residuos de H1 HA1 Q328 y S329;
dd) no incluye uno, dos, tres, cuatro o ninguno de los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
ee) incluye uno, dos o ninguno de los residuos de H1 HA1 T319, R322 y 1324 que están unidos por Ab 044 y FI6; o
ff) incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o todos los residuos de H1 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57.
[0381] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa; y bb.
[0382] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: cc; y dd.
[0383] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa; y cc o dd.
[0384] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: bb; y cc o dd.
[0385] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: cc; y aa o bb.
[0386] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: dd; y aa o bb.
[0387] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa, bb, cc y dd.
[0388] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades: aa, bb, cc, dd, ee y ff.
[0389] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H1 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta al menos 2, 5, 10 o 100 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
aa) los residuos de H1 HA1 H31, N279 y S292;
bb) el residuo de H1 HA2 G12;
cc) los residuos de H1 HA1 T319, R322 y 1324; o
dd) los residuos de H1 HA2 A7, E11, I18, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57.
[0390] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una Kd para H1 igual o inferior a 10-6, en la que dicha Kd aumenta no más de 2 o 5 veces, por una mutación o mutaciones en cualquiera de:
cc) los residuos de H1 HA1 Q328 y S329; o
dd) los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46;
[0391] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una, dos, tres o la totalidad de las siguientes propiedades:
a y aa;
b y bb;
c y cc;
d y dd.
[0392] En una realización, la molécula de anticuerpo tiene las propiedades c, cc, d y dd.
[0393] En un aspecto, la descripción presenta un agente de unión anti-hemaglutinina (anti-HA), por ejemplo, una molécula o preparación de anticuerpo, o preparación aislada de la misma, que comprende:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende uno o más o la totalidad de una
CDR1 que comprende la secuencia G-F-T-F-[S/T]-[S/T]-Y-[A/G]-M-H (SEQ ID NO:1), o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:1 en no más de 1 o 2 residuos;
una CDR2 que comprende la secuencia V-[I/V/L]-S-[Y/F]-D-G-[S/N]-[Y/N]-[K/R]-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:2) o una secuencia que difiere de la SEQ ID nO:2 en no más de 1 o 2 residuos; y
una CDR3 que comprende la secuencia D-[S/T]-[R/K/Q]-L-R-[S/T]-L-L-Y-F-E-W-L-S-[Q/S]-G-[Y/L/V]-[F/L]-[N/D]-[P/Y] (SEQ ID NO:3), o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:3 en no más de 1 o 2 residuos; y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende una o más o la totalidad de una
CDR1 que comprende la secuencia [K/R]-S-S-Q-[S/T]-[V/L/I]-[T/S]-[Y/F/W]-[N/S/D]-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:4) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:4 en no más de 1 o 2 residuos, o que comprende la secuencia [K/R]-S-S-Q-[S/T]-[V/L/I]-[T/S]-[Y/F/W]-[N/S/D/Q/R/E]-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO: 170) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:170 en no más de 1 o 2 residuos o [K/R]-S-S-Q-[S/T]-[V/L/I]-[T/S]-[Y/F/W]-[N/S/D/E]-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:4) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:170 en no más de 1 o 2 residuos; una CDR2 que comprende la secuencia W-[A/G]-S-[T/A/Y/H/K/D]-[R/L]-E-[S/T] (SEQ ID NO:5) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:5 en no más de 1 o 2 residuos;
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-[Y/H]-Y-R-T-P-P-[T/S] (SEQ ID NO:6) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:6 en no más de 1 o 2 residuos;
opcionalmente, con la condición de que,
si el segmento de región variable de cadena ligera comprende: una CDR 1 que comprende la secuencia K-S-S-Q-S-V-T-Y-N-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:83); una CDR2 que comprende la secuencia W-A-S-T-R-E-S (SEQ ID NO:84); y una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-Y-Y-R-T-P-P-T (SEQ ID NO:85);
entonces el segmento de región variable de cadena pesada comprenda una o más de las siguientes: (a) CDR distintas de las siguientes: una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-G-M-H (SEQ ID NO:86); una CDR2 que comprende la secuencia V-I-S-Y-D-G-S-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:87); o una CDR3 que comprende la secuencia D-S-E-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:88); o (b) FR distintas de las siguientes: una FR1 distinta de E-V-Q-L-E-S-G-G-G-L-V-K-P-G-Q-S-L-K-L-S-C-A-A-S-G-F-T-F-J (SEQ ID NO:82); una FR2 distinta de W-V-R-Q-P-P-G-K-G-L-E-W-V-A (SEQ ID NO:75); una FR3 distinta de R-F-T-I-S-R-D-N-S-K-N-T-L-Y-L-Q-M-N-S-L-R-A-E-D-T-A-V-Y-C-A-K (SEQ ID NO:76); o una FR4 distinta de W-G-A-G-T-T-T-L-T-V-S-S (SEQ ID NO:89); (c) una CDR1 en la que el residuo amino en la posición 5 de la SEQ ID NO:1 es S, el residuo aminoácido en la posición 6 de la SEQ ID NO:1 es T, o el residuo aminoácido en la posición 8 de la SEQ ID NO:1 es A; (d) una CDR2 en la que el residuo amino en la posición 2 de la SEQ ID nO:2 es V o L, el aminoácido en la posición 4 es F, el aminoácido en la posición 7 es N, el aminoácido en la posición 8 es Y, o el aminoácido en la posición 9 es R; (e) una CDR3 en la que el residuo amino en la posición 2 de la SEQ ID NO:3 es T, el residuo de aminoácido en la posición 3 de la SEQ ID NO:3 es R, K, o Q, el residuo de aminoácido en la posición 6 de la SEQ ID NO:3 es T, el residuo de aminoácido en la posición 15 de la SEQ ID NO:3 es S, el residuo de aminoácido en la posición 17 de la SEQ ID NO:3 es L, o V, el residuo de aminoácido en la posición 18 de la SEQ ID NO:3 es L, el residuo de aminoácido en la posición 19 de la SEQ ID NO:3 es D, o el residuo de aminoácido en la posición 20 de la SEQ ID NO:3 es Y; (f) una FR1 en la que el residuo amino en la posición 11 de la SEQ ID NO:7 es Q, o el residuo de aminoácido en la posición 7 de la SEQ ID NO:7 es T; (g) una FR4 en la que el residuo amino en la posición 3 de la SEQ ID NO:10 es Q, el residuo de aminoácido en la posición 5 de la SEQ ID NO:10 es A; el residuo de aminoácido en la posición 6 de la SEQ ID NO:10 es M, o el residuo de aminoácido en la posición 7 de la SEQ ID NO:10 es V; o (h) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67-11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114 o CR6261, por ejemplo, cuando se ensaya mediante un procedimiento descrito en el presente documento, y también con la condición de que, si el segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada comprende: una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-G-M-H (SEQ ID NO:86); una CDR2 que comprende la secuencia V-I-S-Y-D-G-S-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:87); y una CDR3 que comprende la secuencia D-S-E-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO: 88), entonces el segmento de región variable de cadena ligera comprenda uno o más de los siguientes: (a) CDR distintas de las siguientes: CDR1 KSSQSVTYNYKNYLA (SEQ ID NO:83); CDR2 WASTRES (SEQ ID NO:84); o CDR3 QQYYRTPPT (SEQ ID NO:85); (b) FR distintas de las siguientes: FR1 que comprende la secuencia EIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO:90); FR2 que comprende la secuencia WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO:91); FR3 que comprende la secuencia GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO:92); o
FR4 que comprende la secuencia FGGGTKLDIK (SEQ ID NO:93); (c) una CDR1 en la que el residuo amino en la posición 1 de la SEQ ID NO:4 es R, el residuo amino en la posición 5 de la SEQ ID NO:4 es T, el residuo amino en la posición 6 de la SEQ ID NO:4 es L o I, el residuo amino en la posición 7 de la SEQ ID NO:4 es S, el residuo amino en la posición 8 de la SEQ ID NO:4 es F o W, o el residuo amino en la posición 9 de la SEQ ID NO:4 es S o D; (d) una CDR2 en la que el residuo amino en la posición 2 de la SEQ ID NO:5 es G, el residuo amino en la posición 4 de la SEQ ID NO:5 es A, Y, H, K, o D, el residuo amino en la posición 5 de la SEQ ID NO:5 es L, el residuo amino en la posición 7 de la SEQ ID NO:5 es T; (e) una CDR3 en la que el residuo amino en la posición 3 de la SEQ ID NO:6 es H; el residuo de aminoácido en la posición 9 de la SEQ ID NO:6 es S; (f) una FR1 en la que el residuo amino en la posición 1 de la SEQ ID NO:11 es D; el residuo amino en la posición 3 de la SEQ ID NO:11 es Q, el residuo amino en la posición 9 de la SEQ ID NO:11 es S, el residuo amino en la posición 10 de la SEQ ID NO:11 es T, el residuo amino en la posición 11 de la SEQ ID NO:11 es V, el residuo amino en la posición 12 de la SEQ ID NO:11 es S, el residuo amino en la posición 13 de la SEQ ID NO:11 es A, el residuo amino en la posición 14 de la SEQ ID NO:11 es T, el residuo amino en la posición 15 de la SEQ ID NO:11 es V o R, el residuo amino en la posición 17 de la SEQ ID NO:11 es D, el residuo amino en la posición 20 de la SEQ ID NO:11 es S, el residuo amino en la posición 22 de la SEQ ID NO:11 es T, Q, D, o R; (g) una FR2 en la que el residuo amino en la posición 8 de la SEQ ID NO:12 es K; o el residuo amino en la posición 9 de la SEQ ID NO: 12 es A; (h) una FR3 en la que el residuo amino en la posición 4 de la SEQ ID NO: 13 es E o S; el residuo amino en la posición 24 de la s Eq ID NO: 13 es P, el residuo amino en la posición 27 de la SEQ ID NO: 13 es F, K, o D, el residuo amino en la posición 29 de la SEQ ID NO: 13 es T; (i) una FR4 en la que el residuo amino en la posición 3 de la SEQ ID NO:14 es Q, T, S, o N, el residuo amino en la posición 7 de la SEQ ID NO:14 es V, o el residuo amino en la posición 8 de la SEQ ID NO:14 es E; o (j) produce menos mutantes de escape que una molécula de anticuerpo anti-HA de referencia, por ejemplo, Ab 67-11, FI6, FI28, C179, F10, CR9114 o CR6261, por ejemplo, cuando se ensaya mediante un procedimiento descrito en el presente documento; y adicionalmente con la condición de que si el segmento de región variable de cadena ligera comprende: una CDR 1 que comprende la secuencia K-S-S-Q-S-V-T-F-N-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:146); una CDR2 que comprende la secuencia W-A-S-A-R-E-S (SEQ ID NO:147); y una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-T (SEQ ID NO:148); entonces el segmento de región variable de cadena pesada comprenda una o más de las siguientes: CDR distintas de las CDR descritas en la figura 12B; o FR distintas de las FR descritas en la figura 12C.
[0394] En un ejemplo, las secuencias de CDR de cadena pesada, colectivamente, difieren de las secuencias mencionadas en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos; y las secuencias de CDR de cadena ligera, colectivamente, difieren de las secuencias mencionadas en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos.
[0395] En un aspecto, la descripción presenta una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que se presenta en la descripción.
[0396] En otro aspecto, la descripción presenta una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que se presenta en la descripción.
[0397] En aún otro aspecto, la descripción presenta una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que se presenta en la descripción y un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que se presenta en la descripción.
[0398] En aún otro aspecto, la descripción presenta un vector recombinante, tal como un vector de expresión, que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada, o una secuencia de nucleótidos que codifica un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que se presenta en la descripción.
[0399] En un aspecto, la descripción presenta un vector recombinante, tal como un vector de expresión, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que se presenta en la descripción.
[0400] En una realización, las moléculas de ácido nucleico en el vector recombinante incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica (a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de: S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68) en CDR1; V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69) en CDR2; y D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID NO:70) en CDR3; y (b) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de: Q-S-I-T-F-D-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:145) en CDR1; W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72) en CDR2; y Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID NO:73) en CDR3.
[0401] En un aspecto, la descripción presenta una célula que contiene un vector recombinante que se presenta en la descripción, tal como un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada, o un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera. En un ejemplo, la célula contiene un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada y un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera. En aún otro ejemplo, la célula contiene un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera.
[0402] En un aspecto, la descripción presenta un procedimiento para elaborar una molécula de anticuerpo tal como proporcionando una célula huésped que comprende una secuencia de ácido nucleico que expresa un segmento de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que expresa un segmento de cadena ligera, y que expresa los ácidos nucleicos en la célula huésped.
[0403] En un ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que expresa el segmento de cadena pesada y la secuencia de ácido nucleico que expresa el segmento de cadena ligera se encuentran en el mismo vector de expresión recombinante. En otro aspecto, la secuencia de ácido nucleico que expresa el segmento de cadena pesada y la secuencia de ácido nucleico que expresa el segmento de cadena ligera se encuentran en vectores de expresión recombinantes separados.
[0404] En un aspecto, la descripción presenta una composición farmacéutica que contiene una molécula de anticuerpo que se presenta en la descripción, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0405] En otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento para tratar o prevenir una infección con un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010), en un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, que comprende:
administrar un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se presenta en la descripción, a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, que lo necesite.
[0406] En un ejemplo, el virus de gripe A es una cepa H1, H5, H9, H3 o H7, tal como una cepa H1N1, una cepa H3N2, o una cepa H5N1 de virus de gripe A.
[0407] En un ejemplo, la administración da como resultado, o se correlaciona con, uno o más de una reducción en la incidencia o gravedad de un síntoma o manifestación de una infección por gripe, o el retraso o inicio de un síntoma o manifestación de una infección por gripe.
[0408] En un ejemplo, la administración da como resultado, o se correlaciona con, uno o más de una reducción en la incidencia o gravedad de un síntoma o manifestación de una infección secundaria, o el retraso o inicio de un síntoma o manifestación de una infección secundaria.
[0409] En algunos ejemplos, se ha administrado al sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, o el procedimiento comprende administrar o recomendar la administración de, una segunda terapia o terapia adicional.
[0410] En algunos ejemplos, la molécula de anticuerpo se administra en combinación con un segundo agente o terapia o agente o terapia adicional.
[0411] En algunos ejemplos, la segunda terapia o terapia adicional comprende la administración de una vacuna o una terapia antiviral, por ejemplo, una terapia anti-NA o una terapia anti-M2.
[0412] En un ejemplo, la segunda terapia o terapia adicional comprende una administración de una vacuna, por ejemplo, una vacuna descrita en el presente documento o una mezcla (también conocida como cóctel) de péptidos de gripe para estimular el sistema inmunitario del paciente para prevenir una infección con cepas particulares de gripe A.
[0413] En un ejemplo, el segundo agente o agente adicional comprende administrar un agente antiviral, un analgésico, un antiinflamatorio, un antibiótico, un agente esteroideo, una segunda molécula de anticuerpo terapéutica (por ejemplo, un anticuerpo anti-HA), un adyuvante, una proteasa o glucosidasa (por ejemplo, sialidasa).
[0414] En un ejemplo, el segundo agente o agente adicional comprende aciclovir, ribavirina, amantadina, remantidina, un inhibidor de neuraminidasa (por ejemplo, zanamivir (Relenza®), oseltamivir (Tamiflu®), laninamivir, peramivir), o rimantadina.
[0415] En un ejemplo, el segundo agente o agente adicional comprende una segunda molécula de anticuerpo, por ejemplo, Ab 67-11 (solicitud provisional de EE.UU. número 61/645.453, FI6 (solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813), FI28 (solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813), C179 (Okuno et al., J. Virol. 67:2552-8, 1993), F10 (Sui et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 16:265, 2009), CR9114 (Dreyfus et al., Science 337:1343, 2012), o CR6261 (véase, por ejemplo, Ekiert et al., Science 324:246, 2009). Por lo tanto, Ab 044 se puede utilizar en combinación con cualquiera de estos anticuerpos.
[0416] En un ejemplo, el segundo agente o agente adicional comprende un segundo agente de unión o adicional, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-HA, por ejemplo, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se pueden administrar dos o más de Ab 044, Ab 069, Ab 032 y Ab 031. Por ejemplo, se puede administrar Ab 044 en combinación con Ab 069 o Ab 032
[0417] En el caso de combinaciones, se pueden administrar dos agentes como parte de la misma unidad de dosificación o se pueden administrar por separado. Otros agentes ejemplares útiles para tratar los síntomas asociados con una infección por gripe son acetaminofeno, ibuprofeno, aspirina y naproxeno.
[0418] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se administra a un sujeto humano que padece o es susceptible a una infección por gripe.
[0419] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se administra antes de la exposición conocida a la gripe, o a subtipos o cepas de gripe particulares.
[0420] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se administra antes de la manifestación de efectos o síntomas de la infección por gripe, o de la manifestación de uno o más efectos o síntomas particulares de la infección por gripe.
[0421] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se administra después de la exposición conocida a la gripe, o a subtipos o cepas de gripe particulares.
[0422] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se administra después de la manifestación de efectos o síntomas de la infección por gripe, o después de observar la manifestación de uno o más efectos o síntomas particulares de la infección por gripe.
[0423] En un ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se administra en respuesta a, o para tratar o prevenir, una manifestación de un efecto o un síntoma de infección por gripe, por ejemplo, inflamación, fiebre, náuseas, pérdida de peso, pérdida de apetito, respiración rápida, aumento de la frecuencia cardíaca, presión arterial alta, dolores corporales, dolor muscular, dolor ocular, fatiga, malestar, tos seca, secreción nasal y/o dolor de garganta.
[0424] En un ejemplo, el procedimiento comprende además evaluar al sujeto humano en busca del virus de gripe, por ejemplo, con un procedimiento descrito en el presente documento. En algunos ejemplos, la administración responde a una prueba positiva para gripe.
[0425] En aún otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, infectado con un virus de la gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010) mediante la administración de un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se presenta en la descripción. Por ejemplo, el virus de gripe A es una cepa H1, H5, H9, H3 o H7, tal como una cepa H1N1, una cepa H3N2, o una cepa H5N1 de virus de gripe A.
[0426] En un ejemplo, se administra un agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo anti-HA, descrito en el presente documento, en lugar de una vacuna para la prevención de la gripe. En otro ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-HA, se administra en combinación con (simultánea o secuencialmente con) una vacuna para la prevención de la gripe.
[0427] En aún otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento para detectar viriones de gripe (por ejemplo, gripe A o gripe B) en una muestra biológica, tal como poniendo en contacto la muestra con un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se presenta en la descripción, y detectando a continuación, la unión de la molécula de anticuerpo a la muestra. En un ejemplo, el procedimiento para detectar el virus de gripe (por ejemplo, virus de gripe A o virus de gripe B) se realiza in vitro.
[0428] En un aspecto, la descripción presenta un procedimiento para (a) proporcionar una muestra de un paciente; (b) poner en contacto la muestra con un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se presenta en la descripción, y (c) determinar si el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se presenta en la descripción, se une a un polipéptido en la muestra, donde, si el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une a un polipéptido en la muestra, entonces se determina que el paciente está infectado con un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010). En un ejemplo, se determina que el paciente está infectado con un virus de gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5n 1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010), y al paciente se le administra además un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, descrita en el presente documento, por ejemplo, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, con el que se realizó la prueba.
[0429] En otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento para inducir inmunidad a una o más cepas de gripe, o prevenir, retrasar o reducir la infección con una cepa de gripe, o síntoma de la misma, en un vertebrado, por ejemplo, un ser humano. El procedimiento comprende administrarle al vertebrado, por ejemplo, un ser humano, una vacuna de amplio espectro, o un inmunógeno de amplio espectro, descritos en el presente documento.
[0430] En un ejemplo, la vacuna de amplio espectro, o inmunógeno de amplio espectro, induce una respuesta inmunitaria contra, o confiere protección contra, una o más cepas de gripe.
[0431] En un ejemplo, la vacuna de amplio espectro, o inmunógeno de amplio espectro, induce una respuesta inmunitaria contra, o confiere protección contra, dos cepas de gripe.
[0432] En un ejemplo, la vacuna de amplio espectro, o inmunógeno de amplio espectro, induce una respuesta inmunitaria contra, o confiere protección contra, dos cepas de gripe del Grupo 1.
[0433] En un ejemplo, la vacuna de amplio espectro, o inmunógeno de amplio espectro, induce una respuesta inmunitaria contra, o confiere protección contra, al menos una cepa del Grupo 1, y una segunda cepa del Grupo 1, Grupo 2 o una cepa de gripe B.
[0434] En un ejemplo, el virus de gripe A es una cepa H1, H5, H9, H3 o H7, tal como una cepa H1N1, una cepa H3N2, o una cepa H5N1 de virus de gripe A.
[0435] En un ejemplo, la administración da como resultado, o se correlaciona con, uno o más de: una reducción en la posibilidad de una infección una reducción en la incidencia o gravedad de un síntoma o manifestación de una infección por gripe, o el retraso o inicio de un síntoma o manifestación de una infección por gripe.
[0436] En un ejemplo, la administración da como resultado, o se correlaciona con, uno o más de: una reducción en la incidencia o gravedad de un síntoma o manifestación de una infección secundaria, o el retraso o inicio de un síntoma o manifestación de una infección secundaria.
[0437] En algunos ejemplos, se ha administrado al sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, o el procedimiento comprende administrar o recomendar la administración de, una segunda terapia o terapia adicional.
[0438] En algunos ejemplos, la vacuna de amplio espectro se administra en combinación con un segundo agente o terapia adicional.
[0439] En algunos ejemplos, el segundo agente o agente adicional comprende la administración de otra vacuna u otra terapia antiviral, por ejemplo, una terapia anti-NA o anti-M2.
[0440] En un ejemplo, el segundo agente o agente adicional comprende la administración de una vacuna que comprende una mezcla (también conocida como un cóctel) de péptidos de gripe para estimular el sistema inmunitario del paciente para prevenir una infección con cepas particulares de gripe A.
[0441] En un ejemplo, el segundo agente o agente adicional comprende administrar un agente antiviral, un analgésico, un antiinflamatorio, un antibiótico, un agente esteroideo, una segunda molécula de anticuerpo terapéutica (por ejemplo, un anticuerpo anti-HA), un adyuvante, una proteasa o glucosidasa (por ejemplo, sialidasa).
[0442] En un ejemplo, el segundo agente o agente adicional comprende aciclovir, ribavirina, amantadina, remantidina, un inhibidor de neuraminidasa (por ejemplo, zanamivir (Relenza®), oseltamivir (Tamiflu®), laninamivir, peramivir), o rimantadina.
[0443] En un ejemplo, el segundo agente o agente adicional comprende una molécula de anticuerpo, por ejemplo, Ab 67-11 (solicitud provisional de EE.UU. número 61/645.453, FI6 (solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813), FI28 (solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813), C179 (Okuno et al., J. Virol. 67:2552-8, 1993), F10 (Sui et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 16:265, 2009), CR9114 (Dreyfus et al., Science 337:1343, 2012), o CR6261 (véase, por ejemplo, Ekiert et al., Science 324:246, 2009).
[0444] En un ejemplo, el segundo agente o agente adicional comprende una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento, por ejemplo, una molécula de anticuerpo seleccionada de moléculas de anticuerpo Ab-044, Ab 069, Ab 032 y Ab 031.
[0445] En el caso de combinaciones, se pueden administrar dos agentes como parte de la misma unidad de dosificación o se pueden administrar por separado.
[0446] Otros segundos agentes o agentes adicionales ejemplares útiles para tratar los síntomas asociados con una infección por gripe son acetaminofeno, ibuprofeno, aspirina y naproxeno.
[0447] En un ejemplo, la vacuna de amplio espectro, o inmunógeno de amplio espectro, se administra a un sujeto humano que padece o es susceptible a una infección por gripe.
[0448] En un ejemplo, la vacuna de amplio espectro, o inmunógeno de amplio espectro, se administra antes de la exposición conocida a la gripe, o a subtipos o cepas de gripe particulares.
[0449] En un ejemplo, la vacuna de amplio espectro, o inmunógeno de amplio espectro, se administra antes de la manifestación de efectos o síntomas de la infección por gripe, o de la manifestación de uno o más efectos o síntomas particulares de la infección por gripe.
[0450] En un ejemplo, la vacuna de amplio espectro, o inmunógeno de amplio espectro, se administra después de la exposición conocida a la gripe, o a subtipos o cepas de gripe particulares.
[0451] En un ejemplo, la vacuna de amplio espectro se administra después de la manifestación de efectos o síntomas de la infección por gripe, o después de observar la manifestación de uno o más efectos o síntomas particulares de la infección por gripe.
[0452] En un ejemplo, la vacuna de amplio espectro, o inmunógeno de amplio espectro, se administra en respuesta a, o para tratar o prevenir, una manifestación de un efecto o un síntoma de infección por gripe, por ejemplo, inflamación, fiebre, náuseas, pérdida de peso, pérdida de apetito, respiración rápida, aumento de la frecuencia cardíaca, presión arterial alta, dolores corporales, dolor muscular, dolor ocular, fatiga, malestar, tos seca, secreción nasal y/o dolor de garganta.
[0453] En un ejemplo, el procedimiento comprende además evaluar al sujeto humano en busca del virus de gripe, por ejemplo, con un procedimiento descrito en el presente documento. En algunos ejemplos, la administración responde a una prueba positiva para gripe.
[0454] En aún otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, infectado con un virus de la gripe (por ejemplo, un virus de gripe A, por ejemplo, una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, o un virus de gripe B, por ejemplo, B/Wisconsin/1/2010) mediante la administración de una vacuna de amplio espectro que se presenta en la descripción. Por ejemplo, el virus de gripe A es una cepa H1, H5, H9, H3 o H7, tal como una cepa H1N1, una cepa H3N2, o una cepa H5N1 de virus de gripe A.
[0455] En otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento para reducir la gravedad de la gripe en una población. El procedimiento incluye la administración de una vacuna de amplio espectro, o inmunógeno de amplio espectro, a suficientes individuos en la población para prevenir o disminuir la posibilidad de transmisión del virus de gripe a otro individuo en la población.
[0456] En otro aspecto, la descripción presenta un kit que comprende uno o más recipientes que tienen dispuesto en los mismos un inmunógeno de amplio espectro, un ácido nucleico que codifica el epítopo de amplio espectro, o una vacuna de amplio espectro descrita en el presente documento. En un ejemplo, el kit incluye un recipiente que tiene adyuvante dispuesto en el mismo. En un ejemplo, el kit comprende un dispositivo de administración, por ejemplo, un dispositivo de inyección o inhalador. En un ejemplo, el epítopo de amplio espectro descrito en el presente documento, o un ácido nucleico que codifica el epítopo de amplio espectro o la vacuna de amplio espectro, se dispone en un dispositivo de administración.
[0457] En un ejemplo, el kit comprende un dispositivo de administración, por ejemplo, un dispositivo de inyección o inhalador. En un ejemplo, la vacuna se dispone en un dispositivo de administración.
[0458] En otro aspecto, la descripción presenta una composición, por ejemplo, una vacuna, que comprende un epítopo de amplio espectro descrito en el presente documento, envasado en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla. En un ejemplo, la composición es un líquido. En un ejemplo, la composición es un líquido, un polvo liofilizado esterilizado seco o un concentrado libre de agua.
[0459] A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden utilizar en la práctica o ensayo de la invención, a continuación, se describen procedimientos y materiales adecuados.
[0460] Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son ilustrativos solamente y no pretenden ser limitantes.
[0461] Los detalles de una o más realizaciones presentadas en la descripción se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas presentadas en la descripción serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0462]
La figura 1 son las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera (SEQ ID NOs:94 y 95, respectivamente) del anticuerpo anti-HA A18. La secuencia de dominio constante se indica en cursiva. Las CDR se indican por subrayado.
La figura 2 es la secuencia de dominio de cadena pesada variable de anticuerpos anti-HA ejemplares. Las SEQ ID NOs. para las secuencias mostradas son las siguientes: VH15 es la SEQ ID NO: 15; VH16 es la SEQ ID NO: 16; VH17 es la SEQ ID NO: 17; VH18 es la SEQ ID NO: 18; VH19 es la SEQ ID NO: 19; VH21 es la SEQ ID NO: 21; VH22 es la SEQ ID NO: 22; VH20 es la SEQ ID NO: 20; VH23 es la SEQ ID NO: 23; VH24 es la SEQ ID NO: 24; VH25 es la SEQ ID NO: 25; VH26 es la SEQ ID NO: 26; VH27 es la SEQ ID NO: 27; y VH161 es la SEQ ID NO: 161.
La figura 3 es la secuencia de dominio de cadena pesada ligera de anticuerpos anti-HA ejemplares. Las SEQ ID NOs. para las secuencias mostradas son las siguientes: VL28 es la SEQ ID NO: 28; VL29 es la SEQ ID NO: 29; VL30 es la SEQ ID NO: 30; VL35 es la SEQ ID NO: 35; VL31 es la SEQ ID NO: 31; VL32 es la SEQ ID NO: 32; VL33 es la SEQ ID NO: 33; VL34-ID es la SEQ ID NO: 34; VL36 es la SEQ ID NO: 36; VL45 es la SEQ ID NO: 45; VL46 es la SEQ ID NO: 46; VL37 es la SEQ ID NO: 37; VL38 es la SEQ ID NO: 38; VL39 es la SEQ ID NO: 39; VL40 es la SEQ ID NO: 40; VL41 es la SEQ ID NO: 41; VL42 es la SEQ ID NO: 42; VL43 es la SEQ ID NO: 43; VL44 es la SEQ ID NO: 44; VL47 es la SEQ ID NO: 47; VL48 es la SEQ ID NO: 48; VL49 es la SEQ ID NO: 49; VL50 es la SEQ ID NO: 50; VL51 es la SEQ ID NO: 51; VL52 es la SEQ ID NO: 52; VL53 es la SEQ ID NO: 53; VL54 es la SEQ ID NO: 54; VL55 es la SEQ ID NO: 55; VL56 es la SEQ ID NO: 56; VL57 es la SEQ ID NO: 57; VL58 es la SEQ ID NO: 58; VL59 es la SEQ ID NO: 59; VL60 es la SEQ ID NO: 60; VL61 es la SEQ ID NO: 61; VL153 es la SEQ ID NO: 153; VL154 es la SEQ ID NO: 154; VL155 es la SEQ ID NO: 155; VL156 es la SEQ ID NO: 156; y VL62 es la SEQ ID NO: 62.
La figura 4 es un gráfico que representa la neutralización de la cepa X-31 de H3N2 por anticuerpos A18. En contraste, la cepa X-31 no se neutralizó por anticuerpos AB1.
La figura 5 es un gráfico de los resultados de ELISA que representa una unión más fuerte de A18 a H3 Brisbane/07, y una unión mucho más débil a H3 Wyoming/03.
La figura 6 es un gráfico de los resultados de ELISA que representa la unión de A18 a virus H3 Bris07 HA, H3N2 Bris07, y una unión débil al control negativo, BSA (albúmina sérica bovina).
Las figuras 7A y 7B son gráficos que representan la capacidad del anticuerpo A18 para proteger a los ratones infectados de la pérdida de peso. Los ratones se infectaron con cepas de gripe H1N1 (figura 7A) o H3N2 (figura 7B).
Las figuras 8A y 8B son gráficos que representan el porcentaje de supervivencia de ratones infectados con H1N1 (figura 8A) o h3n2 (figura 8B), y tratados 48 horas después con anticuerpos Ab 028, Ab 031 o Ab 032.
Las figuras 9A, 9B y 9C son gráficos que representan el porcentaje de supervivencia de ratones infectados con H1N1 (A/Puerto Rico/8/34) (figura 9A), H3N2 (A/Victoria/03/75) (figura 9B) o H1N1 (A/California/04/09) (figura 9C). Los ratones se trataron con varias dosis de anticuerpo Ab 032.
Las figuras 10A a 10D son gráficos de los resultados de ELISA que representan la amplia especificidad de los anticuerpos Ab 014 y Ab 028. Se ha demostrado que ambos anticuerpos se unen a subtipos de gripe del Grupo 1 (subtipos H1, H5 y H9) y del Grupo 2 (subtipos H3 y H7).
La figura 11 es un gráfico que representa la incapacidad de la cepa de gripe PR8 (H1N1) para superar la neutralización por AB 1 después de 5 rondas (R5) de propagación en presencia de AB1. Por otro lado, PR8 desarrolla resistencia al anticuerpo neutralizante de control C179 visto por la recuperación del título después de 4 rondas de selección en presencia de C179.
La figura 12 muestra las secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de FI6 (SEQ ID NO: 175), FI370 (SEQ ID NO: 176), variante 1 de FI6 (SEQ ID NO: 177), variante 3 de FI6 (SEQ ID NO: 178), FI6/370 (SEQ ID NO: 179) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera kappa de FI6 (SEQ ID NO: 180).
La figura 13 es la secuencia de dominio de cadena pesada variable de anticuerpos anti-HA ejemplares como se muestra en la figura 2 y que incluye un dipéptido ID N-terminal. Las SEQ ID NOs. para las secuencias mostradas son las siguientes: VH15-ID es la SEQ ID NO: 96; VH16-ID es la SEQ ID NO: 97; VH17-ID es la SEQ ID NO: 98; VH18-ID es la SEQ ID NO: 99; VH19-ID es la SEQ ID NO: 100; VH21-ID es la SEQ ID NO: 101; VH22-ID es la SEQ ID NO: 102; VH20-ID es la SEQ ID NO: 103; VH23-ID es la SEQ ID NO: 104; VH24-ID es la SEQ ID NO: 105; VH25-ID es la SEQ ID NO: 106; VH26-ID es la SEQ ID NO: 107; VH27-ID es la SEQ ID NO: 108; y VH161-ID es la SEQ ID NO: 109.
La figura 14 es la secuencia de dominio de cadena ligera variable de anticuerpos anti-HA ejemplares como se muestra en la figura 3 y que incluye un dipéptido ID N-terminal. Las SEQ ID NOs. para las secuencias mostradas son las siguientes: VL28-ID es la SEQ ID NO: 110; VL29-ID es la SEQ ID NO: 111; VL30-ID es la SEQ ID NO: 112; VL35-ID es la SEQ ID NO: 113; VL31-ID es la SEQ ID NO: 114; VL32-ID es la SEQ ID NO: 115; VL33-ID es la SEQ ID NO: 116; VL34-ID es la SEQ ID NO: 117; VL36-ID es la SEQ ID NO: 118; VL45-ID es la SEQ ID NO: 119; VL46-ID es la SEQ ID NO: 120; VL37-ID es la SEQ ID NO: 121; VL38-ID es la SEQ ID NO: 122; VL39-ID es la SEQ ID NO: 123; VL40-ID es la SEQ ID NO: 124; VL41-ID es la SEQ ID NO: 125; VL42-ID es la SEQ ID NO: 126; VL43-ID es la SEQ ID NO: 127; VL44-ID es la SEQ ID NO: 128; VL47-ID es la SEQ ID NO: 129; VL48-ID es la SEQ ID NO: 130; VL49-ID es la SEQ ID NO: 131; VL50-ID es la SEQ ID NO: 132; VL51-ID es la SEQ ID NO: 133; VL52-ID es la SEQ ID NO: 134; VL53-ID es la SEQ ID NO: 135; VL54-ID es la SEQ ID NO: 136; VL55-ID es la SEQ ID NO: 137; VL56-ID es la SEQ ID NO: 138; VL57-ID es la SEQ ID NO: 139; VL58-ID es la SEQ ID NO: 140; VL59-ID es la SEQ ID NO: 141; VL60-ID es la SEQ ID NO: 142; VL61-ID es la SEQ ID NO: 143; VL153-ID es la SEQ ID NO: 157; VL154-ID es la SEQ ID NO: 158; VL155-ID es la SEQ ID NO: 159; VL156-ID es la SEQ ID NO: 160; y VL62-ID es la SEQ ID NO: 144.
La figura 15 es un gráfico que representa la cantidad de sincitios observados después del tratamiento de células HEK293 infectadas por HA con el anticuerpo Ab 032. "Pre" y "post" indican el tratamiento de las células con anticuerpo antes de la inducción de condiciones de fusión por pH bajo (5,0), o después de la inducción por pH bajo.
La figura 16 es un gráfico que representa el porcentaje de supervivencia de ratones infectados con H1N1 y posteriormente infectados con la bacteria S. pneumococcus. Los ratones se trataron con antibióticos o anticuerpos anti-HA.
La figura 17 muestra las secuencias de cadena ligera y pesada variables de anticuerpos anti-HA ejemplares adicionales. Las SEQ ID NOs. para las secuencias mostradas son las siguientes: VL165 es la SEQ ID NO: 165; VL166 es la SEQ ID NO: 166; VL167 es la SEQ ID NO: 167; VL168 es la SEQ ID NO: 168; VL169 es la SEQ ID NO: 169; VH164 es la SEQ ID NO: 164; VH162 es la SEQ ID NO: 162; VH163 es la SEQ ID NO: 163.
La figura 18 es un gráfico que representa la cantidad de sincitios observados después del tratamiento de células HEK293 infectadas por HA con el anticuerpo Ab 044. Barra izquierda = pH 5,0; barra derecha = pH 7,0.
La figura 19A muestra los cambios de peso de ratones después de exposición a la cepa H1N1 PR8 y la administración de vehículo, ribavirina, profilaxis con Ab 044 a 10 mg/kg, profilaxis con Ab 044 a 2,5 mg/kg, o profilaxis con Ab 044 a 0,6 mg/kg.
La figura 19B muestra el cambio de peso de los ratones después de exposición a la cepa H1N1 PR8 y la administración de terapia con Ab 044 dos días después de la infección a 10 mg/kg, 2,5 mg/kg o 0,6 mg/kg; o terapia con Ab 044 tres días después de la infección a 20 mg/kg.
La figura 20A muestra los cambios de peso de ratones después de la exposición a la cepa Victoria de H3N2 y la administración de vehículo, ribavirina, o profilaxis con AB 044 a 10 mg/kg.
La figura 20B muestra los cambios de peso de los ratones después de exposición a H3N2 y la administración de terapia con Ab 044 dos días después de la infección a 10 mg/kg, 2,5 mg/kg o 0,6 mg/kg; o terapia con Ab 044 tres días después de la infección a 20 mg/kg.
La figura 21A muestra la carga viral pulmonar en ratones cuatro días después de la exposición viral a H1N1, según se mide mediante ensayo en placas. Los ratones infectados se trataron con vehículo, ribavirina, profilaxis con Ab 044 a 10 mg/kg, profilaxis con Ab 044 a 2,5 mg/kg, profilaxis con Ab 044 a 0,6 mg/kg, terapia con Ab 044 a 10 mg/kg, terapia con Ab 044 a 2,5 mg/kg, terapia con Ab 044 a 0,6 mg/kg, o terapia con Ab 044 en 72 h.
La figura 21B muestra la carga viral pulmonar en ratones cuatro días después de la exposición viral a H3N2. Los ratones infectados se trataron con vehículo, ribavirina, profilaxis con Ab 044 a 10 mg/kg, terapia con Ab 044 a 10 mg/kg, terapia con Ab 044 a 2,5 mg/kg, terapia con Ab 044 a 0,6 mg/kg, o terapia con Ab 044 en 72 h. Asterisco, p<0,05.
La figura 22A muestra las curvas de supervivencia de ratones después de la exposición a H1N1 y la administración de vehículo, ribavirina, profilaxis con Ab 044 a 10 mg/kg, 2,5 mg/kg o 0,6 mg/kg.
La figura 22B muestra las curvas de supervivencia de ratones después de la exposición a H1N1 y la administración de vehículo, terapia con Ab 044 en 48 h a 10 mg/kg, a 2,5 mg/kg, a 0,6 mg/kg o terapia con Ab 044 en 72 h a 20 mg/kg.
La figura 23A muestra las curvas de supervivencia de ratones después de la exposición a H3N2 y la administración de vehículo, ribavirina, o profilaxis con Ab 044 a 10 mg/kg.
La figura 23B muestra las curvas de supervivencia de ratones después de la exposición a H3N2 y la administración de vehículo, terapia con Ab 044 en 48 h después de la infección a 10 mg/kg, a 2,5 mg/kg, a 0,6 mg/kg o terapia con Ab 044 en 72 h después de la infección a 20 mg/kg.
La figura 24 ilustra los efectos de la administración profiláctica y terapéutica de Ab 044 en el peso de ratones BALB/c infectados con el virus de gripe H5N1 A/Vietnam/1203/2004.
La figura 25 ilustra los efectos de la administración profiláctica y terapéutica de Ab 044 en la supervivencia de ratones BALB/c infectados con el virus de gripe H5N1 A/Vietnam/1203/2004.
La figura 26 es una representación tridimensional de H3 HA con los residuos de aminoácidos que se predice que forman parte del epítopo Ab044, pero no forman parte del epítopo de FI6 destacado. Es decir, los aminoácidos destacados son exclusivos del epítopo de Ab044.
La figura 27 es una representación tridimensional de H3 HA con los residuos de aminoácidos que forman parte del epítopo de FI6, pero que no se predice que formen parte del epítopo de Ab044 destacado.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0463] La descripción se basa, al menos en parte, en el diseño y la síntesis de moléculas de anticuerpo que pueden unirse a un epítopo que se conserva a través de múltiples subtipos de hemaglutinina de virus de gripe (por ejemplo, virus de gripe A y virus de gripe B). Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento son útiles como terapia de amplio espectro contra la enfermedad causada por al menos una cepa de gripe A perteneciente al Grupo 1 y una cepa de gripe A perteneciente al Grupo 2 para neutralizar la infectividad de virus pertenecientes tanto al Grupo 1 como al Grupo 2 (al menos un subtipo de cada uno).
[0464] Las moléculas de anticuerpo se diseñaron mediante un enfoque racional basado en la estructura para dirigirse a una región en el virus que no es completamente accesible para el sistema inmunitario humano y, por lo tanto, no es susceptible a la selección de anticuerpos a través de enfoques de cribado más clásicos. Este enfoque racional para el diseño y desarrollo de moléculas de anticuerpos de amplio espectro permite el desarrollo de vacunas más eficaces para la gripe pandémica y estacional. Este enfoque también permite la preparación anticipada de vacunas pandémicas para que estén listas para ser empleadas contra subtipos específicos de virus (por ejemplo, subtipos de virus aviares) que pueden mutar para adaptarse a los seres humanos y ser altamente transmisibles. Las vacunas (por ejemplo, vacunas estacionales) que utilizan las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento pueden generar una respuesta inmunitaria más potente sin el uso de adyuvantes y proporcionar una amplia protección contra la variación de la cepa viral.
Definiciones
[0465] Como se usa en el presente documento, el término "molécula de anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia suficiente de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y/o una secuencia suficiente de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina, para proporcionar unión específica al antígeno. Comprende anticuerpos de longitud completa, así como fragmentos de los mismos, por ejemplo, fragmentos Fab, que soportan la unión al antígeno. Típicamente, una molécula de anticuerpo comprenderá una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera. Las moléculas de anticuerpo incluyen anticuerpos humanos, humanizados, injertados en CDR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones, una molécula de anticuerpo comprende una proteína que comprende al menos un segmento de región variable de inmunoglobulina, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que proporciona un dominio variable de inmunoglobulina o una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina.
[0466] La cadena VH o VL de la molécula de anticuerpo puede incluir además la totalidad o parte de una región constante de cadena pesada o ligera, para formar así una cadena de inmunoglobulina pesada o ligera, respectivamente. En una realización, la molécula de anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulina pesadas y dos cadenas de inmunoglobulina ligeras.
[0467] Una molécula de anticuerpo puede comprender uno o ambos de un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada (o ligera). Como se usa en el presente documento, el término "segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada (o ligera)" se refiere a una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada (o ligera) completa, o un fragmento de la misma, que es capaz de unirse al antígeno. La capacidad de un segmento de cadena pesada o ligera para unirse al antígeno se mide con el segmento emparejado con una cadena ligera o pesada, respectivamente. En alguna realización, un segmento de cadena pesada o ligera que es menor que una región variable de longitud completa, cuando se empareja con la cadena adecuada, se une con una afinidad que es al menos un 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 95 % de lo que se ve cuando la cadena de longitud completa se empareja con una cadena ligera o cadena pesada, respectivamente.
[0468] Un segmento de región variable de inmunoglobulina puede diferir de una secuencia de referencia o consenso. Como se usa en el presente documento, "diferir" significa que un residuo en la secuencia de referencia o secuencia consenso se reemplaza con un residuo diferente o un residuo ausente o insertado.
[0469] Una molécula de anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada (H) (abreviada en el presente documento como VH) y una región variable de cadena ligera (L) (abreviada en el presente documento como VL). En otro ejemplo, un anticuerpo comprende dos regiones variables de cadena pesada (H) y dos regiones variables de cadena ligera (L) o fragmentos de unión al anticuerpo de las mismas. Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipos kappa o lambda. En una realización, la molécula de anticuerpo está glucosilada.
humanizada.
[0477] Un "dominio de inmunoglobulina" se refiere a un dominio del dominio variable o constante de moléculas de inmunoglobulina. Los dominios de inmunoglobulina típicamente contienen dos láminas p formadas por aproximadamente hebras p, y un enlace disulfuro conservado (véase, por ejemplo, A. F. Williams y A. N. Barclay (1988) Ann. Rev. Immunol. 6:381-405).
[0478] Como se usa en el presente documento, una "secuencia de dominio variable de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de aminoácidos que puede formar la estructura de un dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, la secuencia puede incluir la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos de un dominio variable de origen natural. Por ejemplo, la secuencia puede omitir uno, dos o más aminoácidos N o C-terminales, aminoácidos internos, puede incluir una o más inserciones o aminoácidos terminales adicionales, o puede incluir otras alteraciones. En una realización, un polipéptido que comprende una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina puede asociarse con otra secuencia de dominio variable de inmunoglobulina para formar una estructura de unión diana (o "sitio de unión a antígeno"), por ejemplo, una estructura que interactúa con el antígeno diana.
[0479] Como se usa en el presente documento, el término anticuerpos comprende anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, anticuerpos de dominio único de tiburón (por ejemplo, IgNAR o fragmentos de los mismos)), anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos siempre que muestren la actividad biológica deseada. Los anticuerpos para su uso en el presente documento pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM).
[0480] El anticuerpo o molécula de anticuerpo puede derivar de un mamífero, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o rata, caballo, cerdo o cabra. En algunas realizaciones, un anticuerpo o molécula de anticuerpo se produce usando una célula recombinante. En algunas realizaciones, un anticuerpo o molécula de anticuerpo es un anticuerpo quimérico, por ejemplo, de ratón, rata, caballo, cerdo u otras especies, con dominios de regiones constantes y/o variables humanas.
[0481] Un agente de unión, como se usa en el presente documento, es un agente que se une, por ejemplo, se une específicamente, a un antígeno diana, por ejemplo, HA. Los agentes de unión comparten suficiente relación estructural con moléculas de anticuerpo anti-HA descritas en el presente documento para soportar la unión específica a HA y, en algunos ejemplos, otras propiedades funcionales de una molécula de anticuerpo anti-HA descrita en el presente documento. En algunos ejemplos, un agente de unión exhibirá una afinidad de unión de al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % de una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento, por ejemplo, una molécula de anticuerpo con la que comparte homología estructural significativa, por ejemplo, secuencias CDR. Los agentes de unión pueden ser de origen natural, por ejemplo, al igual que algunos anticuerpos, o sintéticos. En un ejemplo, un agente de unión es un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo. Si bien algunos agentes de unión son moléculas de anticuerpo, otras moléculas, por ejemplo, otros polipéptidos, también pueden funcionar como agentes de unión. Los agentes de unión a polipéptidos pueden ser monoméricos o multiméricos, por ejemplo, diméricos, triméricos o tetraméricos, y se pueden estabilizar mediante enlaces intra o intercatenarios, por ejemplo, enlaces disulfuro. Pueden contener residuos de aminoácidos de origen natural o no natural. En algunos ejemplos, los agentes de unión son moléculas de anticuerpo, u otros polipéptidos, que presentan una o más CDR de moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento o que imitan de otro modo la estructura de una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento. Los agentes de unión también pueden comprender aptámeros, ácidos nucleicos u otras entidades moleculares. Un agente de unión se puede desarrollar de una diversidad de maneras, por ejemplo, mediante inmunización, mediante diseño racional, análisis de estructuras aleatorias, o una combinación de estos u otros enfoques. Típicamente, un agente de unión actuará poniendo en contacto sustancialmente el mismo epítopo que una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento, por ejemplo, una molécula de anticuerpo con la que comparte una homología estructural significativa, por ejemplo, secuencias CDR. Un agente de unión puede interactuar con aminoácidos, sacáridos o combinaciones de los mismos. Se pueden utilizar polipéptidos distintos de los anticuerpos como andamiaje para presentar la secuencia, por ejemplo, una o más, o un conjunto completo de CDR de cadena pesada y/o cadena ligera, descritas en el presente documento. Los andamiajes ejemplares incluyen adnectina, proteínas de unión al ADN de dedos de cinc, proteína A, lipoclinas, dominio de repetición de consenso de anquirina, tiorredoxina, anticalinas, centirina, dominios de avimer, ubiquitina, peptidomiméticos, péptidos encadenados, miniproteínas de nudo de cistina, e IgNAR. En algunos ejemplos, un agente de unión es o comprende un ácido nucleico, por ejemplo, ADN, ARN, o mezclas de los mismos. En algunos ejemplos, un agente de unión, por ejemplo, un ácido nucleico, muestra una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria. En algunos ejemplos, un agente de unión, por ejemplo, un ácido nucleico, forma una estructura que imita la estructura de una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento.
[0482] Un agente de unión de amplio espectro, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, como se usa en el presente documento, se une a múltiples moléculas de hA diferentes, y opcionalmente neutraliza virus que comprenden las diferentes moléculas de HA. En una realización, se une a una primera HA y se une a una segunda HA del Grupo 1 de gripe A, y opcionalmente neutraliza virus que comprenden la primera o segunda molécula de HA. En una realización, se une a una primera HA de un virus del Grupo 1 de gripe A, y se une a un segundo HA de un virus del Grupo 2 de gripe A, y opcionalmente neutraliza virus que comprenden las diferentes moléculas de HA. En una realización, se une a una primera HA de un virus del Grupo 1 o 2 de gripe A, y se une a una HA de un virus de gripe B, y opcionalmente neutraliza virus que comprenden las diferentes moléculas de HA. En una realización, se une, y en algunas realizaciones neutraliza, al menos dos clados o clústeres de virus diferentes, por ejemplo, de diferentes Grupos. En algunas realizaciones, se une, y en algunas realizaciones neutraliza, todas o sustancialmente todas las cepas del Grupo 1 y/o Grupo 2 descritas en el presente documento. En una realización, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une y, en algunas realizaciones, neutraliza: al menos una cepa del clúster H1 del Grupo 1, por ejemplo, H1a o H1b, y al menos una cepa del clúster H3 o H7 del Grupo 2. En una realización, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une y, en algunas realizaciones, neutraliza: al menos una cepa del clúster H1 del Grupo 1, por ejemplo, H1a o H1b, y al menos una cepa de gripe B. En una realización, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une, y en algunas realizaciones, neutraliza: al menos una cepa del clúster H3 o H7 del Grupo 2, y al menos una cepa de gripe B. En una realización, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une y, en algunas realizaciones, neutraliza: al menos una cepa del clúster H1 del Grupo 1, por ejemplo, H1a o H1b, al menos una cepa del clúster H3 o H7 del Grupo 2, y al menos una cepa de gripe B. En algunas realizaciones, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se une, y opcionalmente neutraliza o media la infección de huéspedes particulares, por ejemplo, aviares, camélidos, caninos, gatos, civetas, equinos, humanos, ratones, cerdos, tigres u otros mamíferos o aves.
[0483] El término "terapia de combinación", como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de múltiples agentes, por ejemplo, en la que al menos un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, descrito en el presente documento se administra a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano. La introducción de los agentes en el sujeto puede ser en diferentes momentos. En algunos ejemplos, los agentes se administran en regímenes superpuestos, o de modo que el sujeto se expone simultáneamente a ambos agentes, o de modo que la respuesta del sujeto sea mejor de lo que se vería con cualquiera de los agentes administrados en solitario.
[0484] Como se usa en el presente documento, un "mutante de escape" es una cepa de gripe mutada que es resistente a la neutralización por una molécula de anticuerpo anti-HA descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, un mutante de escape es resistente a la neutralización con un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, pero su cepa progenitora se neutraliza por el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo.
[0485] Como se usa en el presente documento, "gripe pandémica" se refiere a una nueva cepa viral que surge debido a la adaptación humana de una cepa de gripe por mutación o por aparición de una cepa por reasignación de diferentes cepas de gripe A. La cepa pandémica resultante es significativamente diferente de las cepas anteriores y la mayoría de las personas tendrán poca o ninguna inmunidad preexistente. Los síntomas y complicaciones pueden ser más graves y más frecuentes que los típicos de la gripe estacional. Los ejemplos de virus de gripe pandémica pasados incluyen, por ejemplo, la "gripe porcina" H1N1 de 2009, la "gripe asiática" H2N2 de 1957-58, y las cepas de gripe H3N2 de 1968.
[0486] Los términos "purificado" y "aislado", como se usan en el presente documento, en el contexto de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo, un inmunógeno o, generalmente, un polipéptido, obtenido de una fuente natural, se refieren a una molécula que está sustancialmente libre de materiales contaminantes de la fuente natural, por ejemplo, materiales celulares de la fuente natural, por ejemplo, desechos celulares, membranas, organelos, la mayor parte de los ácidos nucleicos, o proteínas, presentes en las células. Por lo tanto, un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se aísla, incluye preparaciones de un polipéptido que tiene menos de aproximadamente el 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 2 % o el 1 % (en peso seco) de materiales celulares y/o materiales contaminantes. Los términos "purificado" y "aislado", cuando se usan en el contexto de una especie sintetizada químicamente, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, o inmunógeno, se refieren a la especie que está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos que participan en las síntesis de la molécula.
[0487] Una preparación de agentes de unión, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, como se usa en el presente documento, comprende una pluralidad de moléculas de un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, ese agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, constituye al menos el 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, 99,5 o el 99,9 % de la preparación, o de los principios activos de la preparación, en peso o en número. En algunas realizaciones, ese agente de unión es una molécula de anticuerpo que constituye al menos el 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, 99,5 o el 99,9 % de la preparación, o de los principios activos, o ingredientes polipeptídicos, o moléculas de anticuerpo, de la preparación, en peso o en número. En algunas realizaciones, el agente de unión es una molécula de anticuerpo y la preparación no contiene más del 30, 20, 10, 5, 2, 1 o 0,5 %, en peso o cantidad, de un contaminante, por ejemplo, un reactivo, disolvente, precursor u otras especies, de la fuente, o utilizado en la preparación, de la molécula de anticuerpo, por ejemplo, una especie de una célula, mezcla de reacción, u otro sistema utilizado para producir la molécula de anticuerpo.
[0488] Como se usa en el presente documento, el término "prevenir una infección" significa que un sujeto (por ejemplo, un ser humano) tiene menos probabilidades de infectarse por gripe si el sujeto recibe el anticuerpo antes de (por ejemplo, 1 día, 2 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 1 mes o más) estar expuesto a gripe.
[0489] Como se usa en el presente documento, "gripe estacional" es una cepa que es idéntica o estrechamente
relacionada con cepas que han estado circulando en la población humana en los últimos años y, por lo tanto, la mayoría
de las personas son al menos parcialmente inmunes a ella. No es probable que tal cepa cause una enfermedad grave.
Los síntomas pueden incluir fiebre, tos, secreción nasal y dolor muscular, y en casos raros, la muerte puede ser el
resultado de complicaciones, tal como neumonía. Los brotes siguen patrones estacionales predecibles, anualmente,
y generalmente en otoño e invierno y en climas templados. La infección debida a la gripe estacional se conoce
comúnmente como gripe.
[0490] Como se usa en el presente documento, unión específica significa que un agente de unión, por ejemplo,
una molécula de anticuerpo, se une a su antígeno con una Kd igual o inferior a 10-5. En algunas realizaciones, el
anticuerpo se une a su antígeno con una Kd igual o inferior a 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-1°, 10-11, o 10-1
[0491] Como se usa en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una
cantidad de un agente terapéutico, por ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que da
como resultado un resultado positivo para el sujeto. En algunas realizaciones, se puede correlacionar estadísticamente
con el efecto o beneficio terapéutico, por ejemplo, la disminución o prevención de una manifestación de un efecto o
síntoma, cuando se administra a una población de sujetos. En algunas realizaciones, es una cantidad que también
proporciona una relación beneficio/riesgo preseleccionada o razonable. En algunas realizaciones, es una cantidad
eficaz para reducir la incidencia y/o gravedad y/o retrasar el inicio de una o más rasgos, síntomas o características de
una enfermedad, trastorno o afección. Se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz en un régimen de
dosificación que puede comprender una o múltiples dosis unitarias.
[0492] Como se usa en el presente documento, el término "tratar infección" significa que un sujeto (por ejemplo,
un ser humano) que ha sido infectado con gripe y experimenta síntomas de gripe (por ejemplo, la gripe), en algunas
realizaciones, padecerá síntomas menos graves y/o se recuperará más rápido cuando se administre la molécula de
anticuerpo que si nunca se administra el anticuerpo. En algunas realizaciones, cuando se trata una infección, un
ensayo para detectar virus en el sujeto detectará menos virus después de un tratamiento eficaz para la infección. Por
ejemplo, un ensayo de diagnóstico que utiliza una molécula de anticuerpo, tal como una molécula de anticuerpo
descrita en el presente documento, detectará menos virus o ningún virus en una muestra biológica de un paciente
después de la administración de una molécula de anticuerpo para el tratamiento eficaz de la infección viral. También
se pueden utilizar otros ensayos, tales como PCR (por ejemplo, qPCR) para monitorizar el tratamiento en un paciente,
para detectar la presencia, por ejemplo, disminución de la presencia (o ausencia) después del tratamiento de la
infección viral en el paciente. El tratamiento puede, por ejemplo, aliviar, mejorar, aligerar, inhibir, reducir parcial o
completamente la gravedad y/o reduce la incidencia y, opcionalmente, retrasa el inicio de una o más manifestaciones
de los efectos o síntomas, características y/o causas de una enfermedad, trastorno y/o afección particular (por ejemplo,
gripe). En algunas realizaciones, el tratamiento es de un sujeto que no muestra signos de la enfermedad, trastorno y/o
afección relevante y/o de un sujeto que muestra solo signos tempranos de la enfermedad, trastorno y/o afección. En
algunas realizaciones, el tratamiento es de un sujeto que muestra uno o más signos establecidos de la enfermedad,
trastorno y/o afección relevante. En algunas realizaciones, el tratamiento es de un sujeto al que se le ha diagnosticado
que padece gripe.
Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" o "identidad" entre dos secuencias (los términos se utilizan
indistintamente en el presente documento) se pueden realizar de la siguiente manera. Las secuencias se alinean para
fines de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una
segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para un alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas se
pueden ignorar para fines comparativos). El alineamiento óptimo se determina como la mejor puntuación usando el
programa GAP en el paquete de software GCG con una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por
hueco de 12, una penalización de extensión por hueco de 4 y una penalización por hueco de desplazamiento de 5. A
continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones
de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo
de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son
idénticas en esa posición (como se usa en el presente documento, "identidad" de aminoácidos o ácido nucleico es
equivalente a "homología" de aminoácidos o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias va
en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias.
Polipéptidos de hemaalutinina (HA) e gripe
[0493] Los virus de la gripe son virus de envoltura de ARN segmentados, monocatenarios y con sentido
negativo. Se muestran dos glucoproteínas, un polipéptido de hemaglutinina (HA) y un polipéptido de neuraminidasa
(NA) en la superficie externa de la envoltura viral. Hay varios subtipos de gripe A, etiquetados según un número H
(para el tipo de hemaglutinina) y un número N (para el tipo de neuraminidasa). Hay 17 antígenos H diferentes (H1 a
H17) y nueve antígenos N diferentes (N1 a N9). Las cepas de gripe se identifican mediante una nomenclatura basada
en la cantidad de subtipos de polipéptido HA y polipéptido NA de la cepa, por ejemplo, H1N1, H1N2, H1N3, H1N4,
H1N5, y similares.
[0494] L a H A e s la p r in c ip a l g lu c o p ro te ín a d e s u p e r f ic ie v ira l q u e m e d ia la u n ió n y la e n tra d a de l v iru s e n la s c é lu la s h u é s p e d y e s un o b je tiv o p r in c ip a l d e la s re s p u e s ta s d e a n t ic u e rp o s n e u tra liz a n te s . La H A e s un t r ím e r o de t re s m o n ó m e ro s id é n tic o s . C a d a m o n ó m e ro s e s in te t iz a c o m o un p re c u rs o r , H A 0, q u e s e p ro c e s a p ro te o lí t ic a m e n te en d o s c a d e n a s p o lip e p t íd ic a s u n id a s a d is u lfu ro , H A 1 y H A 2. El e c to d o m in io d e e s ta p ro te ín a t ie n e (i) un d o m in io c a b e z a g lo b u la r q u e p o s e e a c t iv id a d d e u n ió n al re c e p to r y d e te rm in a n te s a n t ig é n ic o s p r in c ip a le s , ( ii) u n a re g ió n b is a g ra , y (iii) u n a re g ió n m a d re d o n d e s e e n c u e n tra u n a s e c u e n c ia c r ít ic a p a ra la fu s ió n , el p é p tid o d e fu s ió n . El c ic lo d e re p lic a c ió n v ira l s e in ic ia c u a n d o el v ir ió n s e u n e a t ra v é s d e s u s p ro te ín a s d e h e m a g lu t in in a s u p e r f ic ia le s a lo s re c e p to re s d e g lu c a n o s s ia l i la d o s e n la c é lu la h u é s p e d y e n tra e n la c é lu la p o r e n d o c ito s is . El e n to rn o á c id o e n el e n d o s o m a in d u c e c a m b io s c o n fo rm a c io n a le s en la H A q u e e x p o n e n el p é p tid o d e fu s ió n o c u lto d e n tro d e la re g ió n d e l ta llo d e l tr ím e ro . El p é p tid o d e fu s ió n e x p u e s to m e d ia la fu s ió n d e la s m e m b ra n a s c e lu la re s v ira le s y d ia n a d a n d o c o m o re s u lta d o la lib e ra c ió n d e la r ib o n u c le o p ro te ín a v ira l e n el c ito p la s m a c e lu la r .
[0495] L o s s u b t ip o s d e h e m a g lu t in in a d e g r ip e A s e h a n d iv id id o e n d o s g ru p o s p r in c ip a le s y c u a tro c la d o s m á s p e q u e ñ o s , y e s to s s e d iv id e n a d ic io n a lm e n te e n c lú s te re s . L a s c e p a s d e g r ip e A d e l G ru p o 1 s e d iv id e n e n 3 c la d o s : (i) H 8 , H 9 y H 12 ("e l c lú s te r H 9 "); ( ii) H 1, H 2 , H 5 , H 6 y H 17 ("e l c lú s te r H 1 a "); y ( iii) H 11 , H 13 y H 16 ("e l c lú s te r H 1 b "). L a s c e p a s d e l G ru p o 2 s e d iv id e n e n 2 c la d o s : (i) H 3 , H 4 y H 14 ("e l c lú s te r H 3 "); y ( ii) H 7 , H 10 y H 15 ("e l c lú s te r H 7 "). L o s c lú s te re s H 1 b y H 1 a s e c la s if ic a n ju n to s c o m o el c lú s te r H 1. L o s d ife re n te s s u b t ip o s d e Ha n o n e c e s a r ia m e n te c o m p a r te n u n a id e n tid a d d e s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s fu e r te , p e ro s u s e s tru c tu ra s 3 D g e n e ra le s s o n s im ila re s .
[0496] D e lo s 17 s u b t ip o s d e p o lip é p t id o s H A , s o lo 3 (H 1 , H 2 y H 3 ) s e h a n a d a p ta d o p a ra la in fe c c ió n h u m a n a . E s to s s u b t ip o s t ie n e n e n c o m ú n la c a p a c id a d d e u n irs e a a lfa g lic a n o s 2 ,6 s ia li la d o s . P o r el c o n tra r io , s u s h o m ó lo g o s a v ia re s s e u n e n p re fe re n te m e n te a a lfa g l ic a n o s 2 ,3 s ia li la d o s . L o s p o lip é p t id o s H A q u e s e h a n a d a p ta d o p a ra in fe c ta r h u m a n o s (p o r e je m p lo , d e p o lip é p t id o s H A d e lo s s u b t ip o s d e g r ip e p a n d é m ic a H 1 N 1 (1918 ) y H 3 N 2 (1967 -68 ) ) s e h a n c a ra c te r iz a d o p o r u n a c a p a c id a d d e u n irs e p re fe re n te m e n te a g lic a n o s a 2 ,6 s ia l i la d o s en c o m p a ra c ió n c o n s u s p ro g e n ito re s a v ia re s q u e s e u n e n p re fe re n te m e n te a g lic a n o s a 2 ,3 s ia l i la d o s (v é a n s e , p o r e je m p lo , S k e h e l & W ile y , A n n u R e v B io c h e m , 69 :531 , 2000 ; R o g e rs , y P a u ls o n , V iro lo g y , 127 :361 , 1983 ; R o g e rs e t a l., N a tu re , 304 :76 , 1983 ; S a u te r e t a l., B io c h e m is try , 31 :9609 , 1992
[0497] A d e m á s , lo s p o lip é p t id o s H A q u e m e d ia n la in fe c c ió n d e s e re s h u m a n o s s e u n e n p re fe re n te m e n te a g lic a n o s d e to p o lo g ía e n p a ra g u a s s o b re g lic a n o s d e to p o lo g ía c ó n ic a (v é a s e , p o r e je m p lo , el d o c u m e n to U .S .
20 11 /0201547 ) . S in d e s e a r q u e d a r lig a n d o a n in g u n a te o r ía p a r t ic u la r , s e ha p ro p u e s to q u e la c a p a c id a d d e in fe c ta r h u é s p e d e s h u m a n o s s e c o r re la c io n a m e n o s c o n la u n ió n a g lic a n o s d e un e n la c e p a rt ic u la r , y m á s c o n la u n ió n a g lic a n o s d e u n a to p o lo g ía p a r t ic u la r , a u n q u e lo s g lic a n o s d e to p o lo g ía c ó n ic a p u e d e n s e r g lic a n o s a 2 ,6 s ia li la d o s . S e h a d e m o s tra d o q u e lo s p o lip é p t id o s H A q u e m e d ia n la in fe c c ió n d e s e re s h u m a n o s s e u n e n a lo s g lic a n o s d e to p o lo g ía e n p a ra g u a s , m o s tra n d o a m e n u d o p re fe re n c ia p o r lo s g l ic a n o s d e to p o lo g ía e n p a ra g u a s s o b re lo s g lic a n o s de to p o lo g ía c ó n ic a .
[0498] L o s p o lip é p t id o s H A m a d u ro s in c lu y e n t re s d o m in io s , (i) un d o m in io g lo b u la r ( ta m b ié n c o n o c id o c o m o el d o m in io c a b e z a ) c o n s is te p r in c ip a lm e n te e n el p é p tid o H A 1 y c o n t ie n e la re g ió n d e u n ió n al re c e p to r (g lu c o p ro te ín a s s ia li la d a s ) , ( ii) un d o m in io d e ta l lo (H A 1 y H A 2 ) d o n d e re s id e el p é p tid o d e fu s ió n d e m e m b ra n a , y ( iii) un d o m in io t ra n s m e m b ra n a (H A 2 ) q u e a n c la la h e m a g lu t in in a a la e n v o ltu ra v ira l. U n c o n ju n to d e a m in o á c id o s e n la in te r fa z de lo s p é p tid o s H A 1 y H A 2 e s tá a lta m e n te c o n s e rv a d o e n to d o s lo s s u b t ip o s d e g rip e . L a re g ió n p ro x im a l d e la m e m b ra n a H A 1 /H A 2 (M P E R ), in c lu y e n d o u n a h é lic e a lfa c a n ó n ic a , ta m b ié n e s tá a lta m e n te c o n s e rv a d a a t ra v é s d e s u b t ip o s de g rip e .
[0499] L o s p o lip é p t id o s H A in te ra c tú a n c o n la s u p e r f ic ie d e la s c é lu la s u n ié n d o s e a un re c e p to r d e g lu c o p ro te ín a , c o n o c id o c o m o re c e p to r H A . La u n ió n d e un p o lip é p t id o H A a un re c e p to r H A e s tá m e d ia d a p re d o m in a n te m e n te p o r g lic a n o s u n id o s a N e n lo s re c e p to re s H A . L o s p o lip é p t id o s H A en la s u p e r f ic ie d e p a r t íc u la s d e v iru s d e la g r ip e re c o n o c e n g lic a n o s s ia l i la d o s q u e e s tá n a s o c ia d o s c o n re c e p to re s H A e n la s u p e r f ic ie de l h u é s p e d c e lu la r . D e s p u é s d e la re p lic a c ió n d e p ro te ín a s v ira le s y g e n o m a p o r la m a q u in a r ia c e lu la r , b ro ta n n u e v a s p a r t íc u la s v ira le s d e l h u é s p e d p a ra in fe c ta r la s c é lu la s v e c in a s .
[0500] A c tu a lm e n te , la s v a c u n a s s e a d m in is tra n a s u je to s , p o r e je m p lo , s e re s h u m a n o s , p a ra p re v e n ir la g rip e , p o r e je m p lo , p a ra p re v e n ir la in fe c c ió n o p a ra m in im iz a r lo s e fe c to s d e u n a in fe c c ió n c o n el v iru s d e g rip e . L a s v a c u n a s tra d ic io n a le s c o n t ie n e n un c ó c te l d e a n t íg e n o s d e d iv e rs a s c e p a s d e g r ip e y s e a d m in is tra n a lo s s e re s h u m a n o s p a ra e v ita r q u e el s e r h u m a n o s e in fe c te c o n el v iru s . L a H A e s el o b je t iv o p r in c ip a l d e lo s a n t ic u e rp o s n e u tra liz a n te s d e g r ip e A , y la H A e x p e r im e n ta u n a e v o lu c ió n c o n t in u a im p u ls a d a p o r la p re s ió n s e le c t iv a d e la re s p u e s ta d e l a n t ic u e rp o , q u e s e d ir ig e p r in c ip a lm e n te c o n tra el s u b d o m in io d e u n ió n al re c e p to r d is ta l d e m e m b ra n a d e l p o lip é p t id o H A . S in e m b a rg o , el s u je to s o lo e s tá p ro te g id o d e c e p a s q u e s o n id é n tic a s o e s t re c h a m e n te re la c io n a d a s c o n la s c e p a s d e la s q u e s e d e r iv a ro n lo s a n t íg e n o s e n el c ó c te l. El s e r h u m a n o s ig u e s ie n d o m á s v u ln e ra b le a la in fe c c ió n p o r o tra s c e p a s d e la g r ip e q u e n o s e in c lu y e ro n en el c ó c te l. U n a d e la s v e n ta ja s d e lo s a n t ic u e rp o s p ro p o rc io n a d o s e n el p re s e n te d o c u m e n to e s s u c a p a c id a d p a ra u n irs e a un e p íto p o d e H A q u e s e c o n s e rv a a t ra v é s d e m ú lt ip le s c e p a s d e g r ip e A , y e n a lg u n a s re a liz a c io n e s , g r ip e B. P o r lo ta n to , la a d m in is tra c ió n d e un a n t ic u e rp o a n t i-H A d e s c r ito e n el p re s e n te d o c u m e n to s e rá m á s e f ic a z p a ra p ro te g e r a un in d iv id u o d e la in fe c c ió n d e un e s p e c tro m á s a m p lio d e g r ip e (p o r ejemplo, gripe A y, en algunas realizaciones, gripe B) y afecciones asociadas a la misma (por ejemplo, infecciones secundarias, por ejemplo, infecciones bacterianas secundarias). Además, los anticuerpos son eficaces en el tratamiento de un sujeto después de que se ha producido la infección.
Moléculas de anticuerpos anti-HA
[0501] Los agentes de unión, y en particular, las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento, se pueden unir a los virus de gripe A tanto del Grupo 1 como del Grupo 2, y en algunas realizaciones, también se unen a los virus de gripe B. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento pueden unirse a un polipéptido HA en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 cepas del Grupo 1, y también pueden unirse a un polipéptido HA en al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 cepas del Grupo 2. En otro ejemplo, las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento pueden unirse a un polipéptido HA en una cepa de gripe de al menos 1, 2 o 3 clados del Grupo 1, y también pueden unirse a un polipéptido hA en una cepa de gripe de uno o ambos clados del Grupo 2. Las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento inhiben la entrada celular y, por lo tanto, se dirigen a una etapa temprana en el proceso de infección.
[0502] Los agentes de unión, y en particular, las moléculas de anticuerpo que se presentan en la descripción, pueden ser eficaces para tratar o prevenir la infección por cepas de gripe estacional o pandémica. Los agentes de unión, y en particular las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento, se pueden caracterizar por su capacidad para prevenir o tratar una cepa del Grupo 1 o del Grupo 2 de virus de gripe A o, en algunas realizaciones, una cepa de virus de gripe B. Los agentes de unión, y en particular las moléculas de anticuerpo que se presentan en la descripción, son eficaces para prevenir o tratar la infección por una o más cepas del Grupo 1, una o más cepas del Grupo 2, y también una o más cepas de virus de gripe B.
[0503] Los agentes de unión y, en particular, las moléculas de anticuerpo pueden ser eficaces para tratar la infección cuando se administran el mismo día en que se expone al sujeto, o cuando se administran, por ejemplo, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días o más tarde después de la infección, o tras un primer síntoma experimentado por el paciente. Cepas
[0504] Las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento son eficaces para tratar una o más cepas de gripe del Grupo 1, una o más cepas de gripe del Grupo 2, y también una o más cepas de gripe B, y aislados específicos dentro de estas cepas. Determinadas moléculas de anticuerpo pueden ser más eficaces para el tratamiento de determinados aislados que otros aislados. Los ejemplos de cepas de gripe y aislados se describen en la siguiente Tabla 1.
T l 1 E m l ri i l
Figure imgf000059_0001
(continuación)
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[0505] La afinidad también puede referirse a un aislado particular de una cepa dada del Grupo 1 o Grupo 2 para virus de gripe A o una cepa para virus de gripe B. Los ejemplos de aislados son los que se proporcionan en la Tabla 1 anterior.
Mecanismos de inhibición
[0506] Sin quedar limitados por un mecanismo específico, los anticuerpos específicos de HA pueden inhibir la infección mediante numerosos procedimientos, tales como bloquear la unión viral a residuos de ácido siálico en proteínas de superficie en células huésped, interfiriendo con la transición estructural de HA que desencadena la actividad de fusión en el endosoma, o inhibiendo simultáneamente la unión y la fusión virus-célula.
[0507] En algunas realizaciones, las moléculas de anticuerpos que se presentan en el presente documento se unen a un epítopo en la interfaz trimérica de HA. Los cambios estructurales en la interfaz trimérica son importantes para la fusión de la membrana viral y la membrana endocítica, y las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento interfieren con esta etapa crítica de infección. Los ensayos para medir la actividad fusogénica de HA se conocen en la técnica. Por ejemplo, un ensayo de fusión mide la formación de sincitios, que tiene lugar en eventos de fusión célula-célula. En el ensayo se pueden usar células que expresan y muestran una HA de cepa viral de gripe. La hemaglutinina anclada a membrana en estas células se induce a convertir a la conformación de fusión mediante una breve exposición (por ejemplo, 3 minutos) a pH bajo (por ejemplo, pH 5). A continuación, sigue un periodo de incubación de 2-3 horas para permitir que las células se recuperen y se fusionen para formar sincitios. Se puede usar una tinción nuclear para facilitar la visualización de estos productos de fusión, y su recuento se utiliza como un indicador de la actividad de fusión. Se puede añadir un anticuerpo anti-HA candidato antes o después del tratamiento a pH bajo para determinar en qué fase del proceso de fusión interfiere el anticuerpo.
[0508] Otro tipo de ensayo de fusión monitoriza la mezcla de contenido. Para medir la mezcla de contenido, las células huésped (por ejemplo, eritrocitos) se cargan con un colorante (por ejemplo, amarillo Lucifer) para determinar si el contenido de células huésped unidas a HA podría administrarse a células que expresan HA después de la exposición a condiciones inductoras de fusión (por ejemplo, pH bajo, tal como pH menor de 6 o pH menor de 5). Si el colorante no se mezcla con el contenido de las células huésped, entonces se puede llegar a la conclusión de que se inhibe la fusión. Véase, por ejemplo, Kemble et al., J. Virol. 66:4940-4950, 1992.
[0509] En otro ejemplo, se realiza un ensayo de fusión monitorizando la mezcla de lípidos. El ensayo de mezcla de lípidos se puede realizar marcando células huésped (por ejemplo, eritrocitos) con un colorante fluorescente (por ejemplo, R18 (octadecil-rodamina)) o pares de colorantes (por ejemplo, CPT-PC/DABS-PC) (para transferencia de energía de resonancia de fluorescencia), exponiendo las células huésped y las células que expresan HA a condiciones inductoras de fusión, y ensayando la desactivación de fluorescencia (FDQ). La mezcla de lípidos conduce a la dilución de la etiqueta en la envoltura viral y una consiguiente desactivación. Un retraso en la desactivación o la ausencia de desactivación es indicativo de la inhibición de la fusión de membrana. Véase, por ejemplo, Kemble et al., J. Virol.
66:4940-4950, 1992; y Carr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:14306-14313, 1997.
Mutantes de escape
[0510] En algunas realizaciones, las cepas de gripe rara vez, si es que alguna vez lo hacen, producen mutantes de escape cuando entran en contacto con las moléculas de anticuerpo destacadas.
[0511] Los mutantes de escape se pueden identificar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo que se presenta en la descripción no producirá un mutante de escape cuando las células están infectadas con el virus bajo exposición prolongada o repetida a los anticuerpos anti-HA que se presentan en la descripción.
[0512] Un procedimiento ejemplar incluye la infección de células (por ejemplo, células MDCK) con una cantidad fija de partículas virales de gripe A en presencia del anticuerpo a una concentración conocida por atenuar las tasas de infección en un 50 %. La progenie viral recolectada después de cada pase se utiliza para infectar un cultivo celular fresco en presencia de la misma o mayor concentración del anticuerpo. Después de múltiples ciclos de infección, por ejemplo, después de 15 ciclos, 12 ciclos, 11 ciclos, 10 ciclos, 9 ciclos, 8 ciclos, 7 ciclos, 6 ciclos o 5 ciclos de infección en estas condiciones, se evalúa la secuencia de nucleótidos de HA extraída de 20 recolecciones de placa viral para determinar el enriquecimiento para mutaciones que hacen que el aislado viral sea resistente a la neutralización por el anticuerpo (un mutante de escape). Si no se detectan mutantes con sensibilidad reducida al anticuerpo después de las múltiples rondas de selección, por ejemplo, después de 11 rondas, 10 rondas o 9 rondas de selección, se determina que el anticuerpo es resistente a mutaciones de escape (véase, por ejemplo, Throsby et al. (2008) PLoS One, volumen 3, e3942).
[0513] En otro ejemplo, se puede utilizar un ensayo que mide la concentración inhibitoria mínima (MIC) del anticuerpo neutralizante para identificar mutantes de escape. La MIC de una molécula de anticuerpo es la concentración más baja de una molécula de anticuerpo que se puede mezclar con el virus para prevenir la infección del cultivo celular con gripe. Si surgen mutantes de escape dentro de una población viral, entonces se observará que la MIC de un anticuerpo particular aumenta con mayores rondas de propagación bajo la presión selectiva del anticuerpo, a medida que aumenta la proporción de partículas virales que portan la mutación de resistencia dentro de la población. Los mutantes de escape de gripe rara vez, si es que alguna vez lo hacen, evolucionan en respuesta a una molécula de anticuerpo anti-HA descrita en el presente documento y, por lo tanto, la MIC permanecerá igual con el tiempo.
[0514] Otro ensayo adecuado para monitorizar el desarrollo de mutantes de escape es un ensayo de efecto citopático (CPE). Un ensayo CPE monitoriza la capacidad de un anticuerpo para neutralizar (es decir, prevenir la infección por) una cepa de gripe. Un ensayo CPE proporciona la concentración mínima de anticuerpo requerida en el cultivo celular para neutralizar el virus. Si surgen mutantes de escape, que el CPE de un anticuerpo particular aumentará con el tiempo, a medida que el anticuerpo se vuelve menos eficaz para neutralizar el virus. Las cepas virales rara vez producen, si lo hacen, mutantes de escape en respuesta a una molécula de anticuerpo anti-HA descrita en el presente documento y, por lo tanto, el CPE permanecerá esencialmente igual con el tiempo.
[0515] La reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (qPCR) también se puede utilizar para monitorizar el desarrollo de mutantes de escape. La qPCR es útil para monitorizar la capacidad de un anticuerpo para neutralizar (es decir, prevenir la infección por) una cepa de gripe. Si un anticuerpo neutraliza eficazmente un virus, entonces la qPCR realizada en muestras de cultivo celular no detectará la presencia de ácido nucleico genómico viral. Si surgen mutantes de escape, con el tiempo, la qPCR amplificará más y más ácido nucleico genómico viral. Los mutantes de escape rara vez, si es que alguna vez lo hacen, se desarrollan en respuesta a una molécula de anticuerpo anti-HA descrita en el presente documento y, por lo tanto, la qPCR rara vez, si alguna vez lo hace, detectará ácido nucleico genómico viral, incluso después del paso del tiempo.
Unión y afinidad
[0516] En algunos ejemplos, los agentes de unión, particularmente moléculas de anticuerpo, que se presentan en el presente documento, se unen a dos o más de los siguientes:
al menos un polipéptido HA de una cepa de gripe del Grupo 1 (por ejemplo, un polipéptido H1, H2, H5, H6, H8, H9 H12, H11, H13, H16 o H17);
al menos un polipéptido HA de una cepa de gripe del Grupo 2 (por ejemplo, un polipéptido H3, H4, H14, H7, H10 o H15); y
al menos un polipéptido HA de una cepa de gripe B.
[0517] En un aspecto, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, tendrá una Kd para una HA de una cepa de gripe del Grupo 1 (por ejemplo, un polipéptido H1, H2, H5, H6, H8, H9 H12, H11, H13, H16 o H17) igual o inferior a 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, o 10-12.
[0518] En un aspecto, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, tendrá una Kd para una HA de una cepa de gripe del Grupo 2 (por ejemplo, un polipéptido H3, H4, H14, H7, H10, o H15) igual o inferior a 10­ 6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, o 10-12.
[0519] En un aspecto, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, tendrá una Kd para una HA de gripe B igual o inferior a 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, o 10-12.
[0520] En un ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, tendrá:
a) una primera Kd (que representa una afinidad por una HA de una cepa de gripe del Grupo 1, por ejemplo, un polipéptido H1, H2, H5, H6, H8, H9, H12, H11, H13, H16 o H17); y
b) una segunda KD (que representa una afinidad por una HA de una cepa de gripe del Grupo 2, por ejemplo, un polipéptido H3, H4, H14, H7, H10 o H15),
en el que la primera y segunda KD son uno o ambos de:
tanto igual como inferior a 10-8; y
dentro 10 o 100 veces entre sí;
[0521] En un ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, tendrá
a) una primera Kd (que representa una afinidad por un H1, por ejemplo, e1H1 de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004); y
b) una segunda Kd (que representa una afinidad por un polipéptido H3, por ejemplo, e1H3 de una cepa H3N2, por ejemplo, A/Brisbane/59/2007),
en el que la primera y segunda KD son uno o ambos de:
tanto igual como inferior a 10-8; y
dentro 10 o 100 veces entre sí;
[0522] En un ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, tendrá
a) una primera Kd (que representa una afinidad por un H1, por ejemplo, e1H1 de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/I ndonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004); y
b) una segunda Kd (que representa una afinidad por un polipéptido H3, por ejemplo, e1H3 de una cepa H3N2, por ejemplo, A/Brisbane/59/2007),
en el que la primera y segunda KD son uno o ambos de:
tanto igual como inferior a 10-8; y
dentro 10 o 100 veces entre sí.
[0523] En un ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, tendrá:
a) una primera Kd (que representa una afinidad por una HA de una cepa de gripe del Grupo 1, por ejemplo, un polipéptido H1, H2, H5, H6, H8, H9 H12, H11, H13, H16 o H17, y/o una afinidad por una HA de una cepa de gripe del Grupo 2, por ejemplo, un polipéptido H3, H4, H14, H7, H10 o H15); y
b) una segunda KD (que representa una afinidad por una HA de gripe B, por ejemplo, de B/Wisconsin/1/2010); en el que la primera y segunda KD son uno o ambos de:
tanto igual como inferior a 10'8; y
dentro 10 o 100 veces entre sí.
[0524] En un ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, tendrá:
a) una primera Kd (que representa una afinidad por una HA de una cepa de gripe del Grupo 1, por ejemplo, un H1, por ejemplo, el H1 de una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934, o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, y/o una afinidad por una HA de una cepa de gripe del Grupo 2, por ejemplo, un polipéptido H3, de una cepa H3N2, por ejemplo, de A/Brisbane/59/2007); y
b) una segunda Kd (una afinidad por una HA de gripe B);
en el que la primera y segunda KD son: uno o ambos de:
tanto igual como inferior a 10'8; y
dentro 10 o 100 veces entre sí.
[0525] En una realización, la molécula de anticuerpo se une al menos a un polipéptido HA de una cepa de gripe del Grupo 1 con una afinidad mayor que un anticuerpo anti-HA de referencia, y al menos a un polipéptido HA de una cepa de gripe del Grupo 2 con una afinidad mayor que un anticuerpo anti-HA de referencia. En otra realización, la molécula de anticuerpo se une al menos a un polipéptido HA de una cepa de gripe A con una afinidad mayor que un anticuerpo anti-HA de referencia, y al menos a un polipéptido HA de una cepa de gripe B con una afinidad mayor que un anticuerpo anti-HA de referencia. Los anticuerpos HA de referencia ejemplares incluyen Ab 67-11 (solicitud provisional de EE.UU. número 61/645.453, presentada en la misma fecha que la presente solicitud), FI6 (FI6, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier secuencia FI6 descrita específicamente en la solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813, solicitud publicada de EE.UU. N.° 2011/0274702, documento WO2013/011347 o Corti et al., Science 333:850-856, 2011, publicado en línea el 28 de julio de 2011; figuras 12A a 12C), FI28 (solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813), y C179 (Okuno et al., J. Virol. 67:2552-1558, 1993), F10 (Sui et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 16:265, 2009), CR9114 (Dreyfus et al., Science. 2012; 337(6100):1343-1348; publicado en línea el 9 de agosto de 2012), y CR6261 (Ekiert et al., Science 324:246-251,2009; publicado en línea el 26 de febrero de 2009).
[0526] La afinidad, o afinidad o avidez relativa, se puede medir mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como mediante ensayo ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), resonancia por plasmones superficiales (SPR, por ejemplo, mediante un Ensayo Biacore™), o ensayo KinExA® (Sapidyne, Inc.). La afinidad de unión relativa se expresa en el presente documento según el ensayo ELISA. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo anti-HA que se une con "alta afinidad" a una HA del Grupo 1, a una HA del Grupo 2, y a una HA de gripe B, puede unirse a una HA del Grupo 1 con una Kd menor o igual a 200 pM, por ejemplo, menor o igual a 100 pM, según lo medido por ELISA, puede unirse a una HA del Grupo 2 con una Kd menor o igual a 200 pM, por ejemplo, menor o igual a 100 pM, según lo medido por ELISA, y puede unirse a una HA de gripe B con una Kd menor o igual a 200 pM, por ejemplo, menor o igual a 100 pM, según lo medido por ELISA.
Moléculas de anticuerpos anti-HA ejemplares
[0527] En el presente documento se proporcionan anticuerpos que tienen una o más secuencias CDR y una o más secuencias marco (FR) como se muestra en la Tabla 2.
- ^
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(continuación)
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[0528] En una realización, el anticuerpo anti-HA comprende una cadena pesada y/o una cadena ligera como se define en la Tabla 3 a continuación. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras variables de la Tabla 3 se proporcionan en las figuras 2, 3, respectivamente, o en la figura 17.
Tabl -
Figure imgf000064_0002
(continuación)
Figure imgf000064_0003
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(continuación)
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Q ID NO:
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[0529] En una realización, el anticuerpo anti-HA comprende una cadena pesada, como se define en la Tabla 4A a continuación, y/o una cadena ligera, como se define en la Tabla 4A a continuación.
T l 4A=D i n i n = n i = =min i = = n= ^i r
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[0530] En un ejemplo, un anticuerpo que se presenta en la descripción comprende una secuencia de cadena pesada, como se define en la Tabla 4A, y una secuencia de cadena ligera, como se define en la Tabla 4A.
[0531] En un ejemplo, un anticuerpo que se presenta en la descripción comprende una secuencia de cadena pesada, como se define en el presente documento, por ejemplo, en la Tabla 4A, en el que un dipéptido se fusiona con el extremo N. Típicamente, el dipéptido es isoleucina-ácido aspártico (Ile-Asp). En otro ejemplo, un anticuerpo que se presenta en la descripción comprende una secuencia de cadena ligera, como se define en el presente documento, por ejemplo, en la Tabla 4A, en el que un dipéptido se fusiona con el extremo N. Típicamente, el dipéptido es Ile-Asp. En aún otro ejemplo, un anticuerpo que se presenta en la descripción comprende una cadena pesada que comprende un dipéptido Ile-Asp N-terminal y una cadena ligera que comprende un dipéptido Ile-Asp. En la secuencia de propéptido del polipéptido de cadena pesada o cadena ligera, el dipéptido Ile-Asp aparece entre la secuencia señal y f R1. Las secuencias variables de cadena pesada y cadena ligera que comprenden un dipéptido Ile-Asp en el extremo N se identifican en la Tabla 4B.
Tabla 4B. Designaciones de secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera, donde la secuencia incluye un
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[0532] En otro ejemplo, un anticuerpo que se presenta en la descripción es distinto de un anticuerpo conocido en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo no es Ab 67-11 (solicitud provisional de EE.UU. número 61/645.453), FI6 (FI6, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier secuencia FI6 descrita específicamente en la solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813, solicitud publicada de EE.UU. N.° 2011/0274702, documento WO2013/011347, o Corti et al., Science 333:850-856, 2011, publicado en línea el 28 de julio de 2011; figuras 12A a 12C), FI28 (solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813), C179 (Okuno et al., J. Virol. 67:2552, 1993), F10 (Sui et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 16:265, 2009), CR9114 (Dreyfus et al., Science 337:1343, 2012), o CR6261 (Ekiert et al., Science 324:246, 2009).
[0533] En un ejemplo, un anticuerpo que se presenta en la descripción es distinto de Ab 67-11 (solicitud provisional de EE.UU. número 61/645.453, presentada en la misma fecha que la presente solicitud).
Variantes
[0534] En un aspecto, una molécula de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que se presenta en la descripción tiene un dominio de inmunoglobulina de cadena pesada variable que es al menos un 85 %, 87 %, 88 %,
89 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % homólogo, o al menos un 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %,
92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a una cadena pesada descrita en el presente documento, por ejemplo, de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, figura 2, figura 13 o figura 17, por ejemplo, la secuencia consenso de la
SEQ ID NO:161, y tiene un dominio de inmunoglobulina de cadena ligera variable que es al menos un 85 %, 87 %,
88 %, 89 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % homólogo, o al menos 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a una cadena ligera descrita en el presente documento, por ejemplo, de la Tabla 3, Tabla 4A, Tabla 4B, 3, figura 14 o 17, por ejemplo, la secuencia consenso de la SEQ ID NO:62.
Las secuencias consenso se determinaron a través del análisis de las propiedades bioquímicas y biofísicas de varios cientos de combinaciones de VH/VL diseñadas computacionalmente. Las secuencias consenso representan las secuencias de aminoácidos en las que cada aminoácido es el que aparece con mayor frecuencia en ese sitio cuando se alinean múltiples secuencias que comprenden datos bioquímicos y biofísicos deseables.
[0535] Un anticuerpo de unión anti-HA ejemplar tiene una o más CDR, por ejemplo, las tres HC CDR y/o las tres LC CDR de un anticuerpo particular descrito en el presente documento, o CDR que son, en suma, al menos un
85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % homólogas, o al menos un 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a dicho anticuerpo.
[0536] En un ejemplo, los bucles hipervariables H1 y H2 tienen la misma estructura canónica que los de un anticuerpo descrito en el presente documento. En un ejemplo, los bucles hipervariables L1 y L2 tienen la misma estructura canónica que los de un anticuerpo descrito en el presente documento.
[0537] En un ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la secuencia de dominio variable HC y/o LC es al menos un 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % u 99 % homóloga o al menos un 85 %, 87 %, 88 % , 89 % , 90 % , 92 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % o 99 % id é n tic a a la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e l d o m in io v a r ia b le H C y /o L C d e un a n t ic u e rp o d e s c r ito e n el p re s e n te d o c u m e n to . La s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la s e c u e n c ia d e d o m in io v a r ia b le H C y /o L C p u e d e d ife r ir e n al m e n o s un a m in o á c id o , p e ro n o m á s d e d ie z , o c h o , s e is , c in c o , c u a tro , t re s o d o s a m in o á c id o s d e la s e c u e n c ia c o r r e s p o n d ie n te d e un a n t ic u e rp o d e s c r ito en el p re s e n te d o c u m e n to . P o r e je m p lo , la s d ife re n c ia s p u e d e n e s ta r p r in c ip a lm e n te o e n s u to ta lid a d e n la s re g io n e s m a rc o .
[0538] E n d e te rm in a d o s e je m p lo s , la s d ife re n c ia s d e a m in o á c id o s s o n d ife re n c ia s d e a m in o á c id o s c o n s e rv a d o ra s (p o r e je m p lo , s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s c o n s e rv a d o ra s ) . U n a s u s t itu c ió n d e a m in o á c id o s " c o n s e r v a d o r e s " e s a q u e lla en la q u e el re s id u o d e a m in o á c id o s e re e m p la z a c o n un re s id u o d e a m in o á c id o q u e c o m p re n d e u n a c a d e n a la te ra l s im ila r . E n la té c n ic a s e h a n d e f in id o fa m il ia s d e re s id u o s d e a m in o á c id o s q u e c o m p re n d e n c a d e n a s la te ra le s s im ila re s . E s ta s fa m il ia s in c lu y e n , p o r e je m p lo , a m in o á c id o s c o n c a d e n a s la te ra le s b á s ic a s (p o r e je m p lo , lis in a , a rg in in a , h is t id in a ) , c a d e n a s la te ra le s á c id a s (p o r e je m p lo , á c id o a s p á rt ic o , á c id o g lu tá m ic o ) , c a d e n a s la te ra le s p o la re s n o c a rg a d a s (p o r e je m p lo , g lic in a , a s p a ra g in a , g lu ta m in a , s e r in a , tre o n in a , t iro s in a , c is te ín a ) , c a d e n a s la te ra le s n o p o la re s (p o r e je m p lo , a la n in a , v a lin a , le u c in a , is o le u c in a , p ro lin a , fe n ila la n in a , m e tio n in a , t r ip tó fa n o ) , c a d e n a s la te ra le s ra m if ic a d a s b e ta (p o r e je m p lo , t re o n in a , v a lin a , is o le u c in a ) y c a d e n a s la te ra le s a ro m á tic a s (p o r e je m p lo , t iro s in a , fe n ila la n in a , t r ip tó fa n o , h is t id in a ) .
[0539] L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e la s s e c u e n c ia s d e d o m in io v a r ia b le H C y L C p u e d e n c o d if ic a rs e m e d ia n te u n a s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o q u e s e h ib r id a e n c o n d ic io n e s d e a lta r ig u ro s id a d c o n u n a s e c u e n c ia de á c id o n u c le ic o d e s c r ita en el p re s e n te d o c u m e n to o u n a q u e c o d if ic a un d o m in io v a r ia b le o u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e s c r ita e n el p re s e n te d o c u m e n to . E n un e je m p lo , la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e u n a o m á s re g io n e s m a rc o (p o r e je m p lo , F R 1 , F R 2 , F R 3 y /o F R 4 ) d e l d o m in io v a r ia b le H C y /o L C s o n al m e n o s un 85 % , 87 % , 88 % , 89 % , 90 % , 92 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % u 99 % h o m ó lo g a s o al m e n o s un 85 % , 87 % , 88 % , 89 % , 90 % , 92 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % o 99 % id é n tic a s a la s re g io n e s m a rc o c o r re s p o n d ie n te s d e lo s d o m in io s v a r ia b le s H C y L C d e un a n t ic u e rp o d e s c r ito e n el p re s e n te d o c u m e n to . E n un e je m p lo , u n a o m á s re g io n e s m a rc o d e c a d e n a p e s a d a o lig e ra (p o r e je m p lo , H C F R 1 , F R 2 y F R 3 ) s o n al m e n o s un 85 % , 87 % , 88 % , 89 % , 90 % , 92 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % u 99 % h o m ó lo g a s , o al m e n o s un 85 % , 87 % , 88 % , 89 % , 90 % , 92 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % o 99 % id é n tic a s a la s e c u e n c ia d e re g io n e s m a rc o c o r re s p o n d ie n te s d e un a n t ic u e rp o d e l ín e a g e rm in a l h u m a n o .
Validación de epítopos
[0540] E n un e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s q u e s e p re s e n ta n en la d e s c r ip c ió n s o n ú tile s p a ra v a lid a r u n a v a c u n a b a s a d a e n un e p íto p o p a rt ic u la r . P o r e je m p lo , un e p íto p o q u e e s la d ia n a d e un a n t ic u e rp o q u e s e p re s e n ta e n la d e s c r ip c ió n s e p u e d e e v a lu a r m e d ia n te p ro c e d im ie n to s d e c o m p u ta c ió n p a ra id e n tif ic a r un m a rc o p e p tíd ic o a d e c u a d o p a ra s o p o r ta r la c o n fo rm a c ió n d e l e p íto p o , ta l c o m o p a ra e s ta b il iz a r un e p íto p o q u e e s tra n s ito r io o m ín im a m e n te a c c e s ib le p o r n a tu ra le z a . L a a b s tra c c ió n c o m p u ta c io n a l d e la s p ro p ie d a d e s de l e p íto p o y el m a rc o p e rm ite el c r ib a d o a u to m a t iz a d o d e la s b a s e s d e d a to s p a ra id e n tif ic a r lo s a n d a m ia je s d e p é p tid o s a c e p to re s c a n d id a to s . El a n d a m ia je a c e p to r p u e d e te n e r u n a e s tru c tu ra te rc ia r ia p a r t ic u la r q u e in c lu y e , p o r e je m p lo , u n a o m á s d e u n a lá m in a b e ta , un s á n d w ic h b e ta , un b u c le o u n a h é lic e a lfa o b e ta . L o s a n t íg e n o s d e e p íto p o -a n d a m ia je c a n d id a to s s e p u e d e n e n s a y a r in vitro, ta l c o m o p a ra id e n tif ic a r la s p ro p ie d a d e s d e u n ió n c o n un a n t ic u e rp o q u e s e p re s e n ta e n la d e s c r ip c ió n , p o r e je m p lo , a f in id a d d e u n ió n o a n á lis is d e e s tru c tu ra d e l c o m p le jo d e e p íto p o -a n d a m ia je /a n t ic u e rp o , o la n e u tra liz a c ió n in vitro. L a c a p a c id a d de l e p íto p o -a n d a m ia je p a ra g e n e ra r u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia (p o r e je m p lo , p a ra g e n e ra r a n t ic u e rp o s ) s e p u e d e e v a lu a r a d m in is t ra n d o el e p íto p o -a n d a m ia je a un a n im a l (p o r e je m p lo , e n un m a m ífe ro , ta l c o m o u n a ra ta , un ra tó n , u n a c o b a y a o un c o n e jo ) , y a c o n t in u a c ió n , a n a liz a n d o s u e ro s p a ra d e te rm in a r la p re s e n c ia d e a n t ic u e rp o s a n t i-e p íto p o -a n d a m ia je , p o r e je m p lo , m e d ia n te e n s a y o E L IS A . L a c a p a c id a d d e l e p íto p o -a n d a m ia je p a ra o b te n e r p ro te c c ió n c o n tra la in fe c c ió n p o r u n a c e p a d e g r ip e A d e l G ru p o 1 o d e l G ru p o 2, o p o r a m b o s t ip o s d e c e p a s d e g rip e , o u n a c e p a d e g r ip e B, s e p u e d e e v a lu a r in vivo, ta l c o m o en un a n im a l (p o r e je m p lo , e n un m a m ífe ro ) . P o r lo ta n to , un a n t ic u e rp o q u e s e p re s e n ta e n la d e s c r ip c ió n p u e d e p ro p o rc io n a r v a lid a c ió n d e q u e el e p íto p o es fu n c io n a lm e n te im p o r ta n te y q u e el d ire c c io n a m ie n to d e l e p íto p o p ro p o rc io n a rá p ro te c c ió n c o n tra u n a in fe c c ió n c o n u n a c e p a d e g r ip e d e l G ru p o 1 o de l G ru p o 2, o a m b o s t ip o s d e c e p a s , o u n a c e p a d e g r ip e B.
Producción de moléculas de anticuerpo
[0541] L o s á c id o s n u c le ic o s (p o r e je m p lo , lo s g e n e s ) q u e c o d if ic a n u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o g e n e ra d a p o r un p ro c e d im ie n to d e s c r ito e n el p re s e n te d o c u m e n to s e p u e d e n s e c u e n c ia r , y to d o s o p a r te d e lo s á c id o s n u c le ic o s s e p u e d e n c lo n a r e n un v e c to r q u e e x p re s a to d o s o p a r te d e lo s á c id o s n u c le ic o s . P o r e je m p lo , lo s á c id o s n u c le ic o s p u e d e n in c lu ir un fra g m e n to d e l g e n q u e c o d if ic a el a n t ic u e rp o , ta l c o m o un a n t ic u e rp o m o n o c a te n a r io (s c F v ), un f r a g m e n to F (a b ')2, un f ra g m e n to F a b o un fra g m e n to Fd.
[0542] L a d e s c r ip c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a c é lu la s h u é s p e d q u e c o m p re n d e n lo s á c id o s n u c le ic o s q u e c o d if ic a n un a n t ic u e rp o o f ra g m e n to d e l m is m o c o m o s e d e s c r ib e e n el p re s e n te d o c u m e n to . L a s c é lu la s h u é s p e d p u e d e n se r, p o r e je m p lo , c é lu la s p ro c a r io ta s o e u c a r io ta s , p o r e je m p lo , c é lu la s d e m a m ífe ro , o c é lu la s d e le v a d u ra , p o r e je m p lo , P ic h ia (v é a s e , p o r e je m p lo , P o w e rs e t al. (2001 ) J. Im m u n o l. M e th o d s 251 :123 -35 ) , H a n s e u la , o S a c c h a ro m y c e s .
[0543] L a s m o lé c u la s d e a n t ic u e rp o , p a r t ic u la rm e n te m o lé c u la s d e a n t ic u e rp o d e lo n g itu d c o m p le ta , p o r ejemplo, IgG, se pueden producir en células de mamífero. Las células huésped de mamífero ejemplares para expresión recombinante incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), líneas celulares linfocíticas, por ejemplo, células de mieloma NS0 y células SP2, células COS, K562, y una célula de un animal transgénico, por ejemplo, un mamífero transgénico. Por ejemplo, la célula es una célula epitelial mamaria.
[0544] Además de la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de inmunoglobulina, los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias de ácido nucleico adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 4.399.216; 4.634.665; y 5.179.017). Los genes marcadores seleccionables ejemplares incluyen el gen dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células huésped dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418).
[0545] En un sistema ejemplar para la expresión recombinante de una molécula de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o una porción de unión al antígeno del mismo), se introduce un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo en células CHO dhfr- mediante transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, cada uno de los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo está unido operativamente a elementos reguladores potenciadores/promotores (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como un elemento regulador potenciador de CMV/promotor de AdMLP, o un elemento regulador potenciador de SV40/promotor de AdMLP) para impulsar altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que se transfectaron con el vector usando selección/amplificación de metotrexato. Las células huésped transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y la molécula de anticuerpo intacta se recupera del medio de cultivo. Las técnicas de biología molecular estándar se utilizan para preparar el vector de expresión recombinante, para transfectar las células huésped, para seleccionar los transformantes, para cultivar las células huésped, y para recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Por ejemplo, algunos anticuerpos se pueden aislar mediante cromatografía de afinidad con una proteína A o proteína G. Por ejemplo, los anticuerpos purificados se pueden concentrar de aproximadamente 100 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml usando técnicas de concentración de proteínas que se conocen en la técnica.
[0546] Las moléculas de anticuerpo también pueden producirse por un animal transgénico. Por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.849.992 describe un procedimiento para expresar una molécula de anticuerpo en la glándula mamaria de un mamífero transgénico. Se construye un transgén que incluye un promotor específico de la leche y secuencias de ácido nucleico que codifican la molécula de anticuerpo de interés, por ejemplo, un anticuerpo descrito en el presente documento, y una secuencia señal para la secreción. La leche producida por hembras de dichos mamíferos transgénicos incluye, secretada en los mismos, el anticuerpo de interés, por ejemplo, un anticuerpo descrito en el presente documento. La molécula de anticuerpo se puede purificar a partir de la leche, o para algunas aplicaciones, se puede utilizar directamente.
[0547] Las moléculas de anticuerpo también se pueden expresar in vivo, después de la administración de un vector que contiene ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada del anticuerpo y la cadena ligera del anticuerpo. Después, se utiliza la transferencia génica mediada por vectores para modificar genéticamente la secreción del anticuerpo anti-HA en circulación. Por ejemplo, una cadena pesada de anticuerpo anti-HA y una cadena ligera de anticuerpo anti-HA como se describe en el presente documento se clonan en un vector basado en virus adenoasociado (AAV), y cada una de la cadena pesada de anticuerpo anti-HA y la cadena ligera de anticuerpo anti-HA está bajo el control de un promotor, tal como un promotor de citomegalovirus (CMV). La administración del vector a un sujeto, tal como a un paciente, por ejemplo, un paciente humano, tal como mediante inyección intramuscular, da como resultado la expresión de un anticuerpo anti-HA, y secreción en la circulación.
Modificaciones de los agentes de unión
[0548] Los agentes de unión, por ejemplo, las moléculas de anticuerpo se pueden modificar para tener numerosas propiedades, por ejemplo, para alterar, por ejemplo, la semivida extendida, para asociarse con, por ejemplo, unirse covalentemente a restos detectables, por ejemplo, etiquetas, para asociarse con, por ejemplo, unirse covalentemente a toxinas, o para tener otras propiedades, por ejemplo, funcionalidades inmunitarias alteradas.
[0549] Las moléculas de anticuerpo pueden incluir modificaciones, por ejemplo, modificaciones que alteran la función Fc, por ejemplo, para disminuir o eliminar la interacción con un receptor Fc o con C1q, o ambos. En un ejemplo, la región constante de IgG1 humana puede mutarse en uno o más residuos.
[0550] Para algunas moléculas de anticuerpo que incluyen un dominio Fc, el sistema de producción de anticuerpos puede diseñarse para sintetizar moléculas de anticuerpo en las que la región Fc está glucosilada. El dominio Fc se puede producir en un sistema de expresión de mamíferos que glucosila adecuadamente el residuo correspondiente a la asparagina 297. El dominio Fc también puede incluir otras modificaciones postraduccionales eucariotas.
[0551] Otras modificaciones del dominio Fc adecuadas incluyen las descritas en el documento WO2004/029207. Por ejemplo, el dominio Fc puede ser un Fc XmAb® (Xencor, Monrovia, CA). El dominio Fc, o un fragmento del mismo, puede tener una sustitución en una región de unión al receptor Fcy (FcyR), tal como los dominios y fragmentos descritos en el documento WO05/063815. En algunas realizaciones, el dominio Fc, o un fragmento del mismo, tiene una sustitución en una región de unión al receptor Fc neonatal (FcRn), tal como los dominios y fragmentos descritos en el documento WO05047327. En otras realizaciones, el dominio Fc es una cadena sencilla, o fragmento de la misma, o una versión modificada de la misma, tal como las descritas en el documento WO2008143954. En la técnica se conocen y se describen otras modificaciones de Fc adecuadas.
[0552] Las moléculas de anticuerpo se pueden modificar, por ejemplo, con un resto que mejora su estabilización y/o retención en circulación, por ejemplo, en sangre, suero, linfa, lavado broncoalveolar, u otros tejidos, por ejemplo, al menos 1,5, 2, 5, 10 o 50 veces.
[0553] Por ejemplo, una molécula de anticuerpo generada por un procedimiento descrito en el presente documento se puede asociar con un polímero, por ejemplo, un polímero sustancialmente no antigénico, tal como un óxido de polialquileno o un óxido de polietileno. Los polímeros adecuados variarán sustancialmente en peso. Se pueden usar polímeros que comprenden pesos moleculares promedio en número que varían de aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000 daltons (o de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000, y de 2.000 a aproximadamente 12.500).
[0554] Por ejemplo, una molécula de anticuerpo generada por un procedimiento descrito en el presente documento se puede conjugar con un polímero soluble en agua, por ejemplo, un polímero de polivinilo hidrófilo, por ejemplo, alcohol polivinílico o polivinilpirrolidona. Una lista no limitante de dichos polímeros incluye homopolímeros de óxido de polialquileno tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos, y copolímeros de bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque. Los polímeros útiles adicionales incluyen polioxialquilenos tales como polioxietileno, polioxipropileno, y copolímeros en bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o no ramificados que comprenden los monómeros sacáridos D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo, ácido polimanurónico o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico, incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos tales como lactosa, amilopectina, almidón, almidón hidroxietílico, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno, o la subunidad polisacárida de mucopolisacáridos de ácido, por ejemplo, ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar tales como polisorbitol y polimanitol; heparina o heparán.
[0555] Los agentes de unión, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, como se describen en el presente documento, pueden conjugarse con otra entidad o resto (por ejemplo, con un resto citotóxico o citostático, una etiqueta o resto detectable, o un resto terapéutico). Los ejemplos de restos incluyen: un agente citotóxico o citostático, por ejemplo, un agente terapéutico, un fármaco, un compuesto emisor de radiación, moléculas de origen vegetal, fúngico o bacteriano, o una proteína biológica (por ejemplo, una toxina de proteína) o partícula (por ejemplo, una partícula viral recombinante, por ejemplo, a través de una proteína de recubrimiento viral), un agente detectable; un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina). Un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, como se describe en el presente documento, puede unirse funcionalmente mediante cualquier procedimiento adecuado (por ejemplo, acoplamiento químico, fusión genética, unión covalente, asociación no covalente, o de otro modo) a una o más entidades moleculares adicionales.
[0556] Los agentes de unión, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, descritos en el presente documento, se pueden conjugar con un resto detectable, por ejemplo, una etiqueta o agente de formación de imágenes. Dichos restos pueden incluir enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa, glucosa oxidasa y similares), radioetiquetas (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), haptenos, etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, y similares), moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminiscentes, cromóforos, moléculas luminiscentes, moléculas de fotoafinidad, partículas coloreadas o ligandos de afinidad, tales como biotina, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, o sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión metálica, etiquetas de epítopos). En algunas realizaciones, un resto, por ejemplo, un resto detectable, por ejemplo, una etiqueta, está unido por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir posibles impedimentos estéricos.
[0557] En algunos ejemplos, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, descrito en el presente documento, se deriva con una enzima detectable y se detecta mediante la adición de reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando el agente detectable, peroxidasa de rábano picante está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción de color, que es detectable. Un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, descrito en el presente documento, también puede derivarse con un grupo protésico (por ejemplo, estreptavidina/biotina y avidina/biotina). Por ejemplo, un anticuerpo puede derivarse con biotina y detectarse a través de la medición indirecta de la unión a avidina o estreptavidina.
[0558] En algunas realizaciones, el resto comprende iones paramagnéticos y sustancias detectables por RMN, entre otros. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un ión paramagnético es uno o más de cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III), lántalo (III), oro (III), plomo (II), y/o bismuto (III).
[0559] Los agentes de unión, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, como se describen en el presente documento, se pueden modificar para asociarse, por ejemplo, conjugarse con un agente terapéutico, por ejemplo, un agente que comprende actividad antiviral, actividad antiinflamatoria, o actividad citotóxica, etc. En algunos ejemplos, los agentes terapéuticos pueden tratar síntomas o causas de infección por gripe (por ejemplo, actividades antivirales, alivio del dolor, antiinflamatorias, inmunomoduladoras, inductoras del sueño, etc.).
Procedimientos de tratamiento y administración
[0560] Los agentes de unión, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, que se presentan en la descripción, se pueden utilizar para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, infectado con, o en riesgo de infectarse con, un virus de gripe.
[0561] Cualquier ser humano es candidato para recibir una molécula de anticuerpo que se presenta en la descripción para el tratamiento o prevención de una infección por un virus de gripe. Los seres humanos con alto riesgo de infección, tales como los individuos inmunocomprometidos, y los seres humanos con alto riesgo de exposición al virus de gripe son especialmente adecuados para recibir tratamiento con la molécula de anticuerpo. Las personas inmunocomprometidas incluyen ancianos (65 años o más) y niños (por ejemplo, de 6 meses a 18 años), y personas con afecciones médicas crónicas. Las personas con alto riesgo de exposición incluyen trabajadores de atención médica, maestros y equipos de respuesta a emergencias (por ejemplo, bomberos, policías).
[0562] Las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento también se pueden utilizar para prevenir o reducir (por ejemplo, minimizar) una infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria) o un riesgo de comprender una infección secundaria asociada con gripe, o cualquier efecto (por ejemplo, síntomas o complicaciones) de la misma en un sujeto. Las infecciones bacterianas secundarias oportunistas (por ejemplo, neumonía bacteriana secundaria, por ejemplo, principalmente con Streptococcus pneumonia) contribuyen significativamente a la morbilidad y mortalidad generales asociadas con infecciones gripales estacionales y pandémicas. Las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento se pueden utilizar para prevenir o reducir (por ejemplo, minimizar) las complicaciones de infecciones oportunistas secundarias (por ejemplo, infecciones bacterianas) en un sujeto.
[0563] Una molécula de anticuerpo se puede administrar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, mediante una diversidad de procedimientos. Para muchas aplicaciones, la vía de administración es una de: inyección o infusión intravenosa, inyección subcutánea, o inyección intramuscular. Una molécula de anticuerpo se puede administrar como una dosis fija, o en una dosis de mg/kg. La molécula de anticuerpo se puede administrar por vía intravenosa (IV) o subcutánea (SC). Por ejemplo, la molécula de anticuerpo se puede administrar a una dosis unitaria fija de entre aproximadamente 50-600 mg IV, por ejemplo, cada 4 semanas, o entre aproximadamente 50-100 mg SC (por ejemplo, 75 mg), por ejemplo, al menos una vez a la semana (por ejemplo, dos veces a la semana). En un ejemplo, la molécula de anticuerpo se administra IV a una dosis unitaria fija de 50 mg, 60 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 180 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, o 600 mg o más. La administración de la dosis IV puede ser una o dos o tres veces o más por semana, o una vez cada dos, tres, cuatro o cinco semanas, o menos frecuentemente.
[0564] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo se administra SC a una dosis unitaria fija de 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 100 mg, o 120 mg o más. La administración de la dosis SC puede ser una o dos o tres veces o más por semana, o una vez cada dos, tres, cuatro o cinco semanas, o menos frecuentemente.
[0565] Un anticuerpo anti-HA que se presenta en la descripción también se puede administrar por inhalación, tal como por inhalación intranasal u oral, tal como a una dosis unitaria fija de 50 mg, 60 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 180 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, o 600 mg o más.
[0566] En un ejemplo, se administra un anticuerpo anti-HA a un sujeto a través de transferencia génica mediada por vectores, tal como a través de la administración de un vector que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo anti-HA, y el anticuerpo se expresa a partir de los genes de cadena pesada y cadena ligera en el cuerpo. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada y una cadena ligera pueden clonarse en un vector AAV, tal como un vector AAV autocomplementario, el vector scAAV puede administrarse a un ser humano mediante inyección, tal como mediante inyección IM, y el anticuerpo se expresa y se secreta en la circulación del ser humano.
[0567] Una molécula de anticuerpo también se puede administrar en un bolo a una dosis de entre aproximadamente 1 y 50 mg/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 1 y 10 mg/kg, entre aproximadamente 1 y 25 mg/kg o aproximadamente 25 y 50 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 50 mg/kg, 25 mg/kg, 10 mg/kg, 6,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 1,0 mg/kg, o menos. Los intervalos de dosis modificados incluyen una dosis que es menor de aproximadamente 3000 mg/sujeto, aproximadamente 1500 mg/sujeto, aproximadamente 1000 mg/sujeto, aproximadamente 600 mg/sujeto, aproximadamente 500 mg/sujeto, aproximadamente 400 mg/sujeto, aproximadamente 300 mg/sujeto, aproximadamente 250 mg/sujeto, aproximadamente 200 mg/sujeto, o aproximadamente 150 mg/sujeto, típicamente para su administración cada cuatro semanas o una vez al mes. La molécula de anticuerpo se puede administrar, por ejemplo, cada tres a cinco semanas, por ejemplo, cada cuatro semanas, o mensualmente.
[0568] La dosificación se puede ajustar según la tasa de depuración de un paciente de una administración anterior del anticuerpo. Por ejemplo, a un paciente no se le puede administrar una segunda dosis o una dosis de seguimiento antes de que el nivel de anticuerpos en el sistema del paciente haya caído por debajo de un nivel predeterminado. En una realización, se ensaya una muestra de un paciente (por ejemplo, plasma, suero, sangre, orina o líquido cefalorraquídeo (LCR)) para determinar la presencia de anticuerpos, y si el nivel de anticuerpos está por encima de un nivel predeterminado, al paciente no se le administrará una segunda dosis o una dosis de seguimiento. Si el nivel de anticuerpos en el sistema del paciente está por debajo de un nivel predeterminado, entonces al paciente se le administra una segunda dosis o una dosis de seguimiento. Un paciente cuyos niveles de anticuerpos se determina que son demasiado altos (por encima del nivel predeterminado) se puede someter a pruebas de nuevo después de uno o dos o tres días, o una semana, y si el nivel de anticuerpos en las muestras del paciente ha caído por debajo del nivel predeterminado, al paciente se le puede administrar una segunda dosis o una dosis de seguimiento de anticuerpo.
[0569] En determinadas realizaciones, el anticuerpo puede prepararse con un vehículo que protegerá al fármaco contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etilenvinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos procedimientos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos. Véase, por ejemplo, Controlled Drug Delivery (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Segunda Edición, J. Robinson y V. H. L. Lee, eds., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987.
[0570] Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar con un dispositivo médico. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las patentes de EE.UU. N.° 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Ejemplos de implantes y módulos ya conocidos se analizan, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N.° 4.487.603, que describe una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; la patente de EE.UU. N.° 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la patente de EE.UU. N.° 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicación para administrar la medicación a una velocidad de infusión precisa; la patente de EE.UU. N.° 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para administración continua de fármacos; la patente de EE.UU. N.° 4.439.196, que describe un sistema de administración de fármacos osmótico que comprende compartimentos multicámara; y la patente de EE.UU. N.° 4.475.196, que describe un sistema de administración de fármacos osmótico. Por supuesto, también se conocen muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos.
[0571] En algunos ejemplos, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, se administra por vía bucal, oral o mediante administración nasal, por ejemplo, como un líquido, pulverización o aerosol, por ejemplo, mediante aplicación tópica, por ejemplo, mediante un líquido o gotas, o mediante inhalación.
[0572] Una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento se puede administrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, un segundo fármaco, para el tratamiento de una infección viral, o un síntoma de la infección. La molécula de anticuerpo y el uno o más segundos agentes o adicionales pueden formularse juntos, en la misma formulación, o pueden estar en formulaciones separadas y administrarse a un paciente simultánea o secuencialmente, en cualquier orden.
[0573] Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada, tal como una respuesta terapéutica o un efecto terapéutico combinatorio. Generalmente, se puede utilizar cualquier combinación de dosis (ya sea separada o formulada conjuntamente) de una molécula de anticuerpo y un segundo agente o agente adicional para proporcionar a un sujeto ambos agentes en cantidades biodisponibles.
[0574] La forma unitaria de dosificación o "dosis fija", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido y opcionalmente en asociación con otro agente.
[0575] Una composición farmacéutica puede incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente descrito en el presente documento. En algunos ejemplos en los que la molécula de anticuerpo se administra en combinación con un segundo agente o agente adicional, dichas cantidades eficaces se pueden determinar basándose en el efecto combinatorio del primer y segundo agente o agente adicional administrado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente también puede variar según factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del compuesto para provocar una respuesta deseada en el individuo, tal como la mejora de al menos un parámetro de infección, o la mejora de al menos un síntoma de la infección, tal como escalofríos, fiebre, dolor de garganta, dolor muscular, dolor de cabeza, tos, debilidad, fatiga y malestar general. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición es compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.
[0576] En un ejemplo, la administración de un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, proporcionado, por ejemplo, como una preparación farmacéutica, se realiza por una de las siguientes vías: oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, subcutánea, intraventricular, transdérmica, interdérmica, rectal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (en forma de líquidos, polvos, ungüentos, cremas, pulverizaciones o gotas), mucosa, nasal, bucal, enteral, sublingual; instilación intratraqueal, instilación bronquial, y/o inhalación; y/o en forma de una pulverización oral, pulverización nasal y/o aerosol.
Tratamientos de combinación y segundos agentes o adicionales ejemplares
[0577] Los agentes de unión, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, proporcionados, por ejemplo, como composiciones farmacéuticas, pueden administrarse en solitario o en combinación con una o más terapias diferentes, por ejemplo, la administración de un segundo agente terapéutico o adicional.
[0578] En algunas realizaciones, la combinación puede dar como resultado una dosis inferior de la molécula de anticuerpo o de la otra terapia que se necesita, que, en algunas realizaciones, puede reducir los efectos secundarios. En algunas realizaciones, la combinación puede dar como resultado una mejor administración o eficacia de uno o ambos agentes. Los agentes o terapias se pueden administrar al mismo tiempo (por ejemplo, como una formulación única que se administra a un paciente, o como dos formulaciones separadas administradas simultáneamente), o secuencialmente en cualquier orden.
[0579] Dichos segundos agentes o adicionales incluyen vacunas, agentes antivirales, y/o anticuerpos adicionales. En realizaciones típicas, el segundo agente o agente adicional no está formulado conjuntamente con el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, aunque en otros sí lo está.
[0580] En algunos ejemplos, el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, y el segundo agente o agente adicional se administran de manera que se logre uno o más de los siguientes: los niveles terapéuticos, o efectos terapéuticos, de uno se superponen entre sí; los niveles detectables de ambos están presentes al mismo tiempo; o el efecto terapéutico es mayor que lo que se vería en ausencia del agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, o del segundo agente o agente adicional. En algunas realizaciones, cada agente se administrará a una dosis y en un cronograma determinado para ese agente.
[0581] El segundo agente o agente adicional puede ser, por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de gripe. Por ejemplo, los agentes de unión, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpos terapéuticos, proporcionados en el presente documento se pueden administrar en combinación con una vacuna, por ejemplo, una vacuna descrita en el presente documento o una mezcla (también conocida como cóctel) de péptidos de gripe para estimular el sistema inmunitario del paciente para prevenir la infección con cepas particulares de gripe A. En otros ejemplos, el segundo agente o agente adicional es un agente antiviral (por ejemplo, un agente anti-NA o anti-M2), un analgésico, un antiinflamatorio, un antibiótico, un agente esteroide, una segunda molécula de anticuerpo terapéutica (por ejemplo, un anticuerpo anti-HA), un adyuvante, una proteasa o glucosidasa (por ejemplo, sialidasa), etc.
[0582] Los ejemplos de agentes antivirales incluyen, por ejemplo, vacunas, inhibidores de neuraminidasa, o análogos de nucleósidos. Los ejemplos de agentes antivirales pueden incluir, por ejemplo, zidovudina, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina, foscarnet, aciclovir, ribavirina, amantadina, remantidina, saquinavir, indinavir, ritonavir, interferones alfa y otros interferones, un inhibidor de neuraminidasa (por ejemplo, zanamivir (Relenza®), oseltamivir (Tamiflu®), laninamivir, peramivir), rimantadina. Las segundas moléculas de anticuerpo ejemplares incluyen, por ejemplo, Ab 67-11 (solicitud provisional de EE.UU. número 61/645.453, FI6 (solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813), FI28 (solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813), C179 (Okuno et al., J. Virol.
67:2552-8, 1993), F10 (Sui et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 16:265, 2009), CR9114 (Dreyfus et al., Science 337:1343, 2012), o CR6261 (véase, por ejemplo, Ekiert et al., Science 324:246, 2009). Por lo tanto, Ab 044 se puede utilizar en combinación con cualquiera de estos anticuerpos. En otros ejemplos, dos o más agentes de unión, por ejemplo, moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento, se pueden administrar en combinación, por ejemplo, Ab 044 se puede administrar en combinación con Ab 032. En el caso de combinaciones, se pueden administrar dos agentes como parte de la misma unidad de dosificación o se pueden administrar por separado. Otros agentes ejemplares útiles para tratar los síntomas asociados con una infección por gripe son acetaminofeno, ibuprofeno, aspirina y naproxeno.
[0583] En un ejemplo, la molécula de anticuerpo y el segundo agente o agente adicional se proporcionan como una formulación conjunta, y la formulación conjunta se administra al sujeto. Además, es posible, por ejemplo, al menos 24 horas antes o después de administrar la formulación conjunta, administrar por separado una dosis de la formulación de anticuerpo y después una dosis de una formulación que contiene un segundo agente o agente adicional. En otra implementación, la molécula de anticuerpo y el segundo agente o adicional se proporcionan como formulaciones separadas, y la etapa de administración incluye administrar secuencialmente la molécula de anticuerpo y el segundo agente o agente adicional. Las administraciones secuenciales pueden proporcionarse en el mismo día (por ejemplo, en una hora entre sí o al menos con 3, 6 o 12 horas de diferencia) o en días diferentes.
[0584] En algunos ejemplos, la molécula de anticuerpo y el segundo agente o agente adicional se administran cada uno como una pluralidad de dosis separadas en el tiempo. La molécula de anticuerpo y el segundo agente o agente adicional generalmente se administran cada uno según un régimen. El régimen para uno o ambos puede tener una periodicidad regular. El régimen para la molécula de anticuerpo puede tener una periodicidad diferente del régimen para el segundo agente o agente adicional, por ejemplo, uno puede administrarse con más frecuencia que el otro. En una implementación, uno de la molécula de anticuerpo y el segundo agente o agente adicional se administra una vez a la semana y el otro una vez al mes. En otra implementación, uno de la molécula de anticuerpo y el segundo agente o agente adicional se administra de forma continua, por ejemplo, durante un periodo de más de 30 minutos, pero menos de 1, 2, 4 o 12 horas, y el otro se administra como un bolo. En algunos ejemplos, se administran administraciones secuenciales. El tiempo entre la administración de un agente y otro agente puede ser de minutos, horas, días o semanas. El uso de una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento también se puede utilizar para reducir la dosificación de otra terapia, por ejemplo, para reducir los efectos secundarios asociados con otro agente que se administra. Por consiguiente, una combinación puede incluir la administración de un segundo agente o agente adicional a una dosificación al menos un 10, 20, 30 o 50 % menor que la que se usaría en ausencia de la molécula de anticuerpo. La molécula de anticuerpo y el segundo agente o agente adicional se pueden administrar mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa.
[0585] En algunos ejemplos, cada uno de la molécula de anticuerpo y el segundo agente o agente adicional se administra en la misma dosis en la que cada uno se prescribe para monoterapia. En otros ejemplos, la molécula de anticuerpo se administra en una dosificación que es igual o menor que una cantidad necesaria para su eficacia si se administra en solitario. Asimismo, el segundo agente o agente adicional puede administrarse en una dosificación que es igual o menor que una cantidad necesaria para su eficacia si se administra en solitario.
[0586] En algunos ejemplos, las formulaciones descritas en el presente documento, por ejemplo, formulaciones que contienen una molécula de anticuerpo que se presenta en la descripción, incluyen uno o más segundos agentes o adicionales, o se administran en combinación con una formulación que contiene uno o más segundos agentes o adicionales.
[0587] En un ejemplo, un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, proporcionado, por ejemplo, como una preparación farmacéutica, se administra por inhalación o administración en aerosol de múltiples partículas, por ejemplo, partículas que comprenden un tamaño de partícula medio de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 micrómetros.
Composiciones farmacéuticas
[0588] Los agentes de unión, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, que se presentan en la descripción, se pueden formular como composiciones farmacéuticas, tal como para el tratamiento o la prevención de gripe.
[0589] Típicamente, una composición farmacéutica incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles.
[0590] Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácidos incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácidos clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de bases incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína, y similares.
[0591] Las composiciones que comprenden moléculas de anticuerpo se pueden formular según procedimientos conocidos en la técnica. La formulación farmacéutica es una técnica bien establecida y se describe adicionalmente en Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); Y Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3a ed. (2000) (ISBN: 091733096X).
[0592] Las composiciones farmacéuticas pueden tener una diversidad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma puede depender del modo previsto de administración y aplicación terapéutica. Típicamente, las composiciones para los agentes descritos en el presente documento tienen la forma de soluciones inyectables o infundibles.
[0593] Dichas composiciones se pueden administrar mediante un modo parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular). Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", tal como se usan en el presente documento, significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, usualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular (IM), intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural y mediante inyección intraesternal o mediante infusión.
[0594] Las composiciones farmacéuticas pueden proporcionarse en una forma inyectable estéril (por ejemplo, una forma que es adecuada para inyección subcutánea o infusión intravenosa). En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma de dosificación líquida que es adecuada para inyección o aplicación tópica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en forma seca, por ejemplo, como polvos (por ejemplo, preparaciones liofilizadas y/o esterilizadas). La composición farmacéutica se puede proporcionar en condiciones que mejoran la estabilidad, por ejemplo, en una atmósfera de nitrógeno o al vacío. El material seco se puede reconstituir con un diluyente acuoso (por ejemplo, agua, tampón, solución salina, etc.) antes de la inyección.
[0595] En una realización, la composición farmacéutica que contiene un anticuerpo anti-HA se administra por vía intranasal. En otra realización, la composición farmacéutica que contiene un anticuerpo anti-HA se administra por inhalación, tal como por inhalación oral o nasal.
[0596] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es adecuada para administración bucal, oral o nasal, por ejemplo, como un líquido, pulverización o aerosol, por ejemplo, mediante aplicación tópica, por ejemplo, mediante un líquido o gotas, o por inhalación). En algunas realizaciones, una preparación farmacéutica comprende una pluralidad de partículas, adecuadas, por ejemplo, para administración inhalada o en aerosol. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula medio es de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 micrómetros. En algunas realizaciones, una preparación farmacéutica se formula como un polvo seco, adecuado, por ejemplo, para administración inhalada o en aerosol. En algunas realizaciones, una preparación farmacéutica se formula como un polvo húmedo, mediante la inclusión de un agente humectante, por ejemplo, agua, una solución salina, u otro líquido de pH fisiológico. En algunas realizaciones, se proporciona una preparación farmacéutica como gotas, adecuada, por ejemplo, para administración a la cavidad nasal o bucal.
[0597] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se dispone en un dispositivo de administración, por ejemplo, una jeringa, un gotero o frasco de gotero, un inhalador o un dispositivo de dosis medida, por ejemplo, un inhalador.
[0598] En una realización, una composición farmacéutica contiene un vector, tal como un vector basado en virus asociado con adenovirus (AAV), que codifica una cadena pesada de una molécula de anticuerpo anti-HA, y una cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-HA que se presenta en la descripción. La composición que contiene el vector puede administrarse a un sujeto, tal como un paciente, tal como mediante inyección, por ejemplo, inyección IM. Los genes que codifican el anticuerpo anti-HA bajo control de, por ejemplo, promotores de citomegalovirus (CMV), se expresan en el cuerpo, y la molécula de anticuerpo anti-HA recombinante se introduce en la circulación. Véase, por ejemplo, Balazs et al., Nature 30:481:81-84, 2011.
[0599] Las composiciones farmacéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Una composición farmacéutica también puede ensayarse para asegurarse de que cumple con los estándares reguladores y de la industria para la administración.
[0600] La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación de un agente descrito en el presente documento en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando un agente descrito en el presente documento en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos típicos de preparación son secado al vacío y liofilización que produce un polvo de un agente descrito en el presente documento más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables se puede lograr mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
[0601] Una composición farmacéutica puede proporcionarse, prepararse, envasarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria única y/o como múltiples dosis unitarias únicas. Típicamente, una preparación a granel contendrá al menos 2, 5, 10, 20, 50 o 100 dosis unitarias. Una dosis unitaria es típicamente la cantidad introducida en el paciente en una sola administración. En algunas realizaciones, solo se introduce una porción de una dosis unitaria. En algunas realizaciones, se administra un múltiplo pequeño, por ejemplo, hasta 1,5, 2, 3, 5 o 10 veces una dosis unitaria. La cantidad del principio activo es generalmente igual a una dosis que se administrará a un sujeto y/o una fracción conveniente de tal dosis tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de tal dosis.
Inmunógenos y vacunas
[0602] Los anticuerpos de la invención y los anticuerpos de la descripción tienen epítopos dilucidados que son útiles para inducir la inmunidad a, y proporcionar protección contra, una o más, por ejemplo, al menos dos, cepas de gripe. Estos epítopos se denominan en el presente documento "inmunógenos de amplio espectro". En un ejemplo, el inmunógeno de amplio espectro induce inmunidad y, en algunos ejemplos, confiere protección contra al menos una cepa del Grupo 1 y una segunda cepa seleccionada de una cepa del Grupo 1, una cepa del Grupo 2, y una cepa de gripe B. Un inmunógeno de amplio espectro, como se usa el término en el presente documento, comprende un polipéptido que tiene suficiente secuencia y estructura tridimensional de una HA, por ejemplo, una HA de una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa h5n 1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004, para permitir la unión de un anticuerpo de la invención, al inmunógeno de amplio espectro. En algunos ejemplos, el inmunógeno de amplio espectro comprende el epítopo de un anticuerpo descrito en el presente documento, por ejemplo, uno de Ab 044, Ab 069, Ab 032 y Ab 031. En algunos ejemplos, un inmunógeno de amplio espectro no se une a uno o más de Ab 67-11, FI6, FI28, C179 o CR6261. En una realización, Ab 044 se une al inmunógeno de amplio espectro con al menos un 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 % de la afinidad con la que se une a una HA nativa, por ejemplo, una HA de una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. En un ejemplo, CR6261 se une al inmunógeno de amplio espectro con menos del 60, 50, 40, 30, 20, o 10 % de la afinidad con la que se une a una HA nativa, por ejemplo, una HA de una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. En un ejemplo, el inmunógeno de amplio espectro difiere del de tipo natural en al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 o 40 residuos. En un ejemplo, el inmunógeno de amplio espectro se une a uno o más de Ab 67-11, FI6, FI28, C179, o CR6261 con menos del 60, 50, 40, 30, 20, o 10 % de la afinidad con la que se une a una HA nativa, por ejemplo, una HA de una cepa del Grupo 1, por ejemplo, una cepa H1N1, por ejemplo, A/Carolina del Sur/1/1918, A/Puerto Rico/08/1934 o A/California/04/2009, o una cepa H5N1, por ejemplo, A/Indonesia/5/2005 o A/Vietnam/1203/2004. En un ejemplo, el inmunógeno de amplio espectro se une a Ab 044 con una afinidad que es al menos un 10, 30, 50, 100 o 200 % mayor que su afinidad por CR626. En un ejemplo, el epítopo de uno de Ab 044, Ab 069, Ab 032 y Ab 031, por ejemplo, Ab 044, es el epítopo inmunodominante en el inmunógeno de amplio espectro.
[0603] Como se usa en el presente documento, el término "vacuna de amplio espectro" se refiere a una preparación que comprende un inmunógeno de amplio espectro, o un ácido nucleico que codifica a un inmunógeno de amplio espectro, que puede inducir la formación de anticuerpos o inmunidad contra el inmunógeno de amplio espectro o un organismo, por ejemplo, un virus de gripe. El inmunógeno de amplio espectro puede incluir virus muertos o debilitados o determinantes antigénicos del organismo, por ejemplo, un virus de gripe. Típicamente, la vacuna de amplio espectro incluirá uno o más componentes adicionales, por ejemplo, vehículos, adyuvantes, y similares.
[0604] En un ejemplo, una vacuna de amplio espectro comprende dos inmunógenos de amplio espectro, o ácido nucleico que codifica dos inmunógenos de amplio espectro.
[0605] Un inmunógeno de amplio espectro descrito en el presente documento, y vacunas que incluyen un inmunógeno de amplio espectro o un ácido nucleico que codifica un inmunógeno de amplio espectro (vacunas de amplio espectro), se pueden usar para provocar una respuesta inmunitaria, en un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, contra uno o más virus de gripe descritos en el presente documento. En algunos ejemplos, la vacuna de amplio espectro confiere protección contra uno o más de los virus de gripe descritos en el presente documento, por ejemplo, disminuye la probabilidad de desarrollar una infección o el síntoma de una infección, o modera la gravedad de una infección. Las vacunas de amplio espectro pueden comprender un polipéptido HA que comprende un inmunógeno de amplio espectro, un ácido nucleico que codifica un polipéptido hA que comprende un inmunógeno de amplio espectro, una partícula, por ejemplo, una v Lp , liposoma, nanopartícula o micropartícula, que comprende un inmunógeno de amplio espectro o un ácido nucleico que codifica un inmunógeno de amplio espectro. Las vacunas pueden comprender virus vivos o inactivados, por ejemplo, con deficiencia de replicación. La gripe, así como otros virus, se pueden utilizar en vacunas de amplio espectro.
[0606] Como se usa en el presente documento, el término "inmunógeno" o "formulación antigénica" o "composición antigénica" se refiere a una preparación que, cuando se administra a un vertebrado, por ejemplo, un mamífero, por ejemplo, un ser humano, puede inducir una respuesta inmunitaria.
Formulación de vacuna
[0607] Un inmunógeno de amplio espectro, por ejemplo, un polipéptido, o VLP, liposoma, nanopartícula o micropartícula que comprende un inmunógeno de amplio espectro, se puede formular en composiciones que comprenden además un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Un ácido nucleico que codifica un inmunógeno de amplio espectro se puede formular en una composición que comprende además un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Un vehículo o excipiente es un agente farmacéutico que no induce por sí mismo la producción de una respuesta inmunitaria perjudicial para el animal que recibe la composición y que puede administrarse como un componente de vacuna sin causar demasiada toxicidad. Como se usa en el presente documento, el término "componente de vacuna farmacéuticamente aceptable" incluye componentes, por ejemplo, un vehículo, que han sido aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerados en la Farmacopea de Estados Unidos, la Farmacopea Europea, u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en mamíferos, por ejemplo, en seres humanos. Los ejemplos no limitantes de vehículos farmacéuticamente aceptables son una solución salina, una solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, tampón acuoso isotónico estéril, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, y combinaciones de los mismos. En un ejemplo, la formulación se puede utilizar para la administración de la vacuna a seres humanos. En algunos ejemplos, la formulación es estéril, libre de materia particulada, y/o apirógena. La vacuna también puede incluir uno o más de: un agente humectante, un agente emulsionante y un agente tamponante. La vacuna puede estar en forma sólida, por ejemplo, un polvo liofilizado, solución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, cápsula, formulación de liberación sostenida, o polvo.
[0608] En algunos ejemplos, las vacunas de amplio espectro pueden incluir uno o más adyuvantes. Los adyuvantes son agentes que mejoran las respuestas inmunitarias, y su uso se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, "Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, Volumen 6, Eds. Powell y Newman, Plenum Press, Nueva York y Londres, 1995). Los ejemplos no limitantes de adyuvantes son adyuvante completo de Freund (CFA), adyuvante incompleto de Freund (IFA), escualeno, escualano, hidróxido de aluminio, sales de aluminio, sales de calcio y fracciones de saponina derivadas de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina (por ejemplo, QS21). En algunos ejemplos, el adyuvante puede ser una emulsión que comprende aceite y agua. La fase oleosa puede comprender escualeno, escualano y/o un tensioactivo. El tensioactivo puede ser un tensioactivo no iónico, por ejemplo, un éster de ácidos grasos mono o di-C12-C24 de sorbitán o manida.
[0609] También se pueden usar como adyuvantes variantes sintéticas de moléculas reconocidas por los receptores tipo Toll (TLR). Los TLR ayudan al cuerpo a distinguir entre moléculas propias y no propias mediante el reconocimiento de patrones moleculares asociados con patógenos. Las moléculas reconocidas por los TLR incluyen ARN bicatenario, lipopolisacáridos, ARN monocatenario con modificaciones específicas de virus o bacterias, y ADN con modificaciones específicas de virus o bacterias. Las moléculas sintéticas que imitan las propiedades de estas moléculas de origen natural reconocidas por los TLR ayudan a desencadenar una respuesta inmunitaria y, por lo tanto, se pueden utilizar como adyuvantes. Los ejemplos no limitantes de dichas moléculas sintéticas incluyen aci polirriboinosínico: polirribocitidílico (poli (I:C)), ácidos nucleicos bicatenarios con al menos un nucleósido de ácido nucleico bloqueado, derivados de lípido A atenuado (ALD) (por ejemplo, lípido A monofosforilo y lípido A 3-deacil monofosforilo) e imiquimod.
[0610] Las vacunas se pueden formular o administrar en combinación con la administración de estimuladores inmunitarios. Los estimuladores inmunitarios son moléculas que aumentan la respuesta del sistema inmunitario. Ejemplos no limitantes de estimuladores inmunitarios son citocinas, linfocinas y quimiocinas que tienen actividades inmunoestimuladoras, inmunopotenciadoras y proinflamatorias, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13), factores de crecimiento (por ejemplo, factor estimulador de colonias (CSF) de granulocitos y macrófagos (GM)); y otras moléculas inmunoestimuladoras, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando Flt3, B7.1; B7.2, etc. Los inmunoestimuladores se pueden administrar en la misma formulación que las VLP o se pueden administrar por separado. Los inmunoestimuladores se pueden administrar como proteínas o como ácidos nucleicos a partir de los cuales se puede expresar la proteína inmunoestimuladora.
Administración
[0611] Generalmente, las vacunas de amplio espectro se administrarán en una cantidad o cantidad eficaz suficiente para estimular una respuesta inmunitaria contra una o más cepas de gripe. La dosis de vacuna se puede ajustar dentro de este intervalo en función de factores clínicos, por ejemplo, edad, condición física, peso corporal, sexo, dieta y tiempo de administración.
[0612] Los procedimientos para administrar un inmunógeno de amplio espectro o una vacuna de amplio espectro incluyen administración enteral y parenteral. También pueden proporcionarse mediante administración epidural o mucosa (por ejemplo, vía intranasal y oral o pulmonar o mediante supositorios). Se pueden proporcionar por inhalación o contacto directo con las cavidades bucales o nasales. En algunos ejemplos, un inmunógeno de amplio espectro, o vacuna de amplio espectro, se administra por vía intramuscular, intravenosa, subcutánea, transdérmica o intradérmica. Las composiciones se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, colon, conjuntiva, nasofaringe, orofaringe, vagina, uretra, vejiga urinaria y mucosa intestinal, etc.) y por cualquier medio conveniente, por ejemplo, mediante inyección usando una aguja y jeringa o un dispositivo de inyección sin aguja, por gotas, a través de un aerosol que comprende partículas grandes, o mediante pulverización en el tracto respiratorio superior. Un inmunógeno o vacuna de amplio espectro se puede administrar junto con otros agentes biológicamente activos, por ejemplo, agentes inmunogénicos, por ejemplo, antivirales y/o antibióticos.
[0613] En algunos ejemplos, se administra un inmunógeno de amplio espectro o una vacuna de amplio espectro para dirigirse a los tejidos mucosos con el fin de provocar una respuesta inmunitaria en el sitio de inmunización. Por ejemplo, los tejidos mucosos a dirigirse para la inmunización mediante el uso de la administración oral de composiciones que contienen adyuvantes con propiedades de direccionamiento mucosal particulares. Los ejemplos de tejidos mucosos a los que dirigirse incluyen, pero sin limitación, tejido linfoide asociado con el intestino (GALT), tejido linfoide nasofaríngeo (NALT), y tejido linfoide asociado con los bronquios (BALT).
[0614] Se puede administrar un inmunógeno de amplio espectro o una vacuna de amplio espectro en un programa de dosificación, por ejemplo, mediante administraciones secuenciales al sujeto. En algunos ejemplos, una primera dosis de la composición va seguida después de un periodo de tiempo de una segunda dosis. El periodo de tiempo entre la primera y la segunda dosis puede ser de entre dos semanas y un año, por ejemplo, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 meses. En algunos ejemplos, la segunda dosis de la composición va seguida de una tercera dosis administrada un periodo de tiempo después de la primera dosis. El periodo de tiempo entre la primera y la tercera dosis puede ser de aproximadamente tres meses a aproximadamente dos años o más, por ejemplo, aproximadamente 4, aproximadamente 5, o aproximadamente 6 meses, o de aproximadamente 7 meses a aproximadamente un año. En algunos ejemplos, la segunda, tercera o una dosis posterior se administra cuando los niveles de inmunoglobulinas específicas en el suero, orina y/o secreciones mucosas del sujeto caen por debajo de un umbral. En un ejemplo, el periodo de tiempo entre la primera y segunda dosis es de aproximadamente un mes, y el periodo de tiempo entre la primera y tercera dosis es de aproximadamente seis meses. En otro ejemplo, el periodo de tiempo entre la primera y segunda dosis es de aproximadamente seis meses. En algunos ejemplos, por ejemplo, cuando el sujeto es un recién nacido o lactante, se pueden administrar dosis durante la infancia. Otros factores que ponen al sujeto en mayor riesgo de infección, por ejemplo, sujetos que son trabajadores de la salud, trabajadores de guardería, familiares de niños pequeños, ancianos y/o individuos con la función cardiopulmonar comprometida, pueden influir en el programa de dosificación, por ejemplo, pueden requerir que el sujeto tenga más dosis o dosis más frecuentes. Cuando se requieren múltiples dosis, las dosis se pueden administrar por las mismas vías o diferentes.
[0615] Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la dosificación del inmunógeno de amplio espectro o la vacuna de amplio espectro. Por ejemplo, la dosificación se puede determinar identificando dosis que provocan una respuesta inmunitaria terapéutica o protectora, por ejemplo, midiendo el nivel de inmunoglobulinas específicas en el suero o midiendo la relación inhibitoria de anticuerpos en muestras de suero, orina o secreciones mucosas de un sujeto. Las dosis se pueden determinar a partir de estudios en animales, por ejemplo, en cobayas, hámsteres, hurones, chinchillas, ratones o ratas. Un animal no necesita ser un huésped natural de un agente infeccioso particular para servir como sujeto en estudios de la enfermedad causada por dicho agente infeccioso. Las dosificaciones también se pueden determinar a partir de estudios clínicos en seres humanos, que son rutinarios en la técnica. El experto en la técnica entenderá que la vía de administración afectará a la dosificación. Las dosificaciones también se pueden calcular a partir de curvas de respuesta a las dosis obtenidas de estudios in vitro o estudios utilizando modelos animales.
[0616] Un inmunógeno o vacuna de amplio espectro puede administrarse a un sujeto que no tenga una enfermedad causada por una infección por el virus de gripe, o que no ha sido y no está actualmente infectado con una infección por el virus de gripe, por ejemplo, puede administrarse un inmunógeno o vacuna de amplio espectro a un sujeto en riesgo de infección. Se puede administrar un inmunógeno o vacuna de amplio espectro a un sujeto infectado con una primera cepa de gripe, por ejemplo, para protegerlo contra una infección con una segunda cepa. En algunos ejemplos, el inmunógeno o vacuna de amplio espectro protege contra la primera cepa. En algunos ejemplos, el inmunógeno o vacuna de amplio espectro no protege contra la primera cepa.
[0617] En algunos ejemplos, el sujeto es un adulto, un adulto mayor de 50 años, una persona menor de 18 años, una persona menor de 2 años, o una persona menor de 6 meses de edad.
[0618] En un ejemplo, el sujeto está en riesgo de un trastorno del pulmón, por ejemplo, fibrosis quística, enfisema, asma o infecciones bacterianas, o enfermedad cardiovascular. En un ejemplo, el sujeto está inmunocomprometido. En un ejemplo, el sujeto es un proveedor de atención médica, por ejemplo, un médico, enfermera, o auxiliar. En un ejemplo, el sujeto trabaja en o visita regularmente, o vive en un hospital, geriátrico, centro de atención asistida, clínica o consultorio médico.
[0619] Los inmunógenos de amplio espectro y las vacunas de amplio espectro se pueden administrar en solitario o en combinación con uno o más agentes o terapias diferentes, por ejemplo, la administración de un segundo agente o adicional, por ejemplo, para prevenir o retrasar o minimizar uno o más síntomas o efectos de una infección por gripe.
[0620] En algunos ejemplos, la combinación puede dar como resultado una dosis inferior de la vacuna de amplio espectro o de la otra terapia que se necesite, lo que, en algunos ejemplos, puede reducir los efectos secundarios. En algunos ejemplos, la combinación puede dar como resultado una mejor administración o eficacia de uno o ambos agentes. Los agentes o terapias se pueden administrar al mismo tiempo (por ejemplo, como una formulación única que se administra a un paciente, o como dos formulaciones separadas administradas simultáneamente), o secuencialmente en cualquier orden.
[0621] Dichos segundos agentes o agentes adicionales incluyen otras vacunas, agentes antivirales y/o anticuerpos. En ejemplos típicos, el segundo agente o agente adicional no está formulado conjuntamente con el agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, aunque en otros sí lo está.
[0622] En algunos ejemplos, la vacuna de amplio espectro y el segundo agente o agente adicional se administran de manera que se logre uno o más de los siguientes: los niveles terapéuticos, o efectos terapéuticos, de uno se superponen entre sí; los niveles detectables de ambos están presentes al mismo tiempo; o el efecto terapéutico es mayor que lo que se vería en ausencia de la vacuna de amplio espectro, o del segundo agente o agente adicional. En algunos ejemplos, cada agente se administrará a una dosis y en un cronograma determinado para ese agente.
[0623] El segundo agente o agente adicional puede ser, por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de gripe. Por ejemplo, una vacuna de amplio espectro proporcionada en el presente documento se puede administrar en combinación con otra vacuna, por ejemplo, una mezcla (también conocida como cóctel) de péptidos de gripe para estimular el sistema inmunitario del paciente para prevenir la infección con cepas particulares de gripe A. En otros ejemplos, el segundo agente o agente adicional es un agente antiviral (por ejemplo, un agente anti-NA o anti-M2), un analgésico, un antiinflamatorio, un antibiótico, un agente esteroide, una segunda molécula de anticuerpo terapéutica (por ejemplo, un anticuerpo anti-HA), un adyuvante, una proteasa o glucosidasa (por ejemplo, sialidasa), etc.
[0624] Los ejemplos de agentes antivirales incluyen, por ejemplo, vacunas, inhibidores de neuraminidasa, o análogos de nucleósidos. Los ejemplos de agentes antivirales pueden incluir, por ejemplo, zidovudina, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina, foscarnet, aciclovir, ribavirina, amantadina, remantidina, saquinavir, indinavir, ritonavir, interferones alfa y otros interferones, un inhibidor de neuraminidasa (por ejemplo, zanamivir (Relenza®), oseltamivir (Tamiflu®), laninamivir, peramivir), rimantadina. Las moléculas de anticuerpo ejemplares incluyen, por ejemplo, Ab 67-11 (solicitud provisional de EE.UU. número 61/645.453, FI6 (solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813), FI28 (solicitud publicada de EE.UU. N.° 2010/0080813), C179 (Okuno et al., J. Virol. 67:2552-8, 1993), F10 (Sui et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 16:265, 2009), CR9114 (Dreyfus et al., Science 337:1343, 2012), o CR6261 (véase, por ejemplo, Ekiert et al., Science 324:246, 2009). Otros anticuerpos ejemplares incluyen los descritos en el presente documento, por ejemplo, Ab 044, Ab 069, Ab 032 o Ab 031. En el caso de combinaciones, se pueden administrar dos agentes como parte de la misma unidad de dosificación o se pueden administrar por separado. Otros agentes ejemplares útiles para tratar los síntomas asociados con una infección por gripe son acetaminofeno, ibuprofeno, aspirina y naproxeno.
[0625] En un ejemplo, la vacuna de amplio espectro y el segundo agente o agente adicional se proporcionan como formulaciones separadas, y la etapa de administración incluye la administración secuencial de la vacuna de amplio espectro y el segundo agente o agente adicional. Las administraciones secuenciales pueden proporcionarse en el mismo día (por ejemplo, en una hora entre sí o al menos con 3, 6 o 12 horas de diferencia) o en días diferentes.
[0626] En algunos ejemplos, la vacuna de amplio espectro y el segundo agente o agente adicional se administran cada uno como una pluralidad de dosis separadas en el tiempo. La vacuna de amplio espectro y el segundo agente o agente adicional generalmente se administran cada uno según un régimen. El régimen para uno o ambos puede tener una periodicidad regular. El régimen para la vacuna de amplio espectro puede tener una periodicidad diferente del régimen para el segundo agente o agente adicional, por ejemplo, uno puede administrarse con más frecuencia que el otro. En una implementación, uno de la vacuna de amplio espectro y el segundo agente o agente adicional se administra una vez a la semana y el otro una vez al mes. En otra implementación, uno de la vacuna de amplio espectro y el segundo agente o agente adicional se administra de forma continua, por ejemplo, durante un periodo de más de 30 minutos, pero menos de 1, 2, 4 o 12 horas, y el otro se administra como un bolo. En algunos ejemplos, se administran administraciones secuenciales. El tiempo entre la administración de un agente y otro agente puede ser de minutos, horas, días o semanas. El uso de una vacuna de amplio espectro descrita en el presente documento también se puede utilizar para reducir la dosificación de otra terapia, por ejemplo, para reducir los efectos secundarios asociados con otro agente que se administra. Por consiguiente, una combinación puede incluir la administración de un segundo agente o agente adicional en una dosificación al menos un 10, 20, 30 o 50 % menor de la que se usará en ausencia de la vacuna de amplio espectro. La vacuna de amplio espectro y el segundo agente o agente adicional se pueden administrar mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa.
[0627] En algunos ejemplos, cada uno de la vacuna de amplio espectro y el segundo agente o agente adicional se administra en la misma dosis en la que cada uno se prescribe para monoterapia. En otros ejemplos, la vacuna de amplio espectro se administra en una dosificación que es igual o menor que una cantidad necesaria para su eficacia si se administra en solitario. Asimismo, el segundo agente o agente adicional puede administrarse en una dosificación que es igual o menor que una cantidad necesaria para su eficacia si se administra en solitario.
[0628] En algunos ejemplos, las formulaciones descritas en el presente documento, por ejemplo, formulaciones que contienen una vacuna de amplio espectro que se presenta en la descripción, incluyen uno o más segundos agentes o adicionales, por ejemplo, un segundo agente o adicional, o se administran en combinación con una formulación que contiene uno o más segundos agentes o adicionales.
[0629] En un ejemplo, la administración de una vacuna de amplio espectro se realiza por una de las siguientes vías: oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, subcutánea, intraventricular, transdérmica, interdérmica, rectal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (en forma de líquidos, polvos, ungüentos, cremas, pulverizaciones o gotas), mucosa, nasal, bucal, enteral, sublingual; instilación intratraqueal, instilación bronquial, y/o inhalación; y/o en forma de una pulverización oral, pulverización nasal y/o aerosol.
[0630] En un ejemplo, una vacuna de amplio espectro se administra por inhalación o administración en aerosol de múltiples partículas, por ejemplo, partículas que comprenden un tamaño de partícula medio de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 micrómetros.
[0631] Las vacunas se pueden combinar con los agentes secundarios y tratamientos analizados en el contexto del tratamiento con anticuerpos de la invención en otra parte en el presente documento.
Partículas pseudovíricas
[0632] Se puede proporcionar un inmunógeno de amplio espectro en una partícula pseudovírica (VLP). Una VLP es una estructura que comparte algún componente y similitud estructural con un virus, pero generalmente no es infecciosa. Las VLP típicamente carecen de un genoma viral y, por lo tanto, no pueden reproducirse. Las VLP se pueden producir clonando y coexpresando una o más proteínas virales, típicamente incluyendo una proteína antigénica de interés, en una célula, y recuperándose de las células las VLP que incluyen la proteína antigénica de interés. Esto se describe en más detalle a continuación.
Clonación
[0633] Se conocen en la técnica procedimientos de clonación molecular (véanse, por ejemplo, Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif., y Sambrook et al, Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000). Los procedimientos de clonación molecular incluyen técnicas para la modificación por ingeniería genética y mutagénesis de polipéptidos, lo que permite la eliminación, inserción, sustitución y otras alteraciones de aminoácidos dentro de un polipéptido. Los procedimientos de clonación molecular también incluyen técnicas para el aislamiento y la manipulación de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos o que aumentan, disminuyen, regulan o alteran de otro modo la expresión de polipéptidos. Los procedimientos de clonación molecular comprenden además vectores que facilitan la manipulación genética y la expresión de polipéptidos y ácidos nucleicos.
[0634] Un vector es un vehículo a través del cual se puede reproducir o transmitir un ácido nucleico entre células u organismos vivos. Un vector puede ser, pero sin limitación, un plásmido, virus, bacteriófago, provirus, fagémido, transposón o cromosoma artificial. Un vector puede replicarse de forma autónoma o a través de la maquinaria de una célula u organismo huésped. Un vector puede comprender ADN y/o ARN, que pueden existir en una forma aislada o en un complejo con otros componentes, por ejemplo, proteínas. Los procedimientos de clonación molecular se pueden utilizar para insertar ácidos nucleicos exógenos en vectores para crear construcciones para la expresión de ácidos nucleicos y/o polipéptidos, por ejemplo, HA de gripe.
Expresión
[0635] En la técnica se conocen procedimientos para expresar ácidos nucleicos exógenos y/o polipéptidos (véase, por ejemplo, Sambrook). Típicamente, la expresión exógena implica introducir una construcción de expresión, creada usando los procedimientos descritos anteriormente, en una célula u organismo huésped y permitir que la maquinaria bioquímica de la célula huésped produzca uno o más de los ácidos nucleicos y/o polipéptidos extraños. La célula huésped puede ser, pero sin limitación, una célula procariota, por ejemplo, una bacteria o una célula eucariota, por ejemplo, una célula fúngica, vegetal, aviar, anfibia, nematoda, de insecto o de mamífero, por ejemplo, un ratón, hámster, mono o humana. Los ejemplos de células de insectos incluyen células Sf9, SfZ1, High Five y Drosophila S2. Los ejemplos de células huésped de hongos (incluyendo levadura) son S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis, especies de Candida albicans, Candida glabrata, Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris y Yarrowia lipolytica. Los ejemplos de células de mamífero incluyen células COS, células renales de hámster bebé, linfocitos L de ratón, células LNCaP, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (HEK), células de mono verde africano, células CV1, células HeLa, células MDCK, Vero y células Hep-2. Un ejemplo de célula anfibia es un ovocito de Xenopus laevis. Los ejemplos de células procariotas incluyen E. coli, B. subtilis y micobacterias. La célula huésped puede ser parte de un organismo multicelular o puede cultivarse in vitro, por ejemplo, en un cultivo de un tejido, órgano, una población mixta de células, o una población clonal de células. La construcción de expresión se puede introducir en la célula huésped mediante, por ejemplo, transfección, transducción, transformación, electroporación, microinyección, lipofección o infección.
[0636] Las VLP se pueden producir cultivando células huésped en las que se han introducido una o más construcciones que permiten la expresión de polipéptidos exógenos. Las proteínas exógenas pueden ser polipéptidos idénticos a o derivados de los polipéptidos del virus de gripe, por ejemplo, M1, HA o NA, fragmentos de M1, Ha o NA, o variantes de M1, HA o NA. La construcción de expresión puede contener uno o más elementos adicionales, por ejemplo, un marcador, por ejemplo, un marcador seleccionable, o un origen de replicación. Los procedimientos para cultivar células para la producción de VLP incluyen, pero sin limitación, técnicas de cultivo celular por lotes, alimentadas por lotes, continuas y de perfusión. Se pueden utilizar procedimientos y reactivos para aumentar la eficiencia de la producción de VLP. Por ejemplo, una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia señal, puede añadirse a uno o más polipéptidos exógenos, por ejemplo, M1, HA y/o NA, para facilitar el transporte del uno o más polipéptidos exógenos dentro de la célula huésped.
Aislam iento y purificación de VLP
[0637] Las VLP se pueden aislar y purificar usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como centrifugación de gradiente de densidad, filtración, cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía de filtración en gel. Usando los procedimientos descritos anteriormente, las VLP se producen por células huésped y se secretan en el medio de cultivo. Un procedimiento típico por etapas para aislar y purificar las VLP del medio de cultivo implica (1) ultrafiltración del medio de cultivo para concentrar las v Lp , (2) diafiltración de las VLP para eliminar componentes del medio de cultivo, (3) centrifugación de las VLP en un gradiente de densidad de sacarosa para eliminar desechos celulares y materia particulada, y (4) cromatografía de intercambio aniónico de las VLP para eliminar los ácidos nucleicos.
Vesículas
[0638] Un inmunógeno de amplio espectro puede incorporarse o envasarse en una vesícula. Típicamente, las vesículas tienen un compartimiento acuoso encerrado por una o más bicapas que comprende moléculas anfipáticas (por ejemplo, ácidos grasos, lípidos, esteroides, etc.). Un inmunógeno de amplio espectro puede estar contenido dentro del núcleo acuoso de la vesícula o puede estar localizado en la bicapa anfipática.
[0639] En algunos ejemplos, las moléculas anfipáticas de la vesícula son no iónicas, por ejemplo, un tensioactivo no iónico. Por ejemplo, la molécula anfipática no iónica puede ser un tensioactivo ligado a éster a base de glicerol. Dichos ésteres de glicerol pueden comprender uno de dos grupos acilo alifáticos superiores, por ejemplo, un grupo acilo que contiene al menos diez átomos de carbono en cada resto acilo. Los tensioactivos basados en dichos ésteres de glicerol pueden comprender más de una unidad de glicerol, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 unidades de glicerol. Se pueden usar monoésteres de glicerol, por ejemplo, aquellos que contienen un resto alcanoílo o alquenoílo C12-C20, por ejemplo, caproílo, lauroílo, miristoílo, palmitoílo, oleílo o estearoílo. Un ejemplo de tensioactivo unido a éster a base de glicerol es 1-monopalmitoil glicerol.
[0640] La molécula anfipática no iónica de la bicapa vesicular también puede ser un tensioactivo ligado a éter. Por ejemplo, se pueden usar tensioactivos ligados a éter a base de glicerol o un glicol que tiene un glicol alifático inferior de hasta 4 átomos de carbono, tal como etilenglicol. Los tensioactivos basados en dichos glicoles pueden comprender más de una unidad de glicol, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 unidades de glicol (por ejemplo, diglicolcetil éter y/o polioxietilen-3-lauril éter). Se pueden usar monoéteres de glicerol o glicerol, incluyendo aquellos que contienen un resto alquenilo o alquenilo C12-C20, por ejemplo, caprilo, laurilo, miristilo, cetilo, oleílo o estearilo. Para ejemplos de productos de condensación de óxido de etileno que se pueden utilizar como moléculas anfipáticas, véase la publicación PCT N.° WO88/06882 (por ejemplo, éter alifático superior de polioxietileno y tensioactivos de amina). Ejemplos no limitantes de tensioactivos ligados a éter son 1-monocetil glicerol éter y diglicolcetil éter.
[0641] En algunos ejemplos, la vesícula que comprende un tensioactivo no iónico también puede comprender una molécula anfipática iónica. Por ejemplo, un anfífilo iónico puede hacer que las vesículas se carguen negativamente, lo que puede ayudar a estabilizar las vesículas y promover la dispersión. Las moléculas anfipáticas iónicas que se pueden incorporar en vesículas incluyen, pero sin limitación, ácidos alcanoicos y alquenoicos superiores (por ejemplo, ácido palmítico, ácido oleico) y otros compuestos que contienen grupos ácidos, por ejemplo, fosfatos (por ejemplo, fosfatos de dialquilo, por ejemplo, fosfato de dicetilo, o ácido fosfatídico o fosfatidil serina) y monoésteres de sulfato (por ejemplo, sulfatos de alquilo superiores, por ejemplo, sulfato de cetilo). El anfífilo iónico puede estar presente entre el 1 % y el 30 %, entre el 2 % y el 20 %, o entre el 5 % y el 15 % de la cantidad, en peso, de tensioactivo no iónico.
[0642] En algunos ejemplos, la vesícula puede comprender además una molécula hidrófoba de alto peso molecular capaz de formar una bicapa, por ejemplo, un esteroide, por ejemplo, colesterol. La presencia del esteroide puede facilitar la formación de la bicapa, por ejemplo, al conferir propiedades físicas a la bicapa. El esteroide puede estar presente entre el 20 % y el 120 %, entre el 25 % y el 90 %, o entre el 35 % y el 75 % de la cantidad, en peso, de tensioactivo no iónico.
[0643] En algunos ejemplos, la vesícula puede ser un bilosoma (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.876.721). Como se usa en el presente documento, los "bilosomas" son vesículas que comprenden tensioactivos no iónicos y moléculas potenciadoras del transporte que facilitan el transporte de moléculas de tipo lipídico a través de las membranas mucosas.
[0644] Los procedimientos para preparar vesículas que comprenden tensioactivos no iónicos son conocidos en la técnica. El experto en la técnica entenderá que dichos procedimientos se pueden usar para preparar vesículas que comprenden un inmunógeno de amplio espectro.
Vectores virales
[0645] Se puede proporcionar un inmunógeno de amplio espectro en un virus de gripe. En un ejemplo, el inmunógeno de amplio espectro se incorpora en un polipéptido HA, por ejemplo, un polipéptido HA que difiere del tipo natural. En algunos ejemplos, el polipéptido HA que comprende el inmunógeno de amplio espectro es distinto de una secuencia de tipo natural, por ejemplo, una secuencia modificada genéticamente. Se puede incorporar en un virión mediante el suministro del polipéptido en trans durante la producción del virión o el genoma del virus se puede modificar genéticamente para producirlo. En cualquier caso, se producen partículas virales que comprenden el inmunógeno de amplio espectro. En un ejemplo, el virus está diseñado para tener un fenotipo atenuado, por ejemplo, el virus no puede tener, o solo puede tener, niveles muy bajos de replicación en células humanas. En algunos ejemplos, el virus está inactivado. Los procedimientos de inactivación incluyen el contacto con desnaturalizantes, por ejemplo, formalina, calor o detergente. Se puede proporcionar un inmunógeno de amplio espectro en un virus diferente de gripe, por ejemplo, el vector del virus diferente de gripe puede ser un virus de la enfermedad de Newcastle, un virus vaccinia, un adenovirus, virus adenoasociado (AAV), retrovirus o lentivirus.
Kits
[0646] En un ejemplo, el inmunógeno o vacuna de amplio espectro se empaqueta en un kit. En algunos ejemplos, el kit comprende dos recipientes, uno de los cuales contiene el inmunógeno de amplio espectro y el otro contiene un adyuvante. En algunos ejemplos, el kit comprende dos recipientes, uno de los cuales contiene inmunógeno de amplio espectro en forma de un polvo liofilizado, y el otro contiene un líquido para resuspender el inmunógeno de amplio espectro. El kit puede contener un aviso según lo requiera la agencia gubernamental que regula la fabricación, uso y venta de productos farmacéuticos o biológicos, indicando el aviso que la composición ha sido aprobada para la fabricación, uso y/o venta para administración a seres humanos.
[0647] La vacuna puede suministrarse en un recipiente herméticamente sellado. La vacuna se puede proporcionar en forma de un líquido o en forma de un polvo liofilizado que se puede reconstituir mediante la adición, por ejemplo, de agua o solución salina, a una concentración adecuada para la administración a un sujeto.
Epítopo
[0648] Existen HA en la naturaleza como homotrímeros de subunidades maduras procesadas proteolíticamente. Cada subunidad del trímero se sintetiza como un precursor. Una molécula precursora se procesa proteolíticamente en dos cadenas polipeptídicas enlazadas con disulfuro para formar un polipéptido HA maduro. El polipéptido HA maduro incluye dos dominios: (1) un dominio HA-1 central que se extiende desde la base de la molécula a través del tallo fibroso hasta la región cabeza distal de membrana que contiene el dominio de unión al receptor de glicano, regresando a la región fibrosa que termina en el sitio de escisión, y (2) un dominio HA-2 que incluye la región del tallo y el dominio transmembrana de HA. HA-1 incluye un sitio de unión a glicano. El sitio de unión a glicano puede ser responsable de mediar la unión de HA al receptor Ha . El dominio HA-2 actúa para presentar el dominio HA-1. El trímero HA se puede estabilizar mediante interacciones polares y no polares entre las tres hélices alfa de HA largas del tallo de monómeros HA.
[0649] Las secuencias HA de todos los subtipos de gripe comparten un conjunto de aminoácidos en la interfaz de los dominios HA-1 y HA-2 que se conservan bien. La región de epítopo proximal de membrana (MPER) de interfaz HA-1/HA-2 que incluye la hélice a canónica y los residuos en su proximidad también se conservan a través de un amplio espectro de subtipos. (Ekiert et al., Science. 324(5924):246, 2009; Sui et al., Nat Struct Mol Biol. 16(3):265, 2009).
[0650] Ab 044 tiene alta afinidad por HA del Grupo 1 y el Grupo 2. Se une a un epítopo conformacional que se conserva ampliamente a través de una pluralidad de cepas de gripe. Numerosos residuos de aminoácidos distribuidos a lo largo de las secuencias lineales de HA de diferentes cepas/subtipos contribuyen al epítopo conformacional de Ab 044. La interacción de Ab044 con H3 se analizó mediante estudios de acoplamiento y se identificaron residuos unidos por (o no unidos por) Ab044.
[0651] El Fv de Ab 044 se acopló contra HA de cepas de grupo I y II usando ZDOCK. La estructura del antígeno HA se modeló usando el servidor de modelado de homología SWISS MODEL manteniendo la estructura de cristal resuelta de H1N1 como plantilla. ZDOCK utiliza complementariedad de forma junto con términos de desolvatación y energía electrostática ("ZRANK") para clasificar las posturas acopladas. Para garantizar que las posturas acopladas no se desvíen significativamente del complejo nativo, los residuos de epítopos y parátopos mapeados mediante barrido de alanina se ven obligados a incluirse en la interfaz de unión.
[0652] Para estudios comparativos, los aminoácidos que se unen (o no se unen) a FI6 se tomaron de la solicitud de patente de EE.UU. publicada US 2011/0274702 A1, Neutralizing Anti-Gripe A Virus Antibodies and Uses Thereof, presentada el 18 de julio de 2011.
[0653] ZDOCK es un programa de acoplamiento de proteínas basado en la transformada rápida de Fourier. Se desarrolló por Zhiping Weng en la University of Massachusetts Medical School. En ZDOCK, se introducen dos archivos PDB y el resultado es la estructura prevista de su complejo. El programa busca todos los modos de unión posibles en el espacio traslacional y rotacional entre las dos proteínas y evalúa cada uno mediante una función de puntuación de energía. La estructura de la proteína se convierte en una señal digital y se utiliza una técnica de transformada rápida de Fourier para reducir el tiempo computacional. ZDOCK se analiza en Pierce BG, Hourai Y, Weng Z. (2011) Accelerating Protein Docking in ZDOCK Using an Advanced 3D Convolution Library. PLoS One 6(9): e24657, Pierce B, Tong W, Weng Z. (2005) M-ZDOCK: A Grid-based Approach for Cn Symmetric Multimer Docking. Bioinformatics 21(8): 1472-1476; Mintseris J, Pierce B, Wiehe K, Anderson R, Chen R, Weng Z. (2007) Integrating Statistical Pair Potentials into Protein Complex Prediction. Proteins 69(3): 511-520; y Chen R, Li L, Weng Z. (2003) ZDOCK: An Initialstage Protein Docking Algorithm. Proteins 52(1): 80-7.
[0654] SWISS-MODEL es un servidor de modelado de homología de estructura proteica totalmente automatizado. Es accesible a través del servidor web ExPASy, o desde el programa DeepView (Swiss Pdb-Viewer). Swiss-Model se analiza en Arnold K., Bordoli L., Kopp J., y Schwede T. (2006). The Sw Is S-mOd EL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics, 22,195-201; Kiefer F, Arnold K, Künzli M, Bordoli L, Schwede T (2009). The SWISS-Mo DEL Repository and associated resources. Nucleic Acids Research. 37, D387-D392; y Peitsch, M. C. (1995) Protein modeling by E-mail Bio/Technology 13: 658-660.
[0655] A continuación, se analizan los residuos de H3 que se unen a Ab 044 y los residuos de H3 que se unen a FI6.
H3 HA1
[0656] La secuencia de aminoácidos de H3 HA1 se proporciona a continuación, como SEQ ID NO: 173. Los residuos N38, I278 y D291 mostrados en recuadros de líneas discontinuas están unidos por Ab 044, pero no por FI6; Los residuos Q327, T328 y R329 mostrados en recuadros de líneas de puntos, están unidos por FI6, pero no por Ab 044; los residuos T318, r321 y V323 mostrados en recuadros de líneas continuas, están unidos por Ab 044 y FI6.
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ICNNPHRILD GIDCTLIDAL LGDPHCDVFQ NETWDLFVER SKAFSNCYPY DVPDYASLRS
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H3 HA2
[0657] La secuencia de aminoácidos de H3 HA21 se proporciona a continuación, como SEQ ID NO: 174. El residuo N12 mostrado en un recuadro de líneas discontinuas, está unido por Ab 044, pero no por FI6; los residuos G1, L2, F3, G4, y D46 mostrados en recuadros de líneas de puntos, están unidos por FI6, pero no por Ab 044; los residuos A7, E11, 118, D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, I56, y E57, mostrados en recuadros de líneas continuas, están unidos por Ab 044 y FI6.
glfg.-. :|a g : : |e¡n|gwegm|id g | |w|ygfrhqnse gtgqaad|lk|s |t q a .-.|i ¡d q in g k|lñ|rv|iÍ|ktn ekfhqi ekef sevegri qdl ekyvedtkid l wsynaellv alenqht idl
TDSEMNKLFE KTRRQLRENA EEMGNGCFKI YHKCDNACIE SIRNGTYDHD VYRDEALNNR
FQIKG (SEQ ID NO:174)
[0658] A continuación, se analizan los residuos de H1 que se unen a Ab 044 y los residuos de H1 que se unen a FI6.
H1 HA1
[0659] La secuencia de aminoácidos de H1 HA1 se proporciona a continuación, como SEQ ID NO: 181. Los residuos H31, N279 y S292 mostrados en recuadros de líneas discontinuas están unidos por Ab 044, pero no por FI6. Los residuos Q328 y S329 mostrados en recuadros de líneas de puntos, están unidos por FI6, pero no por Ab 044. Los residuos T319, R322, y 1324 mostrados en recuadros de líneas continuas, están unidos tanto por Ab 044 como por FI6.
TNADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVT;H¡SVNLL
EDSHNGKLCK LKGIAPLQLG KCNIAGWLLG NPECDLLLTA SSWSYIVETS
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(SEQ ID NO:181)
H1 HA2
[0660] La secuencia de aminoácidos de H1 HA2 se proporciona a continuación, como SEQ ID NO: 182. El residuo G12 en un recuadro de líneas discontinuas, está unido por Ab 044, pero no por FI6. Los residuos G1, L2, F3, G4, y D46 mostrados en recuadros de líneas de puntos, están unidos por FI6, pero no por Ab 044. Los residuos A7, E11, 118, D19, G20, W21, Q38, K39, T41, Q42, N43, I45, I48, T49, V52, N53, I56, y E57 mostrados en recuadros de líneas continuas, están unidos tanto por Ab 044 como por FI6.
|glf g|ai|a]gf i|e]g:gwtgm[id||gw|ygyhhqne qgsgyaad|qk|s|tqn|a|í|d1g[ti| nk|vn|svie|km NTQFTAVGKE FNNLERRIEN lnkkvddgfl DIWTYNAELL
VLLENERTLD FHDSNVRNLY EKVKSQLKNN AKEIGNGCFE FYHKCDDACM
ESVRNGTYDY PKYSEESKLN REEIDGVKLE SMGVYQILAI YSTVASSLVL
LVSLGAISFW MCSNGSLQCR ICI (SEQ ID NO:182)
[0661] La figura 26 es una representación tridimensional de H3 HA con los residuos de aminoácidos que se predice que forman parte del epítopo Ab044, pero no forman parte del epítopo de FI6 destacado. Es decir, los aminoácidos destacados son exclusivos del epítopo de Ab044.
[0662] La figura 27 es una representación tridimensional de H3 HA con los residuos de aminoácidos que forman parte del epítopo de FI6, pero que no se predice que formen parte del epítopo de Ab044 destacado, se indica.
Procedimientos de diagnóstico
[0663] Los agentes de unión, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, proporcionados en el presente documento son útiles para identificar la presencia de gripe en una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de paciente, tal como una muestra de fluido, por ejemplo, una muestra de sangre, suero, saliva, mucosa u orina, o una muestra de te jid o , ta l c o m o u n a b io p s ia .
[0664] E n un e je m p lo , s e p o n e u n a m u e s tra d e p a c ie n te e n c o n ta c to c o n un a g e n te d e u n ió n , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o , q u e s e p re s e n ta e n la d e s c r ip c ió n , y s e d e te c ta la u n ió n . L a u n ió n s e p u e d e d e te c ta r co n v a r io s fo rm a to s y m e d io s d e d e te c c ió n , p o r e je m p lo , c o n un e n s a y o d e c a p tu ra d e a n t íg e n o s , ta l c o m o un e n s a y o E L IS A o tra n s fe re n c ia W e s te rn , o un e n s a y o d e in m u n o h is to q u ím ic a . E n a lg u n o s e je m p lo s , el a g e n te d e u n ió n , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o , s e p ro p o rc io n a , p o r e je m p lo , a c o p la d o a u n a m a tr iz in s o lu b le , p o r e je m p lo , u n a p e r la u o tro s u s tra to , y s e u t iliz a u n a m o lé c u la d e d e te c c ió n p a ra d e te c ta r la u n ió n d e H A .
[0665] L a u n ió n d e l a g e n te d e u n ió n , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o , a H A , s e p u e d e d e te c ta r c o n un re a c t iv o q u e c o m p re n d e un re s to d e te c ta b le , p o r e je m p lo , un re a c tiv o , p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o , q u e s e u n e al a g e n te d e u n ió n , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o . E n a lg u n o s e je m p lo s , el a g e n te d e u n ió n , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o , t ie n e un re s to d e te c ta b le . L o s re s to s d e te c ta b le s a d e c u a d o s in c lu y e n e n z im a s (p o r e je m p lo , p e ro x id a s a d e rá b a n o p ic a n te , b e ta -g a la c to s id a s a , lu c ife ra s a , fo s fa ta s a a lc a lin a , a c e t ilc o lin e s te ra s a , g lu c o s a o x id a s a y s im ila re s ) , ra d io e t iq u e ta s (p o r e je m p lo , 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y , 99T c , 111In, 125I, 131I), h a p te n o s , e t iq u e ta s f lu o re s c e n te s (p o r e je m p lo , F IT C , ro d a m in a , fó s fo ro s d e la n tá n id o s , f lu o re s c e ín a , is o t io c ia n a to d e f lu o re s c e ín a , ro d a m in a , c lo ru ro d e 5 -d im e t i la m in a -1 -n a f ta le n o s u lfo n ilo , f ic o e r it r in a , y s im ila re s ) , m o lé c u la s fo s fo re s c e n te s , m o lé c u la s q u im io lu m in is c e n te s , c ro m ó fo ro s , m o lé c u la s lu m in is c e n te s , m o lé c u la s d e fo to a f in id a d , p a r t íc u la s c o lo re a d a s o l ig a n d o s d e a f in id a d , ta le s c o m o b io tin a , e p íto p o s p o lip e p t íd ic o s p re d e te rm in a d o s re c o n o c id o s p o r un in d ic a d o r s e c u n d a r io (p o r e je m p lo , s e c u e n c ia s d e p a re s d e c re m a lle ra d e le u c in a , o s it io s d e u n ió n p a ra a n t ic u e rp o s s e c u n d a r io s , d o m in io s d e u n ió n m e tá lic a , e t iq u e ta s d e e p íto p o s ) . E n a lg u n o s e je m p lo s , la s e t iq u e ta s s e u n e n m e d ia n te b ra z o s e s p a c ia d o re s d e d iv e rs a s lo n g itu d e s p a ra re d u c ir lo s p o s ib le s im p e d im e n to s e s té r ic o s .
[0666] E n a lg u n o s e je m p lo s , s e e n s a y a la p re s e n c ia d e l v iru s d e g r ip e e n un s e r h u m a n o c o m o un p ro c e d im ie n to d e s c r ito e n el p re s e n te d o c u m e n to y , s i la p ru e b a e s p o s it iv a , s e a d m in is tra un a g e n te d e u n ió n , p o r e je m p lo , m o lé c u la s d e a n t ic u e rp o , p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o , p ro p o rc io n a d o e n el p re s e n te d o c u m e n to .
[0667] L o s a g e n te s d e u n ió n , p o r e je m p lo , m o lé c u la s d e a n t ic u e rp o , p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o , p ro p o rc io n a d o s e n el p re s e n te d o c u m e n to s e p u e d e n u t i l iz a r p a ra e n s a y o s c ito ló g ic o s , ta l c o m o p a ra id e n tif ic a r u n a H A e n u n a c é lu la . El e n s a y o p u e d e s e r un e n s a y o c o lo r im é tr ic o . C o m o c o n tro l s e u t iliz a u n a m u e s tra b io ló g ic a d e un in d iv id u o n o rm a l (n o in fe c ta d o ) . El e n s a y o d e d ia g n ó s t ic o s e p u e d e re a liz a r in vitro.
[0668] El e n s a y o d e d ia g n ó s t ic o ta m b ié n s e p u e d e re a liz a r p a ra d e te rm in a r la in fe c c ió n d e c é lu la s en c u lt iv o , p o r e je m p lo , d e c é lu la s d e m a m ífe ro e n c u lt iv o . L a s m o lé c u la s d e a n t ic u e rp o s e p u e d e n u t i l iz a r en e n s a y o s in vitro.
[0669] D e b id o a q u e la s m o lé c u la s d e a n t ic u e rp o q u e s e p re s e n ta n e n el p re s e n te d o c u m e n to s e u n e n a un a m p lio e s p e c tro d e s u b t ip o s d e H A , lo s e n s a y o s d e d ia g n ó s t ic o q u e s e p re s e n ta n e n la d e s c r ip c ió n p u e d e n d e te c ta r la p re s e n c ia d e l v iru s d e g r ip e e n p a c ie n te s in fe c ta d o s c o n u n a v a r ie d a d d e c e p a s d is t in ta s d e g r ip e . U n a m u e s tra de p a c ie n te s e p u e d e e n s a y a r a d ic io n a lm e n te c o n a n t ic u e rp o s e s p e c íf ic o s d e s u b tip o , u o tro s e n s a y o s (p o r e je m p lo , R F L P (p o lim o r f is m o d e lo n g itu d d e l f ra g m e n to d e re s tr ic c ió n ) , P C R ( re a c c ió n e n c a d e n a d e la p o lim e ra s a ) , R T -P C R ( t ra n s c r ip c ió n in v e rs a a c o p la d a a re a c c ió n e n c a d e n a d e la p o lim e ra s a ) , t ra n s fe re n c ia N o r th e rn , t ra n s fe re n c ia S o u th e rn o s e c u e n c ia c ió n d e A D N ) p a ra d e te rm in a r a d ic io n a lm e n te la c e p a p a r t ic u la r de l v iru s .
[0670] E n un e je m p lo , a un p a c ie n te q u e s e d e te rm in a q u e e s tá in fe c ta d o c o n g r ip e A s e le p u e d e a d m in is tra r a d ic io n a lm e n te u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o q u e s e p re s e n ta e n la d e s c r ip c ió n , p a ra t r a ta r la in fe c c ió n .
[0671] T a m b ié n s e p ro p o rc io n a n s u s tra to s s ó lid o s , p o r e je m p lo , p e r la s , t ira s re a c tiv a s , m a tr ic e s , y s im ila re s , s o b re lo s c u a le s s e d is p o n e un a g e n te d e u n ió n , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la d e a n tic u e rp o .
Kits
[0672] U n a g e n te d e u n ió n , p o r e je m p lo , u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o , d e s c r ito e n el p re s e n te d o c u m e n to , p o r e je m p lo , g e n e ra d o p o r lo s p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s e n el p re s e n te d o c u m e n to , s e p u e d e p ro p o rc io n a r e n un kit. El k it p u e d e in c lu ir u n o o m á s c o m p u e s to s a d ic io n a le s , p o r e je m p lo , re c ip ie n te s , ta m p o n e s u o tro s d ilu y e n te s , d is p o s it iv o s d e a d m in is tra c ió n y s im ila re s .
[0673] E n u n a re a liz a c ió n , el k it in c lu y e m a te r ia le s p a ra a d m in is t ra r u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o a un s u je to , ta l c o m o p a ra el t ra ta m ie n to o p re v e n c ió n d e u n a in fe c c ió n p o r v iru s d e g rip e . P o r e je m p lo , el k it p u e d e in c lu ir u n o o m á s o to d o s : (a ) un re c ip ie n te q u e c o n t ie n e u n a c o m p o s ic ió n q u e in c lu y e u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o , o p c io n a lm e n te (b ) un re c ip ie n te q u e c o n t ie n e u n a c o m p o s ic ió n q u e in c lu y e un s e g u n d o a g e n te te ra p é u t ic o , y o p c io n a lm e n te (c ) m a te r ia l in fo rm a t iv o .
[0674] E n o tra re a liz a c ió n , el k it in c lu y e m a te r ia le s p a ra u s a r u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o e n un e n s a y o d e d ia g n ó s t ic o , ta l c o m o p a ra la d e te c c ió n d e H A en u n a m u e s tra b io ló g ic a . P o r e je m p lo , el k it p u e d e in c lu ir u n o o m á s o to d o s : (a ) un re c ip ie n te q u e c o n t ie n e u n a c o m p o s ic ió n q u e in c lu y e u n a m o lé c u la d e a n t ic u e rp o , o p c io n a lm e n te (b ) un recipiente que contiene un reactivo, por ejemplo, etiquetado con un resto detectable, para detectar el anticuerpo, por ejemplo, para su uso en un ensayo ELISA o inmunohistoquímico, y opcionalmente (c) material informativo. En otras realizaciones, el kit comprende un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que comprende un resto detectable.
[0675] En una realización, el kit comprende un sustrato sólido, por ejemplo, perla, tira reactiva, matriz, y similares, sobre el cual se dispone un agente de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo.
[0676] El material informativo puede ser descriptivo, instructivo, de comercialización u otro material que se refiera a los procedimientos descritos en el presente documento y/o el uso de los agentes para beneficio terapéutico, o para un ensayo de diagnóstico.
[0677] El material informativo de los kits no está limitado en su forma. En una realización, el material informativo puede incluir información sobre la producción del anticuerpo, concentración, fecha de caducidad, información del lote o sitio de producción, etc. En una realización, el material informativo se refiere a procedimientos para administrar el anticuerpo, por ejemplo, en una dosis, forma de dosificación o modo de administración adecuados (por ejemplo, una dosis, forma de dosificación o modo de administración descritos en el presente documento), para tratar a un sujeto que tiene una infección, por ejemplo, una infección viral o infección secundaria (por ejemplo, infección bacteriana secundaria).
[0678] En otra realización, el material informativo se refiere a procedimientos para usar la molécula de anticuerpo para un ensayo de diagnóstico, por ejemplo, para detectar la presencia de virus de gripe en una muestra biológica.
[0679] La información se puede proporcionar en una variedad de formatos, incluyendo texto impreso, material legible por ordenador, grabación de vídeo o grabación de audio, o información que proporciona un enlace o dirección a material sustantivo.
[0680] Además del agente, la composición en el kit puede incluir otros ingredientes, tales como un disolvente o tampón, un estabilizador o un conservante. El agente puede proporcionarse en cualquier forma, por ejemplo, una forma líquida, seca o liofilizada, y sustancialmente pura y/o estéril. Cuando los agentes se proporcionan en una solución líquida, la solución líquida típicamente es una solución acuosa. Cuando los agentes se proporcionan como una forma seca, la reconstitución generalmente se realiza mediante la adición de un disolvente adecuado. Opcionalmente, el disolvente, por ejemplo, agua estéril o tampón, puede proporcionarse en el kit.
[0681] El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición o composiciones que contienen los agentes. En algunas realizaciones, el kit contiene recipientes, divisores o compartimentos separados para la composición y el material informativo. Por ejemplo, la composición puede estar contenida en un frasco, vial o jeringa, y el material informativo puede estar contenido en una funda de plástico o paquete. En otras realizaciones, los elementos separados del kit están contenidos dentro de un único recipiente indiviso. Por ejemplo, la composición está contenida en un frasco, vial o jeringa que tiene unido a los mismos el material informativo en forma de una etiqueta. En algunas realizaciones, el kit incluye una pluralidad (por ejemplo, un paquete) de recipientes individuales, conteniendo cada uno una o más formas de dosificación unitaria (por ejemplo, una forma de dosificación descrita en el presente documento) de los agentes. Los recipientes pueden incluir una dosificación unitaria de combinación, por ejemplo, una unidad que incluye tanto la molécula de anticuerpo como el segundo agente o agente adicional, tal como en una relación deseada. Por ejemplo, el kit puede incluir una pluralidad de jeringas, ampollas, paquetes de papel de aluminio, blísters o dispositivos médicos que contienen, por ejemplo, cada uno una dosis unitaria de combinación única. Los recipientes de los kits pueden ser herméticos al aire, impermeables (por ejemplo, impermeables a los cambios en la humedad o evaporación) y/o estancos a la luz.
[0682] El kit incluye opcionalmente un dispositivo adecuado para administrar la composición, por ejemplo, una jeringa o dispositivo para suministrar partículas o aerosoles, por ejemplo, un inhalador, un dispositivo de pulverización o un gotero u otro dispositivo de administración adecuado. El dispositivo se puede proporcionar precargado con uno o ambos agentes o puede estar vacío, pero ser adecuado para la carga.
[0683] La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes adicionalmente.
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EJEMPLOS
Ejemplo 1. Diseño de anticuerpos anti-HA
[0684] Los anticuerpos humanos (IgG) dirigidos a hemaglutinina (HA) viral se diseñaron de forma computacional. La HA media la unión viral al receptor de superficie de la célula huésped y la fusión de membrana celular a la envoltura viral, dando como resultado la entrada viral. Las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento se diseñaron para bloquear la actividad fusogénica de HA.
[0685] Todas las construcciones de anticuerpos se basaron en la estructura de IgG1 humana (cadena pesada Y1 y cadena ligera k). Se diseñaron computacionalmente mutaciones puntuales en el Vh (dominio pesado variable) y Vl (dominio ligero variable). Estas mutaciones se encuentran dentro o fuera de las CDR (regiones determinantes de complementariedad). Las mutaciones se diseñaron, por ejemplo, para modificar las propiedades de unión a antígeno (por ejemplo, para afinidad de unión más fuerte o más débil), o para estabilizar la estructura, o para mejorar las propiedades de expresión, etc.
[0686] Las secuencias de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, denominado A18, se proporcionan en la figura 1.
[0687] Los emparejamientos de cadena pesada y ligera para anticuerpos diseñados de forma computacional ejemplares se muestran en la Tabla 3, anteriormente en la Descripción detallada.
[0688] A continuación, se proporcionan secuencias de ADN para la cadena pesada variable y la cadena ligera variable para cada uno de los anticuerpos Ab A18, Ab 031, Ab 032, Ab 044, Ab 014 y Ab 028.
VH16:
GAGGTACAGCTCCTCGAATCGGGAGGGGGACTGGTCAAACCCGGTCAATCGCTCAAA
CTCTCGTGTGCAGCGTCAGGTTTTACGTTCAGCTCATATGGGATGCACTGGGTCCGC
CAGCCTCCGGGAAAGGGACTGGAGTGGGTGGCAGTCGTGTCGTATGACGGGAGCAAT
AAGTACTACGCCGATTCAGTGCAAGGTCGGTTTACCATTTCGAGGGATAACAGCAAG
AACACGCTCTACTTGCAGATGAACTCACTTAGAGCGGAAGATACGGCTGTGTACTAT
TGCGCCAAAGACACAAAGCTGCGATCCCTGTTGTACTTCGAATGGTTGTCCTCGGGC
TTGCTTGACTATTGGGGGCAGGGCGCCATGGTCACAGTATCCAGCGCGTCGACTAAG
GGGCCC (SEQ ID NO:63)
VL29:
GAGATCGTGATGACGCAGAGCCCCGATAGCCTCGCTGTCTCATTGGGGGAACGGGCC
ACGATTAACTGCAAATCCTCACAGTCGGTGACTTTCAGCTATAAGAATTACCTGGCA
TGGTATCAGCAGAAGCCGGGTCAACCCCCAAAACTGTTGATCTACTGGGCCTCCACA
CGCGAGTCGGGAGTCCCGGACCGATTTTCGGGTTCAGGGTCCGGCACTGACTTTACC
CTCACAATTTCATCGCTTCAAGCGGAGGATGTAGCAGTGTACTATTGTCAGCAGTAT
TACAGAACACCTCCCACCTTCGGAGGGGGAACGAAACTTGACATCAAGGGATCC
(SEQ ID NO:64)
VL30:
GAGATCGTGATGACGCAGAGCCCCGATAGCCTCGCTGTCTCATTGGGGGAACGGGCC
ACGATTAACTGCAAATCCTCACAGTCGGTGACTTTCGACTATAAGAATTACCTGGCA
TGGTATCAGCAGAAGCCGGGTCAACCCCCAAAACTGTTGATCTACTGGGCCTCCACA
CGCGAGTCGGGAGTCCCGGACCGATTTTCGGGTTCAGGGTCCGGCACTGACTTTACC
CTCACAATTTCATCGCTTCAAGCGGAGGATGTAGCAGTGTACTATTGTCAGCAGTAT
TACAGAACACCTCCCACCTTCGGAGGGGGAACGAAACTTGACATCAAGGGATCC
(SEQ ID NO:65)
VH15:
GAAGTGCAACTCCTCGAGTCAGGAGGAGGTTTGGTGAAACCGGGTCAGTCCTTGAAA
CTGAGCTGTGCAGCAAGCGGGTTCACGTTTACGTCGTACGGCATGCACTGGGTACGG
CAGCCTCCCGGGAAGGGACTTGAATGGGTCGCCGTCATCTCATACGACGGGTCGTAC
AAATACTATGCGGATAGCGTGCAAGGTCGCTTCACAATTTCCCGGGACAATTCGAAG
AATACACTGTATCTTCAGATGAACTCGCTCAGGGCTGAGGACACGGCGGTCTATTAC
TGCGCGAAGGATTCGCGACTCAGATCCCTTTTGTACTTTGAGTGGCTGTCGCAGGGG
TATTTCAACCCATGGGGAGCCGGAACCACTTTGACCGTATCAAGCGCGTCAACAAAG
GGGCCC (SEQ ID NO:66)
VL28:
GAAATTGTAATGACGCAGAGCCCTGATAGCCTTGCCGTGTCCCTGGGTGAGAGGGCG
ACAATCAATTGTAAGTCATCACAGTCGGTCACGTACAACTACAAGAACTACCTGGCG
TGGTATCAACAGAAACCCGGGCAGCCGCCCAAATTGCTCATCTATTGGGCTTCGACA
CGGGAGTCGGGTGTGCCAGACCGCTTCTCCGGGTCAGGATCGGGAACTGACTTCACG
TTGACTATTTCGTCCCTCCAGGCAGAAGATGTAGCCGTCTACTATTGCCAACAGTAT
TACAGAACGCCGCCTACATTTGGAGGCGGGACCAAACTTGACATCAAGGGATCCGTG
GCCGCCCCCAGCGTCTTCATCTTCCCGCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCGGGCACG
GCCAGCGTGGTGTGCCTCCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCGAAGGTCCAGTGG
AAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGGAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGAC
TCGAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAGGCCGACTAC
GAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGGCTCTCGAGCCCCGTG
ACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC (SEQ ID NO:67)
VL52:
GACATTCAGATGACTCAGTCGCCTTCGTCATTGTCCGCCTCCGTGGGTGATAGGGTC
ACGATCACGTGCCGGAGCAGCCAGTCCATCACCTTCAATTACAAAAACTATTTGGCA
TGGTATCAACAGAAACCCGGAAAGGCGCCGAAGCTCCTGATCTACTGGGGTTCATAT
CTTGAGTCGGGGGTGCCGTCGAGATTTTCGGGCAGCGGATCAGGGACGGATTTCACG
CTGACCATTTCGTCACTCCAGCCCGAGGACTTTGCGACATATTACTGTCAACAGCAC
TACAGGACACCCCCATCTTTCGGACAGGGGACTAAAGTAGAAATCAAGGGATCCGTG
GCCGCCCCCAGCGTCTTCATCTTCCCGCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCGGGCACG
GCCAGCGTGGTGTGCCTCCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCGAAGGTCCAGTGG
AAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGGAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGAC
TCGAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAGGCCGACTAC
GAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGGCTCTCGAGCCCCGTG
ACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA (SEQ ID NO:149)
VL45:
GACATTCAGATGACTCAGTCGCCTTCGTCATTGTCCGCCTCCGTGGGTGATAGGGTC
ACGATCACGTGCCGGAGCAGCCAGTCCATCACCTTCAATTACAAAAACTATTTGGCA
TGGTATCAACAGAAACCCGGAAAGGCGCCGAAGCTCCTGATCTACTGGGGTTCATAT
CTTGAGTCGGGGGTGCCGTCGAGATTTTCGGGCAGCGGATCAGGGACGGATTTCACG
CTGACCATTTCGTCACTCCAGCCCGAGGACTTTGCGACATATTACTGTCAACAGCAC
TACAGGACACCCCCATCTTTCGGACAGGGGACTAAAGTAGAAATCAAGGGATCCGTG
GCCGCCCCCAGCGTCTTCATCTTCCCGCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCGGGCACG
GCCAGCGTGGTGTGCCTCCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCGAAGGTCCAGTGG
AAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGGAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGAC
TCGAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAGGCCGACTAC
GAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGGCTCTCGAGCCCCGTG
ACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGAGAATTC (SEQ ID NO:150)
VH25:
CAGGTACAATTGCTTGAGACAGGTGGAGGACTCGTGAAGCCAGGTCAGTCATTGAAA
CTGAGCTGTGCCGCATCCGGGTTCACATTCACTTCCTACGCGATGCACTGGGTCCGC
CAGCCTCCCGGAAAGGGACTTGAGTGGGTCGCTGTGGTATCGTATGATGGGAATTAC
AAATACTATGCAGACTCCGTGCAAGGCCGGTTTACGATTAGCAGGGACAACTCGAAG
AATACCCTTTACCTCCAAATGAACTCGCTCCGAGCGGAGGACACGGCGGTGTATTAC
TGCGCGAAGGATTCACGGTTGAGATCGCTGCTCTATTTTGAATGGTTGTCACAGGGG
TACTTCAACCCGTGGGGTCAGGGAACAACACTGACCGTCAGCTCAGCCTCGACTAAA
GGGCCCAGCGTGTTCCCGCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGGACCGCC
GCCCTGGGCTGCCTCGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCGTGGAAC
AGCGGCGCGCTGACGAGCGGGGTCCACACCTTCCCGGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGC
CTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGGACCCAGACG
TACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTGGAG
CCCCCGAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTACTGAACTC
CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC
TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG
GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG
CGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAC
CAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGAGCCCCGAGAACCACAGGTG
TACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC
CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAG
CCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC
CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA
TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG
TCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO:151)
VH24:
GAAGTACAATTGCTTGAGTCGGGTGGAGGACTCGTGAAGCCAGGTCAGTCATTGAAA
CTGAGCTGTGCCGCATCCGGGTTCACATTCACTTCCTACGCGATGCACTGGGTCCGC
CAGCCTCCCGGAAAGGGACTTGAGTGGGTCGCTGTGGTATCGTATGATGGGAATTAC
AAATACTATGCAGACTCCGTGCAAGGCCGGTTTACGATTAGCAGGGACAACTCGAAG
AATACCCTTTACCTCCAAATGAACTCGCTCCGAGCGGAGGACACGGCGGTGTATTAC
TGCGCGAAGGATTCACGGTTGAGATCGCTGCTCTATTTTGAATGGTTGTCACAGGGG
TACTTCAACCCGTGGGGTCAGGGAACAACACTGACCGTCAGCTCAGCCTCGACTAAA
GGGCCCAGCGTGTTCCCGCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGGACCGCC
GCCCTGGGCTGCCTCGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCGTGGAAC
AGCGGCGCGCTGACGAGCGGGGTCCACACCTTCCCGGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGC
CTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGGACCCAGACG
TACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTGGAG
CCCCCGAAGAGCTGCGACGGTACCCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTACTGAACTC
CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC
TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG
GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG
CGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAC
CAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGAGCCCCGAGAACCACAGGTG
TACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC
CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAG
CCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC
CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA
TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG
TCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO:152)
[0689] Cada una de las secuencias anteriores se puede modificar para incluir una secuencia de nucleótidos ATCGAT en el extremo 5', que codificará un polipéptido de cadena pesada o cadena ligera variable que comprende Ile-Asp en el extremo amino.
Ejemplo 2. Unión de anticuerpos anti-HA a hemaglutininas de una diversidad de virus de gripe según se mide por ELISA
[0690] Los anticuerpos se ensayaron para determinar la unión a hemaglutininas (HA) de diferentes cepas de gripe mediante ensayo ELISA. Los anticuerpos también se ensayaron para determinar la unión a BSA para evaluar la unión no específica. No existe necesariamente una correlación directa entre la afinidad de unión y el nivel de eficacia en los estudios in vivo.
[0691] La afinidad de unión de los anticuerpos se midió mediante ELISA. Para realizar el ELISA, se recubrieron placas NUNC Maxisorp de fondo plano de 96 pocillos (N.° de cat. 439454) con las hemaglutininas (HA) indicadas diluidas a 2 pg/ml en 1x PBS, 100 pl por pocillo. La placa se selló con una cubierta de placa y se dejó incubar durante la noche a 4 °C estática. A continuación, las placas se lavaron tres veces con 1x PBS Tween-20 al 0,05 % (PBST). Las placas recubiertas con HA se bloquearon con 200 pl de Blotto al 5 % (Santa Cruz Biotechnology Cat. N.° sc-2325) en 1x PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, las placas se lavaron tres veces con PBST. Una vez lavadas, los anticuerpos (descritos en la descripción) se diluyeron a la concentración inicial deseada en PBST y se cargaron en la placa con dilución seriada. No se añadió ninguna muestra al último pocillo del conjunto para obtener la lectura del antígeno en blanco. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas, estáticas, y a continuación, se lavaron tres veces con PBST, y se presionaron hasta secar. Se diluyó el anticuerpo conjugado con HRP anti-humano en PBST y se cargaron 100 pl de anticuerpo HRP por pocillo en todos los pocillos. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces con PBST. Se preparó la solución de TMB (KPL, Gaithersburg, m D, N.° de cat. 50-76-00) antes de su uso y se dejó calentar a temperatura ambiente. A continuación, se añadió la solución de TMB a la placa y se desarrolló hasta que la DO máxima fue de entre 2 y 3 unidades de absorbancia a 650 nm según se leyó en un lector de placas de 96 pocillos (SpectraMax M2e o similar), o 4 minutos, después de alcanzar la DO deseada, la reacción se interrumpió con H2SO4 1 N y se leyó la DO a 450 nm en el mismo lector de placas en la placa. La DO se representó en función de la concentración y la Kd relativa se calculó usando un ajuste de cuatro parámetros.
[0692] Anticuerpo Ab 018. Se encontró que el anticuerpo Ab 018 tiene afinidad de unión picomolar a las cepas del Grupo 1 (H1 (A/Islas Salomón/3/2006), H5 (A/Vietnam/1203/2004) y H9 (A/Hong Kong/1073/99)), y al menos una cepa del Grupo 2 (H7 (A/Países Bajos/219/2003), pero no al menos una cepa de H3 (A/Wyoming/03/2003)) cuando se midió mediante ELISA. Véase la Tabla 5.
Figure imgf000106_0002
[0693] Anticuerpos Ab 004, Ab 005, Ab 031, Ab 032, Ab 037, y Ab 038. Las afinidades de unión para los anticuerpos seleccionados (Ab 004, Ab 005, Ab 031, Ab 032, Ab 037 y Ab 038), según se determina por e LiSA, se muestran en la Tabla 6 a continuación.
T ^= =En i = ^ n= n ^ r
Figure imgf000106_0001
[0694] Anticuerpos Ab 014 y Ab 028. Se descubrió que los anticuerpos Ab 014 y Ab 028 tienen una especificidad amplia, como se midió mediante ensayo ELISA (véanse las figuras 10A a 10D).
[0695] Anticuerpo Ab 044. Se encontró que el anticuerpo Ab 044 tiene menos de 500 pM de afinidad de unión pM (Kd) a hemaglutininas (HA) de una diversidad de cepas de gripe de diferentes grupos, clados y subtipos, incluyendo cepas del Grupo 1 ("el clúster H1a" (H1 (A/Islas Salomón/20/1999, A/Puerto Rico/8/34), H2 (A/pollo/PA/2004), H5 (A/Vietnam/1203/2004)); "el clúster H9" (H9 (A/Hong Kong/1073/1999, A/Gallina pintada/HK/WF10/99)); "el clúster H1b" (H16 (A/Gaviota reidora/Mongolia/1756/2006))) y cepas del Grupo 2 ("el clúster H3" (H3 (A/Brisbane/10/2007, A/Nueva York/55/2004, A/Wyoming/3/2003, A/Wisconsin/67/2005, A/Moscú/10/1999, A/Perth/16/2006, A/Uruguay/716/2007)); "el clúster H7" (H7 (A/Países Bajos/219/2003))), cuando se miden por ELISA.
[0696] También se encontró que el anticuerpo Ab 044 tiene menos de 500 pM de afinidad de unión (Kd) a una HA de gripe B (B/Wisconsin/1/2010) como se midió mediante ELISA.
Ejemplo 3. Unión del anticuerpo anti-HA Ab 032 a hemaglutininas de diversas cepas de gripe, según se mide por resonancia por plasmones superficiales (SPR)
[0697] El kit Biotin CAPture de GE Biacore™ (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA) se ha usado con éxito para medir la tasa de asociación (kasociación) y la tasa de disociación (kdisociación), de las cuales se obtuvo la constante de disociación (Kd = kdisociación/kasociación) entre dos compañeros. Específicamente, la interacción de Ab 032 contra hemaglutininas H3 (A/Brisbane/10/07), H7 (A/Países Bajos/219/03), H1 (A/California/07/09), y H5 (A/Vietnam/1203/2004) subestequiométricamente biotiniladas e inmovilizadas de Protein Sciences (Meriden, CT) se evaluaron usando resonancia por plasmones superficiales en un instrumento Biacore® 3000 (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA). El kit contiene un chip cuya superficie se modifica covalentemente con ADN monocatenario. El kit también contiene ADN complementario modificado con estreptavidina, que es capturado por la superficie a través de la hibridación. Se aplicaron dianas de hemaglutinina biotinilada que se han pasado a través de dos columnas y dispositivos de desalación por centrifugación Zeba 7k MWCO (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) para eliminar la biotina no incorporada al nivel de UR deseado (~100 UR de diferentes ligandos de hemaglutinina en células de flujo 2, 3 o 4). El ligando diana biotinilado se inmovilizó mediante la interacción de biotina-estreptavidina fuerte y no covalente, y la modificación de lisinas diana con un éster NHS activado de biotina (N.° 21338 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina de Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) se realizó subestequiométricamente con respecto al monómero de hemaglutinina ~72 kDa para ayudar en la presentación uniforme del ligando. Los parámetros cinéticos se basaron en el ajuste global de 4 o más curvas generadas por inyecciones secuenciales de 30 pl/min de analito de anticuerpo Ab 032 de concentración creciente (500 s de datos de tasa de asociación para el ajuste) y la acumulación de los datos de desintegración cuando se detuvo la inyección (1200 s de datos de tasa de disociación para el ajuste), usando una resta de referencia doble y una unión 1:1 con modelo de transferencia de masa con un chip acoplado que se normalizó con glicerol al 40 % antes del experimento. El tampón de corrida y diluyente para Ab 032 fue 1 x PBS (Gibco®, Life Technologies Corporation, Grand Island, NY) en EdTA 3 mM (pH 8,5) y tensioactivo P-20 al 0,005 % (GE N.° BR-1000-54, Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA). El software BIAevaluation (versión 4.1.1) se utilizó en el módulo "Kinetics Simultaneous ka/kd." en el que el índice de refracción se estableció en 0, Rmáx se ajustó localmente, y se empleó la unión 1:1 con transferencia de masa. Los datos se "restaron con referencia doble" antes del procesamiento, en el que la señal de la célula de flujo de referencia (que contenía la superficie de estreptavidina, pero no hemaglutinina) se restó de la célula de flujo que contenía hemaglutinina de interés; de las curvas dentro de este conjunto se restaron a continuación, la curva de la inyección de tampón de corrida (sin anticuerpo). La superficie se regeneró mediante desnaturalización de ADN con una inyección de NaOH 0,25 M y guanidina-HCl 6 M antes del siguiente ciclo de aplicación de ADN fresco-estreptavidina y diana de hemaglutinina biotinilada para la siguiente inyección de concentración de Ab 032. Se realizaron tres ciclos de corrida completos de inyección en blanco seguidos de concentraciones bajas a altas de analito Ab 032, y la tercera inyección en blanco se utilizó para la resta de referencia doble usando la célula de flujo 1, que contenía conjugado híbrido de ADN-estreptavidina, pero sin cargarse con material biotinilado.
[0698] Se midió la unión del analito de anticuerpo Ab 032 contra la diana de hemaglutinina H7 Países Bajos subestequiométricamente biotinilada e inmovilizada. Se utilizaron diluciones seriadas dobles de Ab 032 de 8 nM a 0,5 nM contra 85 RU H7 depositadas.
[0699] En un experimento separado, se midió la unión del analito de anticuerpo Ab 032 contra la diana de hemaglutinina H1 California 07 subestequiométricamente biotinilada e inmovilizada. Se utilizaron diluciones seriadas dobles de Ab 032 de 8 nM a 0,5 nM contra 111 RU H1 depositadas.
[0700] Los resultados se muestran en la Tabla 7 a continuación.
= = = = =
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[0701] La tasa de disociación (kdisociación) para Ab 032 que interactúa con H5 Vietnam fue tan lenta, que cayó fuera del rango de especificaciones de medición de Biacore (<5x10-6 s-1), y, por lo tanto, se designa como no disponible (NA) en la Tabla 7. Dado que la constante de disociación (Kd) se determina mediante la tasa de disociación dividida por la tasa de asociación, también lleva la designación NA.
Ejemplo 4. Actividad antiviral in v itro de anticuerpos anti-HA
Ensayo MIC, ensayo CPE y qRT-PCR.
[0702] Los anticuerpos se ensayaron para determinar la concentración inhibitoria mínima (MIC). A pesar de los resultados del ensayo ELISA (mostrado en el Ejemplo 2) que indican que A18 no se une a una cepa de H3 (A/Wyoming/03/2003), A18 neutralizó cepas tanto de H1N1 (PR8) como una cepa diferente de H3N2 (X-31) in vitro en un ensayo MIC. La MIC de A18 con PR8 fue de aproximadamente 26 pg/ml, y la MIC de A18 con X-31 fue de aproximadamente 421 pg/ml.
[0703] Los anticuerpos descritos en la Tabla 6 también neutralizaron los virus H1N1 y H3N2 in vitro. Véase a continuación, en la Tabla 8.
Figure imgf000108_0002
[0704] En un ensayo de efecto citopático (CPE), A18 a 10 pg/ml y 50 pg/ml demostró una inhibición casi completa de la infección por X-31, mientras que el anticuerpo de control anti-HA AB1 a 10 pg/ml y 50 pg/ml mostró poca o ninguna inhibición de la infección por X-31 (figura 4). AB1 se une a la región del tallo del trímero HA.
[0705] Una cuantificación de ensayo qPCR de ARN viral X-31 indicó además que la CI50 de A18 es probablemente significativamente menor de 10 pg/ml.
[0706] Los experimentos RT-PCR revelaron que A18 podría neutralizar múltiples cepas de H3N2, incluyendo Vic75 (CI50= 2 pg/ml), X-31 (CI50= 0,4 pg/ml) y Bris07 (CI50= ~7 pg/ml).
Ensayos visuales y de rojo neutro.
[0707] La validación externa del potencial de neutralización in vitro de Ab 032 se confirmó mediante ensayos visuales y de rojo neutro.
[0708] Brevemente, los anticuerpos se prepararon en solución de MEM con 50 pg/ml de gentamicina. A partir de 500 pg/ml como la concentración más alta, se prepararon diluciones semilogarítmicas y se añadieron a 5 pocillos cada una en una placa de 96 pocilios con células MDCK en confluencia. Tres pocilios de cada dilución se infectaron con un título bajo de virus, y dos pocillos permanecieron no infectados como controles de toxicidad. Las placas se incubaron durante 3-6 días hasta que los pocillos de control del virus alcanzaron el efecto citopático máximo (CPE). Las placas se evaluaron mediante puntuación visual de CPE o se tiñeron con colorante rojo neutro durante aproximadamente 2 horas, a continuación, se retiró el colorante sobrenadante de los pocillos y se extrajo el colorante incorporado en 50:50 de tampón citrato Sorensen/etanol, a continuación, se leyó la densidad óptica (D.O.) en un espectrofotómetro. Después, la D.O. se convirtió en un porcentaje de controles celulares y se normalizó con respecto al control de virus, a continuación, se calculó la concentración del compuesto de prueba necesaria para inhibir el CPE en un 50 % (CE50) mediante análisis de regresión. La concentración del compuesto que causará el 50 % del CPE en ausencia del virus se calculó de manera similar (CC50). El índice de selectividad (SI) es el CC50 dividido por CE50.
[0709] Los resultados se muestran a continuación, en la Tabla 9.
^ ^
Figure imgf000109_0001
[0710] El efecto antiviral in vitro de Ab 044 también se examinó mediante el ensayo descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 10. In vitro, Ab 044 demostró inhibición viral dependiente de la dosis in vitro con una CE50 en el intervalo de 0,3 - 6,8 ug/ml contra todas las cepas de virus del Grupo 1 y del Grupo 2 analizadas.
Figure imgf000109_0002
Ejemplo 5. Ensayo de resistencia farmacológica in v itro
[0711] La aparición de resistencia farmacológica se evaluó después de la exposición continua de la cepa de gripe H1N1 PR8 a anticuerpos dirigidos a HA anti-gripe descritos en el presente documento. En resumen, p R8 se incubó previamente con un anticuerpo en el CI50 durante 40 minutos antes de infectar células MDCK confluentes en un formato de placa de 96 pocillos. La infección se produjo durante 1 h, momento en el que se retiró el medio que contenía anticuerpo y virus y se reemplazó con un medio libre de virus que contenía el anticuerpo a la CI50. Después de 48 horas de incubación a 37 °C, CO2 al 5 %, el sobrenadante se retiró y se cuantificó el título viral mediante PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos para la proteína M del virus. Una vez titulados, los sobrenadantes virales se diluyeron y se utilizaron para volver a infectar células MDCK a la misma UFP/ml después de la preincubación con el fármaco a la CI50. A medida que cada ronda de reinfección continúa bajo presión farmacológica, hay una mayor probabilidad de selección para poblaciones resistentes. C179 se evaluó como un agente de control, ya que es un agente anti-gripe conocido que se dirige a la región del tallo de HA (Okuna et al., J Virol 1993).
[0712] Un ejemplo que utiliza dos anticuerpos del tallo anti-HA de control, AB1 y C179 (Takara), se muestra en la figura 11. La concentración de ambos anticuerpos se mantuvo en 1 pg/ml (niveles de CI50 de partida para ambos). Después de 5 rondas de pase en presencia de C179, pero no en presencia de AB1, se recuperaron los títulos virales de PR8, lo que sugiere que, en condiciones dadas, PR8 es resistente a escapar de la inhibición de AB1, pero no de la de C179.
[0713] Tanto AB1 como C179 inhibieron la propagación de PR8 en células MDCK, sin embargo, esta inhibición se perdió durante cinco rondas de pase con el tratamiento de C179, mientras se retuvo durante el tratamiento con AB1. PR8 pasado por el fármaco se purificó en placas para aislar diez placas que se secuenciaron para HA para confirmar que AB1 no estaba generando poblaciones resistentes minoritarias.
[0714] Estos resultados indicaron que el tratamiento de células con AB1 impidió la producción de mutantes de escape durante al menos cinco rondas de infectividad.
Ejemplo 6. Inhibiciones de la fusión celular mediada por H5 por anticuerpos anti-HA
[0715] Se evaluaron las capacidades de Ab 032 y Ab 044 para bloquear la fusión célula-célula. Brevemente, el ensayo utiliza células HEK293 que expresan y muestran de forma estable H5 (Viet04). La hemaglutinina anclada a la membrana se puede inducir la conversión en su conformación de fusión mediante una breve exposición (3 minutos) a pH bajo (5,0). A continuación, sigue un periodo de incubación de 3 horas para permitir que las células se recuperen y se fusionen para formar sincitios. Se usa una tinción nuclear para facilitar la visualización de estos productos de fusión, y su recuento se utiliza como un indicador de la actividad de fusión. El anticuerpo de prueba se añade antes o después del tratamiento a pH bajo para determinar con qué fase del proceso de fusión interfiere.
[0716] Se añadió Ab 032 o Ab 044 a los niveles indicados a cultivos en placas de 96 pocillos de células HEK293 que mostraban el H5 de superficie (Viet04) 1 hora antes o inmediatamente después de la inducción de HA en su conformación de fusión a un pH bajo (5,0) o pH neutro de 3 minutos (7,0; control). Después de la inducción de 3 minutos para estimular la fusión celular, el tampón se reemplazó con medio de cultivo completo (pH 7,4), y las células se dejaron recuperar y fusionar durante un período de incubación de 2-3 horas. Los cultivos celulares se trataron con Ab 032 a 0, 10 o 100 pg/ml o con Ab 044 a 0, 0,2, 0,78, 3,13, 12,5 o 50 pg/ml, ya sea antes o después de la inducción de fusión a pH bajo o tratamiento con tampón de control a pH neutro. Después, las células se fijaron y sus núcleos se tiñeron con Hema-3. El grado de fusión celular se midió por la cantidad de sincitios observados bajo la lente del microscopio (20X) por campo (figura 15).
[0717] Como se muestra en la figura 15, Ab 032 es eficaz para inhibir la fusión celular solo cuando se añade al cultivo celular antes de la activación de HA a pH bajo.
[0718] Como se muestra en la figura 18, la formación de sincitios entre células que expresan HA se inhibió con el pretratamiento de Ab 044 de una manera en respuesta a la dosis. El resultado indicó que Ab 044 fue capaz de bloquear la fusión mediada por HA si estaba presente antes de la exposición a tampón de pH bajo, presumiblemente mediante la unión a HA y evitando su conversión en la conformación activa/fusogénica. Ab044 no inhibe la aglutinación de tRBC por el virus H1N1.
Ejemplo 7. Efecto profiláctico y terapéutico de anticuerpos anti-HA en un modelo de coinfección murina [0719] La administración terapéutica de Ab 032 y Ab 028 rescató ratones expuestos a H1N1 y H3N2.
[0720] Para evaluar el efecto de los anticuerpos anti-HA in vivo, se utilizó un modelo de ratón de coinfección (McCullers, "Effect of Antiviral Treatment on the Outcome of Secondary Bacterial Pneumonia after Gripe" Jour. Infect. Dis. 190:519-526, 2004). En resumen, el día cero, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se expusieron por vía intranasal a gripe H1N1 a 100 UFP/cabeza en un volumen de 50 pl de PBS. El día 7 después de la infección viral, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se expusieron por vía intranasal a Streptococcus pneumoniae a una dosis de 200 UFC/cabeza en un volumen de 50 |jl de PBS. A los animales se les administró el fármaco mediante tratamiento intraperitoneal (IP) en un volumen de 200 j l los días como se indica en la Tabla 11. Debido a que el régimen de anestesia puede contribuir a la patología, todos los ratones se anestesiaron en ambas etapas de infección. Los pulmones se extrajeron el día cuatro después de la infección viral para la determinación de la carga viral y el día once después de la infección viral para la determinación de la carga bacteriana. Los pulmones se almacenaron a -80 °C hasta el momento en el que todas las muestras se pudieron analizar para detectar las cargas virales y microbianas, respectivamente. Se registraron diariamente el peso y la puntuación corporal de los animales. Los animales se sacrificaron tras la pérdida de peso considerable (>20 %) junto con indicadores físicos de enfermedad tales como piloerección.
[0721] Se proporciona un esquema del diseño experimental en la Tabla 11 a continuación. El grupo de control negativo se coinfectó, pero no recibió ningún agente distinto de PBS. Se utilizó ribavirina, un inhibidor conocido de H1N1, como control positivo de la actividad antiviral. Se utilizó azitromicina, un inhibidor conocido de Streptococcus pneumoniae, como control positivo de la actividad antibacteriana. Se administró Ab 032 como profilaxis en una dosis única 24 h antes de la infección a 10 mg/kg o como terapia en una dosis única 48 h después de la infección a 10 mg/kg. Se administró Ab 028 a 10 mg/kg como terapia en una dosis única 48 h después de la infección.
T =11=D^ ^ ^ ri^ ^ l= =m l = i^ ^nm rin i
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[0722] Se generaron curvas de supervivencia para describir el resultado experimental. El tratamiento con ribavirina no logró rescatar a los animales de la muerte, mientras que la terapia con Ab 028 dio como resultado una supervivencia del 100 % (figura 16). Ab 032, ya sea como profilaxis o como terapia a 10 mg/kg, protegió al 80 % de los ratones de la muerte debido a una infección neumocócica secundaria, a pesar de que no comprendía actividad inhibidora antibacteriana directa (figuras 9A, 9B y 9C).
[0723] En conjunto, Ab 028 y Ab 032 no solo pueden afectar el daño inducido por virus, sino también prevenir complicaciones de infecciones bacterianas secundarias y oportunistas, tales como por Streptococcus pneumonia. Ejemplo 8. Eficacia profiláctica y terapéutica de los anticuerpos anti-HA AB1 y A18 en modelos de ratón de H1N1yH3N2
[0724] La eficacia profiláctica y terapéutica de los anticuerpos anti-HA AB1 y A18 se investigó en los modelos de ratón H1N1 y H3N2 esencialmente de la misma manera que se describe en el Ejemplo 10.
[0725] Los resultados se muestran en las figuras 7A-7B. AB1 y A18 fueron eficaces a 10 mg/kg contra H1N1 (PR8) cuando se administraron a ratones 48 h después de la infección (figura 7A).
[0726] A18 también fue eficaz a 10 mg/kg contra H3N2 (Vic75) cuando se administró a ratones como profilaxis o 48 h después de la infección (figura 7B).
Ejemplo 9. Eficacia profiláctica y terapéutica de los anticuerpos anti-HA Ab 028, Ab 031 y Ab 032 en modelos de ratón de H1N1 y H3N2
[0727] La eficacia profiláctica y terapéutica de los anticuerpos anti-HA Ab 028, Ab 031, y Ab 032 se investigó en los modelos de ratón H1N1 y H3N2 esencialmente de la misma manera que se describe en el Ejemplo 10.
[0728] Los resultados se muestran en las figuras 8A-8B. La figura 8A indica el tiempo de supervivencia de ratones infectados con H1N1 a los que se les administró terapia con anticuerpos contra HA 48 horas después de la infección. La figura 8B indica el tiempo de supervivencia de ratones infectados con H3N2 a los que se les administró terapia con anticuerpos contra HA 48 horas después de la infección.
Ejemplo 10. Eficacia profiláctica y terapéutica del anticuerpo anti-HA Ab 044 en modelos de ratón de H1N1 y H3N2
[0729] Se realizaron experimentos in vivo para investigar el potencial del agente Ab 044 como terapia y profilaxis en los modelos de ratón letales de H1N1 y H3N2. Se utilizó un diseño de respuesta a la dosis para discriminar las cantidades mínimas de fármaco necesarias para la eficacia terapéutica. Ab 044 a veces se denomina en el presente documento G044, G44 o Ab044,
[0730] Brevemente, los modelos de ratón de H1N1 y H3N2 fueron letales con una dosis de exposición de PR8 a 100 UFP/cabeza y de Victoria a 10.000 UFP/cabeza. Los ratones se anestesiaron con isoflurano y se expusieron IN a una suspensión viral de 50 ul. A los animales se les administró el agente IP en un volumen de 200 ul, (a) como profilaxis un día antes de la infección, (b) como terapia dos días después de la infección, o (c) como terapia tres días después de la infección. El peso y la apariencia de los animales se registraron diariamente. Los animales se sacrificaron tras la pérdida de peso considerable (>20 %) junto con una puntuación corporal alta que indicaba enfermedad. Los pulmones se extrajeron de algunos animales el día cuatro después de la infección para la determinación de la carga viral mediante ensayo en placas. Además, los pulmones el día ocho se sometieron a examen histológico. El estudio se completó de la siguiente manera (Tabla 12).
=
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Resumen de resultados
[0731] En modelos de exposición a gripe letales contra H1N1 (A/Puerto Rico/08/1934; virus del Grupo 1) o H3N2 (A/Victoria/03/1975; virus del Grupo 2), una sola inyección de Ab 044 a 10 mg/kg (48 horas después de la infección) o 20 mg/kg (72 horas después de la infección) conduce al 100 % de supervivencia de los ratones (n = 5 por grupo) si se administra terapéuticamente. La supervivencia está correlacionada con las métricas secundarias, incluyendo la caída en el título viral y la reducción en la pérdida de peso inducida por virus y la puntuación corporal.
[0732] En modelos de exposición a gripe letales contra H1N1 (A/Puerto Rico/08/1934) o H3N2 (A/Victoria/03/1975), una sola inyección de Ab 044 de hasta 10 mg/kg (24 horas antes de la infección conduce al 100 % de protección de los ratones (n = 5 por grupo) si se administra profilácticamente. La supervivencia está correlacionada con las métricas secundarias, incluyendo la caída en el título viral y la reducción en la pérdida de peso inducida por virus y la puntuación corporal.
[0733] A continuación, se presentan los resultados experimentales detallados.
Resultados de H1N1
[0734] Señales visuales. Los animales se monitorizaron a diario para detectar signos de enfermedad (pelaje erizado, encorvamiento). La puntuación visual refleja el promedio del grupo; aquí, las líneas sin marcadores puntuales reflejan el promedio de supervivientes en recuperación.
[0735] Los ratones que se expusieron a H1N1 parecían enfermos tres días después de la infección y se sacrificaron el día siete, como se esperaba. Los ratones que se expusieron a H1N1 y se trataron con ribavirina mostraron signos insignificantes de enfermedad y se recuperaron completamente. Los ratones que se trataron con Ab 044 un día antes de la exposición a 2,5 mg/kg o 10 mg/kg no presentaron signos de enfermedad. Los ratones que se trataron con Ab 044 un día antes de la exposición a 0,6 mg/kg presentaron signos de enfermedad; 60 % de recuperación.
[0736] El agente Ab 044 se administró en respuesta a la dosis dos días después de la infección. Los animales que recibieron 10 mg/kg mostraron pocos signos de enfermedad, mientras que los animales que recibieron 2,5 mg/kg o 0,6 mg/kg enfermaron bastante, con algunas muertes contadas en ambos grupos. El agente Ab 044 también se administró a 20 mg/kg tres días después de la infección; estos animales se beneficiaron de la terapia, con una clara diferencia entre los animales tratados y los no tratados el día seis, y la recuperación completa el día siete.
[0737] También se monitorizó la pérdida de peso de los animales. El cambio de peso refleja el promedio del grupo; aquí, las líneas sin marcadores puntuales reflejan el promedio de supervivientes en recuperación.
[0738] Los ratones que se expusieron a H1N1 perdieron >20 % de peso el día siete y se sacrificaron, como se esperaba. Los ratones que se expusieron, pero se trataron con ribavirina a 75 mg/kg una vez al día durante tres días presentaron <10 % de pérdida de peso y se recuperaron. Los ratones que se trataron con Ab 044 un día antes de la exposición a 2,5 mg/kg o 10 mg/kg no presentaron pérdida de peso o aumentaron de peso con el tiempo. Los ratones que se trataron con profilaxis con Ab 044 a 0,6 mg/kg perdieron una cantidad sustancial de peso, perdiendo tres de cinco animales >16 % de peso corporal; se sacrificaron dos de cinco animales (figura 19A).
[0739] La terapia de Ab 044 se administró en respuesta a la dosis. Los animales que recibieron 10 mg/kg presentaron el 10 % de pérdida de peso y se recuperaron. Los animales que recibieron 2,5 mg/kg perdieron un peso sustancial y cuatro de cinco animales perdieron >16 % de peso corporal; tres animales se sacrificaron. Todos menos un animal que recibió 0,6 mg/kg perdieron >20 % de peso corporal y se sacrificaron (figura 19B).
[0740] En resumen, la profilaxis con Ab 044 un día antes de la exposición evitó la muerte por infección por H1N1 cuando se administró a >2,5 mg/kg. La terapia con Ab 044 dos días después de la infección rescató a los ratones de la muerte cuando se les administró a 10 mg/kg, mientras que la terapia con Ab 044 tres días después de la infección a 20 mg/kg fue completamente eficaz.
[0741] Carga viral. Las cargas virales pulmonares cuatro días después de la infección por H1N1 se evaluaron en un único ensayo de placas (Tabla 13). Las reducciones en la carga viral pulmonar fueron más sustanciales de lo esperado en tres grupos: ribavirina, profilaxis con Ab 044 a 10 mg/kg, y profilaxis con Ab 044 a 2,5 mg/kg. Las cargas virales en las muestras se confirmaron mediante un ensayo de placas repetido y después de nuevo mediante qPCR (datos no mostrados) y, por lo tanto, se informan aquí.
T l =1 = r2 r l= lm n r n=r n = r = í = = =l x i i n==Hl 1=PR
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[0742] Se realizaron comparaciones entre los grupos de tratamiento para evaluar la significancia de las reducciones en la carga viral pulmonar. Se determinó la significancia (p<0,05) de la prueba U de Mann Whitney. La carga viral pulmonar en todos los grupos de tratamiento fue significativamente diferente de la del grupo no tratado, con la excepción de la terapia con Ab 044 a 0,6 mg/kg a las 48 h, que no fue diferente de sin tratamiento.
Resultados de H3N2
[0743] Señales visuales. Los animales se monitorizaron a diario para detectar signos de enfermedad (piloerección, encorvamiento).
[0744] Los ratones que se expusieron a H3N2 parecían enfermos tres días después de la infección y se sacrificaron el día siete, como se esperaba. Los ratones que se expusieron a H3N2 y se trataron con ribavirina no mostraron signos de enfermedad y se recuperaron completamente, como se esperaba. Los ratones que se trataron con Ab 044 un día antes de la exposición a 10 mg/kg no presentaron signos de enfermedad.
[0745] El agente Ab 044 se administró en respuesta a la dosis dos días después de la infección. Los animales que recibieron terapia a >2,5 mg/kg presentaron una enfermedad insignificante y se recuperaron por completo. Los ratones que recibieron terapia a 0,6 mg/kg no se distinguían de los ratones en el grupo no tratado, con enfermedad grave y eutanasia requerida para el día siete. El agente Ab 044 también se administró a 20 mg/kg tres días después de la infección; estos animales se beneficiaron de la terapia, con una clara diferencia entre los animales tratados y los no tratados el día cuatro, y la recuperación completa el día seis.
[0746] También se monitorizó la pérdida de peso de los animales (figuras 20A-20B).
[0747] Todos los ratones que se expusieron a H3N2 perdieron >10 % de peso el día cinco y se sacrificaron con >20 % de pérdida de peso el día siete. Los ratones que se expusieron, pero se trataron con ribavirina a 75 mg/kg una vez al día durante tres días presentaron <10 % de pérdida de peso y se recuperaron. Los ratones que se trataron con Ab 044 un día antes de la exposición a 10 mg/kg aumentaron de peso con el tiempo (figura 20A).
[0748] La terapia de Ab 044 se administró en respuesta a la dosis. Los animales que recibieron 10 mg/kg presentaron <10 % de pérdida de peso y se recuperaron. Los animales que recibieron 2,5 mg/kg perdieron >10 % de peso, pero se recuperaron. Los animales que recibieron 0,6 mg/kg perdieron >20 % de peso corporal y se sacrificaron (figura 20B).
[0749] Carga viral. Las cargas virales pulmonares cuatro días después de la infección por H3N2 se evaluaron en un único ensayo de placas (Tabla 15).
T l =^ = r2 r l lm n r n=r n = r = í = = x i n==H 2
Figure imgf000115_0001
[0750] Se realizaron comparaciones entre los grupos de tratamiento para evaluar la significancia de las reducciones en la carga viral pulmonar. Se determinó la significancia (p<0,05) de la prueba U de Mann Whitney. La carga viral pulmonar en todos los grupos de tratamiento fue significativamente diferente de la del grupo no tratado, con dos excepciones. Las cargas virales pulmonares después de la terapia con Ab 044 a las 48 h a 2,5 mg/kg o 0,6 mg/kg no fueron diferentes de las no tratadas.
Correlación entre las actividades in v itro e in vivo .
[0751] El agente Ab 044 mostró actividad reproducible in vitro contra H1N1 PR8 y H3N2 X31 (Tabla 17).
Figure imgf000115_0002
[0752] La actividad in vitro se ha traducido en actividad in vivo en ambos modelos. La carga viral pulmonar el día cuatro proporcionó una instantánea del estado de la infección (figuras 21A-21B) y demostró una reducción significativa (p<0,05) en la carga viral atribuible a diversas estrategias de tratamiento con Ab 044.
[0753] Se tomó una segunda instantánea de la infección cuando se extrajeron los pulmones para su examen histológico el día ocho (Tablas 14 y 16). La administración de Ab 044 a 10 mg/kg como profilaxis un día antes de la exposición disminuyó sustancialmente la gravedad de la necrosis e inflamación atribuible a la infección por H1N1. La administración terapéutica de Ab 044 a 10 mg/kg dos días después de la infección no tuvo un efecto claro sobre la alteración de la estructura pulmonar fina atribuible a infecciones por H1N1 o H3N2. Se esperaba que tanto la profilaxis con Ab 044 como la terapia redujeran visiblemente la inflamación y necrosis asociadas con la infección por gripe. En cambio, parece haber un componente temporal, de modo que la administración de Ab 044 antes de la infección altera la cascada de citocinas con su reclutamiento de glóbulos blancos y la inflamación y necrosis resultantes, mientras que la administración de Ab 044 después de la infección afecta mínimamente al resultado.
[0754] Curvas de supervivencia generadas para el modelo H1N1. La profilaxis con Ab 044 dio como resultado una supervivencia del 100 % a pesar de la exposición letal cuando se administró a >2,5 mg/kg un día antes de la infección (figura 22A). Se observó un 100 % de supervivencia de animales infectados letalmente con terapia con Ab 044 dos días después de la infección a 10 mg/kg o terapia con Ab 044 tres días después de la infección a 20 mg/kg (figura 22B).
[0755] Curvas de supervivencia generadas para el modelo H3N2. La profilaxis con Ab 044 a 10 mg/kg dio como resultado un 100 % de supervivencia (figura 23A). Se observó un 100 % de supervivencia de animales infectados letalmente con terapia con Ab 044 dos días después de la infección a >2,5 mg/kg o terapia con Ab 044 tres días después de la infección a 20 mg/kg (figura 23B).
[0756] En resumen, Ab 044 fue eficaz en los modelos de ratón de H1N1 y H3N2 (Tabla 18). La administración de profilaxis con Ab 044 a 2,5 mg/kg o más dio como resultado una supervivencia del 100 % en el modelo de H1N1, una dosis que probablemente también lograría una supervivencia del 100 % en el modelo de H3N2. La administración de terapia con Ab 04448 h después de la infección a 10 mg/kg contra la infección por H1N1 y a >2,5 mg/kg contra la infección por H3N2 logró una supervivencia del 100 %. La administración de la terapia con Ab 044 a 20 mg/kg tres días después de la infección rescató al 100 % de los animales infectados con H1N1 y H3N2.
T l 1 Efi i n l nfBA 44 nm l =r íL f
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Ejemplo 11. Eficacia profiláctica y terapéutica del anticuerpo anti-HA Ab 044 en un modelo de ratón con virus de gripe aviar A altamente patógeno
[0757] Se ensayó Ab 044 para determinar su eficacia en un modelo de ratón de H5N1 de gripe A aviar altamente patógena.
[0758] El objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia de los regímenes de dosificación tanto profilácticos como terapéuticos de Ab 044. Los parámetros/criterios de valoración a evaluar incluyeron: pérdida de peso (evaluada todos los días durante 21 días), reducción del título pulmonar del virus el día 4 después de la exposición al virus, y mortalidad.
Materiales y procedimientos
[0759] Animales: Se obtuvieron ratones hembra BALB/c de 17-20 g de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) para este estudio. Se mantuvieron en Wayne Lab Blox y con agua del grifo a voluntad. Se pusieron en cuarentena durante 24 h antes de su uso.
[0760] Virus: El virus de gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) se obtuvo de la Dra. Jackie Katz de Centers for disease control. Los ratones expuestos a dosis letales del virus (5 MLD50, 5 UFP/ratón) generalmente mueren entre los días 8-13.
[0761] Diseño experimental: A grupos de ratones se les administró por vía intraperitoneal (i.p.) Ab 044 una vez (qd) 24 h antes de la exposición al virus con dosis de Ab 044 a 20, 10 o 5 mg/kg. Cinco de estos ratones se sacrificaron el día 4 para determinar la extensión de la patología pulmonar macroscópica observable, la extensión del edema pulmonar en forma de aumento del peso pulmonar, y para determinar los títulos pulmonares del virus. Los ratones restantes se observaron para determinar la mortalidad o para determinar eventos adversos hasta el día 21 después de la exposición al virus. Trece ratones se trataron con 20 mg/kg de Ab 04424 h después de la exposición al virus y 13 ratones se trataron con 20 mg/kg de Ab 04448 h después de la exposición al virus, sacrificándose 4 ratones de cada grupo el día 4 después de la exposición al virus como se ha descrito anteriormente, y el resto se mantuvo en observación para determinar la muerte o eventos adversos hasta el día 21 después de la exposición al virus. Otros 7 ratones recibieron oseltamivir a 30 mg/kg/d, dos veces al día durante cinco días (bid X 5) a partir del momento 0; observando la mortalidad o los eventos adversos hasta el día 21 después de la exposición al virus. También se trataron veinte con PSS 48 h después de la exposición al virus, y 5 de estos se sacrificaron para determinar los títulos pulmonares el día 4. Estos ratones representaban los controles con placebo. Los ratones se pesaron todos los días hasta el día 21, o hasta la muerte, comenzando justo antes de la exposición al virus.
[0762] Determinación del título del virus pulmonar: Cada pulmón de ratón se homogeneizó en solución de MEM y se ensayó por triplicado para determinar el virus infeccioso en células MDCK. Las muestras de cada grupo de prueba se titularon por triplicado.
[0763] Análisis estadístico: La normalidad de los pesos animales se ensayó mediante la prueba de normalidad ómnibus de D'Agostino & Pearson. Al encontrar que los datos de peso se ajustaban a una distribución gaussiana, se realizaron inferencias estadísticas mediante análisis de varianza bidireccional seguido de comparaciones por pares utilizando las pruebas posteriores de Bonferroni para comparar cada grupo de tratamiento con el tratamiento con placebo. El análisis de supervivencia se realizó utilizando el procedimiento gráfico Kaplan-Meier y una prueba de rango logarítmico. Este análisis reveló diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. Por lo tanto, las comparaciones por pares de curvas de supervivientes (PSS frente a cualquier tratamiento) se analizaron mediante la prueba de Gehan-Breslow Wilcoxon para determinar qué grupo de tratamiento difería significativamente del grupo placebo, y la significación relativa se ajustó a un umbral de significación corregido por Bonferroni para el número de comparaciones de tratamiento realizadas.
[0764] Las relaciones de riesgo (HR), que comparan la rapidez con la que los grupos de ratones tratados mueren en relación con los grupos de control no tratados de ratones, se determinaron mediante las pruebas de Mantel-Haenszel como parte del programa de análisis de supervivencia utilizado anteriormente (GraphPad Prism® para MAC v5). La prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba posterior de Dunn para evaluar comparaciones por pares significativas, se utilizó para detectar diferencias significativas en el día medio de muerte entre los grupos de tratamiento y los ratones tratados con placebo. Las diferencias en las relaciones de ratones vivos/ratones totales para los grupos de tratamiento se analizaron usando análisis de tabla de contingencia, y se realizaron comparaciones por pares con el grupo tratado con placebo mediante las pruebas exactas de Fisher.
[0765] Los títulos pulmonares del virus de cada grupo de tratamiento se compararon con los controles no tratados mediante el análisis de la varianza en los valores transformados logarítmicamente suponiendo la misma varianza y distribución normal. Cuando se alcanzó la significancia a P<0,05 mediante el análisis de ANOVA de todos los tratamientos, los valores de tratamiento individuales se compararon entonces con el control de PSS utilizando pruebas de comparación por pares de Newman-Keuls.
Resumen de resultados
[0766] En un modelo de exposición letal a gripe contra el H5N1 (A/Vietnam/1203/2004; virus del Grupo 1), una sola inyección de Ab 044 a 10-20 mg/kg (24 horas antes de la infección) o 20 mg/kg (hasta 72 horas después de la infección) conduce al 100 % de supervivencia de los ratones (n = 5 por grupo) si se administra terapéuticamente. La supervivencia está correlacionada con las métricas secundarias, incluyendo la caída en el título viral y la reducción en la pérdida de peso inducida por virus y la puntuación corporal. En este mismo experimento, 30 mg/kg de oseltamivir, administrados dos veces al día durante 5 días, dieron como resultado sólo un 60 % de supervivencia.
[0767] Se observaron los ratones tratados con Ab 044 a 10 mg/kg durante 14 días. Los ratones tratados con Ab 044 no perdieron peso ni mostraron signos visibles de estrés. El análisis histológico se realizó en los pulmones extraídos el día 8, donde los tejidos se puntuaron basándose en la necrosis observada o signos de inflamación. No se observó necrosis ni inflamación en los tejidos de ratones tratados con Ab 044.
[0768] A continuación, se presentan los resultados experimentales detallados.
Resultados
[0769] Los datos de peso mostrados en la figura 24 sugieren que el compuesto fue bien tolerado incluso en ratones infectados, ya que los ratones tratados con Ab 044 no perdieron cantidades significativas de peso en comparación con los pesos iniciales de estos ratones tratados. Además, los ratones infectados tratados con Ab 044 se protegieron significativamente contra la pérdida de peso debido a la infección por virus en todas las concentraciones de Ab 044 utilizadas desde los días 7 a 12 después de la exposición al virus independientemente del régimen de dosificación utilizado (figura 24, Tabla 19; P<0,01-P<0,001). La única excepción a esta generalización fue el grupo de ratones que se trató con Ab044 a 5 mg/kg/d (qd X 1, beg. -24 h) el día 12 después de la exposición al virus. Especialmente notable sobre la falta de pérdida de peso fue el hecho de que los ratones tratados con las dosis de 20 mg/kg no perdieron peso en absoluto y la mayoría de los ratones incluso habían ganado peso en comparación con su peso inicial al final del experimento. Esto se correlacionó muy bien con el hecho de que los ratones que recibieron Ab 044 a 20 mg/kg después de la exposición al virus sobrevivieron a la infección (figura 25). De hecho, cantidades significativas (90-100 %) de ratones sobrevivieron a la infección en cada grupo de tratamiento que recibió Ab 044 independientemente de la dosis y el régimen de tratamiento utilizado (P<0,0001).
T l 1 T l if r n i i nifi i il r n l fi r 24
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[0770] Aunque solo el 60 % de los ratones tratados con oseltamivir sobrevivieron a la infección, esta tasa de supervivencia fue significativamente diferente del grupo de ratones infectados no tratados (P = 0,0055). En el pasado, cuando los ratones infectados con H5N1 han sido tratados con oseltamivir a 30 mg/kg/d durante ocho días en lugar de los cinco días como se hizo en el estudio actual, el 90-100 % de los ratones tratados durante el periodo más largo de tiempo sobrevivieron a la infección por el virus con poca o ninguna pérdida de peso. La pérdida de peso en estudios anteriores fue significativamente menor que en ratones infectados no tratados, a diferencia de la pérdida de peso detectada los días 9, 10 y 12 después de la exposición al virus en el estudio actual (figura 24, Tabla 19).
[0771] Curiosamente, fue durante el periodo de tiempo de los días 9-12 posteriores a la exposición al virus que los ratones en el grupo de ratones tratados con oseltamivir sucumbieron a la infección por el virus en el estudio actual (figura 25).
[0772] El tratamiento de ratones con Ab 044 no solo protegió significativamente a los ratones contra la muerte según lo medido por los supervivientes totales (Tabla 20, columna Vivos/Total, P <0,0019), sino que los tratamientos también afectaron profundamente a la cinética de la muerte; los ratones tratados con Ab 044 tuvieron 11-38 veces menos probabilidades de morir tan rápidamente de infección por el virus, si es que murieron, que los ratones infectados no tratados (Tabla 20, relaciones de riesgo). Además, para la mayoría de los regímenes de tratamiento con Ab 044, el único ratón que sucumbió a la infección en cada grupo lo hizo uno o dos días después en comparación con los ratones que murieron en el grupo de placebo (PSS) (Tabla 20, véase día medio de muerte).
Tabla 20. Efectos de Ab 044 en diversos parámetros de mortalidad medidos para ratones BALB/c infectados con una _________________________ dosis letal del virus H5N1 de gripe A/Vietnam/1203/2004________________________ Animales: Ratones BALB/c hembra
de 17-20 g Programa de tratamiento: Variable
Virus: A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)
1 DL90 Tratamientos:
Vía del virus: i.n. Ab 044
Duración del experimento: 21 días Oseltamivir
Vía de tratamiento: i.p.
Tratamiento Vivos/Total Día medio de muerte Mediana de Relación de ± DEa supervivencia riesgo (CI al (días)b 95 %)c
PSS 0/15 11,3 ± 1,8 11,5 -Ab 044 (20 mg/kg/d, qd X 1, -24 h) 9/10** 10,0 ± 0,0 Sin definir 10,9 (3,9-32,3) Ab 044 (10 mg/kg/d, qd X 1, -24 h) 9/10** 12,0 ± 0,0 Sin definir 14,2 (4,7-42,6) Ab 044 (5 mg/kg/d, qd X 1, -24 h) 9/10** 13,0 ± 0,0 Sin definir 15,74 (5,3-46,7) Ab 044 (20 mg/kg/d, qd X 1, 24 h) 9/9tt >21 *** Sin definir 38,0 (12,2-116,6) Ab 044 (20 mg/kg/d, qd X 1, 48 h) 9/9tt >21 *** Sin definir 38,0 (12,2-116,6) (continuación)
Tratamiento Vivos/Total Día medio de muerte Mediana de Relación de ± DEa supervivencia riesgo (CI al (días)b 95 %)c
Oseltamivir (30 mg/kg/d, bid X 5, 0 h) 4/7* 11,3 ± 0,6 Sin definir 4,8 (1,6-14,3) aTiempo promedio hasta la muerte entre los animales que sucumben a la infección.
bEl tiempo en el que la supervivencia fraccionada es igual al 50 %. (es decir, el tiempo calculado en el que la mitad de los sujetos han muerto y la mitad siguen vivos).
cLas relaciones de riesgo se calculan en relación con el placebo.
Vivos/Total: * P = 0,02, ** P = 0,0019 frente a Placebo, tt P = 0,0014 frente a Placebo. Día medio de muerte: *** P<0,001 frente a Placebo.
[0773] No se detectó patología pulmonar macroscópica o edema el día 4 después de la exposición al virus, porque estos fenómenos relacionados con la infección se observan generalmente el día 8 o posterior después de la exposición al virus en el modelo de ratón de H5N1. Sin embargo, los títulos pulmonares del virus se redujeron significativamente en ratones tratados con dosis de Ab 044 de 10 mg/kg o más independientemente de cuándo se administró Ab 044 (Tabla 21, P<0,05, P<0,01). Los títulos pulmonares del virus de ratones tratados con 5 mg/kg de Ab 044 fueron menores, pero estadísticamente similares a los títulos pulmonares del virus detectados en los pulmones de ratones del grupo de placebo.
[0774] Por lo tanto, la reducción de los títulos pulmonares del virus al inicio de la infección mediante el tratamiento con Ab 04424 h después de la exposición al virus probablemente redujo la cantidad de antígeno producido que fue capaz de inducir una respuesta hiperinflamatoria patógena característica de las infecciones pulmonares por H5N1 en ratones (Otte et al., Am J Pathol 179:230-239 (2011)). Sin embargo, los datos del título del virus del tratamiento que comienza 48 h después de la exposición al virus aparentemente podrían contradecir esa hipótesis, ya que los títulos del día 4 para ese grupo de ratones estaban cerca de los niveles de los ratones tratados con placebo. Puede ser que el tratamiento a las 48 h mantuviera los títulos suficientemente bajos durante las siguientes 24 h para evitar una respuesta hiperinflamatoria al insulto original. También es posible que el compuesto no tuviera tiempo suficiente para ejercer su efecto antiviral entre 48 horas y el ensayo de título del virus del día 4, pero tenía actividad suficiente el día 9 cuando las muertes comenzaron a proteger a los ratones contra la muerte.
Tabla 21. Efectos de Ab 044 en el título del virus pulmonar medido para ratones BALB/c infectados con una dosis _________________________ letal del virus H5N1 de gripe A/Vietnam/1203/2004_________________________ Animales: Ratones BALB/c hembra de 17-20 g Programa de tratamiento: Variable
Virus: A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) 1 DL90 Tratamientos:
Vía del virus: i.n. Ab044
Duración del experimento: 21 días Oseltamivir
Vía de tratamiento: i.p.
Tratamiento Títulos de virus pulmonar ± DE
PSS 5,67 ± 0,49
Ab 044 (20 mg/kg/d, qd X 1, -24 h) 3,54 ± 0,91**
Ab 044 (10 mg/kg/d, qd X 1, -24 h) 3,01 ± 1,05**
Ab 044 (5 mg/kg/d, qd X 1, -24 h) 4,40 ± 0,62
Ab 044 (20 mg/kg/d, qd X 1, 24 h) 3,98 ± 0,98*
Ab 044 (20 mg/kg/d, qd X 1, 48 h) 5,24 ± 0,88
* P<0,05, ** P<0,01 frente a Placebo.
[0775] En conclusión, a dosis de 2,5 y 10 mg/kg, Ab 044 proporciona un 100 % de protección contra la exposición letal de H1N1 y H3N2, respectivamente. Además, cuando el anticuerpo monoclonal se administró hasta 72 horas después de la infección, fue completamente eficaz en el tratamiento de la infección con el 100 % de supervivencia para ambos subtipos de virus de H1N1 y H3N2. Ab 044, independientemente de la dosis o el régimen de dosificación utilizado (profiláctico o terapéutico), fue extremadamente eficaz en la protección de ratones BALB/c contra la muerte debido a una infección extremadamente letal con un virus H5N1 de gripe A aviar altamente patógeno. Además, los mismos regímenes de tratamiento con Ab 044 fueron extremadamente eficaces en la prevención de la pérdida de peso debido a la infección por virus y en la reducción significativa de los títulos pulmonares del virus del día 4.
Ejemplo 12. Ensayos de competencia para el mapeo de epítopos de anticuerpos
[0776] El análisis ELISA de competición se utiliza para evaluar si un anticuerpo monoclonal (mAbl) altera la capacidad de otro anticuerpo (por ejemplo, mAb2, o anticuerpo de prueba) para unirse a la diana. Para realizar el ensayo, se recubren placas NUNC Maxisorp de fondo plano de 96 pocillos (N.° de cat. 439454) con la hemaglutinina (HA) deseada diluida a 2 pg/ml en 1x PBS, 100 pl por pocillo. La placa se sella con una cubierta de placa y se deja incubar durante la noche a 4 °C estática. A continuación, las placas se lavan tres veces con 1x PBS Tween-20 al 0,05 % (PBST). Las placas recubiertas con HA se bloquean con 200 pl de Blotto al 5 % (Santa Cruz Biotechnology Cat. N.° sc-2325) en 1x PBS y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, las placas se lavan tres veces con PBST. A continuación, se añaden cien microlitros de mAb1 a los pocillos a la concentración de saturación (determinada previamente) y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavan para retirar el mAb1 no unido y el anticuerpo de prueba (mAb2) se diluye a la concentración inicial deseada en PBST y se carga en la placa. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas, se mantienen estáticas y después se lavan tres veces con PBST y se presionan para secarlas. El anticuerpo conjugado con HRP adecuado a la concentración deseada se diluye en PBST, y se cargan 100 pl de anticuerpo HRP por pocillo en todos los pocillos. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavan tres veces con PBST. La solución de TMB (KPL Cat. N.° 50-76-00) se prepara antes de su uso y se deja calentar a temperatura ambiente. Después, la solución de TMB se añade a la placa y se desarrolla hasta una DO máxima de entre 2 y 3 unidades de absorbancia a 650 nm como se lee en un lector de placas de 96 pocillos (SpectraMax M2e o similar). Una vez alcanzada la DO deseada, se lee la reacción inactivada con H2SO41 N y la DO a 450 nm. La DO se representa en función de la concentración y la Kd se calcula usando un ajuste de cuatro parámetros. La existencia de un epítopo superpuesto entre mAb1 y mAb2 estará indicada por una disminución significativa en la unión de mAb2 a HA en presencia de mAb1 con respecto a la observada en su ausencia (mAb1) en los pocillos de control.
Ejemplo 13: Realización y prueba de anticuerpos candidatos
Expresión recombinante del anticuerpo:
[0777] Para la expresión recombinante de una IgG1, las regiones Vh y Vl del anticuerpo pueden aislarse de linfocitos B, hibridomas o sintetizarse y subclonarse en plásmidos que contienen Ch 1-h2-h3 y Cl , respectivamente. La expresión recombinante del anticuerpo se puede llevar a cabo en células de mamífero tales como células de suspensión HEK 293-F FreeStyle (Invitrogen, Carlsbad, CA) cultivadas en medio de expresión 293-F FreeStyle (Invitrogen, Carlsbad, CA) mantenido a 37 °C, 80 % de humedad y 8 % de CO2. Las células (con >95 % de viabilidad) se transfectan con Poli-etileno-imina Max (PEI-MAX, PolySciences) con cantidades equivalentes de plásmidos que contienen HC y LC. Siete días después de la infección, las células se recogen haciendo girar las células a 4000 rpm durante 15 min a 4 °C y se filtran a través de un sistema de filtro de 0,45 pm (Nalgene) y se complementan con un cóctel inhibidor de proteasa diluido 1:1000 (Calbiochem).
[0778] El anticuerpo se purifica del sobrenadante usando una columna llena de resina de proteína A (Pierce) en un sistema FPLC purificador AKTA. El anticuerpo se eluye con un tampón de glicina-HCl 100 mM (pH 2,5) y el pH se neutraliza mediante la adición de NaCl 2,5 M Tri-base 1 M al 10 % (pH 8,5). A continuación, la muestra purificada se intercambia en tampón en 1x PBS (pH 7,4) y se concentra mediante ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) utilizando un filtro de centrifugación MWCO de 30 KDa (Millipore). El anticuerpo purificado se cuantifica utilizando el espectrofotómetro NanoDrop.
Ensayos de unión ELISA
[0779] La hemaglutinina recombinante se diluye a 2 pg/ml en PBS y se utilizan 100 pl para recubrir placas de microtitulación de 96 pocillos (Immuno™ Maxisorp, Nunc). Las placas se incuban a 4 °C durante una noche. Posteriormente, las placas se lavan tres veces con 1x PBS Tween-20 al 0,05 % (PBST) y después se bloquean con 200 pl de Blotto al 5 % (Santa Cruz Biotechnology) en 1x PBS durante 1 h. A continuación, las placas se lavan tres veces con PBST, se añade anticuerpo diluido en serie en PBST y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan posteriormente con PBST y la IgG1 unida se detecta usando 100 pl de anti-hIgG1 conjugado con HRP 1:1000. Después de 1 hora de incubación, las placas se lavan y la reacción se desarrolló usando una solución de TMB (KPL) y se detuvo mediante la adición de H2SO41 N. La absorbancia a 450 nm se mide usando d TMB en un lector de placas SpectraMax M2e.
Ensayos de m icroneutralización
[0780] El ensayo de neutralización in vitro se realiza utilizando el protocolo descrito por Sidwelly Huffman para probar la capacidad del anticuerpo para inhibir la infectividad del virus de gripe en células MDCK. Brevemente, el anticuerpo se prepara en diluciones semilogarítmicas comenzando con 500 pg/ml en una solución de MEM con 50 pg/ml de gentamicina. Cada dilución se añade a 5 pocillos de una placa de 96 pocillos con células confluentes. Tres pocillos de cada dilución se infectan con un título bajo de virus, y dos pocillos permanecen no infectados como controles de toxicidad. La ribavirina se incluye como control. Las placas se incuban durante 3-6 días hasta que los pocilios de control del virus alcanzan el efecto citopático máximo (CPE). A continuación, las placas se tiñen con colorante rojo neutro durante aproximadamente 2 horas, después el colorante sobrenadante se retira de los pocillos y el colorante incorporado se extrae en 50:50 de tampón citrato Sorensen/etanol, y la densidad óptica se lee en un espectrofotómetro. Las densidades ópticas se convierten en un porcentaje de controles celulares y se normalizan con respecto al control de virus, y se calculó la concentración del compuesto de prueba necesaria para inhibir el CPE en un 50 % (CE50) mediante análisis de regresión. La concentración del compuesto que causaría el 50 % de CPE en ausencia del virus se calculó de manera similar (CC50). El índice selectivo (Si) es la CC50 dividida por la CE50.
Equivalentes
[0781] Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en el presente documento.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de anticuerpo capaz de unirse a hemaglutinina (HA), que comprende:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia S-Y-A-M-H (SEQ ID NO:68);
una CDR2 que comprende la secuencia V-V-S-Y-D-G-N-Y-K-Y-Y-A-D-S-V-Q-G (SEQ ID NO:69); y
una CDR3 que comprende la secuencia D-S-R-L-R-S-L-L-Y-F-E-W-L-S-Q-G-Y-F-N-P (SEQ ID No :70); y
(b) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia Q-S-I-T-F-D-Y-K-N-Y-L-A (SEQ ID NO:145);
una CDR2 que comprende la secuencia W-G-S-Y-L-E-S (SEQ ID NO:72); y
una CDR3 que comprende la secuencia Q-Q-H-Y-R-T-P-P-S (SEQ ID nO:73).
2. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende uno o ambos de:
a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; y b) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:52,
opcionalmente en el que dicha molécula de anticuerpo comprende un tetrámero de:
dos segmentos de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada, comprendiendo cada uno la SEQ ID
NO: 25; y
dos segmentos de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera, comprendiendo cada uno la SEQ ID
NO: 52.
3. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en la que la molécula de anticuerpo es un
anticuerpo monocatenario (scFv), un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un anticuerpo IgG1, un
anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo que comprende dos regiones variables
de cadena pesada y dos regiones variables de cadena ligera.
4. La molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la molécula de anticuerpo
se une a un epítopo que tiene una, dos, tres, cuatro, cinco o cada una de las siguientes propiedades a)-f):
a) comprende uno, dos o todos los residuos de H3 HA1 N38, 1278 y D291;
b) comprende el residuo de H3 HA2 N12;
c) no comprende uno, dos o ninguno de los residuos de H3 HA1 Q327, T328 y R329;
d) no comprende uno, dos, tres, cuatro o todos los residuos de H3 HA2 G1, l2, F3, G4 y D46;
e) comprende uno, dos o todos los residuos de H3 HA1 T318, R321 y V323; o
f) comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o todos los residuos de H3 HA2 A7, E11, I18,
D19, G20, W21, L38, K39, T41, Q42, A43, I45, I48, N49, L52, N53, 156, y E57,
opcionalmente en la que el epítopo
(i) tiene las propiedades c) y d);
(ii) no comprende uno o ambos de:
cc) uno o ambos residuos de H1 HA1 Q328 y S329; y
dd) uno, dos, tres, cuatro o todos los residuos de H1 HA2 G1, L2, F3, G4 y D46; o
(iii) tiene las propiedades: a) o b); y c) o d).
5. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una
región variable de inmunoglobulina de cadena pesada y una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera de
la molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5.
7. Una célula huésped aislada que comprende:
(a) un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de
inmunoglobulina de cadena pesada y un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico
que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera; o
(b) un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de
inmunoglobulina de cadena pesada y una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera.
8. Un procedimiento para producir la molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende proporcionar una célula huésped de la reivindicación 7 y expresar los ácidos nucleicos en la célula huésped, produciendo así la molécula de anticuerpo.
9. Una molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso en la prevención o el tratamiento de una infección con un virus de gripe en un sujeto humano, opcionalmente en la que la gripe es gripe A, opcionalmente en la que el virus de gripe es:
(i) una cepa del Grupo 1;
(ii) una cepa del Grupo 2;
(iii) una cepa H1, H3, H5, H7 o H9; o
(iv) una cepa H1N1, H3N2 o H5N1.
10. La molécula de anticuerpo para su uso según la reivindicación 9, en la que el sujeto humano:
(i) tiene un alto riesgo de exposición al virus de gripe;
(ii) está inmunocomprometido, tiene 65 años o más, entre 6 meses y 18 años de edad, o padece una enfermedad crónica;
(iii) tiene o corre el riesgo de tener una infección bacteriana secundaria; o
(iv) se ensaya para determinar el virus de gripe, y/o
en la que la molécula de anticuerpo se utiliza:
(i) a una dosis de entre 1 mg/kg y 50 mg/kg;
(ii) a una dosis de entre 25 mg/kg y 50 mg/kg;
(iii) antes de una exposición conocida a la infección por el virus de gripe;
(iv) antes de la manifestación de un efecto o síntoma de la infección por el virus de gripe;
(v) después de una exposición conocida a la infección por el virus de gripe;
(vi) después de la manifestación de un efecto o un síntoma de la infección por el virus de gripe.
11. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 9 o 10 para su uso en combinación con un segundo agente, opcionalmente en la que el segundo agente se selecciona de una vacuna, un agente antiviral, un analgésico, un agente antiinflamatorio, un antibiótico, un agente esteroideo, un adyuvante, una proteasa, una glucosidasa, un inhibidor de neuraminidasa o análogo de nucleósido, aciclovir, ribavirina, amantadina, rimantadina, interferones alfa y otros interferones, zanamivir, oseltamivir, laninamivir, peramivir, o un segundo anticuerpo anti-HA, opcionalmente en la que el segundo anticuerpo anti-HA se selecciona de una molécula de anticuerpo que comprende un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25 y un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 155, una molécula de anticuerpo que comprende un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25 y un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 45, o una molécula de anticuerpo que comprende un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 24 y un segmento de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 45.
12. Un procedimiento para detectar un virus de gripe en una muestra biológica o determinar si un paciente está infectado con gripe, que comprende poner en contacto la muestra o una muestra del paciente con la molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y detectar la unión de la molécula de anticuerpo a la muestra o un polipéptido en la muestra, detectando así el virus de gripe en la muestra o determinar si el paciente está infectado con gripe.
13. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Un kit que comprende la molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y un vehículo o tampón de administración farmacéuticamente aceptable, un dispositivo de administración, o ambos.
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