ES2784523T3 - Profármacos de un compuesto inhibidor de JAK para el tratamiento de enfermedades inflamatorias gastrointestinales - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la fórmula (I): **(Ver fórmula)** donde n es 0, 1 o 2; R1 se elige entre hidrógeno, alquilo C1-4, alcoxi C1-3, amino, nitro, halo, ciano, hidroxilo y triflurometilo; cada R2, cuando está presente, se elige independientemente entre alquilo C1-4, alcoxi C1-3, amino, nitro, halo, ciano, hidroxilo y triflurometilo; R3 es hidrógeno, metilo o etilo; R4 es hidrógeno, metilo o etilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Profármacos de un compuesto inhibidor de JAK para el tratamiento de enfermedades inflamatorias gastrointestinales

ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCIÓN

Ámbito de la presente invención

La presente invención se refiere a compuestos diseñados para la administración selectiva de un inhibidor de JAK al tracto gastrointestinal. La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen dichos compuestos, a compuestos para usar en métodos de tratamiento de enfermedades inflamatorias gastrointestinales y a procesos y productos intermedios útiles para preparar tales compuestos.

Estado técnico

La enfermedad inflamatoria intestinal, que incluye principalmente la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn, implica la inflamación crónica del tracto gastrointestinal o de una parte del mismo. La colitis ulcerosa se caracteriza por la inflamación y la ulceración de la capa mucosa del recto y del intestino grueso, mientras que la enfermedad de Crohn afecta en gran medida al íleon, pero puede ocurrir en cualquier parte del tracto intestinal. Los síntomas comunes son diarrea, heces sanguinolentas y dolor abdominal. El curso clínico de la colitis ulcerosa es intermitente y se caracteriza por períodos alternos de exacerbación y remisión. La incidencia parece ser mayor en los países desarrollados que en los países en desarrollo. Se estima que en los principales países industrializados hay 1,3 millones de personas que padecen colitis ulcerosa y cabe esperar que las cifras aumenten con el crecimiento de la población. Los pacientes con colitis ulcerosa tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer colorrectal. (p.ej. Danese y otros, N Engl J Med, 2011, 365, 1713-1725). Asimismo se estima que 1 millón de personas en los países industrializados padecen la enfermedad de Crohn.

Si bien hay diversas opciones terapéuticas para promover y mantener la remisión de la colitis ulcerosa (CU) en los pacientes, ninguna es ideal. Los tratamientos relacionados con la sulfasalazina suelen ser efectivos para la CU leve, pero mucho menos cuando la enfermedad es moderada o grave. Los corticosteroides se usan a menudo para inducir rápidamente la remisión en pacientes con CU moderada hasta grave. Sin embargo, se desaconseja el uso crónico de esteroides para mantener la remisión debido a su relación con efectos adversos a más largo plazo (p.ej. osteoporosis y fracturas, infecciones, cataratas, cicatrización más lenta de las heridas y supresión de la producción hormonal de las glándulas suprarrenales). Los inmunosupresores sistémicos como la azatioprina, la ciclosporina y el metotrexato tienen un arranque lento y una eficacia discreta en pacientes con CU moderada hasta grave, pero el uso prolongado puede ser problemático debido a las consecuencias de la inmunosupresión sistémica a largo plazo (p.ej. un mayor riesgo de padecer infecciones y linfoma). Los anticuerpos anti-TNFa (p.ej. infliximab y adalimumab), aunque son caros y deben administrarse por vía subcutánea o intravenosa, son eficaces en aproximadamente el 60 al 70% de los pacientes de CU con enfermedad moderada a grave. Sin embargo, hasta un tercio de los pacientes no responden adecuadamente, mientras que otro tercio de los que responden inicialmente al tratamiento desarrollan tolerancia durante unas semanas (Allez y otros, J Crohn's Colitis, 2010, 4, 355-366; Rutgeerts y otros, N Engl J Med, 2005, 353, 2462-2476). La sustancia aprobada más recientemente para el tratamiento de la CU, el vedolizumab, un anticuerpo anti-integrina a4p7, es eficaz en pacientes con CU moderada hasta grave, aunque su ruta parenteral es subóptima y aún están por determinar las consecuencias de la inmunosupresión a largo plazo mediante este mecanismo. A pesar de las opciones terapéuticas existentes, entre un 10 y un 20% de los pacientes de CU todavía requiere colectomía dentro de los 10 años siguientes al diagnóstico (Targownik y otros, Am J Gastroenterol, 2012, 107, 1228-1235). Es evidente que sigue existiendo una necesidad médica insatisfecha de una terapia efectiva para promover y mantener la remisión de la CU moderada hasta grave sin los problemas de seguridad resultantes de la inmunosupresión crónica y sistémica.

Aunque el mecanismo subyacente a la colitis ulcerosa no está del todo entendido, se cree que los factores ambientales provocan en los individuos genéticamente susceptibles una reacción inapropiada (excesiva) del sistema inmunitario a la microbiota intestinal, que produce inflamación del colon, daño tisular y los síntomas característicos asociados a la enfermedad.

Aunque la patogenia precisa de la CU no está clara, es obvio que las citocinas proinflamatorias tienen un papel crucial en la respuesta inmunológica (Strober y otros, Gastroenterol, 2011, 140, 1756-1767). Los niveles elevados de muchas citocinas proinflamatorias que aparecen más frecuentemente en la CU (p.ej. de IL-4, IL-6, IL-13, IL-15, IL-23, IL-24, IFNy y leptina) dependen de la familia JAK de tirosina cinasas (es decir, JAK1, JAK2, JAK3 y Tyk2) para la transducción de señales. La unión del ligando a un receptor de citocinas desencadena la autofosforilación de su JAK asociado, que a su vez produce la fosforilación de una proteína transductora de señales y activadora de transcripción (STAT). Varias STAT forman hetero- u homodímeros que promueven la transcripción de sus genes diana en el núcleo celular para regular funciones tales como el crecimiento, la diferenciación y la muerte celular (Clark y otros, J Med Chem, 2014, 57, 5023-5038).

La inhibición de la familia de enzimas JAK podría inhibir la señalización de muchas citocinas proinflamatorias clave. Por consiguiente es probable que los inhibidores de JAK sean útiles para el tratamiento de la colitis ulcerosa y otras enfermedades inflamatorias, como la enfermedad de Crohn, la rinitis alérgica, el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Sin embargo, debido al efecto modulador de la vía JAK/STAT en el sistema inmunitario, la exposición sistémica a los inhibidores de JAK puede tener un efecto inmunosupresor sistémico adverso.

El citrato de tofacitinib (Xeljanz®), un pan-inhibidor de JAK sistémicamente disponible por vía oral, fue aprobado en los Estados Unidos en noviembre de 2012 para tratar a los adultos con artritis reumatoide activa moderada a grave que han tenido una respuesta inadecuada o son intolerantes al metotrexato. Si bien en estudios clínicos se demostró que tenía una mayor eficacia a dosis más altas, el tofacitinib solo se aprobó para una dosis de 5 mg dos veces al día (BID) basándose en efectos adversos limitativos de la dosificación, mediados sistémicamente (p.ej. colesterol elevado, incremento del índice de infecciones oportunistas, neutropenia, linfocitopenia, linfoma y tumores sólidos). En EUA el fármaco lleva una advertencia recuadrada que detalla los riesgos de seguridad y en Europa se rechazó su aprobación basándose en “problemas importantes no resueltos” relativos al perfil general de seguridad. El tofacitinib se encuentra en desarrollo activo para la CU, tras haberse manifestado una respuesta clínica en un ensayo de fase 2 (8 semanas) en la CU (Sandborn y otros, N Engl J Med, 2011, 365, 1713-1725), en concreto a unas dosis BID de 10 mg y 15 mg (véase también, Panes y otros, BMC Gastroenterol, 2015, 15, 14), que actualmente no están aprobadas para ninguna indicación. El patrocinador también ha informado de que una mayor proporción de pacientes que recibieron 10 mg BID de tofacitinib frente a placebo, en un ensayo de inducción de CU en una fase 3 (8 semanas), estaban en remisión, al igual que unos pacientes que recibieron 5 mg y 10 mg BID de tofacitinib en un ensayo de mantenimiento de la CU en una fase 3 (52 semanas).

Para el tratamiento de la colitis ulcerosa y de otras enfermedades inflamatorias gastrointestinales sería conveniente proporcionar un compuesto que por administración oral alcanzara una exposición suficientemente alta de tofacitinib en el tracto gastrointestinal, para optimizar su eficacia clínica, evitando la exposición sistémica limitativa de la dosis.

RESUMEN DE LA PRESENTE INVENCIÓN

En un aspecto, la presente invención proporciona nuevos profármacos glucurónidos del inhibidor de JAK tofacitinib. Dichos profármacos aprovechan el abundante contenido o producción de p-glucuronidasa en el microbioma intestinal, que escinde selectivamente el fragmento glucurónido del profármaco, para desencadenar la liberación de tofacitinib en el tracto gastrointestinal, en particular en el colon.

Sorprendentemente, los profármacos de la presente invención que contienen glucurónidos tienen suficiente estabilidad para ser aislados, formulados en una composición farmacéutica y administrados al paciente necesitado de tratamiento. No obstante, también son suficientemente lábiles para ser escindidos por la p-glucuronidasa y descomponerse todavía más para liberar eficientemente tofacitinib. En cambio, cuando el fragmento glucurónido del profármaco empleado en la presente invención se unía a ciertos otros fármacos de conocida o potencial utilidad para tratar la CU, los fármacos no se liberaban en contacto con la p-glucuronidasa (como se describe más detalladamente a continuación). Por tanto, los profármacos de la presente invención que llevan glucurónidos son particularmente útiles para administrar y liberar el tofacitinib.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula (I):

donde

n es 0, 1 o 2;

R¹ se elige entre hidrógeno, alquilo C^{1 -4} , alcoxi C^{1 -3} , amino, nitro, halo, ciano, hidroxilo y triflurometilo;

cada R² , cuando está presente, se elige independientemente entre alquilo C^{1 -4} , alcoxi C^{1 -3} , amino, nitro, halo, ciano, hidroxilo y triflurometilo;

R³ es hidrógeno, metilo o etilo;

R4 es hidrógeno, metilo o etilo;

o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otro aspecto la presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula (II):

donde

R¹ se elige entre hidrógeno, alquilo C^{1 -4} , alcoxi C^{1 -3} , amino, nitro, halo, ciano, hidroxilo y triflurometilo; o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una forma de ejecución, la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula (II) en la cual R¹ se elige entre hidrógeno, metilo, metoxi, amino, nitro y cloro, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otro aspecto la presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula 1:

o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

El compuesto de la fórmula 1 ha mostrado una baja biodisponibilidad oral y una fuerte liberación de tofacitinib (2)

in vivo tras su administración oral en especies preclínicas, que produce un marcado aumento de la relación entre la exposición en el colon y la exposición en el plasma respecto a la obtenida con la dosificación oral del propio tofacitinib.

También se revela que el compuesto de la fórmula 1 o una sal del mismo producen tofacitinib al entrar en contacto con p-glucuronidasa.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que incluye un vehículo aceptable farmacéuticamente y un compuesto de la fórmula (I), (II) o 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o cualquier forma de ejecución específica del mismo aquí descrita.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), (II) o 1, o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o a cualquier forma de ejecución específica de las mismas aquí descrita, para su uso en métodos de tratamiento de una enfermedad inflamatoria gastrointestinal en un mamífero, los cuales consisten en administrar al mamífero una composición farmacéutica que incluya un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la fórmula (I), (II) o 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o cualquier forma de ejecución específica del mismo aquí descrita.

En una forma de ejecución, la enfermedad inflamatoria gastrointestinal es colitis ulcerosa. En otra forma de ejecución, la enfermedad inflamatoria gastrointestinal es la enfermedad de Crohn. Y en otra forma de ejecución, la enfermedad inflamatoria gastrointestinal es la colitis relacionada con la terapia inhibidora del punto de control inmunitario.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un profármaco de tofacitinib que contiene glucurónido y es escindido por la p-glucuronidasa en el tracto gastrointestinal para liberar tofacitinib, con el fin de usarlo en un método de aporte de tofacitinib al tracto gastrointestinal de un mamífero, en particular al colon, que consiste en administrar al mamífero por vía oral un profármaco de tofacitinib que contiene glucurónido y es escindido por la p-glucuronidasa para liberar el tofacitinib en el tracto gastrointestinal.

En formas de ejecución separadas y distintas el profármaco de tofacitinib que contiene glucurónido es un compuesto de la fórmula (I), (II) o 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o cualquier forma de ejecución específica del mismo aquí descrita.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un proceso para preparar un compuesto de la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que consiste en desproteger un compuesto de la fórmula (I-A):

o una sal del mismo; donde R1, R2, R3, R4 y n son tal como se han definido aquí; cada PGa es independientemente un grupo protector de hidroxilo y PGb es un grupo protector de carboxilo; a fin de obtener un compuesto de la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una forma de ejecución de este proceso, R1 es nitro, R3 y R4 son metilo, cada PGa es acetilo, PGb es metilo y n es igual a 0.

En otro aspecto la presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula (I-A), o a una sal del mismo, o a cualquier forma de ejecución específica del mismo aquí descrita.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un proceso para preparar un compuesto de la fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que consiste en:

(a) hacer reaccionar un compuesto de la fórmula 12'

o una sal del mismo, donde cada PGa es independientemente un grupo protector de hidroxilo, con un compuesto de la fórmula 13

para obtener un compuesto de la fórmula 14':

y

(b) desproteger el compuesto de la fórmula 14' para dar el compuesto de fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una forma de ejecución de este proceso PGa es acetilo.

En aspectos separados y distintos, la presente invención también se refiere a un compuesto de la fórmula 13 o a una sal del mismo, y a un compuesto de la fórmula 14' o a una sal del mismo, o a cualquier forma de ejecución específica del mismo aquí descrita.

En aspectos separados y distintos, la presente invención también se refiere a otros procesos de síntesis e intermedios aquí descritos, que sirven para preparar los compuestos de la presente invención.

En aspectos separados y distintos, la presente invención también se refiere a un compuesto de la fórmula (I), (II) o 1, o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o a cualquier forma de ejecución específica del mismo aquí descrita, para usar en terapia médica o en la producción de un medicamento o de una formulación. En una forma de ejecución el medicamento o la formulación es para tratar una enfermedad inflamatoria gastrointestinal en un mamífero. Otros aspectos y formas de ejecución de la presente invención se describen en este documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA

La figura 1 es una representación gráfica de la concentración de los metabolitos activos, tofacitinib y los compuestos C-1M y C-2M, respectivamente, en función del tiempo como resultado de la incubación del compuesto de la presente invención (compuesto 1) y de los compuestos comparativos C-1 y C-2 con el contenido en el colon de rata.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCIÓN

Entre otros aspectos, la presente invención proporciona profármacos glucurónidos del inhibidor tofacitinib de la cinasa JAK, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y productos intermedios para prepararlos.

Las estructuras químicas se nombran aquí de acuerdo con las convenciones de IUPAC implementadas en el software ChemDraw (PerkinElmer, Inc., Cambridge, MA). Según la convención el compuesto de la fórmula 1 puede identificarse como:

el ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-cianoacetil)-4-metilpiperidin-3-il)(metil)amino)-N-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-7-carboxamido)etil)(metil)carbamoíl)oxi)metil)-2-nitrofenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico,

mientras que el tofacitinib (2) puede identificarse como 3-((3R,4R)-4-metil-3-(metil(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-amino)piperidin-1-il)-3-oxopropanonitrilo.

Los compuestos de la presente invención contienen múltiples centros quirales. La representación o denominación de un estereoisómero concreto significa que el estéreocentro en cuestión tiene la estereoquímica designada, entendiendo que también puede haber pequeñas proporciones de otros estereoisómeros, a no ser que se indique lo contrario y que la utilidad del compuesto representado o nombrado no se descarte por la presencia de otro estereoisómero

Definiciones

En la descripción de la presente invención, incluidos sus varios aspectos y formas de ejecución, los siguientes términos tienen los significados siguientes, a menos que se indique lo contrario.

Los términos singulares “un” y “el” incluyen los correspondientes términos plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

El término “alquilo” se refiere a un grupo hidrocarbonado saturado y monovalente, que puede ser lineal o ramificado o combinaciones de los mismos. A no ser que se definan de otra manera, dichos grupos alquilo contienen normalmente 1 hasta unos 10 átomos de carbono. Los grupos alquilo representativos incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, ferc-butilo, n-pentilo, n-hexilo, 2,2-dimetilpropilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2-etilbutilo, 2,2-dimetilpentilo, 2-propilpentilo y similares.

Cuando hay un número concreto de átomos de carbono asignado a un término particular, se indica el número de átomos de carbono asociado al término. Por ejemplo, el término “alquilo C^{1 -3} ” se refiere a un grupo alquilo constituido por 1 hasta 3 átomos de carbono en cualquier configuración químicamente aceptable, incluidas las configuraciones lineales o ramificadas.

El término “alcoxi” se refiere al grupo monovalente -O-alquilo, en el cual el alquilo se define como arriba. Los grupos alcoxi representativos incluyen, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, butoxi y similares.

El término “halo” significa fluoro, cloro, bromo o yodo.

El término “cantidad terapéuticamente efectiva” significa una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento cuando se administra a un paciente que lo necesita.

Tal como se emplea aquí, el término “tratamiento” significa el tratamiento de una enfermedad, trastorno o problema médico en un paciente como un mamífero (particularmente un ser humano), que incluye una o más de las siguientes medidas:

(a) evitar la aparición de la enfermedad, del trastorno o del problema médico, es decir, prevenir la recaída de la enfermedad o del problema médico, o el tratamiento profiláctico de un paciente predispuesto a la enfermedad o al problema médico;

(b) mejorar la enfermedad, el trastorno o el problema médico, es decir, eliminar o provocar la regresión de la enfermedad, del trastorno o del problema médico en un paciente, incluida la neutralización de los efectos de otros agentes terapéuticos;

(c) suprimir la enfermedad, el trastorno o el problema médico, es decir, ralentizar o detener el desarrollo de la enfermedad, del trastorno o del problema médico en un paciente; o

(d) aliviar los síntomas de la enfermedad, del trastorno o del problema médico en un paciente.

El término “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a una sal que es aceptable para la administración a un paciente o un mamífero tal como un ser humano (p.ej. sales que tienen una seguridad aceptable para un mamífero a un régimen de dosificación determinado). Las sales farmacéuticamente aceptables derivadas de ácidos incluyen sales de ácido acético, ascórbico, bencenosulfónico, benzoico, canforsulfónico, cítrico, etanosulfónico, edisílico, fumárico, gentísico, glucónico, glucorónico, glutámico, hipúrico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, lactobiónico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, naftalenosulfónico, naftalen-1,5-disulfónico, naftalen-2,6-disulfónico, nicotínico, nítrico, orótico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluensulfónico, xinafoico y similares.

Las sales derivadas de bases inorgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de amonio, calcio, magnesio, potasio, sodio, cinc y similares. Las sales derivadas de bases orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de arginina, colina, glucamina, lisina, benethamina, benzatina, betaína, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, hidrabamina, morfolina, trometamina, dietanolamina, etanolamina, etilendiamina, trietanolamina, 1H-imidazol, piperazina y similares.

Tal como se usa aquí, la expresión “sal del mismo” se refiere a un compuesto iónico cuyo anión o catión es una forma de un compuesto de la fórmula (I). Por ejemplo, el anión del compuesto iónico puede ser un anión carboxilato, que es una forma desprotonada de un compuesto de la fórmula (I). El catión puede ser una forma protonada de un compuesto de la fórmula (I), es decir, una forma en la cual un grupo amino ha sido protonado por un ácido. Normalmente la sal es una sal farmacéuticamente aceptable, pero en el caso de las sales de los compuestos intermedios no es preciso, porque no están destinadas a ser administradas a los pacientes.

Los compuestos neutros de la fórmula (I) pueden tomar opcionalmente la forma de un zwitterión, término que significa una molécula neutra con cargas eléctricas positivas y negativas.

La expresión “grupo protector de hidroxilo” se refiere a un grupo protector conveniente para evitar las reacciones no deseadas de un grupo hidroxilo. Los grupos protectores de hidroxilo representativos incluyen, de modo no excluyente, grupos alquilo tales como metilo, etilo y tere-butilo; grupos alilo; grupos acilo, por ejemplo grupos alcanoílo tales como acetilo; grupos arilmetilo tales como bencilo (Bn), p-metoxibencilo (PMB), 9-fluorenilmetilo (Fm) y difenilmetilo (benzhidrilo, DPM); grupos sililo tales como trimetilsililo (TMS) y tere-butildimetilsililo (TBS), y similares.

La expresión "grupo protector de carboxilo" se refiere a un grupo protector conveniente para evitar las reacciones no deseadas de un grupo carboxilo. Los grupos protectores de carboxilo representativos incluyen, de modo no excluyente, grupos alquilo tales como metilo, etilo, tere-butilo y similares; grupos arilmetilo tales como bencilo, 4-nitrobencilo, 4-metoxibencilo y similares; grupos tiol tales como -S-tere-butilo y similares; grupos sililo tales como trimetilsililo, terebutildimetilsililo y similares; oxazolinas, y similares.

A todos los demás términos utilizados aquí les corresponde su significado usual, tal como lo entienden los especialistas del ámbito técnico al que pertenecen.

Formas de ejecución representativas y agrupaciones subgenéricas

Los siguientes sustituyentes y valores están pensados para ofrecer ejemplos representativos de diversos aspectos y formas de ejecución de la presente invención. Estos valores representativos pretenden definir e ilustrar con mayor detalle tales aspectos y formas de ejecución, sin excluir otras formas de ejecución ni limitar el alcance de la presente invención.

En una forma de ejecución R¹ es hidrógeno, alquilo C^{1 -4} , alcoxi C^{1 -3} , amino, nitro, halo, ciano, hidroxilo o triflurometilo. En otra forma de ejecución R¹ es hidrógeno, alquilo C^{1 -4} , alcoxi C^{1 -3} , amino, nitro o cloro. En otra forma de ejecución, R¹ es hidrógeno, metilo, metoxi, amino, nitro o cloro. En una forma de ejecución particular R¹ es hidrógeno. En otra forma de ejecución particular R¹ es nitro.

En una forma de ejecución n es 0. En otra forma de ejecución n es 1. En otra forma de ejecución n es 2.

Si n es 1, en una forma de ejecución R² es alquilo C^{1 -4} , alcoxi C^{1 -3} , amino, nitro, halo, ciano, hidroxilo o triflurometilo. En otra forma de ejecución R² es alquilo C^{1 -4} , alcoxi C^{1 -3} , amino, nitro, fluoro o cloro. En otra forma de ejecución R² es metilo, metoxi, amino, nitro, fluoro o cloro. En una forma de ejecución particular, R² es fluoro.

Cuando n es 1, el sustituyente R² puede estar en cualquier posición disponible del anillo de fenilo al que va unido R². En una forma de ejecución R² es orto respecto a R¹. En otra forma de ejecución R² es meta respecto a R¹. En otra forma de ejecución R² es para respecto a R¹.

Cuando n es 2, en una forma de ejecución cada R² es independientemente alquilo C^{1 -4} , alcoxi C^{1 -3} , amino, nitro, halo, ciano, hidroxilo o triflurometilo. En otra forma de ejecución cada R² es independientemente alquilo C^{1 -4} , alcoxi C^{1 -3} , amino, nitro, fluoro o cloro. En otra forma de ejecución cada R² es independientemente metilo, metoxi, amino, nitro, fluoro o cloro. En una forma de ejecución particular cada R² es fluoro.

Si n es 2, los sustituyentes R² pueden estar en cualquier posición disponible del anillo de fenilo al que va unido R². En una forma de ejecución los sustituyentes R2 son orto y meta respecto a R1. En otra forma de ejecución los sustituyentes R2 son orto y para respecto a R1. En otra forma de ejecución los sustituyentes R2 son meta y para respecto a R1. En una forma de ejecución R3 es hidrógeno. En otra forma de ejecución R3 es metilo. En otra forma de ejecución R3 es etilo.

En una forma de ejecución R4 es hidrógeno. En otra forma de ejecución R4 es metilo. En otra forma de ejecución R4 es etilo.

En una forma de ejecución, tanto R3 como R4 son metilo. En otra forma de ejecución R3 o R4 es hidrógeno y el otro es metilo.

En una forma de ejecución, n es 0; R1 es hidrógeno, metilo, metoxi, amino, nitro o cloro; R3 es metilo; y R4 es metilo. En otra forma de ejecución, n es 0; R1 es hidrógeno, metilo, metoxi, amino, nitro o cloro; R3 es hidrógeno; y R4 es metilo.

En una forma de ejecución n es 0; R1 es hidrógeno, metilo, metoxi, amino, nitro o cloro; R3 es metilo y R4 es metilo. En otra forma de ejecución n es 0; R1 es hidrógeno, metilo, metoxi, amino, nitro o cloro; R3 es hidrógeno y R4 es metilo. En otra forma de ejecución n es 0; R1 es hidrógeno, metilo, metoxi, amino, nitro o cloro; R3 es metilo y R4 es hidrógeno. En otra forma de ejecución n es 0; R1 es hidrógeno, metilo, metoxi, amino, nitro o cloro; R3 es etilo y R4 es etilo. En otra forma de ejecución n es 1; R1 es hidrógeno, metilo, metoxi, amino, nitro o cloro; R2 es metilo, metoxi, amino, nitro, fluoro o cloro; R3 es metilo y R4 es metilo.

En otra forma de ejecución n es 1; R1 es hidrógeno, metilo, metoxi, amino, nitro o cloro; R2 es metilo, metoxi, amino, nitro, fluoro o cloro; R3 es hidrógeno y R4 es metilo.

En otra forma de ejecución n es 1; R1 es hidrógeno, metilo, metoxi, amino, nitro o cloro; R2 es metilo, metoxi, amino, nitro, fluoro o cloro; R3 es metilo y R4 es hidrógeno.

Procedimientos de síntesis

Los compuestos de la fórmula (I) se pueden preparar siguiendo el método de síntesis descrito detalladamente en los ejemplos adjuntos. Tal como ilustra el esquema 1, específicamente para la preparación del compuesto de la fórmula 1, la etapa clave de la síntesis es la formación del enlace de urea entre el tofacitinib y una forma protegida del fragmento glucurónido 12' del profármaco. En el esquema 1 PGa representa un grupo protector de hidroxilo, preferiblemente alilo o acetilo, aunque también se puede usar otro grupo protector de hidroxilo, incluido un grupo protector de sililo tal como el ferc-butildimetilsililo.

Esquema 1

La formación de este enlace clave de urea se centró inicialmente en usar el tofacitinib como nucleófilo; sin embargo, se vio que esta etapa de formación del enlace era incoherente, porque la reacción del tofacitinib con varios electrófilos diferentes solo condujo a la formación del producto deseado con bajos rendimientos. Por tanto se consideró necesario intercambiar el papel de ambos reactantes, haciendo que un derivado de tofacitinib fuera el reactante electrófilo y el fragmento glucurónido del profármaco el nucleófilo. Tras examinar muchos reactivos se comprobó que el tofacitinib se podía modificar transformándolo en electrófilo, al unirlo a un radical reactivo para-nitrofenilo o pentafluorofenilo con un enlace carbamato. Por ejemplo, los reactivos de para-nitrofenil cloroformiato, bis(4-nitrofenil) carbonato o bis(pentafluorofenil) carbonato fueron capaces de alcanzar el equilibrio deseado entre ser suficientemente reactivos para formar un enlace con el tofacitinib y a la vez proporcionar un producto intermedio no tan reactivo como para descomponerse antes de la reacción con los tipos de glucurónidos. El producto intermedio protegido resultante 14' se desprotege - por ejemplo cuando PGa es un grupo acetato - con hidróxido de litio en una etapa posterior para obtener el compuesto de la fórmula 1.

Así, en un aspecto, la presente invención proporciona un proceso de preparación del compuesto 1 que consiste en (a) hacer reaccionar un fragmento glucurónido del profármaco protegido 12' con un derivado electrófilo del tofacitinib 13 para producir el compuesto 14' y (b) desproteger el compuesto 14' para obtener el compuesto de la fórmula 1. En un aspecto adicional la presente invención proporciona el compuesto electrófilo de tofacitinib 13.

Se representa la acción de un enzima p-glucuronidasa sobre los profármacos de la presente invención en el caso del compuesto de la fórmula 1. Tal como se muestra en el esquema 2, cuando un enzima p-glucuronidasa actúa sobre el compuesto de la fórmula 1 se libera tofacitinib mediante un proceso de varias etapas:

Esquema 2

En la etapa inicial el enzima p-glucuronidasa escinde el enlace glucosídico del compuesto de la fórmula 1, liberando el ácido glucurónico (a) y formando una aglicona intermedia (b). La aglicona se descompone espontáneamente dando una especie de meturo de quinona (c) que puede atraparse con agua, y un ácido carbámico transitorio que pierde dióxido de carbono produciendo una diamina (d ). La ciclación intramolecular de la diamina da lugar a la formación de un derivado de imidazolidinona (e) y a la liberación de tofacitinib.

Tal como se describe en la siguiente sección experimental, la conversión del compuesto de la fórmula 1 en tofacitinib mediante las etapas intermedias ilustradas en el esquema 2 ha sido observada en incubaciones con p-glucuronidasa purificada (ensayo 2) y homogenado con contenido de colon de rata recién preparado (ensayo 3). En estos últimos ensayos se controlaron las concentraciones del compuesto de la fórmula 1, de la aglicona intermedia b , de la diamina intermedia d y del tofacitinib en función del tiempo. La pronta desaparición del compuesto de la fórmula 1 fue seguida por la formación rápida y transitoria de la aglicona y por la aparición, más lenta y determinante de la velocidad, de la diamina d y del tofacitinib como principal metabolito activo.

Los presentes investigadores han comprobado que la descomposición del compuesto profármaco glucurónido en varias etapas, que comienza con la escisión enzimática del enlace glucosídico por la p-glucuronidasa bacteriana para liberar directa y beneficiosamente un fragmento activo deseado al sitio de acción en el colon, depende sensiblemente del tipo de enlace y del fragmento activo específico. La mesalamina, ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) (el compuesto C-1M), es un agente más antiguo, utilizado durante mucho tiempo en el tratamiento de la colitis ulcerosa leve o moderada. Sin embargo, este método con profármacos glucurónidos no parece ser aplicable a la administración directa de 5-ASA al colon. El profármaco glucurónido de 5-ASA (compuesto C-1)

se incubó con un homogenato que contenía colon de rata en un ensayo análogo al mencionado anteriormente. Si bien se observó una aglicona transitoria análoga a la aglicona b del esquema 2 y una aparición más lenta de una diamina análoga a d en un periodo de tiempo similar al del compuesto de fórmula 1, no se pudo encontrar ningún indicio del metabolito activo 5-ASA.

Una publicación reciente, US2013/0109720, reveló el 2-(5-fluoro-4-metilpiridin-3-il)-5-(4-metil-6-(metilsulfonil)piridin-3-il)-1H-indol (compuesto C-2M) como inhibidor del canal de calcio activado por liberación de calcio (CRAC). También se cree que los inhibidores de CRAC son útiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Sin embargo, este método con profármacos glucurónidos tampoco parece ser aplicable a la administración selectiva de este inhibidor de CRAC. La descomposición del profármaco inhibidor CRAC C-2

también se estudió en homogenato con contenido de colon de rata y se obtuvieron resultados similares a los obtenidos con el compuesto C-1. Aunque se observaron productos de descomposición intermedios, no se pudo encontrar ningún indicio de liberación del inhibidor activo de CRAC C-2M.

Las pruebas actuales sugieren que los profármacos de la presente invención son excepcionalmente adecuados para aprovechar un mecanismo de descomposición iniciado por la p-glucuronidasa bacteriana para liberar tofacitinib en el colon.

Composiciones farmacéuticas

Los compuestos de la presente invención y sus sales farmacéuticamente aceptables se usan normalmente en forma de composición o formulación farmacéutica. Por consiguiente, en uno de sus aspectos, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y un compuesto de fórmula (I), (II) o 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Estas composiciones farmacéuticas pueden contener opcionalmente otros agentes terapéuticos y/o de formulación, si se desea.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención contienen normalmente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. Los especialistas en la materia reconocerán sin embargo que una composición farmacéutica puede contener una cantidad superior a la terapéuticamente efectiva, es decir, como las composiciones básicas, o una cantidad inferior a la terapéuticamente efectiva, es decir, como las monodosis diseñadas para alcanzar una cantidad terapéuticamente efectiva mediante su administración múltiple.

Normalmente, estas composiciones farmacéuticas llevarán aproximadamente 0,1 hasta 95% en peso del compuesto de la fórmula (I), incluido un intervalo aproximado del 5 hasta el 70% en peso, por ejemplo del 10 hasta el 60% en peso, aproximadamente, del compuesto de la fórmula (I).

En las composiciones farmacéuticas de la presente invención se puede usar cualquier vehículo o excipiente habitual. La selección de un vehículo o excipiente particular, o de combinaciones de vehículos o excipientes, dependerá del modo de administración utilizado para tratar a un paciente particular o un tipo de problema médico o estado patológico. En este sentido la preparación de una composición farmacéutica adaptada a un modo particular de administración cae dentro del alcance de los especialistas en técnicas farmacéuticas. Además, los vehículos o excipientes empleados en las composiciones farmacéuticas de la presente invención están disponibles comercialmente. A modo de información adicional, las técnicas de formulación corrientes están descritas en Remington Farmacia: The Science and Practice of Pharmacy [Ciencia y práctica farmacéutica], 20a edición, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); y en H.C. Ansel y otros, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems [Formas de dosificación farmacéutica y sistemas de administración de fármacos], 7a edición, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).

Los ejemplos representativos de materiales utilizables como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitarse a ellos, los siguientes: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como los de maíz y patata; celulosas como la celulosa microcristalina y sus derivados, como la carboximetilcelulosa sódica, la etilcelulosa y el acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tales como el aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tales como el propilenglicol; polioles tales como glicerina, sorbita, manita y polietilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tampón tales como el hidróxido magnésico y el hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones tampón de fosfato, y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en las composiciones farmacéuticas.

Las composiciones farmacéuticas se preparan normalmente mezclando o combinando a fondo e íntimamente un compuesto de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable y uno o más ingredientes optativos. Luego la mezcla uniforme resultante se puede conformar o cargar en tabletas, cápsulas, píldoras y similares, utilizando procedimientos y equipos convencionales.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se envasan preferiblemente en una forma de dosificación unitaria. La expresión “forma de dosificación unitaria” se refiere a una unidad física discreta, adecuada para dosificarla a un paciente, es decir, que cada unidad contiene una cantidad prefijada de los presentes compuestos, calculada para producir el efecto terapéutico deseado, ya sea sola o en combinación con una o más unidades adicionales. Dichas formas de dosificación unitarias pueden ser, por ejemplo, cápsulas, tabletas, píldoras y similares, o envases unitarios adecuados para la administración parenteral.

En una forma de ejecución las composiciones farmacéuticas de la presente invención son aptas para administración oral. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración la oral pueden estar en forma de cápsulas, tabletas, píldoras, obleas, sellos, grageas, polvos, granulados; o como solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite; o como un elixir o jarabe; y similares; cada una de ellas contiene una cantidad prefijada de un compuesto de la presente invención como ingrediente activo.

Cuando van destinadas a la administración oral en una forma de dosificación sólida (es decir, como cápsulas, tabletas, píldoras y similares), las composiciones farmacéuticas de la presente invención llevarán normalmente un compuesto de la presente invención y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, como citrato sódico o fosfato dicálcico. Opcional o alternativamente, estas formas de dosificación sólidas también pueden incluir: cargas o rellenos tales como almidones, celulosa microcristalina, lactosa, fosfato dicálcico, sacarosa, glucosa, manita y/o ácido silícico; ligantes tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o acacia; humectantes tales como glicerina; agentes desintegrantes tales como croscarmelosa sódica, agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y/o carbonato sódico; agentes retardantes de disolución tales como parafina; acelerantes de absorción tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes humectantes tales como alcohol cetílico y/o monoestearato de glicerol; absorbentes tales como caolín y/o arcilla de bentonita; lubricantes tales como talco, estearato cálcico, estearato magnésico, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato sódico y/o mezclas de los mismos; agentes colorantes; y agentes tampón.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener agentes antiadherentes, agentes humectantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, saborizantes y aromatizantes, conservantes y antioxidantes. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes hidrosolubles tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfato sódico, sulfito sódico y semejantes; antioxidantes liposolubles tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y agentes complejantes de metales tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético, sorbita, ácido tartárico, ácido fosfórico y análogos. Los agentes de recubrimiento para tabletas, cápsulas, píldoras y similares incluyen los utilizados para recubrimientos entéricos, como por ejemplo acetato-ftalato de celulosa, acetatoftalato de polivinilo, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, ácido metacrílico, copolímeros de ésteres de ácido metacrílico, acetato-trimelitato de celulosa, carboximetil etil celulosa, acetato-succinato de hidroxipropil metil celulosa y similares.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden formularse para lograr una liberación lenta o controlada del principio activo, empleando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables u otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden formularse de forma que liberen el ingrediente activo solo o, preferentemente, en una determinada porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente de manera retardada. Los ejemplos de composiciones integradas utilizables incluyen sustancias poliméricas y ceras. Si es conveniente, el principio activo también puede estar en forma microencapsulada con uno o más de los excipientes arriba descritos.

Como formas de dosificación líquidas adecuadas para la administración oral cabe mencionar, por ejemplo, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Las formas líquidas de dosificación llevan normalmente el principio activo y un diluyente inerte como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (principalmente de semillas de algodón, cacahuete, maíz, germen de trigo, oliva, ricino y sésamo), ácido oleico, glicerina, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de sorbitán de ácidos grasos y mezclas de ellos. Alternativamente, ciertas formulaciones líquidas se pueden elaborar en polvo, por ejemplo secándolas por pulverización, que luego se emplea para preparar formas de dosificación sólidas mediante procedimientos convencionales.

Las suspensiones, además del ingrediente activo, pueden incluir agentes de suspensión como, por ejemplo, isoestearil alcoholes etoxilados, ésteres de polioxietileno-sorbita y -sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

Los siguientes ejemplos no limitativos muestran composiciones farmacéuticas características de la presente invención. Dosificación sólida oral en forma de tableta

Se mezcla en seco un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona y croscarmelosa sódica en relación 4:5:1:1 y se comprime en tabletas para obtener una dosis unitaria de, por ejemplo, 4 mg, 10 mg o 20 mg de principio activo por tableta.

Dosificación sólida oral en forma de tableta

Se mezcla completamente un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (40 g) con celulosa microcristalina (445 g), dióxido de silicio pirogénico (10 g) y ácido esteárico (5 g). La mezcla se comprime luego en una prensa para formar tabletas de 100 mg de peso cada una. Cada tableta proporciona 8 mg del principio activo por dosis unitaria, adecuada para la administración oral.

Dosificación sólida oral en forma de tableta

Se mezcla completamente un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (10 g) con almidón de maíz (50 g), croscarmelosa sódica (25 g), lactosa (110 mg) y estearato magnésico (5 mg). La mezcla se comprime en una prensa para formar tabletas de 200 mg cada una. Cada tableta proporciona 10 mg del principio activo por dosis unitaria, adecuada para la administración oral.

Dosificación sólida oral en forma de cápsula

Se combina un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona y croscarmelosa sódica en relación 4:5:1:1 por granulación húmeda y se carga en cápsulas de gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa para proporcionar una dosis unitaria de, por ejemplo, 4 mg, 10 mg o 20 mg de principio activo por cápsula.

Polvo en cápsulas

Una cápsula de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) vacía, apta para la administración oral, se rellena con un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (de 1 a 50 mg).

Formulación líquida

Un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (50 mg) se mezcla y se disuelve totalmente en 100 ml de una bebida deportiva de frutas del bosque, de bajo contenido calórico, en una botella tapada. Se midieron varios volúmenes de esta solución para ofrecer distintos niveles de dosis.

Formulación líquida

Se prepara una formulación líquida que contiene un compuesto de la presente invención (0,1%), agua (98,9%) y ácido ascórbico (1,0%), añadiendo un compuesto de la presente invención a una mezcla de agua y ácido ascórbico, Forma de dosificación oral con recubrimiento entérico

Se disuelve un compuesto de la presente invención en una solución acuosa que lleva polivinilpirrolidona y se pulveriza sobre celulosa microcristalina o perlas de azúcar en una relación 1:5 p/p de principio activo: perlas y luego se aplica un recubrimiento entérico formado por un copolímero acrílico, por ejemplo una combinación de copolímeros acrílicos disponibles con las marcas comerciales Eudragit-L® y Eudragit-S®, o acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa, hasta un aumento de peso del 5% aproximadamente. Las perlas con recubrimiento entérico se cargan en cápsulas de gelatina o de hidroxipropilmetilcelulosa para proporcionar una dosis unitaria de, por ejemplo, 5 mg de principio activo por cápsula.

Forma de dosificación oral con recubrimiento entérico

Un recubrimiento entérico compuesto por una combinación de Eudragit-L® y Eudragit-S®, o por acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa, se aplica a una tableta o cápsula como las formas de dosificación oral arriba descritas.

Utilidad

Los presentes compuestos se han diseñado para administrar un agente clínicamente eficaz, directamente al sitio de acción en el tracto gastrointestinal, con el fin de tratar enfermedades inflamatorias gastrointestinales, en particular para tratar enfermedades inflamatorias intestinales como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. También se espera que los compuestos sirvan para tratar la colitis relacionada con las terapias inhibidoras del punto de control inmunitario. En particular, los profármacos glucurónidos de la presente invención están diseñados para aprovechar la abundancia del enzima bacteriano del p-glucurónido en el tracto gastrointestinal, en particular en el colon, a fin de liberar el inhibidor de JAK tofacitinib predominantemente en el tracto gastrointestinal inferior. Además se ha demostrado que la absorción sistémica de los compuestos mostrados como ejemplos de la presente invención es escasa, lo cual minimiza el riesgo de inmunosupresión.

Los compuestos profármacos de la presente invención están diseñados de forma que carecen de actividad biológica. Por ejemplo, el compuesto de la fórmula 1 no tiene ninguna afinidad significativa o potencial por la familia enzimática de las cinasas de Jano (JAK), por enzimas no-JAK o por una gama de receptores, canales iónicos y transportadores acoplados a proteínas G, que pueden ser expresados en el tracto gastrointestinal (GI) o sistémicamente. La actividad biológica posterior a la administración de los presentes compuestos cabe atribuirla al tofacitinib generado.

Tal como se describe en la siguiente sección experimental, los compuestos de la presente invención se han descrito extensamente en uno o más ensayos preclínicos. Se ha demostrado que los compuestos se descomponen mediante la p-glucuronidasa presente en las heces del colon de rata. Así, por ejemplo, se investigó la estabilidad metabólica del compuesto de fórmula 1 y la formación de tofacitinib en incubaciones de homogenados de contenido luminal intestinal aislado del duodeno, íleon, yeyuno y colon de rata. El compuesto mostró un gradiente de conversión creciente, desde un contenido estable en el duodeno y el yeyuno (vida media > 60 minutos) hasta una conversión moderada en el íleon (vida media igual a 34 minutos) y una rápida conversión en el colon (vida media < 5 minutos), con evidente formación de tofacitinib. El gradiente de conversión creciente del compuesto refleja la progresiva presencia de bacterias desde el GI superior hasta el GI inferior.

La liberación de tofacitinib de los presentes compuestos tras la dosificación oral se ha estudiado en ratones, ratas y monos cynomolgus. Tal como se describe luego en los ensayos 4, 5, 9 y 10, en todas las especies los profármacos, liberaron reveladoramente mucho más tofacitinib en el colon que en el plasma. En particular, se estudió la liberación de tofacitinib del compuesto de la fórmula 1 en segmentos específicos del tracto gastrointestinal de ratas y monos, y se comparó con la concentración resultante después de la administración oral de dosis equivalentes de tofacitinib. El compuesto 1 no solo mostró una exposición significativamente más elevada en todo el tracto gastrointestinal que en el plasma (por ejemplo, en relaciones superiores a 500 en segmentos de colon de las ratas y entre aproximadamente 60 y 150 en segmentos de colon de los monos), sino también un aumento de la concentración en el tejido GI y de la relación entre la concentración en el tejido GI y la concentración en el plasma, respecto a la obtenida con la dosificación oral de tofacitinib. Por ejemplo, en los monos se observó una concentración de tofacitinib cinco a siete veces mayor en el tejido del ciego y del colon proximal y distal tras la administración oral del profármaco, en comparación con la resultante de la administración oral de tofacitinib.

La eficacia de algunos compuestos de la presente invención también se analizó en el modelo de colitis inducida por oxazolona en ratones. En los ratones, los compuestos de las fórmulas 1 y 4 mostraron actividad en el modelo de colitis inducida por oxazolona a dosis orales más bajas que las necesarias para conseguir un efecto equivalente mediante la administración directa de tofacitinib. Además, las dosis eficaces del compuesto de la fórmula 1 están relacionadas con una menor exposición sistémica de tofacitinib respecto a la exposición sistémica resultante de la administración de la dosis eficaz del propio tofacitinib. En un modelo de inmunosupresión en ratones el compuesto 1 tuvo un mínimo efecto inmunosupresor a la misma dosis necesaria para mostrar una eficacia comparable en el modelo de oxazolona (índice terapéutico > 3 veces), mientras que el tofacitinib es inmunosupresor a una dosis inferior a su dosis eficaz (índice terapéutico < 0,3).

En consecuencia es de esperar que los profármacos glucurónidos de tofacitinib de la presente invención sean útiles para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal, en particular de la colitis ulcerosa. También cabe esperar que los presentes compuestos sean útiles para el tratamiento de la enfermedad de Crohn y el tratamiento de la colitis relacionada con la terapia inhibidora del punto de control inmunitario, que es una consecuencia potencialmente grave de las inmunoterapias contra el cáncer. Las terapias inhibidoras del punto de control inmunitario incluyen, sin limitarse a ellos, inhibidores del antígeno 4 de los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), como ipilimumab (Yervoy®) y tremelimumab; inhibidores de la muerte celular programada 1 (PD-1) tales como pembrolizumab (Keytruda®) y nivolumab (Opdivo®) e inhibidores del ligando 1 de la muerte programada (PD-L1) tales como atezolizumab (Tecentriq®), durvalumab y avelumab. En particular cabe esperar que los compuestos sean útiles para el tratamiento de la colitis inducida por los inhibidores del CTLA-4. Los compuestos también pueden tener utilidad en el tratamiento de otras afecciones tales como los efectos gastrointestinales adversos de la reacción del injerto contra huésped, la enfermedad celíaca, la colitis microscópica, la reservoritis y la enteropatía autoinmune.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona compuestos de la fórmula (I) para usar en un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria gastrointestinal en un mamífero (p.ej. un ser humano), que consiste en administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención o de una composición farmacéutica que contenga un vehículo farmacéuticamente aceptable más el compuesto de la presente invención.

En una forma de ejecución la enfermedad inflamatoria gastrointestinal es colitis ulcerosa. En otra forma de ejecución la enfermedad inflamatoria gastrointestinal es la enfermedad de Crohn. Y en otra forma de ejecución la enfermedad inflamatoria gastrointestinal es la colitis relacionada con la terapia inhibidora del punto de control inmunitario.

La presente invención proporciona además compuestos de la fórmula (I) para usar en un método de tratamiento de la colitis ulcerosa en un mamífero, que consiste en administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención o de una composición farmacéutica que lleve un vehículo farmacéuticamente aceptable más el compuesto de la presente invención.

Cuando se use para tratar la colitis ulcerosa, el compuesto de la presente invención se administrará normalmente por vía oral en una dosis diaria única o múltiple, aunque se pueden usar otras formas de administración. La cantidad de principio activo administrada por dosis o la cantidad total administrada por día la determinará en general un médico en función de las circunstancias relevantes, incluida la enfermedad que debe tratarse, la vía de administración elegida, el compuesto concreto administrado y su actividad relativa, la edad, el peso y la respuesta de cada paciente, la gravedad de los síntomas del paciente y similares.

Se espera que las dosis adecuadas para tratar la colitis ulcerosa y otros trastornos inflamatorios gastrointestinales varíen aproximadamente entre 2 y 60 mg/día del compuesto de la fórmula (I), comprendiendo aproximadamente entre 4 a 50 mg/día y aproximadamente entre 4 y 40 mg por día para humanos con un peso medio de 70 kg.

Terapia combinada

Los compuestos de la presente invención también se pueden usar en combinación con uno o más agentes que actúen mediante el mismo mecanismo o por diferentes mecanismos efectivos del tratamiento de los trastornos inflamatorios gastrointestinales. Las tipos de agentes útiles para la terapia combinada incluyen, sin limitarse a ellos, aminosalicilatos, esteroides, inmunosupresores sistémicos, anticuerpos anti-TNFa, anticuerpos anti-alfa-4 (anti-VLA-4), anticuerpos anti-integrina a4p7, agentes antibacterianos y medicamentos antidiarreicos.

Los aminosalicilatos que pueden usarse en combinación con los presentes compuestos incluyen, sin limitarse a ellos, mesalamina, olsalazina y sulfasalazina. Los ejemplos de esteroides incluyen, entre otros, prednisona, prednisolona, hidrocortisona, budesonida, beclometasona y fluticasona. Los inmunosupresores sistémicos útiles para el tratamiento de los trastornos inflamatorios incluyen, sin limitarse a ellos, ciclosporina, azatioprina, metotrexato, 6-mercaptopurina y tacrolimus. También se pueden emplear en terapia combinada anticuerpos anti-TNFa, incluidos, sin limitarse a ellos, infliximab, adalimumab, golimumab y certolizumab. Como compuestos útiles que actúan por otros mecanismos cabe citar anticuerpos anti-alfa-4 tales como natalizumab; anticuerpos anti-integrina a4p7 tales como vedolizumab, agentes antibacterianos como rifaximina y medicamentos antidiarreicos como loperamida. (Mozaffari y otros, Expert Opin. Biol. Ther. 2014, 14, 583-600; Danese, Gut, 2012, 61, 918-932; Lam y otros, Immunotherapy, 2014, 6, 963-971.)

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención proporciona una combinación terapéutica para tratar trastornos inflamatorios gastrointestinales, que contiene un compuesto de la presente invención y uno o más agentes terapéuticos útiles para tratar trastornos inflamatorios gastrointestinales. Por ejemplo, la presente invención ofrece una combinación que contiene un compuesto de la presente invención y uno o más agentes elegidos entre aminosalicilatos, esteroides, inmunosupresores sistémicos, anticuerpos anti-TNFa, anticuerpos anti-alfa-4, anticuerpos anti-integrina a4p7, agentes antibacterianos y medicamentos antidiarreicos. Cuando se incluyen agentes secundarios, éstos se encuentran en una cantidad terapéuticamente efectiva, es decir, en cualquier cantidad que produzca un efecto terapéutico beneficioso al administrarla conjuntamente con un compuesto de la presente invención.

Además, en otro aspecto, la presente invención ofrece un compuesto según la presente invención y uno o más agentes terapéuticos útiles para tratar trastornos inflamatorios gastrointestinales y para usar en un método de tratamiento de los trastornos inflamatorios gastrointestinales.

Cuando se usan en una terapia combinada, los agentes pueden formularse en una única composición farmacéutica, como la descrita anteriormente, o pueden aportarse en composiciones separadas que se administran simultáneamente o en momentos separados, por la misma o por diferentes vías de administración. Cuando se administran por separado, los agentes se dosifican en tiempos suficientemente próximos, a fin de producir el efecto terapéutico deseado. Dichas composiciones pueden empaquetarse por separado o juntas, en forma de un kit. Los dos o más agentes terapéuticos del kit se pueden administrar por la misma vía de administración o por vías de administración diferentes.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos sintéticos y biológicos se ofrecen para ilustrar la presente invención y no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la misma. En estos ejemplos las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados, a no ser que se indique otra cosa. Las abreviaturas que no están definidas aquí tienen sus significados generalmente aceptados.

Ac = acetilo

ACN = acetonitrilo

alloc = aliloxicarbonilo

d = día(s)

DCM = diclorometano

DIPEA = W,W-diisopropiletilamina

DMAP = 4-dimetilaminopiridina

EtaN = trietilamina

EtOAc = acetato de etilo

EtOH = etanol

h = hora(s)

IPA = alcohol isopropílico

MeOH = metanol

min = minuto(s)

TA = temperatura ambiente

tBu = ferc-butilo

TFA = ácido trifluoroacético

THF = tetrahidrofurano

Se adquirieron reactivos y disolventes a proveedores comerciales (de Sigma-Aldrich, Fluka, etc.) y se utilizaron sin purificarlos más. El desarrollo de las mezclas reactivas se controló por cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía líquida analítica de alto rendimiento (HPLC anal.) y espectrometría de masas. Las mezclas reactivas se elaboraron tal como se describe específicamente para cada reacción; normalmente se purificaron por extracción y otros métodos de purificación tales como cristalización y precipitación en función de la temperatura y del disolvente. Además, las mezclas reactivas se purificaron rutinariamente por cromatografía en columna o por HPLC preparativa, utilizando normalmente rellenos de columna C18 o BDS y eluyentes convencionales. A continuación se detallan las condiciones características de la HPLC preparativa.

Los productos de reacción se identificaron usualmente por espectrometría de masas y HPLC analítica. La identificación de los compuestos por espectrometría de masas se llevó a cabo mediante un método de ionización por electrospray (ES/MS) con un aparato API 150 EX de Applied Biosystems (Foster City, CA) o un aparato Waters (Milford, MA) 3100, acoplado a sistemas de autopurificación.

Condiciones de la HPLC preparativa

Columna: C18,5 |jm, 21,2 x 150 mm o C18,5 jim, 21 x 250 o C14,5 |jm, 21 x 150 mm Temperatura de la columna: temperatura ambiente

Caudal: 20,0 ml/min

Fases móviles: A = agua 0,05% de TFA

B = ACN 0,05% de TFA,

Volumen de inyección: (100-1500 jl)

Longitud de onda del detector: 214 nm

Los compuestos crudos se disolvieron en agua: ácido acético 1:1 a una concentración aproximada de 50 mg/ml. Se realizó una prueba a escala analítica de 4 minutos, usando una columna C18 de 2,1 x 50 mm, seguida de una prueba a escala preparativa de 15 o 20 minutos, usando un volumen de inyección de 100 j l con el gradiente basado en el % de retención de B en la prueba a escala analítica. Los gradientes exactos dependieron de la muestra. Las muestras con impurezas de tandas contiguas se comprobaron con una columna C18 de 21 x 250 mm y/o una columna C14 de 21 x 150 mm para mejorar la separación. Las fracciones que incluían el producto deseado se identificaron por análisis espectrométrico de masas.

Condiciones de la HPLC analítica

Método A

Aparato: Agilent 1260 HPLC

Columna: LUNA C18 (2), 150 x 4,60 mm, 3 micras

Temperatura de la columna: 35°C

Caudal: 1,2 ml/min

Volumen de inyección: 5 jl

Preparación de la muestra: disolver en ACN: agua 1:1 hasta ~0,5 mg/ml de solución

Fases móviles: A = agua:ACN:TFA (98:2:0,05)

B = agua:ACN:TFA (30:70:0,05)

Longitud de onda del detector: 230 nm

Gradiente: 28 total min (tiempo (min)/ % de B): 0/10, 20/100, 22/100, 23/10, 28/10

Método B

Aparato: Agilent 1260 HPLC

Columna: Zorbax-Bonus RP C14, 30 x 2,1 mm, 1,8 micras

Temperatura de la columna: 60°C

Caudal: 1,2 ml/min

Volumen de inyección: 3 |jl

Preparación de la muestra: disolver en ACN: agua 1:1 hasta ~1,0 mg/ml de solución

Fases móviles: A = agua:TFA (99,9%:0,1%)

B = ACN:TFA (99,9%:0,1%)

Longitud de onda del detector: 214 nm

Gradiente: total 3,0 min (tiempo (min)/ % de B): 0/5, 1,5/65, 1,8/95, 2,1/95, 2,5/5, 3,0/5

Preparación 1: triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(hidroximetil)-2-mtrofenoxi)-6-(metoxicarboml)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (10)

En un matraz de 2 l y 3 bocas provisto de un agitador mecánico se introdujo triacetato de (2R,3R,4S,5S,6S)-2-bromo-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (8) (51 g, 128,4 mmoles), 4-hidroxi-3-nitrobenzaldehído (20,98 g, 125,5 mmoles) y óxido de plata (37,7 g, 162,7 mmoles), seguido de ACN (750 ml). La mezcla reactiva se agitó en la oscuridad durante 18 h y se filtró a través de tierra de diatomeas (Celite®). El sólido se lavó con ACN (3 x 100 ml) y el filtrado se destiló a presión reducida hasta 100 ml. Al filtrado se le añadió EtOAc (1750 ml) y bicarbonato sódico saturado (1 l) y la mezcla reactiva se agitó a TA durante 30 minutos, se filtró a través de Celite y se dejó sedimentar. La capa orgánica se lavó con bicarbonato sódico saturado (1 l) y salmuera (1 l), se secó sobre sulfato sódico (100 g) durante 2 h, se filtró y se destiló a presión reducida hasta sequedad para obtener el compuesto 9 crudo en forma de un sólido amarillo (55 g, 90% de rendimiento, 97,4% de pureza). Tiempo de retención en HPLC 15,61 min.

(b) Triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(hidroximetil)-2-nitrofenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (10)

En un matraz de 1 l y 3 bocas provisto de un agitador mecánico se introdujo el compuesto 9 (32,7 g, 67,6 mmoles), seguido de DCM (350 ml) e IPA (70 ml). La mezcla reactiva se agitó para disolver el sólido y luego se enfrió a 0°C. A la solución se le añadió borohidruro sódico (1,54 g, 40,6 mmoles) en tres porciones, manteniendo la temperatura por debajo de 5°C, y la mezcla reactiva se agitó a 0°C durante 1 hora y se vertió lentamente en agua con hielo (400 ml). Se añadió DCM (350 ml) a la solución y la mezcla se agitó durante 30 minutos, se dejó sedimentar durante 30 minutos y se separaron las capas. La capa acuosa se volvió a extraer con DCM (100 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (500 ml). Después de 30 minutos se separaron las capas y la capa de salmuera se extrajo de nuevo con DCM (100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico (50 g) durante 2 h, se filtraron a través de Celite y se destilaron a presión reducida hasta sequedad. El sólido resultante se agitó con EtOH desnaturalizado al 95% (130 ml), a 50°C durante 30 minutos y a TA durante 12 h, para formar un sólido cristalino que se lavó con EtOH (30 ml) y se secó al vacío a TA durante 16 h para obtener el compuesto del título en forma de un sólido blanco (21 g, 66% de rendimiento, 98% de pureza). Método A de HPLC. Tiempo de retención 13,18 min.

Preparación 2: triacetato de (2S,3S,4S,5R,6S)-2-(metoxicarboml)-6-(4-(((metil(2-(metilammo)etil)carbamoíl)-oxi)metil)-2-mtrofenoxi)-tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (12)

En un matraz de 100 ml provisto de un agitador magnético se introdujo triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(hidroximetil)-2-nitrofenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (10) (4,86 g, 10 mmoles) y carbonildiimidazol (2,11 g, 13 mmoles), seguido de DCM (50 ml). La mezcla reactiva se agitó a TA durante 3 h para formar una solución de triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(((1H-imidazol-1-carbonil)oxi)metil)-2-nitrofenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro 2H-piran-3,4,5-triilo (11).

En un matraz de 250 ml y 3 bocas equipado con un agitador magnético se introdujo Ní ,N2-dimetiletan-1,2-diamina (3,09 g, 35 mmoles, 3,76 ml) y luego DCM (30 ml). La mezcla reactiva se enfrió a 0°C y se añadió lentamente ácido acético (2,1 g, 35 mmoles, 2 ml) a < 5°C para formar una suspensión. Se añadió lentamente la solución del producto intermedio 11 a la suspensión; la mezcla reactiva se agitó a 0-5°C durante 30 minutos y luego a TA durante 3 horas. Se agregó DCM (30 ml) y agua (60 ml) y la mezcla reactiva se agitó a TA durante 10 minutos. La capa orgánica se lavó con agua (2 x 60 ml), se secó sobre sulfato sódico durante 2 h y se filtró para obtener el compuesto del título en solución (~ 70% de rendimiento), el cual se conservó a 0-4°C y se utilizó sin purificar. Método A de HPLC. Tiempo de retención 11,04 min.

Preparación 3: triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacetN)-4-met¡lp¡per¡dm-3)-N)-(met¡l)ammo)-N-met¡l-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡dm-7-carboxam¡do)etM)(met¡l)carbamoN)ox¡)met¡l)-2-mtrofenox¡)-6-(metoxicarbonilo)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (14)

Un matraz de 1 l y 3 bocas dotado de un agitador magnético se llenó con 3-((3R,4R)-4-metil-3-(metil(7H-pirrolo [2,3d]-pirimidin-4-il)amino)piperidin-1-il)-3-oxopropanonitrilo(2) (9,65 g, 31 mmoles), bis (4-nitrofenil)carbonato (12,22 g, 40 mmoles) y ACN (240 ml) y la mezcla reactiva se enfrió a 0°C. Se añadió gota a gota DIPEA (5,59 g, 43 mmoles) y la mezcla reactiva se agitó a TA durante 4 h y luego se enfrió a 0°C. A la mezcla reactiva enfriada se le añadió una solución de triacetato de (2S,3S,4S,5R,6S)-2-(metoxicarbonil)-6-(4-(((metil(2-(metilamino)etil)-carbamoíl)oxi)metil)-2-nitrofenoxi)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (12) en DCM (350 ml, 30 mmoles) a < 10°C y la mezcla reactiva se agitó a 15°C durante 1 h y luego se paró con ácido acético (2.5 g, 42 mmoles). Se añadió DCM (200 ml) y agua (300 ml), se separaron las capas y la capa orgánica se lavó con carbonato sódico al 3% (2 x 350 ml) y luego con HCl 0,5 M (2 x 200 ml) y con cloruro sódico al 10% (200 ml), y se secó sobre sulfato sódico (50 g) durante 5 h, se filtró y se concentró hasta ~ 100 ml. La solución concentrada se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (columna de sílice de 600 g, caudal de 60 ml/min, gradiente: DCM al 40% en EtOAc hasta EtOAc al 100% durante 5 min, EtOAc al 100% durante 60 min, MeOH al 3% hasta el 5% MeOH en EtOAc durante 30 minutos, MeOH al 5% en EtOAc hasta el final). Las fracciones puras se combinaron y se destilaron al vacío hasta sequedad para obtener el compuesto del título (21,2 g, 97% de pureza, 73% de rendimiento). Método A de HPLC. Tiempo de retención 13,92 min.

Ejemplo 1: ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-cianoacetil)-4-metilpiperidm-3)-il)(metil)ammo)-N-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirim idm-7-carboxamido)etil)(metil)carbamoíl)oxi)metil)-2-mtrofenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (1)

Un matraz de 500 ml con 3 bocas y un agitador magnético se llenó con triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((((2-(4-(((3R,4R))1-(2-cianoacetil)-4-metilpiperldin-3-il)(metil)amino)-N-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-7-carboxamido)etil)-(metil)carbamoíl)oxi)metil)-2-nitrofenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (14) (20,9 g, 22 mmoles) y THF (210 ml). La mezcla reactiva se enfrió a 0°C y se añadió LiOH 1 M en agua (46 ml, 47 mmoles) durante 20 minutos y la mezcla reactiva se agitó durante 20 min. Se añadió otra porción igual de solución de LiOH durante 30 min y la mezcla reactiva se agitó durante 2 h. Se añadió ácido acético (5,6 g, 93 mmoles) y la mezcla reactiva se transfirió a un matraz de fondo redondo de 2 l. A este matraz se le añadió ACN (500 ml) y la mezcla se destiló a presión reducida para eliminar 600 ml de disolvente. El proceso se repitió dos veces, destilando la tercera vez hasta sequedad. El sólido resultante se disolvió en ACN al 2% en agua (350 ml) y se purificó en lotes de 90 ml por cromatografía de fase inversa (columna C-18 con 450 g de sílice, caudal de 40 ml/min, disolvente A: ácido acético al 0,5% en agua; disolvente B: Ac N; gradiente: 110 min en total (tiempo (min) /% de B): 0/2, 10/2, 100/28, 110/28, seguido de lavado con 90% de B. Se juntaron las fracciones del producto, se repitió tres veces el proceso y las fracciones combinadas se concentraron hasta aproximadamente 600 ml y se liofilizaron para obtener el compuesto del título en forma sólida (11,2 g, 60% de rendimiento, 99% de pureza). Método A de HPLC. Tiempo de retención 7,95 min.

Ejemplo 2: ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-ammo-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-cianoacetil)-4-metilpiperidm-3-il)(metil)-ammo)-N-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidm-7-carboxamido)etil)(metil)carbamoíl)oxi)metil)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (3)

(a) triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-am¡no-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4)-met¡lp¡per¡d¡n-3-¡l)(met¡l)-am¡no)-N-met¡l-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carboxam¡do)et¡l)(met¡l)carbamoíl)ox¡)met¡l)fenox¡)-6-(metox¡carbon¡l)tetrah¡dro-2w-piran-3,4,5-tr¡ilo (15)

A una soluc¡ón de tr¡acetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4)-met¡lp¡per¡d¡n-3-¡l)(met¡l)-am¡no)-N-met¡l-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carboxam¡do)et¡l)(met¡l)carbamoíl)ox¡)met¡l)-2-n¡trofenox¡)-6-(metox¡-carbon¡l)tetrah¡dro-2H-p¡ran-3,4,5-tr¡¡lo (14) (1,55 g, 1,65 mmoles) en EtOH (50 ml) se le añad¡ó h¡dróx¡do de palad¡o sobre carbono (11,57 mg, 0,08 mmoles). La soluc¡ón react¡va se ag¡tó en atmósfera de h¡drógeno a la temperatura amb¡ente durante 3 días, se f¡ltró a través de un bloque de Cel¡te, se lavó con EtOH y se concentró al vacío. El mater¡al bruto a¡slado en forma de espuma marrón se usó s¡n pur¡f¡carlo más. (m/z): [M+H]⁺ calculado para C⁴²H⁵³N⁹O¹⁴ 908,37; encontrado 908,8.

(b) ác¡do (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-am¡no-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4)-met¡lp¡per¡d¡n-3-¡l)(met¡l)am¡no)-N-met¡l-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carboxam¡do)et¡l)(met¡l)carbamoíl)ox¡)met¡l)fenox¡)-3,4,5-tr¡h¡drox¡tetrah¡dro-2H-p¡ran-2-carboxíl¡co (3)

A una soluc¡ón del producto de la etapa anter¡or (0,95 g, 1,05 mmoles) en una mezcla 1:1:1 de MeOH (3,49 ml), THF (3,49 ml) y agua (3,49 ml) se le añad¡ó L¡OH (63 mg, 2,62 mmoles) y la mezcla se ag¡tó a la temperatura amb¡ente durante 1 h. La soluc¡ón react¡va se concentró al vacío y el mater¡al bruto se pur¡f¡có por cromatografía en columna de fase ¡nversa para obtener el compuesto del título (96 mg, 12% de rend¡m¡ento) en forma de un sól¡do blanco. Método B de HPLC. T¡empo de retenc¡ón 0,85 m¡n.

Preparación 4: 4-mtrofeml-4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacetN)-4-metNp¡per¡dm-3-M)(metM)ammo)-7H-p¡rrolo[2,3-d]-pirim idin-7-carboxilato (13)

A una soluc¡ón de 3-((3R,4R)-4-met¡l-3-(met¡l(7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-4-¡l)am¡no)p¡per¡d¡n-1-¡l)-3-oxopropanon¡tr¡lo (2) (0,75 g, 2,40 mmoles) en DCM (12 ml) se le añad¡ó una soluc¡ón de h¡dróx¡do sód¡co (0,29 g, 7,20 mmoles) en agua (4,00 ml) y bromuro de tetrabut¡lamon¡o (0,08 g, 0,24 mmoles). Se añad¡ó lentamente una soluc¡ón de cloroform¡ato de 4-n¡trofen¡lo (0,97 g, 4,80 mmoles) en DCM (4 ml). La mezcla react¡va se ag¡tó a TA durante 1 h, se extrajo con DCM y la capa orgán¡ca se lavó con soluc¡ón saturada de cloruro amón¡co y salmuera, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. El residuo bruto se purificó por cromatografía en columna (0-100% de EtOAc en hexanos) para obtener el compuesto del título (0,94 g, 82%) en forma de un sólido amarillo claro. (m/z):

[M+H]⁺ calculado para C²³H²³N⁷O⁵478,18; encontrado 478,2.

Preparación 5: triacetato de (2S,3S,4S,5R,6S)-2-(metoxicarboml)-6-(4-(((metil(2-(metilammo)etil)carbamoíl)-oxi)metil)fenoxi)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (18)

(a) triacetato de (2S,3S,4S,5R,6S)-2-(metoxicarbonil)-6-(4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenoxi)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (17)

A una solución de triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(hidroximetil)fenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (16) (27,0 g, 61,3 mmoles) y Et³N (25,5 ml, 17,0 mmoles) en DCM (250 ml) se le añadió lentamente una solución de cloroformiato de p-nitrofenilo (18,53 g, 91,9 mmoles) en DCM (100 ml). La solución se agitó a TA durante 1 h, se diluyó con agua (100 ml) y se extrajo con DCM (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida y el residuo bruto se purificó por cromatografía en columna (35% de EtOAc en hexanos) para dar el compuesto del título (37,0 g, 56% de rendimiento).

(b) triacetato de (2S,3S,4S,5R,6S)-2-(metoxicarbonil)-6-(4-(((metil(2-(metilamino)etil)carbamoíl)oxi)metil)fenoxi)tetrahidro-2H- piran-3,4,5-triilo (18)

A una solución de triacetato de (2S,3S,4S,5R,6S)-2-(metoxicarbonil)-6-(4-(((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenoxi)-tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (17) (0,50 g, 0,83 mmoles) en DCM (8,26 ml) se le añadió a temperatura ambiente N1,N2-dimetiletan-1,2-diamina (0,44 ml, 4,13 mmoles). Al cabo de 1,5 h, la solución reactiva se filtró y se lavó con DCM. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna (0-10% de MeOH en DCM) para obtener el compuesto del título (354 mg, 77% de rendimiento) en forma de un sólido coloreado. (m/z): [M+H]⁺ calculado para C²⁵H³⁴N²O¹² 555,21; encontrado 555,6.

Los siguientes productos intermedios se prepararon mediante un proceso análogo a la preparación 5:

Ejemplo 3: ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-cianoacetil)-4-metMpiperidm-3)-il)(metil)ammo)-N-metM-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidm-7-carboxamido)etil)(metil)carbamoN)oxi)metM)fenoxi)3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (4)

(a) triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4-met¡lp¡per¡d¡n-3)-¡l)(met¡l)am¡no)-N-met¡l-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carboxam¡do)et¡l)-(met¡l)carbamoíl)ox¡)met¡l)fenox¡)-6-(metox¡carbon¡l)tetrah¡dro-2H-p¡ ran-3,4,5-tr¡¡lo (22)

A una soluc¡ón de tr¡acetato de (2S,3S,4S,5R,6S)-2-(metox¡carbon¡l)-6-(4-(((met¡l(2-(met¡lam¡no)et¡l)carbamoíl)ox¡)-met¡l)fenox¡)tetrah¡dro-2H-p¡ran-3,4,5-tr¡¡lo (18) (0,35 g, 0,63 mmoles) y 4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4-met¡lp¡per¡d¡n-3-¡l)(met¡l)am¡no)-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carbox¡lato de 4-n¡trofen¡lo (13) (0,30 g, 0,63 mmoles) en DMF (5,05 ml) se le añad¡ó Et3N (0,13 ml, 0,95 mmoles) y la mezcla resultante se ag¡tó a 40°C. Al cabo de 1,5 h la LC/MS ¡ndícó la formac¡ón de producto l¡mp¡o. La soluc¡ón react¡va se enfrió hasta la temperatura amb¡ente y se concentró al vacío. El producto bruto a¡slado en forma de un res¡duo amar¡llo se ut¡l¡zó s¡n pur¡f¡carlo más. (m/z): [M+H]+ calculado para C42H52N8O14893,36; encontrado 893,9.

(b) ác¡do (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4-met¡lp¡per¡d¡n-3)-¡l)(met¡l)am¡no)-N-met¡l-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carboxam¡do)et¡l)(met¡l)carbamoíl)ox¡)met¡l)fenox¡)-3,4,5-tr¡h¡drox¡tetrah¡dro-2H-p¡ran-2-carboxíl¡co (4)

A una soluc¡ón del producto de la etapa anter¡or (0,56 g, 0,63 mmoles) en una mezcla 1:1:1 de MeOH (2,10 ml), THF (2,10 ml) y agua (2,10 ml) se le añad¡ó L¡OH (40 mg, 1,70 mmoles) y la d¡soluc¡ón se agitó a TA, se concentró al vacío y el res¡duo en bruto se purificó por cromatografía en columna de fase ¡nversa para obtener el compuesto del título (0,12 g, 27%) en forma de un sól¡do blanco. (m/z): [M+H]+ calculado para C35H44N8O11 753,31; encontrado 753,8. Método B de HPLC. T¡empo de retenc¡ón 0,98 m¡n.

Ejemplo 4: ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-cianoacetil)-4-metMpiperidm-3)-N)(metM)ammo)-N-metM-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidm-7-carboxamido)etil)(metM)carbamoN)oxi)metM)-2-metMfenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxíNco (5)

(a) triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c\anoaceti\)-4-met\\p\peridin-3)-\\)(meti\)amino)-N-meti\-7H-p\rro\o[2,3-d]pir\m\din-7-carboxam\do)eti\)-(met\\)carbamoí\)ox\)met\\)-2-met\\fenox\)-6-(metoxicarboni\)tetrah\dro-2H-p\ran-3,4,5-tr\\\o (23)

A una solución de triacetato de (2S,3S,4S,5R,6S)-2-(metox\carbon\\)-6-(2-met\\-4-(((met\\(2-(meti\amino)eti\)-carbamoí\)ox\)meti\)fenox\)tetrah\dro-2H-p\ran-3,4,5-tr\\\o (19) (0,46 g, 0,81 mmoles) en DCM (8,0o m\) se le añadió lentamente una solución de 4-(((3R,4R)-1-(2-c\anoaceti\)-4-met\\p\peridin-3-i\)(meti\)amino)-7H-p\rro\o[2,3d]pirimidin-7-carboxilato de 4-n\trofen\\o (13) (0,39 g, 0,81 mmoles) en DCM (3,00 m\) y la solución se agitó a TA durante 1,5 h, se concentró al vacío y el sólido amarillo se usó sin purificarlo más. (m/z): [M+H]+ calculado para C43H54N8O14907,38; encontrado 907,6.

(b) ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c\anoacet\\)-4-meti\p\peridin-3)-i\)(met\\)amino)-N-meti\-7H-p\rro\o[2,3-d]p\r\m\d\n-7-carboxam\do)et\\)(met\\)carbamoí\)ox\)met\\)-2-met\\fenox\)-3,4,5-tr\h\drox\tetrah\dro-2H-p\ran-2-carboxí\\co (5)

A una solución enfriada con hielo del producto de la etapa anterior (0,73 g, 0,81 mmoles) en MeOH (29 m\) se añadió lentamente una solución acuosa de LiOH (4,04 m\, 4,04 mmoles). Después de agitar a 0°C durante 1,5 h, la solución reactiva se ajustó a pH 5-6 añadiendo lentamente HCl 1 N. La solución reactiva se concentró al vacío y el material bruto se purificó por cromatografía en columna de fase inversa para obtener el compuesto del título (0,47 g, 76% de rendimiento) en forma de un sólido blanco. (m/z): [M+H]+ calculado para C36H46N8O11 767,33; encontrado 767,8. Método B de HPLC. Tiempo de retención 1,02 min.

Ejemplo 5: ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-cloro-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-cianoacetM)-4)-metNpiperidm-3-il)(metM)-ammo)-N-metM-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidm-7-carboxamido)etM)(metil)carbamoíl)oxi)metM)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (6)

(a) triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-cloro-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4)-met¡lp¡per¡d¡n-3-¡l)(met¡l)-am¡no)-N-met¡l-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carboxam¡do)et¡l)(met¡l)carbamoíl)ox¡)met¡l)fenox¡)-6-(metox¡carbon¡l)tetra-h¡dro-2W-piran-3,4,5-triilo (24)

A una soluc¡ón de tr¡acetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-cloro-4-(((met¡l(2-(met¡lam¡no)et¡l)-carbamoíl)ox¡)met¡l)fenox¡)-6-(metox¡carbon¡l)tetrah¡dro-2H-p¡ran-3,4,5-tr¡¡lo (20) (0,33 g, 0,57 mmoles) y 4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4-met¡lp¡per¡d¡n-3-¡l)(met¡l)am¡no)-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carbox¡lato de 4-n¡trofen¡lo (13) (0,27 g, 0,57 mmoles) en DMF (4,52 ml) se le añad¡ó Et3N (0,12 ml, 0,85 mmoles) y la soluc¡ón resultante se ag¡tó a 40°C. Después de 1 h, la soluc¡ón se concentró al vacío. El producto se a¡sló en forma de un res¡duo amar¡llo que se usó s¡n pur¡f¡carlo más. (m/z): [M+H]+ calculado para C42H510N8O14927,32; encontrado 927,7.

(b) ác¡do (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-cloro-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4)-met¡lp¡per¡d¡n-3-¡l)(met¡l)am¡no)-N-met¡l-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carboxam¡do)et¡l)(met¡l)carbamoíl)ox¡)met¡l)fenox¡)-3,4,5-tr¡h¡drox¡tetrah¡dro-2H-p¡ran-2-carboxíl¡co (6)

A una soluc¡ón de tr¡acetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-cloro-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4-met¡lp¡per¡d¡n-3-¡l)(met¡l)am¡no)-N-met¡l-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carboxam¡do)et¡l)(met¡l)carbamoíl)ox¡)met¡l)fenox¡)-6-(metox¡-carbon¡l)tetrah¡dro-2H-p¡ran-3,4,5-tr¡¡lo (0,52 g, 0,57 mmoles) en una mezcla 1:1:1 de MeOH (1,88 ml), THF (1,88 ml) y agua (1,88 ml) se le añad¡ó L¡OH (40 mg, 1,53 mmoles) y la soluc¡ón se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 2 h. La soluc¡ón react¡va se concentró al vacío y el mater¡al bruto se pur¡f¡có por cromatografía en columna de fase ¡nversa para obtener el producto f¡nal (0,22 g, 49%) en forma de un sól¡do blanco. (m/z): [M+H]+ calculado para C35H43ON8O11 787,27; encontrado 787,8. Método B de HPLC. T¡empo de retenc¡ón 1,04 m¡n.

Ejemplo 6: ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-cianoacetil)-4-metMpiperidm-3)-il)(metM)ammo)-N-metM-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidm-7-carboxamido)etil)(metM)carbamoíl)oxi)metM)-2-metoxifenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (7)

(a) triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4-met¡lp¡per¡d¡n-3)-¡l)(met¡l)am¡no)-N-met¡l-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carboxam¡do)et¡l)(met¡l)carbamoíl)ox¡)met¡l)-2-metox¡fenox¡)-6-(metox¡carbon¡l)tetrah¡dro-2H-p¡ran-3,4,5-tr¡¡lo (25)

A una soluc¡ón de tr¡acetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-metox¡-4-((((met¡l(2-(met¡lam¡no)et¡l)carbamoíl)ox¡)met¡l)-fenox¡)-6-(metox¡carbon¡l)tetrah¡dro-2H-p¡ran-3,4,5-tr¡¡lo (21) (0,60 g, 1,02 mmoles) en DCM (l0,00 ml) se le añad¡ó lentamente una soluc¡ón de 4-((((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4-met¡lp¡per¡d¡n-3-¡l)(met¡l)am¡no)-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carbox¡lato de 4-n¡trofen¡lo (13) (0,49 g, 1,02 mmoles) en DCM (3,00 ml) y la mezcla resultante se ag¡tó a t A durante 1,5 h. La soluc¡ón react¡va se concentró al vacío y el sól¡do amarillo resultante se usó s¡n pur¡f¡carlo más. (m/z): [M+H]+ calculado para C43H54N8O15923,37; encontrado 924,1.

(b) ác¡do (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-c¡anoacet¡l)-4-met¡lp¡per¡d¡n-3)-¡l)(met¡l)am¡no)-N-met¡l-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-carboxam¡do)et¡l)(met¡l)carbamoíl)ox¡)met¡l)-2-metox¡fenox¡)-3,4,5-tr¡h¡drox¡tetrah¡dro-2H-p¡ran-2-carboxíl¡co (7)

A una soluc¡ón enfr¡ada con hielo del producto de la etapa anter¡or (0,94 g, 1,02 mmoles) en MeOH (36,80 ml) se le añad¡ó lentamente una d¡soluc¡ón acuosa de L¡OH (5,12 ml, 5,12 mmoles). La mezcla react¡va se agitó a 0°C durante 2 h antes de ajustar el pH de la soluc¡ón a 5-6, añad¡endo lentamente HCl 1 N. La mezcla se concentró al vacío y el res¡duo crudo se pur¡f¡có por cromatografía en columna de fase ¡nversa para obtener el compuesto del título (0,46 g, 57% de rend¡m¡ento) en forma de un sól¡do blanco. (m/z): [M+H]+ calculado para C36H46N8O12783,32; encontrado 783,8. Método B de HPLC. T¡empo de retenc¡ón 0,99 m¡n.

Ejemplo C-1

(a) Compuesto C-5

Se introdujo en un matraz la sal de TFA del compuesto C-3 (285 mg, 0,497 mmoles) y el compuesto C-4 (445 mg, 1,289 mmoles), seguido de DMF (2,485 ml) y trietilamina (0,416 ml, 2,98 mmoles). Al día siguiente la mezcla reactiva se concentró por evaporación rotatoria y se purificó por cromatografía en columna de fase normal (MeOH al 0-15% en DCM durante 15 minutos y a continuación continuamente al 15% durante 5 minutos), para obtener el compuesto del título (90 mg).

(b) Compuesto C-1

Se disolvió el producto de la etapa anterior (45 mg, 0,061 mmoles) y carbonato potásico (33,8 mg, 0,244 mmoles) en MeOH (0,8 ml) y agua (0,4 ml) y se agitó a TA. Al cabo de 2 h se añadió MeOH para formar un azeótropo con agua y se añadió DCM (0,4 ml), seguido de TFA (0,4 ml, 5,19 mmoles). La mezcla reactiva se concentró por evaporación rotatoria, se disolvió en agua:ACN 1:1, se filtró y se purificó por HPLC preparativa para obtener el compuesto del título (17,7 mg, 97% de pureza) en forma de un polvo blanquecino. (m/z): [M+H]+ calculado para C26H30N4O15 639,17; encontrado 639,2.

Preparación del compuesto C-7

A una solución del compuesto C-6 (300 mg, 0,374 mmoles) disuelto en DCM (3,74 ml) se le añadió a 0°C N,N’-dimetiletilendiamina (159 pl, 1,495 mmoles) en una porción. La mezcla reactiva se agitó a 0°C durante 30 minutos, se diluyó en DCM (15 ml) y se lavó con agua (3 x 10 ml). La capa orgánica se lavó con salmuera, se separó, se secó sobre sulfato sódico y se filtró para obtener el producto intermedio del título en forma de un aceite amarillo que se usó sin purificarlo más. (m/z): [M+H]⁺ calculado para C³³H⁴¹N³O¹⁷ 752,24; encontrado 752,4.

Preparación del compuesto C-8

Se añadió bis(2,4-dinitrofenil)carbonato (299 mg, 0,759 mmoles) a una solución de hidruro sódico (36,4 mg, 0,9105 mmoles) disuelto en una mezcla de THF (3,372 ml) y DMF (1,686 ml). La mezcla reactiva se agitó a 0°C durante 1 hora y luego se añadió lentamente una solución de 2-(5-fluoro-4-metilpiridin-3-il)-5-(4-metil-6-(metilsulfonil)piridin-3-il)-1H-indol (compuesto C-2M) (200 mg, 0,506 mmoles) disuelto en THF (1,2 ml) y la mezcla reactiva se calentó a TA. Al cabo de 9 h se añadió bicarbonato sódico saturado y la mezcla reactiva se lavó con salmuera. La capa orgánica se separó, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró. El residuo bruto se purificó por cromatografía en columna (eluido con EtOAc al 0-80% en hexanos) para obtener el producto intermedio del título (109 mg) en forma de un aceite de color marrón. (m/z): [M+H]+ calculado para C28H20FN5O8S 606,10: encontrado 606,3.

Ejemplo C-2

(a) Compuesto C-9

A una solución del compuesto C-8 (250 mg, 0,413 mmoles) en DCM (4,13 ml) se le añadió el compuesto C-9 (310 mg, 0,413 mmoles), seguido de 4-dimetilaminopiridina (22 mg, 0,180 mmoles). La mezcla reactiva se agitó a 40°C durante 1 h, se enfrió a TA y se concentró para obtener el producto intermedio del título que se usó directamente en la siguiente etapa sin purificarlo. (m/z): [M+H]+ calculado para C55H57FN6O20S 1173,33; encontrado 1173,4.

(b) Compuesto C-2

A una solución desgasificada del producto de la etapa anterior (485 mg, 0,413 mmoles) disuelto en THF (4,13 ml) se le añadió tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) (47,7 mg, 0,041 mmoles) y morfolina (360 pl, 4,13 mmoles). La mezcla reactiva se agitó a TA durante 45 minutos, luego se añadió agua y se separaron las capas. La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró al vacío. El residuo crudo se purificó por HPLC preparativa y se liofilizó para obtener el compuesto del título (136 mg, 99% de pureza) en forma de un polvo blanco. (m/z): [M+H]+ calculado para C40H41FN6O14S 881,24; encontrado 881,2.

Ensayos biológicos

Los compuestos de la presente invención se han identificado en uno o más de los siguientes ensayos biológicos. En las descripciones de los ensayos puede aludirse alternativamente al compuesto de la fórmula 1 como compuesto 1 y de manera análoga en caso de los demás compuestos de la presente invención.

Ensayo 1: ensayo bioquím ico de las cinasas JAK

Se realizó un panel de cuatro ensayos bioquímicos LanthaScreen de JAK (JAK1,2, 3 y Tyk2) en un tampón de reacción común de cinasas (HEPES 50 mM, pH 7,5, Brij-35 al 0,01%, MgCh 10 mM y EGTA 1 mM). Los enzimas JAK marcados con GST recombinante y un substrato peptídico STAT1 marcado con GFP se obtuvieron de Life Technologies.

Los compuestos diluidos en serie se preincubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con cada una de los cuatro enzimas JAK y el substrato, en microplacas blancas de 384 pocillos (Corning). Luego se agregó ATP para iniciar las reacciones de cinasa en un volumen total de 10 pl, con 1% de DMSO. Las concentraciones enzimáticas finales de JAK1, 2, 3 y Tyk2 son de 4,2 nM, 0,1 nM, 1 nM y 0,25 nM respectivamente; las concentraciones empleadas de ATP correspondientes a Km son de 25 pM, 3 pM, 1,6 pM y 10 pM, y la concentración del substrato es de 200 nM para los cuatro ensayos. La actividad de la cinasa JAK1 también se ensayó a una concentración 1 mM de ATP. Las reacciones de la cinasa se dejaron proseguir durante 1 hora a temperatura ambiente antes de añadir una preparación de 10 pl de EDTA (concentración final 10 mM) y anticuerpo Tb-anti-pSTAT1 (pTyr701) (Life Technologies, concentración final 2 nM) en tampón de dilución TR-FRET (Life Technologies). Las placas se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 1 hora antes de leerlas en el lector EnVision (Perkin Elmer). Se registraron las señales relativas de emisión (520 nm/495 nm) y se utilizaron para calcular los valores del porcentaje de inhibición respecto a DMSO y controles de fondo.

Para el análisis de dosis-respuesta se representaron gráficamente los datos del porcentaje de inhibición frente a las concentraciones de compuesto y los valores IC⁵⁰ se calcularon a partir de un modelo de ajuste robusto de 4 parámetros con el programa Prism (software GraphPad). Los resultados se expresaron como pIC⁵⁰ (logaritmo negativo de IC⁵⁰) y después se convirtieron en pKi (logaritmo negativo de la constante de disociación Ki) utilizando la ecuación de Cheng-Prusoff. La tabla 1 resume los resultados para el compuesto 1 y el tofacitinib (compuesto 2).

Tabla 1. Potencia enzimática

Ensayo 2: estabilidad metabólica del compuesto 1 en p-Glucuronidasa de E. Coli

Para identificar los metabolitos intermedios y el producto final resultante del tratamiento del compuesto 1 en presencia del enzima p-glucuronidasa, el compuesto 1 (30 pM en DMSO) se incubó a 37°C en presencia de p-glucuronidasa purificada de E. coli (100 unidades/ml en un tampón de fosfato potásico 0,1 M) durante un periodo de 0-90 minutos. Las incubaciones se detuvieron a los 0, 1, 2, 3, 5, 10, 15, 30, 60 y 90 minutos añadiendo 100 pl de ACN. Las muestras se diluyeron con agua 1% de ácido fórmico (4 x) y se analizaron empleando un sistema LC-MS Thermo Q-Exactive™. Las concentraciones de compuesto 1 y tofacitinib se cuantificaron por comparación con unas curvas patrón trazadas a las mismas diluciones que las muestras.

La desaparición rápida del compuesto 1 (vida media < 5 min) fue acompañada por la formación rápida y transitoria de la aglicona intermedia (compuesto b en el esquema 2). Se observó que la conversión de la aglicona intermedia en su subsiguiente diamina intermedia (compuesto d ) y en el metabolito activo final (tofacitinib) era el paso más lento que determinaba la velocidad. Se observó que la concentración de tofacitinib aumentaba gradualmente durante el periodo de tiempo de 90 minutos del ensayo, hasta llegar a una concentración final de 20 pM aproximadamente.

Con el fin de demostrar que la conversión observada del compuesto 1 en tofacitinib era debida a la acción del enzima glucuronidasa, el compuesto 1 (30 pM) se incubó con p-glucuronidasa (45 unidades/ml) y el conocido inhibidor de la p-glucuronidasa bacteriana amoxapina (100 pM). Tras 60 minutos de incubación, la concentración final de tofacitinib en presencia del inhibidor fue de 1 pM, comparada con 7 pM (sin inhibidor).

Ensayo 3: estabilidad metabólica en homogenados preparados a partir de contenido intestinal superior e inferior de rata

La conversión del compuesto 1 en tofacitinib se evaluó en un contenido de lumen intestinal preparado a partir de los diversos segmentos GI aislados de ratas recién sacrificadas. Cada segmento de contenido procedente del duodeno, yeyuno, íleon y colon se diluyó 1:10 en solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS). Una solución madre 10 mM en DPBS del compuesto 1 se diluyó en DMSO para tener una concentración final 10 pM del substrato. La incubación se realizó en un baño de agua a 37°C y los intervalos de tiempo se fijaron en 0, 5, 10, 20, 40 y 60 min. El volumen total de incubación fue de 400 pl; se tomaron alícuotas de 40 pl a cada intervalo de tiempo y se diluyeron en 160 pl con 97% de ACN 3% de ácido fórmico un patrón interno. Las muestras se centrifugaron a 2200 fcr durante 10 minutos y 50 pl del sobrenadante se diluyeron en 150 pl de agua 1% de ácido fórmico. Las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas API 4000 para determinar el compuesto 1 y el tofacitinib. Abajo se indica la vida media encontrada para la desaparición del compuesto 1.

Tabla 2

Ensayo 4: farmacocinética oral del compuesto 1 en ratas

El objetivo de este estudio era comparar la farmacocinética en la mucosa gastrointestinal con la plasmática tras una dosis oral simultánea de compuesto 1 y de tofacitinib. Se dosificaron a ratas macho Sprague Dawley (n = 3/intervalo de tiempo) por sonda gástrica oral 3 mg/kg de compuesto 1 y una dosis normalizada de 1,2 mg de tofacitinib marcado con trideuterio (D³-tofacitinib), formulado como solución al 5% en DMSO 1% de hidroxipropilmetilcelulosa en agua. A cada intervalo de tiempo (0,5, 1,3, 6, 8 y 24 h) se tomaron muestras de plasma por punción cardíaca y se recogieron los siguientes tejidos: estómago, tracto gastrointestinal superior (cortado aproximadamente en tercios [U-1, U-2, U-3]), ciego y tracto gastrointestinal inferior (cortado aproximadamente en dos mitades [L-1, L-2]). Cada muestra de tejido se enjuagó con agua, se secó con un papel absorbente, se transfirió a un recipiente tarado, se pesó, se diluyó con un volumen de agua acidificada 3 veces superior al peso del tejido (p/v), se homogeneizó a 6500 RPM (3 x 45 segundos) y se congeló. Las concentraciones del tofacitinib liberado por el compuesto 1 y del D³-tofacitinib en cada muestra de tejido se determinaron del modo siguiente. Las muestras de tejido se agitaron con turbulencia, se combinaron con un alícuota de 50 pl de plasma de rata, se extrajeron con 200 pl de ACN que contenía un patrón interno y se cuantificaron por LC-MS frente al patrón interno. Las concentraciones del tofactinib liberado por el compuesto 1 se pudieron medir en el plasma entre las 3 y las 8 horas, en el estómago y en las secciones U-1, U-2 y U-3 hasta las 8 horas, y en el ciego y en las secciones L-1 y L-2 entre las 3 y 24 las horas. Las concentraciones de D³-tofacitinib se pudieron medir en el plasma entre las 0,5 y las 8 horas, en el estómago y en las secciones U-1, U-2 y U-3 a lo largo de 8 horas, y en el ciego, y en las secciones L-1 y L-2 entre las 3 y 24 las horas. Los parámetros farmacocinéticos estándar resultantes, la C^máx (concentración máxima) y la ABC (0-t) (área bajo la curva de concentración en función del tiempo, integrada hasta el último intervalo temporal de medición) están indicados en la tabla 3.

Tabla 3: concentración de to facitin ib y de ܳ-tofacitinib en ratas

Ensayo 5: farmacocinética oral del compuesto 1 en monos cynomolgus

El objetivo de este estudio era comparar la farmacocinética colónica y plasmática del compuesto 1 y del tofacitinib tras una dosis oral simultánea. Se dosificaron a monos cynomolgus machos (n = 1/intervalo de tiempo) por sonda gástrica oral 3 mg/kg de compuesto 1 y 2,1 mg/kg de tofacitinib marcado con trideuterio (D3-tofacitinib), formulado como una solución al 98,5% en tampón de citrato pH 6 1 % de hidroxipropil metilcelulosa 0,5% de Tween 20. A cada intervalo de tiempo (0,5, 1, 3, 6, 9 y 24 h) se tomaron muestras de plasma de la vena femoral y se recogieron los siguientes tejidos: estómago, tracto gastrointestinal superior (seccionados aproximadamente en tercios [U-1, U-2, U-3]), ciego, colon proximal, colon distal y recto. Cada muestra de tejido se enjuagó con agua, se secó con papel absorbente, se transfirió a un recipiente tarado, se pesó, se ultracongeló, se pulverizó y se conservó a -70°C. Se diluyó un alícuota de 2 g aproximadamente con un volumen de plasma de rata de control en agua, 3 veces superior al peso del tejido (p/v), se homogeneizó y se guardó a -70°C. Las concentraciones de tofacitinib liberado por el compuesto 1 y de D3-tofacitinib en cada muestra de tejido se determinaron del modo siguiente. Las muestras se agitaron con turbulencia y un alícuota de 50 pl de plasma, o una muestra de tejido preparada, se extrajo con 200 pl de ACN que contenía un patrón interno y se cuantificó por LC-MS frente al patrón interno. Las concentraciones del tofactinib liberado por el compuesto 1 se pudieron medir en el plasma y en todas las muestras de tejido entre las 0,5 y las 24 horas. Las concentraciones de D3-tofacitinib se pudieron medir en el plasma y en el estómago entre las 0,5 y las 9 horas, y en todos los demás cortes de tejido entre las 0,5 y las 24 horas. Los parámetros farmacocinéticos estándar resultantes, la C^máx (concentración máxima) y la ABC (0-t) (área bajo la curva de concentración en función del tiempo, integrada hasta el último intervalo temporal de medición) están indicados en la tabla 4.

Tabla 4: concentración de to facitin ib y de ܳ-tofacitinib en monos

Ensayo 6: modelo murino de colitis inducida por oxazolona

La colitis inducida por oxazolona es un modelo experimental que tiene una semejanza histológica con la colitis ulcerosa humana (Heller y otros, Immunology, 2002, 17, 629-638). En el ensayo se usaron ratones BALB/C adultos (25-28 g, 9-12 semanas de edad) de BioNeeds (India). El día 1 los animales fueron ligeramente anestesiados con isoflurano y se eliminaron con cuidado los pelos entre los omóplatos antes de aplicar lentamente oxazolona (6 mg/ratón, 100 pl, formulación en acetona: aceite de oliva 4:1) o solución de vehículo para sensibilizar la piel. Seis días después de la sensibilización de la piel, se dejó a los ratones en ayunas durante la noche, se anestesiaron con ketamina y xilazina por vía IP y se insertó cuidadosamente una jeringa de 1 ml llena de solución de oxazolona ~3,8 cm en el colon del ratón. Los animales se pusieron cabeza abajo y se les instiló muy lentamente en el recto oxazolona (0,5 mg/50 pl/ratón en etanol al 50%) o etanol al 50% en suero fisiológico, a lo largo de un minuto. Los ratones se mantuvieron en posición vertical, cabeza abajo, durante otro minuto para asegurar que toda la solución de oxazolona permaneciera dentro del colon. El tratamiento farmacológico (PO BID o TID) o con vehículo se inició la noche anterior a la instilación intrarrectal (IR) de oxazolona. El primer (día 1) y el segundo (día 2) día después de la exposición IR a la oxazolona se evaluó el índice de actividad de la enfermedad (DAI) por medio de experimentadores cegados al tratamiento de cada ratón, de acuerdo con las siguientes subcategorías: consistencia de las heces (0, normales; 2, sueltas; 4, diarrea), sangrado macroscópico y prueba de sangre en heces (0, ausencia; 2, teñido de sangre; 4, presencia manifiesta de sangre), y pérdida de peso (0, ninguna; 1, 1%-5%; 2, 6%-10%; 3, 11 %-15%; 4, más del 15%); Da I = promedio de las puntuaciones de consistencia de las heces presencia de sangre pérdida de peso.

Se calculó el área bajo la curva (ABC), basándose en las puntuaciones DAI totales, para controlar la progresión de la enfermedad durante el curso del ensayo. La ABC de cada grupo experimental se calculó del modo siguiente: ABC = [(día 1 - día 0)-promedio (puntuación DAI del día 0 y del día 1)] [(día 2 - día 1)-promedio (puntuación DAI del día 1 y del día 2)]. Con una prueba t de Student se comparó la puntuación DAI ABC de los grupos vehículo/vehículo y vehículo/ oxazolona para valorar si la enfermedad había sido inducida después del tratamiento con oxazolona. A continuación se realizó un ANOVA unidireccional, con prueba Dunnett post hoc, para comparar la puntuación DAI ABC de los grupos de vehículo/oxazolona y compuesto de ensayo/oxazolona. La significación estadística se definió por un nivel a fijado en p < 0,05.

En el modelo de colitis aguda inducida por oxazolona, el compuesto de la fórmula 1 (3, 10, 30 y 60 mg/kg, PO BID) produjo una reversión significativa de la colitis inducida por oxazolona de magnitud similar a la lograda con tofacitinib (30 y 60 mg/kg, PO BID). En un ensayo aparte, siguiendo el modelo de oxazolona, el compuesto de la fórmula 4 (3, 10 y 30 mg/kg, PO BID) produjo una reversión significativa de la colitis inducida por oxazolona de magnitud similar a la lograda por tofacitinib (30 mg/kg, PO BID)

Ensayo 7: efectos inmunosupresores en células asesinas naturales (NK) de bazo de ratón

La depleción de células esplénicas murinas es un modelo experimental de inmunosupresión (Kudlacz y otros, Am. J. of Transplantation, 2004, 4, 51-57). El compuesto 1 se evaluó en el modelo de células esplénicas murinas, siguiendo el mismo paradigma de tratamiento utilizado en el modelo de colitis inducida por oxazolona (ensayo 6).

En el estudio se usaron ratones adultos Balb/C machos (12-14 semanas de edad) de Harlan. El compuesto 1 (1, 3 y 10 mg/kg, BID) y el tofacitinib (10, 30 y 60 mg/kg, BID) se dosificaron por vía oral durante tres días a ratones ingenuos. Los bazos se recogieron 30 minutos o 3 h después de la última dosis y se trituraron inmediatamente para la tinción del subtipo celular. Antes de la fijación se incubaron anticuerpos marcados con fluoróforo para CD19 (FITC; células B), CD3e (PE; células T-pan) y DX5 (APC; células NK) con muestras de esplenocitos de cada animal, para permitir el análisis simultáneo en % de los múltiples subtipos en el citómetro de flujo El número total de células esplénicas de cada animal se midió mediante el contador celular automático portátil Sceptre™ 2.0.

El número absoluto de población de subtipos linfocíticos (p.ej. de células esplénicas B, T y NK) se calculó multiplicando el porcentaje de cada subtipo por el total de células esplénicas de cada animal. Se usó un ANOVA unidireccional, con prueba Dunnett posthoc, para comparar el número de linfocitos esplénicos del vehículo y de los grupos de compuestos de ensayo. El nivel a se fijó en p < 0,05. Los datos se indicaron como la media ± ESM para cada grupo.

El tofacitinib (10, 30 y 60 mg/kg; PO TID) redujo significativamente los recuentos de células esplénicas NK en función de la dosis. En el mismo estudio, los recuentos de células esplénicas NK no se vieron afectados por el compuesto 1 a dosis PO (BID) de hasta 10 mg/kg (la dosis máxima ensayada). El tratamiento con ambos compuestos no tuvo ningún efecto en las poblaciones de células B y T.

Estos datos, junto con el efecto anticolítico del compuesto 1 en el modelo murino de la colitis inducida por oxazolona (ensayo 6), permiten calcular un índice terapéutico funcional como el indicado en la tabla 5 siguiente.

Tabla 5: índice terapéutico funcional

Ensayo 8: estabilidad del homogenado fecal de colon de rata

El objetivo de este estudio era determinar la estabilidad de los presentes compuestos en el homogenado fecal de colon de rata, es decir, la vida media de descomposición en presencia de la p-glucuronidasa en heces de colon de rata.

Después de sacrificar una rata macho ingenua (~ 300 g), desangrándola por punción cardíaca, se ligó el colon y se llevó a una cámara anaeróbica (AS-580, Anaerobe Systems). El contenido fecal se extrajo dentro de la cámara y se diluyó 1:10 (1 gramo en 9 ml de tampón fosfato) y a continuación se homogeneizó con un Omni Tissue Master portátil. El homogenado fecal se centrifugó a 2000 g durante 10 minutos para separar el sólido y el sobrenadante se extrajo y se destinó a las incubaciones.

Se prepararon muestras de ensayo y un control positivo (sulfasalazina) como soluciones madre 10 mM en DMSO. La concentración final de substrato en cada ensayo fue de 10 pM (30 pM para el compuesto 5). Las reacciones se iniciaron agregando un alícuota de 5 pl de solución madre del compuesto de ensayo diluido en 300 pl del sobrenadante fecal de rata homogeneizado. A los 0, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos del inicio de la reacción se extrajo un alícuota de 50 pl y se diluyó en 200 pl de acetonitrilo con 3% de ácido fórmico y una molécula patrón interna. Todas las muestras se centrifugaron a 2000 g durante 10 minutos y después se diluyeron 50 pl del sobrenadante en 150 pl de agua para su análisis en un sistema LC-MS. Las vidas medias in vitro de pérdida de profármaco se calcularon del siguiente modo: (T ^ = 0,693/constante de la tasa de eliminación).

Tabla 6. Estabilidad colónica in vitro

Ensayo 9: farmacocinética oral en ratones

El objetivo de este estudio era evaluar la conversión de los profármacos de la presente invención a tofacitinib en el plasma y en el colon tras la administración oral a ratones.

Los ratones macho Balb/c (n = 2 /intervalo de tiempo) recibieron por sonda gástrica oral una dosis PO única (5 mg/kg en una mezcla 1:20 de DMSO al 5% e HPMC al 1 %) de los compuestos de ensayo. A las 2 horas y 6 horas después de la dosificación se sacrificaron los ratones, desangrándolos por punción cardíaca; las muestras de sangre obtenidas se introdujeron en tubos Microtainer® que contenían NaF y después se colocaron sobre hielo. El plasma se obtuvo centrifugando (centrífuga Eppendorf 5804R) a 4°C durante 4 minutos a 12.000 rpm aproximadamente.

Se extrajeron los colones de los ratones desangrados y se eliminó cuidadosamente el contenido fecal del colon. Los colones se enjuagaron con suero fisiológico y se secaron con papel absorbente. Luego se homogeneizaron en 3 veces su volumen de agua esterilizada, utilizando un homogeneizador Precellys a 4°C aproximadamente. Todas las muestras se conservaron a -80°C para su posterior bioanálisis.

Las concentraciones del tofacitinib liberado del profármaco en cada muestra de tejido se determinaron del siguiente modo: las muestras de plasma y de homogenado de colon se agitaron con turbulencia, se combinaron con un alícuota de 50 |jl de plasma de rata, se extrajeron con 200 j l de ACN que contenía un patrón interno y se cuantificaron por LC-MS frente al patrón interno. Se calculó un área bajo la curva de concentración (ABCo-6 h) en plasma y en colon para el compuesto de ensayo y el tofacitinib liberado. El parámetro clave para evaluar la idoneidad fue la relación de las ABC de tofacitinib en colon/plasma.

Tabla 7: concentración de to facitin ib en los ratones

Ensayo 10: farmacocinética oral en ratas

El objetivo de este estudio era evaluar la conversión de los profármacos de la presente invención a tofacitinib en el plasma y en el colon tras la administración oral a ratas.

Las ratas macho Sprague Dawley (n = 2 /intervalo de tiempo) recibieron por sonda gástrica oral una dosis PO única (5 mg/kg en una mezcla 1:20 de DMSO al 5% e HPMC al 1%) de los compuestos de ensayo. A las 0,5, 1, 3, 6 y 24 horas posteriores a la dosificación se sacrificaron las ratas, desangrándolas por punción cardíaca; las muestras de sangre obtenidas se introdujeron en tubos Microtainer® que contenían NaF y luego se colocaron sobre hielo. El plasma se obtuvo centrifugando (centrífuga Eppendorf 5804R) a 4°C durante 4 minutos a 12.000 rpm aproximadamente.

Se extrajeron los colones de las ratas desangradas y se eliminó cuidadosamente el contenido fecal del colon. Los colones se enjuagaron con suero fisiológico y se secaron con papel absorbente. Luego se homogeneizaron en 3 veces su volumen de agua esterilizada, utilizando un homogeneizador Precellys a 4°C aproximadamente. Todas las muestras se conservaron a -80°C para su posterior bioanálisis.

Las concentraciones del tofacitinib liberado del profármaco en cada muestra de tejido se determinaron del siguiente modo: las muestras de plasma y de homogenado de colon se agitaron con turbulencia, se combinaron con un alícuota de 50 j l de plasma de rata, se extrajeron con 200 j l de ACN que contenía un patrón interno y se cuantificaron por LC-MS frente al patrón interno. Se calculó un área bajo la curva de concentración (ABC^{0 -6} h) en plasma y en colon para el compuesto de ensayo y el tofacitinib liberado. El parámetro clave para evaluar la idoneidad fue la relación de las ABC de tofacitinib en colon/plasma.

Tabla 8: concentración de to facitin ib en las ratas

Ensayo 11: estabilidad metabólica de los compuestos comparativos en el contenido de colon de rata

Se recogió el contenido fecal del colon de una rata Sprague Dawley macho ingenua y se diluyó 1:10 (1 gramo en 9 ml de tampón fosfato) y luego se homogeneizó mediante un Omni Tissue Master portátil. Los compuestos de ensayo, los compuestos comparativos C-1 y C-2, así como el compuesto de la presente invención, el compuesto 1, se prepararon como soluciones madre 10 mM en DMSO y se diluyeron en tampón fosfato hasta una concentración final de substrato de 10 jM . Se añadió un alícuota de 5 j l del compuesto de ensayo diluido en 300 j l de contenido de colon de rata homogeneizado para iniciar la reacción a 37°C. Se extrajeron alícuotas (50 j l) de las incubaciones en los siguientes intervalos de tiempo (0, 15, 50, 85 y 120 min) y se añadieron a 200 j l de ACN con ácido fórmico al 3% y una molécula patrón interna. Las curvas estándar de cada metabolito, de tofacitinib, de 5-ASA (compuesto C-1M) y del inhibidor del CRAC (compuesto C-2M) se trazaron usando la misma matriz y procedimiento de dilución que con las muestras. Todas las muestras se centrifugaron a 2000 x g durante 10 minutos y luego se diluyeron 50 j l de sobrenadante en 150 j l de agua y se analizaron mediante un sistema LC-MS Thermo Q-Exactive. Para tabular y representar los datos se usaron los programas GraphPad Prism y Microsoft Excel.

Después de la incubación a una concentración de substrato de 10 jM en contenido de colon de rata, los compuestos comparativos, así como el compuesto de la presente invención, mostraron una rápida pérdida de la molécula original en la incubación (vidas medias < 15 min). Sin embargo, al medir el metabolito activo de cada profármaco se vio que solo el compuesto 1 había producido niveles medibles de su metabolito activo, el tofacitinib. Después de 120 minutos de incubación se midió una concentración de tofacitinib de 8,8 pM.

En cambio los compuestos C-1 y C-2 no lograron generar cantidades medibles de sus metabolitos activos (compuestos C-1M y C-2M, respectivamente). La producción de metabolitos con el tiempo, a lo largo de 120 minutos, se ilustra en la figura 1.

Aunque la presente invención se ha descrito haciendo referencia a aspectos específicos o a formas de ejecución de la misma, los especialistas en la técnica comprenderán que pueden hacerse varios cambios sin apartarse del alcance de la presente invención, tal como está definida en las reivindicaciones.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la fórmula (I):

donde

n es 0, 1 o 2;

R1 se elige entre hidrógeno, alquilo C^{1 - 4} , alcoxi C^{1 -3} , amino, nitro, halo, ciano, hidroxilo y triflurometilo;

cada R2, cuando está presente, se elige independientemente entre alquilo C^{1 - 4} , alcoxi C^{1 - 3} , amino, nitro, halo, ciano, hidroxilo y triflurometilo;

R3 es hidrógeno, metilo o etilo;

R4 es hidrógeno, metilo o etilo;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el cual R1 es hidrógeno.

3. El compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el cual R1 es nitro.

4. El compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el cual R1 es amino.

5. El compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el cual n es 0.

6. El compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el cual n es 1.

7. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene la fórmula (II):

donde

R1 se elige entre hidrógeno, alquilo C^{1 -4} , alcoxi C^{1 - 3} , amino, nitro, halo, ciano, hidroxilo y triflurometilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

8. El compuesto de la reivindicación 7 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el cual R1 se elige entre hidrogeno, metilo, metoxi, amino, nitro y cloro.

9. El compuesto de la reivindicación 7 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el cual R1 es hidrogeno.

10. El compuesto de la reivindicación 7 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el cual R1 es amino.

11. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene la fórmula 1:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

12. El compuesto de la reivindicación 11, que es

13. Una composición farmacéutica que contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable y el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Un proceso para preparar el compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el cual consiste en desproteger un compuesto de la fórmula (I-A):

o una sal del mismo; donde R1, R2, R3, R4 y n son tal como se han definido en la reivindicación 1; cada PGa es independientemente un grupo protector de hidroxilo y PGb es un grupo protector de carboxilo; a fin de obtener un compuesto de la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

15. El proceso de la reivindicación 14, en el cual R1 es nitro; R3 y R4 son metilo; cada PGa es acetilo; PGb es metilo, y n es 0.

16. El proceso de la reivindicación 14 para preparar el compuesto de la fórmula 1:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el cual el compuesto de la fórmula (I-A) es un compuesto de la fórmula 14':

o una sal del mismo

y el proceso consiste además en:

(a) hacer reaccionar un compuesto de la fórmula 12':

o una sal del mismo; en el cual cada PGa es independientemente un grupo protector de hidroxilo, con un compuesto de la fórmula 13:

para obtener el compuesto de la fórmula 14' o una sal del mismo.

17. Un compuesto de la fórmula 13:

o una sal del mismo.

18. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria intestinal de un mamífero.

19. El compuesto de la reivindicación18, siendo la enfermedad inflamatoria intestinal colitis ulcerosa.

20. El compuesto de la reivindicación18, siendo la enfermedad inflamatoria intestinal la enfermedad de Crohn.

21. El compuesto de la reivindicación18, siendo la enfermedad inflamatoria intestinal la colitis ulcerosa relacionada con la terapia inhibidora del punto de control inmunitario

22. Un profármaco glucurónido de tofacitinib según las reivindicaciones 1 a 12 para usar en un método de liberación de tofacitinib en el colon de un mamífero, de manera que el profármaco es escindido por p-glucuronidasa en el colon liberando el tofacitinib.