CN108290918B - 用于治疗胃肠发炎疾病的jak抑制剂化合物的前药 - Google Patents

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Abstract

本发明提供作为JAK抑制剂的前药的式(I)化合物，其用于将JAK抑制剂靶向递送至哺乳动物的胃肠道。本发明还提供包含所述化合物的医药组合物、使用所述化合物治疗胃肠发炎疾病的方法和可用于制备所述化合物的方法和中间体。

Description

用于治疗胃肠发炎疾病的JAK抑制剂化合物的前药
技术领域
本发明是针对经设计以将JAK抑制剂靶向递送至胃肠道的化合物。本发明还针对包含所述化合物的医药组合物，使用所述化合物治疗胃肠发炎疾病的方法，和适用于制备所述化合物的方法和中间体。
背景技术
主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn's disease)的发炎性肠病包括胃肠道的全部或部分慢性炎症。溃疡性结肠炎的特征在于直肠和大肠粘膜层的炎症和溃疡而克罗恩氏病大部分涉及回肠但可发生在沿肠道的任何地方。常见症状包括腹泻、血便和腹痛。经由恶化和缓解的交替周期间歇性标记溃疡性结肠炎的临床疗程。发病率似乎在发达国家比发展中国家更高。在主要工业化国家，估计有1.3百万人患有溃疡性结肠炎且数量预期随人口增长而增加。患有溃疡性结肠炎的患者罹患结肠直肠癌的风险增加。(例如丹尼斯(Danese)等人，新英格兰医学杂志(N Engl J Med)，2011，365，1713-1725)。另外，在工业化国家中估计有1百万人患有克罗恩氏病。
虽然存在多种治疗选项来增进且维持患者中溃疡性结肠炎(UC)的缓解，但无一者为理想的。柳氮磺胺吡啶相关的治疗在轻度UC中常常有效，但在中度至重度疾病中很少有效。在患有中度至重度UC的患者中，皮质类固醇常常用以提供对缓解的快速诱导。然而，不赞成长期使用类固醇以维持缓解，此是由于其与较长期不良效应(例如骨质疏松和骨折、感染、白内障、较慢的伤口愈合和对肾上腺激素产生的抑止)相关。在中度至重度UC患者中，如硫唑嘌呤、环孢灵和甲胺喋呤的全身性免疫抑止剂具有减缓发作和适度功效，但归因于长期全身性免疫抑止的后果(例如感染和淋巴瘤的风险增加)，长期使用可能存在问题。抗TNFα抗体(例如英利昔单抗(infliximab)和阿达木单抗(adalimumab))虽然昂贵且需要皮下或静脉内投药，但在大约60％至70％患有中度至重度疾病的UC患者中有效。然而，至多三分之一患者不能充分响应，而另外三分之一初始响应者产生超过几周的耐受度(艾尔勒兹(Allez)等人，克罗恩氏病和结肠炎杂志(J Crohn's Colitis)，2010，4，355-366；鲁特吉尔兹(Rutgeerts)等人，新英格兰医学杂志(N Engl J Med)，2005，353，2462-2476)。最新审批通过的UC疗法、维多珠单抗(vedolizumab)、抗α4β7整合素抗体在中度至重度UC患者中有效，但其肠胃外途径为次优的，且经由此机制长期免疫抑止的后果有待确定。尽管现有治疗性选项，但约10％至20％UC患者仍需要在10年诊断期内进行结肠切除术(塔高尼克(Targownik)等人，美国胃肠病学杂志(Am J Gastroenterol)，2012，107，1228-1235)。应了解，对于增进且维持中度至重度UC的缓解，而无由慢性、全身性免疫抑止引起的安全问题的有效治疗，仍存在着未满足的医学需要。
虽然未完全理解引起溃疡性结肠炎的机制，但咸信基因上易感个体的环境因素通过免疫系统至肠微生物群引起不当(过度)反应，导致结肠发炎、组织损害和疾病的相关症状特征。
尽管UC的确切致病机制不明确，但显而易见促炎性细胞激素在免疫反应中发挥关键作用(斯托伯(Strober)等人，胃肠病学(Gastroenterol)，2011，140，1756-1767)。在UC中最常提高的许多促炎性细胞激素(例如，IL-4、IL-6、IL-13、IL-15、IL-23、IL-24、IFNγ和瘦素)依赖于酪胺酸激酶的JAK家族(即，JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2)以用于信号转导。结合至细胞激素受体的配体引起其相关JAK的自体磷酸化，此反过来导致信号转导子和转导活化子(STAT)蛋白的磷酸化。不同STAT形成异二聚体或均二聚体且增进其目标基因在细胞核中的转录以调节如细胞生长、分化和死亡的功能(克拉克(Clark)等人，医药化学杂志(J MedChem)，2014，57，5023-5038)。
对JAK酶的家族的抑制可抑制许多关键促炎性细胞激素的信号传导。因此，JAK抑制剂很可能适用于治疗溃疡性结肠炎和其它发炎疾病，如克罗恩氏病、过敏性鼻炎、哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)。然而，归因于JAK/STAT路径对免疫系统的调节效应，全身性暴露于JAK抑制剂可能具有不利的全身性免疫抑止效应。
2012年11月美国审批通过托法替尼柠檬酸酯(Tofacitinib citrate)
Figure BDA0001668657950000021
(一种口服、全身性可供使用的盘式JAK抑制剂)以治疗对甲胺喋呤(methotrexate)不充分响应或不耐受的患有中度至重度活跃性类风湿性关节炎的成年人。虽然在临床研究中证实剂量越高功效更优，但基于剂量限制、全身性介导的不良迹象(例如，胆固醇增高、机会性感染率增大、嗜中性白细胞减少症、淋巴细胞减少症、淋巴瘤和实体肿瘤)仅认可5mg每天两次(BID)的托法替尼。药物在详述安全性风险的US中携载有黑框警告且基于关于总体安全性的明显且未解决的问题而在欧洲拒绝批准。在积极研发下，用于UC的托法替尼在2期(8周)UC试验中已显示临床反应(桑德伯恩(Sandborn)等人，新英格兰医学杂志(N Engl J Med)，2011，365，1713-1725)，尤其在10mg和15mg BID剂量时(也参见佩恩斯(Panes)等人，BMC胃肠病学(BMC Gastroenterol)，2015，15，14)，目前未获准用于任何适应症。发起人还已经报道了相较于安慰剂组，更大比例的接受10mg BID托法替尼的患者在3期(8周)UC诱导试验中正处于缓解中，并且接受5mg和10mg BID托法替尼的患者在3期(52周)UC维持试验中也处于缓解中。
对于治疗溃疡性结肠炎和其它胃肠发炎疾病，将期望提供化合物在经口投药时实现托法替尼在胃肠道中的足够高暴露以优化临床功效，同时避免全身性剂量限制全身性暴露。
发明内容
在一个方面中，本发明提供JAK抑制剂托法替尼的新颖的含有葡糖苷酸的前药。此类前药利用含有或产生选择性分解含有葡萄糖醛酸的前药部分的丰富的β-葡糖苷酸酶的肠微生物群落以触发托法替尼在胃肠道中(尤其在结肠中)的释放。
出人意料地，本发明的含有葡糖苷酸的前药足够稳定以经分离、配制于医药组合物中并向需要治疗的患者投与。然而，其也充分不稳定，从而由β-葡糖苷酸酶分解且进一步分解以有效释放托法替尼。相比之下，当本发明中所使用的含有葡糖苷酸的前药部分附着至已知或潜在地适用于治疗UC的某些其它药物时，所述药物在与β-葡糖苷酸酶接触时不经释放(如下文更充分地描述)。因此，本发明的含有葡糖苷酸的前药特别适用于递送和释放托法替尼。
在一个方面中，本发明涉及式(I)化合物：
Figure BDA0001668657950000031
其中
n是0、1或2；
R1选自氢、C1-4烷基、C1-3烷氧基、氨基、硝基、卤基、氰基、羟基和三氟甲基；
每个R2(若存在)独立地选自C1-4烷基、C1-3烷氧基、氨基、硝基、卤基、氰基、羟基和三氟甲基；
R3是氢、甲基或乙基；
R4是氢、甲基或乙基；
或其医药学上可接受的盐。
在另一方面中，本发明涉及式(II)化合物：
Figure BDA0001668657950000041
其中
R1选自氢、C1-4烷基、C1-3烷氧基、氨基、硝基、卤基、氰基、羟基和三氟甲基；
或其医药学上可接受的盐。
在一个实施例中，本发明提供式(II)化合物(其中R1选自氢、甲基、甲氧基、氨基、硝基和氯基)或其医药学上可接受的盐。
在另一方面中，本发明涉及式1化合物：
Figure BDA0001668657950000051
或其医药学上可接受的盐。
式1化合物已展示较低口服生物可用性且一旦以临床前物质经口投与之后活体内稳固释放托法替尼(2)而引起结肠暴露比血浆暴露的比率相对于经口给药托法替尼本身而获得的比率显著增加。
Figure BDA0001668657950000052
在一个实施例中，式1化合物与β-葡糖苷酸酶接触之后产生托法替尼或其盐。
在另一方面中，本发明涉及一种包含医药学上可接受的载剂和式(I)、(II)或1化合物，或其医药学上可接受的盐；或本文所描述的其任何特定实施例的医药组合物。
在另一方面中，本发明涉及一种治疗哺乳动物中的胃肠发炎疾病的方法，所述方法包含向哺乳动物投与包含医药学上可接受的载剂和式(I)、(II)或1化合物，或其医药学上可接受的盐；或本文所描述的其任何特定实施例的医药组合物。
在一个实施例中，胃肠发炎疾病是溃疡性结肠炎。在另一实施例中，胃肠发炎疾病是克罗恩氏病。且在另一实施例中，胃肠发炎疾病是与免疫检查点抑制剂疗法相关的结肠炎。
在另一方面中，本发明涉及一种将托法替尼递送至哺乳动物的胃肠道(尤其，至结肠)的方法，所述方法包含向哺乳动物经口投与托法替尼的含有葡糖苷酸的前药，所述前药通过胃肠道中的β-葡糖苷酸酶分解以释放托法替尼。
在独立且不同实施例中，托法替尼的含有葡糖苷酸的前药是式(I)、(II)或1化合物或其医药学上可接受的盐；或本文所描述的其任何特定实施例。
在另一方面中，本发明涉及一种制备式(I)化合物或其医药学上可接受的盐的方法，所述方法包含由式(I-A)化合物：
Figure BDA0001668657950000061
或其盐脱除保护基；其中R1、R2、R3、R4和n如本文所定义；每个PGa独立地是羟基保护基；且PGb是羧基保护基；，获得式(I)化合物或其医药学上可接受的盐。
在此方法的一个实施例中，R1是硝基；R3和R4是甲基；每个PGa是乙酰基；PGb是甲基；且n是0。
在另一方面中，本发明涉及一种式(I-A)化合物或其盐；或本文所描述的其任何特定实施例。
在另一方面中，本发明涉及一种制备式1化合物或其医药学上可接受的盐的方法，所述方法包含：
(a)使式12'化合物或其盐(其中每个PGa独立地是羟基保护基)与式13化合物反应
Figure BDA0001668657950000071
以获得式14'化合物：
Figure BDA0001668657950000072
以及
(b)脱除式14'化合物的保护基以获得式1化合物或其医药学上可接受的盐。
在此方法的一个实施例中，PGa是乙酰基。
在独立且不同的方面中，本发明还涉及式13化合物或其盐；和式14'化合物或其盐；或本文所描述的其任何特定实施例。
在独立且不同的方面中，本发明还涉及适用于制备本发明的化合物的本文所描述的其它合成方法和中间体。
在独立且不同的方面中，本发明还涉及供医学疗法中使用；或供制备药剂或配制物中使用的式(I)、(II)或1化合物或其医药学上可接受的盐；或本文所描述的其任何特定实施例。在一个实施例中，药剂或配制物是用于治疗哺乳动物的胃肠发炎疾病。
本文中公开了本发明的其它方面和实施例。
附图说明
图1说明作为通过大鼠结肠内容物培育本发明的化合物(化合物1)和对比化合物C-1和C-2的结果，活性代谢物、托法替尼和化合物C-1M和C-2M分别随时间变化的浓度。
具体实施方式
在其它方面中，本发明提供JAK激酶抑制剂托法替尼的葡糖苷酸前药、其医药学上可接受的盐和用于其制备的中间体。
如ChemDraw软件(PerkinElmer,Inc.,Cambridge,MA)中所实施，本文中根据IUPAC公约命名化学结构。根据公约，可将式1化合物识别为：
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸，
而托法替尼(2)可被识别为3-((3R,4R)-4-甲基-3-(甲基(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)哌啶-1-基)-3-侧氧基丙腈。
本发明的化合物含有多个手性中心。除非另外指示，否则特定立体异构体的描述或命名意指所指示立构中心具有指定的立体化学，同时应理解为也可存在少量其它立体异构体，其限制条件为所描绘或所命名的化合物的效用不因存在另一立体异构体而消除。
定义
除非另外指明，否则当描述本发明(包括其各种方面和实施例)时，以下术语具有以下含义。
除非在使用上下文中清晰地指明，否则单数术语“一(a/an)”和“所述(the)”包括相应复数术语。
术语“烷基”意指可以是直链或分支链或其组合的单价饱和烃基。除非另外定义，否则这些环烷基通常含有1个至约10个碳原子。代表性烷基包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、第二丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、2,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-乙基丁基、2,2-二甲基戊基、2-丙基戊基等。
当特定数目个碳原子希望用于特定术语时，碳原子数目在术语前展示。举例来说，术语“C1-3烷基”意指具有1至3个碳原子的烷基，其中碳原子呈任何化学可接受的构型，包括直链或分支链构型。
术语“烷氧基”意指单价基团-O-烷基，其中烷基如以上所定义。代表性烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。
术语“卤基”意指氟基、氯基、溴基或碘基。
术语“治疗有效量”意指当投与需要治疗的患者时足以实现治疗的量。
如本文中所使用的术语“治疗”意指对如哺乳动物(具体地说，人类)的患者的疾病、病症或医学病状(如胃肠发炎疾病)的治疗，其包括以下中的一或多种：
(a)预防疾病、病症或医学病状发生，即预防疾病或医学病状复发，或预防性治疗预先易患疾病或医学病状的患者；
(b)改善疾病、病症或医学病状，即消除或引起患者的疾病、病症或医学病状的消退，包括抵消其它治疗剂的作用；
(c)抑止疾病、病症或医学病状，即减缓或阻止患者的疾病、病症或医学病状的发展；或
(d)缓解患者的疾病、病症或医学病状的症状。
术语“医药学上可接受的盐”意指可接受用于投与患者或哺乳动物(如人类)的盐(例如，对于既定给药方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。自酸衍生的代表性医药学上可接受的盐包括乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、乙二磺酸(edisylic)、反丁烯二酸、龙胆酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、麸胺酸、马尿酸、氢溴酸、氢氯酸、羟乙基磺酸、乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘液酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸、烟碱酸、硝酸、乳清酸、帕莫酸(pamoic)、泛酸、磷酸、丁二酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸和羟萘甲酸(xinafoic acid)等。
自医药学上可接受的无机碱衍生的盐类包括铵、钙、镁、钾、钠和锌等。自医药学上可接受的有机碱衍生的盐类包括精胺酸、胆碱、还原葡糖胺、离胺酸、苄乙胺(benethamine)、苄乙二胺(benzathine)、甜菜碱、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、哈胺(hydrabamine)、吗啉、氨基丁三醇(tromethamine)、二乙醇胺、乙醇胺、乙二胺、三乙醇胺、1H-咪唑、哌嗪等盐类。
如本文所使用的术语“其盐”意指一种离子化合物，其中式(I)化合物的形式是离子化合物的阴离子或阳离子。举例来说，离子化合物的阴离子可以是式(I)化合物的去质子化形式的羧酸根阴离子。阳离子可以是式(I)化合物的质子化形式，即氨基已经由酸质子化的形式。通常，盐是医药学上可接受的盐，但此点对于无意投与患者的中间化合物的盐并非必要条件。
式(I)的中性化合物可任选地呈两性离子的形式，其中术语“两性离子”意指具有阳性和阴性电荷的中性分子。
术语“羟基保护基”意指适用于防止羟基发生不当反应的保护基。代表性羟基-保护基包括(但不限于)烷基，如甲基、乙基和叔丁基；烯丙基；酰基，例如烷酰基、如乙酰基；芳基甲基，如苯甲基(Bn)、对甲氧基苯甲基(PMB)、9-芴基甲基(Fm)及二苯甲基(二苯甲基，DPM)；硅烷基，如三甲基硅烷基(TMS)及叔丁基二甲基硅烷基(TBS)；等。
术语“羧基保护基”意指适用于防止羧基发生不当反应的保护基。代表性羧基保护基包括(但不限于)烷基，如甲基、乙基、叔丁基等；芳基甲基，如苯甲基、4-硝基苯甲基、4-甲氧基苯甲基等；硫醇基，如-S-叔丁基等；硅烷基，如三甲基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基等；恶唑啉；等。
本文中所使用的所有其它术语均希望具有其所属相关领域中的一般技术人员所理解的其普通含义。
代表性实施例和子类分组
希望以下取代基和值提供本发明的各种方面和实施例的代表性实例。希望这些代表性值进一步定义并且说明此类方面和实施例，并且不希望排除其它实施例或限制本发明的范围。
在一个实施例中，R1是氢、C1-4烷基、C1-3烷氧基、氨基、硝基、卤基、氰基、羟基或三氟甲基。在另一个实施例中，R1是氢、C1-4烷基、C1-3烷氧基、氨基、硝基或氯。在另一个实施例中，R1是氢、甲基、甲氧基、氨基、硝基或氯。在一个特定实施例中，R1是氢。在另一个特定实施例中，R1是硝基。
在一个实施例中，n是0。在另一个实施例中，n是1。在另一个实施例中，n是2。
当n是1时，在一个实施例中，R2是C1-4烷基、C1-3烷氧基、氨基、硝基、卤基、氰基、羟基或三氟甲基。在另一个实施例中，R2是C1-4烷基、C1-3烷氧基、氨基、硝基、氟或氯。在另一个实施例中，R2是甲基、甲氧基、氨基、硝基、氟或氯。在一个特定实施例中，R2是氟。
当n是1时，R2取代基可以位于R2所连接的苯环上的任何可利用位置。在一个实施例中，R2位于R1的邻位。在另一个实施例中，R2位于R1的间位。在另一个实施例中，R2位于R1的对位。
当n是2时，在一个实施例中，每个R2独立地是C1-4烷基、C1-3烷氧基、氨基、硝基、卤基、氰基、羟基或三氟甲基。在另一个实施例中，每个R2独立地是C1-4烷基、C1-3烷氧基、氨基、硝基、氟或氯。在另一个实施例中，每个R2独立地是甲基、甲氧基、氨基、硝基、氟或氯。
在一个特定实施例中，每个R2是氟。
当n是2时，R2取代基可以位于R2所连接的苯环上的任何可利用位置。在一个实施例中，R2取代基位于R1的邻位和间位。在另一个实施例中，R2取代基位于R1的邻位和对位。在另一个实施例中，R2取代基位于R1的间位和对位。
在一个实施例中，R3是氢。在另一个实施例中，R3是甲基。在另一个实施例中，R3是乙基。
在一个实施例中，R4是氢。在另一个实施例中，R4是甲基。在另一个实施例中，R4是乙基。
在一个实施例中，R3和R4均是甲基。在另一个实施例中，R3和R4之一是氢且另一个是甲基。
在一个实施例中，n是0；R1是氢、甲基、甲氧基、氨基、硝基或氯；R3是甲基；且R4是甲基。
在另一个实施例中，n是0；R1是氢、甲基、甲氧基、氨基、硝基或氯；R3是氢；且R4是甲基。
在另一个实施例中，n是0；R1是氢、甲基、甲氧基、氨基、硝基或氯；R3是甲基；且R4是氢。
在另一个实施例中，n是0；R1是氢、甲基、甲氧基、氨基、硝基或氯；R3是乙基；且R4是乙基。
在另一个实施例中，n是1；R1是氢、甲基、甲氧基、氨基、硝基或氯；R2是甲基、甲氧基、氨基、硝基、氟或氯；R3是甲基；且R4是甲基。
在另一个实施例中，n是1；R1是氢、甲基、甲氧基、氨基、硝基或氯；R2是甲基、甲氧基、氨基、硝基、氟或氯；R3是氢；且R4是甲基。
在另一个实施例中，n是1；R1是氢、甲基、甲氧基、氨基、硝基或氯；R2是甲基、甲氧基、氨基、硝基、氟或氯；R3是甲基；且R4是氢。
合成程序
可根据随附实例中详细描述的合成方法来制备式(I)化合物。如特定用于制备式1化合物的方案1中所说明，合成的关键步骤为在托法替尼与受保护形式的葡糖苷酸前药部分12'之间形成脲键。在方案1中，PGa表示羟基保护基，优选烯丙基或乙酰基，但也可使用其它羟基保护基，包括如叔丁基二甲基硅烷基的硅烷基保护基。
方案1
Figure BDA0001668657950000121
形成此主要脲键最初集中于将托法替尼用作亲核体；然而，认为此键形成步骤为不一致的，此由于托法替尼与一系列不同亲电体的反应仅引起较低产量的期望产物形成。因此认为有必要切换两个搭配物的作用且使托法替尼衍生物为亲电子反应搭配物和使葡糖苷酸前药部分为亲核体。在检验许多试剂之后，确定托法替尼在经由氨基甲酸酯键与反应性对硝苯基或五氟苯基部分接合时可衍生化且提供亲电子。举例来说，氯甲酸对硝苯酯、双(4-硝基苯基)碳酸酯或碳酸双(五氟苯基)酯试剂能够实现所需平衡，具有足够的活性以影响与托法替尼形成键，同时也提供在与葡糖苷酸物质反应的前不太具分解活性的中间产物。所得受保护的中间产物14'(例如当PGa为乙酸酯基团时)在后续步骤中利用氢氧化锂脱除保护基以获得式1化合物。
因此，在一个方面中，本发明提供一种制备化合物1的方法，所述方法包含(a)使受保护的葡糖苷酸前药部分12'与亲电子托法替尼衍生物13反应以获得化合物14'，和(b)脱除化合物14'的保护基以获得式1化合物。在另一方面中，本发明提供亲电子托法替尼化合物13。
针对式1化合物说明β-葡糖苷酸酶对本发明的前药的作用。如方案2中示出，在β-葡糖苷酸酶对式1化合物作用时，通过多步骤方法释放托法替尼：
方案2
Figure BDA0001668657950000131
在初始步骤中，β-葡糖苷酸酶分解式1化合物的糖苷键，使得释放葡萄糖醛酸(a)且形成糖苷配基中间产物(b)。糖苷配基自主分解得到可通过水捕集的苯醌甲基化物物质(c)和丢失二氧化碳以得到二胺(d)的瞬时氨基甲酸。二胺的分子内环化引起形成咪唑烷酮衍生物(e)且释放托法替尼。
如以下实验部分中所描述，已在与纯β-葡糖苷酸酶(分析2)和与新制备的大鼠结肠内容物匀浆(分析3)的培育中观测到式1化合物经由方案2中绘示的中间步骤转化成托法替尼。在这些后半实验中，随时间变化监测式1化合物、糖苷配基中间产物b、二胺中间产物d和托法替尼的浓度。伴随着式1化合物的快速消失，快速且暂时形成糖苷配基b且更慢速率确定二胺d和最终活性代谢物托法替尼的形态。
本发明研究者已确定开始于细菌性β-葡糖苷酸酶解糖苷键以将所需活性部分直接有利地递送至结肠中的作用部位的葡糖苷酸前药化合物的多步分解敏感地取决于键的性质和特定活性部分。美色拉嗪(Mesalamine)、5-氨基水杨酸(5-ASA)(化合物C-1M)是长期用以治疗轻度至中度溃疡性结肠炎的早期试剂。然而，本葡糖苷酸前药途径似乎不适用于将5-ASA直接递送至结肠。在类似于上文提及的实验中，将5-ASA(化合物C-1)的葡糖苷酸前药与大鼠结肠内容物匀浆一起培育。
Figure BDA0001668657950000141
虽然在类似于式1化合物中的时间刻度观测到类似于方案2中的糖苷配基b的瞬时糖苷配基和类似于d的二胺的较慢形态，但不可发现活性代谢物5-ASA的迹象。
最新公开US2013/0109720公开了作为钙释放活性钙通道(CRAC)抑制剂的2-(5-氟-4-甲基吡啶-3-基)-5-(4-甲基-6-(甲磺酰基)吡啶-3-基)-1H-吲哚(化合物C-2M)。还相信CRAC抑制剂适用于治疗发炎疾病。然而，本葡糖苷酸前药途径似乎也不适用于靶向递送此CRAC抑制剂。还在大鼠结肠内容物匀浆中通过类似于化合物C-1所获得的那些的结果研究CRAC抑制剂前药C-2的分解。
Figure BDA0001668657950000142
虽然观测到中间分解产物，但不能发现活性CRAC抑制剂C-2M的释放迹象。
这种迹象表明本发明的前药独特地适合于利用引发细菌性β-葡萄糖醛酸分解机制以在结肠中释放托法替尼。
医药组合物
本发明的化合物和其医药学上可接受的盐通常以医药组合物或配制物的形式使用。因此，在其组合物方面之一中，本发明涉及一种包含医药学上可接受的载剂或赋形剂和式(I)、(II)或1化合物或其医药学上可接受的盐的医药组合物。任选地，必要时这些医药组合物可含有其它治疗剂和/或配制剂。
本发明的医药组合物通常含有治疗有效量的本发明化合物。然而，本领域中的技术人员将认识到，医药组合物可含有多于治疗有效量，即散装组合物，或少于治疗有效量，即针对多次投药而设计以获得治疗有效量的个别单位剂量。
通常地，这些医药组合物将含有约0.1重量％至约95重量％的式(I)化合物；包括约5重量％至约70重量％；如约10重量％至约60重量％的式(I)化合物。
任何常规载剂或赋形剂可用于本发明的医药组合物中。特定载剂或赋形剂或载剂或赋形剂的组合的选择将取决于用于治疗特定患者或医学病状或疾病病况的类型的投药模式。就此来说，对于特定的投药模式，适合医药组合物的制备完全在医药领域的技术人员的范围内。另外，本发明的医药组合物中所使用的载剂或赋形剂可以市购。作为进一步说明，常规的调配技术描述于雷明顿：制药科学和实践(The Science and Practice ofPharmacy)，第20版，利平科特·威廉斯·怀特出版公司(Lippincott Williams&White),马里兰州巴尔的摩(Baltimore,Maryland)(2000)；和H.C.安塞尔(H.C.Ansel)等人，医药剂型和药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，第7版，利平科特·威廉斯·怀特出版公司,马里兰州巴尔的摩(1999)。
可用作医药学上可接受的载剂的物质的代表性实例包括(但不限于)以下：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素，如微晶纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄蓍；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原质水；等张性生理盐水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和医药组合物中所采用的其它无毒的兼容物质。
通常通过将本发明的化合物与医药学上可接受的载剂和一或多种任选的成分彻底且紧密混合或掺合来制备医药组合物。随后可使用常规程序和设备将所得均匀掺合的混合物成形为片剂、胶囊、丸剂等或装载至其中。
本发明的医药组合物优选以单位剂型封装。术语“单位剂型”是指适用于给药患者的实体离散单元，即，每个单元含有经计算以单独或与一或多种额外单元组合产生所需治疗作用的预定量的本发明化合物。举例来说，这些单位剂型可以是胶囊、片剂、丸剂等，或适合于肠胃外投药的单位封装。
在一个实施例中，本发明的医药组合物适合于经口投药。用于经口投药的适合医药组合物可呈胶囊、片剂、丸剂、口含锭、扁囊剂、糖衣药丸、散剂、颗粒形式；或呈存在于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液形式；或呈水包油或油包水液体乳液形式；或呈酏剂或糖浆形式；和其类似形式；各自含有预定量的本发明化合物作为活性成份。
当希望以固体剂型(即，以胶囊、片剂、丸剂等的形式)经口投药时，本发明的医药组合物将通常包含本发明的化合物和如柠檬酸钠或磷酸二钙的一或多种医药学上可接受的载剂。任选地或替代地，此类固体剂型还可包含：填充剂或展剂，如淀粉、微晶纤维素、乳糖、磷酸二钙、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；粘合剂，如羧基甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；保湿剂，如丙三醇；崩解剂，如交联羧甲基纤维素钠、琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和/或碳酸钠；溶解阻滞剂，如烷烃；吸收促进剂，如第四铵化合物；润湿剂，如十六基醇和/或丙三醇单硬脂酸酯；吸附剂，如高岭土和/或膨润土；润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和/或其混合物；着色剂；和缓冲剂。
释放剂、湿润剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂还可存在于本发明的医药组合物中。医药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱胺酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基大茴香醚、丁基化羟基甲苯、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。用于片剂、胶囊、丸剂等的包衣剂包括用于肠溶包衣的那些包衣剂，如邻苯二甲酸乙酸纤维素、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯共聚物、偏苯三甲酸乙酸纤维素、羧甲基乙基纤维素、丁二酸乙酸羟丙基甲基纤维素等。
本发明的医药组合物还可经配制，以使用(例如)呈变化比例的羟丙基甲基纤维素或其它聚合物基质、脂质体和/或微球体，来提供活性剂的减缓或控制释放。另外，本发明的医药组合物可任选地含有乳浊剂且可经配制，使得其任选地以经延迟方式在胃肠道的某一部分中仅仅或优先释放活性成份。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。活性剂还可呈(若适宜)与以上所描述的赋形剂中的一或多种的微囊封形式。
用于经口投药的适合液体剂型(以说明的方式)包括医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。液体剂型通常包含活性剂和惰性稀释剂(如水)或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、油酸、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，和其混合物。替代地，某些液体配制物可(例如)通过喷雾干燥转变成用以通过常规程序制备固体剂型的粉末。
除活性成份以外，悬浮液可含有悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和黄芪胶和其混合物。
以下非限制性实例说明本发明的代表性医药组合物。
片剂口服固体剂型
将本发明化合物或其医药学上可接受的盐与微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲纤维素钠以4:5:1:1的比干燥掺合，且压缩成片剂，得到例如4mg、10mg或20mg活性剂/片剂的单位剂量。
片剂口服固体剂型
将本发明的化合物或其医药学上可接受的盐(40g)与微晶纤维素(445g)、烟雾状二氧化硅(10g)和硬脂酸(5g)彻底掺合。随后在片剂制造机上压缩混合物以形成各重100mg的片剂。各片剂提供适用于经口投药的8mg活性剂/单位剂量。
片剂口服固体剂型
将本发明的化合物或其医药学上可接受的盐(10g)与玉米淀粉(50g)、交联羧甲纤维素钠(25g)、乳糖(110mg)和硬脂酸镁(5mg)彻底掺合。随后在片剂制造机上压缩混合物以形成各重200mg的片剂。各片剂提供适用于经口投药的10mg活性剂/单位剂量。
胶囊口服固体剂型
通过湿式造粒将本发明的化合物或其医药学上可接受的盐与微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠以4:5:1:1的比组合，且装载至明胶或羟丙基甲基纤维素胶囊中，得到例如4mg、10mg或20mg活性剂/胶囊的单位剂量。
胶囊中的散剂
将本发明的化合物或其医药学上可接受的盐(1mg至50mg)填充至希望经口投药的羟丙基甲基纤维素(HPMC)空胶囊中。
液体配制物
将本发明的化合物或其医药学上可接受的盐(50mg)与封闭的瓶子中的100mL低卡路里混合浆果类运动饮品混合且充分溶解于其中。此溶液的不同容积经测量得到不同的剂量水平。
液体配制物
包含本发明的化合物(0.1％)、水(98.9％)和抗坏血酸(1.0％)的液体配制物是通过将本发明的化合物添加至水与抗坏血酸的混合物中来形成。
包覆肠溶包衣口服剂型
将本发明的化合物溶解于含有聚乙烯吡咯烷酮的水性溶液中且以1:5w/w活性剂:珠粒的比率喷雾包覆至微晶纤维素或糖珠粒上，且接着施用大致5％重量增加的包含丙烯酸共聚物(例如在商标名
Figure BDA0001668657950000181
和
Figure BDA0001668657950000182
下可获得的丙烯酸共聚物的组合)或丁二酸乙酸羟丙基甲基纤维素的肠溶性包衣。将包覆肠溶包衣的珠粒装载至明胶或羟丙基甲基纤维素胶囊中，得到例如5mg活性剂/胶囊的单位剂量。
包覆肠溶包衣口服剂型
将包含
Figure BDA0001668657950000183
和
Figure BDA0001668657950000184
的组合或丁二酸乙酸羟丙基甲基纤维素的肠溶包衣施用至上述片剂口服剂型或胶囊口服剂型。
效用
本发明化合物已经设计用以将临床上有效试剂直接递送至胃肠道中的作用部位供治疗胃肠发炎疾病，尤其供治疗如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的发炎性肠道疾病。还期望所述化合物适用于治疗与免疫检查点抑制剂治疗剂相关的结肠炎。具体地说，本发明的葡糖苷酸前药经设计用以利用胃肠道中(尤其结肠中)的丰富的细菌性β-葡糖苷酸酶以主要在下胃肠道中释放JAK抑制剂托法替尼。此外，本发明的例示性化合物已展示不充分地全身性吸收，由此使免疫抑止的风险降到最低。
本发明前药化合物经设计以缺少生物活性。举例来说，式1化合物对于杰纳斯激酶(Janus kinase)(JAK)族酶类、非JAK酶类或一系列G蛋白耦接受体、离子通道和可在胃肠(GI)道或全身性中表现的转运蛋白无显著亲和力，或效能。在投与本发明化合物后的生物活性有助于产生托法替尼。
如以下实验部分中所描述，已在一或多种临床前分析中充分剖析本发明化合物。已展示化合物在大鼠结肠粪便中所存在的β-葡萄糖醛酸的存在下分解。举例来说，在肠内腔内容物与大鼠的十二指肠、回肠、空肠和结肠隔离匀浆培育中研究式1化合物的代谢稳定性和托法替尼的形成。通过托法替尼形成的迹象证实，化合物在十二指肠和空肠内容物(半衰期>60分钟)中的稳定至在回肠内容物(半衰期34分钟)中的中度转化至在结肠内容物(半衰期<5分钟)中的快速转化的递增转化梯度。化合物递增转化的梯度反映细菌自上部GI至下部GI的递增存在量。
已在小鼠、大鼠和食蟹猕猴中研究经口投与本发明化合物后所释放的托法替尼。如以下分析法4、5、9和10中所描述，在所有物质中，所述前药展现托法替尼在结肠中的暴露量显著高于在血浆中的暴露量。具体地说，在大鼠和猴中研究式1化合物在胃肠道的特定节段中释放的托法替尼，且与以等效剂量经口投与托法替尼本身而获得的浓度相比。化合物1不仅在整个胃肠道中的暴露量展现显著高于血浆中的暴露量(例如，在大鼠结肠节段中比率大于500且在猴结肠节段中约60与150之间)，而且GI组织浓度和GI组织对血浆浓度的比率还显示相对于经口投与托法替尼本身所获得的浓度增加。举例来说，在猴中，在与口服托法替尼而获得的浓度比较时，自经口投与前药所观测盲肠、近端和末端结肠组织中的托法替尼浓度为增加五倍至七倍。
还在小鼠恶唑酮诱导的结肠炎模型中测试本发明的某些化合物的功效。式1和4化合物在小鼠恶唑酮诱导的结肠炎模型中证实，要达到等效作用时所需的剂量比直接投与托法替尼时需要的剂量更低。另外，式1化合物的有效剂量与托法替尼的全身性暴露量比托法替尼本身以其有效剂量投药所获得的全身性暴露量降低相关。在小鼠的免疫抑止模型中，化合物1在恶唑酮模型中证实，在达到相比拟的功效时所需要的相同剂量下展示最小的免疫抑止效应(治疗指数>3倍)，而托法替尼在低于其有效剂量的剂量下具有免疫抑止性(治疗指数≤0.3)。
因此，预期本发明的托法替尼的葡糖苷酸前药适用于治疗发炎性肠病，尤其溃疡性结肠炎。还预期本发明化合物适用于治疗克罗恩氏病且治疗与免疫检查点抑制剂疗法(癌症免疫疗法的潜在严重后果)相关的结肠炎。免疫检查点抑制剂疗法包括(但不限于)细胞毒素T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂，如伊派利单抗(ipilimumab)
Figure BDA0001668657950000191
和曲美木单抗(tremelimumab)；渐进式细胞死亡1(PD-1)抑制剂，如派立珠单抗(pembrolizumab)
Figure BDA0001668657950000192
或纳武单抗(nivolumab)
Figure BDA0001668657950000193
和程序化死亡配位体1(PD-L1)抑制剂，如阿特唑单抗(atezolizumab)
Figure BDA0001668657950000194
得瓦鲁单抗(durvalumab)和阿维卢单抗(avelumab)。具体地说，所述化合物经预期适用于治疗CTLA-4抑制剂诱导的结肠炎。所述化合物还可用于治疗其它病状(如移植物抗宿主疾病、口炎性腹泻、微观结肠炎、贮存袋炎和自体免疫性肠病中的胃肠不良效应)。
因此，在一个方面中，本发明提供一种治疗哺乳动物(例如人类)的胃肠发炎疾病的方法，所述方法包含向哺乳动物投与治疗有效量的本发明化合物，或包含医药学上可接受的载剂和本发明化合物的医药组合物。
在一个实施例中，胃肠发炎疾病是溃疡性结肠炎。在另一实施例中，胃肠发炎疾病是克罗恩氏病。且在另一实施例中，胃肠发炎疾病是与免疫检查点抑制剂疗法相关的结肠炎。
本发明进一步提供一种治疗哺乳动物的溃疡性结肠炎的方法，所述方法包含向哺乳动物投与治疗有效量的本发明化合物，或包含医药学上可接受的载剂和本发明化合物的医药组合物。
当用于治疗溃疡性结肠炎时，本发明的化合物将通常以单一日剂量或每日多个剂量经口投与，不过可使用其它投药形式。每剂量投与的活性剂的量或每天投与的总量将通常由医师根据相关情况，包括待治疗的病状、所选投药途径、投与的实际化合物和其相对活性、个别患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度等来确定。
对于平均70kg的人类来说，用于治疗溃疡性结肠炎和其它胃肠发炎病症的合适剂量预计为约2毫克/天至约60毫克/天的式(I)化合物，包括约4毫克/天至约50毫克/天和约4毫克/天至约40毫克/天的范围。
组合疗法
本发明的化合物还可与一或多种通过相同机制或通过不同机制起作用来实现胃肠发炎性病症的治疗的药剂组合使用。用于组合疗法的药剂的有用种类包括(但不限于)氨基水杨酸盐、类固醇、全身性免疫抑止剂、抗TNFα抗体、抗α4(抗VLA-4)抗体、抗整合素α4β7抗体、抗细菌剂和抗腹泻药品。
可与本发明化合物组合使用的氨基水杨酸盐包括(但不限于)美沙拉嗪(mesalamine)、奥沙拉嗪(olsalazine)和柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)。类固醇的实例包括(但不限于)泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone)、布地奈德(budesonide)、倍氯米松(beclomethasone)和氟替卡松(fluticasone)。适用于治疗发炎性病症的全身性免疫抑止剂包括(但不限于)环孢灵、硫唑嘌呤、氨胺喋呤、6-巯基嘌呤和他克莫司(tacrolimus)。此外，在组合疗法中可使用抗TNFα抗体，包括(但不限于)英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、戈利木单抗(golimumab)和赛妥珠单抗(certolizumab)。通过其它机制起作用的有用化合物包括抗α4抗体，如那他珠单抗(natalizumab)；抗整合素α4β7抗体，如维多珠单抗(vedolizumab)；抗细菌剂，如利福昔明(rifaximin)和抗腹泻药品，如洛哌丁胺(loperamide)。(莫扎弗瑞(Mozaffari)等人，生物疗法专家意见(Expert Opin.Biol.Ther.)2014，14，583-600；丹尼斯(Danese)，胃肠病学(Gut)，2012，61，918-932；拉姆(Lam)等人，免疫疗法(Immunotherapy)，2014，6，963-971。)
因此，在另一方面中，本发明提供一种用于治疗胃肠发炎性病症的治疗组合，所述组合包含本发明的化合物和一或多种适用于治疗胃肠发炎性病症的其它治疗剂。举例来说，本发明提供包含本发明的化合物和一或多种选自以下的药剂的组合：氨基水杨酸盐、类固醇、全身性免疫抑止剂、抗TNFα抗体、抗α4抗体、抗整合素α4β7抗体、抗细菌剂和抗腹泻药品。二级药剂(当包括时)以治疗有效量，即以当与本发明的化合物共同投与时产生治疗上有益的效应的任何量存在。
此外，在一方法方面中，本发明提供一种治疗胃肠发炎性病症的方法，所述方法包含向哺乳动物投与本发明的化合物和一或多种适用于治疗胃肠发炎性病症的其它治疗剂。
当用于组合疗法中时，所述药剂可如上文所公开，配制成单一医药组合物，或所述药剂可提供在单独的组合物中，这些单独组合物同时或在不同时间通过相同或通过不同的投药途径投与。当分开投与时，所述药剂的投与在时间上足够接近以便提供所需治疗效应。这些组合物可分开地封装或可作为试剂盒共同封装。试剂盒中两种或更多种治疗剂可通过相同的投药途径或通过不同的投药途径投与。
实例
提供以下合成和生物实例来说明本发明，且不以任何方式解释为限制本发明的范畴。除非另外指示，否则在以下实例中，以下缩写具有以下含义。以下未定义的缩写具有其一般可接受的含义。
Ac＝ 乙酰基
ACN＝ 乙腈
alloc＝ 烯丙氧羰基
d＝ 天数
DCM＝ 二氯甲烷
DIPEA ＝ N,N-二异丙基乙胺
DMAP＝ 4-二甲氨基吡啶
Et3N＝ 三乙胺
EtOAc ＝ 乙酸乙酯
EtOH＝ 乙醇
h＝ 小时
IPA＝ 异丙醇
MeOH＝ 甲醇
min＝ 分钟
RT＝ 室温
tBu＝ 叔丁基
TFA＝ 三氟乙酸
THF＝ 四氢呋喃
试剂和溶剂购自商业供货商(Sigma-Aldrich、Fluka等)且不经进一步提纯即使用。通过薄层层析(TLC)、分析型高效液相层析(anal.HPLC)和质谱分析监测反应混合物的进展。如各反应中具体描述来处理反应混合物；通常通过萃取和其它提纯方法(如温度依赖性和溶剂依赖性结晶和沉淀)来提纯反应混合物。另外，通过柱层析或通过制备型HPLC，通常使用C18或BDS柱填充物和常规洗提剂来常规提纯反应混合物。下文描述典型的制备型HPLC条件。
通常通过质谱法和分析型HPLC进行反应产物的表征。通过电喷雾电离法(ESMS)用耦接至自动提纯系统的Applied Biosystems(Foster City,CA)型号API 150EX仪器或Waters(Milford,MA)3100仪器，来进行化合物的质谱鉴定。
制备型HPLC条件
柱：C18,5μm 21.2×150mm或C18,5μm 21×250或C14,5μm 21×150mm
柱温度：室温
流速：20.0mL/min
流动相：A＝水+0.05％TFA
B＝ACN+0.05％TFA,
注射体积：(100-1500μL)
检测器波长：214nm
将粗化合物以约50mg/mL溶解于1:1水:乙酸中。使用2.1×50mm C18柱进行4分钟分析规模的测试操作，接着使用100μL注射液，使用基于分析规模测试操作的B滞留％的梯度，进行15分钟或20分钟制备型规模操作。准确的梯度依赖于样品。用21×250mm C18柱和/或21×150mm C14柱检查具有紧密操作杂质的样品以进行最佳分离。通过质谱分析来鉴别含有所希望产物的洗脱份。
分析型HPLC条件
方法A
仪器：Agilent 1260HPLC
柱：LUNA C18(2)，150×4.60mm，3微米
柱温度：35℃
流速：1.2mL/min
注射体积：5μL
样品制备：溶解于1:1ACN:水中成约0.5mg/mL溶液
流动相：A＝水:ACN:TFA(98:2:0.05)
B＝水:ACN:TFA(30:70:0.05)
检测器波长：230nm
梯度：总共28分钟(时间(min)/％B)：0/10、20/100、22/100、23/10、28/10
方法B
仪器：Agilent 1260HPLC
柱：Zorbax-Bonus RP C14，30×2.1mm，1.8微米
柱温度：60℃
流速：1.2mL/min
注射体积：3μL
样品制备：溶解于1:1ACN:水中成约1.0mg/mL溶液
流动相：A＝水:TFA(99.9％:0.1％)
B＝ACN:TFA(99.9％:0.1％)
检测器波长：214nm
梯度：总共3.0分钟(时间(min)/％B)：0/5、1.5/65、1.8/95、2.1/95、2.5/5、3.0/5
制备1三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(羟基甲基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(10)
Figure BDA0001668657950000231
(a)三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-甲酰基-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(9)
向2L配备有机械搅拌器的3颈烧瓶中加入三乙酸(2R,3R,4S,5S,6S)-2-溴基-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(8)(51g，128.4mmol)、4-羟基-3-硝基苯甲醛(20.98g，125.5mmol)和氧化银(37.7g，162.7mmol)，接着加入ACN(750mL)。在暗处搅拌反应混合物18小时且经由
Figure BDA0001668657950000232
过滤。用ACN(3×100mL)洗涤固体且将滤过物在减压下蒸馏至100mL。向滤过物中加入EtOAc(1750mL)和饱和碳酸氢钠(1L)且在室温下搅拌反应混合物30分钟，经Celite过滤并使其沉降。有机层经饱和碳酸氢钠(1L)和盐水(1L)洗涤，经硫酸钠(100g)干燥2小时，过滤且在减压下蒸馏至干燥，获得呈黄色固体的粗化合物9(55g，90％产率，97.4％纯度)。HPLC滞留时间15.61分钟。
(b)三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(羟基甲基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(10)
向1L配备有机械搅拌器的3颈烧瓶中加入化合物9(32.7g，67.6mmol)，接着加入DCM(350mL)和IPA(70mL)。搅拌反应混合物至溶解固体且接着冷却至0℃。向溶液中分三份加入硼氢化钠(1.54g，40.6mmol)，保持温度低于5℃且在0℃搅拌反应混合物1小时并缓慢倒入至冰水(400mL)中。向溶液中加入DCM(350mL)且搅拌混合物30分钟，使其沉降30分钟并分离各层。用DCM(100mL)反萃取水层。将合并的有机层用盐水(500mL)洗涤。在30分钟之后，分离各层且用DCM(100mL)反萃取盐水层。合并的有机层经硫酸钠(50g)干燥2小时，经Celite过滤，且在减压下蒸馏至干燥。在50℃下将所得固体于95％变性EtOH(130mL)搅拌30分钟且在室温下搅拌12小时以形成结晶固体，所述结晶固体经EtOH(30mL)洗涤且在室温下真空干燥16小时，获得呈白色固体状的标题化合物(21g，66％产率，98％纯度)。HPLC方法A滞留时间13.18分钟。
制备2：三乙酸(2S,3S,4S,5R,6S)-2-(甲氧羰基)-6-(4-(((甲基(2-(甲氨基)乙基)胺甲酰基)氧基)甲基)-2-硝基苯氧基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(12)
Figure BDA0001668657950000241
向配备有电磁搅拌器的100mL烧瓶中加入三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(羟基甲基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(10)(4.86g，10mmol)和羰基二咪唑(2.11g，13mmol)，接着加入DCM(50mL)。在室温下搅拌反应混合物3小时以形成三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(((1H-咪唑-1-羰基)氧基)甲基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(11)的溶液。
向250mL配备有电磁搅拌器的3颈烧瓶中加入N1,N2-二甲基乙烷-1,2-二胺(3.09g，35mmol，3.76mL)，接着加入DCM(30mL)。使反应混合物冷却至0℃且在<5℃下缓慢加入乙酸(2.1g，35mmol，2mL)以形成悬浮液。向悬浮液中缓慢加入中间产物11的溶液；在0℃至5℃下搅拌反应混合物30分钟且接着在室温下搅拌3小时。加入DCM(30mL)和水(60mL)且在室温下搅拌反应混合物10分钟。有机层经水(2×60mL)洗涤，经硫酸钠干燥2小时并过滤，获得呈溶解状态的标题化合物(约70％产率)，将其储存于0℃至4℃下且不经提纯即使用。HPLC方法A滞留时间11.04分钟。
制备3：三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(14)
Figure BDA0001668657950000251
向1L配备有电磁搅拌器的3颈烧瓶中加入3-((3R,4R)-4-甲基-3-(甲基(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)哌啶-1-基)-3-侧氧基丙腈(2)(9.65g，31mmol)、双(4-硝基苯基)碳酸酯(12.22g，40mmol)和ACN(240mL)，且使反应混合物冷却至0℃。逐滴加入DIPEA(5.59g，43mmol)且在室温下搅拌反应混合物4小时并冷却至0℃。在<10℃下向经冷却的反应混合物中加入三乙酸(2S,3S,4S,5R,6S)-2-(甲氧羰基)-6-(4-(((甲基(2-(甲氨基)乙基)-胺甲酰基)氧基)甲基)-2-硝基苯氧基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(12)于DCM(350mL，30mmol)中的溶液且在15℃下搅拌反应混合物1小时并接着用乙酸(2.5g，42mmol)淬灭。加入DCM(200mL)和水(300mL)，分离各层且有机层经3％碳酸钠(2×350mL)，接着经0.5M HCl(2×200mL)和经10％氯化钠(200mL)洗涤，且经硫酸钠(50g)干燥5小时，过滤，且浓缩至约100mL。通过硅胶层析(600g二氧化硅柱，流速60mL/min，梯度：含40％DCM的EtOAc历经5分钟至100％EtOAc，100％EtOAc 60分钟，含3％MeOH至5％MeOH的EtOAc历经30分钟，含5％MeOH的EtOAc至完成)提纯浓缩溶液。合并纯洗脱份且在真空下蒸馏至干燥，获得标题化合物(21.2g，97％纯度，73％产率)。HPLC方法A滞留时间13.92分钟。
实例1：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸(1)
Figure BDA0001668657950000261
向500mL配备有电磁搅拌器的3颈烧瓶中加入三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(14)(20.9g，22mmol)和THF(210mL)。使反应混合物冷却至0℃且历经20分钟加入含1M LiOH的水(46mL，47mmol)并搅拌反应混合物20分钟。历经30分钟加入LiOH溶液的第二均等部分且搅拌反应混合物2小时。加入乙酸(5.6g，93mmol)且将反应混合物转移至2L圆底烧瓶中。向烧瓶中加入ACN(500mL)且在减压下蒸馏混合物以去除600mL溶剂。重复所述程序两次和第三次蒸馏继续干燥。将所得固体溶解于含2％ACN的水(350mL)中且以90mL分批通过逆相层析法(450g C-18二氧化硅柱，流速40mL/min，溶剂A：含0.5％乙酸的水；溶剂B：ACN，梯度：总共110分钟(时间(min)/％B)：0/2、10/2、100/28、110/28接着洗涤90％B)提纯。合并产物洗脱份，重复程序3次且使合并的洗脱份浓缩至约600mL并冷冻干燥，获得呈固体状的标题化合物(11.2g，60％产率，99％纯度)。HPLC方法A滞留时间7.95分钟。
实例2：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-氨基-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸(3)
Figure BDA0001668657950000271
(a)三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-氨基-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(15)
向三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(14)(1.55g，1.65mmol)于EtOH(50mL)中的溶液中加入氢氧化钯/碳(11.57mg，0.08mmol)。在氢气下在室温下搅拌反应溶液3天，经由硅藻土垫过滤，用EtOH洗涤并真空浓缩。粗物质经分离呈褐色泡沫状且不经进一步提纯即使用。(m/z)：C42H53N9O14的[M+H]+计算值908.37，实验值：908.8。
(b)(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-氨基-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸(3)
向前一步骤的产物(0.95g，1.05mmol)于MeOH(3.49mL)、THF(3.49mL)和水(3.49mL)的1:1:1混合物的溶液中加入LiOH(63mg，2.62mmol)且在室温下搅拌混合物1小时。在真空中浓缩反应溶液且通过逆相柱层析法提纯粗物质以得到呈白色固体的标题化合物(96mg，12％产率)。HPLC方法B滞留时间0.85分钟。
制备4：4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酸4-硝基苯基酯(13)
Figure BDA0001668657950000281
向3-((3R,4R)-4-甲基-3-(甲基(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)哌啶-1-基)-3-侧氧基丙腈(2)(0.75g，2.40mmol)于DCM(12mL)中的溶液中加入氢氧化钠(0.29g，7.20mmol)于水(4.00mL)和四丁基溴化铵(0.08g，0.24mmol)中的溶液。缓慢加入氯甲酸4-硝基苯基酯(0.97g，4.80mmol)于DCM(4mL)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物1小时，用DCM萃取且有机层经饱和氯化铵溶液和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。通过柱层析法(含0-100％EtOAc的己烷)提纯粗残余物以得到呈淡黄色固体状的标题化合物(0.94g，82％)。(m/z)：C23H23N7O5的[M+H]+计算值为478.18，实验值：478.2。
制备5：三乙酸(2S,3S,4S,5R,6S)-2-(甲氧羰基)-6-(4-(((甲基(2-(甲氨基)乙基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(18)
Figure BDA0001668657950000282
(a)三乙酸(2S,3S,4S,5R,6S)-2-(甲氧羰基)-6-(4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(17)
向三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(羟基甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(16)(27.0g，61.3mmol)和Et3N(25.5mL，17.0mmol)于DCM(250mL)中的溶液中缓慢加入氯甲酸对硝苯基酯(18.53g，91.9mmol)于DCM(100mL)中的溶液。在室温下搅拌溶液1小时，用水(100mL)稀释且用DCM(3×100mL)萃取。在减压下浓缩合并的有机层且通过柱层析法(含35％EtOAc的己烷)提纯粗残余物以得到标题化合物(37.0g，56％产率)。
(b)三乙酸(2S,3S,4S,5R,6S)-2-(甲氧羰基)-6-(4-(((甲基(2-(甲氨基)乙基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(18)
在室温下向三乙酸(2S,3S,4S,5R,6S)-2-(甲氧羰基)-6-(4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(17)(0.50g，0.83mmol)于DCM(8.26mL)中的溶液中加入N1,N2-二甲基乙烷-1,2-二胺(0.44mL，4.13mmol)。1.5小时后，过滤反应溶液并用DCM洗涤。在真空中浓缩滤过物且通过柱层析(含0-10％MeOH的DCM)提纯残余物以得到呈着色固体状的标题化合物(354mg，77％产率)。(m/z)：C25H34N2O12的[M+H]+计算值555.21，实验值：555.6。
通过类似于制备5的制程制备以下中间体：
Figure BDA0001668657950000291
R<sup>1</sup> 化合物编号
甲基 19 (m/z)：C<sub>26</sub>H<sub>36</sub>N<sub>2</sub>O<sub>12</sub>的[M+H]<sup>+</sup>计算值569.23，实验值：569.7
氯基 20 (m/z)：C<sub>25</sub>H<sub>33</sub>ClN<sub>2</sub>O<sub>12</sub>的[M+H]<sup>+</sup>计算值591.17，实验值：591.4
甲氧基 21 (m/z)：C<sub>26</sub>H<sub>36</sub>N<sub>2</sub>O<sub>13</sub>的[M+H]<sup>+</sup>计算值585.22，实验值：585.5
实例3：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸(4)
Figure BDA0001668657950000292
(a)三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)-(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(22)
向三乙酸(2S,3S,4S,5R,6S)-2-(甲氧羰基)-6-(4-(((甲基(2-(甲氨基)乙基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(18)(0.35g，0.63mmol)和4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酸4-硝基苯基酯(13)(0.30g，0.63mmol)于DMF(5.05mL)中的溶液中加入Et3N(0.13mL，0.95mmol)且在40℃下搅拌所得混合物。在1.5小时之后，LC/MS指示纯净产物形成。将反应溶液冷却至室温且在真空中浓缩。粗产物经分离而得到黄色残余物，其不经进一步提纯即使用。(m/z)：C42H52N8O14的[M+H]+计算值893.36，实验值：893.9。
(b)(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸(4)
向前一步骤的产物(0.56g，0.63mmol)于MeOH(2.10mL)、THF(2.10mL)和水(2.10mL)的1:1:1混合物中的溶液中加入LiOH(40mg，1.70mmol)且在室温下搅拌溶液，在真空中浓缩且通过逆相柱层析法提纯粗残余物以得到呈白色固体的标题化合物(0.12g，27％)。(m/z)：C35H44N8O11的[M+H]+计算值753.31，实验值：753.8。HPLC方法B滞留时间0.98分钟。
实例4：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)-2-甲基苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸(5)
Figure BDA0001668657950000301
(a)三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)-(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)-2-甲基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(23)
向三乙酸(2S,3S,4S,5R,6S)-2-(甲氧羰基)-6-(2-甲基-4-(((甲基(2-(甲氨基)乙基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(19)(0.46g，0.81mmol)于DCM(8.00mL)中的溶液中缓慢加入4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酸4-硝基苯基酯(13)(0.39g，0.81mmol)于DCM(3.00mL)中的溶液且在室温下搅拌溶液1.5小时，在真空中浓缩且黄色固体不经进一步提纯即使用。(m/z)：C43H54N8O14的[M+H]+计算值907.38，实验值：907.6。
(b)(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)-2-甲基苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸(5)
向前一步骤的产物(0.73g，0.81mmol)于MeOH(29mL)中的冰冷溶液中缓慢加入LiOH(4.04mL，4.04mmol)水性溶液。在0℃下搅拌1.5小时之后，通过缓慢添加1N HCl将反应溶液调整至pH 5-6。在真空中浓缩反应溶液且通过逆相柱层析法提纯粗物质以得到呈白色固体的标题化合物(0.47g，76％产率)。(m/z)：C36H46N8O11的[M+H]+计算值767.33，实验值：767.8。HPLC方法B滞留时间1.02分钟。
实例5：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-氯-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸(6)
Figure BDA0001668657950000311
(a)三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-氯-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(24)
向三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-氯-4-(((甲基(2-(甲氨基)乙基)-胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(20)(0.33g，0.57mmol)和4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酸4-硝基苯基酯(13)(0.27g，0.57mmol)于DMF(4.52mL)中的溶液中加入Et3N(0.12mL，0.85mmol)且在40℃下搅拌所得溶液。在1小时之后，在真空中浓缩溶液。产物经分离而得到黄色残余物，其不经进一步提纯即使用。(m/z)：C42H51N8O14的[M+H]+计算值927.32，实验值：927.7。
(b)(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-氯-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸(6)
向三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-氯-4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(0.52g，0.57mmol)于MeOH(1.88mL)、THF(1.88mL)和水(1.88mL)的1:1:1混合物中的溶液中加入LiOH(40mg，1.53mmol)且在室温下搅拌溶液2小时。在真空中浓缩反应溶液且通过逆相柱层析法提纯粗物质以得到呈白色固体的最终产物(0.22g，49％)。(m/z)：C35H43N8O11的[M+H]+计算值787.27，实验值：787.8。HPLC方法B滞留时间1.04分钟。
实例6：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)-2-甲氧基苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸(7)
Figure BDA0001668657950000321
(a)三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)-2-甲氧基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(25)
向三乙酸(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-甲氧基-4-(((甲基(2-(甲氨基)乙基)胺甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-哌喃-3,4,5-三基酯(21)(0.60g，1.02mmol)于DCM(10.00mL)中的溶液中缓慢加入4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酸4-硝基苯基酯(13)(0.49g，1.02mmol)于DCM(3.00mL)中的溶液且在室温下搅拌所得混合物1.5小时。在真空中浓缩反应溶液且所得黄色固体不经进一步提纯即使用。(m/z)：C43H54N8O15的[M+H]+计算值923.37，实验值：924.1。
(b)(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)胺甲酰基)氧基)甲基)-2-甲氧基苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸(7)
向前一步骤的产物(0.94g，1.02mmol)于MeOH(36.80mL)中的冰冷溶液中缓慢加入LiOH(5.12mL，5.12mmol)水性溶液。在0℃下搅拌反应混合物2小时之后通过缓慢添加1NHCl将溶液的pH调整至5至6。在真空中浓缩混合物且通过逆相柱层析法提纯粗残余物以得到呈白色固体的标题化合物(0.46g，57％产率)。(m/z)：C36H46N8O12的[M+H]+计算值783.32，实验值：783.8。HPLC方法B滞留时间0.99分钟。
实例C-1
Figure BDA0001668657950000331
(a)化合物C-5
向烧瓶中加入化合物C-3(285mg，0.497mmol)和化合物C-4(445mg，1.289mmol)的TFA盐，接着加入DMF(2.485mL)和三乙胺(0.416mL，2.98mmol)。第二天通过旋转蒸发浓缩反应混合物并通过正相柱层析法(含0-15％MeOH的DCM历经15分钟，随后连续15％历经5分钟)提纯，获得标题化合物(90mg)。
(b)化合物C-1
将前一步骤的产物(45mg，0.061mmol)和碳酸钾(33.8mg，0.244mmol)溶解于MeOH(0.8mL)和水(0.4mL)中且在室温下搅拌。在2小时之后，添加MeOH以形成与水的共沸物，且加入DCM(0.4mL)接着TFA(0.4mL，5.19mmol)。反应混合物通过旋转蒸发浓缩，溶解于1:1水:ACN中，过滤且通过制备型HPLC提纯，获得呈灰白色粉末状的标题化合物(17.7mg，97％纯度)。(m/z)：C26H30N4O15的[M+H]+计算值639.17，实验值：639.2。
制备化合物C-7
Figure BDA0001668657950000341
在0℃下向化合物C-6(300mg，0.374mmol)溶解于DCM(3.74mL)中的溶液中一次性加入N,N'-二甲基亚乙基二胺(159μl，1.495mmol)。在0℃下搅拌反应混合物30分钟，在DCM(15mL)中稀释并用水(3×10mL)洗涤。有机层经盐水洗涤，分离，经硫酸钠干燥并过滤，获得呈黄色油状物的标题中间体(其不经进一步提纯即使用)。(m/z)：C33H41N3O17的[M+H]+计算值752.24，实验值：752.4。
制备化合物C-8
Figure BDA0001668657950000342
向氢化钠(36.4mg，0.9105mmol)溶解于THF(3.372mL)和DMF(1.686mL)的混合物溶液中加入碳酸双(2,4-二硝基苯基)酯(299mg，0.759mmol)。在0℃下搅拌反应混合物1小时且接着缓慢加入2-(5-氟-4-甲基吡啶-3-基)-5-(4-甲基-6-(甲磺酰基)吡啶-3-基)-1H-吲哚(化合物C-2M)(200mg,0.506mmol)溶解于THF(1.2mL)的溶液且使反应混合物升温至室温。在9小时之后，加入饱和碳酸氢钠且用盐水洗涤反应混合物。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱层析法(用含0-80％EtOAc的己烷溶离)提纯粗残余物，获得呈褐色油状的标题中间体(109mg)。(m/z)：C28H20FN5O8S的[M+H]+计算值606.10，实验值：606.3。
实例C-2
Figure BDA0001668657950000351
(a)化合物C-9
向化合物C-8(250mg，0.413mmol)于DCM(4.13mL)中的溶液中加入化合物C-9(310mg，0.413mmol)，接着加入4-二甲氨基吡啶(22mg，0.180mmol)。在40℃下搅拌反应混合物1小时，冷却至室温且浓缩，获得不经提纯即直接用于下一步骤的标题中间体。(m/z)：C55H57FN6O20S的[M+H]+计算值1173.33，实验值：1173.4。
(b)化合物C-2
向溶解于THF(4.13mL)的前一步骤产物(485mg，0.413mmol)的脱气溶液中加入四(三苯基膦)钯(0)(47.7mg，0.041mmol)和吗啉(360μL，4.13mmol)。在室温下搅拌反应混合物45分钟且接着加入水并分离各层。有机层经硫酸钠干燥，过滤且在真空中浓缩。通过制备型HPLC提纯粗残余物且冷冻干燥，获得呈白色粉末状的标题化合物(136mg，99％纯度)。(m/z)：C40H41FN6O14S的[M+H]+计算值881.24，实验值：881.2。
生物学分析
已在以下生物分析中的一或多种中表征本发明的化合物。在分析描述中，式1化合物可替代地参考作为化合物1和类似本发明的额外化合物。
分析1：生物化学JAK激酶分析
将四种LanthaScreen JAK生物化学分析的组(JAK1、2、3和Tyk2)载于常见激酶反应缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，0.01％Brij-35，10mM MgCl2，和1mM EGTA)中。重组GST标记的JAK酶和GFP标记的STAT1肽底物获自Life Technologies。
使连续稀释的化合物与四种JAK酶中的每一者和底物在白色384孔微量培养板(Corning)中一起在环境温度下预培育1小时。随后添加总体积为10μL、具有1％DMSO的ATP以引发激酶反应。JAK1、2、3和Tyk2的最终酶浓度分别是4.2nM、0.1nM、1nM和0.25nM；所用的相应Km ATP浓度是25μM、3μM、1.6μM和10μM；而用于所有四个分析的底物浓度均是200nM。还在1mM ATP浓度下测试JAK1激酶活性。在环境温度下使激酶反应进行1小时，之后加入EDTA(10mM最终浓度)和Tb抗pSTAT1(pTyr701)抗体(Life Technologies，2nM最终浓度)于TR-FRET稀释缓冲液(Life Technologies)中的10μL制剂。在环境温度下将培养板培育1小时，之后在EnVision读取器(Perkin Elmer)上读取。记录且使用发射比信号(520nm/495nm)，以基于DMSO和背景对照计算抑制百分比值。
对于剂量反应分析，相较于化合物浓度绘制抑制百分比数据，且用Prism软件(GraphPad Software)、利用4参数稳固拟合模型测定IC50值。结果表示为pIC50(IC50的负对数)，且随后使用Cheng-Prusoff等式变换为pKi(解离常数Ki的负对数)。表1汇总化合物1和托法替尼(化合物2)的结果。
表1酶效能
性质 化合物1 托法替尼
JAK1(pK<sub>i</sub>) <6.3 9.1
JAK2(pK<sub>i</sub>) <6.2 9.2
JAK3(pK<sub>i</sub>) <6.8 9.5
TYK2(pK<sub>i</sub>) <6 7.9
JAK1(在1mM ATP时的pIC<sub>50</sub>) <5 7.7
分析2：化合物1在来自大肠杆菌的β-葡糖苷酸酶中的代谢稳定性
为表征化合物1在存在β-葡糖苷酸酶的情况下的中间代谢物和最终产物，在37℃下在存在来自大肠杆菌(100单位/毫升于0.1M磷酸钾缓冲液中)的β-葡糖苷酸酶的情况下培育化合物1(30μM于DMSO中)时程0至90分钟。在时间点0、1、2、3、5、10、15、30、60和90分钟时通过添加100μL ACN淬灭培育。样品经水+1％甲酸(4次)稀释且使用Thermo Q-ExactiveTMLC-MS系统分析。通过与使用与所述样品相同的稀释液所测定的标准曲线相比来定量化合物1和托法替尼浓度。
化合物1快速消失(半衰期<5分钟)伴有快速且暂时形成糖苷配基中间产物(方案2中的化合物b)。观测糖苷配基中间产物至其后续二胺中间产物(化合物d)和最终活性代谢物(托法替尼)的转化为更慢速的判定步骤。观测到托法替尼的浓度在历经90分钟时程的实验逐渐增加至最终浓度约20μM。
为证实观测的化合物1至托法替尼的转化是归因于葡糖苷酸酶相互作用，将化合物1(30μM)与β-葡糖苷酸酶(45单位/毫升)和已知细菌性β-葡糖苷酸酶抑制剂阿莫沙平(amoxapine)(100μM)一起培育。在60分钟培育之后，与7μM(无抑制剂)相比，在抑制剂存在的情况下托法替尼的最终浓度为1μM。
分析3：用大鼠上部和下部肠道内容物制备的匀浆的代谢稳定性
在用刚杀死大鼠分离的不同GI节段制备的肠内腔内容物中评估化合物1至托法替尼的转化。以1:10杜贝克氏磷酸缓冲液生理盐水(DPBS)溶液稀释来自十二指肠、空肠、回肠和结肠的内容物的各节段。将化合物1的10mM DMSO储备液在DPBS中经稀释以得到10μM的最终底物浓度。在37℃下在水浴中进行培育且采集时间点0、5分钟、10分钟、20分钟、40分钟和60分钟时。总培育体积为400μL且在每个时间点取用40μL等分试样并在160μL的97％ACN+3％甲酸+内标物中稀释。所述样品以2200rcf离心10分钟且将50μL上清液在150μL水+1％甲酸中稀释。在API 4000质谱仪上分析所述样品中的化合物1和托法替尼。针对化合物1的消失所测定的半衰期汇总于下表中。
表2
大鼠肠道内容物 化合物1半衰期
十二指肠 >60min
空肠 >60min
回肠 34min
结肠 <5min
分析4：化合物1在大鼠中的口服药物代谢动力学
此研究的目的是在同时口服给药之后比较化合物1和托法替尼的胃肠粘膜与血浆药物代谢动力学。通过将3mg/kg的化合物1和标准化剂量1.2mg三氘标记的托法替尼(D3-托法替尼)配制成5％DMSO+1％羟丙基甲基纤维素于水中的溶液经由口服管饲向雄性史泊格多利大鼠(n＝3/时间点)给药。在每个时间点(0.5小时、1小时、3小时、6小时、8小时和24小时)处，通过心脏打孔采集血浆样品且收集以下组织：胃、上部胃肠道(大致分割成三段[U-1、U-2、U-3])、盲肠和下部胃肠道(大致分割成半边[L-1、L-2])。各组织样品经水冲洗，拍干，转移至配衡容器，称重，经3倍组织重量/体积(w/v)且酸化的水稀释，以6500RPM(3×45秒)均质化且冷冻。按以下测定各组织样品中自化合物1释放的托法替尼与D3-托法替尼的浓度。所述组织样品经涡旋，与50μL等分试样的大鼠血浆组合，用200μL含有内标物的ACN萃取且通过LC-MS对照内标物定量。可在3小时与8小时之间的血浆中、在经由8小时的胃和区段U-1、U-2和U-3中、且在3小时与24小时之间的盲肠和区段L-1和L-2中测量自化合物1释放的托法替尼浓度。可在0.5小时与8小时之间的血浆中、在经由8小时的胃和区段U-1、U-2和U-3中及3小时与24小时之间的盲肠和区段L-1和L-2中测量D3-托法替尼的浓度。在表3中报告所得标准药物代谢动力学参数、Cmax(最大浓度)和AUC(0-t)(浓度比时间的曲线下面积，整合至所测量的最后的时间点)。
表3：大鼠中托法替尼与D3-托法替尼浓度
Figure BDA0001668657950000381
Figure BDA0001668657950000391
分析5：化合物1在食蟹猕猴中的口服药物代谢动力学
此研究的目的是在同时口服给药之后比较化合物1与托法替尼的结肠和血浆药物代谢动力学。通过将3mg/kg化合物1和2.1mg/kg三氘标记的托法替尼(D3-托法替尼)配制成98.5％pH 6柠檬酸盐缓冲液+1％羟丙基甲基纤维素+0.5％Tween 20溶液经由口服管饲给药雄性食蟹猕猴(n＝1/时间点)。在每个时间点(0.5小时、1小时、3小时、6小时、9小时和24小时)处，自股静脉采集血浆样品且收集以下组织：胃、上部胃肠道(大致分割成三段[U-1、U-2、U-3])、盲肠、近端结肠、末端结肠和直肠。各组织样品经水冲洗，拍干，转移至配衡容器，称重，快速冷冻，粉碎并储存于-70℃下。大致2g等分试样经3倍组织重量/体积(w/v)且含对照大鼠血浆的水稀释、均质化并储存于-70℃下。按以下测定各组织样品中自化合物1释放的托法替尼与D3-托法替尼的浓度。所述样品经涡旋，且50μL等分试样的血浆或制备的组织样品经200μL含有内标物的ACN萃取且通过LC-MS对照内标物定量。可在0.5小时与24小时之间的血浆和所有组织样品中测量自化合物1释放的托法替尼的浓度。可在0.5小时与9小时之间的血浆和胃中，和0.5小时与24小时之间的所有其它组织区段中测量D3-托法替尼的浓度。在表4中报告所得标准药物代谢动力学参数、Cmax(最大浓度)和AUC(0-t)(浓度比时间的曲线下面积，整合至所测量的最后的时间点)。
表4：猕猴中托法替尼与D3-托法替尼浓度
Figure BDA0001668657950000392
分析6：恶唑酮诱导的结肠炎的小鼠模型
恶唑酮诱导的结肠炎是与人类溃疡性结肠炎组织学类似的实验模型(Heller等人，免疫学(Immunology)，2002，17，629-638)。在分析中使用来自BioNeeds(印度)的成年BALB/C小鼠(25-28g，9-12周龄)。在第1天，用异氟醚轻度麻醉动物，且谨慎地去除肩部之间的毛发，之后针对皮肤敏感化缓慢施用恶唑酮(6毫克/鼠，100μL，4:1丙酮:橄榄油配制物)或媒剂溶液。在皮肤敏感化之后的六天，使小鼠禁食整夜，通过氯胺酮麻醉且IP投与甲苯噻嗪，且将填充有恶唑酮溶液在1mL注射器小心地插入至鼠结肠约3.8cm。使动物保持头向下的位置且历经一分钟非常缓慢地经直肠滴注恶唑酮(0.5mg/50μL/鼠的50％乙醇)或50％乙醇/生理盐水。将小鼠垂直固持(头向下)额外一分钟以确保全部恶唑酮溶液保留在结肠内部。在恶唑酮直肠内(IR)激发之前的晚上，开始药物处理(PO，BID或TID)或媒剂。在恶唑酮直肠内激发后的第一(第1天)和第二(第2天)天，通过针对各老鼠的不知情治疗实验根据以下单项得分来评定疾病活性指数(DAI)：大便稠度(0，正常；2，松软；4，腹泻)、总出血和大便潜血测试(0，不存在；2；带血丝；4，明显存在血液)，和重量减轻(0，无；1，1％-5％；2，6％-10％；3，11％-15％；4，大于15％)；DAI＝(大便稠度+血液存在度+重量减轻得分)的平均值。
在实验过程期间进行基于全部DAI得分的曲线下面积(AUC)计算以追踪疾病进展。按AUC＝[(第1天-第0天)×平均(第0天和第1天的DAI得分)]+[(第2天-第1天)×平均(第1天和第2天的DAI得分)]计算各实验组的AUC。斯图登氏t检验(Student's t-test)比较媒剂/媒剂与媒剂/恶唑酮组的DAI AUC得分以评估在恶唑酮治疗之后是否诱发疾病。此后接通过邓尼特事后检验(Dunnett's post hoc test)的单向ANOVA以比较媒剂/恶唑酮与测试化合物/恶唑酮组的DAI AUC得分。由α水平设定为p<0.05定义统计显著性。
在恶唑酮诱导的急性结肠炎模型中，式1化合物(3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg和60mg/kg，PO，BID)产生恶唑酮诱导的结肠炎的显著逆转，与通过托法替尼(30mg/kg和60mg/kg，PO，BID)获得的逆转程度类似。在恶唑酮模型的独立实验中，式4化合物(3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg，PO，BID)产生恶唑酮诱导的结肠炎的显著逆转，与通过托法替尼(30mg/kg，PO，BID)获得的逆转程度类似。
分析7：在鼠脾自然杀手(NK)细胞中的免疫抑止效应
鼠脾细胞的损耗是免疫抑止的实验模型(Kudlacz等人，美国移植杂志(Am.J.ofTransplantation)，2004，4，51-57)。在与恶唑酮诱导子结肠炎模型(分析6)中所使用的相同治疗范例之后，在鼠脾细胞模型中评定化合物1。
来自Harlan的成年雄性Balb/C小鼠(12-14周龄)用于所述研究。向未处理小鼠经口给药化合物1(1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg，BID)和托法替尼(10mg/kg、30mg/kg和60mg/kg，BID)三天。最后剂量后30分钟或3小时收集脾且立即压碎以用于细胞亚型染色。固定之前，将用于CD19(FITC；B细胞)、CD3e(PE；pan T细胞)和DX5(APC；NK细胞)的荧光团标记的抗体与来自各动物的脾细胞样品一起培育，以使得可在流式细胞仪上进行同步的多种亚型％分析。各动物的总脾细胞数量由ScepterTM2.0手持型自动细胞计数器测量。
自各亚型的百分比乘以各动物的总脾细胞来计算淋巴细胞亚型群体(例如，脾B、T和NK细胞)的绝对数。邓尼特事后测试(Dunnett's post hoc test)下的单向ANOVA用以比较媒剂和测试化合物组的脾淋巴细胞数目。α水平设定在p<0.05下。对于各组，数据呈现为平均值±SEM。
托法替尼(10mg/kg、30mg/kg和60mg/kg；PO，TID)剂量依赖性地且显著地减少脾NK细胞计数。在相同研究中，脾NK细胞计数不受化合物1以PO(BID)剂量至多10mg/kg(最大剂测量试)影响。对于使用任一化合物的B和T细胞群体，未观测到治疗效应。
此数据结合化合物1在恶唑酮诱导的结肠炎(分析6)的小鼠模型中的抗结肠炎效应使功能性治疗指数经计算如下文在表5中所报告。
表5：功能性治疗指数
Figure BDA0001668657950000411
*与其媒剂相比，有效剂量在恶唑酮模型中展示可比性药理学效应
分析8：大鼠结肠粪便匀浆稳定性
此研究的目的是测定本发明化合物在大鼠结肠粪便匀浆中的稳定性，即，在大鼠结肠粪便中存在β-葡糖苷酸酶的情况下用于分解的半衰期。
在通过心脏打孔放血杀死未处理雄性大鼠(约300g)之后，接合且去除结肠至厌氧腔室中(AS-580，厌氧菌系统)。在腔室内去除粪便内容物并经1:10(1公克比9mL磷酸缓冲液)稀释且接着使用手持型Omni Tissue Master试剂均质化。粪便匀浆以2000g离心10分钟以去除块状且去除上清液并用以培育。
测试物品和阳性对照(柳氮磺胺吡啶)制备为10mM DMSO储备液。各分析的最终底物浓度是10μM(化合物5是30μM)。通过添加5μL等分试样的经稀释测试化合物储备液至300μL大鼠粪便上清液匀浆中来开始反应。在反应开始后0、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟，通过3％甲酸和内标分子将50μL等分试样移至200μL乙腈中。所有样品以2000g离心10分钟，之后将50μL上清液在150μL水中稀释以在LC-MS系统上分析。如下计算缺失前药的活体外半衰期：(T1/2＝0.693/消除速率常数)。
表6.活体外结肠稳定性
Figure BDA0001668657950000421
分析9：老鼠的口服药物代谢动力学
此研究的目的是在口服给药小鼠之后评定本发明的前药向托法替尼的血浆与结肠转化。
雄性Balb/c小鼠(n＝2/时间点)接受单一PO口服管饲剂量(含5mg/kg的5％DMSO与1％HPMC的1:20混合物)的测试化合物。在给药后2小时和6小时，经由心脏打孔放血杀死小鼠，将所得血液样品置放在含有NaF的
Figure BDA0001668657950000423
导管中并接着置放在冰上。在4℃下通过以大致12,000rpm离心(eppendorf离心机，5804R)4分钟获得血浆。
自经放血的小鼠去除结肠并平缓地去除结肠粪便内容物。所述结肠经生理盐水冲洗并拍干。随后在大致4℃下使用Precellys均匀器在3倍体积的无菌水中均质化所述结肠。所有样品储存于-80℃下用以随后生物分析。
如下测定各组织样品中自前药释放的托法替尼的浓度：血浆和结肠匀浆样品经涡旋，与50μL等分试样的大鼠血浆组合，经200μL含有内标物的ACN萃取且通过LC-MS对照内标物定量。针对血浆和结肠测试化合物和释放的托法替尼计算浓度曲线下的面积(AUC0-6小时)。评定适用性的关键参数是托法替尼结肠/血浆AUC比。
表7：老鼠的托法替尼浓度
Figure BDA0001668657950000422
分析10：大鼠的口服药物代谢动力学
此研究的目的是在口服给药大鼠之后评定本发明的前药向托法替尼的血浆与结肠转化。
雄性史泊格多利大鼠(n＝2/时间点)接受单一PO口服管饲剂量(含5mg/kg的5％DMSO与1％HPMC的1:20混合物)的测试化合物。在给药后0.5小时、1小时、3小时、6小时和24小时，经由心脏打孔放血杀死大鼠，将所得血液样品置放在含有NaF的
Figure BDA0001668657950000432
导管中并接着置放在冰上。在4℃下通过以大致12,000rpm离心(Eppendorf离心机，5804R)4分钟获得血浆。
自经放血的大鼠去除结肠并平缓地去除结肠粪便内容物。所述结肠经生理盐水冲洗并拍干。随后在大致4℃下使用Precellys均匀器在3倍重量的无菌水中均质化所述结肠。所有样品储存于-80℃下用以随后生物分析。
如下测定各组织样品中自前药释放的托法替尼的浓度：血浆和结肠样品经涡旋，与50μL等分试样的大鼠血浆组合，经200μL含有内标物的ACN萃取且通过LC-MS对照内标物定量。针对血浆和结肠测试化合物和释放的托法替尼计算浓度曲线下的面积(AUC0-6hr)。评定适用性的关键参数是托法替尼结肠/血浆AUC比。
表8：大鼠的托法替尼浓度
Figure BDA0001668657950000431
分析11：大鼠结肠内容物中的对比化合物的代谢稳定性
从未处理雄性史泊格多利大白鼠采集结肠粪便内容物且经1:10(1公克比9mL磷酸缓冲液)稀释且接着使用手持型Omni Tissue Master试剂均质化。测试化合物、对比化合物C-1和C-2以及本发明的化合物、化合物1制备是10mM DMSO储备溶液且在磷酸缓冲液中稀释成10μM的最终底物浓度。将5μL等分试样的经稀释测试化合物掺入至300μL大鼠结肠内容物匀浆中以在37℃下开始反应。在以下时间点(0、15分钟、50分钟、85分钟和120分钟)从培育去除等分试样(50μL)且通过3％甲酸和内标分子加入至200μL ACN中。使用与所述样品相同的基质和稀释程序制作各代谢物、托法替尼、5-ASA(化合物C-1M)和CRAC抑制剂(化合物C-2M)的标准曲线。所有样品以2000×g离心10分钟，之后将50μL上清液在150μL水中稀释且使用Thermo Q-Exactive LC-MS系统分析。使用GraphPad Prism和Microsoft Excel列表显示且绘制数据。
在培育之后，在底物浓度是10μM时，在大鼠结肠内容物中，所述比较化合物以及本发明的化合物皆展示母体分子在培育中的快速缺失(半衰期<15分钟)。然而，在测量各前药的活性代谢物后，仅化合物1产生可测量水平的其活性代谢物(托法替尼)。在120分钟培育之后测量托法替尼浓度是8.8μM。
相比之下，化合物C-1和C-2未能产生任何可测量量的其活性代谢物(对应的化合物C-1M和C-2M)。历经120分钟代谢物产生的时程图示于图1中。
虽然本发明已参考其特定方面或实施例进行描述，但本领域中的一般技术人员应了解，可进行各种变化或可代入等效物，而不偏离本发明的真实精神和范畴。另外，在由适用的专利状况和规定允许的程度上，本文中所引用的所有公开、专利和专利申请以全文引用的方式并入本文中，其引用的程度如同将各文件单独地以引用的方式并入本文中一般。

Claims (27)

1.一种式(I)化合物，
Figure FDA0002817778770000011
其中
n是0、1或2；
R1选自氢、C1-4烷基、C1-3烷氧基、氨基、硝基、卤基、氰基、羟基和三氟甲基；
每个R2在若存在时独立地选自C1-4烷基、C1-3烷氧基、氨基、硝基、卤基、氰基、羟基和三氟甲基；
R3是氢、甲基或乙基；
R4是氢、甲基或乙基；
或其医药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1是氢。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中R1是硝基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中R1是氨基。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中n是0。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中n是1。
7.一种式(II)化合物，
Figure FDA0002817778770000021
其中
R1选自氢、C1-4烷基、C1-3烷氧基、氨基、硝基、卤基、氰基、羟基和三氟甲基；
或其医药学上可接受的盐。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中R1是选自氢、甲基、甲氧基、氨基、硝基和氯。
9.根据权利要求7所述的化合物，其中R1是氢。
10.根据权利要求7所述的化合物，其中R1是氨基。
11.一种式1化合物，
Figure FDA0002817778770000031
或其医药学上可接受的盐。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中所述化合物是(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(((3R,4R)-1-(2-氰基乙酰基)-4-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-N-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-甲酰胺基)乙基)(甲基)氨甲酰基)-氧基)甲基)-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-哌喃-2-甲酸。
13.根据权利要求11所述的化合物，其中在与β-葡糖醛酸酶接触之后，产生式2化合物：
Figure FDA0002817778770000032
或其盐。
14.一种医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和根据权利要求1到13中任一权利要求所述的化合物。
15.一种制备根据权利要求1所述的化合物的方法，所述方法包含使式(I-A)化合物或其盐脱除保护基；
Figure FDA0002817778770000041
其中R1、R2、R3、R4和n如权利要求1中所定义；每个PGa独立地是羟基保护基；且PGb是羧基保护基；以获得式(I)化合物或其医药学上可接受的盐。
16.根据权利要求15所述的方法，其中R1是硝基；R3和R4是甲基；每个PGa是乙酰基；PGb是甲基；且n是0。
17.一种用于制备根据权利要求11所述的化合物的方法，所述方法包含：
(a)使式12'化合物：
Figure FDA0002817778770000042
或其盐；其中每个PGa独立地是羟基保护基，与式13化合物反应：
Figure FDA0002817778770000051
以获得式14'化合物：
Figure FDA0002817778770000052
以及
(b)脱除所述式14'化合物的保护基以获得所述式1化合物或其医药学上可接受的盐。
18.一种式13化合物，
Figure FDA0002817778770000053
或其盐。
19.根据权利要求1到13中任一权利要求所述的化合物，用于治疗哺乳动物的胃肠发炎疾病。
20.根据权利要求19所述的化合物，其中所述胃肠发炎疾病是溃疡性结肠炎。
21.根据权利要求19所述的化合物，其中所述胃肠发炎疾病是克罗恩氏病。
22.根据权利要求19所述的化合物，其中所述胃肠发炎疾病是与免疫检查点抑制剂疗法相关的结肠炎。
23.一种根据权利要求1到13中任一权利要求所述的化合物的用途，用于制造供治疗哺乳动物的胃肠发炎疾病的药剂。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述胃肠发炎疾病是溃疡性结肠炎。
25.根据权利要求23所述的用途，其中所述胃肠发炎疾病是克罗恩氏病。
26.根据权利要求23所述的用途，其中所述胃肠发炎疾病是与免疫检查点抑制剂疗法相关的结肠炎。
27.一种托法替尼的含有葡糖苷酸的前药的用途，用于制造供将托法替尼递送至哺乳动物的结肠的药剂，其中托法替尼的所述含有葡糖苷酸的前药是根据权利要求1到13中任一权利要求所述的化合物并且所述前药在所述结肠中通过β-葡糖苷酸酶裂解而释放出托法替尼。
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