ES2744342T3 - Un receptor quimérico soluble de interleucina 10 y su uso terapéutico - Google Patents
Un receptor quimérico soluble de interleucina 10 y su uso terapéutico Download PDFInfo
- Publication number
- ES2744342T3 ES2744342T3 ES16728097T ES16728097T ES2744342T3 ES 2744342 T3 ES2744342 T3 ES 2744342T3 ES 16728097 T ES16728097 T ES 16728097T ES 16728097 T ES16728097 T ES 16728097T ES 2744342 T3 ES2744342 T3 ES 2744342T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- fusion protein
- tumor
- human
- cells
- murine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010017550 Interleukin-10 Receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 102000004551 Interleukin-10 Receptors Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 66
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 85
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 31
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 20
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 6
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 71
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 23
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 21
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 20
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 17
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 101001033233 Homo sapiens Interleukin-10 Proteins 0.000 description 7
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 7
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 7
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 102000052620 human IL10 Human genes 0.000 description 7
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 6
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 6
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 6
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 5
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 101000746783 Homo sapiens Cytochrome b-c1 complex subunit 6, mitochondrial Proteins 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 101100340718 Mus musculus Il10 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 102000048638 human UQCRH Human genes 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 4
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 4
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700032845 Ala(2)- enkephalinamide-Met Proteins 0.000 description 2
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000608571 Murina Species 0.000 description 2
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 2
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 102100036922 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Human genes 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000025020 negative regulation of T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 108010023522 Interleukin-10 Receptor alpha Subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 229960003270 belimumab Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5428—IL-10
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
Abstract
Una proteína de fusión quimérica que comprende albúmina y el dominio extracelular de la unidad alfa del receptor de interleucina 10 (IL10).
Description
DESCRIPCIÓN
Un receptor quimérico soluble de interleucina 10 y su uso terapéutico
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un nuevo receptor quimérico soluble de interleucina 10 (IL10) caracterizado por una baja inmunogenicidad capaz de bloquear la interacción entre la IL 10 y su receptor que se encuentra en las células del hospedador y que en particular es útil para el tratamiento de tumores así como en el tratamiento de patologías caracterizadas por altos niveles de producción de interleucina 10, tales como lupus eritematoso sistémico (LES).
Estado de la técnica
Los enfoques convencionales de terapia tumoral incluyen:
1) la extirpación del tumor mediante cirugía,
2) la destrucción del tumor mediante quimioterapia, radioterapia e inmunoterapia,
Los enfoques de la inmunoterapia aplicada hasta ahora comprenden:
1) Inyecciones de anticuerpos capaces de mediar en la lisis de las células tumorales con diferentes mecanismos, 2) Infusiones de citocinas potencialmente capaces de activar la respuesta inmunitaria antitumoral,
3) Infusiones de linfocitos posiblemente capaces de destruir directamente el tumor;
4) Inmunización con péptidos, proteína o lisados celulares derivados de tumores.
5) Inmunización con genes (en forma de ADN o ARN) que codifican los antígenos asociados a los tumores (AAT).
6) Inhibición de las funciones inmunorreguladoras a través de agentes biológicos específicos (anticuerpos ligando anti CTLA4, anti PD1, anti PD1)
No obstante, las terapias convencionales dan lugar a resultados variables, en relación al tipo histológico o al estadio tumoral. En cuanto a la inmunoterapia, independiente del tipo de terapia seguida, se obtuvieron resultados insatisfactorios (20-30 % de las respuestas clínicas en diferentes protocolos clínicos, con la única excepción con respecto al uso de anticuerpos monoclonales en enfermedades específicas tales como linfoma de células B y tumor mamario).
En general, el arsenal terapéutico utilizado hasta ahora contra los tumores consiste principalmente en maniobras agresivas mediante el uso de agentes que tienen el propósito de destruir el cáncer, que no facilitan el proceso normal de control inmunológico que, en individuos sanos, impide la aparición o la progresión de tumores.
Dado que rara vez se puede lograr una eliminación completa del tumor debido a múltiples razones de naturaleza biológica, las células tumorales supervivientes permanecen en el cuerpo de la mayoría de los pacientes con tumor, a pesar de que están bajo terapia. De hecho, estas células mantienen la capacidad de evadir un sistema inmunitario aún paralizado por factores biológicos dependientes de tumores y por las terapias antitumorales mencionadas anteriormente: por lo tanto, pueden inducir una recidiva y una progresión del tumor. De hecho, incluso si los tumores tienen genes aberrantes que inducen modificaciones sustanciales desde un punto de vista morfológico, fenotípico y funcional con respecto a las células autólogas normales, estos evaden la vigilancia inmunológica. Este fenómeno es aún más sorprendente teniendo en cuenta el hecho de que los tumores expresan antígenos asociados a tumores (AAT) y que están infiltrados por linfocitos T específicos de tumor. Entre los diversos mecanismos biológicos conocidos que contribuyen a verificar la evasión inmunitaria del tumor, la actividad de los linfocitos T reguladores tiene un papel clave - secretan IL10 en el sitio del tumor. Para neutralizar el último fenómeno, sería necesario proporcionar una molécula capaz de inhibir la actividad de los linfocitos T reguladores en el sitio del tumor. La administración de dicha molécula limitaría la evasión inmunitaria del tumor y permitiría al sistema inmunitario del hospedador recuperar una reactividad antitumoral eficaz.
Con respecto a la terapia actual del tratamiento del lupus eritematoso sistémico, esta consiste en la administración de esteroides e inmunosupresores, fármacos que no tienen una especificidad con respecto al mecanismo de acción y además pueden causar diversos efectos secundarios graves. Una terapia más reciente permite la administración de Belimumab, un anticuerpo humano anti Blys (del inglés B lymphocyte stimulator, estimulador de linfocitos B), en otras palabras, un agente terapéutico capaz de inhibir la activación de los linfocitos B.
El LES (lupus eritematoso sistémico), junto con otras patologías autoinmunitarias, se caracteriza por una respuesta inmunitaria anómala de los linfocitos B y por una mayor secreción de IL-10 que causa una hiperproducción de autoanticuerpos con la consiguiente activación del proceso inflamatorio sistémico (Llorente et al., "In vivo production of interleukin-10 by non T-cell in rheumatoid arthritis, Síndrome de Sjogren y lupus eritematoso sistémico: a potential mechanism of B-lymphocyte hyperactivity and autoimmunity" Arthritis Rheum, 1994; 37: 1647-55"). cabe destacar que el tratamiento de pacientes afectados por LES con un anticuerpo monoclonal anti-IL10, tuvo efectos terapéuticos beneficiosos y favorables. (Llorente L. et al., "Clinical and biological effects of antiinterleukin 10 monoclonal antibody
administration in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 2000; 43: 1790-1800). Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar un agente terapéutico capaz de reducir la producción de autoanticuerpos, por ejemplo a través de la neutralización de IL-10.
Antecedentes de la invención
La generación de la inmunoadhesina anti-IL10, es decir, una proteína de fusión constituida por la porción Fc de la inmunoglobulina (Ig) y por la cadena alfa del receptor de IL-10, se ha descrito previamente (Terai M. et al. "Human intertleukin 10 receptor 1/ IgG1-Fc fusion proteins for human IL-10 with therapeutic potential" Cancer Immunol. Immunother. Agosto de 2009; 58(8): 1307-17 EPUB.2009 14 de enero).
Esta proteína de fusión tiene una serie de desventajas causadas por el hecho de que contiene la porción Fc de la IgG1.
De hecho, la inmunoglobulina puede causar reacciones inmunitarias/inflamatorias mediadas por el enlace del Fc con sus receptores presentes en la mayoría de las células del sistema inmunitario (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos -CCDA) o con el complemento (citotoxicidad dependiente del complemento -CDC-). Esto puede conducir a reacciones inmunitarias/inflamatorias colaterales que pueden tener repercusiones significativas en la seguridad y tolerabilidad del producto. (Antibody Fc: Linking Adaptive and Innate Immunity, Margaret Ackerman y Falk Nimmerjahn, Academic Press 2014; Kapur R, Einarsdottir HK, Vidarsson G: IgG-effector functions: "the good, the bad and the ugly". Immunol Lett. Agosto de 2014; 160(2):139-44; Karsten CM, Kohl J: The immunoglobulin, IgG Fc receptor and complement triangle in autoimmune diseases. Immunobiology. Noviembre de 2012; 217(11):1067-79; Dijstelbloem HM, van de Winkel JG, Kallenberg CG: Inflammation in autoimmunity: receptors for IgG revisited. Trends Immunol. Septiembre de 2001; 22(9):510-6).
En el documento US 20090111146, en el que los inventores son algunos de los autores de la publicación anterior, se describe una proteína de fusión en la que una región constante del anticuerpo humano se fusiona con una región extracelular de la IL-10. Por regiones constantes del anticuerpo humano, se entiende regiones constantes de la IgG, en particular, seleccionadas de entre las siguientes clases;
a) la parte Fc,
b) una región que incluye CH2 y CH3,
c) una región que comprende la parte de la bisagra, CH2 y CH3,
d) una región en la que están conectados CH1-CH3,
e) una región obtenida por deleción, adición, sustitución o inserción de 1 o varios aminoácidos en una de las regiones a)-d) citadas anteriormente y que funciona como una región constante.
Además, este tipo de polipéptido de fusión puede utilizarse para enfermedades correlacionadas con IL-10. En particular, las proteínas de fusión en las que la región extracelular del receptor de IL-10 se fusiona con:
a1) una región constante de IgG1 en la que se ha ejecutado una deleción de la región bisagra, o
a2) una región constante de IgG1, que tiene la región bisagra mutada, generada por la mutación de la cisteína en la región bisagra de tal manera que no forme un dímero (estas moléculas pueden emplearse para promover la activación de las células T citotóxicas).
Este tipo de proteínas de fusión podría utilizarse para tratar el cáncer, pero su uso está posiblemente sujeto a un alto riesgo de inducción de efectos secundarios vinculados a la presencia de una porción molecular esencialmente proinflamatoria, como el fragmento Fc o los grandes cambios CH1-CH3 contenidos en Fc (véase anteriormente). Las reacciones inmunitarias/inflamatorias colaterales y sistémicas posiblemente inducidas por dichas moléculas podrían tener repercusiones significativas en la seguridad y tolerabilidad del producto.
Objetivos de la invención
Por lo tanto, el objeto de la presente invención es la generación de un inhibidor de IL-10 en particular para utilizarse como agente terapéuticamente eficaz para todos los tipos de patologías en las que la IL-10 tiene una valencia patógena y que no tiene los inconvenientes de los inhibidores de IL-10 conocidos descritos anteriormente.
El objetivo de la presente invención también es el uso de dicho inhibidor de IL-10 en el tratamiento de tumores.
Otro objeto de la presente invención es el uso de dicho inhibidor de IL-10 en el tratamiento del LES.
Otro objeto de la invención es generar un inhibidor de IL-10 que no tenga porciones moleculares posiblemente capaces de inducir fenómenos inflamatorios/inmunitarios, tales como porciones de anticuerpos o porciones de secuencias de aminoácidos no contenidas en moléculas humanas (por tanto, sustancialmente no portadoras de mutaciones o de moléculas exógenas). Esto con el fin de garantizar la tolerabilidad total de los mismos y eliminar los riesgos vinculados a la inducción de efectos secundarios.
Sumario de la invención
Los objetivos de la presente invención descritos anteriormente se consiguen con la generación de un receptor de proteína de fusión quimérica albúmina-IL10 capaz de antagonizar el enlace de IL-10 con el receptor natural presente en la superficie celular.
La presencia de albúmina dentro del polipéptido de fusión confiere estabilidad y solubilidad a esta molécula. Además, la molécula es poco inmunogénica en individuos singénicos, para evitar riesgos de desarrollar respuestas inmunitarias contra la proteína de fusión, objeto de la presente invención.
Otro objeto de la presente invención es la proteína de fusión mencionada anteriormente para uso como medicamento, en particular para inhibir las enfermedades de IL-10 correlacionadas.
Otro objeto de la presente invención es la proteína de fusión quimérica soluble albúmina-IL10 mencionada anteriormente para su uso en el tratamiento de tumores.
Otro objeto de la presente invención es la proteína de fusión mencionada anteriormente para su uso en el tratamiento del LES.
Otro objeto de la presente invención es una construcción polinucleotídica, preferentemente un gen, que codifica esta proteína de fusión.
Otro objeto de la presente invención es el gen mencionado anteriormente para su uso como medicamento, en particular para inhibir las enfermedades mediadas por IL-10.
Otro objeto de la presente invención es el gen mencionado anteriormente para su uso en el tratamiento de tumores.
Otro objeto adicional de la presente invención es el gen mencionado anteriormente para su uso en el tratamiento del LES.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra el fenotipo y el análisis funcional de los linfocitos infiltrantes de tumores. El eje y muestra las concentraciones porcentuales individuales de cada una de las subpoblaciones de células T: CD8+, CD8+CD28+, CD8+CD28-, CD4+, CD4+CD25+ presentes en la población de linfocitos que infiltran tumores aislados de 22 pacientes. La figura también presenta las diferencias significativas entre los porcentajes promedio.
La Figura 2 presenta la actividad de inmunosupresión llevada a cabo por las células T CD8+CD28+, CD8+CD28-(gráfico de la izquierda) tumores infiltrantes aislados de 23 pacientes, que se sometieron a un ensayo de inhibición de proliferación de células T inducida por un anticuerpo monoclonal (mAb, del inglés monoclonal antibody) anti-CD3. Los datos se expresan como porcentaje de inhibición de la actividad de proliferación inducida por CD3, medido mediante la incorporación de 3H-Timidina en las células proliferantes y realizando la lectura con un contador beta y expresada como recuentos por minuto (rpm) en los cultivos individuales. El gráfico de la derecha muestra la función inmunosupresora de los tumores infiltrantes de células T CD4+CD25+ procedentes de 5 pacientes. La inhibición de la actividad supresora por un anticuerpo monoclonal (mAb) que neutraliza la actividad biológica de IL-10, se presenta solo en el caso de los ensayos funcionales ejecutados con linfocitos TregCD8+CD28-(gráfico de la izquierda).
La Figura 3 muestra la inhibición de la actividad citotóxica de una línea celular de CTL específica para el péptido p540 de la telomerasa contra células T2 pulsadas con el péptido p540, en presencia o en ausencia de células T CD28+CD28-, derivadas de tumores primarios de dos pacientes. Los cultivos que contenían linfocitos T CD28+CD28- se llevaron a cabo en placas de tipo "transwell" para separar los linfocitos T CD28+CD28- de las células diana (línea tumoral T2) y de los linfocitos citotóxicos. a) CTL células T2 no pulsadas, b) CTL+ células T2 pulsadas con el péptido p540 c) CTL+ células T2 pulsadas con el péptido p540 CD28+CD28- d) CTL+ células T2 pulsadas con el péptido p540+ CD28+CD28- mAb anti-IL10; e) CTL+ células T2 pulsadas con el péptido p540+CD28+CD28-+ anticuerpo de control de isotipo del mAb anti-IL10.
La Figura 4 muestra la actividad inmunosupresora en la proliferación de las células T ejercida por (A) gráfico de la izquierda: células T purificadas CD28+CD28- de ganglios linfáticos metastásicos de 23 pacientes o de ganglios linfáticos libres de metástasis de 6 pacientes. (B) gráfico de la derecha: células T CD24+CD25+ derivadas de ganglios linfáticos metastásicos de 6 pacientes, o de ganglios linfáticos sin metástasis de 6 pacientes.
Los datos se expresan como porcentaje de inhibición de la proliferación de células T inducida por un mAb anti-CD3, medido mediante la incorporación de 3H-Timidina y realizando la lectura a través de un contador beta de los recuentos por minuto (rpm) emitidos por los cocultivos.
La Figura 5 presenta el área promedio de lesiones de melanoma en ratones inyectados respectivamente con: *0 “ 1x105 células de melanoma B16 (ratones de control), "# • 1x105 células de melanoma B16 tratadas con células dendríticas (CD) pulsadas con antígeno gp100 de melanoma, inoculadas mediante inyección intramuscular (2x10® CD/ratón x3 veces cada 7 días a partir del día de la administración del tumor), iS r 1x10® células de melanoma B16
tratadas con CD pulsadas con antígeno gp100, inoculadas mediante inyección intramuscular (2x106 células/ratón x3 veces cada 7 días e inyectadas mediante inyección subcutánea con un mAb anti-IL-10 que bloquea la actividad biológica de la citocina (150 |jg x3 veces cada 7 días a partir del día de la administración del tumor).
La Figura 6 presenta el análisis mediante transferencia Western del lisado de células 293T transfectadas con: pcDNA3.1 que contiene el gen que codifica la proteína de fusión murina IL10R-albúmina (carril 1), pcDNA3.1 vacío (carril 2) y lisado de células 293T no transfectadas (carril 3)
La Figura 7 presenta el análisis mediante transferencia Western del lisado de células 293T transfectadas con pcDNA3.1 que contiene el gen que codifica la proteína humana IL10R-albúmina (carril 1); lisado de células 293T transfectadas con pcDNA3.1 vacío (carril 2); sobrenadante de células 293T transfectadas con pcDNA3.1 que contiene el gen que codifica la proteína de fusión humana IL10R-albúmina (carril 3); sobrenadante de células 293T transfectadas con pcDNA3.1 vacío (carril 4).
La Figura 8 presenta el área promedio de las lesiones de melanoma observadas en ratones inyectados respectivamente con:
1x105 células de melanoma B16 (ratones de control), ■ 1x105 células de melanoma B16 tratadas con un plásmido de control (pcDNA 3.1) que se inyectó mediante inyección intradérmica (100 jg x3 veces cada 7 días a partir del día de la administración del tumor).
M I 1x105 células de melanoma B16 tratadas con un plásmido que codifica la proteína de fusión quimérica según la presente invención (pcDNA3.1IL10R-seroalbúmina murina (SAM) que se ha inyectado por vía intradérmica (100 jg x3 veces cada 7 días a partir del día de administración del tumor). La figura también presenta las diferencias significativas entre los grupos.
La Figura 9 representa el área promedio de las lesiones de melanoma observadas en ratones inyectados con:
1x105 células de melanoma B16 (ratones de control),
1x105 células de melanoma B16 tratadas con un plásmido que codifica la proteína de fusión quimérica según la presente invención (pcDNA3.1IL10R-SAM) que se inyectó por vía intradérmica (100 jg x3 veces cada 7 días a partir del día de la administración del tumor);
1x105 células de melanoma B16 tratadas con un plásmido que codifica la proteína de fusión quimérica según la presente invención (pcDNA3.1IL10R-SAM) que se inyectó por vía intradérmica (100 jg x3 veces cada 7 días a partir del día de la administración del tumor) y que se inyectó por vía intradérmica con CD pulsadas con antígeno mgp100, que se inyectaron mediante inyección intramuscular (2x106 células/ratón x3 veces 7 días, a partir del día de la administración del tumor).
■t 1x105 células de melanoma B16 inyectadas por vía intradérmica con CD pulsadas con antígeno rngplOO, que se inyectaron mediante inyección intramuscular (2x106 células/ratón x3 veces cada 7 días a partir del día de la administración del tumor). La figura también presenta las diferencias significativas entre los grupos.
La Figura 10 presenta el área promedio de las lesiones observadas en ratones inyectados con • i 1x105 células de líneas de células tumorales vesicales singénicas MB49 (control), — 1x105 células de líneas de células tumorales vesicales singénicas MB49 tratadas con un plásmido de control (pcDNA 3.1) que se inyectaron por vía intradérmica (100 jg x3 veces a intervalos de 7 días entre una administración y la siguiente a partir del día de la administración del tumor). * i 1x10 5 células tumorales vesicales singénicas MB49 tratadas con un plásmido que codifica la proteína de fusión quimérica según la presente invención (pcDNA3.1IL10R-SAM) que se inyectó por vía intradérmica (100 jg x3 veces en un intervalo de 7 días entre una administración y la siguiente comenzando desde el día de administración del tumor). La figura también presenta las diferencias significativas entre los grupos. La Figura 11 indica la detección del transgén-IL10R-SAM en ADN celular después de haberse extraído de 4x106 células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y de bazo, hígado y riñón de 4 ratones vacunados con ADN (pcDNA3.1IL10R-SAM) y de 1 ratón no vacunado (control), respectivamente:
(A) 24 horas, (B) 14 días, (C) 20 días después de la vacunación y después de la amplificación con PCR anidada de cada uno de los ADN mencionados anteriormente.
La Figura 12A presenta, en forma de gráfico explicativo, los resultados de validación presentados en la figura 12B, obtenidos realizando un ensayo ELISA en la proteína de fusión humana purificada según la presente invención; en la figura 12A el eje x presenta la concentración de IL-10 y el eje y la densidad óptica.
La Figura 13A presenta, en forma explicativa, los resultados de validación presentados en la Figura 13B mediante ensayos ELISA realizados en la proteína murina purificada; en la figura 13B el eje x presenta la concentración de I1L-10 y el eje y la densidad óptica.
Descripción detallada de la invención
Para los fines de la presente invención, por proteína quimérica se entiende una proteína derivada de la fusión de secuencias peptídicas de múltiples proteínas diferentes.
Para los fines de la presente invención, por construcción polinucleotídica se entiende una secuencia de nucleótidos derivada de la fusión de múltiples genes diferentes que codifican múltiples proteínas que son diferentes entre sí.
En la proteína de fusión quimérica según la presente invención, la albúmina es, preferentemente, albúmina de
mamífero, más preferentemente humana y murina y aún más preferentemente humana.
La proteína de fusión albúmina - receptor de interleucina 10 según la presente invención, es un producto génico quimérico, que también se caracteriza porque la albúmina está unida al dominio extracelular de la cadena alfa del receptor de IL-10.
El hecho de que la proteína de fusión, objeto de la invención, solo contenga el dominio extracelular (DEC) es un aspecto ventajoso ya que no contiene la porción intracitoplasmática de la cadena alfa del receptor de IL-10, es decir, una porción rica en aminoácidos hidrófobos. Por tanto, la ausencia del dominio intracitoplasmático hace que la proteína de fusión, objeto de la presente invención, sea mas estable, más soluble y obtenible con un mayor rendimiento durante las etapas de producción (clonación) debido al tamaño limitado con respecto a una proteína de fusión análoga que contiene la cadena alfa completa del receptor de IL-10. Por último, la ausencia del dominio intracitoplasmático hace que la proteína sea menos inmunogénica, impidiendo así el riesgo de que el hospedador inicie una respuesta inmunitaria contra la proteína de fusión de la invención.
El receptor de la interleucina 10 (IL10R) está constituido por dos cadenas: la cadena alfa que media el enlace con la IL10 y la cadena beta que transmite la señal al interior de la célula. Dado que el objeto de la invención es bloquear la IL-10 de modo que ya no esté disponible dentro del microambiente tumoral, en la construcción quimérica solo se clonó la subunidad alfa.
La albúmina está unida al dominio extracelular de la cadena alfa del receptor de IL-10, mediante un espaciador, y preferentemente dicho espaciador es la región bisagra de la IgG (inmunoglobulina gamma).
La IgG es preferentemente IgG1 de mamífero, más preferentemente de tipo humano y murino, aún más preferentemente proveniente de linfocitos de la sangre periférica.
La presencia de la región bisagra de la IgG, y preferentemente la IgG1, confiere flexibilidad a la porción constituida por el dominio extracelular de la cadena alfa del receptor de IL 10, estabilizando así el enlace con su ligando relativo (IL-10) y aumentando la afinidad/avidez de esta interacción.
La proteína de fusión quimérica, albúmina-receptor de IL-10, objeto de la presente invención, para su uso como medicamento, en particular para inhibir las enfermedades correlacionadas con IL-10, pueden administrarse por vía parenteral, preferentemente por vía intravenosa, o incluso por vía tópica, preferentemente mediante administración intradérmica, administración subcutánea, etc.
Además, el gen que codifica la proteína de fusión quimérica, albúmina-receptor de interleucina 10, mencionada anteriormente, puede emplearse para su uso como medicamento en particular para inhibir las enfermedades correlacionadas con IL-10 y puede administrarse por vía parenteral, preferentemente por vía intravenosa o tópica, preferentemente mediante administración intradérmica, administración subcutánea, etc.
Cuando la proteína de fusión quimérica o el gen relativo en particular se emplean para tratar tumores, pueden administrarse por vía parenteral, incluso por vía tópica, según los métodos de administración mencionados anteriormente.
En cualquier caso, en terapia contra el cáncer, la proteína de fusión quimérica o el gen relativo pueden emplearse:
a) Solos, para aumentar la respuesta inmunitaria contra el cáncer. Esto es aconsejable sobre todo en las fases iniciales de la enfermedad.
b) En combinación con quimioterapia y/o radioterapia (para respaldar la respuesta inmunitaria contra el tumor durante una etapa en la que se produjeron los siguientes acontecimientos: reducción de la masa tumoral, liberación de una gran cantidad de antígenos tumorales por células moribundas y recidiva de inflamación debido a la acumulación de material necrótico).
c) En combinación con protocolos inmunoterapéuticos para aumentar la eficacia de estos enfoques terapéuticos, con el propósito de mejorar la eficacia de las respuestas inmunitarias endógenas a través de la inhibición paralela de células reguladoras/supresoras.
En el tratamiento del lupus eritematoso sistémico, la proteína de fusión quimérica albúmina-IL 10R según la presente invención, puede administrarse mediante administración intravenosa sistémica por sí sola o en combinación con los tratamientos de tipo convencional.
A continuación se presentan los siguientes ejemplos experimentales, que demuestran el papel clave de la inhibición de la interleucina 10 en la reducción de los efectos inmunosupresores de los linfocitos reguladores que se infiltran en el tumor, mediante la administración del gen que codifica la proteína de fusión según la presente invención y dicha eficacia antitumoral de la proteína in vivo.
EJEMPLO 1- Demostración del papel clave de la IL-10 secretada por los linfocitos infiltrantes de tumores.
Después de haber recibido el consentimiento informado de cada paciente, Se obtuvieron muestras de biopsia de un grupo de 42 pacientes afectados por cáncer de diversos orígenes, cuyas características se presentan en la siguiente tabla 1, con quienes se realizó una serie de experimentos adaptados para demostrar el papel clave de los linfocitos T reguladores infiltrantes de tumores y de la citocina IL-10 liberada de ese modo en el microambiente tumoral.
TABALA 1 - RESUMEN DE LAS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS Y DEFINICIÓN DE LAS MUESTRAS
BIOLÓGICAS OBTENIDAS DE CADA PACIENTE
continuación
Ejemplo 1A: Caracterización de las poblaciones de linfocitos T reguladores infiltrantes de tumores derivados de pacientes oncológicos.
Se realizó un análisis fenotípico y funcional de las células infiltrantes de tumores derivadas de muestras de biopsia extraídas de 22 pacientes cuyas características se presentan en la Tabla 1. Para dicha finalidad, las muestras tumorales se fragmentaron finamente utilizando filtros estériles adecuados. Posteriormente, las suspensiones celulares obtenidas se estratificaron y se centrifugaron en gradiente de Ficoll. Por último, las diferentes subpoblaciones de linfocitos se purificaron mediante procedimientos de "clasificación" inmunomagnéticos utilizando bolas magnéticas adecuadas conjugadas con anticuerpos específicos (Miltenyi Biotech). El inmunofenotipo de los linfocitos infiltrantes ejecutado con anticuerpos monoclonales anti CD4, anti CD8, anti CD25, anti CD28 conjugados con fluorocromos (BD Biosciences) hizo posible la caracterización de dos poblaciones de linfocitos T reguladores (Treg), es decir, linfocitos Treg CD4+CD25+ y CD8+CD28- de entre los linfocitos infiltrantes de tumor, como se presenta en la Figura 1.
Ejemplo 1B Verificación de la actividad inmunosupresora de las células infiltrantes de tumor en linfocitos T.
La actividad inmunosupresora de las células T infiltrantes de tumor se midió en un ensayo de inhibición de la proliferación de linfocitos T de sangre periférica activados con anticuerpo mAb anti-CD3 y se evaluó mediante la incorporación de 3H-Timidina en las células proliferantes y la lectura se midió en un contador beta como recuentos por minuto (rpm). Los datos se expresan en la Figura 2 como porcentaje de inhibición de la proliferación de células T en presencia del mAb anti-CD3. En particular, el ensayo mostró actividad supresora de la proliferación por células T CD8+CD28-, pero no por células T infiltrantes de tumor CD8+CD28+, extraídas de 23 pacientes (Figura 2, gráfico de la izquierda) y por células T infiltrantes de tumor CD4+CD25+ procedentes de 5 pacientes (Figura 2, gráfico de la derecha). Dicha actividad supresora de los linfocitos Treg infiltrantes de tumor CD8+CD28- se bloquea en presencia del anticuerpo monoclonal mAb anti-IL10 (Figura 2, gráfico de la izquierda).
EJEMPLO 1-C Actividad inhibidora de las células T CD8+CD28- sobre la actividad citotóxica de los linfocitos T específicos de tumor.
La función reguladora de la población de células T CD8+CD28- derivada de muestras oncológicas, también se evaluó con respecto a la capacidad citotóxica de una línea celular humana de CTL específica para el péptido p540 de la telomerasa. Para dicha finalidad, la actividad citotóxica de esta línea de CTL se sometió a ensayo contra células pertenecientes a la línea tumoral linfoblástica T2 pulsada con el péptido p540 en presencia o en ausencia de células T reg CD8+CD28- aisladas de masas tumorales primarias de dos pacientes afectados por tumor de próstata HLA-A2 positivo. Los cocultivos en presencia de los linfocitos T reg intratumorales CD28+CD28- se realizaron en placas de tipo "transwell' adecuadas para separar físicamente los linfocitos Treg de las células diana de las líneas tumorales T2 y de los linfocitos CTL específicos de p540. Después, se llevaron a cabo los siguientes cocultivos:
a) CTL células diana T2 no pulsadas, b) CTL+ células diana T2 pulsadas con el péptido p540 c) CTL+ células diana T2 pulsadas con el péptido p540 Treg CD28+CD28- intratumoral, d) CTL+ células diana T2 pulsadas con el péptido p540+ Treg CD28+CD28- antitumoral mAb anti-IL10; e) CTL+ células diana T2 pulsadas con el péptido p540 Treg CD28+CD28+ intratumoral - mAb de control de isotipo con especificidad no significativa.
Los resultados de este experimento presentados en la Figura 3, se expresan como porcentaje de inhibición de la actividad citotóxica e indican que la población de Treg CD8+CD28- también ejerce una actividad inhibidora contra la función citotóxica de las células T específicas de tumor.
EJEMPLO 1D reducción de la actividad inmunosupresora por el anticuerpo monoclonal mAb anti IL-10
Las actividades inmunosupresoras de la población de células Treg infiltrantes de tumor son contrarrestadas por los anticuerpos monoclonales anti-IL10, demostrando por tanto ser estrictamente dependientes de la secreción de esta citocina. La acumulación de T reg CD8+CD28- y de T reg CD4+CD25+ parece ser estrictamente dependiente del tumor ya que solo se verifica cuando la infiltración del tumor está presente tanto en el sitio del tumor primario como en los
sitios de la metástasis. De hecho, se descubrió que solo los ganglios linfáticos metastásicos, y no los que no tienen metástasis, estaban infiltrados por las poblaciones de células T reguladoras mencionadas anteriormente. (véase la figura 4)
EJEMPLO 1-E Verificación in vivo de la actividad inmunosupresora de la IL-10.
Los ratones negros C57 inyectados por vía subcutánea con 1 x 105 células de melanoma singénico B16 desarrollan un melanoma muy agresivo caracterizado por una invasión local devastadora y una propagación metastásica a través de la contigüidad con los órganos viscerales abdominales, si la inyección se produce en la zona abdominal. Con el fin de identificar una inmunoterapia eficaz, se realizaron diferentes estrategias que comprendían:
vacunación génica con plásmidos que codifican el antígeno gp100 humano o murino asociado a melanoma; b) vacunación subcutánea con péptidos inmunogénicos derivados de gp100 humano (hgp10Ü25-33) o murino (mgp10025-33) en presencia de adyuvante CpG (citosina-fosfato-guanina),
c) "¿ r vacunación con células dendríticas (CD) precargadas con los mismos péptidos inmunogénicos (gp100).
Tanto en un contexto singénico como xenogénico, la vacunación con células dendríticas pulsadas con el péptido gp100 resultó ser el tratamiento más protector que indujo una reducción >50 % de la masa tumoral. En un experimento posterior, los ratones sometidos a "exposición" con células de melanoma B16 se inmunizaron según con el protocolo (c) en asociación con la administración de un mAb anti-IL10: dicha estrategia fue eficaz para inhibir el crecimiento tumoral completo en el 100 % de los ratones tratados, como se presenta en la Figura 5.
Dado que los estudios anteriores ya habían demostrado que la IL-10 causa la diferenciación intratumoral de las células dendríticas tolerogénicas, capaz de inducir más células T reguladoras (Guiducci et al., Cancer Res. 2005; 65; 3437 3446), en su totalidad estos datos respaldan la idea innovadora de que la IL10 tiene un papel importante en la determinación de la evasión del tumor de la vigilancia inmunitaria y que las estrategias que apuntan a bloquear los efectos de la IL-10 intratumoral a nivel funcional/molecular pueden ser enfoques eficaces para el tratamiento de tumores.
EJEMPLO 2 PRODUCCIÓN DE LAS CONSTRUCCIONES DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN:
- ALBUMINA HUMANA - REGIÓN DE BISAGRA DE IgG1 HUMANA - DOMINIO EXTRACELULAR DE LA CADENA ALFA DEL RECEPTOR DE IL 10 HUMANO.
- ALBUMINA MURINA- REGIÓN DE BISAGRA DE IgG1 MURINA - DOMINIO EXTRACELULAR DE LA CADENA ALFA DEL RECEPTOR DE IL 10 MURINO
EJEMPLO 2.1-Preparación de la construcción del plásmido pcDNA 3.1 albúmina humana/murina - región bisagra de IgG1 humana/murina - dominio extracelular de la cadena alfa del receptor de IL 10 humano/murino.
El plásmido de expresión pcDNA -V5-His (Life Technologies), que fue empleado para el estudio, contiene el promotor de los genes del citomegalovirus (CMV) y el fragmento de poliadenilación SV40 necesario para finalizar la transcripción y la traducción; además, también contiene el epítopo V5 y una etiqueta de His útil para la evaluación y purificación de la expresión del producto génico. La selección estable de clones en células eucariotas es posible debido a la presencia del gen de resistencia a G418. Se diseñaron dos proteínas de fusión, respectivamente una humana y una murina, uniendo el ADNc del dominio extracelular (DEC) de la cadena alfa del receptor de interleucina 10 derivado de CMSP, respectivamente humano y murino, a clones de ADNc de seroalbúmina humana y murina respectivamente adquiridos en la ATCC. Los dos ADNc se unieron solo mediante la región bisagra de la IgG1 humana y murina respectivamente derivada de CMSP. La clonación se realizó utilizando la siguiente estrategia: el ADNc del dominio extracelular (DEC) de la cadena alfa del receptor de interleucina 10 murino se clonó por PCR utilizando el siguiente par de cebadores con los sitios de restricción insertados: mIL10R-KpnI directo 5'-TTAGGTACCATGTTGTCGCGTTTGCTCC-3' y mIL10R NotI inverso 5'-GCGGCCGCCTGTACATATGCAAGGCTTACAACC-3', el ADNc de la seroalbúmina murina se clonó por PCR utilizando el siguiente par de cebadores con los sitios de restricción insertados: SAM-NotI directo 5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCGAAGCACACAAGAG 3' y SAM-XbaI inverso 5' GCT CT AGAGGCT AAGGCGT CTTTG-3'. El ADNc del DEC de la cadena alfa del receptor de interleucina 10 humano se clonó por PCR utilizando el siguiente par de cebadores con los sitios de restricción insertados: hIL10R-KpnI directo 5'-GGT ACCAT GCT GCCGTGCCT CGT AG 3' y hIL10R NotI inverso 5'-GCGGCCGC TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCACAA y el ADNc de la seroalbúmina humana (SAH) se clonó por PCR utilizando el siguiente par de cebadores con los sitios de restricción insertados: SAH-NotI directo 5'-GCGGCCGCGGATGCACACAAGAGTG-3' y SAH-ApaI inverso 5' GGGCCCTTATAAGCCTAAGGCA-3'. La PCR se ejecutó en el instrumento Biorad T100.
Para confirmar la alineación exacta de los dos genes, la construcción quimérica fue secuenciada con un secuenciador automático (ABI 3100, Applied Biosystem)
Ejemplo 2.2 análisis y caracterización de las proteínas de fusión quiméricas murinas y humanas de la invención Posteriormente, los productos génicos se analizaron y se evaluaron mediante análisis de transferencia Western según los siguientes modos operativos: células 293T o HEK293 se transfectaron con los dos plásmidos, pcDNA3.1 IL10R-albúmina murina y pcDNA3.1 IL10R-albúmina humana, respectivamente. Los lisados y sobrenadantes relativos de los cultivos celulares mencionados anteriormente se analizaron mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) al 12,5 % en condiciones reductoras y se analizaron mediante transferencia Western, empleando anticuerpos específicos para los productos génicos (por ejemplo, anticuerpo monoclonal anti-CD210 murino y anticuerpo monoclonal anti-IL10R alfa humano, anticuerpo monoclonal anti albúmina murina/humana).
Los lisados celulares y los sobrenadantes de células no transfectadas y/o transfectadas con plásmido "vacío" (es decir, que no contiene el gen quimérico) se analizaron en paralelo como controles negativos: como se esperaba, en estos, no se encontró la presencia del producto quimérico. Los resultados de este análisis se presentan en las figuras 6 y 7 respectivamente. La Figura 6 muestra la presencia de la banda del peso molecular esperado igual a 98 Kd en el carril que contiene el lisado celular de células 293T transfectadas con el plásmido pcDNA3.1 que contiene el gen IL10R-albúmina murino, pero no en los carriles donde se procesaron los lisados de control. La Figura 7 muestra la presencia de la banda del peso molecular esperado igual a 98 Kd en los carriles que contienen el lisado celular o el sobrenadante de células 293T transfectadas con el plásmido pcDNA3.1 que contiene el gen IL10R-albúmina humano, pero no en los carriles donde se procesó el lisado de control o el sobrenadante de control. En general, dichos datos confirman la presencia de la proteína quimérica, murina y humana, respectivamente, objeto de la invención, en el lisado y en el sobrenadante de las células transfectadas con los plásmidos que contienen los genes quiméricos (humanos y murinos, respectivamente).
EJEMPLO 3 ESTUDIOS PRELIMINARES IN VIVO SOBRE LA ACTIVIDAD ANTITUMORAL DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN QUIMÉRICA ALBUMINA-DOMINIO EXTRACELULAR DE LA CADENA ALFA DEL RECEPTOR DE IL 10.
Ejemplo 3.1 - Actividad antitumoral in vivo contra el melanoma inducido por las células tumorales de melanoma B16 por la construcción pcDNA 3.1 - albúmina murina- región bisagra de IgG1 murina - dominio extracelular de la cadena alfa del receptor de IL 10 murino
A 3 grupos de ratones negros C57 se les inyectó respectivamente:
• ; 1x105 células de melanoma B16 (ratones de control); ■ 1x105 células de melanoma B16 tratadas con un plásmido de control (pcDNA 3.1) que se inyectó por vía intradérmica (100 |jg x3 veces a intervalos de 7 días entre una administración y la siguiente, a partir del día de la administración del tumor);
A 11x105 células de melanoma B16 tratadas con un plásmido que codifica la proteína de fusión quimérica según la presente invención (pcDNA3.1IL10R-SAM) que se inyectó por vía intradérmica (100 jg x3 veces a intervalos de 7 días entre una administración y la siguiente, a partir del día de la administración del tumor);
Durante el experimento, las zonas de las lesiones tumorales se monitorizaron y los animales se sacrificaron, en relación con las normas éticas, cuando el mayor diámetro de la masa neoplásica alcanzó un tamaño de 2 cm. Los resultados se presentan en la figura 8. Como se deduce de esta figura, la administración del plásmido vacío no indujo ninguna diferencia significativa con respecto al grupo de control no tratado (tiempos de supervivencia <2 semanas). Por el contrario, los ratones inmunizados con la construcción del plásmido que codifica la proteína de fusión quimérica según la presente invención, mostraron un cambio drástico y significativo de la curva de crecimiento del melanoma, de manera que tenían tiempos de supervivencia de más de 20 días en comparación con los ratones de control.
Ejemplo 3.2 Actividad antitumoral in vivo, después de la administración de células tumorales de melanoma B16, de la construcción del plásmido pcDNA 3.1- albúmina murina-región bisagra de IgG1 murina - dominio extracelular de la cadena alfa del receptor de IL 10 murino asociado a la inmunización con células dendríticas pulsadas con péptido mgp100.
Cuatro grupos de ratones negros C57 se trataron respectivamente con:
• * 1x105 células de melanoma B16 (ratones de control);
■ 1x105 células de melanoma B16 y administración del plásmido que codifica la proteína de fusión quimérica según la presente invención (pcDNA3.1IL10R-SAM) que se inyectó por vía intradérmica (100 jg x3 veces a intervalos de 7 días entre una administración y la siguiente, a partir del día de la administración del tumor);
* i 1x105 células de melanoma B16 y administración del plásmido que codifica la proteína de fusión quimérica según la presente invención (pcDNA3.1IL10R-SAM) que se inyectó por vía intradérmica (100 jg x3 veces a intervalos de 7 días entre una administración y la siguiente, a partir del día de la administración del tumor) asociado a la inoculación intradérmica de CD (células dendríticas) pulsadas con péptido mgp10025-33, que se inyectaron por vía intramuscular (2x106 células/ratón x3 veces a intervalos de 7 días entre una administración y la siguiente, a partir del día de la administración del tumor);
# 1x105 células de melanoma B16 y administración intradérmica de CD (células dendríticas) pulsadas con péptido mgp10025-33, que se inyectaron por vía intramuscular (2x106 células/ratón x3 veces a intervalos de 7 días
entre una administración y la siguiente, a partir del día de la administración del tumor);
Durante el experimento, las zonas de las lesiones tumorales se monitorizaron y los animales se sacrificaron, en relación con las normas éticas, cuando el mayor diámetro de la masa neoplásica alcanzó un tamaño de 2 cm. Los resultados se presentan en la figura 9. A partir de estos datos, resulta que los ratones tratados con la construcción del plásmido que codifica la proteína de fusión, objeto de la invención, tienen una curva de crecimiento tumoral que es practicable superponible a la obtenida después del tratamiento con células dendríticas pulsadas con péptido mgp10025-33. Esto es de gran importancia, ya que el protocolo de vacunación con células dendríticas ha demostrado ser el más eficaz entre los tratamientos inmunoterapéuticos contra el melanoma B16 (véase anteriormente, Ejemplo 1-E en la página 15): por lo tanto, el tratamiento con la construcción del plásmido que codifica la proteína de fusión, objeto de la invención, ha demostrado una eficacia igual al mejor de los tratamientos inmunoterapéuticos. Además, los ratones tratados con la construcción del plásmido que codifica la proteína de fusión, objeto de la presente invención, junto con la administración de células dendríticas pulsadas con el péptido mgp10025-33, mostraron una mayor disminución significativa de la curva de crecimiento neoplásico ya que la aparición de lesiones apreciables se retrasó una semana más con respecto a los animales tratados solo con la administración de células dendríticas pulsadas con el péptido mgp10025-33 o solo con el plásmido que codifica la proteína de fusión, objeto de la invención.
Ejemplo 3.3. Actividad antitumoral in vivo contra la línea celular tumoral vesical M49 de la construcción del plásmido pcDNA 3.1 -albúmina murina - región bisagra de IgG1 murina - dominio extracelular de la cadena alfa del receptor de IL 10 murino.
Tres grupos de ratones negros C57 se trataron respectivamente con:
♦ ! 1x105 células de líneas celulares tumorales vesicales singénicas MB49 (control),
■ 1x105 líneas celulares tumorales vesicales singénicas MB49 y administración del plásmido de control "vacío" (pcDNA 3.1) que se inyectó por vía intradérmica (100 pg x3 veces a intervalos de 7 días entre una administración y la siguiente, a partir del día de la administración del tumor)
* . i 1x105 líneas celulares tumorales vesicales singénicas MB49 y administración del plásmido que codifica la proteína de fusión quimérica según la presente invención (pcDNA3.1IL10R-SAM) que se inyectó por vía intradérmica (100 pg x3 veces a intervalos de 7 días entre una administración y la siguiente, a partir del día de la administración del tumor)
Durante el experimento, las zonas de las lesiones tumorales se monitorizaron y los animales se sacrificaron, en relación con las normas éticas, cuando el mayor diámetro de la masa neoplásica alcanzó un tamaño de 2 cm. Los resultados se presentan en la figura 10.
Como se deduce de esta figura, los datos obtenidos con las líneas celulares tumorales M49 reproducen los datos obtenidos utilizando las células de melanoma. De hecho, la administración del plásmido vacío no indujo ninguna diferencia significativa con respecto al grupo de control no tratado (tiempos de supervivencia <2 semanas). Por el contrario, los ratones inmunizados con la construcción del plásmido que codifica la proteína de fusión quimérica según la presente invención, mostraron un cambio drástico y significativo de la curva de crecimiento del melanoma de manera que tenían tiempos de supervivencia de más de 20 días en comparación con los ratones de control.
EJEMPLO 4-Detección de los linfocitos B transgénicos
Con el fin de evaluar la persistencia y la distribución tisular del transgén, el ADN celular se extrajo de las CMSP y de los órganos (bazo, riñón, hígado, pulmón) de 4 ratones vacunados con alta velocidad de reperfusión, por vía intravenosa con una construcción polinucleotídica que codifica la albúmina murina-región bisagra murina de IgG1 murina- dominio extracelular de la cadena alfa del receptor de IL 10 murino y de 1 ratón no vacunado (control), 24 horas, 14 días y 20 días después de la vacunación. Los resultados se presentan en la figura 11. Como se deduce de dicha figura, el día 20 después de su inoculación, el transgén ya no era detectable, lo que demuestra que su semivida dentro del organismo es de aproximadamente 2 semanas.
Ejemplo 5 - Purificación de la proteína quimérica humana según la presente invención.
Las dos proteínas quiméricas humana y murina, objeto de la presente invención, se purificaron del sobrenadante de células HEK293 y EXPI-293, transfectadas con el plásmido que codifica la proteína de fusión humana y murina.
Las dos proteínas humana y murina se validaron realizando el ensayo ELISA respectivamente en dos lotes distintos, para las proteínas humanas, y en tres lotes distintos para las proteínas murinas. El ensayo ELISA realizado en la proteína quimérica humana demostró que la proteína quimérica humana reconoce específicamente la IL-10 humana y, a su vez, es reconocida por un anticuerpo humano anti albúmina marcado con HRP (peroxidasa de rábano picante).
Los resultados de dicho ensayo se presentan en las figuras 12A y 12B, respectivamente.
Este experimento demuestra que la proteína producida por las células transfectadas es una proteína quimérica que tiene capacidad de receptor específica para IL-10 asociada a una estructura de albúmina.
De manera análoga, los resultados obtenidos con el ensayo ELISA en la proteína de fusión murina presentada en las figuras 13A y 13B, demostraron que la proteína murina se unía específicamente a la interleucina murina, lo que confirmaba la eficacia del receptor. En este caso, la detección se realizó a través de un anticuerpo anti-histidina marcado con HRP, ya que la proteína murina tiene un código de histidina.
A continuación se presentan las secuencias de la proteína de fusión humana y murina según la presente invención en relación a los fragmentos del dominio DEC de la unidad alfa del receptor de IL10, de la región bisagra de la inmunoglobulina gamma, de la albúmina y de los fragmentos de las construcciones polinucleotídicas correspondientes.
Secuencia
<213> Nombre del organismo: Ser humano
<400> Cadena de la secuencia previa:
MLPCLWLLA ALLSLRLGSD AHGTELPSPP SVWFEAEFFH HILHWTPIPN QSESTCYEVA 60
LLRYGIESWN SISNCSQTLS YDLTAVTLDL YHSNGYRARV RAVDGSRHSN WTVTNTRFSV 120
DEVTLTVGSV NLE1HNGFIL GKIQLPRPKM APANDTYESI FSHFREYEIA IRKVPGNFTF 180
THKKVKHENF SLLTSGEVGE FCVQVKPSVA SRSNKGMWSK EECISLTRQY FTVTNSRV 238
<212> Tipo: PRT
<211> Longitud: 238
Nombre de la secuencia: dominio extracelular de IL10 R alfa humano
Secuencia
<213> Nombre del organismo: Ser humano
<400> Cadena de la secuencia previa:
EPKSCDKTHT CPAAA 15
<212> Tipo: PRT
<211> Longitud: 12
Nombre de la secuencia: BISAGRA humana
Secuencia
<213> Nombre del organismo: Ser humano
<400> Cadena de la secuencia previa:
DAHKSEVAHR FKDLGEENFK ALVLIAFAQY LQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE 60 NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNE CFLQHKDDNP NLPRLVRPEV 120 DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKR YKAAFTECCQ AADKAACLLP 180 KLDELRDEGK ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTK 240
VHTECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA 300
DLPSLAADFV ESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSWLLLRLA KTYETTLEKC 360 CAAADPHECY AKVFDEFKPL VEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST 420 PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAE DYLSWLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES 480 LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFNAETFTFH ADICTLSEKE RQIKKQTALV ELVKHKPKAT 540 KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASQ AALGL 585 <212> Tipo: PRT
<211> Longitud: 585
Nombre de la secuencia: Dominio de albúmina humana
Secuencia
<213> Nombre del organismo: Ser humano
<400> Cadena de la secuencia previa:
atgctgccgt gcctcgtagt gctgctggcg gcgctcctca gcctccgtct tggctcagac 60
gctcatggga cagagctgcc cagccctccg tctgtgtggt ttgaagcaga atttttccac 120
cacatcctcc actggacacc catcccaaat cagtctgaaa gtacctgcta tgaagtggcg 180
ctcctgaggt atggaataga gtcctggaac tccatctcca actgtagcca gaccctgtcc 240
tatgacctta ccgcagtgac cttggacctg taccacagca atggctaccg ggccagagtg 300
cgggctgtgg acggcagccg gcactccaac tggaccgtca ccaacacccg cttctctgtg 360
gatgaagtga ctctgacagt tggcagtgtg aacctagaga tccacaatgg cttcatcctc 420
ttcagtcact tccgagagta tgagattgcc attcgcaagg tgccgggaaa cttcacgttc 540
acacacaaga aagtaaaaca tgaaaacttc agcctcctaa cctctggaga agtgggagag 600
ttctgtgtcc aggtgaaacc atctgtcgct tcccgaagta acaaggggat gtggtctaaa 660
gaggagtgca tctccctcac caggcagtat ttcaccgtga ccaactctag agtt 714 <212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 714
Nombre de la secuencia: Nucleótido de dominio extracelular de IL10 R alfa humano
Secue.ncia
<213> Nombre del organismo: Ser humano
<400> Cadena de la secuencia previa:
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccagcgg ccgcg 45
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 45
Nombre de la secuencia: Nucleótido de BISAGRA humana
Secuencia
<213> Nombre del organismo: ratón
<400> Cadena de la secuencia previa:
MLSRLLPFLV TISSLSLEFI AYGTELPSPS YVWFEARFFQ HILHWKPIPN QSESTYYEVA 60
LKQYGNSTWN D1HICRKAQA LSCDLTTFTL DLYHRSYGYR ARVRAVDNSQ YSNWTTTETR 120
FTVDEVILTV DSVTLKAMDG IIYGT1HPPR PTITPAGDEY EQVFKDLRVY KISIRKFSEL 180
KNATKRVKQE TFTLTVPIGV RKFCVKVLPR LESRINKAEW SEEQCLLITT EQYFTVTNLS 240
IKLI 244 <212> Tipo: PRT
<211> Longitud: 244
Nombre de la secuencia: Dominio extracelular de IL10 R alfa de ratón
Secue.ncia
<213> Nombre del organismo: ratón
<400> Cadena de la secuencia previa:
VPRDCGCKPC ICTGGR 16
<212> Tipo: PRT
<211> Longitud: 16
Nombre de la secuencia: bisagra de ratón
Secuencia
.................
<213> Nombre del organismo: ratón
<400> Cadena de la secuencia previa:
EAHKSEIAHR YNDLGEQHFK GLVLIAFSQY LQKCSYDEHA KLVQEVTDFA KTCVADESAA 60
NCDKSLHTLF GDKLCAIPNL RENYGELADC CTKQEPERNE CFLQHKDDNP SLPPFERPEA 120
EAMCTSFKEN PTTFMGHYLH EVARRHPYFY APELLYYAEQ YNEILTQCCA EADKESCLTP 180
KLDGVKEKAL VSSVRQRMKC SSMQKFGERA FKAWAVARLS QTFPNADFAE ITKLATDLTK 240 VNKECCHGDL LECADDRAEL AKYMCENQAT ISSKLQTCCD KPLLKKAHCL SEVEHDTMPA 300
DLPAIAADFV EDQEVCKNYA EAKDVFLGTF LYEYSRRHPD YSVSLLLRLA KKYEATLEKC 360
CAEANPPACY GTVLAEFQPL VEEPKNLVKT NCDLYEKLGE YGFQNAILVR YTQKAPQVST 420
PTLVEAARNL GRVGTKCCTL PEDQRLPCVE DYLSAILNRV CLLHEKTPVS EHVTKCCSGS 480
LVERRPCFSA LTVDETYVPK EFKAETFTFH SDICTLPEKE KQIKKQTALA ELVKHKPKAT 540
AEQLKTVMDD FAQFLDTCCK AADKDTCFST EGPNLVTRCK DALA 584 <212> Tipo: PRT
<211> Longitud: 584
Nombre de la secuencia: Dominio de albúmina murina
Descripción de la secuencia:
Secue.ncia
<213> Nombre del organismo: ratón
<400> Cadena de la secuencia previa:
gtttgctccc attcctcgtc acgatctcca gcctgagcct agaattcatt 60 cagaactgcc aagcccttcc tatgtgtggt ttgaagccag atttttccag 120 actggaaacc tatcccaaac cagtctgaga gcacctacta tgaagtggcc 180 acggaaactc aacctggaat gacatccata tctgtagaaa ggctcaggca 240 atctcacaac gttcaccctg gatctgtatc accgaagcta tggctaccgg 300 gggcagtgga caacagtcag tactccaact ggaccaccac tgagactcgc 360 atgaagtgat tctgacagtg gatagcgtga ctctgaaagc aatggacggc 420 ggacaatcca tccccccagg cccacgataa cccctgcagg ggatgagtac 480 tcaaggatct ccgagtttac aagatttcca tccggaagtt ctcagaacta 540 ccaagagagt gaaacaggaa accttcaccc tcacggtccc cataggggtg 600 gtgtcaaggt gctgccccgc ttggaatccc gaattaacaa ggcagagtgg 660
<211> Longitud: 732
Nombre de la secuencia: Nucleótido de dominio extracelular de IL10 R alfa de ratón
Secuencia
<213> Nombre del organismo: ratón
<400> Cadena de la secuencia previa:
gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtacag gcggccgc 48
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 48
Nombre de la secuencia: Nucleótido de bisagra de ratón
Secuencia
<213> Nombre del organismo: ratón
<400> Cadena de la secuencia previa:
gaagcacaca agagtgagat cgcccatcgg tataatgatt tgggagaaca acatttcaaa 60 ggcctagtcc tgattgcctt ttcccagtat ctccagaaat gctcatacga tgagcatgcc 120 aaattagtgc aggaagtaac agactttgca aagacgtgtg ttgccgatga gtctgccgcc 180 aactgtgaca aatcccttca cactcttttt ggagataagt tgtgtgccat tccaaacctc 240 cgtgaaaact atggtgaact ggctgactgc tgtacaaaac aagagcccga aagaaacgaa 300 tgtttcctgc aacacaaaga tgacaacccc agcctgccac catttgaaag gccagaggct 360 gaggccatgt gcacctcctt taaggaaaac ccaaccacct ttatgggaca ctatttgcat 420 gaagttgcca gaagacatcc ttatttctat gccccagaac ttctttacta tgctgagcag 480 tacaatgaga ttctgaccca gtgttgtgca gaggctgaca aggaaagctg cctgaccccg 540 aagcttgatg gtgtgaagga gaaagcattg gtctcatctg tccgtcagag aatgaagtgc 600 tccagtatgc agaagtttgg agagagagct tttaaagcat gggcagtagc tcgtctgagc 660 cagacattcc ccaatgctga ctttgcagaa atcaccaaat tggcaacaga cctgaccaaa 720 gtcaacaagg agtgctgcca tggtgacctg ctggaatgcg cagatgacag ggcggaactt 780 gccaagtaca tgtgtgaaaa ccaggcgact atctccagca aactgcagac ttgctgcgat 840 aaaccactgt tgaagaaagc ccactgtctt agtgaggtgg agcatgacac catgcctgct 900 gatctgcctg ccattgctgc tgattttgtt gaggaccagg aagtgtgcaa gaactatgct 960 gaggccaagg atgtcttcct gggcacgttc ttgtatgaat attcaagaag acaccctgat 1020 tactctgtat ccctgttgct gagacttgct aagaaatatg aagccactct ggaaaagtgc 1080
ccaatcctcc cgcatgctac ggcacagtgc ttgctgaatt tcagcctctt 1140
ctaagaactt ggtcaaaacc aactgtgatc tttacgagaa gcttggagaa 1200
aaaatgccat tctagttcgc tacacccaga aagcacctca ggtgtcaacc 1260
tggaggctgc aagaaaccta ggaagagtgg gcaccaagtg ttgtacactt 1320
agagactgcc ttgtgtggaa gactatctgt ctgcaatcct gaaccgtgtg 1380
atgagaagac cccagtgagt gagcatgtta ccaagtgctg tagtggatcc 1440 ggcggccatg cttctctgct ctgacagttg atgaaacata tgtccccaaa 1500
ctgagacctt caccttccac tctgatatct gcacacttcc agagaaggag 1560
agaaacaaac ggctcttgct gagctggtga agcacaagcc caaggctaca 1620
tgaagactgt catggatgac tttgcacagt tcctggatac atgttgcaag 1680
gacgccttag cctaa 1755 <212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 1755
Nombre de la secuencia: Nucleótido de dominio de albúmina murina
Secuencia
<213> Nombre del organismo: Ser humano
<400> Cadena de la secuencia previa:
gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60
gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120 aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180
aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240
cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300
tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360
gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420 gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480 tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540 aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600 gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660 cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720 gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780 gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840 aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900 gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960 gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020 tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080 tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140 gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200 tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260 ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320 cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380 tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440 ttggtgaaca ggcgtccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500 gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560 agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620 aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680 gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740 gctgccttag gcttataa 1758
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 1758
Nombre de la secuencia: nucleótido de dominio de albúmina humana
Solicitante .de. la_ Organización
Calle: Vía S.G. Cottolengo 15
Ciudad: MILÁN
Estado: MI
País: ITALIA
Código postal: 20143
Número de teléfono:
Número de fax:
Dirección de correo electrónico:
<110> Nombre de la Organización: MEDIOLANUM FARMACEUTICI S.p.A.
Proyectp.de. la. Solicitud
<120> Título: UN RECEPTOR QUÍMICO SOLUBLE DE INTERLEUCINA 10 Y SU USO TERAPÉUTICO. <130> Referencia de archivo de la solicitud: P05076PCT
<140> Número actual de la solicitud:
<141> Fecha actual del archivo:
Secuencia
<213> Nombre del organismo: Ser humano
<400> Cadena de la secuencia previa:
MLPCLWLLA ALLSLRLGSD AHGTELPSPP SVWFEAEFFH HILHWTPIPN QSESTCYEVA
60
LLRYGIESWN SISNCSQTLS YDLTAVTLDL YHSNGYRARV RAVDGSRHSN WTVTNTRFSV
120
DEVTLTVGSV NLEIHNGFIL GKIQLPRPKM APANDTYESI FSHFREYEIA IRKVPGNFTF
180
THKKVKHENF SLLTSGEVGE FCVQVKPSVA SRSNKGMWSK EECISLTRQY FTVTNSRV
238
<212> Tipo: PRT
<211> Longitud: 238
Nombre de la secuencia: dominio extracelular de IL10 R alfa humano
Secuencia
<213> Nombre del organismo: Ser humano
<400> Cadena de la secuencia previa:
EPKSCDKTHT CPAAA 15
<212> Tipo: PRT
<211> Longitud: 15
Nombre de la secuencia: BISAGRA humana
Secuencia
<213> Nombre del organismo: Ser humano
<400> Cadena de la secuencia previa:
DAHKSEVAHR FKDLGEENFK ALVLIAFAQY LQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE
60
NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNE CFLQHKDDNP NLPRLVRPEV
120
DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKR YKAAFTECCQ AADKAACLLP
KLDELRDEGK ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTK
240
VHTECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA
300
DLPSLAADFV ESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSWLLLRLA KTYETTLEKC
360
CAAADPHECY AKVFDEFKPL VEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST
420
PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAE DYLSWLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES
480
LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFNAETFTFH ADICTLSEKE RQIKKQTALV ELVKHKPKAT
540
KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASQ AALGL
585
<212> Tipo: PRT
<211> Longitud: 585
Nombre de la secuencia: Dominio de albúmina humana
Secuencia
<213> Nombre del organismo: Ser humano
<400> Cadena de la secuencia previa:
atgctgccgt gcctcgtagt gctgctggcg gcgctcctca gcctccgtct tggctcagac 60
gctcatggga cagagctgcc cagccctccg tctgtgtggt ttgaagcaga atttttccac 120
cacatcctcc actggacacc catcccaaat cagtctgaaa gtacctgcta tgaagtggcg 180
ctcctgaggt atggaataga gtcctggaac tccatctcca actgtagcca gaccctgtcc 240
tatgacctta ccgcagtgac cttggacctg taccacagca atggctaccg ggccagagtg 300
cgggctgtgg acggcagccg gcactccaac tggaccgtca ccaacacccg cttctctgtg 360
gatgaagtga ctctgacagt tggcagtgtg aacctagaga tccacaatgg cttcatcctc 420
gggaagattc agctacccag gcccaagatg gcccccgcga atgacacata tgaaagcatc 480
ttcagtcact tccgagagta tgagattgcc attcgcaagg tgccgggaaa cttcacgttc 540
acacacaaga aagtaaaaca tgaaaacttc agcctcctaa cctctggaga agtgggagag 600
ttctgtgtcc aggtgaaacc atctgtcgct tcccgaagta acaaggggat gtggtctaaa 660
gaggagtgca tctccctcac caggcagtat ttcaccgtga ccaactctag agtt 714
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 714
Nombre de la secuencia: Nucleótido de dominio extracelular de IL10 R alfa humano
Secue.ncLa
<213> Nombre del organismo: Ser humano
<400> Cadena de la secuencia previa:
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccagcgg ccgcg
45
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 45
Nombre de la secuencia: Nucleótido de BISAGRA humana
Secuencia
<213> Nombre del organismo: ratón
<400> Cadena de la secuencia previa:
MLSRLLPFLV TISSLSLEFI AYGTELPSPS YVWFEARFFQ HILHWKPIPN QSESTYYEVA
60
LKQYGNSTWN DIHICRKAQA LSCDLTTFTL DLYHRSYGYR ARVRAVDNSQ YSNWTTTETR
120
FTVDEVILTV DSVTLKAMDG IIYGTIHPPR PTITPAGDEY EQVFKDLRVY KISIRKFSEL
180
KNATKRVKQE TFTLTVPIGV RKFCVKVLPR LESRINKAEW SEEQCLLITT EQYFTVTNLS
240
IKLI
244
<212> Tipo: PRT
<211> Longitud: 244
Nombre de la secuencia: Dominio extracelular de IL10 R alfa de ratón
Secuencia
<213> Nombre del organismo: ratón
<400> Cadena de la secuencia previa:
VPRDCGCKPC ICTGGR
16
<212> Tipo: PRT
<211> Longitud: 16
Nombre de la secuencia: bisagra de ratón
Secuencia
<213> Nombre del organismo: ratón
<400> Cadena de la secuencia previa:
EAHKSEIAHR YNDLGEQHFK GLVLIAFSQY LQKCSYDEHA KLVQEVTDFA KTCVADESAA
60
NCDKSLHTLF GDKLCAIPNL RENYGELADC CTKQEPERNE CFLQHKDDNP SLPPFERPEA
120
EAMCTSFKEN PTTFMGHYLH EVARRHPYFY APELLYYAEQ YNEILTQCCA EADKESCLTP
180
KLDGVKEKAL VSSVRQRMKC SSMQKFGERA FKAWAVARLS QTFPNADFAE ITKLATDLTK
240
VNKECCHGDL LECADDRAEL AKYMCENQAT ISSKLQTCCD KPLLKKAHCL SEVEHDTMPA
300
DLPAIAADFV EDQEVCKNYA EAKDVFLGTF LYEYSRRHPD YSVSLLLRLA KKYEATLEKC
360
CAEANPPACY GTVLAEFQPL VEEPKNLVKT NCDLYEKLGE YGFQNAILVR YTQKAPQVST
420
PTLVEAARNL GRVGTKCCTL PEDQRLPCVE DYLSAILNRV CLLHEKTPVS EHVTKCCSGS
480
LVERRPCFSA LTVDETYVPK EFKAETFTFH SDICTLPEKE KQIKKQTALA ELVKHKPKAT
540
AEQLKTVMDD FAQFLDTCCK AADKDTCFST EGPNLVTRCK DALA
584
<212> Tipo: PRT
<211> Longitud: 584
Nombre de la secuencia: Dominio de albúmina murina
Secuencia
<213> Nombre del organismo: ratón
<400> Cadena de la secuencia previa:
atgttgtcgc gtttgctccc attcctcgtc acgatctcca gcctgagcct agaattcatt 60
gcatacggga cagaactgcc aagcccttcc tatgtgtggt ttgaagccag atttttccag 120
cacatcctcc actggaaacc tatcccaaac cagtctgaga gcacctacta tgaagtggcc 180
ctcaaacagt acggaaactc aacctggaat gacatccata tctgtagaaa ggctcaggca 240
ttgtcctgtg atctcacaac gttcaccctg gatctgtatc accgaagcta tggctaccgg 300
gccagagtcc gggcagtgga caacagtcag tactccaact ggaccaccac tgagactcgc 360
ttcacagtgg atgaagtgat tctgacagtg gatagcgtga ctctgaaagc aatggacggc 420
atcatctatg ggacaatcca tccccccagg cccacgataa cccctgcagg ggatgagtac 480
gaacaagtct tcaaggatct ccgagtttac aagatttcca tccggaagtt ctcagaacta 540
aagaatgcaa ccaagagagt gaaacaggaa accttcaccc tcacggtccc cataggggtg 600
agaaagtttt gtgtcaaggt gctgccccgc ttggaatccc gaattaacaa ggcagagtgg 660
tcggaggagc agtgtttact tatcacgacg gagcagtatt tcactgtgac caacctgagc 720
atcaagctta tt
732
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 732
Nombre de la secuencia: Nucleótido de dominio extracelular de IL10 R alfa de ratón
Secuencia
<213> Nombre del organismo: ratón
<400> Cadena de la secuencia previa:
gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtacag gcggccgc 48
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 48
Nombre de la secuencia: Nucleótido de bisagra de ratón
Secuencia
<213> Nombre del organismo: ratón
<400> Cadena de la secuencia previa:
gaagcacaca agagtgagat cgcccatcgg tataatgatt tgggagaaca acatttcaaa 60
ggcctagtcc tgattgcctt ttcccagtat ctccagaaat gctcatacga tgagcatgcc 120
aaattagtgc aggaagtaac agactttgca aagacgtgtg ttgccgatga gtctgccgcc 180
aactgtgaca aatcccttca cactcttttt ggagataagt tgtgtgccat tccaaacctc 240
cgtgaaaact atggtgaact ggctgactgc tgtacaaaac aagagcccga aagaaacgaa 300
tgtttcctgc aacacaaaga tgacaacccc agcctgccac catttgaaag gccagaggct 360
gaggccatgt gcacctcctt taaggaaaac ccaaccacct ttatgggaca ctatttgcat 420
gaagttgcca gaagacatcc ttatttctat gccccagaac ttctttacta tgctgagcag 480
tacaatgaga ttctgaccca gtgttgtgca gaggctgaca aggaaagctg cctgaccccg 540
aagcttgatg gtgtgaagga gaaagcattg gtctcatctg tccgtcagag aatgaagtgc 600
tccagtatgc agaagtttgg agagagagct tttaaagcat gggcagtagc tcgtctgagc 660
cagacattcc ccaatgctga ctttgcagaa atcaccaaat tggcaacaga cctgaccaaa 720
gtcaacaagg agtgctgcca tggtgacctg ctggaatgcg cagatgacag ggcggaactt 780
gccaagtaca tgtgtgaaaa ccaggcgact atctccagca aactgcagac ttgctgcgat 840
aaaccactgt tgaagaaagc ccactgtctt agtgaggtgg agcatgacac catgcctgct 900
gatctgcctg ccattgctgc tgattttgtt gaggaccagg aagtgtgcaa gaactatgct 960
gaggccaagg atgtcttcct gggcacgttc ttgtatgaat attcaagaag acaccctgat 1020
tactctgtat ccctgttgct gagacttgct aagaaatatg aagccactct ggaaaagtgc 1080
tgcgctgaag ccaatcctcc cgcatgctac ggcacagtgc ttgctgaatt tcagcctctt 1140
gtagaagagc ctaagaactt ggtcaaaacc aactgtgatc tttacgagaa gcttggagaa 1200
tatggattcc aaaatgccat tctagttcgc tacacccaga aagcacctca ggtgtcaacc 1260
ccaactctcg tggaggctgc aagaaaccta ggaagagtgg gcaccaagtg ttgtacactt 1320
cctgaagatc agagactgcc ttgtgtggaa gactatctgt ctgcaatcct gaaccgtgtg 1380
tgtctgctgc atgagaagac cccagtgagt gagcatgtta ccaagtgctg tagtggatcc 1440
ctggtggaaa ggcggccatg cttctctgct ctgacagttg atgaaacata tgtccccaaa 1500
gagtttaaag ctgagacctt caccttccac tctgatatct gcacacttcc agagaaggag 1560
aagcagatta agaaacaaac ggctcttgct gagctggtga agcacaagcc caaggctaca 1620
gcggagcaac tgaagactgt catggatgac tttgcacagt tcctggatac atgttgcaag 1680
gctgctgaca aggacacctg cttctcgact gagggtccaa accttgtcac tagatgcaaa 1740
gacgccttag cctaa
1755
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 1755
Nombre de la secuencia: Nucleótido de dominio de albúmina murina
Secuencia
<213> Nombre del organismo: Ser humano
<400> Cadena de la secuencia previa:
gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60
gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120
aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180
aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240
cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300
tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360
gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420
gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480
tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540
aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600
gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660
cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720
gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780
gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840
aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900
gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960
gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020
tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080
tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140
gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200
tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260
ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320
cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380
tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440
ttggtgaaca ggcgtccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500
gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560
agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620
aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680
gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740
gctgccttag gcttataa
1758
<212> Tipo: ADN
<211> Longitud: 1758
Nombre de la secuencia: nucleótido de dominio de albúmina humana
Claims (18)
1. Una proteína de fusión quimérica que comprende albúmina y el dominio extracelular de la unidad alfa del receptor de interleucina 10 (IL10).
2. La proteína de fusión quimérica según la reivindicación 1, en donde dicha albúmina es una seroalbúmina de mamífero.
3. La proteína de fusión quimérica según la reivindicación 2, en donde dicho suero de mamífero es humano o murino.
4. La proteína de fusión quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho dominio extracelular de la unidad alfa del receptor de IL10 proviene de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de mamífero.
5. La proteína de fusión quimérica según la reivindicación 4, en donde dichas CMSP son humanas o murinas.
6. La proteína de fusión quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la albúmina se une a dicho dominio extracelular de la unidad alfa del receptor de IL10 mediante un espaciador.
7. La proteína quimérica según la reivindicación 6, en donde dicho espaciador es la región bisagra de una inmunoglobulina gamma G (IgG).
8. La proteína de fusión quimérica según la reivindicación 7, en donde dicha IgG es IgG1.
9. La proteína de fusión quimérica según la reivindicación 7 u 8, en donde dicha IgG proviene de CMSP de mamífero.
10. La proteína de fusión quimérica según la reivindicación 9, en donde dichas CMSP son humanas o murinas.
11. Una construcción polinucleotídica que codifica la proteína de fusión quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
12. La construcción polinucleotídica según la reivindicación 11, que es un gen.
13. La construcción polinucleotídica según la reivindicación 12, en donde dicho gen está comprendido en un vector.
14. La construcción polinucleotídica según la reivindicación 13, en donde dicho vector es un plásmido.
15. La proteína de fusión quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su uso en el tratamiento de patologías correlacionadas con IL10.
16. La proteína quimérica para su uso según la reivindicación 15, en donde dichas patologías son cáncer y lupus eritematoso sistémico (LES).
17. La construcción polinucleotídica según una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, para su uso en el tratamiento de patologías correlacionadas con IL10.
18. La construcción polinucleotídica para su uso según la reivindicación 17, en donde dichas patologías son cáncer y LES.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITUB20150391 | 2015-04-29 | ||
| PCT/IB2016/052359 WO2016174575A1 (en) | 2015-04-29 | 2016-04-26 | A soluble chimeric interleukin-10 receptor and therapeutic use thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2744342T3 true ES2744342T3 (es) | 2020-02-24 |
Family
ID=53765409
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16728097T Active ES2744342T3 (es) | 2015-04-29 | 2016-04-26 | Un receptor quimérico soluble de interleucina 10 y su uso terapéutico |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20180086809A1 (es) |
| EP (1) | EP3288965B1 (es) |
| JP (1) | JP2018518945A (es) |
| KR (1) | KR20170138569A (es) |
| CN (1) | CN107531771A (es) |
| CA (1) | CA2979973A1 (es) |
| CY (1) | CY1122061T1 (es) |
| DK (1) | DK3288965T3 (es) |
| ES (1) | ES2744342T3 (es) |
| HK (1) | HK1245814B (es) |
| HU (1) | HUE046343T2 (es) |
| PL (1) | PL3288965T3 (es) |
| PT (1) | PT3288965T (es) |
| SI (1) | SI3288965T1 (es) |
| SM (1) | SMT201900530T1 (es) |
| WO (1) | WO2016174575A1 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7421338B2 (ja) | 2016-09-27 | 2024-01-24 | エピセントアールエックス，インコーポレイテッド | 免疫調節融合タンパク質 |
| AU2018338612A1 (en) * | 2017-09-27 | 2020-05-07 | Epicentrx, Inc. | Immunomodulatory fusion proteins |
| WO2020176478A1 (en) | 2019-02-25 | 2020-09-03 | The University Of Chicago | Methods and compositions for treating inflammatory and autoimmune conditions with ecm-affinity peptides linked to anti-inflammatory agents |
| AU2021236879A1 (en) * | 2020-03-16 | 2022-11-10 | Vrije Universiteit Brussel | A mixture of mRNA to enhance the potency of dendritic cells |
| CN116162149A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-05-26 | 苏州绶草生物科技有限公司 | 一种提高植物中合成重组人血清白蛋白基因表达量的方法 |
| CN116125074A (zh) * | 2022-12-13 | 2023-05-16 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种IL-10-Fc融合蛋白与其受体结合活性的检测方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5789192A (en) * | 1992-12-10 | 1998-08-04 | Schering Corporation | Mammalian receptors for interleukin-10 (IL-10) |
| US6165476A (en) * | 1997-07-10 | 2000-12-26 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker |
| JP2003530838A (ja) * | 2000-04-12 | 2003-10-21 | ヒューマン ゲノム サイエンシズ インコーポレイテッド | アルブミン融合タンパク質 |
| US20090111146A1 (en) * | 2003-09-02 | 2009-04-30 | National Institute Of Advanced Industrial Science | Antibody Drug |
| JP2007531513A (ja) * | 2003-11-13 | 2007-11-08 | ハンミ ファーム．インダストリー カンパニー リミテッド | 薬物のキャリアとして有用なＩｇＧＦｃ断片およびその製造方法 |
| CA2687377C (en) * | 2007-05-30 | 2013-05-14 | Genexine Co., Ltd. | Immunoglobulin fusion proteins |
| BRPI0920749A8 (pt) * | 2008-10-02 | 2017-12-12 | Emergent Product Dev Seattle | Proteínas de ligação de antagonista multialvo cd86 |
| US9156887B2 (en) * | 2012-05-25 | 2015-10-13 | Janssen Biotech, Inc. | Non-natural consensus albumin binding domains |
-
2016
- 2016-04-26 ES ES16728097T patent/ES2744342T3/es active Active
- 2016-04-26 KR KR1020177034625A patent/KR20170138569A/ko not_active Withdrawn
- 2016-04-26 SI SI201630348T patent/SI3288965T1/sl unknown
- 2016-04-26 HU HUE16728097A patent/HUE046343T2/hu unknown
- 2016-04-26 SM SM20190530T patent/SMT201900530T1/it unknown
- 2016-04-26 CN CN201680024854.0A patent/CN107531771A/zh active Pending
- 2016-04-26 PL PL16728097T patent/PL3288965T3/pl unknown
- 2016-04-26 WO PCT/IB2016/052359 patent/WO2016174575A1/en not_active Ceased
- 2016-04-26 EP EP16728097.3A patent/EP3288965B1/en active Active
- 2016-04-26 HK HK18105461.9A patent/HK1245814B/en not_active IP Right Cessation
- 2016-04-26 DK DK16728097.3T patent/DK3288965T3/da active
- 2016-04-26 CA CA2979973A patent/CA2979973A1/en not_active Abandoned
- 2016-04-26 PT PT167280973T patent/PT3288965T/pt unknown
- 2016-04-26 US US15/562,557 patent/US20180086809A1/en not_active Abandoned
- 2016-04-26 JP JP2017556722A patent/JP2018518945A/ja active Pending
-
2019
- 2019-09-23 CY CY20191100997T patent/CY1122061T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUE046343T2 (hu) | 2020-02-28 |
| DK3288965T3 (da) | 2019-09-23 |
| US20180086809A1 (en) | 2018-03-29 |
| CN107531771A (zh) | 2018-01-02 |
| HK1245814B (en) | 2020-06-19 |
| WO2016174575A1 (en) | 2016-11-03 |
| CA2979973A1 (en) | 2016-11-03 |
| CY1122061T1 (el) | 2020-11-25 |
| KR20170138569A (ko) | 2017-12-15 |
| SMT201900530T1 (it) | 2019-11-13 |
| EP3288965A1 (en) | 2018-03-07 |
| EP3288965B1 (en) | 2019-06-26 |
| PT3288965T (pt) | 2019-10-15 |
| PL3288965T3 (pl) | 2019-11-29 |
| SI3288965T1 (sl) | 2019-10-30 |
| JP2018518945A (ja) | 2018-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2744342T3 (es) | Un receptor quimérico soluble de interleucina 10 y su uso terapéutico | |
| ES2987087T3 (es) | Métodos y composiciones para terapia celular adoptiva | |
| ES2906795T3 (es) | Receptores de células T anti-KK-LC-1 | |
| JP6979423B2 (ja) | キメラサイトカイン受容体 | |
| AU2016206329B2 (en) | Antigen-specific T cell receptors and T cell epitopes | |
| ES2965011T3 (es) | Péptidos y combinación de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer de pulmón amicrocítico y otros tipos de cáncer | |
| JP5230579B2 (ja) | 癌抑制遺伝子ｗｔ１の産物に基づく癌抗原 | |
| ES2804538T3 (es) | Moléculas de unión de alta avidez que reconocen MAGE-A1 | |
| ES2774931T3 (es) | Receptores de linfocitos t que reconocen MAGE-A3 restringida al MHC de clase II | |
| CN114072157A (zh) | 工程化的嵌合融合蛋白组合物及其使用方法 | |
| CN107532174A (zh) | 转座酶多肽及其用途 | |
| CN108884140A (zh) | 修饰的嵌合受体及相关组合物和方法 | |
| CN111263808B (zh) | 一种靶向HPK1的gRNA和一种编辑HPK1基因的方法 | |
| ES2972783T3 (es) | Tratamiento de las neoplasias malignas hematológicas | |
| HK1245814A1 (en) | A soluble chimeric interleukin-10 receptor and therapeutic use thereof | |
| KR20250027283A (ko) | nr4a3을 표적하는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 용도 | |
| JP7663984B2 (ja) | 免疫チェックポイント阻害抗体 | |
| US12479903B2 (en) | CD5 specific T cell receptor cell or gene therapy | |
| WO2018176034A1 (en) | Modulators of notch signaling and methods of use thereof | |
| CA3076095C (en) | A grna targeting hpk1 and a method for editing hpk1 gene | |
| WO2023219510A1 (en) | Treatment of haematological malignancies | |
| CN118043066A (zh) | 构建体和免疫刺激性化合物的共表达 | |
| KR20220095228A (ko) | 암의 t 세포 치료를 위한 세포독성 효과기 기억 t 세포를 생산하는 방법 |