ES2729402T3 - Micropéptidos y su utilización para la modulación de la expresión de genes - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN, que comprende: - a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 12 a 303 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después - b) una etapa de comparación entre: - la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa dicho microARN, en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y - la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa dicho microARN, en ausencia de dicho péptido, en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
Description
DESCRIPCIÓN
Micropéptidos y su utilización para la modulación de la expresión de genes
La presente invención se refiere a micropéptidos (péptidos codificados por microARN o "miPEP") y su utilización para la modulación de la expresión de genes.
Los microARN (miR) son pequeños ARN no codificantes, de aproximadamente 21 nucleótidos después de la maduración que controlan la expresión de genes diana a nivel postranscripcional, degradando el ARNm diana o inhibiendo su traducción. Los miR se encuentran en las plantas y los animales.
Los genes diana están seguidos de genes clave en los procesos del desarrollo. Codifican por ejemplo los factores de transcripción o las proteínas del proteasoma.
La regulación de la expresión de los miR es muy poco conocida, pero se dice principalmente que puede intervenir, del mismo modo que en la mayoría de los genes codificantes, una ARN polimerasa II: esta enzima produce una transcripción primaria llamada "pri-miR", que a continuación madura por un complejo proteico que contiene principalmente enzimas tipo Dicer. Esta maduración da lugar en primer lugar a la formación de un precursor de miR llamado "pre-miR", que tiene una estructura secundaria en forma de tallo-lazo que contiene el miR y su secuencia miR* complementaria. Después de que el precursor madura, da lugar a la formación de un ARN de doble cadena más corto que contiene el miR y el miR*. Entonces el complejo RISC se hace cargo del miR que escinde el ARN del gen diana o bien inhibe su traducción.
Por otra parte, se ha demostrado que la presencia de intrones en la transcripción primaria del microARN aumenta la expresión del microARN maduro (Schwab y col., EMBO Rep., 14(7):615-21, 2013). Sin embargo, debido a las dificultades experimentales, las transcripciones primarias de los microARN, o pri-miR están poco estudiadas.
Aproximadamente un 50 % de los genes de eucariotas poseen, en el seno de su región UTR 5' (Región no Traducida 5') corriente arriba de la secuencia codificante, pequeñas fases de lectura abierta. Estas pequeñas fases de lectura abierta (o "uORF" por ORF corriente arriba) pueden tener un papel regulador de la traducción, principalmente en cis, modulando la fijación y la velocidad de los ribosomas sobre el ARNm, pero igualmente en trans según un mecanismo aún desconocido, por medio de péptidos codificados por dichas uORf (Combier y col., Gene Dev, 22:1549-1559, 2008). Por definición, las uORF están presentes corriente arriba de los genes codificantes.
Recientemente, se han descubierto igualmente pequeñas ORF en los ARN largos intergénicos no codificantes (lincARN) de las que su supuesta función, si es que existe, no se conoce (Ingolia y col., Cell, 147(4):789-802, 2011; Guttman & Rinn, Nature, 482(7385):339-46, 2012).
Sin embargo, no se ha expuesto ningún ejemplo con respecto a la existencia de ORF que codifiquen péptidos en el seno de microARN no codificantes. Hasta el presente, los microARN, y por extensión su transcripción primaria, siempre se han considerado, por su modo de acción particular, como ARN reguladores no codificantes que no producen ningún péptido.
Uno de los aspectos de la invención es proporcionar péptidos capaces de modular la expresión de los microARN.
Otro aspecto de la invención es proporcionar un medio que permita modular la expresión de uno o varios genes diana de un microARN.
La presente invención presenta la ventaja de permitir un control más fácil y eficaz de la expresión de genes diana por los microARN, con ayuda de un medio distinto del microARN.
La invención se describe por las reivindicaciones adjuntas.
La invención también se refiere aquí a un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN,
que comprende:
- a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 12 a 303 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
- b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa dicho microARN, en presencia de un péptido codificado por una secuencia nucleotídica idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• • la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa dicho microARN,
en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la presencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
La invención también se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN, que comprende:
- a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 15 a 303 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
- b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa dicho microARN, en presencia de un péptido codificado por una secuencia nucleotídica idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa dicho microARN,
en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la presencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
La solicitud también se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN,
que comprende:
a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 15 a 303 nucleótidos o de 12 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después,
b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa dicho microARN, en presencia de un péptido codificado pro una secuencia nucleotídica idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa dicho microARN,
en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
La solicitud también se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN,
que comprende:
a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 12 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa dicho microARN, en presencia de un péptido codificado por una secuencia nucleotídica idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa dicho microARN,
en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
En una primera etapa, el procedimiento de detección e identificación de un micropéptido consiste por tanto en la detección de la existencia en la transcripción primaria de un microARN de una fase de lectura abierta que codifica potencialmente un péptido.
La segunda etapa permite, por su parte, caracterizar dicho péptido, es decir, determinar si dicho péptido corresponde realmente a un péptido producido por la célula, investigando un efecto de dicho péptido sobre la acumulación de dicho microARN.
Para poner en evidencia un efecto del péptido sobre la acumulación del microARN, se introduce una cantidad importante de péptido en una primera célula que expresa dicho microARN. La acumulación del microARN en esta primera célula se mide entonces y se compara con la acumulación del microARN en una segunda célula idéntica a la primera pero que no contiene dicho péptido.
La observación de una variación de las cantidades de microARN entre las células en presencia y ausencia del péptido indica también (i) que existe un péptido codificado por la transcripción primaria de dicho microARN, (ii) que la secuencia de este péptido está codificada por la fase de lectura abierta identificada en la transcripción primaria de dicho microARN, y (iii) que dicho péptido actúa sobre la acumulación de dicho microARN.
La invención se basa en la doble observación inesperada hecha por los inventores de que, por una parte, existen fases de lectura abierta que puedan codificar los micropéptidos presentes en las transcripciones primarias de microARN, y por otra parte que dichos micropéptidos son capaces de modular la acumulación de dichos microARN.
En la invención, las expresiones "microARN", "microARN no codificante" y "miR" son equivalentes y pueden utilizarse de manera intercambiable. Definen pequeñas moléculas de ARN de aproximadamente 21 nucleótidos, que no se traducen y no dan lugar a un péptido o una proteína.
Sin embargo, bajo esta forma madura, los microARN aseguran una función de regulación de ciertos genes mediante mecanismos postranscripcionales, como por ejemplo, por la intervención del complejo RISC.
La transcripción primaria del microARN o "pri-miR" correspondiente con la molécula de ARN directamente obtenida a partir de la transcripción de la molécula de ADN. Generalmente, esta transcripción primaria se somete a una o más modificaciones postranscripcionales, que dan lugar, por ejemplo, a una estructura particular de ARN o una escisión de ciertas partes del ARN por fenómenos de corte y empalme, y que dan lugar a la forma precursora del microARN o "pre-miR", y después a la forma madura del microARN o "miR".
Los términos "micropéptidos" y "miPEP' (PÉPtidos codificados por microARN) son equivalentes y se pueden utilizar de manera intercambiable. Definen un péptido que está codificado por una fase de lectura abierta presente en la transcripción primaria de un microARN, y que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN. Los micropéptidos de acuerdo con la presente invención no se deben considerar como que son necesariamente péptidos de tamaño pequeño, de manera que "micro" no se corresponde con el tamaño del péptido.
Según la invención, un miPEP puede considerarse un modulador de la transcripción, y principalmente un activador transcripcional. Dicho modulador de la transcripción puede actuar a nivel de la transcripción para modular la acumulación de pri-miR, de pre-miR y de miR. Teniendo en cuenta la degeneración del código genético, un mismo micropéptido puede estar codificado por varias secuencias de nucleótidos. Dichas secuencias de nucleótidos, diferentes entre ellas al menos en un nucleótido pero que codifican un mismo péptido, se llaman "secuencias degeneradas".
Las expresiones "fase de lectura abierta" u "ORF ' (fase de lectura abierta) son equivalentes y se pueden utilizar de manera intercambiable. Se corresponden con una secuencia de nucleótidos en una molécula de ADN o ARN que pueden potencialmente codificar un péptido o una proteína: dicha fase de lectura abierta comienza con un codón de inicio (el codón de inicio codifica generalmente una metionina)(, seguido por una serie de codones (cada codón codifica un aminoácido) y se termina con un codón de parada (el codón de parada no se traduce).
En la invención, las ORF pueden ser denominadas de manera específica "miORF ' cuando están presentes en las transcripciones primarias de microARN.
Las miORF como se definen en la invención particular pueden tener un tamaño de 12 a 303 nucleótidos y codificar péptidos de 3 a 100 aminoácidos.
En particular, las miORF como se definen en la invención pueden tener un tamaño de 15 a 303 nucleótidos. Como un aminoácido está codificado por un codón de 3 nucleótidos, las miORF de 15 a 303 nucleótidos codifican miPEP de 4 a 100 aminoácidos.
En particular, las miORF tienen un tamaño de:
15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 47, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300 o 303 nucleótidos, y codifican respectivamente miPEP que tienen un tamaño de:
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,
99 o 100 aminoácidos.
En la invención, por "acumulación" se entiende la producción de una molécula tal como un microARN o un micropéptido, en la célula.
Así, la "modulación" de la acumulación de una molécula en una célula se corresponde con una modificación de la cantidad de dicha molécula presente en la célula.
Por otra parte, el efecto de un miPEP puede observarse mediante la modulación de la acumulación del miR, pero igualmente a través de la modulación de la acumulación del pri-miR o del pre-miR.
En una realización,
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que la modulación de la acumulación de dicho microARN es una disminución o un aumento de la acumulación de dicho microARN en particular un aumento.
Una "disminución de la acumulación" se corresponde a una bajada de la cantidad de dicha molécula en la célula.
Por el contrario, un "aumento de la acumulación" se corresponde a una subida de la cantidad de dicha molécula en la célula.
En una realización ventajosa, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que la modulación de la acumulación de dicho microARN es un aumento de la acumulación de dicho microARN. En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que la presencia de dicho péptido en la célula es el resultado de:
- la introducción en la célula de un ácido nucleico que codifica dicho péptido, o
- la introducción en la célula de dicho péptido.
Para caracterizar un miPEP, es necesario disponer de un modelo celular que exprese un microARN y en el que dicho péptido a ensayar esté presente. Por lo tanto, es posible introducir un péptido en la célula, sea poniendo la célula en contacto con dicho péptido, sea introduciendo en la célula un ácido nucleico que codifique dicho péptido, de manera que el ácido nucleico se traduzca entonces en un péptido en el interior de la célula.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que dicha fase de lectura abierta de la etapa a) está contenida en la parte 5' o 3' de dicha transcripción primaria de microARN, preferentemente en la parte 5'.
Las partes 5' o 3' de la transcripción primaria del microARN se corresponden con las partes terminales de la molécula del ARN que son escindidas en el curso de la maduración del microARN.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que dicho microARN está presente en una célula vegetal nativa.
En la invención, una célula vegetal nativa se corresponde con una célula vegetal que no ha sido modificada genéticamente por el hombre.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que dicho microARN está presente en una célula animal nativa, y principalmente una célula humana nativa o una célula de drosófila nativa.
En la invención, una célula animal nativa se corresponde con una célula animal, y principalmente humana, que no ha sido modificada genéticamente por el hombre.
En un modo de realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que dicha célula eucariota determinada y dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b, son células vegetales de una planta crucífera tal como Arabidopsis thaliana, de una planta leguminosa tal como Glycine max (soja), Medicago truncatula y Medicago sativa (alfalfa) o de una planta solanácea tal como Nicotiana benthamiana (tabaco), Solanum tuberosum (patata), Solanum lycopersicum (tomate) o Solanum melongena (berenjena).
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que dicha célula eucariota determinada y dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b, son células vegetales, preferentemente células de Medicago truncatula, de Nicotiana benthamiana o de Arabidopsis thaliana.
En un modo de realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que dicha célula eucariota determinada y dicha célula eucariota del mismo tipo
que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b, son células animales, preferentemente células humanas o de drosófila. En el procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, después de haber identificado una ORF que pueda codificar un péptido en la transcripción primaria de un microARN, es necesario proporcionar un modelo celular que posea dicho microARN y dicho péptido para poder demostrar un eventual efecto del péptido sobre dicho microARN.
Por lo tanto, se pueden prever dos opciones:
- el modelo celular en el que se ha identificado la miORF y en el que se ha puesto en evidencia el efecto del péptido sobre el miR son idénticos, o
- el modelo celular en el que se ha identificado la miORF y en el que se ha puesto en evidencia el efecto del péptido sobre el miR son diferentes.
En la primera opción, el modelo celular que se utiliza para observar un efecto del péptido es el mismo que en el que se aísla la transcripción primaria de dicho microARN. En este modelo celular, las células eucariotas determinadas contienen naturalmente dicho microARN y solo se debe introducir el péptido a ensayar en estas células. En este contexto, dicho microARN se califica como de "origen endógeno" ya que existe naturalmente en las células. No obstante, en una célula, pueden agregarse otras copias de un microARN de origen endógeno, como, por ejemplo, introduciendo en la célula un vector que codifique dicho microARN de origen endógeno.
En la segunda opción, el modelo celular que se utiliza para observar un efecto del péptido es diferente del que se aísla la transcripción primaria de dicho microARN. En este modelo celular, las células eucariotas determinadas no contienen ni el microARN, ni el péptido a ensayar. Estos dos elementos deberán introducirse entonces en esas células. En este contexto, dicho microARN se califica como de "origen exógeno" ya que no existe naturalmente en las células.
En una realización, En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que dicho microARN es de origen endógeno en dicha célula eucariota y en dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b).
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente en el que dicho microARN es de origen exógeno en dicha célula eucariota y en dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b), conteniendo dichas células un vector que permite la expresión de dicho microARN.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que la acumulación de dicho microARN se determina llevando a cabo una RT-PCR cuantitativa o una transferencia de Northern.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que la acumulación de dicho microARN se determina llevando a cabo un chip de ADN o ARN.
La acumulación de dicho microARN puede determinarse con la ayuda de técnicas de biología molecular que permiten la dosificación de moléculas de ácido nucleico específicas.
La solicitud describe también un procedimiento de detección e identificación de un microARN en el que la secuencia de la transcripción primaria contiene una secuencia de nucleótidos que codifican un miPEP,
que comprende:
- a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 15 a 303 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
- b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa dicho microARN, en presencia de un péptido codificado por una secuencia nucleotídica idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota que expresa dicho microARN,
en ausencia de dicho péptido,
en la que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un microARN en el que la transcripción primaria contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un micropéptido.
En particular, la solicitud describe también un procedimiento de detección e identificación de un microARN en el que la secuencia de la transcripción primaria contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un miPEP,
que comprende:
- a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 15 a 303 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
- b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa la transcripción primaria de dicho microARN,
en presencia de un péptido codificado pro una secuencia nucleotídica idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa la transcripción primaria de dicho microARN, en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un microARN en el que la transcripción primaria contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un micropéptido.
En una realización, la solicitud se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un microARN tal como se define posteriormente, en el que la modulación de la acumulación de dicho microARN es una disminución o un aumento de la acumulación de dicho microARN en particular un aumento. en particular un aumento.
En una realización, En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN tal como se define posteriormente, en el que la presencia de dicho péptido en la célula es el resultado de:
- la introducción en la célula de un ácido nucleico que codifica dicho péptido, o
- la introducción en la célula de dicho péptido.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN tal como se define posteriormente, en el que dicha fase de lectura abierta de la etapa a) está contenida en la parte 5' o 3' de dicha transcripción primaria de microARN, preferentemente en la parte 5'.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un microARN tal como se define posteriormente, en el que dicho microARN está presente en una célula vegetal nativa.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN tal como se define posteriormente, en el que dicho microARN está presente en una célula animal, y principalmente humana, nativa.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN tal como se define posteriormente, en el que dicha célula eucariota determinada y dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b), son células vegetales, preferentemente células de Medicago truncatula.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN tal como se define posteriormente, en el que dicha célula eucariota determinada y dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b), son células animales, preferentemente células de drosófila.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP tal como se define posteriormente, en el que dicho microARN es de origen endógeno en dicha célula eucariota y en dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b).
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN tal como se define posteriormente en el que dicho microARN es de origen exógeno en dicha célula eucariota y en dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b), conteniendo dichas células un vector que permite la expresión de dicho microARN.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN tal como se define posteriormente, en el que la acumulación de dicho microARN se determina llevando a cabo una RT-PCR cuantitativa o una transferencia de Northern.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN tal como se define posteriormente, en el que la acumulación de dicho microARN se determina llevando a cabo un chip de ADN o ARN.
En otro aspecto, la descripción se refiere a un miPEP tal como el que se obtiene llevando a cabo el procedimiento que se define posteriormente.
De manera más particular, la descripción se refiere a un miPEP codificado por una secuencia de nucleótidos tal como el que se obtiene llevando a cabo el procedimiento tal como se define posteriormente. En otras palabras, la invención
se refiere a un miPEP codificado por una secuencia de nucleótidos detectada e identificada llevando a cabo el procedimiento que se define posteriormente.
Otro aspecto se refiere igualmente a un miPEP de 3 a 100 aminoácidos, en particular de 4 a 100 aminoácidos, principalmente de 4 a 60 aminoácidos, preferentemente de 4 a 40 aminoácidos, codificados por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una células eucariota.
Otro aspecto se refiere igualmente a un miPEP de 4 a 100 aminoácidos, o de 3 aminoácidos, codificados por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una células eucariota.
Otro aspecto se refiere igualmente a un miPEP de 3 aminoácidos, codificados por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una células eucariota.
En particular, el miPEP como se define está codificado por una miORF de 15 a 303 nucleótidos y un tamaño de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos, en particular de 5, 8, 10, 18, 19, 23, 37, 50 o 59 aminoácidos.
En particular, el miPEP tiene un tamaño que tiene de 4 a 10 aminoácidos, 4 a 20 aminoácidos, 4 a 30 aminoácidos, 4 a 40 aminoácidos, 4 a 50 aminoácidos, 4 a 60 aminoácidos, 4 a 70 aminoácidos, 4 a 80 aminoácidos, 4 a 90 aminoácidos, o 4 a 100 aminoácidos.
Por otra parte, conviene señalar que se pueden identificar varias miORF en la transcripción primaria de un microARN, indicando que una transcripción primaria de microARN puede potencialmente codificar varios miPEP.
Conviene igualmente señalar que el efecto de un miPEP es generalmente específico de un solo microARN, a saber, del que resulta de la transcripción primaria que codifica dicho miPEP.
La modulación del microARN por dicho miPEP puede ponerse en evidencia después de la observación de una variación de las cantidades de microARN entre las células en presencia y ausencia del miPEP.
En una realización, la descripción se refiere a un miPEP tal como se define posteriormente, estando dicha secuencia de nucleótidos contenida en la parte 5' o 3' de dicha transcripción primaria de un microARN, preferentemente en la parte 5'.
En una realización, la descripción se refiere a un miPEP tal como se define posteriormente, correspondiendo dicha secuencia de nucleótidos a la primera fase de lectura abierta presente en dicha transcripción primaria de un microARN.
En una realización, la descripción se refiere a un miPEP tal como se define posteriormente, teniendo dicho miPEP un punto isoeléctrico básico, preferentemente superior a 8.
En una realización, la descripción se refiere a un miPEP tal como se define posteriormente, teniendo dicho miPEP un punto isoeléctrico ácido.
En una realización, la invención se refiere a un miPEP tal como se define posteriormente, siendo escogido dicho miPEP de entre el grupo de péptidos que consiste en la SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, y SEQ ID NO: 355 (Tabla 1).
En una realización, la invención se refiere a un miPEP tal como se define posteriormente, siendo dicho miPEP escogido de entre el grupo de péptidos que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 355,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En una realización, la invención se refiere a un miPEP tal como se define posteriormente, que consiste en la secuencia de aminoácidos MVT.
En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un miPEP tal como se define posteriormente.
En una realización, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico tal como se define posteriormente, siendo escogida dicha molécula de entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en la SEQ ID NO: 105 a SEQ ID NO 208, SEQ ID NO: 387 a SEQ ID NO: 399 y SEQ ID NO: 356 (Tabla 2).
En una realización, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico tal como se define posteriormente, siendo escogida dicha molécula de entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en:
- SEQ ID NO: 105 a SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 356,
- SEQ ID NO: 387 a SEQ ID NO: 399, o
- SEQ ID NO: 425.
En una realización particular, la invención se refiere al MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 163) contenida en la transcripción primaria del miR171b (SEQ ID NO: 319), siendo capaz dicho MtmiPEP171b1 de modular la acumulación de dicho miR171b en una célula eucariota.
En una realización particular, la invención se refiere al AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO: 24) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 128) contenida en la transcripción primaria del miR164a (SEQ ID NO: 297), siendo capaz dicho AtmiPEP164a1 de modular la acumulación de dicho miR164a en una célula eucariota.
En una realización particular, la invención se refiere al AtmiPEP165a (SEQ ID NO: 43) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 147) contenida en la transcripción primaria del miR165a (SEQ ID NO: 305), siendo capaz dicho miPEP165a de modular la acumulación de dicho miR165a en una célula eucariota.
En una realización particular, la invención se refiere al AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 180) contenida en la transcripción primaria del miR319a (SEQ ID NO: 331), siendo capaz dicho AtmiPEP319a1 de modular la acumulación de dicho miR319a en una célula eucariota.
En una realización particular, la invención se refiere al AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO: 77) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 181) contenida en la transcripción primaria del miR319a (SEQ ID NO: 331), siendo capaz dicho AtmiPEP319a2 de modular la acumulación de dicho miR319a en una célula eucariota.
En una realización particular, la invención se refiere al AtmiPEP160b1 (SEQ ID NO: 14) codificado por la secuencia de nucleótidos (Se Q ID NO: 118) contenida en la transcripción primaria del miR160b (SEQ ID NO: 291), siendo capaz dicho AtmiPEP160b1 de modular la acumulación de dicho miR160b en una célula eucariota.
En una realización particular, la invención se refiere al MtmiPEP169d (SEQ ID NO: 424) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 425) contenida en la transcripción primaria del miR169d (SEQ ID NO: 427), siendo capaz dicho MtmiPEP169d de modular la acumulación de dicho miR169d en una célula eucariota.
En una realización particular, la invención se refiere al MtmiPEP171e (SEQ ID NO: 63) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 167) contenida en la transcripción primaria del miR171e (SEQ ID NO: 322), siendo capaz dicho MtmiPEP171e de modular la acumulación de dicho miR171e en una célula eucariota.
En una realización particular, la invención se refiere al DmmiPEPla (SEQ ID NO: 102) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 206) contenida en la transcripción primaria del miR1 (SEQ ID NO: 353), siendo capaz dicho dmmiPEP1a de modular la acumulación de dicho miR1 en una célula eucariota.
En una realización particular, la invención se refiere al DmmiPEP1b (SEQ ID NO: 103) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 207) contenida en la transcripción primaria del miR1 (SEQ ID NO: 353), siendo capaz dicho dmmiPEP1b de modular la acumulación de dicho miR1 en una célula eucariota.
En una realización particular, la invención se refiere al dmmiPEP8 (SEQ ID NO: 104) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 208) contenida en la transcripción primaria del miR8 (SEQ ID NO: 354), siendo capaz dicho dmmiPEP8 de modular la acumulación de dicho miR8 en una célula eucariota.
En una realización particular, la invención se refiere al HsmiPEP155 (SEQ ID NO: 355) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 356) contenida en la transcripción primaria del miR155 (SEQ ID NO: 358), siendo capaz dicho HsmiPEP155 de modular la acumulación de dicho miR155 en una célula eucariota.
En otro aspecto, la descripción se refiere a un péptido aislado, o un péptido aislado y purificado, o un péptido sintético o un péptido recombinante, que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP, estando dicho miPEP principalmente presente de manera natural en una planta, o en un animal, tal como un ser humano.
En otro aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende al menos una molécula de ácido nucleico tal como se define posteriormente.
En otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
para modular la expresión de un gen en una célula eucariota vegetal determinada, siendo capaz dicha célula eucariota
vegetal determinada de expresar un microARN, en el que la transcripción primaria contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica dicho al menos un miPEP y en el que la acumulación es modulada por dicho al menos un miPEP, siendo regulada la expresión de dicho gen por dicho microARN, escogiéndose dicho miPEP de entre el grupo de péptidos que consiste en:
SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 76, escogiéndose dicho ácido nucleico de entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en:
SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 180,
escogiéndose dicho microARN de entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en:
SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 331.
la descripción se refiere igualmente a la utilización de al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
para modular la expresión de al menos un gen en una célula eucariota determinada, siendo capaz dicha célula eucariota determinada de expresar un microARN, en el que la transcripción primaria contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica dicho al menos un miPEP y en el que la acumulación está modulada por dicho al menos un miPEP, estando regulada la expresión de dicho al menos un gen por dicho microARN.
En otro aspecto, la descripción se refiere igualmente a la utilización de al menos:
- un miPEP de 4 a 100 aminoácidos, preferentemente de 4 a 40 aminoácidos, codificados por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
para modular la expresión de al menos un gen en una célula eucariota determinada, siendo capaz dicha célula eucariota determinada de expresar un microARN, en el que la transcripción primaria contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica dicho al menos un miPEP y en el que la acumulación está modulada por dicho al menos un miPEP, estando regulada la expresión de dicho al menos un gen por dicho microARN.
En otro aspecto, la descripción se refiere igualmente a la utilización de al menos:
- un miPEP de 4 a 100 aminoácidos, o de 3 aminoácidos, codificados por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
para modular la expresión de al menos un gen en una célula eucariota determinada, siendo capaz dicha célula eucariota determinada de expresar un microARN, en el que la transcripción primaria contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica dicho al menos un miPEP y en el que la acumulación está modulada por dicho al menos un miPEP, estando regulada la expresión de dicho al menos un gen por dicho microARN.
En otro aspecto, la descripción se refiere igualmente a la utilización de al menos:
- un miPEP de 3 aminoácidos, codificados por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
para modular la expresión de al menos un gen en una célula eucariota determinada, siendo capaz dicha célula eucariota determinada de expresar un microARN, en el que la transcripción primaria contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica dicho al menos un miPEP y en el que la acumulación está modulada por dicho al menos un miPEP, estando regulada la expresión de dicho al menos un gen por dicho microARN.
La invención se basa en la observación sorprendente de los inventores de que es posible modular la expresión de uno o varios genes diana de un mismo microARN modulando la acumulación de dicho microARN con la ayuda de un miPEP.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicha célula eucariota determinada es una célula vegetal.
En una realización, la invención se refiere a la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente
en la que dicha célula eucariota determinada es una célula vegetal de una planta crucifera tal como Arabidopsis thaliana Glycine max (soja), Medicago truncatula y Medicago sativa (alfalfa) o de una planta solanácea tal como Nicotiana benthamiana (tabaco), Solanum tuberosum (patata), Solanum lycopersicum (tomate) o Solanum melongena (berenjena).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicha célula eucariota determinada es una célula animal, principalmente humana.
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicha célula eucariota determinada es una célula animal, principalmente humana, no siendo utilizado dicho miPEP para el tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo humano o animal, ni para modificar la identidad genética del ser humano.
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicha célula eucariota determinada es una célula animal, utilizándose dicho miPEP para el tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo humano o animal.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho microARN y dicho gen son de origen endógeno en dicha célula eucariota determinada.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho microARN y dicho gen son de origen exógeno en dicha célula eucariota determinada, conteniendo dicha célula eucariota determinada al menos un vector que permite la expresión de dicho microARN de dicho gen.
En la invención, las expresiones "de origen endógeno" y "de origen exógeno" se utilizan para distinguir dichos microARN y/o los genes de especies diferentes, dada la conservación de secuencias entre especies.
De este modo, la expresión "de origen endógeno" indica que el microARN y/o el gen pueden estar presentes de manera natural en la célula en cuestión. De manera artificial, sin embargo, se pueden adjuntar otras copias del microARN y/o del gen de origen endógeno en la célula en cuestión, como por ejemplo, por clonación.
Por el contrario, la expresión "de origen exógeno" indica que el microARN y/o el gen no están nunca presentes de manera natural en la célula en cuestión. Se trata de un microARN y/o de un gen identificado en otro tipo celular o en un organismo de otra especie, por lo tanto, este microARN y/o este gen se introducen necesariamente de manera artificial en la célula en cuestión.
En la invención, una célula transformada genéticamente puede contener por tanto 2 grupos de microARN y/o genes potencialmente próximos en términos de secuencia, uno de origen endógeno y el otro de origen exógeno.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicha transcripción primaria del microARN y dicho gen son de origen exógeno en dicha célula eucariota determinada, conteniendo dicha célula eucariota determinada al menos un vector que permite la expresión de la transcripción primaria del microARN.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que la transcripción primaria del microARN está codificada por un vector introducido artificialmente en la célula.
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se escoge de entre el grupo de péptidos que consiste en la SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386 y SEQ ID NO: 355 (Tabla 1).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se escoge de entre el grupo de péptidos que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 355,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se escoge de entre MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59), el AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO: 24), el AtmiPEP165a (SEQ ID NO: 43), el AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76) y el AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO: 77).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se escoge de entre: el MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59), el AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO: 24), el AtmiPEP165a (SEQ ID NO: 43), el AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76), el AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO: 77), el AtmiPEP160b1 (SEQ ID NO: 14), el MtmiPEP171e (SEQ ID NO: 63) y el MtmiPEP169d (SEQ ID NO: 424).
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se escoge de entre MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59), el AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO: 24), el AtmiPEP165a (SEQ ID NO:
43) y el AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se escoge de entre DmmiPEP1a (SEQ ID NO: 102), el DmmiPEP1b (SEQ ID NO: 103) y el DmmiPEP8 (SEQ ID NO:
104).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho miPEP se escoge de entre HsmiPEP155a (SEQ ID NO: 355).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho ácido nucleico se escoge de entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en la SEQ ID NO: 105 a SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 356 (Tabla 2).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho ácido nucleico se escoge de entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en:
- SEQ ID NO: 105 a SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 356,
- SEQ ID NO: 387 a SEQ ID NO: 399, o
- SEQ ID NO: 425.
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho ácido nucleico se escoge de entre la miORF171b (SEQ ID NO: 163), la miORF164a1 (SEQ ID NO: 128), la miORF165a
(SEQ ID NO: 147), la miORF319a1 (SEQ ID NO: 180) y la miORF319a2 (SEQ ID NO: 181).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho ácido nucleico se escoge de entre la miORF171b (SEQ ID NO: 163), la miORF164a1 (SEQ ID NO: 128), la miORF165a
(SEQ ID NO: 147), la miORF319a1 (SEQ ID NO: 180), la miORF319a2 (SEQ ID NO: 181), la miORF160b1 (SEQ ID
NO: 118), la miORF169d (SEQ ID NO: 425) y la miORF171e (SEQ ID NO: 167).
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho ácido nucleico se escoge de entre la miORF171b (SEQ ID NO: 163), la miORF164a1 (SEQ ID NO: 128), la miORF165a
(SEQ ID NO: 147) y la miORF319a1 (SEQ ID NO: 180).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho ácido nucleico se escoge de entre la miORF1a (SEQ ID NO: 206), la miORF1b (SEQ ID NO: 207) y la miORF8 (SEQ ID NO: 208).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho ácido nucleico se escoge de entre la miORF155 (SEQ ID NO: 356).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho microARN se escoge de entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en la SEQ ID NO: 282 a SEQ ID NO: 354 y SEQ ID NO:
358.
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho microARN se escoge de entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en:
- SEQ ID NO: 282 a SEQ ID NO: 354
358,
- SEQ ID NO: 412 a SEQ ID NO: 423,
- SEQ ID NO: 427.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho microARN se escoge de entre miR171b (SEQ ID NO: 319), la miR165a (SEQ ID NO: 305) y la miR319a (SEQ ID NO: 331).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho microARN se escoge de entre miR171b (SEQ ID NO: 319), la miR164a (SEQ ID NO: 297), la miR165a (SEQ ID NO: 305), la miR319a (SEQ ID NO: 331), la miR160b (SEQ ID NO: 291), la miR171e (SEQ ID NO: 322) y la miR169d (SEQ ID NO:
427).
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho microARN se escoge de entre miR171b (SEQ ID NO: 319), la miR164a (SEQ ID NO: 297), la miR165a (SEQ ID NO: 305) y la miR319a (SEQ ID NO: 331).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho microARN se escoge de entre miR1a (SEQ ID NO: 353) y la miR8 (SEQ ID NO: 354).
En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicho microARN se escoge de entre miR155 (SEQ ID NO: 358).
En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por un microARN en una células eucariota vegetal,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación de un miPEP en dicha célula eucariota, escogiéndose dicho miPEP de entre el grupo de péptidos que consiste en:
escogiéndose dicho miPEP de entre el grupo de péptidos que consiste en: SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 76
en el que, la acumulación de dicho miPEP en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho miPEP.
La descripción se refiere en particular a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por un microARN en una células eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación de un miPEP en dicha célula eucariota, teniendo dicho miPEP:
- un tamaño de 3 a 100 aminoácidos, preferentemente de 4 a 20 aminoácidos, y
- una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un ARNm que regula la expresión de dicho gen, y
- que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN,
en el que, la acumulación de dicho miPEP en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho miPEP.
En otro aspecto, la descripción se refiere en particular a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por un microARN en una células eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación de un miPEP en dicha célula eucariota, teniendo dicho miPEP:
- un tamaño de 4 a 100 aminoácidos, o de 3 aminoácidos, y
- una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un ARNm que regula la expresión de dicho gen, y
- que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN,
en el que, la acumulación de dicho miPEP en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho miPEP.
En otro aspecto, la descripción se refiere en particular a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por un microARN en una células eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación de un miPEP en dicha célula eucariota, teniendo dicho miPEP:
- un tamaño de 3 aminoácidos, y
- una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un ARNm que regula la expresión de dicho gen, y
- que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN,
en el que, la acumulación de dicho miPEP en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho miPEP.
En particular, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por un microARN en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación de un miPEP en dicha célula eucariota, teniendo dicho miPEP:
- un tamaño de 4 a 100 aminoácidos, preferentemente de 4 a 20 aminoácidos, y
- una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un ARNm que regula la expresión de dicho gen, y
- que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN,
en el que, la acumulación de dicho miPEP en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho miPEP.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen tal como se define posteriormente, en el que la acumulación de dicho miPEP en la célula es el resultado de:
- la introducción en la célula de un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- la introducción en la célula de dicho miPEP.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen tal como se define posteriormente, en el que dicha célula eucariota es una célula vegetal.
En una realización, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen tal como se define posteriormente en el que dicha célula eucariota es una célula animal y principalmente humana.
En una realización, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen tal como se define posteriormente en la que dicha célula eucariota es una célula animal y principalmente humana, no siendo utilizado dicho procedimiento para el tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo humano o animal, ni para modificar la identidad genética del ser humano.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen tal como se define posteriormente en el que dicho microARN y dicho gen son de origen endógeno en dicha célula eucariota.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen tal como se define posteriormente en el que dicho microARN y dicho gen son de origen exógeno en dicha célula eucariota, conteniendo dicha célula eucariota al menos un vector que permite la expresión de dicho microARN de dicho gen.
En una realización, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen tal como se define posteriormente en el que dicho miPEP se escoge de entre el grupo de péptidos que consiste en la SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386 y SEQ ID NO: 355.
En una realización, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen tal como se define posteriormente en el que dicho miPEP se escoge de entre el grupo de péptidos que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 355,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En una realización particular, la invención se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR171b (SEQ ID NO: 319) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho MtmiPEP171b1 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho MtmiPEP171b1.
En una realización particular, la invención se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR171b (SEQ ID NO: 319) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho MtmiPEP171b1 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho MtmiPEP171b1,
en el que dicho gen se escoge de entre los genes HAM1 (n° de acceso MtGI9- TC114268) y HAM2 (n° de acceso MtGI9-TC120850) (números de acceso según el banco de datos del Atlas de Expresión Genética ("MtGEA") de Medicago truncatula.
En una realización particular, la invención se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR164a (SEQ ID NO: 297) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del AtmiPEP165a1 (SEQ ID NO: 24) en dicha célula eucariota, en la que, la acumulación de dicho AtmiPEP164a1 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho AtmiPEP164a1.
En una realización particular, la invención se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR165a (SEQ ID NO: 305) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del AtmiPEP165a (SEQ ID NO: 43) en dicha célula eucariota, en la que, la acumulación de dicho AtmiPEP165a en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho AtmiPEP165a.
En una realización particular, la invención se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR319a (SEQ ID NO: 331) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76) en dicha célula eucariota, en la que, la acumulación de dicho AtmiPEP319a1 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho AtmiPEP319a1.
En una realización particular, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR319a (SEQ ID NO: 331) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO: 77) en dicha célula eucariota, en la que, la acumulación de dicho AtmiPEP319a2 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho AtmiPEP319a2.
En una realización particular, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR160b (SEQ ID NO: 291) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del AtmiPEP160b1 (SEQ ID NO: 14) en dicha célula eucariota, en la que, la acumulación de dicho AtmiPEP160b1 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho AtmiPEP160b1.
En una realización particular, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR169d (SEQ ID NO: 427) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del MtmiPEP169d (SEQ ID NO: 424) en dicha célula eucariota, en la que, la acumulación de dicho MtmiPEP169d en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho MtmiPEP169d.
En una realización particular, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR171e (SEQ ID NO: 322) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del MtmiPEP171e (SEQ ID NO: 63) en dicha célula eucariota, en la que, la acumulación de dicho MtmiPEP171e en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho MtmiPEP171e.
En una realización particular, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR1 (SEQ ID NO: 353) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del DmmiPEP1a (SEQ ID NO: 102) en dicha célula eucariota, en la que, la acumulación de dicho DmmiPEP1a en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho DmmiPEP1a.
En una realización particular, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR1 (SEQ ID NO: 353) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del DmmiPEP1b (SEQ ID NO: 103) en dicha célula eucariota, en la que, la acumulación de dicho DmmiPEP1b en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho DmmiPEP1b.
En una realización particular, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR8 (SEQ ID NO: 354) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del DmmiPEP8 (SEQ ID NO: 104) en dicha célula eucariota, en la que, la acumulación de dicho DmmiPEP8 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho DmmiPEP8.
En una realización particular, la descripción se refiere a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR155 (SEQ ID NO: 358) en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del hsmiPEP155 (SEQ ID NO: 355) en dicha célula eucariota, en la que, la acumulación de dicho hsmiPEP155 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho hsmiPEP155.
En otro aspecto, la solicitud también describe una célula eucariota modificada que contiene un péptido idéntico a un miPEP tal como se define posteriormente, en el que el péptido está presente en dicha célula eucariota independientemente de la transcripción de la transcripción primaria del microARN que tiene la secuencia de nucleótidos que codifica dicho miPEP.
En la invención, la expresión "célula eucariota modificada" significa que dicha célula eucariota contiene un miPEP introducido artificialmente en la célula, sea como péptido, o por mediación de un vector que codifique dicho miPEP.
Además de un miPEP introducido artificialmente en la célula, una célula eucariota modificada según la invención contiene igualmente al menos un ácido nucleico que se corresponde con una miORF que codifica dicho miPEP.
Además de un miPEP introducido artificialmente en la célula y de la miORF, una célula eucariota modificada según la invención contiene igualmente al menos un miR, cuya transcripción primaria contiene dicha miORF.
En una realización, la solicitud también describe una célula eucariota modificada tal como se define posteriormente, en la que dicho microARN es de origen endógeno.
En otra realización, la solicitud también describe una célula eucariota modificada tal como se define posteriormente en la que dicho microARN es de origen exógeno, conteniendo dicha célula eucariota un vector que permite la expresión de dicho microARN.
En una realización, la solicitud también describe una célula eucariota modificada tal como se define posteriormente, siendo dicha célula una célula vegetal.
En una realización, la solicitud también describe una célula eucariota modificada tal como se define posteriormente, en la que dicha célula vegetal es una célula de Medicago truncatula o Arabidopsis thaliana, escogiéndose dicho péptido de entre el grupo de péptidos que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En una realización, la solicitud también describe una célula eucariota modificada tal como se define posteriormente,
en la que dicha célula vegetal es una célula de Medicago truncatula o Arabidopsis thaliana, escogiéndose dicho péptido de entre el grupo de péptidos que consiste en la SEQ ID NO: 43, SEQ ID n O: 59 y SEQ ID NO: 77.
En una realización, la solicitud también describe una célula eucariota modificada tal como se define posteriormente, en la que dicha célula vegetal es una célula de Medicago truncatula o Arabidopsis thaliana, escogiéndose dicho péptido de entre el grupo de péptidos que consiste en la SEQ ID NO: 59, SEQ ID No : 24, SEQ ID NO: 43, SEQ ID No : 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 424 y SEQ ID NO: 63. En una realización, la solicitud también describe una célula eucariota modificada tal como se define posteriormente, siendo dicha célula una célula animal.
En una realización, la solicitud también describe una célula eucariota modificada tal como se define posteriormente, en la que dicha célula animal es una célula de drosófila y dicho péptido se escoge entre el grupo de péptidos que consiste en la SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104.
En una realización, la solicitud también describe una célula eucariota modificada tal como se define posteriormente, en la que dicha célula animal es una célula humana y dicho péptido consiste en la SEQ ID NO: 355.
En otro aspecto, la solicitud también describe una planta que comprende al menos una célula eucariota modificada tal como se define posteriormente.
En otro aspecto, la solicitud también describe igualmente un organismo animal no humano que comprende al menos una célula eucariota modificada tal como se define posteriormente.
En otro aspecto, la solicitud también describe una composición que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende al menos un miPEP escogido de entre el grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición pesticida que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición fitofarmacéutica que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición desencadenante que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
Por "composición desencadenante", se designa una composición capaz de conferir a la planta una mejor aptitud a la simbiosis o una mayor resistencia a diferentes tensiones, sean de naturaleza térmica, hídrica o química.
Para este propósito, la invención se refiere igualmente a composiciones que tratan sobre el crecimiento (inhibición del crecimiento o por el contrario, aumento del crecimiento) y la fisiología (mejor aptitud a micorrizar, formación de nudos, mejor tolerancia a diferentes tensiones) de la planta.
En particular, la invención se refiere a composiciones para favorecer el crecimiento de las plantas.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición herbicida que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición insecticida que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP164a como principio activo, consistiendo dicho miPEP164a preferentemente en la SEQ ID NO: 24.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP319a como principio activo, consistiendo dicho miPEP319a preferentemente en la SEQ ID NO: 76.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP171b como principio activo, consistiendo dicho miPEP171b preferentemente en la SEQ ID NO: 59.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP165a como principio activo, consistiendo dicho miPEP165a preferentemente en la SEQ ID NO: 43.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP319a2 como principio activo, consistiendo dicho miPEP319a2 preferentemente en la SEQ ID NO: 77. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP160b1 como principio activo, consistiendo dicho miPEP160b1 preferentemente en la SEQ ID NO: 14. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP169d como principio activo, consistiendo dicho miPEP169d preferentemente en la SEQ ID NO: 424.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP171e como principio activo, consistiendo dicho miPEP171e preferentemente en la SEQ ID NO: 63.
Las propiedades solubles de los miPEP se determinan principalmente por su composición en aminoácidos. Los miPEP hidrófilos pueden ser solubles y acondicionarse en soluciones acuosas, tales como el agua. Los miPEP hidrófilos pueden ser solubles y acondicionarse en disolventes, tales como los disolventes orgánicos.
Para el tratamiento de las plantas con los miPEP, los disolventes orgánicos son disolventes no tóxicos para las plantas en pequeñas cantidades, es decir que no tienen efectos perjudiciales sobre el desarrollo de la planta. De manera no limitante, los disolventes orgánicos pueden escogerse de entre el acetonitrilo y el ácido acético.
Los miPEP hidrófilos pueden ser solubles y acondicionarse en mezclas de disolventes orgánicos, como por ejemplo una mezcla de acetonitrilo y de ácido acético. En particular, los miPEP pueden solubilizarse en una solución que comprenda un 50% de acetonitrilo, un 10% de ácido acético y un 40% de agua (volumen/volumen/volumen).
Preferentemente, los miPEP, 164a y 165a se disuelven en agua, y los miPEP 171b y 319a se disuelven en una solución que comprende un 50% de acetonitrilo, un 10% de ácido acético y un 40% de agua (volumen/volumen/volumen). De manera no limitante, las composiciones, las composiciones plaguicidas, las composiciones fitofarmacéuticas, las composiciones herbicidas y las composiciones insecticidas tales como se definen posteriormente pueden comprender 10-9 M a 10-4 M de miPEP, principalmente 10'9 M, 10'8 M, 10'7 M, 10'6 M, 10'5 M o 10'4 M de miPEP.
Las composiciones más o menos concentradas pueden igualmente estar previstas según las aplicaciones previstas. Por ejemplo, las composiciones que comprenden de 10'1 M a 10'3 M de miPEP, principalmente 10'1 M, 10'2 M o 10'3 M de miPEP, pueden estar previstas en el caso en el que el miPEP tenga que administrarse a la planta por fumigación. En otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, como un herbicida para eliminar las plantas o ralentizar su crecimiento, preferentemente como un herbicida específico de una especie o de un género de plantas.
En una realización particular, la invención se refiere a la utilización de una composición que comprende al menos: - un miPEP tal como se define según la reivindicación 8 a excepción de los miPEP de secuencias SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 355,
- un ácido nucleico según la reivindicación 9 que codifica dicho miPEP, a excepción de los ácidos nucleicos de las secuencias de SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 356, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
como un herbicida, para eliminar las plantas o ralentizar su crecimiento, o
como plaguicida para eliminar los organismos perjudiciales para las plantas o susceptibles de clasificarse como tales. En otro aspecto, la descripción se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, como agente fitofarmacéutico,
- para favorecer el crecimiento y/o el desarrollo de las plantas,
principalmente para la modulación de los parámetros fisiológicos de una planta, en particular la biomasa, la superficie foliar, la floración, el calibre del fruto, la producción y/o la selección de semillas vegetales, en particular para controlar la partenocarpia o la monoecia de una planta, o para la modificación de los parámetros fisiológicos de semillas vegetales, en particular la germinación, la implantación radicular y la resistencia al estrés hídrico,
- o para prevenir o tratar las enfermedades de las plantas,
en particular para favorecer la resistencia a las enfermedades infecciosas.
En una realización particular, la invención se refiere a la utilización de una composición que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define según la reivindicación 8, a excepción de los miPEP de las secuencias de SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 355,
- un ácido nucleico según la reivindicación 9 que codifica dicho miPEP, a excepción de los ácidos nucleicos de las secuencias de SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 356, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
como agente fitofarmacéutico,
- para favorecer el crecimiento y/o el desarrollo de las plantas,
- o para la modificación de parámetros fisiológicos de semillas vegetales o para prevenir o tratar enfermedades de las plantas,
aplicándose dicha composición por fumigación y formación de una película sobre dichas semillas vegetales.
En otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, para modular los parámetros fisiológicos de una planta, en particular la biomasa, la superficie foliar, o el calibre del fruto.
En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, para el aclareo de vergeles con el fin de aumentar el calibre de los frutos.
En una realización, la descripción se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, para la producción y/o la selección de semillas vegetales, utilizándose dicha composición para controlar la partenocarpia y la monoecia de una planta.
En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, administrándose dicha composición a dicha planta por vía foliar o vía radicular.
En una realización, la descripción se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, para la producción y/o la selección de semillas vegetales.
En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, en la que dicha composición se utiliza para modificar los parámetros fisiológicos de dichas semillas vegetales, en particular la implantación radicular, la germinación y la resistencia al estrés hídrico.
En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, para favorecer la resistencia a las enfermedades infecciosas.
En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, en la que dicha composición se aplica por fumigación o formación de una película sobre dichas semillas vegetales.
En otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, como un plaguicida, para eliminar los organismos perjudiciales para las plantas o susceptibles de clasificarse como tales, principalmente como insecticida, aracnicida, limacida o rodenticida.
En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, como insecticida.
En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, para eliminar los insectos devastadores.
En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, para eliminar las especies animales clasificadas como perjudiciales o susceptibles de clasificarse como tales, en particular los murinos, principalmente las ratas.
En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, como plaguicida para eliminar los organismos perjudiciales para las plantas o susceptibles de clasificarse como tales, principalmente como insecticida, aracnicida, limacida o rodenticida,
en particular para la aplicación de dicha composición sobre una planta o sobre un soporte en contacto con la planta.
En otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de una composición tal como se define posteriormente, en la que dicha composición se aplica sobre una planta para protegerla de insectos devastadores.
En otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de un péptido para favorecer el crecimiento de una planta, introduciéndose dicho péptido en la planta, teniendo dicho péptido una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente naturalmente en dicha planta,
siendo dicho miPEP presente de manera natural en dicha planta un péptido de 4 a 100 aminoácidos cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada sobre la transcripción primaria de un miR, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en dicha planta, en la que el miR regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, las hojas o las flores.
Los inventores han constatado de manera sorprendente que la utilización de péptidos en los que la secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de los miPEP codificados por las transcripciones primarias de los miR, permiten favorecer el crecimiento de las plantas.
En la invención, el término "planta" hace referencia de manera general o toda o parte de una planta cualquiera que sea su estado de desarrollo (que comprende la planta en forma de grano o de plántula), a uno o varios órganos de la planta (como por ejemplo, las hojas, las raíces, el tallo, las flores), a una o varias células de la planta, o incluso un conjunto de células de la planta.
En la invención, el término "crecimiento" hace referencia al desarrollo de toda o parte de una planta con el paso del tiempo. El crecimiento de la planta puede determinarse y cuantificarse así siguiendo los parámetros evolutivos que se pueden observar en ciertas partes, células u órganos de la planta, tales como las hojas, las raíces, los tallos o incluso las flores.
De manera no limitante, los parámetros que permiten determinar y cuantificar el crecimiento de una planta pueden ser principalmente:
- el tamaño, la superficie, el volumen, la masa y el número de hojas,
- el tamaño y el número de flores,
- el tamaño del tallo (o del tallo floral),
- la longitud y número de raíces,
- la precocidad de germinación,
- la precocidad de los brotes,
- la precocidad de la inducción floral (o transición floral),
- o incluso el número de células.
En el caso de las plantas leguminosas, el crecimiento de la planta puede estar ligado igualmente a la velocidad de nodulación, o incluso al tamaño y número de nódulos en las raíces.
Por otra parte, en la invención, la expresión "favorecer el crecimiento de la planta" o "mejorar el crecimiento de la planta", indica:
- sea una aceleración del desarrollo (como por ejemplo un tamaño de las hojas más importante para la planta en un momento dado con respecto a una planta de referencia),
- sea un aumento del desarrollo (como por ejemplo, un tamaño de las hojas más importante en una planta, que no pueda alcanzar una planta de referencia),
- sea una aceleración y un aumento del desarrollo de la planta.
Es importante señalar que la utilización según la invención tiene la ventaja de ser ecológica, en comparación con métodos químicos utilizados clásicamente en la industria botánica o en la agricultura, ya que el miPEP es un péptido que está presente naturalmente en la planta.
La invención se refiere igualmente a la utilización de un miPEP introducido en una planta para favorecer el crecimiento, siendo dicho miPEP introducido un péptido que comprende o consiste en, una secuencia idéntica a la de un miPEP que está presente naturalmente en dicha planta,
en el que el miPEP presente naturalmente es un péptido de 4 a 100 aminoácidos, en el que la secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR,
siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en dicha planta, en la que el miR regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, las hojas o las flores,
siendo la suma de la cantidad de dicho miPEP introducido y la de dicho miPEP presente naturalmente estrictamente superior a la cantidad de dicho miPEP naturalmente presente.
En la invención, la expresión "miPEP introducido" hace referencia a un miPEP introducido artificialmente en la planta al contrario del "miPEP presente naturalmente en la planta". La introducción de un miPEP en la planta implica entonces una etapa técnica, en la que la etapa no es un fenómeno natural y no corresponde ni a un cruzamiento, ni a una selección.
El miPEP introducido puede ser o bien un péptido producido fuera de la planta (como por ejemplo un péptido aislado y/o purificado, un péptido sintético o un péptido recombinante), o bien un péptido producido por la planta después de la introducción no natural de un ácido nucleico que codifique dicho miPEP en dicha planta.
La planta en la que no se ha introducido el miPEP posee una cantidad basal de dicho miPEP, que corresponde a la de dicho miPEP presente naturalmente. La utilización de un miPEP que comprende, o consiste en, una secuencia
idéntica a la de dicho miPEP conlleva un aumento de la cantidad total de miPEP, lo que modula la acumulación el miR cuya transcripción primaria contiene la secuencia codificante de dicho miPEP.
Por otra parte, el miPEP introducido se encuentra en la planta y su introducción no tiene un impacto sobre su estabilidad.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se escoge de entre el grupo que consiste en: NACI (n° de acceso AT1G56010.1), NAC4 (n° de acceso AT5G07680.1), NAC5 (n° de acceso AT5G61430.1), CUC1 (n° de acceso AT3G15170.1), CUC2 (n° de acceso AT5G53950.1), TCP3 (n° de acceso AT1G53230.1) y TCP4 (n° de acceso AT3G15030.1) (números de acceso según el banco de datos Recurso de Información de Arabidopsis "TAIR").
En particular, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se escoge de entre el grupo que consiste en: NAC1, NAC4, NAC5, CUC1 y CUC2.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se escoge de entre el grupo que consiste en: TCP3 y TCP4.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miARN se escoge de entre el miR164a y el miR319a.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miARN se escoge de entre el miR164a, el miR319a, el miR171b, el miR165a, el miR160b, el miR169d y el miR171e.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se escoge de entre el AtmiPEP164a1, el AtmiPEP319a1, el AtmiPEP319a2, el MtmiPEP171b1, el AtmiPEP165a1, el AtmiPEP160b1, el MtmiPEP169d, el MtmiPEP171e.
En particular, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que, dicho miR164a tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEQ ID NO: 297.
En particular, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miR164a tiene una secuencia de nucleótidos que presenta al menos un 80% de identidad, preferentemente al menos un 90% de identidad, con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 297.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP es el AtmiPEP164a1, en particular, en la que dicho AtmiPEP164a1 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 24.
En particular, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que, dicho miR319a tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEQ ID NO: 331.
En particular, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miR319a tiene una secuencia de nucleótidos que presenta al menos un 80% de identidad, preferentemente al menos un 90% de identidad, con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 331.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP es el AtmiPEP319a1, en particular, en la que dicho AtmiPEP319a1 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 76.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicha planta es una planta crucifera tal como Arabidopsis thaliana, una planta leguminosa tal como Glycine max (soja), Medicago truncatula y Medicago sativa (alfalfa) o una planta solanácea tal como Nicotiana benthamiana (tabaco), Solanum tuberosum (patata), Solanum lycopersicum (tomate) o Solanum melongena (berenjena).
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicha planta es una planta crucifera.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicha planta es Arabidopsis thaliana.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, para favorecer el crecimiento de una planta de Arabidopsis thaliana, en la que el AtmiPEP164a1 se introduce en dicha planta de Arabidopsis thaliana, estando dicho AtmiPEP164a1 igualmente presente de manera natural en dicha planta de Arabidopsis thaliana,
siendo dicho AtmiPEP164a1 introducido un péptido en el que la secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de dicho AtmiPEP164a1 presente naturalmente, estando dicha secuencia del AtmiPEP164a1 codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de miR164a, en el que el miR164a regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de Arabidopsis thaliana,
siendo la suma de la cantidad de dicho AtmiPEP164a1 introducido y la de dicho AtmiPEP164a1 presente naturalmente estrictamente superior a la cantidad de dicho AtmiPEP164a1 naturalmente presente en dicha planta de Arabidopsis thaliana.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, para favorecer el crecimiento de una planta de Arabidopsis thaliana, en la que el AtmiPEP319a1 se introduce en dicha planta de Arabidopsis thaliana, estando dicho AtmiPEP319a1 igualmente presente de manera natural en dicha planta de Arabidopsis thaliana,
siendo dicho AtmiPEP319a1 introducido un péptido en el que la secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de dicho AtmiPEP319a1 presente naturalmente, estando dicha secuencia del AtmiPEP319a1 codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de miR319a, en el que el miR319a regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de Arabidopsis thaliana, siendo la suma de la cantidad de dicho AtmiPEP319a1 introducido y la de dicho AtmiPEP319a1 presente naturalmente estrictamente superior a la cantidad de dicho AtmiPEP319a1 naturalmente presente en dicha planta de Arabidopsis thaliana.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se introduce por vía externa en la planta, preferentemente por riego, por pulverización o con la adición de un fertilizante, de tierra, de un sustrato de cultivo o de un soporte inerte.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se introduce por riego y pulverización.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se introduce por riego y por la adición de un fertilizante.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se introduce por pulverización y por la adición de un fertilizante.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se introduce, por riego, por pulverización y por adición de un fertilizante.
Los inventores han constatado en efecto de manera inesperada que es posible aplicar directamente una composición que comprende un miPEP sobre la planta para modular la acumulación del miR correspondiente en la planta, lo que indica que el miPEP es captado por la planta.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que la planta se trata con una composición que comprende de 10-9 M a 10-4 M de dicho miPEP, principalmente 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M o 10-4 M de dicho miPEP.
Preferentemente, las composiciones tienen de 10-8 M a 10-5 M para una aplicación por riego o por pulverización sobre la planta.
De manera complementaria, se pueden prever composiciones más o menos concentradas para tratar la planta con el miPEP. Por ejemplo, y de manera no limitante, las composiciones más concentradas que comprenden de 10-1 M a 10 3 M, principalmente 10-2 M de miPEP, pueden estar previstas en el caso en el que el miPEP introducido por vía exógena se administre a la planta por fumigación.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se introduce en la planta por medio de un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, introduciéndose dicho ácido nucleico en la planta.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que el tamaño del tallo aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al tamaño del tallo de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al tamaño del tallo de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que el número de hojas aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que el tamaño de las hojas aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al tamaño de las hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al tamaño de las hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que el número de raíces aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que la longitud de las raíces aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto a la longitud de las raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto a la longitud de las raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que la velocidad de nodulación aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto a la velocidad de nodulación de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto a la velocidad de nodulación de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a la utilización tal como se define posteriormente, en la que el número de nódulos aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de nódulos de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de nódulos de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
El aumento de los parámetros que permiten determinar y cuantificar el crecimiento de la planta en la que se ha introducido el miPEP (tales como el tamaño del tallo, el número y tamaño de las hojas, el número y la longitud de las raíces, la velocidad de nodulación o incluso el número de nódulos en las raíces) se pone en evidencia preferentemente por comparación con una planta idéntica (es decir, una planta de la misma especie y/o variedad), de la misma edad y cultivada en las mismas condiciones pero en la que no se ha introducido ningún miPEP.
En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para favorecer el crecimiento de una planta, que comprende una etapa de introducción de un miPEP en una planta, estando dicho miPEP igualmente presente de manera natural en dicha planta,
siendo dicho miPEP introducido un péptido de 4 a 100 aminoácidos en el que la secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de dicho miPEP presente naturalmente, en el que la secuencia del miPEP presente naturalmente está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR, en la que el miR regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, las hojas o las flores,
siendo la suma de la cantidad de dicho miPEP introducido y la de dicho miPEP presente naturalmente estrictamente superior a la cantidad de dicho miPEP naturalmente presente.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se escoge de entre el grupo que consiste en: NACI (n° de acceso AT1G56010.1), NAC4 (n° de acceso AT5G07680.1), NAC5 (n° de acceso AT5G61430.1), CUC1 (n° de acceso AT3G15170.1), CUC2 (n° de acceso AT5G53950.1), TCP3 (n° de acceso AT1G53230.1) y TCP4 (n° de acceso AT3G15030.1).
En particular, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se escoge de entre el grupo que consiste en: NACI, NAC4, NAC5, CUC1 y CUC2.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se escoge de entre el grupo que consiste en: TCP3 y TCP4.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicho miR se escoge de entre el miR164a, el miR319a, el miR171b, el miR165a, el miR160b, el miR169d y el miRl71e.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicho miR se escoge de entre el AtmiPEP164a1, el AtmiPEP319a1, el AtmiPEP319a2, el MtmiPEP171b1, el AtmiPEP165a1, el AtmiPEP160b1, el MtmiPEP169d, el MtmiPEP171e.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicho miARN es el miR164a, en particular, en el que dicho miR164a tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la
SEQ ID NO: 297.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicho miPEP es el AtmiPEP164a1, en particular, en el que dicho AtmiPEP164a1 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 24.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicho miARN es el miR319a, en particular, en el que dicho miR319a tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEQ ID NO: 331.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicho miPEP es el AtmiPEP319a1, en particular, en el que dicho AtmiPEP319a1 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 76.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en la que dicha planta es una planta crucífera tal como Arabidopsis thaliana, una planta leguminosa tal como Glycine max (soja), Medicago truncatula y Medicago sativa (alfalfa) o una planta solanácea tal como Nicotiana benthamiana (tabaco), Solanum tuberosum (patata), Solanum lycopersicum (tomate) o Solanum melongena (berenjena).
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicha planta es una planta crucífera.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicha planta es Arabidopsis thaliana.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, para favorecer el crecimiento de una planta de Arabidopsis thaliana, en el que el AtmiPEP164a1 se introduce en dicha planta de Arabidopsis thaliana, estando dicho AtmiPEP164a1 igualmente presente de manera natural en dicha planta de Arabidopsis thaliana,
siendo dicho AtmiPEP164a1 introducido un péptido que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de dicho AtmiPEP164a1 presente naturalmente, en el que dicho AtmiPEP164a1 presente naturalmente es un péptido de 4 a 100 aminoácidos cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria del miR164a,
siendo capaz dicho AtmiPEP164a1 de modular la acumulación de dicho miR164a, en el que el miR164a regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de Arabidopsis thaliana,
siendo la suma de la cantidad de dicho AtmiPEP164a1 introducido y la de dicho AtmiPEP164a1 presente naturalmente estrictamente superior a la cantidad de dicho AtmiPEP164a1 presente de manera natural.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, para favorecer el crecimiento de una planta de Arabidopsis thaliana, en el que el AtmiPEP319a1 se introduce en dicha planta de Arabidopsis thaliana, estando dicho AtmiPEP319a1 igualmente presente de manera natural en dicha planta de Arabidopsis thaliana,
siendo dicho AtmiPEP319a1 introducido un péptido que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de dicho AtmiPEP319a1 presente naturalmente, en el que dicho AtmiPEP319a1 presente naturalmente es un péptido de 4 a 100 aminoácidos cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria del miR319a,
siendo capaz dicho AtmiPEP319a1 de modular la acumulación de dicho miR319a, en el que el miR319a regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de Arabidopsis thaliana,
siendo la suma de la cantidad de dicho AtmiPEP319a1 introducido y la de dicho AtmiPEP319a1 presente naturalmente estrictamente superior a la cantidad de dicho AtmiPEP319a1 presente de manera natural.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicho miPEP se introduce por vía externa en la planta, preferentemente por riego, por pulverización o con la adición de un fertilizante, de tierra, de un sustrato de cultivo o de un soporte inerte.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicho miPEP se administra a la planta en forma de una composición que comprende de 10-9 M a 10-4 M de dicho miPEP, en particular 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 o 10-4 M de dicho miPEP. En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en el que dicho miPEP se introduce en la planta por medio de un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, introduciéndose dicho ácido nucleico en la planta.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en la que el tamaño del tallo aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al tamaño del tallo de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al tamaño del tallo de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en la que el número de hojas aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en la que el tamaño de las hojas aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al tamaño de las hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al tamaño de las hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en la que el número de raíces aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en la que la longitud de las raíces aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto a la longitud de las raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto a la longitud de las raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en la que la velocidad de nodulación aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto a la velocidad de nodulación de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto a la velocidad de nodulación de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define posteriormente, en la que el número de nódulos aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de nódulos de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de nódulos de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En otro aspecto, la invención se refiere a una planta en la que se ha introducido un miPEP según la utilización o el procedimiento para favorecer el crecimiento de una planta descrita posteriormente.
En otro aspecto, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica que comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que codifica un miPEP de 4 a 100 aminoácidos en una planta, o en al menos una célula de dicha planta, en condiciones que permiten la expresión de dicho miPEP,
estando dicho miPEP igualmente presente de manera natural en dicha planta, siendo dicho miPEP presente naturalmente un péptido cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en la planta, en la que el miR regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, las hojas o las flores, y
b) una etapa de cultivo de la planta, o de al menos una célula de dicha planta, obtenidas en la etapa a) en condiciones que permitan la obtención de una planta transgénica.
En otro aspecto, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica que comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que codifica un miPEP de 4 a 100 aminoácidos, o de 3 aminoácidos, en una planta, o en al menos una célula de dicha planta, en condiciones que permiten la expresión de dicho miPEP,
estando dicho miPEP igualmente presente de manera natural en dicha planta, siendo dicho miPEP presente naturalmente un péptido cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en la planta, en la que el miR regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, las hojas o las flores, y
b) una etapa de cultivo de la planta, o de al menos una célula de dicha planta, obtenidas en la etapa a) en condiciones que permitan la obtención de una planta transgénica.
En otro aspecto, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica que
comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que codifica un miPEP de 3 aminoácidos, en una planta, o en al menos una célula de dicha planta, en condiciones que permiten la expresión de dicho miPEP,
estando dicho miPEP igualmente presente de manera natural en dicha planta, siendo dicho miPEP presente naturalmente un péptido cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en la planta, en la que el miR regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, las hojas o las flores, y
b) una etapa de cultivo de la planta, o de al menos una célula de dicha planta, obtenidas en la etapa a) en condiciones que permitan la obtención de una planta transgénica.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que dicha planta transgénica obtenida en la etapa b) tiene un mejor crecimiento con respecto a una planta idéntica en la que no se ha introducido dicho ácido nucleico.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que la expresión de dicho miPEP codificado por el ácido nucleico introducido en la planta produce un mejor crecimiento con respecto a una planta idéntica en la que no se ha introducido dicho ácido nucleico.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que la etapa a) se realiza con la ayuda de un vector que contiene dicho ácido nucleico, preferentemente un plásmido.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que la expresión de dicho ácido nucleico de la etapa a) está situado bajo el control de un promotor fuerte, preferentemente un promotor fuerte constitutivo tal como el promotor 35S.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se escoge de entre el grupo que consiste en: NACI (n° de acceso AT1G56010.1), NAC4 (n° de acceso AT5G07680.1), NAC5 (n° de acceso AT5G61430.1), CUC1 (n° de acceso AT3G15170.1), CUC2 (n° de acceso AT5G53950.1), TCP3 (n° de acceso AT1G53230.1) y TCP4 (n° de acceso AT3G15030.1). En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que dicho miPEP tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia escogida de entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que dicho miPEP tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia escogida de entre el grupo constituido por:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que dicho miARN es el miR164a, en particular, en el que dicho miR164a tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEQ ID NO: 297.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que dicho miPEP es el AtmiPEP164a1, en particular, en el que dicho AtmiPEP164a1 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 24.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que dicho miARN es el miR319a, en particular, en el que dicho miR319a tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEQ ID NO: 331.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que dicho miPEP es el AtmiPEP319a1, en particular, en el que dicho AtmiPEP319a1 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 76.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que dicho ácido nucleico introducido en la etapa a) comprende una secuencia de nucleótidos escogida entre las SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 180.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como
se define posteriormente, en la que dicha planta es una planta crucifera tal como Arabidopsis thaliana, una planta leguminosa tal como Glycine max (soja), Medicago truncatula y Medicago sativa (alfalfa) o una planta solanácea tal como Nicotiana benthamiana (tabaco), Solanum tuberosum (patata), Solanum lycopersicum (tomate) o Solanum melongena (berenjena).
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que dicha planta transgénica es una planta crucífera.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en el que dicha planta transgénica es Arabidopsis thaliana.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, que comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 128, que codifica el AtmiPEP164a1 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24, en una planta de Arabidopsis thaliana, o en al menos una célula de dicha planta de Arabidopsis thaliana, en condiciones que permiten la expresión de dicho AtmiPEP164a1,
estando dicho AtmiPEP164a1 igualmente presente de manera natural en dicha planta de Arabidopsis thaliana, siendo dicho miPEP presente naturalmente un péptido cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR164a, siendo capaz dicho AtmiPEP164a1 de modular la acumulación de dicho miR164, en el que el miR164a regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de Arabidopsis thaliana, y
b) una etapa de cultivo de la planta, o de al menos una célula de dicha planta, obtenidas en la etapa a) en condiciones que permitan la obtención de una planta transgénica deArabidopsis thaliana.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, que comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 180, que codifica el AtmiPEP319a1 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 76, en una planta de Arabidopsis thaliana, o en al menos una célula de dicha planta de Arabidopsis thaliana, en condiciones que permiten la expresión de dicho AtmiPEP319a1,
estando dicho AtmiPEP319a1 igualmente presente de manera natural en dicha planta de Arabidopsis thaliana, siendo dicho miPEP presente naturalmente un péptido cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR319a, siendo capaz dicho AtmiPEP319a1 de modular la acumulación de dicho miR319, en el que el miR319a regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de Arabidopsis thaliana, y
b) una etapa de cultivo de la planta, o de al menos una célula de dicha planta, obtenidas en la etapa a) en condiciones que permitan la obtención de una planta transgénica deArabidopsis thaliana.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción tal como se define posteriormente, en el que dicho miPEP se introduce en la planta por medio de un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, introduciéndose dicho ácido nucleico en la planta.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en la que el tamaño del tallo aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al tamaño del tallo de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al tamaño del tallo de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en la que el número de hojas aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en la que el tamaño de las hojas aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al tamaño de las hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al tamaño de las hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en la que el número de raíces aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún
miPEP, o bien con respecto al número de raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en la que la longitud de las raíces aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto a la longitud de las raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto a la longitud de las raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en la que la velocidad de nodulación aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto a la velocidad de nodulación de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto a la velocidad de nodulación de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la solicitud también describe un procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se define posteriormente, en la que el número de nódulos aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de nódulos de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de nódulos de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En un aspecto, la solicitud describe igualmente una planta transgénica tal como la que se obtiene por el procedimiento de producción tal como se define posteriormente.
En otro aspecto, la solicitud también describe una planta transgénica que contiene un vector que codificas un miPEP, estando dicho miPEP igualmente presente de manera natural en dicha planta, siendo dicho miPEP presente naturalmente un péptido cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en la planta, en el que el miR regula la expresión de al menos un gen, produciendo la expresión de dicho miPEP codificado por el vector introducido en la planta una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a una planta idéntica en la que no se ha introducido dicho ácido nucleico.
En una realización, la solicitud también describe una planta transgénica tal como se define posteriormente en la que dicho gen está implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta,, principalmente las raíces, el tallo, los hojas o las flores, y la expresión de dicho miPEP codificado por el ácido nucleico introducido en la planta produce un mejor crecimiento de la planta transgénica con respecto a una planta idéntica en la que no se ha introducido dicho ácido nucleico.
En una realización, la solicitud también describe una planta transgénica tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se escoge de entre el grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En otro aspecto, la solicitud también describe una planta transgénica que comprende un vector, conteniendo dicho vector un ácido nucleico que permite la expresión de una transcripción primaria de miR,
conteniendo dicha transcripción primaria del miR una fase de lectura abierta que codifica un miPEP, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en dicha planta, en el que el miR regula la expresión de al menos un gen en dicha planta, la expresión de dicho miPEP codificado por el vector introducido en la planta produce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a una planta idéntica en la que no se ha introducido dicho vector.
En una realización, la solicitud también describe una planta transgénica tal como se define posteriormente en la que dicho ácido nucleico es de origen endógeno.
Si dicho ácido nucleico es de origen endógeno, al menos una copia de dicho ácido nucleico ya está presente de manera natural en la planta, independientemente del vector introducido en la planta.
En una realización, la solicitud también describe una planta transgénica tal como se define posteriormente en la que dicho ácido nucleico es de origen exógeno.
Si dicho ácido nucleico es de origen exógeno, no hay presente de manera natural ninguna copia de dicho ácido nucleico en la planta.
En una realización, la solicitud también describe una planta transgénica tal como se define posteriormente en la que dicho gen está implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta,, principalmente las raíces, el tallo, los hojas o las flores, y la expresión de dicho miPEP codificado por el ácido nucleico introducido en la
planta produce un mejor crecimiento de la planta transgénica con respecto a una planta idéntica en la que no se ha introducido dicho ácido nucleico.
En una realización, la solicitud también describe una planta transgénica tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se escoge de entre el grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En otro aspecto, la descripción se refiere a una composición que comprende en combinación con una cantidad de semillas de una planta y una cantidad de un péptido en el que la secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de manera natural en dicha planta.
En una realización, la descripción se refiere a una composición tal como se define posteriormente, en la que dicho miPEP se escoge de entre el grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En una realización, la invención se refiere a una composición que comprende en combinación una cantidad de semillas de una planta y una cantidad de un péptido en el que la secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de manera natural en dicha planta
escogiéndose dicho miPEP de entre el grupo de péptidos que consiste en: SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 76.
En una realización, la invención se refiere a una composición que comprende en combinación una cantidad de semillas de una planta, principalmente A. thaliana, y una cantidad de un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la del AtmiPEP164a1.
En una realización, la invención se refiere a una composición que comprende en combinación una cantidad de semillas de una planta, principalmente A. thaliana, y una cantidad de un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la del AtmiPEP319a1.
En una realización, la invención se refiere a una composición que comprende en combinación una cantidad de semillas de una planta, principalmente M. truncatula, y una cantidad de un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la del MtmiPEP171b.
En una realización, la invención se refiere a una composición tal como se define posteriormente formulada de manera que forme una semilla revestida.
El revestimiento se puede realizar según los procedimientos utilizados clásicamente en la industria agroalimentaria y se puede obtener utilizando un material apto para disgregarse en un disolvente o en la tierra, tal como un aglutinante o arcilla.
Según la invención, el revestimiento puede utilizarse para, por ejemplo, conferir propiedades particulares a una composición de miPEP, o también a una composición de semillas en combinación con un miPEP.
En una realización, la invención se refiere a una composición tal como se define posteriormente formulada de manera que forme una semilla revestida que comprende el MtmiPEP171b.
En una realización, la invención se refiere a una composición tal como se define posteriormente formulada de manera que forme una semilla revestida que comprende el AtmiPEP164a1.
En una realización, la invención se refiere a una composición tal como se define posteriormente formulada de manera que forme una semilla revestida que comprende el AtmiPEP319a1.
En otro aspecto, la descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la descripción se refiere a una composición que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
para su utilización como un medicamento, principalmente para el ser humano o para los animales. La utilización de las composiciones de la invención se puede aplicar en medicina humana y en medicina veterinaria.
En otro aspecto, la descripción se refiere a una composición que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
para su utilización en la prevención y/o el tratamiento de una patología que implica la desregulación de la expresión de un gen del paciente,
estando regulada la expresión de dicho gen por un microARN cuya acumulación está modulada por dicho miPEP. En una realización, la descripción se refiere a la utilización tal como se define posteriormente en la que dicha patología se escoge de entre el cáncer, la diabetes, la obesidad, las enfermedades infecciosas y las enfermedades neurodegenerativas.
En una realización, la descripción se refiere a la composición tal como se define posteriormente, en la que dicha patología se escoge de entre: el cáncer, la diabetes, la obesidad, las enfermedades infecciosas, las enfermedades neurovegetativas, las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades autoinmunitarias.
En una realización, la descripción se refiere a la composición tal como se define posteriormente, en la que dicha patología se escoge de entre: el cáncer, la diabetes, la obesidad, las enfermedades infecciosas, y las enfermedades neurovegetativas, o que se escogen entre las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades autoinmunitarias. En una realización, la descripción se refiere a la composición tal como se define posteriormente en la que dicha patología se escoge de entre las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades autoinmunitarias.
En otro aspecto, la descripción se refiere a una composición que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
para su utilización en la prevención y/o el tratamiento de una infección en un animal o un ser humano por un organismo parasitario,
teniendo dicho organismo parasitario un gen cuya expresión está regulada por un micro ARN cuya acumulación está modulada por dicho miPEP.
En otro aspecto, la descripción se refiere a un miPEP de 4 a 100 aminoácidos, o de 3 aminoácidos, codificado por una secuencia de nucleótidos contenido en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota, mediante su utilización como un medicamento. En otro aspecto, la solicitud también describe un anticuerpo que reconoce específicamente un miPEP.
En particular, la solicitud también describe un anticuerpo que reconoce específicamente el AtmiPEP165a.
En particular, la solicitud también describe un anticuerpo que reconoce específicamente el MtmiPEP171b.
En particular, la solicitud también describe un anticuerpo que reconoce específicamente el AtmiPEP164a1.
En particular, la solicitud también describe un anticuerpo que reconoce específicamente el AtmiPEP319a1.
Dicho anticuerpo puede obtenerse a partir de un procedimiento conocido por el experto, como por ejemplo, inyectando dicho miPEP a un animal no humano para desencadenar una reacción de inmunización y la producción de anticuerpos por dicho animal.
En otro aspecto, la solicitud también describe un procedimiento de inmunolocalización de un miPEP que comprende una etapa de marcado de una muestra biológica de una planta con un anticuerpo que reconoce específicamente un miPEP.
En particular, la solicitud también describe
un procedimiento de inmunolocalización del AtmiPEP165a con ayuda de un anticuerpo que reconoce específicamente el AtmiPEP165a.
En particular, la solicitud también describe un procedimiento de inmunolocalización del MtmiPEP171b con ayuda de un anticuerpo que reconoce específicamente el MtmiPEP171b.
En particular, la solicitud también describe un procedimiento de inmunolocalización del AtmiPEP164a1 con ayuda de un anticuerpo que reconoce específicamente el AtmiPEP164a1.
En particular, la solicitud también describe un procedimiento de inmunolocalización del MtmiPEP319a1 con ayuda de un anticuerpo que reconoce específicamente el AtmiPEP319a1.
En otro aspecto, la descripción se refiere a un anticuerpo que reconoce específicamente un miPEP según la invención, mediante su utilización como un medicamento.
En otro aspecto, la descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que reconoce específicamente un miPEP según la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la solicitud también describe un protocolo de producción de un péptido recombinante, cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP tal como se define posteriormente, que comprende una etapa de transformación de un organismo con un vector de expresión que codifica dicho péptido recombinante.
En una realización, dicho organismo se escoge de entre el grupo que comprende las bacterias, las levaduras, los hongos (distintos de levaduras), las células animales, las plantas y los animales.
En una realización, dicho organismo es Escherichia coli.
En particular, la solicitud también describe un protocolo de producción de un péptido recombinante tal como se define posteriormente, que comprende las siguientes etapas:
- el ácido nucleico que codifica dicho péptido recombinante está unido a un marcador de ácido nucleico codificante, tal como la GST,
- el vector de expresión que contiene dicho ácido nucleico que codifica dicho péptido recombinante se introduce en la bacteria E. coli,
- la bacteria E. coli que contiene el vector de expresión se cultiva en un medio LB de preferencia hasta una DO que comprende entre 0,2 y 0,4,
- la producción del péptido recombinante se induce con IPTG, preferentemente durante 4 a 5 horas,
- las bacterias E. coli se centrifugan y se lisan,
- el sobrenadante se filtra,
- dicho péptido recombinante se purifica sobre una columna de sepharose de afinidad con glutatión,
- si es necesario, escindir la GST con una proteasa.
El conjunto de secuencias de miPEP, miORF, miR y las transcripciones primarias de los miR se indican en las tablas 1, 2, 3, 4, 5 y 6.
La tabla 7 presenta un análisis del polimorfismo de la secuencia de ADN de diferentes regiones del pri-miR171b se define un haplotipo cuando difiere al menos un aminoácido de otros haplotipos).
Tabla 4. Lista de microARN (miR)
BnmiPEP165a 
ucggaccaggcuucauccccc SEQ ID NO: 308
continuación
continuación
Tabla 6. Lista de los miR de control
Tabla 7. Polimorfismo de la secuencia de ADN de diferentes regiones del pri-miR171b
Las figuras y los ejemplos siguientes ilustran mejor la invención, sin por ello limitar su ámbito.
LEYENDA DE LAS FIGURAS
FIGURA 1. Efectos de la sobre expresión del MtmiR171b (miR171b identificado en M e d ic a g o tru n c a tu la sobre la expresión de los genes H A M 1 y H A M 2 (A) o sobre el número de raíces laterales (B) en M . t ru n c a tu la .
(A) El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b (columnas de la izquierda), de HAM1 (columnas del centro) o de HAM2 (columnas de la derecha) en una planta de control (columnas blancas) o en una planta en la que se expresa negativamente MtmiR171b (columnas negras). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10). La sobre expresión de MtmiR171b induce la disminución de la expresión de los genes HAM1 y HAM2.
(B) El eje de ordenadas indica el número medio de raíces laterales observados en una planta de control (columna blanca) o en una planta en la que MtmiR171b se sobre expresa (columna negra). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 100). La sobre expresión de MtmiR171b produce una reducción del número de raíces laterales.
FIGURA 2. Efectos de la sobre expresión del MtmiPEP171b1 (miR171b identificado en M e d ic a g o t ru n c a tu la sobre la expresión de los genes H A M 1 y HAM2 (A) o sobre el número de raíces laterales (B) en M . t ru n c a tu la .
(A) El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del MtmiPEP171b1 (gráfico de la izquierda), del miR171b (gráfico de la derecha, columnas de la izquierda), de HAM1 (n° de acceso MtGI9-TCll4268) (gráfico de la derecha, columnas del centro) o de HAM2 (n° de acceso MtGI9-TC120850) (gráfico de la derecha, columnas de la derecha) en una planta de control (columnas blancas) o en una planta en la que se sobre expresa MtmiPEP171b1 (columnas negras). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10). La
sobre expresión del MtmiPEP171b1 induce un aumento de la acumulación del MtmiR171b, así como una disminución de la expresión de los genes HAM1 y HAM2.
(B) El eje de ordenadas indica el número medio de raíces laterales observados en una planta de control (columna blanca) o en una planta en la que MtmiPEP171b1 se sobre expresa (columna negra). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 100). La sobre expresión de MtmiPEP171b1 produce una reducción del número de raíces laterales.
FIGURA 3. Efectos del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del MtmiR171b y los genes H A M 1 y H A M 2 (A) o sobre el número de raíces laterales (B) en M . tru n c a tu la .
(A) El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b (columnas de la izquierda), de HAM1 (columnas del centro) o de HAM2 (columnas de la derecha) en una planta de control (columnas blancas) o en una planta tratada por riego durante 5 días y 1 vez por día con el MtmiPEP171b1 a 0,01 pM (columnas gris claro), 0,1 pM (columnas gris oscuro) o 1 pM (columnas negras). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10). La aplicación del MtmiPEP171b1 a diferentes concentraciones induce un aumento de la acumulación del MtmiR171b, así como una disminución de la expresión de los genes HAM1 y HAM2.
(B) El eje de ordenadas indica el número medio de raíces laterales observado en una planta de control (columna blanca) o en una planta tratada por riego con el MtmiPEP171b1 a 0,1 pM durante 5 días y 1 vez al día (columna negra). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 100). La aplicación del MtmiPEP171b1 a 0,1 pM produce una reducción del número de raíces laterales.
(C) El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b (columnas de la izquierda), de HAM1 (columnas del centro) o de HAM2 (columnas de la derecha) en una planta de control (columnas blancas) o en una planta tratada por riego durante 5 días y 1 vez por día con el MtmiPEP171b1 a 0,01 pM (columnas grises), 0,1 pM (columnas gris oscuro) o 1 pM (columnas negras) o con 0,01 pM de un péptido mezclado (LIVSHlYs EKFDCMRKILRI, SEQ ID NO: 428) (columnas gris claro) cuya composición en aminoácidos es idéntica al miPEP171b aunque la secuencia es diferente. La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
FIGURA 4. Efectos del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del pre-MtmiR171b (A) y del MtmiR171b (B) en M . t r u n c a tu la .
El eje de las ordenadas indica la expresión relativa de los precursores de diferentes formas del microARN en las plantas de control (columna de la izquierda) o de las plantas tratadas por riego durante 5 días y 1 vez al día con el MtmiPEP171b1 a 0,01 pM, 0,1 pM, o 1 pM (columna de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 200). La aplicación del MtmiPEP171b1 a diferentes concentraciones produce un aumento de la acumulación del pre-MtmiR171b (A) y del MtmiR171b (B).
FIGURA 5. Efectos de la sobre expresión del MtmiPEP171b1 (A) y los efectos del MtmiPEP171b1 (B) sobre la expresión de diferentes precursores de miARN en M . tru n c a tu la .
El eje de las ordenadas indica la relación de la expresión de los precursores de microARN en las plantas que sobre expresan el MtmiPEP171b1 sobre la expresión de estos mismos precursores de microARN en las raíces de control (A), o la relación de la expresión de precursores de microARN en las plantas tratadas con el MtmiPEP171b1 (0,1pM) sobre la expresión de estos mismos precursores en las raíces de control (B). Los diferentes precursores de microARN ensayados se indican de izquierda a derecha sobre el eje de las abscisas, a saber, pre-MtmiR171b (SEQ ID NO: 246), pre-MtmiR169 (SEQ ID NO: 359), pre-MtmiR169a (SEQ ID NO: 360), pre-MtmiR171a (SEQ ID NO: 361), pre-MtmiR171h (SEQ ID NO: 362), pre-MtmiR393a (SEQ ID NO: 363), pre-MtmiR393b (SEQ ID NO: 364), pre-MtmiR396a (SEQ ID NO: 365) y pre-MtmiR396b (SEQ ID NO: 366). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10). Se constata que el MtmiPEP171b1 produce un efecto solo en la acumulación del MtmiR171b y no sobre los otros miR.
FIGURA 6. Efectos de la traducción del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del MtmiR171b puestos en evidencia en la planta modelo N ic o t ia n a b e n th a m ia n a . El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b en las plantas de tabaco transformadas para que expresen el pri-MtmiR171b (columna blanca) o un pri-MtmiR171b mutado en el que el codón ATG se ha sustituido con el ATT (columna negra). El pri-MtmiR171b mutado es por lo tanto incapaz de producir el MtmiPEP171b1. La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 30). Se constata que la ausencia de la traducción del MtmiPEP171b1 produce una fuerte disminución la acumulación del miR171b.
FIGURA 7. Efectos de la sobre expresión del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del MtmiR171b puestos en evidencia en la planta modelo N ic o t ia n a b e n th a m ia n a .
El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del pre-MtmiR171b en las plantas de tabaco que se han transformado para que expresen el MtmiR171b (columna de la izquierda), el MtmiR171b y el MtmiPEP171b1(columna del centro), o el MtmiR171b y una versión mutada del MtmiORF171b en la que el codón de inicio ATG se ha sustituido por ATT (coluna de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 30). Se constata que la expresión del MtmiPEP171b1 aumenta la expresión del MtmiR171b y este efecto depende de la traducción de la MtmiORF171b en MtmiPEP171b1.
FIGURA 8. Efectos del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del pre-MtmiR171b puestos en evidencia en la planta modelo N ic o t ia n a b e n th a m ia n a .
El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b en las plantas de tabaco transformadas para que expresen el MtmiR171b en los que el MtmiPEP171b1 se pulverizó (0,1 pM) 2 veces, 12h y 30min antes de la toma de muestras (columna de la derecha) o no (columna de la izquierda). La barra de error se corresponde con
el error típico de la media (número de individuos = 6). El péptido MtmiPEP171b1 utilizado por pulverización induce un aumento de la acumulación del MtmiR171b.
FIGURA 9. Efectos del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del pri-miR171b (A), del pre-MtmiR171b (B) y del MtmiR171b (C) puestos en evidencia en la planta modelo N ic o t ia n a b e n th a m ia n a .
El eje de las ordenadas indica la expresión relativa de precursores de diferentes formas de microARN en las plantas de tabaco modificadas para que expresen el MtmiR171b (columna de la izquierda) o modificados para que expresen el MtmiR171b y sobre expresen el MtmiPEP171b1 (columnas de la derecha, fig. 9A) o tratadas con 0,1 pM de miPEP171b1 (Fig. 9B y C). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 30). La sobre expresión del MtmiPEP171b1 o la aplicación del miPEP171b1 aumenta la acumulación del pri-MtmiR171b (A), del pre-MtmiR171b (B) y del MtmiR171b (C).
FIGURA 10. Localización del MtmiPEP171b1 en las células de las hojas de tabaco que se ha modificado para que expresen el MtmiPEP171b1.
Las fotografías representan las células de las hojas de tabaco modificadas para que expresen la proteína GFP solo (cuadro de la derecha) o la proteína GFP fusionada con el MtmiPEP171b1 (cuadro de la derecha). Estas observaciones indican que el MtmiPEP171b1 está localizado en pequeños cuerpos nucleares.
FIGURA 11. Efectos de la expresión del AtmiPEP165a (identificado en A r a b id o p s is th a lia n a sobre la expresión del AtmiR165a (A) y de la expresión de AtmiPEP319a2 (identificado en A r a b id o p s is th a lia n a ) sobre el AtmiR319a (B), puesto en evidencia en la planta modelo de tabaco.
(A) El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del AtmiR165a en las plantas de tabaco modificadas para que expresen el AtmiR165a (columna de la izquierda) o para que expresen el AtmiR165a y el AtmiPEP165a (columna de la derecha).
(B) El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del AtmiR319a en las plantas de tabaco modificadas para que expresen el AtmiR319a (columna de la izquierda) o para que expresen el AtmiR319a y el AtmiPEP319a (columna de la derecha).
La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 30). En los dos casos, se constata que la expresión de la miORF, y por tanto la producción del miPEP, produce un aumento de la acumulación del pre-miR.
FIGURA 12. Efectos del tratamiento con el AtmiPEP165a sobre el crecimiento de las raíces de A r a b id o p s is th a lia n a .
La fotografía presenta dos plantas de la misma edad: una planta de control (planta de la izquierda) y una planta tratada con el AtmiPEP165a (planta de la derecha). El tratamiento con el AtmiPEP165a produce un fenotipo de crecimiento radical muy acelerado en Arabidopsis thaliana. El gráfico muestra la expresión del pre-miR165 en respuesta al tratamiento con dosis crecientes de AtmiPEP165a.
FIGURA 13. Conservación de la secuencia del miPEP8 identificado en la drosófila.
Las secuencias del miPEP8 (SEQ ID NO: 104) se dedujeron a partir de las secuencias de la miORF8 (SEQ ID NO: 208) de 12 especies de drosófila diferentes y se alinearon. Un histograma representa la conservación de cada aminoácido entre las secuencias de la miORF8 en las 12 especies analizadas.
FIGURA 14. Evolución de la masa (kDa) y del punto isoeléctrico (pI) del miPEP8 en las especies de drosófila.
El eje de las ordenadas de la izquierda indica el tamaño del miPEP8 (en kD). El eje de las ordenadas de la derecha indica el punto isoeléctrico del miPEP. El eje de las abscisas indica el origen del miPEP, es decir, la especie de drosófila. Se constata que a pesar de una modificación importante de su tamaño (más de un factor 3), la carga de los miPEP se mantiene muy básica (>9,8) en las 12 especies estudiadas.
FIGURA 15. Efecto de la adición de secuencias sobre la función del miPEP.
Las hojas de tabaco se transformaron par que sobre expresaran el miPEP171b. Estos gráficos muestran que la adición de secuencias (marcador His, HA o GFP) no altera la función del miPEP. El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del pre-MtmiR171b en las plantas de tabaco que se han transformado para que expresen el MtmiR171b (columna de la izquierda), el MtmiR171b y el MtmiPEP171b1. con o sin la adición de marcadores proteicos (columnas de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 6). Se constata que la expresión del MtmiPEP171b1 aumenta la expresión del MtmiR171b y este efecto es independiente de la presencia de marcadores.
FIGURA 16. Expresión del MtmiPEP171b1 en el sistema radical de M e d ic a g o tru n c a tu la .
Las raíces de Medicago truncatula se transformaron para que expresaran fusiones entre la proteína GUS (en azul) y el promotor del miR17b (A, E), el ATG del miPEP171b1 (B, F), el miPEP171b1 completo (C, G) o bien el ATG2 (segundo ATG que se encuentra en el precursor, después del miPEP) (D, H). Se ve bien una expresión del miR en los puntos radicales (A) así como en las raíces laterales (E). Las fusiones transcripcionales (B, F) y traduccionales (C, G) muestran una expresión del miPEP171b en los mismos tejidos, aunque el ATG siguiente no está activo (D, H).
FIGURA 17. Expresión del DmmiPEP8 en las células de D r o s o p h ila m e la n o g a s te r
Las células de Drosophila melanogaster se transfectaron para que sobre expresaran el DmmiPEP8 (OE miPEP8) o bien el miPEP8 en el que los codones de inicio de la traducción estaban mutados ((OE miPEP8 mut). El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del pre-miR8. La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de experimentos independientes = 6). Se constata que la expresión del DmmiPEP8 aumenta la expresión del DmmiR8 y este efecto está unido a la traducción del ARNm.
FIGURA 18. Impacto del DmmiPEP8 sobre la acumulación del DmmiR8 en las células de D . m e la n o g a s te r Las células de Drosophila melanogaster se transfectaron para que sobre expresaran el DmmiR8 nativo (OE miR8) o bien el DmmiR8 en el que los codones de inicio de la traducción estaban mutados (OE miR8 miPEP8 mut). El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del pre-miR8. La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de experimentos independientes = 2). Se constata que la presencia del DmmiPEP8 aumenta la expresión del DmmiR8.
FIGURA 19. Impacto del HsmiPEP155 sobre la acumulación del HsmiR155 en las células de H o m o s a p ie n s Las células HeLa de Homo sapiens se transfectaron para que sobre expresaran el HsmiPEP155 (OE miPEP155). El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del pre-miR155. La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de experimentos independientes = 2). Se constata que la expresión del HsmiPEP155 aumenta la expresión del HsmiR155.
FIGURA 20. Efectos de la traducción del MtmiPEP171bl sobre la expresión del MtmiR171b puestos en evidencia en la planta modelo N ic o t ia n a b e n th a m ia n a .
El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b en las plantas de tabaco que se han transformado para que expresen el pri-MtmiR171b (columna de la izquierda), un pri-miR171b en el que la miORF171b se ha eliminado (columna del centro) o un pri-miR171b mutado en el que el codón ATG se ha sustituido por ATT (columna de la derecha). El pri-primiR171b mutado es por lo tanto incapaz de producir el miPEP171b1. La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 30). Se constata que la ausencia de la traducción del miPEP171b1 produce una fuerte disminución la acumulación del miR171b.
FIGURA 21. Efectos de la sobre expresión del MtmiPEP171bl sobre la expresión del MtmiR171b puestos en evidencia en la planta modelo N ic o t ia n a b e n th a m ia n a .
El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b en las plantas de tabaco que se han transformado con un vector que permita la expresión del miPEP171b y quesea un segundo vector vacío (columna blanca), que sea un vector que permita la expresión del mtmiPEP171b (columna negra de la izquierda), que sea un vector en el que el codón de la ORF que codifica el mtmiPEP171b se ha sustituido por ATT (columna negra del centro), que sea un vector en el que la secuencia de nucleótidos de la ORF se ha mutado sin modificar la secuencia de aminoácidos del péptido traducido (miPEP codificado por una ORF degenerada) (columna negra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 30). Se constata que la expresión del MtmiPEP171b1 aumenta la expresión del MtmiR171b y este efecto depende de la traducción de la MtmiORF171b en MtmiPEP171b1.
FIGURA 22. Efectos del AtmiPEP165a sobre la acumulación del AtmiR165a y de sus genes diana (P H A V O L U T A : P H V , P H A B O L U S A : P H B y R E V O L U T A : R E V ).
El eje de las ordenadas indica la expresión relativa de AtmiR165a, PHV, PHB y REV en las raíces de Arabidopsis thaliana tratadas con agua (control) o diferentes concentraciones de AtmiPEP165a 0,01 pM, 0,1 pM, 1 pM, o 10 pM). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
El tratamiento de las plantas con concentraciones más y más importantes de AtmiPEP165a pone en evidencia un efecto dependiente de la dosis de la acumulación del AtmiR165a y de la regulación negativa de sus genes diana en función de la cantidad de AtmiPEP165a.
FIGURA 23. Efectos de un tratamiento con el AtmiPEP164a sobre la expresión del AtmiR164a en A . th a lia n a .
Las fotografías representan los resultados de un análisis mediante transferencia de Northern de la acumulación del AtmiR164a en las raíces tratadas con agua (control, fotografía de la izquierda) o con 0,1 pM de un péptido sintético, que tiene una secuencia idéntica a la del AtmiPEP164a, disuelto en agua (0,1 pM miPEP164a). El ARN U6 se utiliza como control de carga que permite cuantificar la cantidad de AtmiR164a.
Este experimento se repitió 4 veces de manera independiente y dio resultados similares.
El tratamiento de los brotes de A. thaliana con 0,1 pM de miPEP164a produce un aumento de acumulación del miR164a.
FIGURA 24. Efectos del tratamiento con el AtmiPEP164a sobre el crecimiento de A r a b id o p s is th a lia n a . Las fotografías presentan dos plantas (vistas desde arriba y vistas de perfil) después de 3 semanas de crecimiento, una planta de control regada con agua (A), y una planta regada con una composición de 0,1 pM de péptido sintético correspondiente con el AtmiPEP164a (B). El riego de las plantas de Arabidopsis thaliana con AtmiPEP164a aumenta significativamente el crecimiento de la planta.
FIGURA 25. Efectos de un tratamiento con el AtmiPEP165a sobre la expresión del AtmiR165a en A . th a lia n a .
Las fotografías representan los resultados de un análisis mediante transferencia de Northern de la acumulación
del AtmiR165a en las raíces tratadas con agua (control, fotografía de la izquierda) o con 0,1 pM de un péptido sintético, que tiene una secuencia idéntica a la del AtmiPEP165a, disuelto en agua (0,1 pM miPEP165a). El ARN U6 se utiliza como control de carga que permite cuantificar la cantidad de AtmiR165a.
Este experimento se repitió 4 veces de manera independiente y dio resultados similares.
El tratamiento de los brotes de A. thaliana con 0,1 pM de miPEP165a produce un aumento de acumulación del miR165a.
FIGURA 26. Efectos de la sobre expresión del AtmiPEP319a1 sobre la expresión del AtmiR319a en A . th a lia n a .
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del AtmiR319a en una planta de control (columna de la izquierda) o en una planta en la que se sobre expresa AtmiPEP319a1 (columna de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10). La sobre expresión del AtmiPEP319a1 induce un aumento de la acumulación del Atmir319a.
FIGURA 27. Efectos del tratamiento con el AtmiPEP319a sobre el crecimiento de A r a b id o p s is th a lia n a . Las fotografías presentan dos plantas (vistas desde arriba y vistas de perfil) después de 3 semanas de crecimiento, una planta de control regada con agua (A), y una planta regada con una composición de 0,1 pM de péptido sintético correspondiente con el AtmiPEP319a1 (B). El riego de las plantas de Arabidopsis thaliana con AtmiPEP319a1 aumenta significativamente el crecimiento de la planta.
FIGURA 28. Inmunolocalización.
Las raíces de Medicago truncatula se transformaron para que expresaran fusiones entre la proteína GUS (en azul) y el ATG del miPEP171b (PromiR171b-ATG1:GUS) o bien el ATG2 (segundo ATG que se encuentra en el precursor, después del miPEP) (PromiR171b-ATG2:GUS). Se realizó igualmente un marcaje con un anticuerpo anti-miPEP171b (mipEP171b). La inmunolocalización del miPEP171b en las raíces de M. truncatula revelan la presencia del miPEP171b en los sitios de inicio de las raíces laterales, mostrando una co-localización entre el microARN y el miPEP correspondiente.
FIGURA 29. Efectos de la sobre expresión del AtmiPEP160b1 sobre la expresión del AtmiR160b en A . th a lia n a .
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del AtmiR160b en una planta de control (barra de la izquierda) o en una planta en la que se sobre expresa AtmiPEP160b1 (barra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
La sobre expresión del AtmiPEP160b1 produce un aumento de la expresión relativa del AtmiR160b.
FIGURA 30. Efectos del AtmiPEP164a1 sobre la expresión del pri-AtmiR164a.
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del AtmiR164a en una planta de control (barra de la izquierda) o en una planta tratada por riego 1 vez al día con el AtmiPEP164a1 a 0,1 pM (barra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
La adición de AtmiPEP164a1 produce un aumento de la expresión relativa del AtmiR164a.
FIGURA 31. Efectos de la sobre expresión del AtmiPEP319a1 sobre la expresión del AtmiR319a en A . th a lia n a .
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del AtmiR319a en una planta de control (barra de la izquierda) o en una planta en la que se sobre expresa AtmiPEP319a1 (barra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
La sobre expresión del AtmiPEP319a1 produce un aumento de la expresión relativa del AtmiR319a.
FIGURA 32. Efectos de la sobre expresión del MtmiPEP169d sobre la expresión del MtmiR169d en M . t ru n c a tu la .
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR169d en una planta de control (barra de la izquierda) o en una planta tratada por riego 1 vez al día con el MtmiPEP169d a 0,1 pM (barra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
La adición de MtmiPEP169d produce un aumento de la expresión relativa del MtmiR169d.
FIGURA 33. Efectos de la sobre expresión del MtmiPEP171e sobre la expresión del MtmiR171e en M . t ru n c a tu la
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171e en una planta de control (barra de la izquierda) o en una planta en la que se sobre expresa MtmiPEP171e (barra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
La sobre expresión del MtmiPEP171e produce un aumento de la expresión relativa del MtmiR171e.
FIGURA 34. Localización del MtmiPEP171b1 en una planta de M . t r u n c a tu la silvestre.
Se analizaron diferentes cantidades de péptidos sintéticos MtmiPEP171b1 (1, 0,5, o 0,1 nmol) y un extracto total de raíces de M. truncatula por inmunotransferencia con un anticuerpo específico del MtmiPEP171b1.
El MtmiPEP171b1 se produce naturalmente en las raíces de M. truncatula.
FIGURA 35. Presencia del AtmiPEP165a en una planta de A . th a lia n a silvestre.
La fotografía de arriba corresponde a un análisis por transferencia de western de la cantidad de AtmiPEP165a en una planta joven de A. thaliana silvestre Col-0 (izquierda) y una planta joven de A. thaliana que sobre expresa AtmiPEP165a (derecha).
La fotografía de abajo corresponde al análisis por transferencia de western de la cantidad de una proteína de control, la tubulina, en una planta joven de A. thaliana silvestre Col-0 (izquierda) y una planta joven de A. thaliana que sobre expresa AtmiPEP165a (derecha).
El AtmiPEP165a se produce naturalmente en A. thaliana y está presente en mayor cantidad en las plantas que sobre expresan AtmiPEP165a.
FIGURA 36. Modo de acción del AtmiPEP165a en A . th a lia n a .
(A) El eje de ordenadas indica la expresión relativa del miR165a en las raíces de control (barra de la izquierda) o tratadas por riego 1 vez al día con el AtmiPEP165a a 10 pM (barra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
La adición de AtmiPEP165a produce un aumento de la expresión relativa del AtmiR165a.
(B) El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del pri-miR165a, en presencia de cordicepina (inhibidor de la síntesis de ARN), en las raíces de control (curva gris) o tratadas por riego 1 vez al día con el AtmiPEP165a a 10 pM (curva negra). El eje de abscisas indica la duración del tratamiento con cordicepina. La adición de AtmiPEP165a no produce una mayor estabilidad del pri-miR165a.
(C) El eje de las ordenadas indica la expresión relativa del pri-miR165a, en las plantas silvestres (Col-0) o mutadas con un alelo débil de la segunda subunidad grande de la ARN polimerasa II (nrpb2-3). El eje de abscisas indica si las plantas se han regado con agua o con el AtmiPEP165a a 10 pM.
Las plantas mutadas, contrariamente a las plantas silvestres, no son capaces de acumular el AtmiR165a en respuesta al AtmiPEP165a.
FIGURA 37. Efectos del pri-miR171b sobre el número de raíces laterales en M . t ru n c a tu la .
El eje de ordenadas indica el número medio de raíces laterales observados en una planta de control (barra blanca) o en una planta en la que se sobre expresa pri-miR171b (barra negra). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 100).
La sobre expresión del pri-miR171b produce una reducción del número de raíces laterales.
FIGURA 38. Posibilidad de traducción del DmmiPEP8 en las células de D r o s o p h ila m e la n o g a s te r .
Las células de Drosophila melanogaster se transfectaron para que sobre expresaran el DmmiPEP8 (miPEP8::GF) o bien el DmmiPEP8 mt (en el que los codones de inicio de la traducción estaban mutados(miPEP8 mt::GFP)). Como control de la transfección, se cotransfectó un plásmido que producía la proteína moesina-RFP (imágenes de abajo) con los plásmidos codificantes de los DmmiPEP8 (imagen de la izquierda) y DmmiPEP 8 mt (imagen de la derecha). Se constata que los codones de inicio presentes en la secuencia de DmmiPEP8 son funcionales ya que permiten la síntesis de la GFP (imagen de arriba a la izquierda) mientras que las construcciones mutadas en los ATG no producen casi nada de GFP (imagen de arriba a la derecha).
Estos resultados sugieren por tanto que la ORF del miPEP es funcional.
Ejemplos
A: Análisis de los miPEP en las plantas
Ejemplo 1 - Caracterización en la planta modelo M e d ic a d o t ru n c a tu la
Ejemplo 1A - MtmiPEP171b1
a) Identificación y caracterización del MtmiPEP171b1 (miPEP171b1 identificado en Medicago truncatula)
El microARN MtmiR171b se expresa en la región meristemática de las raíces. La sobre expresión de este microARN conduce principalmente a una reducción de la expresión de los genes HAM1 (n° de acceso MtGI9-TC114268) y HAM2 (n° de acceso MtGI9-TC120850) (Figura 1A), así como una reducción del número de raíces laterales (Figura 1B). La sobre expresión del pri-miR171b produce igualmente una reducción del número de raíces laterales (Figura 37).
La secuencia de la transcripción primaria del MtmiR171b se determinó utilizando la técnica RACE-PCR. El análisis de la secuencia de la transcripción primaria ha permitido identificar la presencia de varias pequeñas fases de lectura abierta (ORF) completamente inesperadas. Estas ORF se han denominado miORF por "ORF de microARN". Estas miORF codifican potencialmente péptidos cortos, de aproximadamente 4 a 100 aminoácidos. No se ha encontrado ninguna homología significativa respecto a estas miORF en las bases de datos.
La sobre expresión de la primera miORF, llamada MtmiORF171b, da lugar a un aumento de la acumulación del MtmiR171b y una reducción de la expresión de los genes HAM1 y HAM2 (ver Figura 2A), así como una reducción del número de raíces laterales (Figura 2B), como la que se había observado cuando la sobre expresión del MtmiR171b.
Para determinar si la MtmiORF171b da lugar a la producción real de un péptido y si la función de regulación observada
anteriormente se lleva a cabo por dicho péptido, se aplicó un péptido sintético, en el que la secuencia era idéntica a la codificada potencialmente por la MtmiORF171b, se aplicó en las raíces del Medicago truncatula. La aplicación de este péptido produce el fenotipo ya observado anteriormente con la sobre expresión del MtmiORF171b, es decir, que produce un aumento de la acumulación del MtmiR171b y una reducción de la expresión de los genes HAM1 y HAM2 (ver Figura 3A), así como una reducción del número de raíces laterales (Figura 3B).
Los resultados de estos experimentos demuestran que la MtmiORF171b codifica un péptido capaz de modular la acumulación del MtmiR171b y la expresión de genes diana del MtmiR171b: HAM1 y HAM2. Dicho péptido se denominó MtmiPEP171b1 ("miPEP" correspondiente a un PÉPtido codificado por un microARN).
Por otra parte, el MtPEP171b1 produce un aumento de la acumulación del MtmiR171b (Figura 4A) y del pre-MtmiR171b (Figura 4B).
b) Especificidad del miPEP171b1
Se determinó y comparó la expresión de diferentes microARN de Medicago truncatula (MtmiR171b SEQ ID NO: 319, MtmiR169 (SEQ ID NO: 367, MtmiR169a (SEQ ID NO: 368, MtmiR171a (SEQ ID NO: 369, MtmiR171h (SEQ ID NO: 370, MtmiR393a (SEQ ID NO: 371, MtmiR393b (SEQ ID NO: 372, MtmiR396a (SEQ ID NO: 373 y MtmiR396b (SEQ ID NO: 374) entre plantas de control y plantas en las que se sobre expresa la MtmiORF171b que codifica el MtmiPEP171b1 (Figura 5A), o entre plantas de control y plantas cultivadas en un medio de cultivo que contenía el MtmiPEP171b1 (Figura 5B).
Los resultados obtenidos indican que el MtmiPEP171b1 solo produce un aumento de la acumulación del MtmiR171b y no en otros miR, lo que indica que un miPEP solo tiene efecto sobre el microARN del que procede.
c) Localización del miPEP171b1
Por otra parte, La inmunolocalización del miPEP171b1 en las raíces de M. truncatula revelan la presencia del miPEP171b1 en los sitios de inicio de las raíces laterales, mostrando una co-localización entre el microARN y el miPEP correspondiente (Figuras 28 y 34).
Ejemplo 1B - MtmiPEP169d
En referencia al MtmiPEP169d, se ha demostrado in vivo en M. truncatula que la adición de MtmiPEP169d produce una acumulación del MtmiR169d (Figura 32).
Ejemplo 1C - MtmiPEP171e
En referencia al MtmiPEP171e, se ha demostrado in vivo en M. truncatula que la sobre expresión de este miPEP produce una acumulación del MtmiR171e (Figura 33).
Ejemplo 2 - Caracterización en la planta modelo del tabaco
a) Conservación del mecanismo en el tabaco
Para determinar si el mecanismo de regulación de los microARN se conserva en otras especies de plantas, se ensayó la regulación delMtmiR171b por el MtmiPEP171b1 en un modelo celular diferente. Para esto, se introdujeron el MtmiR171b y el MtmiPEP171b1 en las hojas de tabaco.
La acumulación del MtmiR171b se midió en las hojas de tabaco transformadas para que expresen el MtmiR171b de Medicago truncatula a partir del pri-miR silvestre capaz de producir el MtmiPEP171b1 o a partir de una versión mutada del pri-miR incapaz de producir el MtmiPEP171b1 (en la que el codón de inicio ATG de la MtmiORF171b se ha sustituido por ATT) (Figura 6 y Figura 20). La ausencia de traducción del MtmiPEP171b1 da lugar a una fuerte disminución de la acumulación del MtmiR171b.
La acumulación del pre-MtmiR171b se ha medido en las hojas de tabaco transformadas para que expresen el MtmiR171b de Medicago truncatula solo (control), o que expresen además la MtmiORF171b silvestre de Medicago truncatula (35SmiPEP171b1 ATG), o una versión mutada de MtmiORF171b en la que el codón de inicio ATG se ha sustituido por ATT (35SmiPEP171b1 ATT) (Figura 7 y Figura 21). La expresión de MtmiORF171b produce un aumento de la acumulación del pre-miR171b, y esta acumulación del pre-miR171b depende de la traducción de la MtmiORF171b en micropéptido.
Igualmente, en las hojas de tabaco transformadas para que expresen el MtmiR171b de Medicago truncatula, tratadas o no por pulverización con el MtmiPEP171b1 (0,1 pM) una primara vez 12h antes de la toma de muestras y luego una segunda vez 30 minutos antes de la toma de muestras, se ha observado que el MtmiPEP171b1 puede utilizarse directamente en forma de péptido por medio de pulverizaciones foliares (Figura 8).
Por otra parte, se ha observado en el tabaco (como en Medicago truncatula) que el MtmiPEP171b1 produce un aumento de la acumulación de mtmiR171b (Figura 9A)
y del MtmiR171b (Figura 9B), pero disminuye la acumulación del pri-MtmiR171b (Figura 9C).
El conjunto de estos resultados indica que el mecanismo de regulación de los microARN y de sus genes diana bajo el control de los miPEP está conservado entre especies.
b) Localización intracelular del MtmiPEP171b1
Las hojas de tabaco se transformaron para que sobre expresaran el MtmiPEP171b1 de Medicago truncatula fusionado con una proteína fluorescente (GFP) (Figura 10). Los resultados obtenidos indican que el miPEP está localizado en pequeños cuerpos nucleares.
c) Identificación de los miPEP a partir de bases de datos
A partir de las bases de datos genómicas de plantas, se ha investigado la presencia de fases de lectura abierta en el seno de las trascripciones primarias de 70 miR, los inventores han identificado 101 miORF susceptibles de codificar un miPEP.
A día de hoy, los AtmiPEP165a y AtmiPEP319a2, identificados en Arabidopsis thaliana, ya se han caracterizado. Los experimentos realizados en la planta modelo de tabaco han permitido demostrar que la sobre expresión de AtmiORF165a o de AtmiORF319a produce respectivamente un aumento de la acumulación de AtmiR165a o del AtmiR319a (Figura 11).
el miR165a regula factores de transcripción como Revoluta, Phavoluta et Phabulosa. El miR319 regula genes de la familia TCP.
Ejemplo 3 - Caracterización en la planta modelo Arabidopsis thaliana
Ejemplo 3A - AtmiPEP165a
En referencia al AtmiPEP165a, Se ha demostrado in vivo en Arabidopsis thaliana que el tratamiento con el AtmiPEP165a produce un fenotipo de crecimiento radical muy acelerado (Figura 12).
Por otra parte, el tratamiento de las plantas con concentraciones más y más importantes de miPEP165a indica un efecto dependiente de la dosis de la acumulación del miR165a y de la regulación negativa de sus genes diana (PHAVOLUTA: PHV, PHABOLUSA: PHB y REVOLUTA: REV) en función de la cantidad de miPEP165A (véase la Figura 22).
Ejemplo 3B - AtmiPEP164a
En referencia al AtmiPEP164a, se ha sintetizado y se ha utilizado para investigar un aumento de la acumulación del miR164a en las raíces de A. thaliana tratadas con el péptido sintético.
Los análisis por transferencia de Northern indican que el tratamiento de la planta con el péptido miPEP164a produce un aumento de la acumulación del miR164a (Figura 23).
El mismo tipo de resultados se obtuvo por qRT-PCR (Figura 30).
Igualmente se ha demostrado in vivo en Arabidopsis thaliana que el tratamiento de la planta con el AtmiPEP164a aumenta significativamente el crecimiento de la planta (Figura 24).
Ejemplo 3C - AtmiPEP165a
En referencia al AtmiPEP165a, se ha sintetizado y se ha utilizado para investigar un aumento de la acumulación del miR165a en las raíces de A. thaliana tratadas con el péptido sintético.
Los análisis por transferencia de Northern indican que el tratamiento de la planta con el péptido miPEP165a produce un aumento de la acumulación del miR165a (Figura 25).
Por otra parte, para determinar el modo de acción de los miPEP con respecto a la acumulación de sus propios miR, la expresión del pri-miR165a se ha analizado en plantas silvestres y en plantas transformadas para que sobre expresen el miPEP165a (Figura 35).
La expresión del pri-miR165a está favorecida en las plantas que sobre expresan el miPEP165a (Figura 36A).
En presencia de cordicepina, un inhibidor de la síntesis de ARN, la cantidad de pri-miR165a es idéntica en las plantas silvestres y en las plantas transformadas (Figura 36B), lo que indica que el miPEP165a no actúa como un estabilizador del ARN, sino más bien como un activador transcripcional del pri-miR165a.
Además, la expresión del pri-miR165a se analizó en plantas silvestres (Col-0) y en las plantas mutadas con un alelo débil de la segunda subunidad grande de la ARN polimerasa II (plantas nrpb2-3). Los resultados obtenidos indican
que las plantas mutadas no presentan un aumento de la acumulación del pri-miR165 en respuesta al miPEP165a, contrariamente a las plantas silvestres. Esto parece indicar que el miPEP actúa como un regulador transcripcional.
Ejemplo 3D - AtmiPEP319a1
En referencia al AtmiPEP319a1, se ha sintetizado y se ha utilizado para investigar un aumento de la acumulación del miR319a en las raíces de A. thaliana tratadas con el péptido sintético.
Los análisis por qRT-PCR indican que la sobre expresión del AtmiPEP319a1 produce un aumento de la acumulación del miR319a (Figuras 26 y 31).
Igualmente se ha demostrado in vivo en Arabidopsis thaliana que el tratamiento de la planta con el AtmiPEP319a1 aumenta significativamente el crecimiento de la planta (Figura 27).
Ejemplo 3E - AtmiPEP160b1
En referencia al AtmiPEP160b1, se ha demostrado in vivo en A. thaliana que la sobre expresión de este miPEP produce una acumulación del AtmiR160b (Figura 29).
Materiales y procedimientos
Material biológico
La superficie de granos de M. truncatula se esterilizaron y se dejaron germinar sobre placas de agar durante 5 días a 4 °C en oscuridad. Las plántulas se cultivaron enseguida sobre placas cuadradas de 12 cm rellenas de medio de Fahraeus sin nitrógeno y que contenían fosfato 7,5 pM (Lauresergues y col., Plant J., 72(3):512-22, 2012). Se hizo el recuento de las raíces laterales cada día. En los tiestos, las plantas se regaron cada dos días con medio Long Ashton modificado que contenía poco fósforo (Balzergue y col., Journal of experimental botany, (62):1049-1060, 2011).
Los péptidos se sintetizaron en Eurogentec o Smartox-Biotech. El MtmiPEP171b1 se dejó en suspensión en una solución de agua, un 40% de acetonitrilo, un 50% de ácido acético, un 10% (v/v/v), y otros péptidos se dejaron en suspensión en agua.
El riego de las hojas por pulverización con los péptidos se realizó utilizando las soluciones de péptidos a diferentes concentraciones (0,01, 0,1, 1 pM), una primera vez 12h antes de la toma de muestras y luego una segunda vez 30 min antes de la toma de muestras.
Transcripción inversa de los microARN
El ARN se extrajo utilizando el reactivo Tri-Reagent (MRC) según las instrucciones del fabricante, a excepción de la precipitación del ARN que se llevó a cabo con 3 volúmenes de etanol. La transcripción inversa del ARN se llevó a cabo utilizando el cebador específico RTprimerl71b en tallo lazo en combinación con hexámeros para efectuar la transcripción inversa del ARN de alto peso molecular.
En resumen, se añadió 1 pg de ARN al cebador en tallo lazo MIR171b (0,2 pM), el hexámero (500 ng), el tampón RT (IX), la enzima transcriptasa inversa SuperScript (SSIII) (una unidad), los dNTP (0,2 mM de cada), el DDT (0,8 mM) en una mezcla de reacción final de 25 pl. Para efectuar la transcripción inversa, se llevó a cabo una reacción de transcripción inversa pulsada (40 repeticiones del siguiente ciclo: 16 °C durante 2 minutos, 42 °C durante un minuto y 50 °C durante un segundo, seguidos por una inactivación final de la transcripción inversa a 85 °C durante 5 minutos).
Análisis por RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR)
El ARN total de las raíces de M. truncatula o de las hojas de tabaco se extrajeron utilizando el kit de extracción RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). La transcripción inversa se realizó utilizando la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen) a partir de 500 ng de ARN total. Se realizaron tres repeticiones (n=3) con dos repeticiones técnicas cada una. Cada experimento se repitió de dos a tres veces. Las amplificaciones por qPCR se realizaron utilizando un termociclador LightCycler 480 System (Roche Diagnostics) según el procedimiento descrito en Lauressergues y col. (Plant J., 72(3):512-22, 2012).
Análisis estadísticos
Los valores medios de la expresión relativa de los genes o de la producción de raíces laterales se analizaron utilizando el ensayo de Student o el ensayo de Kruskal-Wallis. Las barras de error representan la desviación típica de la media (SEM, Error Típico de la Media). Los asteriscos indican una diferencia significativa (p<0,05).
Construcciones plasmídicas
Los fragmentos de ADN de interés se amplificaron con la polimerasa Pfu (Promega). Los fragmentos de ADN se clonaron con ayuda de las enzimas XhoI y NotI en un plásmido pPEX-DsRED para la sobre expresión bajo el control del promotor fuerte constitutivo 35S, y la ayuda de las enzimas KpnI-NcoI en un plásmido pPEX GUS para los genes
indicadores, según el procedimiento descrito en Combier y col. (Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008).
Para los miPEP 165a y 319a, las miORF correspondientes se clonaron en el pBIN19 según el procedimiento descrito en Combier y col. (Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008).
Transformación de las plantas
Las plantas compuestas poseen raíces transformadas con Agrobacterium rhizogenes se obtuvieron por el procedimiento descrito en Boisson-Dernier y col. (Mol Plant-Microbe Interact, 18:1269-1276, 2005). Las raíces transformadas se verificaron y seleccionaron mediante la observación del DsRED con una lupa binocular fluorescente. Las raíces de control que se corresponden con las raíces transformadas con A. Rhizogenes no contenían el vector pPEXDsRED. La transformación de las hojas de tabaco se llevó a cabo según el procedimiento descrito en Combier y col. (Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008).
Transferencia de Northern
El análisis por transferencia de Northern se llevó a cabo según el protocolo descrito por Lauressergues y col. Plant J, 72(3):512-22, 2012.
Las muestras biológicas se homogeneizaron en un tampón que contenía 0,1 M de NaCl, un 2 % de SDS, 50 mM de Tris-HCl (pH 9), 10 mM de EDTA (pH 8) y 20 mM de mercaptoetanol, y se extrajo el ARN 2 veces con una mezcla de fenol/cloroformo y se precipitó en etanol.
El ARN se cargó sobre gel PAGE al 15% y se transfirió sobre una membrana de nylon (HybondNX, Amersham). El ARN se hibridó con una sonda de oligonucleótidos, se marcó de manera radioactiva en su extremidad, para detectar el ARN U6 o para el miR164a.
Las hibridaciones se llevaron a cabo a 55 °C. Las señales de hibridación se cuantificaron utilizando un phosphoroimager (Fuji) y se normalizaron con la señal de la sonda específica del ARN U6.
Estabilidad del ARN
Para cada condición, las plantas con una edad de 2 semanas y cultivadas verticalmente sobre medio MS sólido se transfirieron en placas de 6 pocillos que contenían 1 ml de medio MS líquido. Después de 16 horas de incubación con 1 mM de miPEP, las plantas se trataron con 100 pg/ml de cordicepina o con agua (utilizada como control), y se recolectaron a diferentes momentos para extraer y cuantificar el ARN. Cada experimento se llevó a cabo 3 veces.
Marcado histoquímico
El marcado con GUS se llevó a cabo según el procedimiento descrito en Combier y col., (Genes & Dev, 22: 1549 1559, 2008). Las muestras se observaron con un microscopio (axiozoom).
Inmunolocalización
Las raíces o las plántulas de tejido de Medicago se fijaron durante 2 horas en un 4 % de formol (v/v) con 50 mM de tampón de fosfato (pH 7,2), y después se incluyeron en agarosa LMP al 5 % en agua (por debajo del punto de fusión). Se obtuvieron cortes finos (100 um) y se colocaron en Pbi (tampón de fosfato para inmunología) sobre láminas revestidas de teflón, se bloquearon en Pbi, un 2 % de Tween y un 1 % de albúmina sérica bovina durante 2 horas (PbiTBSA), y después se marcaron durante una noche (12 h) a 4 °C con el anticuerpo primario diluido en BSA-PbiT. Los cortes se lavaron con pBiT y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h con un anticuerpo secundario diluido en PbiT-BSA. Las láminas se lavaron a continuación en Pbi durante 30 min y se montaron en un citifluor (medio de montaje). Los anticuerpos primarios y las diluciones eran los siguientes: 1716a (1:500, v/v). El anticuerpo secundario era un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo acoplado a la sonda fluorescente Alexa Fluor 633 (Molecular Probes), y se utilizó a una dilución de 1:1000 (v/v).
Transferencia de Western
Se obtuvo un extracto total de proteínas según el procedimiento descrito en Combier y col., (Genes & Dev, 22: 1549 1559, 2008) y se separó por s DS-PAGE. La transferencia se llevó a cabo en un tampón de fosfato durante una noche a 4 °C, a 15V, y después se incubó la membrana durante 45 min a temperatura ambiente en una solución de glutaraldehído al 0,2 % (v/v). Los anticuerpos primarios se utilizaron a una dilución de 1: 1000 (v/v) y los anticuerpos de cabra anti-IgG de conejo conjugados con HRP se utilizaron como anticuerpos secundarios a una dilución de 1: 40.000 (v/v).
Tabla 8. Lista de cebadores
continuación
continuación
B: Análisis de los miPEP en los animales
Ejemplo 4 - Identificación de miPEP candidatos en la drosófila
a) Identificación de miPEP candidatos
Un primer estudio realizado por RACE-PCR en el modelo animal Drosophila melanogaster muestra la existencia de miR que se expresan a lo largo de la embriogénesis, miR1 y miR8.
Como en las plantas, se ha identificado miORF en cada uno de los dos miR estudiados. Por ejemplo, el miR8, conocido por su papel en la regulación del crecimiento de insectos, presenta una miORF que potencialmente codifica el miPEP8. El DmmiR1 (identificado en Drosophila melanogaster) presenta por su parte dos DmmiORF que potencialmente codifican el DmmiPEP1a y el DmmiPEP1b.
Un análisis filogenético muestra la conservación evolutiva de la presencia de las miORF a través de una docena de especies de drosófila analizadas, es decir desde su divergencia hace más de 60 millones de años (Figura 13).
Los miPEP identificados en la drosófila presentan además muchas similitudes con los miPEP de plantas. Si su secuencia primaria y por tanto su tamaño evolucionan rápidamente entre especies, se encuentra un tamaño reducido (de 32 a 104 aa), así como una fuerte conservación por una carga global básica (pHi de 9,5 a 12) (Figura 14).
El conjunto de estos resultados indica por tanto la existencia de miPEP reguladores, codificados por las transcripciones primarias de los microARN, a través de un gran intervalo de especies eucariotas. Estos péptidos descubiertos representan un depósito aún sin explorar de moléculas naturales, susceptibles de regular una variedad de funciones biológicas fundamentales, también tanto en los vegetales como en los animales.
b) Expresión de los miPEP
Unas células de Drosophila melanogaster se transfectaron para que sobre expresaran el DmmiPEP8 (a partir de la SEQ ID NO: 494) o bien el DmmiPEP8 mt en el que los codones de inicio de la traducción se han mutado (a partir de la secuencia SEQ ID NO: 495). Como control de la transfección, se cotransfectó un plásmido que producía la proteína moesina-RFP con los plásmidos codificantes de los DmmiPEP8 y DmmiPEP 8 mt. Se constata que los codones de inicio presentes en la secuencia de DmmiPEP8 son funcionales ya que permiten la síntesis de una proteína de fusión miPEP-GFP visualizada por la GFP mientras que las construcciones mutadas en los ATG no producen casi nada de GFP.
Estos resultados sugieren por tanto que la ORF del miPEP es funcional (Figura 38).
Materiales y procedimientos
Células de Drosophila melanogaster
Las células S2 se cultivan en un matraz T75 en 12 ml de medio de Schneider (GIBCO), que contenía un 1 % de penicilina, 100U/ml de estreptavidina a 100 mg/ml (Sigma) y un 10 % de suero bovino fetal sin complemento (30' a 56 °C).
Se llevan a cabo transfecciones transitorias con la ayuda de un kit de transfección FuGENE® HD (Roche), según sus recomendaciones. Clásicamente, se transfectaron 1,5 millones de células S2, previamente sembradas en placas de 6 pocillos (3 ml de medio por pocillo), con 250 ng de ADN plasmídico total. El ADN se pone en contacto con el Fugene (3 pl) en 100 pl de OPTIMEM (GIBCO). Después de 20 minutos, el reactivo de transfección se pone en contacto con las células en el medio de cultivo. El ARN de las células se extrae 66h después de la transfección.
Clonación de los fragmentos codificantes de DmmiPEP8 y DmmiPEP8. mutado
Los fragmentos de ADN correspondientes a las secuencias del DmmiPEP8 (SEQ ID NO: 494) y del DmmiPEP8 mutado en los codones de inicio (SEQ ID NO: 495) se amplificaron por PCR para clonarse en fase con la GFP en un plásmido pUAS. Las células de insecto S2 se cotransfectaron con una mezcla de plásmidos (relación 1/1/1, 300 ng en total) que codifican el DmmiPEP8::GFP o su versión mutada DmmiPEP8 mt::GFP, un pACT-GAL4 que permite su sobre expresión por medio del factor de transcripción GAL4 producido bajo el control del promotor de actina y de un vector de expresión que codifica la proteína moesina-RFP utilizada como control de la transfección, esta también se coloca
bajo el control del promotor de activa. 48h después de la transfección, las células se fijaron por adición de formaldehído en el medio de cultivo a un 4 % (p/v) final durante 10 min. Las células se aclararon inmediatamente 2x con PBS 1x y se montaron sobre portaobjetos para observarse el microscopio (Leica SPE).
Tabla 9. Secuencias clonadas
C: Caracterización de los miPEP en el ser humano
Ejemplo 5 - Caracterización del HsmiPEP155
Los fragmentos de ADN de interés (el HsmiPEP155 y el miPEP mutado) se sintetizaron o amplificaron por PCR con la ayuda de los cebadores específicos, después se clonaron con la ayuda de las enzimas Xhol y Notl en un plásmido pUAs que permite su sobre expresión por medio de un factor de transcripción GAL4 en el que la expresión se controla pro un promotor fuerte constitutivo.
Las diferentes construcciones se llevaron a cabo sea por amplificación por PCR sobre el ADN genómico de células HeLa, sea por RT-PCR sobre los ARN totales de células humanas L428. Los fragmentos de PCR amplificados se digieren por las enzimas de restricción HindlIl/EcoRI y después se clonaron en el vector pcDNA3.1. La cepa de Escherichia coli DH5a se electroporó y después se cultivó sobre un medio sólido (2YT+agar+ampicilina). El ADN plasmídico de diferentes clones se preparó de esta manera y se secuenció para su verificación. Las construcciones se prepararon inmediatamente con la ayuda del QIAfilter Plasmid Midi kit (QlAGEN) y se conservaron a -20 °C.
Las células HeLa (línea tumoral establecida, ATCC CCL-2.2) se cultivaron en placas de 6 pocillos en el medio completo [(DMEM (1x)+Glutamax+4,5 g/l de glucosa sin piruvato+lx de Penicilina/Estreptomicina 1 mM de piruvato Na un 10% de suero bovino] y se colocaron en una incubadora a 37 °C y un 5 % de CO2.
Las células se transfectaron cuando tenían un 50 % de confluencia. Al principio del experimento, el medio completo que contenía los antibióticos se remplaza por el medio completo sin antibióticos.
En cada pocillo, se preparó una mezcla A [250 j l de Optimem (+Glutamax) (Gibco) 2 |jg de ADN] y una mezcla B [250 j l de Optimem 4 j l de Lipofectamina 2000 (Invitrogen)], dejándolo 5' a temperatura ambiente. Después la mezcla B se mezcló con la mezcla A gota a gota, y se dejó incubar 25' a temperatura ambiente. La mezcla se depositó entonces en el pocillo, gota a gota. 4-5 horas después, el medio se cambió y se remplazó por medio completo con antibióticos. 48 horas después de la transfección, las células se detuvieron. El medio se aspiró y se eliminó, las células se aclararon con PBS 1x. Entonces es posible almacenar las células a - 20 °C o extraer directamente los ARN totales.
En cada pocillo, los ARN se extraen depositando 1 ml de Tri-Reagent (Euromedex) sobre las células. Se aspiró y vertió varias veces el Tri-reagent con el fin de lisar correctamente las células, y después se transfirieron a un tubo de 1,5 ml. Se añadieron 0,2 ml de cloroformo saturado en agua. Se mezcló por agitado, y después se dejó 2 a 3 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó 5 minuto a 15300rpm y a 4 °C. La fase acuosa se precipitó con 0,5 ml de isopropanol después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente y una centrifugación de 15 minutos a 15300rpm y a 4 °C. El sobrenadante se eliminó y el aglomerado se aclaró con 1 ml de etanol al 70 % y se centrifugó 5 minutos a 15300rpm a 4 °C. De nuevo se eliminó el sobrenadante y el aglomerado se secó unos minutos al aire.
Con el fin de eliminar en el mejor de los casos el ADN genómico potencialmente restante, los ARN se trataron con una DNasa. Para esto, el aglomerado se resuspendíó en 170 pl de agua ultra pura, 20 pl de tampón de DNasa 10x y 10 pl de DNasa libre de RNasa RQ1 y se colocó 30 minutos a 37 °C. Después, se añadieron 20 pl de SDS10 % y 5 pl de
Claims (21)
1. Un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN,
que comprende:
- a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 12 a 303 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
- b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa dicho microARN,
en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa dicho microARN,
en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
2. Un procedimiento de detección e identificación de un miPEP según la reivindicación 1, en el que la modulación de la acumulación de dicho microARN es una disminución o un aumento de la acumulación de dicho microARN, en particular un aumento.
3. Un procedimiento de detección e identificación de un miPEP según la reivindicación 1 o 2, en el que la presencia del péptido en la célula da como resultado:
- la introducción en la célula de un ácido nucleico que codifica dicho péptido, o
- la introducción en la célula de dicho péptido.
4. Un procedimiento de detección e identificación de un miPEP según una de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha fase de lectura abierta de la etapa a) está contenida de la parte 5' o 3' de dicha transcripción primaria del microARN, preferentemente en la parte 5'.
5. Un procedimiento de detección e identificación de un miPEP según una de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho microARN está presente en una célula vegetal nativa o en una célula animal nativa, y en el que dicha célula eucariota utilizada en la etapa b) es una célula vegetal o es una célula animal.
6. Un procedimiento de detección e identificación de un miPEP según la reivindicación 5, en la que dicha célula eucariota utilizada en la etapa b) es una célula vegetal de una planta crucifera, de una planta leguminosa o de una planta solanácea.
7. Un procedimiento de detección e identificación de un miPEP según la reivindicación 5, en el que dicha célula eucariota utilizada en la etapa b) es una célula animal escogida de entre una célula humana o una célula de drosófila.
8. Un miPEP escogido de entre el grupo de péptidos que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 355,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
9. Una molécula de ácido nucleico que codifica un miPEP tal como se define según la reivindicación 8, escogiéndose dicha molécula de ácido nucleico de entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en:
- SEQ ID NO: 105 a SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 356,
- SEQ ID NO: 387 a SEQ ID NO: 399, o
- SEQ ID NO: 425.
10. La utilización de al menos:
- un miPEP tal como se define según la reivindicación 8,
- un ácido nucleico según la reivindicación 9 que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
para modular la expresión de un gen en una célula eucariota vegetal determinada,
siendo capaz dicha célula eucariota vegetal determinada de expresar un microARN, en el que la transcripción primaria
contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica dicho al menos un miPEP y en el que la acumulación es modulada por dicho al menos un miPEP,
siendo regulada la expresión de dicho gen por dicho microARN, escogiéndose dicho miPEP de entre el grupo de péptidos que consiste en:
SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 76, escogiéndose dicho ácido nucleico de entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en:
SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 180,
escogiéndose dicho microARN de entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en:
SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 331.
11. Un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulada por un microARN en una célula eucariota vegetal, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación de un miPEP en dicha célula eucariota, escogiéndose dicho miPEP de entre el grupo de péptidos que consiste en: SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 76
en el que, la acumulación de dicho miPEP en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho miPEP.
12. La utilización de una composición que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define según la reivindicación 8, a excepción de los miPEP de las secuencias de SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 355,
- un ácido nucleico según la reivindicación 9 que codifica dicho miPEP, a excepción de los ácidos nucleicos de las secuencias de SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 356, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
como agente fitofarmacéutico,
- para favorecer el crecimiento y/o el desarrollo de las plantas,
- o para la modificación de los parámetros fisiológicos de semillas vegetales
- o para prevenir o tratar las enfermedades de las plantas,
aplicándose dicha composición por fumigación y formación de una película sobre dichas semillas vegetales.
13. La utilización de una composición según la reivindicación 12 para la modulación de los parámetros fisiológicos de una planta.
14. La utilización de una composición según la reivindicación 13 para la modulación de los parámetros fisiológicos de una planta, escogiéndose dichos parámetros de entre la biomasa, la superficie foliar, la floración y el calibre del fruto.
15. La utilización de una composición según la reivindicación 12 para la modificación de los parámetros fisiológicos de semillas vegetales, escogiéndose dichos parámetros de entre la germinación, la implantación radical y la resistencia al estrés hídrico.
16. La utilización de una composición según la reivindicación 12 para favorecer la resistencia a las enfermedades infecciosas.
17. La utilización de una composición que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define según la reivindicación 8 a excepción de los miPEP de secuencias SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 355,
- un ácido nucleico según la reivindicación 9 que codifica dicho miPEP, a excepción de los ácidos nucleicos de las secuencias de SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 356, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
como un herbicida, para eliminar las plantas o ralentizar su crecimiento, o
como plaguicida para eliminar los organismos perjudiciales para las plantas o susceptibles de clasificarse como tales.
18. La utilización de una composición según la reivindicación 17, en la que dicho plaguicida se escoge de entre el grupo que consiste en: un insecticida, un aracnicida, un limacida, y un rodenticida.
19. La utilización de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18, en la que dicha composición como plaguicida se aplica sobre una planta o sobre un soporte en contacto con la planta.
20. Una composición que comprende en combinación una cantidad de semillas de una planta y una cantidad de un péptido en el que la secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de manera natural en dicha planta,
escogiéndose dicho miPEP de entre el grupo de péptidos que consiste en: SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 76.
21. Una composición según la reivindicación 20, formulándose dicha composición de manera que forme una semilla revestida.
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