ES2316199A1 - Plantas transgenicas atpskp2d, su procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. - Google Patents
Plantas transgenicas atpskp2d, su procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Plantas transgénicas AtPSKP2D, su procedimiento de obtención y sus aplicaciones. La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar nuevas plantas transgénicas capaces de adaptarse a situaciones limitantes del medio ambiente, preferentemente por su capacidad de desarrollar raíces laterales. Se describen plantas transgénicas AtPSKP2D capaces de responder ante situaciones medioambientales que contienen un nuevo material genético que permite el control del desarrollo radicular mediante la expresión de forma específica de genes de interés en las células del periciclo formadoras de las raíces laterales (RLs). Estas técnicas pueden aplicarse a plantas de interés comercial de tal forma que estas plantas transgénicas pueden crecer tanto en medios pobres en nutrientes o en agua, como fertilizadas con una menor concentración de fertilizantes, por lo que representan una importante innovación en el sector agroalimentario.
Description
Plantas transgénicas AtPSKP2D, su procedimiento
de obtención y sus aplicaciones.
La invención tiene una aplicación en el sector
de la agricultura, preferentemente en el desarrollo de plantas
transgénicas. Esta invención describe una herramienta biotecnológica
destinada a modificar el desarrollo radicular de las plantas, y por
lo tanto, su acceso a los nutrientes y el agua en función de las
necesidades.
Las plantas, debido a su carácter sésil,
necesitan adaptarse y responder a los diferentes ambientes en los
que crecen. La arquitectura radicular está directamente relacionada
con la adquisición de nutrientes y agua del suelo, y por lo tanto
con la adaptación de las plantas a los diferentes medioambientes.
Por ello, estos organismos han desarrollado diferentes sistemas
radiculares, que están determinados tanto por el número como por la
longitud y la posición de las raíces laterales (RLs) desarrolladas.
En muchos suelos, la disponibilidad de ciertos nutrientes tales
como el fosfato, el nitrato o el azufre, es un parámetro limitante
para el crecimiento y desarrollo de las plantas. Por ello, estos
organismos han desarrollado diferentes sistemas que les permite
cuantificar los niveles de estos nutrientes y responder tanto a
nivel fisiológico como molecular para obtener estos nutrientes en
caso de déficit. Así, por ejemplo, una deficiencia de fosfato o de
azufre estimula la formación de las raíces laterales, lo que
incrementa la superficie de búsqueda de estos compuestos en el suelo
circundante a la planta (revisado por López-Bucio
et al. 2003, Current Opinión Plant Biology 6:
280-287). Las raíces laterales se forman a partir
de unas células específicas en la raíz principal, llamadas células
del periciclo. Drubovsky y colaboradores (Drubovsky et al.
2001, Planta, 214: 30-36) han determinado que las
células del periciclo adyacentes a los polos del xilema son las
responsables de la formación de los primordios laterales. En un
determinado momento del desarrollo las células del periciclo se
paran en la fase G1 del ciclo celular, manteniéndose en este estado
hasta que se reactiva el proceso de división celular para dar lugar
al primordio lateral (Beckman et al., J Exp Bot. 52:
403-11, 2001). La identificación de genes que se
expresan en los primordios laterales y de mutantes que tienen
alterado el desarrollo de las raíces laterales ha contribuido en
gran medida a comenzar a entender las bases genéticas y moleculares
que gobiernan este proceso (Casimiro et al. 2003, Trends
Plant Science 8: 165-171). Sin embargo, los
mecanismos que controlan el patrón espacio-temporal
de formación de las raíces laterales, así como los mecanismos
desencadenantes que hacen que las células del periciclo paradas en
G1 re-entren en proliferación, son desconocidos
hasta la fecha. Diversos resultados obtenidos del análisis de
mutantes afectados en el desarrollo radicular han indicado que la
hormona auxina y la proteólisis selectiva de proteínas a través de
la ruta de la ubiquitina juega un papel crítico en la formación de
las raíces laterales (Casimiro et al. 2003, Trends Plant
Science 8: 165-171; Gray et al. 2001, Nature.
414: 271-6; Xie Q, et al. 2002, Nature 419:
167-170). Uno de los mutantes más severos en la
respuesta a las auxinas es axr1. El gen AXR1 codifica
una proteína implicada en la modificación postraduccional de Culina1
con la proteína RUB. Culina1 es un componente estructural del
complejo SCF. Este complejo interviene en la modificación de
proteínas dianas con ubiquitina para su posterior degradación a
través del proteosoma. Otro mutante de la respuesta a las auxinas,
tir1, también tiene afectado la formación de RLs. TIR1
codifica para una proteína con motivo-F que forma
parte de un complejo ligasa E3 de ubiquitina que está implicada en
el reclutamiento de proteínas dianas para su degradación (Gray
et al. 2001, Nature, 414: 271-6). Mediante
análisis genético, TIR1 se ha situado por debajo de la
función de AXR1 en el proceso de formación de raíces
laterales. Recientemente, Xie et al. (2002, Nature, 419:
167-170) describieron el gen NAC, que
codifica para un factor de trascripción de la familia
NAM/CUC (Aida M, et al. 1997, Plant Cell. 9:
841-57; Xie Q, et al. 2002, Nature, 419:
167-170), que funciona, aguas abajo de TIR1,
como activador de formación de raíces laterales. La actividad de
NAC1 está también regulada mediante degradación selectiva a través
de la ruta de la ubiquitina, implicando la función de la enzima E3
ligasa SINAT5 (Xie Q, et al. 2002, Nature 419:
167-170). Estos resultados indican que la
degradación de reguladores a través de la ruta de la Ub juega un
papel crítico en la formación de las raíces laterales. Además,
estos datos han sugerido que las células del periciclo que van a dar
lugar a los primordios laterales pueden estar paradas en G1 por la
acción de un represor, y que posiblemente se degrade a través de la
ruta de la Ub para permitir la re-entrada en la
división celular de estas células. Sin embargo, aunque esta
hipótesis es muy atractiva, hasta la fecha no existen evidencias
experimentales que la sustenten.
Como se ha comentado anteriormente, la
activación de genes implicados en la proliferación celular es
necesaria para la activación y posterior desarrollo de los
primordios laterales (Himanen et al. 2002, Plant Cell 14:
2339-2351). Diversos genes de proliferación se
expresan constitutivamente en las células del periciclo, lo que los
ha descartando como posibles candidatos responsables del disparo de
la división celular en las células del periciclo (Mironov et
al. 1997, Prog. Cell Cycle Res. 3: 29-41). Sin
embargo, no se debe descartar la posibilidad de una modificación
postraduccional de las proteínas codificadas por estos genes como el
desencadenante de la reactivación de las células del periciclo.
Debido a la parada de estas células del periciclo en G2, se
especuló que la ciclina mitótica B1;1 pudiera ser el gen
regulador del proceso de formación de las LR. Sin embargo, la
expresión ectópica del gen CYCB1;1 bajo el control del
promotor de la kinasa dependiente de ciclina CDKA, que se
expresa en las células del periciclo, no incrementa la formación de
primordios laterales (Doener, et al. 1996, Nature, 380:
520-523). Estos mismos autores han desarrollado una
patente para el control del crecimiento de las plantas mediante la
expresión de la ciclina B1 (Methods for increasing growth
and yield in plants (CYC1). Doerner, Lamb, Patente USA
6,252,139).
El gen DFL1 pertenece a la familia de
genes moduladores de la respuesta a las auxinas GH3. Mediante el
análisis de un mutante para este gen, se ha observado que DFL1
funciona en el desarrollo del tallo y de las raíces laterales, ya
que dicho mutante genera muchas menos RLs sin afectar a la longitud
de la raíz principal (Nakazawa et al. 2001, Plant J. 25:
213-221; Patente 2002-010786 Lateral
root formation supresor gene. Miki Nakazawa et al.).
En resumen, para una buena adaptación de las
plantas al medio ambiente, el desarrollo de un sistema radicular
óptimo al terreno donde crecen es un proceso crítico para su
supervivencia. Por ello, la manipulación de genes que permita
controlar el sistema radicular es de gran interés agronómico, ya que
se podrían obtener plantas que se adapten mejor a los diferentes
medios ambientes hostiles (secos, pobres en nutrientes, etc). El
incremento del sistema radicular hace que las plantas sean más
eficientes en la captación de nutrientes y del agua, con lo que
podría reducir tanto la cantidad de fertilizantes como de agua de
regadío utilizados en diferentes cultivos. Para poder manipular
genéticamente la arquitectura radicular es necesario conocer que
genes están implicados en el desarrollo de las raíces. Sin embargo,
los mecanismos genéticos y moleculares que determinan tanto el
número como la localización de las RLs son completamente
desconocidos. Asimismo, para evitar efectos secundarios en otras
partes de las plantas, es muy importante disponer de promotores que
permitan expresar de forma muy específica los genes de interés que
controlen el desarrollo radicular.
La presente invención se enfrenta al problema de
proporcionar nuevas plantas transgénicas capaces de adaptarse a
situaciones limitantes del medio ambiente, preferentemente por su
capacidad de desarrollar raíces laterales.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye una planta transgénica AtPSKP2D, en adelante planta
transgénica AtPSKP2D de la presente invención, que contiene una
secuencia de DNA AtPSKP2D que permite la expresión de una proteína
de interés en las células de dicha planta, y que está constituida
por una de las dos posibilidades siguientes:
- a)
- una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y
- b)
- una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de obtención de la planta
transgénica
AtPSPK2D, en adelante procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D de la presente invención, que consiste en la introducción en una planta de la secuencia de DNA AtPSKP2D que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes:
AtPSPK2D, en adelante procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D de la presente invención, que consiste en la introducción en una planta de la secuencia de DNA AtPSKP2D que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes:
- a)
- una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y
- b)
- una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
Las secuencias de DNA, vectores de expresión y
células o microorganismos transformados, desarrollados y necesarios
para la puesta en práctica del procedimiento de obtención de plantas
transgénicas AtPSPK2D de la presente invención, así como su empleo
para la producción de dichas plantas, constituyen aspectos
adicionales de la presente invención.
Finalmente, otro objeto de la presente invención
es el uso de las secuencias de DNA AtPSKP2D, vectores de expresión
AtPSKP2D, células transformadas AtPSKP2D, y del procedimiento
AtPSKP2D de la presente invención para la obtención de plantas
transgénicas AtPSKP2D de interés comercial, entre otras, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención:
arroz, trigo, soja, maíz, tomate, patata, tabaco, judía, melón,
sandia, pepino, fresa, etc, así como diferentes especies frutales
(naranjo, limonero, peral, manzano, etc).
La presente invención se enfrenta al problema de
proporcionar nuevas plantas transgénicas capaces de adaptarse a
situaciones limitantes del medio ambiente, preferentemente por su
capacidad de desarrollar raíces laterales.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que los inventores han observado que es posible obtener
plantas transgénicas capaces de responder ante situaciones
medioambientales porque contienen un nuevo material genético que
permite el control del desarrollo radicular mediante la expresión de
forma específica de genes de interés en la células del periciclo
formadoras de las raíces laterales (RLs). Estas nuevas plantas
transgénicas son plantas potencialmente mejoradas para su
crecimiento tanto en medios pobres en nutrientes o en agua, como
fertilizadas con una menor concentración de fertilizantes, por lo
que representan una importante innovación en el sector
agroalimentario.
En la presente invención se describe la
secuencia de DNA de un nuevo gen, la secuencia del gen AtSKP2D (ver
SEQ ID NO2, entre el nucleótido 501-2014), que
codifica para una proteína con motivo-F, homóloga a
SKP2 de humanos (Zhang, H., et al. 1995, Cell 82:
915-925), la proteína AtSKP2D (SEQ ID NO3) y de su
promotor. Esta familia de proteínas con motivo-F
forman parte de los complejos E3-ligasas del tipo
SCF que están implicados en la proteólisis de proteínas a través de
la ruta de la ubiquitina. Datos recientes mostraron que estas
proteínas con motivo-F, y en concreto AtSKP2A,
juegan un papel importante en el control de la proliferación celular
mediante la proteólisis selectiva de reguladores de la división
celular (del Pozo et al. 2002, Plant Cell. 14:
421-433).
Sin embargo, en la presente invención se ha
observado por primera vez que la expresión del gen AtSKP2D se
induce en la raíz de la planta por tratamiento con las hormonas
auxina y ácido abcísico (ABA) o por estrés salino (ver Figura 2 y
Ejemplo 2). Dicho gen se expresa en parches discretos a lo largo de
la raíz principal, y más concretamente en las células del periciclo
(células a partir de las cuales se desarrrollan las RLs) y con
mayor intensidad en las células próximas al xilema, que son las que
se dividen para dar lugar a un primordio lateral (ver Figura 3 y
Ejemplo 3). Análisis micro-morfológico de estos
puntos de expresión de AtSKP2D han mostrado que en muchos de
ellos aun no se ha producido ninguna división de las células del
periciclo. Esto, junto al hecho de que muchos de estos puntos de
expresión estén muy cercanos al meristemo radicular, donde en
condiciones normales no se forman primordios laterales, sugiere que
estos parches de expresión son futuros puntos de formación de
raíces laterales. Esta hipótesis se en-
cuentra soportada igualmente por lo observado en plantas transgénicas PSKP2D::GUS/axr1 (Figura 4 y Ejemplo 4).
cuentra soportada igualmente por lo observado en plantas transgénicas PSKP2D::GUS/axr1 (Figura 4 y Ejemplo 4).
Además, la invención está dirigida a desarrollar
una secuencia de DNA promotora que permita la expresión génica en
una planta, sino también, de forma preferente y específica, en las
células del periciclo que van a dar lugar a la formación de raíces
laterales para poder así controlar el desarrollo del sistema
radicular, es decir, en las raíces. Por ello, se han llevado a cabo
deleciones de la secuencia de DNA del promotor de AtSKP2D para
hallar el dominio responsable de la expresión en parches a lo largo
de la raíz, identificándose una secuencia de DNA (PSKP2B549) (SEQ
ID NO4) que dirige la expresión tan sólo en las células del
periciclo de los puntos a lo largo de la raíz y no en otras células
de otros órganos.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye una planta transgénica AtPSKP2D, en adelante planta
transgénica AtPSKP2D de la presente invención, que contiene una
secuencia de DNA AtPSKP2D que permite la expresión de una proteína
de interés en las células de dicha planta, y que está constituida
por una de las dos posibilidades siguientes:
- c)
- una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y
- d)
- una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "secuencia de DNA promotora AtPSPK2D" se refiere a una
secuencia de DNA promotora de la expresión génica constituida por
una de las secuencias de DNA pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1),
- b)
- secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
- c)
- un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b),
- d)
- secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y
- e)
- cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica.
El término "secuencia de DNA codificante de
una proteína de interés" tal como se utiliza en la presente
invención se refiere a:
- a)
- una secuencia de DNA codificante de una proteína directamente implicada en la formación y desarrollo de las raíces laterales para manipular la arquitectura radicular, es decir, capaz de modificar la arquitectura radicular de una planta - tanto el número como la posición de las raíces laterales - como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, las secuencias de DNA codificantes de las proteínas pertenecientes al siguiente grupo: la secuencia AtPSKP2D (SEQ ID NO2 codificante de la proteína de SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKB1, AtKRP1, AtKRP2, AtCDT1, AtCDC6 (Vandepoele, et al. Plant Cell 2002, 14: 903-916.), AtAXR1 (Leyser et al. Nature 1993, 364: 161-164), AtECR1 (del Pozo et al. Science 1998, 280:1760-1763), AtTIR1 (Ruegger et al. 1998, Genes Dev. 12: 198-207), AtIAA14 (Fukaki et al. 2002, Plant J. 29: 153-168), AtNAC1 (Xie et al. 2000, Gene Dev. 14: 3024-3036), y
- b)
- una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial e industrial cuya expresión en la planta, y más preferentemente en la raíz, permita su recogida y purificación posterior, como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, perteneciente al siguiente grupo: diferentes tipos de inmunoglobulinas (como por ejemplo IgGs contra la caries), de proteínas de uso médico (como por ejemplo la insulina o la relaxina), de diferentes tipos de fármacos, péptidos antimicrobianos y antifúngicos, y proteínas de interés agroalimentario (como por ejemplo, fitasas, liquenasas, transglutaminasas o glicosiltransferasas).
El término "una secuencia de DNA promotora"
tal como se utiliza en la presente invención se refiere a cualquier
secuencia de DNA promotora capaz de regular la expresión génica en
plantas como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el
alcance de la invención, un promotor fuerte constitutivo, como por
ejemplo el promotor del virus del mosaico 35S, o un promotor que se
exprese en todas las células del periciclo, como por ejemplo el de
la kinasa dependiente de ciclinas del tipo A o del tipo B
(Vandepoele, et al. Plant Cell 2002, 14:
903-916).
El término "secuencia de DNA codificante de
una proteína AtPSKP2D" tal como se utiliza en la presente
invención se refiere a la secuencia de DNA del gen AtPSKP2D (SEQ ID
NO2) codificante de la proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO3), así como
cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye una planta transgénica AtPSKP2D de la presente invención
en la que la secuencia de DNA promotora AtPSPK2D es la secuencia de
DNA PSKP2D (SEQ ID NO1). Una realización particular de esta es la
planta transgénica PSKP2D::GUS, y las plantas
PSKP2B::GUS/axr1-12 y
PSKP2B::GUS/axr1-3, generadas en la presente
invención (ver Ejemplo 1 y 4).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una planta transgénica AtPSKP2D que contiene una
secuencia de DNA AtPSKP2D que permite la expresión de una proteína
de interés de manera específica en las células del periciclo que
van a dar lugar a la formación de raíces laterales y que está
constituida por una de las posibilidades siguientes:
- a)
- secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
- b)
- un fragmento de las secuencias de DNA de a),
- c)
- secuencia de DNA análoga a las secuencias de a) y b), y
- d)
- cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), o c) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica.
Una realización particular de la presente
invención lo constituye una planta transgénica AtPSKP2D de la
presente invención en la que la secuencia de DNA promotora AtPSPK2D
es la secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4). Una realización
particular de esta es la planta transgénica PSKP2D549::GUS, generada
en la presente invención (ver Ejemplo 5).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una planta transgénica AtPSKP2D de la presente
invención en la que la secuencia de DNA codificante de una proteína
de interés es la secuencia de DNA codificante de la proteína
AtPSKP2D (SEQ ID NO2).
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de obtención de la planta
transgénica
AtPSPK2D, en adelante procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D de la presente invención, que consiste en la introducción en una planta de la secuencia de DNA AtPSKP2D que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes:
AtPSPK2D, en adelante procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D de la presente invención, que consiste en la introducción en una planta de la secuencia de DNA AtPSKP2D que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes:
- c)
- una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y
- d)
- una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
Una realización particular de la presente
invención lo constituye un procedimiento de obtención de plantas
transgénicas AtPSPK2D que comprende los siguientes pasos:
- a)
- obtención de un vector de expresión que contiene una secuencia de DNA AtPSPK2D,
- b)
- obtención de microorganismos portadores del vector a), y
- c)
- transformación de las plantas con el vector de a) o con el microorganismo de b).
Las secuencias de DNA, vectores de expresión y
células o microorganismos transformados, desarrollados y necesarios
para la puesta en práctica del procedimiento de obtención de plantas
transgénicas AtPSPK2D de la presente invención, así como su empleo
para la producción de dichas plantas, constituyen aspectos
adicionales de la presente invención.
Así, otro objeto de la presente invención lo
constituye una secuencia de DNA AtPSK2D, en adelante secuencia de
DNA AtPSKP2D de la presente invención, que permite la expresión de
una proteína de interés en las células de planta y que está
constituida por una de las posibilidades siguientes:
- a)
- una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y
- b)
- una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye una secuencia de DNA AtPSK2D de la invención en la que
la secuencia de DNA promotora AtPSKP2D está constituida por una de
las secuencias de DNA pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1),
- b)
- secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
- c)
- un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b),
- d)
- secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y
- e)
- cualquier secuencia de DNA que comprenda una secuencia DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una secuencia de DNA AtPSK2D de la invención en la
que la secuencia de DNA codificante de una proteína de interés está
constituida por una de las siguientes secuencias de DNA:
- a)
- una secuencia de DNA codificante de una proteína directamente implicada en la formación y desarrollo de las raíces laterales para manipular la arquitectura radicular, es decir, capaz de modificar la arquitectura radicular de una planta - tanto el número como la posición de las raíces laterales - como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, las secuencias de DNA codificantes de las proteínas pertenecientes al siguiente grupo: la proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO2 codificante de la proteína de SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKB1, AtKRP1, AtKRP2, AtCDT1, AtCDC6 (Vandepoele, et al. Plant Cell 2002, 14: 903-916.), AtAXR1 (Leyser et al. Nature 1993, 364: 161-164), AtECR1 (del Pozo et al. Science 1998, 280:1760-1763), AtTIR1 (Ruegger et al. 1998, Genes Dev. 12: 198-207), AtIAA14 (Fukaki et al. 2002, Plant J. 29: 153-168) y AtNAC1 (Xie et al. 2000, Gene Dev. 14: 3024-3036), y
- b)
- una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial e industrial cuya expresión en la planta, y más preferentemente en la raíz, permita su recogida y purificación posterior, como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, perteneciente al siguiente grupo: diferentes tipos de inmunoglobulinas (como por ejemplo IgGs contra la caries), de proteínas de uso médico (como por ejemplo la insulina o la relaxina), de diferentes tipos de fármacos, péptidos antimicrobianos y antifúngicos, y proteínas de interés agroalimentario (como por ejemplo, fitasas, liquenasas, transglutaminasas o glicosiltransferasas).
Estas proteínas de interés así como las
secuencias de DNA codificantes de las mismas son conocidas por un
experto en la materia e incluyen igualmente todas aquellas que se
identifiquen en el futuro.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una secuencia de DNA AtPSK2D de la invención en la
que la secuencia de DNA promotora es cualquier secuencia de DNA
promotora capaz de regular la expresión génica en plantas como por
ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
invención, un promotor fuerte constitutivo, como por ejemplo el
promotor del virus del mosaico 35S, o un promotor que se exprese en
todas las células del periciclo, como por ejemplo el de la kinasa
dependiente de ciclinas del tipo A (CDKA) o del tipo B (Vandepoele,
et al. Plant Cell 2002, 14:
903-916)
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una secuencia de DNA AtPSK2D de la invención en la
que la secuencia de DNA codificante de una proteína de interés es la
secuencia de DNA AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de la proteína
de SEQ ID NO3, así como cualquier forma análoga de esta secuencia de
DNA.
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de
nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a las
secuencias de DNA mostradas en la presente invención, por ejemplo,
mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos
conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o
más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera
de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más
nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la
secuencia.
En general, una secuencia de ADN análoga es
sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos comentadas
anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "sustancialmente homóloga" significa que las
secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad,
a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de,
al menos un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
La secuencia de ADN promotora AtPSKP2D (SEQ ID
NO1) y del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) de la invención proceden de
Arabidopsis thaliana y pueden encontrarse en formas homólogas
en otras especies de plantas superiores de interés comercial, entre
otras, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
presente invención: arroz, trigo, soja, maíz, tomate, tabaco,
judía, así como diferentes especies frutales (naranjo, limonero,
etc), donde pueden estar de forma natural o en otro caso, también
podrían estar como resultado de un proceso de transformación génica
en el que el organismo transformado reproduzca dichas moléculas de
ADN. Estas formas homólogas de la secuencia de ADN promotora
AtPSKP2D (SEQ ID NO 1) y del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) de la
invención pueden ser aisladas, mediante técnicas convencionales, a
partir del ADN de cualquier planta que las contengas y mediante el
empleo de sondas o de oligonucleótidos, preparados gracias a la
información de las secuencias de nucleótidos de dichas moléculas de
ADN proporcionadas en esta invención, por cualquier experto en la
materia.
Por otro lado, a partir de las secuencias de DNA
promotoras de la presente invención, AtPSKP2D y PSKP2D549, un
experto en la materia puede fácilmente obtener otras deleciones o
fragmentos que permitan regular la expresión génica específica o no
de órgano, y preferentemente otras secuencias de DNA promotoras de
forma especifica de un gen de interés en la raíz.
La secuencia de DNA AtPSK2D de la invención
puede ser utilizada, en general, en la generación de un vector de
expresión que permite la expresión de estas proteínas en una amplia
gama de células huésped.
Por lo tanto, la invención también se refiere a
un vector de expresión que comprende la secuencia de DNA AtPSKP2D
de la invención, en adelante vector de expresión AtPSKP2D de la
presente invención, y que permite la transformación o transfección
de microorganismos y células y la posterior obtención de las plantas
transgénicas AtPSKP2D de la invención. Como realizaciones
particulares del vector de expresión AtPSKP2D de la invención se han
generado los vectores pBI101-PSKP2D (ver Ejemplo 1)
y el vector pBI101-PSKP2D549 (ver ejemplo 5).
En general, el vector de expresión AtPSKP2D de
la presente invención comprende, al menos, una secuencia de DNA
AtPSKP2D de la invención y, al menos, un promotor que dirige la
transcripción del gen de interés (la secuencia de DNA promotora la
contiene la secuencia de DNA AtPSKP2D), al que está operativamente
enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas para la
transcripción del gen de interés y su regulación adecuada en tiempo
y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de
corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores
transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales
(silencers), etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados
pueden seleccionarse acuerdo con las condiciones y necesidades de
cada caso concreto entre plásmidos de expresión de plantas
(Rothstein et al. (1987) Promoter cassettes,
antibiotic-resistance genes, and vectors for plant
transformation Gene 53:153-61; Potrykus, I. (1991).
Gene transfer to plants: Assessment of published approaches and
results. Annu. Rev. Pl. Physiol. Pl. Mol. Biol. 42,
205-255.), virus ("Plant Virology Protocols"
From Virus Isolation to Transgenic Resistance Edited by: Gary D.
Foster University of Bristol, Bristol, UKPublished: 1998), que
pueden contener, además, un origen bacteriano o de levadura de
replicación para que pueda ser amplificado en bacterias o levaduras,
así como un marcador utilizable para seleccionar las células
transfectadas diferente al gen o genes de interés. Para la
transformación de las plantas se pueden utilizar diferentes métodos
- vectores plasmidicos, liposomas, electroporación, microinyección,
etc - descritos en diversos manuales (ver por ejemplo: (Plant Gene
Transfer and Expression Protocols Jones, Heddwyn University of
Hertfordshire, Hatfield, UK. Human Press Publishers). La elección
del vector dependerá de la célula hospedadora y de la planta en la
que se va a introducir posteriormente.
Otro objeto de la invención lo constituye un
microorganismo o célula, en adelante célula AtPSKP2D de la
invención, que contiene la secuencia de DNA AtPSKP2D o el vector de
expresión AtPSKP2D de la invención.
Finalmente, otro objeto de la presente invención
es el uso de las secuencias de DNA AtPSKP2D, vectores de expresión
AtPSKP2D, células transformadas AtPSKP2D, y del procedimiento
AtPSKP2D de la presente invención para la obtención de plantas
transgénicas AtPSKP2D de interés comercial, entre otras, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención:
arroz, trigo, soja, maíz, tomate, patata, tabaco, judía, melón,
sandia, pepino, fresa, etc, así como diferentes especies frutales
(naranjo, limonero, peral, manzano, etc).
Figura 1: Expresión del gen GUS mediante la
secuencia de DNA promotora AtPSKP2D. La secuencia de DNA
promotora de AtPSKP2D se fusionó al gen reportador GUS
(pSKP2D::GUS) para analizar el patrón de expresión de dicho
gen. A) Plántulas transgénicas portadoras de la construcción
pSKP2D::GUS de 6 días teñidas para actividad GUS. B)
Actividad GUS en cotiledones (detalle del tejido vascular y de los
estomas). C) Actividad GUS en flores jóvenes. D) Actividad GUS en
una flor madura, mostrando tinción en los sépalos, en los pétalos,
en los estambres y en el carpelo.
Figura 2: La secuencia de DNA promotora
AtPSKP2D induce la expresión de GUS por auxinas, ácido abcísico
(ABA), sal y deficiencia nutricional. A, Control; B, Auxinas;
C, ABA; D, NaCl; E, +PI, con fosfato; F, -PI, sin fosfato.
Figura 3: La secuencia de DNA promotora
AtPSKP2D induce la expresión de GUS en las células del
periciclo. A) Plántulas transgénicas portadoras de la
construcción pSKP2D::GUS de 6 días teñidas para actividad
GUS. B) Detalle de los puntos de tinción a lo largo de la raíz. C)
Corte transversal de unos de los puntos mostrados en B, y más
cercanos al meristemo radicular, que muestra tinción GUS en las
células del periciclo.
Figura 4: La expresión génica de GUS inducida
por La secuencia de DNA promotora AtPSKP2D está disminuida en las
raíces de los mutantes axr1. La construcción
pSKP2D::GUS se introdujo en los mutantes
axr1-3 y axr1-12.
Raíces de las plantas axr1-3/pSKP2D::GUS y
axr1-12/pSKP2D::GUS se tiñeron para actividad
GUS. Como se muestran en las fotografías, los mutantes axr1
(axr1-3 y axr1-12)
desarrollan menos puntos de expresión de GUS a lo largo de la raíz
principal.
Figura 5: Expresión génica de GUS específica
en la raíz inducida por La secuencia de DNA promotora
PSKP2D549. La región promotora que comprende aproximadamente
los primeros 549 pares de bases aguas arriba del ATG del gen
AtSKP2D se fusionó al gen reportador GUS
(pSKP2D549::GUS) para analizar la capacidad y el patrón de
expresión de dicho fragmento de DNA. Plántulas transgénicas
portadoras de la construcción pSKP2D::GUS de 6 días teñidas
para actividad GUS. A) Parte apical de plántulas pSKP2D::GUS y
pSKP2D549::GUS B) Parte distal de las raíces de plántulas
pSKP2D::GUS y pSKP2D549::GUS. C) Parte apical de las raíces de
plántulas pSKP2D::GUS y pSKP2D549::GUS.
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Ejemplo
1
La secuencia de DNA del gen AtSKP2D se
identificó por homología de secuencia al gen codificante de la
proteína de humanos SKP2, que está implicada en el control del
ciclo celular y en el desarrollo de diversos tumores (Zhang, H.,
et al. 1995, Cell 82: 915-925). Para
aislar esta secuencia de DNA AtSKP2D, se diseñaron a partir de la
secuencia anotada en el banco de DNA del genoma de Arabidopsis
(http://www.arabidopsis.org) los cebadores de la región codificante
del cDNA de dicho gen (P3: 5' ATGGTGAGTGAAGGAGCAAC AAG 3' (SEQ ID
NO5) y P4: 5' TCAATGCGCCGGGTGAGGGTA 3' (SEQ ID NO 6)) y se amplificó
mediante PCR, utilizando una genoteca de flores de Arabidopsis
thaliana como DNA molde. Dicho cDNA se clonó en el vector PCR2.1
(Invitrogen). De dicho clonaje se secuenciaron varios clones
obteniéndose de todos ellos la misma secuencia de DNA, que
correspondía a la secuencia de DNA AtSKP2D (SEQ ID NO2).
Para analizar la capacidad reguladora de la
expresión génica de la secuencia de DNA promotora AtSKP2D a
lo largo del desarrollo de las plantas se han generado plantas
transgénicas que portan la secuencia de DNA del promotor del gen
AtSKP2D capaz de dirigir la expresión del gen reportador GUS.
Para clonar la secuencia de DNA del promotor del gen AtSKP2D
se amplificó un fragmento de 1740 pares de bases, que supuestamente
debería de contener toda la información de expresión del gen
AtSKP2D, mediante PCR utilizando los oligonucleótidos P1:
5'-GAAGATTTGGGGGAAGCTGCCC-3' (SEQ ID
NO7) y P2:
5'-GCTCCTAGGTACTCACCATCCTTGAAGCGG-3'
(SEQ ID NO8). Dichos cebadores se diseñaron a partir de la
secuencia anotada del genoma de Arabidopsis. La secuencia de DNA del
promotor se secuenció resultando una secuencia de DNA de 1740
nucleótidos (SEQ ID NO1). La secuencia de DNA amplificada, SEQ ID
NO1, se clonó en el vector PCR2.1 (Invitrogen) generando el vector
PCR2.1-PSKP2D. Este vector se digirió con las
enzimas de restricción BamHI y SpeI para clonarlo posteriormente en
el vector pBI101 (Clontech), que aporta la secuencia de DNA
codificante del gen GUS utilizado como reportero, generando el
vector pBI101-PSKP2D. El vector
pBI101-PSKP2D se introdujo en la cepa de
Agrobacterium tumefaciens C58C1 mediante choque
térmico (cepa Agrobacterium tumefaciens PSKP2D). Este
Agrobacterium se utilizó para transformar plantas de Arabidopsis
thaliana ecotipo Columbia mediante infiltración (Bechtold et
al. 1993. C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci. 316:
15-18). Las plantas transgénicas portadoras de la
secuencia de DNA del promotor del gen AtSKP2D fusionado al gen
reportero \beta-glucoronidasa (GUS) (Jefferson
et al., 1987. EMBO J. 6: 3901-3907), plantas
transgénicas PSKP2D::GUS, se aislaron mediante resistencia al
antibiótico kanamicina, y representan una realización particular de
la planta transgénica AtPSKP2D de la presente invención.
Estas plantas transgénicas se analizaron
mediante tinción histoquímica de la actividad GUS de acuerdo con el
protocolo descrito por del Pozo et al. (2002, Plant Cell, 14:
421-433). Se identificaron 35 líneas diferentes y
32 de ellas mostraban el mismo patrón de tinción GUS, y de estas,
dos líneas independientes fueron analizadas en más detalle. Un
análisis histoquímico de estas plantas transgénicas ha mostrado que
la secuencia de DNA del promotor AtSKP2D es capaz de dirigir
la expresión del gen reportador GUS a lo largo de la raíz principal
(Figura 1A), en zonas de división celular (meristemos apical y
radicular), en el tejido vascular y en los estomas de las
hojas
(Figura 1).
(Figura 1).
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Ejemplo
2
Diversos factores ambientales (NaCl) u
hormonales (auxina, ABA) son capaces de inducir la expresión génica
a través del promotor AtSKP2D en la raíz. La mayoría de estos
factores están relacionados con el desarrollo del sistema
radicular. Por ejemplo, las auxinas inducen la formación de raíces
laterales; la deficiencia nutricional o de agua (salinidad)
estimula el desarrollo del sistema radicular para incrementar la
superficie de búsqueda de nutrientes o agua en el suelo. Para
analizar como diferentes estímulos que afectan a la formación de las
raíces laterales modifican la expresión a través de la secuencia de
DNA del promotor AtSKP2D, plantas PSKP2D::GUS de 5 días se
trataron con 0.1 \muM 2,4-D (auxina), 1 \muM de
ABA ó 150 mM de sal (NaCl) durante 16 horas. Estas plantas se
tiñeron posteriormente para la actividad GUS tal como se indica en
el Ejemplo 1. Como se observa en la Figura 2 (A, B, C y D), estos
tres estímulos incrementan la expresión de GUS a través del
promotor del gen AtSKP2D.
Además, para analizar el efecto de la
deficiencia nutricional sobre la expresión génica a partir del
promotor AtSKP2D, plantas transgénicas PSKP2D::GUS de 5 días
se crecieron durante 6 días más en un medio MS con (+Pi) o sin
(-Pi) de fosfato. Posteriormente, estas plantas se tiñeron para la
actividad GUS para analizar la expresión génica a partir del
promotor AtSKP2D, que como se observa en la Figura 2 (E y F), se
induce claramente cuando las plantas crecen en un medio deficiente
en nutrientes (-Pi, Figura 2F).
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Ejemplo
3
El desarrollo de la invención se ha centrado en
el análisis histoquímico de las plantas transgénicas PSKP2D::GUS,
que mostró la expresión de este gen GUS en puntos discretos a lo
largo de toda la raíz (Figura 3A y 3B), que se correlacionan con
los puntos de formación de las raíces laterales. Cortes
transversales de estos puntos de expresión con actividad GUS han
mostrado que el promotor del gen AtSKP2D (PSKP2D) dirige la
expresión del gen GUS en las células del periciclo, con mayor
intensidad en las células próximas al xilema, que son las que se
dividen para dar lugar a un primordio lateral (RLs) (Figura 3C).
El análisis micro-morfológico de
estos puntos de expresión del gen GUS en estas plantas transgénicas
han mostrado que en muchos de ellos aun no se ha producido ninguna
división de las células del periciclo. Esto, junto al hecho de que
muchos de estos puntos de expresión estén muy cercanos al meristemo
radicular, donde en condiciones normales no se forman primordios
laterales, sugiere que estos parches de expresión son futuros puntos
de formación de raíces laterales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Para poder determinar si existe una correlación
entre el número de puntos de expresión inducidos por el promotor
AtSKP2D a lo largo de la raíz y la distribución o número de las
raíces laterales, el transgén PSKP2B::GUS se introdujo dentro del
fondo genético axr1 (dentro del alelo débil
axr1-3 y del alelo fuerte
axr1-12). El gen AXR1 codifica para
una enzima implicada en la modificación de AtCUL1, un componente
estructural del complejo SCF de la ruta de la ubiquitina (del Pozo
et al. 2002, Plant Cell, 14: 421-433). Las
plantas mutantes axr1-3 y
axr1-12 presentan una respuesta disminuida a
las auxinas y además la formación de raíces laterales está
disminuida (Lincon et al., 1990 Plant Cell 2:
1071-1080). Así, las plantas transgénicas
PSKP2D::GUS se cruzaron con plantas mutantes axr1(alelos 3
y 12) obteniéndose plantas transgénicas PSKP2D con mutaciones
axr1 (plantas PSKP2B::GUS/axr1-12 y
PSKP2B::GUS/axr1-3), que representan una
realización particular de la planta transgénica AtPSKP2D de la
presente invención. Las plantas transgénicas PSKP2B::GUS y
PSKP2B::GUS/axr1 de 5 días se tiñeron para actividad GUS.
Como se observa en la Figura 4, la mutación en el gen AXR1 (plantas
PSKP2B::GUS/axr1-12 y
PSKP2B::GUS/axr1-3) reduce drásticamente tanto
el número como la posición de los puntos de expresión de GUS a
través del promotor AtSKP2D a lo largo de la raíz y, también, estas
plantas mutadas axr1 desarrollan muy pocas raíces laterales. Este
resultado indica que existe una correlación entre el número de
puntos de expresión inducidos por el promotor AtSKP2D y el número
de raíces laterales formadas.
Estos resultados apoyan la hipótesis de que los
puntos de la raíz donde la secuencia de DNA del promotor
AtSKP2D permite la expresión son regiones de formación de
las raíces laterales. Debido a que AtSKP2D es una proteína
implicada en la degradación, únicamente como hipótesis científica,
es muy posible que el complejo SCF^{AtSKP2D} esté implicado en la
degradación selectiva de un represor de la formación de primordios
laterales a través de la ruta de la UBQ. Además, la expresión en
parches a lo largo de la raíz podría estar marcando donde se deben
formar estos primordios laterales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La secuencia de DNA promotora AtSKP2D aislada es
capaz de dirigir la expresión del gen chivato GUS en diferentes
órganos como se ha descrito anteriormente (Figura 1). Para poder
delimitar la región responsable de la expresión de AtSKP2D, sola y
de forma específica, en las células del periciclo que van a dar
lugar a la formación de raíces laterales - es decir, la expresión
en parches a lo largo de la raíz - y, por tanto así controlar el
desarrollo radicular, se han realizado deleciones de esta secuencia
de DNA promotora AtSKP2D y analizado la capacidad reguladora de la
expresión de un gen reportero. De las distintas deleciones
estudiadas, y como una de las muchas posibles, se describe a
continuación la generación y los resultados obtenidos con la
secuencia de DNA promotora PSKP2D549.
Para generar dicha secuencia de DNA del promotor
PSKP2D549, el vector pBI101-PSKP2D, descrito en el
Ejemplo 1, se digirió con la enzima de restricción HindIII,
eliminando una región 5' de 1191 pares de bases del promotor
PSKP2B. El vector se religó, generándose el vector
pBI101-PSKP2D549, que contiene 549 nucleótidos de la
región promotora aguas arriba del ATG del gen AtSKP2D
(incluyendo las bases del ATG) fusionados al gen reportador GUS
(SEQ ID NO4). Plantas de Arabidopsis thaliana se
transformaron con Agrobacterium tumefaciens C58C1 que
tenía el plásmido binario pBI101-PSKP2D549
(desarrollado tal como se indica en el Ejemplo 1 para el plásmido
pBI101-PSKP2D). Las plantas transgénicas así
obtenidas, plantas transgénicas PSKP2D549::GUS, que representan una
realización particular de la planta transgénica AtPSKP2D de la
presente invención, se seleccionaron en medio MS con kanamicina (50
\mug/ml) y posteriormente se analizó el patrón de tinción de la
actividad GUS en plántulas de 6 días como se ha comentado
anteriormente. Las plantas transgénicas PSKP2D549::GUS mostraban un
patrón de expresión del gen GUS diferente al de las plantas
transgénicas PSKP2D::GUS, ya que la actividad GUS sólo se detectaba
en los puntos discretos a lo largo de la raíz principal (Figura 5),
concretamente en las células del pericilo, y no en otras áreas o
células de las plantas. Así, se ha identificado una secuencia de
DNA promotora de 549 pares de bases aguas arriba del ATG (PSKP2D549,
SEQ ID NO4) que dirige de forma altamente específica la expresión
del gen GUS en las células del periciclo, en forma de puntos
discretos a lo largo de la raíz (Figura 5) y no en otras células de
otros órganos.
Además, esta secuencia de DNA promotora
PSKP2D549 (SEQ ID NO 4) no responde a diferentes estímulos externos
frente a los que la secuencia de DNA promotora AtPSKP2D se inducía,
tales como salinidad, exceso de azucares o tratamientos con las
hormonas auxinas y ABA o por exposición a patógenos (los resultados
son negativos y el patrón observado es idéntico al de las plantas
PSKP2D549::GUS control). Los anteriores experimentos se realizaron
tal como se han descrito anteriormente. Hay que destacar que esta
especificidad es muy importante para evitar efectos secundarios de
la expresión de genes reguladores bajo la secuencia de DNA promotora
de la invención.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTIFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PLANTAS TRANSGÉNICAS AtPSKP2D, SU
PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> AtSKP2D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1740
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promoter AtSKP2D
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1698)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2514
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(500)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región 5'-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exon
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (501)..(718)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región codificante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (719)..(990)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exon
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (991)..(1339)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región codificante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1340)..(1434)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región codificante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exon
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1435)..(1576)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región codificante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1577)..(1640)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exon
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1641)..(2014)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región codificante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2015)..(2514)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región 3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 360
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 549
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región promotora mínima
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo P1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagatttgg gggaagctgc cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo P2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcctaggt actcaccatc cttgaagcgg
\hfill30
Claims (21)
1. Planta transgénica caracterizada
porque contiene una secuencia de DNA que permite la expresión de una
proteína de interés en las células de dicha planta y porque dicha
secuencia de DNA está constituida por una de las dos posibilidades
siguientes:
- i)
- una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, donde la secuencia de DNA promotora AtPSPK2D es una secuencia de DNA promotora de la expresión génica constituida por una de las secuencias de DNA pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1),
- b)
- secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
- c)
- un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b),
- d)
- secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y
- e)
- cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica,
- y,
- ii)
- una secuencia de DNA promotora conjuntamente con una secuencia de DNA codificante de una proteína constituida por la secuencia de DNA del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de la proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO3) o con cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA.
2. Planta transgénica según la reivindicación 1
caracterizada porque la secuencia de DNA promotora AtPSPK2D
es la secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1).
3. Planta transgénica según la reivindicación 1
caracterizada porque la secuencia de DNA codificante de una
proteína de interés de i) es una secuencia de DNA perteneciente al
siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de DNA codificante de una proteína directamente implicada en la formación y desarrollo de las raíces laterales para manipular la arquitectura radicular, o
- b)
- una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial e industrial cuya expresión en la planta, y más preferentemente en la raíz, permita su recogida y purificación posterior.
4. Planta transgénica según la reivindicación 3
caracterizada porque la secuencia de DNA codificante de una
proteína de a) es una de las secuencias perteneciente al siguiente
grupo: secuencia AtPSKP2D (SEQ ID NO2 codificante de la proteína de
SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKB1, AtKRP1, AtKRP2,
AtCDT1, AtCDC6, AtAXR1, AtTIR1, AtNAC1, así como cualquier forma
análoga de estas secuencia de DNA.
5. Planta transgénica según la reivindicación 3
caracterizada porque la secuencia de DNA codificante de una
proteína de b) pertenece al siguiente grupo de secuencias
codificantes de proteínas: diferentes tipos de inmunoglobulinas
(como por ejemplo IgGs contra la caries), de proteínas de uso médico
(como por ejemplo la insulina o la relaxina), de diferentes tipos
de fármacos, péptidos antimicrobianos y antifungicos, y proteínas
de interés agroalimentario (como por ejemplo fitasas,
transglutaminasas o glicosiltransferasas).
6. Planta transgénica según la reivindicación 1
caracterizada porque la secuencia de DNA promotora de ii) es
una secuencia de DNA promotora capaz de regular la expresión génica
en plantas perteneciente al siguiente grupo:
- a)
- un promotor fuerte constitutivo, como por ejemplo el promotor del virus del mosaico 35S, y
- b)
- un promotor que se exprese en todas las células del periciclo, como por ejemplo el de la kinasa dependiente de ciclinas del tipo A o del tipo B.
7. Planta transgénica según la reivindicación 1
caracterizada porque contiene una secuencia de DNA que
permite la expresión de una proteína de interés de manera
específica en las células del periciclo que van a dar lugar a la
formación de raíces laterales y que está constituida por una de las
posibilidades siguientes:
- a)
- secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
- b)
- un fragmento de las secuencias de DNA de a),
- c)
- secuencia de DNA análoga a las secuencias de a) y b), y
- d)
- cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), o c) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica.
8. Planta transgénica según la reivindicación 7
caracterizada porque la secuencia de DNA promotora es la
secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4).
9. Procedimiento de obtención de una planta
transgénica según las reivindicaciones 1 a la 8 caracterizado
porque consiste en la introducción en una planta de una secuencia
de DNA constituida por una de las dos posibilidades siguientes:
- i)
- una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, donde la secuencia de DNA promotora es una secuencia de DNA promotora de la expresión génica constituida por una de las secuencias de DNA perteneciente al siguiente grupo:
- a)
- secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1),
- b)
- secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
- c)
- un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b),
- d)
- secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y
- e)
- cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica,
- y,
- ii)
- una secuencia de DNA promotora conjuntamente con una secuencia de DNA codificante de una proteína constituida por la secuencia de DNA del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de la proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO3) o con cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA.
10. Procedimiento de obtención según la
reivindicación 9 caracterizado porque comprende los
siguientes pasos:
- i)
- obtención de un vector de expresión que contiene una secuencia de DNA perteneciente al siguiente grupo:
- a)
- secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1),
- b)
- secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
- c)
- un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b),
- d)
- secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y
- e)
- cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica.
- ii)
- obtención de microorganismos portadores del vector a), y
- iii)
- transformación de las plantas con el vector de i) o con el microorganismo de ii).
11. Secuencia de DNA caracterizada porque
permite la expresión de una proteína de interés en las células de
una planta y porque está constituida por una de las dos
posibilidades siguientes:
- i)
- una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, donde la secuencia de DNA promotora AtPSPK2D es una secuencia de DNA promotora de la expresión génica constituida por una de las secuencias de DNA pertenecientes al siguiente grupo:
- a.
- secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1),
- b.
- secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
- c.
- un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b),
- d.
- secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y
- e.
- cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica,
- y
- ii)
- una secuencia de DNA promotora conjuntamente con una secuencia de DNA codificante de una proteína constituida por la secuencia de DNA del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de la proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO3) o con cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA..
12. Secuencia de DNA según la reivindicación 11
caracterizada porque la secuencia de DNA codificante de una
proteína de interés de i) está constituida por una de las siguientes
secuencias de DNA:
- a)
- una secuencia de DNA codificante de una proteína directamente implicada en la formación y desarrollo de las raíces laterales para manipular la arquitectura radicular, o
- b)
- una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial e industrial cuya expresión en la planta, y más preferentemente en la raíz, permita su recogida y purificación posterior.
13. Secuencia de DNA según la reivindicación 12
caracterizada porque la secuencia DNA codificante de una
proteína de a) es una de las secuencias perteneciente al siguiente
grupo: secuencia de DNA AtPSKP2D (SEQ ID NO2 codificante de la
proteína de SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKB1, AtKRP1,
AtKRP2, AtCDT1, AtCDC6, AtAXR1, AtTIR1, AtNAC1, así como cualquier
forma análoga de estas secuencia de DNA.
14. Secuencia de DNA según la reivindicación 12
caracterizada porque la secuencia de DNA codificante de una
proteína de a) es la secuencia de DNA AtPSKP2D (SEQ ID NO2)
codificante de la proteína de SEQ ID NO3, así como cualquier forma
análoga de esta secuencia de DNA.
15. Secuencia de DNA según la reivindicación 12
caracterizada porque la secuencia de DNA codificante de una
proteína de interés comercial de b) pertenece al siguiente grupo de
secuencias codificantes de proteínas: diferentes tipos de
inmunoglobulinas (como por ejemplo IgGs contra la caries), de
proteínas de uso médico (como por ejemplo la insulina o la
relaxina), de diferentes tipos de fármacos, péptidos antimicrobianos
y antifungicos, y proteínas de interés agroalimentario (como por
ejemplo fitasas, transglutaminasas o glicosiltransferasas).
16. Secuencia de DNA según la reivindicación 11
caracterizada porque la secuencia de DNA promotora es una
secuencia de DNA promotora capaz de regular la expresión génica en
plantas.
17. Secuencia de DNA según la reivindicación 16
caracterizada porque la secuencia de DNA promotora pertenece
al siguiente grupo: el promotor del virus del mosaico 35S, y el
promotor de la kinasa dependiente de ciclinas del tipo A (CDKA) o
del tipo B.
18. Vector de expresión caracterizado
porque comprende la secuencia de DNA según las reivindicaciones 11
a la 17 y porque permite la transformación o transfección de
microorganismos y células y la posterior obtención de las plantas
transgénicas según las reivindicaciones 1 a la 8.
19. Microorganismo o célula transformada
caracterizada porque contiene la secuencia de DNA según las
reivindicaciones 11 a la 17 ó el vector de expresión según la
reivindicación 18.
20. Uso de las secuencias de DNA según las
reivindicaciones 11 a la 17, el vector de expresión según la
reivindicación 18, la célula transformada según la reivindicación
19, y del procedimiento según las reivindicaciones 9 y 10 para la
obtención de plantas transgénicas de interés comercial.
21. Uso según la reivindicación 20
caracterizado porque la planta de interés comercial pertenece
al siguiente grupo: arroz, trigo, soja, maíz, tomate, patata,
tabaco, judía, melón, sandia, pepino y fresa, y frutales como el
naranjo, limonero, peral y manzano.
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|---|---|---|---|
| ES200402349A ES2316199B1 (es) | 2004-10-01 | 2004-10-01 | Plantas transgenicas atpskp2d, su procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. |
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2004
- 2004-10-01 ES ES200402349A patent/ES2316199B1/es not_active Expired - Fee Related
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2005
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