ES2316199A1 - Plantas transgenicas atpskp2d, su procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. - Google Patents

Plantas transgenicas atpskp2d, su procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. Download PDF

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Abstract

Plantas transgénicas AtPSKP2D, su procedimiento de obtención y sus aplicaciones. La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar nuevas plantas transgénicas capaces de adaptarse a situaciones limitantes del medio ambiente, preferentemente por su capacidad de desarrollar raíces laterales. Se describen plantas transgénicas AtPSKP2D capaces de responder ante situaciones medioambientales que contienen un nuevo material genético que permite el control del desarrollo radicular mediante la expresión de forma específica de genes de interés en las células del periciclo formadoras de las raíces laterales (RLs). Estas técnicas pueden aplicarse a plantas de interés comercial de tal forma que estas plantas transgénicas pueden crecer tanto en medios pobres en nutrientes o en agua, como fertilizadas con una menor concentración de fertilizantes, por lo que representan una importante innovación en el sector agroalimentario.

Description

Plantas transgénicas AtPSKP2D, su procedimiento de obtención y sus aplicaciones.
Sector de la técnica
La invención tiene una aplicación en el sector de la agricultura, preferentemente en el desarrollo de plantas transgénicas. Esta invención describe una herramienta biotecnológica destinada a modificar el desarrollo radicular de las plantas, y por lo tanto, su acceso a los nutrientes y el agua en función de las necesidades.
Estado de la técnica
Las plantas, debido a su carácter sésil, necesitan adaptarse y responder a los diferentes ambientes en los que crecen. La arquitectura radicular está directamente relacionada con la adquisición de nutrientes y agua del suelo, y por lo tanto con la adaptación de las plantas a los diferentes medioambientes. Por ello, estos organismos han desarrollado diferentes sistemas radiculares, que están determinados tanto por el número como por la longitud y la posición de las raíces laterales (RLs) desarrolladas. En muchos suelos, la disponibilidad de ciertos nutrientes tales como el fosfato, el nitrato o el azufre, es un parámetro limitante para el crecimiento y desarrollo de las plantas. Por ello, estos organismos han desarrollado diferentes sistemas que les permite cuantificar los niveles de estos nutrientes y responder tanto a nivel fisiológico como molecular para obtener estos nutrientes en caso de déficit. Así, por ejemplo, una deficiencia de fosfato o de azufre estimula la formación de las raíces laterales, lo que incrementa la superficie de búsqueda de estos compuestos en el suelo circundante a la planta (revisado por López-Bucio et al. 2003, Current Opinión Plant Biology 6: 280-287). Las raíces laterales se forman a partir de unas células específicas en la raíz principal, llamadas células del periciclo. Drubovsky y colaboradores (Drubovsky et al. 2001, Planta, 214: 30-36) han determinado que las células del periciclo adyacentes a los polos del xilema son las responsables de la formación de los primordios laterales. En un determinado momento del desarrollo las células del periciclo se paran en la fase G1 del ciclo celular, manteniéndose en este estado hasta que se reactiva el proceso de división celular para dar lugar al primordio lateral (Beckman et al., J Exp Bot. 52: 403-11, 2001). La identificación de genes que se expresan en los primordios laterales y de mutantes que tienen alterado el desarrollo de las raíces laterales ha contribuido en gran medida a comenzar a entender las bases genéticas y moleculares que gobiernan este proceso (Casimiro et al. 2003, Trends Plant Science 8: 165-171). Sin embargo, los mecanismos que controlan el patrón espacio-temporal de formación de las raíces laterales, así como los mecanismos desencadenantes que hacen que las células del periciclo paradas en G1 re-entren en proliferación, son desconocidos hasta la fecha. Diversos resultados obtenidos del análisis de mutantes afectados en el desarrollo radicular han indicado que la hormona auxina y la proteólisis selectiva de proteínas a través de la ruta de la ubiquitina juega un papel crítico en la formación de las raíces laterales (Casimiro et al. 2003, Trends Plant Science 8: 165-171; Gray et al. 2001, Nature. 414: 271-6; Xie Q, et al. 2002, Nature 419: 167-170). Uno de los mutantes más severos en la respuesta a las auxinas es axr1. El gen AXR1 codifica una proteína implicada en la modificación postraduccional de Culina1 con la proteína RUB. Culina1 es un componente estructural del complejo SCF. Este complejo interviene en la modificación de proteínas dianas con ubiquitina para su posterior degradación a través del proteosoma. Otro mutante de la respuesta a las auxinas, tir1, también tiene afectado la formación de RLs. TIR1 codifica para una proteína con motivo-F que forma parte de un complejo ligasa E3 de ubiquitina que está implicada en el reclutamiento de proteínas dianas para su degradación (Gray et al. 2001, Nature, 414: 271-6). Mediante análisis genético, TIR1 se ha situado por debajo de la función de AXR1 en el proceso de formación de raíces laterales. Recientemente, Xie et al. (2002, Nature, 419: 167-170) describieron el gen NAC, que codifica para un factor de trascripción de la familia NAM/CUC (Aida M, et al. 1997, Plant Cell. 9: 841-57; Xie Q, et al. 2002, Nature, 419: 167-170), que funciona, aguas abajo de TIR1, como activador de formación de raíces laterales. La actividad de NAC1 está también regulada mediante degradación selectiva a través de la ruta de la ubiquitina, implicando la función de la enzima E3 ligasa SINAT5 (Xie Q, et al. 2002, Nature 419: 167-170). Estos resultados indican que la degradación de reguladores a través de la ruta de la Ub juega un papel crítico en la formación de las raíces laterales. Además, estos datos han sugerido que las células del periciclo que van a dar lugar a los primordios laterales pueden estar paradas en G1 por la acción de un represor, y que posiblemente se degrade a través de la ruta de la Ub para permitir la re-entrada en la división celular de estas células. Sin embargo, aunque esta hipótesis es muy atractiva, hasta la fecha no existen evidencias experimentales que la sustenten.
Como se ha comentado anteriormente, la activación de genes implicados en la proliferación celular es necesaria para la activación y posterior desarrollo de los primordios laterales (Himanen et al. 2002, Plant Cell 14: 2339-2351). Diversos genes de proliferación se expresan constitutivamente en las células del periciclo, lo que los ha descartando como posibles candidatos responsables del disparo de la división celular en las células del periciclo (Mironov et al. 1997, Prog. Cell Cycle Res. 3: 29-41). Sin embargo, no se debe descartar la posibilidad de una modificación postraduccional de las proteínas codificadas por estos genes como el desencadenante de la reactivación de las células del periciclo. Debido a la parada de estas células del periciclo en G2, se especuló que la ciclina mitótica B1;1 pudiera ser el gen regulador del proceso de formación de las LR. Sin embargo, la expresión ectópica del gen CYCB1;1 bajo el control del promotor de la kinasa dependiente de ciclina CDKA, que se expresa en las células del periciclo, no incrementa la formación de primordios laterales (Doener, et al. 1996, Nature, 380: 520-523). Estos mismos autores han desarrollado una patente para el control del crecimiento de las plantas mediante la expresión de la ciclina B1 (Methods for increasing growth and yield in plants (CYC1). Doerner, Lamb, Patente USA 6,252,139).
El gen DFL1 pertenece a la familia de genes moduladores de la respuesta a las auxinas GH3. Mediante el análisis de un mutante para este gen, se ha observado que DFL1 funciona en el desarrollo del tallo y de las raíces laterales, ya que dicho mutante genera muchas menos RLs sin afectar a la longitud de la raíz principal (Nakazawa et al. 2001, Plant J. 25: 213-221; Patente 2002-010786 Lateral root formation supresor gene. Miki Nakazawa et al.).
En resumen, para una buena adaptación de las plantas al medio ambiente, el desarrollo de un sistema radicular óptimo al terreno donde crecen es un proceso crítico para su supervivencia. Por ello, la manipulación de genes que permita controlar el sistema radicular es de gran interés agronómico, ya que se podrían obtener plantas que se adapten mejor a los diferentes medios ambientes hostiles (secos, pobres en nutrientes, etc). El incremento del sistema radicular hace que las plantas sean más eficientes en la captación de nutrientes y del agua, con lo que podría reducir tanto la cantidad de fertilizantes como de agua de regadío utilizados en diferentes cultivos. Para poder manipular genéticamente la arquitectura radicular es necesario conocer que genes están implicados en el desarrollo de las raíces. Sin embargo, los mecanismos genéticos y moleculares que determinan tanto el número como la localización de las RLs son completamente desconocidos. Asimismo, para evitar efectos secundarios en otras partes de las plantas, es muy importante disponer de promotores que permitan expresar de forma muy específica los genes de interés que controlen el desarrollo radicular.
Descripción de la invención Descripción breve
La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar nuevas plantas transgénicas capaces de adaptarse a situaciones limitantes del medio ambiente, preferentemente por su capacidad de desarrollar raíces laterales.
Así, un objeto de la presente invención lo constituye una planta transgénica AtPSKP2D, en adelante planta transgénica AtPSKP2D de la presente invención, que contiene una secuencia de DNA AtPSKP2D que permite la expresión de una proteína de interés en las células de dicha planta, y que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes:
a)
una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y
b)
una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
Otro objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de obtención de la planta transgénica
AtPSPK2D, en adelante procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D de la presente invención, que consiste en la introducción en una planta de la secuencia de DNA AtPSKP2D que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes:
a)
una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y
b)
una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
Las secuencias de DNA, vectores de expresión y células o microorganismos transformados, desarrollados y necesarios para la puesta en práctica del procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D de la presente invención, así como su empleo para la producción de dichas plantas, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.
Finalmente, otro objeto de la presente invención es el uso de las secuencias de DNA AtPSKP2D, vectores de expresión AtPSKP2D, células transformadas AtPSKP2D, y del procedimiento AtPSKP2D de la presente invención para la obtención de plantas transgénicas AtPSKP2D de interés comercial, entre otras, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención: arroz, trigo, soja, maíz, tomate, patata, tabaco, judía, melón, sandia, pepino, fresa, etc, así como diferentes especies frutales (naranjo, limonero, peral, manzano, etc).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar nuevas plantas transgénicas capaces de adaptarse a situaciones limitantes del medio ambiente, preferentemente por su capacidad de desarrollar raíces laterales.
La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han observado que es posible obtener plantas transgénicas capaces de responder ante situaciones medioambientales porque contienen un nuevo material genético que permite el control del desarrollo radicular mediante la expresión de forma específica de genes de interés en la células del periciclo formadoras de las raíces laterales (RLs). Estas nuevas plantas transgénicas son plantas potencialmente mejoradas para su crecimiento tanto en medios pobres en nutrientes o en agua, como fertilizadas con una menor concentración de fertilizantes, por lo que representan una importante innovación en el sector agroalimentario.
En la presente invención se describe la secuencia de DNA de un nuevo gen, la secuencia del gen AtSKP2D (ver SEQ ID NO2, entre el nucleótido 501-2014), que codifica para una proteína con motivo-F, homóloga a SKP2 de humanos (Zhang, H., et al. 1995, Cell 82: 915-925), la proteína AtSKP2D (SEQ ID NO3) y de su promotor. Esta familia de proteínas con motivo-F forman parte de los complejos E3-ligasas del tipo SCF que están implicados en la proteólisis de proteínas a través de la ruta de la ubiquitina. Datos recientes mostraron que estas proteínas con motivo-F, y en concreto AtSKP2A, juegan un papel importante en el control de la proliferación celular mediante la proteólisis selectiva de reguladores de la división celular (del Pozo et al. 2002, Plant Cell. 14: 421-433).
Sin embargo, en la presente invención se ha observado por primera vez que la expresión del gen AtSKP2D se induce en la raíz de la planta por tratamiento con las hormonas auxina y ácido abcísico (ABA) o por estrés salino (ver Figura 2 y Ejemplo 2). Dicho gen se expresa en parches discretos a lo largo de la raíz principal, y más concretamente en las células del periciclo (células a partir de las cuales se desarrrollan las RLs) y con mayor intensidad en las células próximas al xilema, que son las que se dividen para dar lugar a un primordio lateral (ver Figura 3 y Ejemplo 3). Análisis micro-morfológico de estos puntos de expresión de AtSKP2D han mostrado que en muchos de ellos aun no se ha producido ninguna división de las células del periciclo. Esto, junto al hecho de que muchos de estos puntos de expresión estén muy cercanos al meristemo radicular, donde en condiciones normales no se forman primordios laterales, sugiere que estos parches de expresión son futuros puntos de formación de raíces laterales. Esta hipótesis se en-
cuentra soportada igualmente por lo observado en plantas transgénicas PSKP2D::GUS/axr1 (Figura 4 y Ejemplo 4).
Además, la invención está dirigida a desarrollar una secuencia de DNA promotora que permita la expresión génica en una planta, sino también, de forma preferente y específica, en las células del periciclo que van a dar lugar a la formación de raíces laterales para poder así controlar el desarrollo del sistema radicular, es decir, en las raíces. Por ello, se han llevado a cabo deleciones de la secuencia de DNA del promotor de AtSKP2D para hallar el dominio responsable de la expresión en parches a lo largo de la raíz, identificándose una secuencia de DNA (PSKP2B549) (SEQ ID NO4) que dirige la expresión tan sólo en las células del periciclo de los puntos a lo largo de la raíz y no en otras células de otros órganos.
Así, un objeto de la presente invención lo constituye una planta transgénica AtPSKP2D, en adelante planta transgénica AtPSKP2D de la presente invención, que contiene una secuencia de DNA AtPSKP2D que permite la expresión de una proteína de interés en las células de dicha planta, y que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes:
c)
una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y
d)
una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "secuencia de DNA promotora AtPSPK2D" se refiere a una secuencia de DNA promotora de la expresión génica constituida por una de las secuencias de DNA pertenecientes al siguiente grupo:
a)
secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1),
b)
secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
c)
un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b),
d)
secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y
e)
cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica.
El término "secuencia de DNA codificante de una proteína de interés" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a:
a)
una secuencia de DNA codificante de una proteína directamente implicada en la formación y desarrollo de las raíces laterales para manipular la arquitectura radicular, es decir, capaz de modificar la arquitectura radicular de una planta - tanto el número como la posición de las raíces laterales - como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, las secuencias de DNA codificantes de las proteínas pertenecientes al siguiente grupo: la secuencia AtPSKP2D (SEQ ID NO2 codificante de la proteína de SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKB1, AtKRP1, AtKRP2, AtCDT1, AtCDC6 (Vandepoele, et al. Plant Cell 2002, 14: 903-916.), AtAXR1 (Leyser et al. Nature 1993, 364: 161-164), AtECR1 (del Pozo et al. Science 1998, 280:1760-1763), AtTIR1 (Ruegger et al. 1998, Genes Dev. 12: 198-207), AtIAA14 (Fukaki et al. 2002, Plant J. 29: 153-168), AtNAC1 (Xie et al. 2000, Gene Dev. 14: 3024-3036), y
b)
una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial e industrial cuya expresión en la planta, y más preferentemente en la raíz, permita su recogida y purificación posterior, como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, perteneciente al siguiente grupo: diferentes tipos de inmunoglobulinas (como por ejemplo IgGs contra la caries), de proteínas de uso médico (como por ejemplo la insulina o la relaxina), de diferentes tipos de fármacos, péptidos antimicrobianos y antifúngicos, y proteínas de interés agroalimentario (como por ejemplo, fitasas, liquenasas, transglutaminasas o glicosiltransferasas).
El término "una secuencia de DNA promotora" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a cualquier secuencia de DNA promotora capaz de regular la expresión génica en plantas como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, un promotor fuerte constitutivo, como por ejemplo el promotor del virus del mosaico 35S, o un promotor que se exprese en todas las células del periciclo, como por ejemplo el de la kinasa dependiente de ciclinas del tipo A o del tipo B (Vandepoele, et al. Plant Cell 2002, 14: 903-916).
El término "secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a la secuencia de DNA del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de la proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO3), así como cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA.
Un objeto particular de la presente invención lo constituye una planta transgénica AtPSKP2D de la presente invención en la que la secuencia de DNA promotora AtPSPK2D es la secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1). Una realización particular de esta es la planta transgénica PSKP2D::GUS, y las plantas PSKP2B::GUS/axr1-12 y PSKP2B::GUS/axr1-3, generadas en la presente invención (ver Ejemplo 1 y 4).
Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una planta transgénica AtPSKP2D que contiene una secuencia de DNA AtPSKP2D que permite la expresión de una proteína de interés de manera específica en las células del periciclo que van a dar lugar a la formación de raíces laterales y que está constituida por una de las posibilidades siguientes:
a)
secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
b)
un fragmento de las secuencias de DNA de a),
c)
secuencia de DNA análoga a las secuencias de a) y b), y
d)
cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), o c) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica.
Una realización particular de la presente invención lo constituye una planta transgénica AtPSKP2D de la presente invención en la que la secuencia de DNA promotora AtPSPK2D es la secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4). Una realización particular de esta es la planta transgénica PSKP2D549::GUS, generada en la presente invención (ver Ejemplo 5).
Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una planta transgénica AtPSKP2D de la presente invención en la que la secuencia de DNA codificante de una proteína de interés es la secuencia de DNA codificante de la proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO2).
Otro objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de obtención de la planta transgénica
AtPSPK2D, en adelante procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D de la presente invención, que consiste en la introducción en una planta de la secuencia de DNA AtPSKP2D que está constituida por una de las dos posibilidades siguientes:
c)
una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y
d)
una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
Una realización particular de la presente invención lo constituye un procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D que comprende los siguientes pasos:
a)
obtención de un vector de expresión que contiene una secuencia de DNA AtPSPK2D,
b)
obtención de microorganismos portadores del vector a), y
c)
transformación de las plantas con el vector de a) o con el microorganismo de b).
Las secuencias de DNA, vectores de expresión y células o microorganismos transformados, desarrollados y necesarios para la puesta en práctica del procedimiento de obtención de plantas transgénicas AtPSPK2D de la presente invención, así como su empleo para la producción de dichas plantas, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.
Así, otro objeto de la presente invención lo constituye una secuencia de DNA AtPSK2D, en adelante secuencia de DNA AtPSKP2D de la presente invención, que permite la expresión de una proteína de interés en las células de planta y que está constituida por una de las posibilidades siguientes:
a)
una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, y
b)
una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína AtPSKP2D.
Un objeto particular de la presente invención lo constituye una secuencia de DNA AtPSK2D de la invención en la que la secuencia de DNA promotora AtPSKP2D está constituida por una de las secuencias de DNA pertenecientes al siguiente grupo:
a)
secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1),
b)
secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
c)
un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b),
d)
secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y
e)
cualquier secuencia de DNA que comprenda una secuencia DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica.
Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una secuencia de DNA AtPSK2D de la invención en la que la secuencia de DNA codificante de una proteína de interés está constituida por una de las siguientes secuencias de DNA:
a)
una secuencia de DNA codificante de una proteína directamente implicada en la formación y desarrollo de las raíces laterales para manipular la arquitectura radicular, es decir, capaz de modificar la arquitectura radicular de una planta - tanto el número como la posición de las raíces laterales - como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, las secuencias de DNA codificantes de las proteínas pertenecientes al siguiente grupo: la proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO2 codificante de la proteína de SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKB1, AtKRP1, AtKRP2, AtCDT1, AtCDC6 (Vandepoele, et al. Plant Cell 2002, 14: 903-916.), AtAXR1 (Leyser et al. Nature 1993, 364: 161-164), AtECR1 (del Pozo et al. Science 1998, 280:1760-1763), AtTIR1 (Ruegger et al. 1998, Genes Dev. 12: 198-207), AtIAA14 (Fukaki et al. 2002, Plant J. 29: 153-168) y AtNAC1 (Xie et al. 2000, Gene Dev. 14: 3024-3036), y
b)
una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial e industrial cuya expresión en la planta, y más preferentemente en la raíz, permita su recogida y purificación posterior, como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, perteneciente al siguiente grupo: diferentes tipos de inmunoglobulinas (como por ejemplo IgGs contra la caries), de proteínas de uso médico (como por ejemplo la insulina o la relaxina), de diferentes tipos de fármacos, péptidos antimicrobianos y antifúngicos, y proteínas de interés agroalimentario (como por ejemplo, fitasas, liquenasas, transglutaminasas o glicosiltransferasas).
Estas proteínas de interés así como las secuencias de DNA codificantes de las mismas son conocidas por un experto en la materia e incluyen igualmente todas aquellas que se identifiquen en el futuro.
Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una secuencia de DNA AtPSK2D de la invención en la que la secuencia de DNA promotora es cualquier secuencia de DNA promotora capaz de regular la expresión génica en plantas como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, un promotor fuerte constitutivo, como por ejemplo el promotor del virus del mosaico 35S, o un promotor que se exprese en todas las células del periciclo, como por ejemplo el de la kinasa dependiente de ciclinas del tipo A (CDKA) o del tipo B (Vandepoele, et al. Plant Cell 2002, 14: 903-916)
Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una secuencia de DNA AtPSK2D de la invención en la que la secuencia de DNA codificante de una proteína de interés es la secuencia de DNA AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de la proteína de SEQ ID NO3, así como cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a las secuencias de DNA mostradas en la presente invención, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia.
En general, una secuencia de ADN análoga es sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos comentadas anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
La secuencia de ADN promotora AtPSKP2D (SEQ ID NO1) y del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) de la invención proceden de Arabidopsis thaliana y pueden encontrarse en formas homólogas en otras especies de plantas superiores de interés comercial, entre otras, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención: arroz, trigo, soja, maíz, tomate, tabaco, judía, así como diferentes especies frutales (naranjo, limonero, etc), donde pueden estar de forma natural o en otro caso, también podrían estar como resultado de un proceso de transformación génica en el que el organismo transformado reproduzca dichas moléculas de ADN. Estas formas homólogas de la secuencia de ADN promotora AtPSKP2D (SEQ ID NO 1) y del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) de la invención pueden ser aisladas, mediante técnicas convencionales, a partir del ADN de cualquier planta que las contengas y mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos, preparados gracias a la información de las secuencias de nucleótidos de dichas moléculas de ADN proporcionadas en esta invención, por cualquier experto en la materia.
Por otro lado, a partir de las secuencias de DNA promotoras de la presente invención, AtPSKP2D y PSKP2D549, un experto en la materia puede fácilmente obtener otras deleciones o fragmentos que permitan regular la expresión génica específica o no de órgano, y preferentemente otras secuencias de DNA promotoras de forma especifica de un gen de interés en la raíz.
La secuencia de DNA AtPSK2D de la invención puede ser utilizada, en general, en la generación de un vector de expresión que permite la expresión de estas proteínas en una amplia gama de células huésped.
Por lo tanto, la invención también se refiere a un vector de expresión que comprende la secuencia de DNA AtPSKP2D de la invención, en adelante vector de expresión AtPSKP2D de la presente invención, y que permite la transformación o transfección de microorganismos y células y la posterior obtención de las plantas transgénicas AtPSKP2D de la invención. Como realizaciones particulares del vector de expresión AtPSKP2D de la invención se han generado los vectores pBI101-PSKP2D (ver Ejemplo 1) y el vector pBI101-PSKP2D549 (ver ejemplo 5).
En general, el vector de expresión AtPSKP2D de la presente invención comprende, al menos, una secuencia de DNA AtPSKP2D de la invención y, al menos, un promotor que dirige la transcripción del gen de interés (la secuencia de DNA promotora la contiene la secuencia de DNA AtPSKP2D), al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción del gen de interés y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos de expresión de plantas (Rothstein et al. (1987) Promoter cassettes, antibiotic-resistance genes, and vectors for plant transformation Gene 53:153-61; Potrykus, I. (1991). Gene transfer to plants: Assessment of published approaches and results. Annu. Rev. Pl. Physiol. Pl. Mol. Biol. 42, 205-255.), virus ("Plant Virology Protocols" From Virus Isolation to Transgenic Resistance Edited by: Gary D. Foster University of Bristol, Bristol, UKPublished: 1998), que pueden contener, además, un origen bacteriano o de levadura de replicación para que pueda ser amplificado en bacterias o levaduras, así como un marcador utilizable para seleccionar las células transfectadas diferente al gen o genes de interés. Para la transformación de las plantas se pueden utilizar diferentes métodos - vectores plasmidicos, liposomas, electroporación, microinyección, etc - descritos en diversos manuales (ver por ejemplo: (Plant Gene Transfer and Expression Protocols Jones, Heddwyn University of Hertfordshire, Hatfield, UK. Human Press Publishers). La elección del vector dependerá de la célula hospedadora y de la planta en la que se va a introducir posteriormente.
Otro objeto de la invención lo constituye un microorganismo o célula, en adelante célula AtPSKP2D de la invención, que contiene la secuencia de DNA AtPSKP2D o el vector de expresión AtPSKP2D de la invención.
Finalmente, otro objeto de la presente invención es el uso de las secuencias de DNA AtPSKP2D, vectores de expresión AtPSKP2D, células transformadas AtPSKP2D, y del procedimiento AtPSKP2D de la presente invención para la obtención de plantas transgénicas AtPSKP2D de interés comercial, entre otras, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención: arroz, trigo, soja, maíz, tomate, patata, tabaco, judía, melón, sandia, pepino, fresa, etc, así como diferentes especies frutales (naranjo, limonero, peral, manzano, etc).
Descripción de figuras
Figura 1: Expresión del gen GUS mediante la secuencia de DNA promotora AtPSKP2D. La secuencia de DNA promotora de AtPSKP2D se fusionó al gen reportador GUS (pSKP2D::GUS) para analizar el patrón de expresión de dicho gen. A) Plántulas transgénicas portadoras de la construcción pSKP2D::GUS de 6 días teñidas para actividad GUS. B) Actividad GUS en cotiledones (detalle del tejido vascular y de los estomas). C) Actividad GUS en flores jóvenes. D) Actividad GUS en una flor madura, mostrando tinción en los sépalos, en los pétalos, en los estambres y en el carpelo.
Figura 2: La secuencia de DNA promotora AtPSKP2D induce la expresión de GUS por auxinas, ácido abcísico (ABA), sal y deficiencia nutricional. A, Control; B, Auxinas; C, ABA; D, NaCl; E, +PI, con fosfato; F, -PI, sin fosfato.
Figura 3: La secuencia de DNA promotora AtPSKP2D induce la expresión de GUS en las células del periciclo. A) Plántulas transgénicas portadoras de la construcción pSKP2D::GUS de 6 días teñidas para actividad GUS. B) Detalle de los puntos de tinción a lo largo de la raíz. C) Corte transversal de unos de los puntos mostrados en B, y más cercanos al meristemo radicular, que muestra tinción GUS en las células del periciclo.
Figura 4: La expresión génica de GUS inducida por La secuencia de DNA promotora AtPSKP2D está disminuida en las raíces de los mutantes axr1. La construcción pSKP2D::GUS se introdujo en los mutantes axr1-3 y axr1-12. Raíces de las plantas axr1-3/pSKP2D::GUS y axr1-12/pSKP2D::GUS se tiñeron para actividad GUS. Como se muestran en las fotografías, los mutantes axr1 (axr1-3 y axr1-12) desarrollan menos puntos de expresión de GUS a lo largo de la raíz principal.
Figura 5: Expresión génica de GUS específica en la raíz inducida por La secuencia de DNA promotora PSKP2D549. La región promotora que comprende aproximadamente los primeros 549 pares de bases aguas arriba del ATG del gen AtSKP2D se fusionó al gen reportador GUS (pSKP2D549::GUS) para analizar la capacidad y el patrón de expresión de dicho fragmento de DNA. Plántulas transgénicas portadoras de la construcción pSKP2D::GUS de 6 días teñidas para actividad GUS. A) Parte apical de plántulas pSKP2D::GUS y pSKP2D549::GUS B) Parte distal de las raíces de plántulas pSKP2D::GUS y pSKP2D549::GUS. C) Parte apical de las raíces de plántulas pSKP2D::GUS y pSKP2D549::GUS.
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Ejemplos de realización de la invención
Ejemplo 1
Clonaje de una secuencia de DNA que controla la expresión de genes en puntos de formación de las raíces laterales (PSKP2D) y en los meristemos apical y radicular
La secuencia de DNA del gen AtSKP2D se identificó por homología de secuencia al gen codificante de la proteína de humanos SKP2, que está implicada en el control del ciclo celular y en el desarrollo de diversos tumores (Zhang, H., et al. 1995, Cell 82: 915-925). Para aislar esta secuencia de DNA AtSKP2D, se diseñaron a partir de la secuencia anotada en el banco de DNA del genoma de Arabidopsis (http://www.arabidopsis.org) los cebadores de la región codificante del cDNA de dicho gen (P3: 5' ATGGTGAGTGAAGGAGCAAC AAG 3' (SEQ ID NO5) y P4: 5' TCAATGCGCCGGGTGAGGGTA 3' (SEQ ID NO 6)) y se amplificó mediante PCR, utilizando una genoteca de flores de Arabidopsis thaliana como DNA molde. Dicho cDNA se clonó en el vector PCR2.1 (Invitrogen). De dicho clonaje se secuenciaron varios clones obteniéndose de todos ellos la misma secuencia de DNA, que correspondía a la secuencia de DNA AtSKP2D (SEQ ID NO2).
Para analizar la capacidad reguladora de la expresión génica de la secuencia de DNA promotora AtSKP2D a lo largo del desarrollo de las plantas se han generado plantas transgénicas que portan la secuencia de DNA del promotor del gen AtSKP2D capaz de dirigir la expresión del gen reportador GUS. Para clonar la secuencia de DNA del promotor del gen AtSKP2D se amplificó un fragmento de 1740 pares de bases, que supuestamente debería de contener toda la información de expresión del gen AtSKP2D, mediante PCR utilizando los oligonucleótidos P1: 5'-GAAGATTTGGGGGAAGCTGCCC-3' (SEQ ID NO7) y P2: 5'-GCTCCTAGGTACTCACCATCCTTGAAGCGG-3' (SEQ ID NO8). Dichos cebadores se diseñaron a partir de la secuencia anotada del genoma de Arabidopsis. La secuencia de DNA del promotor se secuenció resultando una secuencia de DNA de 1740 nucleótidos (SEQ ID NO1). La secuencia de DNA amplificada, SEQ ID NO1, se clonó en el vector PCR2.1 (Invitrogen) generando el vector PCR2.1-PSKP2D. Este vector se digirió con las enzimas de restricción BamHI y SpeI para clonarlo posteriormente en el vector pBI101 (Clontech), que aporta la secuencia de DNA codificante del gen GUS utilizado como reportero, generando el vector pBI101-PSKP2D. El vector pBI101-PSKP2D se introdujo en la cepa de Agrobacterium tumefaciens C58C1 mediante choque térmico (cepa Agrobacterium tumefaciens PSKP2D). Este Agrobacterium se utilizó para transformar plantas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia mediante infiltración (Bechtold et al. 1993. C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci. 316: 15-18). Las plantas transgénicas portadoras de la secuencia de DNA del promotor del gen AtSKP2D fusionado al gen reportero \beta-glucoronidasa (GUS) (Jefferson et al., 1987. EMBO J. 6: 3901-3907), plantas transgénicas PSKP2D::GUS, se aislaron mediante resistencia al antibiótico kanamicina, y representan una realización particular de la planta transgénica AtPSKP2D de la presente invención.
Estas plantas transgénicas se analizaron mediante tinción histoquímica de la actividad GUS de acuerdo con el protocolo descrito por del Pozo et al. (2002, Plant Cell, 14: 421-433). Se identificaron 35 líneas diferentes y 32 de ellas mostraban el mismo patrón de tinción GUS, y de estas, dos líneas independientes fueron analizadas en más detalle. Un análisis histoquímico de estas plantas transgénicas ha mostrado que la secuencia de DNA del promotor AtSKP2D es capaz de dirigir la expresión del gen reportador GUS a lo largo de la raíz principal (Figura 1A), en zonas de división celular (meristemos apical y radicular), en el tejido vascular y en los estomas de las hojas
(Figura 1).
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Ejemplo 2
La expresión génica a partir del promotor AtSKP2D es controlada por diferentes factores ambientales-hormonales
Diversos factores ambientales (NaCl) u hormonales (auxina, ABA) son capaces de inducir la expresión génica a través del promotor AtSKP2D en la raíz. La mayoría de estos factores están relacionados con el desarrollo del sistema radicular. Por ejemplo, las auxinas inducen la formación de raíces laterales; la deficiencia nutricional o de agua (salinidad) estimula el desarrollo del sistema radicular para incrementar la superficie de búsqueda de nutrientes o agua en el suelo. Para analizar como diferentes estímulos que afectan a la formación de las raíces laterales modifican la expresión a través de la secuencia de DNA del promotor AtSKP2D, plantas PSKP2D::GUS de 5 días se trataron con 0.1 \muM 2,4-D (auxina), 1 \muM de ABA ó 150 mM de sal (NaCl) durante 16 horas. Estas plantas se tiñeron posteriormente para la actividad GUS tal como se indica en el Ejemplo 1. Como se observa en la Figura 2 (A, B, C y D), estos tres estímulos incrementan la expresión de GUS a través del promotor del gen AtSKP2D.
Además, para analizar el efecto de la deficiencia nutricional sobre la expresión génica a partir del promotor AtSKP2D, plantas transgénicas PSKP2D::GUS de 5 días se crecieron durante 6 días más en un medio MS con (+Pi) o sin (-Pi) de fosfato. Posteriormente, estas plantas se tiñeron para la actividad GUS para analizar la expresión génica a partir del promotor AtSKP2D, que como se observa en la Figura 2 (E y F), se induce claramente cuando las plantas crecen en un medio deficiente en nutrientes (-Pi, Figura 2F).
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Ejemplo 3
La expresión génica a partir del promotor AtSKP2D se produce en las células del periciclo formadoras de las raíces laterales
El desarrollo de la invención se ha centrado en el análisis histoquímico de las plantas transgénicas PSKP2D::GUS, que mostró la expresión de este gen GUS en puntos discretos a lo largo de toda la raíz (Figura 3A y 3B), que se correlacionan con los puntos de formación de las raíces laterales. Cortes transversales de estos puntos de expresión con actividad GUS han mostrado que el promotor del gen AtSKP2D (PSKP2D) dirige la expresión del gen GUS en las células del periciclo, con mayor intensidad en las células próximas al xilema, que son las que se dividen para dar lugar a un primordio lateral (RLs) (Figura 3C).
El análisis micro-morfológico de estos puntos de expresión del gen GUS en estas plantas transgénicas han mostrado que en muchos de ellos aun no se ha producido ninguna división de las células del periciclo. Esto, junto al hecho de que muchos de estos puntos de expresión estén muy cercanos al meristemo radicular, donde en condiciones normales no se forman primordios laterales, sugiere que estos parches de expresión son futuros puntos de formación de raíces laterales.
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Ejemplo 4
Expresión de PSKP2B en mutantes deficientes en la formación de raíces laterales
Para poder determinar si existe una correlación entre el número de puntos de expresión inducidos por el promotor AtSKP2D a lo largo de la raíz y la distribución o número de las raíces laterales, el transgén PSKP2B::GUS se introdujo dentro del fondo genético axr1 (dentro del alelo débil axr1-3 y del alelo fuerte axr1-12). El gen AXR1 codifica para una enzima implicada en la modificación de AtCUL1, un componente estructural del complejo SCF de la ruta de la ubiquitina (del Pozo et al. 2002, Plant Cell, 14: 421-433). Las plantas mutantes axr1-3 y axr1-12 presentan una respuesta disminuida a las auxinas y además la formación de raíces laterales está disminuida (Lincon et al., 1990 Plant Cell 2: 1071-1080). Así, las plantas transgénicas PSKP2D::GUS se cruzaron con plantas mutantes axr1(alelos 3 y 12) obteniéndose plantas transgénicas PSKP2D con mutaciones axr1 (plantas PSKP2B::GUS/axr1-12 y PSKP2B::GUS/axr1-3), que representan una realización particular de la planta transgénica AtPSKP2D de la presente invención. Las plantas transgénicas PSKP2B::GUS y PSKP2B::GUS/axr1 de 5 días se tiñeron para actividad GUS. Como se observa en la Figura 4, la mutación en el gen AXR1 (plantas PSKP2B::GUS/axr1-12 y PSKP2B::GUS/axr1-3) reduce drásticamente tanto el número como la posición de los puntos de expresión de GUS a través del promotor AtSKP2D a lo largo de la raíz y, también, estas plantas mutadas axr1 desarrollan muy pocas raíces laterales. Este resultado indica que existe una correlación entre el número de puntos de expresión inducidos por el promotor AtSKP2D y el número de raíces laterales formadas.
Estos resultados apoyan la hipótesis de que los puntos de la raíz donde la secuencia de DNA del promotor AtSKP2D permite la expresión son regiones de formación de las raíces laterales. Debido a que AtSKP2D es una proteína implicada en la degradación, únicamente como hipótesis científica, es muy posible que el complejo SCF^{AtSKP2D} esté implicado en la degradación selectiva de un represor de la formación de primordios laterales a través de la ruta de la UBQ. Además, la expresión en parches a lo largo de la raíz podría estar marcando donde se deben formar estos primordios laterales.
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Ejemplo 5
Identificación de una región de DNA que dirige la expresión de genes de forma altamente específica a las células del periciclo
La secuencia de DNA promotora AtSKP2D aislada es capaz de dirigir la expresión del gen chivato GUS en diferentes órganos como se ha descrito anteriormente (Figura 1). Para poder delimitar la región responsable de la expresión de AtSKP2D, sola y de forma específica, en las células del periciclo que van a dar lugar a la formación de raíces laterales - es decir, la expresión en parches a lo largo de la raíz - y, por tanto así controlar el desarrollo radicular, se han realizado deleciones de esta secuencia de DNA promotora AtSKP2D y analizado la capacidad reguladora de la expresión de un gen reportero. De las distintas deleciones estudiadas, y como una de las muchas posibles, se describe a continuación la generación y los resultados obtenidos con la secuencia de DNA promotora PSKP2D549.
Para generar dicha secuencia de DNA del promotor PSKP2D549, el vector pBI101-PSKP2D, descrito en el Ejemplo 1, se digirió con la enzima de restricción HindIII, eliminando una región 5' de 1191 pares de bases del promotor PSKP2B. El vector se religó, generándose el vector pBI101-PSKP2D549, que contiene 549 nucleótidos de la región promotora aguas arriba del ATG del gen AtSKP2D (incluyendo las bases del ATG) fusionados al gen reportador GUS (SEQ ID NO4). Plantas de Arabidopsis thaliana se transformaron con Agrobacterium tumefaciens C58C1 que tenía el plásmido binario pBI101-PSKP2D549 (desarrollado tal como se indica en el Ejemplo 1 para el plásmido pBI101-PSKP2D). Las plantas transgénicas así obtenidas, plantas transgénicas PSKP2D549::GUS, que representan una realización particular de la planta transgénica AtPSKP2D de la presente invención, se seleccionaron en medio MS con kanamicina (50 \mug/ml) y posteriormente se analizó el patrón de tinción de la actividad GUS en plántulas de 6 días como se ha comentado anteriormente. Las plantas transgénicas PSKP2D549::GUS mostraban un patrón de expresión del gen GUS diferente al de las plantas transgénicas PSKP2D::GUS, ya que la actividad GUS sólo se detectaba en los puntos discretos a lo largo de la raíz principal (Figura 5), concretamente en las células del pericilo, y no en otras áreas o células de las plantas. Así, se ha identificado una secuencia de DNA promotora de 549 pares de bases aguas arriba del ATG (PSKP2D549, SEQ ID NO4) que dirige de forma altamente específica la expresión del gen GUS en las células del periciclo, en forma de puntos discretos a lo largo de la raíz (Figura 5) y no en otras células de otros órganos.
Además, esta secuencia de DNA promotora PSKP2D549 (SEQ ID NO 4) no responde a diferentes estímulos externos frente a los que la secuencia de DNA promotora AtPSKP2D se inducía, tales como salinidad, exceso de azucares o tratamientos con las hormonas auxinas y ABA o por exposición a patógenos (los resultados son negativos y el patrón observado es idéntico al de las plantas PSKP2D549::GUS control). Los anteriores experimentos se realizaron tal como se han descrito anteriormente. Hay que destacar que esta especificidad es muy importante para evitar efectos secundarios de la expresión de genes reguladores bajo la secuencia de DNA promotora de la invención.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS
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<120> PLANTAS TRANSGÉNICAS AtPSKP2D, SU PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES
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<130> AtSKP2D
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<160> 6
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<170> PatentIn version 3.2
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<210> 1
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<211> 1740
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
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<220>
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<221> promoter AtSKP2D
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<222> (1)..(1698)
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<400> 1
1
2
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<210> 2
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<211> 2514
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(500)
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<223> región 5'-3'
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<220>
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<221> exon
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<222> (501)..(718)
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<223> Región codificante
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<220>
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<221> Intron
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<222> (719)..(990)
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<220>
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<221> exon
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<222> (991)..(1339)
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<223> Región codificante
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<220>
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<221> Intron
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<222> (1340)..(1434)
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<223> Región codificante
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<220>
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<221> exon
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<222> (1435)..(1576)
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<223> Región codificante
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<220>
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<221> Intron
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<222> (1577)..(1640)
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<220>
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<221> exon
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<222> (1641)..(2014)
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<223> Región codificante
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (2015)..(2514)
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<223> Región 3'
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<400> 2
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3
4
5
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<210> 3
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<211> 360
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 3
6
7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 549
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región promotora mínima
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo P1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagatttgg gggaagctgc cc
\hfill
22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> DNA
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<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo P2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctcctaggt actcaccatc cttgaagcgg
\hfill
30

Claims (21)

1. Planta transgénica caracterizada porque contiene una secuencia de DNA que permite la expresión de una proteína de interés en las células de dicha planta y porque dicha secuencia de DNA está constituida por una de las dos posibilidades siguientes:
i)
una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, donde la secuencia de DNA promotora AtPSPK2D es una secuencia de DNA promotora de la expresión génica constituida por una de las secuencias de DNA pertenecientes al siguiente grupo:
a)
secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1),
b)
secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
c)
un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b),
d)
secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y
e)
cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica,
y,
ii)
una secuencia de DNA promotora conjuntamente con una secuencia de DNA codificante de una proteína constituida por la secuencia de DNA del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de la proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO3) o con cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA.
2. Planta transgénica según la reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia de DNA promotora AtPSPK2D es la secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1).
3. Planta transgénica según la reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia de DNA codificante de una proteína de interés de i) es una secuencia de DNA perteneciente al siguiente grupo:
a)
una secuencia de DNA codificante de una proteína directamente implicada en la formación y desarrollo de las raíces laterales para manipular la arquitectura radicular, o
b)
una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial e industrial cuya expresión en la planta, y más preferentemente en la raíz, permita su recogida y purificación posterior.
4. Planta transgénica según la reivindicación 3 caracterizada porque la secuencia de DNA codificante de una proteína de a) es una de las secuencias perteneciente al siguiente grupo: secuencia AtPSKP2D (SEQ ID NO2 codificante de la proteína de SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKB1, AtKRP1, AtKRP2, AtCDT1, AtCDC6, AtAXR1, AtTIR1, AtNAC1, así como cualquier forma análoga de estas secuencia de DNA.
5. Planta transgénica según la reivindicación 3 caracterizada porque la secuencia de DNA codificante de una proteína de b) pertenece al siguiente grupo de secuencias codificantes de proteínas: diferentes tipos de inmunoglobulinas (como por ejemplo IgGs contra la caries), de proteínas de uso médico (como por ejemplo la insulina o la relaxina), de diferentes tipos de fármacos, péptidos antimicrobianos y antifungicos, y proteínas de interés agroalimentario (como por ejemplo fitasas, transglutaminasas o glicosiltransferasas).
6. Planta transgénica según la reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia de DNA promotora de ii) es una secuencia de DNA promotora capaz de regular la expresión génica en plantas perteneciente al siguiente grupo:
a)
un promotor fuerte constitutivo, como por ejemplo el promotor del virus del mosaico 35S, y
b)
un promotor que se exprese en todas las células del periciclo, como por ejemplo el de la kinasa dependiente de ciclinas del tipo A o del tipo B.
7. Planta transgénica según la reivindicación 1 caracterizada porque contiene una secuencia de DNA que permite la expresión de una proteína de interés de manera específica en las células del periciclo que van a dar lugar a la formación de raíces laterales y que está constituida por una de las posibilidades siguientes:
a)
secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
b)
un fragmento de las secuencias de DNA de a),
c)
secuencia de DNA análoga a las secuencias de a) y b), y
d)
cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), o c) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica.
8. Planta transgénica según la reivindicación 7 caracterizada porque la secuencia de DNA promotora es la secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4).
9. Procedimiento de obtención de una planta transgénica según las reivindicaciones 1 a la 8 caracterizado porque consiste en la introducción en una planta de una secuencia de DNA constituida por una de las dos posibilidades siguientes:
i)
una secuencia de DNA promotora y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, donde la secuencia de DNA promotora es una secuencia de DNA promotora de la expresión génica constituida por una de las secuencias de DNA perteneciente al siguiente grupo:
a)
secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1),
b)
secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
c)
un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b),
d)
secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y
e)
cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica,
y,
ii)
una secuencia de DNA promotora conjuntamente con una secuencia de DNA codificante de una proteína constituida por la secuencia de DNA del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de la proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO3) o con cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA.
10. Procedimiento de obtención según la reivindicación 9 caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
i)
obtención de un vector de expresión que contiene una secuencia de DNA perteneciente al siguiente grupo:
a)
secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1),
b)
secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
c)
un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b),
d)
secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y
e)
cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica.
ii)
obtención de microorganismos portadores del vector a), y
iii)
transformación de las plantas con el vector de i) o con el microorganismo de ii).
11. Secuencia de DNA caracterizada porque permite la expresión de una proteína de interés en las células de una planta y porque está constituida por una de las dos posibilidades siguientes:
i)
una secuencia de DNA promotora AtPSKP2D y una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés, donde la secuencia de DNA promotora AtPSPK2D es una secuencia de DNA promotora de la expresión génica constituida por una de las secuencias de DNA pertenecientes al siguiente grupo:
a.
secuencia de DNA PSKP2D (SEQ ID NO1),
b.
secuencia de DNA PSKP2D549 (SEQ ID NO4),
c.
un fragmento de las secuencias de DNA de a) y b),
d.
secuencia de DNA análoga a las secuencias de a), b) y c), y
e.
cualquier secuencia de DNA que comprenda la secuencia de DNA de a), b), c) o d) y que sea capaz de mantener su misma actividad reguladora de la expresión génica,
y
ii)
una secuencia de DNA promotora conjuntamente con una secuencia de DNA codificante de una proteína constituida por la secuencia de DNA del gen AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de la proteína AtPSKP2D (SEQ ID NO3) o con cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA..
12. Secuencia de DNA según la reivindicación 11 caracterizada porque la secuencia de DNA codificante de una proteína de interés de i) está constituida por una de las siguientes secuencias de DNA:
a)
una secuencia de DNA codificante de una proteína directamente implicada en la formación y desarrollo de las raíces laterales para manipular la arquitectura radicular, o
b)
una secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial e industrial cuya expresión en la planta, y más preferentemente en la raíz, permita su recogida y purificación posterior.
13. Secuencia de DNA según la reivindicación 12 caracterizada porque la secuencia DNA codificante de una proteína de a) es una de las secuencias perteneciente al siguiente grupo: secuencia de DNA AtPSKP2D (SEQ ID NO2 codificante de la proteína de SEQ ID NO3), AtE2Fc, AtE2Fa, AtCYCA, AtCDKB1, AtKRP1, AtKRP2, AtCDT1, AtCDC6, AtAXR1, AtTIR1, AtNAC1, así como cualquier forma análoga de estas secuencia de DNA.
14. Secuencia de DNA según la reivindicación 12 caracterizada porque la secuencia de DNA codificante de una proteína de a) es la secuencia de DNA AtPSKP2D (SEQ ID NO2) codificante de la proteína de SEQ ID NO3, así como cualquier forma análoga de esta secuencia de DNA.
15. Secuencia de DNA según la reivindicación 12 caracterizada porque la secuencia de DNA codificante de una proteína de interés comercial de b) pertenece al siguiente grupo de secuencias codificantes de proteínas: diferentes tipos de inmunoglobulinas (como por ejemplo IgGs contra la caries), de proteínas de uso médico (como por ejemplo la insulina o la relaxina), de diferentes tipos de fármacos, péptidos antimicrobianos y antifungicos, y proteínas de interés agroalimentario (como por ejemplo fitasas, transglutaminasas o glicosiltransferasas).
16. Secuencia de DNA según la reivindicación 11 caracterizada porque la secuencia de DNA promotora es una secuencia de DNA promotora capaz de regular la expresión génica en plantas.
17. Secuencia de DNA según la reivindicación 16 caracterizada porque la secuencia de DNA promotora pertenece al siguiente grupo: el promotor del virus del mosaico 35S, y el promotor de la kinasa dependiente de ciclinas del tipo A (CDKA) o del tipo B.
18. Vector de expresión caracterizado porque comprende la secuencia de DNA según las reivindicaciones 11 a la 17 y porque permite la transformación o transfección de microorganismos y células y la posterior obtención de las plantas transgénicas según las reivindicaciones 1 a la 8.
19. Microorganismo o célula transformada caracterizada porque contiene la secuencia de DNA según las reivindicaciones 11 a la 17 ó el vector de expresión según la reivindicación 18.
20. Uso de las secuencias de DNA según las reivindicaciones 11 a la 17, el vector de expresión según la reivindicación 18, la célula transformada según la reivindicación 19, y del procedimiento según las reivindicaciones 9 y 10 para la obtención de plantas transgénicas de interés comercial.
21. Uso según la reivindicación 20 caracterizado porque la planta de interés comercial pertenece al siguiente grupo: arroz, trigo, soja, maíz, tomate, patata, tabaco, judía, melón, sandia, pepino y fresa, y frutales como el naranjo, limonero, peral y manzano.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002016655A2 (en) * 2000-08-24 2002-02-28 The Scripps Research Institute Stress-regulated genes of plants, transgenic plants containing same, and methods of use
WO2003000898A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 Syngenta Participations Ag Plant genes involved in defense against pathogens

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1033404A1 (en) * 1999-01-29 2000-09-06 F. Hoffmann-La Roche Ag New gene with down-regulated expression in metastatic human melanoma cells

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002016655A2 (en) * 2000-08-24 2002-02-28 The Scripps Research Institute Stress-regulated genes of plants, transgenic plants containing same, and methods of use
WO2003000898A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 Syngenta Participations Ag Plant genes involved in defense against pathogens

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"{}Arabidopsis thaliana chromosome I BAC F22K20 genomic 6,17,14\\ Y sequence,complete". 08.06.1997. Recuperado de EBI. Nº de acceso AC002291. *
"Arabidopsis thaliana chromosome I BAC F22K20 genomic sequence,complete". 08.06.1997. Recuperado de EBI. Nº de acceso AC002291. *
"F22K20.10 protein (F-box protein family, AtFBL5)". 01.06.1998. 6,17,14\\ Y Recuperado de EBI. Nº de acceso O49286. *
"F22K20.10 protein (F-box protein family, AtFBL5)". 01.06.1998. Recuperado de EBI. Nº de acceso O49286. <B563>X</B563> <B564>6,17,14</B564> <B563>Y</B563> <B562> <REL>DEL POZO JC. et al., "AXR1-ECR1-Dependent Conjugation of RUB1 to the Arabidopsis Cullin AtCUL1 Is Required for Auxin Response" . The Plant Cell, Febrero 2002, Vol. 14, páginas 421-433. *
DEL POZO JC. et al., "{}AXR1-ECR1-Dependent Conjugation of RUB1 to the Arabidopsis Cullin AtCUL1 Is Required for Auxin Response" . The Plant Cell, Febrero 2002, Vol. 14, páginas 421-433. *
DEL POZO JC. et al.,"{}Arabidopsis E2Fc Functions in Cell Division and Is Degraded by the Ubiquitin-SFC-AtSKP2 Pathway in Response to Light" The Plant Cell, Diciembre 2002, Vol. 14, páginas 3057-3071. *
DEL POZO JC. et al.,"Arabidopsis E2Fc Functions in Cell Division and Is Degraded by the Ubiquitin-SFC-AtSKP2 Pathway in Response to Light" The Plant Cell, Diciembre 2002, Vol. 14, páginas 3057-3071. *

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