CN112626078B - 玉米转录因子ZmGBF1基因及其表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子育种领域，涉及玉米新品种的培育，特别是指玉米转录因子ZmGBF1基因及其表达载体和应用。ZmGBF1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，位于第7染色体，含有2个外显子和1个内含子。ZmGBF1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该蛋白含有bZIP‑plant‑G‑box结合因子结构域、N末端富含脯氨酸的结构域和钙依赖蛋白激酶的结合位点，具有转录激活活性且属于核蛋白。本发明筛选到一个全新的差异极显著表达的bZIP转录因子，通过实验研究发现，这个bZIP转录因子ZmGBF1为基因表达的关键调控因子，在植物发育和对不良环境胁迫中起着至关重要的作用。

Description

玉米转录因子ZmGBF1基因及其表达载体和应用

技术领域

本发明属于分子育种领域，涉及玉米新品种的培育，特别是指玉米转录因子ZmGBF1基因及其表达载体和应用。

背景技术

在诸多影响作物产量的因素中，干旱出现的频率、持续的时间使其成为影响范围最广、造成农业损失最严重的自然灾害之一，因干旱而造成农作物产量下降、农产品品质降低等损失居各种自然灾害之首。

为解决可用水资源不足、干旱对玉米造成的严重影响，石元春院士在1999年曾提出了“生物节水”的概念，即利用和开发生物体自身的生理和基因潜力，在同等水供应条件下能够获得更多的农业产出。生物节水包括遗传改良、群体适应和生理调控。其中，通过遗传改良培育抗旱节水新品种是生物节水的一个核心目标，在培育节水抗旱新品种方面，从分子水平上，高效发掘与创新抗旱节水基因资源是生物节水农业发展的关键。因此深入研究玉米抗旱分子调控机制，明确玉米不同抗旱基因在增强玉米抗旱性中的作用，挖掘抗旱的主效基因，创制抗旱种质资源，最终转向抗旱节水基因的利用，提高玉米的生物节水能力至关重要。

目前利用全基因组关联分析，克隆了一个抗旱基因质子泵-焦磷酸水解酶ZmVPP1，过表达该基因显著提高玉米抗旱性；ZmNAC84氨基酸被ZmCCaMK磷酸化，过表达该基因，可以提高烟草的抗旱性；玉米ZmbZIP4基因通过调节ABA合成和根的发育来促进干旱胁迫响应；ABA受体蛋白ZmPYL8、ZmPYL9、ZmPYL12和ZmNF-YB16提高玉米耐旱性；ZmOST1间接调控玉米抗旱性；ZmPIP1;1同时增强玉米耐旱和耐盐性；编码1个S-酰基转移酶基因ZmTIP1能够通过调节玉米根毛长度正向调控玉米的耐旱性，在转基因拟南芥和玉米中增强ZmTIP1的表达可以增加根毛长度，并提高植株对水分亏缺的耐受性；ZmMP⁃KL1通过改变ABA生物合成和分解代谢基因的转录以及ABA的动态平衡来正向调控玉米幼苗的抗旱性；bHLH转录因子基因ZmPTF1，通过影响玉米体内ABA的合成以及ABA信号通路相关基因来调控根系的发育，进而对外界干旱做出响应；对一个玉米光泽(glossy6)突变体的耐旱性进行了研究，与野生型相比，glossy6表皮蜡质负荷减少，通透性增加，幼苗耐旱性降低。这些干旱胁迫基因的鉴定和分析为玉米抗性分子设计育种提供重要基因资源。

bZIP转录因子是普遍存在于动植物及微生物中的一类转录因子，植物中包括玉米O2，拟南芥PosF21，小麦和水稻的HBP-1等多种转录因子。bZIP 类转录因子识别核心序列为ACGT的顺式作用元件如CACGTG(G )，GACGTC(C盒)，TACGTA(A盒)等，一些受光或脱落酸(ABA)诱导的基因的启动子区都含有这些元件。其中G盒元件普遍存在于受ABA、生长素、茉莉酸、水杨酸诱导的基因中。它还是光诱导基因中最常见的顺式作用元件之一，bZIP类转录因子都能与G盒元件特异结合，激活光诱导基因的转录。玉米O2转录因子既能以同源二聚体形式作用于其顺式作用元件，又能与玉米中的其他蛋白(如 PBF-1，OHP1等)结合，以异源二聚体的方式同靶位点结合能被玉米胚乳的核酸提取物或拟南芥CK的重组体磷酸化，在O2的主要激活区还发现有多个可被磷酸化的位点，因此认为磷酸化作用可能在O2活性的调控中起重要作用。

抗旱基因的挖掘、功能验证及机理分析研究对玉米抗旱分子设计育种有着重要的作用。bZIP转录因子作为基因表达的关键调控因子，在植物发育和对不良环境胁迫中起着至关重要的作用。本申请在一个自发突变体上鉴定到一个全新的差异表达的ZmbZIP转录因子，包含GBF1结构域，暂时命名为ZmGBF1。

发明内容

为了对新发现的转录因子进行研究、挖掘其抗逆性的机理及在玉米育种中的应用，本发明提出一种玉米转录因子ZmGBF1基因及其表达载体和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

玉米转录因子ZmGBF1基因，所述ZmGBF1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，位于第7染色体，含有2个外显子和1个内含子。

玉米转录因子ZmGBF1蛋白，所述ZmGBF1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该蛋白含有bZIP-plant-G-box结合因子结构域、N末端富含脯氨酸的结构域和钙依赖蛋白激酶的结合位点，具有转录激活活性且属于核蛋白。

含有所述的玉米转录因子ZmGBF1基因的表达载体。

所述表达载体为融合表达载体或过表达载体。

上述融合表达载体的制备方法，步骤如下：

（1）以玉米总RNA反转录得到的cDNA为模板，以ZmGBF1-F和ZmGBF1-R为引物对进行扩增目的片段并回收；

（2）以步骤（1）的目的片段作为模板，分别以ZmGBF1-F-SpeI和ZmGBF1-R-AscI、ZmGBF1-F-ECORI和ZmGBF1-R-BamHI、ZmGBF1-F-AscI和ZmGBF1-R-BamHI，作为特异性引物对，进行扩增；

（3）步骤（2）的三个扩增产物经双酶切后用T4连接酶过夜连接并转化，挑取验证正确的阳性克隆即为玉米转录因子ZmGBF1基因的融合表达载体ZmGBF1-pMDC83-GFP。

所述步骤（1）中引物ZmGBF1-F的序列如SEQ ID No.3所示、ZmGBF1-R的序列如SEQID No.4所示。

所述步骤（2）中ZmGBF1-F-SpeI的序列如SEQ ID No.5所示、ZmGBF1-R-AscI的序列如SEQ ID No.6所示、ZmGBF1-F-ECORI的序列如SEQ ID No.7所示、ZmGBF1-R-BamHI的序列如SEQ ID No.8所示、ZmGBF1-F-AscI的序列如SEQ ID No.9所示、ZmGBF1-R-BamHI的序列如SEQ ID No.10所示。

上述的表达载体在提高玉米发芽能力、根系发育、花粉活力的干旱和盐胁迫中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过GO和KEGG代谢路径分析干旱胁迫下转录组得到的差异表达基因，筛选到一个全新的差异极显著表达的bZIP转录因子，通过实验研究发现，这个bZIP转录因子ZmGBF1为基因表达的关键调控因子，在植物发育和对不良环境胁迫中起着至关重要的作用。

2、本申请的转录因子ZmGBF1蛋白具有转录激活活性，过表达ZmGBF1基因显著提高了玉米的抗旱和耐盐性，并提高玉米根系活力，促进根系发育；ZmGBF1过表达可以减小对叶片叶绿素的影响，并能提高玉米叶片渗透调节物质可溶性蛋白含量和抗氧化酶POD、SOD和CAT活性，减缓干旱和盐胁迫对细胞膜的损伤，提高玉米抗旱和耐盐性，维持玉米正常生长；在散粉期干旱胁迫，野生型的花粉发育明显受到抑制，而转基因ZmGBF1过表达株系在胁迫后花粉仍能保持较高的发育，对提高后期籽粒结实率非常重要，直接影响产量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为玉米ZmGBF1蛋白保守结构域。

图2为玉米ZmGBF1在不同组织器官中的表达模式。

图3为ZmGBF1响应干旱、高温、盐和ABA的表达模式。

图4为 ZmGBF1基因PCR产物电泳图。

图5为ZmGBF1基因装载到不同融合载体的菌体PCR检测图，注：Maker为2000DL，其中1泳道为空白对照，2~4泳道为ZmGBF1装载到PMD83载体，5~7泳道为ZmGBF1装载到pGBKT7载体，8~10泳道为ZmGBF1装载到pFGC5941载体。

图6为ZmGXM1连接融合载体的双酶切验证图，注：Maker为2000DL，1、2和3泳道分别为ZmGBF1装载到PMD83、pGBKT7和pFGC5941载体的双酶切跑胶泳道。

图7为ZmGBF1的亚细胞定位图。

图8为ZmGBF1的转录活性图，注：pGBKT7-53+pGADT7-T为阳性对照;pGBKT7-Lam +pGADT7-T为阴性对照。

图9为ZmGBF1过量表达拟南芥株系和玉米的PCR检测图，注：Maker为2000DL，其中1~4泳道为玉米转基因株系，6~9泳道为拟南芥转基因株系，5泳道为阴性对照。

图10为ZmGBF1基因在转基因拟南芥和玉米株系中的表达情况，图A 为拟南芥株系，图B为玉米株系。星号“*”表示差异达到显著水平（P<0.05）,下同。

图11为干旱和盐胁迫对ZmGBF1转基因拟南芥种子萌发的影响。

图12为干旱和盐胁迫对ZmGBF1转基因拟南芥种子萌发率的影响。

图13为干旱胁迫下ZmGBF1转基因拟南芥的抗性表现。

图14为干旱胁迫下ZmGBF1转基因拟南芥的根系情况。

图15为干旱和盐胁迫对ZmGBF1转基因玉米种子萌发的影响。

图16为干旱和盐胁迫对ZmGBF1转基因玉米种子萌发率的影响。

图17为PEG和NaCl渗透胁迫对玉米幼苗生长的影响。

图18为土培条件下干旱和盐胁迫对玉米幼苗生长的影响。

图19为干旱和盐胁迫对玉米幼苗根活力的影响。

图20为干旱和盐胁迫对玉米幼苗叶片叶绿素含量的影响。

图21为干旱和盐胁迫对玉米幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响。

图22为干旱和盐胁迫对玉米幼苗叶片抗氧化酶活性的影响。

图23为干旱胁迫对花粉活力的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

玉米转录因子ZmGBF1基因，所述ZmGBF1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，位于第7染色体，含有2个外显子和1个内含子。

玉米转录因子ZmGBF1蛋白，所述ZmGBF1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该蛋白含有bZIP-plant-G-box结合因子结构域、N末端富含脯氨酸的结构域和钙依赖蛋白激酶的结合位点，具有转录激活活性且属于核蛋白。

含有所述的玉米转录因子ZmGBF1基因的表达载体。

所述表达载体为融合表达载体或过表达载体。

上述融合表达载体的制备方法，步骤如下：

（1）以玉米总RNA反转录得到的cDNA为模板，以ZmGBF1-F和ZmGBF1-R为引物对进行扩增目的片段并回收；

（2）以步骤（1）的目的片段作为模板，分别以ZmGBF1-F-SpeI和ZmGBF1-R-AscI、ZmGBF1-F-ECORI和ZmGBF1-R-BamHI、ZmGBF1-F-AscI和ZmGBF1-R-BamHI，作为特异性引物对，进行扩增；

（3）步骤（2）的三个扩增产物经双酶切后用T4连接酶过夜连接并转化，挑取验证正确的阳性克隆即为玉米转录因子ZmGBF1基因的融合表达载体ZmGBF1-pMDC83-GFP。

所述步骤（1）中引物ZmGBF1-F的序列如SEQ ID No.3所示、ZmGBF1-R的序列如SEQID No.4所示。

所述步骤（2）中ZmGBF1-F-SpeI的序列如SEQ ID No.5所示、ZmGBF1-R-AscI的序列如SEQ ID No.6所示、ZmGBF1-F-ECORI的序列如SEQ ID No.7所示、ZmGBF1-R-BamHI的序列如SEQ ID No.8所示、ZmGBF1-F-AscI的序列如SEQ ID No.9所示、ZmGBF1-R-BamHI的序列如SEQ ID No.10所示。

上述的表达载体在提高玉米发芽能力、根系发育、花粉活力的抗逆性中的应用。

实施例1：ZmGBF1的序列分析

20%PEG6000处理玉米自交系郑8713，与正常条件下的叶片转录组相比，筛选到一个差异表达非常显著的bZIP基因。NCBI功能注释发现该转录因子位于第7染色体，含有2个外显子和1个内含子。蛋白保守结构域分析发现，该蛋白含有bZIP-plant-G-box结合因子（GBF）结构域、N末端富含脯氨酸的结构域和钙依赖蛋白激酶（CDPK）的结合位点(PTHR22952) （图1），暂时命名该基因为ZmGBF1。

以ZmGBF1基因编码的蛋白序列进行NCBI搜索，发现与拟南芥的AtGBF5(AT2G18160.1) 、水稻的OsbZIP44( LOC_Os09g13570.1)和高粱的SibZIP44(Sobic.002G162800.1)亲缘关系较近，推测可能存在相似的生物学功能。首先利用plantcare软件对四个基因的启动子序列进行核心元件分析，结果如表1：

表1 ZmGBF1、SibZIP44、OsbZIP44和AtGBF5基因的启动子顺式元件

发现（表1）在ZmGBF1中存在多个胁迫响应元件，包括响应脱落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、茉莉酸和生长素的元件及响应病害和胁迫等核心元件，说明ZmGBF1的表达可能受多种植物激素和非生物、生物胁迫的调控。与ZmGBF1相比，SibZIP44、OsbZIP44和AtGBF5基因的启动子区虽然胁迫元件的个数少了，但也包含多个胁迫响应的元件。以上结果说明ZmGBF1及同源SibZIP44、OsbZIP44和AtGBF5基因都可能参与对逆境胁迫的响应。

实施例2：玉米ZmGBF1表达模式分析

一、ZmGBF1时空表达模式

以转基因的野生型（WT）为材料，分析ZmGBF1基因在不同器官中的表达模式（图2 ），发现该基因在根、茎、叶和发育器官中均表达，属于组织型表达基因，并在幼根和幼叶中高强度表达。

二、ZmGBF1响应非生物胁迫和植物激素的表达模式

启动子核心元件分析（表1）表明ZmGBF1及拟南芥、高粱和水稻同源基因的启动子区域均含有响应非生物胁迫及植物激素的元件，因此对干旱（20% PEG6000）、高温（42°C）、盐（200 mmol/L）和ABA（0.1 mmol/L）激素处理下ZmGBF1的表达变化进行分析。如图3所示，在干旱、高温、盐和ABA激素处理下ZmGBF1表达均上调表达，尤其是干旱胁迫诱导下上调幅度大，达百倍；高温、盐和激素处理上调幅度也达到50倍。结果说明ZmGBF1积极上调表达响应干旱、高温、盐和ABA处理。

实施例3：ZmGBF1基因的克隆及融合载体构建

一、ZmGBF1基因的克隆

提取玉米总RNA，以反转录到的cDNA为模块，ZmGBF1-F (Forward Primer):ATGTCAAGTGGCACTTCGT和ZmGBF1-R (Reverse Primer):CTAGAAGCATTGGTACAGGT特异序列为引物，选择TaKaRa高保真酶（TAKARA, 中国,大连）扩增ZmGBF1基因的ORF（开放阅读框）。扩增程序为: 95℃预变性5 min，95℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸1min,第三个步骤循环33次，最后72℃延伸10 min，扩增体系如表2。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，有单一且条带大小与ZmGBF1基因一致的片段（图4）。

表2 ZmGBF1基因克隆的扩增体系

二、ZmGBF1基因的融合载体构建

纯化回收PCR扩增的条带，以回收的DNA为模板，分别以ZmGBF1-F-SpeI (ForwardPrimer): CTAGACTAGTATGTCAAGTGGCACTTCGT和ZmGBF1-R-AscI (Reverse Primer):TTGGCGCGCCCTAGAAGCATTGGTACAGGT;ZmGBF1-F-ECORI (Forward Primer):CGGAATTCATGTCAAGTGGCACTTCGT和ZmGBF1-R-BamHI (Reverse Primer):CGGGATCCCTAGAAGCATTGGTACAGGT;ZmGBF1-F-AscI (Forward Primer):AGGCGCGCCATGTCAAGTGGCACTTCGT和ZmGBF1-R-BamHI (Reverse Primer):CGGGATCCCTAGAAGCATTGGTACAGGT特异序列为引物，使用TaKaRa高保真酶进行PCR扩增，体系如表2。

选择SpeI和AscI双酶切PMD83载体和对应酶扩增的PCR纯化回收产物；ECORI和 BamHI双酶切pGBKT7载体和对应酶扩增的PCR纯化回收产物;AscI和BamHI双酶切pFGC5941载体和对应酶扩增的PCR纯化回收产物,使回收产物与融合载体产生相同的粘性末端，使用T4连接酶16°C过夜连接，然后转化大肠杆菌DH5a，挑取PCR检测正确的阳性克隆（图5）送公司测序。测序正确的菌液提取质粒，并进一步双酶切检测（图6）。最终将ZmGBF1基因的ORF分别装载到PMD83、pGBKT7和pFGC5941载体。

实施例4：ZmGBF1亚细胞定位及活性

利用侵染烟草叶片方法将融合表达载体ZmGBF1-pMDC83-GFP转入烟草实现瞬时表达，激光共聚焦显微镜观察发现ZmGBF1-pMDC83-GFP仅在细胞核中发出绿色荧光，如图7所示，说明ZmGBF1蛋白定位于细胞核，属于核蛋白。

为了探究ZmGBF1的转录活性，将其完整的ORF装载到pGBKT7载体的GAL4 DNA结合域，然后将融合载体pGBKT7-ZmGBF1转化到酵母菌株AH109中。如图8所示，pGBKT7-ZmGBF1与阳性对照在酵母中的活性一致，说明ZmGBF1蛋白具有转录激活活性。

实施例5：ZmGBF1转基因材料的鉴定

通过拟南芥花序侵染法和玉米茎尖侵染法分别将ZmGBF1基因过表达转入拟南芥和玉米。转基因玉米和种子播种土壤中，出苗后喷洒草甘膦。挑选生长健壮的拟南芥和玉米转基因株系提取DNA，以Bar（405bp）引物（Bar-Forward:5'-AAACCCACGTCATGCCAGTT-3’和Bar-Reverse:5'-CATCGAGACAAGCACGGTCA-3’）进行PCR扩增，挑选阳性植株（图9）。

提取野生型和检测带有Bar条带的拟南芥和玉米株系的RNA，反转录成cDNA，检测ZmGBF1基因的表达量，转基因拟南芥（L1和L2）和玉米（OE1和OE2）株系中表达量显著高于野生型，见图10。结果表明成功将ZmGBF1基因转入拟南芥和玉米，使其在拟南芥和玉米株系中过量表达。

实施例6：ZmGBF1过表达拟南芥的抗逆性分析

一、萌发期ZmGBF1过表达拟南芥的种抗逆性分析

将T3代转基因拟南芥种子春化3天后，分别撒在正常MS培养基和含有200 mM甘露醇和200 mmol NaCl的 MS上，5天后观察发芽情况。图11可知，甘露醇模拟的干旱胁迫和NaCl模拟的盐胁迫处理下，ZmGBF1转基因拟南芥（L1和L2）的发芽情况均比野生型（Col）好。进一步统计学分析，由图12可知，正常MS培养基时野生型和转基因拟南芥的种子发芽率差异很小，但干旱胁迫时转基因株系L1和L2的发芽率分别比野生型Col升高了56%和51%，达到差异显著水平（P<0.05），盐胁迫时转基因株系L1和L2的发芽率分别比野生型Col升高了66%和33%，达到差异显著水平。结果表明，干旱和盐胁迫处理时，ZmGBF1转基因提高了拟南芥种子的发芽能力。

二、干旱胁迫对拟南芥幼苗生长发育的影响

由图13可知，正常水分生长条件下，野生型和转基因ZmGBF1株系L1和L2的长势基本一致，生长状态较好。干旱胁迫7天后，转基因株系和野生型生长均受到抑制，叶片萎蔫，叶尖发黄，但转基因过表达株系L1和L2相对于野生型均表现出较好的生长状态。

将正常MS培养基上生长5天的野生型拟南芥和转基因株系，部分苗转移到含有200mM 甘露醇的MS培养基上，7天后观察根系发育情况，由图14可知，正常MS培养基生长的野生型和转基因株系根系情况差异不明显，但200mM 甘露醇胁迫时，转基因株系L1和L2的根系均比野生型长，且侧根较多。结果说明干旱胁迫下，过表达ZmGBF1基因提高了拟南芥根系发育和抗旱性。

实施例7：ZmGBF1过表达玉米的抗逆性分析

一、萌发期ZmGBF1过表达玉米的抗逆性分析

选取转基因过表达ZmGBF1和野生型的种子消毒，分别在含有0 mmol/L（正常）、150mmol/L、200 mmol/L、12%PEG和18%PEG溶液的滤纸上萌发，观察生长情况，统计萌发率。分析发现，ZmGBF1过表达转基因玉米在PEG和盐胁迫下的生长情况较野生型好，芽较长（图15）。统计学分析萌发率显示（图16），ZmGBF1过表达转基因玉米种子萌发率显著高于野生型（P<0.05）。

二、PEG和NaCl渗透胁迫对玉米幼苗生长的影响

为了更好的观察干旱和盐胁迫下，野生型和ZmGBF1转基因玉米叶片和根系的变化，分别使用PEG模拟干旱胁迫和NaCl模拟盐胁迫。相同土培条件下将生长一致的野生型和转基因植株转移至霍格兰（Hoagland）营养液中，待长至三叶期进行20%PEG和200 mmol /LNaCl的营养液中。处理48 h后发现，正常条件下的野生型和过表达转基因株系叶片和根系均无明显的差异；PEG胁迫下的转基因株系和野生型叶片均失水萎蔫，叶尖出现枯死，但转基因株系生长状况明显优于野生型，转基因株系的根长和侧根明显大于野生型；NaCl胁迫下的转基因株系和野生型叶片均失绿，变黄，叶尖枯死，但野生型叶片发黄及叶尖枯死程度较为严重，且转基因株系的根长和侧根明显大于野生型（图17）。结果表明过表达ZmGBF1基可以提高玉米的抗旱性和耐盐性及促进根系发育。

三、土培条件下干旱和盐胁迫对玉米幼苗生长及生理的影响

1、干旱和盐胁迫对玉米幼苗生长发育的影响

土培野生型和转基因株系到三叶期，分别干旱胁迫5天和浇灌200 mmol/L NaCl胁迫5天，观察叶片和根系情况。图18可知，胁迫前野生型和转基因株系的叶片和根系差异不明显；干旱和盐胁迫5天后，野生型叶片失水萎蔫，叶片枯死严重，而转基因株系生长状态良好；观察根系发现，干旱胁迫时转基因株系的根长和侧根明显优于野生型，盐胁迫时转基因株系的侧根明显较多，根系发黄程度较轻。

进一步使用根系扫描仪分析野生型和转基因株系在干旱和盐胁迫下根系的变化（表2），发现胁迫前转基因和野生型株系的根长、根表面积、根直径、根体积和根尖数差异不显著；干旱胁迫和盐胁迫后，与野生型相比，转基因株系的根长、根表面积、根直径、根体积和根尖数显著增加。采用TTC法测定干旱和盐胁迫下野生型和转基因株系的根系活力，如图19所示，干旱和盐胁迫时，转基因株系的根系活力均显著高于野生型。

以上结果说明，过表达ZmGBF1基因显著提高了玉米的抗旱和耐盐性，并提高玉米根系活力，促进根系发育。

表3 干旱和盐胁迫对玉米幼苗根发育的影响

注：不同字母代表相同处理下野生型与转基因株系差异达到显著水平（P<0.05）。

2、干旱和盐胁迫对玉米幼苗叶片生理的影响

为了探究干旱和盐胁迫下，ZmGBF1过表达转基因株系提高抗旱和耐盐性的生理机制，进一步分析野生型和转基因株系叶片的叶绿素含量、渗透调节物质可溶性蛋白、抗氧化物酶活性的变化情况。如图20可知，干旱和盐胁迫导致野生型和转基因株系的叶绿素含量均下降，但两种胁迫下转基因株系的叶绿素含量显著高于野生型。

作为渗透调节物质和营养物质，可溶性蛋白既可调节细胞内外渗透势，提高细胞的保水能力，又对细胞的生命物质起到保护作用。本研究发现，干旱和盐胁迫时，转基因株系中的可溶性蛋白含量显著高于野生型（图21）。

抗氧化酶是过氧化物酶POD、超氧化物岐化酶SOD、过氧化氢酶CAT和谷胱甘肽过氧化物酶等的统称，协同抑制和消除植物体内有害自由基的产生或积累，能够清除 活性氧ROS来维持植物正常生长，植物在遭受旱胁迫时可通过 提高其活性来缓解旱压力，从而保护细胞膜免受伤害。由图22可知，干旱和盐胁迫时，转基因株系中的POD、SOD和CAT活性显著高于野生型。

以上结果说明，干旱和盐胁迫时，ZmGBF1过表达可以减小对叶片叶绿素的影响，并能提高玉米叶片渗透调节物质可溶性蛋白含量和抗氧化酶POD、SOD和CAT活性，减缓干旱和盐胁迫对细胞膜的损伤，提高玉米抗旱和耐盐性，维持玉米正常生长。

3、散粉期干旱胁迫下ZmGBF1过表达转基因玉米的花粉活力分析

采用TTC染色法测定散粉期干旱胁迫下转基因株系和野生型花粉活力，取少量野生型和转基因株系的花粉放在干净的载玻片上，加2滴TTC溶液，混匀盖上盖玻片，放置37°C培养箱中，30min后放在体式镜下观察，红色表示花粉活力强，淡红色次之，黄色或无色的为发育不良的花粉。图23可知，转基因株系中的花粉活力多为深红色，而野生型WT中的花粉多为浅红色和黄色。结果表明，散粉期干旱胁迫，野生型的花粉发育明显受到抑制，而转基因ZmGBF1过表达株系在胁迫后花粉仍能保持较高的发育，对提高后期籽粒结实率非常重要，直接影响产量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 河南省农业科学院粮食作物研究所

<120> 玉米转录因子ZmGBF1基因及其表达载体的制备方法和应用

<141> 2020-12-15

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 471

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

atgtcaagtg gcacttcgtc cggatcgagc cggtgggtcc aaagttctag atccgaggat 60

gacctagatc tccaggccca gatggagagg aggagaaagc ggaggaagga gtcgaatcgg 120

gagtcagctc ggaggtctag gcaacggaag caagaacacc ttgacgacct cacctcacag 180

gtaaatcagc tgaaggacca gaacaagcag ctcagcatgg cactgagtat aaccagccaa 240

aaccttgtgg cagtgcaagc gcagaactct gttctgcaga cccagaagat ggagctggac 300

agcaggctgg gtgccctgac ggagatcctc tggtacatga actcaagcac cagcaccagc 360

actgctccta caaatccagc catagcgaac gacttcacag catggagcag agcctctgat 420

attcttggtg gaaccagcta cagcgccata gacctgtacc aatgcttcta g 471

<210> 2

<211> 156

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 2

Met Ser Ser Gly Thr Ser Ser Gly Ser Ser Arg Trp Val Gln Ser Ser

1 5 10 15

Arg Ser Glu Asp Asp Leu Asp Leu Gln Ala Gln Met Glu Arg Arg Arg

20 25 30

Lys Arg Arg Lys Glu Ser Asn Arg Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg Gln

35 40 45

Arg Lys Gln Glu His Leu Asp Asp Leu Thr Ser Gln Val Asn Gln Leu

50 55 60

Lys Asp Gln Asn Lys Gln Leu Ser Met Ala Leu Ser Ile Thr Ser Gln

65 70 75 80

Asn Leu Val Ala Val Gln Ala Gln Asn Ser Val Leu Gln Thr Gln Lys

85 90 95

Met Glu Leu Asp Ser Arg Leu Gly Ala Leu Thr Glu Ile Leu Trp Tyr

100 105 110

Met Asn Ser Ser Thr Ser Thr Ser Thr Ala Pro Thr Asn Pro Ala Ile

115 120 125

Ala Asn Asp Phe Thr Ala Trp Ser Arg Ala Ser Asp Ile Leu Gly Gly

130 135 140

Thr Ser Tyr Ser Ala Ile Asp Leu Tyr Gln Cys Phe

145 150 155

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtcaagtg gcacttcgt 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctagaagcat tggtacaggt 20

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctagactagt atgtcaagtg gcacttcgt 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttggcgcgcc ctagaagcat tggtacaggt 30

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cggaattcat gtcaagtggc acttcgt 27

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgggatccct agaagcattg gtacaggt 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aggcgcgcca tgtcaagtgg cacttcgt 28

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgggatccct agaagcattg gtacaggt 28

Claims (4)

1.玉米转录因子ZmGBF1基因在提高玉米抗干旱和耐盐性中的应用，其特征在于：将ZmGBF1基因在玉米中过表达，在干旱胁迫和盐胁迫条件下提高玉米发芽能力、根系发育和花粉活力；所述ZmGBF1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，位于第7染色体，含有2个外显子和1个内含子；该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该蛋白含有bZIP-plant-G-box结合因子结构域、N末端富含脯氨酸的结构域和钙依赖蛋白激酶的结合位点，具有转录激活活性且属于核蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在散粉期干旱胁迫条件下，花粉仍能保持较高的发育，提高后期籽粒结实率。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述应用通过构建玉米转录因子ZmGBF1基因的融合表达载体或过表达载体，然后转入玉米植株中实现。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述融合表达载体的制备步骤如下：

（1）以玉米总RNA反转录得到的cDNA为模板，以ZmGBF1-F和ZmGBF1-R为引物对进行扩增目的片段并回收；其中引物ZmGBF1-F的序列如SEQ ID No.3所示、ZmGBF1-R的序列如SEQ IDNo.4所示；

（2）以步骤（1）的目的片段作为模板，分别以ZmGBF1-F-SpeI和ZmGBF1-R-AscI、ZmGBF1-F-ECORI和ZmGBF1-R-BamHI、ZmGBF1-F-AscI和ZmGBF1-R-BamHI，作为特异性引物对，进行扩增；其中ZmGBF1-F-SpeI的序列如SEQ ID No.5所示、ZmGBF1-R-AscI的序列如SEQ ID No.6所示、ZmGBF1-F-ECORI的序列如SEQ ID No.7所示、ZmGBF1-R-BamHI的序列如SEQ ID No.8所示、ZmGBF1-F-AscI的序列如SEQ ID No.9所示；

（3）步骤（2）的三个扩增产物经双酶切后用T4连接酶过夜连接并转化，挑取验证正确的阳性克隆即为玉米转录因子ZmGBF1基因的融合表达载体ZmGBF1-pMDC83-GFP。

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