FR3141177A1 - Nouveaux peptides et leur utilisation pour moduler l’accumulation d’une proteine - Google Patents
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Abstract
TITRE : NOUVEAUX PEPTIDES ET LEUR UTILISATION POUR MODULER L’ACCUMULATION D’UNE PROTEINE La présente invention concerne de nouveaux peptides (cPEPs & altPEPs), leur procédé de préparation et leur utilisation pour moduler l’accumulation de protéines spécifiques. (pas de figure)
Description
La présente invention concerne de nouveaux peptides (cPEPs & altPEPs), leur procédé de préparation et leur utilisation pour moduler l’accumulation de protéines spécifiques.
De manière générale, les peptides sont de courtes séquences de 2 à environ 100 acides aminés. Il s’agit souvent de molécules très actives, comme par exemple des hormones ou des composés de venins.
Chez les plantes, les peptides remplissent de nombreuses fonctions biologiques, telles que le développement ou les mécanismes de défense. Dans la mesure où la détection des peptides est relativement difficile, seul un nombre limité de peptides a été identifié, sous-estimant probablement la quantité et le rôle des peptides chez ces organismes.
La plupart des peptides caractérisés chez les plantes résulte vraisemblablement de la dégradation de protéines fonctionnelles. Toutefois, il a été montré que les transcrits primaires de microARNs (miRs) des plantes contiennent en réalité de petits cadres ouverts de lecture (miORFs) codant des peptides régulateurs, appelés miPEPs (Lauressergues Det al. Primary transcripts of microRNAs encode regulatory peptides. Nature. 2015 Apr 2 ;520(7545):90-3.). Les miPEPs sont produits au même endroit que les miRs d’où ils proviennent et permettent d’améliorer la transcription des pri-miRs correspondants. L’activité d’un miPEP est très spécifique du miR correspondant, permettant de sur-réguler le miR choisi sans affecter l’expression des autres miRs. L’utilisation de miPEPs peut permettre de moduler l’expression d’un gène, si celui-ci est régulé par un miR, lui-même régulé par un miPEP (WO 2015/063431).
Dans ce contexte, l’exposé ci-après offre un moyen universel, et facilement exploitable, pour moduler spécifiquement l’accumulation d’une protéine choisie chez une plante à l’aide soit d’un peptide non naturel (invention No. 1 ;cPEP), c’est-à-dire un peptide qui n’est pas naturellement produit par la plante, soit d’un peptide naturel (invention No. 2 ;altPEP), c’est-à-dire un peptide qui est naturellement produit par la plante.
Quelle que soit l’invention considérée, l’un de leurs aspects est de proposer un procédé de préparation et de détermination d’un peptide « cPEP » ou « altPEP » capable de moduler l’accumulation (l’expression) d’une protéine spécifique dans une cellule végétale. Un second aspect de celles-ci est de proposer un procédé de modulation de l’accumulation d’une protéine chez une plante à l’aide d’un cPEP ou d’un altPEP. Un troisième aspect de celles-ci est de proposer l’utilisation d’un cPEP ou d’un altPEP pour moduler l’accumulation d’une protéine chez une plante. Un quatrième aspect de celles-ci est de proposer un procédé pour favoriser, ralentir ou empêcher le développement d’une plante. Un cinquième aspect de celles-ci est de proposer des peptides cPEP ou des peptides altPEP permettant de moduler l’accumulation d’une protéine chez une plante. D’autres aspects complémentaires de ces inventions concernent un acide nucléique codant un cPEP ou un altPEP, des compositions comprenant un cPEP ou un altPEP et des plantes modifiées ou transgéniques comprenant un cPEP ou un altPEP.
Considérant la première invention (cPEP), un premier aspect de celle-ci concerne un procédé de préparation et de détermination d’un cPEP, ledit cPEP :
- ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés ;
- étant capable de moduler l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale ; et
- n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine,
ledit procédé comprenant :
a. une étape de détermination de la séquence d’acides nucléiques de l’ARN messager (ARNm) codant ladite protéine ;
b. une étape de détermination au sein de cet ARNm de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine ;
c. une étape de détermination au sein de cette séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale d’un fragment de celle-ci,
ledit fragment ayant une taille de 3nnucléotides,nétant compris de 4 à 70, en particuliernétant compris de 4 à 41, et ledit fragment ayant une taille inférieure à celle de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale ;
d. une étape de production du peptide codé par ledit fragment ; et
e. une étape de comparaison :
- entre l’accumulation de ladite protéine dans une cellule végétale en présence dudit peptide et l’accumulation de ladite protéine dans une cellule végétale de même type en absence dudit peptide ; et/ou
- entre le phénotype d’une plante en présence dudit peptide et le phénotype d’une plante de même type en absence dudit peptide,
dans laquelle :
- une différence de la quantité de ladite protéine en présence dudit peptide par rapport à la quantité de ladite protéine en absence dudit peptide ; et/ou
- une différence du phénotype en présence dudit peptide par rapport au phénotype en absence dudit peptide,
indique que ledit peptide est un cPEP capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans une cellule végétale.
La présente invention repose sur la constatation inattendue faite par les Inventeurs qu’il est possible de moduler spécifiquement l’accumulation d’une protéine à l’aide d’un peptide particulier non produit naturellement, dont la séquence correspond à la traduction (artificielle) d’un fragment de l’ARN messager (ARNm) codant ladite protéine, ledit fragment étant choisi sur la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine.
Dans l’invention, le terme « cPEP » (complementary peptide) désigne un peptide artificiel capable de moduler spécifiquement l’accumulation d’une protéine une fois introduit dans une cellule végétale.
Selon l’invention, un cPEP n’est pas présent naturellement dans une cellule végétale. Cela signifie que la cellule végétale contient l’information du cPEP mais ne contient pas la séquence nucléique capable de permettre son expression. Seule la séquence peptidique du cPEP peut être déduite à partir de la séquence de l’ARNm codant ladite protéine dont on veut moduler l’accumulation.
Un cPEP n’est présent dans une cellule végétale qu’une fois que celui-ci y a été introduit sous la forme d’un peptide ou sous la forme d’un acide nucléique codant ledit peptide.
La spécificité du cPEP vis-à-vis d’une protéine cible (d’un gène cible) est déterminée par sa séquence d’acides aminés. En effet, la séquence d’un cPEP correspond à la traductionin silico(artificielle) d’un fragment de l’ARNm codant ladite protéine, ledit fragment étant choisi sur la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine.
La séquence peptidique d’un cPEP peut donc être déterminée à partir d’un fragment de l’ARNm codant ladite protéine en appliquant, dès le premier nucléotide dudit fragment, le code génétique attribuant à chaque triplet de nucléotides un acide aminé spécifique (AUC = Isoleucine, ACA = Thréonine,etc.).
Dans l’invention, le fragment de l’ARNm utilisé pour déterminer la séquence du cPEP peut être choisi dans les trois cadres de lecture existants sur la séquence de l’ARNm. En d’autres termes, un fragment peut être sélectionné dans les cadres de lecture +1, +2 ou +3. Sur ce point, il est possible que les trois des cadres de lecture contiennent l’information d’un cPEP comme il est possible que seulement un des trois des cadres de lecture (le +1, le +2 ou le +3) ou deux des trois des cadres de lecture (le +1 et le +2, le +1 et le +3, ou le +2 et le +3) contiennent l’information d’un cPEP.
Dans l’invention, le terme « cadre de lecture » désigne le regroupement des nucléotides constituant une séquence d’acides nucléiques en triplets (ou codons) consécutifs, qui se succèdent sans interruption ni recouvrement.
D’une manière générale, les cPEPs ont une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier une taille comprise de 4 à 41 acides aminés, notamment une taille comprise de 5 à 40 acides aminés, de 7 à 20 acides aminés ou plus particulièrement une taille comprise de 8 à 15 acides aminés. Par conséquent, la séquence d’un cPEP correspond à la traduction d’un fragment compris de 4 à 70 triplets de nucléotides, en particulier un fragment compris de 4 à 41 triplets de nucléotides, notamment d’un fragment compris de 5 à 40 triplets de nucléotides, de 7 à 20 triplets de nucléotides ou plus particulièrement d’un fragment compris de 8 à 15 triplets de nucléotides.
En d’autres termes, la séquence d’un cPEP correspond à la traduction en acides aminés d’un fragment de « 3n» nucléotides de l’ARNm de la protéine cible,nétant compris de 4 à 70, en particulier compris de 4 à 41, notamment compris de 5 à 40, de 7 à 20 ou plus particulièrement compris de 8 à 15.
Par exemple, sinest égal à 5, le cPEP a une taille de 5 acides aminés et correspond à la traduction d’un fragment de 15 (= 3 x 5) nucléotides. Par exemple, sinest égal à 40, le cPEP a une taille de 40 acides aminés et correspond à la traduction d’un fragment de 120 (= 3 x 40) nucléotides. Par exemple, sinest égal à 70, le cPEP a une taille de 70 acides aminés et correspond à la traduction d’un fragment de 210 (= 3 x 70) nucléotides.Etc.
Les cPEPs ont une taille de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 acides aminés, et correspondent respectivement à la traduction de fragments de 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207 ou 210 nucléotides.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit fragment a une taille de 3nnucléotides,nétant compris :
- de 4 à 41 ;
- de 5 à 40 ;
- de 7 à 20 ; ou
- de 8 à 15.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit peptide a une taille choisie parmi : 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 et 70 acides aminés.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP a une taille inférieure à celle de ladite protéine (i.e.celle dont le cPEP module l’accumulation).
Comme indiqué plus haut, les cPEPs ont la capacité de moduler spécifiquement l’accumulation d’une protéine sans que l’accumulation de l’ARNm lui correspondant soit impacté. Autrement dit, l’ajout d’un cPEP dans une cellule végétale ne modifie pas la quantité d’ARNm permettant d’exprimer la protéine qu’il a la capacité de réguler, mais seulement la quantité de ladite protéine.
Selon l’invention, le terme « protéine » désigne une séquence d’acides aminés dont l’information est codée par un gène présent sur le génome d’une cellule végétale. Par « gène », on désigne donc, notamment, la séquence d’acides nucléiques nécessaire à la synthèse de ladite protéine. Aussi, un gène comprend davantage que les nucléotides codant la séquence d’acides aminés de la protéine. Par exemple, un gène inclut les séquences d’ADN nécessaires à la synthèse d’un pré-messager (pré-ARNm), lequel est ensuite maturé par la machinerie cellulaire en un ARN messager (ARNm). Ce dernier peut alors être traduit,viales ribosomes, en une protéine.
Au vu de ce qui précède, on comprend que l’ARN pré-messager (pré-ARNm) n’a pas subi d’épissage et est susceptible de contenir des introns, tandis que l’ARN messager (ARNm) mature peut avoir subi un épissage et ne contient que des exons.
Pour préparer un cPEP capable de moduler l’accumulation d’une protéine, il convient de traduire un fragment de l’ARNm codant ladite protéine, ledit fragment étant choisi sur la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine, lequel ne comprend ni la région 5’-UTR, ni la région 3’-UTR de l’ARNm.
Dans l’invention, la « modulation » de l’accumulation d’une protéine désigne soit une augmentation de l’accumulation de ladite protéine (i.e.une augmentation de la quantité de protéine dans la cellule végétale), soit une diminution de l’accumulation de ladite protéine (i.e.une diminution de la quantité de protéine dans la cellule végétale). Autrement dit, un mode de réalisation de l’invention a pour objet le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite modulation de l’accumulation de ladite protéine induite par ledit cPEP est :
- une diminution de l’accumulation de ladite protéine ; ou
- une augmentation de l’accumulation de ladite protéine.
L’augmentation et la diminution de l’accumulation de ladite protéine peuvent être mesurées et suivies à l’aide de méthodes bien connues de l’homme du métier, telles que le couplage de la protéine à un marqueurvial’utilisation de cassettes d’expression particulières, ou un Western blot.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel à l’étape e., la quantité de protéine en présence dudit peptide est supérieure à la quantité de protéine en absence dudit peptide. En d’autres termes, en présence d’un cPEP favorisant l’augmentation de l’accumulation de la protéine, la traduction de l’ARNm correspondant est augmentée, ce qui conduit à une production plus importante de la protéine sans que soit modifiée la quantité dudit ARNm.
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel à l’étape e., la quantité de protéine en présence dudit peptide est inférieure à la quantité de protéine en absence dudit peptide. En d’autres termes, en présence d’un cPEP favorisant la diminution de l’accumulation de la protéine, la traduction de l’ARNm correspondant est diminuée (inhibée), ce qui conduit à une production moins importante de la protéine sans que soit modifiée la quantité dudit ARNm.
Dans l’invention, bien que le fragment de l’ARNm codant ledit cPEP soit situé au sein la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine, ledit fragment en tant que tel n’est pas traduit naturellement dans ladite cellule végétale. Ceci, quel que soit le cadre de lecture utilisé. L’existence d’un cPEP au sein de ladite cellule végétale est donc artificielle et a pour origine une action de l’Homme. Pour cela, il est possible soit d’introduire artificiellement ledit cPEP en tant que tel, soit d’introduire une cassette d’expression comprenant la séquence d’acides nucléiques codant ledit cPEP et les moyens de l’exprimer dans ladite cellule végétale.
Dans l’invention, la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale, laquelle comprend un fragment portant l’information d’un cPEP, est une région de l’ARNm qualifiée de « codante », c’est-à-dire qu’elle correspond à une région de l’ARNm qui code tout ou partie de la protéine fonctionnelle. Cette séquence correspond donc au cadre ouvert de lecture principal, lequel code la protéine dont on veut moduler l’accumulation.
Dans l’invention, les termes « cadre ouvert de lecture » et « ORF » (open reading frame) sont équivalents, et peuvent être utilisés l’un pour l’autre. Ils correspondent à une séquence de nucléotides (acides nucléiques) dans une molécule d’ADN ou d’ARN pouvant potentiellement coder un peptide ou une protéine : ledit cadre ouvert de lecture débute par un codon START (le codon START codant généralement une méthionine), suivi d’une série de codons (chaque codon codant un acide aminé), et se termine par un codon STOP (le codon STOP n’étant pas traduit).
La région codante de l’ARNm correspond donc à la séquence génétique délimitée par le codon START ou codon d’initiation (codant le plus souvent une méthionine) à l’extrémité 5’ et par le codon STOP à l’extrémité 3’. La région codante de l’ARNm ne comprend pas donc les séquences introniques éventuellement présentes dans la séquence d’un gène ou de l’ARN pré-messager (pré-ARNm), ni les régions 5’UTR et 3’UTR, car celles-ci ne sont pas traduites et ne codent donc pas une partie de la protéine fonctionnelle du gène.
Dans l’invention, la séquence d’un cPEP est déterminée en effectuant une traduction (artificielle) d’un fragment de l’ARNm de la protéine dont on veut moduler l’accumulation, ledit fragment étant choisi sur la séquence (codante) d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine. Aussi, une même séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale peut donner des cPEPs différents selon le fragment de l’ARNm choisi. Par ailleurs, ce même fragment d’ARNm peut lui aussi donner des cPEPs différents selon le cadre de lecture utilisé pour le traduire (artificiellement),i.e.selon le regroupement des nucléotides de la séquence en triplets consécutifs. En effet et comme précédemment mentionné, une traduction peut être réalisée dans les trois cadres de lecture différents conduisant ainsi à potentiellement trois cPEPs différents.
Selon l’invention, le cadre de lecture ‘‘+1’’ correspond au cadre de lecture déterminé par le codon d’initiation de la protéine,i.e.le codon START du cadre ouvert de lecture utilisé naturellement pour la traduction de l’ARNm. En d’autres termes, dans le cas d’un fragment d’ARNm correspondant à une région codante et traduit selon le cadre de lecture +1, le cPEP obtenu possède une séquence identique à celle d’un fragment de la séquence d’acides aminés de la protéine naturellement codée par ledit ARNm.
Les cadres de lecture ‘‘+2’’ et ‘‘+3’’ correspondent à des cadres de lecture qui ne sont pas (ou peu) utilisés naturellement pour la traduction de l’ARNm. Selon l’invention, le cadre de lecture ‘‘+2’’ correspond au cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture utilisé naturellement pour la traduction de l’ARNm et de la protéine qu’il code. Selon l’invention, le cadre de lecture ‘‘+3’’ correspond au cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture utilisé naturellement pour la traduction de l’ARNm et de la protéine qu’il code.
Généralement, dans le cas d’un fragment d’ARNm correspondant à une région codante et traduit selon le cadre de lecture +2 ou +3, les cPEPs obtenus possèdent une séquence différente de celle d’un fragment de la séquence d’acides aminés de la protéine naturellement codée par ledit ARNm.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit fragment est dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; ou
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et dans lequel ledit fragment est choisi :
- soit dans le même cadre de lecture que le cadre ouvert de lecture codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit fragment est dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; et
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et dans lequel ledit fragment est choisi :
- soit dans le même cadre de lecture que le cadre ouvert de lecture codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine.
On comprend donc qu’un cPEP, selon les modes de réalisation ci-dessus, comprend soit un codon AUG (et pas de codon STOP), soit un codon STOP (et pas de codon AUG), soit aucun de ces deux éléments. En l’espèce, c’est l’homme du métier qui ajoute si besoin l’élément manquant ou ces éléments manquants pour permettre, de manière non limitative, soit de produirein vitroun cPEP par le biais, par exemple, d’un microorganisme puis de l’utiliser (dans une composition par exemple), soit d’en introduire la séquence et les moyens de l’exprimerviaun vecteur dans une cellule de plante ou une plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le même cadre de lecture que le cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le cadre de lecture déterminé par le codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est un peptide hydrophobe ou un peptide hydrophile. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est un peptide hydrophobe. Par « peptide hydrophobe », on entend un peptide dont la séquence en acides aminés comprend plus de 50 % d’acides aminés hydrophobes. Par « plus de 50 % », on entend que la séquence en acides aminés comprend plus de 55 %, plus de 60 %, plus de 65 %, plus de 70 %, plus de 75 % ou plus de 80 % d’acides aminés hydrophobes. Par « plus de 50 % », on entend également que la séquence en acides aminés comprend au moins 51 %, au moins 56 %, au moins 61 %, au moins 66 %, au moins 71 %, au moins 76 % ou au moins 81 % d’acides aminés hydrophobes. Par « acides aminés hydrophobes », on entend les acides aminés choisis parmi : alanine (Ala / A), isoleucine (Ile / I), leucine (Leu / L), méthionine (Met / M), phénylalanine (Phe / F), tryptophane (Trp / W), tyrosine (Tyr / Y) et valine (Val / V).
En particulier, l’invention concerne également le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est un peptide hydrophile. Par « peptide hydrophile », on entend un peptide dont la séquence en acides aminés comprend plus de 50 % d’acides aminés hydrophiles. Par « plus de 50 % », on entend que la séquence en acides aminés comprend plus de 55 %, plus de 60 %, plus de 65 %, plus de 70 %, plus de 75 % ou plus de 80 % d’acides aminés hydrophiles. Par « plus de 50 % », on entend également que la séquence en acides aminés comprend au moins 51 %, au moins 56 %, au moins 61 %, au moins 66 %, au moins 71 %, au moins 76 % ou au moins 81 % d’acides aminés hydrophiles. Par « acides aminés hydrophiles », on entend les acides aminés choisis parmi : acide aspartique (Asp / D), acide glutamique (Glu / E), arginine (Arg / R), asparagine (Asn / N), glutamine (Gln / Q), histidine (His / H), lysine (Lys / K), sérine (Ser / S) et thréonine (Thr / T).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de préparation et de détermination d’un cPEP, ledit cPEP :
- ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés ;
- étant capable de moduler l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale ; et
- n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine,
ledit procédé comprenant :
a. une étape de détermination de la séquence d’acides nucléiques de l’ARN messager (ARNm) codant ladite protéine ;
b. une étape de détermination au sein de cet ARNm d’une des séquences d’acides nucléiques comprenant deux parties contiguës :
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée non codante (i.e.non traduite naturellement,e.g.5’UTR ou 3’UTR), et
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée codante (i.e.traduite naturellement,e.g.exon) ;
c. une étape de détermination au sein de cette séquence d’acides nucléiques comprenant deux parties contiguës d’un fragment de celle-ci,
ledit fragment ayant une taille de 3nnucléotides susceptible d’être traduiteviale code génétique en un peptide,nétant compris de 4 à 70, en particuliernétant compris de 4 à 41 ;
d. une étape de production dudit peptide ; et
e. une étape de comparaison :
- entre l’accumulation de ladite protéine dans une cellule végétale en présence dudit peptide et l’accumulation de ladite protéine dans une cellule végétale de même type en absence dudit peptide ; et/ou
- entre le phénotype d’une plante en présence dudit peptide et le phénotype d’une plante de même type en absence dudit peptide,
dans laquelle :
- une différence de la quantité de ladite protéine en présence dudit peptide par rapport à la quantité de ladite protéine en absence dudit peptide ; et/ou
- une différence du phénotype en présence dudit peptide par rapport au phénotype en absence dudit peptide,
indique que ledit peptide est un cPEP capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans une cellule végétale.
Selon l’invention, un cPEP peut être produit par tout type de moyens accessibles à l’homme du métier.
De manière non limitative, un cPEP peut être produit aussi bien par synthèse, que par expression recombinante dans des systèmes homologues ou hétérologues. Le cPEP ainsi produit peut ensuite être introduit dans une cellule pour moduler l’accumulation d’une protéine cible.
De manière non limitative, il est également possible de produire un cPEP directement dans la cellule végétale contenant la protéine cible, en introduisant artificiellement dans celle-ci un acide nucléique (tel qu’un vecteur d’expression) codant ledit cPEP.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel, à l’étape d., la production dudit peptide est réalisée par synthèse peptidique ou par expression recombinante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel, à l’étape d., la production dudit peptide est réalisée à l’aide d’un acide nucléique codant ledit peptide introduit dans une cellule.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel, à l’étape e., la production dudit peptide est réalisée à l’aide d’un acide nucléique codant ledit peptide introduit dans ladite cellule végétale ou dans ladite plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel, à l’étape e., ledit peptide est mis en contact avec ladite cellule végétale ou dans ladite plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel, à l’étape e., ledit peptide est présent dans ladite cellule végétale ou dans ladite plante suite à l’expression d’un acide nucléique codant ledit peptide dans ladite cellule végétale ou dans ladite plante.
Au vu de ce qui précède, on comprend qu’un autre mode de réalisation de l’invention a pour objet le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel, à l’étape e., la présence dudit peptide dans ladite cellule végétale ou dans ladite plante résulte :
- de l’introduction d’une séquence d’acides nucléiques codant ledit peptide et comprenant les moyens de l’exprimer ; ou
- de l’introduction d’une séquence d’acides aminés correspondant audit peptide.
Un cPEP peut être utilisé pour moduler l’accumulation d’une protéine présente naturellement (i.e.endogène) ou non (i.e.exogène) dans ladite cellule végétale ou dans ladite plante.
Une « protéine naturellement présente dans une cellule végétale ou dans une plante » correspond à une protéine endogène codée par un gène présent sur le génome de la cellule végétale ou de la plante sans qu’il y ait eu nécessité d’intervention directe ou indirecte d’un être humain.
Une « protéine qui n’est pas naturellement présente dans une cellule végétale ou dans une plante » correspond à une protéine exogène codée par une séquence d’acides nucléiques présente sur le génome de la cellule végétale ou de la plante qui a nécessité l’intervention d’un être humain et l’emploi de moyens connus de l’homme du métier. Une telle séquence d’acides nucléiques peut provenir de la même espèce de plante ou d’une autre espèce de plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est d’origine endogène dans lesdites cellules végétales ou lesdites plantes utilisées à l’étape e.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est d’origine exogène dans lesdites cellules végétales ou lesdites plantes utilisées à l’étape e., lesdites cellules végétales ou lesdites plantes utilisées à l’étape e. comprenant alors une séquence d’acides nucléiques permettant l’expression de ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel l’accumulation de ladite protéine est déterminéeviala mise en œuvre d’une technique choisie parmi : le Western blot, la mesure de l’activité enzymatique, la spectrométrie de masse et la fusion traductionnelle. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel l’accumulation de ladite protéine est déterminéeviala mise en œuvre d’un Western blot.
Les Inventeurs ont constaté de manière surprenante que l’utilisation des cPEPs permet de modifier les phénotypes d’une plante visibles à l’échelle macroscopique. Il est donc tout à fait possible d’utiliser ces derniers pour affirmer (ou infirmer) que le peptide déterminé aux étapes a., b. et c., et éventuellement produit à l’étape d. est un cPEP (ou non). C’est d’ailleurs ce que permet l’alternative dite de comparaison phénotypique mise en œuvre à l’étape e. Par exemple, si le peptide déterminé sur l’ARNm d’une protéine impliquée dans la taille de la tige d’une plante provoque une augmentation, ou une diminution, de la taille de la tige d’une plante traitée avec ce dernier par rapport à une plante non traitée, cela signifie que ledit peptide est un cPEP capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la taille de la tige.
Dans l’invention, le terme « plante » fait référence de manière générale :
- à un ensemble de cellules végétales organisé en tout ou partie d’une plante quel que soit son stade de développement (y compris la plante sous forme de graine ou de jeune pousse) ;
- à un ou plusieurs organes de la plante (comme par exemple les feuilles, les racines, la tige, les fleurs) ;
- à une ou plusieurs cellules de la plante ; ou encore
- à un amas de cellules de la plante (e.g.un cal).
Dans l’invention, le terme « phénotype » désigne de manière non limitative les caractères visibles à l’échelle macroscopique tel que le nombre de racines latérales, le nombre de feuilles, la taille de la tige, la durée de floraison et la résistance au stress. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne par conséquent le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est impliquée dans au moins un phénotype de plante choisi parmi :
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de feuilles ;
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de fleurs ;
- la taille de la tige (ou de la hampe florale) ;
- la biomasse racinaire ;
- le nombre, la longueur et le niveau de ramification des racines ;
- la précocité de la germination ;
- la précocité du bourgeonnement ;
- la précocité de l’induction florale (ou transition florale) ;
- la vigueur germinative et la durée de phase juvénile ;
- la durée de la floraison ;
- la résistance à un stress biotique ;
- la résistance à un stress abiotique ; et
- le nombre de cellules.
Selon l’invention, une protéine est « impliquée dans un phénotype » si une modification de l’accumulation de celle-ci est associée à une modification dudit phénotype. En d’autres termes, une protéine est impliquée dans un phénotype si elle intervient dans le(s) caractère(s) correspondant audit phénotype.
Au vu de ce qui précède, on comprend qu’un objet de l’invention est le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel le phénotype observé à l’étape e. est choisi parmi :
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de feuilles ;
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de fleurs ;
- la taille de la tige (ou de la hampe florale) ;
- la biomasse racinaire ;
- le nombre, la longueur et le niveau de ramification des racines ;
- la précocité de la germination ;
- la précocité du bourgeonnement ;
- la précocité de l’induction florale (ou transition florale) ;
- la vigueur germinative et la durée de phase juvénile ;
- la durée de la floraison ;
- la résistance à un stress biotique ;
- la résistance à un stress abiotique ; et
- le nombre de cellules.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP :
- ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés ;
- étant capable de moduler l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale ; et
- n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine,
et dans lequel ladite cellule végétale (i.e.celle dans laquelle on souhaite moduler l’accumulation d’une protéine) appartient à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum(pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel lesdites cellules végétales ou lesdites plantes utilisées à l’étape e. appartiennent à :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum(pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite cellule végétale (i.e.celle dans laquelle on souhaite moduler l’accumulation d’une protéine) est une cellule d’une algue.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel lesdites cellules végétales ou lesdites plantes utilisées à l’étape e appartiennent à une algue.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène choisi parmi :Aae15 (Acyl-activating enzyme 15), Aae16 (AMP-dependent synthetase and ligase family protein), Abcg11 (White-brown complex-like protein), Abdcg34 (ABC transporter G family member 34), Acc1 (Acetyl-CoA Carboxylase), Agb1 (GTP binding protein beta 1), Als (Acetolactate synthase (chloroplastic)), Anac076 (NAC domain-containing protein 76), Apg9 (Autophagy 9), Arlb1 (GTP-binding protein 1), Arr1 (Two-component response regulator ARR1), Arr5 (Two-component response regulator ARR5), Arr6 (Two-component response regulator ARR6), At59 (Pectate lyase family protein), Bak1 (Brassinosteroid insensitive 1-associated receptor kinase 1), Bccp1 (Acetyl-CoA Carboxylase (chloroplastic) subunit 1), Bccp2 (Acetyl-CoA Carboxylase (chloroplastic) subunit 2), Bri1 (Brassinosteroid insensitive 1), Bzo2h3 (bZIP transcription factor family protein), Cesa6 (Cellulose synthase A catalytic subunit 6), Cipk3 (CBL-interacting protein kinase 3), Cks1 (Cyclin-dependent kinases regulatory subunit 1), Cobl8 (COBRA-like protein 8 precursor), Coi1 (Coronatine-insensitive protein 1), Cpk3 (Calcium-dependent protein kinase 3), Crk34 (Cysteine-rich receptor-like protein kinase 34), Cyp705a18 (Cytochrome P450, family 705, subfamily A, polypeptide 18), Cyp71b26 (Cytochrome P450, family 71, subfamily B, polypeptide 26), Cyp78a8 (Cytochrome P450, family 78, subfamily A, polypeptide 8), Cyp97b3 (Cytochrome P450, family 97, subfamily B, polypeptide 3), Dcl1 (Endoribonuclease Dicer homolog 1), Dur3 (Urea-proton symporter DUR3), Ein2 (Ethylene-insensitive protein 2), Emb175 (Pentatricopeptide repeat-containing protein), Emb2726 (Elongation factor Ts family protein), Emb9 (Dihydrofolate synthetase), Epsps (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (chloroplastic)), Fnr1 (Ferredoxin-NADP[+]-oxidoreductase 1), Fve (Transducin family protein / WD-40 repeat family protein), Ga2ox7 (Gibberellin 2-beta-dioxygenase 7), Gapc (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), Gcn2 (ABC transporter family protein), Gdi2 (Guanosine nucleotide diphosphate dissociation inhibitor 2), Gln2 (Glutamine synthetase (chloroplastic)), Gsl3 (Callose synthase 2), Hag5 (Histone acetyltransferase of the MYST family 2), Hda18 (Histone deacetylase 18), Hexo1 (Beta-hexosaminidase 1), Hppd (4-hydroxyphenyl-pyruvate-dioxygenase), Hsl1 (B3 domain-containing transcription repressor VAL2), Iaa31 (Indole-3-acetic acid inducible 31), Iqd28 (IQ-domain 28), Jac1 (J-domain protein required for chloroplast accumulation response 1), Jar1 (Jasmonoyl--L-amino acid synthetase), Kp1 (Kinesin-like protein 1), Lrx2 (Leucine-rich repeat/extensin 2), Mapkkk3 (Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3), Mapkkk5 (Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5), Mfp2 (Multifunctional protein 2), Mrb1 (Transmembrane protein, putative (DUF3537)), Nsp1 (Nodulation signaling pathway 1), Pds (Phytoene desaturase (chloroplastic)), Pen3 (Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase and protein-tyrosine-phosphatase), Phyb (Phytochrome B), Pif3 (Phytochrome interacting factor 3), Pizza (Brassinosteroid-related acyltransferase 1), Ppox1 (Protoporphyrinogen oxidase (chloroplastic) 1), Ppox2 (Protoporphyrinogen oxidase (chloroplastic) 2), Prp39 (Tetratricopeptide repeat (TPR)-like superfamily protein), PsbA (Photosystem II D1 protein), Pskr1 (Phytosulfokin receptor 1), Rd21 (Granulin repeat cysteine protease family protein), Ring1 (RING/U-box superfamily protein), Ros1 (DNA glycosylase/AP lyase ROS1), Rpt4a (26S proteasome regulatory subunit 10B homolog A), Sfr6 (Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 16), Shr (Protein SHORT-ROOT), Shy2 (Auxin-responsive protein IAA3), Skl (EIN2-like protein, nramp transporter), Sps1 (Sucrose phosphate synthase 2F), Spt (Transcription factor SPATULA), Stn8 (Serine/threonine-protein kinase), Tap46 (PP2A regulatory subunit TAP46), Topp6 (Serine/threonine-protein phosphatase PP1 isozyme 7), TubB6 (Tubulin), TubB8 (Tubulin), Uba1a (RNA-binding (RRM/RBD/RNP motifs) family protein), Vim3 (E3 ubiquitin-protein ligase), Sgr1 (Magnesium dechelatase), Abi5 (Abscisic acid (ABA)-insensitive 5), Hsp101 (Heat shock protein 101), Rh10 (ATP-dependent RNA helicase)etWus (WUSCHEL).
En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène choisi parmi :Cpk3,Dcl1etNsp1. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par le gèneCpk3. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par le gèneDcl1. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par le gèneNsp1.
Les gènesAae15, Aae16, abcg11, Abdcg34, Acc1, Agb1, Als, Anac076, Apg9, Arlb1, Arr1, Arr5, Arr6, At59, Bak1, Bccp1, Bccp2, Bri1, Bzo2h3, Cesa6, Cipk3, Cks1, Cobl8, Coi1, Cpk3, Crk34, Cyp705a18, Cyp71b26, Cyp78a8, Cyp97b3, Dcl1, Dur3, Ein2, Emb175, Emb2726, Emb9, Epsps, Fnr1, Fve, Ga2ox7, Gapc, Gcn2, Gdi2, Gln2, Gsl3, Hag5, Hda18, Hexo1, Hppd, Hsl1, Iaa31, Iqd28, Jac1, Jar1, Kp1, Lrx2, Mapkkk3, Mapkkk5, Mfp2, Mrb1, Nsp1, Pds, Pen3, Phyb, Pif3, Pizza, Ppox1, Ppox2, Prp39, PsbA, Pskr1, Rd21, Ring1, Ros1, Rpt4a, Sfr6, Shr, Shy2, Skl, Sps1, Spt, Stn8, Tap46, Topp6, TubB6, TubB8, Uba1a, Vim3, Sgr1, Abi5, Hsp101, Rh10etWusfont références aux protéines indiquées entre parenthèses. Bien entendu, l’invention concerne également des gènes homologues et/ou similaires susceptibles de porter des dénominations différentes. Par exemple, chezA. thalianale gèneGsl3codant pour lacallose synthase 2s’appelle égalementCals2.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un ORF comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NO : 1 (ORF de la protéine Aae15,A. thaliana), SEQ ID NO : 2 (ORF de la protéine Aae16,A. thaliana), SEQ ID NO : 3 (ORF de la protéine abcg11,A. thaliana), SEQ ID NO : 4 (ORF de la protéine Abdcg34,A. thaliana), SEQ ID NO : 5 (ORF de la protéine Acc1,A. thaliana), SEQ ID NO : 6 (ORF de la protéine Agb1,A. thaliana), SEQ ID NO : 7 (ORF de la protéine Als,A. thaliana), SEQ ID NO : 8 (ORF de la protéine Anac076,A. thaliana), SEQ ID NO : 9 (ORF de la protéine Apg9,A. thaliana), SEQ ID NO : 10 (ORF de la protéine Arlb1,A. thaliana), SEQ ID NO : 11 (ORF de la protéine Arr1,A. thaliana), SEQ ID NO : 12 (ORF de la protéine Arr5,A. thaliana), SEQ ID NO : 13 (ORF de la protéine Arr6,A. thaliana), SEQ ID NO : 14 (ORF de la protéine At59,A. thaliana), SEQ ID NO : 15 (ORF de la protéine Bak1,A. thaliana), SEQ ID NO : 16 (ORF de la protéine Bccp1,A. thaliana), SEQ ID NO : 17 (ORF de la protéine Bccp2,A. thaliana), SEQ ID NO : 18 (ORF de la protéine Bri1,A. thaliana), SEQ ID NO : 19 (ORF de la protéine Bzo2h3,A. thaliana), SEQ ID NO : 20 (ORF de la protéine Cesa6,A. thaliana), SEQ ID NO : 21 (ORF de la protéine Cipk3,A. thaliana), SEQ ID NO : 22 (ORF de la protéine Cks1,A. thaliana), SEQ ID NO : 23 (ORF de la protéine Cobl8,A. thaliana), SEQ ID NO : 24 (ORF de la protéine Coi1,A. thaliana), SEQ ID NO : 25 (ORF de la protéine Coi1,A. thaliana), SEQ ID NO : 26 (ORF de la protéine Cpk3,A. thaliana), SEQ ID NO : 27 (ORF de la protéine Cpk3,A. hypochondriacus), SEQ ID NO : 28 (ORF de la protéine Cpk3,B. distachyon), SEQ ID NO : 29 (ORF de la protéine Cpk3,B. distachyon), SEQ ID NO : 30 (ORF de la protéine Cpk3,G. max), SEQ ID NO : 31 (ORF de la protéine Cpk3,G. max), SEQ ID NO : 32 (ORF de la protéine Cpk3,G. max), SEQ ID NO : 33 (ORF de la protéine Cpk3,G. max), SEQ ID NO : 34 (ORF de la protéine Cpk3,O. sativa), SEQ ID NO : 35 (ORF de la protéine Cpk3,O. sativa), SEQ ID NO : 36 (ORF de la protéine Cpk3,S. lycopersicum), SEQ ID NO : 37 (ORF de la protéine Cpk3,Z. mays), SEQ ID NO : 38 (ORF de la protéine Cpk3,Z. mays), SEQ ID NO : 39 (ORF de la protéine Cpk3,Z. mays), SEQ ID NO : 40 (ORF de la protéine Cpk3,B. rapa), SEQ ID NO : 41 (ORF de la protéine Cpk3,B. rapa), SEQ ID NO : 42 (ORF de la protéine Cpk3,H. vulgare), SEQ ID NO : 43 (ORF de la protéine Cpk3,H. vulgare), SEQ ID NO : 44 (ORF de la protéine Cpk3,S. tuberosum), SEQ ID NO : 45 (ORF de la protéine Cpk3,A. palmeri), SEQ ID NO : 46 (ORF de la protéine Cpk3,M. truncatula), SEQ ID NO : 47 (ORF de la protéine Cpk3,M. truncatula), SEQ ID NO : 48 (ORF de la protéine Cpk3,T. aestivum), SEQ ID NO : 49 (ORF de la protéine Cpk3,T. aestivum), SEQ ID NO : 50 (ORF de la protéine Cpk3,T. aestivum), SEQ ID NO : 51 (ORF de la protéine Cpk3,T. aestivum), SEQ ID NO : 52 (ORF de la protéine Cpk3,L. perenne), SEQ ID NO : 53 (ORF de la protéine Cpk3,L. perenne), SEQ ID NO : 54 (ORF de la protéine Cpk3,L. perenne), SEQ ID NO : 55 (ORF de la protéine Cpk3,L. perenne), SEQ ID NO : 56 (ORF de la protéine Crk34,A. thaliana), SEQ ID NO : 57 (ORF de la protéine Cyp705a18,A. thaliana), SEQ ID NO : 58 (ORF de la protéine Cyp71b26,A. thaliana), SEQ ID NO : 59 (ORF de la protéine Cyp78a8,A. thaliana), SEQ ID NO : 60 (ORF de la protéine Cyp97b3,A. thaliana), SEQ ID NO : 61 (ORF de la protéine Dcl1,A. thaliana), SEQ ID NO : 62 (ORF de la protéine Dcl1,A. thaliana), SEQ ID NO : 63 (ORF de la protéine Dcl1,A. hypochondriacus), SEQ ID NO : 64 (ORF de la protéine Dcl1,B. distachyon), SEQ ID NO : 65 (ORF de la protéine Dcl1,G. max), SEQ ID NO : 66 (ORF de la protéine Dcl1,G. max), SEQ ID NO : 67 (ORF de la protéine Dcl1,O. sativa), SEQ ID NO : 68 (ORF de la protéine Dcl1,S. lycopersicum), SEQ ID NO : 69 (ORF de la protéine Dcl1,Z. mays), SEQ ID NO : 70 (ORF de la protéine Dcl1,B. rapa), SEQ ID NO : 71 (ORF de la protéine Dcl1,H. vulgare), SEQ ID NO : 72 (ORF de la protéine Dcl1,S. tuberosum), SEQ ID NO : 73 (ORF de la protéine Dcl1,M. truncatula), SEQ ID NO : 74 (ORF de la protéine Dcl1,T. aestivum), SEQ ID NO : 75 (ORF de la protéine Dcl1,T. aestivum), SEQ ID NO : 76 (ORF de la protéine Dcl1,T. aestivum), SEQ ID NO : 77 (ORF de la protéine Dcl1,T. aestivum), SEQ ID NO : 78 (ORF de la protéine Dcl1,L. perenne), SEQ ID NO : 79 (ORF de la protéine Dcl1,L. perenne), SEQ ID NO : 80 (ORF de la protéine Dur3,A. thaliana), SEQ ID NO : 81 (ORF de la protéine Ein2,A. thaliana), SEQ ID NO : 82 (ORF de la protéine Emb175,A. thaliana), SEQ ID NO : 83 (ORF de la protéine Emb2726,A. thaliana), SEQ ID NO : 84 (ORF de la protéine Emb9,A. thaliana), SEQ ID NO : 85 (ORF de la protéine Epsps,A. thaliana), SEQ ID NO : 86 (ORF de la protéine Fnr1,A. thaliana), SEQ ID NO : 87 (ORF de la protéine Fve,A. thaliana), SEQ ID NO : 88 (ORF de la protéine Ga2ox7,A. thaliana), SEQ ID NO : 89 (ORF de la protéine Gapc,N. benthamiana), SEQ ID NO : 90 (ORF de la protéine Gcn2,A. thaliana), SEQ ID NO : 91 (ORF de la protéine Gdi2,A. thaliana), SEQ ID NO : 92 (ORF de la protéine Gln2,A. thaliana), SEQ ID NO : 93 (ORF de la protéine Gsl3,A. thaliana), SEQ ID NO : 94 (ORF de la protéine Hag5,A. thaliana), SEQ ID NO : 95 (ORF de la protéine Hda18,A. thaliana), SEQ ID NO : 96 (ORF de la protéine Hexo1,A. thaliana), SEQ ID NO : 97 (ORF de la protéine Hppd,A. thaliana), SEQ ID NO : 98 (ORF de la protéine Hsl1,A. thaliana), SEQ ID NO : 99 (ORF de la protéine Iaa31,A. thaliana), SEQ ID NO : 100 (ORF de la protéine Iqd28,A. thaliana), SEQ ID NO : 101 (ORF de la protéine Jac1,A. thaliana), SEQ ID NO : 102 (ORF de la protéine Jar1,A. thaliana), SEQ ID NO : 103 (ORF de la protéine Kp1,A. thaliana), SEQ ID NO : 104 (ORF de la protéine Lrx2,A. thaliana), SEQ ID NO : 105 (ORF de la protéine Mapkkk3,A. thaliana), SEQ ID NO : 106 (ORF de la protéine Mapkkk5,A. thaliana), SEQ ID NO : 107 (ORF de la protéine Mfp2,A. thaliana), SEQ ID NO : 108 (ORF de la protéine Mrb1,A. thaliana), SEQ ID NO : 109 (ORF de la protéine Nsp1,M. truncatula), SEQ ID NO : 110 (ORF de la protéine Nsp1,A. thaliana), SEQ ID NO : 111 (ORF de la protéine Nsp1,B. distachyon), SEQ ID NO : 112 (ORF de la protéine Nsp1,G. max), SEQ ID NO : 113 (ORF de la protéine Nsp1,G. max), SEQ ID NO : 114 (ORF de la protéine Nsp1,O. sativa), SEQ ID NO : 115 (ORF de la protéine Nsp1,S. lycopersicum), SEQ ID NO : 116 (ORF de la protéine Nsp1,S. lycopersicum), SEQ ID NO : 117 (ORF de la protéine Nsp1,Z. mays), SEQ ID NO : 118 (ORF de la protéine Nsp1,Z. mays), SEQ ID NO : 119 (ORF de la protéine Nsp1,Z. mays), SEQ ID NO : 120 (ORF de la protéine Nsp1,Z. mays), SEQ ID NO : 121 (ORF de la protéine Nsp1,B. rapa), SEQ ID NO : 122 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 123 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 124 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 125 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 126 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 127 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 128 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 129 (ORF de la protéine Nsp1,S. tuberosum), SEQ ID NO : 130 (ORF de la protéine Nsp1,S. tuberosum), SEQ ID NO : 131 (ORF de la protéine Nsp1,T. aestivum), SEQ ID NO : 132 (ORF de la protéine Nsp1,T. aestivum), SEQ ID NO : 133 (ORF de la protéine Nsp1,L. perenne), SEQ ID NO : 134 (ORF de la protéine Nsp1,L. perenne), SEQ ID NO : 135 (ORF de la protéine Pds,A. thaliana), SEQ ID NO : 136 (ORF de la protéine Pen3,A. thaliana), SEQ ID NO : 137 (ORF de la protéine Phyb,A. thaliana), SEQ ID NO : 138 (ORF de la protéine Pif3,A. thaliana), SEQ ID NO : 139 (ORF de la protéine Pizza,A. thaliana), SEQ ID NO : 140 (ORF de la protéine Ppox1,A. thaliana), SEQ ID NO : 141 (ORF de la protéine Ppox2,A. thaliana), SEQ ID NO : 142 (ORF de la protéine Prp39,A. thaliana), SEQ ID NO : 143 (ORF de la protéine PsbA,A. thaliana), SEQ ID NO : 144 (ORF de la protéine Pskr1,A. thaliana), SEQ ID NO : 145 (ORF de la protéine Rd21,A. thaliana), SEQ ID NO : 146 (ORF de la protéine Ring1,A. thaliana), SEQ ID NO : 147 (ORF de la protéine Ros1,A. thaliana), SEQ ID NO : 148 (ORF de la protéine Rpt4a,A. thaliana), SEQ ID NO : 149 (ORF de la protéine Sfr6,A. thaliana), SEQ ID NO : 150 (ORF de la protéine Shr,A. thaliana), SEQ ID NO : 151 (ORF de la protéine Shy2,A. thaliana), SEQ ID NO : 152 (ORF de la protéine Skl,M. truncatula), SEQ ID NO : 153 (ORF de la protéine Sps1,A. thaliana), SEQ ID NO : 154 (ORF de la protéine Spt,A. thaliana), SEQ ID NO : 155 (ORF de la protéine Stn8,A. thaliana), SEQ ID NO : 156 (ORF de la protéine Tap46,A. thaliana), SEQ ID NO : 157 (ORF de la protéine Topp6,A. thaliana), SEQ ID NO : 158 (ORF de la protéine TubB6,A. thaliana), SEQ ID NO : 159 (ORF de la protéine TubB8,A. thaliana), SEQ ID NO : 160 (ORF de la protéine Uba1a,A. thaliana), SEQ ID NO : 161 (ORF de la protéine Vim3,A. thaliana), SEQ ID NO : 381 (ORF de la protéine Sgr1,A. thaliana), SEQ ID NO : 382 (ORF de la protéine Abi5,A. thaliana), SEQ ID NO : 383 (ORF de la protéine Hsp101,A. thaliana), SEQ ID NO : 384 (ORF de la protéine Rh10,M. truncatula) et SEQ ID NO : 385 (ORF de la protéine Wus,A. thaliana).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un ORF comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Par « pourcentage d’identité » entre deux séquences d’acides nucléiques (ou d’acides aminés), on entend un pourcentage de nucléotides (ou de résidus d’acides aminés) identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties au hasard sur toute la longueur des séquences. Le meilleur alignement (ou alignement optimal) est l’alignement pour lequel le pourcentage d’identité entre les deux séquences à comparer, comme calculé ci- après, est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d’acides nucléiques (ou d’acides aminés) sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L’alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé manuellement ou au moyen d’algorithmes et de logiciels à la disposition de l’homme de l’art, par exemple, la plateforme BLAST ou le programme MatGat (Campanella, Bitincka and Smalley, 2003).
Le pourcentage d’identité entre deux séquences est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide (ou l’acide aminé) est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100.
Au sens de l’invention, il est entendu dans l’invention que des séquences présentant « au moins 80% d’identité » avec une séquence de référence peuvent notamment présenter au moins 80%, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d’identité avec ladite séquence de référence.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne également le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la séquence dudit peptide est choisie parmi les séquences : SEQ ID NO : 162 (cPEPcpk3), SEQ ID NO : 163 (cPEPdcl1), SEQ ID NO : 164 (cPEPnsp1_3), SEQ ID NO : 165 (cPEPnsp1_1), SEQ ID NO : 166 (cPEPnsp1_2), SEQ ID NO : 167 (cPEPnsp1_4), SEQ ID NO : 168 (cPEPnsp1_5), SEQ ID NO : 169 (cPEPnsp1 5aa), SEQ ID NO : 170 (cPEPnsp1 20aa), SEQ ID NO : 171 (cPEPnsp1 30aa), SEQ ID NO : 172 (cPEPnsp1 40aa), SEQ ID NO : 173 (cPEPnsp1 60aa), SEQ ID NO : 174 (cPEPnsp1 80aa), SEQ ID NO : 175 (cPEPgapc), SEQ ID NO : 176 (cPEPbri1), SEQ ID NO : 177 (cPEPbak1), SEQ ID NO : 178 (cPEPshy2), SEQ ID NO : 179 (cPEPpizza), SEQ ID NO : 180 (cPEPmrb1), SEQ ID NO : 181 (cPEPtap46), SEQ ID NO : 182 (cPEPspt), SEQ ID NO : 183 (cPEPga2ox7), SEQ ID NO : 184 (cPEPphyb), SEQ ID NO : 185 (cPEPhag5), SEQ ID NO : 186 (cPEPshr), SEQ ID NO : 187 (cPEPmapkkk3), SEQ ID NO : 188 (cPEPmapkkk5_1), SEQ ID NO : 189 (cPEPmapkkk5_2), SEQ ID NO : 190 (cPEPring1), SEQ ID NO : 191 (cPEPros1), SEQ ID NO : 192 (cPEPjar1), SEQ ID NO : 193 (cPEPcoi1), SEQ ID NO : 194 (cPEPabcg34), SEQ ID NO : 195 (cPEPagb1), SEQ ID NO : 196 (cPEPwus), SEQ ID NO : 197 (AhEIN2), SEQ ID NO : 198 (AhBRI1), SEQ ID NO : 199 (AhBAK1), SEQ ID NO : 200 (AtEIN2cPEP1), SEQ ID NO : 201 (AtEIN2cPEP2), SEQ ID NO : 202 (AtEIN2cPEP3), SEQ ID NO : 203 (AtEIN2cPEP13), SEQ ID NO : 204 (cPEPein2_1), SEQ ID NO : 205 (cPEPein2_2), SEQ ID NO : 206 (cPEPein2_3), SEQ ID NO : 404 (cPEPhsp101), SEQ ID NO : 406 (cPEPabi5), SEQ ID NO : 407 (cPEPsgr1), SEQ ID NO : 408 (cPEPhsp101), SEQ ID NO : 409 (cPEPmrb1), SEQ ID NO : 410 (cPEPshy2), SEQ ID NO : 411 (cPEPskl), SEQ ID NO : 412 (cPEPrh10), SEQ ID NO : 413 (cPEpjar1), SEQ ID NO : 414 (cPEPbak1), SEQ ID NO : 415 (cPEPbri1), SEQ ID NO : 416 (cPEPwus) et SEQ ID NO : 417 (cPEPein2).
En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la séquence dudit peptide est choisie parmi les séquences : SEQ ID NO : 162, SEQ ID NO : 163 et SEQ ID NOs : 164 à 174. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la séquence dudit peptide est la séquence SEQ ID NO : 162. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la séquence dudit peptide est la séquence : SEQ ID NO : 163. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la séquence dudit peptide est choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 164 à 174.
Dans un deuxième aspect, l’invention ci-dessus a pour objet un cPEP tel qu’obtenu par la mise en œuvre du procédé tel que décrit précédemment. Selon ce même aspect, l’invention a également pour objet un cPEP, de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment (non naturellement traduit) d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm,
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que précédemment décrit, ledit fragment ayant une taille de 3nnucléotides,nétant compris :
- de 4 à 41 ;
- de 5 à 40 ;
- de 7 à 20 ; ou
- de 8 à 15.
Autrement dit, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP comprenant 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 acides aminés.
En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP comprenant de 4 à 41 acides aminés. En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP comprenant de 5 à 40 acides aminés. En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP comprenant de 7 à 20 acides aminés. En particulier, l’invention concerne également le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP comprenant de 8 à 15 acides aminés.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la taille dudit cPEP est inférieure à celle de ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit fragment étant dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; ou
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit fragment étant dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; et
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et dans lequel ledit fragment est choisi :
- soit dans le même cadre de lecture que le cadre ouvert de lecture codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le même cadre de lecture que le cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le cadre de lecture déterminé par le codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention a pour objet un cPEP, de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques d’un ARNm d’une protéine, ladite séquence d’acides nucléiques comprenant deux parties contiguës :
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée non codante (i.e.non traduite naturellement,e.g.3’UTR ou 5’UTR) ; et
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée codante (i.e.traduite naturellement,e.g.exon),
ledit fragment ayant une taille de 3nnucléotides,nétant compris de 4 à 70, en particuliernétant compris de 4 à 41, et ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans une cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est capable d’augmenter l’accumulation de ladite protéine dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est capable diminuer l’accumulation de ladite protéine dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est un peptide synthétique.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est un peptide isolé.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est un peptide recombinant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP étant un peptide hydrophobe ou un peptide hydrophile.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est naturellement présente dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine n’est pas présente naturellement dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un transgène introduit artificiellement dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un vecteur introduit artificiellement dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite cellule végétale (i.e.celle dans laquelle on souhaite moduler l’accumulation d’une protéine) appartient à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum(pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite cellule végétale est une cellule d’une algue.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène choisi parmi :Aae15, Aae16, abcg11, Abdcg34, Acc1, Agb1, Als, Anac076, Apg9, Arlb1, Arr1, Arr5, Arr6, At59, Bak1, Bccp1, Bccp2, Bri1, Bzo2h3, Cesa6, Cipk3, Cks1, Cobl8, Coi1, Cpk3, Crk34, Cyp705a18, Cyp71b26, Cyp78a8, Cyp97b3, Dcl1, Dur3, Ein2, Emb175, Emb2726, Emb9, Epsps, Fnr1, Fve, Ga2ox7, Gapc, Gcn2, Gdi2, Gln2, Gsl3, Hag5, Hda18, Hexo1, Hppd, Hsl1, Iaa31, Iqd28, Jac1, Jar1, Kp1, Lrx2, Mapkkk3, Mapkkk5, Mfp2, Mrb1, Nsp1, Pds, Pen3, Phyb, Pif3, Pizza, Ppox1, Ppox2, Prp39, PsbA, Pskr1, Rd21, Ring1, Ros1, Rpt4a, Sfr6, Shr, Shy2, Skl, Sps1, Spt, Stn8, Tap46, Topp6, TubB6, TubB8, Uba1a, Vim3, Sgr1, Abi5, Hsp101, Rh10etWus.
En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène choisi parmi les gènes :Cpk3,Dcl1etNsp1. En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par le gèneCpk3. En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par le gèneDcl1. En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par le gèneNsp1.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385.
En particulier, l’invention concerne l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1). En particulier, l’invention concerne également le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne également le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne également le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385. L’invention concerne notamment le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la séquence dudit peptide est choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 162 à 206, 404 et 406 à 417.
En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la séquence dudit peptide est choisie parmi les séquences : SEQ ID NO : 162, SEQ ID NO : 163 et SEQ ID NOs : 164 à 174. En particulier, l’invention le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la séquence dudit peptide est la séquence SEQ ID NO : 162. En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la séquence dudit peptide est la séquence : SEQ ID NO : 163. En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la séquence dudit peptide est choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 164 à 174.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est impliquée dans au moins un phénotype de plante choisi parmi :
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de feuilles ;
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de fleurs ;
- la taille de la tige (ou de la hampe florale) ;
- la biomasse racinaire ;
- le nombre, la longueur et le niveau de ramification des racines ;
- la précocité de la germination ;
- la précocité du bourgeonnement ;
- la précocité de l’induction florale (ou transition florale) ;
- la vigueur germinative et la durée de phase juvénile ;
- la durée de la floraison ;
- la résistance à un stress biotique ;
- la résistance à un stress abiotique ; et
- le nombre de cellules.
Dans l’invention, un cPEP peut être fusionné ou lié à une ou plusieurs molécules facilitant l’entrée du cPEP dans la cellule. Parmi ces molécules, on peut notamment citer des peptides pénétrants (Numata, K.,et al. Library screening of cell-penetrating peptide for BY-2 cells, leaves of Arabidopsis, tobacco, tomato, poplar, and rice callus. Sci Rep 8, 10966 (2018).) et l’acide palmitique. Par « peptide pénétrant » (ci-après CPP), on entend des peptides de petite taille pénétrant les bicouches lipidiques cellulaires ou déstabilisent les membranes cellulaires. Les CPP peuvent être classés en trois groupes : cationiques, amphipathiques et hydrophobes. En particulier :
- les CPP cationiques contiennent de nombreux acides aminés chargés positivement, tels que la lysine (Lys) et l'arginine (Arg) ;
- les CPP amphipathiques sont généralement composés d'une séquence alternée d'acides aminés polaires et non polaires ; et
- les CPP hydrophobes se composent d'acides aminés non polaires avec des charges nettes relativement faibles.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP étant fusionné à un peptide facilitant son entrée dans la cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP étant fusionné à un peptide pénétrant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP étant fusionné à l’extrémité N-terminale ou à l’extrémité C-terminale avec ledit peptide facilitant son entrée dans la cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP étant fusionné à l’extrémité N-terminale ou à l’extrémité C-terminale avec ledit peptide pénétrant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP étant fusionné avec :
- le peptide TAT (SEQ ID NO : 380) ;
- la pénétratine ;
- un peptide polyhistidine (notamment un peptide d’au moins 4 résidus histidine) ; ou
- un peptide polyarginine (notamment un peptide de 4 résidus arginine).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP étant lié à une ou plusieurs molécules d’acide palmitique.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le cPEP tel que décrit précédemment, ledit cPEP étant lié à l’extrémité N-terminale ou à l’extrémité C-terminale à une ou plusieurs molécules d’acide palmitique.
Sur ce point, il convient de noter que la quantité de cPEP nécessaire pour moduler l’accumulation d’une protéine peut varier selon que le cPEP soit ou non modifié avec l’une des molécules facilitant sa pénétration cellulaire.
Dans un troisième aspect, l’invention ci-dessus a pour objet un acide nucléique codant un cPEP tel que décrit précédemment. Selon ce même aspect, l’invention a également pour objet un acide nucléique de 3nnucléotides, lequel acide nucléique correspond à un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’acide nucléique que décrit précédemment, ledit fragment étant dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; ou
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’acide nucléique que décrit précédemment, ledit fragment étant dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; et
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’acide nucléique tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le même cadre de lecture que le cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne l’acide nucléique tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le cadre de lecture déterminé par le codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’acide nucléique tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’acide nucléique tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également l’acide nucléique tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne l’acide nucléique tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un acide nucléique de 3nnucléotides, lequel acide nucléique correspond à un fragment d’une séquence d’acides nucléiques d’un ARNm d’une protéine, ladite séquence d’acides nucléiques comprenant deux parties contiguës :
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée non codante (i.e.non traduite naturellement,e.g.3’UTR ou 5’UTR) ; et
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée codante (i.e.traduite naturellement,e.g.exon).
En particulier, l’invention concerne l’acide nucléique tel que décrit précédemment, oùnest compris :
- de 4 à 70 ;
- de 4 à 41 ;
- de 5 à 40 ;
- de 7 à 20 ; ou
- de 8 à 15.
Dans un autre aspect, l’invention ci-dessus concerne une composition comprenant un cPEP tel que décrit ci-dessus en tant que substance active.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une composition comprenant un cPEP en tant que substance active, ledit cPEP :
- ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm ; et
- étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit fragment est dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; ou
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit fragment est dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; et
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le même cadre de lecture que le cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le cadre de lecture déterminé par le codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une composition comprenant un cPEP en tant que substance active, ledit cPEP :
- ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm, ledit fragment ayant une taille de 3nnucléotides,nétant compris de 4 à 70, en particuliernétant compris de 4 à 41, et ladite séquence d’acides nucléiques comprenant deux parties contiguës :
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée non codante (i.e.non traduite naturellement,e.g.3’UTR ou 5’UTR) ; et
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée codante (i.e.traduite naturellement,e.g.exon) ; et
- étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est à une concentration comprise de 10-9M à 10-3M. Sur ce point, il convient de noter d’une part que la composition de l’invention n’existe pas à l’état naturel et ceci est d’autant plus vrai qu’une telle concentration en cPEP ne peut exister au sein d’une cellule végétale. De plus et par « concentration comprise de 10-9M à 10-3M », on entend que la concentration en cPEP peut être comprise de 10-9à 10-4M, de 10-8à 10-4M, de 10-9à 10-5M, de 10-8à 10-5M, comme elle peut être comprise de 5 µM à 500 µM, de 30 µM à 70 µM, ou encore être de 50 µM.
En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est à une concentration comprise de 10-9à 10-4M, de 10-8à 10-4M, de 10-9à 10-5M ou de 10-8à 10-5M. En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est à une concentration comprise de 5 µM à 500 µM ou de 30 µM à 70 µM. En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est à une concentration de 50 µM. De manière non limitative, cette concentration peut également être de 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M, 10-5M ou 10-4M.
Au vu de ce qui précède, on comprend que l’invention concerne également la composition comprenant un cPEP en tant que substance active, ledit cPEP :
- ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm ;
- étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine ; et
- étant notamment à une concentration comprise de 5 µM à 500 µM ou de 30 µM à 70 µM, ou étant notamment à une concentration de 50 µM.
A noter que par « composition comprenant un cPEP », on entend que la composition de l’invention comprend au moins un cPEP. C’est-à-dire qu’un mélange de cPEPs est envisageable, lesdits cPEPs pouvant cibler une même protéine ou plusieurs protéines selon le fragment d’acides nucléiques dont ils sont issus. A cet égard, les concentrations susmentionnées concernent soit le mélange de cPEPs en tant que tel, soit chacun des cPEPs dudit mélange, lesdits cPEPs pouvant être à la même concentration ou pouvant être à des concentrations différentes parmi celles citées ci-dessus.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition étant une composition phytopharmaceutique, une composition herbicide ou une composition d’enrobage,
en particulier ladite composition d’enrobage comprenant en outre au moins un agent de fixation.
En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition étant une composition phytopharmaceutique. En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition étant une composition herbicide. En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition étant une composition d’enrobage. De préférence, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition étant une composition d’enrobage comprenant en outre au moins un agent de fixation.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition comprenant en outre au moins un solvant. De préférence, ledit solvant est choisi parmi : l’acétone, l’acétonitrile, l’acide acétique, l’acide formique, l’adipate de diméthyle, le benzyl acétate, le bi-butyl carbonate, le dimethyl sulfoxide (DMSO), l’eau, le glutarate de diméthyle, l’hydroxyde d’ammonium, l’iso-butanol, l’iso-propanol, le lactate de diéthyle héxyle, le solvant naphta aromatique léger, le solvant naphta aromatique lourd, le succinate de diéthyle et leurs mélanges (e.g.mélange [eau ; acide acétique] ; [acétonitrile ; acide acétique], [eau, acétonitrile ; acide acétique], [eau ; DMSO], [eau ; acétonitrile] ou [eau ; hydroxyde d’ammonium]).
Les propriétés de solubilité des cPEPs sont déterminées notamment par leur composition en acides aminés. Les cPEPs hydrophiles peuvent être solubilisés et conditionnés dans des solutions aqueuses, telles que l’eau. Les cPEPs hydrophobes peuvent être solubilisés et conditionnés dans des solvants, tels que les solvants organiques.
Pour un traitement des plantes par les cPEPs, les solvants organiques sont des solvants non toxiques pour les plantes en faibles quantités, c’est-à-dire qu’ils n’ont pas d’effet délétère sur le développement de la plante. De manière non limitative, les solvants organiques peuvent être ceux cités ci-dessus et en particulier choisis parmi l’acétonitrile et l’acide acétique.
Comme indiqué ci-dessus, les cPEPs peuvent également être solubilisés et conditionnés dans des mélanges de solvants, comme par exemple, un mélange de solvant organique [acétonitrile ; acide acétique], un mélange [eau ; DMSO] dans un ratio volume:volume compris de 99:1 à 1:99, un mélange [eau ; acétonitrile] dans un ratio volume:volume compris de 99:1 à 1:99 ou un mélange [eau ; hydroxyde d’ammonium] dans un ratio volume:volume compris de 99:1 à 99,9:0,1. Les cPEPs peuvent également être solubilisés dans une solution comprenant 50 % d’acétonitrile, 10 % d’acide acétique et 40 % d’eau (volume/volume/volume).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition comprenant en outre au moins un diluant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition comprenant en outre au moins un adjuvant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition comprenant en outre au moins un agent de fixation.
Par « agent de fixation », on entend un agent chimique ou naturel lequel permet de coller la composition de l’invention à une graine de végétal de manière à enrober ladite graine de végétal. On entend également une substance rendant possible l’application et la tenue de la ou des substances actives sur le grain. Parmi les agents de fixation disponibles, on retrouve notamment la carboxymethyl cellulose (CMC) et la gomme arabique. De plus et de manière non limitative, un agent de fixation peut comprendre des solvants organiques, de l’eau, des dispersants, des émulgateurs, des tensioactifs, des mouillants et des colorants.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition comprenant en outre au moins un nutriment végétal. En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition comprenant en outre au moins un agent de fixation et au moins un nutriment végétal.
Par « nutriment végétal », on entend un élément assimilé par la plante pour permettre son développement. De manière non limitative, un nutriment végétal peut être choisi parmi : l’azote, le phosphore, le potassium, le calcium, le magnésium, le soufre, le manganèse, le fer, le cuivre, le bore, le zinc, le molybdène et leurs mélanges.
Au vu de ce qui précède, on comprend qu’un autre aspect de l’invention a pour objet une semence enrobée comprenant une graine de plante, ladite graine de plante étant enrobée par une composition d’enrobage telle que décrite précédemment.
L’enrobage peut être réalisé selon les procédés classiquement utilisés dans l’industrie agroalimentaire et peut être obtenu en utilisant un matériau apte à se désagréger dans un solvant ou dans la terre, tel qu’un liant ou de l’argile.
Selon l’invention, l’enrobage peut être utilisé pour conférer des propriétés particulières à une semence en combinaison avec un cPEP, telles qu’une croissance améliorée ou une résistance à certains stress biotiques ou abiotiques.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la semence enrobée telle que décrite précédemment, dans lequel ladite graine de plante à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum(pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la semence enrobée telle que décrite précédemment, ladite semence étant traitée par trempage dans une composition contenant un cPEP. Lors d’un trempage, la semence est alors plongée totalement ou partiellement dans une composition contenant un cPEP.
Dans un autre aspect, l’invention ci-dessus concerne une utilisation d’un cPEP en tant qu’agent phytosanitaire pour moduler l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale,
ledit cPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture de ladite protéine codée par ledit ARNm,
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit fragment est dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; ou
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit fragment est dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; et
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le même cadre de lecture que le cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le cadre de lecture déterminé par le codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une utilisation d’un cPEP en tant qu’agent phytosanitaire pour moduler l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale,
ledit cPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture de ladite protéine codée par ledit ARNm, ledit fragment ayant une taille de 3nnucléotides,nétant compris de 4 à 70, en particuliernétant compris de 4 à 41, et ladite séquence d’acides nucléiques comprenant deux parties contiguës :
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée non codante (i.e.non traduite naturellement,e.g.intron) ; et
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée codante (i.e.traduite naturellement,e.g.exon) ;
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment pour augmenter l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale. La présence du cPEP fait que la quantité de ladite protéine dans la cellule végétale traitée est supérieure à celle dans une cellule végétale non traitée.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment pour diminuer (inhiber) l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale. La présence du cPEP fait que la quantité de ladite protéine dans la cellule végétale traitée est inférieure à celle dans une cellule végétale non traitée.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est produit hors de ladite cellule végétale avant d’être introduit dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est un peptide synthétique.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est un peptide isolé.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est un peptide recombinant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est un peptide hydrophobe ou un peptide hydrophile.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est introduit dans ladite cellule végétale sous la forme d’un acide nucléique codant ledit cPEP. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est introduit dans ladite cellule végétale sous la forme d’un acide nucléique codant ledit cPEP et comprenant les moyens de l’exprimer.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est naturellement présente dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine n’est pas présente naturellement dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un transgène introduit artificiellement dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un vecteur introduit artificiellement dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle l’accumulation de ladite protéine est déterminéeviala mise en œuvre d’une technique choisie parmi : le Western blot, la mesure de l’activité enzymatique, la spectrométrie de masse et la fusion traductionnelle. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle l’accumulation de ladite protéine est déterminéeviala mise en œuvre d’un Western blot.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP a une taille comprise de 4 à 41 acides aminés, de 5 à 40 acides aminés, de 7 à 20 acides aminés ou plus particulièrement une taille comprise de 8 à 15 acides aminés. En particulier, ledit cPEP a une taille de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 acides aminés.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite cellule végétale appartient à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum(pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite cellule végétale est une cellule d’une algue.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène choisi parmi :Aae15, Aae16, abcg11, Abdcg34, Acc1, Agb1, Als, Anac076, Apg9, Arlb1, Arr1, Arr5, Arr6, At59, Bak1, Bccp1, Bccp2, Bri1, Bzo2h3, Cesa6, Cipk3, Cks1, Cobl8, Coi1, Cpk3, Crk34, Cyp705a18, Cyp71b26, Cyp78a8, Cyp97b3, Dcl1, Dur3, Ein2, Emb175, Emb2726, Emb9, Epsps, Fnr1, Fve, Ga2ox7, Gapc, Gcn2, Gdi2, Gln2, Gsl3, Hag5, Hda18, Hexo1, Hppd, Hsl1, Iaa31, Iqd28, Jac1, Jar1, Kp1, Lrx2, Mapkkk3, Mapkkk5, Mfp2, Mrb1, Nsp1, Pds, Pen3, Phyb, Pif3, Pizza, Ppox1, Ppox2, Prp39, PsbA, Pskr1, Rd21, Ring1, Ros1, Rpt4a, Sfr6, Shr, Shy2, Skl, Sps1, Spt, Stn8, Tap46, Topp6, TubB6, TubB8, Uba1a, Vim3, Sgr1, Abi5, Hsp101, Rh10etWus.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un ORF comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un ORF comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne également l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est choisi parmi les séquences : SEQ ID NOs : 162 à 206, 404 et 406 à 417.
En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est choisi parmi les séquences : SEQ ID NO : 162, SEQ ID NO : 163 et SEQ ID NOs : 164 à 174. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est de séquence SEQ ID NO : 162. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est de séquence : SEQ ID NO : 163. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est choisi parmi les séquences : SEQ ID NOs : 164 à 174.
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est impliquée dans au moins un phénotype de plante choisi parmi :
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de feuilles ;
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de fleurs ;
- la taille de la tige (ou de la hampe florale) ;
- la biomasse racinaire ;
- le nombre, la longueur et le niveau de ramification des racines ;
- la précocité de la germination ;
- la précocité du bourgeonnement ;
- la précocité de l’induction florale (ou transition florale) ;
- la vigueur germinative et la durée de phase juvénile ;
- la durée de la floraison ;
- la résistance à un stress biotique ;
- la résistance à un stress abiotique ; et
- le nombre de cellules.
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, pour moduler l’accumulation d’une protéine recombinante dont la séquence d’acides nucléiques qui la code correspond à la fusion des séquences d’acides nucléiques de deux gènes distincts.
En particulier, la séquence codante d’au moins un des deux gènes est celle d’un gène rapporteur, par exemple un gène codant une protéine fluorescente (telle que la GFP) ou une protéine permettant la résistance de la plante à un composé.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, pour moduler l’accumulation d’une protéine recombinante dont la séquence d’acides nucléiques qui la code correspond à la fusion :
- d’une séquence d’acides nucléiques réputée non codante d’un premier gène ; et
- d’une séquence d’acides nucléiques codante d’un second gène,
la séquence dudit cPEP correspondant à la traductionviale code génétique d’un fragment de la séquence d’acides nucléiques réputée non codante du premier gène.
Dans un autre aspect, l’invention ci-dessus concerne un procédé de modulation de l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale comprenant une étape d’introduction :
- d’un cPEP ; ou
- d’un acide nucléique codant ledit cPEP et les moyens de l’exprimer,
dans ladite cellule végétale, l’introduction dudit cPEP entraînant une modulation de la quantité de ladite protéine dans ladite cellule végétale,
ledit cPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture de ladite protéine codée par ledit ARNm,
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit fragment étant dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; ou
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit fragment étant dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; et
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le même cadre de lecture que le cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le cadre de lecture déterminé par le codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de modulation de l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale comprenant une étape d’introduction :
- d’un cPEP ; ou
- d’un acide nucléique codant ledit cPEP et les moyens de l’exprimer,
dans ladite cellule végétale, l’introduction dudit cPEP entraînant une modulation de la quantité de ladite protéine dans ladite cellule végétale,
ledit cPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture de ladite protéine codée par ledit ARNm, ledit fragment ayant une taille de 3nnucléotides,nétant compris de 4 à 70, en particuliernétant compris de 4 à 41, et ladite séquence d’acides nucléiques comprenant deux parties contiguës :
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée non codante (i.e.non traduite naturellement,e.g.3’UTR ou 5’UTR) ; et
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée codante (i.e.traduite naturellement,e.g.exon) ;
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, ledit procédé permettant :
- de favoriser le développement d’une plante ; ou
- de ralentir ou d’empêcher le développement d’une plante.
En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, ledit procédé permettant de favoriser le développement d’une plante. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, ledit procédé permettant de ralentir ou d’empêcher le développement d’une plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment pour augmenter l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale. La présence du cPEP fait que la quantité de ladite protéine dans la cellule végétale traitée est supérieure à celle dans une cellule végétale non traitée.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment pour diminuer (inhiber) l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale. La présence du cPEP fait que la quantité de ladite protéine dans la cellule végétale traitée est inférieure à celle dans une cellule végétale non traitée.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est produit hors de ladite cellule végétale avant d’être introduit dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est un peptide synthétique.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est un peptide isolé.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est un peptide recombinant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP étant un peptide hydrophobe ou un peptide hydrophile.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est introduit dans ladite cellule végétale sous la forme d’un acide nucléique codant ledit cPEP. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est introduit dans ladite cellule végétale sous la forme d’un acide nucléique codant ledit cPEP et comprenant les moyens de l’exprimer.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est naturellement présente dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine n’est pas présente naturellement dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un transgène introduit artificiellement dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un vecteur introduit artificiellement dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel l’accumulation de ladite protéine est déterminéeviala mise en œuvre d’une technique choisie parmi : le Western blot, la mesure de l’activité enzymatique, la spectrométrie de masse et la fusion traductionnelle. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel l’accumulation de ladite protéine est déterminéeviala mise en œuvre d’un Western blot.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP a une taille comprise de 4 à 41 acides aminés, de 5 à 40 acides aminés, de 7 à 20 acides aminés ou plus particulièrement une taille comprise de 8 à 15 acides aminés. En particulier, ledit cPEP a une taille de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 acides aminés.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite cellule végétale ou ladite plante appartient à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum(pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite cellule végétale est une cellule d’une algue.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène choisi parmi :Aae15, Aae16, abcg11, Abdcg34, Acc1, Agb1, Als, Anac076, Apg9, Arlb1, Arr1, Arr5, Arr6, At59, Bak1, Bccp1, Bccp2, Bri1, Bzo2h3, Cesa6, Cipk3, Cks1, Cobl8, Coi1, Cpk3, Crk34, Cyp705a18, Cyp71b26, Cyp78a8, Cyp97b3, Dcl1, Dur3, Ein2, Emb175, Emb2726, Emb9, Epsps, Fnr1, Fve, Ga2ox7, Gapc, Gcn2, Gdi2, Gln2, Gsl3, Hag5, Hda18, Hexo1, Hppd, Hsl1, Iaa31, Iqd28, Jac1, Jar1, Kp1, Lrx2, Mapkkk3, Mapkkk5, Mfp2, Mrb1, Nsp1, Pds, Pen3, Phyb, Pif3, Pizza, Ppox1, Ppox2, Prp39, PsbA, Pskr1, Rd21, Ring1, Ros1, Rpt4a, Sfr6, Shr, Shy2, Skl, Sps1, Spt, Stn8, Tap46, Topp6, TubB6, TubB8, Uba1a, Vim3, Sgr1, Abi5, Hsp101, Rh10etWus.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un ORF comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un ORF comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne également le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est choisi parmi les séquences : SEQ ID NOs : 162 à 206, 404 et 406 à 417.
En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est choisi parmi les séquences : SEQ ID NO : 162, SEQ ID NO : 163 et SEQ ID NOs : 164 à 174. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est de séquence SEQ ID NO : 162. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est de séquence : SEQ ID NO : 163. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un cPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit cPEP est choisi parmi les séquences : SEQ ID NOs : 164 à 174.
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est impliquée dans au moins un phénotype de plante choisi parmi :
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de feuilles ;
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de fleurs ;
- la taille de la tige (ou de la hampe florale) ;
- la biomasse racinaire ;
- le nombre, la longueur et le niveau de ramification des racines ;
- la précocité de la germination ;
- la précocité du bourgeonnement ;
- la précocité de l’induction florale (ou transition florale) ;
- la vigueur germinative et la durée de phase juvénile ;
- la durée de la floraison ;
- la résistance à un stress biotique ;
- la résistance à un stress abiotique ; et
- le nombre de cellules.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel l’introduction dudit cPEP entraîne une précocité de la montaison chez ladite plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel l’introduction dudit cPEP entraîne une précocité de la floraison chez ladite plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel l’introduction dudit cPEP entraîne une augmentation de la taille de la tige chez ladite plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel l’introduction dudit cPEP entraîne une précocité de croissance de la tige chez ladite plante.
Les Inventeurs ont en effet constaté de manière inattendue qu’il est possible d’appliquer directement un cPEP sur la plante,e.g. vial’emploi de la composition de l’invention (cf. supra) comprenant un cPEP, pour moduler l’accumulation d’une protéine cible dans la plante, ce qui indique que le cPEP est capté par la plante.
Par conséquent, dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit cPEP est introduit dans ladite plante :
- par arrosage, par pulvérisation ou par l’ajout d’un engrais, d’un terreau, d’un substrat de culture ou d’un support en contact avec la plante, ledit cPEP étant notamment administré à la plante sous la forme d’une composition comprenant de 10-9M à 10-4M dudit cPEP ;
- par arrosage, par trempage, par pulvérisation ou par l’ajout d’un engrais, d’un terreau, d’un substrat de culture ou d’un support en contact avec la plante, ledit cPEP étant notamment administré à une graine ou une semence sous la forme d’une composition comprenant de 10-9M à 10-4M dudit cPEP ; ou
- par le biais d’un acide nucléique codant ledit cPEP et comprenant les moyen d’exprimer ledit cPEP, ledit acide nucléique étant introduit artificiellement dans la plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que défini précédemment, dans lequel ledit cPEP est introduit artificiellement par voie externe dans la plante, de préférence par arrosage, par pulvérisation ou par l’ajout d’un engrais, d’un terreau, d’un substrat de culture ou d’un support inerte.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que défini précédemment, dans lequel ledit cPEP est introduit par arrosage.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que défini précédemment, dans lequel ledit cPEP est introduit par pulvérisation.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que défini précédemment, dans lequel ledit cPEP est introduit par l’ajout d’un engrais.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que défini précédemment, dans lequel la plante est traitée avec une composition comprenant de 10-9M à 10-4M dudit cPEP, ou comprenant notamment 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M, 10-5M ou 10-4M dudit cPEP. De préférence, les compositions ont une concentration de 10-8M à 10-5M pour une application par arrosage ou par pulvérisation sur la plante.
De manière complémentaire, des compositions plus ou moins concentrées peuvent être envisagées pour traiter la plante avec le cPEP. Par exemple, et de manière non limitative, des compositions plus concentrées comprenant de 10-1M à 10-3M, ou comprenant notamment 10-2M de cPEP, peuvent être utilisées dans le cas où le cPEP introduit artificiellement par voie externe est administré à la plante par épandage.
Dans un autre aspect, l’invention ci-dessus concerne une plante modifiée contenant un cPEP, laquelle « plante modifiée » correspond à une plante dans laquelle a été introduit artificiellement un cPEP, notamment par arrosage, par pulvérisation ouviaun engrais.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante modifiée comprenant un cPEP introduit par voie exogène, ledit cPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm,
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit fragment est dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; ou
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit fragment est dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; et
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le même cadre de lecture que le cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le cadre de lecture déterminé par le codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une plante modifiée comprenant un cPEP introduit par voie exogène, ledit cPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm, ledit fragment ayant une taille de 3nnucléotides,nétant compris de 4 à 70, en particuliernétant compris de 4 à 41, et ladite séquence d’acides nucléiques comprenant deux parties contiguës :
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée non codante (i.e.non traduite naturellement,e.g.3’UTR ou 5’UTR) ; et
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée codante (i.e.traduite naturellement,e.g.exon) ;
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, ladite plante appartenant à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacusAmaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum(pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
Dans un autre aspect, l’invention ci-dessus concerne une plante transgénique comprenant un acide nucléique codant un cPEP et les moyens de l’exprimer,
ledit cPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm,
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit fragment est dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; ou
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit fragment est dépourvu :
- du codon initiateur AUG codant une méthionine initiatrice ; et
- d’un codon STOP choisi parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi :
- soit dans le même cadre ouvert de lecture que celui codant ladite protéine ;
- soit dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le même cadre de lecture que le cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans le cadre de lecture déterminé par le codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une plante transgénique comprenant un cPEP introduit par voie exogène, ledit cPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 70 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm, ledit fragment ayant une taille de 3nnucléotides,nétant compris de 4 à 70, en particuliernétant compris de 4 à 41, et ladite séquence d’acides nucléiques comprenant deux parties contiguës :
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée non codante (i.e.non traduite naturellement,e.g.3’UTR ou 5’UTR) ; et
- une partie située au sein d’une séquence d’acides nucléiques réputée codante (i.e.traduite naturellement,e.g.exon) ;
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante transgénique telle que définie précédemment, dans laquelle la séquence codant ledit cPEP est plus courte que la séquence de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, ladite plante appartenant à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus , Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum(pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle l’expression dudit cPEP est placée sous le contrôle d’un promoteur fort, de préférence un promoteur fort constitutif tel que le promoteur 35S.
A tout égard, il convient de noter que les différents aspects de l’invention No. 1, tout comme les différents modes de réalisation de celle-ci sont interdépendants. Ces derniers peuvent donc être combinés entre eux pour obtenir des aspects et/ou des modes de réalisation préférés de l’invention No. 1 non explicitement décrits. Ceci est également valable pour l’ensemble des définitions fourni dans la présente description, lequel s’applique à tous les aspects de l’invention No. 1 et ses modes de réalisation.
* * *
Considérant la seconde invention (altPEP), un premier aspect de celle-ci concerne un procédé de préparation et de détermination d’un altPEP, ledit altPEP :
- ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés ;
- étant capable de moduler l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale ; et
- n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine,
ledit procédé comprenant :
a. une étape de détermination de la séquence d’acides nucléiques de l’ARN messager (ARNm) codant ladite protéine ;
b. une étape de détermination au sein de cet ARNm de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine ;
c. une étape de détermination au sein de cette séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale d’un fragment naturellement traduit de celle-ci,
ledit fragment ayant une taille de 3nnucléotides susceptible d’être traduiteviale code génétique en un peptide,nétant compris de 4 à 70, en particuliernétant compris de 4 à 41, et ledit fragment ayant une taille inférieure à celle de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale ;
d. une étape de production dudit peptide ; et
e. une étape de comparaison :
- entre l’accumulation de ladite protéine dans une cellule végétale en présence dudit peptide et l’accumulation de ladite protéine dans une cellule végétale de même type en absence dudit peptide ; et/ou
- entre le phénotype d’une plante en présence dudit peptide et le phénotype d’une plante de même type en absence dudit peptide,
dans laquelle :
- une différence de la quantité de ladite protéine en présence dudit peptide par rapport à la quantité de ladite protéine en absence dudit peptide ; et/ou
- une différence du phénotype en présence dudit peptide par rapport au phénotype en absence dudit peptide,
indique que ledit peptide est un altPEP capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans une cellule végétale.
La présente invention repose sur la constatation inattendue faite par les Inventeurs qu’il est possible de moduler spécifiquement l’accumulation d’une protéine à l’aide d’un peptide particulier produit naturellement, dont la séquence correspond à la traduction d’un fragment de l’ARN messager (ARNm) codant ladite protéine, ledit fragment étant choisi sur la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine.
Dans l’invention, le terme « altPEP » (alternative peptide) désigne un peptide capable de moduler spécifiquement l’accumulation d’une protéine une fois introduit dans une cellule végétale.
Selon l’invention, un altPEP est présent naturellement dans une cellule végétale. Cela signifie que la cellule végétale contient l’information de l’altPEP et les moyens de permettre son expression (i.e.codon START et codon STOP).
Un altPEP est peut donc être présent dans une cellule végétale et la quantité de celui-ci peut être modifiée par l’ajout artificiel de celui-ci, sous la forme d’un peptide ou sous la forme d’un acide nucléique codant ledit peptide, dans la cellule végétale.
La spécificité de l’altPEP vis-à-vis d’une protéine cible (d’un gène cible) est déterminée par sa séquence d’acides aminés. En effet, la séquence d’un altPEP correspond à la traduction d’un fragment de l’ARNm codant ladite protéine, ledit fragment étant choisi sur la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine.
La séquence peptidique d’un altPEP peut donc être déterminée à partir d’un fragment de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans l’invention, le fragment de l’ARNm utilisé pour déterminer la séquence de l’altPEP peut être choisi dans les deux autres cadres de lecture que celui codant la protéine dont on souhaite moduler l’accumulation existants sur la séquence de l’ARNm. En d’autres termes, un fragment peut être sélectionné dans les cadres de lecture +2 ou +3. Sur ce point, il est possible que les deux autres des cadres de lecture (le +2 et le +3) contiennent l’information d’un altPEP comme il est possible que seulement un des deux des cadres de lecture (le +2 ou le +3) contiennent l’information d’un altPEP.
Dans l’invention, le terme « cadre de lecture » désigne le regroupement des nucléotides constituant une séquence d’acides nucléiques en triplets (ou codons) consécutifs, qui se succèdent sans interruption ni recouvrement.
D’une manière générale, les altPEPs ont une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, notamment une taille comprise de 5 à 40 acides aminés, de 7 à 20 acides aminés ou plus particulièrement une taille comprise de 8 à 15 acides aminés. Par conséquent, la séquence d’un altPEP correspond à la traduction d’un fragment compris de 4 à 41 triplets de nucléotides, notamment d’un fragment compris de 5 à 40 triplets de nucléotides, de 7 à 20 triplets de nucléotides ou plus particulièrement d’un fragment compris de 8 à 15 triplets de nucléotides.
En d’autres termes, la séquence d’un altPEP correspond à la traduction en acides aminés d’un fragment de « 3n» nucléotides de l’ARNm de la protéine cible,nétant compris de 4 à 70, en particuliernétant compris de 4 à 41, notamment compris de 5 à 40, de 7 à 20 ou plus particulièrement compris de 8 à 15.
Par exemple, sinest égal à 5, l’altPEP a une taille de 5 acides aminés et correspond à la traduction d’un fragment de 15 (= 3 x 5) nucléotides. Par exemple, sinest égal à 40, l’altPEP a une taille de 40 acides aminés et correspond à la traduction d’un fragment de 120 (= 3 x 40) nucléotides. Par exemple, si n est égal à 70, l’altPEP a une taille de 70 acides aminés et correspond à la traduction d’un fragment de 210 (= 3 x 70) nucléotides.Etc.
Les altPEPs ont une taille de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 acides aminés, et correspondent respectivement à la traduction de fragments de 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207 ou 210 nucléotides.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit fragment a une taille de 3nnucléotides,nétant compris :
- de 4 à 41 ;
- de 5 à 40 ;
- de 7 à 20 ; ou
- de 8 à 15.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit peptide a une taille choisie parmi : 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 et 70 acides aminés.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP a une taille inférieure à celle de ladite protéine (i.e.celle dont l’altPEP module l’accumulation).
Comme indiqué plus haut, les altPEPs ont la capacité de moduler spécifiquement l’accumulation d’une protéine sans que l’accumulation de l’ARNm lui correspondant soit impacté. Autrement dit, l’ajout d’un altPEP dans une cellule végétale ne modifie pas la quantité d’ARNm permettant d’exprimer la protéine qu’il a la capacité de réguler, mais seulement la quantité de ladite protéine.
Selon l’invention, le terme « protéine » désigne une séquence d’acides aminés dont l’information est codée par un gène présent sur le génome d’une cellule végétale. Par « gène », on désigne donc, notamment, la séquence d’acides nucléiques nécessaire à la synthèse de ladite protéine. Aussi, un gène comprend davantage que les nucléotides codant la séquence d’acides aminés de la protéine. Par exemple, un gène inclut les séquences d’ADN nécessaires à la synthèse d’un pré-messager (pré-ARNm), lequel est ensuite maturé par la machinerie cellulaire en un ARN messager (ARNm). Ce dernier peut alors être traduit,viales ribosomes, en une protéine.
Au vu de ce qui précède, on comprend que l’ARN pré-messager (pré-ARNm) n’a pas subi d’épissage et est susceptible de contenir des introns, tandis que l’ARN messager (ARNm) mature peut avoir subi un épissage et ne contient que des exons.
Pour préparer un altPEP capable de moduler l’accumulation d’une protéine, il convient de traduire un fragment de l’ARNm codant ladite protéine, ledit fragment étant choisi sur la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine, lequel ne comprend ni la région 5’-UTR, ni la région 3’-UTR de l’ARNm.
Dans l’invention, la « modulation » de l’accumulation d’une protéine désigne soit une augmentation de l’accumulation de ladite protéine (i.e.une augmentation de la quantité de protéine dans la cellule végétale), soit une diminution de l’accumulation de ladite protéine (i.e.une diminution de la quantité de protéine dans la cellule végétale). Autrement dit, un mode de réalisation de l’invention a pour objet le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite modulation de l’accumulation de ladite protéine induite par ledit altPEP est :
- une diminution de l’accumulation de ladite protéine ; ou
- une augmentation de l’accumulation de ladite protéine.
L’augmentation et la diminution de l’accumulation de ladite protéine peuvent être mesurées et suivies à l’aide de méthodes bien connues de l’homme du métier, telles que le couplage de la protéine à un marqueurvial’utilisation de cassettes d’expression particulières, ou un Western blot.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel à l’étape e., la quantité de protéine en présence dudit peptide est supérieure à la quantité de protéine en absence dudit peptide. En d’autres termes, en présence d’un altPEP favorisant l’augmentation de l’accumulation de la protéine, la traduction de l’ARNm correspondant est augmentée, ce qui conduit à une production plus importante de la protéine sans que soit modifiée la quantité dudit ARNm.
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel à l’étape e., la quantité de protéine en présence dudit peptide est inférieure à la quantité de protéine en absence dudit peptide. En d’autres termes, en présence d’un altPEP favorisant la diminution de l’accumulation de la protéine, la traduction de l’ARNm correspondant est diminuée (inhibée), ce qui conduit à une production moins importante de la protéine sans que soit modifiée la quantité dudit ARNm.
Dans l’invention, le fragment de l’ARNm codant ledit altPEP est situé au sein la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine, et ledit fragment en tant que tel peut également être traduit naturellement dans ladite cellule végétale. Ceci, quel que soit le cadre de lecture utilisé (i.e.le +2 et/ou le +3). L’existence d’un altPEP au sein de ladite cellule végétale est donc naturelle et a pour origine soit la machinerie cellulaire, soit une action de l’Homme. Pour cela, il est possible soit d’introduire artificiellement ledit altPEP en tant que tel, soit d’introduire une cassette d’expression comprenant la séquence d’acides nucléiques codant ledit altPEP et les moyens de l’exprimer dans ladite cellule végétale.
Dans l’invention, la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale, laquelle comprend un fragment portant l’information d’un altPEP, est une région de l’ARNm qualifiée de « codante », c’est-à-dire qu’elle correspond à une région de l’ARNm qui code tout ou partie de la protéine fonctionnelle. Cette séquence correspond donc au cadre ouvert de lecture principal (i.e.le +1), lequel code la protéine dont on veut moduler l’accumulation.
Dans l’invention, les termes « cadre ouvert de lecture » et « ORF » (open reading frame) sont équivalents, et peuvent être utilisés l’un pour l’autre. Ils correspondent à une séquence de nucléotides (acides nucléiques) dans une molécule d’ADN ou d’ARN pouvant potentiellement coder un peptide ou une protéine : ledit cadre ouvert de lecture débute par un codon START (le codon START codant généralement une méthionine), suivi d’une série de codons (chaque codon codant un acide aminé), et se termine par un codon STOP (le codon STOP n’étant pas traduit).
La région codante de l’ARNm correspond donc à la séquence génétique délimitée par le codon START ou codon d’initiation (codant le plus souvent une méthionine) à l’extrémité 5’ et par le codon STOP à l’extrémité 3’. La région codante de l’ARNm ne comprend pas donc les séquences introniques éventuellement présentes dans la séquence d’un gène ou de l’ARN pré-messager (pré-ARNm), ni les régions 5’UTR et 3’UTR, car celles-ci ne sont pas traduites et ne codent donc pas une partie de la protéine fonctionnelle du gène.
Dans l’invention, la séquence d’un altPEP est déterminée en effectuant une traduction d’un fragment de l’ARNm de la protéine dont on veut moduler l’accumulation, ledit fragment étant choisi sur la séquence (codante) d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine. Aussi, une même séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale peut donner des altPEPs différents selon le fragment de l’ARNm choisi. Par ailleurs, ce même fragment d’ARNm peut lui aussi donner des altPEPs différents selon le cadre de lecture utilisé pour le traduire,i.e.selon le regroupement des nucléotides de la séquence en triplets consécutifs. En effet et comme précédemment mentionné, une traduction peut être réalisée dans deux cadres de lecture différents (le +2 et/ou le +3) conduisant ainsi à potentiellement deux altPEPs différents.
Selon l’invention, le cadre de lecture ‘‘+1’’ correspond au cadre de lecture déterminé par le codon d’initiation de la protéine,i.e.le codon START du cadre ouvert de lecture utilisé naturellement pour la traduction de l’ARNm.
Les cadres de lecture ‘‘+2’’ et ‘‘+3’’ correspondent à des cadres de lecture qui ne sont pas ou peu utilisés naturellement pour la traduction de l’ARNm. Selon l’invention, le cadre de lecture ‘‘+2’’ correspond au cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture utilisé naturellement pour la traduction de l’ARNm et de la protéine qu’il code. Selon l’invention, le cadre de lecture ‘‘+3’’ correspond au cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture utilisé naturellement pour la traduction de l’ARNm et de la protéine qu’il code.
Généralement, dans le cas d’un fragment d’ARNm correspondant à une région codante et traduit selon le cadre de lecture +2 ou +3, les altPEPs obtenus possèdent une séquence différente de celle d’un fragment de la séquence d’acides aminés de la protéine naturellement codée par ledit ARNm.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit fragment comprend :
- un codon initiateur codant une méthionine initiatrice ; et
- un codon STOP choisie parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et dans lequel ledit fragment est choisi dans un cadre de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP est un peptide hydrophobe ou un peptide hydrophile. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP est un peptide hydrophobe. Par « peptide hydrophobe », on entend un peptide dont la séquence en acides aminés comprend plus de 50 % d’acides aminés hydrophobes. Par « plus de 50 % », on entend que la séquence en acides aminés comprend plus de 55 %, plus de 60 %, plus de 65 %, plus de 70 %, plus de 75 % ou plus de 80 % d’acides aminés hydrophobes. Par « plus de 50 % », on entend également que la séquence en acides aminés comprend au moins 51 %, au moins 56 %, au moins 61 %, au moins 66 %, au moins 71 %, au moins 76 % ou au moins 81 % d’acides aminés hydrophobes. Par « acides aminés hydrophobes », on entend les acides aminés choisis parmi : alanine (Ala / A), isoleucine (Ile / I), leucine (Leu / L), méthionine (Met / M), phénylalanine (Phe / F), tryptophane (Trp / W), tyrosine (Tyr / Y) et valine (Val / V).
En particulier, l’invention concerne également le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP est un peptide hydrophile. Par « peptide hydrophile », on entend un peptide dont la séquence en acides aminés comprend plus de 50 % d’acides aminés hydrophiles. Par « plus de 50 % », on entend que la séquence en acides aminés comprend plus de 55 %, plus de 60 %, plus de 65 %, plus de 70 %, plus de 75 % ou plus de 80 % d’acides aminés hydrophiles. Par « plus de 50 % », on entend également que la séquence en acides aminés comprend au moins 51 %, au moins 56 %, au moins 61 %, au moins 66 %, au moins 71 %, au moins 76 % ou au moins 81 % d’acides aminés hydrophiles. Par « acides aminés hydrophiles », on entend les acides aminés choisis parmi : acide aspartique (Asp / D), acide glutamique (Glu / E), arginine (Arg / R), asparagine (Asn / N), glutamine (Gln / Q), histidine (His / H), lysine (Lys / K), sérine (Ser / S) et thréonine (Thr / T).
Selon l’invention, un altPEP peut être produit par tout type de moyens accessibles à l’homme du métier.
De manière non limitative, un altPEP peut être produit aussi bien par synthèse, que par expression recombinante dans des systèmes homologues ou hétérologues. L’altPEP ainsi produit peut ensuite être introduit dans une cellule pour moduler l’accumulation d’une protéine cible.
De manière non limitative, il est également possible de produire un altPEP directement dans la cellule végétale contenant la protéine cible, en introduisant artificiellement dans celle-ci un acide nucléique (tel qu’un vecteur d’expression) codant ledit altPEP.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel, à l’étape d., la production dudit peptide est réalisée par synthèse peptidique ou par expression recombinante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel, à l’étape d., la production dudit peptide est réalisée à l’aide d’un acide nucléique codant ledit peptide introduit dans une cellule.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel, à l’étape e., la production dudit peptide est réalisée à l’aide d’un acide nucléique codant ledit peptide introduit dans ladite cellule végétale ou dans ladite plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel, à l’étape e., ledit peptide est mis en contact avec ladite cellule végétale ou dans ladite plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel, à l’étape e., ledit peptide est présent dans ladite cellule végétale ou dans ladite plante suite à l’expression d’un acide nucléique codant ledit peptide dans ladite cellule végétale ou dans ladite plante.
Au vu de ce qui précède, on comprend qu’un autre mode de réalisation de l’invention a pour objet le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel, à l’étape e., la présence dudit peptide dans ladite cellule végétale ou dans ladite plante résulte :
- de l’introduction d’une séquence d’acides nucléiques codant ledit peptide et comprenant les moyens de l’exprimer ; ou
- de l’introduction d’une séquence d’acides aminés correspondant audit peptide.
Un altPEP peut être utilisé pour moduler l’accumulation d’une protéine présente naturellement (i.e.endogène) ou non (i.e.exogène) dans ladite cellule végétale ou dans ladite plante.
Une « protéine naturellement présente dans une cellule végétale ou dans une plante » correspond à une protéine endogène codée par un gène présent sur le génome de la cellule végétale ou de la plante sans qu’il y ait eu nécessité d’intervention directe ou indirecte d’un être humain.
Une « protéine qui n’est pas naturellement présente dans une cellule végétale ou dans une plante » correspond à une protéine exogène codée par une séquence d’acides nucléiques présente sur le génome de la cellule végétale ou de la plante qui a nécessité l’intervention d’un être humain et l’emploi de moyens connus de l’homme du métier. Une telle séquence d’acides nucléiques peut provenir de la même espèce de plante ou d’une autre espèce de plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est d’origine endogène dans lesdites cellules végétales ou lesdites plantes utilisées à l’étape e.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est d’origine exogène dans lesdites cellules végétales ou lesdites plantes utilisées à l’étape e., lesdites cellules végétales ou lesdites plantes utilisées à l’étape e. comprenant alors une séquence d’acides nucléiques permettant l’expression de ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel l’accumulation de ladite protéine est déterminéeviala mise en œuvre d’une technique choisie parmi : le Western blot, la mesure de l’activité enzymatique, la spectrométrie de masse et la fusion traductionnelle. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel l’accumulation de ladite protéine est déterminéeviala mise en œuvre d’un Western blot.
Les Inventeurs ont constaté de manière surprenante que l’utilisation des altPEPs permet de modifier les phénotypes d’une plante visibles à l’échelle macroscopique. Il est donc tout à fait possible d’utiliser ces derniers pour affirmer (ou infirmer) que le peptide déterminé aux étapes a., b. et c., et éventuellement produit à l’étape d. est un altPEP (ou non). C’est d’ailleurs ce que permet l’alternative dite de comparaison phénotypique mise en œuvre à l’étape e. Par exemple, si le peptide déterminé sur l’ARNm d’une protéine impliquée dans la taille de la tige d’une plante provoque une augmentation, ou une diminution, de la taille de la tige d’une plante traitée avec ce dernier par rapport à une plante non traitée, cela signifie que ledit peptide est un altPEP capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la taille de la tige.
Dans l’invention, le terme « plante » fait référence de manière générale :
- à un ensemble de cellules végétales organisé en tout ou partie d’une plante quel que soit son stade de développement (y compris la plante sous forme de graine ou de jeune pousse) ;
- à un ou plusieurs organes de la plante (comme par exemple les feuilles, les racines, la tige, les fleurs) ;
- à une ou plusieurs cellules de la plante ; ou encore
- à un amas de cellules de la plante (e.g.un cal).
Dans l’invention, le terme « phénotype » désigne de manière non limitative les caractères visibles à l’échelle macroscopique tel que le nombre de racines latérales, le nombre de feuilles, la taille de la tige, la durée de floraison et la résistance au stress. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne par conséquent le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est impliquée dans au moins un phénotype de plante choisi parmi :
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de feuilles ;
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de fleurs ;
- la taille de la tige (ou de la hampe florale) ;
- la biomasse racinaire ;
- le nombre, la longueur et le niveau de ramification des racines ;
- la précocité de la germination ;
- la précocité du bourgeonnement ;
- la précocité de l’induction florale (ou transition florale) ;
- la vigueur germinative et la durée de phase juvénile ;
- la durée de la floraison ;
- la résistance à un stress biotique ;
- la résistance à un stress abiotique ; et
- le nombre de cellules.
Selon l’invention, une protéine est « impliquée dans un phénotype » si une modification de l’accumulation de celle-ci est associée à une modification dudit phénotype. En d’autres termes, une protéine est impliquée dans un phénotype si elle intervient dans le(s) caractère(s) correspondant audit phénotype.
Au vu de ce qui précède, on comprend qu’un objet de l’invention est le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel le phénotype observé à l’étape e. est choisi parmi :
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de feuilles ;
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de fleurs ;
- la taille de la tige (ou de la hampe florale) ;
- la biomasse racinaire ;
- le nombre, la longueur et le niveau de ramification des racines ;
- la précocité de la germination ;
- la précocité du bourgeonnement ;
- la précocité de l’induction florale (ou transition florale) ;
- la vigueur germinative et la durée de phase juvénile ;
- la durée de la floraison ;
- la résistance à un stress biotique ;
- la résistance à un stress abiotique ; et
- le nombre de cellules.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, ledit altPEP :
- ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés ;
- étant capable de moduler l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale ; et
- n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine,
et dans lequel ladite cellule végétale (i.e.celle dans laquelle on souhaite moduler l’accumulation d’une protéine) appartient à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum (pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel lesdites cellules végétales ou lesdites plantes utilisées à l’étape e. appartiennent à :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz),Pisum sativum (pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite cellule végétale (i.e.celle dans laquelle on souhaite moduler l’accumulation d’une protéine) est une cellule d’une algue.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel lesdites cellules végétales ou lesdites plantes utilisées à l’étape e appartiennent à une algue.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène choisi parmi :Aae15 (Acyl-activating enzyme 15), Aae16 (AMP-dependent synthetase and ligase family protein), Abcg11 (White-brown complex-like protein), Abdcg34 (ABC transporter G family member 34), Acc1 (Acetyl-CoA Carboxylase), Agb1 (GTP binding protein beta 1), Als (Acetolactate synthase (chloroplastic)), Anac076 (NAC domain-containing protein 76), Apg9 (Autophagy 9), Arlb1 (GTP-binding protein 1), Arr1 (Two-component response regulator ARR1), Arr5 (Two-component response regulator ARR5), Arr6 (Two-component response regulator ARR6), At59 (Pectate lyase family protein), Bak1 (Brassinosteroid insensitive 1-associated receptor kinase 1), Bccp1 (Acetyl-CoA Carboxylase (chloroplastic) subunit 1), Bccp2 (Acetyl-CoA Carboxylase (chloroplastic) subunit 2), Bri1 (Brassinosteroid insensitive 1), Bzo2h3 (bZIP transcription factor family protein), Cesa6 (Cellulose synthase A catalytic subunit 6), Cipk3 (CBL-interacting protein kinase 3), Cks1 (Cyclin-dependent kinases regulatory subunit 1), Cobl8 (COBRA-like protein 8 precursor), Coi1 (Coronatine-insensitive protein 1), Cpk3 (Calcium-dependent protein kinase 3), Crk34 (Cysteine-rich receptor-like protein kinase 34), Cyp705a18 (Cytochrome P450, family 705, subfamily A, polypeptide 18), Cyp71b26 (Cytochrome P450, family 71, subfamily B, polypeptide 26), Cyp78a8 (Cytochrome P450, family 78, subfamily A, polypeptide 8), Cyp97b3 (Cytochrome P450, family 97, subfamily B, polypeptide 3), Dcl1 (Endoribonuclease Dicer homolog 1), Dur3 (Urea-proton symporter DUR3), Ein2 (Ethylene-insensitive protein 2), Emb175 (Pentatricopeptide repeat-containing protein), Emb2726 (Elongation factor Ts family protein), Emb9 (Dihydrofolate synthetase), Epsps (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (chloroplastic)), Fnr1 (Ferredoxin-NADP[+]-oxidoreductase 1), Fve (Transducin family protein / WD-40 repeat family protein), Ga2ox7 (Gibberellin 2-beta-dioxygenase 7), Gapc (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), Gcn2 (ABC transporter family protein), Gdi2 (Guanosine nucleotide diphosphate dissociation inhibitor 2), Gln2 (Glutamine synthetase (chloroplastic)), Gsl3 (Callose synthase 2), Hag5 (Histone acetyltransferase of the MYST family 2), Hda18 (Histone deacetylase 18), Hexo1 (Beta-hexosaminidase 1), Hppd (4-hydroxyphenyl-pyruvate-dioxygenase), Hsl1 (B3 domain-containing transcription repressor VAL2), Iaa31 (Indole-3-acetic acid inducible 31), Iqd28 (IQ-domain 28), Jac1 (J-domain protein required for chloroplast accumulation response 1), Jar1 (Jasmonoyl--L-amino acid synthetase), Kp1 (Kinesin-like protein 1), Lrx2 (Leucine-rich repeat/extensin 2), Mapkkk3 (Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3), Mapkkk5 (Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5), Mfp2 (Multifunctional protein 2), Mrb1 (Transmembrane protein, putative (DUF3537)), Nsp1 (Nodulation signaling pathway 1), Pds (Phytoene desaturase (chloroplastic)), Pen3 (Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase and protein-tyrosine-phosphatase), Phyb (Phytochrome B), Pif3 (Phytochrome interacting factor 3), Pizza (Brassinosteroid-related acyltransferase 1), Ppox1 (Protoporphyrinogen oxidase (chloroplastic) 1), Ppox2 (Protoporphyrinogen oxidase (chloroplastic) 2), Prp39 (Tetratricopeptide repeat (TPR)-like superfamily protein), PsbA (Photosystem II D1 protein), Pskr1 (Phytosulfokin receptor 1), Rd21 (Granulin repeat cysteine protease family protein), Ring1 (RING/U-box superfamily protein), Ros1 (DNA glycosylase/AP lyase ROS1), Rpt4a (26S proteasome regulatory subunit 10B homolog A), Sfr6 (Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 16), Shr (Protein SHORT-ROOT), Shy2 (Auxin-responsive protein IAA3), Skl (EIN2-like protein, nramp transporter), Sps1 (Sucrose phosphate synthase 2F), Spt (Transcription factor SPATULA), Stn8 (Serine/threonine-protein kinase), Tap46 (PP2A regulatory subunit TAP46), Topp6 (Serine/threonine-protein phosphatase PP1 isozyme 7), TubB6 (Tubulin), TubB8 (Tubulin), Uba1a (RNA-binding (RRM/RBD/RNP motifs) family protein), Vim3 (E3 ubiquitin-protein ligase), Sgr1 (Magnesium dechelatase), Abi5 (Abscisic acid (ABA)-insensitive 5), Hsp101 (Heat shock protein 101), Rh10 (ATP-dependent RNA helicase)etWus (WUSCHEL).
En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène choisi parmi :Cpk3,Dcl1etNsp1. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par le gèneCpk3. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par le gèneDcl1. En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par le gèneNsp1.
Les gènesAae15, Aae16, abcg11, Abdcg34, Acc1, Agb1, Als, Anac076, Apg9, Arlb1, Arr1, Arr5, Arr6, At59, Bak1, Bccp1, Bccp2, Bri1, Bzo2h3, Cesa6, Cipk3, Cks1, Cobl8, Coi1, Cpk3, Crk34, Cyp705a18, Cyp71b26, Cyp78a8, Cyp97b3, Dcl1, Dur3, Ein2, Emb175, Emb2726, Emb9, Epsps, Fnr1, Fve, Ga2ox7, Gapc, Gcn2, Gdi2, Gln2, Gsl3, Hag5, Hda18, Hexo1, Hppd, Hsl1, Iaa31, Iqd28, Jac1, Jar1, Kp1, Lrx2, Mapkkk3, Mapkkk5, Mfp2, Mrb1, Nsp1, Pds, Pen3, Phyb, Pif3, Pizza, Ppox1, Ppox2, Prp39, PsbA, Pskr1, Rd21, Ring1, Ros1, Rpt4a, Sfr6, Shr, Shy2, Skl, Sps1, Spt, Stn8, Tap46, Topp6, TubB6, TubB8, Uba1a, Vim3, Sgr1, Abi5, Hsp101, Rh10etWusfont références aux protéines indiquées entre parenthèses. Bien entendu, l’invention concerne également des gènes homologues et/ou similaires susceptibles de porter des dénominations différentes. Par exemple, chezA. thalianale gèneGsl3codant pour lacallose synthase 2s’appelle égalementCals2.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un ORF comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NO : 1 (ORF de la protéine Aae15,A. thaliana), SEQ ID NO : 2 (ORF de la protéine Aae16,A. thaliana), SEQ ID NO : 3 (ORF de la protéine abcg11,A. thaliana), SEQ ID NO : 4 (ORF de la protéine Abdcg34,A. thaliana), SEQ ID NO : 5 (ORF de la protéine Acc1,A. thaliana), SEQ ID NO : 6 (ORF de la protéine Agb1,A. thaliana), SEQ ID NO : 7 (ORF de la protéine Als,A. thaliana), SEQ ID NO : 8 (ORF de la protéine Anac076,A. thaliana), SEQ ID NO : 9 (ORF de la protéine Apg9,A. thaliana), SEQ ID NO : 10 (ORF de la protéine Arlb1,A. thaliana), SEQ ID NO : 11 (ORF de la protéine Arr1,A. thaliana), SEQ ID NO : 12 (ORF de la protéine Arr5,A. thaliana), SEQ ID NO : 13 (ORF de la protéine Arr6,A. thaliana), SEQ ID NO : 14 (ORF de la protéine At59,A. thaliana), SEQ ID NO : 15 (ORF de la protéine Bak1,A. thaliana), SEQ ID NO : 16 (ORF de la protéine Bccp1,A. thaliana), SEQ ID NO : 17 (ORF de la protéine Bccp2,A. thaliana), SEQ ID NO : 18 (ORF de la protéine Bri1,A. thaliana), SEQ ID NO : 19 (ORF de la protéine Bzo2h3,A. thaliana), SEQ ID NO : 20 (ORF de la protéine Cesa6,A. thaliana), SEQ ID NO : 21 (ORF de la protéine Cipk3,A. thaliana), SEQ ID NO : 22 (ORF de la protéine Cks1,A. thaliana), SEQ ID NO : 23 (ORF de la protéine Cobl8,A. thaliana), SEQ ID NO : 24 (ORF de la protéine Coi1,A. thaliana), SEQ ID NO : 25 (ORF de la protéine Coi1,A. thaliana), SEQ ID NO : 26 (ORF de la protéine Cpk3,A. thaliana), SEQ ID NO : 27 (ORF de la protéine Cpk3,A. hypochondriacus), SEQ ID NO : 28 (ORF de la protéine Cpk3,B. distachyon), SEQ ID NO : 29 (ORF de la protéine Cpk3,B. distachyon), SEQ ID NO : 30 (ORF de la protéine Cpk3,G. max), SEQ ID NO : 31 (ORF de la protéine Cpk3,G. max), SEQ ID NO : 32 (ORF de la protéine Cpk3,G. max), SEQ ID NO : 33 (ORF de la protéine Cpk3,G. max), SEQ ID NO : 34 (ORF de la protéine Cpk3,O. sativa), SEQ ID NO : 35 (ORF de la protéine Cpk3,O. sativa), SEQ ID NO : 36 (ORF de la protéine Cpk3,S. lycopersicum), SEQ ID NO : 37 (ORF de la protéine Cpk3,Z. mays), SEQ ID NO : 38 (ORF de la protéine Cpk3,Z. mays), SEQ ID NO : 39 (ORF de la protéine Cpk3,Z. mays), SEQ ID NO : 40 (ORF de la protéine Cpk3,B. rapa), SEQ ID NO : 41 (ORF de la protéine Cpk3,B. rapa), SEQ ID NO : 42 (ORF de la protéine Cpk3,H. vulgare), SEQ ID NO : 43 (ORF de la protéine Cpk3,H. vulgare), SEQ ID NO : 44 (ORF de la protéine Cpk3,S. tuberosum), SEQ ID NO : 45 (ORF de la protéine Cpk3,A. palmeri), SEQ ID NO : 46 (ORF de la protéine Cpk3,M. truncatula), SEQ ID NO : 47 (ORF de la protéine Cpk3,M. truncatula), SEQ ID NO : 48 (ORF de la protéine Cpk3,T. aestivum), SEQ ID NO : 49 (ORF de la protéine Cpk3,T. aestivum), SEQ ID NO : 50 (ORF de la protéine Cpk3,T. aestivum), SEQ ID NO : 51 (ORF de la protéine Cpk3,T. aestivum), SEQ ID NO : 52 (ORF de la protéine Cpk3,L. perenne), SEQ ID NO : 53 (ORF de la protéine Cpk3,L. perenne), SEQ ID NO : 54 (ORF de la protéine Cpk3,L. perenne), SEQ ID NO : 55 (ORF de la protéine Cpk3,L. perenne), SEQ ID NO : 56 (ORF de la protéine Crk34,A. thaliana), SEQ ID NO : 57 (ORF de la protéine Cyp705a18,A. thaliana), SEQ ID NO : 58 (ORF de la protéine Cyp71b26,A. thaliana), SEQ ID NO : 59 (ORF de la protéine Cyp78a8,A. thaliana), SEQ ID NO : 60 (ORF de la protéine Cyp97b3,A. thaliana), SEQ ID NO : 61 (ORF de la protéine Dcl1,A. thaliana), SEQ ID NO : 62 (ORF de la protéine Dcl1,A. thaliana), SEQ ID NO : 63 (ORF de la protéine Dcl1,A. hypochondriacus), SEQ ID NO : 64 (ORF de la protéine Dcl1,B. distachyon), SEQ ID NO : 65 (ORF de la protéine Dcl1,G. max), SEQ ID NO : 66 (ORF de la protéine Dcl1,G. max), SEQ ID NO : 67 (ORF de la protéine Dcl1,O. sativa), SEQ ID NO : 68 (ORF de la protéine Dcl1,S. lycopersicum), SEQ ID NO : 69 (ORF de la protéine Dcl1,Z. mays), SEQ ID NO : 70 (ORF de la protéine Dcl1,B. rapa), SEQ ID NO : 71 (ORF de la protéine Dcl1,H. vulgare), SEQ ID NO : 72 (ORF de la protéine Dcl1,S. tuberosum), SEQ ID NO : 73 (ORF de la protéine Dcl1,M. truncatula), SEQ ID NO : 74 (ORF de la protéine Dcl1,T. aestivum), SEQ ID NO : 75 (ORF de la protéine Dcl1,T. aestivum), SEQ ID NO : 76 (ORF de la protéine Dcl1,T. aestivum), SEQ ID NO : 77 (ORF de la protéine Dcl1,T. aestivum), SEQ ID NO : 78 (ORF de la protéine Dcl1,L. perenne), SEQ ID NO : 79 (ORF de la protéine Dcl1,L. perenne), SEQ ID NO : 80 (ORF de la protéine Dur3,A. thaliana), SEQ ID NO : 81 (ORF de la protéine Ein2,A. thaliana), SEQ ID NO : 82 (ORF de la protéine Emb175,A. thaliana), SEQ ID NO : 83 (ORF de la protéine Emb2726,A. thaliana), SEQ ID NO : 84 (ORF de la protéine Emb9,A. thaliana), SEQ ID NO : 85 (ORF de la protéine Epsps,A. thaliana), SEQ ID NO : 86 (ORF de la protéine Fnr1,A. thaliana), SEQ ID NO : 87 (ORF de la protéine Fve,A. thaliana), SEQ ID NO : 88 (ORF de la protéine Ga2ox7,A. thaliana), SEQ ID NO : 89 (ORF de la protéine Gapc,N. benthamiana), SEQ ID NO : 90 (ORF de la protéine Gcn2,A. thaliana), SEQ ID NO : 91 (ORF de la protéine Gdi2,A. thaliana), SEQ ID NO : 92 (ORF de la protéine Gln2,A. thaliana), SEQ ID NO : 93 (ORF de la protéine Gsl3,A. thaliana), SEQ ID NO : 94 (ORF de la protéine Hag5,A. thaliana), SEQ ID NO : 95 (ORF de la protéine Hda18,A. thaliana), SEQ ID NO : 96 (ORF de la protéine Hexo1,A. thaliana), SEQ ID NO : 97 (ORF de la protéine Hppd,A. thaliana), SEQ ID NO : 98 (ORF de la protéine Hsl1,A. thaliana), SEQ ID NO : 99 (ORF de la protéine Iaa31,A. thaliana), SEQ ID NO : 100 (ORF de la protéine Iqd28,A. thaliana), SEQ ID NO : 101 (ORF de la protéine Jac1,A. thaliana), SEQ ID NO : 102 (ORF de la protéine Jar1,A. thaliana), SEQ ID NO : 103 (ORF de la protéine Kp1,A. thaliana), SEQ ID NO : 104 (ORF de la protéine Lrx2,A. thaliana), SEQ ID NO : 105 (ORF de la protéine Mapkkk3,A. thaliana), SEQ ID NO : 106 (ORF de la protéine Mapkkk5,A. thaliana), SEQ ID NO : 107 (ORF de la protéine Mfp2,A. thaliana), SEQ ID NO : 108 (ORF de la protéine Mrb1,A. thaliana), SEQ ID NO : 109 (ORF de la protéine Nsp1,M. truncatula), SEQ ID NO : 110 (ORF de la protéine Nsp1,A. thaliana), SEQ ID NO : 111 (ORF de la protéine Nsp1,B. distachyon), SEQ ID NO : 112 (ORF de la protéine Nsp1,G. max), SEQ ID NO : 113 (ORF de la protéine Nsp1,G. max), SEQ ID NO : 114 (ORF de la protéine Nsp1,O. sativa), SEQ ID NO : 115 (ORF de la protéine Nsp1,S. lycopersicum), SEQ ID NO : 116 (ORF de la protéine Nsp1,S. lycopersicum), SEQ ID NO : 117 (ORF de la protéine Nsp1,Z. mays), SEQ ID NO : 118 (ORF de la protéine Nsp1,Z. mays), SEQ ID NO : 119 (ORF de la protéine Nsp1,Z. mays), SEQ ID NO : 120 (ORF de la protéine Nsp1,Z. mays), SEQ ID NO : 121 (ORF de la protéine Nsp1,B. rapa), SEQ ID NO : 122 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 123 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 124 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 125 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 126 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 127 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 128 (ORF de la protéine Nsp1,H. vulgare), SEQ ID NO : 129 (ORF de la protéine Nsp1,S. tuberosum), SEQ ID NO : 130 (ORF de la protéine Nsp1,S. tuberosum), SEQ ID NO : 131 (ORF de la protéine Nsp1,T. aestivum), SEQ ID NO : 132 (ORF de la protéine Nsp1,T. aestivum), SEQ ID NO : 133 (ORF de la protéine Nsp1,L. perenne), SEQ ID NO : 134 (ORF de la protéine Nsp1,L. perenne), SEQ ID NO : 135 (ORF de la protéine Pds,A. thaliana), SEQ ID NO : 136 (ORF de la protéine Pen3,A. thaliana), SEQ ID NO : 137 (ORF de la protéine Phyb,A. thaliana), SEQ ID NO : 138 (ORF de la protéine Pif3,A. thaliana), SEQ ID NO : 139 (ORF de la protéine Pizza,A. thaliana), SEQ ID NO : 140 (ORF de la protéine Ppox1,A. thaliana), SEQ ID NO : 141 (ORF de la protéine Ppox2,A. thaliana), SEQ ID NO : 142 (ORF de la protéine Prp39,A. thaliana), SEQ ID NO : 143 (ORF de la protéine PsbA,A. thaliana), SEQ ID NO : 144 (ORF de la protéine Pskr1,A. thaliana), SEQ ID NO : 145 (ORF de la protéine Rd21,A. thaliana), SEQ ID NO : 146 (ORF de la protéine Ring1,A. thaliana), SEQ ID NO : 147 (ORF de la protéine Ros1,A. thaliana), SEQ ID NO : 148 (ORF de la protéine Rpt4a,A. thaliana), SEQ ID NO : 149 (ORF de la protéine Sfr6,A. thaliana), SEQ ID NO : 150 (ORF de la protéine Shr,A. thaliana), SEQ ID NO : 151 (ORF de la protéine Shy2,A. thaliana), SEQ ID NO : 152 (ORF de la protéine Skl,M. truncatula), SEQ ID NO : 153 (ORF de la protéine Sps1,A. thaliana), SEQ ID NO : 154 (ORF de la protéine Spt,A. thaliana), SEQ ID NO : 155 (ORF de la protéine Stn8,A. thaliana), SEQ ID NO : 156 (ORF de la protéine Tap46,A. thaliana), SEQ ID NO : 157 (ORF de la protéine Topp6,A. thaliana), SEQ ID NO : 158 (ORF de la protéine TubB6,A. thaliana), SEQ ID NO : 159 (ORF de la protéine TubB8,A. thaliana), SEQ ID NO : 160 (ORF de la protéine Uba1a,A. thaliana), SEQ ID NO : 161 (ORF de la protéine Vim3,A. thaliana), SEQ ID NO : 381 (ORF de la protéine Sgr1,A. thaliana), SEQ ID NO : 382 (ORF de la protéine Abi5,A. thaliana), SEQ ID NO : 383 (ORF de la protéine Hsp101,A. thaliana), SEQ ID NO : 384 (ORF de la protéine Rh10,M. truncatula) et SEQ ID NO : 385 (ORF de la protéine Wus,A. thaliana).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un ORF comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Par « pourcentage d’identité » entre deux séquences d’acides nucléiques (ou d’acides aminés), on entend un pourcentage de nucléotides (ou de résidus d’acides aminés) identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties au hasard sur toute la longueur des séquences. Le meilleur alignement (ou alignement optimal) est l’alignement pour lequel le pourcentage d’identité entre les deux séquences à comparer, comme calculé ci- après, est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d’acides nucléiques (ou d’acides aminés) sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L’alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé manuellement ou au moyen d’algorithmes et de logiciels à la disposition de l’homme de l’art, par exemple, la plateforme BLAST ou le programme MatGat (Campanella, Bitincka and Smalley, 2003).
Le pourcentage d’identité entre deux séquences est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide (ou l’acide aminé) est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100.
Au sens de l’invention, il est entendu dans l’invention que des séquences présentant « au moins 80% d’identité » avec une séquence de référence peuvent notamment présenter au moins 80%, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d’identité avec ladite séquence de référence.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne également le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de préparation et de détermination d’un altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel la séquence dudit peptide est choisie parmi les séquences : SEQ ID NO : 224 (AtDCL1alt18), SEQ ID NO : 225 (CrDCL1alt18), SEQ ID NO : 226 (EsDCL1alt18), SEQ ID NO : 227 (AlDCL1alt19), SEQ ID NO : 228 (CsDCL1alt19), SEQ ID NO : 229 (RsDCL1alt15), SEQ ID NO : 230 (BnDCL1alt14), SEQ ID NO : 231 (BoDCL1alt15), SEQ ID NO : 232 (BRDCL1alt17), SEQ ID NO : 233 (BsEIN2alt1), SEQ ID NO : 234 (CgEIN2alt1), SEQ ID NO : 235 (CrEIN2alt1), SEQ ID NO : 236 (EsEIN2alt1), SEQ ID NO : 237 (ThEIN2alt1), SEQ ID NO : 238 (BrEIN2alt1), SEQ ID NO : 239 (BoEIN2alt1), SEQ ID NO : 240 (BnEIN2alt1), SEQ ID NO : 241 (AtEIN2alt1), SEQ ID NO : 242 (AlEIN2alt1), SEQ ID NO : 243 (AtAP2alt1), SEQ ID NO : 244 (AlAP2alt1), SEQ ID NO : 245 (BoAP2alt1), SEQ ID NO : 246 (CgAP2alt1), SEQ ID NO : 247 (CrAP2alt1), SEQ ID NO : 248 (BrAP2alt1), SEQ ID NO : 249 (BsAP2alt1), SEQ ID NO : 250 (EsAP2alt1), SEQ ID NO : 251 (ThAP2alt1), SEQ ID NO : 252 (altPEP_DCL1), SEQ ID NO : 253 (altPEP_CYP78A8), SEQ ID NO : 254 (altPEP_PRP39), SEQ ID NO : 255 (altPEP_PIF3), SEQ ID NO : 256 (altPEP_PIF3), SEQ ID NO : 257 (altPEP_IQD28), SEQ ID NO : 258 (altPEP_AT59), SEQ ID NO : 259 (altPEP_AT59), SEQ ID NO : 260 (altPEP_ABCG11), SEQ ID NO : 261 (altPEP_ABCG11), SEQ ID NO : 262 (altPEP_ABCG11), SEQ ID NO : 263 (altPEP_ABCG11), SEQ ID NO : 264 (altPEP_ABCG11), SEQ ID NO : 265 (altPEP_ABCG11), SEQ ID NO : 266 (altPEP_ABCG11), SEQ ID NO : 267 (altPEP_RD21), SEQ ID NO : 268 (altPEP_RD21), SEQ ID NO : 269 (altPEP_RD21), SEQ ID NO : 270 (altPEP_RD21), SEQ ID NO : 271 (altPEP_LRX2), SEQ ID NO : 272 (altPEP_LRX2), SEQ ID NO : 273 (altPEP_LRX2), SEQ ID NO : 274 (altPEP_JAC1), SEQ ID NO : 275 (altPEP_JAC1), SEQ ID NO : 276 (altPEP_JAC1), SEQ ID NO : 277 (altPEP_PSKR1), SEQ ID NO : 278 (altPEP_PSKR1), SEQ ID NO : 279 (altPEP_PSKR1), SEQ ID NO : 280 (altPEP_PSKR1), SEQ ID NO : 281 (altPEP_PSKR1), SEQ ID NO : 282 (altPEP_PSKR1), SEQ ID NO : 283 (altPEP_FVE), SEQ ID NO : 284 (altPEP_FVE), SEQ ID NO : 285 (altPEP_UBA1A), SEQ ID NO : 286 (altPEP_CIPK3), SEQ ID NO : 287 (altPEP_CIPK3), SEQ ID NO : 288 (altPEP_APG9), SEQ ID NO : 289 (altPEP_APG9), SEQ ID NO : 290 (altPEP_COI1), SEQ ID NO : 291 (altPEP_COI1), SEQ ID NO : 292 (altPEP_COI1), SEQ ID NO : 293 (altPEP_COI1), SEQ ID NO : 294 (altPEP_COI1), SEQ ID NO : 295 (altPEP_COI1), SEQ ID NO : 296 (altPEP_COI1), SEQ ID NO : 297 (altPEP_COI1), SEQ ID NO : 298 (altPEP_COI1), SEQ ID NO : 299 (altPEP_MFP2), SEQ ID NO : 300 (altPEP_MFP2), SEQ ID NO : 301 (altPEP_MFP2), SEQ ID NO : 302 (altPEP_COBL8), SEQ ID NO : 303 (altPEP_IAA31), SEQ ID NO : 304 (altPEP_CYP705A18), SEQ ID NO : 305 (altPEP_AAE16), SEQ ID NO : 306 (altPEP_AAE16), SEQ ID NO : 307 (altPEP_CYP71B26), SEQ ID NO : 308 (altPEP_CYP71B26), SEQ ID NO : 309 (altPEP_CYP71B26), SEQ ID NO : 310 (altPEP_CYP71B26), SEQ ID NO : 311 (altPEP_CYP71B26), SEQ ID NO : 312 (altPEP_CYP71B26), SEQ ID NO : 313 (altPEP_KP1), SEQ ID NO : 314 (altPEP_KP1), SEQ ID NO : 315 (altPEP_PEN3), SEQ ID NO : 316 (altPEP_PEN3), SEQ ID NO : 317 (altPEP_HEXO1), SEQ ID NO : 318 (altPEP_GDI2), SEQ ID NO : 319 (altPEP_GDI2), SEQ ID NO : 320 (altPEP_GDI2), SEQ ID NO : 321 (altPEP_GDI2), SEQ ID NO : 322 (altPEP_GDI2), SEQ ID NO : 323 (altPEP_SFR6), SEQ ID NO : 324 (altPEP_CRK34), SEQ ID NO : 325 (altPEP_AAE15), SEQ ID NO : 326 (altPEP_CYP97B3), SEQ ID NO : 327 (altPEP_CYP97B3), SEQ ID NO : 328 (altPEP_CYP97B3), SEQ ID NO : 329 (altPEP_CYP97B3), SEQ ID NO : 330 (altPEP_AMB2726), SEQ ID NO : 331 (altPEP_HSL1), SEQ ID NO : 332 (altPEP_HSL1), SEQ ID NO : 333 (altPEP_HSL1), SEQ ID NO : 334 (altPEP_ANAC076), SEQ ID NO : 335 (altPEP_STN8), SEQ ID NO : 336 (altPEP_EMB175), SEQ ID NO : 337 (altPEP_EMB175), SEQ ID NO : 338 (altPEP_EMB175), SEQ ID NO : 339 (altPEP_EMB175), SEQ ID NO : 340 (altPEP_EMB175), SEQ ID NO : 341 (altPEP_GCN2), SEQ ID NO : 342 (altPEP_SPS1), SEQ ID NO : 343 (altPEP_SPS1), SEQ ID NO : 344 (altPEP_SPS1), SEQ ID NO : 345 (altPEP_SPS1), SEQ ID NO : 346 (altPEP_BZO2H3), SEQ ID NO : 347 (altPEP_VIM3), SEQ ID NO : 348 (altPEP_EMB9), SEQ ID NO : 349 (altPEP_EMB9), SEQ ID NO : 350 (altPEP_RPT4A), SEQ ID NO : 351 (altPEP_TOPP6), SEQ ID NO : 352 (altPEP_DUR3), SEQ ID NO : 353 (altPEP_DUR3), SEQ ID NO : 354 (altPEP_DUR3), SEQ ID NO : 355 (altPEP_ARLB1), SEQ ID NO : 356 (altPEP_ARLB1), SEQ ID NO : 357 (altPEP_HDA18), SEQ ID NO : 358 (altPEP_HDA18), SEQ ID NO : 359 (altPEP_HDA18), SEQ ID NO : 360 (altPEP_CESA6), SEQ ID NO : 361 (altPEP_FNR1), SEQ ID NO : 362 (altPEP_FNR1), SEQ ID NO : 363 (altPEP_FNR1), SEQ ID NO : 364 (EIN2alt1), SEQ ID NO : 365 (EIN2alt2) et SEQ ID NO : 366 (EIN2alt3).
Dans un deuxième aspect, l’invention ci-dessus a pour objet un altPEP tel qu’obtenu par la mise en œuvre du procédé tel que décrit précédemment. Selon ce même aspect, l’invention a également pour objet un altPEP isolé, de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment naturellement traduit d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm,
ledit altPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que précédemment décrit, ledit fragment ayant une taille de 3nnucléotides,nétant compris :
- de 4 à 41 ;
- de 5 à 40 ;
- de 7 à 20 ; ou
- de 8 à 15.
Autrement dit, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, ledit altPEP isolé comprenant 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 acides aminés.
En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, ledit altPEP isolé comprenant de 4 à 41 acides aminés. En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, ledit altPEP isolé comprenant de 5 à 40 acides aminés. En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, ledit altPEP isolé comprenant de 7 à 20 acides aminés. En particulier, l’invention concerne également l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, ledit altPEP isolé comprenant de 8 à 15 acides aminés.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel la taille dudit altPEP isolé est inférieure à celle de ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, ledit fragment comprenant :
- un codon initiateur codant une méthionine initiatrice ; et
- un codon STOP choisie parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP isolé est capable d’augmenter l’accumulation de ladite protéine dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP isolé est capable diminuer l’accumulation de ladite protéine dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP isolé est un peptide synthétique.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le altPEP tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP isolé est un peptide recombinant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, ledit altPEP isolé étant un peptide hydrophobe ou un peptide hydrophile.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est naturellement présente dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine n’est pas présente naturellement dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un transgène introduit artificiellement dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un vecteur introduit artificiellement dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite cellule végétale (i.e.celle dans laquelle on souhaite moduler l’accumulation d’une protéine) appartient à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum (pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite cellule végétale est une cellule d’une algue.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène choisi parmi :Aae15, Aae16, abcg11, Abdcg34, Acc1, Agb1, Als, Anac076, Apg9, Arlb1, Arr1, Arr5, Arr6, At59, Bak1, Bccp1, Bccp2, Bri1, Bzo2h3, Cesa6, Cipk3, Cks1, Cobl8, Coi1, Cpk3, Crk34, Cyp705a18, Cyp71b26, Cyp78a8, Cyp97b3, Dcl1, Dur3, Ein2, Emb175, Emb2726, Emb9, Epsps, Fnr1, Fve, Ga2ox7, Gapc, Gcn2, Gdi2, Gln2, Gsl3, Hag5, Hda18, Hexo1, Hppd, Hsl1, Iaa31, Iqd28, Jac1, Jar1, Kp1, Lrx2, Mapkkk3, Mapkkk5, Mfp2, Mrb1, Nsp1, Pds, Pen3, Phyb, Pif3, Pizza, Ppox1, Ppox2, Prp39, PsbA, Pskr1, Rd21, Ring1, Ros1, Rpt4a, Sfr6, Shr, Shy2, Skl, Sps1, Spt, Stn8, Tap46, Topp6, TubB6, TubB8, Uba1a, Vim3, Sgr1, Abi5, Hsp101, Rh10etWus.
En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène choisi parmi les gènes :Cpk3,Dcl1etNsp1. En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par le gèneCpk3. En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par le gèneDcl1. En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par le gèneNsp1.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385.
En particulier, l’invention concerne l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1). En particulier, l’invention concerne également l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne également l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne également l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385. L’invention concerne notamment l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel la séquence dudit peptide est choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 224 à 366.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est impliquée dans au moins un phénotype de plante choisi parmi :
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de feuilles ;
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de fleurs ;
- la taille de la tige (ou de la hampe florale) ;
- la biomasse racinaire ;
- le nombre, la longueur et le niveau de ramification des racines ;
- la précocité de la germination ;
- la précocité du bourgeonnement ;
- la précocité de l’induction florale (ou transition florale) ;
- la vigueur germinative et la durée de phase juvénile ;
- la durée de la floraison ;
- la résistance à un stress biotique ;
- la résistance à un stress abiotique ; et
- le nombre de cellules.
Dans l’invention, un altPEP peut être fusionné ou lié à une ou plusieurs molécules facilitant l’entrée de l’altPEP dans la cellule. Parmi ces molécules, on peut notamment citer des peptides et l’acide palmitique. Parmi ces molécules, on peut notamment citer des peptides pénétrants (Numata, K.,et al. Library screening of cell-penetrating peptide for BY-2 cells, leaves of Arabidopsis, tobacco, tomato, poplar, and rice callus. Sci Rep 8, 10966 (2018).) et l’acide palmitique. Par « peptide pénétrant » (ci-après CPP), on entend des peptides de petite taille pénétrant les bicouches lipidiques cellulaires ou déstabilisent les membranes cellulaires. Les CPP peuvent être classés en trois groupes : cationiques, amphipathiques et hydrophobes. En particulier :
- les CPP cationiques contiennent de nombreux acides aminés chargés positivement, tels que la lysine (Lys) et l'arginine (Arg) ;
- Les CPP amphipathiques sont généralement composés d'une séquence alternée d'acides aminés polaires et non polaires ; et
- Les CPP hydrophobes se composent d'acides aminés non polaires avec des charges nettes relativement faibles.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, ledit altPEP isolé étant fusionné à un peptide facilitant son entrée dans la cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’altPEP tel que décrit précédemment, ledit altPEP étant fusionné à un peptide pénétrant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, ledit altPEP isolé étant fusionné à l’extrémité N-terminale ou à l’extrémité C-terminale avec ledit peptide facilitant son entrée dans la cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’altPEP tel que décrit précédemment, ledit altPEP étant fusionné à l’extrémité N-terminale ou à l’extrémité C-terminale avec ledit peptide pénétrant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, ledit altPEP isolé étant fusionné avec :
- le peptide TAT (SEQ ID NO : 380) ;
- la pénétratine ;
- un peptide polyhistidine (notamment un peptide d’au moins 4 résidus histidine) ; ou
- un peptide polyarginine (notamment un peptide de 4 résidus arginine).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, ledit altPEP isolé étant lié à une ou plusieurs molécules d’acide palmitique.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’altPEP isolé tel que décrit précédemment, ledit altPEP isolé étant lié à l’extrémité N-terminale ou à l’extrémité C-terminale à une ou plusieurs molécules d’acide palmitique.
Sur ce point, il convient de noter que la quantité de l’altPEP nécessaire pour moduler l’accumulation d’une protéine peut varier selon que l’altPEP soit ou non modifié avec l’une des molécules facilitant sa pénétration cellulaire.
Dans un troisième aspect, l’invention ci-dessus a pour objet un acide nucléique codant un altPEP tel que décrit précédemment. Selon ce même aspect, l’invention a également pour objet un acide nucléique de 3nnucléotides, lequel acide nucléique correspond à un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’acide nucléique tel que décrit précédemment, ledit fragment comprenant :
- un codon initiateur codant une méthionine initiatrice ; et
- un codon STOP choisie parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’acide nucléique tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’acide nucléique tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également l’acide nucléique tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne l’acide nucléique tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
En particulier, l’invention concerne l’acide nucléique tel que décrit précédemment, oùnest compris :
- de 4 à 70 ;
- de 4 à 41 ;
- de 5 à 40 ;
- de 7 à 20 ; ou
- de 8 à 15.
Dans un autre aspect, l’invention ci-dessus concerne une composition comprenant un altPEP tel que décrit ci-dessus en tant que substance active.
Dans un autre mode de réalisation, l’invention ci-dessus concerne une composition comprenant un altPEP en tant que substance active, ledit altPEP :
- ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm ; et
- étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit fragment comprend :
- un codon initiateur codant une méthionine initiatrice ; et
- un codon STOP choisie parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP est à une concentration comprise de 10-9M à 10-3M. Sur ce point, il convient de noter d’une part que la composition de l’invention n’existe pas à l’état naturel et ceci est d’autant plus vrai qu’une telle concentration en altPEP ne peut exister au sein d’une cellule végétale. De plus et par « concentration comprise de 10-9M à 10-3M », on entend que la concentration en altPEP peut être comprise de 10-9à 10-4M, de 10-8à 10-4M, de 10-9à 10-5M, de 10-8à 10-5M, comme elle peut être comprise de 5 µM à 500 µM, de 30 µM à 70 µM, ou encore être de 50 µM.
En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP est à une concentration comprise de 10-9à 10-4M, de 10-8à 10-4M, de 10-9à 10-5M ou de 10-8à 10-5M. En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP est à une concentration comprise de 5 µM à 500 µM ou de 30 µM à 70 µM. En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP est à une concentration de 50 µM. De manière non limitative, cette concentration peut également être de 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M, 10-5M ou 10-4M.
Au vu de ce qui précède, on comprend que l’invention concerne également la composition comprenant un altPEP en tant que substance active, ledit altPEP :
- ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm ;
- étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine ; et
- étant notamment à une concentration comprise de 5 µM à 500 µM ou de 30 µM à 70 µM, ou étant notamment à une concentration de 50 µM.
A noter que par « composition comprenant un altPEP », on entend que la composition de l’invention comprend au moins un altPEP. C’est-à-dire qu’un mélange d’altPEPs est envisageable, lesdits altPEPs pouvant cibler une même protéine ou plusieurs protéines selon le fragment d’acides nucléiques dont ils sont issus. A cet égard, les concentrations susmentionnées concernent soit le mélange d’altPEPs en tant que tel, soit chacun des altPEPs dudit mélange, lesdits altPEPs pouvant être à la même concentration ou pouvant être à des concentrations différentes parmi celles citées ci-dessus.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition étant une composition phytopharmaceutique, une composition herbicide ou une composition d’enrobage,
en particulier ladite composition d’enrobage comprenant en outre au moins un agent de fixation.
En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition étant une composition phytopharmaceutique. En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition étant une composition herbicide. En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition étant une composition d’enrobage. De préférence, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition étant une composition d’enrobage comprenant en outre au moins un agent de fixation.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition comprenant en outre au moins un solvant. De préférence, ledit solvant est choisi parmi : l’acétone, l’acétonitrile, l’acide acétique, l’acide formique, l’adipate de diméthyle, le benzyl acétate, le bi-butyl carbonate, le dimethyl sulfoxide (DMSO), l’eau, le glutarate de diméthyle, l’hydroxyde d’ammonium, l’iso-butanol, l’iso-propanol, le lactate de diéthyle héxyle, le solvant naphta aromatique léger, le solvant naphta aromatique lourd, le succinate de diéthyle et leurs mélanges (e.g.mélange [eau ; acide acétique] ; [acétonitrile ; acide acétique], [eau, acétonitrile ; acide acétique], [eau ; DMSO], [eau ; acétonitrile] ou [eau ; hydroxyde d’ammonium]).
Les propriétés de solubilité des altPEPs sont déterminées notamment par leur composition en acides aminés. Les altPEPs hydrophiles peuvent être solubilisés et conditionnés dans des solutions aqueuses, telles que l’eau. Les altPEPs hydrophobes peuvent être solubilisés et conditionnés dans des solvants, tels que les solvants organiques.
Pour un traitement des plantes par les altPEPs, les solvants organiques sont des solvants non toxiques pour les plantes en faibles quantités, c’est-à-dire qu’ils n’ont pas d’effet délétère sur le développement de la plante. De manière non limitative, les solvants organiques peuvent être ceux cités ci-dessus et en particulier choisis parmi l’acétonitrile et l’acide acétique.
Comme indiqué ci-dessus, les altPEPs peuvent également être solubilisés et conditionnés dans des mélanges de solvants, comme par exemple, un mélange de solvant organique [acétonitrile ; acide acétique], un mélange [eau ; DMSO] dans un ratio volume:volume compris de 99:1 à 1:99, un mélange [eau ; acétonitrile] dans un ratio volume:volume compris de 99:1 à 1:99 ou un mélange [eau ; hydroxyde d’ammonium] dans un ratio volume:volume compris de 99:1 à 99,9:0,1. Les altPEPs peuvent également être solubilisés dans une solution comprenant 50 % d’acétonitrile, 10 % d’acide acétique et 40 % d’eau (volume/volume/volume).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition comprenant en outre au moins un diluant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition comprenant en outre au moins un adjuvant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition comprenant en outre au moins un agent de fixation.
Par « agent de fixation », on entend un agent chimique ou naturel lequel permet de coller la composition de l’invention à une graine de végétal de manière à enrober ladite graine de végétal. On entend également une substance rendant possible l’application et la tenue de la ou des substances actives sur le grain. Parmi les agents de fixation disponibles, on retrouve notamment la carboxymethyl cellulose (CMC) et la gomme arabique. De plus et de manière non limitative, un agent de fixation peut comprendre des solvants organiques, de l’eau, des dispersants, des émulgateurs, des tensioactifs, des mouillants et des colorants.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition comprenant en outre au moins un nutriment végétal. En particulier, l’invention concerne la composition telle que décrite précédemment, ladite composition comprenant en outre au moins un agent de fixation et au moins un nutriment végétal.
Par « nutriment végétal », on entend un élément assimilé par la plante pour permettre son développement. De manière non limitative, un nutriment végétal peut être choisi parmi : l’azote, le phosphore, le potassium, le calcium, le magnésium, le soufre, le manganèse, le fer, le cuivre, le bore, le zinc, le molybdène et leurs mélanges.
Au vu de ce qui précède, on comprend qu’un autre aspect de l’invention a pour objet une semence enrobée comprenant une graine de plante, ladite graine de plante étant enrobée par une composition d’enrobage telle que décrite précédemment.
L’enrobage peut être réalisé selon les procédés classiquement utilisés dans l’industrie agroalimentaire et peut être obtenu en utilisant un matériau apte à se désagréger dans un solvant ou dans la terre, tel qu’un liant ou de l’argile.
Selon l’invention, l’enrobage peut être utilisé pour conférer des propriétés particulières à une semence en combinaison avec un altPEP, telles qu’une croissance améliorée ou une résistance à certains stress biotiques ou abiotiques.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la semence enrobée telle que décrite précédemment, dans lequel ladite graine de plante à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum (pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la semence enrobée telle que décrite précédemment, ladite semence étant traitée par trempage dans une composition contenant un altPEP. Lors d’un trempage, la semence est alors plongée totalement ou partiellement dans une composition contenant un altPEP.
Dans un autre aspect, l’invention concerne une utilisation d’un altPEP en tant qu’agent phytosanitaire pour moduler l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale,
ledit altPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture de ladite protéine codée par ledit ARNm,
ledit altPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit fragment comprend :
- un codon initiateur codant une méthionine initiatrice ; et
- un codon STOP choisie parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment pour augmenter l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale. La présence de l’altPEP fait que la quantité de ladite protéine dans la cellule végétale traitée est supérieure à celle dans une cellule végétale non traitée.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment pour diminuer (inhiber) l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale. La présence du altPEP fait que la quantité de ladite protéine dans la cellule végétale traitée est inférieure à celle dans une cellule végétale non traitée.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP est produit hors de ladite cellule végétale avant d’être introduit dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP est un peptide synthétique.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP est un peptide isolé.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP est un peptide recombinant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP est un peptide hydrophobe ou un peptide hydrophile.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP est introduit dans ladite cellule végétale sous la forme d’un acide nucléique codant ledit altPEP. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP est introduit dans ladite cellule végétale sous la forme d’un acide nucléique codant ledit altPEP et comprenant les moyens de l’exprimer.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est naturellement présente dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine n’est pas présente naturellement dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un transgène introduit artificiellement dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un vecteur introduit artificiellement dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle l’accumulation de ladite protéine est déterminéeviala mise en œuvre d’une technique choisie parmi : le Western blot, la mesure de l’activité enzymatique, la spectrométrie de masse et la fusion traductionnelle. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle l’accumulation de ladite protéine est déterminéeviala mise en œuvre d’un Western blot.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP a une taille comprise de 4 à 41 acides aminés, de 5 à 40 acides aminés, de 7 à 20 acides aminés ou plus particulièrement une taille comprise de 8 à 15 acides aminés. En particulier, ledit altPEP a une taille de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 acides aminés.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite cellule végétale appartient à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum (pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite cellule végétale est une cellule d’une algue.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène choisi parmi :Aae15, Aae16, abcg11, Abdcg34, Acc1, Agb1, Als, Anac076, Apg9, Arlb1, Arr1, Arr5, Arr6, At59, Bak1, Bccp1, Bccp2, Bri1, Bzo2h3, Cesa6, Cipk3, Cks1, Cobl8, Coi1, Cpk3, Crk34, Cyp705a18, Cyp71b26, Cyp78a8, Cyp97b3, Dcl1, Dur3, Ein2, Emb175, Emb2726, Emb9, Epsps, Fnr1, Fve, Ga2ox7, Gapc, Gcn2, Gdi2, Gln2, Gsl3, Hag5, Hda18, Hexo1, Hppd, Hsl1, Iaa31, Iqd28, Jac1, Jar1, Kp1, Lrx2, Mapkkk3, Mapkkk5, Mfp2, Mrb1, Nsp1, Pds, Pen3, Phyb, Pif3, Pizza, Ppox1, Ppox2, Prp39, PsbA, Pskr1, Rd21, Ring1, Ros1, Rpt4a, Sfr6, Shr, Shy2, Skl, Sps1, Spt, Stn8, Tap46, Topp6, TubB6, TubB8, Uba1a, Vim3, Sgr1, Abi5, Hsp101, Rh10etWus.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un ORF comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un ORF comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne également l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit altPEP est choisi parmi les séquences : SEQ ID NOs : 224 à 366.
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, dans laquelle ladite protéine est impliquée dans au moins un phénotype de plante choisi parmi :
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de feuilles ;
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de fleurs ;
- la taille de la tige (ou de la hampe florale) ;
- la biomasse racinaire ;
- le nombre, la longueur et le niveau de ramification des racines ;
- la précocité de la germination ;
- la précocité du bourgeonnement ;
- la précocité de l’induction florale (ou transition florale) ;
- la vigueur germinative et la durée de phase juvénile ;
- la durée de la floraison ;
- la résistance à un stress biotique ;
- la résistance à un stress abiotique ; et
- le nombre de cellules.
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, pour moduler l’accumulation d’une protéine recombinante dont la séquence d’acides nucléiques qui la code correspond à la fusion des séquences d’acides nucléiques de deux gènes distincts.
En particulier, la séquence codante d’au moins un des deux gènes est celle d’un gène rapporteur, par exemple un gène codant une protéine fluorescente (telle que la GFP) ou une protéine permettant la résistance de la plante à un composé.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un altPEP telle que décrite précédemment, pour moduler l’accumulation d’une protéine recombinante dont la séquence d’acides nucléiques qui la code correspond à la fusion :
- d’une séquence d’acides nucléiques réputée non codante d’un premier gène ; et
- d’une séquence d’acides nucléiques codante d’un second gène,
la séquence dudit altPEP correspondant à la traductionviale code génétique d’un fragment de la séquence d’acides nucléiques réputée non codante du premier gène.
Dans un autre aspect, l’invention ci-dessus concerne un procédé de modulation de l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale comprenant une étape d’introduction :
- d’un altPEP ; ou
- d’un acide nucléique codant ledit altPEP et les moyens de l’exprimer,
dans ladite cellule végétale, l’introduction dudit altPEP entraînant une modulation de la quantité de ladite protéine dans ladite cellule végétale,
ledit altPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture de ladite protéine codée par ledit ARNm,
ledit altPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit fragment comprenant :
- un codon initiateur codant une méthionine initiatrice ; et
- un codon STOP choisie parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, ledit procédé permettant :
- de favoriser le développement d’une plante ; ou
- de ralentir ou d’empêcher le développement d’une plante.
En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, ledit procédé permettant de favoriser le développement d’une plante. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, ledit procédé permettant de ralentir ou d’empêcher le développement d’une plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment pour augmenter l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale. La présence du altPEP fait que la quantité de ladite protéine dans la cellule végétale traitée est supérieure à celle dans une cellule végétale non traitée.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment pour diminuer (inhiber) l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale. La présence du altPEP fait que la quantité de ladite protéine dans la cellule végétale traitée est inférieure à celle dans une cellule végétale non traitée.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP est produit hors de ladite cellule végétale avant d’être introduit dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP est un peptide synthétique.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP est un peptide isolé.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP est un peptide recombinant.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP est un peptide hydrophobe ou un peptide hydrophile.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP est introduit dans ladite cellule végétale sous la forme d’un acide nucléique codant ledit altPEP. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP est introduit dans ladite cellule végétale sous la forme d’un acide nucléique codant ledit altPEP et comprenant les moyens de l’exprimer.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est naturellement présente dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine n’est pas présente naturellement dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un transgène introduit artificiellement dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un vecteur introduit artificiellement dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel l’accumulation de ladite protéine est déterminéeviala mise en œuvre d’une technique choisie parmi : le Western blot, la mesure de l’activité enzymatique, la spectrométrie de masse et la fusion traductionnelle. En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel l’accumulation de ladite protéine est déterminéeviala mise en œuvre d’un Western blot.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP a une taille comprise de 4 à 41 acides aminés, de 5 à 40 acides aminés, de 7 à 20 acides aminés ou plus particulièrement une taille comprise de 8 à 15 acides aminés. En particulier, ledit altPEP a une taille de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 acides aminés.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite cellule végétale ou ladite plante appartient à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum (pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite cellule végétale est une cellule d’une algue.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène choisi parmi :Aae15, Aae16, abcg11, Abdcg34, Acc1, Agb1, Als, Anac076, Apg9, Arlb1, Arr1, Arr5, Arr6, At59, Bak1, Bccp1, Bccp2, Bri1, Bzo2h3, Cesa6, Cipk3, Cks1, Cobl8, Coi1, Cpk3, Crk34, Cyp705a18, Cyp71b26, Cyp78a8, Cyp97b3, Dcl1, Dur3, Ein2, Emb175, Emb2726, Emb9, Epsps, Fnr1, Fve, Ga2ox7, Gapc, Gcn2, Gdi2, Gln2, Gsl3, Hag5, Hda18, Hexo1, Hppd, Hsl1, Iaa31, Iqd28, Jac1, Jar1, Kp1, Lrx2, Mapkkk3, Mapkkk5, Mfp2, Mrb1, Nsp1, Pds, Pen3, Phyb, Pif3, Pizza, Ppox1, Ppox2, Prp39, PsbA, Pskr1, Rd21, Ring1, Ros1, Rpt4a, Sfr6, Shr, Shy2, Skl, Sps1, Spt, Stn8, Tap46, Topp6, TubB6, TubB8, Uba1a, Vim3, Sgr1, Abi5, Hsp101, Rh10etWus.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un ORF comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un ORF comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques présentant au moins 80 % d’identité, de préférence au moins 90 % d’identité, avec une séquence choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 1 à 161 et 381 à 385. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne également le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une séquence d’acides nucléiques choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3), SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1) et SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 26 à 55 (Cpk3). En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 61 à 79 (Dcl1). En particulier, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est codée par un gène comprenant une choisie parmi les séquences : SEQ ID NOs : 109 à 134 (Nsp1).
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP est choisi parmi les séquences : SEQ ID NOs : 224 à 366.
Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ladite protéine est impliquée dans au moins un phénotype de plante choisi parmi :
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de feuilles ;
- la taille, la forme, la surface, le volume, la masse et le nombre de fleurs ;
- la taille de la tige (ou de la hampe florale) ;
- la biomasse racinaire ;
- le nombre, la longueur et le niveau de ramification des racines ;
- la précocité de la germination ;
- la précocité du bourgeonnement ;
- la précocité de l’induction florale (ou transition florale) ;
- la vigueur germinative et la durée de phase juvénile ;
- la durée de la floraison ;
- la résistance à un stress biotique ;
- la résistance à un stress abiotique ; et
- le nombre de cellules.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel l’introduction dudit altPEP entraîne une précocité de la montaison chez ladite plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel l’introduction dudit altPEP entraîne une précocité de la floraison chez ladite plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel l’introduction dudit altPEP entraîne une augmentation de la taille de la tige chez ladite plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel l’introduction dudit altPEP entraîne une précocité de croissance de la tige chez ladite plante.
Les Inventeurs ont en effet constaté de manière inattendue qu’il est possible d’appliquer directement un altPEP sur la plante,e.g. vial’emploi de la composition de l’invention (cf. supra) comprenant un altPEP, pour moduler l’accumulation d’une protéine cible dans la plante, ce qui indique que le altPEP est capté par la plante.
Par conséquent, dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel ledit altPEP est introduit dans ladite plante :
- par arrosage, par pulvérisation ou par l’ajout d’un engrais, d’un terreau, d’un substrat de culture ou d’un support en contact avec la plante, ledit altPEP étant notamment administré à la plante sous la forme d’une composition comprenant de 10-9M à 10-4M dudit altPEP ;
- par arrosage, par trempage, par pulvérisation ou par l’ajout d’un engrais, d’un terreau, d’un substrat de culture ou d’un support en contact avec la plante, ledit altPEP étant notamment administré à une graine ou une semence sous la forme d’une composition comprenant de 10-9M à 10-4M dudit altPEP ; ou
- par le biais d’un acide nucléique codant ledit altPEP et comprenant les moyen d’exprimer ledit altPEP, ledit acide nucléique étant introduit artificiellement dans la plante.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que défini précédemment, dans lequel ledit altPEP est introduit artificiellement par voie externe dans la plante, de préférence par arrosage, par pulvérisation ou par l’ajout d’un engrais, d’un terreau, d’un substrat de culture ou d’un support inerte.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que défini précédemment, dans lequel ledit altPEP est introduit par arrosage.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que défini précédemment, dans lequel ledit altPEP est introduit par pulvérisation.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que défini précédemment, dans lequel ledit altPEP est introduit par l’ajout d’un engrais.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que défini précédemment, dans lequel la plante est traitée avec une composition comprenant de 10-9M à 10-4M dudit altPEP, ou comprenant notamment 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M, 10-5M ou 10-4M dudit altPEP. De préférence, les compositions ont une concentration de 10-8M à 10-5M pour une application par arrosage ou par pulvérisation sur la plante.
De manière complémentaire, des compositions plus ou moins concentrées peuvent être envisagées pour traiter la plante avec le altPEP. Par exemple, et de manière non limitative, des compositions plus concentrées comprenant de 10-1M à 10-3M, ou comprenant notamment 10-2M de altPEP, peuvent être utilisées dans le cas où le altPEP introduit artificiellement par voie externe est administré à la plante par épandage.
Dans un autre aspect, l’invention ci-dessus concerne une plante modifiée contenant un altPEP, laquelle « plante modifiée » correspond à une plante dans laquelle a été introduit artificiellement un altPEP, notamment par arrosage, par pulvérisation ouviaun engrais.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante modifiée comprenant un altPEP introduit par voie exogène, ledit altPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm,
ledit altPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit fragment comprend :
- un codon initiateur codant une méthionine initiatrice ; et
- un codon STOP choisie parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante modifiée telle que décrite précédemment, ladite plante appartenant à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum (pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
Dans un autre aspect, l’invention ci-dessus concerne une plante transgénique comprenant un acide nucléique codant un altPEP et les moyens de l’exprimer,
ledit altPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm,
ledit altPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit fragment comprend :
- un codon initiateur codant une méthionine initiatrice ; et
- un codon STOP choisie parmi les codons : UAG, UGA et UAA,
et ledit fragment étant choisi dans un cadre ouvert de lecture décalé d’un ou deux nucléotides par rapport à celui codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture différent du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un nucléotide en 3’ (ou de deux nucléotides en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. En particulier, l’invention concerne également la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé de deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale. Autrement dit, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle la traduction du fragment de l’ARNm est opérée dans un cadre de lecture décalé d’un (ou deux nucléotides en 5’) ou deux nucléotides en 3’ (ou d’un nucléotide en 5’) par rapport au codon d’initiation du cadre ouvert de lecture de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante transgénique telle que définie précédemment, dans laquelle la séquence codant ledit altPEP est plus courte que la séquence de l’ARNm codant ladite protéine.
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, ladite plante appartenant à une espèce végétale choisie parmi :Alopecurus myosuroides, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Arabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Barbarea vulgaris, Boechera stricta, Brachypodium distachyon, Brassica napus(colza), Brassica oleracea, Brassica rapa(colza), Camelina sativa, Capsella grandiflora, Capsella rubella, Carica papaya, Eutrema salsugineum, Glycine max(soja), Gossypium raimondii, Gossypium spp.(coton), Hordeum vulgare(orge), Lollium spp., Lotus japonicus(lotier), Medicago sativa (luzerne), Medicago truncatula(luzerne), Nicotiana benthamiana(tabac), Oryza sativa(riz), Pisum sativum (pois), Raphanus sativus, Solanum lycopersicum(tomate), Solanum melongena(aubergine), Solanum tuberosum(pomme de terre), Thellungiella halophila, Theobroma cacao, Triticum spp.(blé), Vitis vinifera(vigne) etZea mays(maïs).
Dans un mode de réalisation, l’invention concerne la plante transgénique telle que décrite précédemment, dans laquelle l’expression dudit altPEP est placée sous le contrôle d’un promoteur fort, de préférence un promoteur fort constitutif tel que le promoteur 35S.
A tout égard, il convient de noter que les différents aspects de l’invention No. 2, tout comme les différents modes de réalisation de celle-ci sont interdépendants. Ces derniers peuvent donc être combinés entre eux pour obtenir des aspects et/ou des modes de réalisation préférés de l’invention No. 2 non explicitement décrits. Ceci est également valable pour l’ensemble des définitions fourni dans la présente description, lequel s’applique à tous les aspects de l’invention No. 2 et ses modes de réalisation.
* * *
En outre, les inventions No. 1 et No. 2 sont illustrées, sans toutefois s’y limiter, par les Figures et Exemples suivants.
La est une représentation schématique illustrant les premières étapes du procédé de préparation et de détermination d’un cPEP. En particulier sont illustrés les étapes permettant de déterminer au sein d’un ARNm d’une protéine l’une des séquences d’acides nucléiques à partir de laquelle le peptide à tester (i.e.le cPEP potentiel) est identifié.
Les séquences : SEQ ID NOs : 375 à 379 sont uniquement fournies à titre d’exemple.
(a) Représentation schématique d'un gène codant portant des altORFs produisant des altPEPs. (b) Distribution du classement des ORFs des altPEPs détectés par MS. (c) Fréquence des altPEPs détectés par MS par plages de longueur. (d) Longueur de la racine principale des plantules d'A. thalianatraitées avec 100 µM de peptide pendant 4 jours. (e,f) Quantification de l'expression deDCL1par RT-qPCR (e) et par Western blot en utilisant des anticorps anti-DCL1 (f) dans des feuilles deA. thalianatraitées pendant 5 jours avec 100 µM de peptide. (g,h) Quantification de COI1, AP2, CPK3 (g) et EIN2 (h) par Western blot en utilisant des anticorps spécifiques dans des feuilles deA. thalianatraitées pendant 5 jours avec 100 µM de peptide.
Les résultats sont représentatifs de quatre expériences indépendantes. Les chiffres indiquent la moyenne et le SEM. Les témoins sont le peptide non pertinent et l'eau. Les barres d'erreur représentent les SEM, les astérisques indiquent une différence significative entre la condition de test et le contrôle selon le test t de Student (d) ou le test de Wilcoxon (e-h) (n = 100 (d), n = 4 (e-h) ; p < 0,05).
(a) Distribution des altPEP détectés par MS en fonction du nombre d'espèces deBrassicaceaedans lesquelles des homologues (plus de 80) ont été trouvés. (b) Distribution des altPEPs détectés par MS en fonction de leur cadre d'encodage. (c) Alignement des homologues d'AtDCL1alt18 (SEQ ID NO : 224) dans différentes espèces deBrassicaceae. (d,e) Conservation du premier altPEP de AP2 (d) et EIN2 (e) dans différentes espèces deBrassicaceae. (f) Activité de refAUG de EIN2 comparée à l'activité de altAUG1 réalisée avec le système de transcription/translationin vitro.
At :Arabidopsis thaliana, Al :Arabidopsis lyrata, Bn :Brassica napus, Bo :Brassica oleracea, Br :Brassica rapa, Bs :Boechera stricta, Cg :Capsella grandiflora, Cr :Capsella rubella, Cs :Camelina sativa, Es :Eutrema salsugineum, Rs :Raphanus sativus, Th :Thellungiella halophila.
Quantification par qRT PCR de l'expression de différents gènes en réponse à 100 µM de différents peptides
(a) Traitement des plantes avec le peptide AtCOI1alt1 ; (b) Traitement des plantes avec le peptide AtAP2alt1 ; (c) Traitement des plantes avec le peptide AtEIN2alt1 (d) Traitement des plantes avec le peptide AtCPK3alt1.
Les barres d'erreur représentent les SEM.
Les peptides complémentaires augmentent l'expression des protéines
Analyse de l'expression de la luciférase dansA. thalianaexprimant de manière constitutive le transgèneLUC. (a) Gel d'agarose après amplification PCR de l'ARN obtenu par immunoprécipitation à l'aide de billes magnétiques anti-HA, suivie d'une RT-PCR, sur des plantes traitées avec le peptide indiqué (SC-HA : Scrambled cPEPluc-HA ; Luc-HA : cPEPluc-HA). (b) Expression relative du transgène de la luciférase dans les plantes traitées avec le peptide indiqué, quantifiée par RT-qPCR. (c-e) Quantification relative de LUC dans les plantes traitées avec le peptide indiqué. (f,g) Ratio entre induction et quantification de LUC dans les plantes traitées avec cPEPluc par rapport aux plantes traitées avec un Scrambled cPEPluc, en utilisant diverses concentrations de peptides (f) ou prélevé à différents points de temps (g). (h) Analyse transcriptomique des plantes traitées avec cPEPluc-HA par rapport aux plantes traitées avec Scrambled cPEPluc-HA. (i) Analyse protéomique des plantes traitées avec cPEPluc-HA par rapport aux plantes traitées avec Scrambled cPEPluc-HA. L'expression protéique a été analysée par Western blots et quantifiée avec ImageJ.
Les barres d'erreur représentent les SEM, les astérisques indiquent une différence significative entre la condition de test et le contrôle selon le test de Wilcoxon (a, h, i, n = 5 ; c, n = 6 ; b, d-g, n = 12 ; p < 0,05).
Les cPEP nécessitent une complémentarité de séquence avec leur cible pour leur activité
(a) Analyse FRET-FLIM de l'interaction entre cPEPnsp1-FAM et NSP1 (gauche) ou NSP1ΔcPEP (droite)in planta. (b) Quantification par qRT-PCR de l'expression de NSP1 dans les racines deM. truncatulatraitées avec cPEPnsp1 ou Scrambled cPEPnsp1. (c) Quantification via GUS des racines deM. truncatulatraitées par peptide et portant la fusion Pro NSP1-NSP1-GUS. (d,e) Quantification de l'expression de NSP1 dans les feuilles deN. benthamianaaprès infiltration de différentes constructions : Type « sauvage » i.e. version de NSP1 dans laquelle la séquence cPEP a été supprimée (NSP1 ΔcPEP) ou version de NSP1 dans laquelle la séquence cPEP a été remplacée par une séquence artificielle (NSP1 ΔcPEP-cPEPartificiel), avec un vecteur vide (contrôle) ou cPEPnsp1 ou cPEPartificiel. (f,g) Formation de racines latérales de plantules deM. truncatulaWT,nsp1ou surexprimant NSP1, en réponse à cPEPnsp1 ou Scrambled cPEPnsp1. (h,i) Quantification des nodules sur des racines deM. truncatulatraitées avec un peptide non pertinent ou cPEPskl. (j) Développement racinaire de plantules deM. truncatulainfectées parA. euteicheset traitées avec un peptide non pertinent ou avec cPEPrh10. (k) Expression relative de l'α-tubuline deA. euteichesdans des plantules deM. truncatulainfectées parA. euteicheset traitées avec un peptide non pertinent ou avec cPEPrh10.
Les barres d'erreur représentent les SEM, les astérisques indiquent une différence significative entre la condition de test et le contrôle selon le test t de Student (f-i, j) ou le test de Wilcoxon (b-e, k) (b-e, k, n = 6 ; f-i, n = 50 ; j, n = 60 ; p < 0,05).
Les cPEPs peuvent moduler le développement d'
A. thaliana
et sa réponse aux stress
(a,b) Longueur des racines primaires de plantules d'A. thalianatraitées avec un Scrambled cPEPdcl1 ou avec un cPEPdcl1. (c) Teneur relative en chlorophylle de plants d'A. thalianatraités avec le peptide correspondant. (d) Reprise de la croissance des plantules deA. thalianaaprès un choc thermique de 45°C pendant 45 min et traitées avec le peptide correspondant. (e) Surface relative des lésions des plants deA. thalianainfectés parB. cinereaet traités avec le peptide indiqué. (f) Mesure du jour de floraison des plants d’A. thalianatraités avec les peptides indiqués. (g,h) Mesure du jour de floraison des plants d’A. thalianatraités avec un peptide non pertinent ou un mélange de cPEPs (ciblant EIN2, BRI1, BAK1 et WUS). (i,j) Surface foliaire de plants deA. thalianatraités avec un peptide non pertinent ou un mélange de cPEPs (ciblant EIN2, BRI1, BAK1 et WUS).
Les barres d'erreur représentent les SEM, les astérisques indiquent une différence significative entre la condition testée et le contrôle selon le test t de Student (b, c, e, f, h, j) (b, n =50 ; c, e, f, h, j, n = 40 ; d, n = 5 ; p < 0,05).
Les cPEPs peuvent moduler le développement d'
A. thaliana
et sa réponse aux stress
(a) Quantification de l'expression de CPK3, à l'aide d'anticorps CPK3, dans des plantes deA. thalianatraitées par peptide. (b-c) Test d'infection de feuilles d'A. thalianatraitées au peptide inoculées avec des spores deB. cinerea.
Les barres d'erreur représentent les SEM, les astérisques indiquent une différence significative entre la condition de test et le contrôle selon le test de Wilcoxon (a) et le test t de Student (c) (a: n = 6 ;c, n = 50 ; p < 0,05).
(a) Analyse de l'activité de la luciférase dans des plants d’A. thalianaexprimant constitutivement le transgène LUC et traitées avec un Scrambled cPEPluc ou un cPEPluc, avec ou sans cycloheximide. (b) Analyse de l'activité de la luciférase après transcription/traductionin vitrode la luciférase exprimée avec une cPEPluc ou un Scrambled cPEPluc.
Les barres d'erreur représentent les SEM, les astérisques indiquent une différence significative entre la condition de test et le contrôle selon le test de Wilcoxon (a-b) (a, b, n = 6 ; p < 0,05).
(a,b) Surface relative des lésions sur des feuilles deS. lycopersicuminfectées parB. cinereaet traitées avec un peptide non pertinent ou cPEPjar1. (c,d) Résistance au stress thermique de plants de soja traités avec un peptide non pertinent ou cPEPhsp101. (e,f) Croissance (hauteur des plantes) des plants de soja traités avec un peptide non pertinent ou un mélange de cPEP (ciblant MRB1, SHY2 et SGR1). (g,h) Surface des feuilles de plantes deB. vulgaristraitées avec un peptide non pertinent ou un mélange de cPEPs (ciblant EIN2, BRI1, BAK1 et WUS). (i,j) Surface des feuilles de plants d'A. hypochondriacustraités avec un peptide non pertinent ou un mélange de cPEPs (ciblant EIN2, BRI1, BAK1 et WUS).
Les barres d'erreur représentent les SEM, les astérisques indiquent une différence significative entre la condition de test et le contrôle selon le test t de Student (b, d, f, h, j, n = 40 ; p < 0,05).
Les plants deMedicago truncatulaGaertn cv. Jemalong génotype A17 ont été cultivés sur milieu Long Aston comme décrit dans Delaux PMet al.(New Phytol. 2013 Jul ;199(1):59-65). Les plants d’Arabidopsis thalianaCol-0 ont été cultivées en terre jusqu'à l'âge de 4 semaines dans une chambre de croissance (22/20°C, 16 h/8 h L/D, HR 80 %, ~ 75 µmol. m-2. s-1). Les graines deBarbarea vulgarisont été stratifiées pendant 24h à 4°C avant d'être cultivées en pot dans une chambre de croissance. Les graines d'Amaranthus hypochondriacus,Glycine maxetSolanum lycopersicumont été semées sur pots et cultivées en chambre de croissance. Les plantesNicotiana benthamianaetM. truncatulaont été cultivées comme décrit dans Combier JP et al. (Genes and Development. 22, 1549-1559, 2008). Les plantules ABRE-LUC ont été fournies par MR Knight (Arabidopsis. Plant Cell. 23, 4079-95, 2011). Les plants d’Arabidopsis thalianaLUC ont été stérilisées et semées sur des plaques de 96 puits contenant 100 µL de milieu MS/2.
Les peptides de séquences SEQ ID NOs : 162 à 223 et 386 à 418 ont été synthétisés par Smart Biosciences et dissous à une concentration comprise de 2 à 10 mM dans l’eau, aliquotés et conservés à - 80°C.
Les plasmides ont été obtenus en utilisant la stratégie de clonage Golden Gate dans pCAMBIA220 modifié. La fusion translationnelleMt-NSP1(Medtr8g020840):GUS a été réalisée en utilisant 3183 pb du promoteurNSP1et 3180 pb de la sectionpostCDS deNSP1. Les expressions dans les feuilles deN. benthamianaont été réalisées en utilisant le promoteur 35S.
Les transformations des feuilles deNicotiana benthamianaont été réalisées selon Combier JP et al. (Genes and Development. 22, 1549-1559, 2008).
La quantification des ARNm a été réalisée par qRT-PCR en utilisant les couples de primers adéquat choisis parmi les séquences : SEQ ID NOs : 367 à 374. Les niveaux d’expression pour les contrôles ont été fixés à 100. Les primers utilisés pour les tests surA. euteichessont décrit dans Camborde et al. (New Phytol. 233:2232-2248. 2022).
Des feuilles d’A. thalianade type sauvage (wild-type) ou mutant ont été pulvérisées quotidiennement avec 100 μM de peptide ou 100 μM de la versionscramblecorrespondante pendant 3 jours. Six heures après le dernier traitement, cinq feuilles matures par plante ont été inoculées avec une gouttelette de 5 μL de 2,5×105spores/mL de la souche B05.10 deBotrytis cinereadiluée dans 100 μM de peptide ou de sa versionscramblecorrespondante. Après inoculation, les plantes ont été maintenues dans une humidité relative de 100 %. Ensuite, une gouttelette de 2 μL de 100 μM de peptide ou de 100 μM de la versionscramblecorrespondante a été déposée quotidiennement sur les feuilles infectées parB. cinereapendant 3 jours (jusqu’à l’apparition des symptômes). Les feuilles ont été prélevées des plantes pour déterminer les zones de lésions en utilisant le programme ImageJ. Pour la tomate, le protocole a été le même sauf que l'inoculation a été effectuée avec 5 000 spores deB. cinerea, sans peptide. Les peptides ont été ajoutés 1h après l'inoculation (1 µL de 500 µM) et chaque jour pendant deux jours avec 5 µL de 100 µM de peptide. Pour l’infection deM. truncatulaavecA. euteiches, les plantes ont été cultivées sur un milieu d’agar et traitées avec 10 µL de 100 µM de peptides, 24 h avant, et 24 h et 72h après l’infection avec 10 µL (1000 spores) de spores d’A. euteiches. Les plants sont récoltés 7 jours après l’inoculation pour l’extraction d’ARN.
Les plants deN. benthamianaont été traitées par pulvérisation des feuilles 24 h avant la récolte. Pour les tests Luc, 100 µL de milieu liquide MS/2 contenant les peptides ont été ajoutés à chaque puits. 5 µL de luciférine ont été ajoutés et l'activité luciférase a été lue 30 minutes plus tard à l'aide d'un spectrophotomètre. Tous les autres essais ont été réalisés en pulvérisant ou en arrosant les plantes. Pour quantifier le niveau de protéine induit par les cPEPs dansArabidopsis, les rosettes ont été pulvérisées chaque jour avec 100 µM de peptide ou son contrôle pendant 5 jours. Les feuilles ont été récoltées 6 heures après le dernier traitement pour des analyses par western blot. En ce qui concerne le test de floraison et le contenu en chlorophylle, des plantes d'Arabidopsisâgées de 10 jours ont été pulvérisées avec 500 µL de 10 µM de peptide, trois fois par semaine jusqu'à la floraison. La teneur en chlorophylle a été mesurée avec le chlorophylomètre SPAD (Konica Minolta). La surface foliaire a été mesurée à l'aide du logiciel ImageJ. Les plantules deBarbarea vulgarisetA. hypochondriacusont été traitées juste après le semis et 3 fois par semaine avec 500 µL d'un mélange de 20 µM de chaque peptide. Pour le western blot, un choc thermique a été réalisé en plaçant des plants de 20 jours cultivés dans des plaques à 24 puits sur du MS/2, 90 min à 37 °C avant de les récolter. Les plants ont été traités avec 100 µM de peptide pendant 24 h. Pour le test de résistance au choc thermique surA. thaliana, des plantules de 3 jours ont été traitées pendant trois jours avec 100 µM de peptide avant de placer les plantes à 45 °C pendant 45 min. Les plants ont été placés dans une chambre de croissance pour récupérer et traités 24 h après le choc thermique avec 100 µM de peptide. Pour le choc thermique du soja, des plantules d'une semaine ont été traitées 48 h, 24 h et 30 min avant d'être placées à 45 °C pendant 24 h. Pour la croissance du soja, les jeunes plants ont été traités 3 fois par semaine pendant deux semaines avec 500 µL de 100 µM de peptides.
Les protéines totales des plants d’Arabidopsisont été extraites selon Ormanceyet al. (Plant Sci. 2019 Mar ;280:12-17). Les analyses Western blot ont été réalisées selon Combieret al. (Genes Dev. 2008 Jun 1 ;22(11):1549-59). Les niveaux de protéines ont été normalisés par rapport à la coloration Ponceau. Les anticorps ont été acquis auprès d’Agrisera et Sigma.
Le système d’expression de protéines de germe de blé à haut rendement TnT®SP6 (Promega) a été utilisé selon les instructions du fabricant. La séquence LUC a été amplifiée à l’aide de la polymérase GoTaq®(Promega), les cPEP ou leurs versions Scramble correspondantes ont été ajoutés juste avant le début de la réaction. La réaction a été arrêtée après 60 min, après quoi l’activité LUC a été mesurée avec un spectrophotomètre à plaque (Perkin-Elmer Victor Nivo).
Les plants deArabidopsis thalianacomprenant la construction LUC ont été traitées en infiltrant les feuilles avec une solution de peptide avec ou sans cycloheximide (200 μg.mL-1) dans un milieu MS/2, 24 h avant la récolte pour le test LUC.
La co-immunoprécipitation de l'ARN a été adaptée de Merretet al. (Plant Physiol. 174:1216-1225. 2017). 400 mg de poudre de tissu ont été incubés dans 3 mL de tampon de lyse (200 mM Tris, pH 9,0, 110 mM acétate de potassium, 0,5% Triton X-100, 0,1% Tween®20, 5 mM DTT, 1,5% inhibiteur de protéase et 80 unités.ml-1 RNasin). Le lysat a été incubé sur la glace pendant 10 minutes, puis centrifugé à 16 000g pendant 10 minutes à 4°C. 1,5 mL d'extrait brut a été incubé avec 25 μL de billes magnétiques anti-HA (Thermo Scientific) pendant 1,5 h à 4°C sous rotation. Après liaison, les billes ont été lavées cinq fois avec 0,75 mL de tampon de lyse. L'élution a été réalisée avec 200 μL de guanidium 8 M pendant 5 minutes sur glace et précipitée pendant la nuit avec 300 μL d'éthanol à 100 %. Après centrifugation (16 000g, 45 min, 4°C), les culots ont été remis en suspension dans 200 μL de réactif Monarch de protection ADN/ARN (New England Biolabs) et l'ARN a été extrait selon les instructions du fabricant et concentré dans 10 μL à l'aide du kit de nettoyage ARN Monarch®(New England Biolabs). 300 μL de fractions d'entrée et de fractions non liées ont été conservés et l'ARN a été extrait comme décrit ci-dessus. La transcription inverse a été réalisée sur 10 μL d'éluat ou 500 ng d'entrée/sans liaison en utilisant le kit Superscript®IV (Thermo Scientific). L'amplification par PCR a été réalisée sur 1 μL d'ADNc avec des amorces spécifiques.
Analyse FRET FLIM, préparation d’échantillon de feuilles pour les tests
Les échantillons ont été préparé sur la base des protocoles de Cambordeet al(Nat Protoc. 12:1933-1950. 2017). Brièvement, la soucheAgrobacterium tumefaciensGV3101pmp90 portant les plasmides 35S-NSP1 ou 35S-NSP1ΔORF ont été utilisés pour infiltrer les feuilles deN. benthamiana. Les disques agro-infiltrés d'au moins trois feuilles différentes ont été fixés après 48 heures par infiltration sous vide d'une solution de fixation de paraformaldéhyde à 4 % (p/v), suivie d'une étape de perméabilisation à l'aide d'un traitement à la protéinase K. Après des lavages, la coloration des acides nucléiques a été réalisée par infiltration sous vide d'une solution de Sytox Orange 5µM (Invitrogen). Ensuite, les disques ont été lavés et montés sur TBS avant les mesures FLIM des noyaux.
Analyse FRET FLIM, préparation des échantillons de feuilles de cPEP pour les expériences FRET-FLIM
Les plasmides 35s-NSP1 ou 35s-NSP1ΔcPEP ont été transformés dans la souche pmp90 de A. tumefaciens GV3101 et agro-infiltrés dans des feuilles de N. benthamiana. 40h plus tard, une solution de 10µM de cPEP-FAM a été infiltrée dans les mêmes feuilles et les plantes ont été incubées pendant 3h. Ensuite, les disques foliaires ont été fixés et traités comme décrit dans Cambordeet al(Nat Protoc. 12:1933-1950. 2017), puis lavés et montés sur TBS avant les mesures de FLIM cytoplasmique.
Analyse FRET FLIM, acquisition de données TCSPC-FLIM
La FLIM a été réalisée sur Leica TCS SP8 SMD qui consiste en un microscope inversé LEICA DMi8 équipé d'un système TCSPC de PicoQuant. L'excitation du donneur FITC à 470 nm a été réalisée par un laser à diode pulsé picoseconde à une fréquence de répétition de 40 MHz, à travers un objectif à immersion d'huile (63×, N.A. 1,4). La lumière émise a été détectée par un détecteur Leica HyD dans la gamme d'émission de 500-550 nm. Les images ont été acquises avec des photons d'acquisition allant jusqu'à 1500 par pixel.
À partir des images d'intensité de fluorescence, les courbes de décroissance ont été calculées par pixel et ajustées (par estimation du maximum de vraisemblance de la Loi de Poisson) avec un modèle de décroissance mono- ou double-exponentiel à l'aide du logiciel SymphoTime 64 (PicoQuant, Allemagne). La fonction du modèle mono-exponentiel a été appliquée pour les échantillons de donneurs avec seulement du FITC présent. La fonction modèle double-exponentielle a été utilisée pour les échantillons contenant du FITC et du Sytox. Les expériences ont été répétées au moins trois fois pour obtenir des données statistiquement valides. L'efficacité du transfert d'énergie (E) basée sur la durée de vie de la fluorescence (τ) a été calculée comme suit : E = 1 - (τD+A/τD-A), où τD+A est la durée de vie de la fluorescence du donneur en présence de l'accepteur et τD-A est la durée de vie de la fluorescence du donneur en l'absence de l'accepteur.
Les valeurs moyennes de l’expression génique relative, du niveau de protéines ou des paramètres phénotypiques ont été comparées à l’aide du test de Wilcoxon ou du test t de Student. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la moyenne (SEM). Les astérisques indiquent des différences significatives (p < 0,05).
Les altPEP contrôlent la traduction de leur gène codant
Un premier objectif a été d'examiner si des altPEPs naturels pouvaient être détectés dansA. thaliana(Fig. 2a). Pour ce faire, il a été générée bio-informatiquement une liste de tous les altORFs potentiels de plus de 10 acides aminés de longueur, et situés hors cadre dans les séquences codantes deA. thaliana. Sur la base de cette liste, nous avons analysé un ensemble de données MS récemment publié (Müller J.B.et al.Nature. 582, 592-596 (2020)) et identifié 112 nouveaux altPEPs, montrant que les altPEPs sont naturellement représentés dans le protéomein planta(SEQ ID NOs : 252-363). En même temps, ont été identifiés 85 des 112 protéines de référence correspondantes dans le même ensemble de données, ce qui suggère que les altPEPs pourraient dans certains cas être plus exprimées que leurs protéines de référence. Parmi les 112 altPEP identifiées, 24 d'entre eux correspondaient au premier altORF trouvé dans la séquence codante (Fig. 2b ; SEQ ID NOs : 258, 261, 262, 263, 270, 274, 284, 285, 286, 290, 295, 303, 312, 316, 320, 321, 323, 324, 332, 343, 344, 352, 353 et 358). De manière surprenante, la majorité des altPEPs identifiées étaient codées à partir d'autres AUG alternatifs (altAUG), du deuxième au 23ème, ce qui montre que plusieurs altAUG, situés en aval des AUG canoniques, peuvent être traduits et être actifsin planta(Fig. 2b). La longueur moyenne des peptides codés par les altORFs détectés était de 45 acides aminés, tandis que le plus long contenait 212 acides aminés (Fig. 2c, SEQ ID NO : 295). Il est intéressant de noter que 35 altPEPs ne partageaient aucune homologie parmi lesBrassicaceae(Fig. 3a). Enfin, il est surprenant que 105 altPEPs sur 112 soient codées par des altAUGs situés dans le cadre 2 (si l'on considère que la protéine principale est codée par le cadre 1) (Fig. 3b). Ces altPEPs n'ont pas été décrits par d'autres (Wang S.et al.Mol Plant13, 1-16 (2020)), apportant des peptides traduits supplémentaires à ceux déjà décrits. Cette analyse a montré que les altPEPs sont naturellement exprimés à des niveaux détectablesin planta,et qu’ils sont probablement répandus parmi les différents gènes codants annotés, bien que les altPEPs identifiés ici ne correspondent probablement qu'à une fraction des altPEPs réellement présents dans les cellules végétales.
Pour étudier les rôles biologiques des altPEPs, deux types d'altPEPs ont été étudié : un bien conservé parmi lesBrassicaceae, et correspondant à l'altORF18 du gèneDCL1(Fig. 3c), et un autre, correspondant au premier altORF du gèneCOI1, mais non conservé parmi lesBrassicaceae. Des plantules d'A. thalianaont été traités avec le peptide AtDCL1alt18 (SEQ ID NO : 224) et le développement des racines analysé, puisque les mutantsdcl1présentent des racines principales plus longues (Park, W.,et al. Curr. Biol. 12, 1484–1495 (2002)). De manière intéressante, le traitement avec le peptide AtDCL1alt18 a conduit à une diminution du développement des racines (Fig. 2d). Une analyse par qRT-PCR et Western blot pour quantifier l'expression de DCL1 a été réalisée et alors qu'aucun effet sur l'expression de l'ARNm n'a été observé, l'application du peptide AtDCL1alt18 a augmenté l'accumulation de la protéine DCL1 (Fig. 2e, f). De manière intéressante, le traitement des plantes avec le peptide AtCOI1alt1 a révélé une augmentation du niveau de la protéine COI1, montrant que cette propriété n'est pas limitée à DCL1 (Fig. 2g ; Fig. 4a).
Pour prolonger cette observation, ont été identifiés par bioinformatique les premiers altPEPs de plus de 10 acides aminés de plusieurs gènes codants bien connus deA. thaliana. Il s’agit des trois gènes :AP2etEIN2, pour lesquels le premier altPEP potentiel était conservé parmi lesBrassicaceae(Fig. 3d, e), etCPK3, pour lequel le premier altPEP n'était pas conservé. A été également testé si l'altAUG1 du gèneEIN2est traduitin vitro, en utilisant un système de transcription/translationin vitrodans des extraits de germe de blé. Pour cela, le CDS de la luciférase a été fusionné au 5'UTR deEIN2jusqu'au refAUG ou à l'altAUG1, et a été comparée l'expression de la luciférase. De manière intéressante, il a été montré que altAUG1 est efficace pour promouvoir la traduction (Fig. 3f). L'efficacité de traduction est du même ordre que l'activité de refAUG, ce qui suggère une co-translation en quantité similaire de la protéine EIN2 canonique et de l'altPEP. Les plantes ont ensuite été traitées avec les trois altPEP synthétiques (AtAP2alt1 ; SEQ ID NO : 243, AtCPK3alt1 et AtEIN2alt1 ; SEQ ID NO : 241). Dans chaque cas, il a été observé une augmentation de la protéine de référence, sans détecter aucun changement dans l'expression de l'ARNm (Fig. 2g, h ; Fig. 4b, c, d). Ceci suggère que l'augmentation de l'expression des protéines de référence est probablement une propriété commune des altPEPs. En parallèle, la conservation des altPEPs ne semble pas être importante pour leur activité. Sur la base de ces deux constatations, ont été synthétisés trois altPEPs (SEQ ID NOs : 334 à 366) correspondant à différentes régions du gèneEIN2et ont été traitées indépendamment des plantesA. thalianaavec ceux-ci. De manière intéressante, les trois peptides ont été capables d'augmenter le niveau de la protéine EIN2 (Fig. 2h), montrant que tous les altPEPs testés partagent la propriété d'augmenter les niveaux de leur protéine de référence.
Il a été démontré dans le point précédent que les peptides courts peuvent interagir physiquement avec leur ARN naissant (Lauressergues D,et al. Cell Reports. 38:110339, 2022). il a été questionné si tout peptide traduit à partir d'une séquence située dans un gène codant pouvait partager la même propriété (Fig. 5a). Pour ce faire, il a été conçu un peptide complémentaire de 10 acides aminées (SEQ ID NO : 213) correspondant à un fragment de 10 acides aminés de la protéine luciférase, exprimée de façon constitutive dansArabidopsis thaliana(Whalleyet al. Plant Cell. 23, 4079-95, 2011), et ne présentant aucune homologie avec une quelconque séquence du génome deA. thaliana. En utilisant la méthode RNA-IP suivie de la PCR sur des plantes traitées avec des peptides marqués HA (cPEPluc-HA ; SEQ ID NO : 387), il a été validé qu'un tel cPEP était spécifiquement capable d'interagir avec l'ARNm de la luciférase, alors qu'un Scrambled peptide correspondant (SEQ ID NO : 386) ne le pouvait pas (Fig. 5a). Pour déterminer si cette interaction pouvait avoir une pertinence biologique, des plants ont été traités avec le cPEPluc synthétique et l'expression de la luciférase a été analysée. Alors que l'analyse qPCR n'a montré aucun effet sur l'abondance de l'ARNm (Fig. 5b), le traitement avec le peptide a augmenté l'activité de la luciférase par rapport aux traitements avec de l'eau ou des peptides non spécifiques de la luciférase (Fig. 5c). Un essai en microplaque à 96 puits a été développé, dans lequel des graines ont été semées sur un demi-milieu solide MS et les plantules de 14 jours ont été traitées en ajoutant 100 µL d’un milieu liquide contenant les peptides. Dans un second temps, dix peptides supplémentaires de 10 acides aminés ciblant des séquences distinctes du gène de la luciférase ont été développés (SEQ ID NOs : 388 à 397), dans les trois cadres (ORF1 correspond à la protéine luciférase canonique), et tous ont été capables d'augmenter l'activité luciférase (Fig. 5d). En parallèle, 7 cPEPs de 5 à 60 acides aminés (SEQ ID NOs :398 à 403) ont été conçus et synthétisés. Le traitement exogène avec ces différents peptides a révélé une augmentation de l'activité luciférase pour les peptides allant de 5 à 40 acides aminés, alors que les peptides plus longs n'ont eu aucun effet (Fig. 5e). L'effet de la concentration en peptides et du temps de traitement sur l'activité cPEPluc a ensuite été analysé. Ainsi, la concentration optimale de cPEP dans ces conditions a été trouvée à 50 µM (Fig. 5f), et 24h de traitement ont montré l'effet maximal du cPEP (Fig. 5g). Enfin, pour savoir si les cPEP pouvaient avoir des effets secondaires, des plants d’A. thalianaexprimant la luciférase ont été traités avec un cPEPluc (SEQ ID NO : 213) ou son Scrambled peptide (SEQ ID NO : 220) et une analyse transcriptomique et protéomique a été effectuée (Fig. 5h, i). De manière intéressante, aucun changement dans le transcriptome et dans le protéome des plantes traitées avec le cPEPluc n’a été détecté, par rapport aux plantes traitées avec le Scrambled peptide, ce qui suggère une forte spécificité des cPEPs pour leur protéine cible.
Généralisation du concept de peptides augmentant l'expression des protéines
Afin de vérifier si les cPEP peuvent cibler n'importe quelle protéine, il a été étudié et validé l'activité de 12 cPEP ciblant 12 protéines différentes pour lesquelles des anticorps étaient disponibles, dans trois espèces végétales différentes. La question était de savoir si l'augmentation de la quantité de protéines observée après le traitement par les cPEP était suffisante pour moduler le développement des plantes. Pour répondre à cette question, le développement s’est concentré sur différentes protéines de la plante modèleM. truncatula. L'application de cPEPnsp1 (SEQ ID NO :164) a diminué la quantité de racines latérales (Fig. 6f, g), tout comme le mutant nsp1 et une surexpression de NSP1, alors que tous deux sont restés insensibles au peptide (Fig. 6g). Le gène Sickle (SKL) deM. truncatulaest homologue à AtEIN2, et les mutants skl développent plus de nodules que les plantes de type sauvage (Penmetsaet al. Plant J. 55:580-595, 2008). De manière cohérente, l'application d'un cPEPskl (SEQ ID NO : 411) a conduit à une diminution de la quantité de nodules (Fig. 6h, i). Il a ensuite été ciblé la protéine RH10 deM. truncatula, qui module la réponse des plantes à un oomycète pathogène,Aphanomyces euteiches(Cambordeet al. New Phytol. 233:2232-2248. 2022). Le traitement des plantes avec un cPEP ciblant MtRH10 (SEQ ID NO : 412) a augmenté la résistance des plantes au pathogène, comme le révèle l'augmentation du développement des racines et la diminution de l'expression de l'α-tubuline d'A. euteichesdans les racines (Fig. 6j, k).
Généralisation à d’autre modèle de plantes, d’autres protéines
Les travaux se sont ensuite concentrés sur différentes protéines deA. thalianaimpliquées dans différentes fonctions de la plante. Tout d'abord, le traitement de plantules d'A. thalianaavec un cPEPdcl1 (SEQ ID NO : 163) a conduit à une diminution de la croissance des racines primaires puisque les mutants dcl1 présentent des racines primaires plus longues (Parket al. Curr. Biol. 12:1484–1495 (2002). (Fig. 7a, b). Puis des plants d'A. thalianaont été traités avec des cPEP ciblant des régulateurs de la teneur en chlorophylle. De façon intéressante, un cPEP ciblant la protéine ABI5 (SEQ ID NO : 406) a pu être identifié, diminuant la teneur en chlorophylle, et un cPEP ciblant la protéine SGR1 (SEQ ID NO : 407), augmentant cette teneur (Fig. 7c). De même, un cPEP ciblant la protéine HSP101 (SEQ ID NO : 404), impliquée dans la tolérance au stress thermique (Queitsch et al, Plant Cell. 12:479-492, 2000), a amélioré la viabilité des plantules à un choc thermique (Fig. 7d). En parallèle, plusieurs régulateurs de défense des plants d'A. thaliana ont été ciblés, AGB1 (SEQ ID NO : 195), MAPKKK3 (SEQ ID NO : 187), JAR1 (SEQ ID NO : 192), MAPKKK5 (SEQ ID NO : 188), ABCG34 (SEQ ID NO : 194) et CPK3 (SEQ ID NO : 162). De manière intéressante, ces cPEPs ont amélioré la défense des plantes contre le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea, comme le révèle la diminution de la taille des lésions observée dans les plantes traitées avec les cPEPs par rapport aux plantes traitées avec un peptide non pertinent (Fig. 7e ; ). Ensuite, plusieurs cPEPs ont été conçu ciblant différentes protéines impliquées dans le développement des plants en mesurant le jour de floraison. Il a pu être identifié des cPEPs augmentant le développement des plantes (SHY2 et MRB1, SEQ ID NOs : 178 et 180) alors que d'autres étaient capables de diminuer le développement des plantes (BRI1, SEQ ID NO 198 ; BAK1, SEQ ID NO 199 ; TAP46, SEQ ID NO 181 ; SPT, SEQ ID NO 182 ; EIN2, SEQ ID NO 204 ; GA2OX7, SEQ ID NO 183 ; PHYB, SEQ ID NO 184 ; HAG5, SEQ ID NO 185 ; SHR, SEQ ID NO 186 et WUS, SEQ ID NO 196) (Fig. 7f). Enfin, il a été cherché à savoir si les cPEPs pouvaient avoir des effets synergiques, en mélangeant certains d'entre eux. De manière intéressante, alors que chaque peptide séparément a diminué le développement jusqu'à 17% (Fig. 7f), un mélange de cPEPs ciblant EIN2, BRI1, BAK1 et WUS (respectivement SEQ ID NOs : 204, 198, 199 et 196), a diminué le développement de 23%, comme le montre le jour de floraison (Fig. 7g, h) et la croissance des feuilles (Fig. 7i, j), montrant un effet synergique des cPEPs. Toutes ces données ont montré que, en plus d'améliorer l'expression des protéines, les cPEPs sont des outils utiles pour moduler précisément plusieurs phénotypes végétaux.
Les cPEP augmentent l'efficacité de la traduction des protéines
Les cPEPs augmentent la quantité de protéines sans perturber les niveaux d'ARNm, ce qui suggère que les cPEPs augmentent la traduction ou la stabilité des protéines. Afin de distinguer les deux options, des plants deA. thalianaexprimant le gène LUC ont été traités avec cPEPluc (SEQ ID NO : 213) et du cycloheximide (CHX), un inhibiteur de traduction. Le dosage de l'activité luciférase a montré que l'effet du cPEPluc était inhibé en présence de CHX, ce qui montre que les cPEP n'agissent pas sur la stabilité des protéines (Fig. 9a). Pour appuyer ces données, le gène LUC a été exprimé avec ou sans cPEPluc dans le système de transcription/traductionin vitrodu germe de blé, où aucune activité protéasique ne se produit. Cela a révélé que la cPEPluc augmentait l'activité de LUCin vitro, renforçant fortement l'idée que les cPEP augmentent l'efficacité de la traduction des protéines (Fig. 9b).
L'intérêt principal des cPEPs pourrait être l'utilisation en agronomie pour améliorer le rendement des cultures. Pour en apporter la preuve, ils ont été testés sur des plantes d'intérêt agronomique, en se concentrant sur les mêmes phénotypes que ceux qui ont été étudiés sur les plantes modèles. Ainsi, les travaux se sont d'abord concentrés sur la défense des plantes et la protéine JAR1 de la tomate a été ciblée. Conformément à l'observation précédente chezA. thaliana, le traitement de la tomate avec cPEPjar1 (SEQ ID NO : 413) a permis d'améliorer la résistance de la plante àB. cinerea(Fig. 10a, b). En parallèle, il a été identifié l'homologue de la HSP101 dans le soja et un cPEP ciblant cette protéine a été conçu (SEQ ID NO : 408). De manière intéressante, le traitement des plantes de soja avec ce peptide a augmenté leur tolérance à un stress thermique (Fig. 10c, d). En parallèle, il a été validé sur le soja que l'utilisation de cPEP peut améliorer la croissance des plantes, en utilisant un mélange de cPEP ciblant SHY2, MRB1 et SGR1 (respectivement SEQ ID NOs : 410, 409 et 407) (Fig. 10e, f). Enfin, il a été testé si les cPEPs pouvaient diminuer la croissance des adventices (mauvaises herbes) en ciblant une espèce deBrassicaceae,Barbarea vulgaris, et il a été montré qu'un mélange de cPEPs ciblant EIN2, BRI1, BAK1 et WUS (respectivement SEQ ID NOs : 417, 415, 414 et 416), était capable de le faire (Fig. 10g, h). Pour aller plus loin, il a été sélectionné une des mauvaises herbes les plus envahissantes et problématiques, l'Amaranthus, et il a été conçu des cPEPs pour cibler les protéines correspondantes (respectivement SEQ ID NOs : 204, 176, 177 et 196). Un mélange de ces cPEPs a été capable de diminuer la croissance de la plante (Fig. 10i, j).
Les résultats présentés ont démontré la possibilité de moduler l'expression de n'importe quel gène codant par application externe de petits peptides synthétiques, facilitant ainsi l'étude des gènes sans avoir besoin de plantes transgéniques. Cela peut être particulièrement pertinent dans le cas de plantes récalcitrantes à la transformation génétique. Le simple fait d'arroser ou de pulvériser les plantes avec des cPEP permet une réponse biologique conforme à ce qui est connu de la fonction des protéines ciblées, comme la modulation de la croissance des plantes ou l'amélioration de la résistance des plantes à certains pathogènes.
L'agriculture du 21ème siècle est confrontée à plusieurs défis de taille pour nourrir la population mondiale croissante. Dans ce contexte, il est urgent de trouver de nouvelles molécules pour maintenir ou améliorer le rendement des cultures. Jusqu'à présent, aucune alternative crédible aux produits chimiques n'a émergé. L'utilisation de CRISPR en agriculture est prometteuse, notamment pour améliorer la croissance des cultures, mais il est difficile de penser à la lutte contre les mauvaises herbes avec cette stratégie. L'utilisation de petits ARN, malgré son fantastique potentiel, est confrontée à l'insoluble problème de la faible pénétration dans les cellules végétales, conduisant à une faible activité dans les champs, sauf pour le contrôle des insectes. En parallèle, il a été montré ici que les cPEP sont capables de moduler différents traits des plantes, tels que la résistance à la chaleur ou la teneur en chlorophylle, qui sont très difficiles à gérer avec des produits chimiques ou d'autres molécules.
Dans ce contexte, le développement de la technologie des cPEPs ouvre une nouvelle voie en agriculture avec l'utilisation de petits peptides. En parallèle, le mode d'action des cPEP, basé sur la complémentarité de leur séquence avec la protéine ciblée, permettra d'identifier plus facilement les interactions non-spécifique par bio-informatique, ce qui permettra de cibler une seule espèce, une famille ou toutes les plantes.
Enfin, les peptides étant de courts polymères d'acides aminés, ils sont susceptibles d'être rapidement dégradés par le microbiote du sol, contrairement aux produits chimiques polluants. Par ailleurs, la pénétration des peptides dans les cellules animales semble difficile sans la présence de peptides pénétrant dans les cellules ce qui laisse penser que les cPEP n'auront pas d'activité biologique chez l'animal et l'homme, hormis une éventuelle toxicité intrinsèque.
Claims (10)
- Procédé de préparation et de détermination d’un cPEP, ledit cPEP :
- ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés ;
- étant capable de moduler l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale ; et
- n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine,
a. une étape de détermination de la séquence d’acides nucléiques de l’ARN messager (ARNm) codant ladite protéine ;
b. une étape de détermination au sein de cet ARNm de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale et qui correspond au cadre ouvert de lecture codant ladite protéine ;
c. une étape de détermination au sein de cette séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale d’un fragment de celle-ci,
ledit fragment ayant une taille de 3nnucléotides,nétant compris de 4 à 70, en particuliernétant compris de 4 à 41, et ledit fragment ayant une taille inférieure à celle de la séquence d’acides nucléiques naturellement traduite dans ladite cellule végétale ;
d. une étape de production du peptide codé par ledit fragment ; et
e. une étape de comparaison :- entre l’accumulation de ladite protéine dans une cellule végétale en présence dudit peptide et l’accumulation de ladite protéine dans une cellule végétale de même type en absence dudit peptide ; et/ou
- entre le phénotype d’une plante en présence dudit peptide et le phénotype d’une plante de même type en absence dudit peptide,
- une différence de la quantité de ladite protéine en présence dudit peptide par rapport à la quantité de ladite protéine en absence dudit peptide ; et/ou
- une différence du phénotype en présence dudit peptide par rapport au phénotype en absence dudit peptide,
- cPEP, de 4 à 70 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm,
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine. - Acide nucléique codant un cPEP selon la revendication 2.
- Composition comprenant un cPEP en tant que substance active, ledit cPEP :
- ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm ;
- étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine ; et
- étant notamment à une concentration comprise de 5 µM à 500 µM ou de 30 µM à 70 µM, ou étant notamment à une concentration de 50 µM.
- Composition selon la revendication 4, ladite composition étant une composition phytopharmaceutique, une composition herbicide ou une composition d’enrobage,
en particulier ladite composition d’enrobage comprenant en outre au moins un agent de fixation. - Semence enrobée comprenant une graine de plante, ladite graine de plante étant enrobée par une composition d’enrobage selon la revendication 5.
- Utilisation d’un cPEP en tant qu’agent phytosanitaire pour moduler l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale,
ledit cPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture de ladite protéine codée par ledit ARNm,
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine. - Procédé de modulation de l’accumulation d’une protéine dans une cellule végétale comprenant une étape d’introduction :
- d’un cPEP ; ou
- d’un acide nucléique codant ledit cPEP et les moyens de l’exprimer,
ledit cPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture de ladite protéine codée par ledit ARNm,
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine. - Procédé selon la revendication 8, ledit procédé permettant :
- de favoriser le développement d’une plante ; ou
- de ralentir ou d’empêcher le développement d’une plante.
- Plante transgénique comprenant un acide nucléique codant un cPEP et les moyens de l’exprimer,
ledit cPEP ayant une taille comprise de 4 à 70 acides aminés, en particulier de 4 à 41 acides aminés, dont la séquence d’acides aminés correspond à la traductionviale code génétique d’un fragment d’une séquence d’acides nucléiques naturellement traduite sur un ARNm dans une cellule végétale laquelle correspond au cadre ouvert de lecture d’une protéine codée par ledit ARNm,
ledit cPEP étant capable de moduler l’accumulation de ladite protéine dans la cellule végétale et n’étant pas capable de moduler l’accumulation de l’ARNm codant ladite protéine.
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