FR3021502A1 - Utilisation de micropeptides pour favoriser la croissance des plantes - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne l'utilisation de micropeptides (peptides codés par des microARNs ou « miPEPs ») pour favoriser la croissance des plantes.
Description
1 UTILISATION DE MICROPEPTIDES POUR FAVORISER LA CROISSANCE DES PLANTES La présente invention concerne l'utilisation de micropeptides (peptides codés par des 5 microARNs ou « miPEPs ») pour favoriser la croissance des plantes. Les microARNs (miRs) sont des petits ARNs non codants, d'environ 21 nucléotides après maturation, qui contrôlent l'expression de gènes cibles au niveau post-transcriptionnel, en dégradant l'ARNm cible ou en inhibant sa traduction. 10 Les miRs sont notamment rencontrés chez les plantes. Les gènes ciblés par les miRs sont souvent des gènes clés de processus développementaux. Par exemple, les miR164 ciblent des gènes de la famille CUC (Blein et al., Science, 322(5909):1835-9, 2008). La famille des miR164 est ainsi impliquée dans le développement des méristèmes et notamment dans 15 le développement de la feuille (Laufs et al., Development, 131(17):4311-22, 2004; Nikovics et al., Plant Cell, 18(11):2929-45, 2006). Les miRs pourraient donc, par leur action de régulation de l'expression de certains gènes, représenter une cible d'intérêt pour contrôler la croissance des plantes, et en particulier 20 pour en favoriser la croissance. La régulation de l'expression des miRs est très peu connue, mais il a été démontré que celle-ci fait intervenir, à l'instar de la plupart des gènes codants, une ARN polymerase II : cette enzyme produit un transcrit primaire, appelé « pri-miR », qui est ensuite maturé par 25 un complexe protéique contenant notamment les enzymes type Dicer. Cette maturation conduit tout d'abord à la formation d'un précurseur de miR appelé «pre-miR », ayant une structure secondaire en forme tige-boucle contenant le miR et sa séquence miR* complémentaire. Puis le précurseur est maturé, ce qui conduit à la formation d'un ARN double brin plus court contenant le miR et le miR*. Le miR est ensuite pris en charge par 30 le complexe RISC qui clive l'ARNm du gène cible ou bien inhibe sa traduction. Jusqu'à présent, les miRs, et par extension leur transcrit primaire, ont toujours été considérés, de par leur mode d'action particulier, comme des ARNs régulateurs non 3021502 2 codants et ne produisant aucun peptide. Or, les Inventeurs ont récemment mis en évidence dans la demande de brevet FR 13/60727 l'existence de micropeptides (ou « miPEPs », microRNA encoded PEPtides) capables de moduler l'accumulation des miRs.
Dans ce contexte, la présente invention a pour but de proposer de nouveaux outils efficaces et écologiques pour favoriser la croissance des plantes. L'un des aspects de l'invention est de proposer une nouvelle utilisation des miPEPs pour favoriser la croissance des plantes.
Un autre aspect de l'invention concerne également un nouveau procédé de culture de plantes. Un autre aspect de l'invention est de proposer une composition de miPEPs permettant de favoriser la croissance des plantes. L'un des autres aspects de l'invention est également de proposer une plante transgénique et 15 des parties de plantes transgéniques, et leur procédé de production. L'un des autres aspects de l'invention est également de proposer des organes, cellules et semences de plantes transgéniques. L'un des autres aspects de l'invention est de proposer des plantes modifiées écologiquement. 20 L'invention concerne donc l'utilisation d'un peptide pour favoriser la croissance d'une plante, ledit peptide étant introduit dans la plante, ledit peptide ayant une séquence d'acides aminés comprenant ou consistant en une séquence identique à celle d'un miPEP naturellement présent dans ladite plante, 25 ledit miPEP naturellement présent dans ladite plante étant un peptide de 4 à 100 acides aminés dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans ladite plante, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les 30 racines, la tige, les feuilles ou les fleurs. De manière surprenante et inattendue, les Inventeurs ont constaté que l'utilisation de peptides dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle de 3021502 3 miPEPs codés sur les transcrits primaires de miRs, permet de favoriser la croissance des plantes. Dans l'invention, les termes « microARN », « microARN non codant » et « miR » sont 5 équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils définissent des petites molécules d'ARN d'environ 21 nucléotides, qui ne sont pas traduites et ne conduisent pas à un peptide ou une protéine. Cependant, sous cette forme mature, les miRs assurent une fonction de régulation de certains gènes via des mécanismes post-transcriptionnels, comme par exemple par l'intermédiaire du complexe RISC. 10 Le « transcrit primaire de miR» (ou « pri-miR ») correspond lui à la molécule d'ARN directement obtenue à partir de la transcription de la molécule d'ADN. Généralement, ce transcrit primaire subit une ou plusieurs modifications post-transcriptionnelles, qui entraînent par exemple une structure particulière de l'ARN ou un clivage de certaines parties de l'ARN par des phénomènes d'épissage, et qui conduisent à la forme précurseur du miR ou (« pre-miR »), puis à la forme mature du miR. Les termes « micropeptides » et « miPEPs » (microRNA encoded PEPtides) sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils définissent un peptide qui est codé par un cadre ouvert de lecture présent sur le transcrit primaire d'un miR, et qui est capable de moduler l'accumulation dudit miR. Les miPEPs au sens de la présente invention ne doivent être entendus comme étant nécessairement des peptides de petite taille, dans la mesure où « micro » ne correspond pas à la taille du peptide.
Comme indiqué dans la demande de brevet FR 13/60727, dont le contenu doit être considéré comme faisant partie de la présente demande, les miPEPs sont des peptides : - de 4 à 100 acides aminés, de préférence de 4 à 60 acides aminés, notamment de 4 à 59 acides aminés, - codés par un cadre ouvert de lecture contenu dans le transcrit primaire d'un miR, de 30 préférence dans la partie 5' du transcrit primaire dudit miR, et - capables de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote. 3021502 4 Les termes « cadre ouvert de lecture » ou « ORF » (open reading frame) sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils correspondent à une séquence de nucléotides dans une molécule d'ADN ou d'ARN pouvant potentiellement coder un peptide ou une protéine: ledit cadre ouvert de lecture débute par un codon start (le codon start codant 5 généralement une méthionine), suivi d'une série de codons (chaque codon codant un acide aminé), et se termine par un codon stop (le codon stop n'étant pas traduit). Dans l'invention, les ORFs peuvent être dénommés de manière spécifique « miORFs » lorsque ceux-ci sont présents sur les transcrits primaires de miR. 10 Les miORFs tels que définis dans l'invention peuvent avoir une taille de 15 à 303 nucléotides. Un acide aminé étant codé par un codon de 3 nucléotides, les miORFs de 15 à 303 nucléotides codent des miPEPS de 4 à 100 acides aminés. En particulier, les miORFs ont une taille de : 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 47, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 15 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300 ou 303 nucléotides, et codent respectivement des miPEPs ayant une taille de : 20 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 acides aminés. 25 Un miPEP peut également avoir une taille de 3 acides aminés. Compte tenu de la dégénérescence du code génétique, un même miPEP peut être codé par plusieurs séquences nucléotidiques. De telles séquences nucléotidiques, différentes entre 30 elles d'au moins un nucléotide mais codant un même peptide, sont appelées « séquences dégénérées ». 3021502 5 Dans l'invention, le terme « plante » fait référence de manière générale à tout ou partie d'une plante quel que soit son stade de développement (y compris la plante sous forme de graine ou de jeune pousse), à un ou plusieurs organes de la plante (comme par exemple les feuilles, les racines, la tige, les fleurs), à une ou plusieurs cellules de la plante, ou encore à 5 un amas de cellules de la plante. Dans l'invention, le terme « croissance » fait référence au développement de tout ou partie d'une plante au cours du temps. La croissance de la plante peut ainsi être déterminée et quantifiée par le suivi de paramètres évolutifs observables pour certaines parties, cellules ou organes de la plante, tels que les feuilles, les racines, les tiges ou encore les fleurs. 10 De manière non limitative, les paramètres permettant de déterminer et quantifier la croissance d'une plante peuvent être notamment : - la taille, la surface, le volume, la masse et le nombre de feuilles, - la taille et le nombre de fleurs, 15 - la taille de la tige (ou de la hampe florale), - la longueur et le nombre de racines, - la précocité de la germination, - la précocité du bourgeonnement, - la précocité de l'induction florale (ou transition florale), 20 - ou encore le nombre de cellules. Par ailleurs, dans l'invention, l'expression «favoriser la croissance de la plante », ou « améliorer la croissance de la plante », indique : - soit une accélération du développement (comme par exemple une taille des feuilles plus 25 importante pour une plante à un instant donné par rapport à une plante de référence), - soit à un accroissement du développement (comme par exemple une taille de feuilles plus importante pour une plante qui ne peut être atteinte par une plante de référence), - soit à une accélération et un accroissement du développement de la plante.
Il est important de noter que l'utilisation selon l'invention possède l'avantage d'être écologique, en comparaison des méthodes chimiques classiquement utilisées dans l'industrie botanique ou dans l'agriculture, car le miPEP est un peptide qui est présent naturellement chez la plante.
3021502 6 L'invention concerne également l'utilisation d'un miPEP introduit par voie exogène dans une plante pour en favoriser la croissance, ledit miPEP introduit par voie exogène étant un peptide comprenant, ou consistant en, une 5 séquence identique à celle d'un miPEP naturellement présent dans ladite plante, lequel miPEP naturellement présent est un peptide de 4 à 100 acides aminés, dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans ladite plante, lequel 10 miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs, la somme de la quantité dudit miPEP introduit par voie exogène et de celle dudit miPEP naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit miPEP naturellement 15 présent. Dans l'invention, l'expression « miPEP introduit par voie exogène » fait référence à un miPEP introduit artificiellement dans la plante, que celui-ci existe ou non naturellement dans la plante.
20 Si le miPEP existe naturellement chez la plante, il s'agit d'un « miPEP d'origine endogène ». Si le miPEP n'existe pas naturellement chez la plante, il s'agit d'un « miPEP d'origine 25 exogène ». Lorsqu'il est introduit dans la plante un « miPEP d'origine exogène », il est alors nécessaire d'introduire également le miR correspondant et son transcrit primaire. L'introduction d'un miPEP par voie exogène dans la plante implique donc une étape 30 technique, laquelle étape n'est pas un phénomène naturel et ne correspond ni à un croisement, ni à une sélection.
3021502 7 Le miPEP introduit par voie exogène peut être soit un peptide produit hors de la plante (comme par exemple un peptide isolé et/ou purifié, un peptide synthétique ou un peptide recombinant), soit un peptide produit dans la plante suite à l'introduction non naturelle d'un acide nucléique codant ledit miPEP dans ladite plante.
5 La plante dans laquelle le miPEP n'a pas été introduit possède une quantité basale dudit miPEP, qui correspond à celle dudit miPEP naturellement présent. L'utilisation d'un miPEP comprenant, ou consistant en, une séquence identique à celle dudit miPEP entraîne une augmentation de la quantité totale de miPEP, ce qui module l'accumulation du miR 10 dont le transcrit primaire contient la séquence codant ledit miPEP. Par ailleurs, le miPEP introduit se retrouve dans la plante et son introduction n'a pas d'impact sur sa stabilité.
15 Dans l'invention, par « accumulation », on entend la production d'une molécule, telle qu'un miR ou un miPEP, dans la cellule. Ainsi, la « modulation de l'accumulation » d'une molécule dans une cellule correspond à une modification de la quantité de cette molécule dans la cellule.
20 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans lequel la modulation de l'accumulation dudit miR est une diminution ou une augmentation de l'accumulation dudit miR, en particulier une augmentation. Une « diminution de l'accumulation du miR» correspond à une baisse de la quantité de 25 ladite molécule dans la cellule. A l'inverse, une « augmentation de l'accumulation du miR» correspond à une hausse de la quantité de ladite molécule dans la cellule. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, 30 dans laquelle ledit gène, impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, est choisi parmi le groupe consistant en : NAC1 (Accession n'AT1G56010.1), NAC4 (Accession n° AT5G07680.1), NAC5 (Accession n° AT5G61430.1), CUC/ (Accession n° AT3G15170.1) et CUC2 (Accession n° 3021502 8 AT5G53950.1) (numéros d'accession selon la banque de données The Arabidopsis Information Resource « TAIR »). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, 5 dans laquelle ledit miARN est le miR164a, en particulier, dans laquelle ledit miR164a possède une séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 1. En particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit ledit miR164a possède une séquence nucléotidique présentant au moins 80% 10 d'identité, de préférence au moins 90 % d'identité, avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 1. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est le miPEP164a, en particulier, dans laquelle ledit miPEP164a 15 possède une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO : 2. En particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit ledit miPEP164a possède une d'acides aminés présentant au moins 80% d'identité, de préférence au moins 90 % d'identité, avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2.
20 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite plante est une plante crucifère telle qu' Arabidopsis thaliana, une plante légumineuse telle que Glycine max (soja), Medicago truncatula et Medicago sativa (luzerne) ou une plante solanacée telle que Nicotiana benthamiana (tabac), Solanum 25 tuberosum (pomme de terre), Solanum lycopersicum (tomate) ou Solanum melongena (aubergine). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite plante est une plante crucifère.
30 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite plante est Arabidopsis thaliana.
3021502 9 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, pour favoriser la croissance d'une plante Arabidopsis thaliana, dans laquelle le miPEP164a est introduit par voie exogène dans ladite plante Arabidopsis thaliana, ledit miPEP164a étant également naturellement présent dans ladite plante Arabidopsis thaliana, 5 ledit miPEP164a introduit par voie exogène étant un peptide dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle dudit miPEP164a naturellement présent, ladite séquence du miPEP164a naturellement présent étant codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire du miR164a, lequel miR164a régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices 10 d'Arabidopsis thaliana, la somme de la quantité dudit miPEP164a introduit par voie exogène et de celle dudit miPEP164a naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit miPEP164a naturellement présent chez ladite plante Arabidopsis thaliana.
15 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est introduit par voie externe dans la plante, de préférence par arrosage, par pulvérisation ou par l'ajout d'un engrais, d'un terreau, d'un substrat de culture ou d'un support inerte.
20 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est introduit par arrosage et par pulvérisation. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est introduit par arrosage et par l'ajout d'un engrais.
25 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est introduit par pulvérisation et par l'ajout d'un engrais. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, 30 dans laquelle ledit miPEP est introduit, par arrosage, par pulvérisation et par l'ajout d'un engrais.
3021502 10 Les Inventeurs ont en effet constaté de manière inattendue qu'il est possible d'appliquer directement une composition comprenant un miPEP sur la plante pour moduler l'accumulation du miR correspondant dans la plante, ce qui indique que le miPEP est capté par la plante.
5 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle la plante est traitée avec une composition comprenant 10-9 M à 10-4 M dudit miPEP, notamment 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M ou 10-4 M dudit miPEP.
10 De préférence, les compositions ont une concentration de 10-8 M à 10-5 M pour une application par arrosage ou par pulvérisation sur la plante. De manière complémentaire, des compositions plus ou moins concentrées peuvent être envisagées pour traiter la plante avec le miPEP. Par exemple, et de manière non limitative, 15 des compositions plus concentrées comprenant 10-1 M à 10-3 M, notamment 10-2 M de miPEP, peuvent être utilisées dans le cas où le miPEP introduit par voie exogène est administré à la plante par épandage. Les propriétés de solubilité des miPEPs sont déterminées notamment par leur composition 20 en acides aminés. Les miPEPs hydrophiles peuvent être solubilisés et conditionnés dans des solutions aqueuses, telles que l'eau. Les miPEPs hydrophobes peuvent être solubilisés et conditionnés dans des solvants, tels que les solvants organiques. Pour un traitement des plantes par les miPEPs, les solvants organiques sont des solvants 25 non toxiques pour les plantes en faibles quantités, c'est-à-dire qu'ils n'ont pas d'effet délétères sur le développement de la plante. De manière non limitative, les solvants organiques peuvent être choisis parmi l'acétonitrile et l'acide acétique. Les miPEPs peuvent également être solubilisés et conditionnés dans des mélanges de 30 solvants organiques, comme par exemple un mélange d' acétonitrile et d'acide acétique. En particulier, les miPEPs peuvent être solubilisés dans une solution comprenant 50 % d' acétonitrile, 10% d'acide acétique et 40% d'eau (volume/volume/volume).
3021502 11 En particulier, le miPEP164a est solubilisé dans l'eau. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est introduit dans la plante par le biais d'un acide nucléique 5 codant ledit miPEP, ledit acide nucléique étant introduit dans la plante. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle la taille de la tige est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la taille de la tige d'une plante identique et de même âge dans 10 laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la taille de la tige d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle le nombre de feuilles est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit 15 ledit miPEP par rapport au nombre de feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, 20 dans laquelle la taille des feuilles est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la taille des feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la taille des feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
25 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle le nombre de racines est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
30 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle la longueur des racines est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la longueur des racines d'une plante identique et de 3021502 12 même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la longueur des racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
5 L'augmentation des paramètres permettant de déterminer et quantifier la croissance chez la plante dans laquelle a été introduit le miPEP (tels que la taille de la tige, le nombre et la taille des feuilles, ou encore le nombre et la longueur des racines) est de préférence mis en évidence par comparaison avec une plante identique (c'est-à-dire une plante de la même espèce et/ou variété), de même âge et cultivée dans les mêmes conditions mais dans 10 laquelle aucun miPEP n'a été introduit. L'invention concerne également l'utilisation d'un miPEP introduit par voie exogène dans une plante pour en favoriser la croissance, ledit miPEP étant codé par le transcrit primaire, introduit artificiellement dans la plante, 15 d'un miR, ledit transcrit primaire, ledit miR et ledit miPEP étant absents naturellement chez la plante, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans ladite plante, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les 20 fleurs. Dans un mode de réalisation particulier, ledit transcrit primaire du miR, le miR et ledit miPEP sont introduits dans la plante à l'aide d'un vecteur.
25 Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé pour favoriser la croissance d'une plante, comprenant une étape d'introduction d'un miPEP dans une plante par voie exogène, ledit miPEP étant également présent naturellement dans ladite plante, ledit miPEP introduit par voie exogène étant un peptide de 4 à 100 acides aminés dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle dudit miPEP 30 naturellement présent, laquelle séquence du miPEP naturellement présent est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR, lequel miR régule l'expression d'au moins 3021502 13 un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs, la somme de la quantité dudit miPEP introduit par voie exogène et de celle dudit miPEP naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit miPEP naturellement 5 présent. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit gène, impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, est choisi parmi le groupe consistant en : NAC1 (Accession n'AT1G56010.1), 10 NAC4 (Accession n° AT5G07680.1), NAC5 (Accession n° AT5G61430.1), CUC/ (Accession n° AT3G15170.1) et CUC2 (Accession n° AT5G53950.1). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miARN est le miR164a, en particulier, dans lequel ledit miR164a possède une 15 séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 1. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est le miPEP164a, en particulier, dans lequel ledit miPEP164a possède une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO : 2.
20 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante est une plante crucifère telle qu' Arabidopsis thaliana, une plante légumineuse telle que Glycine max (soja), Medicago truncatula et Medicago sativa (luzerne) ou une plante solanacée telle que Nicotiana benthamiana (tabac), Solanum tuberosum (pomme de terre), Solanum lycopersicum (tomate) ou Solanum melongena 25 (aubergine). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante est une plante crucifère.
30 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante est Arabidopsis thaliana.
3021502 14 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, pour favoriser la croissance d'une plante Arabidopsis thaliana, dans lequel le miPEP164a est introduit par voie exogène dans ladite plante Arabidopsis thaliana, ledit miPEP164a étant également naturellement présent dans ladite plante Arabidopsis thaliana, 5 ledit miPEP164a introduit par voie exogène étant un peptide comprenant ou consistant en une séquence identique à celle dudit miPEP164a naturellement présent, lequel miPEP164a naturellement présent est un peptide de 4 à 100 acides aminés dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire du miR164a, ledit miPEP164a étant capable d'augmenter l'accumulation dudit miR164a, lequel 10 miR164a régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices d' Arabidopsis thaliana, la somme de la quantité dudit miPEP164a introduit par voie exogène et de celle dudit miPEP164a naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit miPEP164a naturellement présent.
15 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est introduit par voie externe dans la plante, de préférence par arrosage, par pulvérisation ou par l'ajout d'un engrais, d'un terreau, d'un substrat de culture ou d'un support inerte.
20 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est administré à la plante sous la forme d'une composition comprenant 10-9 M à 10-4 M dudit miPEP, en particulier 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 ou 10-4 M dudit miPEP.
25 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est introduit dans la plante par le biais d'un acide nucléique codant ledit miPEP, ledit acide nucléique étant introduit dans la plante.
30 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans laquelle la taille de la tige est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la taille de la tige d'une plante identique et de même âge dans laquelle 3021502 15 aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la taille de la tige d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans 5 laquelle le nombre de feuilles est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
10 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans laquelle la taille des feuilles est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la taille des feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la taille des feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
15 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans laquelle le nombre de racines est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de racines d'une 20 plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans laquelle la longueur des racines est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la longueur des racines d'une plante identique et de même âge 25 dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la longueur des racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit. Dans un autre aspect, l'invention concerne une plante dans laquelle a été introduit un miPEP selon l'utilisation ou le procédé pour favoriser la croissance d'une plante décrits ci-30 dessus. Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique comprenant: 3021502 16 a) une étape d'introduction d'un acide nucléique codant un miPEP de 4 à 100 acides aminés dans une plante, ou dans au moins une cellule de ladite plante, dans des conditions permettant l'expression dudit miPEP, ledit miPEP étant également naturellement présent dans ladite plante, ledit miPEP 5 naturellement présent étant un peptide dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans la plante, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs, et 10 b) une étape de culture de la plante, ou d'au moins une cellule de ladite plante, obtenues à l'étape a) dans des conditions permettant l'obtention d'une plante transgénique. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante transgénique obtenue à 15 l'étape b) a une croissance améliorée par rapport à une plante identique dans laquelle ledit acide nucléique n'a pas été introduit. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel l'étape a) est réalisée à l'aide d'un 20 vecteur contenant ledit acide nucléique, de préférence un plasmide. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel l'expression dudit acide nucléique de l'étape a) est placée sous le contrôle d'un promoteur fort, de préférence un promoteur fort 25 constitutif tel que le promoteur 35S. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit gène, impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, est choisi parmi le 30 groupe consistant en : NAC1 (Accession n'AT1G56010.1), NAC4 (Accession n° AT5G07680.1), NAC5 (Accession n° AT5G61430.1), CUC/ (Accession n° AT3G15170.1) et CUC2 (Accession n° AT5G53950.1).
3021502 17 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miARN est le miR164a, en particulier, dans lequel ledit miR164a possède une séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 1. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est le miPEP164a, en particulier, dans lequel ledit miPEP164a possède une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO : 2. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit acide nucléique introduit à l'étape a) comprend une séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 3. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante 15 transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante transgénique est une plante crucifère telle qu' Arabidopsis thaliana, une plante légumineuse telle que Glycine max (soja), Medicago truncatula et Medicago sativa (luzerne) ou une plante solanacée telle que Nicotiana benthamiana (tabac), Solanum tuberosum (pomme de terre), Solanum lycopersicum (tomate) ou Solanum melongena (aubergine).
20 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante transgénique est une plante crucifère.
25 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante transgénique est Arabidopsis thaliana. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante 30 transgénique tel que défini ci-dessus, comprenant : a) une étape d'introduction d'un acide nucléique contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3, codant le miPEP164a consistant en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, dans une plante Arabidopsis thaliana, ou dans au moins une cellule de 5 10 3021502 18 ladite plante Arabidopsis thaliana, dans des conditions permettant l'expression du miPEP164a, ledit miPEP164a étant également naturellement présent dans ladite plante Arabidopsis thaliana, ledit miPEP naturellement présent étant un peptide dont la séquence est codée par 5 un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire du miR164a, ledit miPEP164a étant capable de moduler l'accumulation dudit miR164, lequel miR164a régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices d' Arabidopsis thaliana, et b) une étape de culture de la plante, ou d'au moins une cellule de ladite plante, obtenues à 10 l'étape a) dans des conditions permettant l'obtention d'une plante Arabidopsis thaliana transgénique. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est introduit dans la plante par le biais d'un acide 15 nucléique codant ledit miPEP, ledit acide nucléique étant introduit dans la plante. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans laquelle la taille de la tige est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la taille de la tige d'une plante 20 identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la taille de la tige d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante 25 transgénique tel que défini ci-dessus, dans laquelle le nombre de feuilles est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
30 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans laquelle la taille des feuilles est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la taille des feuilles d'une 3021502 19 plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la taille des feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
5 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans laquelle le nombre de racines est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit 10 miPEP n'a pas été introduit. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans laquelle la longueur des racines est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la longueur des 15 racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la longueur des racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit. Dans un aspect, l'invention concerne également une plante transgénique telle qu'obtenue 20 par le procédé de production tel que défini ci-dessus. Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition, en particulier une composition phytosanitaire, comprenant le miPEP164a en tant que substance active, ledit miPEP164a consistant de préférence en SEQ ID NO : 1.
25 Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP164a est à une concentration de 10-9M à 10-4M, en particulier 10- 9, 10-8, 107, 106, 10-5 ou 104 M.
30 De préférence, une composition telle que définie ci-dessus a une concentration de 10-8 M à 10-5 M pour une application par arrosage ou par pulvérisation sur la plante. De manière complémentaire, des compositions plus ou moins concentrées peuvent être envisagées pour traiter la plante avec le miPEP. Par exemple, et de manière non limitative, 3021502 20 des compositions plus concentrées comprenant 10-1 M à 10-3 M, notamment 10-2 M de miPEP, peuvent être utilisées dans le cas où le miPEP introduit par voie exogène est administré à la plante par épandage.
5 Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, comprenant de plus un excipient, un diluant ou un solvant. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus formulée de façon à former un enrobé.
10 Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant en combinaison une quantité de semences d'une plante et une quantité d'un peptide dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle d'un miPEP naturellement présent chez ladite plante.
15 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition comprenant en combinaison une quantité de semences d'une plante crucifère, notamment A. thaliana, et une quantité d'un peptide dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle du miPEP164a.
20 Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, comprenant de plus un excipient, un diluant ou un solvant. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus formulée de façon à former une semence enrobée.
25 L'enrobage peut être réalisé selon les procédés classiquement utilisées dans l'industrie agroalimentaire et peut être obtenu en utilisant un matériau apte à se désagréger dans un solvant ou dans la terre, tel qu'un liant ou de l'argile.
30 Selon l'invention, l'enrobage peut être utilisé pour par exemple conférer des propriétés particulières à une composition de miPEP, ou encore à une composition de semences en combinaison avec un miPEP.
3021502 21 Dans un autre aspect, l'invention concerne un protocole de production d'un peptide recombinant, dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle d'un miPEP tel que défini ci-dessus, comprenant une étape de transformation d'un organisme avec un vecteur d'expression codant ledit peptide recombinant.
5 Dans un mode de réalisation, ledit organisme est choisi parmi le groupe comprenant les bactéries, les levures, les champignons (autre que levures), les cellules animales, les plantes et les animaux.
10 Dans un mode de réalisation, ledit organisme est Escherichia En particulier, l'invention concerne un protocole de production d'un peptide recombinant tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : - l'acide nucléique codant ledit peptide recombinant est lié à un acide nucléique 15 codant une étiquette, telle que la GST, - le vecteur d'expression contenant ledit acide nucléique codant ledit peptide recombinant est introduit dans la bactérie E. coh, - la bactérie E. coli contenant le vecteur d'expression est cultivée dans du milieu LB de préférence jusqu'à une DO comprise entre 0.2 et 0.4, 20 - la production du peptide recombinant est induite avec de l'IPTG, de préférence pendant 4 à 5 heures, - les bactéries E. coli sont centrifugées et lysées, - le surnageant est filtré, - ledit peptide recombinant est purifié sur une colonne d'affinité glutathion 25 sepharose, - si nécessaire, cliver la GST avec une protéase. Dans un autre aspect, l'invention concerne un anticorps reconnaissant spécifiquement le miPEP164a, en particulier ledit miPEP164a consistant en SEQ ID NO : 1.
30 Un tel anticorps peut être obtenu à partir d'un procédé connu de l'homme du métier, comme par exemple en injectant ledit miPEP164a à un animal non humain pour déclencher une réaction d'immunisation et la production d'anticorps par ledit animal.
3021502 22 Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé d'immunolocalisation du miPEP164a comprenant une étape de marquage d'un échantillon biologique d'une plante avec un anticorps reconnaissant spécifiquement ledit miPEP164a.
5 Les séquences du miPEP164a, de son cadre ouvert de lecture, du miR164a et des transcrits primaires du miR164a chez Arabidopsis thaliana sont indiquées dans le tableau 1. miR164a uggagaagcagggcacgugca SEQ ID NO : 1 miPEP164a MP SWHGMVLLPYVKHTHAS THTHTHNIYGC ACELVFH SEQ ID NO : 2 miORF164a ATGCCATCATGGCATGGTATGGTTCTTTTGC CTTACGTAAAACACACTCACGCCAGCACAC ACACACACACACATAACATATACGGATGTG CGTGTGAGCTAGTCTTCCATTAA SEQ ID NO : 3 pri-miR164a AGACAAGCCCCCACACTAAAAAAACAGTAA TATGGAATAAAAAAAAGCTTTCAAAACTTA GCAGTTATTAGACAAGGTATTGTTTGGCCCT AGCTAGCGATCGTTTAGCTCTCTTCACTCTC TCACTTTTTTAGTTCAACCCTTCTTTTGCGTG AGATGCCATCATGGCATGGTATGGTTCTTTT GCCTTACGTAAAACACACTCACGCCAGCAC ACACACACACACACATAACATATACGGATG TGCGTGTGAGCTAGTCTTCCATTAATGCAAT CTTTGGGCCTATATATACAAACCTTTCCATA ACCAAAGTTCTCATACTACAAACGCCCCTC ATGTGCTTGGAAATGCGGGTGAGAATCTCC ATGTTGGAGAAGCAGGGCACGTGCAAACCA ACAAACACGAAATCCGTCTCATTTGCTTATT TGCACGTACTTAACTTCTCCAACATGAGCTC TTCACCC SEQ ID NO : 4 Tableau 1.
10 15 3021502 23 5 10 Les pages 24 à 43 correspondent à des extraits de la demande de brevet 15 français n° FR 13/60727 déposée le 31 octobre 2013 pour « Micropeptides et leur utilisation pour moduler l'expression de gènes » 20 25 30 3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 24 L'objet de la demande FR 13 60727 concerne des micropeptides (peptides codés par des microARNs ou « miPEPs ») et leur utilisation pour moduler l'expression de gènes. Les microARNs (miRs) sont des petits ARNs non codants, d'environ 21 nucléotides après 5 maturation, qui contrôlent l'expression de gènes cibles au niveau post-transcriptionnel, en dégradant l'ARNm cible ou en inhibant sa traduction. Les miRs sont rencontrés chez les plantes et les animaux. Les gènes cibles sont souvent des gènes clés de processus développementaux. Ils codent 10 par exemple des facteurs de transcription ou des protéines du protéasome. La régulation de l'expression des miRs est très peu connue, mais on sait notamment que celle-ci fait intervenir, à l'instar de la plupart des gènes codants, une ARN polymerase II : cette enzyme produit un transcrit primaire, appelé « pri-miR », qui est ensuite maturé par 15 un complexe protéique contenant notamment les enzymes type Dicer. Cette maturation conduit tout d'abord à la formation d'un précurseur de miR appelé « pre-miR », ayant une structure secondaire en forme tige-boucle contenant le miR et sa séquence miR * complémentaire. Puis le précurseur est maturé, ce qui conduit à la formation d'un ARN double brin plus court contenant le miR et le miR *. Le miR est ensuite pris en charge par 20 le complexe RISC qui clive l'ARNm du gène cible ou bien inhibe sa traduction. Par ailleurs, il a été montré que la présence d'introns dans le transcrit primaire du microARN augmente l'expression du microARN mature (Schwab et al., EMBO Rep., 14(7): 615-21, 2013). Cependant, du fait de difficultés expérimentales, les transcrits 25 primaires de microARNs, ou pri-miRs, sont très peu étudiés. Environ 50% des gènes eucaryotes possèdent, au sein de leur région 5 'UTR (5' UnTranslated Region) en amont de la séquence codante, de petits cadres ouverts de lecture. Ces petits cadres ouverts de lecture (ou « uORFs » pour upstream ORFs) peuvent 30 jouer un rôle de régulateur de la traduction, principalement en cis, en modulant la fixation et la vitesse des ribosomes sur l'ARNm, mais également en trans selon un mécanisme encore inconnu, par l'intermédiaire de peptides codés par lesdits uORFs (Combien et al., 3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 25 Gene Dev, 22:1549-1559, 2008). Par définition, les uORFS sont présents en amont de gènes codants. Récemment, il a également été découvert de petits ORFs dans de longs ARN non codants 5 intergéniques (lincRNAs) dont la fonction putative, si elle existe, n'est pas connue (Ingolia et al., Cell, 147 (4):789-802, 2011; Guttman & Rinn, Nature, 482(7385):339-46, 2012). Toutefois, aucun exemple n'a encore été rapporté concernant l'existence d'ORFs codant des peptides au sein de microARNs non codants. Jusqu'à présent, les microARNs, et par 10 extension leur transcrit primaire, ont toujours été considérés, de par leur mode d'action particulier, comme des ARNs régulateurs non codants ne produisant aucun peptide. L'un des aspects de l'objet de la demande FR 13 60727 est de proposer des peptides capables de moduler l'expression des microARNs.
15 Un autre aspect de l'objet de la demande FR 13 60727 est de proposer un moyen permettant de moduler l'expression d'un ou plusieurs gènes cibles d'un microARN. L'objet de la demande FR 13 60727 présente l'avantage de permettre un contrôle plus facile et plus efficace de l'expression de gènes ciblés par les microARNs, à l'aide d'un moyen autre que le microARN.
20 L'objet de la demande FR 13 60727 concerne ainsi un procédé de détection et d'identification d'un micropeptide (miPEP) codé par une séquence nucléotidique contenue dans la séquence du transcrit primaire d'un microARN, comprenant : 25 - a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 15 à 303 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit microARN, puis - b) une étape de comparaison entre : - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN, 30 en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit microARN, et 3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 26 - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN, en absence dudit peptide, dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit microARN en présence dudit peptide 5 par rapport à l'accumulation dudit microARN en absence dudit peptide indique l'existence d'un micropeptide codé par ledit cadre ouvert de lecture. Dans une première étape, le procédé de détection et d'identification d'un micropeptide consiste donc à détecter sur le transcrit primaire d'un microARN l'existence d'un cadre 10 ouvert de lecture codant potentiellement un peptide. La deuxième étape permet, quant à elle, de caractériser ledit peptide, c'est-à-dire de déterminer si ledit peptide correspond a un peptide réellement produit dans la cellule, en recherchant un effet dudit peptide sur l'accumulation dudit microARN.
15 Pour mettre en évidence un effet du peptide sur l'accumulation du microARN, une quantité importante de peptide est introduite dans une première cellule exprimant ledit microARN. L'accumulation du microARN dans cette première cellule est ensuite mesurée et comparée avec l'accumulation du microARN dans une deuxième cellule identique à la première, mais 20 ne contenant pas ledit peptide. L'observation d'une variation des quantités de microARN entre les cellules en présence et en absence du peptide indique ainsi (i) qu'il existe un peptide codé sur le transcrit primaire dudit microARN, (ii) que la séquence de ce peptide est codée par le cadre ouvert de lecture 25 identifié sur le transcrit primaire dudit microARN, et (iii) que ledit peptide agit sur l'accumulation dudit microARN. L'objet de la demande FR 13 60727 repose donc sur la double observation inattendue faite par les Inventeurs que d'une part, il existe des cadres ouverts de lecture susceptibles de 30 coder des micropeptides présents sur les transcrits primaires de microARNs, et d'autre part que lesdits micropeptides sont capables de moduler l'accumulation desdits microARNs.
3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 27 Dans la demande FR 13 60727, les termes « microARN », « microARN non codant » et « miR » sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils définissent des petites molécules d'ARN d'environ 21 nucléotides, qui ne sont pas traduites et ne conduisent pas à un peptide ou une protéine.
5 Cependant, sous cette forme mature, les microARNs assurent une fonction de régulation de certains gènes via des mécanismes post-transcriptionnels, comme par exemple par l'intermédiaire du complexe RISC. Le transcrit primaire du microARN ou « pri-miR » correspond lui à la molécule d'ARN 10 directement obtenue à partir de la transcription de la molécule d'ADN Généralement, ce transcrit primaire subit une ou plusieurs modifications post-transcriptionnelles, qui entraînent par exemple une structure particulière de l'ARN ou un clivage de certaines parties de l'ARN par des phénomènes d'épissage, et qui conduisent à la forme précurseur du microARN ou « pre-miR », puis à la forme mature du microARN ou « miR ».
15 Les termes « micropeptides » et « miPEPs » (microRNA encoded PEPtides) sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils définissent un peptide qui est codé par un cadre ouvert de lecture présent sur le transcrit primaire d'un microARN, et qui est capable de moduler l'accumulation dudit microARN. Les micropeptides au sens de la 20 demande FR 13 60727 ne doivent être entendus comme étant nécessairement des peptides de petite taille, dans la mesure où « micro » ne correspond pas à la taille du peptide. Compte tenu de la dégénérescence du code génétique, un même micropeptide peut être codé par plusieurs séquences nucléotidiques. De telles séquences nucléotidiques, 25 différentes entre elles d'au moins un nucléotide mais codant un même peptide, sont appelées « séquences dégénérées ». Les termes « cadre ouvert de lecture » ou « ORF » (open reading rame) sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils correspondent à une séquence de nucléotides 30 dans une molécule d'ADN ou d'ARN pouvant potentiellement coder un peptide ou une protéine: ledit cadre ouvert de lecture débute par un codon start, suivi d'une série de codons, et se termine par un codon stop.
3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 28 Dans la demande FR 13 60727, les ORFs peuvent être dénommés de manière spécifique « miORFs » lorsque ceux-ci sont présents sur les transcrits primaires de microARN. Dans la demande FR 13 60727, par « accumulation », on entend la production d'une 5 molécule, telle qu'un microARN ou un micropeptide, dans la cellule. Ainsi, la «modulation » de l'accumulation d'une molécule dans une cellule correspond à une modification de la quantité de cette molécule présente dans la cellule. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de 10 détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel la modulation de l'accumulation dudit microARN est une diminution ou une augmentation de l'accumulation dudit microARN, en particulier une augmentation. Une « diminution de l'accumulation » correspond à une baisse de la quantité de ladite 15 molécule dans la cellule. A l'inverse, une « augmentation de l'accumulation » correspond à une hausse de la quantité de ladite molécule dans la cellule. Dans un mode de réalisation avantageux, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un 20 procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel la modulation de l'accumulation dudit microARN est une augmentation de l'accumulation dudit microARN. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de 25 détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel la présence dudit peptide dans la cellule résulte : - de l'introduction dans la cellule d'un acide nucléique codant ledit peptide, ou - de l'introduction dans la cellule dudit peptide 30 De manière à caractériser un miPEP, il est nécessaire de disposer d'un modèle cellulaire exprimant un microARN et dans lequel ledit peptide à tester est présent. Pour cela, il est possible d'introduire un peptide dans la cellule, soit en mettant la cellule en contact avec 3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 29 le dit peptide, soit en introduisant dans la cellule un acide nucléique codant ledit peptide, lequel acide nucléique sera alors traduit en peptide à l'intérieur de la cellule. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de 5 détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel le dit cadre ouvert de lecture de l'étape a) est contenu dans la partie 5' ou 3' dudit transcrit primaire du microARN, de préférence dans la partie 5'. Les parties 5' ou 3' du transcrit primaire du microARN correspondent aux parties 10 terminales de la molécule de l'ARN qui sont clivées au cours de la maturation du microARN. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit 15 microARN est présent dans une cellule végétale sauvage. Dans la demande FR 13 60727, une cellule végétale sauvage correspond à une cellule végétale qui n'a pas été modifiée génétiquement par l'homme.
20 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite cellule eucaryote déterminée, et ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b, sont des cellules végétales, de préférence des cellules de Medicago truncatula ou d'Arabidopsis thaliana.
25 Dans le procédé de détection et d'identification d'un micropeptide tel que défini ci-dessus, après avoir identifié un ORF susceptible de coder un peptide sur le transcrit primaire d'un microARN, il est nécessaire de disposer d'un modèle cellulaire possédant ledit microARN et ledit peptide, pour pouvoir démontrer un effet éventuel du peptide sur ledit microARN.
30 Deux options sont donc envisageables : - le modèle cellulaire dans lequel a été identifié le miORF et celui dans lequel est mis en évidence l'effet du peptide sur le miR sont identiques, ou 3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 30 - le modèle cellulaire dans lequel a été identifié le miORF et celui dans lequel est mis en évidence l'effet du peptide sur le miR sont différents. Dans la première option, le modèle cellulaire utilisé pour observer un effet du peptide est 5 le même que celui dans lequel le transcrit primaire dudit microARN a été isolé. Dans ce modèle cellulaire, les cellules eucaryotes déterminées contiennent naturellement ledit microARN et seul le peptide à tester doit être introduit dans ces cellules. Dans ce contexte, ledit microARN est qualifié « d'origine endogène » car celui-ci existe naturellement dans les cellules. Néanmoins, dans une cellule, d'autres copies d'un microARN d'origine 10 endogène peuvent être ajoutées, comme par exemple en introduisant dans la cellule un vecteur codant ledit microARN d'origine endogène. Dans la deuxième option, le modèle cellulaire utilisé pour observer un effet du peptide est différent de celui dans lequel le transcrit primaire dudit microARN a été isolé. Dans ce 15 modèle cellulaire, les cellules eucaryotes déterminées ne contiennent ni le microARN, ni le peptide à tester. Ces deux éléments doivent donc être introduits dans ces cellules. Dans ce contexte, ledit microARN est qualifié « d'origine exogène » car celui-ci n'existe pas naturellement dans les cellules.
20 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit microARN est d'origine endogène dans ladite cellule eucaryote et dans ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b).
25 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus dans lequel ledit microARN est d'origine exogène dans ladite cellule eucaryote et dans ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b), lesdites cellules eucaryotes contenant un vecteur permettant l'expression dudit microARN.
30 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel 3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 31 l'accumulation dudit microARN est déterminée en mettant en oeuvre une RT-PCR quantitative ou un Northern blot.
5 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel l'accumulation dudit microARN est déterminée en mettant en oeuvre une puce à ADN ou à ARN.
10 L'accumulation dudit microARN peut être déterminée à l'aide des techniques de biologie moléculaire permettant le dosage de molécules d'acides nucléiques spécifiques.
15 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne également un procédé de détection et d'identification d'un microARN dont la séquence du transcrit primaire contient une séquence nucléotidique codant un miPEP, comprenant : a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 15 à 303 nucléotides contenu 20 dans la séquence du transcrit primaire dudit microARN, puis - b) une étape de comparaison entre : - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN, en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou 25 dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit microARN, et - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote, de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN, 30 en absence dudit peptide, dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit microARN en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit microARN en absence dudit peptide indique l'existence 3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 32 d'un microARN dont le transcrit primaire contient une séquence nucléotidique codant un micropeptide. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de 5 détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel la modulation de l'accumulation dudit microARN est une diminution ou une augmentation de l'accumulation dudit microARN, en particulier une augmentation.
10 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel la présence dudit peptide dans la cellule résulte : - de l'introduction dans la cellule d'un acide nucléique codant ledit peptide, ou - de l'introduction dans la cellule de ledit peptide.
15 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel le dit cadre ouvert de lecture de l'étape a) est contenu dans la partie 5' ou 3' dudit transcrit 20 primaire du microARN, de préférence dans la partie 5'. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit 25 microARN est présent dans une cellule végétale sauvage. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite 30 cellule eucaryote, et ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b) sont des cellules végétales, de préférence des cellules de Medicago truncatula.
3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 33 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit microARN est d'origine endogène dans ladite cellule eucaryote et dans ladite cellule 5 eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b). Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus dans lequel ledit 10 microARN est d'origine exogène dans ladite cellule eucaryote et dans ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b), lesdites cellules eucaryotes contenant un vecteur permettant l'expression dudit microARN.
15 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel l'accumulation dudit microARN est déterminée en mettant en oeuvre une RT-PCR quantitative ou un Northern blot.
20 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel l'accumulation dudit microARN est déterminée en mettant en oeuvre une puce à ADN ou à ARN.
25 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un miPEP tel qu'obtenu par la mise en oeuvre du procédé tel que défini ci-dessus.
30 Un autre aspect de l'objet de la demande FR 13 60727 concerne également un miPEP de 4 à 100 acides aminés, de préférence de 4 à 40 acides aminés, codé par une séquence 3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 34 nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote.
5 Par ailleurs, il convient de noter que plusieurs miORFS peuvent être identifiés sur le transcrit primaire d'un microARN, indiquant qu'un transcrit primaire de microARN peut potentiellement coder plusieurs miPEPs. 10 11 convient également de noter que l'effet d'un miPEP est généralement spécifique d'un seul microARN, à savoir celui résultant du transcrit primaire codant ledit miPEP. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un miPEP tel 15 que défini ci-dessus, ladite séquence nucléotidique étant contenue dans la partie 5' ou 3' dudit transcrit primaire d'un microARN, de préférence dans la partie 5'. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un miPEP tel que défini ci-dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant au premier cadre ouvert 20 de lecture présent sur ledit transcrit primaire d'un microARN. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un miPEP tel que défini ci-dessus, ledit miPEP possédant un point isoélectrique basique, de préférence 25 supérieur à 8. Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne une molécule d'acide nucléique codant un miPEP tel que défini ci-dessus.
30 Dans autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique tel que définie ci-dessus.
3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne également l'utilisation d'au moins : 5 - un miPEP tel que défini ci-dessus, - un acide nucléique codant ledit miPEP, ou un vecteur contenant ledit acide nucléique, pour moduler l'expression d'au moins un gène dans une cellule eucaryote déterminée, ladite cellule eucaryote déterminée étant capable d'exprimer un microARN, dont le 10 transcrit primaire contient au moins une séquence nucléotidique codant ledit au moins un miPEP et dont l'accumulation est modulée par ledit au moins un miPEP, l'expression dudit au moins un gène étant régulée par ledit microARN.
15 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne également l'utilisation d'au moins : - un miPEP de 4 à 100 acides aminés, de préférence de 4 à 40 acides aminés, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN dans une cellule 20 eucaryote, - un acide nucléique codant ledit miPEP, ou - un vecteur contenant ledit acide nucléique, pour moduler l'expression d'au moins un gène dans une cellule eucaryote déterminée, ladite cellule eucaryote déterminée étant capable d'exprimer un microARN, dont le 25 transcrit primaire contient au moins une séquence nucléotidique codant ledit au moins un miPEP et dont l'accumulation est modulée par ledit au moins un miPEP, l'expression dudit au moins un gène étant régulée par ledit microARN.
30 L'objet de la demande FR 13 60727 repose sur l'observation surprenante faite par les Inventeurs qu'il est possible de moduler l'expression d'un ou plusieurs gènes cibles d'un même microARN en modulant l'accumulation dudit microARN à l'aide d'un miPEP.
3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 36 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite cellule eucaryote déterminée est une cellule végétale.
5 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit microARN et ledit gène sont d'origine endogène dans ladite cellule eucaryote déterminée.
10 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit microARN et ledit gène sont d'origine exogène dans ladite cellule eucaryote déterminée, ladite cellule eucaryote déterminée 15 contenant au moins un vecteur permettant l'expression dudit microARN et dudit gène. Dans la demande FR 13 60727, les expressions « d'origine endogène » et « d'origine exogène » sont utilisées pour distinguer lesdits microARNs et/ou les gènes d'espèces 20 différentes, étant donné la conservation des séquences entre espèces. Ainsi, le terme « d'origine endogène » indique que le microARN et/ou le gène peuvent être présents de manière naturelle dans la cellule en question. De manière artificielle, d'autres copies du microARN et/ou du gène d'origine endogène peuvent néanmoins être ajoutées dans la cellule en question, comme par exemple par clonage.
25 A l'inverse, le terme « d'origine exogène » indique que le microARN et/ou le gène ne sont jamais présents naturellement dans la cellule en question. Il s'agit d'un microARN et/ou d'un gène identifié dans un autre type cellulaire ou dans un organisme d'une autre espèce, ce microARN et/ou ce gène sont donc nécessairement introduits artificiellement dans la cellule en question.
30 3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 37 Dans la demande FR 13 60727, une cellule transformée génétiquement peut donc contenir 2 groupes de microARNs et/ou de gènes potentiellement proches en termes de séquence, l'un d'origine endogène et l'autre d'origine exogène.
5 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par un microARN dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en oeuvre d'une étape d'accumulation d'un miPEP dans ladite cellule 10 eucaryote, ledit miPEP ayant une taille de 4 à 100 acides aminés, de préférence 4 à 20 acides aminés, et une séquence peptidique identique à celle codée par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN régulant l'expression dudit 15 gène, et étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN, dans lequel, l'accumulation dudit miPEP dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit miPEP.
20 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène tel que défini ci-dessus, dans lequel l'accumulation dudit miPEP dans la cellule résulte .- 25 - de l'introduction dans la cellule d'un acide nucléique codant ledit miPEP, ou - de l'introduction dans la cellule dudit miPEP. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de 30 modulation de l'expression d'un gène tel que défini ci-dessus dans lequel ladite cellule eucaryote est une cellule végétale.
3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 38 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène tel que défini ci-dessus dans lequel ledit microARN et ledit gène sont d'origine endogène dans ladite cellule eucaryote.
5 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène tel que défini ci-dessus dans lequel ledit microARN et ledit gène sont d'origine exogène dans ladite cellule eucaryote, ladite cellule eucaryote contenant au moins un vecteur permettant l'expression dudit microARN et dudit gène.
10 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne une cellule eucaryote modifiée contenant un peptide identique à un miPEP tel que défini ci-dessus, lequel peptide est présent dans ladite cellule eucaryote indépendamment de la transcription du transcrit 15 primaire du microARN portant la séquence nucléotidique codant ledit miPEP. Dans la demande FR 13 60727, le terme « cellule eucaryote modifiée » signifie que ladite cellule eucaryote contient un miPEP introduit artificiellement dans la cellule, que ce soit 20 en tant que peptide, ou par l'intermédiaire d'un vecteur codant ledit miPEP. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit microARN est d'origine 25 endogène. Dans un autre mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit microARN est 30 d'origine exogène, ladite cellule eucaryote modifiée contenant un vecteur permettant l'expression dudit microARN.
3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 39 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus, ladite cellule étant une cellule végétale.
5 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne une plante comprenant au moins une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus. Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne une composition 10 comprenant au moins : - un miPEP tel que défini ci-dessus, - un acide nucléique codant ledit miPEP, ou - un vecteur contenant ledit acide nucléique.
15 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne une composition pesticide comprenant au moins : - un miPEP tel que défini ci-dessus, - un acide nucléique codant ledit miPEP, ou 20 - un vecteur contenant ledit acide nucléique. Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne une composition phytopharmaceutique comprenant au moins : 25 - un miPEP tel que défini ci-dessus, - un acide nucléique codant ledit miPEP, ou - un vecteur contenant ledit acide nucléique.
30 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne une composition élicitrice comprenant au moins : - un miPEP tel que défini ci-dessus, - un acide nucléique codant ledit miPEP, ou 3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 - un vecteur contenant ledit acide nucléique. Par « composition élicitrice », on désigne une composition capable de conférer à la plante 5 une meilleure aptitude à la symbiose ou une meilleure résistance à différents stress, qu'ils soient de nature thermiques, hydriques ou chimiques. A cet effet, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne également des compositions agissant sur la croissance (inhibition de la croissance ou au contraire augmentation de la croissance) et la physiologie (meilleure aptitude à mycorhizer, noduler, meilleure 10 tolérance à différents stress) de la plante. Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne une composition herbicide comprenant au moins : - un miPEP tel que défini ci-dessus, 15 - un acide nucléique codant ledit miPEP, ou - un vecteur contenant ledit acide nucléique. Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne une composition 20 insecticide comprenant au moins : - un miPEP tel que défini ci-dessus, -. un acide nucléique codant ledit miPEP, ou - un vecteur contenant ledit acide nucléique.
25 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, en tant qu'herbicide pour éliminer les plantes ou ralentir leur croissance, de préférence en tant qu'herbicide spécifique d'une espèce ou d'un genre de plantes.
30 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, en tant qu'agent phytopharmaceutique, 3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 41 - pour favoriser la croissance et/ou le développement des plantes, notamment pour la modulation des paramètres physiologiques d'une plante, en particulier la biomasse, la surface foliaire, la floraison, le calibre du fruit, la production et/ou la sélection de semence végétales, en particulier pour contrôler la parthénocarpie ou la 5 monoecie d'une plante, ou pour la modification des paramètres physiologiques de semences végétales, en particulier la germination, l'implantation racinaire et la résistance au stress hydrique, - ou pour prévenir ou traiter les maladies des plantes, en particulier pour favoriser la résistance aux maladies infectieuses.
10 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, pour moduler les paramètres physiologiques d'une plante, en particulier la biomasse, la surface foliaire, ou le calibre du fruit. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, pour l'éclaircissage de vergers afin d'augmenter le calibre des fruits. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, pour la production et/ou la sélection de semences végétales, ladite composition étant utilisée pour contrôler la parthénocarpie ou la monoecie d'une plante.
25 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, ladite composition étant administrée à ladite plante par la voie foliaire ou par la voie racinaire.
15 20 30 3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 42 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, pour la production et/ou la sélection de semences végétales.
5 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite composition est utilisée pour modifier les paramètres physiologiques desdites semences végétales, en particulier l'implantation racinaire, la germination et la résistance au stress hydrique.
10 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite composition est appliquée par enrobage ou pelliculage sur lesdites semences végétales.
15 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, entant que pesticide, pour éliminer les organismes nuisibles des plantes ou susceptibles d'être classés comme tels, notamment en tant qu'insecticide, arachnicide, limacide ou rodonticide.
20 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, en tant qu'insecticide. Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, pour éliminer les insectes ravageurs.
25 Dans un mode de réalisation, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, pour éliminer les espèces animales classées nuisibles ou susceptibles d'être classées comme telles, en particulier les muridae, 30 notamment le rat.
3021502 Extraits de la demande FR 13 60727 43 Dans un autre aspect, l'objet de la demande FR 13 60727 concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite composition est appliquée sur une plante pour la protéger d'insectes ravageurs.
5 3021502 44 Les figures et les exemples suivants illustreront mieux l'invention, sans pour autant en limiter sa portée. LEGENDES DES FIGURES 5 FIGURE 1. Effets d'un traitement avec le miPEP164a sur l'expression du miR164a chez A. thaliana. Les photographies représentent les résultats d'une analyse par Northern blot de l'accumulation du miR164a dans des racines traitées avec de l'eau (contrôle, photographie 10 de gauche) ou avec 0,1 1.11\4 d'un peptide synthétique, ayant une séquence identique à celle du miPEP164a, dissout dans de l'eau (0,1 1.11\4 miPEP164a). L'ARN U6 est utilisé comme témoin de charge permettant de quantifier la quantité de miR164a. Cette expérience a été répétée 4 fois de manière indépendante et a abouti à des résultats similaires.
15 Le traitement des pousses d'A. thaliana avec 0,1 1.11\4 de miPEP164a entraîne une augmentation de l'accumulation du miR164a. FIGURE 2. Effets d'un traitement avec le miPEP164a sur la croissance d'Arabidopsis thaliana.
20 Les photographies présentent deux plantes (vues de dessus et vues de côté) après 3 semaines de croissance : une plante contrôle arrosée et vaporisée avec de l'eau (A) et une plante arrosée et vaporisée avec une composition de 0,1 1.11\4 de peptide synthétique dont la séquence est identique miPEP164a (B). L'arrosage des plantes d'Arabidopsis thaliana avec le miPEP164a augmente significativement la croissance de la plante.
25 30 3021502 EXEMPLES Exemple 1 - Identification et caractérisation du miPEP164a 5 Pour identifier des miPEPs codés par des pri-miRNAs de plantes, des ORFS ont été recherchés dans des données de RACE-PCR (Xie et al., Plant Physiol, 138:2145-54, 2005), dans lesquelles les séquences de l'extrémité 5' du pri-miR de 50 miRs d'A. thaliana est disponible. Des ORFs susceptibles de coder des peptides de 4 à 59 acides aminés ont été identifiés 10 dans chacun des pri-miRs, et notamment un miORF, identifié sur le pri-miR du miR164a, susceptible de coder un peptide miPEP164a. Pour tester si ce peptide est réellement un miPEP, celui-ci a été synthétisé et a été utilisé pour rechercher une augmentation de l'accumulation du miR164a chez des racines d'A. 15 thaliana traitées avec le peptide synthétique. Les analyses par Northen blot indiquent que le traitement de la plante avec le peptide miPEP164a entraîne une augmentation de l'accumulation du miR164a (Figure 1). Par ailleurs, des expériences de croissance ont également été réalisées sur des plantes A. 20 thaliana et indiquent que l'arrosage des plantes d'A. thaliana avec le miPEP164a augmente significativement la croissance de la plante (Figure 2). Exemple 2 - Matériel et méthodes 25 Plantes Les plantes A. thaliana Col-0 sont cultivées sur un milieu de base MS complété avec 10 g/1 de sucrose. Peptides 31 Les peptides ont été synthétisés par Smartox et dissous dans de l'eau.
3021502 46 Northern blot L'analyse par Northern blot a été réalisée selon le protocole décrit dans Lauressergues et al. Plant J, 72(3):512-22, 2012. Les échantillons biologiques ont été homogénéisés dans un tampon contenant 0,1 M de 5 NaC1, 2% de SDS, 50 mM de Tris-HC1 (pH 9), 10 mM de EDTA (PH 8) et 20 mM de mercaptoéthanol, et l'ARN a été extrait 2 fois avec un mélange phénol/chloroforme et précipité à l'éthanol. L'ARN a été chargé sur gel PAGE 15% et transféré sur une membrane de nylon (HybondNX, Amersham). L'ARN a été hybridé avec une sonde d'oligonucléotides, 10 radioactive marquée à son extrémité, pour détecter l'ARN U6 ou pour le miR164a. Les hybridations ont été réalisées à 55°c. Les signaux d'hybridation ont été quantifiés en utilisant un phophorimager (Fuji) et normalisés avec le signal de la sonde spécifique de l'ARN U6.
15 Test de croissance d'A. thaliana Les graines d' Arabidopsis thaliana ont germé sur GiFi, puis ont été repiquées en terreau et cultivées pendant 3 semaines. L'arrosage a été réalisé tous les 2-3 jours avec de l'eau pour les plantes contrôles et avec de l'eau contenant 0,1 1.1M de peptide synthétique (dont la séquence est identique 20 miPEP164a) pour les plantes tests. 25 30
Claims (12)
- REVENDICATIONS1. Utilisation d'un miPEP introduit par voie exogène dans une plante pour en favoriser la croissance, ledit miPEP introduit par voie exogène étant un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence identique à celle d'un miPEP naturellement présent dans ladite plante, lequel miPEP naturellement présent est un peptide de 4 à 100 acides aminés, dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans ladite plante, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs, la somme de la quantité dudit miPEP introduit par voie exogène et de celle dudit miPEP naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit miPEP naturellement présent. notamment, ledit gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante étant choisi parmi le groupe consistant en : NACI, NAC4, 20 NAC5, CUCI et CUC2.
- 2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle ledit miARN est le miRl64a, en particulier, dans laquelle ledit miR164a possède une séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 1. 25
- 3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit miPEP est le miPEP164a, en particulier, dans laquelle ledit miPEP164a possède une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO : 2. 30
- 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite plante est une plante crucifère, telle qu'Arabidopsis thaliana, une plante solanacée ou une plante légumineuse. 3021502 48
- 5. Procédé pour favoriser la croissance d'une plante, comprenant une étape d'introduction d'un miPEP dans une plante par voie exogène, ledit miPEP étant également présent naturellement dans ladite plante, ledit miPEP introduit par voie exogène étant un peptide de 4 à 100 acides aminés 5 dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle dudit miPEP naturellement présent, laquelle séquence du miPEP naturellement présent est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou 10 reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs, la somme de la quantité dudit miPEP introduit par voie exogène et de celle dudit miPEP naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit miPEP naturellement présent, notamment, ledit gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou 15 reproductrices de la plante étant choisi parmi le groupe consistant en : NACJ, NAC4, NAC5, CUC1 et CUC2.
- 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel ledit miR est le miR164a, ledit miR164a possédant en particulier une séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 1, ledit miPEP étant notamment le miPEP164a, ledit miPEP164a possédant en particulier une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO : 2 ladite plante étant notamment une plante crucifère, une plante solanacée ou une plante légumineuse.
- 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 6, pour favoriser la croissance d'une plante Arabidopsis thaliana, dans lequel le miPEPl64a est introduit par voie exogène dans ladite plante Arabidopsis thaliana, ledit miPEP164a étant également naturellement présent dans ladite plante Arabidopsis thaliana, ledit miPEP164a introduit par voie exogène étant un peptide comprenant ou consistant en une séquence identique à celle dudit miPEPl64a naturellement présent, lequel miPEP 164a naturellement présent est un peptide de 4 à 100 acides aminés dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire du miR164a, 3021502 49 ledit miPEP164a étant capable d'augmenter l'accumulation dudit miR164a, lequel miR164a régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices d'Arabidopsis thaliana, la somme de la quantité dudit miPEP164a introduit par voie exogène et de celle 5 dudit miPEP164a naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit miPEP164a naturellement présent.
- 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel ledit miPEP est introduit dans la plante : 10 - par voie externe de préférence par arrosage, par pulvérisation ou par l'ajout d'un engrais, ledit miPEP étant notamment administré à la plante sous la forme d'une composition comprenant 10-9 M à 10-4 M dudit miPEP, en particulier 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 ou 10-4 M dudit miPEP, ou - par le biais d'un acide nucléique codant ledit miPEP, ledit acide nucléique étant 15 introduit dans la plante.
- 9. Procédé de production d'une plante transgénique comprenant: a) une étape d'introduction d'un acide nucléique codant un miPEP de 4 à 100 acides aminés dans une plante, ou dans au moins une cellule de ladite plante, dans des 20 conditions permettant l'expression dudit miPEP, ledit miPEP étant également naturellement présent dans ladite plante, ledit miPEP naturellement présent étant un peptide dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans la plante, lequel miR régule l'expression d'au 25 moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs, et b) une étape de culture de la plante, ou d'au moins une cellule de ladite plante, obtenues à l'étape a) dans des conditions permettant l'obtention d'une plante transgénique, 30 ledit gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante étant notamment choisi parmi le groupe consistant en : NAC], NAC4, NAC5, CUC1 et CUC2, 3021502 50 ledit miARN étant notamment le miR164a, ledit miR164a possédant en particulier une séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 1, ledit miPEP étant notamment le miPEP164a, ledit miPEP164a possédant en particulier une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO : 2. 5
- 10. Plante transgénique telle qu'obtenue par le procédé tel que défini selon la revendication 9.
- 11. Composition comprenant le miPEP164a en tant que substance active, ledit miPEP164a 10 consistant de préférence en SEQ ID NO : 2, Ledit miPEP164a étant notamment à une concentration de 10-9M à 10-4M, en particulier 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 ou 10-4 M, en particulier, ladite composition comprenant de plus un excipient, un diluant ou un solvant, 15 en particulier, ladite composition étant formulée de façon à former un enrobé.
- 12. Composition comprenant en combinaison une quantité de semences d'une plante et une quantité d'un peptide dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle d'un miPEP naturellement présent chez ladite plante, 20 ledit peptide ayant notamment une séquence comprenant ou consistant en une séquence identique à celle du miPEP164a, en particulier, ladite composition étant formulée de façon à former une semence enrobée.
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Non-Patent Citations (6)
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