ES2715674T3 - Construcciones de proteína USPA2 y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

Una proteína que consiste en la fórmula I: A-(R1)m-(B)n (fórmula I) en la que: A es un fragmento inmunogénico de UspA2 de Moraxella catarrhalis que tiene al menos un 90 % de identidad con SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43; R1 es un aminoácido; m es 0 o 2; B es histidina; y n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

Description

DESCRIPCIÓN
Construcciones de proteína USPA2 y usos de las mismas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones que comprenden la proteína superficial ubicua A2 (UspA2) de Moraxella catarrhalis (M. catarrhalis, M. cat.). Más particularmente, la presente solicitud se refiere a construcciones de proteína UspA2 y a composiciones inmunogénicas que comprenden las construcciones, a vacunas que comprenden tales composiciones inmunogénicas y a los usos terapéuticos de las mismas.
Antecedentes de la invención
La proteína superficial ubicua A2 (UspA2) es un auto-transportador trimérico que se presenta como una estructura en forma de piruleta en las micrografías electrónicas (Hoiczyk y col., EMBO J. 19: 5989-5999 (2000)). Está compuesta por una cabeza N-terminal, seguida de un tallo que termina en una hélice anfipática y un dominio de membrana C-terminal (Hoiczyk y col., EMBO J. 19: 5989-5999 (2000)). UspA2 contiene un dominio muy bien conservado (Aebi y col., Infection & Immunity 65(11) 4367-4377 (1997)), que se reconoce por un anticuerpo monoclonal que se mostró ser protector después de la transferencia pasiva en un modelo de estímulo de ratón con Moraxella catarrhalis (Helminnen y col., J Infect Dis. 170(4): 867-72 (1994)).
Se ha demostrado que UspA2 interactúa con las estructuras del hospedador y las proteínas de la matriz extracelular como fibronectina (Tan y col., J Infect Dis. 192(6): 1029-38 (2005)) y laminina (Tan y col., J Infect Dis. 194(4): 493-7 (2006)), sugiriendo que puede tener una función en una etapa temprana de la infección por Moraxella catarrhalis.
UspA2 también parece estar implicada en la capacidad de Moraxella catarrhalis para resistir a la actividad bactericida del suero humano normal (Attia AS y col., Infect Immun 73(4): 2400 a 2410 (2005)). Ésta (i) se une al inhibidor del complemento C4bp, permitiendo que Moraxella catarrhalis inhiba el sistema de complemento clásico, (ii) impide la activación de la ruta alternativa del complemento mediante la absorción de C3 a partir del suero y (iii) interfiere con las fases terminales del sistema de complemento, el Complejo de Ataque de Membrana (MAC, por sus siglas en inglés), uniendo a la proteína reguladora del complemento vitronectina (de Vries y col., Microbiol Mol Biol Rev. 73(3): 389-406 (2009)).
Moraxella catarrhalis es un patógeno respiratorio importante y común que se ha asociado a un mayor riesgo de exacerbaciones en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) en adultos (Sateesh y col., Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3: 109-115 (2006)). El impacto de la diversidad de secuencias en el dominio de la cabeza de UspA2/UspA2H de Moraxella catarrhalis sobre la unión a vitronectina y la variación antigénica se informó en Yu-Ching Su y col. Microbes and Infection (vol. 15, n.° 5, 2013 páginas 275-387). El aislamiento y la caracterización de dos proteínas de Moraxella catarrhalis que llevan un epítopo común se informó en McMichael JC, Infection and Immunity (American Society for Microbiology, vol. 66, n.° 9, 1998, páginas 4374-4381). Los antígenos UspA1 y UspA2 de Moraxella catarrhalis se informaron en el documento WO98/28333A2. Una proteína novedosa de Haemophilus influenzae expuesta de superficie (Proteína E) se informó en el documento WO2007/084053A1. La retirada de la endotoxina bacteriana en una solución de proteína por cromatografía de afinidad de metal inmovilizado se informó en el documento WO02/083710A2.
Existe una necesidad de vacunas para Moraxella catarrhalis.
Breve sumario de la invención
Como un primer aspecto, la presente invención proporciona las proteínas que consisten en la fórmula (I).
A-(R1)m-(B)n (fórmula I)
en la que:
A es un fragmento inmunogénico de UspA2 de Moraxella catarrhalis que tiene al menos un 90 % de identidad a SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43;
R1 es un aminoácido;
m es 0 o 2;
B es histidina; y
n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Como un segundo aspecto, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden proteínas de fórmula (I) y proteínas de la invención. La composición puede comprender además un adyuvante farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender un excipiente.
En un tercer aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento o la prevención de una afección o enfermedad causadas total o parcialmente por Moraxella catarrhalis. El procedimiento comprende administrar a un sujeto en necesidad de la misma una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fórmula (I) o de una proteína de la invención.
En un cuarto aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento o la prevención de otitis media. El procedimiento comprende administrar a un sujeto en necesidad de la misma una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fórmula (I) o de una proteína de la divulgación.
En un quinto aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento o la prevención de exacerbaciones en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. El procedimiento comprende administrar a un sujeto en necesidad de la misma una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fórmula (I) o de una proteína de la divulgación.
En un sexto aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento o la prevención de neumonía. El procedimiento comprende administrar a un sujeto en necesidad de la misma una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fórmula (I) o de una proteína de la divulgación.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención, para su uso en el tratamiento o en la prevención de una afección o enfermedad causada total o parcialmente por Moraxella catarrhalis. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición que comprende al menos un antígeno de Moraxella catarrhalis y al menos un antígeno de Haemophilus influenzae. La composición puede comprender además un adyuvante farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender un excipiente.
En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento o la prevención de una afección o enfermedad causada total o parcialmente por Moraxella catarrhalis y/o Haemophilus influenzae. El procedimiento comprende administrar a un sujeto en necesidad de la misma una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fórmula (I) o de una proteína de la divulgación.
En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento o la prevención de exacerbaciones en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. El procedimiento comprende administrar a un sujeto en necesidad de la misma una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fórmula (I) o de una proteína de la divulgación y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un antígeno de Haemophilus influenzae.
La presente divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención para su uso en el tratamiento o en la prevención de una afección o enfermedad causada total o parcialmente por Moraxella catarrhalis, en combinación con al menos un antígeno de Haemophilus influenzae. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Aspectos adicionales de la presente invención se describen en la descripción detallada de las realizaciones particulares, ejemplos y reivindicaciones que siguen.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Un perfil de fermentación típico con los procedimientos de inducción de alta densidad celular (HCDI, por sus siglas en inglés) y los parámetros monitorizados durante la fermentación en lotes a una escala de 20 l.
Figura 2: Un perfil de fermentación típico con los procedimientos de inducción de baja densidad celular (LCDI, por sus siglas en inglés) y los parámetros monitorizados durante la fermentación en lotes a una escala de 20 l.
Figura 3: Rendimiento de UspA2 a partir de las construcciones de proteínas MC-001, MC-002, MC-004, MC-005, MC-006, MC-007, MC-008 y MC-010 evaluadas en el fermentador; datos de la Tabla 4.
Figura 4: Distribución del peso molecular de la MC-005 purificada determinada mediante ultra-centrifugación analítica de velocidad de sedimentación. La mayoría de la proteína se encuentra como un trímero, con una pequeña proporción de un oligómero de peso molecular más alto que puede corresponder al dímero del trímero. MW = peso molecular. kDa = kilodaltons.
Figura 5: Distribución del peso molecular de la MC-001 purificada determinada mediante ultra-centrifugación analítica de velocidad de sedimentación. La mayoría de la proteína se encuentra como un trímero.
Figura 6: Distribución del peso molecular de la MC-001 purificada determinada mediante ultra-centrifugación analítica de velocidad de sedimentación. La muestra presenta múltiples especies y es altamente poli-dispersa. El coeficiente de sedimentación de las especies superiores detectado no corresponde a aquél de los trímeros normalmente detectado en los otros lotes.
Figura 7: Distribución del peso molecular de la MC-001 purificada determinada mediante ultra-centrifugación analítica de velocidad de sedimentación. La mayoría de la proteína se encuentra como un trímero.
Figura 8: Distribución del peso molecular de la MC-007 purificada determinada mediante ultra-centrifugación analítica de velocidad de sedimentación. La mayoría de la proteína se encuentra como un trímero.
Figura 9: Espectros de dicroísmo circular (CD, por sus siglas en inglés) del ultravioleta lejano (Far-UV) de las construcciones de UspA2 dando una indicación de las estructuras secundarias de la proteína.
Figura 10: Monitorización de las estructuras secundarias mediante dicroísmo circular (CD) durante el despliegue térmico de MC-005 (UspA2Ahélice 6His). El análisis visual de los espectros claramente muestra que la proteína pierde la mayor parte de sus estructuras secundarias a 33 °C.
Figura 11: Monitorización de las estructuras secundarias mediante dicroísmo circular (CD) durante el despliegue térmico de MC-007 (UspA2 hélice completa 6His). El análisis visual de los espectros muestra que la pérdida de la estructura secundaria es más lenta en comparación con la construcción sin hélice. Los cambios estructurales son detectables después de calentar hasta 33 °C, pero parece producirse un despliegue completo entre 35 °C y 37 °C.
Figura 12: Espectro MALDI de MC-001 lote opt-01. La masa observada a 57427 Da puede ser coherente con la proteína desmetionilada, mientras que el pico a 57620 Da podría corresponder a la proteína completa.
Figura 13: Espectro MALDI de MC-011 lote BMP37. La masa observada puede ser coherente con la proteína desmetionilada. Los otros dos picos a 186 Da y 366 Da no están identificados.
Figura 14: Efectividad protectora de MC-001 y MC-007 en un modelo de ratón de colonización pulmonar.
Figura 15: Respuesta del anticuerpo dirigida contra UspA2 inducida después de la administración intramuscular en ratones, donde PII y PIII indican, respectivamente, los niveles anti-IgG en los sueros recogidos en el día 28 (post II) y el día 42 (post III).
Figura 16: Títulos bactericidas inducidos por UspA2 contra una cepa homóloga formulada con diferentes adyuvantes (AS01 e, AS04c y AlPO4 ).
Figura 17: Respuesta del anticuerpo dirigida contra UspA2 inducida después de la administración intramuscular en ratones, utilizando diferentes formulaciones de antígenos y adyuvantes.
Figura 18: Títulos bactericidas inducidos por UspA2 contra una cepa homóloga, utilizando diferentes formulaciones de antígenos y adyuvantes.
Figura 19: Respuesta de IgG inducida contra PD en ratones mediante la vacuna PD-PEPilA-UspA2 (una vacuna trivalente de NTHi-Mcaf.), formulada con diferentes adyuvantes.
Figura 20: Respuesta de IgG inducida contra PE en ratones mediante la vacuna PD-PEPilA-UspA2 (una vacuna trivalente de NTHi-Mcaf.), formulada con diferentes adyuvantes.
Figura 21: Respuesta de IgG inducida contra PilA en ratones mediante la vacuna PD-PEPilA-UspA2 (una vacuna trivalente de NTHi-Mcaf.), formulada con diferentes adyuvantes.
Figura 22: Inmunogenicidad de PE en las formulaciones de PD-PEPilA bivalente y PD-PEPilA-UspA2 trivalente con AS01E.
Figura 23: Inmunogenicidad de PilA en las formulaciones de PD-PEPilA bivalente y PD-PEPilA-UspA2 trivalente con AS01E.
Figura 24: Inmunogenicidad de PD en las formulaciones de PD-PEPilA bivalente y PD-PEPilA-UspA2 trivalente con AS01E.
Figura 25: Efecto de la formulación de vacuna PD/PEPilA/UspA2/AS01E tetravalente sobre los pulmones de ratón previamente sensibilizados con M. caf. inactivado por calor - Perivascularitis y peribronquiolitis en ratones inmunizados con PBS.
Figura 26: Efecto de la formulación de vacuna PD/PEPilA/UspA2/AS01E tetravalente sobre los pulmones de ratón previamente sensibilizados con M. caf. inactivado por calor - día 2 después de la inmunización.
Figura 27: Efecto de la formulación de vacuna PD/PEPilA/UspA2/AS01E tetravalente sobre los pulmones de ratón previamente sensibilizados con M. caf. inactivado por calor - día 7 después de la inmunización.
Figura 28: Efecto de la formulación de vacuna PD/PEPilA/UspA2/AS01E tetravalente sobre los pulmones de ratón previamente sensibilizados con M. caf. inactivado por calor - día 14 después de la inmunización.
Figura 29: Efecto de la formulación de vacuna PD/PEPilA/UspA2/AS01E tetravalente sobre los pulmones de ratón previamente sensibilizados con M. cat. inactivado por calor - Resultados detallados.
Figura 30: Respuestas de células-T CD4 de los pulmones después de la vacunación tras la re-estimulación con células enteras (WC) de M. cat. Células CD4 de los pulmones que expresan IL17. Re-estimuladas con células enteras (WC) de M. cat. inactivadas por calor o el medio.
Figura 31: Respuestas de células-T CD4 de los pulmones después de la vacunación tras la re-estimulación con células enteras (WC) de M. cat. Células CD4 de los pulmones que expresan TNFa. Re-estimuladas con células enteras (WC) de M. cat. inactivadas por calor o el medio.
Figura 32: Respuestas de células-T CD4 de los pulmones después de la vacunación tras la re-estimulación con células enteras (WC) de M. cat. Células CD4 de los pulmones que expresan IFNy. Re-estimuladas con células enteras (WC) de M. cat. inactivadas por calor o el medio.
Figura 33: Respuestas de células-T CD4 de los pulmones después de la vacunación tras la re-estimulación con células enteras (WC) de M. cat. Células CD4 de los pulmones que expresan IL13. Re-estimuladas con células enteras (WC) de M. cat. inactivadas por calor o el medio.
Figura 34: Respuestas de células-T CD4 de los pulmones posteriores al estímulo, tras la re-estimulación con células enteras (WC) de M. cat. Células CD4 de los pulmones que expresan IL17. Re-estimuladas con células enteras (WC) de M. cat. inactivadas por calor o el medio.
Figura 35: Respuestas de células-T CD4 de los pulmones posteriores al estímulo, tras la re-estimulación con células enteras (WC) de M. cat. Células CD4 de los pulmones que expresan TNFa. Re-estimuladas con células enteras (WC) de M. cat. inactivadas por calor o el medio.
Figura 36: Respuestas de células-T CD4 de los pulmones posteriores al estímulo, después de la re-estimulación con células enteras (WC) de M. cat. Células CD4 de los pulmones que expresan IFNy. Re-estimuladas con células enteras (WC) de M. cat. inactivadas por calor o el medio.
Figura 37: Respuestas de células-T CD4 de los pulmones posteriores al estímulo, después de la re-estimulación con células enteras (WC) de M. cat. Células CD4 de los pulmones que expresan IL13. Re-estimuladas con células enteras (WC) de M. cat. inactivadas por calor o el medio.
Descripción detallada de la invención
A menos que se expliquen o se definan de otra manera en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece esta divulgación. Por ejemplo, las definiciones de los términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew y col., (Editores), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (Editor), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Los términos en singular “un", “uno", y "el” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. De una manera similar, la palabra “o” pretende incluir “y” a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Además debe entenderse que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos y todos los valores de peso molecular o de masa molecular, dados para los ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan para su descripción. Adicionalmente, las limitaciones numéricas dadas con respecto a concentraciones o niveles de una sustancia, tales como un antígeno, pueden ser aproximadas. Por consiguiente, cuando se indica que una concentración es (por ejemplo) de aproximadamente 200 pg, se pretende que la concentración incluya valores ligeramente mayores o ligeramente menores que (“aproximadamente" o "~”) 200 pg.
Aunque pueden usarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o prueba de esta divulgación, los procedimientos y materiales adecuados se describen más adelante.
El término "comprende" significa “incluye”. Por consiguiente, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra “comprende" y las variaciones, tales como "comprenden" y "comprendiendo", se entenderá que implican la inclusión de un compuesto o composición mencionados (por ejemplo, ácido nucleico, polipéptido, antígeno) o etapa, o grupo de compuestos o etapas, pero no con la exclusión de ningún otro compuesto, composición, etapa o grupo de los mismos. La abreviatura, “e.g.” deriva del latín exempli gratia, y se usa en el presente documento para indicar un ejemplo no limitante. Por consiguiente, la abreviatura “e.g.” es un sinónimo de la expresión “por ejemplo”.
Para facilitar la revisión de las diferentes realizaciones de esta divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos. Se proporcionan términos y explicaciones adicionales en el contexto de esta divulgación.
Un "sujeto", como se utiliza en el presente documento, es un mamífero, incluyendo seres humanos, primates no humanos, y mamíferos no primates, tales como los miembros del género de los roedores (incluyendo, pero no limitándose a, ratones y ratas), y los miembros del orden Lagomorpha (incluyendo, pero no limitándose a, conejos).
Como se usa en el presente documento, “UspA2” significa la proteína superficial ubicua A2 de Moraxella catarrhalis. UspA2 puede consistir en o comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de ATCC 25238:
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así como las secuencias con al menos o exactamente el 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad, sobre toda su longitud, con la SEQ ID NO: 1. Una comparación de 38 secuencias de UspA2 de Moraxella catarrhalis (Tabla 1, SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38) demostró aproximadamente el 63 % a aproximadamente el 100 % de identidad con UspA2 como se estipula en la SEQ ID NO: 1.
UspA2, como se describe en la SEQ ID NO: 1 contiene un péptido señal (por ejemplo, los aminoácidos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 1), un dominio de unión a laminina (por ejemplo, los aminoácidos 30 a 177 de la SEQ ID NO: 1), un dominio de unión a fibronectina (por ejemplo, los aminoácidos 165 a 318 de la SEQ ID NO: 1) (Tan y col., JID 192: 1029-38 (2005)), un dominio de unión a C3 (por ejemplo, los aminoácidos 30 a 539 de la SEQ iD NO: 1 (documento WO2007/018463) o un fragmento de los aminoácidos 30 a 539 de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, los aminoácidos 165 a 318 de la SEQ ID NO: 1 (Hallstrom T y col., J. Immunol. 186: 3120-3129 (2011)), una hélice anfipática (por ejemplo, los aminoácidos 519 a 564 de la SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos 520-559 de la SEQ ID NO: 1, identificados usando diferentes procedimientos de predicción) y un dominio de ancla C-terminal (por ejemplo, los aminoácidos 576 a 630 de la SeQ ID NO: 1 (Brooks y col., Infection & Immunity, 76(11), 5330-5340 (2008)).
Se han descrito diferencias de aminoácidos de UspA2 para diversas especies de Moraxella catarrhalis. Véase, por ejemplo, J Bacteriology 181(13): 4026-34 (1999), Infection & Immunity, 76(11): 5330-40 (2008), y PLoS One 7(9): e45452 (2012).
UspA2 puede consistir en o comprender una secuencia de aminoácidos que difiera de la SEQ ID NO: 1 en cualquiera o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: los Aa (aminoácidos) 30 a 298, AA 299 a 302, AA 303 a 333, AA 334 a 339, AA 349, AA 352 a 354, AA 368 a 403, AA 441, AA 451 a 471, AA 472, AA474 a 483, AA 487, AA 490, AA 493, AA 529, AA 532 o AA 543. UspA2 puede consistir en o comprender una secuencia de aminoácidos que difiera de la SEQ ID NO: 1 en que contenga al menos una inserción de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 1. UspA2 puede consistir en, o puede comprender, una secuencia de aminoácidos que difiera de la SEQ ID NO: 1 en cualquiera de las diferencias de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 38. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 puede contener K en lugar de Q en el aminoácido 70, Q en lugar de G en el aminoácido 135 y/o D en lugar de N en el aminoácido 216.
Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de UspA2 de 38 cepas de Moraxella catarrhalis (SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO:
38).
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(continuación)
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UspA2 puede ser UspA2 de M. catarrhalis cepa ATCC (una marca registrada en EE.UU.) 25238™, Americana 2933. Americana 2912, Americana 2908, Finlandesa 307, Finlandesa 353, Finlandesa 358, Finlandesa 216, Holandesa H2, Holandesa F10, Noruega 1, Noruega 13, Noruega 20, Noruega 25, Noruega 27, Noruega 36, BC5SV, Noruega 14, Noruega 3, Finlandesa 414, Japonesa Z7476, Belga Z7530, Alemana Z8063, Americana O12E, Griega MC317, Americana V1122, Americana P44, Americana V1171, Americana TTA24, Americana O35E, Americana SP12-6, Americana SP12-5, Sueca BC5, Americana 7169, Finlandesa FIN2344, Americana V1118, Americana V1145 o Americana V1156. UspA2 puede ser UspA2 como se estipula en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. UspA2 puede ser UspA2 de otra fuente que corresponda a la secuencia de UspA2 en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. Las secuencias de UspA2 correspondientes pueden determinarse por un experto en la materia utilizando diversos algoritmos. Por ejemplo, puede usarse el programa Gap o el programa Needle para determinar las secuencias de UspA2 correspondientes a cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38.
UspA2 puede ser una secuencia con al menos el 95 % de identidad, sobre toda su longitud, con cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38.
Los fragmentos inmunogénicos de UspA2 comprenden fragmentos inmunogénicos de al menos 450 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1, 490 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, el fragmento de UspA2 de MC-004 o MC-005), 511 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, el fragmento de UspA2 de la construcción MC-001, MC-002, MC-003 o MC-004), 534 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, el fragmento de UspA2 de MC-009 o MC-011) o 535 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, el fragmento de UspA2 de MC-007, MC-008 o MC-010). Los fragmentos inmunogénicos pueden producir anticuerpos que pueden unir la SEQ ID NO: 1.
Los fragmentos inmunogénicos de UspA2 pueden comprender fragmentos inmunogénicos de al menos 450, 490, 511, 534 o 535 aminoácidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. Los fragmentos inmunogénicos de UspA2 pueden comprender fragmentos inmunogénicos de UspA2 de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 38 que corresponden al fragmento de UspA2 de la SeQ ID NO: 1 en cualquiera de las construcciones de UspA2 MC-001, MC-002, MC-003, MC-004, MC-005, MC-006, MC-007, MC-008, MC-009, MC-010 o MC-011. Los fragmentos inmunogénicos pueden producir anticuerpos que pueden unirse a la secuencia de longitud completa a partir de la cual deriva el fragmento.
Las alineaciones entre pares de polipéptidos pueden calcularse mediante diversos programas. Por ejemplo, puede usarse el programa Needle a partir del paquete EMBOSS (Software gratuito; EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Trends in Genetics 16(6): 276-277), y el programa Gap a partir del paquete GCG (una marca registrada en EE.UU.) (Accelrys Inc.).
Los programas Gap y Needle son una implementación del algoritmo de Needleman-Wunsch descrito en: Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. Estos programas usan con frecuencia la matriz de puntuación BLOSUM62 (Steven Henikoft y Jorja G. Henikoft (1992), “Amino acid substitution matrices from protein blocks”), Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89 (Biochemistry): 10915-10919) con penalidades por abertura y extensión de hueco de, respectivamente, 8 y 2. Algunas veces, también se usa la matriz de puntuación PAM250 (Dayhoft y col., (1978), “A model of evolutionary changes in proteins”, en “Atlas of Protein sequence and structure” 5(3) M.O. Dayhoft (Editor), 345-352, National Biomedical Research Foundation, Washington).
Las matrices de puntuación describen mediante números la tendencia de cada aminoácido a mutar en otro, o a conservarse. Estos números se computan generalmente a partir de las estadísticas de las mutaciones observadas en las alineaciones fieles por pares o múltiples, o incluso en fragmentos de múltiples alineaciones. Generalmente, en estas tablas, si un número positivo alto se asocia a un par de aminoácidos idénticos, indica que este resto tiene una baja tendencia a la mutación. Por el contrario, un número positivo alto asociado a un par de aminoácidos diferentes está indicando una alta tendencia a la mutación entre estos dos. Y esto se denomina una “sustitución conservativa”. Viendo una alineación por pares, pueden observarse restos idénticos alineados (“identidades”) entre las dos secuencias. Puede calcularse un porcentaje de identidad multiplicando por 100 (1) el cociente entre el número de identidades y la longitud de la alineación (por ejemplo, en el resultado del programa Needle), o (2) el cociente entre el número de identidades y la longitud de la secuencia más larga, o (3) el cociente entre el número de identidades y la longitud de la secuencia más corta, o (4) el cociente entre el número de identidades y el número de restos alineados (por ejemplo, en el resultado del programa Gap).
Los porcentajes de identidades de la Tabla 8 se han calculado de acuerdo con la definición (3) del párrafo anterior, utilizando las alineaciones por pares calculadas por el software Gap.
Como se usa en el presente documento, “adyuvante” significa un compuesto o sustancia que, cuando se administra a un sujeto en conjunto con una vacuna, producto inmunoterapéutico, u otra composición que contenga antígeno o inmunógeno, aumenta o potencia la respuesta inmunitaria del sujeto al antígeno o inmunógeno administrado (comparándose con la respuesta inmunitaria que se obtendría en ausencia del adyuvante). Éste se va a distinguir de la “terapia adyuvante”, definida por el National Cáncer Institute of the United States Institutes of Health en el contexto del tratamiento de cáncer como un tratamiento adicional dado después del tratamiento primario, para reducir el riesgo de que recurra el cáncer.
La invención proporciona además proteínas de fórmula (I) que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, las proteínas de fórmula (I) pueden contener una sustitución conservativa de cualquier aminoácido de UspA2 de Moraxella catarrhalis como se describe en cualquiera de las secuencias estipuladas en el presente documento (por ejemplo, cualquier secuencia de UspA2 estipulada en las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38). Como se usa en el presente documento, "péptido señal" se refiere a un polipéptido corto (de menos de 60 aminoácidos, por ejemplo, de 3 a 60 aminoácidos) presente en las proteínas precursoras (típicamente en el N terminal), y que está típicamente ausente de la proteína madura. El péptido señal (sp) es típicamente rico en aminoácidos hidrófobos. El péptido señal dirige el transporte y/o la secreción de la proteína traducida a través de la membrana. Los péptidos señal también pueden denominarse señales de diana, péptidos de tránsito, señales de localización o secuencias señal. Por ejemplo, la secuencia señal puede ser un péptido señal co-traduccional o posttraduccional.
Un péptido señal heterólogo puede escindirse de una construcción de proteína mediante las peptidasas del péptido señal durante o después de la transportación o la secreción de la proteína. Por ejemplo, la peptidasa del péptido señal es la peptidasa I del péptido señal. Un péptido señal “heterólogo” es uno que no está asociado a la proteína como existe en la naturaleza.
Como se usa en el presente documento "tratamiento" significa la prevención de la aparición de los síntomas de la afección o enfermedad en un sujeto, la prevención de recurrencia de los síntomas de la afección o enfermedad en un sujeto, el retraso de recurrencia de los síntomas de la afección o enfermedad en un sujeto, la disminución en la gravedad o frecuencia de los síntomas de la afección o enfermedad en un sujeto, la ralentización o la eliminación del progreso de la afección y la eliminación parcial o total de los síntomas de la enfermedad o afección en un sujeto. Como se usa en el presente documento, “opcionalmente” significa que el evento o eventos posteriormente descritos pueden presentarse o no, e incluye tanto el evento o eventos que se presentan como los eventos que no se presentan.
La otitis media es una causa importante de morbilidad en el 80 % de todos los niños menores de 3 años de edad (Expert Rev. Vaccines 5: 517-534 (2006)). Más del 90 % de los niños desarrollan otitis media antes de los 7 años de edad (Current Opinion in Investigational Drugs 4: 953-958 (2003)). En el año 2000, hubo 16 millones de citas con los médicos de consulta para otitis media en los Estados Unidos y aproximadamente 13 millones de recetas de anti­ bacterianos dispensadas (Pediatrics 113: 1451-1465 (2004)). En los países europeos, los índices de otitis media aguda indicados están en el intervalo de entre 0,125 y 1,24 por niño-año (Expert Review of Vaccines 8: 1479-1,500 (2009)). La otitis media es una infección costosa y la razón más común por la cual los niños reciben antibióticos (Current Infectious Disease Reports 11: 177-182 (2009)). Las bacterias son responsables de aproximadamente el 70 % de los casos de otitis media aguda, predominando Streptococcus neumoniae, Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) y Moraxella catarrhalis como los agentes causantes (Expert Review of Vaccines 5: 517-534 (2006)). Un subconjunto de niños experimenta otitis media recurrente y crónica, y estos niños susceptibles a la otitis tienen extensas efusiones del oído medio que están asociadas con pérdida del oído y retrasos en el desarrollo del habla y el lenguaje (Current Infectious Disease Reports 11: 177-182 (2009)). La reciente presión con los antibióticos y la vacunación con la vacuna del conjugado neumocócico han dado como resultado el surgimiento de Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis productoras de p-lactamasa como los principales organismos que provocan la otitis media aguda en Norteamérica, seguidas de Streptococcus neumoniae (Pediatr Clin N Am 60 (2013) 391-407). Debido a que la otitis media es una enfermedad multifactorial, se ha cuestionado la factibilidad de prevenir la otitis media utilizando una estrategia de vacunación (Current Infectious Disease Reports 11: 177-182 (2009)).
El modelo de chinchilla es un modelo animal robusto y validado de otitis media y su prevención (Expert Review of Vaccines 8: 1063-1082 (2009)). Aunque el modelo de chinchilla puede imitar el curso natural de la infección humana, otros han sugerido que los resultados en el modelo de chinchilla pueden variar de un laboratorio al siguiente (Current Opinion in Investigational Drugs 4: 953-958 (2003)).
También se han utilizado diversos roedores diferentes para la inducción de otitis media y se resumen en Vaccine 26: 1501-1524 (2008). En la investigación de otitis media, con frecuencia se estudia el modelo animal murino.
La presencia del anticuerpo bactericida se asocia a la protección de la otitis media debido a la H. influenzae no tipificable (Current Opinion in Infectious Disease 16: 129-134 (2003)). Sin embargo, una respuesta inmunitaria no necesita ser bactericida para ser eficaz contra NTHi. Los anticuerpos que meramente reaccionan con las adhesinas de superficie de NTHi pueden reducir o eliminar la otitis media en la chinchilla (Current Opinion in Investigational Drugs 4: 953-958 (2003)).
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica es una enfermedad inflamatoria crónica de los pulmones y una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Aproximadamente una de cada 20 muertes en el año 2005 en EE.UU. tuvo la EPOC como la causa subyacente (Drugs and Aging 26: 985-999 (2009)). Se proyecta que en el año 2020 la EPOC se elevará hasta la quinta causa más importante de los años de vida ajustados a la discapacidad, las enfermedades invalidantes crónicas, y hasta la tercera causa más importante de mortalidad (Lancet 349: 1498­ 1504 (1997)).
El curso de la EPOC se caracteriza por un empeoramiento progresivo de la limitación del flujo de aire y por una declinación en la función pulmonar. La EPOC puede complicarse por las exacerbaciones agudas (AE, por sus siglas en inglés) frecuentes y recurrentes, las cuales están asociadas con un enorme gasto para el cuidado de la salud y con una alta patología (Proceedings of the American Thoracic Society 4: 554-564 (2007)). Un estudio sugiere que aproximadamente el 50 % de las exacerbaciones agudas de los síntomas en la EPOC están causadas por Haemophilus influenzae no tipificable, Moraxella catarrhalis, Streptococcus neumoniae y Pseudomonas aeruginosa. (Drugs and Aging 26: 985-999 (2009)). Haemophilus influenzae (H. influenzae) se encuentra en el 20 al 30 % de las exacerbaciones de la EPOC; Streptococcus neumoniae, en el 10 al 15 % de las exacerbaciones de la EPOC; y Moraxella catarrhalis, en el 10 al 15 % de las exacerbaciones de la EPOC (New England Journal of Medicine 359: 2355-2365 (2008)). Se ha demostrado que Haemophilus influenzae, Streptococcus neumoniae, y Moraxella catarrhalis son los patógenos primarios en las exacerbaciones agudas de bronquitis en Hong Kong, Corea del Sur, y las Filipinas, mientras que Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp. constituyen una gran proporción de patógenos en otros países/regiones de Asia, incluyendo Indonesia, Tailandia, Malasia, y Taiwán (Respirology, (2011) 16, 532-539; doi: 10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x). En Bangladesh, el 20 % de los pacientes con la EPOC mostraron un cultivo de esputo positivo para Pseudomonas, Klebsiella, Streptococcus neumoniae y Haemophilus influenzae, mientras que el 65 % de los pacientes con EAEPOC (exacerbación aguda de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica) mostraron cultivos positivos para Pseudomonas, Klebsiella, Acinetobacter, Enterobacter, Moraxella catarrhalis, y combinaciones de las mismas. (Mymensingh Medical Journal 19: 576-585 (2010)). Sin embargo, se ha sugerido que las dos medidas más importantes para prevenir la exacerbación de la EPOC son las inmunizaciones activas y el mantenimiento crónico de farmacoterapia. (Proceedings of the American Thoracic Society 4: 554-564 (2007)).
La neumonía adquirida en la comunidad (CAP, por sus siglas en inglés) se ha descrito como la principal causa de muerte por enfermedad infecciosa y la causa de muerte clasificada en sexto lugar globalmente en los Estados Unidos. Moraxella catarrhalis es uno de los patógenos asociados con la neumonía adquirida en la comunidad (CAP) en Norteamérica (Clin Chest Med 26 (2005) 37-55), y es uno de los patógenos asociados con la neumonía adquirida en la comunidad moderada a grave en Japón (J Infect Chemother. 2014 Nov 20. pii: S1341-321X(14)00396-1. doi:10.1016/j.jiac.2014.11.006. [Publicación electrónica antes de impresión]).
Existe una necesidad de vacunas eficaces contra M. catarrhalis.
La presente invención se refiere a las proteínas que consisten en la fórmula (I).
A-(R1)m-(B)n (fórmula I)
en la que:
A es un fragmento inmunogénico de UspA2 de Moraxella catarrhalis que tiene al menos un 90 % de identidad a SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43; R1 es un aminoácido; m es 0 o 2;
B es histidina; y
n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
En una realización particular, se definen R1 y m en la que (R1)m es AS (alanina serina). En otra realización, R1 es un aminoácido no nativo.
En una realización, se definen las proteínas de fórmula (I) y las proteínas de la invención en las que m es 0. En una realización, cuando m es 0, n es 2.
En una realización, m es 2.
En una realización particular, n se selecciona del grupo que consiste en 1, 2 y 6. En otra realización, n se selecciona del grupo que consiste en 2 y 6. En una realización particular, n es 2. En otra realización, n es 6.
En una realización, n se selecciona del grupo que consiste en 1, 2 y 6, o cualquier subconjunto de los mismos. En una realización, n es 1. En una realización, n es 3. En una realización, n es 4. En una realización, n es 5.
En una realización, las proteínas de fórmula (I) contienen además una metionina (M) en el amino terminal; una proteína con la siguiente fórmula: metionina-A-(R1)m-(B)n. Éstas se incluyen dentro de las proteínas de la invención. En una realización, las proteínas de fórmula (I) y las proteínas de la invención son proteínas no nativas.
De acuerdo con la divulgación, se definen las proteínas de fórmula (I) en la que A es UspA2 de M. catarrhalis. De acuerdo con la divulgación, se definen las proteínas de fórmula (I) en la que A es UspA2 como se estipula en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38 o cualquier subconjunto de la SEQ ID NO: 1 hasta la SEQ ID NO: 38. De acuerdo con la divulgación, se definen las proteínas de fórmula (I) en la que A es UspA2, en la que UspA2 es al menos el 63 %, 66 %, 70 %, 72 %, 74 %, 75 %, 77 %, 80 %, 84 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica, sobre toda su longitud, a la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con la divulgación, se definen las proteínas de fórmula (I) en la que A es UspA2, en la que UspA2 es de aproximadamente el 75 % hasta el 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de UspA2 estipulada en la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con la divulgación, A es UspA2 en la que UspA2 es de aproximadamente el 90 % hasta el 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de UspA2 estipulada en la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con la divulgación, A es UspA2 en la que UspA2 es al menos el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de UspA2 estipulada en la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con la divulgación, se definen las proteínas de fórmula (I) en la que A es UspA2, en la que UspA2 es de aproximadamente el 75 % hasta el 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de UspA2 estipulada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. De acuerdo con la divulgación, A es UspA2 en la que UspA2 es de aproximadamente el 90 % hasta el 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de UspA2 estipulada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. De acuerdo con la divulgación, A es UspA2 en la que UspA2 es al menos el 95 % idéntica a UspA2, como se estipula en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. De acuerdo con la divulgación, A es UspA2 que tiene la secuencia de aminoácidos estipulada en la SEQ ID NO: 1.
En otra realización, se definen las proteínas de fórmula (I) en la que A es un fragmento inmunogénico de UspA2 de M. catarrhalis. En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de UspA2 en la que UspA2 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38 o cualquier subconjunto de la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 38. En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de UspA2, en la que UspA2 es de aproximadamente el 90 % al 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 1. En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de UspA2, en la que UspA2 es al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 1. En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de UspA2, en la que UspA2 es de aproximadamente el 90 % hasta el 100 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. En una realización adicional, A es un fragmento inmunogénico de UspA2, en la que UspA2 es al menos el 95 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. En una realización particular, A es un fragmento inmunogénico de UspA2, en la que UspA2 tiene la secuencia de aminoácidos estipulada en la SEQ ID NO: 1.
En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de UspA2 de M. catarrhalis seleccionado a partir del grupo que consiste en los aminoácidos 30-540 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 39), los aminoácidos 31-540 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 40), los aminoácidos 30-519 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 41), los aminoácidos 30-564 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 42), y los aminoácidos 31-564 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 43). De una manera más específica, en una realización, A es la SEQ ID NO: 43, los aminoácidos 31-564 de la SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, A es la SEQ ID NO: 42, los aminoácidos 30-564 de la SEQ ID NO: 1. En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de UspA2 de M. catarrhalis seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 30­ 540 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 39), los aminoácidos 31-540 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 40), y los aminoácidos 30-519 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 41). En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de UspA2 con al menos el 52 % (Americana 2908), 55 % (Noruega 25), 57 % (Japonesa Z7476), 62 % (Finlandesa FIN2344), 64 % (Americana 2912), 69 % (Americana P44), 73 % (Americana 7169), 76 % (Noruega 27), 81 % (Americana V1145), 88 % (Alemana Z8063) o 100 % (Sueca BC5) de identidad con la SEQ ID NO: 39. En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de UspA2 con al menos el 52 % (Americana 2908), 57 % (Holandesa F10), 62 % (Americana 2933), 65 % (Griega MC317), 67 % (Americana V1122), 70 % (Americana P44), 73 % (Americana 7169), 76 % (Noruega 3), 81 % (Alemana Z8063), 100 % (Sueca BC5) de identidad con la SEQ ID NO:
43.
En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de UspA2 de M. catarrhalis de la SEQ ID NO: 2 hasta la SEQ ID NO: 38, en donde el fragmento comprende los aminoácidos que se alinean con los aminoácidos 30-540 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 39), los aminoácidos 31-540 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 40), los aminoácidos 30­ 519 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 41), los aminoácidos 30-564 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 42) o los aminoácidos 31-564 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 43). En una realización, puede usarse el programa Gap (a partir del paquete GCG), o el programa Needle (a partir del paquete EMBOSS), que implementan el algoritmo de Needleman-Wunsch, para alinear las secuencias.
UspA2 - SEQ ID NO: 1
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE
AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD
FGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEELFNLSG
RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA
NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA
LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN
I YELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL
ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK
VNAFBGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRV
N PN LAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYE F
Aminoácidos 30-540 de UspA2 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 39
QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE
AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD
FGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSG
R E I DQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA
NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA
LNKAS SENTQNI EDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNI AKNQADI ANNINN
IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL
ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK
Aminoácidos 31-540 de UspA2 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40
AKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE
AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD
FGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEELFNLSG
RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA
NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA
LNKAS S ENTQNIE DLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASS ENTQNIAKNQADIANNINN
I YELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL
ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK
Aminoácidos 30-519 de UspA2 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 41
QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE
AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD
FGHEVAES IG E I HAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNW EEL FNLSG
RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA
NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA
LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN
IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL
ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKS
Aminoácidos 30-564 de UspA2 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 42
QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE
AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD
FGHEVAESIG E I HAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSG
RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTD IAQNQA
NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA
LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN
I YELAQQQDQHS SDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL
ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK
VNAFDGRI TALDSKVENGMAAQAA
Aminoácidos 31-564 de UspA2 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 43
AKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE
AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD
FGHEVAES IGE I HAHNE AQNETLKGL IT N S I ENTNN ITKNKADIQALENNW EEL FNLSG
R LI DQKADI DNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA
NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA
LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN
IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL
ITA N K TA IDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK VNAFDGRITALDSKVE N GMAAQAA
En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de UspA2 de M. catarrhalis que difiere de la SEQ ID NO: 1 en uno o más de los siguientes aminoácidos: AA (aminoácidos) 30 a 298, AA 299 a 302, AA 303 a 333, AA 334 a 339, AA 349, AA 352 a 354, AA 368 a 403, AA 441, AA 451 a 471, AA 472, AA 474 a 483, AA 487, AA 490, AA 493, AA 529, AA 532 o AA 543. En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de UspA2 de M. catarrhalis que difiere de la SEQ ID NO: 1 en que contiene al menos una inserción de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 1.
En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de UspA2 que contiene un dominio de unión a laminina y un dominio de unión a fibronectina.
En una realización adicional, A es un fragmento inmunogénico de UspA2 que contiene un dominio de unión a laminina, un dominio de unión a fibronectina y un dominio de unión a C3.
En una realización adicional, A es un fragmento inmunogénico de UspA2 que contiene un dominio de unión a laminina, un dominio de unión a fibronectina, un dominio de unión a C3 y una hélice anfipática.
El dominio de unión a laminina, el dominio de unión a fibronectina, el dominio de unión a C3 o la hélice anfipática pueden ser como se definen para SEQ ID NO: 1 o pueden ser la secuencia correspondiente en cualquiera de la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 38.
Las proteínas de fórmula (I) y las proteínas de la invención son útiles como inmunógenos en sujetos tales como mamíferos, en particular en seres humanos. En particular, las proteínas de fórmula (I), y las proteínas de la invención, son útiles para inducir una respuesta inmunitaria contra M. catarrhalis en los sujetos, en particular en los seres humanos. Las proteínas de fórmula (I) y las proteínas de la invención son útiles en el tratamiento o en la prevención de infección o enfermedad por M. catarrhalis. De una manera más específica, las proteínas de fórmula (I), y las proteínas de la invención, son útiles en el tratamiento o en la prevención de otitis media y/o EPOC y/o EAEPOC y/o neumonía.
La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden UspA2 de M. catarrhalis o un fragmento inmunogénico de la misma. La presente invención también se refiere a vacunas que comprenden dichas composiciones inmunogénicas y a los usos terapéuticos de las mismas. Las composiciones inmunogénicas y vacunas de la presente invención son útiles en el tratamiento o en la prevención de infección o enfermedad por M. catarrhalis. De una manera más específica, las composiciones inmunogénicas y vacunas descritas en el presente documento son útiles en el tratamiento o en la prevención de otitis media y/o EPOc y/o EAEPOC y/o neumonía. De acuerdo con la divulgación, la composición inmunogénica comprende UspA2 de M. catarrhalis. UspA2 puede ser cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 38 o una secuencia de UspA2 al menos el 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 38. UspA2 también puede ser una secuencia de UspA2 al menos el 63 % (Americana 2908), 66 % (Japonesa Z7476), 70 % (Holandesa F10), 72 % (Finlandesa 358), 74 % (Americana P44), 77 % (Finlandesa 307), 80 % (Noruega 3), 84 % (Americana V1145), 90 % (Alemana Z8063) o 100 % (Sueca BC5) idéntica a aquélla de la SeQ ID NO: 1.
En otra realización, la composición inmunogénica comprende un fragmento inmunogénico de UspA2. El fragmento inmunogénico de UspA2 puede ser la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 42 o la SEQ ID NO: 43, o una secuencia que tenga al menos el 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43. El fragmento inmunogénico de UspA2 puede ser una secuencia de UspA2 al menos el 52 % (Americana 2908), 55 % (Noruega 25), 57 % (Japonesa Z7476), 62 % (Finlandesa FIN2344), 64 % (Americana 2912), 69 % (Americana P44), 73 % (Americana 7169), 76 % (Noruega 27), 81 % (Americana V1145), 88 % (Alemana Z8063) o 100 % (Sueca BC5) idéntica a la SEQ ID NO: 39. El fragmento inmunogénico de UspA2 también puede ser una secuencia de UspA2 al menos el 52 % (Americana 2908), 57 % (Holandesa F10), 62 % (Americana 2933), 65 % (Griega MC317), 67 % (Americana V1122), 70 % (Americana P44), 73 % (Americana 7169), 76 % (Noruega 3), 81 % (Alemana Z8063), 100 % (Sueca BC5) idéntica a la SEQ ID NO: 43. Se han descrito diferencias de aminoácidos en UspA2 a partir de diversas especies de Moraxella catarrhalis.
UspA2 contiene un dominio de unión a laminina (por ejemplo, los aminoácidos 30-177 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44). En una realización, el fragmento de UspA2 comprende la región de unión a laminina de la SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, el fragmento de UspA2 comprende la región de unión a laminina de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 38.
Aminoácidos 30-177 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44:
QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVG
WNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNL
VNGFEIEKNKDAIAKNNESIED.
UspA2 contiene un dominio de unión a fibronectina (por ejemplo, los aminoácidos 165-318 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45). En una realización, el fragmento de UspA2 comprende la región de unión a fibronectina de la SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, el fragmento de UspA2 comprende la región de unión a fibronectina de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 38. El dominio de unión a fibronectina de la SEQ ID NO: 45 también tiene propiedades de unión a C3.
Aminoácidos 165-318 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45:
KDAIAKNNESIEDLYD
FGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNW EELFNLSG
RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA
NIQDLATYNELQDQYAQK.
UspA2 contiene el dominio de unión del componente de complemento 3 (C3) (por ejemplo, los aminoácidos 30-539 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 46, o los aminoácidos 165-318 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45). El fragmento de UspA2 comprende la región de unión a C3 de la SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, el fragmento de UspA2 comprende un dominio de unión a C3 de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 38. Aminoácidos 30-539 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 46:
Q A K N D ITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILA LEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE
AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD
FGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNW EELFNLSG
RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA
NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA
LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN
IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL
IT A N K T A IDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDT
UspA2 contiene una hélice anfipática (por ejemplo, los aminoácidos 519-564 de la SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos 520-559 de la SEQ ID NO: 1). En una realización, el fragmento de UspA2 comprende los aminoácidos 519-564 de la SEQ ID NO: 1. En otra realización, el fragmento de UspA2 comprende los aminoácidos 520-559 de la SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, el fragmento de UspA2 comprende una hélice anfipática de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 38.
En una realización, la composición inmunogénica comprende una proteína de fórmula (I) en la que A es un fragmento inmunogénico de UspA2 que comprende un dominio de unión a laminina y un dominio de unión a fibronectina.
En una realización adicional, la composición inmunogénica comprende una proteína de fórmula (I) en la que A es un fragmento inmunogénico de UspA2 que comprende un dominio de unión a laminina, un dominio de unión a fibronectina y un dominio de unión a C3.
En una realización adicional, la composición inmunogénica comprende una proteína de fórmula (I) en la que A es un fragmento inmunogénico de UspA2 que comprende un dominio de unión a laminina, un dominio de unión a fibronectina, un dominio de unión a C3 y una hélice anfipática.
En otra realización, la composición inmunogénica comprende una proteína como se define mediante la fórmula (I). La composición inmunogénica puede contener, por ejemplo, una proteína de fórmula (I) con una metionina adicional en el amino terminal.
En una realización, las presentes composiciones inmunogénicas pueden administrarse con otros antígenos. Por ejemplo, la presente composición inmunogénica puede administrarse con antígenos de H. influenzae. Por ejemplo, la proteína de fórmula (I) puede administrarse con Proteína D (PD) de H. influenzae. La Proteína D puede ser como se describe en el documento WO91/18926. La presente composición inmunogénica puede administrarse con Proteína E (PE), y Pilina A (PilA) de H. influenzae. La Proteína E y Pilina A pueden ser como se describen en el documento WO2012/139225. La Proteína E y Pilina A pueden presentarse como una proteína de fusión.
En otra realización, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse con antígenos adicionales de otras especies bacterianas también conocidas por provocar otitis media, EPOC, EAEPOC o neumonía.
La cantidad de la composición inmunogénica que se requiere para lograr el efecto terapéutico o biológico deseado dependerá de un número de factores, tales como el uso para el que se pretenda, el medio de administración, el receptor y el tipo y la gravedad de la afección que se trate, y por último, estará a la discreción del médico o veterinario que atienda. En general, una dosis típica para el tratamiento de una afección causada total o parcialmente por M. catarrhalis en un ser humano, por ejemplo, se puede esperar que quede en el intervalo de aproximadamente 0,001 mg - 0,120 mg. De una manera más específica, una dosis típica para el tratamiento de una afección causada total o parcialmente por M. catarrhalis en un ser humano puede quedar en el intervalo de aproximadamente 0,003 mg a aproximadamente 0,03 mg de proteína. La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención para su uso en el tratamiento o en la prevención de una afección o enfermedad causada total o parcialmente por M. catarrhalis. La composición inmunogénica puede contener antígenos adicionales; una dosis típica para el tratamiento de una afección causada total o parcialmente por H. influenzae en un ser humano puede quedar en el intervalo de aproximadamente 0,005 mg a aproximadamente 0,05 mg para cada antígeno adicional. Esta dosis puede administrarse como una sola dosis unitaria. También pueden administrarse varias dosis unitarias separadas. Por ejemplo, las dosis unitarias separadas pueden administrarse como dosis iniciales separadas dentro del primer año de vida o como dosis de refuerzo separadas dadas a intervalos regulares (por ejemplo, cada 1, 5 o 10 años). La presente invención también proporciona una composición inmunogénica, que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención, para su uso en el tratamiento o en la prevención de una afección o enfermedad causada total o parcialmente por Moraxella catarrhalis en combinación con al menos un antígeno de Haemophilus influenzae.
Las formulaciones que comprenden las composiciones inmunogénicas de la invención pueden adaptarse para su administración por una vía apropiada, por ejemplo, por la vía intramuscular, sublingual, transcutánea, intradérmica o intranasal. Estas formulaciones se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica.
Las composiciones inmunogénicas de la presente invención adicionalmente pueden comprender un adyuvante. Cuando se utiliza el término “adyuvante” en esta memoria descriptiva, se refiere a una sustancia que se administra en conjunto con la composición inmunogénica para reforzar la respuesta inmunitaria del paciente al componente inmunogénico de la composición.
Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio, tal como gel de hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio o alumbre, pero también pueden ser una sal de calcio, magnesio, hierro o zinc, o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, sacáridos catiónicamente o aniónicamente derivados, o polifosfazenos. En una realización, la proteína puede ser adsorbida sobre fosfato de aluminio. En otra realización, la proteína puede ser adsorbida sobre hidróxido de aluminio. En una tercera realización, puede usarse alumbre como un adyuvante.
Los sistemas de adyuvantes adecuados que promueven una respuesta predominantemente de Th1 incluyen: derivados no tóxicos de lípido A, Monofosforil-lípido A (MPL) o un derivado del mismo, en particular monofosforillípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) (para su preparación véase la el documento GB 2220211 A); y una combinación de monofosforil-lípido A, de preferencia monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado, junto con cualquiera de una sal de aluminio (por ejemplo, fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) o una emulsión de aceite en agua. En tales combinaciones, el antígeno y 3D-MPL están contenidos en las mismas estructuras en partículas, permitiendo un suministro más eficiente de las señales antigénicas e inmunoestimulantes. Los estudios han demostrado que 3D-MPL es capaz de mejorar adicionalmente la inmunogenicidad de un antígeno adsorbido por alumbre (Thoelen y col., Vaccine (1998) 16: 708-14; documento EP 689454-B1).
AS01 es un sistema adyuvante que contiene MPL (3-0-desacil-4'- monofosforil-lípido A), QS21 ((Quillaja saponaria Molina, fracción 21) Antigenics, Nueva York, NY, EUA), y liposomas. AS01B es un sistema adyuvante que contiene MPL, QS21 y liposomas (50 pg de MPL y 50 pg de QS21). AS01E es un sistema adyuvante que contiene MPL, QS21 y liposomas (25 pg de MPL y 25 pg de QS21). En una realización, la composición inmunogénica o la vacuna comprende AS01. En otra realización, la composición inmunogénica o la vacuna comprende AS01B o AS01E. En una realización particular, la composición inmunogénica o la vacuna comprende AS01E.
AS02 es un sistema adyuvante que contiene MPL y QS21 en una emulsión de aceite/agua. AS02V es un sistema adyuvante que contiene MPL y QS21 en una emulsión de aceite/agua (50 pg de MPL y 50 pg de QS21).
AS03 es un sistema adyuvante que contiene a-Tocoferol y escualeno en una emulsión de aceite/agua (ac/ag). AS03a es un sistema adyuvante que contiene a-Tocoferol y escualeno en una emulsión de aceite/agua (ac/ag) (11,86 mg de tocoferol). AS03b es un sistema adyuvante que contiene a-Tocoferol y escualeno en una emulsión de aceite/agua (ac/ag) (5,93 mg de tocoferol). AS03c es un sistema adyuvante que contiene a-Tocoferol y escualeno en una emulsión de aceite/agua (ac/ag) (2,97 mg de tocoferol). En una realización, la composición inmunogénica o vacuna comprende AS03.
AS04 es un sistema adyuvante que contiene MPL (50 pg de MPL) adsorbido sobre una sal de aluminio (500 pg de Al3+). En una realización, la composición inmunogénica o la vacuna comprende AS04.
Un sistema que implica el uso de QS21 y 3D-MPL se desvela en el documento WO 94/00153. Una composición en la que el QS21 se inactiva con colesterol se desvela en el documento WO 96/33739. Una formulación adyuvante adicional que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210. En una realización, la composición inmunogénica adicionalmente comprende una saponina, que puede ser QS21. La formulación también puede comprender una emulsión de aceite en agua y tocoferol (documento WO 95/17210). Los oligonucleótidos que contienen CpG no metilados (documento WO 96/02555), y otros oligonucleótidos inmunomoduladores (documentos WO 0226757 y WO 03507822) son también inductores preferenciales de una respuesta TH1 y son adecuados para su uso en la presente invención.
Los adyuvantes adicionales son aquellos seleccionados del grupo de sales de metales, emulsiones de aceite en agua, agonistas de los receptores tipo Toll (en particular el agonista del receptor tipo Toll 2, el agonista del receptor tipo Toll 3, el agonista del receptor tipo Toll 4, el agonista del receptor tipo Toll 7, el agonista del receptor tipo Toll 8 y el agonista del receptor tipo Toll 9), saponinas o combinaciones de los mismos.
La presente invención proporciona un proceso para la preparación de una composición inmunogénica, que comprende combinar una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención con un adyuvante.
La presente invención proporciona además una vacuna que contiene una composición inmunogénica de la invención y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Los posibles excipientes incluyen arginina, ácido plurónico y/o polisorbato. En una realización preferida, se utiliza polisorbato 80 (por ejemplo, TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) 80). En una realización adicional, se utiliza una concentración final de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,06 %. Específicamente, puede usarse una concentración final de aproximadamente el 0,03 %, el 0,04 %, el 0,05 % o el 0,06 % de polisorbato 80 (p/v).
La presente invención proporciona un proceso para la preparación de una composición inmunogénica o vacuna, que comprende combinar una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La divulgación también proporciona ácidos nucleicos que codifican las proteínas de la invención. La expresión “ácido nucleico” se refiere a una forma polimérica de nucleótidos. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, o las formas modificadas de cualquiera de los ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. El término incluye las formas de ADN individuales y dobles. Los ácidos nucleicos están de preferencia sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos.
La presente divulgación proporciona un proceso para la producción de los ácidos nucleicos de la invención. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar mediante los procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la invención pueden sintetizarse en parte o del todo. Los ácidos nucleicos pueden prepararse mediante la digestión de los aminoácidos más largos o mediante la unión de los aminoácidos más cortos.
La presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento o la prevención de otitis media. El procedimiento comprende administrar a un sujeto en necesidad de la misma, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fórmula (I) o de una proteína de la invención.
La presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento o la prevención de exacerbaciones en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La exacerbación de la EPOC puede ser una exacerbación aguda. El procedimiento comprende administrar a un sujeto en necesidad de la misma, una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fórmula (I) o de una proteína de la invención.
La presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento o la prevención de neumonía. El procedimiento comprende administrar a un sujeto en necesidad de la misma, una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fórmula (I) o de una proteína de la invención.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención, para su uso en el tratamiento o en la prevención de una afección o enfermedad causada total o parcialmente por Moraxella catarrhalis. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona el uso de (a) proteínas de fórmula (I) y proteínas de la invención, (b) una composición inmunogénica que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención o (c) una vacuna que comprende (c1) una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención o (c2) una composición inmunogénica que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la prevención de infección o enfermedad por M. catarrhalis.
La presente invención proporciona el uso de (a) proteínas de fórmula (I) y proteínas de la invención, (b) una composición inmunogénica que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención o (c) una vacuna que comprende (c1) una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención o (c2) una composición inmunogénica que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la prevención de otitis media.
La presente invención proporciona el uso de (a) proteínas de fórmula (I) y proteínas de la invención, (b) una composición inmunogénica que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención o (c) una vacuna que comprende (c1) una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención o (c2) una composición inmunogénica que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la prevención de las exacerbaciones agudas de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EAEPOC).
La presente invención proporciona un uso de (a) proteínas de fórmula (I) y proteínas de la invención, (b) una composición inmunogénica que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención o (c) una vacuna que comprende (c1) una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención o (c2) una composición inmunogénica que comprende una proteína de fórmula (I) o una proteína de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la prevención de neumonía.
Los siguientes ejemplos se pretenden para ilustración solamente y no se pretenden para limitar el alcance de la invención de ninguna manera.
En los ejemplos, los siguientes términos tienen el significado designado:
6xhis = seis histidinas;
xg = fuerza centrífuga (número de gravedades)
AS = alanina serina
BSA = albúmina de suero bovino;
°C = grados Celsius;
CaCl2 = cloruro de calcio;
CD = dicroísmo circular;
CHCl3 = cloroformo;
CH3CN = acetonitrilo;
CO2 = dióxido de carbono;
Da = daltons;
ADN = ácido desoxirribonucleico;
DO = oxígeno disuelto;
DSC = calorimetría diferencial de barrido;
EDTA = ácido etilendiaminotetraacético;
h = hora;
H2O = agua;
H2O2 = peróxido de hidrógeno;
HCDI = inducción de alta densidad celular;
HCl = cloruro de hidrógeno;
His = his = histidina;
IMAC = cromatografía de afinidad con metal inmovilizado;
IPTG = isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido;
kVoltios = kilovoltios
l = litro;
LB = Luria-Bertani;
LCDI = inducción de baja densidad celular;
MeOH = metanol;
ml = mililitro;
NaCl = cloruro de sodio;
RPM = rpm = revoluciones por minuto;
Min = minuto;
mM = milimolar;
pg = microgramo;
pl = microlitro;
MW = peso molecular;
m/z = masa/carga;
NaCl = cloruro de sodio;
NaPO4 = fosfato de sodio;
ng = nanogramo;
NH4OH = hidróxido de amonio;
nm = nanómetro;
O.D. = densidad óptica;
PBS = solución salina tamponada con fosfato;
PCR = reacción en cadena de la polimerasa;
psi (kg/cm2) = libras por pulgada cuadrada (kilogramos por centímetro cuadrado);
PVDF = difluoruro de poli-vinilideno;
SDS-PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio;
TFA = ácido trifluoroacético
Tm = punto de fusión;
Tm1 = primer punto de fusión;
Tm2 = segundo punto de fusión;
p/v = peso/volumen.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Construcciones de proteínas
Las construcciones de proteínas se produjeron con diferentes fragmentos de UspA2 con y sin aminoácidos adicionales. La siguiente Tabla describe las construcciones de proteínas fabricadas.
Tabla 2
Construcciones de proteínas que contienen la proteína UspA2
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
(continuación)
Figure imgf000028_0002
A.A. = aminoácido
Las secuencias de ADN y de aminoácidos para las construcciones de cada proteína listadas en la Tabla 2 se estipulan a continuación.
SECUENCIAS DE CONSTRUCCIONES DE PROTEÍNAS:
Figure imgf000028_0003
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDV GWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRN LVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIG E IHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNI TKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEG LLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY
NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQN IAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNT LIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDS RVTALDTKASHHHHHH
MC-002 (ADN)- SEQ ID NO: 54
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCAG AACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCCAG TATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTG GGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCAG AATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAAT CTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGAT GCCATTGCCAAAAACAAC GAAAGCATT GAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAAC GAAGCACAGAATGAAACC C T GAAAG GT C T GAT TAC CAACAGCAT C GAAAATAC CAATAACAT T ACCAAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTG AGCGGTCGTCTGATTGATCAGAAAGCCGATATCGATAATAACATTAACAACATTTATGAACTG GCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGT CTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAATCAGGCAAAT ATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCA ATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATAC AACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCA AGCTCTGAAAACACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTAT GCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAAT ATCGCCAAAAATCAGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAG CAGGATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGT ATTGCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACACTGACGAAAAACCAGAACACC CTGATTGAAAAAGATAAAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCA AATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAAT GCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGC CGTGTGACCGCACTGGATACCAAATAA
5 MC-002 (Proteína) - (M)(UspA2 aminoácidos 30-540) SEQ ID NO: 55
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDV GWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRN LVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNI TKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEG LLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQD
AYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQ ADI ANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLARASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKD KE HDKLI TANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSIT DLGTKVDGFDSRVTAL DTK
SEQ ID NO: 56
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCAG AACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCCAG TATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTG GGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCAG AATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCT GCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAAT CT GGT GAAT GGCT TT GAAATT GAAAAAAACAAAGAT G C CAT T GC CAAAAACAAC GAAAGCAT T GAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAAC GAAGCACAGAATGAAACCCTGAAAGGTCTGATTACCAACAGCATCGAAAATACCAATAACATT ACCAAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTG AGCGGTCGTCTGATTGATCAGAAAGCCGATAT CGATAATAACATTAACAACATTTAT GAACTG GCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGT CTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAATCAGGCAAAT ATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCA ATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATAC AACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCA AGCTCTGAAAACACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTAT GCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAAT ATCGCCAAAAATCAGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAG CAGGATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGT AT T GC GAAAAACAAAG C C GAT G CAGAT G C AAGC T T T GAAACACT GAC GAAAAAC CAGAACAC C CTGATTGAAAAAGATAAAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCA AATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAAT GCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGC CGTGTGACCGCACTGGATACCAAAGTTAATGCATTTGATGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGT AAAGTTGAAAATGGAATGGCAGCACAAGCAGCACACTAA
SEQ ID NO: 57 MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDV GWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRN LVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNI TKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEG LLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQN IAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNT LIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDS RVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAH
MC-003 (ADN) - SEQ ID NO: 87
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCAG AACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCCAG TATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTG G GT T GGAAT CAGAAT GATAT C G C CAATC T GGAAGATGAT GT T GAAAC CC TGACCAAAAAT CAG AATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAAT C T G G T GAAT GGC T T T GAAATT GAAAAAAACAAAGATG C CAT T GC CAAAAACAAC GAAAGCAT T GAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAAC GAAGCACAGAATGAAACCCTGAAAGGTCTGATTACCAACAGCATCGAAAATACCAATAACATT ACCAAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTG AGCGGTCGTCTGATTGAT CAGAAAGC C GATAT C GATAATAACAT TAACAACAT T TAT GAAC T G GCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGT CTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAATCAGGCAAAT ATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCA ATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATAC AACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCA AGCTCTGAAAACACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTAT GCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAAT ATCGCCAAAAATCAGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAG CAGGATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGT A T T GC GAAAAAC AAAGC C GAT G C AGAT G CAAGC T T T GAAACAC T GACGAAAAACCAGAACACC CTGATTGAAAAAGATAAAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCA AATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAAT GCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGC CGTGTGACCGCACTGGATACCAAACACTAA
MC-003 (Proteína) - (M) (UspA2 aminoácidos 30-540) (H) - SEQ ID NO: 88
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDV GWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRN LVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNI TKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEG LLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQN IAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLARASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNT LIERDKEHDKLITANRTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDS RVTALDTKH
5 MC-004 (ADN)- SEQ ID NO: 58
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCAG AACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCCAG TATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTG GGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCAG AATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAAT CTGGTGAATGGC'TTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGAAAGCATT GAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAAC GAAGCACAGAATGAAACCCTGAAAGGTCTGATTACCAACAGCATCGAAAATACCAATAACATT ACCAAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTG AGCGGTCGTCTGAT T GAT CAGAAAG C C GATATC GATAATAACATTAACAACAT TTAT GAAC TG GCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGT CTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAATCAGGCAAAT ATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCA ATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATAC AACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCA AGCTCTGAAAACACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTAT GCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAAT ATCGCCAAAAATCAGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAG CAGGATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGT ATTGCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACACTGACGAAAAACCAGAACACC CTGATTGAAAAAGATAAAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCA AATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAAT GCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGC CGTGTGACCGCACTGGATACCAAACATCATTAA MC-004 (Proteína) - (M) (UspA2 aminoácidos 30-540) (HH) SEQ ID NO: 59
M Q A K N D IT L E D LP Y L IK K ID Q N E LE A D IG D IT A LE K Y LA LS Q Y G N ILA LE E LN K A LE E L D E D V GW NQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRN L V N G F E IE K N K D A IA K N N E S IE D LY D F G H E V A E S IG E IH A H N E A Q N E T LK G LIT N S IE N T N N I TKN KAD IQ ALEN N V V E E LFN LS G R LID Q K A D ID N N IN N IY E LA Q Q Q D Q H S S D IK TLK K N V E E G LLE LS G H LID Q K TD IA Q N Q A N IQ D LATYN ELQ D Q YAQ KQ TEAID ALN K ASSEN TQ N IED LAAY N ELQ D AYAKQ Q TEAIDALNKASSENTQ NIEDLAAYNELQ DAYAKQ Q TEAIDALNKASSENTQ N
IA K N Q A D IA N N IN N IY E LA Q Q Q D Q H S S D IK TLA K A S A A N TD R IA K N K A D A D A S FE TLTK N Q N T L IE K D K E H D K LIT A N K T A ID A N K A S A D T K F A A T A D A IT K N G N A IT K N A K S IT D LG T K V D G F D S RVTALDTKHH MC-005 (ADN)- SEQ ID NO: 60
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCAG AACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCCAG TATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTG GGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCAG AATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAAT C T G GT GAAT G G C T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT G C CAT T GC CAAAAACAAC GAAAGCAT T GAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAAC GAAGCACAGAATGAAACC C T GAAAGGTCTGATTACCAACAGCATCGAAAATAC CAATAACAT T ACCAAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTG AGCGGTCGTCTGATTGATCAGAAAGCCGATATCGATAATAACATTAACAACATTTATGAACTG GCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGT CTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAATCAGGCAAAT ATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCA ATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATAC AACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCA AGCTCTGAAAACACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTAT GCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAAT ATCGCCAAAAATCAGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAG CAGGATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGT ATTGCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACACTGACGAAAAACCAGAACACC CTGATTGAAAAAGATAAAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCA AATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAAT GCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCGCAAGCCATCATCATCACCACCACTAA
MC-005 (Proteína) - (M) (UspA2 aminoácidos 30-519) (ASHHHHHH) SEQ ID NO: 61
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDV GWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRN LVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNI TKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEG LLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQN IAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNT LIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSASHHHHHH
MC-006 (ADN)- SEQ ID NO: 62
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCAG AACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCCAG TATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTG GGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCAG AATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAAT CTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGAAAGCATT GAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAAC GAAGCACAGAAT GAAAC C C T GAAAGGTCT GAT TAC CAACAG CAT C GAAAATAC CAATAACAT T ACCAAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTG AGCGGTCGTCTGATTGATCAGAAAGCCGATATCGATAATAACATTAACAACATTTATGAACTG GCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGT CTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAATCAGGCAAAT ATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCA ATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATAC AACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCA AGCTCTGAAAACACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTAT GCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAAT AT C G CCAAAAATCAGGCC GATAT T GC CAACAATAT CAATAATAT C TAT GAACTGGCCCAGCAG CAGGATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGT AT T G C GAAAAACAAAG CCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACAC T GAC GAAAAAC CAGAACAC C CTGATTGAAAAAGATAAAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCA AATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAAT GCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCTAA
MC-006 (Proteína) - (M) (UspA2 aminoácidos 30-519) SEQ ID NO: 63
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDV GWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRN LVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNI TKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEG LLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEA I DALNKAS SENTQNI E DLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQN IAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNT LIEKDKE HDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKS
MC-007 (ADN)- SEQ ID NO: 64
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGATCAG
5 AACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCCAG TATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTG GGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCAG AATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAAT CTGGTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGAAAGCATT GAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAAC GAAGCACAGAATGAAACCCTGAAAGGTCTGATTACCAACAGCATCGAAAATACCAATAACATT ACCAAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTG AGCGGTCGTCTGATTGATCAGAAAGCCGATATCGATAATAACATTAACAACATTTATGAACTG GCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGC GATATCAAAAC CC TGAAAAAAAAC G T TGAAGAAGGT CTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAATCAGGCAAAT ATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCA ATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATAC AACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCA AGCTCTGAAAACACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTAT GCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAAT ATCGCCAAAAATCAGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAG CAGGATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGT ATTGCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACACTGACGAAAAACCAGAACACC CTGATTGAAAAAGATAAAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCA AATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAAT GCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGC CGTGTGACCGCACTGGATACCAAAGTTAATGCATTTGATGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGT AAAGTTGAAAATGGTATGGCAGCACAGGCAGCAGCAAGCCATCATCATCACCACCACTAA
MC-007 (Proteína) - (M) (UspA2 aminoácidos 30-564) (ASHHHHHH) SEQ ID NO: 65
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDV GWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRN LVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNI TKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEG LLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQN IAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNT LIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDS RVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAASHHHHHH
MC-008 (ADN)- SEQ ID NO: 66
A T G C A G G C C A A A A A T G A T A T T A C C C T G G A A G A T C T G C C G T A T C T G A T C A A A A A A A T C G A T C A G A A C G A A C T G G A A G C C G A T A T T G G T G A T A T T A C C G C A C T G G A A A A A T A T C T G G C A C T G A G C C A G TATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTG GGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCAG AATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAG GT CAG GAAGG CAAAATT C T G CAGAAC GAAACCAGCATC AAAAAAAACAC C CAG C GTAAT C TG G T GAAT GGC T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT G C CAT T GC CAAAAACAAC GAAAGCAT T GAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAAC GAAGCACAGAATGAAACCCTGAAAGGTCTGATTACCAACAGCATCGAAAATACCAATAACATT ACCAAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTG AGCGGTCGTCTGATTGATCAGAAAGCCGATATCGATAATAACATTAACAACATTTATGAACTG GCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGT CTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAATCAGGCAAAT ATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCA ATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATAC AACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCA AGCTCTGAAAACACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTAT GCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAAT ATCGCCAAAAATCAGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAG CAGGATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGT ATTGCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACACTGACGAAAAACCAGAACACC CTGATTGAAAAAGATAAAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCA AATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAAT GCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGC CGTGTGACCGCACTGGATACCAAAGTTAATGCATTTGATGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGT AAAGTTGAAAATGGTATGGCAGCACAGGCAGCACACCACTAA
MC-008 (Proteína) - (M) (UspA230-564) (HH) SEQ ID NO: 67
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDV GWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRN LVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNI TKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEG LLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQN IAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNT LIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDS RVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAHH
MC-009 (ADN)- SEQ ID NO: 68
A T G G C G A A A A A T G A T A T T A C C C T G G A A G A T C T G C C G T A T C T G A T C A A A A A A A T C G A T C A G A A C G A A C T G G A A G C C G A T A T T G G T G A T A T T A C C G C A C T G G A A A A A T A T C T G G C A C T G A G C C A G T A T GGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTGGGT TGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCAGAAT GCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTTGAA GGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATCTG GT GAAT GG CT T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GC C AT T G C C AAAAACAAC GAAAGC AT T GAA GATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAA GCACAGAATGAAACCCTGAAAGGTCTGATTACCAACAGCATCGAAAATACCAATAACATTACC AAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTGAGC GGTCGTCTGATTGATCAGAAAGCCGATATCGATAATAACATTAACAACATTTATGAACTGGCA CAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTG CTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAATCAGGCAAATATT CAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATT GAT GCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATC GAAGATCTGGCAGCATACAAC GAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCAAGC TCTGAAAACACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCC AAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAATATC GCCAAAAATCAGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAG GATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATT GCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACACTGACGAAAAACCAGAACACCCTG ATTGAAAAAGATAAAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAAT AAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCC ATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGT GTGACCGCACTGGATACCAAAGTTAATGCATTTGATGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGTAAA GTTGAAAATGGTATGGCAGCACAGGCAGCACACCACTAA
MC-009 (Proteína) - (M) (UspA231-564) (HH) SEQ ID NO: 69
MAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVG
w n q n d ia n l e d d v e t l t k n q n a l a e q g e a ik e d l q g l a d f v e g q e g k il q n e t s ik k n t q r .n l VNGFEIEKNKDAIAKNNE S IE DLYDFGHEVAE SIGEIHAHNEAQNET LKGLI TN SIEN TN N IT KNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGL LELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYN ELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNI AKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTL IEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSR VTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAHH
MC-010 (ADN)- SEQ ID NO: 70
A T G C A G G C C A A A A A T G A T A T T A C C C T G G A A G A T C T G C C G T A T C T G A T C A A A A A A ñ T C G A T C A G A A C G A A C T G G A A G C C G A T A T T G G T G A T A T T A C C G C A C T G G A A A A A T A T C T G G C A C T G A G C C A G TATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTG GGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCAG AATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAAT C T G GTGAATGGCTT T GAAAT TGAAAAAAACAAAGAT GC CATT GC CAAAAACAAC GAAAGCAT T GAAGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAAC GAAGCACAGAAT GAAAC C C T GAAAGGTCT GAT TAC CAACAG CAT C GAAAATACCAATAACAT T ACCAAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTG AGCGGTCGTCTGATTGATCAGAAAGCCGATATCGATAATAACATTAACAACATTTATGAACTG GCACAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGT CTGCTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAATCAGGCAAAT ATTCAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCA ATTGATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATAC AACGAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCA AGCTCTGAAAACACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTAT GCCAAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAAT ATCGCCAAAAATCAGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAG CAGGATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGT AT T G C GAAAAACAAAG CCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACAC T GAC GAAAAACCAGAACAC C CTGATTGAAAAAGATAAAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCA AATAAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAAT GCCATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGC CGTGTGACCGCACTGGATACCAAAGTTAATGCATTTGATGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGT AAAGTTGAAAATGGTATGGCAGCACAGGCAGCATAA
MC-010 (Proteína) - (M) (UspA2 aminoácidos 30-564) SEQ ID NO: 71
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDV GWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRN LVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIG E IHAHNEAQNETLRGLITNSIENTNNI TKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEG LLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQN IAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNT LIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDS RVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAA
MC-011 (ADN)- SEQ ID NO: 72
A T G G C G A A A A A T G A T A T T A C C C T G G A A G A T C T G C C G T A T C T G A T C A A A A A A A T C G A T C A G A A C G A A C T G G A A G C C G A T A T T G G T G A T A T T A C C G C A C T G G A A A A A T A T C T G G C A C T G A G C C A G T A T GGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTGGGT TGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCAGAAT GCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTTGAA GGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATCTG GTGAATGGCTTTGAAATTGAAAAAAACAAAGATGCCATTGCCAAAAACAACGAAAGCATTGAA GATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAA GCACAGAATGAAACCCTGAAAGGTCTGATTACCAACAGCATCGAAAATACCAATAACATTACC
AAAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTGAGC
GGTCGTCTGATTGATCAGAAAGCCGATATCGATAATAACATTAACAACATTTATGAACTGGCA CAGCAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTG CTGGAACTGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAATCAGGCAAATATT CAGGATCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATT GATGCCCTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAAC GAACTGCAGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCAAGC TCTGAAAACACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCC
AAACAGCAGACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAATATC
GCCAAAAATCAGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAG GATCAGCACTCTTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATT GCGAAAAACAAAGCCGATGCAGATGCAAGCTTTGAAACACTGACGAAAAACCAGAACACCCTG
ATTGAAAAAGATAAAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAAT
AAAGCCAGCGCAGATACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCC
ATCACCAAAAATGCCAAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGT
GTGACCGCACTGGATACCAAAGCAAGCCATCATCATCACCACCACTAA
MC-011 (Proteína) - (M) (UspA2 aminoácidos 31-540) (ASHHHHHH) SEQ ID NO: 73
MAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVG WNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNL VNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNIT KNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGL LELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYN ELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNI AKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTL IEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSR VTALDTKASHHHHHH
Construcción y Transformación de Vectores
Secuencia de ADN para UspA2 de la cepa ATCC 25238 - SEQ ID NO: 74.
ATGAAAACCATGAAACTTCTCCCTCTAAAAATCGCTGTAACCAGTGCCATGATTATTGGCTTGGGTG
CGGCATCTACT G CG AAT GCGCAGGCT AAAAAT G AT ATAACTTT AG AGG ATTT ACC AT ATTT AAT AAA
AAAG ATT G ACC AAAATG AATT GG AAGC AG AT AT CGGAG AT ATT ACT GCT CTTG AAAAGT AT CTAGCA
CTTAGCCAGTATGGCAATATTTTAGCTCTAGAAGAGCTCAACAAGGCTCTAGAAGAGCTCGACGAG
GATGTTGGATGGAATCAGAATGATATTGCAAACTTGGAAGATGATGTTGAAACGCTCACCAAAAAT
CAAAATGCTTTGGCTGAACAAGGTGAGGCAATTAAAGAAGATCTTCAAGGGCTTGCAGATTTTGTA
G AAGG GC AAG AGGGT AAAATT CT AC AAAAT G AAACTT C AATT AAAAAAAAT ACT C AG AG AAACCTT G
T CAAT G GGTTT G AGATT G AGAAAAAT AAAG ATGCTATT G CT AAAAAC AAT GAGT CT ATCGAAG AT CT
TTATGATTTTGGTCATGAGGTTGCAGAAAGTATAGGCGAGATACATGCTCATAATGAAGCGCAAAA
TGAAACTCTTAAAGGCTTGATAACAAACAGTATTGAGAATACTAATAATATTACCAAAAACAAAGCT
GAC AT CCAAGCACTT GAAAACAAT GT CGT AG AAG AACT ATT CAAT CT AAG CGGTCGCCT AATTG AT
C AAAAAGC AGAT ATT GAT AAT AAC ATC AAC AAT AT CT AT GAG CTG GC AC AACAGCAAG AT CAG C AT A
GCTCTGATATCAAAACACTTAAAAAAAATGTCGAAGAAGGTTTGTTGGAGCTAAGCGGTCACCTAAT
T GAT CAAAAAACAG AT ATTGCT CAAAACC AAGCT AACATCC AAG AT CTGGCCACTT ACAACGAGCT A
CAAGACCAGTATGCTCAAAAGCAAACCGAAGCGATTGACGCTCTAAATAAAGCAAGCTCTGAGAAT
ACAC AAAAC AT CGAAGATCTGGCCGCTT ACAACGAGCT AC AAG ATG CCT AT G CC AAAC AG C AAACC
GAAGCAATTGACGCTCTAAATAAAGCAAGCTCTGAGAATACACAAAACATCGAAGATCTGGCCGCT
T AC AACGAG CT ACAAG ATG CCT ATG CC AAAC AG CAAACCG AAG CC ATT G ACG CTCT AAAT AAAGC A
AG CTCT GAG AAT ACAC AAAAC ATT GCT AAAAAC CAAGCG GAT ATT GCT AAT AAC AT C AAC AAT ATCT
AT G AGCT GGCAC AACAGCAAG AT C AGCAT AGCT CT GATAT CAAAACCTT GGC AAAAGCAAGT G CTG
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T CTT ATAACAT CG GT GTG AATT ACG AGTT CT AA
Secuencia de proteína para UspA2 de la cepa ATCC 25238. - SEQ ID NO: 1 como se describe anteriormente. Construcción del vector
Para generar la construcción MC-001, el fragmento de ADN que codifica para un fragmento genético UspA2 (aminoácidos 30 a 540 de la cepa ATCC 25238) incluyendo los sitios de restricción NdeI / XhoI para facilitar la clonación (la metionina de partida está codificada por el sitio NdeI) y la secuencia de ADN correspondiente al enlazador de aminoácidos AS (alanina serina) y los aminoácidos 6xhis se optimizó en los codones (no nativo) y se sintetizó por GENEART (una marca registrada en EE.UU.). Optimizado en los codones significa que la secuencia de nucleótidos se cambió desde la secuencia nativa sin cambiar la secuencia de aminoácidos para ajustar mejor con el uso de codones en Escherichia coli para su expresión óptima. El fragmento UspA2 se clonó de acuerdo con los procedimientos convencionales en el vector de expresión pET-26b usando los sitios de restricción NdeI / XhoI. Para generar las construcciones MC-002, MC-003 y MC-004, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el fragmento genético de UspA2 (aminoácidos 30-540 de la cepa ATCC 25238) usando la construcción MC-001 como una plantilla, el cebador UspA2Nde opt (que contiene el codón de inicio de metionina) y el cebador UspA2opt delta His, A2opt 1His delta AS, y A2opt 2His delta AS, respectivamente. El fragmento de UspA2 se clonó de acuerdo con los procedimientos convencionales en el vector de expresión pET-26b utilizando los sitios de restricción NdeI / XhoI.
Para generar la construcción MC-005, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el fragmento genético de UspA2 (aminoácidos 30-519 de la cepa ATCC 25238), utilizando el vector MC-001 como una plantilla con los cebadores UspA2Nde opt (que contiene el codón de inicio de metionina), y R delta horquilla A2opt
His. La secuencia de ADN correspondiente al sitio de restricción NdeI se incorporó en el cebador 5' y el sitio de restricción XhoI se incorporó en el cebador 3'. En adición, la secuencia de ADN correspondiente al enlazador de aminoácidos AS y los aminoácidos 6xhis se incorporó en el cebador 3'. El producto generado de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se insertó entonces en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN (una marca registrada en Ee .UU.)).
Para generar la construcción MC-006, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el fragmento genético de UspA2 (aminoácidos 30-519 de la cepa ATCC 25238) usando la construcción MC-005 como una plantilla con los cebadores UspA2Nde opt (que contiene el codón de inicio de metionina), y delta His delta hélice. La secuencia de ADN correspondiente al sitio de restricción NdeI se incorporó en el cebador 5' y el sitio de restricción XhoI se incorporó en el cebador 3'. El producto generado de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) se insertó entonces en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN (una marca registrada en EE.UU.)).
Para generar la construcción MC-007, el fragmento de ADN que codifica para un fragmento genético de UspA2 (aminoácidos 30 a 564 de la cepa ATCC 25238), incluyendo los sitios de restricción NdeI / XhoI, para facilitar la clonación (la metionina de partida es codificada por el sitio NdeI), y la secuencia de ADN correspondiente al enlazador de aminoácidos AS y los aminoácidos 6xhis, se optimizó en los codones y se sintetizó mediante GENEART (una marca registrada en EE.UU.) (plásmido: 1026399). El fragmento de UspA2 se clonó de acuerdo con los procedimientos convencionales en el vector de expresión pET-26b utilizando los sitios de restricción NdeI / XhoI.
Para generar la construcción MC-008, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el fragmento genético de UspA2 (aminoácidos 30-564 de la cepa ATCC 25238), utilizando la construcción MC-007 como una plantilla con los cebadores UspA2Nde opt (que contiene el codón de inicio de metionina), y 2His hélice deltaAS. La secuencia de ADN correspondiente al sitio de restricción NdeI se incorporó en el cebador 5' y el sitio de restricción XhoI se incorporó en el cebador 3'. El producto generado de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) se insertó entonces en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN (una marca registrada en EE.UU.)).
Para generar la construcción MC-009, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el fragmento genético de UspA2 (aminoácidos 31-564 de la cepa ATCC 25238), utilizando el plásmido 1026399 como la plantilla, y los cebadores N-term cyto Abis (que contiene el codón de inicio de metionina), y 2His hélice deltaAS.
La secuencia de ADN correspondiente al sitio de restricción NdeI se incorporó en el cebador 5' incluyendo la supresión de glutamina, y el sitio de restricción XhoI se incorporó en el cebador 3' incluyendo dos residuos de histidina. El producto generado de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se insertó entonces en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN (una marca registrada en e E.UU.)). Se llevó a cabo la secuenciación del ADN de la construcción final para confirmar la secuencia correcta.
Para generar la construcción MC-010, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el fragmento genético de UspA2 (aminoácidos 30-564 de la cepa ATCC 25238), utilizando la construcción MC-00 como una plantilla con los cebadores UspA2 Nde opt (que contiene el codón de inicio de metionina), y cyto hé dHis dAS. La secuencia de ADN correspondiente al sitio de restricción NdeI se incorporó en el cebador 5' y el sitio de restricción XhoI se incorporó en el cebador 3'. El producto generado de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) se insertó entonces en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN (una marca registrada en EE.UU.)).
Para generar la construcción MC-011, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el fragmento genético de UspA2 (aminoácidos 31-540 de la cepa ATCC 25238), utilizando la construcción MC-00 como una plantilla con los cebadores N-term cyto Abis (que contiene el codón de inicio de metionina), y N-term reversa. La secuencia de ADN correspondiente al sitio de restricción NdeI se incorporó en el cebador 5' y el sitio de restricción XhoI se incorporó en el cebador 3'. El producto generado de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) se insertó entonces en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN (una marca registrada en EE.UU.)).
En la Tabla 3 se ilustra una lista detallada de las secuencias de cebadores de la PCR usadas para las amplificaciones. La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo utilizando el kit Expand High Fidelity PCR
System (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La ligación se llevó a cabo utilizando el kit
Rapid DNA Ligation (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Tabla 3: Secuencias de cebadores de PCR utilizadas para las amplificaciones de UspA2
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continuación
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Transformación
Las células BLR (DE3) de Escherichia coli (E. coli), BLR (DE3) modificadas, o B834(DE3), se transformaron con el ADN del plásmido de acuerdo con los procedimientos convencionales con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » En Glover, D. M. (Editor), DNA cloning. IRL Press London. (1985): páginas 109-135.). Brevemente, las células competentes BLR (DE3) se descongelaron suavemente sobre hielo. Se mezclaron aproximadamente 4 pl del plásmido (de 10 a 100 ng) usando 50-100 pl de células competentes. Posteriormente, esta formulación se incubó sobre hielo durante 5 minutos. Para llevar a cabo la reacción de transformación, la formulación se impulsó con calor a 42 °C durante 30 segundos, entonces se incubó sobre hielo durante 2 minutos. Se añadieron aproximadamente 0,5 mililitros del medio SOC (caldo súper óptimo con represión del Catabolito) a las células transformadas y el cultivo celular se incubó a 37 °C durante una hora antes colocarse en placa sobre agar de Luria-Bertani (LB) con 50 pg/ml de kanamicina. Se colocaron en placa alrededor de 150 pl del cultivo celular transformado, y se incubaron durante la noche a 37 °C.
BLR (DE3): BLR es un derivado recA de BL21 (F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3). Esta cepa de E. coli utilizada para la expresión de las proteínas recombinantes mejora los rendimientos monoméricos del plásmido y puede ayudar a estabilizar los plásmidos objeto que contengan secuencias repetitivas o cuyos productos puedan provocar la pérdida del profago DE3 (Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219: 37-44). El genotipo detallado de BLR (DE3) de E.coli ha sido publicado por NOVAGEN (una marca registrada en EE.UU.). (F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm A(srl-recA)306::Tn10 (TetR) (DE3).
B834 (DE3) es la cepa progenitora para BL21. Estos hospedadores son auxótrofos de metionina y permiten el marcado de alta actividad específica de las proteínas objeto con 35S-metionina y selenometionina para la cristalografía. El genotipo detallado de B834 (DE3) de E.coli ha sido publicado por NOVAGEN (una marca registrada en EE.UU.): F- ompThsdSs(rs- me-) gal dcm met (DE3).
BLR (DE3) modificada: Para impedir la (fosfo)-gluconoilación, se insertó el gen Pgl en el locus de biotina localizado en el genoma de BLR (DE3). En adición, para prevenir las sustituciones de Ile-Val, se corrigió la mutación C219Y en el gen de desaminasa de treonina.
Genotipo: (F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm A(srl-recA)306::Tn10 (TetR); A(bioA-bioD)::Pgl; TD (C219Y) (DE3).
Ejemplo 2: Expresión de proteína utilizando un matraz de agitación
Se utilizaron cepas de Escherichia coli transformadas con el plásmido recombinante para inocular 100 ml de caldo LB (Becton, Dickinson and Company) ± 1 % (peso/volumen, p/v) glucosa (Laboratoire MAT, número de catálogo: GR-0101), y 50 pg/mililitro de kanamicina (Sigma). Este pre-cultivo se hizo crecer generalmente durante la noche a 37 °C. Se utilizaron doce ml del pre-cultivo para inocular 500 ml de caldo LB 50 pg/mililitro de kanamicina. Los cultivos se incubaron a 37 °C con agitación de 150 revoluciones por minuto (rpm) para alcanzar una O.D.6 0 0 nm de ~ 0,6.
A una O.D.6 0 0 nm de ~ 0.6, los cultivos de BLR (DE3) se indujeron para la expresión de la proteína recombinante mediante la adición de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranosida 1 mM (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815), y se incubaron durante la noche a 23 °C con agitación a 150 rpm. Después del período de inducción, los cultivos se centrifugaron a 6,370 g durante 20 minutos, y los aglomerados a partir de 350 ml del cultivo se congelaron a -20 °C por separado.
Ejemplo 3: Purificación de proteína utilizando tampón fosfato (construcción MC-001 y construcción MC-011)
Cada aglomerado bacteriano obtenido después de la inducción en el matraz de agitación se volvió a suspender en 30 ml de tampón fosfato de potasio 20 mM (pH de 8.0) que contenía NaCl 10 mM y cóctel inhibidor de proteasa COMPLETE de Roche (una marca registrada en EE.UU.) (1 tableta/50 ml de regulador). La lisis celular se llevó a cabo mediante 3 extracciones en la Prensa francesa (1.400 kg/cm2 ), y la aclaración se llevó a cabo mediante centrifugación durante 30 minutos a 23.700 g. El sobrenadante se cosechó y se filtró a través de 0,22 gm.
Las proteínas marcadas con 6xHis se purificaron mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC), utilizando una columna XK16 y 20 ml resina de NiNTA (Qiagen) previamente equilibrada con tampón fosfato de potasio 20 mM (pH de 8,0) que contenía NaCl 10 mM o tampón PBS a un pH de 8,0, que contenía arginina 500 mM. Los componentes solubles se cargaron hasta 4 ml/minuto (produciendo u “flujo a través de la fracción”). Después de cargarse en la columna, la columna se lavó con 60 ml de tampón fosfato de potasio 20 mM (pH de 8,0) que contenía NaCl 10 mM a una velocidad de 4 ml/minuto, produciendo una “fracción de lavado n.° 1. Se llevó a cabo un segundo lavado utilizando el mismo regulador imidazol 10 mM, produciendo una “fracción de lavado n.° 2. La elución se llevó a cabo utilizando el mismo regulador que contenía imidazol 200 y/o 500 mM.
Las muestras a partir de las fracciones de la elución se analizaron mediante electroforesis en gel de dodecil-sulfato de sodio/poli-acrilamida (SDS-PAGE). Las muestras que contenían la proteína se dializaron contra 5 l de tampón fosfato de potasio 20 mM (pH de 8,0) que contenía NaCl 10 mM. La concentración de proteína se determinó utilizando el procedimiento de Lowry.
Ejemplo 4: P urificación de proteína u tilizando arginina que contenía regulador (MC-001, MC-005 y MC-007) Cada aglomerado bacteriano obtenido después de la inducción en el matraz de agitación (Ejemplo 3) o en el fermentador (Ejemplo 5), se volvió a suspender en 30 ml de tampón PBS arginina 500 mM, pH de 8.0, y cóctel inhibidor de proteasa COMPLETE de Roche (una marca registrada en EE.UU.) (1 tableta/50 ml de regulador). De una manera alternativa, la pasta de células de la fermentación (“ 7 gramos) se volvió a suspender en 90 ml de tampón PBS que contenía arginina 500 mM, pH de 8,0, y cóctel inhibidor de proteasa COMPLETE de Roche (una marca registrada en EE.UU.) (1 tableta/50 ml de regulador).
La lisis celular se llevó a cabo mediante 2 o 3 extracciones en la Prensa francesa (1.400 kg/cm2 ), y la aclaración se llevó a cabo mediante centrifugación durante 30 minutos a 23.700g a 4 °C. El sobrenadante se cosechó y se filtró a través de 0,22 gm. Las proteínas marcadas con 6xHis se purificaron mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC), utilizando una columna XK16 y 80 ml de resina de NiNTA (Qiagen) previamente equilibrada con tampón PBS arginina 500 mM, pH de 8,0 . Los componentes solubles se cargaron hasta 4 ml/minuto (produciendo un “flujo a través de la fracción”). Después de cargarse en la columna, la columna se lavó con el mismo tampón, y luego con tampón fosfato de potasio 20 mM (pH de 8,0) que contenía NaCl 10 mM, a una velocidad de 4 a 6 ml/minuto, produciendo una “fracción de lavado n.° 1”. Se llevó a cabo un segundo lavado utilizando el mismo tampón imidazol 10 mM, produciendo una “fracción de lavado n.° 2”. La elución se llevó a cabo utilizando el mismo tampón imidazol 200 mM o imidazol 500 mM. En frascos de elución adicionales, se añadió EDTA en una concentración final de 5 mM.
Las muestras a partir de las fracciones de la elución se analizaron mediante electroforesis en gel de dodecil-sulfato de sodio/poli-acrilamida (SDS-PAGE). Las muestras que contenían las proteínas se dializaron contra 5 litros de tampón fosfato de potasio 20 mM (pH de 8,0) que contenía NaCl 10 mM y EDTA 5 mM. La concentración de proteína se determinó utilizando el procedimiento de Lowry.
Este protocolo puede usarse con otras proteínas marcadas con 6xHis.
Ejem plo 5: Ferm entación
Se puede emplear el siguiente procedimiento de fermentación:
Las siembras de procesamiento son alícuotas congeladas de cepas derivadas a partir de BLR(DE3) o BLR(DE3) de Escherichia coli transformadas con un derivado de pET26b que contenía una secuencia que codificaba para una construcción de proteína recombinante candidata de antígeno específico.
Se retira una siembra de procesamiento (WS) del almacenamiento congelado, se descongela, y se utiliza para inocular un matraz Erlenmeyer que contiene el medio de pre-cultivo. La manipulación de la siembra y el cultivo del matraz se lleva a cabo asépticamente bajo una campana de flujo de aire laminar (LAF) o un gabinete de seguridad biológica (BSC). El matraz de pre-cultivo se incuba típicamente entre 30 °C - 37 °C bajo una velocidad de agitación de 200 revoluciones por minuto (rpm) durante el tiempo necesario para alcanzar una densidad óptica a 650 nm (OD6 5 0 nm) de entre 1,0 y 3,0, típicamente entre 4 y 6 horas.
Se prepara un fermentador de 20 l mediante un Clean-In-Place, seguido de una secuencia de esterilización automatizada con vapor. El medio de partida se transfiere asépticamente al fermentador. Se conecta asépticamente un frasco llenado con NH4 OH al 25 % con el fermentador para el control automático del pH. El pH inicial del medio de partida se ajusta a un pH objeto mediante la adición de una solución de NH4 OH. Se agrega antiespumante irradiado utilizando una jeringa a través de un septo en la placa frontal. Se conecta asépticamente un frasco llenado con el medio de alimentación al fermentador. La adición de la alimentación se controla ya sea mediante una cascada de pO2 (oxígeno disuelto de control) o bien mediante una curva de alimentación previamente programada. La agitación se controla bien mediante una cascada de pO2 o bien mediante una curva de agitación previamente programada.
Los parámetros iniciales del termentador son típicamente como siguen:
• Temperatura: 28 °C - 32 °C.
• Presión: 0,5 barg (7 psi).
• Velocidad de flujo de aire: 2 VVM (volúmenes del recipiente por minuto).
• pH: Regulado a 6,8 mediante la adición de NH4 OH al 25 %.
Se utiliza una alícuota de este pre-cultivo (típicamente de entre 5 ml y 50 ml) para inocular el medio de partida del termentador mediante adición con jeringa a través de un septo en la placa frontal del termentador. Las fases del cultivo de fermentación son:
• Fase del Lote: La biomasa se acumula utilizando una fuente de carbono en el medio de partida.
• Fase en lotes: El medio de suministro se introduce bien de acuerdo con el control de cascada de pO2 o bien de la curva de alimentación previamente programada. La acumulación de la biomasa continúa sobre la fuente de carbón en el medio de alimentación.
• Fase de inducción: Se induce la expresión del antígeno de la proteína recombinante mediante la adición de una solución de IPTG al cultivo en el fermentador.
En la cosecha, el cultivo se recolecta típicamente en frascos de centrifugación de 1 l y se centrifuga para separar la fracción del aglomerado sólido (pasta celular) a partir de la fracción del sobrenadante líquido. El sobrenadante se desecha, y se registra el peso húmedo de las células (aglomerado sólido), y las bolsas con pasta celular se guardan a -20 °C.
También se puede emplear el siguiente procedimiento:
Pre-cultivo convencional de Escherichia co li
Cada pre-cultivo convencional se preparó utilizando un cultivo de siembra congelado de cepas de Escherichia coli. Estas cepas son cepas de BLR(DE3) transformadas con un derivado de pET26b que contiene una secuencia que codifica para la construcción específica que se vaya a evaluar.
El cultivo de siembra se descongeló a temperatura ambiente, y se utilizaron 400 pl para inocular un matraz Erlenmeyer de 2 l que contenía 400 ml del medio de pre-cultivo (adaptado a partir de Zabriskie y col., (J. Ind. Microbiol. 2: 87-95 (1987)).
El matraz inoculado se incubó entonces a 37 °C (+ 1 °C), y a 200 rpm. El pre-cultivo se detuvo después de 6 horas de incubación. En esta etapa, la densidad óptica a 650 nm (OD6 5 0 nm) es de aproximadamente 2. El pre-cultivo se utilizó para inocular el medio en un fermentador tan pronto como se detuvo el cultivo.
Fermentación en lotes a una escala de 20 l
Procedimiento
Se utilizó un fermentador de 20 l (Biolafitte). Se transfirieron asépticamente nueve litros del medio en la fase del lote, al fermentador. El pH del medio se reajustó a 6,8 con adición de base. También se añadió al fermentador 1 ml de antiespumante irradiado sin diluir (SAG 471). Entonces se ajustaron la temperatura (28 °C), la presión hidrostática (50 kPa), la tasa de aireación (20 l de aire burbujeado por minuto), y la velocidad de agitación inicial (300 rpm), antes de la inoculación. El nivel de oxígeno disuelto en estas condiciones fue del 100 %. La presión hidrostática y la tasa de aireación se mantuvieron en un nivel constante durante la fermentación.
La inoculación se logró mediante la adición de un equivalente de 10 ml a una OD6 5 0 nm = 2 del pre-cultivo (preparado como se describe anteriormente, en el Ejemplo 2) de acuerdo con la siguiente fórmula:
20
Volumen de Precultivo (mí) =
OD650nm Final de Precultivo
Durante la fase en lotes (0-15 horas), la temperatura se mantuvo a 28 °C. El nivel de oxígeno disuelto se estableció en el 20 %. El nivel de oxígeno disuelto (DO) se reguló aumentando la agitación cuando el DO cayó por debajo del 20 %. El agotamiento de glucosa dio como resultado un aumento en el DO y una disminución concomitante en la agitación.
Cuando se agotó la glucosa, la velocidad de alimentación se inició basándose en una señal del pH que aumentaba por encima de 7,0. Desde este punto en adelante, la velocidad de alimentación fue controlada por la demanda de oxígeno, aumentando la velocidad de flujo cuando el oxígeno disuelto tendía a caer por debajo del punto establecido del 20 %. En este paso, la velocidad de alimentación se mantuvo a 900 rpm.
Durante la fase en lotes (antes de la inducción), el pH se mantuvo en 6,8 mediante la adición de base, y la temperatura se reguló a 30 °C.
Se aplicaron dos estrategias para producir la proteína:
Se aplicó la “inducción de alta densidad celular” (HCDI) cuando se inducía el cultivo con IPTG 1 mM (isopropil-beta-D-tiogalacto-piranosida) a una densidad óptica de 80 ± 5, típicamente alcanzada después de 40 horas de cultivo. La temperatura se mantuvo a 28 °C, y la velocidad de alimentación todavía fue controlada por la demanda de oxígeno con una velocidad de agitación constante a 900 rpm.
El proceso de “inducción de baja densidad celular” (LCDI) significa una inducción a una densidad óptica de 40 ± 5 habitualmente alcanzada después de 24 h de cultivo. La temperatura se redujo hasta 30 °C, y se aplicó una velocidad de suministro constante de 0,5 ml/min. Después se añadió IPTG 1 mM al cultivo. En esta etapa, el nivel de oxígeno disuelto (DO) se mantuvo en el 20 % mediante el control de la velocidad de agitación.
Al final de la fase de inducción (72 horas), la pasta celular se recogió mediante centrifugación (6.500 xg, 4 °C durante 1 h), y se almacenó a -20 °C.
Las Figuras 1 y 2 ilustran un perfil de fermentación típico con los procedimientos de inducción de alta densidad celular (HCDI) e inducción de baja densidad celular (LCDI), y los parámetros monitorizados durante la fermentación en lotes a una escala de 20 l.
La Tabla 4 estipula las construcciones evaluadas en el fermentador y el rendimiento de UspA2 obtenido para cada una.
Tabla 4
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La Figura 3 ilustra en una forma gráfica el rendimiento de UspA2 en la Tabla 4 a partir de las construcciones evaluadas en el fermentador.
En esta Figura, el rendimiento de UspA2 es afectado por los restos de histidina presentes en la construcción. (p<0,05, una vía, tres niveles, ANOVA Tipo II). Se observó una correlación positiva entre el número de restos de histidina y el rendimiento de la fermentación de UspA2, con un incremento en el rendimiento mayor que el 400 % entre 0 y 6 restos en las fermentaciones por lotes.
También se observó que un resto de histidina añadido al patrón de media hélice (construcción MC-003) producía un rendimiento de UspA2 de aproximadamente 1 g/l de proteína.
Ejemplo 6: Caracterización de Proteínas
Ultra-centrifugación analítica
Se utiliza ultra-centrifugación analítica para determinar la homogeneidad y la distribución de tamaños en solución de las diferentes especies dentro de una muestra de proteína mediante la medición de la velocidad a la cual se mueven las moléculas en respuesta a una fuerza centrífuga. Esto se basa en el cálculo de los coeficientes de sedimentación de las diferentes especies, que se obtienen mediante el experimento de velocidad de sedimentación, los cuales dependen de su forma y masa molecular.
Las siguientes muestras de proteínas se centrifugaron en un ultra-centrífugo analítico Beckman-Coulter ProteomeLab XL-1 a 28.000 revoluciones por minuto (rpm) después de que se hubiera equilibrado el rotor AN-60Ti a 15 °C.
a. MC-005 lote BMP53, 675 pg/ml en NaPO420mM, NaCl 10 mM, pH de 8,0.
b. MC-001 lote BMP13, 545 pg/ml en NaPO420mM, NaCl 10 mM, pH de 8,0.
c. MC-001 lote BMP14, 545 pg/ml en NaPO420mM, NaCl 10 mM, pH de 8,0.
d. MC-001 lote BMP54, 445 pg/ml en NaPO420mM, NaCl 10 mM, pH de 8,0.
e. MC-007 lote BMP70, 510 pg/ml en NaPO420mM, NaCl 10 mM, pH de 8,0.
Para la recolección de los datos, se registraron de 133 a 325 escaneos a 280 nm cada 5 minutos.
El análisis de datos se llevó a cabo utilizando el programa SEDFIT (disponible a través de los National Institutes for Health (Institutos Nacionales de Salud)) para la determinación de la distribución C(S). La distribución C(S) es una representación de la intensidad relativa de los diferentes componentes en una mezcla de macromoléculas separadas por su coeficiente de sedimentación, que es una función del tamaño y la conformación de la molécula. La determinación del volumen parcial específico de las proteínas a 15 °C se llevó a cabo con el software SEDNTERP a partir de su secuencia de aminoácidos. También se utilizó el SEDNTERP (SEDNTERP es distribuido y soportado a través del Biomolecular Interaction Technologies Center (Centro de Tecnologías de Interacción Biomolecular) en la Universidad de New Hampshire) para determinar la viscosidad y la densidad del tampón a 15 °C.
La determinación de la abundancia relativa de todas las especies se llevó a cabo considerando el área total debajo de la curva de la distribución global como el 100 % de la muestra, y calculando el porcentaje de esta área total representado por la contribución de cada especie. Se utilizó la gráfica de distribución C(S) (coeficiente de concentración contra sedimentación) para ese cálculo, considerando que es una mejor representación de los datos brutos que la distribución C(M) (concentración contra peso molecular).
La ultra-centrifugación analítica de las diferentes construcciones purificadas permitió hacer la observación de que UspA2 Ahélice, UspA2 A hélice y UspA2 hélice completa con la marca His C-terminal, están presentes principalmente como trímeros en solución cuando se agrega L-Arginina 500 mM durante la lisis celular antes de la purificación (Figuras 4, 5, 7 y 8).
Se observó una distribución de tamaños heterogénea para UspA2 'A hélice cuando no se añadió L-arginina durante la lisis celular. Se observaron dos poblaciones mayores. No fue posible confirmar el peso molecular de las especies detectadas por la AUC (ultra-centrifugación analítica) con esta preparación de proteína, debido a que la proporción friccional que es esencial para la estimación del peso molecular se necesita calcular a partir de una muestra homogénea. Sin embargo, basándose en los coeficientes de sedimentación, ninguna de las especies observadas parece corresponder al trímero observado en otras muestras.
La Figura 4 ilustra la distribución de peso molecular de la MC-005 purificada determinada mediante ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación. La mayoría de la proteína se encuentra como un trímero, con una pequeña proporción de un oligómero de peso molecular más alto que puede corresponder al dímero del trímero.
La Figura 5 ilustra la distribución de peso molecular de la MC-001 purificada determinada mediante ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación. La mayoría de la proteína se encuentra como un trímero.
La Figura 6 ilustra la distribución de peso molecular de la MC-001 purificada determinada mediante ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación. La muestra presenta múltiples especies y es altamente polidispersa. El coeficiente de sedimentación de las especies superiores detectadas no corresponde a aquél de los trímeros normalmente detectados en los otros lotes.
La Figura 7 ilustra la distribución de peso molecular de la MC-001 purificada determinada mediante ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación. La mayoría de la proteína se encuentra como un trímero.
La Figura 8 ilustra la distribución de peso molecular de la MC-007 purificada determinada mediante ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación. La mayoría de la proteína se encuentra como un trímero.
Dicroísmo circular/Estructura secundaria
El dicroísmo circular (CD) se utiliza para determinar la composición de la estructura secundaria de una proteína mediante la medición de la diferencia en la absorción de la luz polarizada a la izquierda contra la luz polarizada a la derecha, lo cual se debe a la asimetría estructural. La forma y la magnitud de los espectros del dicroísmo circular (CD) en la región ultravioleta lejano (far-UV) (de 190 a 250 nm) son diferentes si una proteína exhibe una estructura de hoja-beta, de hélice-alfa, o de bobina aleatoria. La abundancia relativa de cada tipo de estructura secundaria en una muestra de proteína dada, puede calcularse mediante una comparación con los espectros de referencia.
Los espectros ultravioleta lejanos (far-UV) se miden utilizando una trayectoria óptica de 0,01 centímetros desde 178 hasta 250 nm, con una resolución de 1 nm y amplitud de banda en un espectropolarímetro Jasco J-720. La temperatura de la célula se mantiene a diferentes temperaturas mediante un bloque de células RTE-111 con termostato Peltier. Se mantiene un flujo de nitrógeno de 10 l/min durante las mediciones.
La concentración de las siguientes construcciones de proteínas se ajustó a 400 pg/ml en un tampón NaPÜ4 20mM, NaCl 10 mM, pH de 8,0.
a. MC-005 lote BMP53, en NaPÜ420mM, NaCl 10 mM, pH de 8,0.
b. MC-001 lote BMP13, en NaPÜ420mM, NaCl 10 mM, pH de 8,0.
c. MC-001 lote BMP14, en NaPO420mM, NaCI 10 mM, pH de 8,0.
d. MC-001 lote BMP54, en NaPO4 20mM, NaCl 10 mM, pH de 8,0.
e. MC-007 lote BMP70, en NaPO4 20mM, NaCl 10 mM, pH de 8,0.
Los cálculos de las estructuras secundarias se hicieron utilizando los siguientes algoritmos:
Selcon 3 (Sreerama y Woody, Anal. Biochem. (1993), 209, 32; Sreerama y Woody, Biochemistry, 33, 10022-25 (1994); Sreerama y col., Protein Science, 8, 370-380 (1999); Johnson W. C. Jr., Proteins: Str. Func. Genet. 35, 307-312 (1999)).
CDSSTR (Johnson W.C. Proteins: Struc. Func. Genet. 35, 307-312 (1999) modificado por Sreerama. N. (Anal. Biochem., 287, 252 (2000)).
Los resultados exhibidos son un promedio del porcentaje calculado con ambos algoritmos y están sujetos a un margen de error del 5 %.
Los resultados de los cálculos de la estructura secundaria para las proteínas expresadas por el fermentador se exhiben en la Tabla 5, considerando un margen de error del 5 %.
Tabla 5: Cálculos de la estructura secundaria a 22 °C
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Los cálculos son compatibles con la forma y el análisis visual de los espectros, en los que el contenido helicoidal se incrementa con la intensidad del mínimo a 208 y 220 nm. Las proteínas están compuestas de una alta proporción de estructuras helicoidales, con la presencia de estructuras beta.
La superposición de los espectros en la Figura 9 no muestra ninguna diferencia significativa en la forma entre las construcciones. Los espectros de MC-005 hélice muestran una intensidad más baja que podría contar para una estructura alfa más baja que es coherente con la ausencia de la hélice C-terminal.
La Figura 9 ilustra los espectros del dicroísmo circular ultravioleta lejano (far-UV) de las construcciones de UspA2 MC-001, MC-005 y MC007, dando una indicación de las estructuras secundarias de la proteína. La superposición de los espectros claramente muestra que las construcciones que contienen hélice C-terminal media y completa, no tienen ninguna diferencia detectable en sus estructuras secundarias, mientras que la construcción sin hélice genera un espectro con una diferencia en la intensidad que podría contar para un contenido diferente de la estructura secundaria.
Despliegue térmico
La medición de los espectros ultravioleta lejanos (far-UV) a diferentes temperaturas durante el despliegue térmico, sugirió que la MC-005 es menos térmicamente estable que la MC-007. Los espectros observados a 33 °C para MC-005 son similares a los espectros típicos de una proteína desplegada. Para la construcción MC-007, incluso si se observa una pérdida parcial de estructuras secundarias a 33 °C, parece presentarse un despliegue completo entre 35 °C y 37 °C. Esto puede ser una indicación de una estabilidad térmica más alta de la hélice completa que contiene la construcción MC-007.
La Figura 10 ilustra la monitorización de las estructuras secundarias mediante dicroísmo circular durante el despliegue térmico de MC-005 (UspA2Ahélice 6His). El análisis visual de los espectros claramente muestra que la proteína pierde la mayor parte de sus estructuras secundarias a 33 °C.
La Figura 11 ilustra la monitorización de las estructuras secundarias mediante dicroísmo circular durante el despliegue térmico de MC-007 (UspA2 hélice 6His). El análisis visual de los espectros muestra que la pérdida de la estructura secundaria es más lenta comparándose con la construcción sin hélice. Los cambios estructurales son detectable después de calentar hasta 33 °C, pero parece presentarse un despliegue completo entre 35 °C y 37 °C.
Despliegue térmico con calorimetría diferencial de barrido (DSC)
Se compararon las transiciones térmicas de diferentes construcciones de UspA2 para evaluar el efecto de las modificaciones de la hélice C-terminal sobre la estabilidad térmica de las proteínas.
El análisis se hizo en un VP-DSC de MicroCal (parte de GE Healthcare). Se utilizó el tampón de NaPO4 20 mM, NaCl 10 mM, EDTA 5 mM, pH de 8, como referencia, y se sustrajo de los barridos. Las proteínas se equilibraron a una temperatura inicial durante 15 minutos antes de elevar la temperatura, y entonces se condujeron los barridos de la DSC desde 10 °C hasta 60 °C a una velocidad de calentamiento de 90 °C/h.
Se detectaron dos transiciones en las construcciones MC-001 y MC-007, y solamente una en MC-005. Los valores de las transiciones (o Tm) de las diferentes construcciones se pueden encontrar en la Tabla 6.
Aunque la Tm más baja de las tres proteínas es de alrededor de 32 °C, la diferencia principal es el valor de la segunda Tm. La construcción que contiene una hélice completa (MC-007) tiene una Tm más alta a 37,5 °C comparándose con 34,5 °C para la media hélice (MC-001).
Se ha demostrado que para MC-001 y MC-007, la primera Tm de alrededor de 32 °C es reversible, mientras que la Tm más alta es irreversible. Para MC-005, la única Tm detectada es irreversible.
Esto puede ser una indicación de una estabilidad térmica más alta de la hélice completa que contiene la construcción MC-007.
Tabla 6: Puntos de fusión de las construcciones de UspA2 medidos mediante DSC
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Espectrometría de masas
Las muestras de proteína UspA2 se prepararon mediante la precipitación de la proteína con el sistema de CHCl3 / metanol (MeOH) / H2 O. El aglomerado de proteína se centrifugó en el fondo del tubo Eppendorf antes de secarse suavemente bajo nitrógeno. El aglomerado seco se disolvió entonces en 2 pl de ácido fórmico puro antes de diluirse con 3 pl de agua ultra-pura y 5 pl de ácido sinapínico. El ácido sinapínico utilizado como matriz para el análisis MALDI-TOF (desorción/ionización de láser asistida por matriz seguida por el analizador de espectrometría del tiempo de vuelo) se prepara en el 50 % de CH3 CN / 50 % de H2 O complementado por ácido trifluoro-acético (TFA) en una concentración final del 0,1 %.
1 microlitro de la muestra la mezcla de matriz se transfirió a un objeto de MALDI de acero inoxidable molido Bruker 384, y se dejó secar para la cristalización a temperatura ambiente y a presión atmosférica (procedimiento de gota secada).
El análisis de espectrometría de masas de UspA2 se llevó a cabo en un espectrómetro de masas Bruker Ultraflex 2 MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) en el modo de ionización positiva y lineal. Las muestras de proteína, co-cristalizadas en la matriz de ácido sinapínico, se irradiaron mediante un dispositivo de láser de haz inteligente. La medición de la masa de la proteína UspA2 intacta se hizo sobre un intervalo de masa de 10.000 a 100.000 Daltons, con un voltaje de aceleración de 25 kVoltios. La atenuación del láser se afinó para obtener la mejor señal de proteína que fuera posible y para evitar cualquier fragmentación así como los fenómenos de sobre­ ionización del fondo. La calibración del espectrómetro de masas se llevó a cabo en el procedimiento externo cerrado con la matriz homóloga y utilizando la mezcla comercial de calibración de proteína Bruker 2, mediante mediciones precisas de los siguientes calibradores: [M+2H]2+ (masa medida mediante el detector de MS en seguida de la adición de dos iones H+ a la proteína durante la ionización) especies de la proteína A a una m/z 22307 Da, [M+H]+ especies de tripsinógeno a una m/z 23982 Da, [M+H]+ especies de la proteína A a una m/z 44613 Da, y [M+H]+ especies de albúmina bovina a una m/z 66431 Da°. Cada espectro presentado resulta a partir de la suma de 500 disparos individuales.
Se analizaron las siguientes muestras:
Construcción MC-001 con los aminoácidos MQAK (SEQ ID NO: 85) en el N terminal producidos en el matraz de agitación, lote opt-01, construcción MC-011 con los aminoácidos MAK en el N terminal producidos en el matraz de agitación, lote BMP37.
En la Tabla 7 y en la Figura 12, se demostró que la proteína MC-001 con los aminoácidos MQAK (SEQ ID NO: 85) en el extremo N-terminal está al menos parcialmente desmetionilada, como se muestra por la masa molecular medida de 57427 Daltons, comparándose con la masa esperada de 57565 Daltons. El otro pico de 57620 Daltons puede representar la proteína no desmetionilada completa, la proteína N-acetilada, u otra población de proteínas modificadas.
La Figura 12 ilustra el espectro MALDI de MC-001 lote opt-01. La masa observada a 57427 Daltons puede ser coherente con la proteína desmetionilada, mientras que el pico a 57620 Daltons podría corresponder a la proteína completa.
Como se muestra en la Tabla 7 y en la Figura 13, la proteína MC-011 con los aminoácidos MAK en el extremo N-terminal dio una mayor población en MALDI-MS que puede corresponder a la proteína desmetionilada, con una masa de 57265 Daltons, comparándose con 57437 Daltons para la masa esperada basándose en la secuencia completa de aminoácidos. Los otros dos picos a 186 Daltons y a 366 Daltons no están cerca de ninguna modificación posterior a la traducción esperada, de modo que no se podrían identificar mediante este experimento.
Tabla 7: Masa molecular de dos construcciones de UspA2 como se mide mediante MALDI-MS. Ambas construcciones tienen una masa principal medida más baja que aquélla esperada a partir de la secuencia de aminoácidos. La masa de la mayor población obtenida con ambas construcciones puede ser coherente con una proteína desmetionilada.
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Secuenciación N-terminal mediante la degradación de Edman
Para evaluar si la optimización de la región N-terminal (optimización de la secuencia de aminoácidos cerca de la metionina N-terminal) conduce a la desmetionilación de la proteína, se hizo la secuenciación N-terminal sobre la construcción MC-011 que llevaba los aminoácidos MAK sobre su extremo N-terminal.
Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE sobre un gel del 4 % al 20 % de poliacrilamida Novex de Invitrogen, antes de transferirse a la membrana de PVDF (difluoruro de poli-vinilideno) Problot. La membrana se tiñó con negro de amida. Entonces se cortó la banda de interés, y se llevó el análisis a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante, utilizando un sistema secuenciador Applied Biosystems Procise. Se llevaron a cabo doce ciclos de la degradación de Edman.
La secuencia de aminoácidos N-terminal obtenida es AKNDITLEDLP (SEQ ID NO: 86), que corresponde al extremo N-terminal de la proteína empezando en el número de aminoácido dos después de la metionina inicial. Esto indica que la proteína madura está principalmente desmetionilada.
Ejemplo 7: Construcción MC-001 de UspA2: Actividad bactericida.
Ensayo bactericida
Se cultivó Moraxella catarrhalis durante la noche en una placa de Petri a 37 °C CO2 al 5 %. Las bacterias se transfirieron a 12 ml de tampón HBSS-BSA (solución salina tamponada de Hank con albúmina de suero bovino al 0,1 %), para obtener una OD62 0 de 0,650. Las muestras de suero se calentaron durante 45 minutos a 56 °C para inactivar el complemento endógeno. Se añadieron diluciones dobles en serie de los sueros en tampón (HBSS-BSA al 0,1 %) sobre una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos (25 pl/pocillo). Posteriormente, se añadieron 50 pl de tampón de SBA a cada pocillo. Entonces se añadieron 25 pl de cepas de Moraxella catarrhalis a 4 x 104 unidades formadoras de colonias (ufc)/ml a los pocillos que contenían suero, y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente se añadieron 25 pl de complemento de conejo bebé recién descongelado diluido a 1/8 en HBSS-BSA al 0,1 % para alcanzar un volumen final de 125 pl. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C con agitación orbital (210 revoluciones por minuto (rpm)). La reacción se interrumpió extendiendo la microplaca sobre hielo durante al menos 5 minutos.
Después de la homogeneización, se añadieron diversas diluciones de la suspensión (una mezcla de bacterias, suero, complemento y tampón, en un volumen de 125 pl, como se analiza en el párrafo anterior) sobre placas de agar de chocolate, y se incubaron durante 24 horas a 37 °C con CO2 al 5 %, y se contaron las colonias de Moraxella catarrhalis.
Se utilizaron ocho pocillos sin muestra de suero como controles bacterianos para determinar el número de colonias de Moraxella catarrhalis por pocillo. Se determinó el número promedio de UFC (unidades formadoras de colonias) de los pocillos de control, y se utilizaron para el cálculo de la actividad aniquiladora para cada muestra de suero. Las titulaciones bactericidas se expresaron en la dilución recíproca de suero que induce una aniquilación del 50 %. Se probaron los anti-sueros anti-UspA2 generados en los ratones, cobayas y conejos contra MC-001 en el ensayo bactericida descrito anteriormente contra 20 diferentes cepas de Moraxella catarrhalis aisladas de diversos tejidos (sangre, esputo, fluidos de nariz y de oído medio) en diversos países (EE.UU., Finlandia, Holanda, Noruega, Suecia).
Como se muestra más adelante, los anticuerpos anti-UspA2 fueron capaces de inducir una aniquilación bactericida cruzada de Moraxella catarrhalis, cualquiera que fuera el porcentaje de homología de la UspA2 expresada por la cepa probada. Más aún, también se demostró una actividad bactericida contra las cepas que solamente expresaban UspA1 o la proteína quimérica UspA2H. Como se esperaba, no se midieron o solamente se midieron titulaciones débiles del anticuerpo bactericida contra los mutantes de eliminación genética doble UspA1 y UspA2.
Tabla 8: Actividad bactericida cruzada de los anticuerpos anti-MC-001 de UspA2 generados en ratón, cobayo y conejo. 1+2 KO es una doble eliminación genética, UspA1 y UspA2. 1KO es una eliminación genética UspA1 solamente. MEF (AOM) = fluido del oído medio (otitis media aguda). “/ “ en la columna de fuente de aislado = no consciente de la fuente de aislado.
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Tabla 9: Expresión de UspA en las cepas de M. catarrhalis de la Tabla 8.
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(continuación)
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Ejemplo 8: Protección en un modelo de ratón de colonización pulm onar (MC-001)
Los ratones Balb/c hembras de cinco semanas de edad (n = 8/5 grupos) se inmunizaron por la vía intramuscular en los días 0, 14 y 28 con 50 pl de la vacuna que contenía 10 pg de la construcción MC-001 de UspA2 formulada dentro de AS02V. Los ratones se estimularon intranasalmente en el día 42 con 5 x 105 UFC de diversas cepas de Moraxella catarrhalis. Se contaron las bacterias en los pulmones recolectados a las 0, 3 y 6 horas después del estímulo. Se analizaron las diferencias entre los grupos utilizando la prueba de Dunnet.
Como se resume en la Tabla 10, la construcción MC-001 de UspA2 indujo una protección significativa contra las cepas tanto homólogas como heterólogas, incluyendo la cepa 43617 que sí expresa UspA1 pero no UspA2, y la cepa BBH18 que expresa la proteína quimérica UspA2H (constituida por la secuencia N-terminal de UspA1 y la secuencia C-terminal de UspA2).
Tabla 10: Efectividad protectora de la construcción MC-001 de UspA2.
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Ejemplo 9: Construcción MC-007 de UspA2: Actividad bactericida del anticuerpo.
Ensayo bactericida
Se cultivó Moraxella catarrhalis 25238 durante la noche en una placa de Petri a 37 °C CO2 al 5 %. Las bacterias se transfirieron a 12 ml del tampón de HBSS-BSA al 0,1 % para obtener una OD6 20 de 0,650. Las muestras de suero se calentaron durante 45 minutos a 56 °C para inactivar el complemento endógeno. Se añadieron diluciones dobles en serie del suero en tampón de SBA (HBSS-BSA al 0,1 %) sobre una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos (25 pl/pocillo). Posteriormente, se añadieron a cada pocillo 50 pl de tampón de SBA. Entonces se añadieron 25 pl de la cepa 25238 de Moraxella catarrhalis a 4 x 104 ufc/ml a los pocillos que contenían suero, y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 25 pl de complemento de conejo bebé recién descongelado diluido a 1/8 en HBSS-BSA al 0,1 % para alcanzar un volumen final de 125 pl. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C con agitación orbital (210 revoluciones por minuto (rpm)). La reacción se interrumpió extendiendo la microplaca sobre hielo durante al menos 5 minutos. Después de la homogeneización, se añadieron diversas diluciones de la suspensión a placas de agar de chocolate, y se incubaron durante 24 horas a 37 °C con CO2 al 5 %, y se contaron las colonias de Moraxella. Se utilizaron ocho pocillos sin muestra de suero como controles bacterianos para determinar el número de colonias de Moraxella catarrhalis por pocillo. Se determinó el número promedio de unidades formadoras de colonias (UFC) de los pocillos de control, y se utilizó para el cálculo de la actividad aniquiladora para cada muestra de suero. Las titulaciones bactericidas se expresaron en la dilución recíproca de suero que indujo una aniquilación del 50 %.
Se probaron los anti-sueros anti-UspA2 generados en los ratones con la construcción MC-001 o MC-007 de UspA2 en un ensayo bactericida utilizando el protocolo descrito anteriormente contra la cepa homóloga de Moraxella catarrhalis 25238.
Como se muestra en la Tabla 11, la construcción MC-007 de UspA2 provocó una alta respuesta bactericida, similar a aquélla inducida por la MC-001.
Tabla 11: Actividad bactericida de los anticuerpos anti-MC-001 y -MC-007 de UspA2. Suero normal de ratón = suero a partir de ratones inmunizados con AS02V solamente, no con UspA2.
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Ejemplo 10: Construcción MC-007 de UspA2: Efectividad protectora en un modelo de estímulo de pulmón Protección en un modelo de colonización pulmonar de ratón
Los ratones Balb/c de cinco semanas de edad (8 ratones por grupo, 5 grupos máximo por punto del tiempo) se inmunizaron por la vía intramuscular en los días 0, 14 y 28 con 50 pl de la vacuna que contenía 10 pg de la construcción MC-001 de UspA2 formulada con AS02V, o de la MC-007 formulada dentro de AS02V. Los ratones se estimularon intranasalmente en el día 42 con 5 x 105 UFC de la cepa de Moraxella catarrhalis ATCC 25238™ (una marca registrada en EE.UU.). Los ratones se inmunizaron con 10 pg de células enteras muertas de la cepa de Moraxella catarrhalis cepa ATCC 25238™ (una marca registrada en EE.UU.) (como un control positivo) (M.cat. WC 25238, en la Figura 14) o con AS02V solo (como el control negativo). Las bacterias se contaron en los pulmones recolectados a las 0, 3 y 6 horas después del estímulo. Las diferencias entre los grupos se analizaron utilizando la prueba de Dunnet.
Como se muestra en la Figura 14, ambas construcciones de UspA2 fueron similarmente protectoras contra la cepa ATCC 25238™ (una marca registrada en EE.UU.).
Ejemplo 11: Inmunogenicidad de las formulaciones de proteína MC-009 de UspA2 en ratones
Los grupos de 25 ratones Balb/c hembras se inmunizaron por la vía intramuscular (IM) en los días 0, 14 y 28 con 50 pl de las siguientes formulaciones:
- MC-009 (1 |jg) AIPO4 (1,000 jg/ml).
- MC-009 (1 jg ) AS04C (AIPO4/MPL, 100/100 por ml).
- MC-009 (1 jg ) AS01E (QS21/MPL, 50/50 por ml).
Los niveles anti-IgG se determinaron en los sueros individuales recolectados en los días 28 (PII) y 42 (PIII), utilizando el siguiente protocolo:
ELISA para medir los anticuerpos anti-UspA2.
Las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C con 100 μl por pocillo de la construcción MC-009 de UspA2 a 4 jg/ml en tampón de carbonato, pH de 9,6. Las placas se lavaron tres veces con NaCl al 0,09 % y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) 20 (polisorbato 20) al 0,05 %. Después de lavar, se añadieron a los micro-pocillos diluciones dobles en serie del suero, en suero regulado con fosfato (PBS) y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) 20 al 0,05 %. Las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Después de lavar se añadieron los anticuerpos IgG anti-ratón (Jackson 115-035-003) conjugados con peroxidasa (100 μl por pocillo), y las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Las placas se lavaron como anteriormente, y se añadieron la solución de revelado (4 mg de OPDA Sigma P8787), y 5 μl de H2 O2 en 10 ml de citrato 0,1 M PH (pH de 4,5) a cada pocillo (100 jl/pocillo) durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 μl de HCl 1N, y se leyó la absorbencia a 490 nm (620 nm para el filtro de referencia).
Los títulos se calcularon mediante el procedimiento de 4 parámetros utilizando el software SOFTMAX (una marca registrada en EE.UU.) Pro.
Como se muestra en la Figura 15, UspA2 indujo altos niveles de anticuerpos con cada formulación adyuvante. Ensayo bactericida
El ensayo bactericida se llevó a cabo contra la cepa de M. catarrhalis (ATCC 25238™ (una marca registrada en EE.UU.)) que expresaba UspA2 homóloga de longitud completa, utilizando el siguiente protocolo: La cepa de Moraxella catarrhalis ATCC 25238™ (una marca registrada en EE.UU.) se cultivó durante la noche en una placa de Petri a 37 °C CO2 al 5 %. Las bacterias se transfirieron a 10 ml de BHi (infusión de caldo de corazón) para obtener una OD6 20 de 0,650. Las muestras de suero se calentaron durante 45 minutos a 56 °C para inactivar el complemento endógeno. Se añadieron diluciones dobles en serie del suero en tampón de SBA (HBSS-BSA al 0,1 %) sobre una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos (25 μl/pocillo). Posteriormente, se añadieron 50 μl de tampón de SBA a cada pocillo. Entonces se añadieron 25 μl de la cepa 25238™ de Moraxella catarrhalis a 4 x 103 ufc/ml a los pocillos que contenían suero, y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente se añadieron 25 μl de complemento de conejo bebé recién descongelado diluido a 1/8 en HBSS-BSA al 0,1 % para alcanzar un volumen final de 125 jl. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C con agitación orbital (210 revoluciones por minuto (rpm)). La reacción se interrumpió extendiendo la microplaca sobre hielo durante al menos 5 minutos. Entonces se transfirió una alícuota de 20 μl de cada pocillo de la placa al pocillo correspondiente de una microplaca de fondo plano de 96 pocillos, y se añadieron 50 μl de agar de caldo de Mueller Hinton al 0,9 % a cada pocillo. Se añadieron 50 μl de agar PBS al 0,9 % como una segunda capa. Después de 3 horas a 37 °C con CO2 al 5 %, las placas se incubaron durante la noche a 25 °C, se contaron las colonias de Moraxella utilizando un sistema de análisis de imágenes automatizado (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Alemania). Se utilizaron ocho pocillos sin muestra de suero como controles bacterianos para determinar el número de Moraxella por pocillo. Se determinó el número promedio de UFC de los pocillos de control, y se utilizó para el cálculo de la actividad aniquiladora para cada muestra de suero. Las titulaciones bactericidas se expresaron en la dilución recíproca de suero que indujo una aniquilación del 50 %.
La Figura 16 ilustra las titulaciones bactericidas inducidas por UspA2 contra una cepa homóloga. En este experimento, UspA2 indujo altos niveles de anticuerpos bactericidas para cada formulación adyuvante. Los sueros se probaron en PIII; se probaron cinco reservas de cinco muestras de suero.
Ejemplo 12: Inmunogenicidad de UspA2 en combinación con los antígenos PD y PE-PilA de NTHi.
Protocolo de inmunización
Los grupos de 25 ratones Balb/c hembras se inmunizaron por la vía intramuscular (IM) en los días 0, 14 y 28 con 50 μl de las siguientes formulaciones:
- Construcción MC-009 de UspA2 (1 jg ) AlPO4.
- Construcción MC-009 de UspA2 (1 jg ) AS04C.
- Construcción MC-009 de UspA2 (1 jg ) AS01E.
- UspA2-PD-PEPilA (construcción MC-009 de UspA2, construcción LVL-735 de PEPilA) AlPO4 (1 jg de cada uno de UspA2, PD y PEPilA; 1,000 mg/ml de AlPO4).
- UspA2-PD-PEPilA (construcción MC-009 de UspA2, construcción LVL-735 de PEPilA) AS04C AIPO4 (1 pg de cada uno de UspA2, PD y PEPilA; 100/100 por ml de AIPO4/MPL).
- UspA2-PD-PEPilA (construcción MC-009 de UspA2, construcción LVL-735 de PEPilA) AS01E (1 pg de cada uno de UspA2, PD y PEPilA; 50/50 por ml de QS21/MPL).
ELISA para medir los anticuerpos anti-UspA2
Se determinaron los niveles de IgG anti-UspA2 en los sueros individuales recolectados en los días 28 y 42 utilizando el siguiente protocolo.
Las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C con 100 pl por pocillo de la construcción MC-009 de UspA2 a 4 pg/ml en tampón de carbonato, pH de 9,6. Las placas se lavaron tres veces con NaCl al 0,09 % y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) 20 (polisorbato 20) al 0,05 %. Después de lavar, se añadieron diluciones dobles en serie del suero a los micro-pocillos en suero regulado con fosfato (PBS) y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) 20 al 0,05 %. Las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Después de lavar, se añadieron anticuerpos de IgG anti-ratón (Jackson 115-035-003) conjugados con peroxidasa (100 pl por pocillo), y las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Las placas se lavaron como anteriormente, y se añadieron la solución de revelado (4 mg de OPDA Sigma P8787), y 5 pl de H2 O2 en 10 ml de citrato 0,1 M PH (pH de 4,5) a cada pocillo (100 pl/pocillo) durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 pl de HCl 1N, y la absorbencia se leyó a 490 nm (620 nm para el filtro de referencia). Los títulos se calcularon mediante el procedimiento de 4 parámetros utilizando el software SOFTMAX (una marca registrada en EE.UU.) Pro.
ELISA para medir los anticuerpos anti-PE
Las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C con 100 pl por pocillo de 2 pg/ml de UspA2 en tampón de carbonato, pH de 9,6. Las placas se lavaron tres veces con NaCl al 0,09 % y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) al 0,05 %. Después de lavar, se añadieron diluciones dobles en serie del suero a los micro-pocillos en PBS y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) 20 al 0,05 %. Las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Después de lavar, se añadieron los anticuerpos de IgG anti-ratón (Jackson 115-035-003) conjugados con peroxidasa (100 pl por pocillo), y las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Las placas se lavaron como anteriormente, y se añadieron la solución de revelado (4 mg de OPDA), y 5 pl de H2 O2 en 10 ml de citrato 0,1 M PH (pH de 4,5) a cada pocillo (100 pl/pocillo) durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 pl de HCl 1N, y la absorbencia se leyó a 490 nm (620 nm para el filtro de referencia).
Los títulos se calcularon mediante el procedimiento de 4 parámetros utilizando el software SOFTMAX (una marca registrada en EE.UU.) Pro.
ELISA para medir los anticuerpos anti-PilA
Las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C con 100 pl por pocillo de 4 pg/ml de PilA en tampón de carbonato, pH de 9,6, Las placas se lavaron tres veces con NaCl al 0,09 % y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) al 0,05 %. Después de lavar, se añadieron diluciones dobles en serie del suero a los micro-pocillos en suero regulado con fosfato (PBS) y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) 20 al 0,05 %. Las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Después de lavar, se añadieron los anticuerpos de IgG anti-ratón (Jackson 115-035-003) conjugados con peroxidasa (100 pl por pocillo), y las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Las placas se lavaron como anteriormente, y se añadieron la solución de revelado (4 mg de OPDA), y 5 pl de H2 O2 en 10 ml de citrato 0,1 M PH (pH de 4,5) a cada pocillo (100 pl/pocillo) durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 pl de HCl 1N, y la absorbencia se leyó a 490 nm (620 nm para el filtro de referencia).
Los títulos se calcularon mediante el procedimiento de 4 parámetros utilizando el software SOFTMAX (una marca registrada en EE.UU.) Pro.
ELISA para medir los anticuerpos anti-PD
Las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C con 100 pl por pocillo de 8 pg/ml de PD en tampón de carbonato, pH de 9,6, Las placas se lavaron tres veces con NaCl al 0,09 % y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) al 0,05 %. Después de lavar, se añadieron diluciones dobles en serie del suero a los micro-pocillos en suero regulado con fosfato (PBS) y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) 20 al 0,05 %. Las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Después de lavar, se añadieron los anticuerpos de IgG anti-ratón (Jackson 115-035-003) conjugados con peroxidasa (100 pl por pocillo), y las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Las placas se lavaron como anteriormente, y se añadieron la solución de revelado (4 mg de OPDA), y 5 pl de H2 O2 en 10 ml de citrato 0,1 M PH (pH de 4,5) a cada pocillo (100 pl/pocillo) durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 pl de HCl 1N, y la absorbencia se leyó a 490 nm (620 nm para el filtro de referencia).
Los títulos se calcularon mediante el procedimiento de 4 parámetros utilizando el software SOFTMAX (una marca registrada en EE.UU.) Pro.
Ensayo bactericida
Los títulos bactericidas se midieron en los sueros reservados (5 reservas / grupo) recolectados en el día 42 utilizando el siguiente protocolo:
Se cultivó Moraxella catarrhalis durante la noche en una placa de Petri a 37 °C CO2 al 5 %. Las bacterias se transfirieron a 10 ml del medio BHi (infusión de caldo de corazón) para obtener una OD6 20 de 0,650. Las muestras de suero se calentaron durante 45 minutos a 56 °C para inactivar el complemento endógeno. Se añadieron diluciones dobles en serie del suero en tampón de SBA (HBSS-BSA al 0,1 %) sobre una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos (25 pl/pocillo). Posteriormente, se añadieron 50 pl de tampón de SBA a cada pocillo. Entonces se añadieron 25 pl de la cepa 25238 de Moraxella catarrhalis a 4 x 103 unidades formadoras de colonias (ufc)/ml a los pocillos que contenían suero, y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente se añadieron 25 pl de complemento de conejo bebé recién descongelado diluido a 1/8 en HBSS-BSA al 0,1 %, para alcanzar un volumen final de 125 pl. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C con agitación orbital (210 revoluciones por minuto (rpm)). La reacción se interrumpió extendiendo la microplaca sobre hielo durante al menos 5 minutos. Entonces se transfirió una alícuota de 20 pl de cada pocillo de la placa al pocillo correspondiente de una microplaca de fondo plano de 96 pocillos, y se añadieron 50 pl de agar de caldo de Mueller Hinton al 0,9 % a cada pocillo. Se añadieron 50 pl de agar de suero regulado con fosfato (PBS) al 0,9 % como una segunda capa. Después de 3 horas a 37 °C con CO2 al 5 %, las placas se incubaron durante la noche a 25 °C. Las colonias de Moraxella se contaron utilizando un sistema de análisis de imágenes automatizado (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Alemania). Se utilizaron ocho pocillos sin muestra de suero como controles bacterianos para determinar el número de Moraxella por pocillo. Se determinó el número promedio de UFC de los pocillos de control, y se utilizó para el cálculo de la actividad aniquiladora para cada muestra de suero. Las titulaciones bactericidas se expresaron en la dilución recíproca de suero que indujo una aniquilación del 50 %.
El ensayo bactericida se llevó a cabo contra la cepa 25238™ de Moraxella catarrhalis, que expresa una UspA2 homóloga.
Se observó un impacto negativo de la presencia de los antígenos de PD y PE-PilA sobre los niveles de IgG de UspA2 en las formulaciones AS04C (post III) y AS01E (post II) (Figura 17). Sin embargo, el impacto siguió siendo limitado (disminución de anticuerpos < 2 veces), y no se confirmó en el ensayo bactericida (Figura 18). Las respuestas de IgG inducidas contra PD, PE y PilA en los ratones mediante la vacuna de PE-PEPilA-UspA2 se muestran en la Figura 19, Figura 20 y Figura 21, respectivamente.
Por consiguiente, UspA2 fue inmunogénica cuando se combinó con PD y PE-PilA.
Ejemplo 13: Construcción MC-009 de UspA2: Inmunogenicidad de antígenos PD y PE-PilA de NTHi en combinación con UspA2 en ratones
Protocolo de inmunización
Los grupos de 25 ratones Balb/c hembras se inmunizaron por la vía intramuscular (IM) en los días 0, 14 y 28 con 50 pl de las siguientes formulaciones:
- PD-PEPilA (1 pg de PD y 1 pg de la construcción LVL-735 de PEPilA la) AS01E.
- UspA2-PD-PEPilA (1 pg de la construcción MC-009 de UspA2, y de la construcción LVL-735PD de PEPilA) AS01E.
Se determinaron los niveles de IgG en ELISA para PD, PE y PilA en los sueros individuales recolectados en los días 28 (PII) y 42 (PIII).
ELISA para medir los anticuerpos anti-PE
Las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C con 100 pl por pocillo de 2 pg/ml de UspA2 en tampón de carbonato, pH de 9,6. Las placas se lavaron tres veces con NaCl al 0,09 % y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) al 0,05 %. Después de lavar, se añadieron diluciones dobles en serie del suero a los micro-pocillos en suero regulado con fosfato (PBS) y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) 20 al 0,05 %. Las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Después de lavar, se añadieron los anticuerpos de IgG anti-ratón (Jackson 115-035-003) conjugados con peroxidasa (100 pl por pocillo), y las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Las placas se lavaron como anteriormente, y se añadieron la solución de revelado (4 mg de OPDA), y 5 pl de H2 O2 en 10 ml de citrato 0,1 M PH (pH de 4,5) a cada pocillo (100 pl/pocillo) durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 pl de HCl 1N, y la absorbencia se leyó a 490 nm (620 nm para el filtro de referencia).
Los títulos se calcularon mediante el procedimiento de 4 parámetros utilizando el software SOFTMAX (una marca registrada en EE.UU.) Pro.
ELISA para medir los anticuerpos anti-PilA
Las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C con 100 pl por pocillo de 4 pg/ml de PilA en tampón de carbonato, pH de 9,6. Las placas se lavaron tres veces con NaCI al 0,09 % y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) al 0,05 %. Después de lavar, se añadieron diluciones dobles en serie del suero a los micro-pocillos en suero regulado con fosfato (PBS) y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) 20 al 0,05 %. Las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Después de lavar, se añadieron los anticuerpos de IgG anti-ratón (Jackson 115-035-003) conjugados con peroxidasa (100 pl por pocillo), y las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Las placas se lavaron como anteriormente, y se añadieron la solución de revelado (4 mg de OPDA), y 5 pl de H2 O2 en 10 ml de citrato 0,1 M PH (pH de 4,5) a cada pocillo (100 pl/pocillo) durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 pl de HCl 1N, y la absorbencia se leyó a 490 nm (620 nm para el filtro de referencia).
Los títulos se calcularon mediante el procedimiento de 4 parámetros utilizando el software SOFTMAX (una marca registrada en EE.UU.) Pro.
ELISA para medir los anticuerpos anti-PD
Las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C con 100 pl por pocillo de 8 pg/ml de PD en tampón de carbonato, pH de 9,6. Las placas se lavaron tres veces con NaCl al 0,09 % y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) al 0,05 %. Después de lavar, se añadieron diluciones dobles en serie del suero a los micro-pocillos en suero regulado con fosfato (PBS) y TWEEN (una marca registrada en EE.UU.) 20 al 0,05 %. Las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Después de lavar, se añadieron los anticuerpos de IgG anti-ratón (Jackson 115-035-003) conjugados con peroxidasa (100 pl por pocillo), y las placas se colocaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Las placas se lavaron como anteriormente, y se añadieron la solución de revelado (4 mg de OPDA), y 5 pl de H2 O2 en 10 ml de citrato 0,1 M PH (pH de 4,5) a cada pocillo (100 pl/pocillo) durante 15 minutos en la oscuridad. La reacción se interrumpió mediante la adición de 50 pl de HCl 1N, y la absorbencia se leyó a 490 nm (620 nm para el filtro de referencia).
Los títulos se calcularon mediante el procedimiento de 4 parámetros utilizando el software SOFTMAX (una marca registrada en EE.UU.) Pro.
No se observó mayor impacto de la adición de UspA2 sobre la inmunogenicidad de PD y PEPilA en AS01E, como se muestra en las Figuras 22, 23 y 24.
Ejemplo 14: Seguridad de una formulación de vacuna tetravalente que contiene UspA2 en un modelo de ratón de inflamación pulmonar por M oraxella catarrhalis.
Para reducir el riesgo de inducir respuestas inflamatorias indeseables en los pulmones de los pacientes con EPOC después de la inmunización con una vacuna candidata que tenga como objeto prevenir las exacerbaciones debidas a Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) y Moraxella catarrhalis (M. cat.), se desarrollaron diversos modelos animales y se utilizaron para evaluar la seguridad de esta vacuna. La formulación probada contenía tres antígenos de NTHi (PD, PE y PilA, con los dos últimos combinados como una proteína de fusión PEPilA), un antígeno de M. cat. (UspA2), y el sistema adyuvante 01e (AS01E).
Dos modelos fueron particularmente dedicados para evaluar la seguridad del componente de UspA2 de la vacuna.
Modelo 1:
• Objeto
Este modelo tuvo como objeto evaluar la posible inducción de respuestas inmunitarias indeseables en los pulmones inflamados después de la vacunación.
• Diseño del estudio
Los ratones C57Bl/6 se sensibilizaron mediante tres administraciones intranasales de 25 pg de células enteras la cepa de M. cat. ATCC 25238™ (una marca registrada en EE.UU.) inactivada por calor (que expresan una UspA2 que es 100 % homóloga a la vacuna UspA2) en los días 0, 7 y 14. Este tratamiento indujo en los pulmones una inflamación perivascular y peribronquiolar (con formación de aglomerados linfoides), alveolitis, neumonitis, fibrosis y una fuerte respuesta de células-T CD4+ IL-17+ específica de células enteras de M.cat., que juntos imitaban el proceso inflamatorio observado en los pulmones de los pacientes con EPOC (excepto enfisema).
Los ratones entonces se vacunaron en el día 42 por la vía intramuscular con 1/10 de la dosis humana de las siguientes formulaciones:
- PD, 10 pg/PEPilA (construcción LVL735, descrita en el documento WO2012/139225), 10 pg/UspA2 (construcción MC009), 10 pg/AS0%
- PD, 10 pg/ PEPilA (construcción LVL735), 10 pg/UspA2 (construcción MC009), 3,3 pg/AS0%
- AS01e (control negativo).
- PBS (control negativo).
Para evaluar el impacto de estas formulaciones sobre la inflamación pulmonar inducida por la sensibilización: - Los ratones se monitorizaron diariamente desde el día 43 hasta el día 49 para observar la mortalidad y cualesquiera signos clínicos que indicaran la inducción de eventos adversos (postración, piloerección, posición encorvada).
- Se llevó a cabo un análisis histológico de los pulmones en los días 2, 7 y 14 después de la vacunación (con 5 ratones por grupo y punto del tiempo) para observar un posible agravamiento de la inflamación.
- Se evaluó la inducción de respuestas potencialmente indeseables de células-T en las reservas de pulmones recolectados en los días 7 y 14 después de la vacunación (con 4 reservas/ grupo/punto del tiempo y los pulmones de 3 ratones por reserva). Las células-T de pulmón se volvieron a estimular durante la noche ya sea con los péptidos de UspA2, las células enteras (WC) de M. cat. inactivadas por calor, o el medio (como un control negativo), y entonces se analizaron mediante citometría de flujo para la expresión de CD5, CD4, CD8, IL-17, IL-13, TNFa e IFNy.
• Resultados
- No se informó mortalidad o evento adverso.
- Histología de pulmón (Figuras 25 a 29):
o Las alteraciones observadas en los pulmones fueron similares en gravedad en todos los grupos, y se caracterizaron por infiltrados de células mononucleares perivasculares/bronquiolares ligeros a moderados. o No se observó alveolitis y/o neumonitis relacionada con la vacunación.
- Respuesta de células-T:
o Se midieron fuertes respuestas de células-T CD4+ (principalmente células productoras de IL-17 y TNFa) en los pulmones después de la re-estimulación con células enteras (WC), pero independientemente de la formulación administrada (vacunas o adyuvante solo o PBS) (Figuras 30 a 33). Se observaron bajas respuestas de células-T CD8+ en pulmón, o ninguna respuesta (no se muestran los datos).
o Los péptidos de UspA2 no re-estimularon ninguna respuesta de células-T detectable, cualquiera que fuera el grupo, indicando que no se inició ni se reforzó ninguna respuesta específica de UspA2 después de la vacunación (no se muestran los datos).
Modelo 2:
• Objeto
Este modelo tuvo como objeto evaluar la posible inducción de respuestas inmunitarias indeseables en los pulmones inflamados después de la vacunación y el estímulo con M. cat.
• Diseño del estudio
Los ratones C57Bl/6 fueron sucesivamente:
- sensibilizados mediante tres administraciones intra-nasales de 25 pg de células enteras (WC) de la cepa 25238 de M. cat. inactivada por calor (que expresan una UspA2 que es 100 % homóloga a la vacuna de UspA2) en los días 0, 7 y 14 (como en el Modelo 1).
- vacunados en el día 42 por la vía intramuscular con 1/10 de la dosis humana de las siguientes formulaciones (como en el Modelo 1):
• PD, 10 pg/PEPilA (construcción LVL735), 10 pg/UspA2 (construcción MC009), 10 pg/AS01e;
• PD, 10 pg/PEPilA (construcción LVL735), 10 pg/UspA2 (construcción MC009), 3,3 pg/AS01e;
• AS01e (control negativo);
• PBS (control negativo);
- estimulados mediante una administración intranasal de 25 pg de células enteras (WC) de la cepa F10 de M. cat.
inactivada por calor (que expresan una UspA2 que comparte el 53 % de homología con la vacuna de UspA2), o mediante una administración intranasal de suero regulado con fosfato como un control, ambas en el día 56. La cepa de estímulo fue diferente de la cepa de sensibilización para imitar la situación observada en los pacientes con EPOC que experimentan nuevas exacerbaciones debido a las cepas de M. cat. recién adquiridas.
Para evaluar el impacto de la vacunación y el estímulo sobre la inflamación pulmonar inducida por la sensibilización:
- Los ratones se monitorizaron diariamente a partir del día 43 hasta el día 63 para observar la mortalidad y cualesquiera signos clínicos que indicaran la inducción de eventos adversos (postración, piloerección, posición encorvada).
- Se evaluó la inducción de las respuestas de células-T potencialmente indeseables sobre las reservas de pulmones recolectados en los días 7 y 14 después del estímulo (con 4 reservas/grupo/punto del tiempo, y los pulmones de 3 ratones por reserva). Las células-T de pulmón se volvieron a estimular durante la noche ya sea con péptidos de UspA2, células enteras (WC) F10 de M. cat. inactivadas por calor, o el medio (como un control

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína que consiste en la fórmula I:
A-(Ri)m-(B)n (fórmula I)
en la que:
A es un fragmento inmunogénico de UspA2 de Moraxella catarrhalis que tiene al menos un 90 % de identidad con SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43;
R1 es un aminoácido;
m es 0 o 2;
B es histidina; y
n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
2. La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en la que (R1 )m es AS (alanina serina).
3. Una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que comprende además una metionina en el amino terminal.
4. La proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que A es un fragmento inmunogénico de UspA2 seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 30-540 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 39), aminoácidos 31-540 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 40), aminoácidos 30-519 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 41), aminoácidos 30-564 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 42) y aminoácidos 31-564 de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 43).
5. La proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que A es un fragmento inmunogénico de UspA2 de SEQ ID NO: 43 o una secuencia que tiene al menos el 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 43.
6. La proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la proteína se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 88.
7. La proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la proteína es la SEQ ID NO: 69 (MC-009).
8. Una composición inmunogénica que comprende una proteína de fórmula (I) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. La composición inmunogénica de la reivindicación 8, que comprende además al menos un antígeno de Haemophilus influenzae, opcionalmente la Proteína D.
10. La composición inmunogénica de la reivindicación 8-9, que comprende además los antígenos de Haemophilus influenzae, Proteína E, PilA o la Proteína E y PilA como una proteína de fusión.
11. Una vacuna que comprende la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o la composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 8-10, y opcionalmente que comprende además un adyuvante, opcionalmente AS01E.
12. La vacuna de la reivindicación 11, en la que la composición inmunogénica contiene una proteína de la SEQ ID NO: 69, la Proteína D y una proteína de fusión PE-PilA, opcionalmente LVL-735.
13. La proteína de las reivindicaciones 1-7, o la composición inmunogénica de las reivindicaciones 8-10, o la vacuna de las reivindicaciones 11-12, para su uso en el tratamiento o en la prevención otitis media, neumonía, o infección por M. catarrhalis.
14. La proteína de las reivindicaciones 1-7, o la composición inmunogénica de las reivindicaciones 8-10, o la vacuna de las reivindicaciones 11-12, para su uso en el tratamiento o en la prevención de las exacerbaciones agudas de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EAEPOC).
15. Un procedimiento para preparar la composición inmunogénica de las reivindicaciones 8-10 o la vacuna de las reivindicaciones 11 y 12, que comprende combinar una proteína de fórmula (I) con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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