EA034352B1 - Конструкции белка uspa2 и их применения - Google Patents

Конструкции белка uspa2 и их применения Download PDF

Info

Publication number
EA034352B1
EA034352B1 EA201691611A EA201691611A EA034352B1 EA 034352 B1 EA034352 B1 EA 034352B1 EA 201691611 A EA201691611 A EA 201691611A EA 201691611 A EA201691611 A EA 201691611A EA 034352 B1 EA034352 B1 EA 034352B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
protein
uspa2
immunogenic composition
amino acids
Prior art date
Application number
EA201691611A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201691611A1 (ru
Inventor
Норман Бле
Синди Кастадо
Патрик Шоме
Марьянн Девершен
Original Assignee
Глэксосмитклайн Байолоджикалз Са
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Глэксосмитклайн Байолоджикалз Са filed Critical Глэксосмитклайн Байолоджикалз Са
Publication of EA201691611A1 publication Critical patent/EA201691611A1/ru
Publication of EA034352B1 publication Critical patent/EA034352B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C07K14/212—Moraxellaceae, e.g. Acinetobacter, Moraxella, Oligella, Psychrobacter
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
    • A61K39/1045—Moraxella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к композициям, содержащим убиквитарный поверхностный белок А2 (UspA2) Moraxella catarrhalis (M. catarrhalis). Более конкретно, настоящее изобретение относится к белковым конструкциям UspA2 и иммуногенным композициям, содержащим конструкции, к вакцинам, содержащим такие иммуногенные композиции, и к их терапевтическим применениям. Кроме того, изобретение относится к композициям, содержащим UspA2 в комбинации по меньшей мере с одним антигеном из Haemophilus influenzae, иммуногенным композициям, содержащим антигены, вакцинам, содержащим такие иммуногенные композиции, и к их терапевтическим применениям.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим убиквитарный поверхностный белок А2 (UspA2) Moraxella catarrhalis (М. catarrhalis, M. cat.). Более конкретно, настоящая заявка относится к конструкциям белка UspA2 и иммуногенным композициям, содержащим конструкции, вакцинам, содержащим такие иммуногенные композиции, и к их терапевтическим применениям.
Уровень техники, предшествующий изобретению
Убиквитарный поверхностный белок А2 (UspA2) представляет собой тримерный аутотранспортер, который выглядит как структура в форме леденца на электронных микрофотографиях (Hoiczyk et al. EMBO J. 19: 5989-5999 (2000)). Он состоит из N-концевой головки, за которой следует ножка, оканчивающаяся амфипатической спиралью и С-концевым мембранным доменом. (Hoiczyk et al. EMBO J. 19: 5989-5999 (2000)). UspA2 содержит очень консервативный домен (Aebi et al., Infection & Immunity 65(11) 4367-4377 (1997)), узнаваемый моноклональным антителом, как показано, являющимся защитным при пассивном переносе в модели заражения Moraxella catarrhalis на мышах (Helminnen et al. J Infect Dis. 170(4): 867-72 (1994)).
Показано, что UspA2 взаимодействует с структурами и белками внеклеточного матрикса хозяина, подобными фибронектину (Tan et al., J Infect Dis. 192(6): 1029-38 (2005)) и ламинину (Tan et al., J Infect Dis. 194(4): 493-7 (2006)), что позволяет предполагать, что он может играть роль на ранней стадии инфекции Moraxella catarrhalis.
UspA2 также, по-видимому, вовлечен в способность Moraxella catarrhalis к устойчивости против бактерицидной активности нормальной сыворотки человека. (Attia AS et al. Infect Immun 73(4): 24002410 (2005)). Он (i) связывается с ингибитором комплемента C4bp, позволяя Moraxella catarrhalis ингибировать классическую систему комплемента, (ii) предотвращает активацию альтернативного пути комплемента посредством абсорбции C3 из сыворотки и (iii) создает помехи для системы комплемента на терминальных стадиях, мембраноатакующего комплекса (MAC), посредством связывания регуляторного белка для комплемента витронектина. (de Vries et al., Microbiol Mol Biol Rev. 73(3): 389-406 (2009)).
Moraxella catarrhalis является важным и общераспространенным патогеном дыхательных путей, ассоциированным с повышенным риском обострений при хроническом обструктивном заболевании легких (COPD) у взрослых. (Sateesh et al., Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3: 109-115 (2006)).
Существует необходимость в вакцинах против Moraxella catarrhalis.
Краткая сущность изобретения
В первом аспекте, настоящее изобретение относится к белкам формулы (I).
A- (Ri)m- (В) η (формула I), где А представляет собой UspA2 из Moraxella catarrhalis или его иммуногенный фрагмент;
R1 представляет собой аминокислоту;
m представляет собой 0, 1 или 2;
В представляет собой гистидин и n представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим белки формулы (I) и белки по изобретению. Композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый адъювант. Композиция может содержать эксципиент.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики состояния или заболевания, вызванного полностью или частично Moraxella catarrhalis. Способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества белка формулы (I) или белка по изобретению.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики отита среднего уха. Способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества белка формулы (I) или белка по изобретению.
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики обострений при хроническом обструктивном заболевании легких. Способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количество белка формулы (I) или белка по изобретению.
В шестом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактки пневмонии. Способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количество белка формулы (I) или белка по изобретению.
В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению, для применения в лечении или профилактикепрофилактике состояния или заболевания, вызванного, полностью или частично, Moraxella catarrhalis. Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый адъювант.
В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим белки по изобретению.
В девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения нуклеиновых кислот по изобретению.
В десятом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере один антиген из Moraxella catarrhalis и по меньшей мере один антиген из Haemophilus influenzae. Компо- 1 034352 зиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый адъювант. Композиция может содержать эксципиент.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики состояния или заболевания, вызванного, полностью или частично, Moraxella catarrhalis и/или Haemophilus influenzae. Способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества белка формулы (I) или белка по изобретению.
В дополнительном аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики обострений при хроническом обструктивном заболевании легких. Способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества белка формулы (I) или белка по изобретению и терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного антигена из Haemophilus influenzae.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению для применения в лечении или профилактике состояния или заболевания, вызванного полностью или частично Moraxella catarrhalis в комбинации с по меньшей мере одним антигеном из Haemophilus influenzae. Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый адъювант.
Дополнительные аспекты настоящего изобретения описаны в следующем подробном описании конкретных вариантов осуществления, примерах и формуле изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - типичный профиль ферментации для способов с индукцией при высокой плотности клеток (HCDI) и параметры, мониторируемые в ходе периодической ферментации с подпиткой в масштабе 20 л.
Фиг. 2 - типичный профиль ферментации для способов с индукцией при низкой плотности клеток A (LCDI) и параметры, мониторируемые в ходе периодической ферментации с подпиткой в масштабе 20 л.
Фиг. 3 - выход UspA2 для белковых конструкций МС-001, МС-002, МС-004, МС-005, МС-006, МС007, МС-008 и МС-010, оцененный в ферментере; данные из табл. 4.
Фиг. 4 - распределение молекулярной массы очищенного МС-005, определенное посредством ультрацентрифугирования с анализом скорости седиментации. Большая часть белка обнаружена в форме тримера, с небольшой долей олигомера более высокой молекулярной массы, которая может соответствовать олигомеру от димера до тримера. MW=молекулярная масса. кДа=килодальтон.
Фиг. 5 - распределение молекулярной массы очищенного МС-001, определенное посредством ультрацентрифугирования с анализом скорости седиментации. Большая часть белка обнаружена в форме тримера.
Фиг. 6 - распределение молекулярной массы очищенного МС-001, определенное посредством ультрацентрифугирования с анализом скорости седиментации. В образце представлено множество молекул, и он обладает высокой полидисперсностью. Коэффициент седиментации основных детектированных молекул не соответствует ни одному из тримеров, в норме детектированных в других партиях.
Фиг. 7 - распределение молекулярной массы очищенного МС-001, определенное посредством ультрацентрифугирования с анализом скорости седиментации. Большая часть белка обнаружена в форме тримера.
Фиг. 8 - распределение молекулярной массы очищенного МС-007, определенное посредством ультрацентрифугирования с анализом скорости седиментации. Большая часть белка обнаружена в форме тримера.
Фиг. 9 - спектры кругового дихроизма (CD) в дальнем УФ для конструкций UspA2, дающие указания на вторичные структуры белков.
Фиг. 10 - мониторинг вторичных структур посредством кругового дихроизма (CD) в ходе термического разворачивания МС-005 (UspA2 с Δ спирали+6His). Визуальный анализ спектров ясно показывает, что белок теряет большую часть своей вторичной структуры при 33°C.
Фиг. 11 - мониторинг вторичных структур посредством кругового дихроизма (CD) в ходе термического разворачивания МС-007 (UspA2 с полной спиралью+6His). Визуальный анализ спектров показывает, что потеря вторичной структуры является более медленной по сравнению с конструкцией без спирали. Структурные изменения поддаются детекции при нагревании до 33°C, однако, по-видимому, полное разворачивание происходит между 35 и 37°C.
Фиг. 12 - спектр MALDI МС-001 партии opt-01. Наблюдаемая масса 57427 Да может соответствовать деметионилированному белку, в то время как пик 57620 Да может соответствовать полноразмерному белку.
Фиг. 13 - спектр MALDI MC-011 партии ВМР37. Наблюдаемая масса может соответствовать деметионилированному белку. Два других пика +186 Да и +366 Да не идентифицированы.
Фиг. 14 - защитная эффективность МС-001 и МС-007 в модели колонизации легких на мышах.
Фиг. 15 - ответ антител, направленный против UspA2, индуцированный после внутримышечного введения у мышей, где PII и PIII обозначают, соответственно, уровни антител против IgG в сыворотке, собранной на сутки 28 (точка II) и сутки 42 (точка III).
Фиг. 16 - бактерицидные титры против гомологичного штамма, индуцированные UspA2, составленным с различными адъювантами (AS01E, AS04C и AlPO4).
- 2 034352
Фиг. 17 - ответ антител, направленный против UspA2, индуцированный после внутримышечного введения у мышей, с использованием различных составов антигенов и адъювантов.
Фиг. 18 - бактерицидные титры против гомологичного штамма, индуцированные UspA2 с использованием различных составов антигенов и адъювантов.
Фиг. 19 - ответ IgG, индуцированный против PD у мышей посредством вакцины PD-PEPilA-UspA2 (трехвалентной вакцины NTHi-M.cat.), составленной с различными адъювантами.
Фиг. 20 - ответ IgG, индуцированный против РЕ у мышей посредством вакцины PD-PEPilA-UspA2 (трехвалентной вакцины NTHi-М. cat.), составленной с различными адъювантами.
Фиг. 21 - ответ IgG, индуцированный против PiLA у мышей посредством вакцины PD-PEPilAUspA2 (трехвалентной вакцины NTHi-М. cat.), составленной с различными адъювантами.
Фиг. 22 - иммуногенность РЕ в двухвалентном PD-PEPilA и трехвалентном PD-PEPilA-UspA2 составах с AS01E.
Фиг. 23 - иммуногенность PilA в двухвалентном PD-PEPilA и трехвалентном PE-PilA-UspA2 составах с AS01e.
Фиг. 24 - иммуногенность PD в двухвалентном PD-PEPilA и трехвалентном PE-PilA-UspA2 составах с AS01E.
Фиг. 25 - эффект тетравалентного вакцинного состава PD/PEPilA/UspA2/AS01E на легкие мыши, предварительно сенсибилизированные инактивированным нагреванием М. cat. - периваскулит и перибронхиолит у иммунизированных PBS мышей.
Фиг. 26 - эффект тетравалентного вакцинного состава PD/PEPilA/UspA2/AS01E на легкие мыши, предварительно сенсибилизированные инактивированным нагреванием М. cat. - Сутки 2 после иммунизации.
Фиг. 27 - эффект тетравалентного вакцинного состава PD/PEPilA/UspA2/AS01E на легкие мыши, предварительно сенсибилизированные инактивированным нагреванием М. cat. - Сутки 7 после иммунизации.
Фиг. 28 - эффект тетравалентного вакцинного состава PD/PEPilA/UspA2/AS01E на легкие мыши, предварительно сенсибилизированные инактивированным нагреванием М. cat. - Сутки 14 после иммунизации.
Фиг. 29 - эффект тетравалентного вакцинного состава PD/PEPilA/UspA2/AS01E на легкие мыши, предварительно сенсибилизированные инактивированным нагреванием М. cat. (подробные результаты).
Фиг. 30 - ответы CD4 Т-клеток легких после вакцинации после повторной стимуляции WC M. cat. Клетки CD4 легких, экспрессирующие IL17. Повторно стимулированы инактивированными нагреванием цельными клетками (WC) M. cat или средой.
Фиг. 31 - ответы CD4 Т-клеток легких после вакцинации после повторной стимуляции WC M. cat. Клетки CD4 легких, экспрессирующие TNFa. Повторно стимулированы инактивированными нагреванием цельными клетками (WC) M. cat. или средой.
Фиг. 32 - ответы CD4 Т-клеток легких после вакцинации после повторной стимуляции WC M. cat. Клетки CD4 легких, экспрессирующие IFNy. Повторно стимулированы инактивированными нагреванием цельными клетками (WC) M. cat. или средой.
Фиг. 33 - ответы CD4 Т-клеток легких после вакцинации при повторной стимуляции WC M. cat. Клетки CD4 легких, экспрессирующие IL13. Повторно стимулированы инактивированными нагреванием цельными клетками (WC) M. cat. или средой.
Фиг. 34 - ответы CD4 Т-клеток легких после заражения при повторной стимуляции WC M. cat. Клетки CD4 легких, экспрессирующие IL17. Повторно стимулированы инактивированными нагреванием цельными клетками (WC) M. cat. или средой.
Фиг. 35 - ответы CD4 Т-клеток легких после заражения при повторной стимуляции WC M. cat. Клетки CD4 легких, экспрессирующие TNFa. Повторно стимулированные инактивированными нагреванием цельными клетками (WC) M. cat. или средой.
Фиг. 36 - ответы CD4 Т-клеток легких после заражения при повторной стимуляции WC M. cat. Клетки CD4 легких, экспрессирующие IFNy. Повторно стимулированы инактивированными нагреванием цельными клетками (WC) M. cat. или средой.
Фиг. 37 - ответы CD4 Т-клеток легких после заражения при повторной стимуляции WC M. cat. Клетки CD4 легких, экспрессирующие IL13. Повторно стимулированные инактивированными нагреванием цельными клетками (WC) M. cat. или средой.
Подробное описание изобретения
Если в настоящем описании не объяснено или не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится это описание. Например, определения общепринятых в молекулярной биологии терминов можно найти в Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9) и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology
- 3 034352 and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 156081-569-8).
Термины единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст явно не указывает иное. Подобным образом, слово или предназначено, чтобы включать и, если контекст явно не указывает иное. Кроме того, следует понимать, что все размеры в парах оснований или размеры в аминокислотах и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными, и представлены для описания. Дополнительно, числовые пределы, данные в отношении концентраций или уровней вещества, такого как антиген, могут являться приблизительными. Таким образом, когда указано, что концентрация составляет (например) приблизительно 200 пг, следует понимать, что концентрация включает значения, немного большие или немного меньшие, чем (приблизительно или ~) 200 пг.
Хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные описываемым в настоящем описании, можно использовать в практическом осуществлении или тестировании этого описания, пригодные способы и материалы описаны ниже.
Термин содержит означает включает. Таким образом, если контекст не требует иного, слово содержит и варианты, такие как содержать и содержащий, следует понимать как предполагающие включение указанного соединения или композиции (например, нуклеиновой кислоты, полипептида, антигена) или стадии, или группы соединений или стадий, но не исключение любых других соединений, композиции, стадий или их групп. Сокращение e.g. происходит от латинского exempli gratia, и его используют в настоящем описании для обозначения неограничивающего примера. Таким образом, сокращение e.g. является синонимом термина например.
Для упрощения обзора различных вариантов осуществления этого описания, представлено следующее объяснение терминов. Дополнительные термины и объяснения представлены в контексте этого описания.
Пациент в рамках изобретения представляет собой млекопитающее, включая человека, не являющихся человеком приматов и не являющихся приматами млекопитающих, таких как члены отряда грызунов (включая в качестве неограничивающих примеров мышей и крыс) и членов рода Lagomorpha (включая в качестве неограничивающих примеров кроликов).
В рамках изобретения UspA2 обозначает убиквитарный поверхностный белок А2 из Moraxella catarrhalis. UspA2 может состоять из аминокислотной последовательности или содержать аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1 из АТСС 25238.
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE TLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEE L FNL S G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN lYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL ITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK VNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRV NPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (SEQ ID NO: 1), а также последовательности с по меньшей мере или точно 63, 66, 70, 72, 74, 75, 77, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности, на протяжении полной длины, с SEQ ID NO: 1. Сравнение 38 последовательностей UspA2 из Moraxella catarrhalis (табл. 1, SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38) показало от приблизительно 63 до приблизительно 100% идентичности с UspA2, как указано в SEQ ID NO. 1.
UspA2, как описано в SEQ ID NO: 1, содержит сигнальный пептид (например, аминокислоты 1-29 из SEQ ID NO: 1), связывающий ламинин домен (например, аминокислоты 30-177 из SEQ ID NO: 1), связывающий фибронектин домен (например, аминокислоты 165-318 из SEQ ID NO: 1) (Tan et al. JID 192: 1029-38 (2005)), связывающий C3 домен (например, аминокислоты 30-539 из SEQ ID NO: 1 (WO2007/018463), или фрагмент из аминокислот 30-539 из SEQ ID NO: 1, например, аминокислоты 165318 из SEQ ID NO: 1 (Hallstrom T et al. J. Immunol. 186: 3120-3129 (2011)), амфипатическую спираль (например, аминокислоты 519-564 из SEQ ID NO: 1 или аминокислоты 520-559 из SEQ ID NO:1, идентифицированные с использованием различных прогностических способов) и С-концевой якорный домен (например, аминокислоты 576-630 из SEQ ID NO: 1 (Brooks et al., Infection & Immunity, 76 (11), 5330-5340 (2008)).
Описаны различия аминокислот UspA2 для различных видов Moraxella catarrhalis. См., например, J Bacteriology 181 (13): 4026-34 (1999), Infection and Immunity 76(11): 5330-40 (2008) и PLoS One 7(9):e45452 (2012).
UspA2 может состоять из аминокислотной последовательности или содержать аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO. 1 любой одной или несколькими аминокислотами, вы
- 4 034352 бранными из группы, состоящей из: ак (аминокислот) 30-298, ак 299-302, ак 303-333, ак 334-339, ак 349, ак 352-354, ак 368-403, ак 441, ак 451-471, ак 472, ак 474-483, ак 487, ак 490, ак 493, ак 529, ак 532 или ак 543. UspA2 может состоять из аминокислотной последовательности или содержать аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 1 тем, что она содержит по меньшей мере одну вставку аминокислоты по сравнению с SEQ ID NO. 1. UspA2 может состоять из аминокислотной последовательности или содержать аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO. 1 любым из отличий аминокислот в SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 38. Например, SEQ ID NO. 1 может содержать К вместо Q в положении аминокислоты 70, Q вместо G в положении аминокислоты 135 и/или D вместо N в положении аминокислоты 216.
Таблица 1. Аминокислотные последовательности UspA2 из 38 штаммов Moraxalla catarrhalis (SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38)
Штамм Последовательности UspA2
ATCC 25238 (SEQ ID NO: 1) MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNEL EADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDD VETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLV NG ЕЕIEKNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLIT NSIENTNNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELA QQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQ DQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKA SSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIAN NINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQN TLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSI TDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPY SVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNI GVNYEF (630 ак)
American 2933 (SEQ ID NO: 2) MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQSRDRSLEDIQDSISKLVQDDIN TLKQDQQKMNKYLLLNQLANTLITDELNNNVIKNTNSIEALGDEIGWLENDI ADLEEGVEELTKNQNTLIEKDEEHDRLIAQNQADIQTLENNWEELFNLSGR LIDQEADIAKNNASIEELYDFDNEVAERIGEIHAYTEEVNKTLENLITNSVK NTDNIDKNKADIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIKTLKNNVEEGLLELSGHLI DQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADLTKDIKALESNVEEGLLD LSGRLLDQKADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQ NIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIY E LAQQQDQHS S DIKT LAKASAANTNRIATAE LGIAENKKDAQIAKAQANANK TAIDENKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTAL DTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSK SAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (613 ак)
- 5 034352
American 2912 (SEQ ID NO: 3) MKTMKLLPLKIAVTSALIIGLGAASTANAQQQLQTETFLPNFLSNDNYDLTD PFYHNMILGDTALLDKQDGSQPQLKFYSNDKDSVPDSLLFSKLLHEQQLNGF KKGDTIIPLDKDGKPVYQVDYKLDGKGKKQKRRQVYSVTTKTATDDDVNSAY SRGILGKVDDLDDEMNFLNHDITSLYDVTANQQDAIKDLKKGVKGLNKELKE LDKEVGVL S RDIGS LNDDVAQNNE SIEDLYDFS QEVADSIGEIHAHNKAQNE TLQDLITNSVENTNNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADLTKDI KTLESNVEEGLLELSGHLIDQKADIAKNQADIAQNQANIQDLAAYNELQDAY AKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSE NTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKA DADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDENKASADTKFAATADAI TKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENG MAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGA AINTSGNKKGSYNIGVNYEF (644 ак)
American 2908 (SEQ ID NO: 4) MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQLVERFFPNIFLDKPLAKQHYHN VWGDTSIVSDLQSNSDQLKFYSDDEGLVPDSLLFNKMLHEQLLNGFKEGDT IIPLDENGKPVYKVDYKLDGKEPRKVYSVTTKIATAEDVATSSYANGIQKDI DDLYDFDHQVTERLTQHGKTIYRNGERILANEESVQYLNKEVQNNIEHIYEL AQQQDQHSSDIKTLESNVEKGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLL DLSGRLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDL AAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEA IDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAA NTNRIATAELGIAENKKDAQIAKAQANANKTAIDENKASADTKFAATADAIT KNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGM AAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAA INTSGNKKGSYNIGVNYEF (591 ак)
Finnish 307 (SEQ ID NO: 5) MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQQQQQQQQQQQSRTEIFFPNIFF NENHDELDDAYHNIILGDTALLDKQDGSQPQLKFYSNDKDSVPDSLLFSKLL HEQQLNGFKKGDTIIPLDKDGKPVYQVDYKLDGKGKKQKRRQVYSVTTKTAT DDDVNSAYSRGILGKVDDLDDEMNFLNHDITSLYDVTANQQDAIKGLKKGVK GLNKELKELDKEVGVLSRDIGSLNDDVAQNNESIEDLYDFSQEVADSIGEIH AHNKAQNE TLQDLITNSVENTNNITKNKADIQALENNWEE LFNL S GRLIDQ KADLTKDIKTLESNVEEGLLELSGHLIDQKADIAKNQADIAQNQANIQDLAA YNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAID ALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQ ADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETL TKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDENKASADTKFAATADAITKNGNAITK NAKSITDLGTKVDAFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSG LFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKK GSYNIGVNYEF (687 ак)
Finnish 353 (SEQ ID NO: 6) MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGMASTANAQQQKSPKTETFLPNIFFNEYADD LDTLYHNMILGDTAITHDDQYKFYADDATEVPDSLFFNKILHDQLLYGFKEG DKIIPLDENGKPVYKLDKRLENGVQKTVYSVTTKTATADDVNSAYSRGIQGD IDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIHELAQQQDQ HSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQ KQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADL TKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQ QTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQ NIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIY ELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKD KEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTK VDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQP YSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYN IGVNYEF (683 аминокислот)
- 6 034352
Finnish 358 (SEQ ID NO: 7) MKTMKLLPLKIAVTSAMMVGLGMASTANAQQQKSPKTEIFLPNLFDNDNTEL TDPLYHNMILGNTALLTQENQYKFYADDGNGVPDSLLFNKILHDQLLHGFKE GGTIIPLDENGKPVYKLDSIVEQGKTKTVYSVTTKTATADDVNSAYSRGIQG DIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIHELAQQQD QHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYA QKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKAD LTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAK QQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENT QNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNI YELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEK DKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGT KVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQ PYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSY NIGVNYEF (684 аминокислот)
Finnish 216 (SEQ ID NO: 8) MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQQQQKTKTEVFLPNLFDNDYYDL TDPLYHSMILGDTATLFDQQDNSKSQLKFYSNDKDSVPDSLLFSKLLHEQQL NGFKAGDTIIPLDKDGKPVYTQDTRTKDGKVETVYSVTTKIATQDDVEQSAY SRGIQGDIDDLYDINREVNEYLKATHDYNERQTEAIDALNKAS SANTDRIDT AEERIDKNEYDIKALESNVGKDLLDLSGRLIAQKEDIDNNINHIYELAQQQD QHSSDIKTLKNNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLENNIEEGLLELSGH LIDQKADLTKDIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNE LQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALN KASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADI ANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKVSAANTDRIAKNKADADASFETLTKN QNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAK SITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQ PYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSY NIGVNYEF (684 аминокислот)
Dutch H2 (SEQ ID NO: 9) MKTMKLLPLKIAVTSAMMVGLGMASTANAQQQKSPKTEIFLPNLFDNDNTEL TDPLYHNMILGNTALLTQENQYKFYADDGNGVPDSLLFNKILHDQLLHGFKK GDTIIPLDENGKPVYKLDSIVEQGKTKTVYSVTTKTATADDVNSAYSRGIQG DIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIΕΝIYE LVQQQD QHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYA QKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKAD LTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAK QQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENT QNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNI YELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEK DKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGT KVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQ PYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSY NIGVNYEF (684 аминокислот)
Dutch F10 (SEQ ID NO : 10) MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQLAEQFFPNIFSNHAPVKQHYHN VWGDTSIVENLQDSDDTQLKFYSNDEYSVPDSLLFNKMLHEQQLNGFKKGD TIIPLDENGKPVYKVDYKLDGQEPRRVYSVTTKIATQDDVDNSPYSRGIQGD IDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIENIYELAQQQDQ HSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLELSGHL IDQKADIAKNQADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SEN TQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIE KDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLG TKVDAFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGK FNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNY EE (574 аминокислот)
- 7 034352
Norwegian 1 (SEQ ID NO: 11) Norwegian 13 (SEQ ID NO: 12) Norwegian 20 (SEQ ID NO: 13) MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQQQPQTETFFPNIFFNENHDALD DVYHNMILGDTAITQDNQYKFYADAISEVPDSLLFNKILHDQQLNGFKEGDT IIPLDENGKPVYKLDEKVENGVKKSVYSVTTKTATRADVEQSAYSRGIQGDI DDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIENIHELAQQQDQH SSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLDLSGRLL DQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLA AYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAI DALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDL AAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQ QDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDK LITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDAFD GRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGK FNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNY EE (678 аминокислот) MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGAASTANAQQQQQPRTETFFPNIFFNENHDA LDDVYHNMILGDTAITQDNQYKFYADAISEVPDSLLFNKILHDQQLNGFKEG DTIIPLDENGKPVYKLDEKVENGVKKSVYSVTTKTATRADVEQSAYSRGIQG DIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIHELAQQQD QHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYA QKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKAD LTKDIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRL LDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDL AAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQ QDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDK LITANKTAIDTNKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFD GRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGK FNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNY EE (678 аминокислот) MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQLVERFFPNIFLDKPLAKQHYHN WVGDTSIVSDLQSNSDQLKFYSDDEGLVPDSLLFNKMLHEQLLNGFKEGDT IIPLDENGKPVYKVDYKLDGKEPRKVYSVTTKIATAEDVATSSYANGIQKDI DDLYDFDHQVTERLTQHGKTIYRNGERILANEESVQYLNKEVQNNIEHIYEL AQQQDQHSSDIKTLESNVEKGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLENNVEEGLL DLS GRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKAS SENT QNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNI YELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEK DKEHDKLITANKTAIDTNKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGT KVDG FD S RVTAL D T KVNAL D T KVNAL D T KVNAFDGRITALDS KVENGMAAQA ALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTS GNKKGSYNIGVNYEF (587 аминокислот)
Norwegian 25 (SEQ ID NO: 14) MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGAASTANAQQQQQPRTETFFPNIFFNENHDA LDDVYHNMILGDTAITQDNQYKFYADAISEVPDSLLFNKILHDQQLNGFKEG DTIIPLDENGKPVYKLDEKVENGVKKSVYSVTTKTATRADVEQSAYSRGIQG DIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIHELAQQQD QHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYA QKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKAD LTKDIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRL LDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDL AAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQ QDQHS S DIKT LAKASAANT DRIAKNKADADAS EET L TKNQNT LIEKDKEHDK LITANKTAIDTNKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSIT DLGTKVDGFD GRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGK FNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNY EE (678 аминокислот)
- 8 034352
Norwegian 27 (SEQ ID NO: 15) Norwegian 36 (SEQ ID NO: 16) BC5SV (SEQ ID NO: 17) MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQVRDKSLEDIEALLGKIDISKLE KEKKQQTELQKYLLLSQYANVLTMEELNKNVEKNTNSIEALGYEIGWLENDI ADLEEGVEELTKNQNTLIEKDEEHDRLIAQNQADIKTLENNWEELFNLSDR LIDQEADIAKNNASIEELYDFDNEVAERIGEIHAYTEEVNKTLEKLITNSVK NTDNIDKNKADIQALENNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGL LDLSGRLLDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDAL NKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQ HSSDIKTLAKVSAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLIT ANKTAID ANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRV TALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGY GSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (616 аминокислот) MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQATETFLPNLFDNDYTETTDPLY HGMILGNTAITQDTQYKFYAENGNEVPDSLFFNKILHDQQLNGFKEGDTIIP LDENGKPVYKLDEITENGVKRKVYSVTTKTATREDVEQSAYSRGIQGDIDDL YEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIΕΝIHE LAQQQDQHS S D IKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGHLIDQK ADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAY NELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAA YNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQD QHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLI TANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGR VTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFN ATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (676 аминокислот) MKTMKLLPLKIAVT SALIVGLGAAS TANAQNGTS TKLKNLKEYAQYLDNYAQ YLDDDIDDLDKEVGELSQNIAKNQANIKDLNKKLSRDIDSLREDVYDNQYEI VNNQADIEKNQDDIKELENNVGKELLNLSGRLLDQKADIDNNINNIYELAQQ QDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKSDIAQNQTDIQDLATYNELQDQ YAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASS ENTQNIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQD AYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKAS SENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANN INNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNT LIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSIT DLGTKVDAFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYS VGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIG VNYEF (629 аминокислот)
Norwegian 14 (SEQ ID NO: 18) MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGMASTANAQQQRSPKTETFLPNIFFNEYADD LDTLYHNMILGDTAITHDDQYKFYADDATEVPDSLFFNKILHDQLLYGFKEG DKIIPLDENGKPVYKLDKRLDNGVQKTVYSVTTKTATADDVNSAYSRGIQGD IDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIENIHELAQQQDQ HSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQ KQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNRIKALENNIEEGLLELSGHLIDQKADL TKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQ QTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQ NIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIY ELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKD KEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTK VDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQP YSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYN IGVNYEF (683 аминокислот)
- 9 034352
Norwegian 3 (SEQ ID NO: 19) MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGAASTANAQAQSNRSLDQVQALLRGIDETKI KKEIQQSQQPELNKYLTFNQLANALNIEELNNNVQKNTQRLDSAATLYGDLS KTVPKSIKENKE SIKENKE SIKENKE SIKENKE SIKENKE SIKENKE SIT T L TRKS FQNQVDIVRNNASIEDLYAYGQEVAKSIGEIHAYTEEVNKTLENLITN SVENTNNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQ QQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLDL SGRLLDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQN IEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQ QTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQ NIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADAD ASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTVIDANKASADTKFAATADAITKN GNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSK VENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAF KAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (700 аминокислот)
Finnish 414 (SEQ ID NO: 20) MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQATETFLPNLFDNDYIETTDPLY HGMILGNTAITQDTQYKEYAENGNEVPDSLEENKILHDQQLNGEKEGDTIIP LDENGKPVYKLDEITENGVKRKVYSVTTKTATREDVEQSAYSRGIQGDIDDL YEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIΕΝIHE LAQQQDQHS S D IKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLENNVEEGLLELSGHLIDQK ADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAY NELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAA YNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQD QHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLI TANKTAID ANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGR VTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFN ATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (676 аминокислот)
Japanese Z7476 (SEQ ID NO: 21) MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQLAEQFFPNIFSNHAPVKQHYHN VWGDTSIVENLQDSDDTQLKFYSNDEYSVPDSLLFNKMLHEQQLNGFKKGD TIIPLDENGKPVYKVDYKLDGQEPRRVYSVTTKIATQDDVDNSPYSRGIQGD IDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIENIYELAQQQDQ HSSDIKTLKKNVEEGLLELSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQ KQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENT QNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYA KQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSEN TQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKVSAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIE KDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLG TKVDGFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGK FNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNY EE (678 аминокислот)
Belgian Z7530 (SEQ ID NO: 22) MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQSRDRSLEDIQDSISKLVQDDIN TLKQDQQKMNKYLLLNQLANTLITDELNNNVIKNTNSIEALGDEIGWLENDI ADLEEGVEELTKNQNTLIEKDEEHDRLIAQNQADIQTLENNWEELFNLSGR LIDQEADIAKNNASIEELYDFDNEVAERIGEIHAYTEEVNKTLENLITNSVK NTDNIDKNKADIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIKTLKNNVEEGLLELSGHLI DQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADLTKDIKALESNVEEGLLD LSGRLLDQKADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQ NIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIY E LAQQQDQHS S DIKT LAKASAANTNRIATAE LGIAENKKDAQIAKAQANANK TAIDENKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTAL DTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSK SAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (613 аминокислот)
- 10 034352
German Z8063 (SEQ ID NO: 23) MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQATNKDITLEDVLKSIEEIDPYE LRDYIEYPTAIERFLLLSQYGNTLTLEEFDNDIELLDQDVEDLEESVTELAK NQNSLIEQGEAIKEDLQGLADFVERQEDKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIE KNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVANSIGEIHAHNEAQNE T LKDLITNSVKNT DNITKNKADIQALESNVEKGLLELSGHLIDQKADIDNNINNIHELAQQQDQH SSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKSDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQK QTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQ NIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADAD ASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKN GNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAA QAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAIN TSGNKKGSYNIGVNYEF (589 аминокислот)
American O12E (SEQ ID NO: 24) Greek MC317 (SEQ ID NO: 25) American V1122 (SEQ ID NO: 2 6) MKTMKLLPLKIAVTSAMMVGLGMASTANAQQQKSPKTEIFLPNLFDNDNTEL TDPLYHNMILGNTALLTQENQYKFYADDGNGVPDSLLFNKILHDQLLHGFKE GDTIIPLDENGKPVYKLDSIVEQGKTKTVYSVTTKTATADDVNSAYSRGIQG DIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIHELAQQQD QHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYA QKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKAD LTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAK QQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENT QNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNI YELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEK DKEHDKLITANKTAID ANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGT KVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQ PYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSY NIGVNYEF (684 аминокислот) MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQQQQKTKTEVFLPNLFYNDYIEE TDLLYHNMILGDTAALVDRQNYSNSQLKFYSNDEESVPDSLLFSKMLNNQQL NGFKAGDIIIPVDANGQVIYQKDTRVEGGKTRTVLSVTTKIATQQDVDSAYS RGIQGKVNDLDDEMNFLNHDITSLYDVTANQQDDIKGLKKGVKDLKKGVKGL NKELKELDKEVGVLSRDIGSLNDDVAQNNESIEDLYDFSQEVADSIGEIHAH NKAQNE TLQDLITNSVENTNNITKNKADIQALENNWEE LFNL S GRLIDQKA DLTKDIKTLESNVEEGLLELSGHLIDQKADIAKNQADIAQNQANIQDLAAYN ELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDAL NKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDR lAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDENKASADTKFA ATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNAFDGRITALD SKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNL AFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (650 аминокислот) MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAVSTTNAQAQSRSLDQIQTKLADLAGKIAA GKNGGGQNNQNNQNDINKYLFLSQYANILTMEELNNNWKNSSSIETLETDF GWLENDVADLEDGVEELTKNQNTLIEKDEEHDRLIAQNQADIQTLENNWEE LFNLSDRLIDQKADIAKNQADIAQNNESIEELYDFDNEVAEKIGEIHAYTEE VNKTLQDLITNSVKNTDNIDKNKADIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIKTLKN NVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLENNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKN QADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQ HSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLIT ANKTAIDENKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRV TALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGY GSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (616 аминокислот)
- 11 034352
American P44 (SEQ ID NO: 27) MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGTASTANAQVASPANQKIQQKIKKVRKELRQ DIKSLRNDIDSNTADIGSLNDDVADNQDDILDNQADIAKNQDDIEKNQADIK ELDKEVGVLSREIGSLNDDIADNYTDIIDNYTDIIDNQANIAKNQDDIEKNQ ADIKELDKEVGVLSREIGSLNDDVADNQDDIAKNQADIQTLENNVEEGLLEL SGHLLDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLID QKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQEQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSN RIKALESNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLELSGHLIDQ KADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQ HSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLIT ANKTAIDANKVSADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDAFDSRV TALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGY GSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF ( 6 68 аминокислот)
American V1171 (SEQ ID NO: 28) MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGATSTVNAQWEQFFPNIFFNENHDELDDAY HNMILGDTAIVSNSQDNSTQLKFYSNDEDSVPDSLLFSKLLHEQQLNGFKAG DTIIPLDKDGKPVYTKDTRTKDGKVETVYSVTTKIATQDDVEQSAYSRGIQG DIDDLYDINREVNEYLKATHDYNERQTEAIDALNKAS SANTDRIDTAEERID KNEYDIKALESNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLELSGH LIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNE LQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALN KASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYN ELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQH S S DIKT LAKASAANTDRIAKNKADADASFE T L TKNQNT LIEKDKEHDKLITA NKTAID ANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVT ALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNAT AALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (674 аминокислот)
American TTA24 (SEQ ID NO : 2 9) MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQSRDRSLEDIQDSISKLVQDDID TLKQDQQKMNKYLLLNQLANTLITDELNNNVIKNTNSIEALGDEIGWLENDI ADLEEGVEELTKNQNTLIEKDEEHDRLIAQNQADIQTLENNWEELFNLSGR LIDQEADIAKNNASIEELYDFDNEVAERIGEIHAYTEEVNKTLENLITNSVK NTDNIDKNKADIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIKTLKNNVEEGLLELSGHLI DQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADLTKDIKALESNVEEGLLD LSGRLLDQKADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQ NIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIY E LAQQQDQHS S DIKT LAKASAANTNRIATAE LGIAENKKDAQIAKAQANANK TAIDENKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTAL DTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSK SAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF ( 613 аминокислот)
American O35E (SEQ ID NO: 30) MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGATSTVNAQWEQFFPNIFFNENHDELDDAY HNMILGDTAIVSNSQDNSTQLKFYSNDEDSVPDSLLFSKLLHEQQLNGFKAG DTIIPLDKDGKPVYTKDTRTKDGKVETVYSVTTKIATQDDVEQSAYSRGIQG DIDDLYDINREVNEYLKATHDYNERQTEAIDALNKAS SANTDRIDTAEERID KNEYDIKALESNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLELSGH LIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAKNQADIAQNQTDIQ DLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELA QQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEH DKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDG FDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSV GKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGV NYEF (576 аминокислот)
- 12 034352
American SP12-6 (SEQ ID NO: 31) MKTMKLLPLKIAVTSAMMVGLGMASTANAQQQKSPKTEIFLPNLFDNDNTEL TDPLYHNMILGNTALLTQENQYKFYADDGNGVPDSLLFNKILHDQLLHGFKE GDTIIPLDENGKPVYKLDSIVEQGKTKTVYSVTTKTATADDVNSAYSRGIQG DIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIHELAQQQD QHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYA QKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKAD LTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAK QQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENT QNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNI YELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEK DKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGT KVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQ PYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSY NIGVNYEF (684 аминокислот)
American SP12-5 (SEQ ID NO: 32) MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQATETFLPNLFDNDYTETTDPLY HGMILGNTAITQDTQYKFYAENGNEVPDSLFFNKILHDQQLNGFKEGDTIIP LDENGKPVYKLDEITENGVKRKVYSVTTKTATREDVEQSAYSRGIQGDIDDL YEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIΕΝIHE LAQQQDQHS S D IKTLKKNVEEGLLELSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTE AIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDI KALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQY AQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSE NTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNIN NIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLI EKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDL GTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGL FQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKG SYNIGVNYEF (686 аминокислот)
Swedish BC5 (SEQ ID NO: 33) MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNEL EADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDD VETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLV NG FEIEKNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLIT NSIENTNNITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELA QQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQ DQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKA SSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIAN NINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQN TLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSI TDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPY SVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNI GVNYEF (630 аминокислот)
American 7169 (SEQ ID NO: 34) MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQAQDRSLEQIQDKLANLVEKIEQ AKSQNGQSQKDINQYLLLSQYANVLTMEELNNNWKNSSSIETLDNDIAWLN DDLIDLDKEVGVLSRDIGSLHDDVAQNQADIKTLKNNWEELFNLSDRLIDQ EADIAQNNE SIE DLYD FGREVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKDLITNSVKNT DN ITKNKADIQALENDVGKELLNLSGRLIDQKADIDNNINHIYELAQQQDQHSS DIKTLKNNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQ KADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQ HSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLIT ANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRV TALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGY GSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (616 аминокислот)
- 13 034352
Finnish FIN2344 (SEQ ID NO: 35) MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGATSTVNAQWEQFFPNIFFNENHDELDDAY HNMILGDTAIVSNSQDNSTQLKFYSNDEDSVPDSLLFSKLLHEQQLNGFKAG DTIIPLDKDGKPVYTKDTRTKDGKVETVYSVTTKIATQDDVEQSAYSRGIQG DIDDLYDINREVNEYLKATHDYNERQTEAIDALNKAS SANTDRIDTAEERID KNEYDIKALESNVGKDLLDLSGRLIAQKEDIDNNINHIYELAQQQDQHSSDI KTLKNNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLDLSGRLIDQKA DIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNE LQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHS SDIKTLAKVSAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITAN KTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTA LDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGS KSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (614 аминокислот)
American V1118 (SEQ ID NO: 3 6) MKTMKLPPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQTTETFLPNLFDNDYTETTDPLY HGMILGDTAITQDTQYKFYAENGNEVPDSLFFNKILHDQLLNGFKAGDTIIP LDENGKPVYKLDERTENGVKRKVYSVTTKTATQADVEQSAYSRGIQGDIDDL YEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIΕΝIHE LAQQQDQHS S D IKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTE AIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEECLLELSGHLIDQKADLTKDI KALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEA IDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIED LAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQ QQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHD KLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGF DGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVG KFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVN YEF (679 аминокислот)
American V1145 (SEQ ID NO: 37) MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQETLEEVLESIKQINEQDLQDDI GYNSALDRYLVLSQYGNLLIAKELNENVEKNSNSIAKNSNSIADLEADVGYL AENQNTLIEQNETINQELEGITHELESFIAYAHAQDQKNLVNEFEIEKNKDA IAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAYTEEVNKTLENLITNSVKNTDNITK NKADIQALESNVEKELLNLSGRLIDQKADIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIK TLKKNVEEGLLELSGHLIDQKSDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTEAI DALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDL AAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEA IDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIED LAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQ QQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHD KLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGF DSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAA LGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (724 аминокислот)
American V1156 (SEQ ID NO: 38) MKTMKLLPLKIAVT SALIVGLGAAS TANAQAQARDRSLEDIQALIGNIDVDK IRSQKQKNPEIFQYLLLNQLSNTLITDELNNNVIKNTNSIETLDNDIAWLND DLIDLDKE VGVL S RD IGS LHDDVAQNQADI KT LENNWEE L FNL S DRLIDQE AEIAQNNESIEDLYDFGREVAESIGEIHAHNEAQNETLKDLITNSVKNTDNI DKNKADIQALENNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSG RLLDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASS ENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQD AYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDI KTLAKVSAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTA IDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDT KVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSA VAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF (611 аминокислот)
UspA2 может представлять собой UspA2 из М. catarrhalis штамма АТСС (зарегистрированный в
США товарный знак) 25238™, American 2933. American 2912, American 2908, Finnish 307, Finnish 353,
- 14 034352
Finnish 358, Finnish 216, Dutch H2, Dutch F10, Norwegian 1, Norwegian 13, Norwegian 20, Norwegian 25, Norwegian 27, Norwegian 36, BC5SV, Norwegian 14, Norwegian 3, Finish 414, Japanese Z7476, Belgium Z7530, German Z8063, American O12E, Greek MC317, American V1122, American P44, American V1171, American TTA24, American O35E, American SP12-6, American SP12-5, Swedish BC5, American 7169, Finnish FIN2344, American V1118, American V1145 или American V1156. UspA2 может представлять собой UspA2, как указано в любом из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. UspA2 может представлять собой UspA2 из другого источника, соответствующий последовательности UspA2 из любого из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. Специалист в данной области может определять соответствующие последовательности UspA2 с использованием различных алгоритмов. Например, можно использовать программу Gap или программу Needle для определения последовательностей UspA2, соответствующих любой из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38.
UspA2 может представлять собой последовательность по меньшей мере с 95% идентичности, на протяжении полной длины, с любым из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38.
Иммуногенные фрагменты UspA2 содержат иммуногенные фрагменты по меньшей мере из 450 непрерывных аминокислот из SEQ ID NO: 1, 490 непрерывных аминокислот из SEQ ID NO: 1 (например, the UspA2 фрагмент of МС-004 или МС-005), 511 непрерывных аминокислот из SEQ ID NO: 1 (например, фрагмент UspA2 из конструкции МС-001, МС-002, МС-003 или МС-004), 534 непрерывных аминокислот из SEQ ID NO: 1 (например, фрагмент UspA2 из МС-009 или МС-011) или 535 непрерывных аминокислот из SEQ ID NO: 1 (например, фрагмент UspA2 из МС-007, МС-008 или МС-010). Иммуногенные фрагменты могут стимулировать образование антител, которые могут связывать SEQ ID NO: 1.
Иммуногенные фрагменты UspA2 могут содержать иммуногенные фрагменты по меньшей мере из 450, 490, 511, 534 или 535 непрерывных аминокислот из любой из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. Иммуногенные фрагменты UspA2 могут содержать иммуногенные фрагменты UspA2 из любой из SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 38, соответствующие фрагменту UspA2 из SEQ ID NO: 1 в любой из конструкций UspA2 МС-001, МС-002, МС-003, МС-004, МС-005, МС-006, МС-007, МС-008, МС-009, МС-010 или МС-011. Иммуногенные фрагменты могут стимулировать образование антител, которые могут связывать полноразмерную последовательность, из которой происходит фрагмент.
Выравнивание между парами полипептидов можно рассчитывать посредством различных программ. Например, можно использовать программу Needle из пакета EMBOSS (бесплатное программное обеспечение; EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Trends in Genetics 16(6): 276-277) и программу Gap из пакета GCG (зарегистрированный в США товарный знак) (Accelrys Inc.).
Программы Gap и Needle представляют собой реализацию алгоритма Нидлмана-Вунша, описанного в: Needleman, S. В. and Wunsch, С. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. В этих программах часто используют оценочную матрицу BLOSUM62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), Amino acid substitution matrices from protein blocks), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919) с штрафами за открытие и расширение пропуска, соответственно, 8 и 2. Иногда используют также оценочную матрицу РАМ250 (Dayhoft et al., (1978), A model of evolutionary changes in proteins, In Atlas of Protein sequence and structure 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352, National Biomedical Research Foundation, Washington).
Оценочные матрицы описывают по количественной оценке тенденции каждой аминокислоты подвергаться мутации до другой аминокислоты или оставаться консервативной. Эти значения, как правило, рассчитывают по статистике мутаций, наблюдаемых при точных попарных или множественных выравниваниях, или даже в фрагментах из множественных выравниваний. Как правило, в этих таблицах, если высокое положительное значение ассоциировано с парой идентичных аминокислот, это является показателем того, что этот остаток проявляет низкую тенденцию к мутации. И напротив, высокое положительное значение, ассоциированное с парой различных аминокислот, является показателем высокой тенденции к мутации между этими двумя. И это называют консервативной заменой.
Рассматривая попарное выравнивание, можно наблюдать выровненные идентичные остатки (случаи идентичности) между двумя последовательностями. Процент идентичности можно вычислять посредством умножения на 100 (1) отношения между количеством случаев идентичности и длиной выравнивания (например, в выходе программы Needle), или (2) отношения между количеством случаев идентичности и длиной самой длинной последовательности, или (3) отношения между количеством случаев идентичности и длиной самой короткой последовательности, или (4) отношения между количеством случаев идентичности и количеством выровненных остатков (например, в выходе программы Gap).
Проценты идентичности из табл. 8 рассчитывали в соответствии с определением (3) из предшествующего раздела, с использованием попарного выравнивания, рассчитанного посредством программного обеспечения Gap.
В рамках изобретения адъювант обозначает соединение или вещество, которое при введении пациенту в комбинации с вакциной, иммунотерапевтическим средством, или другой содержащей антиген или иммуноген композицией увеличивает или усиливает иммунный ответ пациента на введенный антиген или иммуноген (по сравнению с иммунным ответом, который можно получить в отсутствие адъюванта). Это следует отличать от адъювантной терапии, определенной Национальным институтом онко- 15 034352 логии Национального института здравоохранения Соединенных Штатов в контексте лечения злокачественных опухолей как дополнительное лечение, проводимое после первичного лечения, для снижения риска того, что произойдет рецидив злокачественной опухоли.
Изобретение дополнительно относится к белкам формулы (I), содержащим консервативные аминокислотные замены. Например, белки формулы (I) могут содержать консервативную замену любой аминокислоты из UspA2 из Moraxella catarrahlis, как описано в любой из последовательностей, указанной в настоящем описании (например, любой последовательности UspA2, указанной в SEQ ID NO. 1 - SEQ ID NO. 38).
В рамках изобретения сигнальный пептид относится к короткому (менее 60 аминокислот, например 3-60 аминокислот) полипептиду, который присутствует в белках-предшественниках (как правило, на N-конце), и который, как правило, отсутствует в зрелом белке. Сигнальный пептид (sp) является, как правило, богатым гидрофобными аминокислотами. Сигнальный пептид направляет транспорт и/или секрецию транслированного белка через мембрану. Сигнальные пептиды также можно называть нацеливающими сигналами, транзитными пептидами, сигналами локализации или сигнальными последовательностями. Например, сигнальная последовательность может представлять собой котрансляционный или посттрансляционный сигнальный пептид.
Гетерологичный сигнальный пептид можно отщеплять от белковой конструкции посредством пептидаз сигнального пептида в ходе или после транспорта или секреции белка. Например, пептидаза сигнального пептида представляет собой пептидазу сигнального пептида I. Гетерологичный сигнальный пептид представляет собой пептид, не ассоциированный с белком, как он существует в природе.
В рамках изобретения лечение обозначает предотвращение возникновения симптомов состояния или заболевания у пациента, предотвращение рецидива симптомов состояния или заболевания у пациента, задержку рецидива симптомов состояния или заболевания у пациента, уменьшение тяжести или частоты симптомов состояния или заболевания у пациента, замедление или прекращение прогрессирования состояния и частичное или полное прекращение симптомов заболевания или состояния у пациента.
В рамках изобретения необязательно означает, что описанное затем событие(события) могут произойти или могут не произойти, и включает как событие(события), которые происходят, так и события, которые не происходят.
Отит среднего уха является основной причиной заболеваемости у 80% всех детей в возрасте менее 3 лет. (Expert Rev. Vaccines 5:517-534 (2006)). Более чем у 90% детей развивается отит среднего уха до возраста 7 лет (Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003)). В 2000 г. состоялось 16 млн приемов у врачей частной практики по поводу отита среднего уха в Соединенных Штатах Америки, и выдано приблизительно 13 млн антибактериальных предписаний. (Pediatrics 113:1451-1465 (2004)). В европейских странах опубликованные частоты острого отита среднего уха лежит в диапазоне 0,125-1,24 на ребенка в год. (Expert Review of Vaccines 8: 1479-1500 (2009)). Отит среднего уха является связанной с затратами инфекцией и наиболее распространенной причиной для введения антибиотиков детям. (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Бактерии являются ответственными за приблизительно 70% случаев острого отита среднего уха, где Streptococcus pneumoniae, нетипируемый Haemophilus influenzae (NTHi) и Moraxella catarrhalis преобладают в качестве этиологических агентов (Expert Review of Vaccines 5:517-534 (2006)). Подгруппа детей, испытывающих рецидивирующий и хронический отит среднего уха, и предрасположенных к этим отитам детей обладают продолжительными эффузиями среднего уха, ассоциированными с потерей слуха и задержкой речевого и языкового развития. (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Недавнее давление антибиотиков и вакцинация конъюгированной пневмококковой вакциной привели к появлению продуцирующих β-лактамазу Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhalis в качестве лидирующих организмов, вызывающих острый отит среднего уха в Северной Америке, следом за Streptococcus pneumoniae (Pediatr Clin N Am 60 (2013) 391-407).
Поскольку отит среднего уха является многофакторным заболеванием, возникает вопрос о целесообразности предотвращения отита среднего уха с использованием способа вакцинации (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)).
Модель на шиншиллах является надежной и проверенной моделью на животных отита среднего уха и его предотвращения (Expert Review of Vaccines 8:1063-1082 (2009)). В то время как модель на шиншиллах может имитировать естественное течение инфекции у человека, другие авторы предполагают, что результаты для модели на шиншиллах могут меняться от лаборатории к лаборатории. (Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003)).
Различных других грызунов также использовали для индукции отита среднего уха, и обобщение приведено в Vaccine 26:1501-1524 (2008). Мышиную модель на животных часто изучают в исследованиях отита среднего уха.
Присутствие бактерицидных антител ассоциировано с защитой от отита среднего уха, обусловленного нетипируемым H. influenzae. (Current Opinion in Infectious Disease 16:129-134 (2003)). Однако иммунный ответ не обязательно должен быть бактерицидным, чтобы быть эффективным против NTHi. Антитела, которые просто вступают в реакцию с поверхностными адгезинами NTHi, могут уменьшать или исключать отит среднего уха у шиншилл. (Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003)).
- 16 034352
Хроническое обструктивное заболевание легких представляет собой хроническое воспалительное заболевание легких и является главной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Приблизительно одна из 20 смертей в 2005 г. В США имела COPD в качестве лежащей в основе причины (Drugs and Aging 26:985-999 (2009)). Прогнозируют, что в 2020 г. COPD может подняться до пятой основной причины утраченных лет жизни с поправкой на длительность инвалидизации, хронических инвалидизирующих заболеваний, и до третьей из наиболее важных причин смертности (Lancet 349:1498-1504 (1997)).
Течение COPD характеризуется прогрессирующим ухудшением в ограничении воздушного потока и уменьшении легочной функции. COPD может осложняться частыми и рецидивирующими острыми приступами (АЕ), ассоциированными с огромными расходами на здравоохранение и высокой заболеваемостью. (Proceedings of the American Thoracic Society 4:554-564 (2007)). Одно исследование позволяют предположить, что приблизительно 50% острых приступов симптомов COPD вызваны нетипируемыми Haemophilias influenzae, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa. (Drugs and Aging 26:985-999 (2009)). Haemophilus influenzae (H. influenzae) обнаружен при 20-30% обострений COPD; Streptococcus pneumonia - при 10-15% обострений COPD; и Moraxella catarrhalis - при 10-15% обострений COPD. (New England Journal of Medicine 359:2355-2365 (2008)). Показано, что Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae и Moraxella catarrhalis являются первичными патогенами при острых приступах бронхита в Гонконге, Южной Корее и на Филиппинах, в то время как Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter spp. Составляют большую часть патогенов в других азиатских странах/регионах, включая Индонезию, Таиланд, Малайзия и Тайвань (Respirology, (2011) 16, 532-539; doi:10,1111/j.1440,1843,2011,01943.х). В Бангладеш для 20% пациентов с COPD показан посев мокроты, положительный по Pseudomonas, Klebsiella, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae, в то время как для 65% пациентов с AECOPD (острый приступ COPD) показан посев мокроты, положительный по Pseudomonas, Klebsiella, Acinetobacter, Enterobacter, Moraxella catarrhalis и их сочетаниям. (Mymensingh Medical Journal 19: 576-585 (2010)). Однако предположили, что двумя наиболее важными мерами для предотвращения обострения COPD являются активные иммунизации и постоянное поддержание фармакотерапии. (Proceedings of the American Thoracic Society 4:554-564 (2007)).
Внебольничная пневмония (CAP) описана в качестве основной причины смертности от инфекционных заболеваний и шестой по счету причины общей смертности в Соединенных Штатах Америки. Moraxella catarrhalis является одним из патогенов, ассоциированных с САР в Северной Америке (Clin Chest Med 26 (2005) 37-55) и является одним из патогенов, ассоциированных с внебольничной пневмонией от умеренной до сильной тяжести в Японии (J Infect Chemother. 2014 Nov 20. pii: S1341-321Х(14) 00396-1. doi: 10, 1016/j. jiac. 2014, 11, 006 [Epub ahead of print]).
Существует необходимость в эффективных вакцинах против М. catarrhalis.
Настоящее изобретение относится к белкам формулы (I).
A- (Ri)m- (В) η (формула I), где А представляет собой UspA2 из Moraxella catarrhalis или его иммуногенный фрагмент; R1 представляет собой аминокислоту; m представляет собой 0 или 2; B представляет собой гистидин и n представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
В одном конкретном варианте осуществления определены R1 и m, где (R1)m представляет собой AS (аланин, серин). В другом варианте осуществления, R1 представляет собой неприродные аминокислоты.
В одном из вариантов осуществления определены белки формулы (I) и белки по изобретению, где m представляет собой 0. В одном из вариантов осуществления, когда m представляет собой 0, n представляет собой 2. В другом варианте осуществления изобретения, когда m представляет собой 0, n представляет собой не 0.
В одном из вариантов осуществления m представляет собой 2.
В одном конкретном варианте осуществления n выбран из группы, состоящей из 1, 2 и 6. В другом варианте осуществления n выбран из группы, состоящей из 2 и 6. В одном конкретном варианте осуществления n представляет собой 2. В другом варианте осуществления n представляет собой 6.
В одном из вариантов осуществления n выбран из группы, состоящей из 0, 1, 2 и 6, или любой ее подгруппы.
В одном из вариантов осуществления n представляет собой 0. В другом варианте осуществления, когда n представляет собой 0, m представляет собой 2.
В одном из вариантов осуществления n представляет собой 1. В одном из вариантов осуществления n представляет собой 3. В одном из вариантов осуществления n представляет собой 4. В одном из вариантов осуществления n представляет собой 5.
В одном из вариантов осуществления белки формулы (I) дополнительно содержат метионин (М) на аминоконце; белок со следующей формулой: метионин-А-^^ДВД. Они включены в белки по изобретению. В одном конкретном варианте осуществления, когда m представляет собой 0, и n представляет собой 0, белки формулы (I) и белки по изобретению являются неприродными белками.
В одном из вариантов осуществления белки формулы (I) и белки по изобретению являются неприродными белками.
- 17 034352
В одном из вариантов осуществления, определены белки формулы (I), где А представляет собой UspA2 из М. catarrhalis. В другом варианте осуществления, определены белки формулы (I), где А представляет собой UspA2, как указано в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ
ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:
26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ
ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38 или из любой подгруппы из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. В другом варианте осуществления, определены белки формулы (I), где А представляет собой UspA2, где UspA2 является по меньшей мере на 63, 66, 70, 72, 74, 75, 77, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичным, на протяжении полной длины, с SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления определены белки формулы (I), где А представляет собой UspA2, где UspA2 является приблизительно на 75-100% идентичным аминокислотной последовательности UspA2, указанной в SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления А представляет собой UspA2, где UspA2 является приблизительно на 90-100% идентичным аминокислотной последовательности UspA2, указанной в SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления А представляет собой UspA2, где UspA2 является по меньшей мере на 95% идентичным аминокислотной последовательности UspA2, указанной в SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления определены белки формулы (I), где А представляет собой UspA2, где UspA2 является приблизительно на 75-100% идентичным аминокислотной последовательности UspA2, указанной в любой из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. В другом варианте осуществления А представляет собой UspA2, где UspA2 является приблизительно на 90-100% идентичным аминокислотной последовательности UspA2, указанной в любой из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. В дополнительном варианте осуществления, А представляет собой UspA2, где UspA2 является по меньшей мере на 95% идентичным UspA2, как указано в любой из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. В конкретном варианте осуществления, А представляет собой UspA2, обладающий аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO. 1.
В другом варианте осуществления определены белки формулы (I), где А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2 из М. catarrhalis. В другом варианте осуществления А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, где UspA2 обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38, или любой подгруппы из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. В другом варианте осуществления, А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, где UspA2 является приблизительно на 75-100% идентичным аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления, А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, где UspA2 является приблизительно на 90100% идентичным SEQ ID NO. 1. В другом варианте осуществления, А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, где UspA2 является по меньшей мере на 95% идентичным SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления, А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, где UspA2 является приблизительно на 75-100% идентичным аминокислотной последовательности, указанной в любом из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. В другом варианте осуществления, А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, где UspA2 является приблизительно на 90-100% идентичным любой из SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 38. В дополнительном варианте осуществления А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, где UspA2 является по меньшей мере на 95% идентичным любой из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38. В конкретном варианте осуществления, А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, где UspA2 обладает аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 1.
В другом варианте осуществления, А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2 из М. catarrhal, выбранный из группы, состоящей из аминокислот 30-540 из SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO: 39), аминокислот 31-540 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 40), аминокислот 30-519 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 41), аминокислот 30-564 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 42) и аминокислот 31-564 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 43). Более конкретно, в одном из вариантов осуществления, А представляет собой SEQ ID NO: 43, аминокислоты 31-564 из SEQ ID NO: 1. В дополнительном варианте осуществления, А представляет собой SEQ ID NO: 42, аминокислоты 30-564 из SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2 из М. catarrhal, выбранный из группы, состоящей из аминокислот 30-540 из SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO:39), аминокислот 31-540 из SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO: 40) и аминокислот 30-519 из SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO: 41). В другом варианте осуществления, А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2 с по меньшей мере 52% (American 2908), 55% (Norwegian 25), 57% (Japanese Z7476), 62% (Finnish FIN2344), 64% (American 2912), 69% (American P44), 73% (Amer- 18 034352 ican 7169), 76% (Norwegian 27), 81% (American V1145), 88% (German Z8063) или 100% (Swedish BC5) идентичности с SEQ ID NO. 39. В другом варианте осуществления, А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2 с по меньшей мере 52% (American 2908), 57% (Dutch F10), 62% (American 2933), 65% (Greek MC317), 67% (American V1122), 70% (American P44), 73% (American 7169), 76% (Norwegian 3),
81% (German Z8063), 100% (Swedish BC5) идентичности с SEQ ID NO. 43.
В другом варианте осуществления, А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2 из М. catarrhalis из SEQ ID NO: 2 -SEQ ID NO: 38, где фрагмент содержит аминокислоты, выравнивающиеся с аминокислотами 30-540 из SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO: 39), аминокислотами 31-540 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 40), аминокислотами 30-519 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 41), аминокислотами 30-564 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 42) или аминокислотами 31-564 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 43). В одном из вариантов осуществления, программу Gap (из пакета GCG) или программу Needle (из пакета EMBOSS), реализующие алгоритм Нидлмана-Вунша, можно использовать для выравнивания последовательностей.
UspA2 - SEQ ID NO: 1
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEE L FNL S G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL ITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK VNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRV NPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
Аминокислоты 30-540 UspA2 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID
N0:39
QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEE L FNL S G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN lYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL ITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK
Аминокислоты 31-540 UspA2 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
AKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD
- 19 034352
FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE TLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEE LFNL S G
RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA
NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL
ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK
Аминокислоты 30-519 UspA2 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE
AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD
FGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEELFNLSG
RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA
NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL
ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKS
Аминокислоты 30-564 UspA2 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEE L FNL S G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL ITANKTAID ANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK VNAFDGRITALDSKVENGMAAQAA
Аминокислоты 31-564 UspA2 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
AKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNWEE L FNL S G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK VNAFDGRITALDSKVENGMAAQAA
В другом варианте осуществления А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2 из М. catarrhalis, который отличается от SEQ ID NO: 1 одной или несколькими из следующих аминокислот: ак (аминокислоты) 30-298, ак 299-302, ак 303-333, ак 334-339, ак 349, ак 352-354, ак 368-403, ак 441, ак 451471, ак 472, ак 474-483, ак 487, ак 490, ак 493, ак 529, ак 532 или ак 543. В другом варианте осуществления, А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2 из М. catarrhalis, который отличается от SEQ ID NO: 1 тем, что он содержит по меньшей мере одну вставку аминокислоты по сравнению с SEQ ID NO. 1.
В другом варианте осуществления А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, содержащий связывающий ламинин домен и связывающий фибронектин домен.
В дополнительном варианте осуществления А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, содержащий связывающий ламинин домен, связывающий фибронектин домен и связывающий C3 домен.
В дополнительном варианте осуществления А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, содержащий связывающий ламинин домен, связывающий фибронектин домен, связывающий C3 домен и
- 20 034352 амфипатическую спираль.
Связывающий ламинин домен, связывающий фибронектин домен, связывающий C3 домен или амфипатическая спираль могут являться такими, как определено для SEQ ID NO: 1, или могут представлять собой соответствующую последовательность в любой из из SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 38.
Белки формулы (I) и белки по изобретению можно использовать в качестве иммуногенов у пациентов, таких как млекопитающие, в частности, человек. В частности, белки формулы (I) и белки по изобретению можно использовать в индукции иммунного ответ против М. catarrhalis у пациентов, в частности, людей. Белки формулы (I) и белки по изобретению можно использовать в лечении или профилактике инфекции или заболевания, вызванных М. catarrhalis. Более конкретно, белки формулы (I) и белки по изобретению можно использовать в лечении или профилактике отита среднего уха и/или COPD, и/или AECOPD, и/или пневмонии.
Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим UspA2 из М. catarrhalis или его иммуногенный фрагмент. Настоящее изобретение также относится к вакцинам, содержащим такие иммуногенные композиции и к их терапевтическим применениям. Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению можно использовать в лечении или профилактике М. catarrhalis инфекция или заболевание. Более конкретно, иммуногенные композиции и вакцины, описываемые в настоящем описании, можно использовать в лечении или профилактике отита среднего уха и/или COPD, и/или AECOPD, и/или пневмонии.
В одном из вариантов осуществления, иммуногенная композиция содержит UspA2 из М. catarrhalis. UspA2 может представлять собой один из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 38 или последовательность UspA2, по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную любому из SEQ ID NO: 1 -SeQ ID NO: 38. UspA2 также может представлять собой последовательность UspA2, по меньшей мере на 63% (American 2908), 66% (Japanese Z7476), 70% (Dutch F10), 72% (Finnish 358), 74% (American P44), 77% (Finnish 307), 80% (Norwegian 3), 84% (American V1145), 90% (German Z8063) или 100% (Swedish BC5) идентичную последовательности из SEQ ID NO. 1.
В другом варианте осуществления, иммуногенная композиция содержит иммуногенный фрагмент UspA2. Иммуногенный фрагмент UspA2 может представлять собой SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO.43, или последовательность, обладающую по меньшей мере 90, 95, 96, 97, 98, 99% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO.43. Иммуногенный фрагмент UspA2 может представлять собой последовательность UspA2, по меньшей мере на 52% (American 2908), 55% (Norwegian 25), 57% (Japanese Z7476), 62% (Finnish FIN2344), 64% (American 2912), 69% (American P44), 73% (American 7169), 76% (Norwegian 27), 81% (American V1145), 88% (German Z8063) или 100% (Swedish BC5) идентичную SEQ ID NO. 39. Иммуногенный фрагмент UspA2 также может представлять собой последовательность UspA2, по меньшей мере на 52% (American 2908), 57% (Dutch F10), 62% (American 2933), 65% (Greek MC317), 67% (American V1122), 70% (American P44), 73% (American 7169), 76% (Norwegian 3), 81% (German Z8063), 100% (Swedish BC5) идентичную SEQ ID NO. 43. Описаны различия аминокислот в UspA2 из различных видов Moraxella catarrhalis.
UspA2 содержит связывающий ламинин домен (например, аминокислоты 30-177 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44). В одном из вариантов осуществления, фрагмент UspA2 содержит связывающую ламинин область из SEQ ID NO: 1. В дополнительном варианте осуществления, фрагмент UspA2 содержит связывающую ламинин область из любой из SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 38.
Аминокислоты 30-177 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 44:
QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGW NQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVN GEEIEKNKDAIAKNNESIED.
UspA2 содержит связывающий фибронектин домен (например, аминокислоты 165-318 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45). В одном из вариантов осуществления, фрагмент UspA2 содержит связывающую фибронектин область из SEQ ID NO: 1. В дополнительном варианте осуществления, фрагмент UspA2 содержит связывающую фибронектин область из любой из SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO:38. Связывающий фибронектин домен из SEQ ID NO: 45 также обладает свойствами связывания C3.
Аминокислоты 165-318 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45:
KDAIAKNNE SIE DLYD
FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEE L FNL S G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQK.
UspA2 содержит связывающий компонент комплемента 3 (C3) домен (например, аминокислоты 30539 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 46 или аминокислоты 165-318 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45). В одном из вариантов осуществления, фрагмент UspA2 содержит связывающую C3 область из SEQ ID NO: 1. В дополнительном варианте осуществления, фрагмент UspA2 содержит связывающий C3 домен из любой из SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 38.
- 21 034352
Аминокислоты 30-539 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 46:
QAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE TLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEE L FNL S G RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL ITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDT
UspA2 содержит амфипатическую спираль (например, аминокислоты 519-564 из SEQ ID NO: 1 или аминокислоты 520-559 из SEQ ID NO:1). В одном из вариантов осуществления, фрагмент UspA2 содержит аминокислоты 519-564 из SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления, фрагмент UspA2 содержит аминокислоты 520-559 из SEQ ID NO:1. В дополнительном варианте осуществления, фрагмент UspA2 содержит амфипатическую спираль из любой из SEQ ID NO: 2 -SEQ ID NO:38.
В одном из вариантов осуществления, иммуногенная композиция содержит белок формулы (I), где А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, содержащий связывающий ламинин домен и связывающий фибронектин домен.
В дополнительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит белок формулы (I), где А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, содержащий связывающий ламинин домен, связывающий фибронектин домен и связывающий C3 домен.
В дополнительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит белок формулы (I), где А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, содержащий связывающий ламинин домен, связывающий фибронектин домен, связывающий C3 домен и амфипатическую спираль.
В другом варианте осуществления иммуногенная композиция содержит белок, как определено посредством формулы (I). Иммуногенная композиция может содержать, например, белок формулы (I) с дополнительным метионином на амино-конце.
В одном из вариантов осуществления настоящие иммуногенные композиции можно вводить с другими антигенами. Например, настоящую иммуногенную композицию можно вводить с антигенами из H. influenzae. Например, белок формулы (I) можно вводить с белком D (PD) из H. influenzae. Белок D может являться таким, как описано в WO91/18926. Настоящую иммуногенную композицию можно вводить с белком Е (РЕ) и пилином А (PilA) из H. Influenzae. Белок Е и пилин А могут являться такими, как описано в WO 2012/139225; содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки. Белок Е и пилин А могут присутствовать в форме слитого белка.
В другом варианте осуществления иммуногенные композиции по изобретению можно вводить с дополнительными антигенами из других видов бактерий, как известно, также вызывающих отит среднего уха, COPD, AECOPD или пневмонию.
Количество иммуногенной композиции, необходимое для достижения желательного терапевтического или биологического действия, зависит от ряда факторов, таких как применение, для которого она предназначена, способы введения, реципиент, и тип и тяжесть состояния, подвергаемого лечению, и в конце концов остается на усмотрение лечащего врача или ветеринара. Как правило, можно ожидать, что типичная доза для лечения состояния, вызванного, полностью или частично, М. catarrhalis у человека, например, может лежать в диапазоне приблизительно 0,001-0,120 мг. Более конкретно, типичная доза для лечения состояния, вызванного, полностью или частично, М. catarrhalis у человека, может лежать в диапазоне от приблизительно 0,003 до приблизительно 0,03 мг белка. Настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению, для применения в лечении или профилактике состояния или заболевание, вызванного, полностью или частично, M. catarrhalis. Иммуногенная композиция может содержать дополнительные антигены; типичная доза для лечения состояния, вызванного, полностью или частично, Н. influenzae у человека, может лежать в диапазоне от приблизительно 0,005 до приблизительно 0,05 мг для каждого дополнительного антигена. Эту дозу можно вводить в форме отдельной единичной дозы. Можно вводить также несколько отдельных единичных доз. Например, отдельные единичные дозы можно вводить в качестве отдельных примирующих доз в пределах первого года жизни или в качестве отдельных бустерных доз, вводимых с равномерными интервалами (например, каждые 1, 5 или 10 лет). Настоящее изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению для применения в лечении или профилактике состояния или заболевания, вызванного, полностью или частично, Moraxella catarrhalis в комбинации с по меньшей мере одним антигеном из Haemophilus influenzae.
Составы, содержащие иммуногенные композиции по изобретению, можно адаптировать для введения подходящим способом, например, посредством внутримышечного, сублингвального, чрескожного, интрадермального или интраназального способа. Такие составы можно получать посредством любого известного в данной области способа.
- 22 034352
Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать адъювант. Когда термин адъювант используют в этом описании, он относится к веществу, которое вводят в комбинации с иммуногенной композицией для стимуляции иммунного ответа пациентов на иммуногенный компонент композиции.
Пригодные адъюванты включают соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия или фосфат алюминия, или квасцы, но также могут представлять собой соль кальция, магния, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина, или ацилированных Сахаров, катионно или анионно дериватизированных сахаридов, или полифосфазенов. В одном из вариантов осуществления белок можно адсорбировать на фосфате алюминия. В другом варианте осуществления белок можно адсорбировать на гидроксиде алюминия. В третьем варианте осуществления квасцы можно использовать в качестве адъюванта.
Пригодные адъювантные системы, стимулирующие преимущественный ответ Th1, включают нетоксичные производные липида А, монофосфориллипид A (MPL) или его производные, в частности, 3де-С-ацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL) (его получение см. в GB 2220211 А); и комбинацию монофосфориллипида А, предпочтительно, 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А, вместе либо с солью алюминия (например, фосфатом алюминия или гидроксидом алюминия), либо с эмульсией масло-в-воде. В таких комбинациях антиген и 3D-MPL содержатся в одних и тех же структурах частиц, позволяя более эффективную доставку антигенных и иммуностимулирующих сигналов. Исследования показали, что 3D-MPL является способным дополнительно усиливать иммуногенность адсорбированного на квасцах антигена (Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; ЕР 689454-В1).
AS01 представляет собой адъювантную систему, содержащую MPL (3-О-дезацил-4'монофосфориллипид A), QS21 ((Quillaja saponaria Molina, фракция 21) Antigenics, New York, NY, USA) и липосомы. AS01B представляет собой адъювантную систему, содержащую MPL, QS21 и липосомы (50 мкг MPL и 50 мкг QS21). AS01E представляет собой адъювантную систему, содержащую MPL, QS21 и липосомы (25 мкг MPL и 25 мкг QS21). В одном из вариантов осуществления иммуногенная композиция или вакцина содержит AS01. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция или вакцина содержит AS01B или AS01E. В конкретном варианте осуществления иммуногенная композиция или вакцина содержит AS01e.
AS02 представляет собой адъювантную систему содержащую MPL и QS21 в эмульсии масло/вода. AS02V представляет собой адъювантную систему, содержащую MPL и QS21 в эмульсии масло/вода (50 мкг MPL и 50 мкг QS21).
AS03 представляет собой адъювантную систему, содержащую α-токоферол и сквален в эмульсии масло/вода (м/в). AS03a представляет собой адъювантную систему, содержащую α-токоферол и сквален в эмульсии м/в (11,86 мг токоферола). AS03B представляет собой адъювантную систему, содержащую αтокоферол и сквален в эмульсии м/в (5,93 мг токоферола). AS03C представляет собой адъювантную систему, содержащую α-токоферол и сквален в эмульсии м/в (2,97 мг токоферола). В одном из вариантов осуществления, иммуногенная композиция или вакцина содержит AS03.
AS04 представляет собой адъювантную систему, содержащую MPL (50 мкг MPL), адсорбированный на соли алюминия (500 мкг Al3+). В одном из вариантов осуществления, иммуногенная композиция или вакцина содержит AS04.
Система, включающая в себя применение QS21 и 3D-MPL, описана в WO 94/00153. Композиция, где QS21 инактивируют с помощью холестерина, описана в WO 96/33739. Дополнительный адъювантный состав, включающий в себя QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии масло в воде, описан в WO 95/17210. В одном из вариантов осуществления иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой QS21. Состав может также содержать эмульсию масло в воде и токоферол (WO 95/17210). Содержащие неметилированные CpG олигонуклеотиды (WO 96/02555) и другие иммуномодулирующие олигонуклеотиды (WO 0226757 и WO 03507822) также являются предпочтительными индукторами ответа ТН1 и являются пригодными для использования по настоящему изобретению.
Дополнительные адъюванты представляют собой адъюванты, выбранные из группы из солей металлов, эмульсий масло в воде, агонистов Toll-подобного рецептора (в частности, агониста Tollподобного рецептора 2, агониста Toll- подобного рецептора 3, агониста Toll-подобного рецептора 4, агониста Toll-подобного рецептора 7, агониста Toll-подобного рецептора 8 и агониста Toll-подобного рецептора 9), сапонинов или их сочетаний.
Настоящее изобретение относится к способу получения иммуногенной композиции, включающему в себя комбинацию белка формулы (I) или белка по изобретению с адъювантом.
Настоящее изобретение дополнительно относится к вакцине, содержащей иммуногенную композицию по изобретению и фармацевтически приемлемый адъювант.
Возможные наполнители включают аргинин, плюроновую кислоту и/или полисорбат. В предпочтительном варианте осуществления, используют полисорбат 80 (например, TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 80). В дополнительном варианте осуществления, используют конечную концентра- 23 034352 цию от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,06%. Конкретно, можно использовать конечную концентрацию 0,03, 0,04, 0,05 или 0,06% полисорбата 80 (мас./об.).
Настоящее изобретение относится к способу получения иммуногенной композиции или вакцины, включающему в себя комбинацию белка формулы (I) или белка по изобретению с фармацевтически приемлемым наполнителем.
Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим белки по изобретению. Термин нуклеиновая кислота относится к полимерной форме нуклеотидов. Нуклеотиды могут представлять собой рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, или модифицированные формы либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов. Термин включает одинарные и двойные формы ДНК. Нуклеиновые кислоты предпочтительно являются в основном свободными от других нуклеиновых кислот.
Настоящее изобретение относится к способу получения нуклеиновых кислот по изобретению. Нуклеиновые кислоты по изобретению можно получать способами, известными специалистам в данной области. Например, нуклеиновые кислоты по изобретению могут являться частично или полностью синтезированными. Нуклеиновые кислоты можно получать посредством расщепления более длинных нуклеиновых кислот или соединения более коротких нуклеиновых кислот.
Настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики отита среднего уха. Способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества белка формулы (I) или белка по изобретению.
Настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики обострений при хроническом обструктивном заболевании легких. Обострение COPD может представлять собой острый приступ. Способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества белка формулы (I) или белка по изобретению.
Настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики пневмонии. Способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества белка формулы (I) или белка по изобретению.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению, для применения в лечении или профилактике состояния или заболевания, вызванного, полностью или частично, Moraxella catarrhalis. Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый адъювант.
Настоящее изобретение относится к применению (а) белков формулы (I) и белков по изобретению, (b) иммуногенной композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению, или (с) вакцины, содержащей (c1) белок формулы (I) или белок по изобретению, или (с2) иммуногенной композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению, для изготовления лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции или заболевания, вызванных М. catarrhalis.
Настоящее изобретение относится к применению (а) белков формулы (I) и белков по изобретению, (b) иммуногенной композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению, или (с) вакцины, содержащей (c1) белок формулы (I) или белок по изобретению, или (с2) иммуногенной композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению, для изготовления лекарственного средства для лечения или профилактики отита среднего уха.
Настоящее изобретение относится к применению (а) белков формулы (I) и белков по изобретению, (b) иммуногенной композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению, или (с) вакцины, содержащей (c1) белок формулы (I) или белок по изобретению, или (с2) иммуногенной композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению, для изготовления лекарственного средства для лечения или профилактики острых приступов хронического обструктивного заболевания легких (AECOPD).
Настоящее изобретение относится к применению (а) белков формулы (I) и белков по изобретению, (b) иммуногенной композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению, или (с) вакцины, содержащей (c1) белок формулы (I) или белок по изобретению, или (с2) иммуногенной композиции, содержащей белок формулы (I) или белок по изобретению, для изготовления лекарственного средства для лечения или профилактики пневмонии.
Следующие примеры предназначены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения никаким образом.
В примерах, следующие термины обладают указанным значением:
- 24 034352
6xhis=mecTb остатков гистидина;
хд=центробежная сила (количество ускорений свободного падения)
А3=аланин, серин
ВЗА=бычий сывороточный альбумин;
°С=градусы Цельсия;
СаС1г=хлорид кальция;
СО=круговой дихроизм;
СНС1з=хлороформ;
СНзСЫ=ацетонитрил;
С0г=диокоид углерода;
Да=дальтон;
ДНК=дезоксирибонуклеиновая кислота;
00=растворенный кислород;
ОЗС=дифференциальная сканирующая калориметрия;
ЭДТА=этилендиаминтетрауксусная кислота;
Ц=час;
НгОвода;
Н2С>2=перокоид водорода;
- 25 034352
НСВ1=индукция при высокой плотности клеток;
НС1=соляная кислота;
Н1з=Ыз = гистидин;
1МАС=аффинная хроматография с использованием иммобилизованных металлов;
1РТС=изопропил-р-0-1-тиогалактопиранозид;
кВ=киловольт
Ъ=литр;
ЪВ=Луриа-Бертани;
ВСВ1=индукция при низкой плотности клеток;
МеОН=метанол; мл=миллилитр;
ЫаС1=хлорид натрия;
ОБ./МИН=об./мин=оборотов в минуту;
мин=минута;
мМ=миллимолярный;
мкг=микрограмм;
мкл=микролитр;
ЮТ=молекулярная масса;
т/г=масса/заряд;
ЫаС1=хлорид натрия;
ЫаР04=фосфат натрия;
нг=нанограмм;
ЫН40Н=гидроксид аммония;
нм=нанометр;
О.D.=оптическая плотность;
РВЗ=фосфатно-солевой буфер;
ПЦР=полимеразная цепная реакция;
рзФ=фунтов на квадратный дюйм;
РУВР=поливинилидендифторид;
ЗВЗ-РАСЕ=электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия;
ТЕА=трифторуксусная кислота
Тт=температура плавления;
Тт.1=первая температура плавления;
Тт2=вторая температура плавления;
масс./об.=масса/объем.
Примеры
Пример 1. Белковые конструкции
Белковые конструкции получали с различными фрагментами UspA2 в присутствии и в отсутствие дополнительных аминокислот. В следующей таблице описаны полученные белковые конструкции.
- 26 034352
Таблица 2. Белковые конструкции, содержащие белок UspA2
ID конструкции Описание N-конец---------------------С-конец
МС-001 UspA2+l/2 спирали+ 6Hi s Фрагмент UspA2 (ак: 30-540 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 47) ASHHHHHH
ак 30 540 541 548
МС-002 UspA2+l/2 спирали Фрагмент UspA2 (ак: 30-540 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 47)
ак 30 540
мс-ооз UspA2+l/2 спирали+lHis Фрагмент UspA2 (ак: 30-540 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 47) H
ак 30 540 541
МС-004 UspA2+l/2 спирали+2Н1з Фрагмент UspA2 (ак: 30-540 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 47) HH
ак 30 540 541 542
МС-005 изрА2+Аспирали + 6His Фрагмент UspA2 (ак: 30-519 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 8) ASHHHHHH
ак 30 519 520 527
МС-006 изрА2+Аспирали Фрагмент UspA2 (ак: 30-519 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 4 8)
30 519
МС-007 UspA2+спираль+ 6His Фрагмент UspA2 (ак: 30-564 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 4 9) ASHHHHHH
ак 30 564 565 572
МС-008 UspA2+спираль + 2His Фрагмент UspA2 (ак: 30-564 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 4 9) HH
ак 30 564 565 566
МС-009 UspA2+спираль +2His Δ0 Фрагмент UspA2 (ак: 31-564 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 50) HH
ак 31 564 565 566
мс-ою UspA2+спираль + 2His Фрагмент UspA2 (ак: 30-564 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 4 9)
ак 30 564
МС-011 UspA2+l/2 спирали +6His Δ0 Фрагмент UspA2 (ак: 31-540 из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 51) ASHHHHHH
ак 30 540 541 548
ак=аминокислота
Последовательности ДНК и аминокислотные последовательности для каждой белковой конструкции, перечисленной в табл. 2, указаны ниже.
- 27 034352
Последовательности белковых конструкций:
МС-001 (ДНК) - SEQ ID NO: 52
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGA
TCAGAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGC
CAGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATG
TGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCA
GAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT
GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATC
T GGT GAAT GGC T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GCCAT T GCCAAAAACAACGAAAGCAT T GA
AGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAA
G CACAGAAT GAAAC С С T GAAAGG T С T GAT TAG СAACAG CATC GAAAATAC СAATAACAT TAG CA
AAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATСTGAGCGG
T C G T С T GAT T GAT CAGAAAGC CGATAT C GATAATAACAT TAACAACAT T TAT GAAC T GGCACAG
CAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTGCTGG
AAC TGTCTGGT СAC С T GAT C GAT CAGAAAAC TGATATTGCC CAGAAT CAG G СAAATAT T CAG GA
TCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATTGATGCC
CTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAACGAACTGC
AGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCAAGCTCTGAAAA
CACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAG
ACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAATATCGCCAAAAATC
AGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTC
TTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAA
G С C GAT G CAGAT G CAAG С T T T GAAACAC T GAC GAAAAAC CAGAACAC С С T GAT T GAAAAAGATA
AAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGA
TACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCC AAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATA С CAAAG CAAG C CAT CAT CAT СAC СAC СAC TAA
МС-001 (белок) - (M) (аминокислоты UspA2 30-540) (ASHHHHHH) SEQ ID NO: 53
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEEL
DEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNT
QRNLVNG EEIEKNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTN
NITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEE
GLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY
NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNI
AKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLI
EKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVT
- 28 034352
ALDTKASHHHHHH
МС-002 (ДНК) - SEQ ID NO: 54
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGA TCAGAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGC CAGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATG TGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCA GAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATC T GGT GAAT GGC T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GCCATT GCCAAAAACAACGAAAGCAT T GA AGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAA G CACAGAAT GAAAC С С T GAAAGG T С T GAT TAC СAACAG CATC GAAAATAC СAATAACAT TAC CA AAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATСTGAGCGG T C G T С T GAT T GAT CAGAAAGC CGATAT C GATAATAACAT TAACAACAT T TAT GAAC T GGCACAG CAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTGCTGG AAC TGTCTGGT СAC С T GAT C GAT CAGAAAAC TGATATTGCC CAGAAT CAG G СAAATAT T CAG GA TCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATTGATGCC CTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAACGAACTGC AGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCAAGCTСTGAAAA CACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAG ACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAATATCGCCAAAAATC AGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTC TTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAA G С C GAT G CAGAT G CAAG С T T T GAAACAC T GAC GAAAAAC CAGAACAC С С T GAT T GAAAAAGATA AAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGA TACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCC AAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATA CCAAATAA
МС-002 (белок) - (M) ( аминокислоты UspA2 30-540) SEQ ID NO 55
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEEL DEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNT QRNLVNG EEIEKNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTN NITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEE GLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQD
AYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNI
- 29 034352
AKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLI EKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVT ALDTK
SEQ ID NO: 56
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGA TCAGAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGC CAGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATG TGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCA GAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATC T GGT GAAT GGC T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GCCAT T GCCAAAAACAACGAAAGCAT T GA AGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAA G CACAGAAT GAAAC С С T GAAAGG T С T GAT TAC СAACAG CATC GAAAATAC СAATAACAT TAC CA AAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATСTGAGCGG T C G T С T GAT T GAT CAGAAAGC CGATAT C GATAATAACAT TAACAACAT T TAT GAAC T GGCACAG CAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTGCTGG AAC TGTCTGGT СAC С T GAT C GAT CAGAAAAC TGATATTGCC CAGAAT CAG G СAAATAT T CAG GA TCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATTGATGCC CTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAACGAACTGC AGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCAAGCTCTGAAAA CACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAG ACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAATATCGCCAAAAATC AGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTC TTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAA G С C GAT G CAGAT G CAAG С T T T GAAACAC T GAC GAAAAAC CAGAACAC С С T GAT T GAAAAAGATA AAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGA TACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCC AAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATA CCAAAGTTAATGCATTTGATGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGTAAAGTTGAAAATGGAATGGC AGCACAAGCAGCACACTAA
SEQ ID NO: 5 7
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEEL DEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNT QRNLVNG FEIEKNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTN NITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEE GLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY
- 30 034352
NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNI AKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLI EKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVT AL D T KVNAFDGRITALDS KVENGMAAQAAH
MC-003 (ДНК) -SEQ ID NO: 8 7
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGA TCAGAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGC CAGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATG TGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCA GAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATC T GGT GAAT GGC T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GCCATT GCCAAAAACAACGAAAGCAT T GA AGAT CTGTATGATTTTGGTCAT GAAG T T G С C GAAAG CAT T G G T GAAAT T CAT G CACATAAC GAA G CACAGAAT GAAAC С С T GAAAGG T С T GAT TAC CAACAG CATC GAAAATAC СAATAACAT TAC CA AAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATСTGAGCGG T C G T С T GAT T GAT CAGAAAGC CGATAT C GATAATAACAT TAACAACAT T TAT GAAC T GGCACAG CAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTGCTGG AAC TGTCTGGT СAC С T GAT C GAT CAGAAAAC TGATATTGCC CAGAAT CAG G СAAATAT T CAG GA TCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATTGATGCC CTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAACGAACTGC AGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCAAGCTСTGAAAA CACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAG ACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAATATCGCCAAAAATC AGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTC TTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAA G С C GAT G CAGAT G CAAG С T T T GAAACAC T GAC GAAAAAC CAGAACAC С С T GAT T GAAAAAGATA AAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGA TACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCC AAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATA CCAAACACTAA
MC-003 (белок) - (M) (аминокислоты UspA2 30-540) (H) -SEQ ID NO: 88
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEEL DEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNT QRNLVNG EEIEKNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTN NITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEE
- 31 034352
GLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNI AKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLI EKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVT ALDTKH
MC-004 (ДНК) - SEQ ID NO: 58
ATGCAGGССAAAAATGATATTACССTGGAAGATСTGСCGTATСTGATСAAAAAAATCGA TCAGAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGC CAGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATG TGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCA GAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATC T GGT GAAT GGC T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GCCAT T GCCAAAAACAACGAAAGCAT T GA AGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAA G C AC AGAAT GAAAC С С T GAAAGG T С T GAT T AC С AAC AG CATC GAAAAT AC С AAT AAC AT T AC C A AAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATСTGAGCGG T C G T С T GAT T GAT CAGAAAGC CGATAT C GATAATAACAT TAACAACAT T TAT GAAC T GGCACAG CAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTGCTGG AAC TGTCTGGT СAC С T GAT C GAT CAGAAAAC TGATATTGCC CAGAAT CAG G СAAATAT T CAG GA TCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATTGATGCC CTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAACGAACTGC AGGAT GCC TAT GCAAAACAGCAGAC T GAAGCCAT CGACGCAC T GAACAAGGCAAGC T С T GAAAA CACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAG ACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAATATCGCCAAAAATC AGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTC TTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAA G С C GAT G CAGAT G CAAG С T T T GAAACAC T GAG GAAAAAC CAGAACAC С С T GAT T GAAAAAGATA AAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGA TACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCC AAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATA CCAAACATCATTAA
MC-004 (белок) - (M) (аминокислоты UspA2 30-540) (HH) SEQ ID NO: 59
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEEL DEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNT QRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTN
- 32 034352
NITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEE GLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNI AKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLI EKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVT ALDTKHH
MC-OO5 (ДНК) - SEQ ID NO: 60
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGA TCAGAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGC CAGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATG TGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCA GAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATC T GGT GAAT GGC T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GCCATT GCCAAAAACAACGAAAGCAT T GA AGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAA G CACAGAAT GAAAC С С T GAAAGG T С T GAT TAC СAACAG CATC GAAAATAC СAATAACAT TAC CA AAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATСTGAGCGG T C G T С T GAT T GAT CAGAAAGC CGATAT C GATAATAACAT TAACAACAT T TAT GAAC T GGCACAG CAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTGCTGG AAC TGTCTGGT СAC С T GAT C GAT CAGAAAAC TGATATTGCC CAGAAT CAG G СAAATAT T CAG GA TCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATTGATGCC CTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAACGAACTGC AGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCAAGCTCTGAAAA CACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAG AC C GAAG CGATTGATGCGCT GAACAAAGCCTCTTCT GAAAATACACAGAATAT C G С СAAAAAT C AGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTC TTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAA G С C GAT G CAGAT G CAAG С T T T GAAACAC T GAC GAAAAAC CAGAACAC С С T GAT T GAAAAAGATA AAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGA TACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCC AAAAG C G CAAG C CAT CAT CAT CAC СAC СAC TAA
MC-OO5 (белок) - (M) (аминокислоты UspA2 30-519) (ASHHHHHH) SEQ ID NO: 61
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEEL DEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNT QRNLVNG EEIEKNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTN
- 33 034352
NITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEE GLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNI AKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLI EKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSASHHHHHH
MC-006 (ДНК) - SEQ ID NO: 62
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGA TCAGAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGC CAGTATGGAAATATTСTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTСTGGAAGAGCTGGATGAAGATG TGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCA GAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATC T GGT GAAT GGC T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GCCAT T GCCAAAAACAACGAAAGCAT T GA AGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAA G C AC AGAAT GAAAC GGT GAAAG G T С T GAT T AC CRAG AG CATC GAAAAT AC С AAT AAC AT TAG C A AAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTGAGCGG T C G T С T GAT T GAT CAGAAAGCC GATAT C GATAATAACAT TAACAACAT T TAT GAAC T GGCACAG CAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTGCTGG AAC TGTCTGGT GAG С T GAT C GAT CAGAAAAC TGATATTGCC CAGAAT GAG G GAAATAT T GAG GA TCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATTGATGCC CTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAACGAACTGC AGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCAAGCTCTGAAAA CACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAG ACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAATATCGCCAAAAATC AGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTC TTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAA G С C GAT G CAGAT G CAAG С T T T GAAACAC T GAG GAAAAACCAGAACACСС T GAT T GAAAAAGATA AAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGA TACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCC AAAAGCTAA
MC-006 (белок) - (M) (аминокислоты UspA2 30-519) SEQ ID NO 63
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEEL DEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNT QRNLVNG EEIEKNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTN NITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEE
- 34 034352
GLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNI AKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLI EKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKS
MC-007 (ДНК) - SEQ ID NO: 64
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGA TCAGAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGC CAGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATG TGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCA GAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATC T GGT GAAT GGC T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GCCATT GCCAAAAACAACGAAAGCAT T GA AGATСTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGСCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAA G CACAGAAT GAAAC С С T GAAAGG T С T GAT TAC CAACAG CATC GAAAATAC СAATAACAT TAC CA AAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATСTGAGCGG T C G T С T GAT T GAT CAGAAAGC CGATAT C GATAATAACAT TAACAACAT T TAT GAAC T GGCACAG CAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTGCTGG AAC TGTCTGGT СAC С T GAT C GAT CAGAAAAC TGATATTGCC CAGAAT CAG G СAAATAT T CAG GA TCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATTGATGCC CTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAACGAACTGC AGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCAAGCTCTGAAAA CACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAG ACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAATATCGCCAAAAATC AGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTC TTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAA G С C GAT G CAGAT G CAAG С T T T GAAACAC T GAC GAAAAAC CAGAACAC С С T GAT T GAAAAAGATA AAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGA TACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCC AAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATA CCAAAGTTAATGCATTTGATGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGTAAAGTTGAAAATGGTATGGC AGCACAGGCAGCAGCAAGCCATCATCATCACCACCACTAA
MC-007 (белок) - (M) (аминокислоты UspA2 30-564) (ASHHHHHH) SEQ ID NO: 65
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEEL DEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNT QRNLVNG ЕЕIEKNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTN
- 35 034352
NITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEE GLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNI AKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLI EKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVT ALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAASHHHHHH
MC-008 (ДНК) - SEQ ID NO: 66
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGA TCAGAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGC CAGTATGGAAATATTCTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTCTGGAAGAGCTGGATGAAGATG TGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCA GAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATC T GGT GAAT GGC Τ Τ T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GCCATT GCCAAAAACAACGAAAGCAT T GA AGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAA G CACAGAAT GAAAC GGT GAAAGG T С T GAT TAG СAACAG CATC GAAAATAC СAATAACAT TAG CA AAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTΤTAATСTGAGCGG T C G T С T GAT T GAT CAGAAAGC CGATAT C GATAATAACAT TAACAACAT Τ TAT GAAC T GGCACAG CAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTGCTGG AAC TGTCTGGT СAC С T GAT C GAT CAGAAAAC TGATATTGCC CAGAAT CAG G СAAATAT T CAG GA TCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATTGATGCC CTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAACGAACTGC AGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCAAGCTCTGAAAA CACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAG ACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAATATCGCCAAAAATC AGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTC TTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAA G С C GAT G CAGAT G CAAG C Τ Τ T GAAACAC T GAC GAAAAAC CAGAACAC С С T GAT T GAAAAAGATA AAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGA TACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCC AAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATA CCAAAGTTAATGCATTTGATGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGTAAAGTTGAAAATGGTATGGC AGCACAGGCAGCACACCACTAA
MC-008 (белок) - (M) (UspA2 30-564) (HH) SEQ ID NO: 67
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEEL DEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNT
- 36 034352
QRNLVNG FEIEKNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T LKGLITNSIENTN NITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEE GLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNI AKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLI EKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKEAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVT AL D T KVNAFDGRITALDS KVENGMAAQAAHH
MC-009 (ДНК) - SEQ ID NO: 68
ATGGCGAAAAATGATATTACССTGGAAGATСTGСCGTATСTGATСAAAAAAATCGATCA GAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCCAG TATGGAAATATTСTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTСTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTGG G T T G GAAT CAGAAT GATAT C G С CAAT С T G GAAGAT GAT G T T GAAAC С С T GAC СAAAAAT CAGAA TGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTTGAA GGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATCTGG T GAAT GGC T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GCCAT T GCCAAAAACAACGAAAGCAT T GAAGA TCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAAGCA CAGAAT GAAAC С С T GAAAG G T С T GAT TAC CAACAG CATC GAAAATAC CAATAACAT TAC СAAAA ACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTGAGCGGTCG T С T GAT T GAT C AGAAAG С C GAT AT C GAT AAT AAC AT T AAC AAC AT T T AT GAAC T G G C AC AG C AG CAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTGCTGGAAC TGTCTGGTCACCTGATCGATCAGAAAACTGATATTGCCCAGAATCAGGCAAATATTCAGGATCT GGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATTGATGCCCTG AATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAACGAACTGCAGG ATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCAAGCTCTGAAAACAC GCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAGACC GAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTСTTСTGAAAATACACAGAATATCGCCAAAAATCAGG CCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTCTTC TGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAAGCC GAT G CAGAT G CAAG С T T T GAAACAC T GAC GAAAAAC CAGAACAC С С T GAT T GAAAAAGATAAAG AACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGATAC CAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCCAAA AGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATACCA AAGTTAATGCATTTGATGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGTAAAGTTGAAAATGGTATGGCAGC ACAGGCAGCACACCACTAA
MC-009 (белок) - (M) (UspA2 31-564) (HH) SEQ ID NO: 69
MAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELD
- 37 034352
EDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQ RNLVNG FEIEKNKDAIAKNNE SIE DLYD FGHEVAE SIGEIHAHNEAQNE T L KGLITNSIENTNN ITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEG LLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYN ELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIA KNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIE KDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTA LDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAHH
MC-010 (ДНК) - SEQ ID NO: 70
ATGCAGGCCAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTGCCGTATCTGATCAAAAAAATCGA TCAGAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGC CAGTATGGAAATATTСTGGCCCTGGAAGAACTGAATAAAGCTСTGGAAGAGСTGGATGAAGATG TGGGTTGGAATCAGAATGATATCGCCAATCTGGAAGATGATGTTGAAACCCTGACCAAAAATCA GAATGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTT GAAGGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATC T GGT GAAT GGC T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGAT GCCATT GCCAAAAACAACGAAAGCAT T GA AGATCTGTATGATTTTGGTCATGAAGTTGCCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAA G CACAGAAT GAAAC С С T GAAAGG T С T GAT TAG СAACAG CATC GAAAATAC СAATAACAT TAG GA AAAACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATСTGAGCGG T C G T С T GAT T GAT CAGAAAGC CGATAT C GATAATAACAT TAACAACAT T TAT GAAC T GGCACAG CAGCAGGATCAGCATAGCAGCGATATCAAAACCCTGAAAAAAAACGTTGAAGAAGGTCTGCTGG AAC TGTCTGGT CAC С T GAT C GAT CAGAAAAC TGATATTGCC CAGAAT GAG G GAAATAT T GAG GA TCTGGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATTGATGCC CTGAATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAACGAACTGC AGGATGCCTATGCAAAACAGCAGACTGAAGCCATCGACGCACTGAACAAGGCAAGCTCTGAAAA CACGCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAG ACCGAAGCGATTGATGCGCTGAACAAAGCCTCTTCTGAAAATACACAGAATATCGCCAAAAATC AGGCCGATATTGCCAACAATATCAATAATATCTATGAACTGGCCCAGCAGCAGGATCAGCACTC TTCTGATATCAAAACACTGGCAAAAGCAAGCGCAGCAAATACCGATCGTATTGCGAAAAACAAA G С C GAT G CAGAT G CAAG С T T T GAAACAC T GAC GAAAAAC CAGAACAC С С T GAT T GAAAAAGATA AAGAACATGATAAACTGATCACCGCCAATAAAACCGCAATTGATGCAAATAAAGCCAGCGCAGA TACCAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACCAAAAATGCC AAAAGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATA CCAAAGTTAATGCATTTGATGGTCGTATTACCGCTCTGGATAGTAAAGTTGAAAATGGTATGGC AGCACAGGCAGCATAA
MC-010 (белок) - (M) (аминокислоты UspA2 30-564) SEQ ID NO
- 38 034352
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEEL DEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNT QRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTN NITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEE GLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAY NELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNI AKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLI EKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVT AL D T KVNAFD GRITALD S KVENGMAAQAA
MC-011 (ДНК) - SEQ ID NO: 72
AT G G C GAAAAAT GATAT TAG С С T G GAAGAT CTGCCGTATCTGAT СAAAAAAAT C GAT CA GAACGAACTGGAAGCCGATATTGGTGATATTACCGCACTGGAAAAATATCTGGCACTGAGCCAG TATGGAAATATTСTGGCССTGGAAGAACTGAATAAAGCTСTGGAAGAGCTGGATGAAGATGTGG G T T G G7XAT C AGAAT GAT AT C G С C AAT С T G GAAGAT G AT G T T GAAAC С С T G AC C ΆΑΑΑΑΤ C AGAA TGCACTGGCAGAACAGGGTGAAGCAATTAAAGAAGATCTGCAGGGTCTGGCAGATTTTGTTGAA GGTCAGGAAGGCAAAATTCTGCAGAACGAAACCAGCATCAAAAAAAACACCCAGCGTAATCTGG T GAAT G G С T T T GAAAT T GAAAAAAACAAAGATGСCAT T GС СAAAAACAACGAAAGCAT T GAAGA TСTGT AT GATTTTGGTCATGAAGTTGСCGAAAGCATTGGTGAAATTCATGCACATAACGAAGCA CAGAAT GAAAC С С T GAAAGG T С T GAT TAG CAAC AGC AT C GAAAAT AC C AAT AAC AT TAG CAAAA ACAAAGCAGATATTCAGGCGCTGGAAAATAATGTTGTGGAAGAACTGTTTAATCTGAGCGGTCG T С T GAT T GAT CAGAAAG С C GAT AT C GAT AAT AACAT T AACAAC AT T TAT GAAC T G GC AC AGC AG CAG GAT CAG CATAG CAG C GATAT СAAAACСС T GAAAAAAAACG T T GAAGAAGGTCTGCTGGAAC TGTCTGGT СAC С T GAT C GAT CAGAAAAC T GATAT T G С C CAGAAT CAG GCAAATAT T CAGGAT С T GGCCACCTATAATGAACTGCAGGATCAGTATGCACAGAAACAGACCGAAGCAATTGATGCCCTG AATAAAGCGAGCAGCGAAAACACCCAGAATATCGAAGATCTGGCAGCATACAACGAACTGCAGG ATGCCTATG C AAAAC AG CAG AC T GAAG С C AT C GAC G С AC T GAAC AAG G C AAG С T С T GAAAAC AC GCAGAACATTGAAGATCTGGCTGCCTATAATGAATTACAGGATGCGTATGCCAAACAGCAGACC GAAG CGATTGATGCGCT GAACAAAG CCTCTTCT GAAAATACACAGAATAT C G C GAAAAAT CAG G CCGATATTGC CAAC AAT AT C AAT AAT AT СТАТ GAAC T G G С С C AG CAG CAGGAT CAG С AC T С T T C T GAT AT C AAAAC AC T G G C AAAAG C AAG C G CAG С AAAT AC CGATCGTATTGC GAAAAAC AAAG С C GAT GC AGAT G CAAG С T T T GAAACAC T GAC GAAAAAC CAGAACAC С С T GAT T GAAAAAGAT AAAG AACAT G AT AAAC T G AT С AC C G С C AAT AAAAC C G C AAT T G AT G GAAAT AAAG С C AG C G C AGAT AC GAAATTTGCAGCAACCGCAGATGCAATTACCAAAAATGGCAATGCCATCACGAAAAATGCCAAA AGCATTACCGATCTGGGCACCAAAGTTGATGGTTTTGATAGCCGTGTGACCGCACTGGATACCA AAGCAAGC CAT CAT CAT CAC CAC CAC TAA
MC-011 (белок) - (M) (аминокислоты UspA2 31-540) (ASHHHHHH)
SEQ ID NO: 73
MAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELD EDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQ RNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNN ITKNKADIQALENNWEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEG LLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYN ELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIA KNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIE KDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTA LDTKASHHHHHH
- 39 034352
Конструирование вектора и трансформация
Последовательность ДНК для UspA2 из штамма АТСС 25238 - SEQ
ID N0: 74.
ATGAAAACСATGAAACТТСТСССТСТΑΑΑΑΆΤСGСТGТААССAGТGССATGАТТАТТGG
CTTGGGTGCGGCATCTACTGCGAATGCGCAGGCTAAAAATGATATAACTTTAGAGGATTTACCA
ТАТ Т ТААТAAAAAAGAT Т GAC CAAAATGAAT Т GGAAGCAGATАТСGGAGATАТ ТAC TGCTCTTG
AAAAGTATCTAGCACTTAGCCAGTATGGCAATATTTTAGCTCTAGAAGAGCTCAACAAGGCTCT
AGAAGAGC Т CGACGAGGAT GT Т GGAT GGAAT CAGAATGATAT Т GCAAAC Т Т GGAAGAT GAT GT Т
GAAACGCТCACCAAAAATCAAAATGCТТТGGCТGAACAAGGTGAGGCAATТAAAGAAGATСТТС
AAGGGCТТGCAGATТТТGTAGAAGGGCAAGAGGGTAAAATТСTACAAAATGAAACТТСААТТАА
ААААААТАС Т CAGAGAAACC Т Т GT СААТ GGGT Т Т GAGAT Т GAGAAAAATAAAGAT GC TAT Т GC Т AAAAACAATGAGTCTATCGAAGATCTTTATGATTTTGGTCATGAGGTTGCAGAAAGTATAGGCG AGATACAT GC Т CATААТ GAAGCGCAAAAT GAAAC Т С Т TAAAGGC Т Т GATAACAAACAGTAT Т GA GAATАС ТААТААТАТТАС СAAAAACAAAG С Т GACАТ С СAAG САС Т Т GAAAACААТ G Т С G ТAGAA GAAC ТАТТ СААТ С ТAAG CGGTCGCCTAATTGAT СAAAAAGСAGATАТ Т GATААТААСАТ СААСА АТАТ С TAT GAGC Т GGCACAACAGCAAGAT CAGCATAGC Т С Т GATAT СААААСАС Т ТАААААААА TGTCGAAGAAGGTTTGTTGGAGCTAAGCGGTCACCTAATTGATCAAAAAACAGATATTGCTCAA AACCAAGCTAACATCCAAGATCTGGCCACTTACAACGAGCTACAAGACCAGTATGCTCAAAAGC АААС С GAAG С GAT Т GAC G С Т С ТАААТAAAGСAAGС Т С Т GAGAATАСАСААААСАТ С GAAGATС Т GGCCGCTTACAACGAGCTACAAGATGCCTATGCCAAACAGCAAACCGAAGCAATTGACGCTCTA AATAAAGCAAGCTCTGAGAATACACAAAACATCGAAGATCTGGCCGCTTACAACGAGCTACAAG ATGCCTATGCCAAACAGCAAACCGAAGCCATTGACGCTCTAAATAAAGCAAGCTCTGAGAATAC АСААААСАТ Т GC TAAAAACCAAGCGGATAT Т GC ТААТААСАТСААСААТАТ С TAT GAGC Т GGCA CAACAGCAAGATCAGCATAGCТСТGATATCAAAACCTTGGCAAAAGCAAGTGCTGCCAATACTG ATCGTATTGCTAAAAACAAAGCCGATGCTGATGCAAGTTTTGAAACGCTCACCAAAAATCAAAA Т АС Т Т Т GAT Т GAAAAAGATAAAGAGCAT GACAAAT ТААТ ТАС Т GCAAACAAAAC Т GCGAT Т GAT GCCAATAAAGCATCTGCGGATACCAAGTTTGCAGCGACAGCAGACGCCATTACCAAAAATGGAA AT GC TAT САС TAAAAACGCAAAATС TAT САС Т GAT Т Т GGGCAC TAAAGT GGAT GGT Т Т Т GACAG Т С G Т G ТААС Т G САТ ТAGACAC CAAAG Т СААТ GCCTTTGATGGTCGTAT СACAG С Т Т ТAGACAG Т AAAGTTGAAAACGGTATGGCTGCCCAAGCTGCCCTAAGTGGTCTATTCCAGCCTTATAGCGTTG GTAAGTTTAATGCGACCGCTGCACTTGGTGGCTATGGCTCAAAATCTGCGGTTGCTATCGGTGC TGGCTATCGTGTGAATCCAAATCTGGCGTTTAAAGCTGGTGCGGCGATTAATACCAGTGGTAAT AAAAAAGGСТСТТАТААСАТСGGТGТGAATТACGAGТТСТАА
Белковая последовательность для UspA2 из штамма АТСС 25238. - SEQ ID NO. 1, как описано выше.
Конструирование вектора
Для получения вектора МС-001, фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент гена UspA2 (аминокислоты 30-540 из штамма АТСС 25238), включая участки рестрикции NdeI/XhoI для облегчения клонирования (начальный метионин закодирован в участке NdeI) и последовательность ДНК, соответствующую аминокислотному линкеру AS (аланин, серин) и аминокислотам 6xhis, являлся оптимизированным по кодонному составу (неприродным) и синтезированным в GENEART (зарегистрированный в США товарный знак). Оптимизированная по кодонному составу означает, что нуклеотидная последовательность изменена по сравнению с нативной последовательностью без изменения аминокислотной последовательности, для лучшего соответствия с использованием кодонов в Escherichia coli для оптимальной экспрессии. Фрагмент UspA2 клонировали в соответствии с стандартными способами в экспрессирующий вектор рЕТ-26Ь с использованием участков рестрикции NdeI/XhoI.
Для получения конструкций МС-002, МС-003 и МС-004, проводили полимеразную цепную реакцию для амплификации фрагмента гена UspA2 (аминокислоты 30-540 из штамма АТСС 25238) с использованием конструкции МС-001 в качестве матрицы, праймера UspA2Nde opt (содержащего инициирующий кодон метионина) и праймера UspA2opt delta His, A2opt 1His delta AS и A2opt 2His delta AS, соответственно. Фрагмент UspA2 клонировали в соответствии со стандартными способами в экспрессирующий вектор рЕТ-26Ь с использованием участков рестрикции NdeI/XhoI.
Для получения конструкции МС-005, проводили полимеразную цепную реакцию для амплификации фрагмента гена UspA2 (аминокислоты 30-519 из штамма АТСС 25238) с использованием вектора МС-001 в качестве матрицы с праймерами UspA2Nde opt (содержащим инициирующий кодон метиони- 40 034352 на) и R delta hairpin A2opt His. Последовательность ДНК, соответствующую участку рестрикции NdeI, вставляли в 5'-праймер, и участок рестрикции XhoI вставляли в 3'-праймер. Кроме того, последовательность ДНК, соответствующую аминокислотному линкеру AS и аминокислотам 6xhis, вставляли в 3'праймер. Полученный продукт ПЦР затем вставляли в вектор для клонирования pET-26b(+) (NOVAGEN (зарегистрированный в США товарный знак)).
Для получения конструкции МС-006, проводили полимеразную цепную реакцию для амплификации фрагмента гена UspA2 (аминокислоты 30-519 из штамма АТСС 25238) с использованием конструкции МС-005 в качестве матрицы с праймерами UspA2Nde opt (содержащим инициирующий кодон метионина) и delta His delta helice. Последовательность ДНК, соответствующую участку рестрикции NdeI, вставляли в 5'-праймер и XhoI участок рестрикции, вставляли в 3'-праймер. Полученный продукт ПЦР затем вставляли в вектор для клонирования рЕТ-26Ь(+) (NOVAGEN (зарегистрированный в США товарный знак)).
Для получения конструкции МС-007, фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент гена UspA2 (аминокислоты 30-564 из штамма АТСС 25238), включая участки рестрикции NdeI/XhoI для облегчения клонирования (начальный метионин закодирован в участке NdeI) и последовательность ДНК, соответствующую аминокислотному линкеру AS и аминокислотам 6xhis, подвергали оптимизации по кодонному составу и синтезировали в GENEART (зарегистрированный в США товарный знак) (плазмида: 1026399). Фрагмент UspA2 клонировали в соответствии с стандартными способами в экспрессирующий вектор рЕТ-26Ь с использованием участков рестрикции NdeI/XhoI.
Для получения конструкции МС-008, проводили полимеразную цепную реакцию для амплификации фрагмента гена UspA2 (аминокислоты 30-564 из штамма АТСС 25238) с использованием конструкции МС-007 в качестве матрицы с праймерами UspA2Nde opt (содержащим инициирующий кодон метионина) и 2His helice deltaAS. Последовательность ДНК, соответствующую участку рестрикции NdeI, вставляли в 5'-праймер, и участок рестрикции XhoI вставляли в 3'-праймер. Полученный продукт ПЦР затем вставляли в вектор для клонирования pET-26b(+) (NOVAGEN (зарегистрированный в США товарный знак)).
Для получения конструкции МС-009, проводили полимеразную цепную реакцию для амплификации фрагмента гена UspA2 (аминокислоты 31-564 из штамма АТСС 25238) с использованием плазмиды 1026399 в качестве матрицы и праймеров N-концевым cyto Abis (содержащим инициирующий кодон метионина) и 2His helice deltaAS. Последовательность ДНК, соответствующую участку рестрикции NdeI, вставляли в 5'-праймер, включая делецию глутамина, и участок рестрикции XhoI, вставляли в 3'-праймер, включая два остатка гистидина. Полученный продукт ПЦР затем вставляли в вектор для клонирования pET-26b(+) (NOVAGEN (зарегистрированный в США товарный знак)). Проводили секвенирование ДНК конечной конструкции для подтверждения правильной последовательности.
Для получения конструкции МС-010, проводили полимеразную цепную реакцию для амплификации фрагмента гена UspA2 (аминокислоты 30-564 из штамма АТСС 25238) с использованием конструкции МС-007 в качестве матрицы с праймерами UspA2 Nde opt (содержащим инициирующий кодон метионина) и cyto helice dHis dAS. Последовательность ДНК, соответствующую участку рестрикции NdeI, вставляли в 5'-праймер, и участок рестрикции XhoI вставляли в 3'-праймер. Полученный продукт ПЦР затем вставляли в вектор для клонирования pET-26b(+) (NOVAGEN (зарегистрированный в США товарный знак)).
Для получения конструкции МС-011, проводили полимеразную цепную реакцию для амплификации фрагмента гена UspA2 (аминокислоты 31-540 из штамма АТСС 25238) с использованием конструкции МС-001 в качестве матрицы с праймерами N-концевым cyto Abis (содержащим инициирующий кодон метионина) и N-концевым обратным. Последовательность ДНК, соответствующую участку рестрикции NdeI, вставляли в 5'-праймер, и участок рестрикции XhoI вставляли в 3'-праймер. Полученный продукт ПЦР затем вставляли в вектор для клонирования pET-26b(+) (NOVAGEN (зарегистрированный в США товарный знак)).
Подробный список последовательностей праймеров для ПЦР, использованных для амплификации, проиллюстрирован в табл. 3. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием набора Expand High Fidelity PCR System (Roche) согласно рекомендациям производителя. Лигирование проводили с использованием набора Rapid DNA Ligation Kit (Roche) согласно рекомендациям производителя.
- 41 034352
Таблица 3. Последовательности праймеров для ПЦР, использованных для амплификации UspA2
ID праймера Последовательность ДНК, 5'-3'
UspA2 Nde opt gaattcttaattaacatatgcaggccaaaaatgatattaccctg (SEQ ID N0:75)
UspA2opt delta His GGCGCGCCTCGAGTTATTATTTGGTATCCAGTGCGGTCACACG (SEQ ID N0:76)
UspA2opt IHis delta AS GGCGCGCCTCGAGTTAGTGTTTGGTATCCAGTGCGGTCACACG (SEQ ID N0:77)
UspA2opt 2His delta AS GGCGCGCCTCGAGTTAGTGGTGTTTGGTATCCAGTGCGGTCACACG (SEQ ID N0:78)
R delta hairpin A2opt His ggcgcgcctcgagttagtggtggtgatgatgatggcttgcgcttttggc atttttggtgatggcat (SEQ ID N0:79)
Delta His delta helice CCGCTCGAGCTAGCTTTTGGCATTTTTGGTGATGGC (SEQ ID NO :8 0)
N-концевой cytoAbis GGAATTCCATATGGCGAAAAATGATATTACCCTGGAAGATCTG (SEQ ID N0:81)
2His helice delta AS GGCGCGCCTCGAGTTAGTGGTGTGCTGCCTGTGCTGCCATACCATT (SEQ ID N0:82)
Cyto helice dHis dAS GGCGCGCCTCGAGTTATGCTGCCTGTGCTGCCATACCATT (SEQ ID N0:83)
N-концевой обратный CAGTTCATTATAGGTGGCCAGATCCTG (SEQ ID N0:84)
Трансформация
Клетки Escherichia coli (Е. coli) BLR (DE3), модифицированные клетки BLR (DE3) или B834(DE3) трансформировали плазмидной ДНК в соответствии с стандартными способами с использованием обработанных CaCl2 клеток (Hanahan D. Plasmid transformation by Simanis. In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.). Кратко, компетентные клетки BLR (DE3) осторожно размораживали на льду. Приблизительно 4 мкл плазмиды (10-100 нг) смешивали с 50-100 мкл компетентных клеток. Затем этот состав инкубировали на льду в течение 5 мин. Для проведения реакции трансформации, состав подвергали воздействию теплового импульса при 42°C в течение 30 с, затем инкубировали на льду в течение 2 мин. Приблизительно 0,5 мл среды SOC (супероптимальной среды с катаболитной репрессией) добавляли к трансформированным клеткам, и культуру клеток инкубировали при 37°C в течение одного часа перед рассевом на агар Луриа-Бертани (LB) с 50 мкг/мл канамицина. Приблизительно 150 мкл трансформированной культуры клеток высевали и инкубировали в течение ночи при 37°C.
BLR (DE3): BLR представляет собой recA- производное BL21 (F-ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3). Этот штамм Е. coli, использованный для экспрессии рекомбинантных белков, улучшает выход мономеров плазмиды и может способствовать стабилизации целевых плазмид, которые содержат повторяющиеся последовательности, или продукты которых могут вызывать потерю профага DE3 (Studier,
F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219: 37-44). Подробный генотип E.coli BLR (DE3) опубликован NOVAGEN (зарегистрированный в США товарный знак). (F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm A(srl-recA)306::Tn10 (TetR) (DE3).
В834 (DE3) является родительским штаммом для BL21. Эти хозяева являются ауксотрофами по метионину и обеспечивают высокую специфическую активность мечения белков-мишеней 35Sметионином и селенометионином для кристаллографии. Подробный генотип E.coli B834 (DE3) опубликован NOVAGEN (зарегистрированный в США товарный знак): F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm met (DE3).
Модифицированный BLR (DE3): Для предотвращения (фосфо)глюконилирования, ген Pg1 вставлен в локус биотина, локализованный в геноме BLR (DE3). Кроме того, для предотвращения замен Ile-Val, скорректирована мутация C219Y в гене треониндезаминазы.
Генотип: (F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm A(srl-recA) 306: :Tn10 (TetR); A(bioA-bioD)::Pg1; TD+(C219Y) (DE3).
Пример 2. Экспрессия белка с использованием встряхиваемой колбы
Штаммы Escherichia coli, трансформированные рекомбинантной плазмидой, использовали для инокуляции 100 мл среды LB (Becton, Dickinson and Company) ±1% (масса/объем, мас./об.) глюкозы (Laboratoire МАТ, каталожный номер: GR-0101) и 50 мкг/мл канамицина (Sigma). Эту прекультуру, как правило,
- 42 034352 выращивали в течение ночи при 37°C. Двенадцать мл прекультуры используют для инокуляции 500 мл среды LB+50 мкг/мл канамицина. Культуры инкубировали при 37°C с встряхиванием при 150 об./мин до достижения С.П.600нм ~0,6.
При С.П.600нм ~0,6, в культурах BLR (DE3) индуцировали экспрессию рекомбинантного белка посредством добавления 1 мМ изопропил-в-Э-1-тиогалактопиранозида (IPTG; EMD Chemicals Inc., каталожный номер: 5815) и инкубировали в течение ночи при 23°C с встряхиванием 150 об./мин. После периода индукции культуры центрифугировали при 6370 g в течение 20 мин, и осадки из 350 мл культуры замораживали при -20°C по отдельности.
Пример 3. Очистка белка с использованием фосфатного буфера (конструкция МС-001 и конструкция МС-011)
Каждый осадок бактерий, полученный после индукции в встряхиваемой колбе, ресуспендировали в 30 мл 20 мМ калий-фосфатного буфера (рН 8,0), содержащего 10 мМ NaCl и коктейль ингибиторов протеаз Roche COMPLETE (зарегистрированный в США товарный знак) (1 таблетка/50 мл буфера). Лизис клеток проводили посредством 3 X экстракций в френч-прессе (20000 psi (137,9 МПа)), и осветление проводили посредством центрифугирования 30 мин при 23700 g. Супернатант собирали и фильтровали при 0,22 мкм.
Меченные 6xHis белки очищали посредством аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов (IMAC) с использованием колонки XK16 и 20 мл смолы NiNTA (Qiagen), предварительно уравновешенных 20 мМ калий-фосфатным буфером (рН 8,0), содержащим 10 мМ NaCl, или буфером PBS рН 8,0, содержащим 500 мМ аргинин. Растворимые компоненты загружали при скорости вплоть до 4 мл/мин (получая фракцию проскока). После загрузки колонки колонку промывали с помощью 60 мл 20 мМ калий-фосфатного буфера (рН 8,0), содержащего 10 мМ NaCl, при скорости 4 мл/мин, получая фракцию промывки #1. Проводили вторую промывку с использованием такого же буфера+10 мМ имидазол, получая фракцию промывки #2. Элюцию проводили с использованием такого же буфера, содержащего 200 или/и 500 мМ имидазола.
Образцы из фракций элюции анализировали посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). Образцы, содержащие белок, подвергали диализу против 5 л 20 мМ калий-фосфатного буфера (рН 8,0), содержащего 10 мМ NaCl. Концентрацию белка определяли с использованием способа Лоури.
Пример 4. Очистка белка с использованием содержащего аргинин буфера (МС-001, МС-005 и МС007)
Каждый осадок бактерий, полученный после индукции в встряхиваемой колбе (пример 3) или ферментере (пример 5), ресуспендировали в 30 мл буфера PBS+500 мМ аргинин рН 8,0 и коктейль ингибиторов протеаз Roche COMPLETE (зарегистрированный в США товарный знак) (1 таблетка/50 мл буфера). Альтернативно, клеточную массу после ферментации (»7 г) ресуспендировали в 90 мл буфера PBS, содержащего 500 мМ аргинина рН 8,0 и коктейль ингибиторов протеаз Roche COMPLETE (зарегистрированный в США товарный знак) (1 таблетка/50 мл буфера).
Лизис клеток проводили посредством 2 или 3 X экстракций в френч-прессе (20000 psi (137,9 МПа)), и осветление проводили посредством центрифугирования 30 мин при 23700 g при 4°C. Супернатант собирали и фильтровали при 0,22 мкм. Меченные 6xHis белки очищали посредством аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов (IMAC) с использованием колонки XK16 и 80 мл смолы NiNTA (Qiagen), предварительно уравновешенных буфером PBS+500 мМ аргинин рН 8,0. Растворимые компоненты загружали при скорости вплоть до 4 мл/мин (получая фракцию проскока). После загрузки колонки колонку промывали таким же буфером, затем 20 мМ калий-фосфатным буфером (рН 8,0), содержащим 10 мМ NaCl, при скорости 4-6 мл/мин, получая фракцию промывки #1. Проводили вторую промывку с использованием такого же буфера+10 мМ имидазол, получая фракцию промывки #2. Элюцию проводили с использованием такого же буфера+200 мМ имидазол или 500 мМ имидазол. В следующие флаконы для элюции добавляли ЭДТА до конечной концентрации 5 мМ.
Образцы из фракций элюции анализировали посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). Образцы, содержащие белки, подвергали диализу против 5 литров 20 мМ калий-фосфатного буфера (рН 8,0), содержащего 10 мМ NaCl и 5 мМ ЭДТА. Концентрацию белка определяли с использованием способа Лоури.
Этот протокол можно использовать для других меченных 6xHis белков.
Пример 5. Ферментация
Можно использовать следующий способ ферментации:
Рабочий посевной материал представляет собой замороженные аликвоты выращенных в колбе штаммов Escherichia coli BLR(DE3) или производных BLR(DE3), трансформированных производным рЕТ26Ъ, содержащим последовательность, кодирующую конструкцию рекомбинантного белка - специфического антигена-кандидата.
Рабочий посевной материал (WS) вынимают из морозильника для хранения, размораживают и используют для инокуляции колбы Эрленмейера, содержащей среду для прекультивирования.
- 43 034352
Манипуляции с посевной культурой и культурой в колбе проводят асептически в ламинарном вытяжном шкафу (LAF) или боксе биологической безопасности (BSC). Колбу для прекультивирования инкубируют, как правило, между 30-37°C при скорости встряхивания 200 об./мин в течение времени, необходимого для достижения оптической плотности при 650 нм (OD650™) между 1,0 и 3,0, как правило, между 4-6 ч.
л ферментер подготавливают посредством безразборной очистки с последующей автоматизированной стерилизации паром. Исходную среду переносят асептически в ферментер. Бутыль, заполненную 25% NH4OH, асептически присоединяют к ферментеру для автоматического контроля рН. Начальный рН исходной среды доводят до целевого рН добавлением раствора NH4OH. Облученный пеногаситель добавляют с использованием шприца через мембрану в головке. Бутыль, заполненную подпитывающей средой, асептически присоединяют к ферментеру. Добавление подпитки контролируют либо посредством каскада рО2 (контроль растворенного кислорода), либо посредством предварительно запрограммированной кривой подпитки. Перемешивание контролируют либо посредством каскада рО2, либо посредством предварительно запрограммированной кривой перемешивания.
Исходные параметры ферментера, как правило, являются следующими:
Температура: 28-32°C
Давление: 0,5 бар и.д. (7 psi (48,3 кПа)); Скорость потока воздуха: 2 WM (объемов сосуда в минуту) рН: регулируют до 6,8 посредством добавления 25% NH4OH. Аликвоту этой прекультуры (как правило, между 5-50 мл) используют для инокуляции исходной среды для ферментера посредством добавления шприцом через мембрану в головке ферментера. Фазы культивирования в ферментере представляют собой:
Периодическая фаза: биомассу накапливают с использованием источника углерода в исходной среде.
Периодическая фаза с подпиткой: Среду для подпитки вводят либо в соответствии с контролем каскада рО2, либо в соответствии с предварительно запрограммированной кривой подпитки.
Продолжается накопление биомассы на источнике углерода в среде для подпитки.
Фаза индукции: Экспрессию рекомбинантного белкового антигена индуцируют посредством добавления раствора IPTG в культуру в ферментере.
При сборе культуру собирают, как правило, в 1 л бутыли для центрифугирования и центрифугируют для отделения фракции твердого осадка (клеточной массы) от фракции жидкого супернатанта. Супернатант отбрасывают, и массу клеток во влажном состоянии (твердого осадка) регистрируют, и пакеты с клеточной массой сохраняют при -20°C.
Можно использовать также следующий способ:
Стандартная прекультура Escherichia coli
Каждую стандартную прекультуру получали с использованием замороженной культуры для посева штаммов Escherichia coli. Эти штаммы представляют собой штаммы BLR(DE3), трансформированные производным рЕТ26Ь, содержащим последовательность, кодирующую конкретную конструкцию, подлежащую оценке.
Культуру для посева размораживали до комнатной температуры, и 400 мкл использовали для инокуляции 2 литровой колбы Эрленмейера, содержащей 400 мл среды для прекультивирования (адаптированной из Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987)).
Затем колбу после инокуляции was инкубировали при 37°C (±1°C) и 200 об./мин. Прекультивирование останавливали после 6 час инкубации. На этой стадии оптическая плотность при 650 нм (OD^^) составляет приблизительно 2. Прекультуру использовали для инокуляции среды в ферментере сразу по сле остановки культивирования.
Периодическая ферментация с подпиткой в масштабе 20 л.
Способ
Использовали 20-литровый ферментер (Biolafitte). Девять литров среды с периодической фазы асептически переносили в ферментер. рН среды повторно доводили до 6,8 с помощью добавления основания. 1 мл неразведенного облученного пеногасителя (SAG 471) также добавляли в ферментер. Затем температуру (28°С), давление в головке (0,5 бар (50 кПа)), скорость аэрации (20 л барботажного воздуха в минуту) и начальную скорость перемешивания (300 об./мин) устанавливали перед инокуляцией. Уровень растворенного кислорода в этих условиях составлял 100%. Давление в головке и скорость аэрации поддерживали на постоянном уровне на протяжении ферментации.
Инокуляцию осуществляли посредством добавления эквивалента 10 мл OD650 нм=2 прекультуры (полученной, как описано выше, в примере 2) в соответствии со следующей формулой:
Объем прекультуры (мл) =---------------------------Конечная OD650hm прекультуры
На протяжении периодической фазы (0-15 час), поддерживали температуру 28°С. Уровень растворенного кислорода устанавливали на 20%. Уровень растворенного кислорода (DO) регулировали посредством увеличения перемешивания, когда DO падает ниже 20%. Истощение глюкозы приводит к увеличе- 44 034352 нию DO и сопутствующему уменьшению перемешивания.
Когда глюкоза истощается, начинают подпитку со скоростью, основанной на сигнале того, что рН увеличивается выше 7,0. Далее после этой точки, скорость подпитки контролировали по необходимости в кислороде, увеличивая скорость потока, когда растворенный кислород проявляет тенденцию к падению ниже 20% от исходной точки. На этой стадии скорость перемешивания поддерживают при 900 об./мин.
На протяжении периодической фазы с подпиткой (до индукции), поддерживали рН 6,8 посредством добавления основания, температуру регулировали при 30°С.
Два способа применяли для получения белка:
Индукцию при высокой плотности клеток (HCDI) применяют, когда индукцию в культуре проводят посредством 1 мМ IPTG (изопропил-бета^-тиогалактопиранозида) при оптической плотности 80±5, как правило, достигаемой через 40 ч культивирования. Температуру поддерживали при 28°C, и скорость подпитки все еще контролируют по потребности в кислороде с постоянной скоростью перемешивания 900 об./мин.
Способ индукции при низкой плотности клеток (LCDI) обозначает индукцию при оптической плотности 40±5, как правило, достигаемой через 24 ч культивирования. Температуру уменьшают до 30°C, и применяют постоянную скорость подпитки 0,5 мл/мин. Затем 1 мМ IPTG добавляют в культуру. На этой стадии, уровень DO поддерживают на 20% посредством контроля скорости перемешивания.
В конце фазы индукции (72 час), клеточную массу собирали посредством центрифугирования (6500 х g, 4°C в течение 1 ч), и сохраняли при -20°C.
На фиг. 1 и 2 проиллюстрирован типичный профиль ферментации с использованием способов HCDI и LCDI, и параметров, мониторируемых в ходе периодической ферментации с подпиткой в масштабе 20 л.
В табл. 4 указаны конструкции, оцененные в ферментере, и выход UspA2, полученный для каждой.
На фиг. 3 изображен в графической форме выход UspA2 в табл. 4 для конструкций, оцененных в ферментере.
На этой фигуре на выход UspA2 влияют остатки гистидина, присутствующие в конструкции. (р<0,05, односторонний, трехуровневый, ANOVA типа II). Наблюдали положительную корреляцию между количеством остатков гистидина и выходом при ферментации UspA2, с увеличением выхода более, чем на 400% при сравнении 0 и 6 остатков в периодической ферментации с подпиткой.
Наблюдали также, что с одним остатком гистидина, добавленным в фрагмент половины спирали (конструкция МС-003), получали выход UspA2 приблизительно 1 г/л белка.
Пример 6. Характеризация белка
Аналитическое ультрацентрифугирование
Аналитическое ультрацентрифугирование используют для определения гомогенности и распределения по размерам в растворе различных молекул в образце белка посредством измерения скорости, при которой молекулы движутся в ответ на центробежную силу. Это основано на расчете коэффициентов седиментации различных молекул, полученных в эксперименте по скорости седиментации, которые зависят от формы и массы их молекул.
Следующие образцы белка центрифугировали на аналитической ультрацентрифуге BeckmanCoulter ProteomeLab XL-1 при 28000 об./мин после уравновешивания ротора AN-60Ti до 15°C.
a) МС-005, партия ВМР53, 675 мкг/мл в 20 мМ NaPO4, 10 мМ NaCl, pH 8,0
b) МС-001, партия ВМР13, 545 мкг/мл в 20 мМ NaPO4, 10 мМ NaCl, pH 8,0
c) МС-001, партия ВМР14, 545 мкг/мл в 20 мМ NaPO4, 10 мМ NaCl, pH 8,0
- 45 034352
d) МС-001, партия ВМР54, 445 мкг/мл в 20 мМ NaPO4, 10 мМ NaCl, pH 8,0
e) МС-007, партия ВМР70, 510 мкг/мл в 20 мМ NaPO4, 10 мМ NaCl, pH 8,0
Для сбора данных, регистрировали от 133 до 325 сканирований при 280 нм каждые 5 мин.
Анализ данных проводили с использованием программы SEDFIT (доступной через National Institutes for Health) для определения распределения C(S). Распределение C(S) является представлением относительной интенсивности различных компонентов в смеси макромолекул, разделенных по их коэффициентам седиментации, которое является функцией размера и конформации молекул. Определение парциального удельного объема белков при 15°C проводили с помощью программного обеспечения SEDNTERP по их аминокислотной последовательности. SEDNTERP (SEDNTERP распространяется и поддерживается через Biomolecular Interaction Technologies Center at the University of New Hampshire) также использовали для определения вязкости и плотности буфера при 15°C.
Определение относительной распространенности всех молекул проводили посредством учета общей площади под кривой общего распределения как 100% образца и посредством расчета процента этой общей области, представленной распределением каждой молекулы. График распределения C(S) (концентрация против коэффициента седиментации) использовали для этого расчета, считая, что это лучшее представление необработанных данных, чем распределение С(М) (концентрация против молекулярной массы).
Аналитическое ультрацентрифугирование различных очищенных конструкций позволило сделать наблюдение, что UspA2 с Δ спирали, UspA2 с 1/2 спирали и UspA2 с полноразмерной спиралью с Сконцевой меткой his присутствуют в основном в форме тримеров в растворе, когда 500 мМ L-аргинин добавляют в ходе лизиса клеток перед очисткой (фиг. 4, 5, 7 и 8).
Гетерогенное распределение размеров наблюдали для UspA2 с 1/2 спирали, когда L-аргинин не добавляли в ходе лизиса клеток. Наблюдали две основных популяции. Не представлялось возможным подтвердить молекулярную массу молекул, детектированных посредством AUC (аналитическое ультрацентрифугирование) для этого препарата белка, поскольку коэффициент трения, который является необходимым для оценки молекулярной массы, необходимо рассчитывать для гомогенного образца. Однако на основании коэффициентов седиментации ни одна из наблюдаемых молекул, по-видимому, не соответствовала тримеру, наблюдаемому в других образцах.
На фиг. 4 проиллюстрировано распределение молекулярной массы очищенного МС-005, определенное посредством ультрацентрифугирования с анализом скорости седиментации. Большая часть белка обнаружена в форме тримера, с небольшой долей олигомера более высокой молекулярной массы, которая может соответствовать олигомеру от димера до тримера.
На фиг. 5 проиллюстрировано распределение молекулярной массы очищенного МС-001, определенное посредством ультрацентрифугирования с анализом скорости седиментации. Большая часть белка обнаружена в форме тримера.
На фиг. 6 проиллюстрировано распределение молекулярной массы очищенного МС-001, определенное посредством ультрацентрифугирования с анализом скорости седиментации. В образце представлено множество молекул, и он обладает высокой полидисперсностью. Коэффициент седиментации основных детектированных молекул не соответствует ни одному из тримеров, в норме детектированных в других партиях.
На фиг. 7 проиллюстрировано распределение молекулярной массы очищенного МС-001, определенное посредством ультрацентрифугирования с анализом скорости седиментации. Большая часть белка обнаружена в форме тримера.
На фиг. 8 проиллюстрировано распределение молекулярной массы очищенного МС-007, определенное посредством ультрацентрифугирования с анализом скорости седиментации. Большая часть белка обнаружена в форме тримера.
Круговой дихроизм/Вторичная структура
Круговой дихроизм (CD) используют для определения состава вторичной структуры белка посредством измерения различия в поглощении левополяризованного света по сравнению с правополяризованным светом, обусловленного структурной асимметрией. Форма и амплитуда спектров CD в области дальнего УФ (190-250 нм) являются различными, в зависимости от того, обладает ли белок бета-листом, альфа-спиралью или неупорядоченной спиральной структурой. Относительную распространенность каждого типа вторичной структуры в данном образце белка можно рассчитывать посредством сравнения с эталонными спектрами.
Спектры в дальнем УФ измеряют с использованием оптического пути 0,01 см от 178 до 250 нм, с разрешением и шириной полосы 1 нм в спектрополяриметре Jasco J-720. Температуру ячейки поддерживают при различных температурах посредством термостатированного по Пелтье блока ячеек RTE-111. Поток азота 10 л/мин поддерживали на протяжении измерений.
Концентрацию следующих белковых конструкций доводили до 4 00 мкг/мл в 20 мМ NaPO4, 10 мМ NaCl, pH8,0 буфер.
a) МС-005, партия ВМР53, в 20 мМ NaPO4, 10 мМ NaCl, pH 8,0
b) МС-001, партия ВМР13, в 20 мМ NaPO4, 10 мМ NaCl, pH 8,0
- 46 034352
c) МС-001, партия ВМР14, в 20 мМ NaPO4, 10 мМ NaCl, pH 8,0
d) МС-001, партия ВМР54, в 20 мМ NaPO4, 10 мМ NaCl, pH 8,0
e) МС-007, партия ВМР70, в 20 мМ NaPO4, 10 мМ NaCl, pH 8,0
Расчеты вторичной структуры выполняли с использованием следующих алгоритмов:
Selcon 3 (Sreerama and Woody, Anal. Biochem. (1993), 209, 32; Sreerama and Woody, Biochemistry, 33, 10022-25 (1994); Sreerama et al. Protein Science, 8, 370-380 (1999); Johnson W.C.Jr., Proteins:Struc.Func.Genet.35,307-312 (1999)) CDSSTR (Johnson W.C. Proteins:Struc.Func.Genet. 35, 307-312 (1999), модифицировано Sreerama. N. (Anal.Biochem., 287,252 (2000)).
Показанные результаты представляют собой среднее от процента, рассчитанного с помощью обоих алгоритмов, и с предельной ошибкой 5%.
Результаты расчетов вторичной структуры для экспрессированных в ферментере белков показаны в табл. 5, с учетом предельной ошибки 5%.
Таблица 5. Расчеты вторичной структуры при 22°C
Белок Спираль Бета Неупорядоченный
МС-005 ВМР53 40, 8 26, 4 34,1
МС-007 ВМР70 58,2 18,2 24,7
МС-001 ВМР54 53,7 14,2 34,4
Расчеты являются сравнимыми с формой и визуальным анализом спектров, где содержание спиралей увеличивается с интенсивностью минимума при 208 и 220 нм. Белки состоят из высокой доли спиральных структур, с присутствием бета-структур.
Наложение спектров на фиг. 9 показывает отсутствие значительных отличий формы между конструкциями. Для спектров спиралей МС-005 показана более низкая интенсивность, которую можно объяснить более низким содержанием альфа-структур, что согласуется с отсутствием С-концевой спирали.
На фиг. 9 проиллюстрированы спектры кругового дихроизма в дальнем УФ для конструкций UspA2 МС-001, МС-005 и МС007, дающие указания на вторичные структуры белков. Наложение спектров явно показывает, что конструкции, содержащие половину С-концевой спирали и полноразмерную Сконцевую спираль, не обладают поддающимися детекции различиями своих вторичных структур, в то время как для конструкции без спирали получены спектры, отличающиеся по интенсивности, что можно объяснить различным содержанием вторичной структуры.
Термическое разворачивание
Измерение спектров CD в дальнем УФ при различных температурах в ходе термического разворачивания позволяет предполагать, что МС-005 является менее термически стабильным, чем МС-007. Спектры, наблюдаемые при 33°C для МС-005, являются сходными с типичными спектрами развернутого белка. Для конструкции МС-007, даже если частичную потерю вторичной структуры наблюдают при 33°C, полное разворачивание, по-видимому, происходит между 35°C и 37°C. Это может являться показателем более высокой термической стабильности содержащей полноразмерную спирать конструкции МС007.
На фиг. 10 проиллюстрировано мониторинг вторичных структур посредством кругового дихроизма в ходе термического разворачивания МС-005 (UspA2 с Δ спирали+6His). Визуальный анализ спектров ясно показывает, что белок теряет большую часть своей вторичной структуры при 33°C.
На фиг. 11 проиллюстрировано мониторинг вторичных структур посредством кругового дихроизма в ходе термического разворачивания МС-007 (UspA2+спираль+6His). Визуальный анализ спектров показывает, что потеря вторичной структуры является более медленной по сравнению с конструкцией без спирали. Структурные изменения поддаются детекции при нагревании до 33°C, однако, по-видимому, полное разворачивание происходит между 35 и 37°C.
Термическое разворачивание по дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC)
Тепловые переходы различных конструкций UspA2 сравнивали, чтобы оценить эффект модификаций С-концевой спирали на термическую стабильность белков.
Анализ выполняли на VP-DSC из MicroCal (часть GE Healthcare). Буфер 20 мМ NaPO4, 10 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, рН8 использовали в качестве контроля и вычитали из сканирований. Белки уравновешивали при исходной температуре в течение 15 мин перед изменением температуры. Затем проводили сканирование DSC от 10 до 60°C со скоростью нагревания 90°CM.
Два перехода детектировали в конструкциях МС-001 и МС-007 и только один - в МС-005. Величину перехода (или Tm) различных конструкций можно найти в табл. 6.
В то время как более низкая Tm всех трех белков составляет приблизительно 32°C, основным различием является значение второй Tm. Конструкция, содержащая полную спираль (МС-007), обладает более высокой Tm при 37,5°C, по сравнению с 34,5°C для половины спирали (МС-001).
Показано, что для МС-001 и МС-007 первая Tm около 32°C является обратимой, в то время как более высокая Tm является необратимой. Для МС-005, единственная детектированная Tm является необратимой.
Это может являться показателем более высокой термостабильности, содержащей полную спираль
- 47 034352 конструкции МС-007.
Таблица 6. Температура плавления конструкций UspA2, измеренная посредством DSC
Конструкции [мг/мл] Тпц (°C) Tm2 (°C)
МС-005, партия ВМР53 0,400 31,74 —
МС-001, партия ВМР54 0,400 32,02 34,51
МС-007, партия ВМР7 0 0,400 32,19 37,50
Масс-спектрометрия
Образцы белка UspA2 получали посредством осаждения белка с помощью системы CHClз/МеОН/H2O. Осадок белка осаждали центрифугированием на дно пробирки eppendorf перед осторожным высушиванием под азотом. Затем высушенный осадок растворяли в 2 мкл чистой муравьиной кислоты перед разведением с помощью 3 мкл ультрачистой воды и 5 мкл синапиновой кислоты. Синапиновую кислоту, использованную в качестве матрицы для анализа MALDI-TOF (на анализаторе массспектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы с последующей времяпролетной спектрометрией) получают в 50% CH3CN/50% H2O, дополненной TFA до конечной концентрации 0,1%.
мкл смеси образец+матрица наносили пятнами на мишень для MALDI из шлифованной нержавеющей стали Bruker 384 и оставляли высыхать для кристаллизации при комнатной температуре и атмосферном давлении (способ высушенных капель).
Масс-спектрометрический анализ UspA2 проводили на масс-спектрометре Bruker Ultraflex 2 MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) в режиме положительной ионизации и в линейном режиме. Образцы белка, совместно кристаллизованные в матрице синапиновой кислоты, облучали посредством лазера smartbeam. Измерение массы интактного белка UspA2 выполняли в диапазоне масс 10000-100000 Да с ускоряющим напряжением 25 кВ. Выполняли тонкую настройку ослабления лазерного излучения, чтобы получать наилучший возможный сигнал белка и чтобы избегать какой-либо фрагментации, а также феномена фоновой сверхионизации. Калибровку масс-спектрометра проводили способом близкого внешнего контроля с гомологичной матрицей и с использованием коммерческой смеси белков для калибровки 2 от Bruker, посредством точного измерения следующих калибраторов: [М+2Н]2+ (масса, измеренная посредством детектора MS после добавления двух ионов Н+ к белку в ходе ионизации) молекул белка А при массе/заряде 22307 Да, [М+Н]+ молекул трипсиногена при массе/заряде 23982 Да, [М+Н]+ молекул белка А при массе/заряде 44613 Да и [М+Н]+ молекул бычьего альбумина при массе/заряде 66431 Да. Каждый представленный спектр получен в результате суммирования 500 индивидуальных измерений.
Анализировали следующие образцы:
Конструкция МС-001 с аминокислотами MQAK (SEQ ID NO: 85) на N-конце, полученная в встряхиваемой колбе, партия opt-01, конструкция МС-011 с аминокислотами MAK на N-конце, полученная в встряхиваемой колбе, партия ВМР37.
В табл. 7 и на фиг. 12 показано, что белок МС-001 с аминокислотами MQAK (SEQ ID NO: 85) на Nконце является по меньшей мере частично деметионилированным, как показано по измеренной молекулярной массе 57427 Да, по сравнению с ожидаемой массой 57565 Да. Другой пик 57620 Да может представлять полноразмерный недеметионилированный белок, N-ацетилированный белок или популяцию другого модифицированного белка.
На фиг. 12 проиллюстрирован спектр MALDI МС-001, партия opt-01. Наблюдаемая масса 57427 Да может соответствовать деметионилированному белку, в то время как пик 57620 Да может соответствовать полноразмерному белку.
Как показано в табл. 7 и на фиг. 13, белок МС-011 с аминокислотами MAK на N-конце составляет основную популяцию при MALDI-MS, которая может соответствовать деметионилированному белку с массой 57265 Да, по сравнению с 57437 Да для ожидаемой массы на основании полной аминокислотной последовательности. Два других пика +186 Да и +366 Да не являются близкими к каким-либо ожидаемым посттрансляционным модификациям, так что их невозможно было идентифицировать в этом эксперименте.
Таблица 7.
Молекулярная масса двух конструкций UspA2, как измерено по MALDI-MS. Обе конструкции обладают средней измеренной массой, более низкой, чем ожидаемая из аминокислотной последовательности. Масса основной популяции, полученная для обеих конструкций, может соответствовать деметионилированному белку.
- 48 034352
Белок Теоретическая масса (Да) Измеренная масса (Да) Комментарий
МС-001, партия opt01 57565,8 -57427,9 -57620,3 - Соответствует деметионилированию (57434,6) - Соответствует белку, содержащему N-концевой метионин
МС-011, партия ВМР37 57437,6 57265,2 Соответствует деметионилированию (57306,4)
N-концевое секвенирование посредством деградации по Эдману
Для оценки того, приводит ли оптимизация N-концевой области (оптимизация аминокислотной последовательности, следующей за N-концевого метионина) к деметионилированию белка, выполняли Nконцевое секвенирование конструкции МС-011, несущей аминокислоты MAK на своем N-конце.
Белки разделяли посредством SDS PAGE в полиакриламидном геле Novex 4-20% от Invitrogen, перед переносом на мембрану Problot PVDF (поливинилидендифторид) (Bio-Rad). Мембрану окрашивали амидочерным. Затем представляющую интерес полосу вырезали, и анализ проводили по протоколу производителя с использованием системы секвенатора Applied Biosystems Procise. Проводили двенадцать циклов деградации по Эдману.
Полученная N-концевая аминокислотная последовательность представляет собой AKNDITLEDLP (SEQ ID NO:86), что соответствует N-концу белка, начиная с аминокислоты номер два после начального метионина. Это указывает на то, что зрелый белок является в основном деметионилированным.
Пример 7. Бактерицидная активность конструкции UspA2 MC-001:
Бактерицидный анализ
Moraxella catarrhalis культивировали в течение ночи на чашке Петри при 37°C+5% CO2. Бактерии переносили в 12 мл 0,1% буфера HBSS-BSA (забуференный солевой раствор Хенкса с бычьим сывороточным альбумином), чтобы получить 0D620 0,650. Образцы сыворотки нагревали в течение 45 мин при 56°C для инактивации эндогенного комплемента. Серийные двукратные разведения сыворотки в буфере SBA (HBSS-BSA 0,1%) добавляли в 96-луночный круглодонный планшет для микротитрования (25 мкл/лунку). Затем 50 мкл буфера SBA добавляли в каждую лунку. Затем 25 мкл штаммов Moraxella catarrhalis при 4х104 КОЕ/мл добавляли в лунки, содержащие сыворотку, и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Наконец, добавляли 25 мкл свежеразмороженного комплемента детеныша кролика, разведенного 1/8 в 0,1% HBSS-BSA, для достижения конечного объема 125 мкл. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°C с ротационным встряхиванием (210 об./мин). Реакцию останавливали посредством выдерживания микропланшета на льду в течение по меньшей мере 5 мин.
После гомогенизации, различные разведения суспензии (смеси бактерий, сыворотки, комплемента и буфера, в объеме 125 мкл, как обсуждали в предыдущем разделе) наносили на чашки с шоколадным агаром, инкубировали в течение 24 ч при 37°C с 5% CO2 и подсчитывали колонии Moraxella catarrhalis.
Восемь лунок без образцов сыворотки использовали в качестве бактериального контроля для определения количества колоний Moraxella catarrhalis на лунку. Среднее количество КОЕ (колониеобразующих единиц) в контрольных лунках определяли и использовали для расчета активности уничтожения для каждого образца сыворотки. Бактерицидные титры выражали как величину, обратную разведению сыворотки, индуцирующему 50% уничтожение.
Антисыворотки против UspA2, полученные у мышей, морских свинок и кроликов против МС-001, тестировали в бактерицидном анализе, описанном в настоящем описании выше, против 20 различных штаммов Moraxella catarrhalis, выделенных из различных тканей (крови, мокроты, жидкостей носа, среднего уха) в различных странах (США, Финляндия, Нидерланды, Норвегия, Швеция).
Как показано ниже, антитела против UspA2 являлись способными индуцировать перекрестное бактерицидное уничтожение Moraxella catarrhalis, вне зависимости от процента гомологии с UspA2, экспрессированного тестируемым штаммом. Кроме того, показана также бактерицидная активность штаммов, экспрессирующих только UspA1 или химерный белок UspA2H. Как и ожидали, не измерены или измерены только слабые титры бактерицидных антител против мутантов с двойным нокаутом UspAl и UspA2.
Таблица 8: Перекрестная бактерицидная активность антител против UspA2 МС-001, полученных у мыши, морской свинки и кролика. 1+2 KO представляет собой двойной нокаут, UspA1 и UspA2. 1KO представляет собой нокаут только UspA1. MEF (АОМ)=жидкость среднего уха (острый отит среднего уха). / в столбце источник выделения=источник выделения неизвестен.
Таблица 8
Перекрестная бактерицидная активность антител против UspA2 MC-001, полученных у мыши, мор- 49 034352 ской свинки и кролика. 1+2 KO представляет собой двойной нокаут, UspAl и UspA2. 1KO представляет собой нокаут только UspA1. MEF (АОМ)=жидкость среднего уха (острый отит среднего уха). / в столбце источник выделения=источник выделения неизвестен.
Штаммы Источник выделения Присутствующий ген UspA Идентичность в %* по сравнению с последовательностью вакцины АТСС25238 Бактерицидная активность
антисыворотки проти: в UspA2
Мышь Морская свинка Кролик
АТСС 25238 / UspAl/UspA2 45,2/100 + + + + + ++ +
43617 бронхит UspAl 40, 1 + + +
American 2926 / UspAl 36, 4 - + /- -
2933 / UspAl/UspA2 44,6/62,4 - + + ++
2912 / UspAl/UspA2 39,3/64.6 + + + + +++
2908 / UspAl/UspA2 43,3/52,8 + + + + + + ++ +
Finnish 307 MEF (AOM) UspAl/UspA2 47,6/70,1 - + + ++ +
353 MEF (AOM) UspAl/UspA2 45/61,8 + + + ++
358 MEF (AOM) UspAl/UspA2 47/61,5 + + + + + + +++
216 MEF (AOM) UspAl/UspA2 46, 6/66, 9 + + + + + + ++ +
Dutch N9 полость носа UspAl/UspA2H 41,1/70,1 + + + + + ++ +
H2 мокрота UspAl/UspA2 47/61,6 + + + + + + ++ +
F10 мокрота трахеотомия UspAl/UspA2 42,9/61,1 + + + + + ++ +
Norwegian 1 (при пневмонии) трахеотомия UspAl/UspA2 44,6/60,9
13 (при пневмонии) трахеотомия UspAl/UspA2 47,8/55 + +
20 (при пневмонии) трахеотомия UspAl/UspA2 33,7/60,6 + + + + + ++ +
25 (при пневмонии) трахеотомия UspAl/UspA2 47,8/65 + + + + + ++ +
27 (при пневмонии) трахеотомия UspAl/UspA2 46/76,1 + +
36 (при пневмонии) UspAl/UspA2 53,6/61,6 + + + ++
Swedish BBH18 WT BBH18 (1+2KO) BBH18(1KO ) RH4 WT RH4 (1+2KO) мокрота кровь UspAl/UspA2H UspA2H UspAl/UspA2H 42,9/57,3 57,3 37,4/59,9 + не выполняли + + + +
* определено с использованием программного обеспечения Gapl./ClustalX по сравнению с фрагментом ак 30-540 UspA2 ATCC25238______________
+ + + >50000
+ + >20000
+ >500
- <200
- 50 034352
Таблица 9. Экспрессия UspA в штаммах М. catarrhalis из табл. 8
Штаммы Экспрессия UspAl Экспрессия UspA2 Экспрессия UspA2H
АТСС 25238 Да Да Нет
43617 Да стоп-кодон Нет
American 2926 Да Нет стоп-кодон
2933 Да Да Нет
2912 Да Да Нет
2908 Да Да Нет
Finnish 307 Да Да Нет
353 Да Да Нет
358 Да Да Нет
216 Да Да Нет
Dutch N9 Да Нет Да
H2 Да Да Нет
F10 Да Да Нет
Norwegian 1 Да Да Нет
13 Да Да Нет
20 Да Да Нет
25 Да Да Нет
27 Да Да Нет
36 Да Да Нет
Swedish BBH18 WT Да Нет Да
BBH18 (1+2KO) Нет Нет Нет
BBH18 (1 KO) Нет Нет Да
RH4 WT Да Нет Да
RH4 (1 + 2KO) Нет Нет Нет
Пример 8. Защита в модели колонизации легких на мышах (МС-001)
Самок мышей Balb/c в возрасте пяти недель (n=8/5 групп) иммунизировали внутримышечным способом на сутки 0, 14 и 28 с помощью 50 мкл вакцины, содержащей 10 мкг конструкции UspA2 МС-001, в составе AS02V. Мышей подвергали интраназальному заражению на сутки 42 с помощью 5х105 КОЕ различных штаммов Moraxella catarrhalis. Бактерии подсчитывали в легких, собранных через 0, 3 и 6 ч после заражения. Различия между группами анализировали с использованием критерия Даннетта.
Как обобщено в табл. 10, конструкция UspA2 MC-001 индуцировала значительную защиту против как гомологичных, так и гетерологичных штаммов, включая штамм 43617, экспрессирующий UspA1, но не UspA2, и штамм ВВН18, экспрессирующий химерный белок UspA2H (состоящий из N-концевой последовательности из UspAl и С-концевой последовательности из UspA2).
Таблица 10. Защитная эффективность конструкции UspA2, MC-001
Штамм Экспрессированный UspA Идентичность в %* по сравнению с последовательностью вакцины АТСС25238 Logio КОЕ/мл Значение р
Контрольная группа Группа вакцины
25238 UspAl и UspA2 45,2/100 5,2 3,1 0, 01
43617 UspAl 40, 1 4,9 3,6 0, 01
F10 UspAl и UspA2 42,9/61,1 4,3 3,9 0,25
F10 UspAl и UspA2 42,9/61,1 4,4 3,6 0, 01
ВВН18 UspAl и UspA2H 42,9/57,3 4,3 3,5 0, 01
20 UspAl и UspA2 33,7/60,6 4,4 3,9 0, 02
* определено с использованием программного обеспечения Gapl./ClustalX по сравнению с фрагментом ак 30-540 UspA2 АТСС25238
Значение р, указанные жирным шрифтом, являются значимыми (р<0,05)
- 51 034352
Пример 9. Конструкция UspA2 MC-007: бактерицидная активность антител Бактерицидный анализ
Moraxella catarrhalis 25238 культивировали в течение ночи на чашке Петри при 37°C+5% CO2. Бактерии переносили в 12 мл буфера HBSS-BSA 0,1%, чтобы получить OD620 0,650. Образцы сыворотки нагревали в течение 45 мин при 56°C для инактивации эндогенного комплемента. Серийные двукратные разведения сыворотки в буфере SBA (HBSS-BSA 0,1%) добавляли в 96-луночный круглодонный планшет для микротитрования (25 мкл/лунку). Затем 50 мкл буфера SBA добавляли в каждую лунку. Затем 25 мкл Moraxella catarrhalis штамма 25238 при 4х104 КОЕ/мл добавляли в лунки, содержащие сыворотку, и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Наконец, добавляли 25 мкл свежеразмороженного комплемента детеныша кролика, разведенного 1/8 в 0,1% HBSS-BSA, для достижения конечного объема 125 мкл. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°C с ротационным встряхиванием (210 об./мин). Реакцию останавливали посредством выдерживания микропланшета на льду в течение по меньшей мере 5 мин. После гомогенизации, различные разведения суспензии наносили на чашки с шоколадным агаром и инкубировали в течение 24 ч при 37°C с 5% CO2, и подсчитывали колонии Moraxella. Восемь лунок без образцов сыворотки использовали в качестве бактериального контроля для определения количества колоний Moraxella catarrhalis на лунку. Среднее количество КОЕ в контрольных лунках определяли и использовали для расчета активности уничтожения для каждого образца сыворотки. Бактерицидные титры выражали как величину, обратную разведению сыворотки, индуцирующему 50% уничтожение.
Антисыворотки против UspA2, полученные у мышей с помощью конструкции UspA2 МС-001 или МС-007, тестировали в бактерицидном анализе с использованием протокола, описанного выше, против гомологичного штамма 25238 Moraxella catarrhalis.
Как показано в табл. 11, конструкция МС-007 UspA2 стимулировала высокий бактерицидный ответ, сходный с ответом, индуцированным МС-001.
Таблица 11. Бактерицидная активность антител против UspA2 MC-001 и МС-007. Нормальная сыворотка мышей=сыворотка от мышей, иммунизированных только AS02V, не UspA2
Образцы Бактерицидные титры
Нормальная сыворотка мышей (AS02V) -
Сыворотка мышей против убитых цельных клеток 25238 + +
Сыворотка мышей против UspA2, против UspA2 МС-001 + + +
Сыворотка мышей против UspA2, против UspA2 МС-007 + + +
Пример 10. Конструкция UspA2 МС-007: Защитная эффективность в модели заражения легких
Защита в модели колонизации легких на мышах самок мышей Balb/c в возрасте пяти недель (8 мышей на группу, 5 групп максимум на момент времени) иммунизировали внутримышечным способом на сутки 0, 14 и 28 с помощью 50 мкл вакцины, содержащей 10 мкг конструкции UspA2 MC-001 в составе с AS02V или МС-007 в составе с AS02V. Мышей подвергали интраназальному заражению на сутки 42 с помощью 5х105 КОЕ Moraxella catarrhalis штамма АТСС (зарегистрированный в США товарный знак) 25238™. Мышей иммунизировали 10 мкг убитых цельных клеток Moraxella catarrhalis штамма АТСС (зарегистрированный в США товарный знак) 25238™ (в качестве положительного контроля) (M.cat. WC 25238 на фиг. 14) или только AS02V (в качестве отрицательного контроля). Бактерии подсчитывали в легких, собранных через 0, 3 и 6 ч после заражения. Различия между группами анализировали с использованием критерия Даннетта.
Как показано на фиг. 14, обе конструкции UspA2 являлись сходным образом защитными против АТСС (зарегистрированный в США товарный знак) штамма 25238™.
Пример 11. Иммуногенность белковых составов UspA2 MC-009 у мышей
Группы из 25 самок мышей Balb/c иммунизировали внутримышечным (IM) способом на сутки 0, 14 и 28 с помощью 50 мкл следyющиx cocтaвoв:
MC-009 (1 мЬг) AlPO4 (1000 мкг/мл)
МС-009 (1 мкг) AS04C (AlPO4/MPL 100/100 на мл)
МС-009 (1 мкг) AS01e (QS21/MPL 50/50 на мл)
Уровни антител против IgG определяли в индивидуальных сыворотках, собранных на сутки 28 (PII) и 42 (PIII) с использованием следующего протокола:
ELISA для измерения антител против UspA2.
Проводили покрытие планшетов в течение ночи при 4°C с помощью 100 мкл на лунку конструкции UspA2 МС-009 при 4 мкг/мл в карбонатном буфере рН 9,6. Планшеты промывали три раза NaCl 0,09% TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 20 (полисорбат 20) 0,05%. После промывки, в микролунки добавляли серийные двукратные разведения сыворотки в PBS TWEEN (зарегистрированный в
- 52 034352
США товарный знак) 20 0,05%. Планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. После промывки добавляли антитела против IgG мыши (Jackson 115-035-003), конъюгированные с пероксидазой (100 мкл на лунку) и планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. Планшеты промывали, как выше, и раствор для проявления (4 мг OPDA Sigma P8787) и 5 мкл Н2О2 в 10 мл цитрата 0,1 М РН (рН) 4,5) добавляли в каждую лунку (100 мкл/лунку) на 15 мин в темноте. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл HCl 1 Н и поглощение считывали при 490 нм (620 нм для контрольного фильтра).
Титры рассчитывали 4-параметрическим способом с использованием программного обеспечения SOFTMAX (зарегистрированный в США товарный знак) Pro.
Как показано на фиг. 15, UspA2 индуцировал высокие уровни антител с каждым адъювантным составом. актерицидный анализ
Бактерицидный анализ проводили против М. catarrhalis штамма (АТСС (зарегистрированный в США товарный знак) 25238™), экспрессирующего гомологичный полноразмерный UspA2 с использованием следующего протокола: Moraxella catarrhalis штамма АТСС (зарегистрированный в США товарный знак) 25238™ культивировали в течение ночи на чашке Петри при 37°C+5% CO2. Бактерии переносили в 10 мл BHi (среда с экстрактом сердца), чтобы получить OD620 0,650. Образцы сыворотки нагревали в течение 45 мин при 56°C для инактивации эндогенного комплемента. Серийные двукратные разведения сыворотки в буфере SBA (HBSS-BSA 0,1%) добавляли в 96-луночный круглодонный планшет для микротитрования (25 мкл/лунку). Затем 50 мкл буфера SBA добавляли в каждую лунку. Затем 25 мкл Moraxella catarrhalis штамма 25238™ при 4х103 КОЕ/мл добавляли в лунки, содержащие сыворотку, и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Наконец, добавляли 25 мкл свежеразмороженного комплемента детеныша кролика, разведенного 1/8 в HBSS-BSA 0,1%, для достижения конечного объема 125 мкл. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°C с ротационным встряхиванием (210 об./мин). Реакцию останавливали посредством выдерживания микропланшета на льду в течение по меньшей мере 5 мин. Затем аликвоту 20 мкл из каждой лунки планшета переносили в соответствующую лунку 96луночного плоскодонного микропланшета и 50 мкл среды Мюллера-Хинтона - 0,9% агара добавляли в каждую лунку. 50 мкл PBS с 0,9% агаром добавляли в качестве второго слоя. После 3 ч при 37°C с 5% CO2 планшеты инкубировали в течение ночи при 25°C, колонии Moraxella подсчитывали с использованием автоматической системы анализа изображений (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Germany). Восемь лунок без образцов сыворотки использовали в качестве бактериального контроля для определения количества Moraxella на лунку. Среднее количество КОЕ в контрольных лунках определяли и использовали для расчета активности уничтожения для каждого образца сыворотки. Бактерицидные титры выражали как величину, обратную разведению сыворотки, индуцирующему 50% уничтожение.
На фиг. 16 проиллюстрированы бактерицидные титры, индуцированные UspA2 против гомологичного штамма. В этом эксперименте, UspA2 индуцировал высокие уровни бактерицидных антител для каждого адъювантного состава. Сыворотку тестировали в PIII; тестировали пять пулов из пяти образцов сыворотки.
Пример 12. Иммуногенность UspA2 в комбинации с антигенами PD и PE-PilA NTHi.
Протокол иммунизации
Группы из 25 самок мышей Balb/c иммунизировали внутримышечным (IM) способом на сутки 0, 14 и 28 с помощью 50 мкл следующих составов:
конструкция UspA2 мС-009 (1 мкг) AlPO4 конструкция UspA2 МС-009 (1 мкг) AS04C конструкция UspA2 МС-009 (1 мкг) AS01E
UspA2-PD-PEPilA (конструкция UspA2 МС-009, конструкция PEPilA LVL-735) AlPO4 (1 мкг каждой из UspA2, PD и PEPilA; 1000 мг/мл AlPO4)
UspA2-PD-PEPilA (конструкция UspA2 МС-009, конструкция PEPilA LVL-735) AS04C, AlPO4 (1 мкг каждой из UspA2, PD и PEPilA; 100/100 на мл AlPO4/MPL)
UspA2-PD-PEPilA (конструкция UspA2 МС-009, конструкция PEPilA LVL-735) AS01E (1 мкг каждой из UspA2, PD и PEPilA; 50/50 на мл QS21/MPL)
ELISA для измерения антител против UspA2
Уровни IgG против Anti-UspA2 определяли в индивидуальных сыворотках, собранных на сутки 28 и 42, с использованием следующего протокола.
Проводили покрытие планшетов в течение ночи при 4°C с помощью 100 мкл на лунку конструкции UspA2 МС-009 при 4 мкг/мл в карбонатном буфере рН 9,6. Планшеты промывали три раза NaCl 0,09% TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 20 (полисорбат 20) 0,05%. После промывки, в микролунки добавляли серийные двукратные разведения сыворотки в PBS TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 20 0,05%. Планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. После промывки добавляли антитела против IgG мыши (Jackson 115-035-003), конъюгированные с пероксидазой (100 мкл на лунку), и планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. Планшеты промывали, как выше, и раствор для проявления (4 мг
- 53 034352
OPDA Sigma P8787) и 5 мкл Н2О2 в 10 мл цитрата 0,1 М РН (рН) 4,5) добавляли в каждую лунку (100 мкл/лунку) на 15 мин в темноте. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл HCl 1Н, и поглощение считывали при 490 нм (620 нм для контрольного фильтра). Титры рассчитывали 4-параметрическим способом с использованием программного обеспечения SOFTMAX (зарегистрированный в США товарный знак) Pro.
ELISA для измерения антител против РЕ
Проводили покрытие планшетов в течение ночи при 4°C с помощью 100 мкл на лунку 2 мкг/мл UspA2 в карбонатном буфере рН 9,6. Планшеты промывали три раза NaCl 0,09% TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 0,05%. После промывки, в микролунки добавляли серийные двукратные разведения сыворотки в PBS TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 20 0,05%. Планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. После промывки добавляли антитела против IgG мыши (Jackson 115-035-003), конъюгированные с пероксидазой (100 мкл на лунку), и планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. Планшеты промывали, как выше, и раствор для проявления (4 мг OPDA и 5 мкл Н2О2 в 10 мл цитрата 0,1 М РН
4,5) добавляли в каждую лунку (100 мкл/лунку) на 15 мин в темноте. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл HCl 1 Н, и поглощение считывали при 490 нм (620 нм для контрольного фильтра).
Титры рассчитывали 4-параметрическим способом с использованием программного обеспечения SOFTMAX (зарегистрированный в США товарный знак) Pro.
ELISA для измерения антител против PilA
Проводили покрытие планшетов в течение ночи при 4°C с помощью 100 мкл на лунку 4 мкг/мл PilA в карбонатном буфере рН 9,6. Планшеты промывали три раза NaCl 0,09% TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 0,05%. После промывки, в микролунки добавляли серийные двукратные разведения сыворотки в PBS TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 20 0,05%. Планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. После промывки добавляли антитела против IgG мыши (Jackson 115-035-003), конъюгированные с пероксидазой (100 мкл на лунку), и планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. Планшеты промывали, как выше, и раствор для проявления (4 мг OPDA и 5 мкл Н2О2 в 10 мл цитрата 0,1М РН 4,5) добавляли в каждую лунку (100 мкл/лунку) на 15 мин в темноте. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл HCl 1 Н, и поглощение считывали при 490 нм (620 нм для контрольного фильтра).
Титры рассчитывали 4-параметрическим способом с использованием программного обеспечения SOFTMAX (зарегистрированный в США товарный знак) Pro.
ELISA для измерения антител против PD
Проводили покрытие планшетов в течение ночи при 4°C с помощью 100 мкл на лунку 8 мкг/мл PD в карбонатном буфере рН 9,6. Планшеты промывали три раза NaCl 0,09% TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 0,05%. После промывки, в микролунки добавляли серийные двукратные разведения сыворотки в PBS TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 20 0,05%. Планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. После промывки добавляли антитела против IgG мыши (Jackson 115-035-003), конъюгированные с пероксидазой (100 мкл на лунку), и планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. Планшеты промывали, как выше, и раствор для проявления (4 мг OPDA и 5 мкл Н2О2 в 10 мл цитрата 0,1 М РН 4,5) добавляли в каждую лунку (100 мкл/лунку) на 15 мин в темноте. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл HCl 1Н, и поглощение считывали при 490 нм (620 нм для контрольного фильтра).
Титры рассчитывали 4-параметрическим способом с использованием программного обеспечения SOFTMAX (зарегистрированный в США товарный знак) Pro. Бактерицидный анализ Бактерицидные титры измеряли в пулированных сыворотках (5 пулов/группу), собранных на сутки 42 с использованием следующего протокола:
Moraxella catarrhalis культивировали в течение ночи на чашке Петри при 37°C+5% CO2. Бактерии переносили в 10 мл BHi (среда с экстрактом сердца), чтобы получить OD620 of 0,650. Образцы сыворотки нагревали в течение 45 мин при 56°C для инактивации эндогенного комплемента. Серийные двукратные разведения сыворотки в буфере SBA (HBSS-BSA 0,1%) добавляли в 96-луночный круглодонный планшет для микротитрования (25 мкл/лунку). Затем 50 мкл буфера SBA добавляли в каждую лунку. Затем 25 мкл Moraxella catarrhalis штамма 25238 при 4х103 КОЕ/мл добавляли в лунки, содержащие сыворотку, и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Наконец, добавляли 25 мкл свежеразмороженного комплемента детеныша кролика, разведенного 1/8 в HBSS-BSA 0,1%, для достижения конечного объема 125 мкл. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°C с ротационным встряхиванием (210 об./мин). Реакцию останавливали посредством выдерживания микропланшета на льду в течение по меньшей мере 5 мин. Затем аликвоту 20 мкл из каждой лунки планшета переносили в соответствующую лунку 96-луночного плоскодонного микропланшета, и 50 мкл среды Мюллера-Хинтона 0,9% агара добавляли в каждую лунку. 50 мкл PBS с 0,9% агаром добавляли в качестве второго слоя. После 3 ч при 37°C с 5% CO2 планшеты инкубировали в течение ночи при 25°C. Колонии Moraxella подсчитывали с использованием автоматической системы анализа изображений (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Germany). Восемь лунок без образцов сыворотки использовали в качестве бактериального контроля для определе- 54 034352 ния количества Moraxella на лунку. Среднее количество КОЕ в контрольных лунках определяли и использовали для расчета активности уничтожения для каждого образца сыворотки. Бактерицидные титры выражали как величину, обратную разведению сыворотки, индуцирующему 50% уничтожение.
Бактерицидный анализ проводили против Moraxella catarrhalis штамма 25238™, экспрессирующего гомологичный UspA2.
Отрицательное влияние присутствия антигенов PD и PE-PilA на уровни IgG против UspA2 наблюдали в составах AS04C (точка III) и AS01E (точка II) (фиг. 17). Однако влияние оставалось ограниченным (уменьшение уровня антител в <2 раза) и не было подтверждено в бактерицидном анализе (фиг. 18). Ответы IgG, индуцированные против PD, РЕ и PilA у мышей посредством вакцины PE-PEPilA-UspA2, показаны на фиг. 19, фиг. 20 и фиг. 21, соответственно.
Таким образом, UspA2 являлся иммуногенным при комбинации с PD и РЕ-PilA.
Пример 13. Конструкция UspA2 МС-009: Иммуногенность антигенов PD и PE-PilA NTHi в комбинации с UspA2 у мышей
Протокол иммунизации
Группы из 25 самок мышей Balb/c иммунизировали внутримышечным (IM) способом на сутки 0, 14 и 28 с помощью 50 мкл следующих составов:
PD-PEPilA (1 мкг PD и 1 мкг конструкции PEPilA LVL-735) AS01E
UspA2-PD-PEPilA (1 мкг конструкции UspA2 МС-009, PD и конструкции PEPilA LVL-735) AS01E
Уровни IgG против PD, РЕ и PilA в ELISA определяли в индивидуальных сыворотках, собранных на сутки 28 (PII) и 42 (PIII).
ELISA для измерения антител против РЕ
Проводили покрытие планшетов в течение ночи при 4°C с помощью 100 мкл на лунку 2 мкг/мл UspA2 в карбонатном буфере рН 9,6. Планшеты промывали три раза NaCl 0,09% TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 0,05%. После промывки, в микролунки добавляли серийные двукратные разведения сыворотки в PBS TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 20 0,05%. Планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. После промывки добавляли антитела против IgG мыши (Jackson 115-035-003), конъюгированные с пероксидазой (100 мкл на лунку), и планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. Планшеты промывали, как выше, и раствор для проявления (4 мг OPDA и 5 мкл Н2О2 в 10 мл цитрата 0,1 М РН
4,5) добавляли в каждую лунку (100 мкл/лунку) на 15 мин в темноте. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл HCl 1 Н, и поглощение считывали при 490 нм (620 нм для контрольного фильтра).
Титры рассчитывали 4-параметрическим способом с использованием программного обеспечения SOFTMAX (зарегистрированный в США товарный знак) Pro. ELISA для измерения антител против PilA
Проводили покрытие планшетов в течение ночи при 4°C с помощью 100 мкл на лунку 4 мкг/мл of PilA в карбонатном буфере рН 9,6. Планшеты промывали три раза NaCl 0,09% TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 0,05%. После промывки, в микролунки добавляли серийные двукратные разведения сыворотки в PBS TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 20 0,05%. Планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. После промывки добавляли антитела против IgG мыши (Jackson 115-035-003), конъюгированные с пероксидазой (100 мкл на лунку), и планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. Планшеты промывали, как выше, и раствор для проявления (4 мг OPDA и 5 мкл Н2О2 в 10 мл цитрата 0,1М РН
4,5) добавляли в каждую лунку (100 мкл/лунку) на 15 мин в темноте. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл HCl 1 Н, и поглощение считывали при 490 нм (620 нм для контрольного фильтра).
Титры рассчитывали 4-параметрическим способом с использованием программного обеспечения SOFTMAX (зарегистрированный в США товарный знак) Pro.
ELISA для измерения антител против PD
Проводили покрытие планшетов в течение ночи при 4°C с помощью 100 мкл на лунку 8 мкг/мл PD в карбонатном буфере рН 9,6. Планшеты промывали три раза NaCl 0,09% TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 0,05%. После промывки, в микролунки добавляли серийные двукратные разведения сыворотки в PBS TWEEN (зарегистрированный в США товарный знак) 20 0,05%. Планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. После промывки добавляли антитела против IgG мыши (Jackson 115-035-003), конъюгированные с пероксидазой (100 мкл на лунку), и планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании. Планшеты промывали, как выше, и раствор для проявления (4 мг OPDA и 5 мкл Н2О2 в 10 мл цитрата 0,1 М РН 4,5) добавляли в каждую лунку (100 мкл/лунку) на 15 мин в темноте. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл HCl 1Н, и поглощение считывали при 490 нм (620 нм для контрольного фильтра).
Титры рассчитывали 4-параметрическим способом с использованием программного обеспечения SOFTMAX (зарегистрированный в США товарный знак) Pro.
Не наблюдали значительного влияния добавления UspA2 на иммуногенность PD и PEPilA в AS01E, как показано на фиг. 22, 23 и 24.
- 55 034352
Пример 14. Безопасность тетравалентного вакцинного состава, содержащего UspA2, в модели воспаления легких с Moraxella catarrhalis на мышах.
Для уменьшения риска индукции нежелательных воспалительных ответов в легких пациентов COPD при иммунизации вакциной-кандидатом с целью предотвращения обострений из-за нетипируемого Haemophilus influenzae (NTHi) и Moraxella catarrhalis (M. cat.), различные модели на животных разработали и использовали для оценки безопасности этой вакцины. Тестированный состав содержал три антигена NTHi (PD, РЕ и PilA, где два последних комбинировали в форме слитого белка PEPilA), один антиген М. cat. (UspA2) и адъювантную систему 01Е (AS01E).
В частности, две модели предназначены для оценки безопасности компонента UspA2 вакцины.
Модель 1.
Цель:
Целью этой модели являлась оценка возможной индукции нежелательных иммунных ответов в воспаленных легких после вакцинации.
Дизайн исследования
Мышей G57Bl/6 сенсибилизировали посредством трех интраназальных введений 25 мкг инактивированных нагреванием цельных клеток М. cat. штамма АТСС (зарегистрированный в США товарный знак) 25238™ (экспрессирующих UspA2, который является на 100% гомологичным вакцинному UspA2) на сутки 0, 7 и 14. Эта обработка индуцировала в легких периваскулярное и перибронхиолярное воспаление (с формированием лимфоидных агрегатов), альвеолит, пневмонит, фиброз и сильный ответ IL-17+ CD4+ Т-клеток, специфических для цельных клеток M.cat., что вместе имитировало воспалительный процесс, наблюдаемый в легких пациентов с COPD (за исключением эмфиземы).
Затем мышей вакцинировали на сутки 42 внутримышечным способом 1/10-й дозы для человека следующих составов:
PD 10 мкг/ PEPilA (конструкция LVL735, описанная в WO 2012/139225) 10 мкг/ UspA2 (конструкция МС009) 10 мкг/ AS01e
PD 10 мкг/ PEPilA (конструкция LVL735) 10 мкг/ UspA2 (конструкция МС009) 3,3 мкг/ AS01E
AS01E (отрицательный контроль)
PBS (отрицательный контроль)
Для оценки влияния этих составов на индуцированное сенсибилизацией воспаление легких:
Мышей ежесуточно мониторировали от суток 43 до суток 49 для обследования смертности и любых клинических признаков, указывающих на индукцию неблагоприятных событий (упадок сил, пилоэрекция, сгорбленная поза).
Гистологический анализ легких проводили на сутки 2, 7 и 14 после вакцинации (по 5 мышей на группу и временную точку) для наблюдения возможного ухудшения воспаления.
Индукцию потенциально нежелательных Т-клеточных ответов оценивали на пулах легких, собранных на сутки 7 и 14 после вакцинации (по 4 пула/группу/временную точку и легкие от 3 мышей на группу). Т-клетки легких повторно стимулировали в течение ночи пептидами UspA2, инактивированными нагреванием цельными клетками (WC) М. cat. или средой (в качестве отрицательного контроля), а затем анализировали проточной цитометрией по экспрессии CD5, CD4, CD8, IL-17, IL-13, TNFa и IFNy.
Результаты
Не зарегистрировано смертности или неблагоприятных событий.
Гистология легких (фиг. 25-29):
Изменения, наблюдаемые в легких, являлись сходными по тяжести во всех группах и характеризовались периваскулярной/бронхиолярной инфильтрацией мононуклеарных клеток от слабой до умеренной степени.
Не наблюдали альвеолита и/или пневмонита, связанных с вакцинацией.
Т-клеточный ответ:
Сильные ответы CD4+ Т-клеток (в основном, клеток, продуцирующих IL-17 и TNFa) измеряли в легких после повторной стимуляции WC, однако, вне зависимости от введенного состава (вакцины или только адъювант, или PBS) (фиг. 30-33). Наблюдали низкие ответы или отсутствие ответов CD8+ Тклеток легких (данные не показаны).
Не происходило повторной стимуляции поддающегося детекции ответа Т-клеток посредством пептидов UspA2, вне зависимости от группы, что указывает на то, что специфический для UspA2 ответ не был примирован или повторно стимулирован после вакцинации (данные не показаны).
Модель 2.
Цель:
Целью этой модели являлась оценка возможной индукции нежелательных иммунных ответов в воспаленных легких после вакцинации и заражения М. cat.
Дизайн исследования
Мышей С57В1/6 последовательно подвергали:
Сенсибилизации посредством трех интраназальных введений 25 мкг инактивированных нагревани- 56 034352 ем цельных клеток М. cat. штамма 25238 (экспрессирующих UspA2, который является на 100% гомологичным вакцинному UspA2) на сутки 0, 7 и 14 (как в модели 1).
Вакцинации на сутки 42 внутримышечным способом 1/10-й дозы для человека следующих составов (как в модели 1):
PD (10 мкг/ PEPilA (конструкция LVL735) 10 мкг/ UspA2 (конструкция МС009) 10 мкг/ AS01E
PD 10 мкг/ PEPilA (конструкция LVL735) 10 мкг/ UspA2 (конструкция МС009) 3,3 мкг/ AS01E AS01e (отрицательный контроль)
PBS (отрицательный контроль)
Заражению посредством одного интраназального введения 25 мкг инактивированных нагреванием WC М. cat. штамма F10 (экспрессирующих UspA2, разделяющий 53% гомологии с вакцинным UspA2) или посредством одного интраназального введения PBS в качестве контроля, оба на сутки 56. Штамм для заражения являлся отличным от штамма для сенсибилизации для имитации ситуации, наблюдаемой у пациентов с COPD, испытывающих новые обострения из-за вновь приобретенных штаммов М. cat.
Для оценки влияния вакцинации и заражения на индуцированное сенсибилизацией воспаление легких:
Мышей ежесуточно мониторировали от суток 43 до суток 63 для обследования смертности и любых клинических признаков, указывающих на индукцию неблагоприятных событий (упадок сил, пилоэрекция, сгорбленная поза).
Индукцию потенциально нежелательных Т-клеточных ответов оценивали на пулах легких, собранных на сутки 7 и 14 после заражения (по 4 пула/группу/временную точку и легкие от 3 мышей на группу). Т-клетки легких повторно стимулировали в течение ночи пептидами UspA2, инактивированными нагреванием WC M. cat. F10 или средой (в качестве отрицательного контроля), а затем анализировали проточной цитометрией по экспрессии CD5, CD4, CD8, IL-17, IL-13, TNFa и IFNy.
Результаты
Не зарегистрировано смертности или неблагоприятных событий.
Ответ Т-клеток:
Сильные ответы CD4+ Т-клеток после заражения (в основном, клеток, продуцирующих IL-17 и TNFa) измеряли в легких после повторной стимуляции WC F10, вне зависимости от введенного состава (вакцины или только адъювант, или PBS) (фиг. 34-37). Неудивительно, что эти ответы были более высокими у мышей после заражения инактивированными бактериями, чем у мышей после заражения PBS. Вне зависимости от заражения, наблюдали низкие ответы или отсутствие ответов CD8+ Т-клеток легких (данные не показаны).
Не происходило повторной стимуляции поддающегося детекции ответа Т-клеток посредством пептидов UspA2, вне зависимости от группы, что указывает на то, что специфический для UspA2 ответ не был примирован или повторно стимулирован после заражения (данные не показаны).
Заключение
Показано, что тестированные составы PD/PEPilA/UspA2/AS01E и, более конкретно, компонент UspA2 этих вакцин, являлись безопасными в модели воспаления легких с М. cat. у мышей.

Claims (43)

1. Белок формулы I для индукции иммунного ответа против Moraxella catarrhalis:
A- (Ri)m- (В)п (формула I), где
А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2 из Moraxella catarrhalis, имеющий по меньшей мере 90% идентичности с SEQ ID No: 39, SEQ ID No: 40, SEQ ID No: 41, SEQ ID No: 42 или SEQ ID No: 43;
R1 представляет собой аминокислоту;
m представляет собой 0 или 2;
B представляет собой гистидин и n представляет собой 0, 1, 2 или 6.
2. Белок по п. 1, где m представляет собой 2.
3. Белок по п. 1, где m представляет собой 0.
4. Белок по любому из пп. 1-3, где (R1)m представляет собой AS (аланин, серин).
5. Белок по любому из пп. 1-4, где n выбран из группы, состоящей из 1, 2 и 6.
6. Белок по любому из пп. 1-5, где n представляет собой 2.
7. Белок по любому из пп. 1-6, дополнительно содержащий метионин на аминоконце.
8. Белок по любому из пп. 1-4 или 7, где n представляет собой 0.
9. Белок по любому из пп.1-8, где А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, выбранный из группы, состоящей из аминокислот 30-540 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 39), аминокислот 31-540 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 40), аминокислот 30-519 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 41), аминокислот 30-564 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 42) и аминокислот 31-564 из SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 43).
- 57 034352
10. Белок по любому из пп.1-9, где А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, имеющий по меньшей мере 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности с SEQ ID NO: 39.
11. Белок по любому из пп.1-9, где А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, имеющий по меньшей мере 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности с SEQ ID NO: 43.
12. Белок по любому из пп.1-11, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 88.
13. Белок по п.12, имеющий последовательность SEQ ID NO: 69.
14. Белок по любому из пп.1-13, где А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, содержащий связывающий ламинин домен и связывающий фибронектин домен.
15. Белок по любому из пп.1-13, где А представляет собой иммуногенный фрагмент UspA2, содержащий связывающий ламинин домен, связывающий фибронектин домен и связывающий C3 домен.
16. Иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против Moraxella catarrhalis, содержащая белок по любому из пп.1-15.
17. Иммуногенная композиция по п.16, содержащая белок, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 88.
18. Иммуногенная композиция по любому из пп.16, 17, дополнительно содержащая по меньшей мере один антиген из Haemophilus influenzae.
19. Иммуногенная композиция по п.18, где указанный один антиген представляет собой белок D.
20. Иммуногенная композиция по пп.16-19, дополнительно содержащая белок Е.
21. Иммуногенная композиция по любому из пп. 16-20, дополнительно содержащая PilA.
22. Иммуногенная композиция по п.21, где РЕ и PilA присутствуют в форме слитого белка.
23. Вакцина для индукции иммунного ответа против Moraxella catarrhalis, содержащая белок по любому из пп.1-15 или иммуногенную композицию по любому из пп.16-22.
24. Вакцина по п.23, дополнительно содержащая адъювант.
25. Вакцина по п.24, где адъювант представляет собой AS01E.
26. Вакцина по любому из пп.23-25, где иммуногенная композиция содержит белок из SEQ ID NO:
69, белок D и слитый белок PE-PilA.
27. Вакцина по любому из пп.23-26, где слитый белок PE-PilA представляет собой LVL-735.
28. Вакцина по любому из пп.23-27, содержащая 10 мкг белка D, 10 мкг слитого белка PEPilA LVL735, 10 мкг фрагмента UspA2 MC009 и адъювант AS01E.
29. Вакцина по любому из пп.23-27, содержащая 10 мкг белка D, 10 мкг слитого белка PEPilA LVL735, 3,3 мкг фрагмента UspA2 МС009 и адъювант AS01E.
30. Способ лечения или профилактики отита среднего уха у пациента, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции по любому из пп. 16-22 или вакцины по любому из пп.23-29.
31. Способ лечения или профилактики острых приступов хронического обструктивного заболевания легких (AECOPD) у пациента, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции по любому из пп.16-22 или вакцины по любому из пп.2329.
32. Способ лечения или профилактики пневмонии у пациента, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции по любому из пп.16-22 или вакцины по любому из пп.23-29.
33. Способ лечения или профилактики заболевания, вызванного М. Catarrhalis, у пациента, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции по любому из пп.16-22 или вакцины по любому из пп.23-29.
34. Применение белка по пп.1-15 в лечении или профилактике отита среднего уха.
35. Применение иммуногенной композиции по пп.16-22 в лечении или профилактике отита среднего уха.
36. Применение вакцины по пп.23-29 в лечении или профилактике отита среднего уха.
37. Применение белка по пп.1-15 в лечении или профилактике острых приступов хронического обструктивного заболевания легких (AECOPD).
38. Применение иммуногенной композиции по пп.16-22 в лечении или профилактике острых приступов хронического обструктивного заболевания легких (AECOPD).
39. Применение вакцины по пп.23-29 в лечении или профилактике острых приступов хронического обструктивного заболевания легких (AECOPD).
40. Применение белка по пп.1-15 в лечении или профилактике пневмонии.
41. Применение иммуногенной композиции по пп.16-22 в лечении или профилактике пневмонии.
42. Применение вакцины по пп.23-29 в лечении или профилактике пневмонии.
43. Белок по пп.1-15 или иммуногенная композиция по пп.16-22, или вакцина по пп.23-29 для применения в лечении или профилактике заболевания, вызванного М. catarrhalis.
EA201691611A 2014-02-24 2015-02-20 Конструкции белка uspa2 и их применения EA034352B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461943909P 2014-02-24 2014-02-24
US201461946937P 2014-03-03 2014-03-03
US201461946932P 2014-03-03 2014-03-03
PCT/IB2015/051308 WO2015125118A1 (en) 2014-02-24 2015-02-20 Uspa2 protein constructs and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201691611A1 EA201691611A1 (ru) 2016-12-30
EA034352B1 true EA034352B1 (ru) 2020-01-30

Family

ID=52629643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201691611A EA034352B1 (ru) 2014-02-24 2015-02-20 Конструкции белка uspa2 и их применения

Country Status (27)

Country Link
US (3) US10040832B2 (ru)
EP (2) EP3110438B1 (ru)
JP (1) JP6585085B2 (ru)
KR (1) KR102515835B1 (ru)
CN (2) CN106061995A (ru)
AU (1) AU2015220369B2 (ru)
BE (1) BE1022345A9 (ru)
BR (1) BR112016019525B1 (ru)
CA (1) CA2939862C (ru)
CY (2) CY1121535T1 (ru)
DK (2) DK3498292T3 (ru)
EA (1) EA034352B1 (ru)
ES (2) ES2899300T3 (ru)
HR (2) HRP20211926T1 (ru)
HU (2) HUE042054T2 (ru)
IL (1) IL246994B (ru)
LT (2) LT3498292T (ru)
ME (1) ME03335B (ru)
MX (1) MX2016010954A (ru)
PL (2) PL3498292T3 (ru)
PT (2) PT3110438T (ru)
RS (2) RS58451B1 (ru)
SG (1) SG11201606272PA (ru)
SI (2) SI3498292T1 (ru)
TW (1) TW201620927A (ru)
UY (1) UY36006A (ru)
WO (1) WO2015125118A1 (ru)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201620927A (zh) * 2014-02-24 2016-06-16 葛蘭素史密斯克藍生物品公司 Ｕｓｐａ２蛋白質構築體及其用途
GB201621686D0 (en) 2016-12-20 2017-02-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods for inducing an immune response
JP2020515587A (ja) * 2017-03-31 2020-05-28 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 免疫原性組成物、使用及び処置方法
WO2018178265A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Immunogenic composition, use and method of treatment
IE87414B1 (en) 2017-05-30 2023-07-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods for manufacturing an adjuvant
WO2019034575A1 (en) 2017-08-14 2019-02-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa METHODS OF AMPLIFYING IMMUNE RESPONSES
EP3717001A1 (en) 2017-12-01 2020-10-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Saponin purification
GB201803692D0 (en) * 2018-03-08 2018-04-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
CA3107077A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Processes and vaccines
CN112912097A (zh) * 2018-08-23 2021-06-04 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性蛋白和组合物
WO2020109365A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Methods for manufacturing an adjuvant
EP3956666A1 (en) 2019-04-18 2022-02-23 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Antigen binding proteins and assays
CN114080393A (zh) 2019-06-05 2022-02-22 葛兰素史克生物有限公司 皂苷纯化
AU2020325645A1 (en) 2019-08-05 2022-02-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
CA3148928A1 (en) 2019-08-05 2021-02-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Process for preparing a composition comprising a protein d polypeptide
EP4028771A1 (en) 2019-09-11 2022-07-20 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Assay
WO2022175423A1 (en) 2021-02-22 2022-08-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition, use and methods
WO2024017827A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Continuous process for vaccine production

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998028333A2 (en) * 1996-12-20 1998-07-02 The Board Of Regents, The University Of Texas System USPA1 AND USPA2 ANTIGENS OF $i(MORAXELLA CATARRHALIS)
WO2002083710A2 (en) * 2001-04-13 2002-10-24 Wyeth Holdings Corporation Removal of bacterial endotoxin in a protein solution by immobilized metal affinity chromatography
WO2007018463A2 (en) * 2005-08-10 2007-02-15 Arne Forsgren Ab Interaction of moraxella catarrhalis with epithelial cells, extracellular matrix proteins and the complement system
WO2007084053A1 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Arne Forsgren A NOVEL SURFACE EXPOSED HAEMOPHILUS INFLUENZAE PROTEIN (PROTEIN E; pE)

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
PT761231E (pt) 1992-06-25 2000-06-30 Smithkline Beecham Biolog Composicao de vacina contendo adjuvantes
EP1175912A1 (en) 1993-03-23 2002-01-30 SmithKline Beecham Biologics SA Vaccine compositions containing 3-O deacylated monophosphoryl lipid A
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US6194388B1 (en) 1994-07-15 2001-02-27 The University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
EP1322656B1 (en) 2000-09-26 2008-01-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
MXPA04000653A (es) * 2001-07-27 2004-11-22 Chiron Srl Adhesinas de meningococcus nada, app y orf 40.
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
ZA200800891B (en) * 2005-08-10 2009-06-24 Arne Forsgren Ab Interaction of moraxella catarrhalis with epithelial cells, extracellular matrix proteins and the complement system
TW201302779A (zh) 2011-04-13 2013-01-16 Glaxosmithkline Biolog Sa 融合蛋白質及組合疫苗
KR20140066126A (ko) * 2011-05-11 2014-05-30 리스벡 헬스케어 스웨덴 에이비 단백질 f - 라미닌 및 비트로넥틴 결합 특성을 갖는 신규한 헤모필러스 인플루엔자 부착분자
TW201620927A (zh) * 2014-02-24 2016-06-16 葛蘭素史密斯克藍生物品公司 Ｕｓｐａ２蛋白質構築體及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998028333A2 (en) * 1996-12-20 1998-07-02 The Board Of Regents, The University Of Texas System USPA1 AND USPA2 ANTIGENS OF $i(MORAXELLA CATARRHALIS)
WO2002083710A2 (en) * 2001-04-13 2002-10-24 Wyeth Holdings Corporation Removal of bacterial endotoxin in a protein solution by immobilized metal affinity chromatography
WO2007018463A2 (en) * 2005-08-10 2007-02-15 Arne Forsgren Ab Interaction of moraxella catarrhalis with epithelial cells, extracellular matrix proteins and the complement system
WO2007084053A1 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Arne Forsgren A NOVEL SURFACE EXPOSED HAEMOPHILUS INFLUENZAE PROTEIN (PROTEIN E; pE)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE UniProt [online] 1 January 1999 (1999-01-01), COPE L D, ET AL: "SubName: Full=Ubiquitous surface protein A2 {ECO:0000313|EMBL:AGH27427.1}; SubName: Full=UspA2 {ECO:0000313|EMBL:AAD43466.1};", XP002739304, retrieved from EBI *
MCMICHAEL JOHN C ET AL: "Isolation and characterization of two proteins from Moraxella catarrhalis that bear a common epitope", INFECTION AND IMMUNITY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 66, no. 9, 1 September 1998 (1998-09-01), US, pages 4374 - 4381, XP002291595, ISSN: 0019-9567 *

Also Published As

Publication number Publication date
SI3498292T1 (sl) 2022-01-31
US20170008932A1 (en) 2017-01-12
TW201620927A (zh) 2016-06-16
RS58451B1 (sr) 2019-04-30
JP6585085B2 (ja) 2019-10-02
AU2015220369B2 (en) 2018-02-01
CA2939862A1 (en) 2015-08-27
SI3110438T1 (sl) 2019-05-31
JP2017507181A (ja) 2017-03-16
CN111499701A (zh) 2020-08-07
US20200325184A1 (en) 2020-10-15
SG11201606272PA (en) 2016-09-29
BE1022345A9 (fr) 2016-11-16
US20180354996A1 (en) 2018-12-13
EP3110438B1 (en) 2019-01-02
US10947280B2 (en) 2021-03-16
HRP20190412T1 (hr) 2019-04-19
ES2715674T3 (es) 2019-06-05
EA201691611A1 (ru) 2016-12-30
HUE042054T2 (hu) 2019-06-28
WO2015125118A1 (en) 2015-08-27
US10040832B2 (en) 2018-08-07
EP3498292B1 (en) 2021-10-20
IL246994A0 (en) 2016-09-29
BR112016019525B1 (pt) 2024-01-02
CY1124979T1 (el) 2022-11-25
BE1022345B1 (fr) 2016-03-25
IL246994B (en) 2020-11-30
ES2899300T3 (es) 2022-03-10
PL3498292T3 (pl) 2022-02-14
UY36006A (es) 2015-09-30
US10745449B2 (en) 2020-08-18
BR112016019525A2 (pt) 2017-10-24
CN106061995A (zh) 2016-10-26
PL3110438T3 (pl) 2019-06-28
HUE057505T2 (hu) 2022-05-28
MX2016010954A (es) 2016-11-11
LT3498292T (lt) 2021-11-25
RS62592B1 (sr) 2021-12-31
HRP20211926T1 (hr) 2022-03-18
LT3110438T (lt) 2019-04-10
EP3498292A1 (en) 2019-06-19
EP3110438A1 (en) 2017-01-04
KR102515835B1 (ko) 2023-03-31
AU2015220369A1 (en) 2016-09-15
KR20160124774A (ko) 2016-10-28
DK3110438T3 (en) 2019-03-25
CY1121535T1 (el) 2020-05-29
DK3498292T3 (da) 2022-01-03
CA2939862C (en) 2022-12-06
PT3110438T (pt) 2019-03-29
ME03335B (me) 2019-10-20
PT3498292T (pt) 2021-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10947280B2 (en) UspA2 protein constructs and uses thereof
US20190015502A1 (en) Use of fluorinated cyclic dinucleotides as oral vaccine adjuvants
EP2214840B1 (en) Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium
US9750793B2 (en) Multifunctional oral vaccine based on chromosome recombineering
KR101840360B1 (ko) 브루셀라 균 주요 공통 항원을 발현하는 lps의 o-항원 결실 비병원성 살모넬라 균주를 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물
JP2020510726A (ja) 低下した反応源性を有するｌｐｓを含むボルデテラワクチン
JP2023098935A (ja) 歯周炎ワクチンおよび関連組成物ならびに使用方法
US20220047697A1 (en) Salmonella vaccine for the treatment of coronavirus
US20060280759A1 (en) Live and subunit vaccines
KR101873362B1 (ko) 브루셀라 균 주요 공통 항원을 발현하는 비병원성 약독화 살모넬라 균주를 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물
WO2019170702A1 (en) Immunogenic composition comprising uspa2 epitope
US20230414738A1 (en) Haemophilus influenzae vaccine and methods of use
US20130330295A1 (en) Antigenic gly1 polypeptide

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG TJ TM