ES2712429T3

ES2712429T3 - Esteres de lactama esteroidea y derivados de ácido bis(2-cloroetil) aminofenoxi propanoico

Info

Publication number: ES2712429T3
Application number: ES16739424T
Authority: ES
Inventors: Dimitrios Trafalis
Original assignee: Energonbio Tech S A; Galenica SA
Current assignee: Energonbio Tech S A; Galenica SA
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2016-06-28
Publication date: 2019-05-13
Anticipated expiration: 2036-06-28
Also published as: EP3186268A1; JP2018519311A; CN107835817A; DK3186268T3; CA2990307A1; IL256456A; PT3186268T; RS58630B1; EP3186268B1; KR102647748B1; CY1121264T1; RU2018103071A3; RU2719457C2; TR201902369T4; IL256456B; CA2990307C; MX2017016679A; CN107835817B; RU2018103071A; AU2016286205A1

Abstract

Un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo**Fórmula** en la que R1 se selecciona del grupo que consiste en**Fórmula** R2 se selecciona del grupo que consiste en H, -CH3, -CH=CH2, -CH2-CH3, - CH2CH2CH3,**Fórmula** R3 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH, -NH2.

Description

DESCRIPCION

Esteres de lactama esteroidea y derivados de acido bis(2-cloroetil) aminofenoxi propanoico

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a nuevos esteres homo-aza-esteroideos con mostazas alquilantes, derivados de anilina, tales como acido bis(2-cloroetil)aminofenoxi propanoico y derivados sustituidos.

Antecedentes de la invencion

En la actualidad, los agentes antineoplasicos alquilantes, como las mostazas de nitrogeno, todavfa siguen siendo una clase eficaz de farmacos antitumorales en la practica clmica actual, cuyos efectos terapeuticos proceden de su capacidad de unir grupos alquilo al ADN celular y producir un dano significativo en el ADN (Hurley LH, Nature Rev Cancer, 2002, 2:188-200; Brendel M y Ruhland A, Mutat Res, 1984; 133:51-85).

Los conjugados esteroideos se han usado previamente como portadores de agentes alquilantes citotoxicos, ya que reducen la toxicidad sistemica y mejoran la eficacia de la terapia del cancer (Wall ME et al, J Med Chem, 1969, 12:810-8; Catane R, Cancer Treat Rep, 1978; 62:1264-5). En la actualidad se aplican agentes alquilantes esteroideos como Estramustina (ester de estradiol y mecloretamina) y Prednimustina (ester de prednisolona y clorambucilo) en la terapia del cancer en el tratamiento del cancer de prostata y neoplasias malignas linfoproliferativas, respectivamente (Catane R, Cancer Treat Rep, 1978, 62:1264-5; Matsumoto K et al, Med Oncol, 2013, 30:717; IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum, 1990, 50:115-22; Hiddemann W, Eur J Cancer, 1995, 31A(13-14):2141-5).

Aunque estos farmacos producen una toxicidad aguda y sistemica disminuida, al contrario que la toxicidad mucho mayor que sus componentes alquilantes producen por sf solos, su actividad antineoplasica no mejora tanto, al igual que la especificidad de la selectividad hacia las celulas cancerosas, que es mas bien baja a pesar de las evaluaciones iniciales. Sin embargo, incluso si los mecanismos farmacologicos moleculares principales mediante los que estramustina y prednimustina ejercen su actividad antineoplasica son muy diferentes a la accion espedfica en los receptores esteroideos, en general muestran una eficacia terapeutica buena y mejorada en la practica clmica.

Se han sintetizado previamente varios esteres homo-aza-esteroideos o esteroideos lactamicos (esteroides que contienen el grupo lactama -NHC=O- en el/los anillo(s) esteroideo(s) conjugado(s) con agentes alquilantes) y se ha ensayado su toxicidad y actividad antineoplasica en el ambito preclmico, in vitro e in vivo (Wampler GL y Catsoulacos P, Cancer Treat Rep, 1977, 61:37-41; Catsoulacos P y Catsoulacos D, Anticancer Res, 1991, 11:1773 7; Catsoulacos P y Catsoulacos D, Anticancer Res, 1993, 13(4): 1203-8; Catsoulacos P et al, Oncology, 1994, 51:74 8; Catsoulacos P y Catsoulacos D, Anticancer Res, 1994, 14(6B):2525-8; Camoutsis C y Trafalis DT, Invest New Drugs, 2003, 21:47-54; Koutsourea Al et al, Bioorg Med Chem, 2008, 16:5207-15). Efthimiou M et al., Mutation Res, 2010, 689:1-11 describe analogos de lactama esteroidea de acido p-N,N-bis(2-cloroetil)aminofenilacetico y su actividad en la proliferation celular. Catsoulacos P et al., J Heterocyclic Chem, 1995, 32:1063-1066 describe esteres de estrona-lactama de acido N,N-bis(2-cloroetil)aminocinamico y acido N,N-bis(2-cloroetil)aminofenilbutmco, su toxicidad y su actividad contra la leucemia. Papaconstantinou IC et al., Anti-Cancer Drugs, 2013, 24(1):52-65 describe esteres de lactama esteroidea de acido 2-[4-N,N-bis(2-cloroetil)aminofenil]butanoico, su toxicidad in vivo y su actividad antileucemica. Papageorgiou A et al., Anti-Cancer Drugs, 2005, 16(10):1075-1082 describe esteres de lactama esteroidea de acido 4-N,N-bis(2-cloroetil)amino fenilacetico, su toxicidad y su actividad antileucemica. Kapou A et al., J Chem Inf Model, 2008, 48:2254-2264 describe esteres de lactama esteroidea de acido p-N,N-bis(2-cloroetil)aminofenilacetico, acido p-metil-m-N,N-bis(2-cloroetil)aminobenzoico y acido p-N,N-bis(2cloroetil)aminofenilbutmco, su toxicidad y su actividad antileucemica.

Los esteres alquilantes esteroideos lactamicos mostraron que generan una toxicidad aguda significativamente disminuida in vivo, a la vez que mostraron una actividad antitumoral incrementada y muy prometedora in vitro e in vivo, mientras los respectivos agentes alquilantes esteroideos sin modificar (no lactamicos) produjeron una actividad antineoplasica significativamente inferior o escasa contra los respectivos sistemas de tumores experimentales. Excepto por la produccion de dano en el ADN celular, todavfa se desconocen los mecanismos farmacologicos moleculares que mejoraron significativamente el efecto antineoplasico de los esteres alquilantes esteroideos lactamicos. Ademas, tambien se desconoce la importancia biologica de la posicion en la que se incorporan uno o mas grupos lactama en la estructura esteroidea. Ademas, el agente alquilante conjugado por medio de un enlace esterico en el esteroide lactamico desempena un papel significativo, y modula la proporcion de toxicidad aguda y actividad antitumoral, y por lo tanto el grado de mdice terapeutico que genera un agente alquilante esteroideo lactamico. Hasta la fecha, se han sintetizado y ensayado varios agentes alquilantes esteroideos lactamicos activos, pero los que mostraron una mayor actividad antitumoral fueron mas toxicos, y los que mostraron una toxicidad menor fueron menos activos. Estas observaciones indican que existe una necesidad clara de desarrollar y producir nuevos conjugados de agentes alquilantes esteroideos lactamicos activos que generen de manera optima la menor toxicidad y la mayor actividad antineoplasica, y por lo tanto un mdice terapeutico optimo.

Los estudios previos sobre esteres alquilantes esteroideos lactamicos de derivados de mostazas de nitrogeno mostraron que el [p-[bis(2-cloroetil)amino]fenil]acetato de 3beta-hidroxi-13alfa-amino-13,17-seco-5alfa-androstan-17-oic-13,17-lactama (ASE, NSC-290205) produjo efectos muy bien equilibrados en ensayos preclmicos sobre la toxicidad aguda in vivo y la actividad antitumoral in vitro e in vivo, manteniendo un mdice terapeutico significativamente elevado.

[p-[bis(2-cloroetil)amino]fenil]acetato de 3beta-hidroxi-13alfa-amino-13,17-seco-5alfa-androstan-17-oic-13,17-lactama

(ASE, NSC-290205)

Por lo tanto, ASE represento la molecula de referencia para el desarrollo de moleculas nuevas de la misma clase de agentes, y para ensayarlas con respecto a la eficacia terapeutica en comparacion con la de ASE.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona esteres nuevos de lactamas esteroideas y agentes alquilantes. De manera mas espedfica, los compuestos de la presente invencion son esteres de lactamas esteroideas con derivados de acido bis(2-cloroetil)aminofenoxipropanoico. Estos compuestos exhiben una actividad antitumoral mayor y una toxicidad aguda menor en comparacion con los esteres alquilantes esteroideos lactamicos de la tecnica anterior, y son utiles como agentes antineoplasicos y agentes terapeuticos del cancer.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo

en la que

Ri se selecciona del grupo que consiste en

R3 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH, -NH2.

Preferiblemente, R1 se selecciona del grupo que consiste en

Mas preferiblemente, Ri se selecciona del grupo que consiste en

Preferiblemente, R2 se selecciona del grupo que consiste en H, -CH3, -CH=CH2, -CH2-CH3, -CH2CH2CH3. Mas preferiblemente, R2 es H.

Preferiblemente, R3 es H o NH2.

El grupo hidroxilo del resto de bis(2-cloroetil)aminofenol de los compuestos de formula (I) puede estar en posicion orto, meta, o para con respecto al grupo amino del anillo fenilo.

Los compuestos de formula (I) contienen al menos un centro asimetrico. Cuando no se especifica la estereoqmmica de un centro asimetrico, la estructura pretende abarcar todos los estereoisomeros individuales, asf como sus mezclas.

Los compuestos de formula (I) contienen al menos un grupo funcional basico y son capaces, por lo tanto, de formar sales farmaceuticamente aceptables mediante tratamiento con un acido adecuado. Los acidos adecuados incluyen acidos inorganicos farmaceuticamente aceptables y acidos organicos farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables incluyen hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato, fosfato, nitrato, acetato, propionato, butirato, maleato, fumarato, tartrato, citrato, lactato, oxalato, succinato, y benzoato.

Se pueden usar los compuestos de formula (I) o sus sales farmaceuticamente aceptables para el tratamiento de una amplia diversidad de canceres. Preferiblemente, se usan para el tratamiento del cancer ovarico, de mama, de prostata o la leucemia.

Los compuestos de formula (I) o sus sales farmaceuticamente aceptables exhiben una actividad antitumoral mayor y una toxicidad aguda menor en comparacion con los esteres alquilantes esteroideos lactamicos de la tecnica anterior, y son utiles como agentes antineoplasicos y agentes terapeuticos del cancer. Los ensayos preclmicos de la actividad biologica descritos en los ejemplos mas adelante en la presente memoria incorporan, como comparacion y para demostrar la superioridad de los nuevos esteres esteroideos lactamicos alquilantes sobre la eficacia terapeutica contra el cancer, dos controles positivos, el agente alquilante acido (3-(4-(bis(2-cloroetil) amino)fenoxi)propanoico, pBCEAPOPA) solo, y la molecula de referencia de la clase descrita de agentes alquilantes esteroideos lactamicos experimentales, ASE (NSC-290205).

La presente invention tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Tal composition farmaceutica se puede formular para la administration mediante cualquier vfa adecuada, tal como la vfa oral, nasal, topica o parenteral. Por ejemplo, se puede formular una composicion farmaceutica en forma de comprimido, capsula, polvo, solution, suspension, crema o gel. Tal composicion contiene en general, ademas de un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Tal vehfculo comprende excipientes muy conocidos en la tecnica, tales como diluyentes, aglutinantes, rellenos, disgregantes, lubricantes, disolventes, agentes de suspension, agentes espesantes, tampones, conservantes. Estas composiciones se pueden preparar siguiendo metodos muy conocidos en la tecnica.

La presente invencion tambien proporciona procesos para la preparation de un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

Las lactamas esteroideas (aza-homo esteroides) de los compuestos de formula (I) portan una o mas funciones amida en los anillos de la estructura esteroidea basica. Se sabe que tales lactamas esteroideas se pueden sintetizar a partir de un cetoesteroide por medio de las oximas correspondientes y una transposition de Beckman (Koutsourea Al et al, Steroids, 2003, 68(7-8):659-66; Mazur RH, J Org Chem, 1963, 28(1):248-250; Morzycki JW et al, Bioorg Med Chem, 1996, 4(8): 1209-15; Camoutsis C y Catsoulacos P, J Heterocycl Chem, 1983, 20(4):1093-4; Huang Y et al, Molecules, 2013, 18(7):7436-47).

Procedimiento general para la transposicion de Beckmann

Las oximas (1 mmol) se disolvieron en 17,5 mL de dioxano seco. La mezcla se enfrio a 0 °C y se anadio cloruro de tionilo (1,9 mL) gota a gota. Se dejo que la mezcla alcanzara la temperatura ambiente y se agito durante 24 h. La reaction se paro con NaHCO3 y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para proporcionar el producto bruto, que se purifico adicionalmente mediante cromatograffa en SiO2.

Los derivados de acido bis(2-cloroetil)aminofenoxi propanoico de los compuestos de la presente invencion se pueden preparar como sigue:

Los acidos 3-(4-(bis(2-cloroetil)amino)fenoxi)propanoicos sustituidos se sintetizaron partiendo de 4-nitrofenol. La alquilacion de 4-nitrofenol con diferentes acidos 3-cloropropanoicos proporciono los acidos 3-(4-nitrofenoxi)propanoicos, que se redujeron adicionalmente hasta los derivados amino mediante el uso de H2 y Pd/C como catalizador. A continuacion, el grupo amino se bis-alquilo con oxirano en CH3COOH, THF siguiendo un procedimiento conocido (Valu et al, J Med Chem, 1990, 33 (11): 3014-19). Finalmente, los grupos alcohol se transformaron en los cloruros correspondientes mediante el uso de POCh en benceno y calentando, lo que proporciono los acidos 3-(4-(bis(2-cloroetil)amino)fenoxi)propanoicos correspondientes. En ciertos casos, cuando hay presentes grupos amino o hidroxilo, son necesarias etapas extra para las reacciones de proteccion y desproteccion. Por ejemplo, cuando R3 es un grupo NH2 u OH, se usan los grupos protectores Boc o Acetilo, respectivamente (Valu ^kK et al, J Med Chem, 1990, 33(11):3014-9). Siguiendo el mismo proceso, y partiendo de 2-nitrofenol o 3-nitrofenol, se pueden sintetizar derivados de formula (I) en los que el grupo hidroxilo esta en posicion orto o meta con respecto al grupo amino.

Para la produccion de los esteres de lactamas esteroideas con agentes alquilantes, las lactamas esteroideas que contienen el grupo OH reaccionan con el agente alquilante de ADN. Por ejemplo, una lactama esteroidea reacciona con el acido 3-(4-(bis(2-cloroetil)amino)fenoxi)propanoico con DCC, DMAP o con cloruro de 3-(4-(bis(2-cloroetil)amino)fenoxi)propanoilo o con un anhffdrido mixto de acido 3-(4-(bis(2-cloroetil)amino)fenoxi)propanoico para producir los esteres correspondientes. Se puede derivatizar cualquier mono- o bis-lactama esteroidea mediante el uso del presente metodo.

Procedimiento general A para la esterificacion de lactamas esteroideas

Se disolvio alcohol (1 mmol) en 28 mL de diclorometano seco. Despues, se anadio acido (2 mmol), DCC (2 mmol) y una cantidad catafftica de DMAP (3 %mol). Despues de agitar la disolucion resultante a temperatura ambiente durante 24 h, se evaporo el disolvente y el residuo se purifico mediante cromatograffa en columna rapida con gel de sflice.

Procedimiento general B para la esterificacion de lactamas esteroideas

En un matraz de fondo redondo se diluyo 1 mmol del acido en 3,3 mL de benceno seco. Se anadio cloruro de 2,4,6-triclorobenzoilo (1,2 mmol) y trietilamina (2,4 mmol), y la mezcla se sometio a reflujo bajo Ar durante 1 h. A esta mezcla se le anadio una disolucion del alcohol esteroideo, 50 mg (1 mmol) en 3,3 mL de benceno seco, y una cantidad catalftica de 4-dimetilaminopiridina. El reflujo continuo durante 3 h. Se elimino completamente el benceno mediante evaporacion a vado, y el residuo restante se diluyo con CH2O2. La mezcla resultante se extrajo con una disolucion acuosa de HCl del 5%, la capa organica se lavo con una disolucion acuosa de NaHCO3 del 7% y finalmente con agua, se seco sobre Na2SO4 y el disolvente se elimino a presion reducida. El residuo se sometio a cromatograffa en columna rapida con gel de sflice.

Procedimiento general C para la esterificacion de lactamas esteroideas

Una mezcla de alcohol (1 mmol), Et3N (1,3 mmol) y una cantidad catalftica de DMAP se disolvio en CH2Cl2 (5 mL), seguido de la adicion de cloruro de benzoilo (0,12 mL, 1,1 mmol). La reaccion se monitorizo mediante TLC y se agito a temperatura ambiente durante 24 h, despues se disolvio con CH2Cl2 y se paro con NH4Cl ac. saturado. La capa organica se seco y el producto bruto se purifico mediante cromatograffa en columna rapida con gel de sflice.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invencion.

Ejemplo 1

1: Se sintetizo 3-aza-17jS-hidroxi-A-homo-4ar-androsten-4-ona mediante un procedimiento de modification (Camoutsis C y Catsoulacos P, J Heterocycl Chem, 1983, 20(4):1093-4) de tres etapas a partir de 17-S-acetato de testosterona. Se disolvio 17-S-acetato de testosterona (914 mg, 2,77 mmol) en 10 ml de piridina seca. Se anadio hidrocloruro de hidroxilamina (461 mg, 6,64 mmol), y la disolucion se agito a reflujo durante 6 h. La disolucion se vertio en agua, y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 30 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para proporcionar el producto bruto, que se purifico adicionalmente mediante cromatograffa en SiO2 (eluyente; hexano-acetato de etilo= 4/1) para proporcionar 675 mg de las syn- y anti-oximas (74%) en forma de solidos blancos.

2: Se disolvieron las syn- y anti-oximas de 17-acetato de testosterona (100 mg, 0,145 mmol) en 3,5 mL de dioxano seco. La mezcla se enfrio a 0 °C y se anadio cloruro de tionilo (0,6 mL) gota a gota. Se dejo que la mezcla alcanzara la temperatura ambiente y se agito durante 3 h. La reaction se paro con NaHCO3 y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para proporcionar el producto bruto, que se purifico adicionalmente mediante cromatograffa en SiO2 (acetato de etilo) para proporcionar 63 mg de 3-aza-17£-acetoxi-A-homo-4ar-androsten-4-ona (63%) en forma de un solido blanco.

Se disolvio la 3-aza-17jS-acetoxi-A-homo-4ar-androsten-4-ona 1 en 4,9 mL de MeOH y se anadio LiOH (1 N, 2 mL) gota a gota. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 h. La reaccion se paro con NH4Cl y la mezcla se extrajo con diclorometano (3 x 10 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para proporcionar 87 mg de la 3-aza-17jS-hidroxi-A-homo-4ar-androsten-4-ona 2 con un rendimiento del 74%.

3: Se disolvio la 3-aza-17£-hidroxi-A-homo-4ar-androsten-4-ona 2 en 28 mL de diclorometano seco. Despues se anadio acido 3-(4-(bis(2-cloroetil)amino)fenoxi)propanoico (106 mg, 0,573 mmol), DCC (119 mg, 0,574 mmol) y una cantidad catalffica de DMAP. Despues de agitar la disolucion resultante a temperatura ambiente durante 24 h, se evaporo el disolvente y el residuo se purifico mediante cromatograffa en columna rapida con gel de sflice (eluyente; hexano-acetato de etilo= 1/2) para proporcionar el conjugado 3 (191 mg, 99%). 3: p.f.=53-56 °C; [a]D23 10,5 (c= 0,91 CHCl3); 1H RMN (500 MHz, CDCh) 56,92 (s, 1H), 6,83 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,66 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 5,72 (s, 1H), 4,66 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 4,17 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,63 (m, 4H), 3,59 (m, 4H), 3,32 - 3,04 (m, 2H), 2,75 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 2,48 (m, 1H), 2,27 (m, 1H), 2,15 (m, 2H), 1,50-1,98 (m, 10H), 1,33 (m, 2H), 1,14 (s, 3H), 1,05 (m, 1H), 0,80 (s, 3H); 13C RMN (126 MHz, CDCh) 5171,0, 170,4, 161,3, 151,3, 140,8, 118,8, 116,3, 114,4, 82,7, 64,4, 54,2, 53,2, 50,2, 44,5, 42,7, 41,9, 40,7, 36,7, 36,2, 35,3, 33,8, 33,1,27,5, 25,6, 24,9, 23,4, 21,3, 12,1; FT-IR: 3450, 2925, 1731, 1651, 1607, 1512, 1469, 1353, 1238, 1181, 1041, 869, 813.

Ejemplo 2

4: La oxima de estrona se sintetizo segun un procedimiento descrito previamente (Ivanenko TI et al, Pharm Chem J, 1982, 16(10):751-6). A una disolucion de estrona (100 mg, 0,37 mmol) en 2,2 mL de etanol absoluto se le anadio hidrocloruro de hidroxilamina (62 mg, 0,88 mmol) y piridina (1,2 mL). La mezcla se sometio a reflujo durante 6 horas. Despues se anadio agua y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 10 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para proporcionar el producto bruto, que se purifico adicionalmente mediante cromatograffa en SiO2 (eluyente; hexano: acetato de etilo= 3:1) para proporcionar 105 mg de oxima de estrona (100 %) en forma de un solido blanco.

5: La lactama 5 se sintetizo segun un procedimiento descrito previamente (Regan BM y Newton Hayes F, J Am Chem Soc, 1956, 78(3): 639-43). La oxima de estrona (108 mg, 0,376 mmol) se disolvio en 6,3 mL de dioxano seco. La mezcla se enfrio a 0 °C y se anadio cloruro de tionilo (0,7 mL) gota a gota. Se dejo que la mezcla alcanzara la temperatura ambiente y se agito durante 24 h. La reaccion se paro con NaHCO3 y la mezcla se extrajo con diclorometano (3 x 20 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para proporcionar el producto bruto, que se purifico adicionalmente mediante cromatograffa en SiO2 (eluyente; hexano: acetato de etilo= 2:1) para proporcionar 42 mg de la lactama 5 (56% respecto del material inicial recuperado) acompanada de material inicial recuperado [32 mg del material inicial (0,112 mmol)].

6: La lactama 5 se disolvio en 14 mL de DMF seca. Despues se anadio acido 3-(4-(bis(2-cloroetil)amino) fenoxi)propanoico (90 mg, 0,293 mmol), DCC (61 mg, 0,293 mmol) y una cantidad catalffica de DMAP. Despues de agitar la disolucion resultante a temperatura ambiente durante 24 h, se evaporo el disolvente y el residuo se purifico mediante cromatograffa en columna rapida con gel de sflice (eluyente; diclorometano/acetona= 2/1) para proporcionar el conjugado 6 (56 mg, 68%). Conjugado 6: [a]o23 73,5 (c= 0,90 CHCh); 1H RMN (500 MHz, CDCh) 5 7,25 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,82 (s, 1H), 6,68 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,31 (s, 1H), 4,30 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 3,62 (dt, J = 29,2, 6,6 Hz, 8H), 2,97 (dd, J = 15,1, 9,0 Hz, 2H), 2,88 (m, 2H), 2,58 - 2,36 (m, 4H), 2,23 - 2,00 (m, 2H), 1,92 - 1,66 (m, 3H), 1,60 - 1,29 (m, 4H), 1,19 (s, 3H); 13C RMN (126 MHz, CDCh) 5 171,7, 169,8, 151,3, 148.5, 141,0, 137,8, 137,2, 126,1, 121,3, 118,7, 116,5, 114,5, 64,4, 54,4, 54,2, 46,6, 43,4, 40,7, 39,9, 38,9, 34,9, 30.5, 29,5, 26,5, 25,9, 22,1, 19,8; FTIR: 3329, 2927, 2850, 1757, 1626, 1577, 1512, 1437, 1311, 1244, 1157, 1088, 1045, 892.

Ejemplo 3

7: Se disolvio 17-hidroxiandrost-4-en-3,11-diona (484 mg, 1,59 mmol) en 2,2 mL de anttdrido acetico. Despues se anadieron 4 mg (0,037 mmol) de DMAP y 0,25 mL de piridina seca. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 24 h. La reaccion se paro con agua y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 30 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para proporcionar el producto bruto, que se purifico adicionalmente mediante cromatografia en SiO2 (eluyente; hexano: acetato de etilo= 6:1) para proporcionar 472 mg de 17-acetoxiandrost-4-en-3,11-diona con un rendimiento del 86%. 7: p.f.=162-164 °C [a]o20 *3 *25+148,0 (c 1,68 CHCh); 1H RMN (500 MHz, CDCl3) 55,69 (s, 1H), 4,76 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 2,83 - 2,69 (m, 1H), 2,54 - 2,20 (m, 6H), 2,01 (d, J = 1,2 Hz, 3H), 1,92 (m, 3H), 1,85 - 1,55 (m, 4H), 1,51 - 1,41 (m, 1H), 1,44 - 1,34 (m, 3H), 1,32 - 1,10 (m, 2H), 0,85 - 0,69 (m, 3H); 13C RMN (126 MHz, CDCh) 5208,3, 199,5, 170,8, 168,3, 124,6, 80,2, 62,6, 54,8, 49,4, 46,2, 38,2, 37,0, 34,7, 33,7, 32,1, 31,7, 27,6, 22,9, 20,9, 17,2, 12,8; FT-IR: 3443, 2958, 2935, 2850, 1732, 1702, 1677, 1618, 1426, 1373, 1360, 1343, 1271, 1238, 1224, 1045, 1027.

8: A una disolucion de 17-acetoxiandrost-4-en-3,11-diona (465 mg, 1,35 mmol) en 7 mL de etanol absoluto se le anadio hidrocloruro de hidroxilamina (100 mg, 1,44 mmol) y piridina seca (4,2 mL). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. Despues se anadio agua y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 40 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para proporcionar el producto bruto, que se purifico adicionalmente mediante cromatografia en SiO2 (eluyente; diclorometano: acetato de etilo= 20:1) para proporcionar 461 mg de las oximas 8 (95 %).

9: Las oximas 8 (264 mg, 0,74 mmol) se disolvieron en 13 mL de dioxano seco. La mezcla se enfrio a 0 °C y se anadio cloruro de tionilo (1,4 mL) gota a gota. Se dejo que la mezcla alcanzara la temperatura ambiente y se agito durante 24 h. La reaccion se paro con NaHCO3 y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para proporcionar el producto bruto, que se purifico adicionalmente mediante cromatografia en SiO2 (eluyente; acetato de etilo: metanol = 1: 0,03) para proporcionar 163 mg de la lactama 9 con un rendimiento del 62 %. 9: 1H RMN (500 MHz, CDCh) 56,39 (s, 1H), 5,75 (s, 1H), 4,78 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 3,35 - 3,18 (m, 1H), 3,09 (dt, J = 14,7, 7,2 Hz, 1H), 2,67 (dd, J = 14,9, 8,2 Hz, 1H), 2,48 (td, J = 13,6, 3,9 Hz, 1H), 2,34 - 2,20 (m, 3H), 2,14 (dd, J = 9,3, 6,5 Hz, 1H), 2,03 (s, 3H), 2,01 - 1,86 (m, 2H), I , 83 - 1,53 (m, 5H), 1,48 - 1,37 (m, 1H), 1,38 (s, 3H), 1,28 - 1,08 (m, 1H), 0,76 (s, 3H); 13C RMN (126 MHz, CDCI3) 5 209,0, 170,8, 169,5, 158,4, 120,1, 80,1, 62,4, 55,1, 49,9, 46,7, 43,6, 40,4, 36,8, 36,8, 35,5, 33,2, 27,6, 22,8, 21,1, 20.9, 12,8; FT-IR: 3428, 2971, 2920, 2878, 2364, 2341, 1736, 1701, 1664, 1639, 1599, 1444, 1375, 1339, 1245, 1127, 1089, 1046.

10: La lactama 9, 76 mg (0,21 mmol) se disolvio en 3 mL de MeOH y se anadio LiOH (1 N, 1,2 mL) gota a gota. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 h. La reaccion se paro con NH4CI y la mezcla se extrajo con diclorometano (3 x 5 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para proporcionar 67 mg de la lactama 10. 10: 1H RMN (500 MHz, DMSO) 57,72 (s, 1H), 5,51 (s, 1H), 4,66 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 3,66 (dd, J = 13,4, 8,4 Hz, 1H), 3,08 - 2,90 (m, 2H), 2,47 - 2,32 (m, 2H), 2,29 (d, J = 11,5 Hz, 1H), 2,21 (d, J = I I , 2 Hz, 1H), 2,14 - 2,01 (m, 2H), 2,01 - 1,78 (m, 3H), 1,74 - 1,50 (m, 3H), 1,40 (m, 1H), 1,28 (s, 3H), 1,23 (s, 1H), 1,15 - 1,02 (m, 1H), 0,55 (s, 3H); 13C RMN (126 MHz, DMSO) 5210,2, 167,8, 157,3, 120,3, 78,1, 61,0, 54,5, 48,8, 47,1, 43,1, 40,4, 36,8, 35,5, 34,9, 33,1, 29,9, 22,3, 20,9, 11,8; FT-IR: 3423, 3262, 2952, 2923, 2853, 1693, 1647, 1609, 1458, 1407, 1375, 1353, 1261, 1062.

11: La lactama 10 se disolvio en 8,2 mL de DCM seco. Despues se anadio acido 3-(4-(bis(2-cloroetil)amino)fenoxi)propanoico (51 mg, 0,17 mmol), DCC (51 mg, 0,25 mmol) y una cantidad catalrtica de DMAP. Despues de agitar la disolucion resultante a temperatura ambiente durante 24 h, se evaporo el disolvente y el residuo se purifico mediante cromatograffa en columna rapida con gel de sflice (eluyente; acetato de etilo) para proporcionar el conjugado 11 (48,5 mg, 96%). Conjugado 11: 1H RMN (500 MHz, CDCh) 56,83 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 6,67 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 6,11 (s, 1H), 5,76 (s, 1H), 4,86 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 4,17 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,61 (m, 8H), 3,25 (m, 1H), 3,18 - 3,01 (m, 1H), 2,84 - 2,59 (m, 2H), 2,59 - 2,38 (m, 1H), 2,37 - 2,25 (m, 3H), 2,16 (m, 1H), 2,10 - 1,89 (m, 3H), 1,87 - 1,55 (m, 4H), 1,39 (s, 3H), 1,26 (m, 2H), 1,12 (m, 1H), 0,76 (s, 3H); 13C RMN (126 MHz, CDCh) 5 208.9, 170,9, 169,5, 158,7, 151,3, 140,9, 119,9, 116,2, 114,5, 80,4, 64,2, 62,4, 55,1, 54,3, 49,9, 46,8, 43,6, 40,7, 36,8, 35,5, 34,9, 33,9, 27,6, 25,6, 24,9, 22,8, 21,2, 12,8; FT-IR: 3432, 3328, 2927, 2850, 1733, 1701, 1664, 1626, 1599, 1513, 1444, 1389, 1369, 1310, 1273, 1243, 1179, 1087, 1041,999.

Ejemplo 4

13: A una disolucion de 12 (100 mg, 0,28 mmol) en 1,5 mL de etanol absoluto en un tubo sellado se le anadio hidrocloruro de hidroxilamina (21 mg, 0,31 mmol) y piridina seca (0,9 mL). La mezcla se calento a 140 °C durante 7 dfas. Despues se anadio agua y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 5 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para proporcionar un producto bruto, que se uso en la etapa siguiente sin purification adicional.

14: Las oximas 13 brutas descritas anteriormente (0,28 mmol) se disolvieron en 4,9 mL de dioxano seco. La mezcla se enfrio a 0 °C y se anadio cloruro de tionilo (0,54 mL) gota a gota. Se dejo que la mezcla alcanzara la temperatura ambiente y se agito durante 24 h. La reaction se paro con NaHCO3 y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida para proporcionar el producto bruto, que se purifico adicionalmente mediante cromatografia en SiO2 (eluyente; acetato de etilo: metanol = 1: 0,1) para proporcionar 52 mg de lactama con un rendimiento del 50 %. 14: 1H RMN (500 MHz, CDCh) 57,00 (s, 1H), 5,77 (s, 1H), 5,59 (s, 1H), 4,61 (t, J = 8,3 Hz, 1H), 3,20 (m, 2H), 3,02 (dd, J = 9,6, 5,0 Hz, 1H), 2,48 - 2,40 (m, 2H), 2,31 (d, J = 13,7 Hz, 1H), 2,16 (m, 2H), 2,09 -2,0- 1,97 (m, 5H), 1,74-1,84 (m, 2H), 1,51 - 1,40 (m, 2H), 1,35 1,30 (m, 1H), 1,24 (s, 3H), 1,23 (m, 1H), 1,08 (m, 1H), 0,95 (s, 3H); 13C RMN (126 MHz, CDCh) 5 175,1, 170,9, 169,4, 156,3, 120,4, 80,1,64,2, 55,5, 45,2, 44,6, 41,0, 40,8, 38,0, 36,3, 34,4, 31,0, 25,4, 25,2, 21,9, 21,0, 11,7.

15: Se disolvio la lactama 14, 28 mg (0,084 mmol) en 1,2 mL de MeOH y se anadio LiOH (1 N, 0,5 mL) gota a gota. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 h. La reaccion se paro con NH4Cl y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 5 mL). Las capas organicas se secaron (Na2SO4) y se concentraron a presion reducida. El producto bruto se purifico adicionalmente mediante cromatografia en SiO2 (eluyente; acetato de etilo: metanol = 1: 0,1) para proporcionar 28 mg de la lactama 15 con un rendimiento del 100 %. 15: 1H RMN (500 MHz, DMSO) 57,75 (s, 1H), 6,13 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 5,53 (s, 1H), 4,66 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 3,40 (m, 2H), 3,11 - 2,93 (m, 2H), 2,44 - 2,34 (m, 1H), 2,29 (s, 2H), 2,04 - 1,72 (m, 5H), 1,65 (m, 2H), 1,24 (m, 3H), 1,20 (s, 3H), 0,89 (m, 1H), 0,66 (s, 3H); 13C RMN (126 MHz, DMSO) 5174,6, 167,7, 156,1, 120,1,78,1,69,8, 63,4, 44,9, 44,2, 41,2, 40,4, 37,7, 35,3, 33,7, 31,3, 27,7, 24,4, 20,9, 10,7.

16: La lactama 15 (30 mg, 0,09 mmol) se disolvio en 9 mL de DCM seco. Despues se anadio acido 3-(4-(bis(2-cloroetil)amino)fenoxi)propanoico (67 mg, 0,22 mmol), DCC (60 mg, 0,29 mmol) y una cantidad catalfiica de DMAP. Despues de agitar la disolucion resultante a temperatura ambiente durante 24 h, se evaporo el disolvente y el residuo se purifico mediante cromatografia en columna rapida con gel de sflice (eluyente; acetato de etilo/MeOH=10/1) para proporcionar el conjugado 16 (39 mg, 70%). 1H RMN (500 MHz, CDCh) 56,85 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 6,76 (s, 1H), 6,65 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 5,79 (s, 1H), 5,46 (s, 1H), 4,68 (t, J = 8,3 Hz, 1H), 4,17 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,60 (m, 4H), 3,51 - 3,42 (m, 1H), 3,18 (m, 2H), 3,02 (dd, J = 9,5, 5,0 Hz, 1H), 2,85 - 2,67 (m, 2H), 2,51 (d, J = 13,8 Hz, 1H), 2,44 (dd, J = 13,6, 10,1 Hz, 1H), 2,33 (d, J = 13,8 Hz, 1H), 2,25 - 2,06 (m, 2H), 2,07 - 1,73 (m, 5H), 1,73 -1,28 (m, 5H), 1,25 (s, 3H), 1,17 -1,03 (m, 2H), 0,96 (s, 3H); 13C RMN (126 MHz, CDCh) 5174,7, 170,9, 169,1, 155,6, 151,3, 140,9, 120,7, 116,3, 114,4, 80,5, 64,2, 64,1, 55,5, 54,2, 45,3, 44,5, 41,1, 40,7, 38,1, 36,3, 34,8, 34,4, 33,9, 31,0, 25,6, 25,5, 25,2, 24,9, 21,9, 11,8. FT-IR: 3410, 3330, 2926, 2850, 1734, 1654, 1627, 1577, 1513, 1445, 1349, 1273, 1243, 1180, 1133, 1110, 1087, 1044, 890.

Ejemplo 5

Se sintetizo la lactama 17 segun Koutsourea et al (Steroids, 2003, 68(7-8):659-66).

18: En un matraz de fondo redondo se diluyeron 48 mg (0,157 mmol) del acido en 0,5 mL de benceno seco. Se anadio cloruro de 2,4,6-triclorobenzoilo (30 ^l, 0,189 mmol) y trietilamina (53 ^l, 0,378 mmol) y la mezcla se sometio a reflujo bajo Ar durante 1 h. A esta mezcla se le anadio una disolucion del alcohol esteroideo, 50 mg (0,157 mmol) en 0,5 mL de benceno seco, y una cantidad catalfiica de 4-dimetilaminopiridina. El reflujo continuo durante 3 h. Se elimino completamente el benceno mediante evaporation a vado, y el residuo restante se diluyo con CH2G2. La mezcla resultante se extrajo con una disolucion acuosa de HCl del 5%, la capa organica se lavo con una disolucion acuosa de NaHCO3 del 7% y finalmente con agua, se seco sobre Na2SO4 y el disolvente se elimino a presion reducida. El residuo se sometio a cromatograffa en una columna de gel de sflice (eluyente; acetato de etilo/MeOH= 100/1) para proporcionar 46 mg del conjugado 18 con un rendimiento del 48%. Conjugado 18: 1H RMN (500 MHz, CDCl3) 56,84 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,67 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,90 (s, 1H), 5,86 (s, 1H), 4,78 (m, 1H), 4,19 (m, 2H), 3,58-3,59 (m, 8H), 3,48 (m, 1H), 2,61-1,25 (18H), 1,29 (s, 3H), 0,88 (s, 3H); [M+H]+=605.

Ejemplo 6

Se sintetizo la lactama 19 segun Koutsourea et al (Steroids, 2003, 68(7-8):659-66).

20: En un matraz de fondo redondo se diluyeron 46 mg (0,15 mmol) del acido en 0,5 mL de benceno seco. Se anadio cloruro de 2,4,6-triclorobenzoilo (28 pl, 0,18 mmol) y trietilamina (50 pl, 0,36 mmol) y la mezcla se sometio a reflujo bajo Ar durante 1 h. A esta mezcla se le anadio una disolucion del alcohol esteroideo, 50 mg (0.150 mmol) en 0,5 mL de benceno seco, y una cantidad catafltica de 4-dimetilaminopiridina. El reflujo continuo durante 3 h. Se elimino completamente el benceno mediante evaporation a vatio, y el residuo restante se diluyo con CH2G2. La mezcla resultante se extrajo con una disolucion acuosa de HCl del 5%, la capa organica se lavo con una disolucion acuosa de NaHCO3 del 7% y finalmente con agua, se seco sobre Na2SO4 y el disolvente se elimino a presion reducida. El residuo se sometio a cromatograffa en una columna de gel de sflice (eluyente; acetato de etilo/MeOH= 100/2) para proporcionar 19 mg del conjugado 20 con un rendimiento del 20%. 20: 1H RMN (500 MHz, CDCh) 57,18 (s, 1H), 6,84 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,65 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,60 (s, 1H), 5,82 (s, 1H), 4,80 (1H, m), 4,21 (2H, m), 3,50 (m, 8H), 3,20 (1H, m), 2,80-1,30 (19H), 1,20 (s, 3H), 0,9 (s, 3H); [M+H]+=621.

Ejemplo 7

Se sintetizo la lactama 21 segun Koutsourea et al (Steroids, 2003, 68(7-8):659-66).

22: En un matraz de fondo redondo se diluyeron 37 mg (0,12 mmol) del acido en 0,4 mL de benceno seco. Se anadio cloruro de 2,4,6-triclorobenzoilo (22 pl, 0,144 mmol) y trietilamina (40 pl, 0,288 mmol) y la mezcla se sometio a reflujo bajo Ar durante 1 h. A esta mezcla se le anadio una disolucion del alcohol esteroideo, 50 mg (0,120 mmol) en 0,4 mL de benceno seco, y una cantidad catalftica de 4-dimetilaminopiridina. El reflujo continuo durante 3 h. Se elimino completamente el benceno mediante evaporacion a vado, y el residuo restante se diluyo con CH2O2. La mezcla resultante se extrajo con una disolucion acuosa de HCl del 5%, la capa organica se lavo con una disolucion acuosa de NaHCO3 del 7% y finalmente con agua, se seco sobre Na2SO4 y el disolvente se elimino a presion reducida. El residuo se sometio a cromatograffa en una columna de gel de sflice (eluyente; acetato de etilo) para proporcionar 34 mg del conjugado 22 con un rendimiento del 40%. 22: 1H RMN (500 ^mH^z, CDCh) 86,84 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,60 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,90 (s, 1H), 5,79 (s, 1H), 4,80 (m, 1H), 4,15 (m, 2H), 3,5 (m, 8H), 3,25 (m, 1H), 2,8-0,8 (22H); [M+H]+=605.

Ejemplo 8

Ensayo biologico in vitro e in vivo de la actividad antineoplasica

A) Actividad antineoplasica in vitro

Se trataron nueve lmeas celulares de cancer humano bien establecidas (tabla 1) para ensayar la actividad citostatica y citotoxica producida por los compuestos recien sintetizados. Las lmeas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en diferentes medios de cultivo segun las instrucciones. El ensayo de MTT (bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) es un metodo bien establecido y estandarizado para determinar la actividad citostatica y citotoxica de farmacos y productos qmmicos (Trafalis DT et al, J BUON, 2003, 8:333-9; Trafalis DT et al, J BUON, 2004, 9(3):275-82; Trafalis DT et al, J BUON, 2005; 10:227-34; Trafalis DT et al, Breast Cancer Res Treat, 2006, 97:17-31). Brevemente, las celulas se colocaron en placas de 96 pocillos a una densidad de ~3 x104 celulas/ml por pocillo, y se mantuvieron durante 72 h a 37 °C en un incubador con un 5% de CO2 y se cultivaron en forma de monocapas o suspensiones. Despues de 24 horas, las celulas se trataron con 0,1 100 pmol/l de los compuestos durante 48 h. Se estimo la viabilidad de las celulas cultivadas con el ensayo metabolico de MTT (Sigma, St Louis, Missouri, EE.UU.) como se describio previamente. La absorbancia del colorante convertido se midio a una longitud de onda de 540 nm en un lector de ELISA (Versamax, Orleans, EE.UU.). Las concentraciones medias de cada farmaco que generaron una inhibicion del crecimiento del 50% o inhibicion total del crecimiento (100%) (GI50 y TGI, respectivamente), asf como las concentraciones de farmaco que produjeron citotoxicidad contra el 50% de las celulas cultivadas [(concentracion citotoxica semimaxima (IC50)] se calcularon mediante el uso del metodo de regresion lineal. Mediante el uso de siete medidas de absorbancia [tiempo 24 h (Ct24), crecimiento de control 72 h (Ct72), y crecimiento de ensayo en presencia de farmaco a cinco niveles de concentracion (Tt72x)], se calculo el porcentaje de crecimiento a cada nivel de concentracion de farmaco. Se calculo la inhibicion del crecimiento en porcentaje segun el Instituto Nacional del Cancer (NCI) como: [(Tt72x)-(Ct24) / (Ct72)-(Ct24)] x 100 para concentraciones para las que Tt72x>Ct24 y [(Tt72x)-(Ct24)/Ct24] x 100 para concentraciones para las que Tt72x<Ct24; GI50 se calculo a partir de [(Tt72x)-(Ct24)/(Ct72)-(Ct24)] x 100=50, TGI a partir de [(Tt72x)-(Ct24)/(Ct72)-(Ct24)] x 100=0, e IC50 a partir de [(Tt72x)-(Ct24)/Ct24] x 100= 50. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.

Tabla 1

Los resultados de los efectos citostaticos (GI50, TGI) y citotoxicos (IC50) in vitro inducidos mediante los compuestos ensayados contra las lmeas celulares de cancer humano se presentan en las tablas 2, 3, 4.

Tabla 2

Tabla 3

Tabla 4

Compuestos

LINEAS CELULARES DE _{CANCER h u m a n o}3 11 16

GI50 TGI IC50 GI50 TGI IC50 GI50 TGI IC50

UWB1.289 3 8 20 6 20 25 3 28 40

UWB1.289+BRCA1 12 25 40 22 31 42 12 32 50

OVCAR-3 21 32 42 8 18 22 9 20 35

SKOV-3 18 52 76 20 32 44 20 46 70 MCF-7 17 38 70 25 68 >100 15 36 65

T-47D 10 25 66 26 59 98 10 30 55

PC-3 22 30 56 29 44 68 16 29 51 MOLT-4 3 27 65 1,5 20 45 4 36 56

K-562 3 30 71 2 35 55 7 47 65

B) Toxicidad aguda in vivo

Para el tratamiento intraperitoneal (i.p.), se prepararon disoluciones de reserva de los compuestos ensayados inmediatamente antes del uso. Se suspendieron en aceite de mafz a la concentracion deseada tras la disolucion inicial en sulfoxido de dimetilo del 10% (DMSO). Esta concentracion por sf misma no produjo un efecto toxico observable.

Se usaron ratones C57BI/6 hembra para los estudios de toxicidad. Los ratones se obtuvieron de la seccion experimental del Instituto Pasteur griego.

Brevemente, se determino la toxicidad aguda inducida mediante los compuestos ensayados, como se habfa descrito muy bien previamente (Catsoulacos P et al, Cancer Chemother Pharmacol, 1979, 3(1):67-70; Catsoulacos P et al, J Pharm Sci, 1978, 67(9):1342-3; Catsoulacos P et al, Anticancer Res, 1995; 15:827-30) tras una unica inyeccion intraperitoneal (i.p.) en grupos de diez (10) ratones C57BI/6 a cuatro dosis diferentes; los ratones se observaron durante 30 dfas, y se determino la dosis terapeutica de los compuestos, que se define normalmente como LD10 (dosis letal para el 10% de los animales) asf como la LD50 (dosis letal para el 50% de los animales) tras la estimacion grafica (curvas de 30 dfas). La toxicidad de los compuestos ensayados se estudio a partir de la letalidad en ratones C57BI/6. Los valores de LD50 y LD10 se estimaron graficamente, donde el porcentaje de muertes debidas a la toxicidad de cada dosis se mostro en el eje de ordenadas, mientras las dosis administradas se indicaron en el eje de abscisas (tabla 5).

C) Actividad antitumoral in vivo

El experimento se inicio en el dfa 0 implantando de manera intraperitoneal (i.p.) 106 celulas asdticas de leucemia linfocftica P388 segun el protocolo del Instituto Nacional del Cancer (NCl), EE.UU. Para el tratamiento i.p., se prepararon disoluciones de reserva de los compuestos ensayados inmediatamente antes del uso. La actividad antitumoral se estudio a partir del parametro oncostatico T/C%, que es el tiempo de supervivencia mediano (MST) de los animales tratados con farmaco (T) respecto de los controles tratados con solucion salina (C). Segun el NCI (EE.UU.), el criterio mmimo de actividad es un T/C mayor del 125 %. Ademas, se estimo la actividad antitumoral a partir del numero de supervivientes a largo plazo (curas: definidas como los ratones vivos durante 90 dfas tras la inoculacion del tumor) (Golidim A et al, Nat Cancer Inst Monogr, 1980, 55: 25-26; Monograffa del NCI, publicacion del NIH 1986, 55:80-193).

Se usaron ratones BALB/c scid hembra para la evaluacion antitumoral. Estos animales portan la mutacion de la deficiencia inmunitaria combinada grave (scid) en la cepa BALB/c, y se obtuvieron del Instituto de Biologfa del NCSR "Demokritos". Los ratones se mantuvieron en condiciones de temperatura y humedad constante, en jaulas esteriles, con agua y alimentos. Se incluyeron seis ratones en cada grupo de tratamiento y ocho en el grupo de control.

La dosis terapeutica ensayada de los compuestos se definio a la LD10 respectiva (mg/kgr).

Tabla 5. Toxicidad aguda de los compuestos en C57BI/6. LD50 y LD10 = dosis letales para el 50 % y 10% de la poblacion de ratones tratados.

COMPUESTOS LD50 (mg/kg) LD10 (mg/kg) pBCEAPOPA 20 15

ASE 50 30

3 150 130

6 100 80

18 110 85

20 135 110

22 - >300

11 130 100

16 165 140

Tabla 6. Actividad antileucemica de los compuestos ensayados contra la leucemia linfocftica P388 murina in vivo.

Compuestos Calendario de Dosis (LD10) (mg/kg) MST ± DE (dfas) T/C % Curas tratamiento

pBCEAPOPA Dfa 1 15 (ip) 19 211* 0/6 ASE Dfa 1 30 (ip) 24 267* 0/6 3 Dfa 1 130 (ip) 39 433* 0/6 6 Dfa 1 80 (ip) 36 400* 0/6 18 Dfa 1 85 (ip) 34 378* 0/6 20 Dfa 1 110 (ip) 32 356* 0/6 11 Dfa 1 100 (ip) 56 622* 1/6 16 Dfa 1 140 (ip) 44 489* 0/6 Controles Dfa 1 Solucion salina 9 ± 1,5 100 0/8 *p<0,001

Se usaron ratones BALB/c scid hembra para la evaluacion antitumoral in vivo de los compuestos ensayados contra el cancer ovarico humano SCOV-3. Se inocularon de manera subcutanea suspensiones de 3x106 celulas de cancer SCOV-3 / 0,2 ml / raton en el flanco derecho o izquierdo de cada animal. Los ratones se mantuvieron en condiciones de temperatura y humedad constante, en jaulas esteriles, con agua y alimentos. Se incluyeron diez ratones en cada grupo de tratamiento y de control. El ensayo se llevo a cabo segun protocolos de laboratorio bien establecidos. La eficacia de los farmacos se determino mediante el cambio medio del volumen tumoral de los animales tratados (T) respecto del control (C) (T/C%=TI, Inhibicion Tumoral), y mediante el incremento del tiempo de supervivencia mediano, segun la cinetica y las propiedades biologicas de las celulas tumorales. Los volumenes o pesos de los tumores se calcularon como 0,52*a2*b, donde a y b son los ejes menor y mayor del tumor, y los datos se representaron en un grafico semilogantmico como los volumenes tumorales medios ± error estandar de la media (±EEM) frente al tiempo tras el tratamiento. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 0,085-0,1 mm3, los ratones se dividieron en grupos de control y de tratamiento con farmaco (10 ratones/grupo), con volumenes tumorales medios similares en cada grupo. Los compuestos ensayados se administraron i.p. a dosis de LD10/4 respectivamente en los dfas 1, 5 y 9.

Para la evaluacion del efecto antitumoral, se determino (a) el cambio semanal en el peso tumoral medio o el volumen tumoral medio, y se calculo la inhibicion tumoral (TI) mediante la formula: TI(%)= [1)(TWT)TWZ)/(TWC)TWZ)]x100, en la que TWT se determina como el peso tumoral (mg) o el volumen tumoral (mm3) en los animales tratados en el momento de la evaluacion, TWZ se determina como el peso tumoral (mg) o el volumen tumoral (mm3) en el momento de inicio del tratamiento (tiempo cero o dfa 1), TWC se determina como el peso tumoral (mg) o el volumen tumoral (mm3) en los animales sin tratar (controles) en el momento de la evaluacion, (b) el porcentaje de supervivientes (OS%) en el Dfa 70, (c) el porcentaje de supervivientes libres de progresion tumoral (PFS%) en el dfa 70. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Actividad antitumoral de los compuestos ensayados contra cancer ovarico humano SCOV-3 in vivo.

Compuestos Calendario de Dosis (LD10/4) TI% en el OS% en el PFS% en el tratamiento (mg/kg) Dfa 35 Dfa 70 Dfa 70 pBCEAPOPA Dfas 1,5,9 4 (ip) 17 40 0

ASE Dfas 1,5,9 8 (ip) 34 80 40 3 Dfas 1,5,9 32 (ip) 62 100 100 6 Dfas 1,5,9 20 (ip) 56 100 100 18 Dfas 1,5,9 21 (ip) 44 100 80 20 Dfas 1,5,9 28 (ip) 41 100 70 11 Dfas 1,5,9 25 (ip) 73 100 100 16 Dfas 1,5,9 37 (ip) 55 100 100 Controles Dfas 1,5,9 Solucion salina 0 0 0

Todas las diferencias en TI%, OS%, PFS% son significativas a niveles de p<0,05-0,001

D) Efectos Farmacologicos

Los nuevos agentes alquilantes esteroideos lactamicos inducen un efecto inhibitorio significativo sobre la actividad de poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP1/2) que muestra concentraciones inhibitorias semimaximas (IC50) menores de 1,7 pM, mejores que el inhibidor conocido de PARP1/2, 3-aminobenzamida (3-AB). Ademas, los nuevos agentes alquilantes esteroideos lactamicos producen cambios significativos sobre la transcripcion y expresion de mARN de PARP1 y PARP2 de manera dependiente de la dosis y el tiempo, in vitro e in vivo. A las primeras dosis o a dosis inferiores, pueden inducir un incremento de la expresion de mARN de PARP1 y PARP2 que alcanza valores 5-400 veces mayores que los valores de control, lo que genera cambios sobre las concentraciones intracelulares de NAD+ y el agotamiento del ATP celular, y mas tarde o en dosis mayores inducen una disminucion de la expresion de mARN de PARP1 y PARP2 que puede alcanzar un valor cercano al 100%. Los nuevos agentes alquilantes esteroideos lactamicos producen un dano significativo en el ADN comparable al inducido por su componente alquilante solo, como se determino in vitro mediante un ensayo de intercambios de cromatidas hermanas (SCE's) e in vivo produciendo aductos de 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG) en suero u orina, a la vez que generan una actividad antitumoral significativamente mayor. Ademas, los nuevos agentes alquilantes esteroideos lactamicos inhiben significativamente (>60%) la fosforilacion de ERK1/2 y AKT1/2, y por lo tanto la activacion de las rutas de senalizacion molecular PI3K y MAPK. Por primera vez se investigaron en profundidad los efectos farmacologicos moleculares de los agentes alquilantes esteroideos lactamicos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de formula (I) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo

en la que

R1 se selecciona del grupo que consiste en

R3 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH, -NH2.

2. Un compuesto segun la reivindicacion 1, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que Ri se selecciona del grupo que consiste en

3. Un compuesto segun la reivindicacion 2 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que Ri se selecciona del grupo que consiste en

4. Un compuesto segun la reivindicacion 2 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que Ri se selecciona del grupo que consiste en

5. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que R2 se selecciona del grupo que consiste en H, -CH3, -CH=CH2, -CH2-CH3, -CH2CH2CH3.

6. Un compuesto segun la reivindicacion 5 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que R2 es H.

7. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que R3 es H.

8. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que R3 es -NH2.

9. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para el uso en medicina.

10. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para el uso en el tratamiento del cancer.

11. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para el uso en el tratamiento del cancer ovarico, cancer de mama, cancer de prostata o la leucemia.

12. Una composition farmaceutica que comprende un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.