JP2017503026A - 水溶性４−アザポドフィルロトキシン類似体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、式（Ｉ）の４−アザポドフィルロトキシン類似体（好ましくは、その医薬上許容される塩であり、溶媒和物の形態であってもよい。）、上記類似体を含む組成物、医薬、特に、癌の治療のための医薬としてのそれらの使用、及びそれらの調製方法に関する：［式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡｒは、請求項１で定義した通りである。］。【選択図】なし

Description

本発明は、４−アザポドフィルロトキシン類似体、上記類似体を含む組成物、それらの医薬（特に癌の治療のためのもの）としての使用、及びそれらの調製方法に関する。
ポドフィルロトキシンは、植物Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｐｅｌｔａｔｕｍ及びＰｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｅｍｏｄｉの根及び根茎から抽出される天然リグナンである。この植物毒素は、微小管の集合を阻害し、癌細胞を含む哺乳動物の細胞に対して毒性がある。しかしながら、ヒトの癌治療におけるポドフィルロトキシンの使用の試みは、吐き気、嘔吐、下痢、深刻な胃腸毒性、及び正常組織へのダメージのような重大な副作用により成功しなかった。
ポドフィルロトキシンの構造的特徴は、５員のラクトン（環Ｄ）、１つの芳香環（環Ｂ）及びヒドロキシルを備える環（環Ｃ）からなる多環部分（縮合環ＡＢＣＤ）及びアリール（環Ｅ）置換基を含む点である。注目すべきは、ポドフィルロトキシンが４つのキラル中心を含む点である。
ポドフィルロトキシンの広範な構造修飾が行われ、より強力で且つ低毒性な抗がん剤が得られた。それは、２つの臨床的活性剤、即ち、エトポシド（ＶＰ１６）及びテニポシド（ＶＭ２６）を含めてエピポドフィロトキシンの半合成により得られた。エトポシド及びテニポシドは、共に、環Ｃのヒドロキシル置換基上に、上記化合物の水溶性を向上させる糖部分を含む。したがって、薬剤としてそれらの製剤化を容易にする。注目すべきは、エトポシドのプロドラッグ−リン酸誘導体−が開発された点である（エトポホス）。リン酸基は、大幅な薬剤の水溶性の改善に寄与する。
エトポシド、テニポシド及びエトポホスは、小細胞肺癌、精巣癌、白血病、及びリンパ腫のようないくつかの腫瘍を治療することが示されている。エトポシド及びテニポシドの作用機序は、それらがトポイソメラーゼＩＩ阻害剤として作用しチューブリン重合を阻害しないため、親化合物ポドフィルロトキシンのものとは全く異なっている（レビューのためにDesbene and Giorgi-Renault, 2002. Drugs that inhibit tubulin polymerization: the particular case of podophyllotoxin and analogues. Curr. Med. Chem. Anticancer Agents, 2, 71-90; Lv, M., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 2011, 11, 901-909; You, Y., Curr Pharm Des, 2005, 11, 1695-1717を参照）。
環Ｃが窒素原子を含む他のポドフィルロトキシン類似体（４−アザ−２，３−ジデヒドロポドフィルロトキシン）は、先行技術に記載されている（特に、ＥＰ１１０３５５４；ＷＯ０２／０９４８３５；ＷＯ０２／０９４８４０；Tratrat et al Organic Letters 2002, 4, 3187-3189を参照）。化学的視点から、４−アザ−２，３−ジデヒドロ類似体は、１つのみのキラル中心及び安定した不飽和ラクトン環を有するという利点が存在する。これらの抗腫瘍分子は、チューブリン重合阻害剤であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで癌細胞に対してかなりの細胞毒性がある。開示された４−アザ−２，３−ジデヒドロポドフィルロトキシンは、特に経口又は静脈経路を介してヒトに投与するために製剤化する場合の非常に重要なパラメーターである、満足のいく水溶性を示さなかった。実際に、容易に製剤化するため並びに生物学的利用能を向上させるために、合理的な水溶性を伴う類似体を得ることが非常に望まれている。
高いチューブリン阻害活性に関連する低い細胞毒性を示すことが分かっているいくつかの誘導体が、良好な血管破壊剤（ＶＤＡ）の候補として挙がっている。実際に、腫瘍増殖及び転移は腫瘍関連血管形成に依存する。ＶＤＡは、腫瘍脈管構造を選択的に破壊する新しいクラスの抗癌剤である。特に、それらは内皮細胞の細胞骨格を標的とする。したがって、癌細胞の増殖及び脈管構造を介する転移性播種を阻害する。今までに開発された小分子量ＶＤＡは、現在、主に、チューブリン結合剤で構成されている。ほとんどのＶＤＡは、実質的に天然化合物のオリジナルの手がかりに基づいている。いくつかの化合物は、現在前臨床評価又は臨床評価を受けている。しかしながら、それらの正常な内皮細胞への親和性及び臨床毒性が観察され、それらの開発が大きく妨げられている。したがって、それらの有効性を向上させ、それらの全身毒性を抑えるために、これらの天然化合物の手掛かりに基づいて新規のＶＤＡを設計することが重要である。
アザポドフィルロトキシン系では、４−アザ−１，２−ジデヒドロポドフィルロトキシン骨格を有する第１類似体が開示されている（Labruere et al 2010 Chem. Med. Chem. 2010, 5, 2016-2025; J. Org. Chem. 2008, 73, 3642-3645）。しかし、興味を起こさせるｉｎ ｖｉｖｏ活性を示さなかった。したがって、水溶性で、正常細胞に対して低毒性であり、癌細胞に対して細胞毒性を示し、さらに腫瘍の脈管構造を破壊する、効果的なアザポドフィルロトキシン類似体の抗腫瘍剤が必要とされている。
出願人は、抗腫瘍性を示し、チューブリン重合阻害を介して抗血管剤又は血管破壊剤として作用する、新規の水溶性芳香族アザポドフィルロトキシン（４−アザ−１，２，３，４−テトラデヒドロポドフィルロトキシン、即ち、シクロケトンと縮環した４−アリールアミノキノリン核）類似体を見出した。これらの薬剤は腫瘍の血管新生（特に内皮細胞の細胞骨格）を標的とする。その結果、癌細胞増殖及び脈管構造を介する転移性播種を阻害する。
したがって、本発明は、上記の芳香族アザポドフィルロトキシン（４−アザ−１，２，３，４−テトラデヒドロポドフィルロトキシン）類似体に関し、好ましくは、塩化形態であり、また、向上した水溶性を示し、抗血管剤として、特に癌の治療に有用である。
したがって、本発明は、第一形態において、式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ及びＡｒは、以下に記載されている通り。］
の化合物に関し、好ましくは、その医薬上許容される塩であり、その溶媒和物の形態であってもよい。
他の形態では、本発明は、上記式（Ｉ）の化合物（好ましくは、その医薬上許容される塩）及び医薬上許容される賦形剤を含む組成物に関する。
他の形態では、本発明は、同時に、交互に又は連続的に使用するための、少なくとも：
− 上記式（Ｉ）の化合物（好ましくは、その医薬上許容される塩）及び医薬上許容される賦形剤を含む第一組成物、及び
− その他の抗腫瘍剤を含む第二組成物
を含むキットに関する。
他の形態では、本発明は、それらの医薬として、特に細胞毒性薬、又は抗血管剤としての使用（有利には癌の治療におけるもの）のための、本発明の式（Ｉ）の化合物（好ましくは、その医薬上許容される塩）又は組成物又はキットに関する。
他の形態では、本発明は、放射線治療手術による治療、温熱療法と共に、或いはその他の抗癌剤と組み合わせて、同時に、交互に又は連続的に使用するための、本発明の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む併用療法に関する。
他の形態では、本発明は、本発明の化合物の調製方法に関する。
対照（短い２時間の期間１μＭの濃度で賦形剤（細胞培地中１％ＤＭＳＯ）に曝された内皮細胞の典型的なラウンディングアップ）に対する、短い２時間の期間１μＭの濃度でＳＧＲ３０７塩酸塩（ＳＧＲ３０７．ＨＣｌ）（下記構造を参照）に曝された内皮細胞の典型的なラウンディングアップ。 ＳＧＲ３０７．ＨＣｌによる内皮細胞索の破壊。内皮の予め形成された索を、内部対照としてのコンブレタスタチンＡ４（ＣＡ４、１μＭ）或いはＳＧＲ３０７．ＨＣｌ（１及び０．５μＭ）に２時間曝した。ＳＧＲ３０７．ＨＣｌは水溶性であるが、内部対照として使用するＣＡ４を可溶化する必要があるため、本実験ではＤＭＳＯを用いた。対照の内皮細胞索は１％ＤＭＳＯに曝した。 ＳＧＲ３０７．ＨＣｌのチューブリン重合の阻害。重合の５０％を阻害する計算濃度は１．０９μＭである。微小管におけるチューブリン集合は、生物的評価のための物質及び方法のセクションに記載されたように、蛍光性色素ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いて行われた。 結腸２６癌腫を有するマウスにおけるＳＧＲ３０７．ＨＣｌの毒性及び抗腫瘍作用。Ａ）腫瘍移植の４、５、１１、１２、１４及び１５日後に腹腔内注射した示されたＳＧＲ３０７．ＨＣｌの用量での体重変化。Ｂ）同じ日に投与した示された用量での対応する抗腫瘍効果。対照には食塩水溶液（０．９％塩化ナトリウム水溶液）を与えた。 ルイス肺癌を有するマウスにおけるＳＧＲ３０７．ＨＣｌの抗腫瘍作用。ＳＧＲ３０７．ＨＣｌを腫瘍移植の４〜８及び１１〜１５日後に腹腔内注射した。対照には食塩水溶液（０．９％塩化ナトリウム水溶液）を与えた。
本発明は、式（Ｉ）：
［式中、
Ｘは、−ＣＨ２−又は−ＣＨ２ＣＨ２−を示し；
Ｒ１及びＲ４は、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキルからなる群から選ばれ；
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルチオ、ハロゲン、トリフルオロメチル、ＣＮからなる群から選ばれるか；
或いは、Ｒ２及びＲ３が、一緒になって、−（ＣＨ２）ｎ−及び−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−からなる群から選ばれる架橋基を形成し、ｎは、３ないし４の整数であり、ｍは、１又は２であり；
Ａｒは、独立して、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルチオ、ハロゲン、トリフルオロメチル、ＣＮからなる群から選ばれる１〜４個の置換基で置換されていてもよいフェニル又はナフチル基を示す。］
の化合物（又は好ましくはその医薬上許容される塩、その溶媒和物の形態であってもよい）に関する。
特定の実施形態では、Ａｒは、少なくとも１個のＣ１−Ｃ４−アルコキシ置換基で２位又は４位（オルト位又はパラ位）が置換されたフェニル、又は少なくとも１個の置換基Ｃ１−Ｃ４−アルコキシで置換されたナフチル基を示し、フェニル又はナフチル基は、独立して、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルチオ、ハロゲン、トリフルオロメチル、ＣＮからなる群から選ばれる１ないし３個以上の置換基でさらに置換されていてもよい。有利には、この実施形態では、Ａｒは、少なくとも１個の置換基Ｃ１−Ｃ４−アルコキシで２又は４位が置換され、且つ独立してＣ１−Ｃ４−アルキル、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルチオ、ハロゲン、トリフルオロメチル、ＣＮからなる群から選ばれる１ないし３個以上の置換基で置換されていてもよいフェニル基を示す。
好ましい実施形態では、Ａｒは、独立して、ＯＨ及びＣ１−Ｃ４−アルコキシからなる群から選ばれる２個の置換基で置換され、且つ独立して、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルチオ、ハロゲン、トリフルオロメチル、ＣＮからなる群から選ばれる１ないし２個以上の置換基で置換されていてもよいフェニル又はナフチル基（好ましくはフェニル基）を示す。より好ましくは、Ａｒは、独立して、ＯＨ及びＣ１−Ｃ４−アルコキシからなる群から選ばれる３個の置換基で置換されたフェニル又はナフチル基を示す。さらに好ましくは、Ａｒは、３個のＣ１−Ｃ４−アルコキシ基で置換されたフェニル又はナフチル基を示す。
医薬上許容される塩としては、医薬上許容される無機酸及び有機酸から誘導されるものが挙げられる。適切な酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、ホウ酸、アスコルビン酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、ヘミコハク酸、トルエン−ｐ−硫酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ヘキサン酸、馬尿酸、ヘプタン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、フェニルグリコキシ酸、ニコチン酸、ナフタレン−２−硫酸及びベンゼンスルホン酸が挙げられる。シュウ酸のような他の酸は、それ自体医薬上許容されないが、化合物及びそれらの医薬上許容される酸付加塩を得る場合の中間体として有用な塩の調製に用いることができる。好ましい医薬上許容される塩としては、塩酸塩、乳酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、及びメタンスルホン酸塩が挙げられる。
溶媒和物は、溶媒と溶質（本明細書では式（Ｉ）の化合物又はその塩）の相互作用で形成した化学複合体である。好ましい医薬上許容される溶媒和物は、水和物、及びエタノールのようなアルコール溶媒の溶媒和物である。好ましくは、溶媒和物は、水和物及び／又はアルコール和物であり、より好ましくは、水和物である。
本発明の枠組みの中で、表現「Ｃ１−Ｃ４−アルキル」は、直鎖又は分枝鎖の１ないし４個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ４）を含む炭化水素鎖として理解される。１ないし４個の炭素原子を含むアルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、及びイソブチル基が挙げられる。
本発明の枠組みの中で、表現「Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ」は、１ないし４個の炭素原子（Ｃ１−Ｃ４）を含むアルコキシ鎖、すなわち、順に分子の残りの部分に結合する酸素原子に結合したＣ１−Ｃ４アルキルとして理解される。
本明細書で用いられる用語「ハロゲン」は、塩素、臭素、ヨウ素又はフッ素を示し、好ましくは塩素又はフッ素である。
好ましくは、Ｒ１及びＲ４は、独立して、Ｈ、ハロゲン、及びメチルからなる群から選ばれ、さらに好ましくは、Ｒ１及びＲ４のうち少なくとも１つが水素である。好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ４は共にＨを示す。
有利には、Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシからなる群から選ばれるか、或いはＲ２及びＲ３が、一緒になって、−（ＣＨ２）ｎ−及び−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−からなる群から選ばれる架橋基を形成し、ｎが３ないし４の整数であり且つｍが１又は２である。より有利には、Ｒ２及びＲ３が、独立して、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシからなる群から選ばれるか、或いはＲ２及びＲ３が、一緒になって、−（ＣＨ２）ｎ−及び−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−からなる群から選ばれる架橋基を形成し、ｎが３ないし６の整数であり、好ましくは３又は４であり、且つｍが１又は２である。
好ましくは、Ａｒは、独立して、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、ＯＨ基からなる群から選ばれる１〜３個の置換基で置換されたフェニル基を示し、より好ましくは２又は３個のＣ１−Ｃ４−アルコキシ基で置換されたフェニル基であり、さらに好ましくは、Ａｒは、３，４，５−トリメトキシフェニル基である。
有利な実施形態では、Ｘが−ＣＨ２ＣＨ２−を示し、Ｒ１及びＲ４が共にＨを示す。
他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３が、一緒になって、架橋基−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−を形成し、ｍが１又は２であり且つＲ１及びＲ４が共にＨを示す。この実施形態では、本発明の化合物は、式（Ｉａ）：
［式中、Ｘ及びＡｒは上記の通りであり、ｍが１又は２である。］
で記載されるものが最良である。
好ましい実施形態では、本発明は、式（Ｉｂ）：
［式中、Ｘ及びＡｒは上記の通りである。］
の化合物に関する。
さらに好ましい実施形態では、本発明は、式（Ｉｃ）：
［式中、Ａｒは上記の通りである。］
の化合物に関する。
特に、本発明の化合物は：
、好ましくは、
、より好ましくは、
、又はそれらの塩（好ましくは、それらの塩酸塩、乳酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、及びメタンスルホン酸塩、最も好ましくは、それらの塩酸塩）（その溶媒和物の形態であってもよい。）である。
好ましくは、本発明の化合物は：
、又はその塩（好ましくは、その塩酸塩、乳酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、及びメタンスルホン酸塩、最も好ましくは、その塩酸塩）である。
本発明において考えられる化合物は、当業者に理解されるような「化学的に安定」したもののみである。
本発明は、式（Ｉ）の化合物の医薬上許容される誘導体を含む。「医薬上許容される誘導体」とは、任意の医薬上許容される塩、又は患者に投与した場合に、本発明の有用な化合物又はその薬理活性のある代謝物又はその薬理活性のある残留物を（直接的又は間接的に）提供することができる任意のその他の化合物をいう。薬理活性のある代謝物は、酵素的に又は化学的に製造することができる任意の本発明の化合物を意味すると理解され得る。これには、例えば、本発明のヒドロキシル化若しくは酸化誘導体化合物、又はその複合体が含まれる。
さらに、本発明の範囲内には、本発明の化合物のプロドラッグの使用が含まれる。プロドラッグには、簡単な化学的変換で本発明の化合物が生成するように修飾したこれらの化合物が含まれる。簡単な化学的変換には、加水分解、酸化及び還元が含まれる。具体的に、プロドラッグを患者に投与した場合に、プロドラッグは本明細書の上記の化合物に変換され、その結果として、所望の薬理効果を与えることができる。
式（Ｉ）の化合物は、本発明の一部を構成もする以下に記載された一般的な合成方法を用いて調製してもよい。
他の形態では、本発明は、活性成分として少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物（好ましくは、その医薬上許容される塩、溶媒和物の形態であってもよい）及び医薬上許容される賦形剤を含む組成物に関する。
本発明の医薬組成物は、例えば、経口経路又は非経口経路、好ましくは非経口経路、特に、静脈内経路により投与される組成物であり得る。
一番好ましい投与経路は経口経路である。経口経路で投与される組成物の例としては、錠剤、ゼラチンカプセル剤、顆粒剤、マイクロスフェア剤、ナノ乳剤、リポソーム剤、散剤及び経口液剤又は懸濁剤が挙げられる。
他の好ましい投与経路は、非経口経路、例えば、静脈内経路である。実際には、本発明の化合物は、水溶液への溶解性がある。有利にはそれらは、５ｇ／Ｌを上回り、好ましくは１０ｇ／Ｌを上回る水への溶解度を示す。例えば、本発明の化合物は、５ないし１０ｇ／Ｌの溶解度を有する。例えば、本発明の化合物（好ましくは塩としてのもの）は、ヒトへの投与に適した、静脈内経路での投与にしばしば用いられる、水中デキストロース５％、アルコール／ポリソルベート／水溶媒、とりわけエタノール／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）／水及びマンニトール／水の混合物、又はシクロデキストリンの補助を伴うもののような水溶液中で製剤化してもよい。本発明の化合物（好ましくは塩としてのもの）は、ナノ乳剤又はリポソーム剤として製剤化してもよい。したがって、本発明に従う組成物は、静脈内経路で投与してもよい。従って、特定の実施形態では、本発明の組成物は注射液として製剤化される。
本発明の組成物は、通常、組成物の全重量に対して０．０１％ないし１０重量％、好ましくは０．１％ないし５重量％の上記式（Ｉ）の化合物を含む。
本発明の組成物は、さらに、他の活性物質を含んでいてもよい。
他の形態では、本発明は、同時に、交互に又は連続的に使用するための、少なくとも：
− 上記式（Ｉ）の化合物及び医薬上許容される賦形剤を含む第一組成物、及び
− 例えば、シスプラチン メトトレキサート、シクロホスファミド、ドキソルビシン、フルオロウラシルのようなその他の抗腫瘍剤を含む第二組成物
を含むキットに関する。
当業者は、もちろん、治療する腫瘍又は癌の性質及びステージ、並びに治療する患者の年齢、性別、体重及び感受性を考慮して、その他の抗腫瘍剤を含む第二組成物を選択するだろう。
一実施形態では、本発明の化合物又は組成物又はキットは、単独で、又は電離放射線又は非電離放射線又は温熱療法と同時に、別々に又は順次組み合わせて用いてもよい。
他の形態では、本発明は、医薬として、特に、細胞毒性薬、抗血管剤として或いは癌の治療において使用するための本発明の式（Ｉ）の化合物、組成物又はキットに関する。
とりわけ、本発明の式（Ｉ）の化合物、組成物又はキットは、特に、黒色腫、肺癌、結腸癌、大腸癌、乳癌、脳腫瘍、膵臓癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、肝癌、卵巣癌、好ましくは、黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌及び結腸癌からなる群から選ばれる癌、より好ましくは、卵巣癌、黒色腫、肺癌、及び結腸癌からなる群から選ばれる癌の治療に用いることができる。
特定の実施形態では、癌が、多剤耐性癌である。例えば、上記癌は、シスプラチン耐性であり得る。
また、他の形態に従って、本発明は、好ましくは非経口経路、特に、静脈内経路又は経口経路により、有効量の本発明に従う化合物、又はその医薬上許容される塩、又は本発明に従う組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む上記障害の治療方法に関する。本発明の化合物の有効量は、例えば、選ばれた投与経路、体重、年齢、性別、治療される病状及び治療する個体の感受性のような多くのパラメーターに依存する。
他の形態では、本発明は、放射線治療、手術、又は温熱療法による治療と共に同時に、交互に又は連続的に使用するために、本発明の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む併用療法に関する。
他の形態に従って、本発明は、好ましくは、癌、特に、上記の障害の治療のための、医薬、特に、細胞毒性薬、抗血管剤の製造のための本発明の式（Ｉ）の化合物又は組成物の使用に関する。
式（Ｉ）の化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてナノモル濃度で内皮細胞のラウンディングアップ及び内皮索の破壊をもたらす。また、本発明の式（Ｉ）の化合物はチューブリン重合を阻害する。それらは、マイクロモル濃度で、コンブレタスタチンＡ４（ＣＡ４）と同等な活性水準を伴ってマウス及びヒト癌細胞に対して細胞毒性を有する。また、それらは、多剤耐性（ＭＤＲ）ヒト癌細胞、特に、シスプラチン耐性ヒト癌細胞株に対して活性である。また、本発明の式（Ｉ）の化合物は、充実性腫瘍を有するマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示す。
また、本発明は、本発明に従う式（Ｉ）の化合物の調製方法を提供する。スキーム全てにおいて、別段の定めがない限り、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ及びＡｒは上記の通りである。
最適な反応条件及び反応時間は、使用する特定の反応物質に応じて変化し得る。特に定めのない限り、溶媒、温度、圧力及びその他の反応条件は、当業者により容易に選択され得る。具体的な手順は、合成例セクションに記載されている。通常、反応の進行は、必要に応じて、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）又はＬＣ−ＭＳでモニターすることができる。中間体及び生成物は、シリカゲルのクロマトグラフィー及び／又は再結晶により精製することができる。
本発明に従う式（Ｉ）の化合物の調製方法は、以下の連続した工程を含む：
ａ） ホルムアルデヒド、１，３−シクロヘキサンジオン又は１，３−シクロペンタンジオン、及びアニリン（ＩＩ）：
を縮合し、続いて酸化して、中間体（ＩＩＩ）：
を得る工程；
ｂ） 中間体（ＩＩＩ）を酸化して、Ｎ−オキシド（ＩＶ）：
を得る工程；
ｃ） Ｎ−オキシド（ＩＶ）を塩素化剤と反応させて、中間体（Ｖ）：
を得る工程；
ｄ） 中間体（Ｖ）をアニリンＡｒＮＨ２（ＶＩ）と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得る工程；
ｅ） 得られた式（Ｉ）の化合物を酸で処理して、上記式（Ｉ）の化合物の塩を得る任意の工程。
有利には、ａ）の三成分反応（ホルムアルデヒド、１，３−シクロヘキサンジオン又は１，３−シクロペンタンジオン、及びアニリン（ＩＩ）の縮合）のサブ工程は、ワンポット反応である。
工程ａ）の縮合のサブ工程は、有利には、還流エタノール中で行うことができる。
ａ）の酸化のサブ工程における酸化剤は、二酸化マンガン、ジメチルスルホキシド、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−キノンであり、より好ましくは、二酸化マンガンである。
好ましくは、工程ｂ）の酸化剤は、酢酸−過酸化水素混合物又はｍ−クロロ過安息香酸であり、より好ましくは、ｍ−クロロ過安息香酸である。
有利には、工程ｃ）の塩素化剤は、五塩化リン、オキシ三塩化リン又は塩化チオニルであり、より好ましくは、オキシ三塩化リンである。
有利には、工程ａ）のアニリン（ＩＩ）は、３，４−ジメトキシアニリン、３，４−ジメチルアニリン又は６−アミノ−１，４−ベンゾジオキサン、より好ましくは、５−アミノ−１，３−ベンゾジオキソールである。
有利には、工程ｄ）のアニリン（ＶＩ）は、３，４，５−トリメトキシアニリン、３，４−ジメトキシアニリン、３，４−メチレンジオキシアニリン、３，５−ジメトキシアニリン、３−メトキシ−又は４−ヒドロキシ−３−メトキシアニリンであり、より好ましくは、３，４，５−トリメトキシアニリンである。
以下の実施例は本発明を説明することを意図するが、いかなる方法においてもその範囲を限定するものではない。以下の実施例は例示であり、過度な実験をすることなく、当業者により認識されるように、特定の試薬又は条件が、個々の化合物に対する必要性に応じて変更され得る。以下のスキームで用いられる出発原料及び中間体は、市販されているか、或いは当業者により市販の物質から容易に調製される。
実施例１：６，７−（メチレンジオキシ）−９−［（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ］−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン塩酸塩（ＳＧＲ３０７．ＨＣｌ）の合成
工程１：
６，７−（メチレンジオキシ）−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン（４）
３，４−（メチレンジオキシ）アニリン１（６．１７ｇ）、パラホルムアルデヒド３（１．３５ｇ）、及びシクロヘキサン−１，３−ジオン２（５．０４ｇ）のＥｔＯＨ（２２０ｍＬ）の等分子（４５ｍｍｏｌ）混合物を、１．５時間還流した。溶媒の半分を減圧下で除去し、得られた固体をろ去した。このジヒドロ及び芳香族化合物の混合物（７．５６ｇ）のジクロロメタン（１．６０Ｌ）溶液に活性化ＭｎＯ２（純度８５％）（６．７４ｇ）を加えた。室温で１．５時間撹拌した後、反応混合物をセライトパッドでろ過し、溶媒を除去し、白色粉末として分析的に純粋な４（７．２２ｇ，６６％）を得た。mp: 210 ℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 2.12 (q, J = 6 Hz, 2H, 3-H), 2.69 (t, J = 6 Hz, 2H, 2-H), 3.13 (t, J = 6 Hz, 2H, 4-H), 6.25 (s, 2H, O-CH2-O), 7.33 (s, 1H, 5-H), 7.50 (s, 1H, 8-H), 8.63 (s, 1H, 9-H).
工程２
６，７−（メチレンジオキシ）−１０−オキシ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン（５）
アクリジン４（１．９１ｇ，７．９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１００ｍＬ）溶液に、ｍ−クロロ過安息香酸（純度７０％）（３．９１ｇ，１５．８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で７２時間攪拌した後、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液（１６０ｍＬ）を加え、反応混合物を１０分間激しく攪拌した。次いで、水層をジクロロメタン（２ｘ５０ｍＬ）で抽出した。まとめた有機相を中性のｐＨとなるまで水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、黄色粉末として５（１．４０ｇ，６８％）を得、さらに精製することなく次工程で用いた。試料を、元素分析のためにシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール９５／５）で精製した。mp: 262 ℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 2.13 (q, J = 6.2 Hz, 2H, 3-H), 2.67 (t, J = 6.2 Hz, 2H, 2-H), 3.18 (t, J = 6.2 Hz, 2H, 4-H), 6.31 (s, 2H, O-CH2-O), 7.63 (s, 1H, 8-H), 7.86 (s, 1H, 5-H), 8.23 (s, 1H, 9-H).
工程３
９−クロロ−６，７−（メチレンジオキシ）−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン（６）
アクリジンＮ−オキシド５（１．３６ｇ，５．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２５０ｍＬ）溶液にＰＯＣｌ３（５．９ｍＬ，６３．６ｍｍｏｌ）を加えた。４８時間の還流後、水（１００ｍＬ）を加え、次いで、８のｐＨになるまで飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加えた。水層をジクロロメタン（２ｘ１００ｍＬ）で抽出した後、有機相を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、薄茶色粉末として６（１．３３ｇ、９３％）を得、さらに精製することなく次工程で用いた。試料をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン）で精製した。Mp: 214 ℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 2.21 (q, J = 6.4 Hz, 2H, 3-H), 2.81 (t, J= 6.4 Hz, 2H, 2-H), 3.25 (t, J = 6.4 Hz, 2H, 4-H), 6.19 (s, 2H, O-CH2-O), 7.29 (s, 1H, 5-H), 7.70 (s, 1H, 8-H).
工程４
６，７−（メチレンジオキシ）−９−（３，４，５−トリメトキシフェニルアミノ）−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン，塩酸塩（ＳＧＲ３０７．ＨＣｌ）
クロロアクリジン６（６９８ｍｇ，２．５３ｍｍｏｌ）及び３，４，５−トリメトキシアニリン（７）（５１０ｍｇ，２．７８ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（３５０ｍＬ）混合物を、５時間還流した。溶媒を減圧留去し、得られた析出物をろ去し、次いでＥｔＯＨから再結晶し、淡黄色粉末としてＳＧＲ３０７．ＨＣｌ（８４８ｍｇ、７３％）を得た。mp: 244-246 ℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 2.16 (q, J = 6.1 Hz, 2H, 3-H), 2.79 (t, J = 6.1 Hz, 2H, 2-H), 3.30 (t, J = 6.1 Hz, 2H, 4-H), 3.70 (s, 3H, 4’-OMe), 3.72 (s, 6H, 2 x OMe), 6.26 (s, 2H, O-CH2-O), 6.72 (s, 1H, 8-H), 6.75 (s, 2H, 2’-H et 6’-H), 7.56 (s, 1H, 5-H), 12.73 (s, 1H, NH), 15.15 (s, 1H, 10-H); HRMS (ES+): m/z calculated for C23H23N2O6[M+]: 423.1556, found: 423,1508.
他の類似体を、同様のプロトコルを用いて、出発原料を変更して調製した。また、これらの化合物のプロトン化のｐＫａを、ＳＰＡＲＣソフトウエアｈｔｔｐ：／／ａｒｃｈｅｍｃａｌｃ．／ｓｐａｒｃ／を用いて計算した。
実施例２ ＳＧＲ３０７．ＨＣｌのＩｎ ｖｉｔｒｏ及びＩｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
生物学評価のための物質及び方法
内皮細胞形態評価
内皮細胞の形態に対する化合物の効果を評価するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の永久ヒト細胞株Ａ５４９との融合物に由来するＥＡｈｙ９２６内皮細胞株を用いた（Edgell et al, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1983, vol 80, issue 12, 3734-3737）。ＥＡｈｙ９２６細胞株は、親のＨＵＶＥＣの大部分の生化学的マーカーを発現するため、ネイティブＨＵＶＥＣの良い代表として考えられる（Bouis et al., Angiogenesis., 2001, 4, 91-102）。ＥＡｈｙ９２６細胞を、加湿雰囲気下（３７℃、５％ＣＯ２）で、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養させた。急激に培養したＥＡｈｙ９２６細胞を、５０００細胞／１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後、培地を吸引し、試験化合物を含む１００μＬの培地を、細胞を含むウェルに加え（３重）、２時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。最も形態学的に活性な化合物のために必要な場合に、用いる最高濃度は、１００μＭとし、それに続いて、低いナノモル濃度までの二倍段階希釈液を用いた。２時間のインキュベーション期間後、１００Ｘ及び２００Ｘの倍率で各ウェルの代表的な中央領域のデジタル写真を撮影した。対照の１％ＤＭＳＯ処理細胞で１５％未満である通常の有糸分裂細胞を排除するために、結果を、フィールド内の１５％を超える細胞のラウンディングアップをもたらし得る最小濃度として示す。通常、同一プレート上で３重の濃度で行った。ＣＡ４を正の内部標準として実験に含めた。
内皮細胞索破壊アッセイ
Ｅａｈｙ９２６内皮細胞を、６ウェルプレートのマトリゲル層に播種し、４８時間マイクロ血管構造（索）を形成させた。索を、０．００５ないし１００μＭの様々な濃度のＳＧＲ３０７．ＨＣｌ及び１μＭのコンブレタスタチンＡ４（ＣＡ４）に２時間曝した。本実験で用いた対照溶媒は、１％ＤＭＳＯ最終濃度であった。これは、この溶媒が正の内部対照として使用するコンブレタスタチンＡ４を可溶化するために必要であったためである。同一プレート領域のデジタル写真を、薬剤使用前及び二時間後に撮影した。
チューブリン重合阻害アッセイ
微小管のチューブリンの集合を、記載されているような９６ウェルプレート型（Bane et al in Zhou, J. (Ed.), Microtubule Protocols. Humana Press, Totowa, New Jersey, 2007, 281-288; Barron et al., Anal. Biochem., 2003, 315, 49-56）で、蛍光色素ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（Bonne et al., J. Biol. Chem., 1985, 260, 2819-2825）を用いて行った。標準アッセイを以下のように行った：ウェルを、１０μＭ ＤＡＰＩ及び様々な濃度の試験化合物を伴うＰＭＥバッファー（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（１，４−ピペラジンビス（エタンスルホン酸））；１ｍＭ ＭｇＳＯ４；２ｍＭ ＥＧＴＡ）中のチューブリン（細胞骨格、純度９７％、最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）で充填した。正の内部標準対照として３０μＭのコルヒチンを用いた。試験化合物の用いた最終濃度は、３０μＭで開始し、阻害が観察されなくなるまで３倍ずつ希釈して低下させた。それぞれの濃度につき三つのウェルで行った。室温で４５分間プレインキュベーションした後、１ｍＭ ＧＴＰ（５μＬ）を各ウェルに加え、チューブリン重合を開始し、次いで、プレートを３７℃でさらなる２時間恒温Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダーに移した。次いで、蛍光を３６０ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの発光で読み取った。阻害割合を以下のように測定した：１−（ΔＦ（サンプル／ΔＦ（対照）Ｘ１００、ここで、ΔＦ対照＝Ｆ（阻害なし）−Ｆ（完結阻害）、ΔＦサンプル＝Ｆ（サンプル）−Ｆ（コルヒチンでの完結阻害）。チューブリン重合の化合物誘導阻害のＩＣ５０は、重合阻害の程度が最大値の５０％となる濃度であり、非線形回帰プログラムＳｉｇｍａＰｌｏｔ（Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて可変勾配を伴うＳ字状モデルに適合した薬剤濃度の対数の関数としての阻害割合の片対数プロットで決定される。これらの条件において、チューブリン重合のコルヒチン阻害のＩＣ５０値は０．３６μＭであった。
マウス癌細胞の細胞毒性アッセイ
マウスＢ１６黒色腫細胞、ルイス肺癌細胞及び結腸２６癌細胞を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。ＳＧＲ３０７．ＨＣｌ及びその他の本発明の化合物を、２．５ｍｇ／ｍＬのストック濃度で水に溶解し、細胞培地でさらに希釈した。急激に培養した細胞を、１００μＬの培地中１ウェルあたり５０００細胞で９６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後、０．０１ないし１００μＭの範囲の最終濃度の試験化合物を含む１００μｌの培地を、細胞を含むウェルに加え（３重）、５％ＣＯ２にて３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間の試験化合物への曝露の期間の後、細胞生存率を、ＭＴＴ（メチルチアゾールテトラゾリウム）試験（Scudiero et al., Cancer Res. 1988, 48, 4827-4833）を用いて評価した。吸光度を、マイクロプレートリーダー（BioKinetics Reader, EL340）にて５６２ｎｍで読み取った。ＤＭＥＭのみ及びＭＴＴを伴う適切な対照を、バックグラウンド吸光度を減算するために用いた。５０％まで細胞生存率を阻害する化合物の濃度（細胞の５０％の阻害濃度、又はＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて測定した。
ヒト癌細胞の細胞毒性アッセイ
ヒト細胞を、５％ＣＯ２下、７５ｃｍ２フラスコ内で、ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢ（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）の存在下、１０％ウシ胎児血清（インビトロゲン）を補充したＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を、２００μｌ培地中６５０細胞／ウェルの密度で９６ウェル組織培養マイクロプレートに播種し、自動ベンチステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ ３０００）を用いて適用される０．５〜１０μＭの範囲の濃度でＤＭＳＯに溶解した化合物で２４時間後に処理した。対照は、試験ウェルに対して同じ体積のＤＭＳＯを与えた（１％最終濃度）。７２時間の曝露の時間後、ＭＴＳ試薬（プロメガ）を加え、３７℃で３時間インキュベートし、吸光度を４９０ ｎｍで読み取った。結果を、比［（ＯＤ４９０処置／ＯＤ４９０対照）×１００］で計算される細胞増殖阻害として示す。ＩＣ５０（細胞増殖の５０％阻害）の決定のために、実験は、２つの独立した２回の実験で行われた。
腫瘍を有するマウスでの抗腫瘍活性評価
メスのＣ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ Ｓａｉｎｔ Ｉｓｌｅ、フランス）から購入した。マウスは、治療開始時に１８ｇを上回る重量であった。食物及び水に自由に出入りさせた。マウスの腫瘍を、適切な血統のマウス系統の連続継代によって維持した。即ち、結腸腫瘍２６（ＣＴ２６）をＢａｌｂ／ｃマウスに継代した（Corbett et al., Cancer Res. 1975, 35, 2434-24391975; Corbett et al., Cancer 1977 40, 2660-2680）。ルイス肺癌（Mayo et al, Cancer Chemotherapy Reports Part 2 Supplement, 1972, vol 3, issue 1, 325-330）がＣ５７ＢＬ／６マウスで保持された。
使用するプロトコル設計、化学療法の技術及び方法は、（Corbett et al., Cancer Res, 1982, 42, 1707-1715; Schabel et al., Pharmacology & Therapeutics Part A-Chemotherapy Toxicology and Metabolic Inhibitors, 1977, 1, 411-435）に従うものを用いた。簡潔に言えば、腫瘍を、１日目に左右に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。動物を処置群（Ｔ）又は対照群（Ｃ）に無作為に割り当てた。腫瘍を、腫瘍が２５００ｍｍ３に到達するまで（腫瘍増殖速度に従って）週に２〜５回キャリパーを用いて測定した。腫瘍容積を、下記式を用いて２次元測定で推定した：腫瘍容積（ｍｍ３）＝［長さ（ｍｍ）×幅２（ｍｍ２）］／２。マウスの体重を週に２〜３回記録した。死亡日を記録した。胸腔及び腹腔を、巨視的に調べ、推定死亡原因を評価した。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のためのＳＧＲ３０７．ＨＣｌの調製
ＳＧＲ３０７．ＨＣｌを、滅菌水、通常の食塩水又は０．５％デキストロースで希釈することにより調製し、体積２００μｌで腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。薬剤用量を、治療開始時の体重に基づいて調整した。用量反応評価を、各試験で行い、最高非毒性用量（ＨＮＴＤ）を測定した。それは、薬剤関連死を伴わず、２０％以上の体重減少をもたらさない最高薬剤用量として定義される。動物の体重は腫瘍重量を含む。
抗腫瘍活性評価に用いられるエンドポイント
腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ値）。これは、早期疾患に関して、抗腫瘍活性の測定で幅広く用いられる基準である。腫瘍容積を、処置群（Ｔ）及び対照群（Ｃ）で同日に測定した。対照群（Ｃ）の腫瘍容積中央値は、７５０ないし１５００ｍｍ３の範囲に達した。その一方で処置群（Ｔ）の腫瘍容積中央値は、ゼロを含めて測定された。パーセントＴ／Ｃ値は以下のように計算される：
［％Ｔ／Ｃ＝（処置腫瘍容積中央値／対照腫瘍容積中央値）×１００］
アメリカ国立癌研究所の標準に従って、Ｔ／Ｃ≦４２％を、活性の最小レベルとみなす。Ｔ／Ｃ＜１０％を、さらなる開発を正当化する高い抗腫瘍活性レベルとみなす。
腫瘍増殖遅延（Ｔ−Ｃ値）。腫瘍増殖遅延は、処置群（Ｔ）と対照群（Ｃ）の所定の腫瘍容積（７５０〜１０００ｍｍ３）に到達する日数の中央値の差として定義される。腫瘍がない生存個体を、これらの計算から除外し、別々に集計する。この値は、以下に定義されるように腫瘍細胞死滅の定量化を可能にする。
腫瘍倍加時間（Ｔｄ）。Ｔｄの日数は、対数期（範囲１００〜１０００ｍｍ３）の間の対照群の腫瘍の対数線形腫瘍増殖プロットに対するベストフィット直線から評価される。
腫瘍Ｌｏｇ細胞死滅の計算。皮下増殖腫瘍について、Ｌｏｇ細胞死滅値を、Ｓｃｈａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Schabel et al., 1977）に記載されたようにして、下記式：［（Ｔ−Ｃ）／３．３２］ｘＴｄ（式中、Ｔ−Ｃ値及びＴｄは、それぞれ、上記定義の腫瘍増殖遅延及び腫瘍倍加時間である。）を用いて計算した。
抗腫瘍活性評価に用いられる基準
抗腫瘍活性を、南部諸州研究学会（ＳＲＩ）で科学者によりはじめに定義されたようにＬｏｇ細胞死滅値≧０．７を用いて評価した（Schabel et al., 1977）。以下のＳＲＩスコアを用いて、以下のｌｏｇ細胞死滅値に基づいて抗腫瘍活性を評価した：＜０．７＝−（不活性）；０．７〜１．２＝＋；１．３〜１．９＝＋＋；２．０〜２．８＝＋＋＋；＞２．８＝＋＋＋＋（高活性）。完全腫瘍退縮（ＣＲ）は、触診限界以下への腫瘍退縮として定義された（〜６２ｍｍ３）。研究終了時に触診可能な腫瘍を有さない動物を、腫瘍を有さない生存個体（ＴＦＳ）としてみなし、Ｔ−Ｃ値の計算から除外した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的評価の結果
ＳＧＲ３０７．ＨＣｌ及びその他の本発明の化合物の内皮細胞形態に対する効果
まず、本発明の化合物を、形質転換ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）であるＥＡｈｙ９２６内皮細胞に対して試験した。これらの細胞は、血管破壊剤（例えば、コンブレタスタチンＡ４）に短い２時間曝露した際にラウンディングアップを受ける。図１は、短い２時間の曝露時間で１μＭの濃度にてＳＧＲ３０７．ＨＣｌに曝露した内皮細胞の典型的なラウンディングアップを示す。内皮細胞の有意なラインディングアップが、０．０６μＭという低い濃度で観察された。
ＳＧＲ３０７．ＨＣｌの内皮索に対する効果
抗血管剤のその他の典型的な効果は、マトリゲル層上で増殖した内皮細胞の予め形成した索の破壊である。ＳＧＲ３０７．ＨＣｌの予め形成した内皮細胞索に対する効果を図２に示す。ＳＧＲ３０７．ＨＣｌによる内皮索の破壊は、２時間の曝露時間にて０．５μＭという低い濃度で観察することができる。実際、ＳＧＲ３０７．ＨＣｌは、内部対照として含めた１μＭのコンブレタスタチンＡ４と同様に効果的に内皮細胞索を破壊し得る。
ＳＧＲ３０７．ＨＣｌ及びその他の本発明の化合物のチューブリン重合阻害
内皮細胞のラウンディングアップ並びに内皮細胞索の破壊が、共に、細胞骨格構造の急速な破壊を示唆するため、次に、我々は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのチューブリン重合に対する本発明の化合物の効果を試験した。図３は、チューブリン重合に対するＳＧＲ３０７．ＨＣｌの効果を示す。ＳＧＲ３０７．ＨＣｌが１．０９μＭのＩＣ５０でチューブリン重合を阻害することが観察できる。同じ実験の条件で、標準的なチューブリン重合阻害剤ポドフィルロトキシン、コルヒチン及びコンブレタスタチンＡ４は、それぞれ、０．２２、０．３６及び０．２９μＭのＩＣ５０を示した。
ＳＧＲ３０７．ＨＣｌ及びその他の本発明の化合物のマウス癌細胞に対する細胞毒性
ＳＧＲ３０７．ＨＣｌの細胞毒性活性を、３種のマウス腫瘍細胞、即ち、Ｂ１６黒色腫、ルイス肺癌及び結腸２６癌腫に対して試験した。表１で示される結果は、以下のＩＣ５０値を示す：Ｂ１６、ルイス肺、及び結腸２６細胞それぞれで４．５、１０．６、及び１．２μＭ。
表１．ＳＧＲ３０７．ＨＣｌのマウス癌細胞に対する細胞毒性
ａマウス癌細胞株を物質及び方法のセクションで記載されたようにしてＤＭＥＭ中で増殖させた。
ｂ４８時間の曝露時間で５０％細胞死滅をもたらすＳＧＲ３０７．ＨＣｌの濃度。生存率は、ＭＴＴ試薬を用いてアッセイした。
ＳＧＲ３０７．ＨＣｌのヒト癌細胞に対する細胞毒性
さらに、ＳＧＲ３０７．ＨＣｌの細胞毒性活性を、最も重要な癌タイプを含むヒト癌細胞株、並びに多剤耐性株、ホルモン感受性及び耐性株の大パネルを用いて評価した。
表２は、これらのアッセイのＩＣ５０を示す。ＳＧＲ３０７．ＨＣｌは、３０ないし３８０ｎＭの範囲の比較的低いＩＣ５０値を伴い、全ての細胞株に対してナノモル濃度で活性であった。
表２．ＳＧＲ３０７．ＨＣｌのヒト癌細胞に対する細胞毒性活性ａ
ａ細胞を７２の間曝し、ＭＴＳ試薬を用いて生存細胞の数を測定した。ＩＣ５０値を、細胞増殖の５０％阻害をもたらす化合物の濃度として計算した。
それらが多剤耐性かどうか、又はエストロゲン受容体陽性かどうかの事実にかかわらず全ての乳癌株がＳＧＲ３０７．ＨＣｌに対して感受性であるということは注目するべきであった。興味深いことに、多剤耐性細胞株は、それらの対応（ＭＣＦ７及びＨＬ６０）の感受性と比較して、ＭＣＦ７Ｒ及びＨＬ６０Ｒ細胞株で示されるようにＳＧＲ３０７に対する感受性を保持した。
結腸細胞株、白血病株、肝臓及び腎臓株は、全て、ＳＧＲ３０７に対してかなり感受性であった。おそらく唯一の例外は、３３０〜３８０ｎＭのＩＣ５０を伴って化合物に対してより低い感受性であったアンドロゲン依存性前立腺腺癌細胞株のＬｎａＣａｐ細胞株である。しかしながら、アンドロゲン非依存性ＰＣ３前立腺腺癌は、ＳＧＲ３０７．ＨＣｌ（１２０〜１３０ｎＭ）に対して非常に感受性であった。
また、シスプラチン耐性卵巣細胞株Ａ２７８０ｃｉｓが、ＳＧＲ３０７に対して感受性であったことは注目すべきである。
静止細胞株ＥＰＣは、興味深いことに、３１０及び３６０ｎＭのＩＣ５０値を伴って化合物に対してより低い感受性であった。
結論として、ＳＧＲ３０７．ＨＣｌは、試験したほとんどのヒト癌細胞株で非常に良好な感受性プロファイルを示す。
ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性の結果
結腸２６癌腫を有するマウスにおけるＳＧＲ３０７．ＨＣｌの抗腫瘍活性
図４は、腫瘍移植後４、５、１１、１２、１４及び１５日目に３１、５０及び８０ｍｇ／ｋｇの薬剤用量で腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した結腸２６を有するマウスにおけるＳＧＲ３０７．ＨＣｌの抗腫瘍作用を示す。図４−Ａで示すことができるように、８０ｍｇ／ｋｇの用量は、２０％を上回る体重減少をもたらす毒性があった。その一方で、３１及び５０ｍｇ／ｋｇは、毒性がなく、この研究の間に体重増加をもたらした。
抗癌活性は、図４−Ｂで示されるように、３１及び５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで有意であった。３１ｍｇ／ｋｇの用量で７．７日の腫瘍増殖遅延（Ｔ−Ｃ）が観察され、５０ｍｇ／ｋｇの用量で１３．７日の腫瘍増殖遅延（Ｔ−Ｃ）が観察された（表３）。これらのＴ−Ｃ値は、充実性腫瘍の活性で一般的に用いられる基準に従えば高い活性剤であることを示す（Schabel et al., 1977）。腫瘍ｌｏｇ細胞死滅値に関して、３１ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇの用量は、それぞれ、高い活性剤であることを示す４．６及び８．３の値をもたらした。
表３．結腸２６腫瘍を有するマウスでのＳＧＲ３０７．ＨＣｌの抗腫瘍活性ａ
ａＳＧＲ３０７．ＨＣｌを示された日に腹腔内注射した。
ｂ腫瘍ｌｏｇ１０細胞死滅＝［（Ｔ−Ｃ）／３．３２］ｘＴｄ（ここで、結腸２６の対照腫瘍倍加時間は２日である。）
ルイス肺癌を有するマウスにおけるＳＧＲ３０７．ＨＣｌの抗腫瘍活性
次いで、抗腫瘍活性を、ルイス肺癌を有するマウスで試験した。図５に示されたデータは、２週連続で週に５日間腹腔内投与した場合に、５０及び５５ｍｇ／ｋｇの用量での重大な増殖遅延を示す。
表４は、これらの用量では毒性はなく、５０及び５５ｍｇ／ｋｇの用量で、それぞれ、４．５及び５．２日の腫瘍増殖遅延で非常に有意な抗癌効果をもたらし得ることを示す。これらの値は、５０及び５５ｍｇ／ｋｇの用量で、それぞれ、３及び５．２の腫瘍ｌｏｇ１０細胞死滅に対応する。この抗癌効果は、高活性であるとしてみなされ得る。
表４．ルイス肺癌を有するマウスにおけるＳＧＲ３０７．ＨＣｌの抗腫瘍活性ａ
ａＳＧＲ３０７．ＨＣｌを示された日に腹腔内注射した。
ｂ腫瘍ｌｏｇ１０細胞死滅＝［（Ｔ−Ｃ）／３．３２］ｘＴｄ（ここで、ルイス肺癌の対照腫瘍倍加時間は２．２日である。）
比較例３
ｐＫＡ、Ｂ１６黒色腫に対する細胞毒性（細胞毒性Ｂ１６）活性、修飾ＨＵＶＥＣ（ＥＡ．ｈｙ９２６）（ＣｍａｒｒＥＡ．ｈｙ９２６）に対する形態学的効果（ラウンディングアップ）、及び化合物ＳＧＲ３０７．ＨＣｌのチューブリン重合阻害（ＩＰＴ）を、先行技術の化合物及びその他の密接に関連する化合物のものと比較した（下記表５参照）。Ｂ１６黒色腫に対する細胞毒性、チューブリン重合、並びに内皮細胞形態を評価するために用いられる試験は、実施例２に記載されたものである。
表５：先行技術の化合物と比較した場合のＳＧＲ３０７の性質及び利点
１ＳＰＡＲＣソフトウエアｈｔｔｐ：／／ａｒｃｈｅｍｃａｌｃ．／ｓｐａｒｃ／
２Ｃｍａｒｒ：修飾ＨＵＶＥＣ（ＥＡ．ｈｙ９２６）に対する形態学的効果（ラウンディングアップ）を、細胞ラウンディングアップが試験化合物での２時間のインキュベーション期間後に観察された最低濃度（μＭ）として示す。
３ＩＰＴ：チューブリン重合阻害
４新たに合成された比較化合物
５Labruere et al. Chem. Med. Chem. 2010, 5, 2016-2025
６ＳＧＲ３０５は窒素上でプロトン化することができない
下記表６は、本発明の化合物の性質及び利点を示す。
表６：本発明の化合物の性質及び利点
これらの結果は、本発明の化合物が、ヒト癌細胞に対する細胞毒性効果（ＩＣ５０Ｂ１６＜２０μＭ）又は強力な抗血管効果（Ｃｍａｒｒ ２ＥＡ．ｈｙ９２６＜１μＭ）を有するか或いは好ましくは両方を有することを示す。
いくつかの構造上の特徴が予期せぬ好ましい効果をもたらすということがこれらの実験から推測することができる：
− 好ましくはＡｒの３位及び５位上の少なくとも２個のＣ１−Ｃ４−アルコキシで置換されたフェニルが、抗血管活性及び腫瘍細胞に対する細胞毒性を向上させる。
− Ｘの−ＣＨ２−又は−ＣＨ２ＣＨ２−、好ましくは−ＣＨ２ＣＨ２−が、化合物の抗血管活性を向上させる。
− Ｒ２及びＲ３が、一緒になって、好ましくは、架橋基−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−又は−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を形成し、より好ましくは架橋基−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−を形成することにより、チューブリン阻害特性及び腫瘍細胞に対する細胞毒性を向上させる。さらに、架橋基−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−及び−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−は、プロトン化の計算ｐＫａで測定されたように血漿溶解度を増加させる。
結論
結論として、合成が容易でもある水溶性化合物ＳＧＲ３０７．ＨＣｌの主な生物学的特性としては、以下のものが挙げられる：
１．ｉｎ ｖｉｔｒｏにてナノモル濃度で独自の作用機構、即ち、内皮細胞のラウンディングアップ及び内皮索の破壊を示す；
２．臨床的に用いられるポドフィルロトキシン類似体（即ち、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（テニポシド又はＶＭ２６、エトポシド又はＶＰ１６、及びエトポシドのプロドラッグであるエトポホス））と比べて、強力なチューブリン重合阻害剤である；
３．マウス癌細胞に対してマイクロモル濃度で細胞毒性がある；
４．いくつかのヒト腫瘍細胞株に対してナノモル濃度でｉｎ ｖｉｔｒｏにて高活性である；
５．ヒト多剤耐性（ＭＤＲ）癌細胞に対して活性である；
６．シスプラチン耐性ヒト癌細胞株に対して活性である；
７．共に薬剤非感受性腫瘍としてみなされる結腸２６癌腫及びルイス肺癌を含む充実性腫瘍を有するマウスにおいて、優れたｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す。

Claims (19)

  1. 式（Ｉ）：
    ［式中、
    Ｘは、−ＣＨ２−又は−ＣＨ２ＣＨ２−を示し；
    Ｒ１及びＲ４は、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキルからなる群から選ばれ；
    Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルチオ、ハロゲン、トリフルオロメチル、ＣＮからなる群から選ばれるか；
    或いは、Ｒ２及びＲ３が、一緒になって、−（ＣＨ２）ｎ−及び−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−からなる群から選ばれる架橋基を形成し、ｎは、３ないし４の整数であり、ｍは、１又は２であり；
    Ａｒは、独立して、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルチオ、ハロゲン、トリフルオロメチル、ＣＮからなる群から選ばれる１〜４個の置換基で置換されていてもよいフェニル又はナフチル基を示す。］
    の化合物、又はその医薬上許容される塩、及び／又はその溶媒和物。
  2. Ａｒが、独立して、ＯＨ及びＣ１−Ｃ４−アルコキシからなる群から選ばれる２個の置換基で置換され、且つ独立して、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルチオ、ハロゲン、トリフルオロメチル、ＣＮからなる群から選ばれる１ないし２個以上の置換基で置換されていてもよいフェニル又はナフチル基を示す請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ２及びＲ３が、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシからなる群から選ばれる請求項１又は２に記載の化合物。
  4. Ｒ２及びＲ３が、一緒になって、架橋基−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−を形成し、ｍが、１又は２であり、Ｒ１及びＲ４が、共に、Ｈを示す請求項１又は２に記載の化合物。
  5. Ｘが、−ＣＨ２ＣＨ２−を示し、Ｒ１及びＲ４が、共に、Ｈを示す前記請求項のいずれかに記載の化合物。
  6. Ａｒが、２又は３個のＣ１−Ｃ４−アルコキシ基で置換されたフェニル基を示す前記請求項のいずれかに記載の化合物。
  7. Ａｒが、３，４，５−トリメトキシフェニル基である前記請求項のいずれかに記載の化合物。
  8. 上記式（Ｉ）の化合物が：
    又はその塩及び／又はその溶媒和物である請求項１ないし７の何れか１項に記載の化合物。
  9. 請求項１ないし８の何れかに記載の化合物、及び医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  10. 組成物の総重量に対して０．０．１％ないし１０重量％の上記式（Ｉ）の化合物を含む請求項９に記載の組成物。
  11. 非経口又は経口経路で投与するための組成物として製剤化される請求項９又は１０の何れかに記載の組成物。
  12. 医薬として使用するための、請求項１ないし８の何れかに記載の化合物、又は請求項９ないし１１の何れかに記載の組成物。
  13. 医薬として、同時に、交互に又は連続的に使用するための、少なくとも：
    − 請求項１ないし８の何れかに定義された上記式（Ｉ）の化合物（好ましくは、その医薬上許容される塩であり、溶媒和物の形態であってもよい。）、及び医薬上許容される賦形剤を含む第一組成物、及び
    − シスプラチン、メトトレキサート、シクロホスファミド、ドキソルビシン、フルオロウラシルのようなその他の抗腫瘍剤を含む第二組成物
    を含むキット。
  14. 細胞毒性薬又は抗血管剤として使用するための、請求項１２に記載の化合物又は組成物、又は請求項１３に記載のキット。
  15. 癌の治療に使用するための、請求項１２又は１４に記載の化合物又は組成物、又は請求項１３又は１４に記載のキット。
  16. 癌が、黒色腫、肺癌、結腸癌、乳癌、脳腫瘍、膵臓癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、及び肝癌からなる群から選ばれる請求項１５に記載の使用のための化合物又は組成物又はキット。
  17. 癌が、多剤耐性癌である、請求項１５又は１６に記載の使用のための化合物又は組成物又はキット。
  18. 単独で、又は電離放射線又は非電離放射線又は温熱療法と同時に、別々に又は順次組み合わせて使用する請求項１５ないし１７の何れかに記載の使用のための化合物又は組成物又はキット。
  19. 以下の連続した工程を含む、請求項１ないし８の何れかに記載の化合物の調製方法：
    ａ） ホルムアルデヒド、１，３−シクロヘキサンジオン又は１，３−シクロペンタンジオン、及びアニリン（ＩＩ）：
    を縮合し、続いて酸化して、中間体（ＩＩＩ）：
    を得る工程；
    ｂ） 中間体（ＩＩＩ）を酸化して、Ｎ−オキシド（ＩＶ）：
    を得る工程；
    ｃ） Ｎ−オキシド（ＩＶ）を塩素化剤と反応させて、中間体（Ｖ）：
    を得る工程；
    ｄ） 中間体（Ｖ）をアニリンＡｒＮＨ２（ＶＩ）と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得る工程；
    ｅ） 得られた式（Ｉ）の化合物を酸で処理して、上記式（Ｉ）の化合物の塩を得る任意の工程。
    ［Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡｒは、請求項１又は２で定義した通りである。］
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