CN106061948A - 水溶性的4‑氮杂鬼臼毒素类似物 - Google Patents

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D.谢尔曼
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Abstract

本发明涉及式(I)的4‑氮杂鬼臼毒素类似物，优选其药学上可接受的盐，任选为溶剂合物的形式，包含所述类似物的组合物，它们作为药物尤其是用于治疗癌症的用途以及它们的制备方法，其中X、R1、R2、R3、R4和Ar如权利要求1所定义。

Description

水溶性的4-氮杂鬼臼毒素类似物
本发明涉及4-氮杂鬼臼毒素类似物、包含所述类似物的组合物、它们作为药物的用途，尤其是用于治疗癌症，以及它们的制备方法。
鬼臼毒素是从植物盾叶鬼臼(Podophyllum peltatum)和桃儿七(Podophyllumemodi)的根和根状茎中提取出的天然木酚素。这个植物毒素抑制微管的组装并对哺乳动物细胞(包括癌细胞)具有毒性。但是，由于严重的副作用(例如恶心、呕吐、腹泻、严重的胃肠毒性和对正常组织的损伤)，在治疗人癌症中使用鬼臼毒素的尝试并不成功。
鬼臼毒素结构和通常的编号
鬼臼毒素的结构特征包括包含五元内酯(环D)、一个芳香环(环B)和具有羟基的环(环C)的多环部分(稠合环ABCD)以及芳基(环E)取代基。应注意，鬼臼毒素包含4个手性中心。
已经进行了鬼臼毒素的广泛结构修饰以获得更有效且毒性更小的抗癌剂，其已通过半合成(hemisynthesis)形成表鬼臼毒素来实现该目的，包括两个临床活性药物，即，依托泊苷(VP16)和替尼泊苷(VM26)。依托泊苷和替尼泊苷均包含在环C羟基取代基上的糖部分，其提高所述化合物的水溶性，从而促进它们的制剂成药。应注意，也研发了依托泊苷的前药–磷酸衍生物(凡毕复(Etopophos))。该磷酸基团大大有助于药物水溶性的提高。
替尼泊苷、依托泊苷及其磷酸盐前药(凡毕复)。
依托泊苷、替尼泊苷和凡毕复旨在治疗多种肿瘤，例如小细胞肺癌、睾丸癌、白血病和淋巴瘤。依托泊苷和替尼泊苷的作用机理完全不同于其母体化合物鬼臼毒素的作用机理，因为它们充当拓扑异构酶II抑制剂且并不抑制微管蛋白的聚合(综述，参见Desbène和Giorgi-Renault，2002。Drugs that inhibit微管蛋白聚合:the particular case ofpodophyllotoxin and analogues.Curr.Med.Chem.Anticancer Agents,2,71-90；Lv,M.,Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 2011,11,901-909；You,Y.,Curr Pharm Des,2005,11,1695-1717)。
其中环C含有氮原子的其他鬼臼毒素类似物(4-氮杂-2,3-二脱氢鬼臼毒素)已经描述于现有技术中(具体参见EP 1 103 554；WO02/094835；WO02/094840；Tratrat等人,Organic Letters 2002，4，3187-3189)。从化学观点来看，所述4-氮杂-2,3-二脱氢类似物呈现出仅具有一个手性中心和稳定的不饱和内酯环的优点。这些抗肿瘤分子是微管蛋白聚合抑制剂且在体外对癌细胞具有非常高的细胞毒性。当所述4-氮杂-2,3-二脱氢鬼臼毒素形成制剂，尤其是用于通过口服或静脉注射途径给药至人时，并不能呈现出令人满意的水溶性(非常重要的参数)。事实上，非常希望得到具有合理的水溶性的类似物，用以轻松配制并提高生物利用性。
发现呈现出与微管蛋白高抑制活性相关的较低细胞毒性的多种衍生物，它们为良好的血管破坏剂(VDA)候选物。事实上，肿瘤生长和转移依赖于肿瘤相关的血管形成。VDA是一类新的抗癌药物，其选择性地破坏肿瘤脉管系统。具体地，它们靶向内皮细胞的细胞骨架，从而阻断癌细胞增殖和通过脉管系统的转移性扩散。迄今为止，目前开发的小分子量VDA主要由微管结合蛋白药物组成。大多数VDA实际上是基于天然化合物来源的引导物。一些化合物目前正处于临床前或临床评价，但是，它们对正常内皮细胞的亲和力以及所观察的临床毒性严重阻碍了它们的发展。因此，有兴趣基于这些天然化合物先导物设计新的VDA以提高它们的疗效并降低它们的全身性毒性。
在所述氮杂鬼臼毒素系列中，具有4-氮杂-1,2-二脱氢鬼臼毒素骨架的第一类似物已经描述(Labruère等人2010Chem.Med.Chem.2010，5，2016-2025；J.Org.Chem.2008，73，3642-3645)，但是它并没有提供感兴趣的体内活性。因此，需要有效的氮杂鬼臼毒素类似物抗肿瘤剂，其是水溶性的，对正常细胞毒性低且其对癌细胞是细胞毒性的并且还破坏肿瘤脉管系统。
申请人已经发现呈现抗肿瘤性质的新的水溶性芳香氮杂鬼臼毒素(4-氮杂-1,2,3,4-四脱氢鬼臼毒素，即增环成环酮的4-芳基氨基喹啉核)类似物，其通过抑制微管蛋白聚合充当抗血管或血管破坏剂。这些药物靶向肿瘤中的新脉管系统，具体是内皮细胞的细胞骨架，从而阻断癌细胞增殖和通过脉管系统的转移性扩散。
因此，本发明涉及所述芳香的氮杂鬼臼毒素(4-氮杂-1,2,3,4-四脱氢鬼臼毒素)类似物，优选其盐形式，其还呈现改善的水溶性并用作抗血管剂，尤其是用于治疗癌症。
因此，在第一方面，本发明涉及式(I)化合物：
其中R1、R2、R3、R4、X和Ar如下所述，优选其药学上可接受的盐，任选地其溶剂合物的形式。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含所述式(I)化合物，优选其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂。
在另一方面，本发明涉及试剂盒，其至少包含：
-第一组合物，其包含所述式(I)化合物，优选其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂，和
-第二组合物，其包含另一抗肿瘤剂，
用于同时、交错(staggered)或连续使用。
在另一方面，本发明涉及式(I)化合物，优选其药学上可接受的盐，或本发明的组合物或试剂盒，其用作药物，特别是用作细胞毒性剂，或抗血管剂，有利地治疗癌症。
在另一方面，本发明涉及组合疗法，其包括向有此需要的患者给药本发明的组合物，用于与放射疗法手术的治疗、热疗治疗或与另一抗癌药物组合的治疗同时、交错或连续使用。
在另一方面，本发明涉及制备本发明化合物的方法。
附图说明
图1.内皮细胞在暴露于1μM浓度的SGR307盐酸盐(SGR307.HCl)(参见下文结构)短短2个小时的时间期限内的典型聚集，与对照组(内皮细胞在暴露于1μM浓度的赋形剂(1％DMSO在细胞培育基中)短短2个小时的时间期限的聚集)相比较。
图2.SGR307.HCl对内皮细胞束的破坏。将内皮形成束(Endothelial preformedcord)暴露于作为内部对照的考布他汀A4(CA4，1μM)、或1和0.5μM的SGR307.HCl 2小时。尽管SGR307.HCl是水溶性的，在该试验中使用DMSO，因为需要溶解用作内部对照的CA4。将所述对照内皮细胞束暴露于1％DMSO。
图3.SGR307.HCl对微管蛋白聚合的抑制。抑制50％聚合的计算浓度是1.09μM。微管蛋白在微管中的组装使用荧光染料DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行，正如生物评估的“材料和方法”部分所述。
图4.SGR307.HCl在患有结肠26癌(colon 26carcinoma)的小鼠中的毒性和抗肿瘤作用。A)在肿瘤移植后的第4、5、11、12、14和15天，腹腔内注射指定剂量的SGR307.HCl所导致的体重变化。B)在相同天所施用的指定剂量所对应的抗肿瘤作用。对照组接受盐水溶液(0.9％氯化钠水溶液)。
图5.SGR307.HCl在患有Lewis肺癌的小鼠中的抗肿瘤作用。在肿瘤移植后的第4-8和11-15天腹腔内注射SGR307.HCl。对照组接受盐水溶液(0.9％氯化钠水溶液)。
本发明涉及式(I)化合物：
其中
X代表-CH2-或-CH2CH2-；
R1和R4独立地选自H、卤素、C1-C4-烷基；
R2和R3独立地选自H、OH、C1-C4烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-烷基硫基、卤素、三氟甲基、CN；
或R2和R3一起形成选自以下的桥连基团：–(CH2)n-和-O-(CH2)m-O-，n为3至4的整数和m为1或2；
Ar代表任选被1-4个独立地选自以下的取代基取代的苯基或萘基：C1-C4-烷基、OH、C1-C4-烷氧基、C1-C4-烷基硫基、卤素、三氟甲基、CN；
或优选其药学上可接受的盐，任选地其溶剂合物的形式。
在具体实施方案中，Ar代表在2位或4位(邻位或对位)被至少一个C1-C4-烷氧基取代基取代的苯基或被至少一个C1-C4-烷氧基取代基取代的萘基，且所述苯基或萘基还任选地被1-3个独立地选自以下的更多的取代基取代：C1-C4-烷基、OH、C1-C4-烷氧基、C1-C4-烷基硫基、卤素、三氟甲基、CN。有利地，在这个实施方案中，Ar代表在2位或4位被至少一个C1-C4-烷氧基取代基取代的苯基，其任选地被1-3个独立地选自以下的更多的取代基取代：C1-C4-烷基、OH、C1-C4-烷氧基、C1-C4-烷基硫基、卤素、三氟甲基、CN。
在优选的实施方案中，Ar代表苯基或萘基(优选苯基)，其被两个独立地选自以下的取代基取代：OH和C1-C4-烷氧基，和任选被1-2个独立地选自以下的更多的取代基取代：C1-C4-烷基、OH、C1-C4-烷氧基、C1-C4-烷基硫基、卤素、三氟甲基、CN。更优选地，Ar代表被三个独立地选自以下的取代基取代的苯基或萘基：OH和C1-C4-烷氧基，和甚至更优选地，Ar代表被三个C1-C4-烷氧基取代的苯基或萘基。
药学上可接受的盐包括衍生自药学上可接受的无机酸和有机酸的那些。合适的酸的实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、硼酸、抗坏血酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、半琥珀酸(hemisuccinic)、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、己酸、马尿酸、庚酸、羟乙磺酸、苯基乙醛酸(phenylglycoxylic)、烟酸、萘-2-硫酸和苯磺酸。其他酸，例如草酸，虽然它们本身不是药学上可接受的，但是可用于制备在获得化合物及其药学上可接受的酸加成盐中用作中间体的盐。优选的药学上可接受的盐包括盐酸盐、乳酸盐、2-羟基乙磺酸盐和甲磺酸盐。
溶剂合物是通过溶剂和溶质(本文为式(I)化合物或其盐)的相互作用所形成的化学络合物。优选的药学上可接受的溶剂合物是水合物和与醇溶剂例如乙醇的溶剂合物。优选地，所述溶剂合物是水合物和/或醇化物，更优选为水合物。
在本发明的框架内，表述“C1-C4-烷基”被理解为包含1-4个碳原子(C1–C4)的直链或支链烃链。包含1-4个碳原子的烷基实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基和异丁基。
在本发明的框架内，表述“C1-C4-烷氧基”被理解为包含1-4个碳原子(C1–C4)的烷氧基链，也就是说与氧原子相连的C1-C4烷基，所述氧原子又与该分子的剩余部分相连。
本文所用术语“卤素”是指氯、溴、碘或氟，优选氯或氟。
优选地，R1和R4独立地选自H、卤素和甲基，甚至更优选地，R1和R4中的至少一个为氢。在优选的实施方案中，R1和R4均表示H。
有利地，R2和R3独立地选自H、OH、C1-C4烷基、C1-C4-烷氧基，或R2和R3一起形成选自以下的桥连基团：–(CH2)n-和-O-(CH2)m-O-，n为3至4的整数和m为1或2。更有利地，R2和R3独立地选自OH、C1-C4烷基、C1-C4-烷氧基，或R2和R3一起形成选自以下的桥连基团：–(CH2)n-和-O-(CH2)m-O-，n为3-6的整数，优选为3或4，和m为1或2。
优选地，Ar代表被1-3个独立地选自以下的取代基取代的苯基：C1-C4-烷基、C1-C4-烷氧基、OH基团，更优选地被两个或三个C1-C4-烷氧基取代，且甚至更优选地，Ar是3,4,5-三甲氧基苯基。
在有利的实施方案中，X代表-CH2CH2-且R1和R4均表示H。
在另一实施方案中，R2和R3一起形成桥连基团–O-(CH2)m-O-，其中m为1或2，并且R1和R4均表示H。在这个实施方案中，本发明化合物经式(Ia)得到最佳描述：
其中X和Ar如上所述且m是1或2。
在优选的实施方案中，本发明涉及式(Ib)化合物：
其中X和Ar如上所述。
在其他优选实施方案中，本发明涉及式(Ic)化合物：
其中Ar如上文所述。
具体地，本发明化合物是：
优选为
更优选地为
或其盐，优选为其盐酸盐、乳酸盐、2-羟基乙磺酸盐和甲磺酸盐，和更优选地为其盐酸盐，任选为其溶剂合物的形式。
优选地，本发明化合物是：
也称为SGR307，
或其盐，优选为其盐酸盐、乳酸盐、2-羟基乙磺酸盐和甲磺酸盐，和更优选地为其盐酸盐。
本发明所预期的化合物仅为本领域技术人员理解为“化学稳定的”那些化合物。
本发明包括式(I)化合物的药学上可接受的衍生物。“药学上可接受的衍生物”是指任意药学上可接受的盐或任意其他化合物，一旦将其给药至患者，其能够提供(直接或间接)用于本发明的化合物或其药理学活性代谢物或药理学活性残余物。药理学活性代谢物应理解为是指能够经酶或化学产生的本发明任意化合物。这包括，例如，本发明羟基化或氧化衍生的化合物或其共轭物。
此外，本发明范围内的是本发明化合物的前药的用途。前药包括那些化合物，其一旦进行简单的化学转化，便会经改变以产生本发明化合物。简单的化学转化包括水解、氧化和还原。具体地，当将前药给药至患者时，所述前药可被转化成上文公开的化合物，从而产生所需的药理学作用。
式(I)化合物可使用下述一般合成方法制备，所述一般合成方法构成本发明的一部分。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含作为活性成分的至少一个式(I)化合物，优选为其药学上可接受的盐，任选为溶剂合物的形式，以及药学上可接受的赋形剂。
本发明药物组合物可为，例如，通过口服或胃肠外途径，优选胃肠外途径，具体为静脉内途径给药的组合物。
给药的第一优选途径是口服途径。通过口服途径给药的组合物的实例包括片剂、明胶胶囊、颗粒、微球体、纳米乳剂、脂质体、粉末和口服溶液或混悬液。
另一优选的给药途径是胃肠外，例如静脉内途径。事实上，本发明化合物在水溶液中是可溶的，有利地，它们在水中呈现大于5g/L，优选大于10g/L的溶解度。例如，本发明化合物具有5-10g/L的溶解度。例如，本发明化合物(优选作为盐)，可配制于水溶液中，例如于5％葡萄糖/水混合物、醇/聚山梨酯80/水溶剂(特别是乙醇//水和甘露醇/水)混合物中或辅助以适用于在人中给药的环糊精，其通常用于经静脉内途径给药。本发明化合物，优选作为盐，还可被配制成纳米乳剂或脂质体。因此，本发明组合物可通过静脉内途径给药。从而，在具体实施方案中，本发明的组合物被配制成可注射溶液。
本发明组合物通常含有0.01％-10％重量，优选0.1％-5％重量的所述式(I)化合物，相对于该组合物的总重。
本发明组合物还可含有另一活性物质。
在另一方面，本发明涉及试剂盒，其至少包含：
-第一组合物，其包含所述式(I)化合物和药学上可接受的赋形剂，和
-第二组合物，其包含另一抗肿瘤剂，例如顺铂、甲氨蝶呤、环磷酰胺、多柔比星、氟尿嘧啶，
用于同时、交替或连续使用。
本领域技术人员在考虑了待治疗的肿瘤或癌症的性质和阶段、以及待治疗患者的年龄、性别、体重和敏感性之后，当然会选择包含另一抗肿瘤剂的第二组合物。
在一个实施方案中，本发明的化合物或组合物或试剂盒可单独使用或与电离或非电离辐射或热疗同时、分开或连续组合使用。
在另一方面，本发明涉及式(I)化合物、本发明的组合物或试剂盒，其用作药物，具体地用作细胞毒性剂、抗血管剂或用于治疗癌症。
应注意，式(I)化合物、本发明的组合物或试剂盒可用于治疗癌症，具体选自黑色素瘤、肺癌、结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑瘤、胰腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、肝癌、卵巢癌，优选地为黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌和结肠癌，更优选地选自卵巢癌、黑色素瘤、肺癌和结肠癌。
在具体实施方案中，所述癌症是多重耐药的癌症。例如，所述癌症可为耐顺铂的。
根据另一方面，本发明还涉及治疗上述疾病的方法，其包括向有此需要的患者给药有效剂量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或本发明组合物，优选通过胃肠外，具体地通过静脉内或口服途径。本发明化合物的有效剂量取决于许多参数，例如，所选择的给药途径、待治疗个体的体重、年龄、性别、所治疗病状的情况和敏感性。
在另一方面，本发明涉及组合疗法，其包括向有此需要的患者给药本发明的组合物，用于与放射疗法、手术或热疗的治疗同时、交替或连续使用。
根据另一方面，本发明涉及式(I)化合物或本发明的组合物在制备药物，具体地为细胞毒性剂、抗血管剂，优选用于治疗癌症(具体地为上述疾病)的药物中的用途。
式(I)化合物在体外在纳摩尔浓度诱导内皮细胞的聚集和内皮束的破坏。本发明式(I)化合物还抑制微管蛋白的聚合。它们在微摩尔浓度对鼠科和人癌细胞具有细胞毒性，其活性水平与考布他汀A4(CA4)相当。它们对多重耐药的(MDR)人癌细胞，具体地对耐顺铂的人癌细胞系也是有活性的。本发明式(I)化合物在患有实体瘤的小鼠中也显示出体内抗肿瘤活性。
本发明还提供了制备本发明式(I)化合物的方法。在所有反应式中，除非另外提及，R1、R2、X和Ar如上所述。
最佳反应条件和反应时间可根据所用的具体反应物而变化。除非另外提及，溶剂、温度、压力和其他反应条件可由本领域技术人员容易地进行选择。在合成性实施例部分中提供了具体步骤。通常，如果需要的话，反应进程可由薄层色谱(TLC)或LC-MS监测，且中间体和产物可通过硅胶色谱和/或重结晶进行纯化。
用于制备本发明式(I)化合物的方法包括以下连续步骤：
a)将甲醛、1,3-环己二酮或1,3-环戊二酮和苯胺(II)缩合：
然后氧化，得到中间体(III)：
b)氧化中间体(III)以得到N-氧化物(IV)：
c)将N-氧化物(IV)与氯化剂反应，得到中间体(V)：
d)将中间体(V)与苯胺ArNH2(VI)反应以得到式(I)化合物；
e)任选地将所得的式(I)化合物用酸处理以获得所述式(I)化合物的盐
有利地，a)中的三成分反应的子步骤(将甲醛、1,3-环己二酮或1,3-环戊二酮和苯胺(II)缩合)是一锅法反应。
步骤a)的缩合子步骤可在回流乙醇中有利地进行。
在a)的氧化子步骤中的氧化剂是二氧化锰、二甲亚砜、2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-quinone)，更优选为二氧化锰。
优选地，步骤b)中的氧化剂是乙酸-过氧化氢混合物或间氯过苯甲酸，更优选为间氯过苯甲酸。
有利地，步骤c)中的氯化剂是五氯化磷、三氯氧磷或亚硫酰氯，更优选为三氯氧磷。
有利地，步骤a)中的苯胺(II)是3,4-二甲氧基苯胺、3,4-二甲基苯胺或6-氨基-1,4-苯并二噁烷，更优选为5-氨基-1,3-苯并二氧杂环戊烯。
有利地，步骤d)中的苯胺(VI)是3,4,5-三甲氧基苯胺、3,4-二甲氧基苯胺、3,4-亚甲基二氧基苯胺、3,5-二甲氧基苯胺、3-甲氧基-或4-羟基-3-甲氧基苯胺，更优选为3,4,5-三甲氧基苯胺。
以下实施例旨在说明本发明，而不是为了以任意方式限制其范围。下面的实施例是说明性的且，正如本领域技术人员所理解，具体试剂或条件可根据单个化合物所需进行修改而无需过度实验。在下文反应式中所用的起始原料和中间体是市售可得的或由本领域技术人员从市售可得的材料容易地制备。
实施例
实施例1：6,7-(亚甲基二氧基)-9-[(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基]-3,4-二氢吖啶-1(2H)-酮盐酸盐(SGR307.HCl)的合成
SGR307.HCl的合成
步骤1：
6,7-(亚甲基二氧基)-3,4-二氢吖啶-1(2H)-酮(4)
将3,4-(亚甲基二氧基)苯胺1(6.17g)、多聚甲醛3(1.35g)和环己烷-1,3-二酮2(5.04g)在EtOH(220mL)中的等分子(equimolecular)(45mmol)混合物回流1.5h。一半的溶剂在减压下除去并将所得固体过滤掉。向该二氢化合物和芳香化合物的混合物(7.56g)在二氯甲烷(1.60L)中的溶液中加入活化的MnO2(85％纯度)(6.74g)。在室温搅拌1.5小时后，将该反应混合物通过硅藻土垫过滤并将该溶剂除去以提供分析纯的4，其为白色粉末(7.22g，66％)。mp:210℃；1H NMR(300MHz，DMSO-d6):δ＝2.12(q，J＝6Hz，2H，3-H)，2.69(t，J＝6Hz，2H，2-H)，3.13(t，J＝6Hz，2H，4-H)，6.25(s，2H，O-CH2-O)，7.33(s，1H，5-H)，7.50(s，1H，8-H)，8.63(s，1H，9-H)。
步骤2
6,7-(亚甲基二氧基)-10-氧基-3,4-二氢吖啶-1(2H)-酮(5)
向吖啶4(1.91g，7.9mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液中加入间氯过苯甲酸(70％纯)(3.91g，15.8mmol)。在室温搅拌72h后，加入1M氢氧化钠的溶液(160mL)并将该反应混合物剧烈搅拌10分钟。然后将该水层用二氯甲烷(2x 50mL)萃取。将合并的有机相用水洗涤直至达到中性pH，用Na2SO4干燥，过滤，然后将该溶剂减压除去以得到5，其为黄色粉末(1.40g，68％)，将其用于下一步中而无需其他纯化。将样品用快速硅胶色谱(二氯甲烷/甲醇95/5)纯化，以用于元素分析。mp:262℃；1H NMR(300MHz，DMSO-d6):δ＝2.13(q，J＝6.2Hz，2H，3-H)，2.67(t，J＝6.2Hz，2H，2-H)，3.18(t，J＝6.2Hz，2H，4-H)，6.31(s，2H，O-CH2-O)，7.63(s，1H，8-H)，7.86(s，1H，5-H)，8.23(s，1H，9-H)。
步骤3
9-氯-6,7-(亚甲基二氧基)-3,4-二氢吖啶-1(2H)-酮(6)
向吖啶N-氧化物5(1.36g，5.2mmol)在二氯甲烷(250mL)中的溶液中加入POCl3(5.9mL，63.6mmol)。回流48h后，加入水(100mL)，然后加入饱和NaHCO3水溶液直至pH达到8。在用二氯甲烷(2x 100mL)萃取水层后，将有机相用水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，然后将该溶剂减压除去以提供6，其为亮棕色粉末(1.33g，93％)，将其用于下一步中而无需其他纯化。样品用快速硅胶色谱(二氯甲烷)纯化。Mp:214℃；1H NMR(300MHz，DMSO-d6):δ＝2.21(q，J＝6.4Hz，2H，3-H)，2.81(t，J＝6.4Hz，2H，2-H)，3.25(t，J＝6.4Hz，2H，4-H)，6.19(s，2H，O-CH2-O)，7.29(s，1H，5-H)，7.70(s，1H，8-H)。
步骤4
6,7-(亚甲基二氧基)-9-(3,4,5-三甲氧基苯基氨基)-3,4-二氢吖啶-1(2H)-酮，盐酸盐(SGR 307.HCl)
将氯吖啶6(698mg，2.53mmol)和3,4,5-三甲氧基苯胺(7)(510mg，2.78mmol)在EtOH(350mL)中的混合物回流5h。将溶剂减压蒸发，将所得沉淀物过滤掉，和然后从EtOH中重结晶以提供SGR 307.HCl，其为淡黄色粉末(848mg，73％)。mp:244-246℃；1H NMR(300MHz，DMSO-d6):δ＝2.16(q，J＝6.1Hz，2H，3-H)，2.79(t，J＝6.1Hz，2H，2-H)，3.30(t，J＝6.1Hz，2H，4-H)，3.70(s，3H，4’-OMe)，3.72(s，6H，2x OMe)，6.26(s，2H，O-CH2-O)，6.72(s，1H，8-H)，6.75(s，2H，2’-H et 6’-H)，7.56(s，1H，5-H)，12.73(s，1H，NH)，15.15(s，1H，10-H)；HRMS(ES+):m/z计算值C23H23N2O6[M+]:423.1556，实测值：423,1508。
使用类似的方案，改变起始原料，制备了其他的类似物。也已经使用SPARC软件(http://archemcalc./sparc/)计算了这些化合物质子化的pKa：
实施例2SGR307.HCl的体外和体内抗肿瘤活性
用于生物评估的材料和方法
内皮细胞形态学评估
为了评估化合物对内皮细胞形态学的影响，使用EAhy 926内皮细胞系，其衍生自人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与永生人细胞系A549的融合物(Edgell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1983，卷80，12期，3734-3737)。所述EAhy 926细胞系被认为良好地代表了天然HUVEC，因为它表达母体HUVEC的绝大多数生化标记物(Bouis等人.，Angiogenesis.，2001，4，91-102)。EAhy 926细胞生长在潮湿环境(37℃，5％CO2)下的含有2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM中。将指数生长的EAhy 926细胞以5000个细胞/100μL/孔平板接种于96孔板中。平板接种后24小时，将培养基吸出，并将100μL的含有测试化合物的培养基加至含有细胞的孔中(一式三份)并培养2h(37℃，5％CO2)。所用的最高浓度是100μM，然后通过连续两倍稀释降低至低纳摩尔浓度(根据最具形态学活性的化合物的需要)。2h-培养期之后，以100X和200X的放大倍数拍摄各孔代表性中心区域的数码照片。结果表示为可引起区域中超过15％的细胞聚集的最低浓度，以便排除正常的有丝分裂细胞(其在对照的1％DMSO处理细胞中小于15％)。在相同板中的一式三份浓度按常规进行。CA4作为阳性内标包括在该试验中。
内皮细胞束破坏测试
将Eahy 926内皮细胞接种到6孔板的基质胶层并使其形成微血管结构共48h(束)。该束暴露于从0.005-100μM的不同浓度的SGR307.HCl和1μM的考布他汀A4(CA4)共2小时。在该实验中，所用的对照溶剂是1％DMSO最终该浓度，因为需要这个溶剂来溶解作为阳性内部对照所用的考布他汀A4。在药物施用前和施用之后两小时对相同板区域拍摄数码照片。
微管蛋白的聚合抑制测试
微管中的微管蛋白组装是使用荧光染料DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)(Bonne等人.，J.Biol.Chem.，1985，260，2819-2825)如所述那样在96-孔板形式中进行的(Bane等人在Zhou，J.(编辑)，Microtubule Protocols.Humana Press,Totowa,New Jersey,2007,281-288；Barron等人,Anal.Biochem.,2003,315,49-56)。所述标准测试按如下进行：向孔中装入于含10μM DAPI和不同浓度的测试化合物的PME缓冲液(100mM PIPES(1,4-哌嗪双(乙磺酸)；1mM MgSO4；2mM EGTA)中的微管蛋白(细胞骨架，97％纯，最终浓度1mg/ml)，其使用30μM秋水仙素作为阳性内标对照。用于测试化合物的最终浓度在30μM起始并以3倍递减稀释直至观察不到抑制。各浓度在孔中一式三份地进行。在室温预培养45min后，将1mM GTP(5μL)加至各孔以引发微管蛋白的聚合，然后将该板转移至恒温Victor板读取器上，在37℃再保持2h。然后在360nm的激发波长和450nm的发射波长下读取荧光。按如下确定抑制百分比：1-(ΔF(样品/ΔF(对照)X 100，其中ΔF对照＝F(无抑制)-F(完全抑制)，和ΔF样品＝F(样品)-F(用秋水仙素完全抑制)。化合物-诱导的对微管蛋白聚合的抑制的IC50是抑制聚合的程度达最大值的50％时的浓度，这是从抑制百分比与药物浓度的对数的函数的半对数图确定的，其使用非线性回归程序SigmaPlot(Jandel Scientific)拟合为具有不同斜率的S形曲线模型。在这些条件下，秋水仙素抑制微管蛋白聚合的IC50值是0.36μM。
鼠科癌细胞的细胞毒性测试
鼠科B16黑色素瘤细胞、Lewis肺癌细胞和结肠26癌细胞生长于含有2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中(37℃，5％CO2)。SGR307.HCl和本发明其他化合物以2.5mg/mL的原液浓度溶于水中并进一步稀释于细胞培养基中。将指数生长的细胞以每孔5000个细胞平板接种于96-孔板的100μL培养基中。平板接种24h后，将100μl含最终浓度范围是0.01-100μM的测试化合物的培养基加至含该细胞的孔中(一式三份)并在37℃和5％CO2培养48h。在暴露于测试化合物48h之后，使用MTT(甲基噻唑四唑鎓盐)测试(Scudiero等人.，Cancer Res.1988，48，4827-4833)来测定细胞存活并在微量培养板读取器(BioKinetics Reader，EL340)上在562nm处读取吸光度。运行仅用DMEM的合适的对照以及用MTT的合适的对照以减去背景吸光度。使用GraphPad Prism软件确定抑制50％细胞存活的化合物的浓度(50％细胞受到抑制的浓度或IC50)。
人癌细胞的细胞毒性测试
在75cm2烧瓶中，在5％CO2下，人细胞生长于存在青霉素、链霉素和两性霉素B(Fungizone)的补充有10％胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培养基中。将细胞以650个细胞/孔的密度将细胞平板接种于96-孔组织培养微量培养板的200μl培养基中并随后使用自动化Benchstation(Beckman Biomek 3000)将其用溶于DMSO的化合物处理24h，化合物的浓度范围是0.5–10μM。对照与测试孔接收相同体积的DMSO(1％最终浓度)。72h的暴露时间后，加入MTS试剂(Promega)并在37℃培养3h并在490nm读取吸光度。结果表示为按所述比例[(处理的OD490/对照的OD490)×100]计算的细胞增殖的抑制。对于IC50测定(50％细胞增殖的抑制)，在两个独立的试验中以一式两份进行试验。
在患有肿瘤的小鼠中的抗肿瘤活性评估
雌性C57BL/6和BALB/c小鼠购自Janvier(Le Genest Saint Isle，France)。在治疗开始时小鼠重18g以上且自由进食和饮水。鼠科肿瘤通过在适合的小鼠品系来源中连续传代进行维持，即，结肠肿瘤26(CT26)在Balb/c小鼠中传代(Corbett等人,CancerRes.1975,35,2434-24391975；Corbett等人,Cancer 1977 40,2660-2680)和Lewis肺癌(Mayo等人,Cancer Chemotherapy Reports Part 2Supplement,1972,vol 3,issue 1,325-330)维持在C57BL/6小鼠中。
所用的方案设计、化学疗法技术和方法是根据(Corbett等人,Cancer Res,1982,42,1707-1715；Schabel等人,Pharmacology&Therapeutics Part A-ChemotherapyToxicology and Metabolic Inhibitors,1977,1,411-435)实施的。简而言之，在第1天将肿瘤皮下(s.c.)和两侧植入。将动物随机分配到治疗组(T)或对照组(C)。使用卡尺测量肿瘤，每周2-5次(根据肿瘤生长速率)直至肿瘤达到2500mm3。肿瘤体积通过使用以下公式从二维测量结果进行评估：肿瘤体积(mm3)＝[长度(mm)×宽度2(mm2)]/2。小鼠体重每周记录2-3次。记录死亡的日期，且肉眼检查胸腔和腹腔以评估可能的死亡原因。
用于体内给药的SGR307.HCl制剂
SGR307.HCl是通过稀释于无菌水、生理盐水或0.5％葡萄糖中制备的并腹膜内(i.p.)给药200μl体积。在治疗开始时根据体重调整药物剂量。在各试验中进行剂量-响应评估以确定最高无毒剂量(HNTD)，其定义是诱导小于20％体重降低且无药物相关死亡的最高药物剂量。动物体重包括肿瘤重量。
用于评估抗肿瘤活性所用的终点
肿瘤生长抑制(T/C值)。对于早期疾病，这是用于确定抗肿瘤活性的广泛使用的标准。治疗组(T)和对照组(C)的肿瘤体积在同一天进行测定。当对照组(C)的中位肿瘤体积达到750-1500mm3的范围时，确定治疗组(T)的中位肿瘤体积，包括零。按如下进行T/C百分比值的计算：
[％T/C＝(治疗组的中位肿瘤体积/对照组的中位肿瘤体积)×100]。根据美国国家癌症研究所的标准，T/C≤42％被认为是最低水平的活性。T/C<10％被认为是高抗肿瘤活性水平，其证明了进一步的发展。
肿瘤生长延迟(T-C值)。所述肿瘤生长延迟被定义为治疗组(T)和对照组(C)在到达预定肿瘤体积(750–1000mm3)的天数上的中位差异。从这些计算中排除无肿瘤幸存患者并单独制表。该值量化了肿瘤细胞杀灭，如下文所定义。
肿瘤倍增时间(Td)。Td(以天为单位)是通过在指数阶段(范围100–1000mm3)的对照组肿瘤的对数线性肿瘤生长图的最佳拟合直线估计的。
肿瘤对数细胞杀灭的计算。对于皮下生长的肿瘤，所述对数细胞杀灭值按Schabel等人所述进行计算。(Schabel等人.，1977)，其使用下式：[(T-C)/3.32]x Td，其中所述T-C值和Td分别是肿瘤生长延迟和肿瘤倍增时间，如上文所定义。
抗肿瘤活性评估所用的标准。抗肿瘤活性使用对数细胞杀灭值≥0.7进行评估，这是由Southern Research Institute(SRI)的科学家最初定义的(Schabel等人.，1977)。基于对数细胞杀灭值使用以下SRI分数评估抗肿瘤活性，如下：<0.7＝-(无活性)；0.7–1.2＝+；1.3–1.9＝++；2.0–2.8＝+++；>2.8＝++++(高活性)。完全肿瘤消退(CR)被定义为低于触诊极限(～62mm3)的肿瘤消退。在研究结束时无可触摸的肿瘤的动物被认为是无肿瘤幸存患者(TFS)并从该T-C值计算中排除。
体外生物学评估的结果
SGR307.HCl和其他本发明化合物对内皮细胞形态学的影响
本发明化合物首先在EAhy 926内皮细胞上进行测试，所述EAhy 926内皮细胞是转化的HUVEC(人脐静脉内皮细胞)。这些细胞在暴露于血管破坏剂(例如考布他汀A4)短短2小时后发生聚集。图1显示了暴露于1μM浓度的SGR307.HCl短短2小时的暴露时间内，内皮细胞的典型聚集。在低至0.06μM的浓度观察到显著的内皮细胞聚集。
SGR307.HCl对内皮束的影响
抗血管剂的另一典型作用是破坏生长在基质胶层的已形成的内皮细胞束。SGR307.HCl对形成的内皮细胞束的影响呈现于图2。SGR307.HCl对内皮束的破坏可在低至0.5μM的浓度在持续2小时的暴露时间下观察到。事实上，SGR307.HCl可能如1μM的考布他汀A4一样有效地破坏内皮细胞束，所述考布他汀A4作为内部对照包括在内。
SGR307.HCl和其他本发明化合物抑制微管蛋白的聚合
由于内皮细胞的聚集以及内皮细胞束的破坏均意味着细胞骨架结构的快速破坏，因此我们接下来测试了本发明化合物在体外对微管蛋白聚合的影响。图3显示了SGR307.HCl对微管蛋白聚合的影响。可以观察到，SGR307.HCl抑制微管蛋白聚合的IC50为1.09μM。在相同实验条件下，标准微管蛋白聚合抑制剂鬼臼毒素、秋水仙素和考布他汀A4呈现的IC50分别是0.22μM、0.36μM和0.29μM。
SGR307.HCl和其他本发明化合物对鼠科癌细胞的细胞毒性
SGR307.HCl的细胞毒性活性在3种鼠科肿瘤细胞(即，B16黑色素瘤、Lewis肺癌和结肠26癌)中进行测定。表1中呈现的结果显示以下IC50值：针对B16、Lewis肺和结肠26细胞分别是4.5μM、10.6μM和1.2μM。
表1.SGR307.HCl对鼠科癌细胞的细胞毒性。
鼠科癌症细胞系a IC50值(μM)b
B16黑色素瘤 4.5
Lewis肺癌 10.6
结肠26癌 1.2
a鼠科癌细胞系生长于DMEM中，如“材料和方法”部分所述。
b在48小时的暴露时间内杀灭50％细胞的SGR307.HCl的浓度。使用MTT试剂测定存活力。
SGR307.HCl对人癌细胞的细胞毒性
进一步使用一大组人癌细胞系(包括绝大多数重要的癌症类型，以及多重耐药系、激素-敏感系和激素-耐药系)评估l SGR307.HCl的细胞毒性活性是。
表2提供了这些测试的IC50。纳摩尔浓度的SGR307.HCl对所有细胞系均具有活性，其具有相对低的IC50值，其范围是30-380nM。
表2.SGR307.HCl对人癌细胞的细胞毒活性。a
a将细胞暴露72并使用MTS试剂测定活细胞数。IC50值被计算成化合物使50％细胞增殖受到抑制的浓度。
值得注意的是，所有乳腺癌系对SGR307.HCl敏感，无论事实上它们是否是多重耐药或是否是雌激素受体阳性的。有趣的是，如MCF7R和HL60R细胞系所示，相比于它们的敏感性对应物(MCF7和HL60)，所述多重耐药细胞系保留对SGR307敏感。
结肠细胞系、白血病系、肝和肾系均对SGR307相当敏感。可能唯一的例外是LnaCap细胞系，其是雄激素依赖的前列腺癌细胞系，其对该化合物不那么敏感，其IC50是330-380nM。但是，独立于雄激素的PC3前列腺癌对SGR307.HCl非常敏感(120-130nM)。
还值得注意的是，耐顺铂的卵巢细胞系A2780cis对SGR307敏感。
有趣的是，所述静止细胞系EPC对化合物并不敏感，其IC50值为310和360nM。
总而言之，SGR307.HCl呈现出对绝大多数所检测的人癌细胞系非常有利的敏感性质。
体内抗肿瘤活性的结果
SGR307.HCl在患有结肠26癌的小鼠中的抗肿瘤活性
图4呈现出在肿瘤移植后第4、5、11、12、14和15天，以31、50和80mg/kg的药物剂量腹膜内(i.p.)注射的SGR307.HCl在患有结肠26小鼠中的抗肿瘤作用。如图4-A可见，所述80mg/kg剂量是有毒的，导致超过20％的体重降低，而所述31和50mg/kg无毒并在该研究过程中使得体重增加。
抗癌活性在31和50mg/kg剂量水平显著，如图4-B所示。针对所述31mg/kg剂量观察到7.7天肿瘤生长延迟(T-C)和针对所述50mg/kg剂量观察到13.7天肿瘤生长延迟(表3)。根据实体瘤活性常用的标准(Schabel等人.，1977)，这些T-C值表明是高活性剂。就肿瘤细胞杀灭对数值而言，所述31mg/kg和所述50mg/kg剂量分别提供4.6和8.3值，其表明是高活性剂。
表3.SGR307.HCl在患有结肠26肿瘤的小鼠中的抗肿瘤活性。a
a在指定天腹膜内注射SGR307.HCl。
b肿瘤log10细胞杀灭＝[(T-C)/3.32]x Td，其中所述对照组的肿瘤26肿瘤倍增时间是2天。
SGR307.HCl在患有Lewis肺癌的小鼠中的抗肿瘤活性
接下来在患有Lewis肺癌的小鼠中检测抗肿瘤活性。图5描述的数据显示当连续2周每周腹膜内给药5天时，50mg/kg和55mg/kg剂量的重要生长延迟。
表4显示了这些剂量不具毒性且对于50和55mg/kg剂量可分别产生4.5天和5.2天肿瘤生长延迟的高度显著的抗癌作用。对于50和55mg/kg剂量，这些值分别对应的是3和5.2的肿瘤log10细胞杀灭。这个抗癌作用可被定义为高活性。
表4.SGR307.HCl在患有Lewis肺癌的小鼠中的抗肿瘤活性。a
a在指定天腹膜内注射SGR307.HCl。
b肿瘤log10细胞杀死＝[(T-C)/3.32]x Td，其中针对肿瘤Lewis肺癌所述对照组的肿瘤倍增时间是2.2天。
比较实施例3
已经将化合物SGR307.HCl的pKA、对B16黑色素瘤的细胞毒性(细胞毒性B16)活性、对修饰的HUVEC(EA.hy 926)(Cmarr EA.hy 926)的形态学影响(聚集)和对微管蛋白的聚合(IPT)的抑制与现有技术化合物和其他密切相关的化合物相比较(参见下表5)。用于评估对B16黑色素瘤的细胞毒性、微管蛋白的聚合以及内皮细胞形态学的测试如实施例2中所描述的那些。
表5:与现有技术化合物比较，SGR 307的性质和优势
1SPARC软件http://archemcalc./sparc/
2Cmarr.：对修饰的HUVEC(EA.hy 926)的形态学作用(聚集)被表示为在用测试化合物培养2h后观测到细胞聚集的最低浓度(μM)。
3IPT：微管蛋白聚合的抑制
4新合成的对比化合物
5Labruère等人.Chem.Med.Chem.2010，5，2016-2025
6SGR 305无法在氮上被质子化。
下表6呈现了本发明化合物的性质和优势
表6：本发明化合物的性质和优势
这些结果表明，本发明化合物对人癌细胞具有细胞毒性作用(IC50B16<20μM)或具有有效的抗血管作用(Cmarr 2EA.hy 926<1μM)或优选具有二者。
可从这些实验中推导出：一些结构特征产生了意料不到和优选的效果：
-优选在3位和5位被至少两个C1-C4-烷氧基取代的苯基作为Ar，因为它提高了抗血管活性和针对肿瘤细胞的细胞毒性
--CH2-或-CH2CH2-且优选-CH2CH2-作为X，因为它提高了化合物的抗血管活性。
-优选R2和R3一起形式桥连基团–O-CH2-O-或–O-CH2-CH2-O-且更优选为桥连基团–O-CH2-O-，从而提高微管蛋白抑制性质和针对肿瘤细胞的细胞毒性。此外，所述桥连基团–O-CH2-O-和–O-CH2-CH2-O-提高了血浆溶解度，正如质子化的pKa计算值所测量的。
总结
总而言之，SGR307.HCl(水溶性化合物，其也易于合成)的主要生物特性包括以下：
1.其显示出不寻常的作用模式，即在体外在纳摩尔浓度下的内皮细胞聚集和内皮束破坏作用；
2.它是强效微管蛋白聚合抑制剂，与临床所用的鬼臼毒素类似物相反，其是拓扑异构酶II抑制剂(替尼泊苷或VM26、依托泊苷或VP16和作为依托泊苷前药的凡毕复)；
3.它在微摩尔浓度对鼠科癌细胞具有细胞毒性；
4.它在体外在纳摩尔浓度下对多种人肿瘤细胞系是高活性的；
5.它对人多重耐药的(MDR)癌细胞具有活性；
6.它对耐顺铂的人癌症细胞系具有活性；
7.它在患有实体瘤(包括结肠26癌和Lewis肺癌，这两者被视为药物不敏感的肿瘤)的小鼠中显示出显著的体内抗肿瘤活性。

Claims (19)

1.式(I)化合物：
其中
X代表-CH2-或-CH2CH2-；
R1和R4独立地选自H、卤素、C1-C4-烷基；
R2和R3独立地选自H、OH、C1-C4烷基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-烷基硫基、卤素、三氟甲基、CN；
或R2和R3一起形成选自以下的桥连基团：–(CH2)n-和-O-(CH2)m-O-，n为3至4的整数和m为1或2；
Ar代表苯基或萘基，其任选被1-4个独立地选自以下的取代基取代：C1-C4-烷基、OH、C1-C4-烷氧基、C1-C4-烷基硫基、卤素、三氟甲基、CN，
或其药学上可接受的盐，和/或其溶剂合物。
2.权利要求1的化合物，其中Ar代表苯基或萘基，其被两个独立地选自以下的取代基取代：OH和C1-C4-烷氧基，和任选被一个或两个独立地选自以下的更多的取代基取代：C1-C4-烷基、OH、C1-C4-烷氧基、C1-C4-烷基硫基、卤素、三氟甲基、CN。
3.权利要求1或2的化合物，其中R2和R3独立地选自H、OH、C1-C4烷基、C1-C4-烷氧基。
4.权利要求1或2的化合物，其中R2和R3一起形成桥连基团-O-(CH2)m-O-，m为1或2且R1和R4均代表H。
5.前述权利要求中任一项的化合物，其中X代表-CH2CH2-且R1和R4均代表H。
6.前述权利要求中任一项的化合物，其中Ar代表被两个或三个C1-C4-烷氧基取代的苯基。
7.前述权利要求中任一项的化合物，其中Ar是3,4,5-三甲氧基苯基。
8.权利要求1-7中任一项的化合物，其中所述式(I)化合物是：
或其盐和/或其溶剂合物。
9.药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项的化合物和药学上可接受的赋形剂。
10.权利要求9的组合物，其中其含有0.01％-10％重量的所述式(I)化合物，相对于该组合物的总重计。
11.权利要求9或10中任一项的组合物，其中其被配制成用于胃肠外或口服途径给药的组合物。
12.权利要求1-8中任一项的化合物或权利要求9-11中任一项的组合物，其用作药物。
13.试剂盒，其至少包含：
-第一组合物，其包含权利要求1-8中任一项所定义的所述式(I)化合物和药学上可接受的赋形剂，所述化合物优选为其药学上可接受的盐，任选地为溶剂合物的形式，和
-第二组合物，其包含另一抗肿瘤剂，例如顺铂、甲氨蝶呤、环磷酰胺、多柔比星、氟尿嘧啶，
用于作为药物同时、交错或连续使用。
14.权利要求12的化合物或组合物或权利要求13的试剂盒，其用作细胞毒性剂或抗血管剂。
15.权利要求12或14的化合物或组合物或权利要求13或14的试剂盒，其用于治疗癌症。
16.如权利要求15所用的的化合物或组合物或试剂盒，其中所述癌症选自黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、脑瘤、胰腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤和肝癌。
17.如权利要求15或16所用的的化合物或组合物或试剂盒，其中所述癌症是多重耐药的癌症。
18.如权利要求15-17中任一项所用的的化合物或组合物或试剂盒，其中其单独使用或与离子化或非离子化放射疗法或热疗组合，同时、分开或连续使用。
19.用于制备权利要求1-8中任一项的化合物的方法，其包括以下连续步骤：
a)将甲醛、1,3-环己二酮或1,3-环戊二酮和苯胺(II)缩合：
然后氧化，得到中间体(III)：
b)氧化中间体(III)以得到N-氧化物(IV)：
c)将N-氧化物(IV)与氯化剂反应，得到中间体(V)：
d)将中间体(V)与苯胺ArNH2(VI)反应以得到式(I)化合物；
e)任选地将所得式(I)化合物用酸处理以得到所述式(I)化合物的盐
其中X、R1、R2、R3、R4和Ar如权利要求1或2所定义。
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