ES2703167T5 - Uso de una laminina para diferenciar células pluripotentes en células de linaje hepatocitario - Google Patents

Uso de una laminina para diferenciar células pluripotentes en células de linaje hepatocitario Download PDF

Info

Publication number
ES2703167T5
ES2703167T5 ES15305265T ES15305265T ES2703167T5 ES 2703167 T5 ES2703167 T5 ES 2703167T5 ES 15305265 T ES15305265 T ES 15305265T ES 15305265 T ES15305265 T ES 15305265T ES 2703167 T5 ES2703167 T5 ES 2703167T5
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
human
laminin
liver
population
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15305265T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2703167T3 (es
Inventor
Tuan Huy Nguyen
Angélique Fourrier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite de Nantes
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Universite de Nantes
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52598699&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2703167(T5) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Universite de Nantes, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Universite de Nantes
Publication of ES2703167T3 publication Critical patent/ES2703167T3/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2703167T5 publication Critical patent/ES2703167T5/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/98—Xeno-free medium and culture conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/237—Oncostatin M [OSM]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de una laminina para diferenciar células pluripotentes en células de linaje hepatocitario
CAMPO DE LA INVENCIÓN:
La invención se refiere al campo de la diferenciación celular y la terapia celular.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN:
Desde su descubrimiento, las células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) y las células madre embrionarias humanas (hESC) se han investigado intensamente como una fuente renovable de cualquier célula especializada del cuerpo para reemplazar las células enfermas [1, 2]. Se han previsto para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades, como cardiopatías graves [3], neurológicas [4], hepáticas [5] y enfermedades de la retina [6] y diabetes [7, 8].
La enfermedad hepática afecta a millones de personas en todo el mundo. Hasta la fecha, el trasplante de hígado es la única opción curativa cuando los pacientes presentan trastornos hepáticos metabólicos graves. Cerca de 25000 pacientes están en las listas de espera para trasplante de hígado en Europa y Estados Unidos. Más de 5500 trasplantes de hígado se realizan en Europa cada año y las enfermedades metabólicas hereditarias representan el 26 % de las indicaciones (Registro Europeo de Trasplantes de Hígado). Sin embargo, solo un tercio de los pacientes en la lista de espera de hígado puede recibir un trasplante de hígado cada año y el número de pacientes que fallecieron mientras estaban en la lista de espera para trasplante de hígado (alrededor del 10 %) ha aumentado durante los últimos años como resultado de la escasez de órganos de donantes.
En los últimos 15 años, el trasplante de hepatocitos aislados de hígados cadavéricos en el hígado de los pacientes se ha convertido en una alternativa clínica al trasplante de hígado [9, 10], en particular para enfermedades metabólicas innatas donde se mantienen las funciones hepáticas y existe un solo defecto enzimático. La evidencia inequívoca de la función metabólica de los hepatocitos humanos trasplantados se demostró por primera vez en un paciente con Crigler-Najjar tipo 1 (CN1) [11]. Después del trasplante celular, el estado clínico y la calidad de vida del paciente mejoraron con la restauración del 5 % de la actividad de UGT1A1, lo que llevó a una reducción del 50 % en la bilirrubinemia y en el tratamiento fototerapéutico. Este estudio seminal abrió el camino para tratar a más de 40 pacientes afectados principalmente por trastornos del ciclo de urea y CN1, además de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo 1, enfermedad de Refsum infantil, colestasis intrahepática familiar tipo 2 progresiva y hemofilia tipo VII [9]. El trasplante de hepatocitos permitió evitar nuevos daños neurológicos en algunos niños mientras esperaban un trasplante de hígado. Una cantidad relativamente pequeña de hepatocitos infundidos (1,5 - 2 x109 células) fue suficiente para mejorar la deficiencia metabólica de algunos pacientes afectados. Sin embargo, el efecto de estabilización de larga duración ciertamente requiere infusiones celulares repetidas [12]. Este enfoque sufre otras limitaciones importantes para su uso general y uso habitual en la práctica clínica. Los trasplantes de hígado disponibles se priorizan para el trasplante de hígado y solo los de calidad marginal se utilizaron para el aislamiento de hepatocitos. Por lo tanto, los hepatocitos aislados son de calidad y cantidad variables. Se desdiferencian rápidamente y no pueden expandirse en el cultivo y no toleran bien la crioconservación. En conjunto, estas limitaciones enfatizan la necesidad de explorar otras fuentes de células hepáticas humanas funcionales.
Estos últimos años, varios grupos informaron la diferenciación in vitro de hESCs e hiPSCs en células similares a hepatocitos (HLC) utilizando diversas condiciones de cultivo que imitan las etapas de desarrollo embrionario del hígado [5, 13-21]. Las HLC no mostraron funciones de hepatocitos completamente maduros, pero tenían un fenotipo más cercano a los hepatocitos humanos fetales, expresando por ejemplo AFP [22]. Pueden injertar, expandir en cierta medida y mantener la funcionalidad hepática después del trasplante en los hígados de animales inmunocomprometidos que fueron lesionados químicamente, irradiados o manipulados genéticamente para dar una ventaja de crecimiento selectivo a los hepatocitos trasplantados, como los ratones que sobreexpresan el activador de plasminógeno tipo uroquinasa para inducir una lesión hepática receptora constitutiva y estímulos regenerativos [5, 14, 17, 23-25].
Algunos estudios investigaron el potencial terapéutico de las HLC y trataron con éxito varios modelos murinos de insuficiencia hepática letal inducida químicamente [26-33]. Sin embargo, el hígado tiene una capacidad notable para regenerarse a partir de hepatocitos endógenos. Por lo tanto, un apoyo temporal de las funciones metabólicas hepáticas por las HLC es suficiente para rescatar a los ratones de la insuficiencia hepática aguda. Por el contrario, para el tratamiento de enfermedades hepáticas hereditarias, las HLC deben diferenciarse completamente in vivo y ser funcionales a largo plazo para expresar las funciones metabólicas hepáticas maduras que faltan en los animales enfermos. Hasta ahora, no se ha demostrado todavía la corrección metabólica exitosa de un animal que modela una enfermedad hepática hereditaria en la cual las HLC trasplantadas no tienen una supervivencia selectiva y una ventaja de crecimiento en los hígados receptores.
La rata Gunn, un animal de CN1, tiene una mutación natural en UGT1A1 que causa una pérdida completa de la actividad de UGT1A1 e hiperbilirrubinemia poco después del nacimiento. La ausencia total de conjugados de bilirrubina en la bilis proporciona una lectura fácil, inequívoca y sensible para evaluar la restauración de la actividad de UGT1A1. Por lo tanto, la rata Gunn constituye un modelo inestimable y conveniente para seguir la maduración de células hepáticas in vivo y el potencial terapéutico de los hepatocitos trasplantados. Al igual que en los pacientes con CN1, una restauración parcial de la actividad de UGT1A1 después del trasplante de hepatocitos produce una corrección metabólica significativa [37-39].
Antes de considerar las HLC para uso clínico, un problema crucial es también producirlas utilizando un protocolo de diferenciación hepática compatible con las BPF (Buenas Prácticas de Fabricación). Los protocolos actuales de diferenciación hepática habitualmente contienen medio condicionado por células alimentadoras, suero, matrices derivadas de animales (como Matrigel®), células alimentadoras de ratón, vectores virales para mejorar la diferenciación hepática o moléculas pequeñas que no están disponibles en las BPF [15, 34 -36]. Todos los cuales son fuentes de factores desconocidos que hacen que los tejidos resultantes sean incompatibles con futuras aplicaciones clínicas.
En consecuencia, existe una demanda clínica de hepatocitos humanos para terapias de células alogénicas. Las células madre pluripotentes han sido investigadas intensamente como una fuente renovable de HLC trasplantables. Sin embargo, todavía se espera la demostración de que las HLC podrían tratar una enfermedad hepática metabólica hereditaria en ausencia de alguna ventaja de crecimiento selectivo de las células trasplantadas sobre los hepatocitos de roedores residentes. Además, las HLC generadas anteriormente se produjeron utilizando protocolos que las hacen inadecuadas para aplicaciones clínicas.
Recientemente, lamininas como la laminina-521 y la laminina-111 se han descrito como una matriz relevante para el cultivo celular, más particularmente para mantener las propiedades funcionales del cultivo in vitro a largo plazo de células de interés tales como células pluripotentes o HLC, pero sin embargo, las lamininas nunca se han descrito ni sugerido como capaces de inducir y / o mejorar la diferenciación hepática.
Por lo tanto, la solicitud de patente internacional WO 2012/080844 se refiere a un nuevo uso de la laminina-521. De hecho, la laminina-521 puede mantener las células madre en pluripotencia in vitro, permitir la autorrenovación y permitir la supervivencia de una única célula de células madre embrionarias humanas. Cuando las células madre embrionarias pluripotentes humanas se cultivan en placas recubiertas con laminina-521 recombinante en ausencia de inhibidores de diferenciación o células alimentadoras, las células madre embrionarias proliferan y mantienen su pluripotencia. Además, se ha demostrado que las células similares a hepatoblastos humanos pueden generarse primero a partir de células pluripotentes en platos recubiertos con Matrigel (inducción de diferenciación hepática) y luego cultivarse en platos recubiertos con laminina-111 para expandirlas durante más de 3 meses mientras mantienen la capacidad potencial de diferenciarse tanto en células similares a hepatocitos como en células similares a colangiocitos [36]. RESUMEN DE LA INVENCIÓN:
En un primer aspecto, la invención se refiere al uso in vitro de una matriz consistente en una laminina (LN) humana para la diferenciación hepática.
En un segundo aspecto, la invención se refiere al uso in vitro de una matriz consistente en una LN humana para inducir y/o mejorar la diferenciación de una población de células pluripotentes o una población de células multipotentes o una población de células endodérmicas definitivas (DE) en una población de células de linaje hepatocitario.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento in vitro para inducir la diferenciación hepática humana que comprende las etapas de:
(i) cultivar una población de células DE humanas en un soporte recubierto con una matriz consistente en laminina humana en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatoblastos humanos, y (ii) cultivar dicha población de células similares a hepatoblastos humanos sobre un soporte recubierto con una matriz consistente en laminina humana en un medio de maduración hepática para producir una población de células similares a hepatocitos fetales humanos.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un procedimiento in vitro para inducir la diferenciación hepática que comprende las etapas de:
(i) cultivar una población de células pluripotentes humanas en un soporte recubierto con una matriz consistente en laminina humana en un medio de inducción endodérmica para producir una población de células DE humanas, (ii) cultivar dicha población de células DE humanas en un soporte recubierto con una matriz consistente en laminina humana en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatoblastos humanos, y (iii) cultivar opcionalmente dicha población de células similares a hepatoblastos humanos en un soporte recubierto con una matriz consistente en laminina humana en un medio de maduración hepática para producir una población de células similares a hepatocitos fetales humanos.
La presente divulgación describe además una población de células similares a hepatoblastos humanos obtenidas mediante el procedimiento de la invención.
La presente divulgación describe además una población de células similares a hepatoblastos humanos de la divulgación para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano.
La presente divulgación describe además una población de células similares a hepatocitos fetales humanos obtenidas mediante el procedimiento de la invención.
La presente divulgación describe además un kit para inducir la diferenciación hepática humana, que comprende un soporte recubierto con una laminina, BMP4 y un miembro de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), tal como FGF2 o FGF10.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención aborda estas necesidades, ya que se refiere a la identificación de un medio químicamente definido capaz de diferenciar una población de células pluripotentes o una población de células endodérmicas definitivas (DE) en una población de células de linaje hepatocitario. Los inventores han demostrado de manera sorprendente que la laminina-111 es tan eficiente como Matrigel para iniciar y apoyar la diferenciación hepática de hiPSC en nuestras condiciones de cultivo, pero con una matriz recombinante.
Los inventores han demostrado que la laminina-521 (LN-521) también es útil como matriz y permite una mejor diferenciación de hiPSC en endodermo definitivo y HLC.
De hecho, los inventores han producido hepatoblastos derivados de células madre pluripotentes humanas (IDHB) en protocolos sin xeno, sin alimentadores y químicamente definidos utilizando laminina-111 recombinante (LN-111) como matriz extracelular para iniciar y apoyar el proceso de diferenciación hepática. Estas IDHB con un conjunto particular de marcadores (combinación de marcadores expresados o no expresados) fueron trasplantadas en el hígado de la rata Gunn, un modelo animal para el síndrome de Crigler-Najjar, que se caracteriza por altos niveles de bilirrubina no conjugada. Después del trasplante celular, mostraron una corrección significativa de la hiperbilirrubinemia, que se mantuvo estable durante los 6 meses de estudio sin eventos adversos. También mostraron que las IDHB trasplantadas se sometieron a una maduración adicional in situ para restaurar la función hepática metabólica deficiente (glucuronidación de bilirrubina por UGT1A1). Para concluir, demostraron por primera vez la eficacia de un regenerativo basado en hiPSC con un protocolo compatible con BPF para tratar una enfermedad metabólica hepática hereditaria en ausencia de cualquier ventaja de crecimiento selectivo de las células trasplantadas sobre los hepatocitos residentes, que es la situación encontrada en el trasplante de hepatocitos en humanos.
Procedimientos de diferenciación hepática y usos de lamininas
Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención se refiere al uso in vitro de una matriz consistente en laminina (LN) humana para la diferenciación hepática.
La invención también se refiere al uso in vitro de una matriz consistente en LN humana para inducir y/o mejorar la diferenciación de una población de células pluripotentes, una población de células multipotentes o una población de células endodérmicas definitivas (DE) en una población de células de linaje hepatocitario.
Como se usa en el presente documento, el término "laminina" (LN) se refiere a una proteína de una familia de glicoproteínas heterotriméricas que residen principalmente en la lámina basal. Funcionan a través de las interacciones de unión con los receptores celulares vecinos en un lado, y al unirse a otras moléculas de laminina u otras proteínas de la matriz como los colágenos, los nidógenos o los proteoglicanos. Las moléculas de laminina también son moléculas de señalización importantes que pueden influir fuertemente en el comportamiento y la función celular. Las lamininas son importantes tanto para mantener el fenotipo de células/tejidos como para promover el crecimiento y la diferenciación celular en la reparación y el desarrollo de tejidos. Las lamininas son proteínas grandes, de múltiples dominios, con una organización estructural común. La molécula de laminina integra varias funciones interactivas de matriz y célula en una molécula. Una molécula de proteína laminina comprende una subunidad de cadena a, una subunidad de cadena p y una subunidad de cadena y, todas juntas en un trímero a través de un dominio de bobina en espiral. Las doce cadenas de subunidades de laminina conocidas pueden formar al menos 15 tipos de lamininas triméricas en tejidos nativos. Dentro de las estructuras de laminina trimérica hay dominios identificables que poseen actividad de unión hacia otras moléculas de laminina y de lámina basal, y receptores unidos a la membrana.
Debe observarse además que el término "laminina" comprende la laminina intacta, como cadenas separadas o como fragmentos de la misma. Como se usa en el presente documento, el término "intacta" se refiere a la proteína que se compone de todos los dominios de la cadena (, la cadena ® y la cadena ©, con las tres cadenas unidas entre sí para formar la estructura heterotrimérica. La proteína no se divide en cadenas, fragmentos o dominios funcionales separados. Por ejemplo, la laminina-111 y la laminina-521 (como se describen a continuación) son proteínas intactas. Como se usa en el presente documento, el término "cadena" se refiere a la totalidad de la cadena alfa, beta o gamma de la proteína laminina. Como se usa en el presente documento, el término "fragmento" se refiere a cualquier fragmento de proteína que contiene uno, dos o tres dominios funcionales que poseen actividad de unión a otra molécula o receptor. Sin embargo, una cadena no debe considerarse un fragmento porque cada cadena posee más de tres dominios de este tipo. Del mismo modo, una proteína laminina intacta no debe considerarse un fragmento. Los ejemplos de dominios funcionales incluyen los dominios I, II, III, IV, V, VI y el dominio G.
Existen cinco cadenas alfa diferentes, tres cadenas beta y tres cadenas gamma que en tejidos humanos se han encontrado en al menos quince combinaciones diferentes. Estas moléculas se denominan laminina-1 a laminina-15 en función de su descubrimiento histórico, pero una nomenclatura alternativa describe las isoformas en función de su composición de cadena, por ejemplo, la laminina-111 (laminina-1) que contiene las cadenas alfa-1, beta-1 y gamma-1. Se han identificado cuatro grupos estructuralmente definidos de familias de lamininas. El primer grupo de cinco moléculas de laminina identificadas comparten las cadenas ®1 y ©1 y varían según su composición de cadena a (cadena (1 a (5). El segundo grupo de cinco moléculas de laminina identificadas, incluida la laminina-521, comparten la cadena ®2 y ©1 y varían nuevamente según su composición de cadena a. El tercer grupo de moléculas de laminina identificadas tiene un miembro identificado, laminina-332, con una composición de cadena de (3®3©2. El cuarto grupo de moléculas de laminina identificadas tiene un miembro identificado, laminina-213, con la composición de cadena y3 recién identificada ((2®1©3).
Se han identificado al menos 15 subtipos (o "isoformas") de laminina (LN), según su composición de cadena, que incluyen LN-111 ((1®1©1), LN-121 ((1®2©1), LN-211 ((2®1©1), LN-213 ((2®1©3), LN-221 ((2®2©1), LN-311 ((3®3©1), LN-321 ((3®2©1), LN-332 ((3®3©2), LN-411 ((4®1©1), LN-421 ((4®2©1), LN-423 ((4®2©3), LN-511 ((5® 1 ©1), LN-521 ((5®2©1), LN-522 ((5®2©2) y LN-523 ((5®2©3).
En una realización de la invención, dicha laminina se selecciona del grupo que consiste en laminina-111 (LN-111), laminina-211 (LN-211), laminina-332 (LN-332), laminina-411 (LN-411) ), laminina-421 (LN-421), laminina-511 (LN-511) y laminina-521 (LN-521).
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana recombinante.
En una realización preferida de la invención, dicha laminina es la laminina-111 humana recombinante (LN-111) o la laminina-521 humana recombinante (LN-521).
Como se usa en el presente documento, el término polipéptido "recombinante" se refiere a un polipéptido que se produce por expresión a partir de una molécula de ácido nucleico codificante. Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células huésped son bien conocidos.
Cuando se expresa en forma recombinante, el polipéptido se genera preferentemente por expresión a partir de un ácido nucleico codificante en una célula huésped. Se puede usar cualquier célula huésped, dependiendo de los requisitos individuales de un sistema particular. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, células de plantas, levaduras y sistemas de baculovirus.
Las lamininas humanas recombinantes, tales como la LN-111 o LN-521 humana recombinante pueden adquirirse de Biolamina, Sundbyberg, Suecia.
En una realización de la invención, la laminina se recubre en el soporte, tal como una placa de 0,5 a 50 microgramos por mililitro (pg/ml), preferentemente de 1 a 10 pg/ml, más preferentemente a 5 pg/ml.
Como se usa en el presente documento, el término "matriz" se refiere a un componente / material (natural, sintético o una combinación de los mismos) que forma una red polimérica que proporciona a células cultivadas in vitro (por ejemplo, en un recipiente de cultivo tal como un recipiente de plástico plano) ambientes fisiológica y morfológicamente relevantes similares a uno in vivo para una biología celular más realista y mejores interacciones intercelulares para el cultivo de células, facilitando la unión celular, el crecimiento y la diferenciación.
En una realización, la matriz comprende una laminina tal como la laminina-111 humana recombinante (LN-111) o la laminina-521 humana recombinante (LN-521) o una mezcla de las mismas.
En otra realización, la matriz comprende una mezcla de una laminina y otro componente (tal como proteínas de matriz que incluyen colágeno I y fibronectina).
Como se usa en el presente documento, el término "población" se refiere a una población de células, donde la mayoría (por ejemplo, al menos aproximadamente el 50 %, preferentemente al menos aproximadamente el 60 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 70 % e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 80 %) del número total de células tiene las características especificadas de las células de interés para al menos uno de los marcadores de interés (por ejemplo, una población de células similares a hepatocitos humanos comprende al menos aproximadamente el 60 %, preferentemente al menos aproximadamente el 70 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 80 % de las células que tienen las funciones hepáticas y que expresan los marcadores expresados típicamente por las células similares a hepatocitos humanos enumerados a continuación, tales como, por ejemplo, el factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF4()).
Como se usa en el presente documento, el término "marcador" se refiere a una proteína, glicoproteína u otra molécula expresada en la superficie de una célula o en una célula, y que se puede usar para ayudar a identificar la célula. Un marcador generalmente puede ser detectado por procedimientos convencionales. Entre los ejemplos específicos, no limitativos, de procedimientos que pueden utilizarse para la detección de un marcador de superficie celular se encuentra la inmunocitoquímica, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y el análisis enzimático, además de los procedimientos de RT-PCR y biología molecular para detectar el ARNm de la proteína.
Como se usa en el presente documento, el término "pluripotente" se refiere a las células con la capacidad de dar lugar a la progenie que puede experimentar diferenciación, en condiciones apropiadas, en tipos de células que presentan colectivamente características asociadas con linajes celulares de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las células madre pluripotentes pueden contribuir a los tejidos de un organismo prenatal, postnatal o adulto. Se puede utilizar una prueba estándar aceptada en la técnica, como la capacidad para formar un teratoma en ratones SCID de 8-12 semanas de edad, para establecer la pluripotencia de una población celular. Sin embargo, la identificación de varias características de células madre pluripotentes también se puede utilizar para identificar células pluripotentes.
En una realización de la invención, las células madre pluripotentes son células madre pluripotentes humanas.
Más específicamente, las células madre pluripotentes humanas pueden expresar al menos algunos, y opcionalmente todos, los marcadores de la siguiente lista no limitativa: SSEA-3, SSEA-4, TRA-I -60, TRA-I -81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox 2, cadherina E, UTF-I, Oct4, Lin28, Rexl y Nanog.
En una realización de la invención, las células madre pluripotentes humanas son células madre pluripotentes inducidas humanas(hiPSC).
Como se usa en el presente documento, el término "célula madre pluripotente inducida" se refiere a una célula madre pluripotente derivada artificialmente de una célula no pluripotente. Una célula no pluripotente puede ser una célula de menor potencia de autorrenovación y diferenciación que una célula madre pluripotente. Las células de menor potencia pueden ser, pero no se limitan a, células madre somáticas, células progenitoras específicas de tejido, células primarias o secundarias. Las iPSC se han obtenido de manera reproducible mediante la reprogramación de diferentes tipos de células a través de la expresión forzada de la combinación de factores de transcripción OCT4, SOX2, c-MYC y KLF4 o mediante una combinación alternativa de factores, sustituyendo KLF4 y c-MYC por o agregando NANOG y LIN28 o cualquier procedimiento conocido por el experto para mejorar el proceso de reprogramación (mediante el uso de moléculas pequeñas como los inhibidores de ADN metiltransferasa (DNMT), ARNmi, etc.).
Como se usa en el presente documento, el término "reprogramación" se refiere al proceso de cambiar el destino de una célula diana por el de un tipo de célula diferente, causado por la expresión de un pequeño conjunto de factores (o factores de reprogramación) en las células diana.
En la técnica, se han descrito procedimientos para generar células madre pluripotentes inducidas basado en vectores de expresión que codifican factores de reprogramación, véanse por ejemplo, los documentos WO2007/69666, EP2096169-A1 o WO2010/042490.
Los vectores de expresión para la expresión ectópica de los factores de reprogramación pueden ser, por ejemplo, un vector plásmido, un vector cósmido, un vector de cromosoma artificial bacteriano (BAC), un vector basado en transposones (como PiggyBac) o un vector viral.
Alternativamente, los factores de reprogramación, por ejemplo, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc o el correspondiente ADN o ARN codificante, se introducen en las células diana sin la integración del material genético exógeno en el ADN huésped, es decir, sin la introducción de la secuencia de nucleótidos en el genoma de la célula. Un vector de expresión tal como un vector plásmido puede administrarse en dichas células para la expresión ectópica del factor de reprogramación, en forma de ADN desnudo. Alternativamente, los ARN que codifican dichos factores de reprogramación, ya sean modificados químicamente o no, pueden introducirse en las células para re programarlos (véase, por ejemplo, Warren L, y col., 2010, Cell Stem Cell. 5 de nov.;7(5):618-30). Otros vectores de expresión se han descrito, por ejemplo, en el documento WO 2009115295.
En una realización, las hiPSC se derivan de células obtenidas de un sujeto sano. En otra realización, las hiPSC se derivan de células obtenidas de un sujeto con una enfermedad hepática tal como una enfermedad hepática metabólica hereditaria y las células similares a hepatocitos muestran un fenotipo de la enfermedad.
Alternativamente, puede obtenerse una población de células de linaje hepatocitario de interés a partir de la diferenciación de células multipotentes, tales como células madre mesenquimales, en una matriz para la diferenciación hepática constituida por una laminina de la invención.
Como se usa en el presente documento, el término "multipotente" se refiere a células capaces de diferenciarse en al menos dos tipos de células diferenciadas terminalmente.
Como se usa en el presente documento, el término "células madre mesenquimales" generalmente se refiere a células estromales encontradas en un tejido diferenciado (especializado) y que son capaces de hacer copias idénticas de sí mismas (autorrenovación) durante el tiempo de vida del organismo y tienen un potencial de diferenciación multipotente (como la diferenciación en osteoblastos, adipocitos, condroblastos). Preferentemente, las células madre mesenquimales humanas que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención incluyen, por lo tanto, cualquier célula madre humana multipotente adecuada (es decir, células con capacidad de autorrenovación y multipotencia) derivadas de cualquier tejido adecuado mediante cualquier procedimiento de aislamiento apropiado. Por ejemplo, las células madre mesenquimales humanas que se pueden utilizar en los procedimientos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, células inducibles adultas multilinaje (MIAMI) (D'Ippolito y col., J. Cell Sci., 2004, 117): 2971-2981), MAPC (también conocido como MPC) (Reyes y col., Blood, 2001, 98: 2615-2625), células madre derivadas de sangre de cordón umbilical (Kogler G y col., J. Exp. Med., 2004, 200(2): 123-135), mesoangioblastos (Sampaolesi M y col., Nature, 2006, 444(7119): 574-579; Dellavalle A y col., Nat. Cell Biol., 2007, 9: 255-267) y células madre amnióticas (De Coppi P y col., Nat Biotechnol 2007, 25:100-106). Además, los bancos de sangre del cordón umbilical (por ejemplo, Établissement Frangais du Sang, en Francia) proporcionan fuentes seguras y fáciles de conseguir de dichas células para el trasplante.
Alternativamente, puede obtenerse una población de células de linaje hepatocitario a partir de la diferenciación de células aisladas de hígados humanos adultos (por ejemplo, células progenitoras de hepatocitos) en una matriz para la diferenciación hepática constituida por una laminina. Como otra alternativa, puede obtenerse una población de células de linaje hepatocitario de interés a partir de la conversión de células somáticas, tales como fibroblastos, en una matriz para la diferenciación hepática constituida por una laminina.
Como se usa en el presente documento, los términos "células de linaje hepatocitario" o "células similares a hepatocitos" (HLC) se refieren a células obtenidas mediante la diferenciación de células pluripotentes, células endodérmicas u otro tipo de células, tales como células multipotentes, de la manera descrita. Las células diferenciadas tienen al menos una entre una variedad de características fenotípicas distintivas de progenitores de hepatocitos conocidos, hepatoblastos, hepatocitos fetales y maduros, como se proporciona más adelante en esta divulgación. El uso de este término no implica ninguna limitación particular con respecto al fenotipo celular, marcadores celulares, función celular o capacidad proliferativa, a menos que se requiera explícitamente. Las células de linaje hepatocitario expresan marcadores hepáticos que incluyen, entre otros, el factor nuclear hepatocitario alfa 4 (HNF4(), albúmina (ALB), alfa-fetoproteína (AfP), citocromo P450 y citoqueratina 19 (CK19).
Procedimientos para determinar el nivel de expresión de los biomarcadores de la invención:
La determinación del nivel de expresión de marcadores, incluidos los marcadores hepáticos (por ejemplo, los genes HNF4{, ALB, AFP, CK19) se puede realizar mediante una variedad de técnicas. Generalmente, el nivel de expresión determinado es un nivel de expresión relativo. Por ejemplo, la determinación comprende poner en contacto la muestra biológica con reactivos selectivos, como sondas o ligandos y detectar así la presencia o medir la cantidad, de ácidos nucleicos o polipéptidos de interés originalmente en dicha muestra biológica. El contacto puede realizarse en cualquier dispositivo adecuado, como una placa, un plato de microtitulación, un tubo de ensayo, un pocillo, un vaso, una columna, etc. En realizaciones específicas, el contacto se realiza sobre un sustrato recubierto con el reactivo, como una matriz de ácido nucleico o una matriz de ligandos específica. El sustrato puede ser un sustrato sólido o semisólido tal como cualquier soporte adecuado que comprenda vidrio, plástico, nailon, papel, metal, polímeros y similares. El sustrato puede ser de varias formas y tamaños, como un lámina, una membrana, una perla, una columna, un gel, etc. El contacto se puede realizar en cualquier condición adecuada para que se forme un complejo detectable, como un híbrido de ácido nucleico o un complejo anticuerpo-antígeno, entre el reactivo y los ácidos nucleicos o polipéptidos de la muestra biológica.
En una realización particular, el nivel de expresión de los genes biomarcadores puede determinarse determinando la cantidad de ARNm.
Los procedimientos para determinar la cantidad de ARNm son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ácido nucleico contenido en las células de interés tales como las HLC de la invención se extrae primero de acuerdo con procedimientos estándar, por ejemplo, utilizando enzimas líticas o soluciones químicas o se extrae mediante resinas de unión a ácidos nucleicos siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARNm extraído se detecta luego mediante hibridación (por ejemplo, análisis por hibridación Northern) y/o amplificación (por ejemplo, RT-PCR). Se prefiere la RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa. La RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa en tiempo real es particularmente ventajosa.
En otra realización, el nivel de expresión de los genes biomarcadores puede determinarse determinando la cantidad de proteína codificada por dichos genes.
Dichos procedimientos comprenden poner en contacto la muestra biológica con un ligando de unión capaz de interactuar selectivamente con la proteína presente en dicha muestra. El ligando de unión es generalmente un anticuerpo que puede ser policlonal o monoclonal, preferentemente monoclonal.
Por ejemplo, el nivel de una proteína biomarcadora tal como HNF4(, ALB, AFP y CK19 puede medirse mediante técnicas electroforéticas e inmunodiagnósticas estándar, incluyendo inmunoensayos tales como ensayos de competencia, reacción directa o tipo sándwich. Dichos ensayos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones Western; pruebas de aglutinación; inmunoensayos de marcado enzimático y mediados, como los ELISA; ensayos tipo biotina / avidina; radioinmunoensayos; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación.
Las condiciones del cultivo celular pueden incluir uno o más componentes adicionales para proporcionar un entorno de apoyo durante la diferenciación dirigida en el tipo de célula diana diferenciada (por ejemplo, células de linaje hepatocitario). Los procedimientos para obtener una población de células diana diferenciadas incluyen además una etapa de inducción de la diferenciación. La inducción de la diferenciación se puede lograr cambiando la composición de los factores de crecimiento en el medio de cultivo en una o más etapas de la diferenciación como se describe a continuación.
Por consiguiente, la divulgación describe además un procedimiento para inducir la diferenciación hepática humana que comprende las etapas de:
(i) proporcionar una población de células endodérmicas humanas definitivas (DE), y (ii) cultivar la población en un soporte recubierto con una laminina en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatoblastos humanos.
La divulgación también describe un procedimiento para obtener células similares a hepatoblastos humanos que comprende las etapas de:
(i) proporcionar una población de células DE humanas, y (ii) cultivar la población en un soporte recubierto con una laminina en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatoblastos humanos.
Como se usa en el presente documento, el término "células endodérmicas definitivas" se refiere a las células que expresan marcadores bioquímicos característicos, que incluyen pero no se limitan a Sox 17 y FoxA2 y no expresan nanog.
Como se usa en el presente documento, los términos "células similares a hepatoblastos" (HB) o "células progenitoras hepáticas" son intercambiables y se refieren a células que expresan marcadores bioquímicos característicos, que incluyen, entre otros, factor nuclear hepatocitario 4 alfa (HNF4(), citoqueratina 19 (CK19 ) y citocromo P450 3A7 (CYP3A7) y que no expresan o no expresan sustancialmente alfa-fetoproteína (AFP) y que no expresan albúmina (ALB), alfa-1 antitripsina (AAT), citocromo P4503A7 (CYP3A7) y difosfato de uridina (UDP)-glucuronosil transferasa 1A1 (UGT1A1).
Como se usa en el presente documento, el término "no sustancialmente" se refiere a una población de células similares a hepatoblastos que expresan un bajo nivel de una proteína de interés tal como AFP. Por consiguiente, dichas células solo pueden expresar una cantidad baja o una cantidad de proteína AFP no detectable por ELISA, como varios picogramos (pg) que está por debajo del límite de detección (LDD) para AFP por ELISA. Sin embargo, debe observarse además que puede detectarse una baja cantidad de ARNm de AFP mediante RT-PCR (pero dicha cantidad es insuficiente para detectar al final la expresión de la proteína AFP).
Como se usa en el presente documento, las expresiones "medio de inducción hepática" o "medio de cultivo que induce la diferenciación hepática" se refieren a un medio de cultivo que es capaz de inducir la diferenciación del endodermo definitivo en células similares a hepatoblastos (y por lo tanto, capaz de inducir la expresión de marcadores hepáticos tales como HNF4(, CK19 y CYP3A7).
Como se usa en este documento, el término "medio de cultivo" se refiere a cualquier medio capaz de soportar el crecimiento y la diferenciación de células endodérmicas definitivas en células progenitoras hepáticas. Las formulaciones de medios preferidas que apoyarán el crecimiento y la diferenciación de las células endodérmicas definitivas en células progenitoras hepáticas incluyen un medio químicamente definido (MQD).
Como se usa en el presente documento, el término "medio químicamente definido" (MQD) se refiere a una solución nutritiva para cultivar células que contiene solo componentes específicos, preferentemente componentes de estructura química conocida. Un medio químicamente definido es un medio sin suero y sin alimentador. Como se usa en este documento, "sin suero" se refiere a un medio de cultivo que no contiene suero agregado. Como se usa en este documento, "sin alimentador" se refiere a un medio de cultivo que no contiene células alimentadoras agregadas. El medio de cultivo usado en esta invención puede ser un medio a base de agua que incluye una combinación de sustancias como sales, nutrientes, minerales, vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos, proteínas como citoquinas, factores de crecimiento y hormonas, todos los cuales son necesarios para la supervivencia celular. Por ejemplo, un medio de cultivo, de acuerdo con esta invención, puede ser un medio de cultivo de tejido sintético como el RPMI (medio Roswell Park Memorial Institute) o el CMRL-1066 (Laboratorio de investigaciones médicas de Connaught) para uso humano, complementado con los aditivos necesarios en caso necesario, como se describe más adelante (sección Ejemplos) como el B27. El suplemento B-27 (Invitrogen) contiene, entre otros constituyentes, SOD, catalasa y otros antioxidantes (GSH) y ácidos grasos únicos, como el ácido linoleico, el ácido linolénico y los ácidos lipoicos.
La etapa de cultivo de células DE con el medio de inducción hepática se llevará a cabo durante el tiempo necesario para la producción de células similares a hepatoblastos. La duración de esta etapa de cultivo puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, durante el cultivo, el experto en la técnica puede monitorizar las células cultivadas para detectar la ausencia de al menos una expresión de los marcadores expresados únicamente por células endodérmicas definitivas (DE) (por ejemplo, Sox17 y FoxA2) y / o por la expresión de marcadores expresados específicamente por células similares a hepatoblastos (por ejemplo, HNF4(, CK19, CYP3A7). Cuando no se puede detectar la expresión de uno o varios marcadores específicos de células DE y / o se detecta la expresión de uno o varios marcadores específicos de células similares a hepatoblastos, se puede detener el cultivo con el medio de inducción hepática. La monitorización de estos marcadores se puede realizar mediante, por ejemplo, el análisis por RT-PCR del ARN extraído de células cultivadas con cebadores específicos, el análisis por inmunofluorescencia con anticuerpos específicos de los marcadores y FACS o cualquier procedimiento para detectar el ARNm correspondiente a las proteínas.
Típicamente, la etapa ii) se puede llevar a cabo durante 3 a 10 días, preferentemente 6 días.
Si es necesario, el medio de cultivo de la invención se puede renovar, parcial o totalmente, a intervalos regulares. Típicamente, el medio de cultivo de la invención se puede reemplazar por medio de cultivo fresco de la invención cada dos días, durante 6 días.
Las células similares a hepatoblastos producidas por el procedimiento anterior se pueden aislar y / o purificar mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo FACS.
El término "factor de crecimiento familiar de FGF", como se usa en relación con el procedimiento para obtener células humanas similares a hepatoblastos, se refiere a cualquier sustancia de origen natural (por ejemplo, una proteína) capaz de estimular el crecimiento celular, la proliferación y la diferenciación celular mediante la unión con un receptor de factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR). Al unirse a un FGFR, la sustancia aumenta, por ejemplo, la fosforilación de tirosina de dicho receptor.
En una realización de la invención, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende proteína 4 morfogenética ósea (BMP4) y un FGF.
En una realización preferida de la invención, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende proteína 4 morfogenética ósea (BMP4) y factor 10 de crecimiento familiar (FGF10).
La proteína FGF10 humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de Uniprot 015520. Típicamente, el FGF10 se agrega al medio de cultivo de la invención en una concentración que oscila entre 1 y 50 ng/ml, preferentemente a aproximadamente 10 ng/ml. El FGF10 puede adquirirse de Peprotech o Miltenyi Biotec.
La proteína BMP4 humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de Uniprot P12644. Típicamente, la BMP4 se agrega al medio de cultivo de la invención en una concentración que oscila entre 1 y 50 ng/ml, preferentemente a aproximadamente 10 ng/ml. La BMP4 puede adquirirse de R&D systems.
En otra realización de la invención, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende proteína 4 morfogenética ósea (BMP4) y FGF2 (también conocido como factor básico de crecimiento de fibroblastos). La proteína FGF2 humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de Uniprot P09038. Típicamente, el FGF2 se agrega al medio de cultivo de la invención en una concentración que oscila entre 1 y 50 ng/ml, preferentemente a aproximadamente 10 ng/ml. El FGF2 puede adquirirse de Peprotech o Miltenyi Biotec.
En algunas realizaciones de la invención, el cultivo de la población de células DE puede incluir adicionalmente el paso de la población de células DE antes o durante el proceso de diferenciación. El proceso de paso de la población de células puede repetirse una o más veces, y puede incluir células disociadas soportadas por la matriz de unión, diluyendo las células disociadas en los medios. Por consiguiente, la etapa ii) puede comprender además una etapa de paso de al menos una vez y/o el recuento celular.
En algunas realizaciones de la invención, para aumentar la clonogenicidad, las células pueden tratarse con un inhibidor de ROCK 4 horas antes de la disociación y 24 horas después del recubrimiento.
Como se usa en el presente documento, el término "inhibidor de proteína quinasa asociada a Rho (ROCK)" se refiere a un compuesto (natural o sintético) que inhibe la actividad de ROCK1 y / o ROCK2, tal como la actividad de la quinasa. En una realización particular de la invención, el inhibidor de ROCK es Y27632 (Watanabe y col. Nature Biotechnology 25, 681 - 686 (2007)).
Típicamente, la concentración de Y27632 en el medio de cultivo puede ser de 1 a 100 ng/ml, preferentemente alrededor de 10 ng/ml.
En una realización de la invención, dicha laminina se selecciona del grupo que consiste en LN-111, LN-211, LN-332, LN-411, LN-421, LN-511 y LN-521.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana recombinante.
En una realización de la invención, la laminina se recubre en el soporte, tal como una placa de 0,5 a 50 microgramos por mililitro (pg/ml), preferentemente de 1 a 10 pg/ml, más preferentemente a 5 pg/ml.
El soporte es típicamente una superficie en un recipiente de cultivo.
En una realización de la invención, el soporte se selecciona del grupo que consiste en una placa, un portaobjetos, un matraz y similares. En una realización preferida de la invención, el soporte tiene al menos una porción de una superficie recubierta con una matriz de la invención, tal como LN-111 humana recombinante o LN-521 humana recombinante. La divulgación también describe un procedimiento para inducir la diferenciación hepática humana que comprende las etapas de:
(i) proporcionar una población de células pluripotentes humanas, y (ii) cultivar la población en un soporte recubierto con una laminina en un medio de inducción endodérmica para producir una población de células DE humanas. La divulgación también describe un procedimiento para células DE humanas que comprende las etapas de:
(i) proporcionar una población de células pluripotentes humanas, y (ii) cultivar la población en un soporte recubierto con una laminina en un medio de inducción endodérmica para producir una población de células DE humanas. La divulgación también describe un procedimiento para inducir la diferenciación hepática humana que comprende las etapas de:
(i) proporcionar una población de células pluripotentes humanas, (ii) cultivar la población en un soporte recubierto con una laminina en un medio de inducción endodérmica para producir una población de células DE humanas, y (iii) cultivar dicha población de células DE humanas en un soporte recubierto con una laminina en un medio de inducción hepática para producir una población de células humanas similares a hepatoblastos tempranos.
La divulgación también describe un procedimiento para obtener células similares a hepatoblastos humanos que comprende las etapas de:
(i) proporcionar una población de células pluripotentes humanas, (ii) cultivar la población en un soporte recubierto con una laminina en un medio de inducción endodérmica para producir una población de células DE humanas, y (iii) cultivar dicha población de células DE humanas en un soporte recubierto con una laminina en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatocitos humanos.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "medio de inducción endodérmica" o "medio de cultivo que induce la diferenciación endodérmica" se refieren a un medio de cultivo que es capaz de inducir la diferenciación de células madres pluripotentes en células endodérmicas definitivas (y por lo tanto, capaz de inducir la expresión de marcadores endodérmicos, tales como Sox 17 y FoxA2).
En una realización preferida de la invención, el medio de inducción endodérmica es un medio químicamente definido que comprende al menos activina A y opcionalmente WNT3A.
La activina A se conoce bien en la técnica y es un polipéptido dimérico que ejerce un rango de efectos celulares a través de la estimulación de la vía activina / nodal (Vallier y col., Cell Science 118: 4495-4509 (2005)). La proteína de activina A humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de GeneBank NP_002183. La activina está disponible en fuentes comerciales (por ejemplo, Stemgent Inc. MA USA o Miltenyi Biotec).
Típicamente, la concentración de activina A en el medio de cultivo puede ser de 10 a 1000 ng/ml, preferentemente alrededor de 100 ng/ml.
La proteína WNT3A humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de Uniprot P56704. Típicamente, la concentración de WNT3A en el medio de cultivo puede contener de 10 a 100 ng/ml de WNT3A, preferentemente alrededor de 50 ng/ml. La WNT3A puede adquirirse de Miltenyi Biotec. La etapa de cultivo de células pluripotentes con el medio de inducción endodérmica se llevará a cabo durante el tiempo necesario para la producción del endodermo definitivo (DE). La duración de esta etapa de cultivo puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, durante el cultivo, el experto en la técnica puede monitorizar las células cultivadas para la expresión de marcadores expresados específicamente por el endodermo definitivo (DE) (por ejemplo, Sox 17 y FoxA2). Cuando se detecta la expresión de uno o varios marcadores específicos de células DE, se puede detener el cultivo con el medio de inducción hepática. La monitorización de estos marcadores se puede realizar mediante, por ejemplo, el análisis por RT-PCR del ARN extraído de células cultivadas con cebadores específicos, el análisis por inmunofluorescencia con anticuerpos específicos de los marcadores, ELISA y FACS o cualquier procedimiento para detectar el ARN / proteína / actividad correspondiente al marcador específico.
Típicamente, la etapa ii) se puede llevar a cabo durante 1 a 10 días, preferentemente 5 días.
Si es necesario, el medio de cultivo de la invención se puede renovar, parcial o totalmente, a intervalos regulares. Típicamente, el medio de cultivo de la invención se puede reemplazar por un medio de cultivo fresco de la invención cada dos días, durante 5 días.
Las células similares a hepatoblastos producidas por el procedimiento anterior se pueden aislar y / o purificar mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo FACS.
En una realización de la invención, dicha laminina se selecciona del grupo que consiste en LN-111, LN-211, LN-332, LN-411, LN-421, LN-511 y LN-521.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana recombinante.
En una realización de la invención, la laminina se recubre en el soporte, tal como una placa de 0,5 a 50 microgramos por mililitro (pg/ml), preferentemente de 1 a 10 pg/ml, más preferentemente a 5 pg/ml.
El soporte es típicamente una superficie en un recipiente de cultivo.
En una realización de la invención, el soporte se selecciona del grupo que consiste en una placa, un portaobjetos, un matraz y similares. En una realización preferida de la invención, el soporte tiene al menos una porción de una superficie recubierta con una matriz de la invención, tal como LN-111 humana recombinante o LN-521 humana recombinante. En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento in vitro para la obtención de células de hepatocitos fetales humanos que comprende las etapas de:
(i) cultivar una población de células pluripotentes humanas en un soporte recubierto con una matriz consistente en laminina humana en un medio de inducción endodérmica para producir una población de células DE humanas, (ii) cultivar dicha población de células DE humanas en un soporte recubierto con una matriz consistente en laminina humana en un medio de maduración hepática para producir una población de células similares a hepatocitos fetales. Como se usa en este documento, los términos "células similares a hepatocitos fetales" o "hepatoblastos diferenciados" se usan en este documento de manera intercambiable y se refieren a células que expresan marcadores bioquímicos característicos, que incluyen pero no se limitan a HNF4(, CYP3A7, AFP y CK19, y pueden expresar algunas proteínas hepáticas maduras, incluidas, pero no limitadas a, ALB, AAT, UGT1A1 y citocromo P4503a 4 (CYP3A4).
Como se usa en el presente documento, las expresiones "medio de maduración hepática" o "medio de cultivo que estimula la maduración hepática" se refieren a un medio de cultivo que es capaz de inducir la maduración de células similares a hepatoblastos a células similares a hepatocitos fetales.
En una realización preferida de la invención, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende HGF y OSM.
Como se usa en el presente documento, el término "factor de crecimiento hepático" (HGF) se refiere a un factor de crecimiento que regula el crecimiento celular, la motilidad celular y la morfogénesis mediante la activación de una cascada de señalización de tirosina quinasa después de la unión al receptor proto-oncogénico c-MET. La proteína HGF humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de Uniprot P14210.
Típicamente, el HGF se agrega al medio de maduración hepática a una concentración que varía de 1 a 100 ng/ml, preferentemente de 5 a 50 ng/ml, e incluso más preferentemente de alrededor de 20 ng/ml. El HGF puede adquirirse de Peprotech.
Como se usa en el presente documento, el término "oncostatina M" (OSM) se refiere a una citoquina que inhibe la proliferación de varias líneas de células tumorales. La proteína OSM humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de Uniprot P13725.
Típicamente, la oncostatina M se agrega al medio de maduración hepática a una concentración que varía de 1 a 100 ng/ml, preferentemente de 5 a 50 ng/ml, e incluso más preferentemente de alrededor de 20 ng/ml. La OSM puede adquirirse de Miltenyi Biotec.
La etapa de cultivo de células similares a hepatoblastos con el medio de maduración hepática se llevará a cabo durante el tiempo necesario requerido para la producción de células similares a hepatocitos fetales. La duración de esta etapa de cultivo puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, durante el cultivo, el experto en la técnica puede monitorizar las células cultivadas para detectar la ausencia de expresión de marcadores de células madre pluripotentes (por ejemplo, Sox 2 y Nanog), la ausencia de expresión de marcadores específicos de endodermo definitivo (DE) (por ejemplo, Sox 17 y FoxA2), la expresión de marcadores específicos de hepatoblastos y/o la expresión de marcadores expresados específicamente por células similares a hepatocitos fetales (por ejemplo, AFP y ALB). Cuando se detecta la expresión de uno o varios marcadores específicos de células similares a hepatocitos fetales, se puede detener el cultivo con el medio de maduración hepática. La monitorización de estos marcadores se puede realizar mediante, por ejemplo, el análisis por RT-PCR del ARN extraído de células cultivadas con cebadores específicos, el análisis por inmunofluorescencia con anticuerpos específicos de los marcadores, ELISA y FACS o cualquier procedimiento para detectar el ARN / proteína / actividad correspondiente al marcador específico.
Típicamente, la etapa ii) se puede llevar a cabo durante 3 a 60 días, preferentemente 30 días.
Si es necesario, el medio de cultivo de la invención se puede renovar, parcial o totalmente, a intervalos regulares. Típicamente, el medio de cultivo de la invención se puede reemplazar por un medio de cultivo fresco de la invención cada dos días, durante 30 días.
Las células similares a hepatocitos fetales producidas mediante el procedimiento anterior se pueden aislar y / o purificar a través de cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo FACS.
En una realización de la invención, dicha laminina se selecciona del grupo que consiste en LN-111, LN-211, LN-332, LN-411, LN-421, LN-511 y LN-521.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana recombinante.
En una realización de la invención, la laminina se recubre en el soporte, tal como una placa de 0,5 a 50 microgramos por mililitro (pg/ml), preferentemente de 1 a 10 pg/ml, más preferentemente a 5 pg/ml.
El soporte es típicamente una superficie en un recipiente de cultivo.
En una realización de la invención, el soporte se selecciona del grupo que consiste en una placa, un portaobjetos, un matraz y similares. En una realización preferida de la invención, el soporte tiene al menos una porción de una superficie recubierta con una matriz de la invención, tal como LN-111 humana recombinante o LN-521 humana recombinante.
Poblaciones de células similares a hepatoblastos humanos de acuerdo con la invención y composiciones farmacéuticas que las comprenden
La divulgación describe además una población de células similares a hepatoblastos humanos obtenidas mediante un procedimiento tal como se ha definido anteriormente.
La divulgación describe además una población de células similares a hepatoblastos humanos obtenidas mediante un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, donde dichas células expresan el factor nuclear hepatocitario 4 alfa (HNF4() y no expresan o no expresan sustancialmente alfa-fetoproteína (AFP).
La divulgación describe además una población de células similares a hepatoblastos humanos obtenidas mediante un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, donde dichas células expresan HNF4(, citoqueratina 19 (CK19) y citocromo P4503A7 (CYP3A7) y no expresan o no expresan sustancialmente AFP, albímina ( ALB), alfa-1 antitripsina (AAT), citocromo P4503A4 (CYP3A4), difosfato de uridina (UDP)-glucuronosil transferasa 1A1 (UGT1A1).
La divulgación describe además una población de células similares a hepatocitos fetales humanos obtenidas mediante un procedimiento tal como se ha definido anteriormente.
La divulgación describe además una población de células similares a hepatocitos fetales humanos obtenidas mediante un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, donde dichas células expresan HNF4(, CK19, CYP3A7, AFP, ALB, AAT y UGT1A1 y citocromo P4503A4 (CYP3A4).
En una realización, las células similares a hepatocitos humanos (es decir, hepatoblastos o células similares a hepatocitos fetales o hepatocitos maduros) muestran un fenotipo normal.
En otra realización, las células similares a hepatoblastos humanos (es decir, hepatoblastos o células similares a hepatocitos fetales) muestran una mutación genética, en particular una mutación genética que afecta a proteínas clave dentro de las células similares a hepatoblastos humanos y que está asociada con una enfermedad hepática. Debe observarse que la mutación genética o el defecto que es responsable del fenotipo de la enfermedad puede corregirse in vitro o ex vivo. Hay varias técnicas disponibles para corregir mutaciones genéticas o defectos en células aisladas de mamíferos.
Modificación genética de células similares a hepatoblastos humanos de la invención
El término "genéticamente modificado" indica que las células similares a hepatocitos humanos (es decir, hepatoblastos o células similares a hepatocitos fetales o hepatocitos maduros) comprenden una molécula de ácido nucleico no presente de forma natural en células progenitoras hepáticas humanas tempranas no modificadas o una molécula de ácido nucleico presente en un estado no natural en dichas células progenitoras hepáticas tempranas humanas (por ejemplo, ampliadas). La molécula de ácido nucleico puede haberse introducido en dichas células o en un ancestro de las mismas (como iPS, que contiene una mutación genética asociada a una enfermedad hepática).
Se pueden utilizar varios enfoques para modificar genéticamente células similares a hepatocitos humanos, como la administración de genes mediada por virus, la administración de genes no mediada por virus, el ADN desnudo, los tratamientos físicos, etc. Para este fin, generalmente se incorpora el ácido nucleico en un vector, como un virus recombinante, un plásmido, fago, episoma, cromosoma artificial, etc.
En una realización particular de la invención, las células similares a hepatocitos (HLC) o las células madre pluripotentes, se modifican genéticamente mediante un vector viral (o un virus recombinante) o un procedimiento no viral. En esta realización, el ácido nucleico heterólogo se introduce, por ejemplo, en un virus recombinante que luego se utiliza para infectar células similares a hepatocitos humanos (HLC). Se pueden utilizar diferentes tipos de virus recombinantes, en particular el lentivirus.
En una realización preferida, dicho lentivirus codifica una proteína inmortalizadora, como SV40T, hTERT, CDK4, etc. En otra realización preferida, dicho lentivirus codifica una proteína de tipo salvaje (presentando dicha proteína generalmente una mutación genética asociada a la enfermedad en pacientes que padecen una enfermedad hepática) como la proteína de tipo salvaje antitripsina (1 (AAT) o la familia UDP glucuronosiltransferasa 1, polipéptido A1 (UGT1A1). Otras mutaciones genéticas implicadas en enfermedades hepáticas han sido descritas previamente. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés (por ejemplo, una proteína inmortalizadora o una proteína de tipo salvaje usada para corregir un fenotipo de enfermedad) está unida operativamente a un promotor.
Alternativamente, dicho lentivirus codifica una proteína reportera o una proteína marcadora. Dicha proteína marcadora, que puede ser una proteína fluorescente o una proteína expresada en la superficie celular, permite la rápida identificación y el aislamiento de células similares a hepatocitos humanos (HLC) de interés.
La proteína marcadora puede, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en:
una proteína fluorescente, en particular la proteína fluorescente verde (GFP) o sus derivados, por ejemplo, la proteína fluorescente verde mejorada, las proteínas fluorescentes azules (EBFP, EBFP2, Azurita, mKalamal), las proteínas fluorescentes cian (ECFP, Cerúleo, CyPet) y las proteínas fluorescentes amarillas (YFP, EYFP, Citrina, Venus, YPet); y cualquier proteína expresada en la superficie celular que no se expresa de forma natural por las HLC.
Como se usa en el presente documento, el término "enlazado operativamente" significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Por lo tanto, una secuencia de ácido nucleico está "enlazada operativamente" cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia nucleica de secuencia. Por ejemplo, un promotor está "enlazado operativamente" a una secuencia de codificación si el promotor causa la transcripción de la secuencia de codificación. En general, enlazado operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico enlazadas son contiguas.
Como se usa en el presente documento, el término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN que determina el sitio de iniciación de la transcripción para un ARN polimerasa. Un promotor puede comprender un promotor de ARN polimerasa III que puede proporcionar altos niveles de expresión constitutiva a través de una variedad de tipos de células y será suficiente para dirigir la transcripción de una secuencia localizada distalmente, que es una secuencia enlazada al extremo 3' de la secuencia promotora en una célula. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, promotores constitutivos, regulados, específicos de tejido o ubicuos, que pueden ser de origen celular, viral o sintético. En una realización, el promotor es un promotor constitutivo tal como el factor-1 alfa de elongación humano (EF-1 alfa), etc.
En otra realización, el promotor es un promotor específico del hígado tal como 1-antitripsina humana, albúmina, etc. En otra realización, el promotor es una secuencia endógena (constitutiva o específica). En ese caso, la proteína de interés está enlazada al promotor endógeno mediante una tecnología de edición del genoma basada en el uso de una nucleasa artificial (por ejemplo: CRISPR/cas, ZFN, TALEN).
En otra realización, la modificación génica de células similares a hepatoblastos humanos se realiza mediante la tecnología de edición del genoma para modificar la secuencia génica endógena.
Es importante destacar que las células de linaje hepatocitario (HLC) son el objetivo de la enfermedad en una variedad de condiciones a menudo conocidas como "enfermedades hepáticas" (también denominadas "patología asociada con daño hepático"). Estos términos se refieren a cualquier enfermedad o condición clínica caracterizada por daño hepático, lesión, disfunción, defecto o anomalía. Por tanto, el término abarca, por ejemplo, lesiones, enfermedades degenerativas y enfermedades genéticas.
Las enfermedades hepáticas se están convirtiendo en una de las causas más comunes de mortalidad en los países en desarrollo. Este grupo de enfermedades que atacan a las células del linaje hepatocitario, como los hepatocitos que representan las células hepáticas dominantes, abarca trastornos metabólicos hereditarios (como el síndrome de Crigler-Najjar tipo I, la enfermedad por almacenamiento de glucógeno, los defectos del ciclo de la urea, la hipercolesterolemia familiar, la tirosinemia y la enfermedad de Wilson), insuficiencia hepática crónica, así como insuficiencia hepática aguda que puede ser causada por infección viral (en particular, infección por VHB o VHC), tóxicos (alcohol) y drogas o trastorno autoinmune (hepatitis autoinmune crónica, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria).
La divulgación describe además una composición farmacéutica que comprende la población de células similares a hepatoblastos humanos (por ejemplo, células similares a hepatoblastos o células similares a hepatocitos fetales) de acuerdo con la divulgación.
La composición farmacéutica puede incluir generalmente uno o más portadores, aditivos, antibióticos, conservantes, adyuvantes, diluyentes, disolventes y/o estabilizadores farmacéuticamente aceptables y aprobados. Dichas sustancias auxiliares pueden ser agua, solución salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH o similares. Los portadores adecuados son típicamente moléculas grandes, de metabolismo lento, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados de lípidos o similares. Esta composición farmacéutica puede contener aditivos adicionales tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros aditivos tales como antioxidantes o gases inertes, estabilizadores o proteínas recombinantes (por ejemplo, albúmina de suero humano) o vitaminas adecuadas para la administración in vivo.
Como se usa en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otras reacciones perjudiciales cuando se administran a un mamífero, especialmente a un ser humano, según corresponda. Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a un portador no sólido, semisólido o líquido no tóxico, diluyente, material envolvente o auxiliar de formulación de cualquier tipo.
Procedimientos de cribado de la invención
En otro aspecto de la divulgación, las células similares a hepatocitos humanos (es decir, hepatoblastos o células similares a hepatocitos fetales) de la descripción obtenidas de pacientes sanos o enfermos también pueden utilizarse ventajosamente para aplicaciones de cribado en la industria farmacéutica.
Dichas pruebas de cribado pueden utilizarse para buscar nuevos fármacos con aplicaciones clínicas o para pruebas de toxicología que evalúen la hepatotoxicidad de compuestos como los compuestos farmacéuticos candidatos. Las células similares a hepatoblastos humanos de acuerdo con la divulgación pueden ser útiles, por ejemplo, para generar modelos celulares de enfermedades hepáticas como se ha descrito anteriormente.
Por consiguiente, la divulgación describe además un procedimiento de cribado de un compuesto útil en el tratamiento de una enfermedad hepática que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una población de células similares a hepatoblastos humanos o células similares a hepatocitos fetales producida mediante un procedimiento de la invención con un compuesto de ensayo, y (b) determinar el efecto del compuesto de ensayo en dichas células similares a hepatoblastos humanos o células similares a hepatocitos fetales.
La divulgación describe además un procedimiento de cribado de compuestos que tienen un efecto hepatoprotector o hepatotóxico o hepatoproliferativo donde dicho procedimiento comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una población de células similares a hepatoblastos humanos o células similares a hepatocitos fetales producidas mediante un procedimiento de la invención con un compuesto de ensayo y; (b) comparar la supervivencia de las células de la etapa a) con la de una población de dichas células como se define anteriormente, cultivadas en ausencia de dicho compuesto de ensayo.
El término "hepatotóxico" se refiere a un compuesto que provoca una disminución en la supervivencia de las células progenitoras hepáticas. Se considera que un compuesto tiene un efecto hepatotóxico si el número de células viables cultivadas en presencia de dicho compuesto es menor que el número de células viables cultivadas en ausencia de dicho compuesto.
El término "hepatoprotector'' se refiere a un compuesto que produce un aumento de la supervivencia de las células progenitoras hepáticas Se considera que un compuesto tiene un efecto hepatoprotector si el número de células viables cultivadas en presencia de dicho compuesto es mayor que el número de células viables cultivadas en ausencia de dicho compuesto.
Típicamente, el efecto hepatoprotector se puede probar en ausencia de factores hepatotróficos. Alternativamente, el efecto hepatoprotector puede analizarse en presencia de un fármaco hepatotóxico conocido. Los fármacos hepatotóxicos conocidos incluyen, pero no se limitan a, amiodarona, metotrexato y nitrofurantoína.
El término "hepatoproliferativo" se refiere a un compuesto que produce un aumento de la proliferación de las células progenitoras hepáticas. Se considera que un compuesto tiene un efecto hepatoproliferativo si el número de células proliferativas cultivadas en presencia de dicho compuesto es mayor que el número de células viables cultivadas en ausencia de dicho compuesto. Típicamente, el efecto hepatoproliferativo se puede probar en ausencia de factores de crecimiento.
Compuestos de ensayo de la invención
En una realización, el compuesto de ensayo puede seleccionarse del grupo que consiste en péptidos, proteínas, peptidomiméticos, moléculas orgánicas pequeñas, aptámeros o ácidos nucleicos. Por ejemplo, el compuesto de ensayo de acuerdo con la descripción puede seleccionarse de una biblioteca de compuestos sintetizados previamente o de una biblioteca de compuestos cuya estructura se determina en una base de datos o de una biblioteca de compuestos que se han sintetizado de novo.
En una realización particular, el compuesto de ensayo puede seleccionarse de pequeñas moléculas orgánicas. Como se usa en el presente documento, el término "molécula orgánica pequeña" se refiere a una molécula de tamaño comparable a las moléculas orgánicas generalmente utilizadas en productos farmacéuticos. El término excluye macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, etc.); las moléculas orgánicas pequeñas preferidas varían en tamaño hasta 2000 Da y más preferentemente hasta aproximadamente 1000 Da.
En otra realización, el compuesto de ensayo puede seleccionarse del grupo que consiste en una biblioteca de ácidos nucleicos, que incluye, pero no se limita a, ARNsh, ARNmi, ARNm.
Modelos animales
La disponibilidad de células similares a hepatoblastos que pueden derivarse de ES o iPS humanas permite además diseñar modelos in vitro e in vivo de enfermedades hepáticas humanas y virus hepatotrópicos, en particular hepatitis B o C. Más específicamente, se puede proporcionar un modelo in vivo de enfermedades hepáticas humanas y virus hepatotrópicos mediante la repoblación del hígado de un mamífero no humano con células progenitoras hepáticas humanas tempranas.
Por consiguiente, la divulgación describe además el uso de células similares a hepatocitos humanos (es decir, células similares a hepatoblastos o células similares a hepatocitos fetales) obtenidas mediante un procedimiento de acuerdo con la invención para producir un huésped mamífero no humano que comprende hepatocitos humanos funcionales. Un procedimiento adecuado para producir un mamífero no humano quimérico que comprende hepatocitos humanos funcionales puede comprender la etapa que consiste en inyectar en el hígado dichas células similares a hepatocitos humanos de mamíferos no humanos (es decir, células similares a hepatoblastos o células similares a hepatocitos fetales ) de acuerdo con la descripción. Para favorecer el injerto de las HLC, el mamífero no humano puede recibir un tratamiento antimacrófago para controlar la defensa no adaptativa. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, administrando difosfonato de diclorometileno, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal de difosfonato de diclorometileno de liposoma encapsulado. Otras estrategias para favorecer el injerto de las HLC pueden depender de la estimulación de la regeneración del hígado antes de la inyección celular. Esto puede realizarse, por ejemplo, realizando una lesión hepática (por ejemplo, hepatectomía parcial, embolización química, irradiación hepática, hepatotoxinas, transgén) o administrando cualquier compuesto que estimule la proliferación de hepatocitos (factor de crecimiento de hepatocitos, hormona T3).
En otra estrategia, el injerto de las HLC también puede favorecerse al inhibir el potencial proliferativo de los hepatocitos endógenos en un hígado regenerado (animales jóvenes o hígado lesionado). Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, administrando retrorsina (inyección intraperitoneal), mitomicina C (inyección intraperitoneal) o hidrocloruro de propranolol (agua potable). Finalmente, el injerto de las HLC puede favorecerse administrando compuestos vasodilatadores. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, administrando trinitrato de glicerilo.
La divulgación describe además a un mamífero no humano quimérico que comprende hepatocitos humanos funcionales obtenidos u obtenibles mediante el procedimiento de la invención.
El mamífero no humano de la descripción puede ser cualquier mamífero no primate en el que se puedan introducir y mantener hepatocitos humanos. Esto incluye, pero no se limita a, caballos, ovejas, vacas, gatos, perros, ratas, hámsters, conejos, jerbos, cobayas y ratones. Preferentemente, el animal huésped es un roedor, más preferentemente aún un ratón. También puede ser un primate no humano (Macacus).
El mamífero no humano puede ser en particular un mamífero inmunocomprometido que generalmente será incapaz de preparar una respuesta inmune completa contra las células xenogénicas (hepatocitos humanos). Los huéspedes mamíferos inmunocomprometidos adecuados para la implantación existen o pueden crearse, por ejemplo, mediante la administración de uno o más compuestos (por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus) o debido a un defecto genético que resulta, por ejemplo, en una incapacidad para sufrir un reordenamiento de ADN en la línea germinal en los loci codificadores de inmunoglobulinas y receptores de antígeno de células T.
La funcionalidad de los hepatocitos humanos puede controlarse mediante la observación de los marcadores sustitutos de la actividad hepatocitaria, incluidos los productos fisiológicos de hepatocitos humanos distinguibles de sus mamíferos no humanos, en particular roedores, análogos por criterios inmunológicos o cuantitativos, por ejemplo, expresión de albúmina sérica humana o los niveles séricos de bilirrubina en animales deficientes para la actividad UGT1A1 (también conocida como bilirrubinemia), etc. Estos marcadores pueden utilizarse para determinar la presencia de células sin sacrificar el receptor.
El mamífero no humano quimérico que comprende hepatocitos humanos funcionales puede utilizarse en particular como un modelo in vivo de infección por hepatitis B humana.
Procedimientos y usos terapéuticos
Un campo de aplicación importante es la terapia celular o la medicina regenerativa. La medicina regenerativa se puede utilizar para curar potencialmente cualquier enfermedad que resulte de un mal funcionamiento, daño o falla del tejido, ya sea regenerando los tejidos dañados in vivo mediante la implantación directa in vivo de una composición farmacéutica que comprende células similares a hepatocitos (por ejemplo, células similares a hepatoblastos) de la descripción.
La divulgación describe también a una población de células humanas comprometidas en el linaje hepatocitario, pero no totalmente diferenciadas para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano. La descripción también se refiere a una población de células humanas comprometidas en el linaje hepatocitario, pero no totalmente diferenciadas para su uso en el tratamiento de una enfermedad hepática.
La divulgación describe también a una población de células similares a hepatocitos (por ejemplo, células similares a hepatoblastos) de la descripción para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano. En una realización, dicha población de células similares a hepatoblastos humanos es una población de dichas células que expresan el factor nuclear 4 alfa hepatocitario ((HNF4() y no expresan o no expresan sustancialmente alfa-fetoproteína (AFP) como se ha descrito anteriormente.
Más particularmente, un aspecto de la descripción se relaciona con una población de células similares a hepatocitos (por ejemplo, células similares a hepatoblastos) de la descripción para su uso en el tratamiento de una enfermedad hepática. En una realización, dicha población de células similares a hepatoblastos humanos es una población de dichas células que expresan el factor nuclear 4 alfa hepatocitario (HNF4() y no expresan o no expresan sustancialmente alfa-fetoproteína (AFP) como se ha descrito anteriormente.
La divulgación también describe a un procedimiento para tratar una enfermedad hepática que comprende la etapa de administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de una población de células similares a hepatocitos (por ejemplo, células similares a hepatoblastos) de la descripción a un paciente que la necesite.
En el contexto de la descripción, los términos "tratar" o "tratamiento", como se usan en el presente documento, se refieren a un procedimiento cuyo objetivo es retrasar o impedir el inicio de una patología, revertir, aliviar, inhibir, ralentizar o detener la progresión, agravación o deterioro de los síntomas de la patología, facilitar la mejoría de los síntomas de la patología y / o curar la patología.
Como se usa en el presente documento, el término "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a cualquier cantidad de una población de células similares a hepatoblastos humanos de acuerdo con la descripción (o una composición farmacéutica de la misma) que sea suficiente para lograr el propósito deseado.
Las dosis eficaces y los regímenes de administración pueden determinarse fácilmente mediante una buena práctica médica basada en la naturaleza de la patología del sujeto, y dependerá de una serie de factores que incluyen, entre otros, el alcance de los síntomas de la patología y el alcance del daño o la degeneración del tejido u órgano de interés y las características del sujeto (por ejemplo, edad, peso corporal, género, salud general y similares).
Para terapia, las poblaciones de células similares a hepatoblastos humanos y las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la descripción pueden administrarse a través de diferentes vías. Los expertos en la técnica pueden optimizar la dosis y el número de administraciones de una manera conocida.
En una realización, las células similares a hepatoblastos humanos de la descripción pueden ser útiles para la terapia autóloga regenerativa de un paciente que padece una enfermedad hepática que necesita terapia regenerativa debido a trastornos específicos o tratamientos asociados a dichos trastornos, incluyendo, sin limitación, Crigler-Najjar de tipo 1 (CN1) debido al déficit en un gen identificado que puede reemplazarse in vitro.
En una realización, la descripción se refiere a células similares a hepatoblastos humanos de la descripción para su uso como un producto de terapia celular para implantar en un paciente humano, como un injerto alogénico o, después de la corrección genética, como un injerto autólogo (es decir, las células tienen el mismo genotipo que las células del paciente).
En una realización, las células similares a hepatoblastos humanos de la descripción pueden ser útiles para hígados modificados por bioingeniería: ya sea por infusión junto con otras células de linaje hepático en un hígado descelularizado, por generación del hígado humano funcionalizado y vascularizado de las iPSCs humanas mediante trasplante de brotes hepáticos creados in vitro (Takebe y col., Nature 2013, 499), por impresión 3D o cualquier otro procedimiento para generar tejido hepático. En otra realización, las células similares a hepatoblastos humanos de la divulgación pueden ser útiles para hígados bioartificiales, ya sea infundiéndolos en dispositivos extracorpóreos o incrustándolos en una biomatriz o hidrogel (como alginato, hidroxipropilmetilcelulosa silanizada) antes de la infusión en el cuerpo.
La invención se ilustrará adicionalmente mediante las figuras y ejemplos siguientes. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invención.
FIGURAS:
Figura 1: Diferenciación hepática de células madre pluripotentes humanas en platos recubiertos con LN111. (A) Protocolo para diferenciar células humanas pluripotentes en células similares a hepatocitos. (BD) La diferenciación hepática se monitorizó a lo largo del tiempo mediante análisis por RT-qPCR para la expresión del ARNm del marcador de pluripotencia (panel B, SOX2), de marcadores endodérmicos (panel C, SOX17, FOXA2) y marcadores hepáticos (panel D, HNF4a, AAT, AFP , ALB, CK19, CYP3A4, CYP3A7, UGT1A1). (E) Secreción de proteínas hepáticas AFP en sobrenadantes celulares mediante ELISA. Los datos representan la media ± SEM. LN111: resultados con hiPSC diferenciados en platos revestidos con LN111; Matrigel: resultados con hiPSC diferenciados en platos recubiertos con Matrigel®. Figura 2: Trasplante de HLCS en los hígados de ratas Gunn. Niveles de bilirrubina sérica en ratas Gunn. La bilirrubinemia se monitorizó con el tiempo en ratas Gunn inmunodeprimidas con tacrolimus que recibieron IDHB 24 horas después de una hepatectomía parcial de dos tercios. Las ratas de control recibieron los mismos procedimientos quirúrgicos, pero no fueron trasplantadas. Figura 3: Diferenciación hepática de células madre pluripotentes humanas en platos recubiertos con LN521. La diferenciación hepática se monitorizó a lo largo del tiempo mediante análisis por RT-qPCR para la expresión de ARNm de marcadores endodérmicos (SOX17) y marcadores hepáticos (HNF4a, aAt , AFP, ALB y CK19).
EJEMPLO 1: USO DE LN-111 COMO MATRIZ PARA DIFERENCIAR CÉLULAS PLURIPOTENTES EN CÉLULAS DE LINAJE HEPATOCITARIO Y USO DE CÉLULAS SIMILARES A HEPATOBLASTOS OBTENIDAS DE ESTE MODO EN TERAPIA.
Material y procedimientos
Este estudio se realizó de acuerdo con la normativa francesa y europea.
Mantenimiento de hiPSC: Las líneas BBHX8 hiPSC [46] se mantuvieron en pocillos de cultivo recubiertos con Matrigel (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) en mTeSR1 (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 % con cambios de medio diarios. Las células se pasaron cada 5-7 días con reactivo de disociación de célula suave (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá).
Diferenciación hepática in vitro : La diferenciación hepática de células madre pluripotentes humanas se realizó siguiendo un protocolo de tres etapas basado en estudios anteriores [16, 20, 40] con algunas modificaciones. Primero, para la diferenciación endodérmica definitiva, las células se recolectaron mediante TrypLE (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.), se contaron con un contador automático de células ADAM (Labtech, Palaiseau, Francia) y luego, se recubrieron en placas (Costar; Corning Life Sciences, Acton, MA) recubiertas previamente con 5 pg/ml de laminina 111 (Biolamina, Sundbyberg, Suecia) o 2 mg/ml de Matrigel (BD Biosciences, San José, CA, EE. u U.) a una densidad celular de 75 x 103 células / cm2. Se cultivaron en RPMI 1640 complementado con un suplemento sin suero B27 (Life technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) (RPMI/B27), 100 ng/ml de activina A (Miltenyi Biotec, París, Francia), 50 ng/ml de WnT3A (R&D systems, Minneapolis, MN, EE. Uu .) y 10 pM de inhibidor de Rock (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) durante 1 día. El inhibidor de Rock y Wnt3A se omitieron del medio en los siguientes 2 días y 3 días, respectivamente. Los siguientes 4 días, las células se cultivaron en RPMI 1640/B27 que contenía 100 ng/ml de activina A y las células se cambiaron diariamente. En segundo lugar, para la especificación hepática, las células se cultivaron durante 2 días en RPMI/B27 complementado con 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 10 (Miltenyi Biotec, París, Francia) y 10 ng/ml de proteína morfogenética ósea (BMP) 4 (R&D systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) con cambio de medio diario. Las células se dividieron luego utilizando TrypLE en 3 placas previamente recubiertas con 5 pg/ml de laminina 111 o 2 mg/ml de Matrigel a una densidad celular de 70 x 103 células / cm2. Se cultivaron en RPMI/B27 complementado con 10 ng/ml de FGF10, 10 ng/ml de BMP-4 y 10 pM de inhibidor de rock durante 1 día y el inhibidor de rock se omitió del medio al día siguiente. Finalmente, para la maduración hepática, las células se cultivaron en medio de cultivo de hepatocitos (Lonza, Bále, Suiza) complementado con 20 ng/ml de factor de crecimiento hepatocitario (HGF) (Miltenyi Biotec, París, Francia) y 20 ng/ml de oncostatina M ( OSM) (Miltenyi Biotec, París, Francia) (medio de maduración) durante 4 días. Los días siguientes, se omitió el HGF del medio de cultivo y el medio se cambió cada 2 días.
Ensayo de inmunofluorescencia: Las células cultivadas se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % en PBS durante 15 minutos y se bloquearon con BSA al 3 % en PBS durante 15 minutos. Las células se incubaron con anticuerpos primarios durante una hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios contra AAT humana (1:100), CK19 (1:50) y AFP (1:300) se adquirieron de DAKO (DakoCytomation, Trappes, Francia); los anticuerpos contra Oct4 humano (1:100), HNF4( (1:100) se adquirieron de TebuBio (Le Perray-en-Yvelines, Francia). Después de realizaron varios lavados en PBS con Tritón al 0,1 %, con anticuerpos secundarios IgG anti-ratón, anti-cabra (ambos de Life Technologies) o anti-conejo (Abcam), conjugados con ALEXA 488, 555 o 647, diluido 1/1000 en PBS con BSA al 1 %, Tritón al 0,1 %, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se contrastaron posteriormente con DAPI, se diluyeron 1/10,000 en PBS, durante 1 minuto a temperatura ambiente y se leyeron en un microscopio de fluorescencia invertida (EvosFL de AMG). Para evaluar la proporción de células diferenciadas, se tomaron imágenes aleatorias de 10 diferenciaciones independientes y luego se contaron las células positivas para los marcadores de diferenciación junto con las células completas.
Citometría de flujo: Para la citometría de flujo, las células diferenciadas se incubaron durante 2 minutos con Accutase a 37 °C. Las células disociadas se fijaron con paraformaldehído al 0,25 % durante 30 minutos a 4 °C, luego se permeabilizaron con Tween-20 al 0,2 % en PBS durante 15 minutos a 37 °C. Las células se bloquearon con BSA / PBS al 3 % durante 30 min. / 4 °C en presencia o ausencia de anticuerpos primarios diluidos en BSA al 0,5 % en PBS. Después del lavado (con PBS), las células se incubaron con BSA / PBS al 3 % luego de una incubación de 20 minutos a 4 °C con un anticuerpo conjugado burro anti-ratón Alexa Fluor 488. El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando un citómetro de flujo BD LSR II (BD Biosciences).
Estudios en animales: Los animales se alojaron en las instalaciones para animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Nantes (Nantes, Francia) y se mantuvieron bajo un ciclo de luz de 12 horas, alimentados a voluntad y recibieron atención humana de acuerdo con las directrices del Ministerio de agricultura francés. En el estudio se utilizaron ratas Gunn homocigotos (j/j) con 120 ± 30 g de peso (edad: 8 - 9 semanas de edad).
Ensayos de función hepática: Se extrajo sangre del seno retro-orbital. La bilirrubina total en suero y las alanina y aspartato aminotransferasas se midieron en el departamento de bioquímica de rutina del hospital de la Universidad de Nantes.
Histología e inmunohistoquímica: La histología y la inmunohistoquímica fueron realizadas por la plataforma MicroPiCell (Nantes). Las secciones de hígado embebidas en parafina (5 pm) se incubaron con anticuerpos humanos Hep Par-1 (Clon OCH1E5, Dako). Las secciones del hígado se contratiñeron con hematoxilina.
RT-qPCR: El ARNm total se aisló de células cultivadas utilizando el minikit RNeasy (QIAGEN) de acuerdo con las especificaciones del fabricante o TRIzol® (Lifetechnology, Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARNm aislado se cuantificó utilizando un NanoDrop y se utilizó una cantidad total de 10 ng por reacción. Los análisis de las transcripciones se realizaron con un sistema de detección de secuencias ViiA7 (Life Technology, Carlsbad, CA, EE. UU.) utilizando el kit Power EXPRESS de un solo paso SYBR®GreenER®, (Life Technology, Carlsbad, CA, EE. UU.).
El procedimiento de PCR y el análisis de los datos de expresión génica relativa mediante el procedimiento de cuantificación de 2-00ot, después de la normalización a los valores de GAPDH, se realizaron como se ha descrito anteriormente. El nivel de expresión de ARNm se define como el cambio de frecuencia en los niveles de ARNm en una muestra dada en relación con los niveles en células indiferenciadas. El nivel de expresión de ARNm se calcula de la siguiente manera: nivel de expresión de ARNm = 2-®®et donde ®®Ct = (Ctdiana - CtGAPDH)muestra -(Ctdiana - CtGAPDH). Las amplificaciones específicas se verificaron mediante curvas de fusión de amplicón.
ELISA: La secreción de alfa-fetoproteína humana (AFP) (Calbiotech) y albúmina (Bethyl Laboratories) en el sobrenadante de cultivo se evaluó mediante ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Trasplante de hepatocitos: Las células se separaron (1 x 107 células) de las placas utilizando TrypLE, se lavaron, se resuspendieron en 200 pl de suero fisiológico y se inyectaron con una aguja de mariposa de calibre 26 en el polo esplénico inferior de ratas Gunn que se habían sometido 24 horas antes a una hepatectomía parcial de dos tercios para crear un entorno óptimo para el trasplante celular [48]. Las ratas se inmunosuprimieron diariamente con tacrolimus a 0,2 mg/kg un día antes del trasplante celular durante 3 días y luego a 0,1 mg/kg.
Análisis estadístico: Los datos se expresan como valores medios ± SEM. El análisis estadístico se realizó mediante el software GraphPad Prim® 5.04 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). La importancia estadística se evaluó mediante la prueba de Mann-Whitney para las comparaciones entre grupos. Un valor de < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Resultados
Modificamos y combinamos los protocolos informados previamente [16, 20, 36, 40] para desarrollar un procedimiento compatible con las BPF en condiciones químicamente definidas sin xeno, sin alimentador y factores recombinantes para producir HLC a partir de hiPSC. La laminina-111 (LN111) se expresa en el hígado fetal [41] y la isoforma de laminina presente principalmente en Matrigel®. Establecimos la hipótesis de que la LN111 constituiría una matriz extracelular eficiente para iniciar y apoyar la diferenciación hepática de hiPSC. Nuestro protocolo de diferenciación de 3 etapas para producir HLC in vitro se describe en la Figura 1A. Usamos la línea celular humana iPSC BBHX8, como una línea celular representativa conocida por diferenciarse en HLC [40, 42]. Cuando las hiPSC estaban en una confluencia del 70 - 90 %, las células se recolectaron y se colocaron en platos recubiertos con LN111 recombinante. Para obtener un proceso de diferenciación hepática más reproducible, las células se recolectaron enzimáticamente y las suspensiones de células individuales se contaron y se colocaron en platos nuevos recubiertos con LN111, en lugar de usar los procedimientos estándar basados en la visualización empírica de la densidad celular para evaluar el tiempo y la división de la relación celular para iniciar la producción de las HLC. En el día 0, las hiPSC dieron positivo para marcadores pluripotentes (Nanog, Sox 2) (Figura 1B) y dieron negativo para endodermo definitivo (Sox 17, FoxA2) (Figura 1C) y marcadores hepáticos (HNF4a, ALB, AFP, Citocromo P450) ( Figura 1D). Las células se trataron con activina A y factor básico de crecimiento de fibroblastos para generar un endodermo definitivo. Se utilizó una breve exposición a Wnt3a y al inhibidor de rock para mejorar la expresión del endodermo definitivo y la supervivencia celular después de la recolección celular enzimática, respectivamente [16, 36]. En el día 5, más del 80 - 90 % de las células expresaron fuertemente los marcadores endodérmicos definitivos SOX17 y FOXA2 y perdieron la expresión de genes pluripotentes (Figura 1B). Las células endodérmicas definitivas resultantes se cultivaron en presencia de FGF10 y BMP4, 2 factores críticos involucrados en las vías de señalización iniciales del desarrollo hepático embrionario temprano, como se ha descrito anteriormente [43]. Después de 3 días de tratamiento celular (día 8 de diferenciación), las células se pasaron enzimáticamente en nuevos platos recubiertos con LN111 para expandirlas y continuar la etapa de especificación hepática durante 3 días.
En el día 11, casi todas las células dan positivo para los marcadores expresados en progenitores hepáticos durante las primeras etapas del desarrollo hepático (HNF4a, CK19 y CYP3A7) (Figura 1D). Dieron negativo para alfafetoproteína (AFP), un marcador de hepatoblastos, albúmina (ALB), AAT (alfa-1 antitripsina) y citocromo P4503A4 (CYP3A4), que son marcadores de hepatocitos maduros. No expresaron SOX17 y tenían un nivel reducido de FOXA2. En conjunto, los resultados mostraron que tienen un fenotipo de hepatoblastos tempranos [44, 45]. Para dirigir la diferenciación en células similares a hepatoblastos (expresión de AFP), las células se cultivaron en presencia de OSM y HGF durante 4 días. Después del día 20, los hepatoblastos derivados de hiPSC expresaron HNF4a, CK19, AFP y CYP3A7 (una enzima CYP450 expresada en hepatocitos fetales) y adquirieron la expresión de algunos marcadores de hepatocitos maduros (ALB, AAT, UGT1A1, CYP3A4) y perdieron la expresión de FOXA2, tal como ha sido evaluado mediante los análisis por RT-qPCR (Figura 1D). De acuerdo con estos resultados, la secreción de AFP en el sobrenadante celular se confirmó mediante ensayos ELISA. Sin embargo, no detectamos la secreción de albúmina, probablemente debido a los bajos niveles de expresión del ARNm de albúmina (Figura 1E). Se obtuvieron resultados similares cuando las hiPSC se diferenciaron en platos recubiertos con Matrigel.
En conjunto, los resultados mostraron que la LN111 es tan eficiente como Matrigel para iniciar y apoyar la diferenciación hepática de hiPSC en nuestras condiciones de cultivo, pero con una matriz recombinante. Nuestro estudio amplió un estudio reciente que muestra que los platos recubiertos con LN111 permitían mantener la hiPSC en una etapa de células similares a hepatoblastos después del endodermo hiPSC y la especificación hepática en el plato recubierto con Matrigel [36]. Esto se corresponde con estudios anteriores que muestran que las HLC maduraron poco in vitro. En el día 20 - 30, nuestras HLC no secretaron albúmina, probablemente porque no realizamos el cultivo en presencia de dexametasona o DMSO que aumenta la madurez de las HLC. Las HLC altamente maduras se asemejan a los hepatocitos primarios humanos que pueden producirse si se cultivaran en cultivo en 3D o en condiciones de cocultivo de micropatrones [34, 46].
Para investigar la eficacia terapéutica, los niveles séricos de bilirrubina se monitorizaron a lo largo del tiempo después del trasplante de IDHB (día 11 de diferenciación hepática en platos recubiertos con LN111) en ratas Gunn inmunodeprimidas. Como se muestra en la Figura 2, hubo una reducción progresiva de los niveles basales de bilirrubina en el grupo tratado después del trasplante de células en el transcurso de 60 días. A partir de entonces, la disminución de la bilirrubinemia sérica persistió a un nivel de 28 ± 5 % a lo largo del estudio y fue estadísticamente significativo en comparación con los valores previos al trasplante (P < 0,05). La bilirrubina sérica en el grupo tratado fue de 57 ± 5 pM en el momento del sacrificio frente a 84 ± 11 pM para valores previos al trasplante (p = 0,005). A diferencia de las ratas tratadas, la bilirrubina sérica en el grupo de control no disminuyó y se mantuvo elevada con valores de hasta 150 pM. Los análisis inmunoquímicos revelaron la presencia de células que expresan el antígeno hepatocítico humano específico Hep Par-1, lo que confirma que las IDHB trasplantadas tenían la capacidad de contribuir al parénquima hepático. Las células humanas representaron menos del 1 % del hígado y se distribuyeron por todo el parénquima hepático, aunque predominantemente en el área periportal y principalmente como células individuales. Esto coincide con la baja eficacia de injerto de los hepatocitos normales en el hígado de los animales, en los que no hay ventajas de crecimiento selectivo de las células trasplantadas [37, 47-50]. La histología del hígado, así como de otros órganos (no mostrados) de todos los animales fue normal. Los niveles séricos de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) (marcadores establecidos de lesión hepatocitaria) en ratas tratadas fueron de 1,59 ± 0,21 pkat/L y de 1, 07 ± 0,16 pkat/L en el día 10 posterior al trasplante, respectivamente y de 2,07 ± 0,85 pkat/L y de 0,95 ± 0,19 pkat/L en el momento del sacrificio, respectivamente. Estos valores no fueron diferentes de los valores preoperatorios (AST:2,44 ± 1 pkat/L y ALT:1,46 ± 0,75 pkat/L) o los valores de las ratas de control en el día 10 después del trasplante (AST:1,59 ± 0,12 pkat/L y ALT:1,03 ± 0,12 pkat/L) y en el momento del sacrificio (AST:1,61 ± 0,53 pkat/L y ALT:1,13 ± 0,33 pkat/L). Los valores de gamma-glutamiltransferasa también fueron normales (< 0,05 pkat/L) en estos puntos temporales. Estos resultados mostraron que el animal se recuperó bien de los procedimientos quirúrgicos. Para seguir la funcionalidad in vivo de las células humanas trasplantadas, medimos la AFP humana y la albúmina humana en sueros de animales a lo largo del tiempo. En un animal, pudimos detectar niveles significativos de AFP humana en suero (sobre el fondo del suero de las ratas de control) en el día 11 posterior al trasplante celular (16 ng/ml) y que progresivamente se hizo indetectable a partir de ese momento. En otros dos animales, pudimos detectar la aparición de albúmina humana sérica a los 5 meses después del trasplante, aunque a un nivel muy bajo (6 y 23 pg/ml). No se detectó ningún nivel detectable de albúmina humana y AFP humana en los sueros de otras ratas Gunn injertadas, probablemente debido al número muy bajo de células humanas en el hígado.
En resumen, demostramos por primera vez la eficacia de un regenerativo basado en hiPSC para el tratamiento de una enfermedad metabólica hepática hereditaria en ausencia de cualquier ventaja de crecimiento selectivo de las células trasplantadas sobre los hepatocitos de roedores residentes, que es la situación encontrada en el trasplante de hepatocitos en humanos [9]. Después del trasplante de células en ratas Gunn adultas ictéricas, demostramos una disminución significativa de larga duración en la hiperbilirrubinemia. La eficacia terapéutica fue equivalente a la obtenida con la terapia génica ex vivo en la rata Gunn utilizando hepatocitos primarios de corrección lentiviral [51]. Cabe destacar que fue tan eficiente como el trasplante de hepatocitos aislados de hígados humanos recién nacidos y más alto que el de los hepatocitos aislados de hígados humanos adultos, que son las células estándar más valiosas para la terapia de células humanas para el tratamiento de la rata Gunn. En el presente estudio, las hiPSC se diferenciaron en células similares a hepatoblastos que no expresaban UGT1A1 para el trasplante celular. Nuestros resultados mostraron evidencias inequívocas de que se ha producido una maduración in situ para ganar la actividad de UGT1A1, que fue máxima a las 8 semanas después del trasplante. También pudimos detectar en algunos animales la expresión transitoria de la AFP sérica y la aparición de la producción de albúmina sérica. Nuestros resultados están en consonancia con estudios previos que muestran que los hepatocitos aislados del hígado fetal repueblan muy eficientemente el hígado huésped, donde adquirieron una maduración completa dentro de las 4 - 6 semanas [52, 53]. Recientemente, se ha informado que las hiPSC especificadas en hepatoblastos diferenciados (que expresan AFP y ALB) eran capaces de diferenciarse aún más en el hígado murino, donde perdieron la expresión de AFP [14, 23, 54]. Nuestro estudio indica ahora que las hiPSC especificadas en hepatoblastos eran capaces de repoblar el hígado de otras especies y adquirieron madurez in situ a un nivel suficiente para asegurar funciones hepáticas metabólicas en el contexto de una regeneración hepática normal.
Es importante destacar que el injerto hepático por las IDHB se mantuvo durante un largo período (6 meses) sin signos de formación de tumores (carcinoma o teratoma) y lesión hepática según lo evaluado por los análisis de los parámetros histológicos y sanguíneos. Al igual que los hepatocitos primarios normales trasplantados en hígados adultos [51], las IDHB repoblaron el hígado como células individuales, lo que sugiere que respondieron a los estímulos antiproliferativos una vez terminada la regeneración del hígado y el hígado volvió a la inactividad mitótica. Además, no se observó ningún teratoma 2 meses después de la inyección directa de IDHB en los testículos, lo que confirma la ausencia de hiPSC indiferenciada residual en la preparación celular de HLC.
Finalmente, nuestro estudio también proporciona un paso crucial hacia la aplicación clínica de la hiPSC para el tratamiento de enfermedades hepáticas hereditarias, ya que hemos producido las HLC mediante un protocolo de diferenciación hepática sin suero, sin xeno y químicamente definido que cumple con los criterios de producción de las BPF. Elegimos recolectar HLC en una etapa de progenitores hepáticos tempranos (expresión de HNF4-alfa y sin expresión de AFP) porque los progenitores hepáticos aislados de hígados fetales humanos tienen la capacidad de injertarse y migrar dentro del hígado del receptor trasplantado de manera más eficiente que los hepatocitos adultos.
[55-57]. También se ha demostrado que las células endodérmicas derivadas de hiPSC tienen mayor capacidad de injerto que las células progenitoras hepáticas que expresan AFP y hepatocitos en proceso de maduración (que expresan albúmina) [31]. Por el contrario, no trasplantamos células similares al endodermo (día 5 de diferenciación) para reducir el riesgo de hiPSC residual indiferenciada o de células no totalmente diferenciadas en las preparaciones celulares finales. Loh y col. observaron que los progenitores hepáticos tempranos derivados de hiPSC no podían injertarse en hígados de neonatos murinos. Esta discrepancia con los estudios mencionados anteriormente y el nuestro puede estar relacionada con un protocolo de diferenciación hepática diferente que conduce a una capacidad de injerto diferente de las HLC producidas (por ejemplo, Loh y col. utilizaron varios inhibidores de moléculas pequeñas), para la diferenciación en el receptor del hígado (hígados de neonatos frente a hígados de adultos).
La recolección en el día 11 de la diferenciación hepática (fin de la etapa de especificación hepática) también simplificó y redujo el tiempo de cultivo y facilitará la estandarización, reproducibilidad y reducirá el coste de la producción masiva de células.
En conclusión, existe una demanda clínica de hepatocitos humanos para el tratamiento de enfermedades hepáticas hereditarias, incluida la CN-1. Los progenitores hepáticos tempranos derivados de hiPSC o de hESC, cultivados en placas recubiertas con laminina podrían ser una alternativa clínica segura a los trasplantes de hígado y hepatocitos humanos aislados de hígados cadavéricos. Aunque el estudio se centró en las terapias para la CN-1, también proporcionó un avance significativo en el tratamiento de otras enfermedades hepáticas hereditarias, como las enfermedades del ciclo de la urea. De hecho, estas enfermedades podrían tratarse con un trasplante alogénico de hepatocitos [9] y, por lo tanto, se podrían aplicar directamente al enfoque de la medicina regenerativa utilizando células madre pluripotentes humanas normales. Como el acceso a las HLC no será limitado, el trasplante de hepatocitos podría repetirse para mantener o lograr beneficios terapéuticos satisfactorios.
EJEMPLO 2: Uso de LN-521 como matriz para diferenciar células pluripotentes en células de linaje hepatocitario. Curiosamente, la laminina-521 humana recombinante (LN-521) puede sustituir la LN-111 como matriz extracelular y se lograba una mejor diferenciación de hiPSC en endodermo definitivo y HLC según lo evaluado por los análisis de RT-qPCR de la expresión del gen de expresión de HNF4alpha, AFP, albúmina, AAT ( Figura 3).
REFERENCIAS:
A lo largo de esta solicitud, varias referencias describen el estado de la técnica al que pertenece esta invención. Las descripciones de estas referencias se incorporan en el presente documento como referencia a la presente descripción.
[1] K. Takahashi, K. Tanabe, M. Ohnuki, M. Narita, T. Ichisaka, K. Tomoda, S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131 (2007) 861-872. [2] J. Yu, M. A. Vodyanik, K. Smuga-Otto, J. Antosiewicz-Bourget, J. L. Frane, S. Tian, J. Nie, G. A. Jonsdottir, V. Ruotti, R. Stewart, Slukvin, II, J. A. Thomson, Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells, Science, 318 (2007) 1917-1920. [3] P. Menasche, V. Vanneaux, J. R. Fabreguettes, A. Bel, L. Tosca, S. Garcia, V. Bellamy, Y. Farouz, J. Pouly, O. Damour, M.C. Perier, M. Desnos, A. Hagege, O. Agbulut, P. Bruneval, G. Tachdjian, J. H. Trouvin, J. Larghero, Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience, European heart journal, (2014). [4] S. Nedelec, B. Onteniente, M. Peschanski, C. Martinat, Genetically-modified human pluripotent stem cells: new hopes for the understanding and the treatment of neurological diseases?, Curr Gene Ther, 13 (2013) 111­ 119. [5] N. Dianat, C. Steichen, L. Vallier, A. Weber, A. Dubart-Kupperschmitt, Human pluripotent stem cells for modelling human liver diseases and cell therapy, Curr Gene Ther, 13 (2013) 120-132. [6] S.D. Schwartz, C. D. Regillo, B. L. Lam, D. Eliott, P. J. Rosenfeld, N. Z. Gregori, J. P. Hubschman, J. L. Davis, G. Heilwell, M. Spirn, J. Maguire, R. Gay, J. Bateman, R. M. Ostrick, D. Morris, M. Vincent, E. Anglade, L. V. Del Priore, R. Lanza, Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies, Lancet, (2014). [7] F. W. Pagliuca, J. R. Millman, M. Gurtler, M. Segel, A. Van Dervort, J. H. Ryu, Q. P. Peterson, D. Greiner, D. A. Melton, Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro, Cell, 159 (2014) 428-439. [8] A. Rezania, J. E. Bruin, P. Arora, A. Rubin, I. Batushansky, A. Asadi, S. O'Dwyer, N. Quiskamp, M. Mojibian, T. Albrecht, Y. H. Yang, J. D. Johnson, T. J. Kieffer, Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells, Nat Biotechnol, 32 (2014) 1121­ 1133. [9] A. Dhawan, J. Puppi, R. D. Hughes, R. R. Mitry, Human hepatocyte transplantation: current experience and future challenges, Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 7 (2010) 288-298. [10] J. H. Waelzlein, J. Puppi, A. Dhawan, Hepatocyte transplantation for correction of inborn errors of metabolism, Current opinion in nephrology and hypertension, 18 (2009) 481-488. [11] I. J. Fox, J. R. Chowdhury, S. S. Kaufman, T. C. Goertzen, N. R. Chowdhury, P. I. Warkentin, K. Dorko, B. V. Sauter, S. C. Strom, Treatment of the Crigler-Najjar syndrome type I with hepatocyte transplantation, N Engl J Med, 338 (1998) 1422-1426. [12] C. Ribes-Koninckx, E. P. Ibars, M. A. Agrasot, A. Bonora-Centelles, B. P. Miquel, J. J. Vila Carbo, E. D. Aliaga, J. M. Pallardo, M. J. Gomez-Lechon, J. V. Castell, Clinical outcome of hepatocyte transplantation in four pediatric patients with inherited metabolic diseases, Cell Transplant, 21 (2012) 2267-2282. [13] K. Takayama, Y. Morisaki, S. Kuno, Y. Nagamoto, K. Harada, N. Furukawa, M. Ohtaka, K. Nishimura, K. Imagawa, F. Sakurai, M. Tachibana, R. Sumazaki, E. Noguchi, M. Nakanishi, K. Hirata, K. Kawabata, H. Mizuguchi, Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes, Proc Natl Acad Sci U S A, 111 (2014) 16772-16777. [14] A. Carpentier, A. Tesfaye, V. Chu, I. Nimgaonkar, F. Zhang, S. B. Lee, S. S. Thorgeirsson, S. M. Feinstone, T. J. Liang, Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model, J Clin Invest, 124 (2014) 4953-4964. [15] S. Gerbal-Chaloin, N. Funakoshi, A. Caillaud, C. Gondeau, B. Champon, K. Si-Tayeb, Human Induced Pluripotent Stem Cells in Hepatology: Beyond the Proof of Concept, Am J Pathol, 184 (2014) 332-347. [16] M. Kajiwara, T. Aoi, K. Okita, R. Takahashi, H. Inoue, N. Takayama, H. Endo, K. Eto, J. Toguchida, S. Uemoto, S. Yamanaka, Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells, Proc Natl Acad Sci U S A, 109 (2012) 12538-12543. [17] H. Basma, A. Soto-Gutierrez, G. R. Yannam, L. Liu, R. Ito, T. Yamamoto, E. Ellis, S. D. Carson, S. Sato, Y. Chen, D. Muirhead, N. Navarro-Alvarez, R. J. Wong, J. Roy-Chowdhury, J. L. Platt, D. F. Mercer, J. D. Miller, S. C. Strom, N. Kobayashi, I. J. Fox, Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes, Gastroenterology, 136 (2009) 990-999. [18] J. Cai, Y. Zhao, Y. Liu, F. Ye, Z. Song, H. Qin, S. Meng, Y. Chen, R. Zhou, X. Song, Y. Guo, M. Ding, H. Deng, Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells, Hepatology, 45 (2007) 1229-1239. [19] D.C. Hay, J. Fletcher, C. Payne, J.D. Terrace, R. C. Gallagher, J. Snoeys, J. R. Black, D. Wojtacha, K. Samuel, Z. Hannoun, A. Pryde, C. Filippi, I. S. Currie, S. J. Forbes, J. A. Ross, P. N. Newsome, J. P. Iredale, Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires Activin A and Wnt3a signaling, Proc Natl Acad Sci U S A, 105 (2008) 12301-12306. [20] K. Si-Tayeb, F. K. Noto, M. Nagaoka, J. Li, M.A. Battle, C. Duris, P. E. North, S. Dalton, S.A. Duncan, Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells, Hepatology, 51 (2010) 297-305. [21] G.J. Sullivan, D.C. Hay, I. H. Park, J. Fletcher, Z. Hannoun, C. M. Payne, D. Dalgetty, J. R. Black, J. A. Ross, K. Samuel, G. Wang, G. Q. Daley, J. H. Lee, G. M. Church, S. J. Forbes, J. P. Iredale, I. Wilmut, Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells, Hepatology, 51 (2010) 329-335. [22] M. Baxter, S. Withey, S. Harrison, C. P. Segeritz, F. Zhang, R. Atkinson-Dell, C. Rowe, D. T. Gerrard, R. Sison-Young, R. Jenkins, J. Henry, A. A. Berry, L. Mohamet, M. Best, S. W. Fenwick, H. Malik, N. R. Kitteringham, C. E. Goldring, K. P. Hanley, L. Vallier, N. A. Hanley, Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes, J Hepatol, (2014). [23] K. M. Loh, L. T. Ang, J. Zhang, V. Kumar, J. Ang, J. Q. Auyeong, K. L. Lee, S. H. Choo, C. Y. Lim, M. Nichane, J. Tan, M. S. Noghabi, L. Azzola, E. S. Ng, J. Durruthy-Durruthy, V. Sebastiano, L. Poellinger, A. G. Elefanty, E. G. Stanley, Q. Chen, S. Prabhakar, I. L. Weissman, B. Lim, Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations, Cell stem cell, 14 (2014) 237-252.
[24] K. Yusa, S. T. Rashid, H. Strick-Marchand, I. Varela, P. Q. Liu, D. E. Paschon, E. Miranda, A. Ordonez, N. R. Hannan, F. J. Rouhani, S. Darche, G. Alexander, S. J. Marciniak, N. Fusaki, M. Hasegawa, M. C. Holmes, J. P. Di Santo, D. A. Lomas, A. Bradley, L. Vallier, Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells, Nature, 478 (2011) 391-394. [25] S. E. Kim, S. Y. An, D. H. Woo, J. Han, J. H. Kim, Y. J. Jang, J. S. Son, H. Yang, Y. P. Cheon, J. H. Kim, Engraftment potential of spheroid-forming hepatic endoderm derived from human embryonic stem cells, Stem cells and development, 22 (2013) 1818-1829. [26] S. Asgari, M. Moslem, K. Bagheri-Lankarani, B. Pournasr, M. Miryounesi, H. Baharvand, Differentiation and transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells, Stem cell reviews, 9 (2013) 493-504. [27] M. Vosough, E. Omidinia, M. Kadivar, M.A. Shokrgozar, B. Pournasr, N. Aghdami, H. Baharvand, Generation of Functional Hepatocyte-Like Cells from Human Pluripotent Stem Cells in a Scalable Suspension Culture, Stem cells and development, 22 (2013) 2693­ 2705. [28] T. Takebe, K. Sekine, M. Enomura, H. Koike, M. Kimura, T. Ogaeri, R. R. Zhang, Y. Ueno, Y. W. Zheng, N. Koike, S. Aoyama, Y. Adachi, H. Taniguchi, Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant, Nature, 499 (2013) 481-484. [29] Y. F. Chen, C. Y. Tseng, H. W. Wang, H. C. Kuo, V. W. Yang, O. K. Lee, Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol, Hepatology, 55 (2012) 1193-1203. [30] H. Y. Li, Y. Chien, Y. J. Chen, S. F. Chen, Y. L. Chang, C. H. Chiang, S. Y. Jeng, C. M. Chang, M. L. Wang, L. K. Chen, S. I. Hung, T. I. Huo, S. D. Lee, S. H. Chiou, Reprogramming induced pluripotent stem cells in the absence of c-Myc for differentiation into hepatocyte-like cells, Biomaterials, 32 (2011) 5994­ 6005. [31] H. Liu, Y. Kim, S. Sharkis, L. Marchionni, Y. Y. Jang, In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins, Science translational medicine, 3 (2011) 82ra39. [32] S. Agarwal, K. L. Holton, R. Lanza, Efficient differentiation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells, Stem Cells, 26 (2008) 1117-1127. [33] A. Soto-Gutierrez, N. Kobayashi, J.D. Rivas-Carrillo, N. Navarro-Alvarez, D. Zhao, T. Okitsu, H. Noguchi, H. Basma, Y. Tabata, Y. Chen, K. Tanaka, M. Narushima, A. Miki, T. Ueda, H. S. Jun, J. W. Yoon, J. Lebkowski, N. Tanaka, I. J. Fox, Reversal of mouse hepatic failure using an implanted liver-assist device containing ES cell-derived hepatocytes, Nat Biotechnol, 24 (2006) 1412-1419. [34] D. R. Berger, B. R. Ware, M.D. Davidson, S. R. Allsup, S. R. Khetani, Enhancing the functional maturity of iPSC-derived human hepatocytes via controlled presentation of cell-cell interactions in vitro, Hepatology, (2014). [35] K. G. Chen, B. S. Mallon, R. D. McKay, P. G. Robey, Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics, Cell stem cell, 14 (2014) 13-26. [36] K. Takayama, Y. Nagamoto, N. Mimura, K. Tashiro, F. Sakurai, M. Tachibana, T. Hayakawa, K. Kawabata, H. Mizuguchi, Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes, Stem cell reports, 1 (2013) 322-335. [37] J. Birraux, O. Menzel, B. Wildhaber, C. Jond, T. H. Nguyen, C. Chardot, A step toward liver gene therapy: efficient correction of the genetic defect of hepatocytes isolated from a patient with Crigler-Najjar syndrome type 1 with lentiviral vectors, Transplantation, 87 (2009) 1006­ 1012. [38] P. A. Lysy, M. Najimi, X. Stephenne, A. Bourgois, F. Smets, E. M. Sokal, Liver cell transplantation for Crigler-Najjar syndrome type I: update and perspectives, World J Gastroenterol, 14 (2008) 3464-3470. [39] T. H. Nguyen, N. Ferry, Gene therapy for liver enzyme deficiencies: What have we learned from models for Crigler-Najjar and Tyrosinemia, Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 1 (2007) 155-177. [40] N. R. Hannan, C. P. Segeritz, T. Touboul, L. Vallier, Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells, Nature protocols, 8 (2013) 430-437. [41] P. Ekblom, P. Lonai, J. F. Talts, Expression and biological role of laminin-1, Matrix Biol, 22 (2003) 35-47. [42] S. Pauklin, L. Vallier, The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity, Cell, 155 (2013) 135-147. [43] T. Touboul, N. R. Hannan, S. Corbineau, A. Martinez, C. Martinet, S. Branchereau, S. Mainot, H. Strick-Marchand, R. Pedersen, J. Di Santo, A. Weber, L. Vallier, Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development, Hepatology, 51 (2010) 1754-1765. [44] G. Lanzoni, T. Oikawa, Y. Wang, C. B. Cui, G. Carpino, V. Cardinale, D. Gerber, M. Gabriel, J. Dominguez-Bendala, M. E. Furth, E. Gaudio, D. Alvaro, L. Inverardi, L. M. Reid, Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas, Stem Cells, 31 (2013) 2047-2060. [45] S.N. de Wildt, G. L. Kearns, J. S. Leeder, J.N. van den Anker, Cytochrome P4503A: ontogeny and drug disposition, Clinical pharmacokinetics, 37 (1999) 485-505. [46] R. L. Gieseck Iii, N. R. Hannan, R. Bort, N. A. Hanley, R. A. Drake, G. W. Cameron, T. A. Wynn, L. Vallier, Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture, PloS one, 9 (2014) e86372. [47] T. H. Nguyen, J. Birraux, B. Wildhaber, A. Myara, F. Trivin, C. Le Coultre, D. Trono, C. Chardot, Ex vivo lentivirus transduction and immediate transplantation of uncultured hepatocytes for treating hyperbilirubinemic Gunn rat, Transplantation, 82 (2006) 794-803.
[48] T. H. Nguyen, J. Oberholzer, J. Birraux, P. Majno, P. Morel, D. Trono, Highly efficient lentiviral vector-mediated transduction of nondividing, fully reimplantable primary hepatocytes, Mol Ther, 6 (2002) 199-209. [49] S. Gupta, P. Rajvanshi, R. Sokhi, S. Slehria, A. Yam, A. Kerr, P. M. Novikoff, Entry and integration of transplanted hepatocytes in rat liver plates occur by disruption of hepatic sinusoidal endothelium, Hepatology, 29 (1999) 509-519. [50] C. Guha, A. Sharma, S. Gupta, A. Alfieri, G. R. Gorla, S. Gagandeep, R. Sokhi, N. Roy-Chowdhury, K. E. Tanaka, B. Vikram, J. Roy-Chowdhury, Amelioration of radiation-induced liver damage in partially hepatectomized rats by hepatocyte transplantation, Cancer Res, 59 (1999) 5871-5874. [51] T. H. Nguyen, M. Bellodi-Privato, D. Aubert, V. Pichard, A. Myara, D. Trono, N. Ferry, Therapeutic lentivirus-mediated neonatal in vivo gene therapy in hyperbilirubinemic Gunn rats, Mol Ther, 12 (2005) 852-859. [52] T. Cantz, D. M. Zuckerman, M. R. Burda, M. Dandri, B. Goricke, S. Thalhammer, W. M. Heckl, M. P. Manns, J. Petersen, M. Ott, Quantitative gene expression analysis reveals transition of fetal liver progenitor cells to mature hepatocytes after transplantation in uPA/rAg -2 mice, Am J Pathol, 162 (2003) 37-45. [53] J. S. Sandhu, P. M. Petkov, M. D. Dabeva, D. A. Shafritz, Stem cell properties and repopulation of the rat liver by fetal liver epithelial progenitor cells, Am J Pathol, 159 (2001) 1323-1334. [54] S. Zhu, M. Rezvani, J. Harbell, A. N. Mattis, A. R. Wolfe, L. Z. Benet, H. Willenbring, S. Ding, Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts, Nature, 508 (2014) 93-97. [55] J. E. Allain, I. Dagher, D. Mahieu-Caputo, N. Loux, M. Andreoletti, K. Westerman, P. Briand, D. Franco, P. Leboulch, A. Weber, Immortalization of a primate bipotent epithelial liver stem cell, Proc Natl Acad Sci U S A, 99 (2002) 3639-3644. [56] J. P. Delgado, V. Vanneaux, J. Branger, T. Touboul, L. Sentilhes, S. Mainot, P. Lainas, P. Leclerc, G. Uzan, D. Mahieu-Caputo, A. Weber, The role of HGF on invasive properties and repopulation potential of human fetal hepatic progenitor cells, Exp Cell Res, 315 (2009) 3396-3405. [57] D. Mahieu-Caputo, J. E. Allain, J. Branger, A. Coulomb, J. P. Delgado, M. Andreoletti, S. Mainot, R. Frydman, P. Leboulch, J. P. Di Santo, F. Capron, A. Weber, Repopulation of athymic mouse liver by cryopreserved early human fetal hepatoblasts, Hum Gene Ther, 15 (2004) 1219-1228. [58] M. Black, B. H. Billing, K. P. Heirwegh, Determination of bilirubin UDP-glucuronyl transferase activity in needle-biopsy specimens of human liver, Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry, 29 (1970) 27-35. [59] M. Muraca, N. Blanckaert, Liquid-chromatographic assay and identification of mono- and diester conjugates of bilirubin in normal serum, Clin Chem, 29 (1983) 1767-1771.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Uso in vitro de una matriz consistente en laminina humana (LN) para la diferenciación hepática.
2. Uso in vitro de una matriz consistente en LN humana para inducir y/o mejorar la diferenciación de una población de células pluripotentes, una población de células multipotentes o una población de células endodérmicas definitivas (DE) en una población de células de linaje hepatocitario.
3. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la LN se selecciona del grupo que consiste en laminina-111 (LN-111), laminina-211 (LN-211), laminina-332 (LN-332), laminina-411 (LN-411) ), laminina-421 (LN-421), laminina-511 (LN-511) y laminina-521 (LN-521).
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la LN es una LN-111 humana recombinante o una LN-521 humana recombinante.
5. Un procedimiento in vitro para inducir la diferenciación hepática humana que comprende las etapas de: (i) cultivar una población de células DE humanas en un soporte recubierto con una matriz consistente en laminina humana en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatoblastos humanos, y
(ii) cultivar dicha población de células similares a hepatoblastos humanos en un soporte recubierto con una matriz consistente en laminina humana en un medio de maduración hepática para producir una población de células similares a hepatocitos fetales humanos.
6. Un procedimiento in vitro para inducir la diferenciación hepática humana que comprende las etapas de: (i) cultivar una población de células pluripotentes humanas en un soporte recubierto con una matriz consistente en laminina humana en un medio de inducción endodérmica para producir una población de células DE humanas, (ii) cultivar dicha población de células DE humanas en un soporte recubierto con una matriz consistente en laminina humana en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatoblastos humanos, y
(iii) cultivar dicha población de células similares a hepatoblastos humanos en un soporte recubierto con una matriz consistente en laminina humana en un medio de maduración hepática para producir una población de células similares a hepatocitos fetales humanos.
7. El procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en el que el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende proteína 4 morfogenética ósea (BMP4) y un factor de crecimiento de fibroblastos seleccionado de entre FGF10 y FGF2.
8. El procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde el medio de maduración hepática es un medio químicamente definido que comprende factor de crecimiento hepático (HGF) y oncostatina M (OSM).
9. El procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicación 6, donde el medio de inducción endodérmica es un medio químicamente definido que comprende al menos activina A y opcionalmente WNT3A.
10. El procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, donde el medio de inducción hepática y / o el medio de inducción endodérmico comprende además un inhibidor de ROCK.
11. El procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, donde las células similares a hepatoblastos humanos expresan el factor nuclear hepatocitario 4-alfa (HNF4() y no expresan o no expresan sustancialmente alfa-fetoproteína (AFP).
ES15305265T 2015-02-20 2015-02-20 Uso de una laminina para diferenciar células pluripotentes en células de linaje hepatocitario Active ES2703167T5 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15305265.9A EP3059307B2 (en) 2015-02-20 2015-02-20 Use of a laminin for differentiating pluripotent cells into hepatocyte lineage cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2703167T3 ES2703167T3 (es) 2019-03-07
ES2703167T5 true ES2703167T5 (es) 2022-09-30

Family

ID=52598699

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15305265T Active ES2703167T5 (es) 2015-02-20 2015-02-20 Uso de una laminina para diferenciar células pluripotentes en células de linaje hepatocitario
ES16705202T Active ES2940191T3 (es) 2015-02-20 2016-02-19 Uso de una laminina para diferenciar células pluripotentes en células de linaje hepatocitario

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16705202T Active ES2940191T3 (es) 2015-02-20 2016-02-19 Uso de una laminina para diferenciar células pluripotentes en células de linaje hepatocitario

Country Status (17)

Country Link
US (2) US20180030415A1 (es)
EP (2) EP3059307B2 (es)
JP (2) JP6840084B2 (es)
CN (2) CN107532144A (es)
CA (1) CA2986830A1 (es)
CY (1) CY1121243T1 (es)
DK (2) DK3059307T5 (es)
ES (2) ES2703167T5 (es)
FI (1) FI3259345T3 (es)
HR (2) HRP20182119T4 (es)
HU (2) HUE041518T2 (es)
LT (2) LT3059307T (es)
PL (2) PL3059307T5 (es)
PT (2) PT3059307T (es)
RS (2) RS58070B2 (es)
SI (2) SI3059307T2 (es)
WO (1) WO2016131959A1 (es)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2872620T3 (pl) * 2012-07-12 2020-08-24 Isletone Ab Wyprowadzenie i samoodnawianie komórek isl1+ i ich zastosowania
DK3059307T5 (da) * 2015-02-20 2022-08-29 Inst Nat Sante Rech Med Anvendelse af et laminin til differentiering af pluripotente celler i hepatocytcellelinier
US10683486B2 (en) 2015-10-30 2020-06-16 Biolamina Ab Methods for producing hepatocytes
WO2018019780A1 (en) * 2016-07-28 2018-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Non-human primate induced pluripotent stem cell derived hepatocytes and uses thereof
SG11201903428XA (en) * 2016-11-16 2019-05-30 Cynata Therapeutics Ltd Pluripotent stem cell assay
EP3583201B1 (en) * 2017-02-14 2024-01-17 University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education Methods of engineering human induced pluripotent stem cells to produce liver tissue
JP6950887B2 (ja) * 2017-04-28 2021-10-13 米満　吉和 体外型の人工肝臓、及び体外型の人工肝臓用又は肝細胞培養用の器具
US11655451B2 (en) 2017-05-05 2023-05-23 National University Of Singapore Methods for culturing human keratinocytes
EP3813853A4 (en) * 2018-06-29 2022-04-06 Platelet Biogenesis, Inc. DELIVERY COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
US11227435B2 (en) 2018-08-13 2022-01-18 Magic Leap, Inc. Cross reality system
CN117802031A (zh) * 2018-09-30 2024-04-02 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 肝细胞的体外扩增培养方法及应用
WO2020097555A1 (en) * 2018-11-09 2020-05-14 Children's Hospital Medical Center In vitro cell culture system for producing hepatocyte-like cells and uses thereof
CN111621467A (zh) * 2020-06-12 2020-09-04 青岛大学 一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法
CN115851578B (zh) * 2022-12-23 2023-11-21 华南理工大学 一种3d悬浮诱导持续扩增肝祖细胞类器官和/或肝细胞类器官的试剂盒及其应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
JP2005095138A (ja) * 2003-08-19 2005-04-14 Effector Cell Institute Inc 多分化能を有する細胞の分化誘導方法
US7332336B2 (en) * 2003-08-19 2008-02-19 Effector Cell Institute, Inc. Methods for inducing differentiation of pluripotent cells
US8354277B2 (en) 2004-10-12 2013-01-15 Technion Research & Development Foundation Ltd. Isolated primate embryonic cells derived from extended blastocysts
EP2208786B1 (en) 2005-12-13 2018-08-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
US8741643B2 (en) * 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
US8951799B2 (en) * 2007-01-04 2015-02-10 Biolamina Ab Composition and method for enabling proliferation of pluripotent stem cells
CN102083967B (zh) * 2007-07-20 2013-05-15 塞拉提斯股份公司 经由定型内胚层(DE-hep)衍生自人胚泡衍生干细胞的新肝细胞群体
KR101564044B1 (ko) 2007-10-31 2015-10-28 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 핵초기화 방법
JP2011516042A (ja) 2008-03-17 2011-05-26 へルムホルツ・ツェントルム・ミュンヘン−ドイチェス・フォルシュングスツェントルム・ヒューア・ゲズントハイト・ウント・ウムヴェルト（ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング） 部位特異的組み換えを用いて無ベクター誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製するベクターおよびその方法
WO2010042490A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Boston Medical Center Corporation A single lentiviral vector system for induced pluripotent (ips) stem cells derivation
JP2011010653A (ja) * 2009-06-05 2011-01-20 Kumamoto Univ 細胞の分化誘導方法
JP5745423B2 (ja) * 2009-10-28 2015-07-08 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 幹細胞から肝細胞への分化誘導方法
CA2805165A1 (en) * 2010-06-11 2011-12-15 Cellartis Ab 3-dimensional scaffolds for improved differentiation of pluripotent stem cells to hepatocytes
JP6002675B2 (ja) 2010-12-17 2016-10-05 ビオラミナ アーベー 細胞培養培地
CA2849244C (en) * 2011-09-22 2023-10-10 Karl Tryggvason Cell culture substrate comprising a laminin and a cadherin
US20130330825A1 (en) * 2012-06-07 2013-12-12 City Of Hope Attachment substrates for directed differentiation of human embryonic stem cells in culture
WO2014103534A1 (ja) * 2012-12-28 2014-07-03 国立大学法人大阪大学 コラーゲン結合性分子を付加した改変ラミニンおよびその利用
WO2014124527A1 (en) * 2013-02-18 2014-08-21 University Health Network Methods for generating hepatocytes and cholangiocytes from pluripotent stem cells
CN105189738A (zh) * 2013-04-08 2015-12-23 国立研究开发法人医药基盘·健康·营养研究所 肝母细胞样细胞的培养方法及其培养物
DK3059307T5 (da) 2015-02-20 2022-08-29 Inst Nat Sante Rech Med Anvendelse af et laminin til differentiering af pluripotente celler i hepatocytcellelinier

Also Published As

Publication number Publication date
SI3059307T2 (sl) 2022-08-31
HRP20182119T1 (hr) 2019-03-08
JP2021006054A (ja) 2021-01-21
EP3059307B2 (en) 2022-05-04
US20180030415A1 (en) 2018-02-01
HUE061457T2 (hu) 2023-06-28
SI3059307T1 (sl) 2019-03-29
PL3059307T3 (pl) 2019-05-31
PL3059307T5 (pl) 2023-04-03
RS58070B1 (sr) 2019-02-28
DK3259345T3 (da) 2023-03-27
HUE041518T2 (hu) 2019-05-28
EP3259345B1 (en) 2023-02-08
HRP20230302T1 (hr) 2023-05-12
LT3059307T (lt) 2019-01-10
WO2016131959A1 (en) 2016-08-25
EP3059307B1 (en) 2018-10-17
ES2703167T3 (es) 2019-03-07
CN107532144A (zh) 2018-01-02
RS64062B1 (sr) 2023-04-28
DK3059307T3 (en) 2019-01-14
CA2986830A1 (en) 2016-08-25
PL3259345T3 (pl) 2023-05-02
HRP20182119T4 (hr) 2022-09-02
ES2940191T3 (es) 2023-05-04
SI3259345T1 (sl) 2023-08-31
LT3259345T (lt) 2023-03-27
CY1121243T1 (el) 2020-05-29
PT3059307T (pt) 2019-01-23
EP3259345A1 (en) 2017-12-27
DK3059307T5 (da) 2022-08-29
JP7132463B2 (ja) 2022-09-07
FI3259345T3 (fi) 2023-04-03
PT3259345T (pt) 2023-03-15
RS58070B2 (sr) 2022-10-31
EP3059307A1 (en) 2016-08-24
DK3059307T4 (da) 2022-08-01
JP6840084B2 (ja) 2021-03-17
JP2018508207A (ja) 2018-03-29
US20240150721A1 (en) 2024-05-09
CN111548985A (zh) 2020-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2703167T5 (es) Uso de una laminina para diferenciar células pluripotentes en células de linaje hepatocitario
JP2018508207A5 (es)
JP6535043B2 (ja) 肝臓オルガノイド、その使用、およびそれを得るための培養方法
US9005964B2 (en) Endodermal progenitor cells
US10526581B2 (en) Modulation of cardiac stem-progenitor cell differentiation, assays and uses thereof
JP6603529B2 (ja) 再プログラム化多能性細胞の作製
CN103981147A (zh) 一种新的制备肝实质细胞的方法
US20140023624A1 (en) Decellularized liver transplantation composition and methods
Navarro-Alvarez et al. Intramuscular transplantation of engineered hepatic tissue constructs corrects acute and chronic liver failure in mice
JP7203427B2 (ja) ヒト人工多能性幹細胞を操作して肝臓組織を作製する方法
US20200385685A1 (en) Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells using transcription factor etv2
Eberle et al. Engineered MSCs from patient-specific iPS cells
CN111849859A (zh) 一种经基因编辑的功能性肝实质细胞的制备方法及其应用
Cortez-Toledo Generation of liver organoids using IPSC derived hepatocyte and endothelial cells for persistent secretion of factor VIII
Rose Persistent secretion of factor VIII by iPSC-derived endothelial cells for treatment of hemophilia A
Muggeo A STEP-BY-STEP PROCESS TO GENERATE FUNCTIONAL OSTEOCLASTS FROM SITE SPECIFIC GENE-CORRECTED INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS: AN AUTOLOGOUS CELL THERAPY APPROACH TO TREAT AUTOSOMAL RECESSIVE OSTEOPETROSIS.
Tafaleng Modeling the personalized variations in liver disease due to α1-antitrypsin deficiency using induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells