JP2018508207A - 多能性細胞を肝細胞系統の細胞へと分化させるためのラミニンの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、肝細胞分化のためのマトリックスとしてのラミニン（ＬＮ）の使用に関する。本発明はまた、肝細胞分化を誘導するための方法であって、（ｉ）ヒト多能性細胞の集団を提供するステップと、（ｉｉ）該集団を内胚葉誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒトＤＥ細胞の集団を生成するステップと、（ｉｉｉ）前記ヒトＤＥ細胞の集団を肝細胞誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒト肝芽細胞様細胞の集団を生成するステップと、（ｉｖ）任意選択で、前記ヒト肝芽細胞様細胞の集団を肝成熟培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒト肝細胞様細胞の集団を生成するステップと、を含む方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法によって取得されたヒト肝芽細胞様細胞またはヒト胎児肝細胞様細胞の集団に関する。本発明は、さらに、人体の治療方法における使用のための、ＨＮＦ４αを発現し、かつ実質的にＡＦＰを発現するヒト肝芽細胞様細胞の集団に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞分化および細胞療法の分野に関する。

その発見以来、ヒト誘導性多能性細胞（ｈｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、病変細胞を置換するための身体の任意の分化した細胞の再生可能な供給源として重点的に研究されてきた（非特許文献１、非特許文献２）。重度の心臓病（非特許文献３）、神経疾患（非特許文献４）、肝疾患（非特許文献５）、網膜疾患（非特許文献６）、糖尿病（非特許文献７、非特許文献８）のような広範囲の疾患の治療が想定されてきた。

肝疾患は世界中の何百万人もの人々が罹患する。今日まで、肝臓移植は、重度の代謝性肝障害を有する患者の唯一の治癒的選択肢である。欧米では、約３万７０００人の患者が肝臓移植待機リストに掲載される。欧州で年間５５００件を超える肝臓移植が行われ、遺伝性代謝疾患は適応症の２６％を占めている（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）。しかしながら、肝臓待機リストの患者の３分の１未満が毎年肝臓移植を受けることができ、肝臓移植の待機リストに掲載されつつ死亡する患者の数（約１０％）は、ドナー臓器の不足の結果、過去数年間で増加している。

過去１５年間に、死体の肝臓から単離した肝細胞を患者の肝臓に移植することは、特に肝機能が維持され、単一の酵素的欠損が存在する先天性代謝疾患のための肝臓移植の臨床的代替手段として現れた（非特許文献９、非特許文献１０）。移植されたヒト肝細胞の代謝機能の明確な証拠は、Ｉ型クリグラー−ナジャー（ＣＮ１）患者で初めて実証された（非特許文献１１）。細胞移植後、患者の臨床状態および生活の質は、５％のＵＧＴ１Ａ１活性の回復により改善され、ビリルビン血症および光線療法の処置の５０％の減少をもたらした。この精査研究は、主にＣＮ１および尿素サイクル障害を伴う遺伝性代謝性肝疾患に罹患した４０人を超える患者の治療の活路を見出し、糖原病Ｉ型、乳児レフサム病、進行性ＩＩ型家族性肝内胆汁うっ滞およびＶＩＩ型血友病の治療にも活路を見出した（非特許文献９）。肝細胞移植は、一部の子供が肝臓移植を待つ間に新たな神経損傷を避けることを可能にした。比較的少量の注入肝細胞（１．５〜２×１０９細胞）は、一部の罹患患者の代謝欠損を改善するのに十分であった。しかしながら、長期間の安定化効果は、反復的な細胞注入を確実に必要とする（非特許文献１２）。このアプローチは、臨床的な実施におけるその一般的かつ日常的な使用のための他の重大な制限を受ける。利用可能な肝臓移植は、肝臓移植のために優先順位付けされ、最低限度の品質のもののみが肝細胞単離のために使用される。これにより、単離された肝細胞はさまざまな品質および量である。それらは急速に脱分化し、培養で増殖することができず、凍結保存によく耐えることがない。まとめると、これらの制限は、機能性ヒト肝細胞の他の供給源を探索する必要性を強調する。

ここ数年の間、いくつかのグループは、肝臓胚発生段階を模倣する多様な培養条件を用いて、ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣの肝細胞様細胞（ＨＬＣ）へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化を報告した（非特許文献５、非特許文献１３〜２１）。ＨＬＣは完全に成熟した肝細胞の機能を示さなかったが、例えばＡＦＰを発現する胎児ヒト肝細胞に近い表現型を有していた（非特許文献２２）。構成的受容性である肝臓傷害および再生刺激を誘導するためにウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータを過剰発現するマウスのような、移植された肝細胞に対して選択的な増殖の利点をもたらすために化学的損傷、放射線照射または遺伝子操作された免疫不全動物の肝臓に、それらを移植することができ、移植後に肝機能をある程度延長し、かつ維持することができた（非特許文献５、非特許文献１４、非特許文献１７、非特許文献２３〜２５、非特許文献６０）。

いくつかの研究は、ＨＬＣの治療可能性を調べ、化学的に誘導された致死的な肝不全の様々なマウスモデルの治療に成功した（非特許文献２６〜３３）。それにもかかわらず、肝臓は内在性肝細胞から再生する顕著な能力を有する。それにより、急性肝不全からマウスを救出するには、ＨＬＣによる肝代謝機能の一時的な支援で十分である。対照的に、遺伝性肝疾患の治療のためには、ＨＬＣは、ｉｎ ｖｉｖｏで完全に分化し、長期間機能して、罹患動物において欠損する成熟肝代謝機能を発現しなければならない。これまで、移植されたＨＬＣがレシピエント肝臓において選択的な生存および増殖の利点を有さないヒト遺伝性肝疾患のモデル動物における代謝矯正の成功はいまだ実証されていない。

ＣＮ１の動物であるＧｕｎｎラットは、ＵＧＴ１Ａ１に自然変異を有し、出生直後にＵＧＴ１Ａ１活性の完全消失と高ビリルビン血症とを生じる。胆汁中に抱合ビリルビンが全く存在しないことは、ＵＧＴ１Ａ１活性の回復を評価するための容易で明瞭で感度の高い読み出しを提供する。したがって、Ｇｕｎｎラットは、移植された肝細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの肝細胞成熟および治療可能性を追跡するための貴重かつ便利なモデルを構成する。ＣＮ１患者の場合と同様に、肝細胞移植後のＵＧＴ１Ａ１活性の部分的修復は、有意な代謝矯正をもたらす（非特許文献３７〜３９）。

臨床使用のためにＨＬＣを検討する前に、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）適合性である肝細胞分化プロトコールを用いてＨＬＣを製造することも重要な問題である。現行の肝細胞分化のプロトコールは、フィーダー細胞−培養上清、血清、（マトリゲル（商標）のような）動物由来のマトリックス、マウスフィーダー細胞、肝細胞分化を改善するためのウイルスベクター、またはＧＭＰで利用できない小分子を共通して含んだ（非特許文献１５、非特許文献３４〜３６）。これらのすべてが、結果として得られる組織を将来の臨床応用と不適合であるものとする未知の因子の源である。

したがって、同種異系細胞療法のためのヒト肝細胞の臨床的要求が存在する。多能性幹細胞は、移植可能なＨＬＣの再生可能な供給源として集中的に研究されている。しかしながら、常在げっ歯類肝細胞において、ＨＬＣが移植された細胞の選択的な増殖の利点がない場合に、遺伝性代謝性肝疾患を治療することができることの実証は、いまだ待たれている。さらに、これまでに生成されたＨＬＣは、臨床応用には不適切なプロトコールを使用して製造された。

最近、ラミニン−５２１（ＬＮ−５２１）およびラミニン−１１１（ＬＮ−１１１）のようなラミニンは、細胞培養のための関連マトリックスとして、より詳細には、多能性細胞またはＨＬＣのような目的の細胞の長期ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の機能特性を維持するための関連マトリックスとして記載されているが、ラミニンが肝細胞分化を誘導および／または改善するのに有用であるとは開示も示唆もまったくなされていなかった。さらに、単独で使用されるラミニンマトリックスが多能性幹細胞株からの肝細胞分化の開始およびその後に続く肝細胞分化を支持し得ることを示唆する研究はなかった。

したがって、国際特許出願ＷＯ２０１２／０８０８４４は、ラミニン−５２１の新規使用に関する。実際、ラミニン−５２１は、幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの多能性を維持し、自己再生を可能にし、ヒト胚性幹細胞の単細胞生存を可能にすることができる。多能性ヒト胚性幹細胞を、分化阻害剤またはフィーダー細胞の非存在下で組換えラミニン−５２１でコーティングしたプレート上で培養すると、胚性幹細胞は増殖し、それらの多能性を維持する。

さらに、ヒト肝芽細胞様細胞は、マトリゲルコーティングされたディッシュ上の多能性細胞から最初に生成され（肝細胞分化の誘導）、次にラミニン−１１１コーティングされたディッシュ上で培養し、肝細胞様細胞と胆管細胞様細胞の両方に分化する潜在的能力を維持しつつ３ヶ月を超えて増殖させることができることが示されている（非特許文献３６）。

驚くべきことに、本出願人は、肝細胞様細胞分化におけるＬＮ−１１１およびＬＮ−５２１の新規な役割を発見した。ＬＮ−５２１のこの新規な役割は、ＷＯ２０１２／０８０８４４に記載されている多能性維持の役割とは反対のものである。

この出願全般にわたる様々な参考文献は、本発明が関係する技術水準を記載する。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。

Ｋ． Ｔａｋａｈａｓｈｉ、 Ｋ． Ｔａｎａｂｅ、 Ｍ． Ｏｈｎｕｋｉ、 Ｍ． Ｎａｒｉｔａ、 Ｔ． Ｉｃｈｉｓａｋａ、 Ｋ． Ｔｏｍｏｄａ、 Ｓ． Ｙａｍａｎａｋａ、 Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ、 Ｃｅｌｌ、 １３１（２００７）８６１−８７２． Ｊ． Ｙｕ、 Ｍ．Ａ． Ｖｏｄｙａｎｉｋ、 Ｋ． Ｓｍｕｇａ−Ｏｔｔｏ、 Ｊ． Ａｎｔｏｓｉｅｗｉｃｚ−Ｂｏｕｒｇｅｔ、 Ｊ．Ｌ． Ｆｒａｎｅ、 Ｓ． Ｔｉａｎ、 Ｊ． Ｎｉｅ、 Ｇ．Ａ． Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ、 Ｖ． Ｒｕｏｔｔｉ、 Ｒ． Ｓｔｅｗａｒｔ、 Ｓｌｕｋｖｉｎ， ＩＩ、 Ｊ．Ａ． Ｔｈｏｍｓｏｎ、 Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、 Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８（２００７）１９１７−１９２０． Ｐ． Ｍｅｎａｓｃｈｅ、 Ｖ． Ｖａｎｎｅａｕｘ、 Ｊ．Ｒ． Ｆａｂｒｅｇｕｅｔｔｅｓ、 Ａ． Ｂｅｌ、 Ｌ． Ｔｏｓｃａ、 Ｓ． Ｇａｒｃｉａ、 Ｖ． Ｂｅｌｌａｍｙ、 Ｙ． Ｆａｒｏｕｚ、 Ｊ． Ｐｏｕｌｙ、 Ｏ． Ｄａｍｏｕｒ、 Ｍ．Ｃ． Ｐｅｒｉｅｒ、 Ｍ． Ｄｅｓｎｏｓ、 Ａ． Ｈａｇｅｇｅ、 Ｏ． Ａｇｂｕｌｕｔ、 Ｐ． Ｂｒｕｎｅｖａｌ、 Ｇ． Ｔａｃｈｄｊｉａｎ、 Ｊ．Ｈ． Ｔｒｏｕｖｉｎ、 Ｊ． Ｌａｒｇｈｅｒｏ、 Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉａｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ： ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ、 Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｈｅａｒｔ ｊｏｕｒｎａｌ、（２０１４）． Ｓ． Ｎｅｄｅｌｅｃ、 Ｂ． Ｏｎｔｅｎｉｅｎｔｅ、 Ｍ． Ｐｅｓｃｈａｎｓｋｉ、 Ｃ． Ｍａｒｔｉｎａｔ、 Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： ｎｅｗ ｈｏｐｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ？、 Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１３（２０１３）１１１−１１９． Ｎ． Ｄｉａｎａｔ、 Ｃ． Ｓｔｅｉｃｈｅｎ、 Ｌ． Ｖａｌｌｉｅｒ、 Ａ． Ｗｅｂｅｒ、 Ａ． Ｄｕｂａｒｔ−Ｋｕｐｐｅｒｓｃｈｍｉｔｔ、 Ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ、 Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、 １３（２０１３）１２０−１３２． Ｓ．Ｄ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ、 Ｃ．Ｄ． Ｒｅｇｉｌｌｏ、 Ｂ．Ｌ． Ｌａｍ、 Ｄ． Ｅｌｉｏｔｔ、 Ｐ．Ｊ． Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、 Ｎ．Ｚ． Ｇｒｅｇｏｒｉ、 Ｊ．Ｐ． Ｈｕｂｓｃｈｍａｎ、 Ｊ．Ｌ． Ｄａｖｉｓ、 Ｇ． Ｈｅｉｌｗｅｌｌ、 Ｍ． Ｓｐｉｒｎ、 Ｊ． Ｍａｇｕｉｒｅ、 Ｒ． Ｇａｙ、 Ｊ． Ｂａｔｅｍａｎ、 Ｒ．Ｍ． Ｏｓｔｒｉｃｋ、 Ｄ． Ｍｏｒｒｉｓ、 Ｍ． Ｖｉｎｃｅｎｔ、 Ｅ． Ａｎｇｌａｄｅ、 Ｌ．Ｖ． Ｄｅｌ Ｐｒｉｏｒｅ、 Ｒ． Ｌａｎｚａ、 Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｒｇａｒｄｔ′ｓ ｍａｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ： ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ ｏｆ ｔｗｏ ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ ｐｈａｓｅ １／２ ｓｔｕｄｉｅｓ、 Ｌａｎｃｅｔ、 （２０１４）． Ｆ．Ｗ． Ｐａｇｌｉｕｃａ、 Ｊ．Ｒ． Ｍｉｌｌｍａｎ、 Ｍ． Ｇｕｒｔｌｅｒ、 Ｍ． Ｓｅｇｅｌ、 Ａ． Ｖａｎ Ｄｅｒｖｏｒｔ、 Ｊ．Ｈ． Ｒｙｕ、 Ｑ．Ｐ． Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、 Ｄ． Ｇｒｅｉｎｅｒ、 Ｄ．Ａ． Ｍｅｌｔｏｎ、 Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、 Ｃｅｌｌ、 １５９（２０１４）４２８−４３９． Ａ． Ｒｅｚａｎｉａ、 Ｊ．Ｅ． Ｂｒｕｉｎ、 Ｐ． Ａｒｏｒａ、 Ａ． Ｒｕｂｉｎ、 Ｉ． Ｂａｔｕｓｈａｎｓｋｙ、 Ａ． Ａｓａｄｉ、 Ｓ． Ｏ′Ｄｗｙｅｒ、 Ｎ． Ｑｕｉｓｋａｍｐ、 Ｍ． Ｍｏｊｉｂｉａｎ、 Ｔ． Ａｌｂｒｅｃｈｔ、 Ｙ．Ｈ． Ｙａｎｇ、 Ｊ．Ｄ． Ｊｏｈｎｓｏｎ、 Ｔ．Ｊ． Ｋｉｅｆｆｅｒ、 Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、 Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、 ３２（２０１４）１１２１−１１３３． Ａ． Ｄｈａｗａｎ、 Ｊ． Ｐｕｐｐｉ、 Ｒ．Ｄ． Ｈｕｇｈｅｓ、 Ｒ．Ｒ． Ｍｉｔｒｙ、 Ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ、 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ、 ７（２０１０）２８８−２９８． Ｊ．Ｈ． Ｗａｅｌｚｌｅｉｎ、 Ｊ． Ｐｕｐｐｉ、 Ａ． Ｄｈａｗａｎ、 Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｂｏｒｎ ｅｒｒｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、 Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、 １８（２００９）４８１−４８８． Ｉ．Ｊ． Ｆｏｘ、 Ｊ．Ｒ． Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、 Ｓ．Ｓ． Ｋａｕｆｍａｎ、 Ｔ．Ｃ． Ｇｏｅｒｔｚｅｎ、 Ｎ．Ｒ． Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、 Ｐ．Ｉ． Ｗａｒｋｅｎｔｉｎ、 Ｋ． Ｄｏｒｋｏ、 Ｂ．Ｖ． Ｓａｕｔｅｒ、 Ｓ．Ｃ． Ｓｔｒｏｍ、 Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｙｐｅ Ｉ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、 Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、 ３３８（１９９８）１４２２−１４２６． Ｃ． Ｒｉｂｅｓ−Ｋｏｎｉｎｃｋｘ、 Ｅ．Ｐ． Ｉｂａｒｓ、 Ｍ．Ａ． Ａｇｒａｓｏｔ、 Ａ． Ｂｏｎｏｒａ−Ｃｅｎｔｅｌｌｅｓ、 Ｂ．Ｐ． Ｍｉｑｕｅｌ、 Ｊ．Ｊ． Ｖｉｌａ Ｃａｒｂｏ、 Ｅ．Ｄ． Ａｌｉａｇａ、 Ｊ．Ｍ． Ｐａｌｌａｒｄｏ、 Ｍ．Ｊ． Ｇｏｍｅｚ−Ｌｅｃｈｏｎ、 Ｊ．Ｖ． Ｃａｓｔｅｌｌ、 Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｏｕｒ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ、 Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、 ２１（２０１２）２２６７−２２８２． Ｋ． Ｔａｋａｙａｍａ、 Ｙ． Ｍｏｒｉｓａｋｉ、 Ｓ． Ｋｕｎｏ、 Ｙ． Ｎａｇａｍｏｔｏ、 Ｋ． Ｈａｒａｄａ、 Ｎ． Ｆｕｒｕｋａｗａ、 Ｍ． Ｏｈｔａｋａ、 Ｋ． Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、 Ｋ． Ｉｍａｇａｗａ、 Ｆ． Ｓａｋｕｒａｉ、 Ｍ． Ｔａｃｈｉｂａｎａ、 Ｒ． Ｓｕｍａｚａｋｉ、 Ｅ． Ｎｏｇｕｃｈｉ、 Ｍ． Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、 Ｋ． Ｈｉｒａｔａ、 Ｋ． Ｋａｗａｂａｔａ、 Ｈ． Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ、 Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｉＰＳ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、 １１１（２０１４）１６７７２−１６７７７． Ａ． Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ、 Ａ． Ｔｅｓｆａｙｅ、 Ｖ． Ｃｈｕ、 Ｉ． Ｎｉｍｇａｏｎｋａｒ、 Ｆ． Ｚｈａｎｇ、 Ｓ．Ｂ． Ｌｅｅ、 Ｓ．Ｓ． Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ、 Ｓ．Ｍ． Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ、 Ｔ．Ｊ． Ｌｉａｎｇ、 Ｅｎｇｒａｆｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＨＣＶ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ、 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、 １２４（２０１４）４９５３−４９６４． Ｓ． Ｇｅｒｂａｌ−Ｃｈａｌｏｉｎ、 Ｎ． Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ、 Ａ． Ｃａｉｌｌａｕｄ、 Ｃ． Ｇｏｎｄｅａｕ、 Ｂ． Ｃｈａｍｐｏｎ、 Ｋ． Ｓｉ−Ｔａｙｅｂ、 Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ： Ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ Ｐｒｏｏｆ ｏｆ Ｃｏｎｃｅｐｔ、 Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、 １８４（２０１４）３３２−３４７． Ｍ． Ｋａｊｉｗａｒａ、 Ｔ． Ａｏｉ、 Ｋ． Ｏｋｉｔａ、 Ｒ． Ｔａｋａｈａｓｈｉ、 Ｈ． Ｉｎｏｕｅ、 Ｎ． Ｔａｋａｙａｍａ、 Ｈ． Ｅｎｄｏ、 Ｋ． Ｅｔｏ、 Ｊ． Ｔｏｇｕｃｈｉｄａ、 Ｓ． Ｕｅｍｏｔｏ、 Ｓ． Ｙａｍａｎａｋａ、 Ｄｏｎｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、 １０９（２０１２）１２５３８−１２５４３． Ｈ． Ｂａｓｍａ、 Ａ． Ｓｏｔｏ−Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ、 Ｇ．Ｒ． Ｙａｎｎａｍ、 Ｌ． Ｌｉｕ、 Ｒ． Ｉｔｏ、 Ｔ． Ｙａｍａｍｏｔｏ、 Ｅ． Ｅｌｌｉｓ、 Ｓ．Ｄ． Ｃａｒｓｏｎ、 Ｓ． Ｓａｔｏ、 Ｙ． Ｃｈｅｎ、 Ｄ． Ｍｕｉｒｈｅａｄ、 Ｎ． Ｎａｖａｒｒｏ−Ａｌｖａｒｅｚ、 Ｒ．Ｊ． Ｗｏｎｇ、 Ｊ． Ｒｏｙ−Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、 Ｊ．Ｌ． Ｐｌａｔｔ、 Ｄ．Ｆ． Ｍｅｒｃｅｒ、 Ｊ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｓ．Ｃ． Ｓｔｒｏｍ、 Ｎ． Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、 Ｉ．Ｊ． Ｆｏｘ、 Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ、 Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、 １３６（２００９）９９０−９９９． Ｊ． Ｃａｉ、 Ｙ． Ｚｈａｏ、 Ｙ． Ｌｉｕ、 Ｆ． Ｙｅ、 Ｚ． Ｓｏｎｇ、 Ｈ． Ｑｉｎ、 Ｓ． Ｍｅｎｇ、 Ｙ． Ｃｈｅｎ、 Ｒ． Ｚｈｏｕ、 Ｘ． Ｓｏｎｇ、 Ｙ． Ｇｕｏ、 Ｍ． Ｄｉｎｇ、 Ｈ． Ｄｅｎｇ、 Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、 Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、 ４５（２００７）１２２９−１２３９． Ｄ．Ｃ． Ｈａｙ、 Ｊ． Ｆｌｅｔｃｈｅｒ、 Ｃ． Ｐａｙｎｅ、 Ｊ．Ｄ． Ｔｅｒｒａｃｅ、 Ｒ．Ｃ． Ｇａｌｌａｇｈｅｒ、 Ｊ． Ｓｎｏｅｙｓ、 Ｊ．Ｒ． Ｂｌａｃｋ、 Ｄ． Ｗｏｊｔａｃｈａ、 Ｋ． Ｓａｍｕｅｌ、 Ｚ． Ｈａｎｎｏｕｎ、 Ａ． Ｐｒｙｄｅ、 Ｃ． Ｆｉｌｉｐｐｉ、 Ｉ．Ｓ． Ｃｕｒｒｉｅ、 Ｓ．Ｊ． Ｆｏｒｂｅｓ、 Ｊ．Ａ． Ｒｏｓｓ、 Ｐ．Ｎ． Ｎｅｗｓｏｍｅ、 Ｊ．Ｐ． Ｉｒｅｄａｌｅ、 Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈＥＳＣｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ＡｃｔｉｖｉｎＡ ａｎｄ Ｗｎｔ３ａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、 １０５（２００８）１２３０１−１２３０６． Ｋ． Ｓｉ−Ｔａｙｅｂ、 Ｆ．Ｋ． Ｎｏｔｏ、 Ｍ． Ｎａｇａｏｋａ、 Ｊ． Ｌｉ、 Ｍ．Ａ． Ｂａｔｔｌｅ、 Ｃ． Ｄｕｒｉｓ、 Ｐ．Ｅ． Ｎｏｒｔｈ、 Ｓ． Ｄａｌｔｏｎ、 Ｓ．Ａ． Ｄｕｎｃａｎ、 Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、 Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、 ５１（２０１０）２９７−３０５． Ｇ．Ｊ． Ｓｕｌｌｉｖａｎ、 Ｄ．Ｃ． Ｈａｙ、 Ｉ．Ｈ． Ｐａｒｋ、 Ｊ． Ｆｌｅｔｃｈｅｒ、 Ｚ． Ｈａｎｎｏｕｎ、 Ｃ．Ｍ． Ｐａｙｎｅ、 Ｄ． Ｄａｌｇｅｔｔｙ、 Ｊ．Ｒ． Ｂｌａｃｋ、 Ｊ．Ａ． Ｒｏｓｓ、 Ｋ． Ｓａｍｕｅｌ、 Ｇ． Ｗａｎｇ、 Ｇ．Ｑ． Ｄａｌｅｙ、 Ｊ．Ｈ． Ｌｅｅ、 Ｇ．Ｍ． Ｃｈｕｒｃｈ、 Ｓ．Ｊ． Ｆｏｒｂｅｓ、 Ｊ．Ｐ． Ｉｒｅｄａｌｅ、 Ｉ． Ｗｉｌｍｕｔ、 Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、 Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ５１（２０１０）３２９−３３５． Ｍ． Ｂａｘｔｅｒ、 Ｓ． Ｗｉｔｈｅｙ、 Ｓ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ、 Ｃ．Ｐ． Ｓｅｇｅｒｉｔｚ、 Ｆ． Ｚｈａｎｇ、 Ｒ． Ａｔｋｉｎｓｏｎ−Ｄｅｌｌ、 Ｃ． Ｒｏｗｅ、 Ｄ．Ｔ． Ｇｅｒｒａｒｄ、 Ｒ． Ｓｉｓｏｎ−Ｙｏｕｎｇ、 Ｒ． Ｊｅｎｋｉｎｓ、 Ｊ． Ｈｅｎｒｙ、 Ａ．Ａ． Ｂｅｒｒｙ、 Ｌ． Ｍｏｈａｍｅｔ、 Ｍ． Ｂｅｓｔ、 Ｓ．Ｗ． Ｆｅｎｗｉｃｋ、 Ｈ． Ｍａｌｉｋ、 Ｎ．Ｒ． Ｋｉｔｔｅｒｉｎｇｈａｍ、 Ｃ．Ｅ． Ｇｏｌｄｒｉｎｇ、 Ｋ．Ｐ． Ｈａｎｌｅｙ、 Ｌ． Ｖａｌｌｉｅｒ、 Ｎ．Ａ． Ｈａｎｌｅｙ、 Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ｓｈｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｂｅｔｔｅｒ ｍｉｍｉｃ ｆｅｔａｌ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ａｄｕｌｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ、 Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ、（２０１４）． Ｋ．Ｍ． Ｌｏｈ、 Ｌ．Ｔ． Ａｎｇ、 Ｊ． Ｚｈａｎｇ、 Ｖ． Ｋｕｍａｒ、 Ｊ． Ａｎｇ、 Ｊ．Ｑ． Ａｕｙｅｏｎｇ、 Ｋ．Ｌ． Ｌｅｅ、 Ｓ．Ｈ． Ｃｈｏｏ、 Ｃ．Ｙ． Ｌｉｍ、 Ｍ． Ｎｉｃｈａｎｅ、 Ｊ． Ｔａｎ、 Ｍ．Ｓ． Ｎｏｇｈａｂｉ、 Ｌ． Ａｚｚｏｌａ、 Ｅ．Ｓ． Ｎｇ、 Ｊ． Ｄｕｒｒｕｔｈｙ−Ｄｕｒｒｕｔｈｙ、 Ｖ． Ｓｅｂａｓｔｉａｎｏ、 Ｌ． Ｐｏｅｌｌｉｎｇｅｒ、 Ａ．Ｇ． Ｅｌｅｆａｎｔｙ、 Ｅ．Ｇ． Ｓｔａｎｌｅｙ、 Ｑ． Ｃｈｅｎ、 Ｓ． Ｐｒａｂｈａｋａｒ、 Ｉ．Ｌ． Ｗｅｉｓｓｍａｎ、 Ｂ． Ｌｉｍ、 Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｌｉｎｅａｇｅ ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎｓ、 Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、 １４（２０１４）２３７−２５２． Ｋ． Ｙｕｓａ、 Ｓ．Ｔ． Ｒａｓｈｉｄ、 Ｈ． Ｓｔｒｉｃｋ−Ｍａｒｃｈａｎｄ、 Ｉ． Ｖａｒｅｌａ、 Ｐ．Ｑ． Ｌｉｕ、 Ｄ．Ｅ． Ｐａｓｃｈｏｎ、 Ｅ． Ｍｉｒａｎｄａ、 Ａ． Ｏｒｄｏｎｅｚ、 Ｎ．Ｒ． Ｈａｎｎａｎ、 Ｆ．Ｊ． Ｒｏｕｈａｎｉ、 Ｓ． Ｄａｒｃｈｅ、 Ｇ． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、 Ｓ．Ｊ． Ｍａｒｃｉｎｉａｋ、 Ｎ． Ｆｕｓａｋｉ、 Ｍ． Ｈａｓｅｇａｗａ、 Ｍ．Ｃ． Ｈｏｌｍｅｓ、 Ｊ．Ｐ． Ｄｉ Ｓａｎｔｏ、 Ｄ．Ａ． Ｌｏｍａｓ、 Ａ． Ｂｒａｄｌｅｙ、 Ｌ． Ｖａｌｌｉｅｒ、 Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ４７８（２０１１）３９１−３９４． Ｓ．Ｅ． Ｋｉｍ、 Ｓ．Ｙ． Ａｎ、 Ｄ．Ｈ． Ｗｏｏ、 Ｊ． Ｈａｎ、 Ｊ．Ｈ． Ｋｉｍ、 Ｙ．Ｊ． Ｊａｎｇ、 Ｊ．Ｓ． Ｓｏｎ、 Ｈ． Ｙａｎｇ、 Ｙ．Ｐ． Ｃｈｅｏｎ、 Ｊ．Ｈ． Ｋｉｍ、 Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｓｐｈｅｒｏｉｄ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、 Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、 ２２（２０１３）１８１８−１８２９． Ｓ． Ａｓｇａｒｉ、 Ｍ． Ｍｏｓｌｅｍ、 Ｋ． Ｂａｇｈｅｒｉ−Ｌａｎｋａｒａｎｉ、 Ｂ． Ｐｏｕｒｎａｓｒ、 Ｍ． Ｍｉｒｙｏｕｎｅｓｉ、 Ｈ． Ｂａｈａｒｖａｎｄ、 Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ、 Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｖｉｅｗｓ、 ９（２０１３）４９３−５０４． Ｍ． Ｖｏｓｏｕｇｈ、 Ｅ． Ｏｍｉｄｉｎｉａ、 Ｍ． Ｋａｄｉｖａｒ、 Ｍ．Ａ． Ｓｈｏｋｒｇｏｚａｒ、 Ｂ． Ｐｏｕｒｎａｓｒ、 Ｎ． Ａｇｈｄａｍｉ、 Ｈ． Ｂａｈａｒｖａｎｄ、 Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−Ｌｉｋｅ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ、 Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、 ２２（２０１３）２６９３−２７０５． Ｔ． Ｔａｋｅｂｅ、 Ｋ． Ｓｅｋｉｎｅ、 Ｍ． Ｅｎｏｍｕｒａ、 Ｈ． Ｋｏｉｋｅ、 Ｍ． Ｋｉｍｕｒａ、 Ｔ． Ｏｇａｅｒｉ、 Ｒ．Ｒ． Ｚｈａｎｇ、 Ｙ． Ｕｅｎｏ、 Ｙ．Ｗ． Ｚｈｅｎｇ、 Ｎ． Ｋｏｉｋｅ、 Ｓ． Ａｏｙａｍａ、 Ｙ． Ａｄａｃｈｉ、 Ｈ． Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、 Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｆｒｏｍ ａｎ ｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎ ｂｕｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ４９９（２０１３）４８１−４８４． Ｙ．Ｆ． Ｃｈｅｎ、 Ｃ．Ｙ． Ｔｓｅｎｇ、 Ｈ．Ｗ． Ｗａｎｇ、 Ｈ．Ｃ． Ｋｕｏ、 Ｖ．Ｗ． Ｙａｎｇ、 Ｏ．Ｋ． Ｌｅｅ、 Ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｐ ｐｒｏｔｏｃｏｌ、 Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、 ５５（２０１２）１１９３−１２０３． Ｈ．Ｙ． Ｌｉ、 Ｙ． Ｃｈｉｅｎ、 Ｙ．Ｊ． Ｃｈｅｎ、 Ｓ．Ｆ． Ｃｈｅｎ、 Ｙ．Ｌ． Ｃｈａｎｇ、 Ｃ．Ｈ． Ｃｈｉａｎｇ、 Ｓ．Ｙ． Ｊｅｎｇ、 Ｃ．Ｍ． Ｃｈａｎｇ、 Ｍ．Ｌ． Ｗａｎｇ、 Ｌ．Ｋ． Ｃｈｅｎ、 Ｓ．Ｉ． Ｈｕｎｇ、 Ｔ．Ｉ． Ｈｕｏ、 Ｓ．Ｄ． Ｌｅｅ、 Ｓ．Ｈ． Ｃｈｉｏｕ、 Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃ−Ｍｙｃ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ、 Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、 ３２（２０１１）５９９４−６００５． Ｈ． Ｌｉｕ、 Ｙ． Ｋｉｍ、 Ｓ． Ｓｈａｒｋｉｓ、 Ｌ． Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ、 Ｙ．Ｙ． Ｊａｎｇ、 Ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｏｒｉｇｉｎｓ、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 ３（２０１１）８２ｒａ３９． Ｓ． Ａｇａｒｗａｌ、 Ｋ．Ｌ． Ｈｏｌｔｏｎ、 Ｒ． Ｌａｎｚａ、 Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、 Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、 ２６（２００８）１１１７−１１２７． Ａ． Ｓｏｔｏ−Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ、 Ｎ． Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、 Ｊ．Ｄ． Ｒｉｖａｓ−Ｃａｒｒｉｌｌｏ、 Ｎ． Ｎａｖａｒｒｏ−Ａｌｖａｒｅｚ、 Ｄ． Ｚｈａｏ、 Ｔ． Ｏｋｉｔｓｕ、 Ｈ． Ｎｏｇｕｃｈｉ、 Ｈ． Ｂａｓｍａ、 Ｙ． Ｔａｂａｔａ、 Ｙ． Ｃｈｅｎ、 Ｋ． Ｔａｎａｋａ、 Ｍ． Ｎａｒｕｓｈｉｍａ、 Ａ． Ｍｉｋｉ、 Ｔ． Ｕｅｄａ、 Ｈ．Ｓ． Ｊｕｎ、 Ｊ．Ｗ． Ｙｏｏｎ、 Ｊ． Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ、 Ｎ． Ｔａｎａｋａ、 Ｉ．Ｊ． Ｆｏｘ、 Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｆａｉｌｕｒｅ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｌｉｖｅｒ−ａｓｓｉｓｔ ｄｅｖｉｃｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＥＳ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ、 Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、 ２４（２００６）１４１２−１４１９． Ｄ．Ｒ． Ｂｅｒｇｅｒ、 Ｂ．Ｒ． Ｗａｒｅ、 Ｍ．Ｄ． Ｄａｖｉｄｓｏｎ、 Ｓ．Ｒ． Ａｌｌｓｕｐ、 Ｓ．Ｒ． Ｋｈｅｔａｎｉ、 Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｔｕｒｉｔｙ ｏｆ ｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｖｉａ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、 Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、 （２０１４）． Ｋ．Ｇ． Ｃｈｅｎ、 Ｂ．Ｓ． Ｍａｌｌｏｎ、 Ｒ．Ｄ． ＭｃＫａｙ、 Ｐ．Ｇ． Ｒｏｂｅｙ、 Ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ： ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ、 ｅｘｐａｎｓｉｏｎ、 ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、 Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、 １４（２０１４）１３−２６． Ｋ． Ｔａｋａｙａｍａ、 Ｙ． Ｎａｇａｍｏｔｏ、 Ｎ． Ｍｉｍｕｒａ、 Ｋ． Ｔａｓｈｉｒｏ、 Ｆ． Ｓａｋｕｒａｉ、 Ｍ． Ｔａｃｈｉｂａｎａ、 Ｔ． Ｈａｙａｋａｗａ、 Ｋ． Ｋａｗａｂａｔａ、 Ｈ． Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ、 Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｓｅｌｆ−Ｒｅｎｅｗａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ Ｃｅｌｌｓ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｌａｍｉｎｉｎ １１１−Ｃｏａｔｅｄ Ｄｉｓｈｅｓ、 Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ、 １（２０１３）３２２−３３５． Ｊ． Ｂｉｒｒａｕｘ、 Ｏ． Ｍｅｎｚｅｌ、 Ｂ． Ｗｉｌｄｈａｂｅｒ、 Ｃ． Ｊｏｎｄ、 Ｔ．Ｈ． Ｎｇｕｙｅｎ、 Ｃ． Ｃｈａｒｄｏｔ、 Ａ ｓｔｅｐ ｔｏｗａｒｄ ｌｉｖｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ： ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｅｆｅｃｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｙｐｅ １ ｗｉｔｈ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ、 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、 ８７（２００９）１００６−１０１２． Ｐ．Ａ． Ｌｙｓｙ、 Ｍ． Ｎａｊｉｍｉ、 Ｘ． Ｓｔｅｐｈｅｎｎｅ、 Ａ． Ｂｏｕｒｇｏｉｓ、 Ｆ． Ｓｍｅｔｓ、 Ｅ．Ｍ． Ｓｏｋａｌ、 Ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｙｐｅ Ｉ： ｕｐｄａｔｅ ａｎｄ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ、 Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、 １４（２００８）３４６４−３４７０． Ｔ．Ｈ． Ｎｇｕｙｅｎ、 Ｎ． Ｆｅｒｒｙ、 Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｅｎｚｙｍｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ： Ｗｈａｔ ｈａｖｅ ｗｅ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ ａｎｄ Ｔｙｒｏｓｉｎｅｍｉａ、 Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ、 １（２００７）１５５−１７７． Ｎ．Ｒ． Ｈａｎｎａｎ、 Ｃ．Ｐ． Ｓｅｇｅｒｉｔｚ、 Ｔ． Ｔｏｕｂｏｕｌ、 Ｌ． Ｖａｌｌｉｅｒ、 Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、 Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、 ８（２０１３）４３０−４３７． Ｐ． Ｅｋｂｌｏｍ、 Ｐ． Ｌｏｎａｉ、 Ｊ．Ｆ． Ｔａｌｔｓ、 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ−１、 Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ、 ２２（２００３）３５−４７． Ｓ． Ｐａｕｋｌｉｎ、 Ｌ． Ｖａｌｌｉｅｒ、 Ｔｈｅ ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ、 Ｃｅｌｌ、 １５５（２０１３）１３５−１４７． Ｔ． Ｔｏｕｂｏｕｌ、 Ｎ．Ｒ． Ｈａｎｎａｎ、 Ｓ． Ｃｏｒｂｉｎｅａｕ、 Ａ． Ｍａｒｔｉｎｅｚ、 Ｃ． Ｍａｒｔｉｎｅｔ、 Ｓ． Ｂｒａｎｃｈｅｒｅａｕ、 Ｓ． Ｍａｉｎｏｔ、 Ｈ． Ｓｔｒｉｃｋ−Ｍａｒｃｈａｎｄ、 Ｒ． Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、 Ｊ． Ｄｉ Ｓａｎｔｏ、 Ａ． Ｗｅｂｅｒ、 Ｌ． Ｖａｌｌｉｅｒ、 Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ ｌｉｖｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、 Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、 ５１（２０１０）１７５４−１７６５． Ｇ． Ｌａｎｚｏｎｉ、 Ｔ． Ｏｉｋａｗａ、 Ｙ． Ｗａｎｇ、 Ｃ．Ｂ． Ｃｕｉ、 Ｇ． Ｃａｒｐｉｎｏ、 Ｖ． Ｃａｒｄｉｎａｌｅ、 Ｄ． Ｇｅｒｂｅｒ、 Ｍ． Ｇａｂｒｉｅｌ、 Ｊ． Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｂｅｎｄａｌａ、 Ｍ．Ｅ． Ｆｕｒｔｈ、 Ｅ． Ｇａｕｄｉｏ、 Ｄ． Ａｌｖａｒｏ、 Ｌ． Ｉｎｖｅｒａｒｄｉ、 Ｌ．Ｍ． Ｒｅｉｄ、 Ｃｏｎｃｉｓｅ ｒｅｖｉｅｗ： ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｓ、 Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、 ３１（２０１３）２０４７−２０６０． Ｓ．Ｎ． ｄｅ Ｗｉｌｄｔ、 Ｇ．Ｌ． Ｋｅａｒｎｓ、 Ｊ．Ｓ． Ｌｅｅｄｅｒ、 Ｊ．Ｎ． ｖａｎ ｄｅｎ Ａｎｋｅｒ、 Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ３Ａ： ｏｎｔｏｇｅｎｙ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ、 Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、 ３７（１９９９）４８５−５０５． Ｒ．Ｌ． Ｇｉｅｓｅｃｋ Ｉｉｉ、 Ｎ．Ｒ． Ｈａｎｎａｎ、 Ｒ． Ｂｏｒｔ、 Ｎ．Ａ． Ｈａｎｌｅｙ、 Ｒ．Ａ． Ｄｒａｋｅ、 Ｇ．Ｗ． Ｃａｍｅｒｏｎ、 Ｔ．Ａ． Ｗｙｎｎ、 Ｌ． Ｖａｌｌｉｅｒ、 Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ３Ｄ−Ｃｕｌｔｕｒｅ、 ＰｌｏＳ ｏｎｅ、 ９（２０１４）ｅ８６３７２． Ｔ．Ｈ． Ｎｇｕｙｅｎ、 Ｊ． Ｂｉｒｒａｕｘ、 Ｂ． Ｗｉｌｄｈａｂｅｒ、 Ａ． Ｍｙａｒａ、 Ｆ． Ｔｒｉｖｉｎ、 Ｃ． Ｌｅ Ｃｏｕｌｔｒｅ、 Ｄ． Ｔｒｏｎｏ、 Ｃ． Ｃｈａｒｄｏｔ、 Ｅｘ ｖｉｖｏ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉｃ Ｇｕｎｎ ｒａｔ、 Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、 ８２（２００６）７９４−８０３． Ｔ．Ｈ． Ｎｇｕｙｅｎ、 Ｊ． Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒ、 Ｊ． Ｂｉｒｒａｕｘ、 Ｐ． Ｍａｊｎｏ、 Ｐ． Ｍｏｒｅｌ、 Ｄ． Ｔｒｏｎｏ、 Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ、 ｆｕｌｌｙ ｒｅｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ、 Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、 ６（２００２）１９９−２０９． Ｓ． Ｇｕｐｔａ、 Ｐ． Ｒａｊｖａｎｓｈｉ、 Ｒ． Ｓｏｋｈｉ、 Ｓ． Ｓｌｅｈｒｉａ、 Ａ． Ｙａｍ、 Ａ． Ｋｅｒｒ、 Ｐ．Ｍ． Ｎｏｖｉｋｏｆｆ、 Ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｐｌａｔｅｓ ｏｃｃｕｒ ｂｙ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ、 Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、 ２９（１９９９）５０９−５１９． Ｃ． Ｇｕｈａ、 Ａ． Ｓｈａｒｍａ、 Ｓ． Ｇｕｐｔａ、 Ａ． Ａｌｆｉｅｒｉ、 Ｇ．Ｒ． Ｇｏｒｌａ、 Ｓ． Ｇａｇａｎｄｅｅｐ、 Ｒ． Ｓｏｋｈｉ、 Ｎ． Ｒｏｙ−Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、 Ｋ．Ｅ． Ｔａｎａｋａ、 Ｂ． Ｖｉｋｒａｍ、 Ｊ． Ｒｏｙ−Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、 Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｒａｔｓ ｂｙ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、 ５９（１９９９）５８７１−５８７４． Ｔ．Ｈ． Ｎｇｕｙｅｎ、 Ｍ． Ｂｅｌｌｏｄｉ−Ｐｒｉｖａｔｏ、 Ｄ． Ａｕｂｅｒｔ、 Ｖ． Ｐｉｃｈａｒｄ、 Ａ． Ｍｙａｒａ、 Ｄ． Ｔｒｏｎｏ、 Ｎ． Ｆｅｒｒｙ、 Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｏｎａｔａｌ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉｃ Ｇｕｎｎ ｒａｔｓ、 Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、 １２（２００５）８５２−８５９． Ｔ． Ｃａｎｔｚ、 Ｄ．Ｍ． Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ、 Ｍ．Ｒ． Ｂｕｒｄａ、 Ｍ． Ｄａｎｄｒｉ、 Ｂ． Ｇｏｒｉｃｋｅ、 Ｓ． Ｔｈａｌｈａｍｍｅｒ、 Ｗ．Ｍ． Ｈｅｃｋｌ、 Ｍ．Ｐ． Ｍａｎｎｓ、 Ｊ． Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、 Ｍ． Ｏｔｔ、 Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｍａｔｕｒｅ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｕＰＡ／ＲＡＧ−２ ｍｉｃｅ、 Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、 １６２（２００３）３７−４５． Ｊ．Ｓ． Ｓａｎｄｈｕ、 Ｐ．Ｍ． Ｐｅｔｋｏｖ、 Ｍ．Ｄ． Ｄａｂｅｖａ、 Ｄ．Ａ． Ｓｈａｆｒｉｔｚ、 Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｂｙ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ、 Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、 １５９（２００１）１３２３−１３３４． Ｓ． Ｚｈｕ、 Ｍ． Ｒｅｚｖａｎｉ、 Ｊ． Ｈａｒｂｅｌｌ、 Ａ．Ｎ． Ｍａｔｔｉｓ、 Ａ．Ｒ． Ｗｏｌｆｅ、 Ｌ．Ｚ． Ｂｅｎｅｔ、 Ｈ． Ｗｉｌｌｅｎｂｒｉｎｇ、 Ｓ． Ｄｉｎｇ、 Ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ５０８（２０１４）９３−９７． Ｊ．Ｅ． Ａｌｌａｉｎ、 Ｉ． Ｄａｇｈｅｒ、 Ｄ． Ｍａｈｉｅｕ−Ｃａｐｕｔｏ、 Ｎ． Ｌｏｕｘ、 Ｍ． Ａｎｄｒｅｏｌｅｔｔｉ、 Ｋ． Ｗｅｓｔｅｒｍａｎ、 Ｐ． Ｂｒｉａｎｄ、 Ｄ． Ｆｒａｎｃｏ、 Ｐ． Ｌｅｂｏｕｌｃｈ、 Ａ． Ｗｅｂｅｒ、 Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｉｍａｔｅ ｂｉｐｏｔｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｖｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、 ９９（２００２）３６３９−３６４４． Ｊ．Ｐ． Ｄｅｌｇａｄｏ、 Ｖ． Ｖａｎｎｅａｕｘ、 Ｊ． Ｂｒａｎｇｅｒ、 Ｔ． Ｔｏｕｂｏｕｌ、 Ｌ． Ｓｅｎｔｉｌｈｅｓ、 Ｓ． Ｍａｉｎｏｔ、 Ｐ． Ｌａｉｎａｓ、 Ｐ． Ｌｅｃｌｅｒｃ、 Ｇ． Ｕｚａｎ、 Ｄ． Ｍａｈｉｅｕ−Ｃａｐｕｔｏ、 Ａ． Ｗｅｂｅｒ、 Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＨＧＦ ｏｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｈｅｐａｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ、 Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、 ３１５（２００９）３３９６−３４０５． Ｄ． Ｍａｈｉｅｕ−Ｃａｐｕｔｏ、 Ｊ．Ｅ． Ａｌｌａｉｎ、 Ｊ． Ｂｒａｎｇｅｒ、 Ａ． Ｃｏｕｌｏｍｂ、 Ｊ．Ｐ． Ｄｅｌｇａｄｏ、 Ｍ． Ａｎｄｒｅｏｌｅｔｔｉ、 Ｓ． Ｍａｉｎｏｔ、 Ｒ． Ｆｒｙｄｍａｎ、 Ｐ． Ｌｅｂｏｕｌｃｈ、 Ｊ．Ｐ． Ｄｉ Ｓａｎｔｏ、 Ｆ． Ｃａｐｒｏｎ、 Ａ． Ｗｅｂｅｒ、 Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｈｙｍｉｃ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ ｂｙ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｅａｒｌｙ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｓ、 Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、 １５（２００４）１２１９−１２２８． Ｍ． Ｂｌａｃｋ、 Ｂ．Ｈ． Ｂｉｌｌｉｎｇ、 Ｋ．Ｐ． Ｈｅｉｒｗｅｇｈ、 Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｎｅｅｄｌｅ−ｂｉｏｐｓｙ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ、 Ｃｌｉｎｉｃａ ｃｈｉｍｉｃａ ａｃｔａ； ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ２９（１９７０）２７−３５． Ｍ． Ｍｕｒａｃａ、 Ｎ． Ｂｌａｎｃｋａｅｒｔ、 Ｌｉｑｕｉｄ−ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏ− ａｎｄ ｄｉｅｓｔｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｓｅｒｕｍ、 Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、 ２９（１９８３）１７６７−１７７１． Ｃｈｅｎ Ｙ、 Ｌｉ Ｙ、 Ｗａｎｇ Ｘ、 Ｚｈａｎｇ Ｗ、 Ｓａｕｅｒ Ｖ、 Ｃｈａｎｇ ＣＪ、 Ｈａｎ Ｂ、 Ｔｃｈａｉｋｏｖｓｋａｙａ Ｔ、 Ａｖｓａｒ Ｙ、 Ｔａｆａｌｅｎｇ Ｅ、 Ｍａｄｈｕｓｕｄａｎａ Ｇｉｒｉｊａ Ｓ、 Ｔａｒ Ｋ、 Ｐｏｌｇａｒ Ｚ、 Ｓｔｒｏｍ Ｓ、 Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａ ＥＥ、 Ｇｕｈａ Ｃ、 Ｆｏｘ ＩＪ、 Ｒｏｙ−Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ Ｊ、 Ｒｏｙ−Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ Ｎ．． Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉａ ｉｎ Ｇｕｎｎ Ｒａｔｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．（２０１５）５（１）：２２−３０． Ｔｏｌｏｓａ Ｌ、 Ｌ ｏｐｅｚ Ｓ、 Ｐａｒｅｊａ Ｅ、 Ｄｏｎａｔｏ ＭＴ、 Ｍｙａｒａ Ａ、 Ｎｇｕｙｅｎ ＴＨ、 Ｃａｓｔｅｌｌ ＪＶ、 Ｇｏｍｅｚ−Ｌｅｃｈｏｎ ＭＪ． Ｈｕｍａｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉａ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｕｎｎ ｒａｔ． Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌ． ２０１５ Ｊｕｎ；２１（６）：８０１−１１． Ｅｎｇｒａｆｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＨＣＶ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ． Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ Ａ、 Ｔｅｓｆａｙｅ Ａ、 Ｃｈｕ Ｖ、 Ｎｉｍｇａｏｎｋａｒ Ｉ、 Ｚｈａｎｇ Ｆ、 Ｌｅｅ ＳＢ、 Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ ＳＳ、 Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ ＳＭ、 Ｌｉａｎｇ ＴＪ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１４ Ｎｏｖ；１２４（１１）：４９５３−６４． Ｃｏｏｐｅｒ ＡＲら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２００９；１３：２６２２ｅ３３；Ｒｏｄｉｎ Ｓら、Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ、２０１４；５：３１９５． Ｓｅｅｂａｃｈｅｒ Ｔら、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １９９７；２３７（１）：７０−６． Ｉ． Ｖｉｒｔａｎｅｎ、 Ｄら、Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２０００；２５７：２９８−３０９．

第１の実施態様において、本発明は、ラミニン（ＬＮ）の肝細胞分化のためのマトリックスとしての使用に関する。

第２の実施態様において、本発明は、多能性細胞の集団または多分化能細胞の集団または胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の集団の、肝細胞系統細胞の集団への分化を誘導および／または改善するためのＬＮの使用に関する。

第３の実施態様において、本発明は、ヒト肝細胞分化を誘導するための方法であって、
（ｉ）ヒトＤＥ細胞の集団を提供するステップと、
（ｉｉ）該集団を肝細胞誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒト肝芽細胞様細胞の集団を生成するステップと、
（ｉｉｉ）任意選択で、ヒト肝芽細胞様細胞の集団を肝細胞成熟培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒト胎児肝細胞様細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法に関する。

第４の実施態様において、本発明は、肝細胞分化を誘導するための方法であって、
（ｉ）ヒト多能性細胞の集団を提供するステップと、
（ｉｉ）該集団を内胚葉誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体で培養して、ヒトＤＥ細胞の集団を生成するステップと、
（ｉｉｉ）ヒトＤＥ細胞の集団を肝細胞誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒト肝芽細胞様細胞の集団を生成するステップと、
（ｉｖ）任意選択で、前記ヒト肝芽細胞の集団を肝細胞成熟培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒト胎児肝細胞様細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法に関する。

第５の実施態様において、本発明は、本発明の方法によって得られるヒト肝芽細胞様細胞の集団に関する。

第６の実施態様において、本発明は、人体を治療する方法において使用するための、本発明のヒト肝芽細胞様細胞の集団に関する。

第７の実施態様において、本発明は、本発明の方法によって得られるヒト胎児肝細胞様細胞の集団に関する。

第８の実施態様において、本発明は、ラミニンでコーティングされた支持体と、ＢＭＰ４、およびＦＧＦ２またはＦＧＦ１０のような線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーとを含む、ヒト肝細胞分化を誘導するためのキットに関する。

ＬＮ１１１コーティングディッシュ中でのヒト多能性幹細胞の肝細胞分化。（Ａ）多能性ヒト細胞を肝細胞様細胞に分化させるプロトコール。（Ｂ〜Ｄ）肝細胞分化が、多能性マーカー（パネルＢ、ＳＯＸ２）、内胚葉マーカー（パネルＣ、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２）および肝細胞マーカー（パネルＤ、ＨＮＦ４ａ、ＡＡＴ、ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＣＫ１９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＵＧＴ１Ａ１）のｍＲＮＡ発現についてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析により、経時的に観察された。（Ｅ）ＥＬＩＳＡによる細胞上清中の肝細胞タンパク質ＡＦＰの分泌。データは平均±ＳＥＭを表す。ＬＮ１１１：ＬＮ１１１コーティングディッシュ上で分化したｈｉＰＳＣでの結果；マトリゲル：マトリゲル（商標）コーティングディッシュ上で分化したｈｉＰＳＣでの結果。 Ｇｕｎｎラットの肝臓へのＨＬＣの移植。Ｇｕｎｎラットにおける血清ビリルビン値。ビリルビン血症は、３分の２の部分肝切除の２４時間後にＩＤＨＢを投与されたタクロリムス免疫抑制Ｇｕｎｎラットにおいて経時的に観察された。対照ラットは同じ外科処置を受けたが、移植されなかった。 ＬＮ５２１コーティングディッシュ中でのヒト多能性幹細胞の肝細胞分化。肝細胞分化を、内胚葉マーカー（ＳＯＸ１７）および肝細胞マーカー（ＨＮＦ４ａ、ＡＡＴ、ＡＦＰ、ＡＬＢおよびＣＫ１９）のｍＲＮＡ発現についてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析によって経時的に観察した。 ＬＮ１１１コーティングディッシュ中でのｉＰＳＣ細胞の肝細胞分化。肝細胞分化を、内胚葉マーカー（Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７）のｍＲＮＡ発現についてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析によって経時的に観察した。 ＬＮ１１１コーティングディッシュ中でのｉＰＳＣ細胞の肝細胞分化。肝細胞分化を、肝細胞マーカー（ＨＮＦ４ａ、ＣＹＰ７Ａ１、ＡＦＰおよびＣＫ１９）のｍＲＮＡ発現についてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析によって経時的に観察した。 ＬＮ１１１コーティングディッシュ中でのｉＰＳＣ細胞の肝細胞分化。肝細胞分化を、肝細胞マーカー（ＡＬＢ、ＡＡＴ）のｍＲＮＡ発現についてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析によって、経時的に観察した。 ＬＮ１１１またはＬＮ５２１コーティングディッシュ中でのｉＰＳＣ細胞の肝細胞分化。肝細胞分化を、肝細胞マーカー（ＨＮＦ４ａ、ＡＡＴ、ＡＦＰおよびＡＬＢ）のｍＲＮＡ発現についてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析によって、経時的に観察した。 ＣＨＩＲ９９０２１を伴うかまたは伴わない、ＬＮ１１１またはＬＮ５２１コーティングディッシュ中でのｈＥＳＣの肝細胞分化。肝細胞分化を、肝細胞マーカー（ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１９、ＡＦＰおよびＣＹＰ３Ａ７）のｍＲＮＡ発現についてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析によって、経時的に観察した。 ＣＨＩＲ９９０２１を伴うかまたは伴わない、ＬＮ１１１またはＬＮ５２１コーティングディッシュ中でのｈＥＳＣの肝細胞分化に対する細胞播種の影響。肝細胞分化を、肝細胞マーカー（ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１９、ＡＦＰおよびＡＬＢ）のｍＲＮＡ発現についてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析によって、経時的に観察した。 Ｇｕｎｎラットの肝臓への新鮮なまたは凍結されたｉＰＳ肝細胞の移植。ビリルビン血症は、３分の２の部分肝切除の２４時間後にＩＤＨＢを投与されたタクロリムス免疫抑制Ｇｕｎｎラットにおいて経時的に観察された。対照ラットは同じ外科処置を受けたが、移植されなかった。 Ｇｕｎｎラットの脾臓または肝臓における肝細胞の検出。３分の２の部分肝切除後２４時間でＩＤＨＢを投与されたタクロリムス免疫抑制Ｇｕｎｎラットの肝臓および脾臓におけるＵＧＴ１Ａ１の免疫組織化学的解析。

本発明は、多能性細胞の集団または胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の集団を肝細胞系統細胞の集団に分化させるのに有用な既知組成培地の同定に関連するため、これらの必要性に対処する。本発明者らは、驚くべきことに、ラミニン−１１１は、本発明者らの培養条件下でｈｉＰＳＣの肝細胞分化の開始および支持について単独でマトリゲルと同じくらい効率的であるが、組換えマトリックスを有することを示した。

そして、本発明者らは、ラミニン−５２１（ＬＮ−５２１）もマトリックスとして有用であり、ｈｉＰＳＣの胚体内胚葉およびＨＬＣへのより良好な分化を可能にすることを示した。

本発明者らは、肝細胞分化プロセスの開始および支持のための細胞外マトリックスとして組換えラミニン−１１１（ＬＮ−１１１）を用いた、異種不含有、フィーダー不含有および既知組成のプロトコールにおいて、ヒト多能性幹細胞由来の肝芽細胞（ＩＤＨＢ）を実際に生成した。特定のセットのマーカー（発現または非発現マーカーの組み合わせ）を有するこれらのＩＤＨＢを、高レベルの非抱合ビリルビンによって特徴付けられるクリグラー−ナジャー症候群の動物モデルであるＧｕｎｎラットの肝臓に移植した。細胞移植後、それらは高ビリルビン血症の有意な矯正を示し、有害事象なしに６ヶ月の試験を通して安定したままであった。彼らはまた、移植されたＩＤＨＢがｉｎ ｓｉｔｕでさらに成熟して、欠損した代謝の肝機能を回復させることを示した（ＵＧＴ１Ａ１によるビリルビングルクロン酸化）。結論として、彼らは、ヒトにおける肝細胞移植において遭遇する状況である、常在性肝細胞に対する移植細胞の選択的増殖の利点がない状態において、遺伝性の肝代謝疾患を治療するためのＧＭＰ適合プロトコールによるｈｉＰＳＣに基づく再生の効力を初めて実証した。

肝細胞分化のための方法およびラミニンの使用
したがって、第１の実施態様において、本発明は、肝細胞分化のためのマトリックスとしてのラミニン（ＬＮ）の使用に関する。

本発明はまた、多能性細胞の集団、多分化能細胞の集団、または胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の集団の、肝細胞系統細胞の集団への分化を誘導および／または改善させるためのＬＮの使用に関する。

本明細書中で使用されるとき、用語「ラミニン」（ＬＮ）は、主に基底層に存在するヘテロ三量体糖タンパク質のファミリーのタンパク質を指す。これらは、一方の側における隣接細胞受容体との結合相互作用を介して、および他のラミニン分子またはコラーゲン、ニドゲンまたはプロテオグリカンなどの他のマトリックスタンパク質に結合することによって機能する。ラミニン分子は、細胞の挙動および機能に強く影響を及ぼし得る重要なシグナル伝達分子でもある。ラミニンは、細胞／組織表現型を維持すること、ならびに組織の修復および発生における細胞の増殖および分化を促進することの両方において重要である。ラミニンは、共通の構造的構成を有する大きなマルチドメインタンパク質である。ラミニン分子は、様々なマトリックスおよび細胞相互作用機能を１つの分子に統合する。ラミニンタンパク質分子は、コイルドコイルドメインを介して一緒に三量体に結合された１つのα鎖サブユニット、１つのβ鎖サブユニット、および１つのγ鎖サブユニットを含む。１２の既知のラミニンサブユニット鎖は、天然の組織において少なくとも１５の三量体ラミニン型を形成することができる。三量体ラミニン構造内には、他のラミニン分子および基底膜分子、ならびに膜結合受容体に対する結合活性を有する同定可能なドメインがある。

用語「ラミニン」は、ラミニンを無傷のまま、分離した鎖として、またはその断片として含むことにさらに注意すべきである。本明細書で使用するとき、用語「無傷」は、α鎖、β鎖およびγ鎖のすべてのドメインから構成され、３つの鎖が互いに結合してヘテロ三量体構造を形成するタンパク質を指す。タンパク質は、分離した鎖、断片、または機能的ドメインに分解されない。例えば、ラミニン−１１１およびラミニン−５２１（以下に記載する）は無傷のタンパク質である。本明細書で使用されるとき、用語「鎖」は、ラミニンタンパク質のα鎖、β鎖またはγ鎖の全体を指す。本明細書中で使用されるとき、用語「断片」は、別の分子または受容体への結合活性を有する１、２または３つの機能的ドメインを含む任意のタンパク質断片をいう。しかしながら、各鎖はそのようなドメインを３つより多く有するので、鎖は断片と見なされるべきではない。同様に、無傷のラミニンタンパク質はフラグメントと見なされるべきではない。機能的ドメインの例には、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＧドメインが含まれる。

ヒト組織において少なくとも１５種類の異なる組み合わせが見出された５つの異なるα鎖、３つのβ鎖および３つのγ鎖が存在する。これらの分子は、それらの歴史における発見に基づいてラミニン−１からラミニン−１５と呼ばれるが、代替的な命名法は、その鎖組成に基づいて異性体を説明し、例えばラミニン−１１１（ラミニン−１）は、α−１、β−１およびγ−１鎖を含む。ラミニンの４つの構造的に定義されたファミリー群が同定されている。同定された５つのラミニン分子の第１群はすべてβ１およびγ１鎖を共有し、それらのａ鎖組成（α１からα５鎖）によって異なる。５つの同定されたラミニン分子の第２群は、ラミニン−５２１を含み、すべてβ２およびγ１鎖を共有し、そして同様にそれらのα鎖組成によって異なる。同定されたラミニン分子の第３群は、α３β３γ２の鎖組成を有する１つの同定されたメンバー、ラミニン−３３２を有する。同定されたラミニン分子の第４群は、新しく同定されたγ３鎖を有する１つの同定されたメンバー、ラミニン−２１３（α２β１γ３）を有する。

少なくとも１５のラミニン（ＬＮ）のサブタイプ（または「異性体」）が、ＬＮ−１１１（α１β１γ１）、ＬＮ−１２１（α１β２γ１）、ＬＮ−２１１（α２β１γ１）、ＬＮ−２１３（α２β１γ３）、ＬＮ−２２１（α２β２γ１）、ＬＮ−３１１（α３β３γ１）、ＬＮ−３２１（α３β２γ１）、ＬＮ−３３２（α３β３γ２）、ＬＮ−４１１（α４β１γ１）、ＬＮ−４２１（α４β２γ１）、ＬＮ−４２３（α４β２γ３）、ＬＮ−５１１（α５β１γ１）、ＬＮ−５２１（α５β２γ１）、ＬＮ−５２２（α５β２γ２）、およびＬＮ−５２３（α５β２γ３）を含む、それらの鎖組成に基づいて同定されている。

本発明の一実施形態では、前記ラミニンは、ラミニン−１１１（ＬＮ−１１１）、ラミニン−２１１（ＬＮ−２１１）、ラミニン−３３２（ＬＮ−３３２）、ラミニン−４１１（ＬＮ−４１１）、ラミニン４２１（ＬＮ−４２１）、ラミニン−５１１（ＬＮ−５１１）およびラミニン−５２１（ＬＮ−５２１）からなる群より選択される。

本発明の一実施形態では、前記ラミニンはヒトラミニンである。

本発明の一実施形態では、前記ラミニンはヒト組換えラミニンである。

本発明の好ましい実施形態では、前記ラミニンは、組換えヒトラミニン−１１１（ＬＮ−１１１）および／または組換えヒトラミニン−５２１（ＬＮ−５２１）である。

ラミニン５２１（α５、β２、γ１鎖から構成される）は、初期胚発生中に発現され、ヒト多能性幹細胞によって分泌され、その強力な増殖を刺激することが知られている（非特許文献６３）。ラミニンα５は、類洞を除く胆管および肝臓血管（肝動脈、門脈）に存在するため、ラミニンα５は正常な肝細胞とは通常は結合しない。さらに、ラミニンβ２鎖、したがってラミニン−５２１は成体および正常の動物の肝臓では発現しない（非特許文献６４）。

ラミニンα１鎖、したがってラミニン−１１１（α１、β１、γ１鎖から構成される）は、成体の動物の肝臓では発現しない（非特許文献６５）。

したがって、成体の肝臓組織から抽出したラミニンはラミニン５２１またはラミニン−１１１を含まない。

本明細書で使用するとき、用語「組換え」ポリペプチドは、コードする核酸分子からの発現によって産生されるポリペプチドを指す。種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムは周知である。

組換えの形態で発現される場合、ポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞におけるコードする核酸からの発現によって産生される。特定のシステムの個々の要求に応じて、任意の宿主細胞を使用することができる。好適な宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母およびバキュロウイルス系を含む。

組換えヒトＬＮ−１１１またはＬＮ−５２１のような組換えヒトラミニンは、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ、Ｓｕｎｄｂｙｂｅｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎより購入可能である。

本発明の一実施形態において、ラミニンは、０．５〜５０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍＬ）、好ましくは１〜１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは５μｇ／ｍＬでプレートのような支持体にコーティングされる。

本明細書中で使用されるとき、用語「マトリックス」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞（例えば、平坦なプラスチック製品のような培養容器上）に対してｉｎ ｖｉｖｏのような形態ならびに細胞培養のためのより現実的な細胞生物学およびより良い細胞間相互作用のための生理学的に関連した環境を提供し、細胞付着、増殖、分化を促進する、ポリマーネットワークを形成する成分／材料（天然、合成、またはそれらの組み合わせ）を指す。

一実施形態において、マトリックスは、組換えヒトラミニン−１１１（ＬＮ−１１１）または組換えヒトラミニン−５２１（ＬＮ−５２１）またはそれらの組み合わせのようなラミニンを含む。

他の実施形態において、マトリックスは、約５％／９５％；１０％／９０％；２０％／８０％；２５％／７５％；３０％／７０％；４０％／６０％；５０％／５０％、６０％／４０％；７０％／３０％；７５％／２５％、８０％／２０％；９０％／１０％；９５％／５％の比率でＬＮ−５２１とＬＮ−１１１とを含む。

他の実施形態において、マトリックスは、ラミニンと他の成分（例えば、コラーゲンＩおよびフィブロネクチンを含むマトリックスタンパク質など）との組み合わせを含む。

本明細書中で使用されるとき、用語「集団」は、細胞の総数の大部分（例えば、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％）が、関心の対象のマーカーの少なくとも１つについて、対象の細胞の特定の特徴を有する細胞の集団を指す（例えば、ヒト肝細胞様細胞の集団は、肝機能を有し、例えば肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４α）のような以下に列挙されるヒト肝細胞様細胞によって典型的に発現されるマーカーを発現する細胞を、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％含む）。

本明細書中で使用されるとき、用語「マーカー」は、細胞の表面、または細胞の内部に発現し、細胞の同定を助けるために使用し得るタンパク質、糖タンパク質または他の分子を指す。マーカーは、一般に、従来の方法によって検出することができる。細胞表面マーカーの検出に使用することができる方法の特定の非限定的な例は、免疫細胞化学、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、および酵素分析であるが、タンパク質のｍＲＮＡを検出するためのＲＴ−ＰＣＲおよび分子生物学方法もまた使用することができる。

本明細書中で使用される場合、用語「多能性」は、適切な条件下で、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）由来の細胞系統に関連する特徴を集合的に示す細胞型へと分化することができる子孫を生じる能力を有する細胞を指す。多能性幹細胞は、出生前、出生後または成体の生物の組織に寄与し得る。８〜１２週齢のＳＣＩＤマウスに奇形腫を形成する能力のような、標準的な技術分野において受け入れられた試験を用いて、細胞集団の多能性を確立することができる。しかしながら、様々な多能性幹細胞の特性の同定は、多能性細胞の同定にも使用することができる。

本発明の一実施形態において、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞である。

より具体的には、ヒト多能性幹細胞は、以下のＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−Ｉ −６０、ＴＲＡ−Ｉ −８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、ＡＬＰ、Ｓｏｘ ２、Ｅ−カドヘリン、ＵＴＦ−Ｉ、Ｏｃｔ４、Ｌｉｎ２８、Ｒｅｘｌ、およびＮａｎｏｇの非限定的列挙からのマーカーの少なくともいくつか、そして任意選択で全てを発現しても良い。

本発明の一実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）またはヒト誘導性多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。

本明細書中で使用されるとき、用語「胚性幹細胞」とは、３つ全ての胚性胚葉（すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉）の細胞に分化し得るか、または未分化状態に留まることができる胚細胞をいう。そのような細胞は、胚の着床前の、妊娠後に形成される胚組織（例えば、胚盤胞）（すなわち、着床前胚盤胞）から得られる細胞、着床後／原腸形成前の段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）（ＷＯ２００６／０４０７６３参照）、妊娠中の任意の時点、好ましくは妊娠１０週前の胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖幹（ＥＧ）細胞、ならびに単為生殖方法または核移植のような未受精卵を用いる他の方法によるものを含み得る。

胚性幹細胞は、周知の細胞培養方法を用いて得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は、典型的には、ヒトｉｎ ｖｉｖｏ着床前胚またはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）胚から得られる。代替的に、単一細胞のヒト胚を胚盤胞期まで拡大することができる。ヒトＥＳ細胞の単離のために、内部細胞塊（ＩＣＭ）を、透明帯を胚盤胞から除去し、栄養外胚葉細胞を溶解し、穏やかなピペット操作によって無傷のＩＣＭから除去する免疫手術によって単離する。次いで、その増殖を可能にする適切な培地を含む組織培養フラスコにＩＣＭを播種する。９〜１５日後、ＩＣＭに由来する増殖物を、機械的解離または酵素分解のいずれかによって凝集塊に解離させ、次いで細胞を新鮮な組織培養培地に再播種する。未分化形態を示すコロニーは、マイクロピペットによって個別に選択され、機械的に塊に解離され、再播種される。次いで、生じるＥＳ細胞は、４〜７日ごとに定期的に継代する。ヒトＥＳ細胞調製方法のさらなる詳細については、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号）を参照されたい。

市販の幹細胞を使用することもできる。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリ（ｈｔｔｐ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から購入することができる。市販の胚性幹細胞株の非限定的な例は、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３、ＴＥ３２、Ｈ９、ＷＡ０９、Ｒｏｓｌｉｎ細胞（ＲＣ６、ＲＣ７、ＲＣ８、ＲＣ９およびＲＣ１０）およびＥＳＩ−０１７、ＥＳＩ−０３５、ＥＳＩ−０４９、ＥＳＩ−０５１、ＥＳＩ−０５３（ＢｉｏＴｉｍｅ）である。

本明細書で使用されるとき、用語「誘導性多能性幹細胞」は、非多能性細胞から人工的に誘導された多能性幹細胞を指す。非多能性細胞は、多能性幹細胞よりも自己複製および分化の能力が低い細胞であり得る。より低い能力の細胞は、体細胞性幹細胞、組織特異的前駆細胞、一次細胞または二次細胞であり得るが、これらに限定されない。ｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣおよびＫＬＦ４転写因子カクテルの強制発現によって、またはＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８によるＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣの置換もしくはＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８の追加による代替的な因子の組み合わせによって、または再プログラミングプロセスを改善するとして当業者に公知の任意の方法（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤、ｍｉＲＮＡなどの小分子の使用の実施）によって、様々な細胞型の再プログラミングにより再現可能に得られてきた。

本明細書で使用されるとき、用語「再プログラミング」は、標的細胞における因子（または再プログラミング因子）の小セットの発現によって引き起こされる、標的細胞の運命を異なる細胞型の運命に変化させるプロセスを指す。

再プログラミング因子をコードする発現ベクターに基づく誘導性多能性幹細胞を生成する方法は、当技術分野で記載されており、例えばＷＯ２００７／６９６６６、ＥＰ２０９６１６９−Ａ１またはＷＯ２０１０／０４２４９０を参照されたい。

再プログラミング因子の異所性発現のための発現ベクターは、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター、トランスポゾンに基づくベクター（ＰｉｇｇｙＢａｃなど）またはウイルスベクターであり得る。

代替的に、例えばＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ、または対応するコードしたＤＮＡまたはＲＮＡなどの再プログラミング因子を、宿主ＤＮＡに外因性遺伝物質を組み込むことなく、すなわち細胞のゲノムへのヌクレオチド配列の導入なしに標的細胞に導入される。プラスミドベクターのような発現ベクターは、裸のＤＮＡの形態で再プログラミング因子の異所的発現のために前記細胞に送達され得る。代替的に、前記再プログラミング因子をコードする、化学修飾されたかまたは化学修飾されていないＲＮＡを細胞に導入してそれらを再プログラムすることができる（例えば、Ｗａｒｒｅｎ Ｌら、２０１０、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、Ｎｏｖ ５；７（５）：６１８−３０を参照されたい）。他の発現ベクターは、例えばＷＯ２００９１１５２９５に記載されている。

一実施形態において、ｈｉＰＳＣは、健康な対象から得られた細胞に由来する。他の実施形態において、ｈｉＰＳＣは、遺伝性代謝性肝疾患などの肝疾患を有する対象から得られた細胞に由来し、肝細胞様細胞は疾患表現型を示す。

代替的に、本発明のラミニンから構成される肝細胞分化のためのマトリックス上における、間葉系幹細胞などの多分化能細胞の分化から目的の肝細胞系統細胞の集団を得ることができる。

本明細書中で使用される場合、用語「多分化能」は、少なくとも２つの最終分化細胞型に分化することができる細胞を指す。

本明細書中で使用されるとき、用語「間葉系幹細胞」は、一般に、分化した（特殊化した）組織中に見出され、生物の生涯にわたってそれら自身の同一コピーを作製（自己複製）することができ、（例えば、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨芽細胞への分化のような）多分化能を有する間質細胞を指す。好ましくは、本発明の文脈において使用され得るヒト間葉系幹細胞は、したがって、任意の適切な単離方法を用いて任意の適切な組織から誘導される任意の適切なヒト多分化能幹細胞（すなわち、自己再生能力および多分化能を有する細胞）を含む。例えば、本発明の方法において使用することができるヒト間葉系幹細胞は、成人多系列誘導性（ＭＩＡＭＩ）細胞（Ｄ’Ｉｐｐｏｌｉｔｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、２００４、１１７：２９７１−２９８１）、ＭＡＰＣ（ＭＰＣとしても知られている）（Ｒｅｙｅｓ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２００１、９８：２６１５−２６２５）、臍帯血由来幹細胞（Ｋｏｇｌｅｒ Ｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００４、２００（２）：１２３−１３５）、ｍｅｓｏａｎｇｉｏｂｌａｓｔ（Ｓａｍｐａｏｌｅｓｉ Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ、２００６、４４４（７１１９）：５７４−５７９；Ｄｅｌｌａｖａｌｌｅ Ａら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００７、９：２５５−２６７）、および羊水幹細胞（Ｄｅ Ｃｏｐｐｉ Ｐら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００７、２５：１００−１０６）を含むがそれらに限定されない。さらに、臍帯血バンク（例えば、フランスのＥｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ）は、移植のためのそのような細胞の安全かつ容易に入手可能な供給源を提供する。

代替的に、肝細胞系統細胞の集団は、成体ヒト肝臓（例えば、肝細胞前駆細胞）から単離された細胞を、ラミニンから構成される肝細胞分化のためのマトリックス上で分化させることによって得ることができる。さらに代替的に、目的の肝細胞系統細胞の集団は、線維芽細胞などの体細胞を、ラミニンから構成される肝細胞分化のためのマトリックス上で転換することによって得ることができる。

本明細書中で使用されるとき、用語「肝細胞系統細胞」または「肝細胞様細胞」（ＨＬＣ）は、多能性細胞、内胚葉細胞、または多分化能細胞などの他の種類の細胞を記載の方法で分化することによって得られる細胞を指す。分化した細胞は、本開示中で後述されるように、既知の肝細胞前駆体、肝芽細胞、胎児、新生児、成熟、成体および完全に成熟した肝細胞の様々な顕著な表現型特徴の少なくとも１つを有する。この用語の使用により、明示的に必要とされる場合を除いて、細胞表現型、細胞マーカー、細胞機能、または増殖能に関しては特に制限することは意図されない。肝細胞系統細胞は、肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４α）、アルブミン（ＡＬＢ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、シトクロムＰ４５０およびサイトケラチン１９（ＣＫ１９）を含むが、これらに限定されない肝細胞マーカーを発現する。

特定の実施形態において、ヒト肝細胞様細胞の集団は、遺伝子を過剰発現しない。好ましくは、これらの細胞の集団は、肝細胞分化に関与する因子を過剰発現しない。肝細胞分化に含まれる因子の例は、ホメオボックス導入遺伝子ＨＥＸ、ＨＮＦ−４、ＨＧＦ、ＦＧＦ４、ＯＳＭ、アクチビン、ＴＧＦ−β、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ２、ＨＮＦ１アルファ、ＨＮＦ１−ベータ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ３ベータ、ＳＯＸ１７、ＦＯＸａ３、Ｆｏｘａ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１、ＣＥＢＰアルファまたは肝臓発生に関与する他の遺伝子（すなわち、内胚葉誘導、肝臓特異的肝臓成熟、肝臓維持、肝細胞増殖因子）を、非限定的に含む。

一実施形態において、ヒト肝細胞様細胞の集団は、ＨＥＸ導入遺伝子を過剰発現しない。

本明細書中で使用されるとき、用語「過剰発現」は、正常よりも多い量の遺伝子産物（ＲＮＡまたはタンパク質）の発現を指す。遺伝子またはタンパク質を過剰発現させる技法は、技術水準において周知であり、ｍＲＮＡのマイクロインジェクション、インジェクション、タンパク質トランスフェクション、または発現ベクターのトランスフェクションを、非限定的に含む。

本発明のバイオマーカーの発現レベルの決定方法
肝細胞マーカー（例えば、ＨＮＦ４α、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＣＫ１９遺伝子）を含むマーカーの発現レベルの決定は、様々な技術によって実施することができる。一般に、決定された発現レベルは相対発現レベルである。例えば、決定は、生物学的サンプルをプローブまたはリガンドのような選択的試薬と接触させ、それによって前記生物学的サンプル中の本来の目的の核酸またはポリペプチドの存在を検出することまたはその量を測定することを含む。接触は、プレート、マイクロタイターディッシュ、試験管、ウェル、ガラス、カラムなどのような任意の適切な装置で行うことができる。特定の実施形態では、接触は、核酸アレイまたは特異的リガンドアレイのような試薬でコーティングされた基材上で行われる。基材は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の適切な支持体のような固体または半固体の基材であってもよい。基材は、スライド、膜、ビーズ、カラム、ゲルなどの様々な形態およびサイズであり得る。接触は、試薬と、生物学的サンプルの核酸またはポリペプチドとの間に形成される、核酸ハイブリッドまたは抗体−抗原複合体のような検出可能な複合体に適した任意の条件下で実施され得る。

特定の実施形態において、バイオマーカー遺伝子の発現レベルは、ｍＲＮＡの量を決定することによって決定され得る。

ｍＲＮＡの量を決定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、本発明のＨＬＣなどの目的の細胞に含まれる核酸は、最初に、例えば溶解酵素または化学溶液を用いて標準的な方法に従って抽出されるか、または製造業者の説明書に従って核酸結合樹脂によって抽出される。次いで、抽出されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット分析）および／または増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出される。定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイムの定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲが特に有利である。

他の実施形態において、バイオマーカー遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子にコードされるタンパク質の量を決定することによって決定され得る。

そのような方法は、生物学的サンプルを、前記サンプル中に存在するタンパク質と選択的に相互作用することができる結合パートナーと接触させることを含む。結合パートナーは、一般に、ポリクローナルまたはモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る抗体である。

例えば、ＨＮＦ４α、ＡＬＢ、ＡＦＰおよびＣＫ１９などのバイオマーカータンパク質のレベルは、標準的な電気泳動、および、競合法、直接反応またはサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含む免疫診断技術を用いて測定することができる。そのようなアッセイには、ウェスタンブロット；凝集試験；酵素標識および媒介イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降を含むがこれらに限定されない。

細胞培養条件は、標的の分化細胞型（例えば、肝細胞系統細胞）への指向性分化の間に支持する環境を提供するための１つまたはそれ以上の追加成分を含み得る。分化した標的細胞の集団を得るための方法は、さらに、分化を誘導するステップを含む。分化の誘導は、後述するように、分化の１つまたはそれ以上の段階において培地中の増殖因子の組成を変更することによって達成され得る。

したがって、第２の実施態様において、本発明は、ヒト肝細胞分化を誘導するための方法であって、
（ｉ）ヒト胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の集団を提供するステップと、
（ｉｉ）該集団を肝細胞誘導培地中においてラミニンでコーティングした支持体上で培養して、ヒト肝細胞様細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法に関する。

本発明はまた、ヒト肝細胞様細胞を取得するための方法であって、
（ｉ）ヒトＤＥ細胞の集団を提供するステップと、
（ｉｉ）該集団を肝細胞誘導培地中においてラミニンでコーティングした支持体上で培養して、ヒト肝細胞様細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法に関する。

本明細書で使用されるとき、用語「胚体内胚葉細胞」は、Ｓｏｘ １７およびＦｏｘＡ２を含むがこれらに限定されない特徴的な生化学マーカーを発現し、ｎａｎｏｇを発現しない細胞を指す。

本明細書中で使用されるとき、用語「肝芽細胞様細胞」（ＨＢ）または用語「肝前駆細胞」は交換可能に使用され、肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４α）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、およびシトクロムＰ４５０ ３Ａ７（ＣＹＰ３Ａ７）を含むがこれらに限定されない特徴的な生化学マーカーを発現し、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を発現しないかまたは実質的に発現せず、アルブミン（ＡＬＢ）、α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）、シトクロムＰ４５０ ３Ａ７（ＣＹＰ３Ａ７）およびウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）を発現しない細胞を指す。

本明細書中で使用されるとき、用語「実質的に〜ない」は、低レベルの、ＡＦＰなどの目的のタンパク質を発現する肝細胞様細胞の集団をいう。したがって、このような細胞は、ＥＬＩＳＡによるＡＦＰの検出限界（ＬＯＤ）未満である数ピコグラム（ｐｇ）のような、ＥＬＩＳＡによって検出されない少数または少量のＡＦＰタンパク質のみを発現し得る。しかしながら、少量のＡＦＰ ｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲによって検出され得ること（しかし、そのような量は、ＡＦＰタンパク質の微細な発現を検出するのには不十分である）がさらに注記されるべきである。

本明細書で使用されるとき、「肝細胞誘導培地」または「肝細胞分化を誘導する培地」という表現は、胚体内胚葉の肝細胞様細胞への分化を誘導することができる（したがって、ＨＮＦ４α、ＣＫ１９およびＣＹＰ３Ａ７のような肝細胞マーカーの発現を誘導することができる）培地を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「培地」は、胚体内胚葉細胞の増殖および肝前駆細胞への分化を支持することができる任意の培地を指す。胚体内胚葉細胞の増殖および肝前駆細胞への分化を支持する好ましい培地組成には、既知組成培地（ＣＤＭ）が含まれる。

本明細書で使用されるとき、用語「既知組成培地」（ＣＤＭ）は、特定された成分、好ましくは既知の化学構造の成分のみを含む、細胞を培養するための栄養溶液を指す。既知組成培地は、無血清およびフィーダー不含有培地である。本明細書において使用されるとき、「無血清」とは、血清を添加していない培地を指す。本明細書において使用されるとき、「フィーダー不含有」とは、フィーダー細胞を添加していない培地を指す。

本発明で用いる培地は、塩類、栄養素、ミネラル類、ビタミン類、アミノ酸類、核酸類、サイトカイン類などのタンパク質類、成長因子類、およびホルモン類などの、すべて細胞の生存に必要である物質の組み合わせを含む水系媒体であってもよい。例えば、本発明による培地は、必要に応じて、以下（実施例のセクション）にさらに記載するようなＢ２７のような必要な添加物を補充した、ヒトへの使用のためのＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地）またはＣＭＲＬ−１０６６（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のような合成組織培養培地であってよい。Ｂ−２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、特に、ＳＯＤ、カタラーゼおよび他の抗酸化物質（ＧＳＨ）、ならびにリノール酸、リノレン酸、リポ酸などの独自の脂肪酸を含む。

ＤＥ細胞を肝細胞誘導培地で培養するステップは、肝細胞様細胞の生成に必要な時間実施されなければならない。この培養ステップの持続時間は、当業者によって容易に決定され得る。例えば、培養中、当業者は、胚体内胚葉（ＤＥ）細胞によってのみ発現されるマーカー（例えば、Ｓｏｘ１７およびＦｏｘＡ２）の発現の少なくとも１つの消失、および／または肝細胞様細胞によって特異的に発現されるマーカー（例えば、ＨＮＦ４α、ＣＫ１９、ＣＹＰ３Ａ７）の発現について、培養細胞を観察できる。ＤＥ細胞に特異的なマーカーの１つまたは複数の発現が検出できないとき、および／または肝細胞様細胞に特異的なマーカーの１つまたは複数の発現が検出されるとき、肝細胞誘導培地での培養を停止することができる。これらのマーカーの観察は、例えば、特異的プライマーを用いる培養細胞から抽出されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析、マーカーに特異的な抗体およびＦＡＣＳを用いた免疫蛍光解析、またはタンパク質に対応するｍＲＮＡを検出する任意の方法を用いて行うことができる。

典型的には、ステップｉｉ）は３〜１０日間、好ましくは６日間行うことができる。

必要であれば、本発明の培地は、部分的にまたは全体を規則的な間隔で交換することができる。典型的には、本発明の培地は、本発明の新鮮な培地と１日おきに６日間交換することができる。

上記の方法によって生成された肝細胞様細胞は、任意の適切な方法、例えばＦＡＣＳを用いて単離および／または精製することができる。

ヒト肝細胞様細胞を取得するための方法に関連して使用される用語「ＦＧＦファミリー増殖因子」は、１つの線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）へと結合することによって、細胞増殖、増殖、および細胞分化を刺激することのできる任意の天然の物質（例えばタンパク質）を指す。１つのＦＧＦＲに結合することにより、該物質は、例えば、前記受容体のチロシンリン酸化を増加させる。

本発明の一実施形態において、肝細胞誘導培地は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む既知組成培地である。

本発明の一実施形態において、肝細胞誘導培地は、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびＦＧＦを含む既知組成培地である。

他の実施形態において、肝細胞誘導培地は、ＢＭＰ２およびＦＧＦを含む既知組成培地である。

本発明の別の実施形態において、肝細胞誘導培地は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＫＯＳＲ（ノックアウト血清代替）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、酪酸ナトリウムを含む既知組成培地である。特定の実施形態において、肝細胞誘導培地は、ＤＭＳＯおよびＫＯＳＲを含む既知組成培地である。他の特定の実施形態において、肝細胞誘導培地は、ＨＧＦおよび酪酸ナトリウムを含む既知組成培地である。

典型的には、ＤＭＳＯは、約０．５〜約５％、好ましくは約１％の濃度で本発明の培地に添加される。ＤＭＳＯはＳｉｇｍａから購入することができる。典型的には、ＫＯＳＲは、約５％〜約３０％、好ましくは２０％の濃度で本発明の培地に添加される。ＫＯＳＲはＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入することができる。

典型的には、ＨＧＦは、約１ｎｇ／ｍＬ〜約２５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で本発明の培地に添加される。ＨＧＦはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入することができる。典型的には、酪酸ナトリウムは、約１〜約１０ｍＭ、好ましくは約２．５ｍＭの濃度で本発明の培地に添加される。酪酸ナトリウムはＳｉｇｍａから購入することができる。

本発明の好ましい実施形態において、肝細胞誘導培地は、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびファミリー増殖因子１０（ＦＧＦ１０）を含む既知組成培地である。天然に存在するヒトＦＧＦ１０タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｏ１５５２０に示されるアミノ酸配列を有する。典型的には、ＦＧＦ１０は、１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培地に添加される。ＦＧＦ１０は、ＰｅｐｒｏｔｅｃｈまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入することができる。

天然に存在するヒトＢＭＰ４タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ１２６４４に示されるアミノ酸配列を有する。典型的には、ＢＭＰ４は、１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培地に添加される。ＢＭＰ４はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入することができる。

天然に存在するヒトＢＭＰ２タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ１２６４３に示されるアミノ酸配列を有する。典型的には、ＢＭＰ２は、１〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培地に添加される。ＢＭＰ２は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓまたはＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入することができる。

本発明の他の実施形態において、肝細胞誘導培地は、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子としても知られる）を含む既知組成培地である。

天然に存在するヒトＦＧＦ２タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ０９０３８に示されるアミノ酸配列を有する。典型的には、ＦＧＦ２は、１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培地に添加される。ＦＧＦ２は、ＰｅｐｒｏｔｅｃｈまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入することができる。

本発明のいくつかの実施形態において、ＤＥ細胞の集団を培養することは、分化プロセスの前またはそのプロセスの最中にＤＥ細胞の集団を継代することをさらに含むことができる。細胞集団を継代させるプロセスは、１回またはそれ以上反復してもよく、付着マトリックスによって支持される細胞を解離させ、培地中に解離細胞を希釈することを含み得る。したがって、ステップｉｉ）は、少なくとも１回継代するステップおよび／または細胞計数するステップをさらに含んでもよい。

本発明のいくつかの実施形態において、クローン原性を高めるために、解離の４時間前および播種の２４時間後にＲＯＣＫ阻害剤で細胞を処理することができる。

本明細書で使用されるとき、用語「Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤」は、キナーゼ活性などのＲＯＣＫ１および／またはＲＯＣＫ２活性を阻害する化合物（天然または合成）を指す。

本発明の特定の実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ２７６３２である（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５、６８１−６８６（２００７））。

典型的には、培地中のＹ２７６３２の濃度は、１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌであってよい。

本発明の一実施形態において、前記ラミニンは、ＬＮ−１１１、ＬＮ−２１１、ＬＮ−３３２、ＬＮ−４１１、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１およびＬＮ−５２１からなる群より選択される。

本発明の一実施形態において、前記ラミニンはヒトラミニンである。

本発明の一実施形態において、前記ラミニンはヒト組換えラミニンである。

本発明の一実施形態において、ラミニンは、０．５〜５０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍＬ）、好ましくは１〜１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは５μｇ／ｍＬでプレートのような支持体にコーティングされる。

支持体は典型的には培養容器の表面である。

本発明の一実施形態において、支持体は、プレート、スライド、フラスコなどからなる群より選択される。本発明の好ましい実施形態において、支持体は、ヒト組換えＬＮ−１１１またはヒト組換えＬＮ−５２１のような本発明のマトリックスでコーティングされた少なくとも一部分の表面を有する。

本発明はまた、ヒト肝細胞分化を誘導するための方法であって、
（ｉ）ヒト多能性細胞の集団を提供するステップと、
（ｉｉ）該集団を内胚葉誘導培地中においてラミニンでコーティングした支持体上で培養して、ヒトＤＥ細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法に関する。

本発明はまた、ヒトＤＥ細胞を取得するための方法であって、
（ｉ）ヒト多能性細胞の集団を提供するステップと、
（ｉｉ）該集団を内胚葉誘導培地中においてラミニンでコーティングした支持体上で培養して、ヒトＤＥ細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法に関する。

本発明はまた、ヒト肝細胞分化を誘導するための方法であって、
（ｉ）ヒト多能性細胞の集団を提供するステップと、
（ｉｉ）該集団を内胚葉誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒトＤＥ細胞の集団を生成するステップと、
（ｉｉｉ）ヒトＤＥ細胞の集団を肝細胞誘導培地中においてラミニンで被覆された支持体上で培養して、ヒト肝芽細胞様細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法に関する。

本発明はさらに、ヒト肝芽細胞様細胞を取得するための方法であって、
（ｉ）ヒト多能性細胞の集団を提供するステップと、
（ｉｉ）該集団を内胚葉誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒトＤＥ細胞の集団を生成するステップと、
（ｉｉｉ）ヒトＤＥ細胞の集団を肝細胞誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒト肝芽細胞様細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法に関する。

本明細書で使用されるとき、「内胚葉誘導培地」または「内胚葉分化を誘導する培地」という表現は、多能性幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化を誘導することができる（したがって、Ｓｏｘ １７およびＦｏｘＡ２のような内胚葉マーカーの発現を誘導することができる）培地を指す。

本発明の好ましい実施形態において、内胚葉誘導培地は、少なくともアクチビンＡおよび任意選択でＷＮＴ３Ａを含む既知組成培地である。

本発明の別の実施形態では、内胚葉誘導培地は、ＣＨＩＲ９９０２１をさらに含む既知組成培地である。

アクチビンＡは当該技術分野で周知であり、アクチビン／ノーダル経路の刺激を介してある範囲の細胞効果を発揮する二量体ポリペプチドである（Ｖａｌｌｉｅｒら、Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１８：４４９５−４５０９（２００５））。天然に存在するヒトアクチビンＡタンパク質は、ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２１８３に示されるアミノ酸配列を有する。アクチビンは、商業的供給源（例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ． ＭＡ ＵＳＡまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）から容易に入手可能である。

典型的には、培地中のアクチビンＡの濃度は、約１０〜約１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌであってよい。

天然に存在するヒトＷＮＴ３Ａタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ５６７０４に示されるアミノ酸配列を有する。典型的には、培地中のＷＮＴ３Ａの濃度は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ３Ａ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌを含み得る。ＷＮＴ３ＡはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入することができる。

ＣＨＩＲ９９０２１は、ＷＮＴ／β−カテニン経路を活性化するＧＳＫ３の阻害剤である。ＣＨＩＲ９９０２１は、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔから購入することができる。

典型的には、培地中のＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、約１μＭ〜約１０μＭ、好ましくは約３μＭである。

多能性幹細胞を内胚葉誘導培地で培養するステップは、胚体内胚葉（ＤＥ）の生成に必要な時間実施されなければならない。この培養ステップの持続時間は、当業者によって容易に決定され得る。例えば、培養中、当業者は、胚体内胚葉（ＤＥ）によって特異的に発現されるマーカー（例えば、Ｓｏｘ １７およびＦｏｘＡ２）の発現について、培養細胞を観察することができる。ＤＥ細胞に特異的な１つまたは複数のマーカーの発現が検出されるとき、肝細胞誘導培地での培養を停止することができる。これらのマーカーの観察は、例えば、特異的プライマーを用いる培養細胞から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析、マーカーに特異的な抗体による免疫蛍光解析、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ、または特異的マーカーに対応するＲＮＡ／タンパク質／活性を検出する任意の方法を用いて行うことができる。

典型的には、ステップｉｉ）は、１〜１０日間、好ましくは５日間実施することができる。

必要であれば、本発明の培地は、部分的にまたは全体を、規則的な間隔で交換することができる。典型的には、本発明の培地は、本発明の新鮮な培地と１日おきに５日間交換することができる。

上述の方法によって生成した肝細胞様細胞は、任意の適切な方法、例えばＦＡＣＳを用いて単離および／または精製することができる。

本発明の一実施形態において、前記ラミニンは、ＬＮ−１１１、ＬＮ−２１１、ＬＮ−３３２、ＬＮ−４１１、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１およびＬＮ−５２１からなる群より選択される。

本発明の一実施形態において、前記ラミニンはヒトラミニンである。

本発明の一実施形態において、前記ラミニンはヒト組換えラミニンである。

本発明の一実施形態において、ラミニンは、０．５〜５０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍＬ）、好ましくは１〜１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは５μｇ／ｍＬでプレートのような支持体にコーティングされる。

支持体は典型的には培養容器の表面である。

本発明の一実施形態において、支持体は、プレート、スライド、フラスコなどからなる群より選択される。本発明の好ましい実施形態において、支持体は、ヒト組換えＬＮ−１１１および／またはヒト組換えＬＮ−５２１のような本発明のマトリックスでコーティングされた少なくとも一部分の表面を有する。

他の実施態様において、本発明は、ヒト胎児肝細胞を取得するための方法であって、
（ｉ）ヒト多能性細胞集団を提供するステップと、
（ｉｉ）該集団を内胚葉誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒトＤＥ細胞の集団を生成するステップと、
（ｉｉｉ）前記ヒトＤＥ細胞の集団を肝細胞誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒト肝芽細胞様細胞の集団を生成するステップと、
（ｉｖ）ヒト肝芽細胞様細胞の集団を肝細胞成熟培地中で培養して、胎児肝細胞様細胞の集団を生成するステップと、
を含む方法に関する。

本明細書中で使用されるとき、用語「胎児肝細胞様細胞」または用語「分化肝芽細胞」は、本明細書において交換可能に使用され、ＨＮＦ４α、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＦＰおよびＣＫ１９を含むがそれらに限定されない特徴的な生化学マーカーを発現し、ＡＬＢ、ＡＡＴ、ＵＧＴ１Ａ１、およびシトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）を含むがそれらに限定されないいくつかの成熟肝細胞タンパク質を発現していてもよい細胞を指す。

本明細書において、「肝細胞成熟培地」または「肝細胞成熟を刺激する培地」という表現は、肝芽細胞様細胞から胎児肝細胞様細胞への成熟を誘導することができる培地を指す。

本発明の好ましい実施形態において、肝細胞誘導培地は、ＨＧＦおよびＯＳＭを含む既知組成培地である。

本明細書で使用されるとき、用語「肝細胞増殖因子」（ＨＧＦ）は、プロトオンコジーンｃ−ＭＥＴ受容体に結合した後にチロシンキナーゼシグナル伝達カスケードを活性化することによって、細胞増殖、細胞運動および形態形成を調節する増殖因子を指す。天然に存在するヒトＨＧＦタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ１４２１０に示されるアミノ酸配列を有する。

典型的には、ＨＧＦは、１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲、好ましくは５〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲、さらにより好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で肝細胞成熟培地に添加される。ＨＧＦはＰｅｐｒｏｔｅｃｈから購入することができる。

本明細書で使用されるとき、用語「オンコスタチンＭ」（ＯＳＭ）は、多数の腫瘍細胞株の増殖を阻害するサイトカインを指す。天然に存在するヒトＯＳＭタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ１３７２５に示されるようなアミノ酸配列を有する。

典型的には、オンコスタチンＭは、１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲、好ましくは５〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲、さらにより好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で肝細胞成熟培地に添加される。ＯＳＭはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入することができる。

肝細胞様細胞を肝細胞成熟培地で培養するステップは、胎児肝細胞様細胞の生成に必要な時間実施されなければならない。この培養ステップの持続時間は、当業者によって容易に決定され得る。例えば、培養中に、当業者は、多能性幹細胞の特異的マーカー（例えば、Ｓｏｘ ２およびＮａｎｏｇ）の発現の非存在、胚体内胚葉（ＤＥ）の特異的マーカー（例えばＳｏｘ １７およびＦｏｘＡ２）の発現の非存在について、肝芽細胞の特異的マーカーの発現、および／または胎児肝細胞様細胞によって特異的に発現されるマーカー（例えば、ＡＦＰおよびＡＬＢ）の発現について、培養細胞を観察することができる。胎児肝細胞様細胞に特異的な１つまたは複数のマーカーの発現が検出されるとき、肝細胞成熟培地による培養を停止することができる。これらのマーカーの観察は、例えば、特異的プライマーを用いる培養細胞から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析、マーカーに特異的な抗体による免疫蛍光解析、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ、または特異的なマーカーに対応するＲＮＡ／タンパク質／活性を検出する任意の方法を用いて実施することができる。

典型的には、ステップｉｉ）は、３〜６０日間、好ましくは３０日間実施することができる。

必要であれば、本発明の培地は、部分的にまたは全体を、規則的な間隔で交換することができる。典型的には、本発明の培地は、本発明の新鮮な培地と１日おきに３０日間交換することができる。

上述の方法によって生成した胎児肝細胞様細胞は、任意の適切な方法、例えばＦＡＣＳを用いて単離および／または精製することができる。

本発明の一実施形態において、前記ラミニンは、ＬＮ−１１１、ＬＮ−２１１、ＬＮ−３３２、ＬＮ−４１１、ＬＮ−４２１、ＬＮ−５１１およびＬＮ−５２１からなる群より選択される。

本発明の一実施形態において、前記ラミニンはヒトラミニンである。

本発明の一実施形態において、前記ラミニンはヒト組換えラミニンである。

本発明の一実施形態において、ラミニンは、０．５〜５０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍＬ）、好ましくは１〜１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは５μｇ／ｍＬでプレートのような支持体にコーティングされる。

支持体は典型的には培養容器の表面である。

本発明の一実施形態において、支持体は、プレート、スライド、フラスコなどからなる群より選択される。本発明の好ましい実施形態において、支持体は、ヒト組換えＬＮ−１１１および／またはヒト組換えＬＮ−５２１のような本発明のマトリックスでコーティングされた少なくとも一部分の表面を有する。

本発明によるヒト肝細胞様細胞の集団およびそれらを含む医薬組成物
他の実施態様において、本発明は上述の方法によって取得されるヒト肝細胞様細胞の集団に関する。

本発明はまた、上述の方法によって取得されたヒト肝芽細胞様細胞の集団に関し、前記細胞は肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４α）を発現し、かつα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を発現しないかまたは実質的に発現しない。

本発明は、上述の方法によって取得されたヒト肝芽細胞様細胞の集団に関し、前記細胞はＨＮＦ４α、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）およびシトクロムＰ４５０ ３Ａ７（ＣＹＰ３Ａ７）を発現し、かつＡＦＰ、アルブミン（ＡＬＢ）、α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）を発現しないかまたは実質的に発現しない。

さらに別の実施態様では、本発明は、上述の方法によって取得されたヒト胎児肝細胞の集団に関する。

本発明はまた、上述の方法によって取得されたヒト胎児肝細胞様細胞の集団に関し、前記細胞はＨＮＦ４α、ＣＫ１９、ＣＹＰ３Ａ７、ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＡＡＴおよびＵＧＴ１Ａ１およびシトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）を発現する。

一実施形態において、ヒト肝細胞様細胞は正常な表現型を示す。

別の実施形態において、ヒト肝細胞様細胞は、遺伝子変異、特に、ヒト肝細胞様細胞内の重要なタンパク質に影響を及ぼし、肝疾患に関連する遺伝子変異を示す。疾患表現型に関与する遺伝子変異または欠損は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで矯正することができることに留意すべきである。単離された哺乳動物細胞における遺伝子変異または欠損を矯正するための様々な技術が利用可能である。

本発明のヒト肝細胞様細胞の遺伝子改変
用語「遺伝子改変された」は、ヒト肝細胞様細胞が非改変ヒト肝前駆細胞に自然に存在しない核酸分子、または前記ヒト肝前駆細胞に非天然状態で存在する（例えば増幅された）核酸分子を含むことを示す。核酸分子は、前記細胞またはその祖先（肝疾患関連遺伝子変異を含むｉＰＳなど）に導入されていてもよい。

ヒト肝細胞様細胞を遺伝子改変するために、ウイルス媒介遺伝子送達、非ウイルス媒介遺伝子送達、裸のＤＮＡ、物理的処理などのような多くの方法が使用され得る。この目的のために、核酸は、通常、組換えウイルス、プラスミド、ファージ、エピソーム、人工染色体などのベクターに組み込まれる。

本発明の特定の実施形態において、肝細胞様細胞（ＨＬＣ）または多能性幹細胞は、ウイルスベクター（または組換えウイルス）または非ウイルスによる方法を用いて遺伝子改変される。この実施形態において、異種核酸は、例えば、組換えウイルスに導入され、次いでヒト肝細胞様細胞（ＨＬＣ）を感染させるために使用される。異なる型の組換えウイルス、特にレンチウイルスを使用することができる。

好ましい実施形態において、前記レンチウイルスは、ＳＶ４０Ｔ、ｈＴＥＲＴ、ＣＤＫ４などのような不死化タンパク質をコードする。

他の好ましい実施形態において、前記レンチウイルスは、野生型α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質またはＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリーポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）のような（肝疾患に罹患した患者において疾患関連遺伝子変異を通常示すタンパク質のような）野生型タンパク質をコードする。肝疾患に関与する他の遺伝子変異は上述される。

一実施形態において、目的のタンパク質（例えば、不死化タンパク質または疾患表現型を矯正するために使用される野生型タンパク質）をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結される。

代替的に、前記レンチウイルスは、レポータータンパク質またはマーカータンパク質をコードする。前記マーカータンパク質は、蛍光タンパク質または細胞表面発現タンパク質であってよく、目的のヒト肝細胞様細胞（ＨＬＣ）の迅速な同定および単離を可能にする。

マーカータンパク質は、例えば：
− 特に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または例えば増強緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）のようなその誘導体のような蛍光タンパク質、ならびに
− ＨＬＣにおいて通常発現していない、任意の細胞表面発現タンパク質
からなる群より選択されてよい。

本明細書中で使用されるとき、用語「作動可能に連結された」は、記載された構成要素が意図された様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。したがって、核酸配列は、他の配列の核酸配列との機能的関係に置かれたときに「作動可能に連結された」となる。例えば、プロモーターがコード配列の転写を引き起こす場合、プロモーターはコード配列に「作動可能に連結された」となる。一般に、作動可能に連結されたとは、連結された核酸配列が隣接していることを意味する。

本明細書で使用されるとき、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの転写開始部位を決定するＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、種々の細胞型にわたって高レベルの構成的発現を提供することができ、そして細胞内において、プロモーターの３’末端に連結された配列である遠位に位置する配列の転写を指示するのに十分であるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含み得る。適切なプロモーターには、例えば、構成的プロモーター、調節プロモーター、組織特異的プロモーターまたはユビキタスプロモーターを含み、細胞性、ウイルス性または合成由来であってもよい。

一実施形態において、プロモーターは、ヒト伸長因子−１α（ＥＦ−１α）などの構成的プロモーターである。

他の実施形態において、プロモーターは、例えばヒト１−アンチトリプシン、アルブミンなどの肝臓特異的プロモーターである。

他の実施形態において、プロモーターは内在性配列（構成的または特異的）である。その場合、目的のタンパク質は、人工ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ、ＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓ）の使用に基づくゲノム編集技術によって内在性プロモーターに連結される。

他の実施形態において、ヒト肝細胞様細胞の遺伝子改変は、内在性遺伝子配列を改変するためのゲノム編集技術によって実施される。

重要なことに、肝細胞系統細胞（ＨＬＣ）は、しばしば「肝疾患」（「肝損傷に関連する病理」とも呼ばれる）として知られる様々な状態における疾患の標的である。これらの用語は、肝障害、傷害、機能不全、欠損または異常を特徴とする任意の疾患または臨床状態を指す。したがって、この用語は、例えば、傷害、変性疾患および遺伝的疾患を包含する。

肝疾患は開発途上国で最も一般的な死亡原因の１つとなっている。主に肝臓の細胞を表す肝細胞のような肝細胞系統細胞を標的とするこの群の疾患は、遺伝的代謝障害（クリグラー−ナジャー症候群Ｉ型、糖原病、尿素サイクル欠陥、家族性高コレステロール血症、チロシン血症およびウィルソン病など）、ウイルス感染（特にＨＢＶまたはＨＣＶ感染）、毒性（アルコール）および薬物、または自己免疫疾患（自己免疫性慢性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎）によって引き起こされ得る慢性肝不全ならびに急性肝不全を包含する。

他の実施態様において、本発明はまた、本発明のヒト肝細胞様細胞の集団を含む医薬組成物を提供する。

医薬組成物は、一般に、１つまたはそれ以上の医薬的に許容されるおよび／または承認された担体、添加剤、抗生物質、防腐剤、アジュバント、希釈剤、溶媒および／または安定剤を含んでよい。そのような補助剤は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などであってよい。適切な担体は、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体などのような、大きくてゆっくりと代謝される分子である。この医薬組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に適したマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドンまたは酸化防止剤または不活性ガス、安定剤または組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）またはビタミンのようなさらなる添加剤を含んでもよい。

本明細書中で使用されるとき、用語「医薬的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトに適切に投与された場合に、有害な、アレルギー性の、または他の有害な反応を生じない分子実体および組成物を指す。医薬的に許容される担体または賦形剤は、任意のタイプの非毒性固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤補助剤をいう。

本発明のスクリーニング方法
他の実施態様において、健康な患者または罹患した患者から取得された本発明のヒト肝細胞様細胞は、製薬産業におけるスクリーニング用途において有利にも使用することもできる。

そのようなスクリーニング試験は、臨床応用での新薬の探索、または医薬的候補化合物のような化合物の肝毒性の毒性試験評価のために使用することができる。本発明によるヒト肝細胞様細胞は、例えば、上述のような肝疾患の細胞モデルを作製するために有用であり得る。

したがって、本発明は、肝疾患の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）本発明の方法によって生成したヒト肝芽細胞様細胞または胎児肝細胞様細胞の集団を試験化合物と接触させるステップと、
（ｂ）前記ヒト肝芽細胞様細胞または胎児肝細胞様細胞に対する該試験化合物の効果を決定するステップと、
を含む方法を提供する。

本発明のさらなる実施態様は、肝保護性または肝毒性または肝増殖性効果を有する化合物をスクリーニングする方法に関し、前記方法は、
（ａ）本発明の方法によって生成したヒト肝芽細胞様細胞または胎児肝細胞様細胞の集団を試験化合物と接触させるステップと、
（ｂ）ステップａ）の細胞の生存を、前記試験化合物の非存在下で培養された上述の前記細胞の集団の生存と比較するステップと、
を含む。

用語「肝毒性」は、肝前駆細胞の生存の低下を引き起こす化合物を指す。前記化合物の存在下で培養された生存細胞の数が、前記化合物の非存在下で培養された生存細胞の数よりも少ない場合、化合物は肝毒性効果を有するとみなされる。

用語「肝保護性」は、肝前駆細胞の生存の増加をもたらす化合物を指す。前記化合物の存在下で培養された生存細胞の数が前記化合物の非存在下で培養された生存細胞の数より多い場合、化合物は肝保護性効果を有するとみなされる。

典型的には、肝保護性効果は、肝栄養因子の非存在下でアッセイすることができる。代替的に、既知の肝毒性薬物の存在下で肝保護性効果をアッセイすることができる。既知の肝毒性薬物には、アミオダロン、メトトレキセート、ニトロフラントインが含まれるが、これらに限定されない。

用語「肝増殖性」は、肝前駆細胞の増殖の増加をもたらす化合物を指す。前記化合物の存在下で培養された増殖細胞の数が、前記化合物の非存在下で培養された生存細胞の数より多い場合、化合物は肝増殖性作用を有するとみなされる。典型的には、増殖因子の非存在下で肝増殖性効果をアッセイすることができる。

本発明の試験化合物
一実施形態において、試験化合物は、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣薬、有機小分子、アプタマーまたは核酸からなる群より選択され得る。例えば、本発明による試験化合物は、以前に合成された化合物のライブラリー、または構造がデータベースで決定される化合物のライブラリー、または新規に合成された化合物のライブラリーより選択され得る。

特定の実施形態において、試験化合物は、有機小分子より選択され得る。本明細書で使用される場合、用語「小有機分子」は、医薬品において一般的に使用される有機分子に匹敵するサイズの分子を指す。この用語は、生物学的高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を排除し、好ましい有機小分子は、２０００Ｄａまで、そして最も好ましくは約１０００Ｄａまでの大きさの範囲である。

他の実施形態において、試験化合物は、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡを含むがこれに限定されない核酸ライブラリーからなる群より選択され得る。

動物モデル
ヒトＥＳまたはｉＰＳに由来し得る肝細胞様細胞の利用可能性はさらに、ヒト肝疾患および向肝性ウイルス、特にＢ型肝炎またはＣ型肝炎のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのモデルを設計することを可能にする。より具体的には、ヒトの肝疾患および向肝性ウイルスのｉｎ ｖｉｖｏモデルが、非ヒト哺乳動物の肝臓にヒト肝前駆細胞を再増殖させることによって提供され得る。

したがって、本発明はさらに、本発明による方法によって取得されるヒト肝細胞様細胞の、機能的ヒト肝細胞を含む非ヒト哺乳動物宿主を産生するための使用に関する。

機能的ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト哺乳動物を産生するための適切な方法は、前記非ヒト哺乳動物の肝臓への本発明のヒト肝細胞様細胞の注入からなるステップを含み得る。ＨＬＣの生着を助けるために、非ヒト哺乳動物は、非適応防御を制御するために抗マクロファージ処理を受けてもよい。これは、例えば、ジクロロメタンジホスホネートを、例えばリポソーム封入ジクロロメチレンジホスホネートの腹腔内注射によって投与することによって実施することができる。ＨＬＣの生着を促進する他の戦略は、細胞注射前に肝再生を刺激することに頼ることができる。これは、例えば、肝臓摘出（例えば、部分肝切除術、化学塞栓術、肝照射、肝毒素、トランスジーン）または肝細胞増殖を刺激する任意の化合物（肝細胞増殖因子、Ｔ３ホルモン）の投与によって実施することができる。

他の戦略において、再生肝（若い動物または傷害された肝臓）における内在性肝細胞の増殖能を阻害することによって、ＨＬＣの生着を支持することもできる。これは、例えば、レトロシン（腹腔内注射）、マイトマイシンＣ（腹腔内注射）または塩酸プロパノロール（飲料水）を投与することによって行うことができる。最後に、ＨＬＣの生着は、血管拡張剤化合物を投与することによって好ましく実施し得る。これは、例えば、グリセリルトリニトレートを投与することによって実施することができる。

本発明は、さらに、本発明の方法によって取得されるかまたは取得することができる機能性ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト哺乳動物に関する。

本発明の非ヒト哺乳動物は、ヒト肝細胞を導入し維持することができる任意の非霊長類哺乳動物であり得る。これには、ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ラット、ハムスター、ウサギ、アレチネズミ、モルモットおよびマウスが含まれるが、それらに限定されない。好ましくは、宿主動物はげっ歯類、さらに好ましくはマウスである。それは、非ヒト霊長類（Ｍａｃａｃｕｓ）であってもよい。

非ヒト哺乳動物は、特に、異種細胞（ヒト肝細胞）に対する完全な免疫応答を一般に開始することができない免疫不全状態の哺乳動物であってもよい。移植に適した免疫不全状態の哺乳動物宿主は存在するか、または例えば１つまたはそれ以上の化合物（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）の投与によって、または例えば、免疫グロブリンおよびＴ細胞抗原受容体をコードする遺伝子座における生殖系列ＤＮＡの再編成の不可能性を生じるような遺伝的欠陥によって作出され得る。

ヒト肝細胞の機能性は、例えばヒト血清アルブミンの発現、またはＵＧＴ１Ａ１活性が欠損している動物（ビリルビン血症とも呼ばれる）における血清ビリルビンレベルなどのような、非ヒト哺乳動物、特にげっ歯類と区別することのできるヒト肝細胞の生理学的産物、免疫学的または定量的な基準による類似体のような、肝細胞活性の代理マーカーを調べることによって観察され得る。これらのマーカーを用いて、レシピエントを犠牲にすることなく細胞の存在を判定することができる。

機能性ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト哺乳動物は、特にヒトＢ型肝炎感染のｉｎ ｖｉｖｏモデルとして使用することができる。

治療法および用途
１つの主な応用分野は、細胞療法または再生医療である。再生医療は、本発明の肝細胞様細胞を含む医薬組成物の直接ｉｎ ｖｉｖｏ移植により、損傷組織をｉｎ ｖｉｖｏで再生することによって、機能不全、損傷または不全組織から生じる任意の疾患を潜在的に治癒するために使用され得る。

本発明はまた、上述のような肝細胞様細胞の集団および少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤を含むか、またはそれらからなるか、または本質的にそれらからなる肝疾患を治療するための、または肝疾患を治療する際に使用するための医薬組成物に関する。

本発明の別の目的は、肝細胞様細胞の集団を含むか、またはそれらからなるか、または本質的にそれらからなる肝疾患を治療するための、または肝疾患を治療する際に使用するための医薬である。

本明細書中で使用されるとき、用語「本質的に〜からなる」は、医薬組成物または医薬に関して、少なくとも１つの本発明の化合物が、前記医薬組成物または医薬品内において生物学的活性を有する唯一の治療剤または薬剤であることを意味する。

医薬的に許容される賦形剤は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指す。一実施形態において、賦形剤は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類およびオリゴ糖類を含む糖類；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などのような誘導体化された糖類、ならびに多糖類または糖ポリマー）の添加剤を含み、それらは単独でまたは組み合わせて存在してもよく、単独または組み合わせて、１〜９９．９９重量％または容積％で含む。例示的なタンパク質賦形剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）のような血清アルブミン、ゼラチン、カゼインなどを含む。

緩衝能においても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどを含む。炭水化物賦形剤も本発明の範囲内であることが意図され、その例は、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどのような単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどのような二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどのような多糖類；およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトールのようなアルジトールを含むがそれらに限定されない。ヒトの投与のためには、調製物は、例えばＦＤＡ局またはＥＭＡなどの規制機関によって要求されるような、無菌性、発熱原性、一般的安全性および純度の基準を満たすべきである。

本発明はまた、肝細胞系統に系統決定されるが、人体の治療方法における使用のために完全に分化していないヒト細胞の集団に関する。本発明はまた、肝細胞系統に系統決定されるが、肝疾患の治療における使用のために完全に分化していないヒト細胞の集団に関する。

肝疾患の例は、肝硬変、肝脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール性肝炎、脂肪肝疾患、妊娠脂肪肝、ウイルス性Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型肝炎、鉄過剰症、肝線維症、（Ｉ型クリグラー−ナジャー（ＣＮ１）、ウイルソン病、尿素サイクル障害、チロシン血症、家族性高コレステロール血症、血友病、シトルリン血症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞、糖原病などのような）先天性肝疾患、急性肝不全劇症肝炎、亜激症肝炎、肝臓癌、高コレステロール血症を、非限定的に含む。

このような疾患は、薬物、毒性キノコ、術後感染、ウイルス、細菌およびアルコールを含むがそれらに限定されない環境要因によって誘発され得る。したがって、本発明の他の実施態様は、人体の治療方法において使用するための、本発明の肝細胞様細胞（例えば、肝芽細胞様細胞）の集団に関する。

一実施形態において、前記ヒト肝芽細胞様細胞の集団は、肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４α）を発現し、かつ上述のようにα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を発現しないか、または実質的に発現しない前記細胞の集団である。

より詳細には、本発明の一実施態様は、肝疾患の治療において使用する本発明の肝細胞様細胞の集団に関する。一実施形態において、前記ヒト肝芽細胞様細胞の集団は、肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４α）を発現し、かつ上述のようにα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を発現しないか、または実質的に発現しない前記細胞の集団である。

本発明はまた、医薬的に有効な量の本発明の肝細胞様細胞の集団を、それを必要とする対象または患者に投与するステップを含む、肝疾患の治療方法に関する。

本発明の文脈において、本明細書で使用される用語「治療する」または用語「治療」は、病理の発症を遅延または予防すること、病理の症状の進行、激化または悪化を逆転、緩和、阻害、減速または停止すること、病理の症状の改善をもたらすこと、および／または病理を治癒することを目的とした方法を指す。

本明細書で使用されるとき、「医薬的に有効な量」という用語は、意図された目的を達成するのに十分な、本発明によるヒト肝細胞様細胞の集団（またはその医薬組成物）の任意の量を指す。

有効な投薬量および投与レジメンは、対象の病態の性質に基づいた適正な医療行為によって容易に決定することができ、投与経路、病理の症状の程度、目的の組織または臓器の損傷または変性の具体的な病理および程度、および対象の特性（例えば、年齢、体重、性別、全般的健康状態など）を含むが、それらに限定されないいくつかの要素に依存する。

治療のために、本発明によるヒト肝細胞様細胞の集団および医薬組成物は、種々の経路で投与することができる。投与量および投与回数は、当業者によって既知の方法で最適化することができる。

一実施形態において、本発明のヒト肝細胞様細胞の集団、医薬組成物、医薬は、局所的にまたは全身的に投与される。

一実施形態において、本発明のヒト肝細胞様細胞の集団、医薬組成物、医薬は、局所的に投与され、肝臓内、その周囲またはその近辺に、肝実質内、肝臓グリッソン嚢下、腎臓嚢下、脾臓内、膵臓内、腹腔内および大網嚢内への本発明のヒト肝細胞様細胞、医薬組成物、医薬の集団の注射または注入または移植を非限定的に含む。好ましくは、局所投与は、肝臓を灌流する血管（門脈、動脈、静脈、腸間膜静脈）を介する注射または注入または移植である。

他の実施形態において、本発明のヒト肝細胞様細胞集団、医薬組成物または医薬は、本発明のヒト肝細胞様細胞の集団のための分化環境内に投与される。

そのような投与経路は、外科処置、腹腔鏡手術、カテーテルシステム経由または腹腔内移植によって達成することができる。

一実施形態において、本発明のヒト肝細胞様細胞の集団、医薬組成物、医薬は、全身投与され、経腸または非経口投与を非限定的に含む。

注射または注入または移植に適合する製剤の例は、液体溶液または懸濁液、注射前の液体中における溶液または懸濁液に適した固体形態が含まれるが、それらに限定されない。注射の例は、静脈内、大動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、および腹腔内注射または灌流を含むが、それらに限定されない。他の実施形態において、注射するとき、本発明のヒト肝細胞様細胞の集団、医薬組成物または医薬は無菌である。滅菌医薬組成物を得るための方法は、ＧＭＰ合成（ＧＭＰは「Ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ」を意味する）を含むが、それに限定されない。

一実施形態において、本発明のヒト肝細胞様細胞の集団、医薬組成物または医薬がカプセル化される。カプセルの例は、マトリゲル、ヒドロゲルを非限定的に含む。

一実施形態において、本発明のヒト肝細胞様細胞の集団、医薬組成物または医薬は、徐放性形態で投与される。他の実施形態において、本発明のヒト肝細胞様細胞の集団、医薬組成物または医薬は、薬剤の放出を制御する送達系を含む。

一実施形態において、治療上有効な量の本発明のヒト肝細胞様細胞の集団、医薬組成物または医薬は、対象において治療効果を得るおよび／または維持するために、対象の生涯において少なくとも１回または数回投与される。

他の実施形態において、本発明のヒト肝細胞様細胞の集団または医薬組成物または医薬の治療上有効な量は、体重１ｋｇあたり約１〜約２億個の細胞の範囲、好ましくは体重１ｋｇあたり約２５００万個の細胞である。

本明細書において数量の前に使用される用語「約」は、前記数量の値のプラス１０％またはマイナス１０％を意味する。

一実施形態において、対象は罹患しており、好ましくは肝疾患と診断されている。

一実施形態において、本発明のヒト肝細胞様細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで置換することのできる１つの特定の遺伝子の欠損に起因するＩ型クリグラー−ナジャー（ＣＮ１）を非限定的に含むような、特定の疾患により再生療法または障害に関連した治療を必要とする肝疾患に罹患している患者の自己再生療法に有用であり得る。

一実施形態において、本発明は、同種異系移植片として、または遺伝子矯正後に、自己移植片（すなわち、細胞は対象／患者の細胞と同じ遺伝子型を有する）としてヒト患者に移植するための細胞治療産物として使用するための本発明のヒト肝細胞様細胞に関する。

一実施形態において、本発明は、補助肝臓として使用するための本発明のヒト肝細胞様細胞に関する。一実施形態において、本発明の肝細胞様細胞は、投与されるとき、脾臓に局在する。一実施形態において、本発明の肝細胞様細胞を含有する脾臓は、二次肝臓として機能する。

一実施形態において、本発明のヒト肝細胞様細胞は、生体工学によって作られる肝臓において有用であり得：他の肝細胞系統細胞と併せて脱細胞化肝臓に注入すること、または肝臓組織を生成させるための３Ｄプリンティングまたはすべての他の方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏで作出された肝臓芽の移植による、ヒトｉＰＳＣからの血管新生され、かつ機能性のヒト肝臓を生成すること（Ｔａｋｅｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９９）のいずれかによる。他の実施形態において、本発明のヒト肝細胞様細胞は、体外装置に注入すること、または身体に注入する前にバイオマトリックスもしくはヒドロゲル（アルジネート、シラン化ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）に埋め込むことのいずれかによってバイオ人工肝臓において有用であり得る。

本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明される。しかしながら、これらの実施例および図面は本発明の範囲を限定するものであると、決して解釈されるべきではない。

実施例１：多能性細胞を肝細胞系統の細胞へと分化させるためのマトリックスとしてのＬＮ−１１１の使用およびこれにより取得された肝芽細胞様細胞の治療における使用
方法および材料
この研究は、フランスと欧州の規制に合致して行われた。
ｈＩＰＳＣの維持：ＢＢＨＸ８ ｈｉＰＳＣ（非特許文献４６）株は、ｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）中においてマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）コーティング培養ウェル上で３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターで毎日培地交換して維持された。細胞は、Ｇｅｎｔｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を用いて５〜７日ごとに継代された。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの肝細胞分化：ヒト多能性幹細胞の肝細胞分化は、いくつかの改変を加えた以前の研究（非特許文献１６、２０、４０）に基づく３ステッププロトコールに従って行った。最初に、胚体内胚葉分化のために、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて採取し、ＡＤＡＭ自動細胞計数器（Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｐａｌａｉｓｅａｕ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて計数し、次いで、５μｇ／ｍｌのラミニン１１１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ、Ｓｕｎｄｂｙｂｅｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）または２ｍｇ／ｍｌのマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）のいずれかで予めコーティングしたプレート（Ｃｏｓｔａｒ；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）中に７５×１０３細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種された。それらは、Ｂ２７無血清サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）の補充されたＲＰＭＩ １６４０（ＲＰＭＩ／Ｂ２７）、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）、１０μＭのｒｏｃｋ阻害剤（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）、および任意選択でＣＨＩＲ ９９０２１中において１日間培養した。ＲＯＣＫ阻害剤およびＷｎｔ３Ａは、それぞれ２日後および３日後に培地から除かれた。続く４日間、細胞は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有するＲＰＭＩ １６４０／Ｂ２７中で細胞を増殖させ、細胞を毎日交換した。次に、肝細胞特異化のために、次いで、細胞は、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）および１０ｎｇ／ｍｌの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を補充したＲＰＭＩ／Ｂ２７中で２日間、毎日培地交換しつつ培養した。次いで、細胞を、ＴｒｙｐＬＥを用いて、５μｇ／ｍｌのラミニン１１１または２ｍｇ／ｍｌのマトリゲルで予めコーティングした３つのプレートに、７０×１０３細胞／ｃｍ２の細胞密度で分割した。それらを、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４および１０μＭのｒｏｃｋ阻害剤を補充したＲＰＭＩ／Ｂ２７中で１日間培養し、翌日にｒｏｃｋ阻害剤を培地から除いた。最後に、肝細胞成熟のために、細胞を２０ｎｇ／ｍＬの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）および２０ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を補充した肝細胞培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂｌｅｌｅ、Ｓｕｉｓｓｅ）（成熟培地）で４日間培養した。翌日に培養培地からＨＧＦを除き、培地を２日毎に交換した。

免疫蛍光アッセイ：培養した細胞を室温で２０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１５分間透過処理をし、ＰＢＳ中３％ＢＳＡで１５分間ブロッキングした。細胞を一次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。ヒトＡＡＴ（１：１００）、ＣＫ１９（１：５０）およびＡＦＰ（１：３００）に対する一次抗体は、ＤＡＫＯ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｔｒａｐｐｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。ヒトＯｃｔ４（１：１００）、ＨＮＦ４α（１：１００）に対する抗体はＴｅｂｕＢｉｏ（Ｌｅ Ｐｅｒｒａｙ−ｅｎ−Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。ＰＢＳ０．１％Ｔｒｉｔｏｎで数回洗浄した後、ＰＢＳ１％ＢＳＡ０．１％Ｔｒｉｔｏｎで１／１０００希釈した、ＡＬＥＸＡ ４８８、５５５または６４７を結合した抗マウス、抗ヤギ（両方がＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのもの）または抗ウサギ（Ａｂｃａｍ）のＩｇＧ二次抗体によって、室温で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を室温で１分間、ＰＢＳで１／１０，０００希釈したＤＡＰＩで対比染色し、倒立蛍光顕微鏡（ＡＭＧのＥｖｏｓＦＬ）で読み取った。分化した細胞の割合を評価するために、１０回の独立した分化からのランダム写真を撮り、次いで分化マーカーの陽性細胞を全細胞と共に計数した。

フローサイトメトリー：フローサイトメトリーのために、分化した細胞をＡｃｃｕｔａｓｅと共に３７℃で２分間インキュベートした。解離した細胞を０．２５％パラホルムアルデヒドで４℃で３０分間固定し、次いでＰＢＳ中の０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０で３７℃で１５分間透過処理した。細胞を、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡで希釈した一次抗体の存在下または非存在下で、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで３０分間／４℃でブロッキングした。洗浄後（ＰＢＳによる）、細胞を３％ＢＳＡ／ＰＢＳと共にインキュベートした後、ロバ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合抗体と４℃で２０分間インキュベートした。フローサイトメトリー分析は、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。

動物実験：動物をＮａｎｔｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ（Ｎａｎｔｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）の動物施設に収容し、１２時間の光周期で維持し、自由摂取させ、フランスのＭｉｎｉｓｔｅｒｅ ｄｅ ｌ’Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅのガイドラインに従って人間の管理を受けて飼育された。試験には、体重１２０±３０ｇ（年齢：８〜９週齢）のホモ接合型（ｊ／ｊ）のＧｕｎｎラットを使用した。

肝機能試験：血液は、眼窩後洞から採取された。血清総ビリルビンとアラニンとアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、Ｎａｎｔｅｓ大学病院のルーチン生化学部門で測定されました。

組織学および免疫組織化学：免疫組織化学的解析は、固定パラフィン包埋切片に対する免疫ペルオキシダーゼ技術の使用を含んだ。ウサギポリクローナル抗ＵＧＴ１Ａ１（１：５０；Ａｂｇｅｎｔ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）、抗αフェトプロテイン（１：２５０；Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）およびマウスモノクローナル抗血清アルブミン（１：２００；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ；Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）の抗体をヒト細胞検出に使用した。要約すると、厚さ４μｍの肝臓切片を脱蝋し、９８℃で４０分間、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝６、１０％、Ｄａｋｏ）中で前処理した。５分間のＨ２Ｏ２（Ｄａｋｏ）およびさらに５分間のＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ（ＳｃｙＴｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｌｏｇａｎ、ＵＳＡ）での処理の後、切片をＢＳＡ ２％およびＴＢＳ Ｔｗｅｅｎを含む一次抗体と共に３７℃で３０分間インキュベートした。結合した抗体を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ二次薬剤（Ｄａｋｏ）および免疫ペルオキシダーゼのためのＤＡＢ液体基質（Ｄａｋｏ）を用いて検出した。

ＲＴ−ｑＰＣＲ：製造者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）または製造者の説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、全ｍＲＮＡを培養細胞から単離した。単離されたｍＲＮＡはＮａｎｏｄｒｏｐを用いて定量され、反応あたり合計１０ｎｇが使用された。転写物の分析は、Ｐｏｗｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＥＲ（商標）キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ＶｉｉＡ７配列検出システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。プライマー配列は以下の通りである：

ＰＣＲ法およびＧＡＰＤＨ値への標準化後の２−ΔΔＣｔ定量法を用いた相対遺伝子発現データの分析は、以前に記載されているように行った。ｍＲＮＡ発現レベルは、未分化細胞におけるレベルと比較して、所与のサンプルにおけるｍＲＮＡレベルの倍数変化として定義される。ｍＲＮＡ発現レベルは以下のように計算される：ｍＲＮＡ発現レベル＝２−ΔΔＣｔ、ここで、ΔΔＣｔ＝（Ｃｔ目的物−ＣｔＧＡＰＤＨ）サンプル−（Ｃｔ目的物−ＣｔＧＡＰＤＨ）。特異的な増幅は、アンプリコンの融解曲線によって検証した。

転写物の他の分析は、ＡｇＰａｔｈ−ＩＤ（商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）および適切なプライマー対（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＶｉｉＡ７配列検出システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって実施された。

ＥＬＩＳＡ：培養上清中のヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）（Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ）およびアルブミン（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の分泌を、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡによって評価した。

肝細胞移植：細胞（１×１０７細胞）は、ＴｒｙｐＬＥを用いてプレートから剥離され、洗浄され、２００μｌの生理的血清に再懸濁され、細胞移植に最適化された環境を創出するために２４時間前に２／３の部分肝切除を施されたＧｕｎｎラットの脾下極中へと２６ゲージの翼状針によって注入された（非特許文献４８）。ラットは、細胞移植１日前まで３日間０．２ｍｇ／ｋｇで、そしてその後に０．１ｍｇ／ｋｇでタクロリムスによって毎日免疫抑制された。

統計解析：データは、平均値±ＳＥＭとして表される。統計解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍ（登録商標）５．０４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて行った。統計的有意性は、群間の比較についてのＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて評価した。ｐ値＜０．０５が統計的に有意であると考えられた。

結果
我々は、以前に報告されたプロトコール（非特許文献１６、２０、３６、４０）を修正および組み合わせて、ｈｉＰＳＣからＨＬＣを生成するための既知組成の条件、異種不含有、フィーダー不含有、および組換え因子を用いたＧＭＰ適合法を開発した。ラミニン−１１１（ＬＮ１１１）は胎児肝臓で発現され（非特許文献４１）、ラミニンアイソフォームは主にマトリゲル（登録商標）中に存在する。我々は、ＬＮ１１１がｈｉＰＳＣの肝細胞分化を開始および支持するための効率的な細胞外マトリックスを構成すると仮定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＬＣを産生するための我々の３ステップ分化プロトコールは、図１Ａに概説されている。我々は、ＨＬＣに分化することが知られている代表的な細胞株として、ヒトｉＰＳＣ細胞株ＢＢＨＸ８を使用した（非特許文献４０、４２）。ｈｉＰＳＣが７０〜９０％コンフルエントであるとき、細胞を回収し、組換えＬＮ１１１でコーティングしたディッシュ上に播種した。より再現性のある肝細胞分化プロセスを得るために、細胞を酵素的に採取し、単細胞懸濁液を計数し、ＨＬＣ生成を開始させる時間および細胞比分割を評価するため、経験的細胞密度視覚化に基づく標準的方法を用いる代わりに新しいＬＮ１１１コーティングディッシュに播種した。０日目に、ｈｉＰＳＣは多能性マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ ２）に対して陽性であり（図１Ｂ）、胚体内胚葉（Ｓｏｘ １７、ＦｏｘＡ２）（図１Ｃ）および肝細胞マーカー（ＨＮＦ４ａ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、シトクロムＰ４５０）（図１Ｄ）に対して陰性であった。これらの実験は、ＡｇＰａｔｈ−ＩＤ（商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐを用いたより正確なＲＴ−ｑＰＣＲ解析により確認された（図４）。

細胞をアクチビンＡおよび塩基性線維芽細胞増殖因子で処理して胚体内胚葉を生成した。Ｗｎｔ３ａおよびｒｏｃｋ阻害剤への短時間暴露が、それぞれ酵素的細胞回収後の胚体内胚葉の発現および細胞生存を改善するために使用された（非特許文献１６、３６）。５日目に、細胞の８０〜９０％超が胚体内胚葉マーカーＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２を強く発現し、多能性遺伝子の発現を失った（図１Ｂ）。次いで、生じた胚体内胚葉細胞を、以前に記載されている（非特許文献４３）ように、初期胚性肝臓発生の初期シグナル伝達経路に関与する２つの重要な因子であるＦＧＦ１０およびＢＭＰ４の存在下で培養した。３日間の細胞処理（分化の８日目）の後、細胞を新しいＬＮ１１１でコーティングしたディッシュ上へと酵素的に継代して拡大させ、肝細胞特異化段階を３日間続けた。

１１日目に、ほとんどの細胞は、肝臓発生の初期段階の間に肝前駆細胞で発現されるマーカー（ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１９およびＣＹＰ３Ａ７）に対して陽性である（図１Ｄ）。それらは、成熟肝細胞のマーカーであるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、肝芽細胞マーカー、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＡＴ（α−１アンチトリプシン）およびシトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）は陰性であった。それらはＳＯＸ１７を発現せず、ＦＯＸＡ２のレベルが低下していた。肝細胞様細胞への分化（ＡＦＰの発現）を目指すために、細胞をＯＳＭおよびＨＧＦの存在下で４日間培養した。同じ段階で、細胞をＡｇＰａｔｈ−ＩＤ（商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐで試験したところ、同様の結果が得られた（図５と図６参照）。集約すると、結果は、それらが肝芽細胞の表現型を有することを示した（非特許文献４４、４５）。

２０日後、ＲＴ−ｑＰＣＲ解析によって評価すると、ｈｉＰＳＣ由来の肝芽細胞はＨＮＦ４ａ、ＣＫ１９、ＡＦＰおよびＣＹＰ３Ａ７（胎児肝細胞で発現されるＣＹＰ４５０酵素）を発現し、成熟肝細胞のいくつかのマーカー（ＡＬＢ、ＡＡＴ、ＵＧＴ１Ａ１、ＣＹＰ３Ａ４）の発現を獲得し、ＦＯＸＡ２発現を失った（図１Ｄ）。これらの結果に従って、細胞上清中のＡＦＰの分泌をＥＬＩＳＡアッセイによって確認した。しかしながら、おそらくアルブミンｍＲＮＡ発現レベルが低いために、我々はアルブミンの分泌を検出しなかった（図１Ｅ）。ｈｉＰＳＣをマトリゲルコーティングディッシュ上で分化させた場合にも同様の結果が得られた。

集約すると、結果は、ＬＮ１１１が、我々の培養条件においてｈｉＰＳＣの肝細胞分化を開始および支持することについて、マトリゲルと同じくらい効率的であることを示したが、組換えマトリックスを有していた。私たちの研究は、ＬＮ１１１をコーティングしたディッシュが、マトリゲルをコーティングしたディッシュ上におけるｈｉＰＳＣ内胚葉後の肝芽細胞様細胞および肝細胞特異化の段階のｈｉＰＳＣの維持を可能にするということを示す最近の研究（非特許文献３６）を拡張した。以前の研究によれば、ＨＬＣはｉｎ ｖｉｔｒｏでほとんど成熟していないことが示されている。２０〜３０日目に、我々のＨＬＣはアルブミンを分泌せず、おそらく、ＨＬＣの成熟を増加させるデキサメタゾンまたはＤＭＳＯの存在下で培養を行わなかったからであろう。ヒト初代肝細胞に類似している高成熟ＨＬＣは、それらを３Ｄ培養またはマイクロパターン共培養条件下で培養した場合に生成することができる（非特許文献３４、４６）。

治療有効性を調べるために、免疫抑制ＧｕｎｎラットにおけるＩＤＨＢ（ＬＮ１１１コーティングディッシュ上での肝細胞分化の１１日目）の移植後に、血清ビリルビンレベルが経時的に観察された。図２に示すように、細胞移植後６０日間にわたって、治療群ではベースラインのビリルビン値が漸進的に低下していた。その後、血清ビリルビン血症の減少は、試験を通して２８±５％のレベルで持続し、移植前値と比較して統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。治療群の血清ビリルビンは犠牲時に５７±５μＭであり、移植前値では８４±１１μＭであった（ｐ＝０．００５）。凍結したＩＤＨＢの移植後に同様のビリルビン血症の減少が観察された（図１０）。治療したラットとは対照的に、対照群の血清ビリルビンは減少せず、１５０μＭまでの値で上昇したままであった。これらの結果は、新鮮肝細胞および凍結肝細胞の両方において確認された（図１０）。免疫化学的解析により、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ１−Ａ（ＵＧＴ１Ａ１）を発現する細胞の存在が明らかになり、移植されたＩＤＨＢは非常に低レベル（＜０．１％）ながらも肝実質に生着する能力を有したことが確認された（図１１の矢印を参照）。それらは肝実質全体に分布し、主に単一細胞として分布していた。これは、移植された細胞の選択的増殖の利点がない動物の肝臓における正常な肝細胞の低い生着効率と一致する（非特許文献３７、４７〜５０）。ＵＧＴ１Ａ１陽性ヒト細胞の大部分もまた脾臓で検出され、脾臓の約１〜２％に相当した（図１１）。ヒトＡＦＰ発現細胞は検出されなかった。これらのデータは、脾臓がＩＤＨＢの成熟肝細胞への成熟をさらに促進することを示した。すべての動物の肝臓および他の器官（図示せず）の組織学は、正常であった。治療ラットにおけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）（確立された肝細胞傷害マーカー）の血清レベルは、移植後１０日目にそれぞれ１．５９±０．２１μｋａｔ／ｌおよび１．０７±０．１６μｋａｔ／ｌであり、犠牲時にそれぞれ２．０７±０．８５μｋａｔ／ｌおよび０．９５±０．１９μｋａｔ／ｌであった。これらの値は、術前の値（ＡＳＴ：２．４４±１μｋａｔ／ｌおよびＡＬＴ：１．４６±０．７５μｋａｔ／ｌ）と変わらず、また、移植後１０日目（ＡＳＴ：１．５９±０．１２μｋａｔ／ｌおよびＡＬＴ：１．０３±０．１２μｋａｔ／ｌ）ならびに犠牲時（ＡＳＴ：１．６１±０．５３μｋａｔ／ｌおよびＡＬＴ：１．１３±０．３３μｋａｔ／ｌ）の対照ラットの値と変わらなかった。ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ値もまた、これらの時点で正常（＜０．０５μｋａｔ／ｌ）であった。これらの結果は、動物が外科手術からうまく回復したことを示した。移植されたヒト細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能性を追跡するために、我々は動物血清中のヒトＡＦＰおよびヒトアルブミンを経時的に測定した。１匹の動物において、細胞移植後１１日目で有意なレベル（１６ｎｇ／ｍｌ）の血清ヒトＡＦＰ（対照ラット血清のバックグラウンドを超える）を検出することができ、その後は漸進的に検出不能になった。他の２匹の動物では、非常に低レベル（６および２３ｐｇ／ｍｌ）であるにもかかわらず、移植後５ヵ月後に血清ヒトアルブミンの出現を検出することができた。ヒトのアルブミンおよびヒトＡＦＰの検出可能なレベルは、他の移植されたＧｕｎｎラットの血清中に検出されず、おそらく、肝臓中のヒト細胞の数が非常に少ないためである。

要約すると、我々は、ヒトにおける肝細胞移植において遭遇する状況である、常在げっ歯類肝細胞上の移植細胞の選択的増殖の利点非存在下（非特許文献９）で、遺伝性肝代謝疾患の治療のためのｈｉＰＳＣに基づく再生の有効性を初めて証明した。我々は、黄疸の成体Ｇｕｎｎラットにおける細胞移植後、新たに調製された、および凍結された治療用ヒト細胞による高ビリルビン血症の持続的な有意な減少を実証した。治療有効性は、レンチウイルス矯正初代肝細胞を用いたＧｕｎｎラットにおけるｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療で得られた有効性と同等であった（非特許文献５１）。注目すべきことに、それは、ヒト新生児肝臓から単離された肝細胞の移植と同じくらい効率的であり、Ｇｕｎラットを治療するためのヒト細胞治療のための究極の判断基準とされる細胞であるヒト成人肝臓から単離された肝細胞のものより高かった（非特許文献６１）。本研究では、ｈｉＰＳＣを、細胞移植のためにＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ１−Ａ（ＵＧＴ１Ａ１）を発現しない肝芽細胞様細胞に分化させた。我々の結果は、ｉｎ ｓｉｔｕ成熟が起きてＵＧＴ１Ａ１活性を得たという明白な証拠を示したが、これは移植後８週間で最大であった。一部の動物において、血清ＡＦＰの一過性発現および血清アルブミン産生の出現を検出することもできた。我々の結果は、肝臓が未成熟肝細胞、すなわち胎児肝臓から単離された肝細胞の最終分化をもたらすことを示す以前の研究と一致する（非特許文献５２、５３）。近年、分化した肝芽細胞（ＡＦＰを発現する）に特異化したｈｉＰＳＣは、マウス肝臓においてＡＦＰ発現を失い、さらに分化することができることが報告されている（非特許文献１４、２３、５４、６２）。我々の研究は、目下のところ、肝芽細胞に特異化したｈｉＰＳＣが、正常な肝再生の状況において代謝性肝機能を確実にするのに十分なレベルで他の種の肝臓に移植可能であり、ｉｎ ｓｉｔｕ成熟を獲得したことを示す。さらに、我々は、脾臓が成人肝細胞へのさらなる分化を促進するための適切な部位を構成することも示したが、これは以前のＨＬＣでの研究では報告されなかった。

重要なことに、ＩＤＨＢによる肝臓移植のｉｎ ｖｉｖｏ機能性は、組織学的および血液パラメータ分析によって評価されるように、腫瘍形成（カルチノーマまたは奇形腫）および肝臓損傷の徴候を示さずに長期間（６ヶ月）持続した。成体肝臓に移植された正常初代肝細胞（非特許文献５１）と同様に、ＩＤＨＢは単一細胞として肝臓に再配置され、肝再生が終了し、肝臓が有糸分裂の静止期に戻ったときに抗増殖刺激に応答することを示唆している。さらに、精巣にＩＤＨＢを直接注射した２ヵ月後に奇形腫は観察されず、ＨＬＣ細胞調製物中に未分化ｈｉＰＳＣが残存していないことが確認された。

最後に、我々が、ＨＬＣがＧＭＰ産生基準を満たす無血清、異種不含有および既知組成の肝細胞分化プロトコールを創出したことから、我々の研究はまた、遺伝性肝疾患の治療のためのｈｉＰＳＣの臨床応用への重要な一歩を提供する。我々は、ヒト胎児肝臓から単離された肝前駆細胞は、成人肝細胞よりも効率的に移植レシピエント肝臓内への移植および移動能を有する（非特許文献５５〜５７）ため、肝前駆細胞（ＨＮＦ４−αの発現およびＡＦＰのいくらかの発現）の段階でＨＬＣを採取することを選択する。ｈｉＰＳＣ由来の内胚葉細胞は、ＡＦＰを発現する肝前駆細胞様細胞および、成熟肝細胞（アルブミンを発現）よりも高い生着能力を有することも示されている（非特許文献３１）。逆に、未分化ｈｉＰＳＣまたは完全に分化していない細胞が最終細胞調製物中に残存するリスクを低減するために、内胚葉様細胞（分化の５日目）を移植しなかった。Ｌｏｈらは、ｈｉＰＳＣ由来の肝前駆細胞は、ネズミ新生児肝臓に移植できなかったことを観察した。上述の研究と我々のこの不一致は、生成されたＨＬＣの異なる生着能力をもたらす異なる肝細胞分化プロトコールの相違（例えば、Ｌｏｈらはいくつかの小分子阻害剤を使用）、肝臓レシピエントの相違（新生児対成人の肝臓）に関係するかも知れない。さらに、我々の研究では、肝臓においてＩＤＨＢはほとんど検出されなかったが、これは、脾臓内細胞の注射時に脾臓がすべてのＩＤＨＢを保持したためである可能性があり、このような脾臓内細胞の保持は他の研究では報告されていない（非特許文献６０〜６２）。

肝細胞分化１１日目（肝細胞特異化段階の終了時）に採取することはまた、培養時間を簡素化および短縮し、標準化、再現性を促進し、大量細胞産生のコストを削減する。

結論として、ＣＮ−１を含む遺伝性肝疾患の治療のためのヒト肝細胞の臨床的要求が存在する。ラミニンコーティングプレート上で培養されたｈｉＰＳＣまたはｈＥＳＣ由来の肝前駆細胞は、肝臓移植および死体肝臓から単離されたヒト肝細胞に対する安全な臨床的代替物であり得る。本研究はＣＮ−１の治療法に焦点を当てていたが、それは尿素サイクル疾患などの他の遺伝性肝疾患の治療においても重要な進歩をもたらした。実際、これらの疾患は、同種異系肝細胞移植（非特許文献９）によって治療することができ、したがって、正常ヒト多能性幹細胞を用いた再生医療アプローチに直接的に順応することができる。ＨＬＣへのアクセスが制限されないので、肝細胞移植は、満足のいく治療上の利益を維持するか、または達成するために繰り返すことができる。

実施例２：多能性細胞を肝細胞系統の細胞へと分化させるためのマトリックスとしてのＬＮ−５２１の使用
興味深いことに、組換えヒトラミニン−５２１（ＬＮ−５２１）は、細胞外マトリックスとしてＬＮ−１１１を置換することができ、ＨＮＦ４α、ＡＦＰ、アルブミン、ＡＡＴ発現の遺伝子発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析によって評価されるようにｈｉＰＳＣ由来の胚体内胚葉およびＨＬＣへのｈｉＰＳＣの良好な分化を可能にした。例えば、我々は、サイバーグリーンに基づいたＲＴ−ｑＰＣＲによって評価されるように、分化の５日目におけるＳＯＸ１７（内胚葉）のより高い発現、１１日目から３０日目までのＨＮＦ４α、ＡＦＰおよびアルブミンのより高い発現を観察した（図３）。これらの結果は、ｈｉＰＳＣ由来のＨＬＣ（図７）およびｈＥＳＣ（ＥＳＩ−０１７細胞株）由来のＨＬＣ（図８）についてＴａｑｍａｎに基づいたＲＴ−ｑＰＣＲを用いて確認された。

ＣＨＩＲ ９９０２１を肝細胞分化プロセスの０日目に２４時間添加すると、ＬＮ−５２１とＬＮ−１１１の差がより顕著になった（図８）。

興味深いことに、ＬＮ−５２１とＬＮ−１１１の混合物（２５％／７５％）を使用したとき、多能性幹細胞（ｈＥＳＣ）の肝細胞分化はＬＮ−５２１またはＬＮ−１１１単独と比較してより効率的である（図９）。この改善は、異なる細胞播種（５０×１０３、７５×１０３および１００×１０３細胞）において観察された。再び、我々はＣＨＩＲ ９９０２１の添加が肝細胞分化の有効性を改善することを観察した。

Claims (16)

1. 肝細胞分化のためのマトリックスとしてのラミニン（ＬＮ）の使用。
2. 多能性細胞の集団、多分化能細胞の集団または胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の集団の、肝細胞系統細胞の集団への分化を誘導および／または改善するためのＬＮの使用。
3. ＬＮがラミニン−１１１（ＬＮ−１１１）、ラミニン−２１１（ＬＮ−２１１）、ラミニン−３３２（ＬＮ−３３２）、ラミニン−４１１（ＬＮ−４１１）、ラミニン４２１（ＬＮ−４２１）、ラミニン−５１１（ＬＮ−５１１）およびラミニン−５２１（ＬＮ−５２１）からなる群より選択される、請求項１または２に記載の使用。
4. ＬＮがヒト組換えＬＮ−１１１またはヒト組換えＬＮ−５２１またはそれらの組み合わせである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
5. ヒト肝細胞分化を誘導するための方法であって、
   （ｉ）ヒト胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の集団を提供するステップと、
   （ｉｉ）前記ヒトＤＥ細胞の集団を肝細胞誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒト肝芽細胞様細胞の集団を生成するステップと、
   （ｉｉｉ）任意選択で、前記ヒト肝芽細胞様細胞の集団を肝細胞成熟培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、肝細胞様細胞の集団、好ましくはヒト胎児肝細胞様細胞の集団を生成するステップと、
   を含む方法。
6. 肝細胞分化を誘導するための方法であって、
   （ｉ）ヒト多能性細胞の集団を提供するステップと、
   （ｉｉ）該集団を内胚葉誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体で培養して、ヒトＤＥ細胞の集団を生成するステップと、
   （ｉｉｉ）前記ヒトＤＥ細胞の集団を肝細胞誘導培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、ヒト肝芽細胞様細胞の集団を生成するステップと、
   （ｉｖ）任意選択で、前記ヒト肝芽細胞様細胞の集団を肝細胞成熟培地中においてラミニンでコーティングされた支持体上で培養して、肝細胞様細胞、好ましくはヒト胎児肝細胞様細胞の集団を生成するステップと、
   を含む方法。
7. 前記肝細胞誘導培地が、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびファミリー増殖因子（ＦＧＦ１０）を含む既知組成培地である、請求項５または６に記載の方法。
8. 前記肝細胞成熟培地が、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）を含む既知組成培地である、請求項５または６に記載の方法。
9. 前記内胚葉誘導培地が、少なくともアクチビンＡを含み、任意選択でＷＮＴ３Ａを含む既知組成培地である、請求項６に記載の方法。
10. 前記肝細胞誘導培地および／または前記内胚葉誘導培地が、ＲＯＣＫ阻害剤および／またはＣＨＩＲ９９０２１をさらに含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法によって取得されるヒト肝細胞様細胞の集団。
12. 請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法によって取得されるヒト肝細胞様細胞の集団であって、前記集団がＨＮＦ４αを発現し、実質的にＡＦＰを発現する、ヒト肝細胞様細胞の集団。
13. 人体の治療方法において使用するための、請求項１１または１２に記載のヒト肝細胞様細胞の集団。
14. 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用するためのヒト肝細胞様細胞の集団であって、脾臓へと投与されるためのヒト肝細胞様細胞の集団。
15. 請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法によって取得されるヒト胎児肝細胞様細胞の集団。
16. ラミニンでコーティングされた支持体と、ＢＭＰ４、ＦＧＦファミリーのメンバー（ＦＧＦ１０またはＦＧＦ２）、および任意選択でＨＦＧ、ＯＳＭ、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａを含む因子とを含む、ヒト肝細胞分化を誘導するためのキット。
    
    
    

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