ES2940191T3 - Uso de una laminina para diferenciar células pluripotentes en células de linaje hepatocitario - Google Patents

Uso de una laminina para diferenciar células pluripotentes en células de linaje hepatocitario Download PDF

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Abstract

La invención se refiere al uso de una laminina (LN) como matriz para la diferenciación hepática. La invención también se refiere a un método para inducir la diferenciación hepática que comprende los pasos de: (i) proporcionar una población de células pluripotentes humanas, (ii) cultivar la población en un soporte recubierto con una laminina en un medio de inducción de endodermo para producir una población de células DE humanas, (iii) cultivar dicha población de células DE humanas sobre un soporte recubierto con una laminina en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatoblastos humanos, y (iv) opcionalmente cultivar dicha población de células similares a hepatoblastos humanos células sobre un soporte recubierto con una laminina en un medio de maduración hepática para producir una población de células similares a los hepatocitos humanos. La invención se refiere además a una población de células similares a hepatoblastos humanos o células similares a hepatocitos fetales humanos obtenidas mediante el método de la invención. La invención se refiere además a una población de células similares a hepatoblastos humanos que expresan HNF4 α y expresan sustancialmente AFP para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de una laminina para diferenciar células pluripotentes en células de linaje hepatocitario
CAMPO DE LA INVENCIÓN:
La invención se refiere al campo de la diferenciación celular y la terapia celular.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN:
Desde su descubrimiento, las células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) y las células madre embrionarias humanas (hESC) se han investigado intensamente como una fuente renovable de cualquier célula especializada del cuerpo para reemplazar las células enfermas [1, 2]. Se han previsto para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades, como cardiopatías graves [3], neurológicas [4], hepáticas [5] y enfermedades de la retina [6] y diabetes [7, 8].
La enfermedad hepática afecta a millones de personas en todo el mundo. Hasta la fecha, el trasplante de hígado es la única opción curativa cuando los pacientes presentan trastornos hepáticos metabólicos graves. Cerca de 37.000 pacientes están en las listas de espera para trasplante de hígado en Europa y Estados Unidos. Más de 5500 trasplantes de hígado se realizan en Europa cada año y las enfermedades metabólicas hereditarias representan el 26 % de las indicaciones (Registro Europeo de T rasplantes de Hígado). Sin embargo, menos de un tercio de los pacientes en la lista de espera de hígado puede recibir un trasplante de hígado cada año y el número de pacientes que fallecieron mientras estaban en la lista de espera para trasplante de hígado (alrededor del 10 %) ha aumentado durante los últimos años como resultado de la escasez de órganos de donantes.
En los últimos 15 años, el trasplante de hepatocitos aislados de hígados cadavéricos en el hígado de los pacientes se ha convertido en una alternativa clínica al trasplante de hígado [9, 10], en particular para enfermedades metabólicas innatas donde se mantienen las funciones hepáticas y existe un solo defecto enzimático. La evidencia inequívoca de la función metabólica de los hepatocitos humanos trasplantados se demostró por primera vez en un paciente con Crigler-Najjar tipo 1 (CN1) [11]. Después del trasplante celular, el estado clínico y la calidad de vida del paciente mejoraron con la restauración del 5 % de la actividad de UGT1A1, lo que llevó a una reducción del 50 % en la bilirrubinemia y en el tratamiento fototerapéutico. Este estudio seminal abrió el camino para tratar a más de 40 pacientes afectados con enfermedad hepática metabólica hereditaria, principalmente por trastornos del ciclo de urea y CN1, además de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo 1, enfermedad de Refsum infantil, colestasis intrahepática familiar tipo 2 progresiva y hemofilia tipo VII [9]. El trasplante de hepatocitos permitió evitar nuevos daños neurológicos en algunos niños mientras esperaban un trasplante de hígado. Una cantidad relativamente pequeña de hepatocitos infundidos (1,5 - 2 x109 células) fue suficiente para mejorar la deficiencia metabólica de algunos pacientes afectados. Sin embargo, el efecto de estabilización de larga duración ciertamente requiere infusiones celulares repetidas [12]. Este enfoque sufre otras limitaciones importantes para su uso general y uso habitual en la práctica clínica. Los trasplantes de hígado disponibles se priorizan para el trasplante de hígado y solo los de calidad marginal se utilizaron para el aislamiento de hepatocitos. Por lo tanto, los hepatocitos aislados son de calidad y cantidad variables. Se desdiferencian rápidamente y no pueden expandirse en el cultivo y no toleran bien la crioconservación. En conjunto, estas limitaciones enfatizan la necesidad de explorar otras fuentes de células hepáticas humanas funcionales.
Estos últimos años, varios grupos informaron la diferenciación in vitro de hESCs e hiPSCs en células similares a hepatocitos (HLC) utilizando diversas condiciones de cultivo que imitan las etapas de desarrollo embrionario del hígado [5, 13-21]. Las HLC no mostraron funciones de hepatocitos completamente maduros, pero tenían un fenotipo más cercano a los hepatocitos humanos fetales, expresando por ejemplo AFP [22]. Pueden injertar, expandir en cierta medida y mantener la funcionalidad hepática después del trasplante en los hígados de animales inmunocomprometidos que fueron lesionados químicamente, irradiados o manipulados genéticamente para dar una ventaja de crecimiento selectivo a los hepatocitos trasplantados, como los ratones que sobreexpresan el activador de plasminógeno tipo uroquinasa para inducir una lesión hepática receptora constitutiva y estímulos regenerativos [5, 14, 17, 23-25].
Algunos estudios investigaron el potencial terapéutico de las HLC y trataron con éxito varios modelos murinos de insuficiencia hepática letal inducida químicamente [26-33]. Sin embargo, el hígado tiene una capacidad notable para regenerarse a partir de hepatocitos endógenos. Por lo tanto, un apoyo temporal de las funciones metabólicas hepáticas por las HLC es suficiente para rescatar a los ratones de la insuficiencia hepática aguda. Por el contrario, para el tratamiento de enfermedades hepáticas hereditarias, las HLC deben diferenciarse completamente in vivo y ser funcionales a largo plazo para expresar las funciones metabólicas hepáticas maduras que faltan en los animales enfermos. Hasta ahora, no se ha demostrado todavía la corrección metabólica exitosa de un animal que modela una enfermedad hepática hereditaria en la cual las HLC trasplantadas no tienen una supervivencia selectiva y una ventaja de crecimiento en los hígados receptores.
La rata Gunn, un animal de CN1, tiene una mutación natural en UGT1A1 que causa una pérdida completa de la actividad de UGT1A1 e hiperbilirrubinemia poco después del nacimiento. La ausencia total de conjugados de bilirrubina en la bilis proporciona una lectura fácil, inequívoca y sensible para evaluar la restauración de la actividad de UGT1A1. Por lo tanto, la rata Gunn constituye un modelo inestimable y conveniente para seguir la maduración de células hepáticas in vivo y el potencial terapéutico de los hepatocitos trasplantados. Al igual que en los pacientes con CN1, una restauración parcial de la actividad de UGT1A1 después del trasplante de hepatocitos produce una corrección metabólica significativa [37-39].
Antes de considerar las HLC para uso clínico, un problema crucial es también producirlas utilizando un protocolo de diferenciación hepática compatible con las BPF (Buenas Prácticas de Fabricación). Los protocolos actuales de diferenciación hepática habitualmente contienen medio condicionado por células alimentadoras, suero, matrices derivadas de animales (como MatrigelTM), células alimentadoras de ratón, vectores virales para mejorar la diferenciación hepática o moléculas pequeñas que no están disponibles en las BPF [15, 34 -36].
Trabajos anteriores divulgan, como en US2005/042748 y la publicación correspondiente [69], divulgan un procedimiento para inducir la diferenciación hepática de células pluripotentes en hepatocitos, donde las células pluripotentes se diferencian primero en placas de cultivo recubiertas de gelatina. Otros autores describen la diferenciación de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en células similares a hepatoblastos (HBC) y su proliferación, donde las hPSC se diferencian primero en placas recubiertas con Matrigel [66], o revelan la diferenciación de células madre embrionarias humanas en hepatocitos. como células usando Matrigel [68] o describe la diferenciación de células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas en hepatoblastos mediante la sobreexpresión del gen homeobox HEX [67].
Todos los cuales son fuentes de factores desconocidos que hacen que los tejidos resultantes sean incompatibles con futuras aplicaciones clínicas.
En consecuencia, existe una demanda clínica de hepatocitos humanos para terapias de células alogénicas. Las células madre pluripotentes han sido investigadas intensamente como una fuente renovable de HLC trasplantables. Sin embargo, todavía se espera la demostración de que las HLC podrían tratar una enfermedad hepática metabólica hereditaria en ausencia de alguna ventaja de crecimiento selectivo de las células trasplantadas sobre los hepatocitos de roedores residentes. Además, las HLC generadas anteriormente se produjeron utilizando protocolos que las hacen inadecuadas para aplicaciones clínicas.
Recientemente, lamininas como la laminina-521 (LN-521) y la laminina-111 (LN-111) se han descrito como una matriz relevante para el cultivo celular, más particularmente para mantener las propiedades funcionales del cultivo in vitro a largo plazo de células de interés tales como células pluripotentes o HLC, sin embargo, las lamininas nunca se han descrito ni sugerido como capaces de inducir y / o mejorar la diferenciación hepática. Además, ningún estudio ha sugerido que las matrices de laminina empleadas solas puedan respaldar el inicio y la subsiguiente diferenciación de hepatocitos a partir de líneas de células madre pluripotentes.
Por lo tanto, la solicitud de patente internacional WO 2012/080844 se refiere a un nuevo uso de la laminina-521. De hecho, la laminina-521 puede mantener las células madre en pluripotencia in vitro, permitir la autorrenovación y permitir la supervivencia de una única célula de células madre embrionarias humanas. Cuando las células madre embrionarias pluripotentes humanas se cultivan en placas recubiertas con laminina-521 recombinante en ausencia de inhibidores de diferenciación o células alimentadoras, las células madre embrionarias proliferan y mantienen su pluripotencia. Además, se ha demostrado que las células similares a hepatoblastos humanos pueden generarse primero a partir de células pluripotentes en platos recubiertos con Matrigel (inducción de diferenciación hepática) y luego cultivarse en platos recubiertos con laminina-111 para expandirlas durante más de 3 meses mientras mantienen la capacidad potencial de diferenciarse tanto en células similares a hepatocitos como en células similares a colangiocitos [36]. Sorprendentemente, el solicitante descubrió un papel novedoso de LN-111 y LN-521 en la diferenciación de células similares a los hepatocitos. Esta nueva función de LN-521 es opuesta a la función de mantenimiento de la pluripotencia descrita en el documento WO2012/080844.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN:
En un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para inducir la diferenciación hepática humana que comprende las etapas de cultivar una población de células pluripotentes o multipotentes humanas sobre un soporte recubierto con laminina humana en un medio de inducción de endodermo para producir una población de células de endodermo definitivo (ED) humano y donde dicho procedimiento no comprenden la sobreexpresión del transgén homeobox HEX en dicha población de células.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para inducir la diferenciación hepática humana que comprende las etapas de:
cultivar una población de células de endodermo definitivo (ED) humanas sobre un soporte recubierto con
(i) laminina humana en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatoblastos humanos, y
(ii) cultivar opcionalmente dicha población de células similares a hepatoblastos humanos en un soporte recubierto con laminina humana en un medio de maduración hepática para producir una población de células similares a hepatocitos, preferiblemente células similares a hepatocitos fetales humanos y
donde dicho procedimiento no comprende la sobreexpresión del transgén homeobox HEX en dicha población de células
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para inducir la diferenciación hepática humana que comprende las etapas de cultivar una población de células pluripotentes o multipotentes humanas sobre un soporte recubierto con laminina humana en un medio de inducción de endodermo para producir una población de endodermo definitivo (ED) humano, cultivar dicha población de células ED humanas sobre un soporte recubierto con laminina humana en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatoblastos humanos, y opcionalmente cultivar dicha población de células similares a hepatoblastos humanos sobre un soporte recubierto con laminina humana en un medio de maduración hepática para producir una población de células similares a los hepatocitos, preferiblemente células similares a los hepatocitos fetales humanos y donde dicho procedimiento no comprende la sobreexpresión del transgén homeobox HEX en dicha población de células
En un cuarto aspecto, la invención Se refiere a un procedimiento para inducir la diferenciación hepática como se mencionó anteriormente, donde el medio de inducción hepática es un mdo definido químicamente que comprende una proteíva morfogénica ósea 4 (BMP4) y factor de crecimiento de la familia (FGF10 o FGF2).
En un quinto aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para inducir la diferenciación hepática como se mencionó anteriormente donde el medio de maduración hepática es un medio químicamente definido que comprende factor de crecimiento hepático (HGF) y oncostatina M (OSM).
En un sexto aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para inducir la diferenciación hepática como se mencionó anteriormente, donde el medio de inducción del endodermo es un medio químicamente definido que comprende al menos Activina A y, opcionalmente, WNT3A.
En un séptimo aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para inducir la diferenciación hepática como se mencionó anteriormente donde el medio de inducción hepática y/o el medio de inducción endodérmica comprende además un inhibidor de ROCK y/o CHIR99021.
En un octavo aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para inducir la diferenciación hepática como se mencionó anteriormente, donde la laminina humana (LN) se selecciona del grupo que consiste en laminina-111 (LN-111), laminina-211 (LN-211), laminina-332 (LN-332), laminina-411 (LN-411), laminina-421 (LN-421), laminina-511 (LN-511) y laminina-521 (LN-521).
En el noveno aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para inducir la diferenciación hepática como se mencionó anteriormente donde la laminina humana (LN) se selecciona del grupo que consiste en laminina-111 recombinante humana (LN-111) y laminina-521 recombinante humana (LN -521) y una mezcla de los mismos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención aborda estas necesidades, ya que se refiere a la identificación de un medio químicamente definido capaz de diferenciar una población de células pluripotentes o una población de células endodérmicas definitivas (ED) en una población de células de linaje hepatocitario. Los inventores han demostrado de manera sorprendente que la laminina-111, sola, es tan eficiente como matrigel para iniciar y apoyar la diferenciación hepática de hiPSC en nuestras condiciones de cultivo, pero con una matriz recombinante.
Los inventores han demostrado que la laminina-521 (LN-521) también es útil como matriz y permite una mejor diferenciación de hiPSC en endodermo definitivo y HLC.
De hecho, los inventores han producido hepatoblastos derivados de células madre pluripotentes humanas (IDHB) en protocolos sin xeno, sin alimentadores y químicamente definidos utilizando laminina-111 recombinante (LN-111) como matriz extracelular para iniciar y apoyar el proceso de diferenciación hepática. Estas IDHB con un conjunto particular de marcadores (combinación de marcadores expresados o no expresados) fueron trasplantadas en el hígado de la rata Gunn, un modelo animal para el síndrome de Crigler-Najjar, que se caracteriza por altos niveles de bilirrubina no conjugada. Después del trasplante celular, mostraron una corrección significativa de la hiperbilirrubinemia, que se mantuvo estable durante los 6 meses de estudio sin eventos adversos. También mostraron que las IDHB trasplantadas se sometieron a una maduración adicional in situ para restaurar la función hepática metabólica deficiente (glucuronidación de bilirrubina por UGT1A1). Para concluir, demostraron por primera vez la eficacia de un regenerativo basado en hiPSC con un protocolo compatible con BPF para tratar una enfermedad metabólica hepática hereditaria en ausencia de cualquier ventaja de crecimiento selectivo de las células trasplantadas sobre los hepatocitos residentes, que es la situación encontrada en el trasplante de hepatocitos en humanos.
Procedimientos de diferenciación hepática y usos de lamininas
Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención se refiere al uso de laminina (LN) como una matriz para la diferenciación hepática.
La invención también se refiere al uso de una LN para inducir y/o mejorar la diferenciación de una población de células pluripotentes, una población de células multipotentes o una población de células endodérmicas definitivas (ED) en una población de células de linaje hepatocitario.
Como se usa en esta invención, el término "laminina" (LN) se refiere a una proteína de una familia de glicoproteínas heterotriméricas que residen principalmente en la lámina basal. Funcionan a través de las interacciones de unión con los receptores celulares vecinos en un lado, y al unirse a otras moléculas de laminina u otras proteínas de la matriz como los colágenos, los nidógenos o los proteoglicanos. Las moléculas de laminina también son moléculas de señalización importantes que pueden influir fuertemente en el comportamiento y la función celular. Las lamininas son importantes tanto para mantener el fenotipo de células/tejidos como para promover el crecimiento y la diferenciación celular en la reparación y el desarrollo de tejidos. Las lamininas son proteínas grandes, de múltiples dominios, con una organización estructural común. La molécula de laminina integra varias funciones interactivas de matriz y célula en una molécula. Una molécula de proteína laminina comprende una subunidad de cadena a, una subunidad de cadena p y una subunidad de cadena y, todas juntas en un trímero a través de un dominio de bobina en espiral. Las doce cadenas de subunidades de laminina conocidas pueden formar al menos 15 tipos de lamininas triméricas en tejidos nativos. Dentro de las estructuras de laminina trimérica hay dominios identificables que poseen actividad de unión hacia otras moléculas de laminina y de lámina basal, y receptores unidos a la membrana.
Debe observarse además que el término "laminina" comprende la laminina intacta, como cadenas separadas o como fragmentos de la misma. Como se usa en esta invención, el término "intacta" se refiere a la proteína que se compone de todos los dominios de la cadena (, la cadena ® y la cadena ©, con las tres cadenas unidas entre sí para formar la estructura heterotrimérica. La proteína no se divide en cadenas, fragmentos o dominios funcionales separados. Por ejemplo, la laminina-111 y la laminina-521 (como se describen a continuación) son proteínas intactas. Como se usa en esta invención, el término "cadena" se refiere a la totalidad de la cadena alfa, beta o gamma de la proteína laminina. Como se usa en esta invención, el término "fragmento" se refiere a cualquier fragmento de proteína que contiene uno, dos o tres dominios funcionales que poseen actividad de unión a otra molécula o receptor. Sin embargo, una cadena no debe considerarse un fragmento porque cada cadena posee más de tres dominios de este tipo. Del mismo modo, una proteína laminina intacta no debe considerarse un fragmento. Los ejemplos de dominios funcionales incluyen los dominios I, II, III, IV, V, VI y el dominio G.
Existen cinco cadenas alfa diferentes, tres cadenas beta y tres cadenas gamma que en tejidos humanos se han encontrado en al menos quince combinaciones diferentes. Estas moléculas se denominan laminina-1 a laminina-15 en función de su descubrimiento histórico, pero una nomenclatura alternativa describe las isoformas en función de su composición de cadena, por ejemplo, la laminina-111 (laminina-1) que contiene las cadenas alfa-1, beta-1 y gamma1. Se han identificado cuatro grupos estructuralmente definidos de familias de lamininas. El primer grupo de cinco moléculas de laminina identificadas comparten las cadenas p1 y y1 y varían según su composición de cadena a (cadena a 1 a a 5). El segundo grupo de cinco moléculas de laminina identificadas, incluida la laminina-521, comparten la cadena p2 y y1 y varían nuevamente según su composición de cadena a. El tercer grupo de moléculas de laminina identificadas tiene un miembro identificado, laminina-332, con una composición de cadena de a 3p3y2. El cuarto grupo de moléculas de laminina identificadas tiene un miembro identificado, laminina-213, con la composición de cadena y3 recién identificada (a2p1y3).
Se han identificado al menos 15 subtipos (o "isoformas") de laminina (LN), según su composición de cadena, que incluyen LN-111 (a 1p1y1), LN-121 (a 1p2y1), LN-211 (a2p1y1), LN-213 (a2p1y3), LN-221 (a2p2y1), LN-311 (a 3p3y1), LN-321 (a3p2y1), LN-332 (a 3p3y2), LN-411 (a4p1y1), LN-421 (a4p2y1), LN-423 (a4p2y3), LN-511 (a 5p1y1), LN-521 (a 5p2y1), LN-522 (a 5p2y2) y LN-523 (a 5p2y3).
En una realización de la invención, dicha laminina se selecciona del grupo que consiste en laminina-111 (LN-111), laminina-211 (LN-211), laminina-332 (LN-332), laminina-411 (LN-411) ), laminina-421 (LN-421), laminina-511 (LN-511) y laminina-521 (LN-521).
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana recombinante.
En una realización preferida de la invención, dicha laminina es la laminina-111 humana recombinante (LN-111) y/o la laminina-521 humana recombinante (LN-521).
La laminina 521 (compuesta por cadenas a5, 132, y1) se expresa durante el desarrollo embrionario temprano, es secretada por las células madre pluripotentes humanas y se sabe que estimula su robusta proliferación [63]. La laminina a5 está presente en los conductos biliares y los vasos sanguíneos hepáticos (arterias hepáticas, venas porta), excepto en los sinusoides y, por lo tanto, la laminina a5 normalmente no se asocia con los hepatocitos normales. Además, la cadena 32 de laminina y, por lo tanto, la laminina-521, no se expresa en el hígado de animales adultos y normales [64].
La cadena de laminina a1, y por tanto la laminina-111 (compuesta por cadenas a1, 31, y1), no se expresa en el hígado de animales adultos [65].
Por tanto, las lamininas extraídas de tejidos hepáticos adultos no contienen laminina 521 ni laminina-111.
Como se usa en esta invención, el término polipéptido "recombinante" se refiere a un polipéptido que se produce por expresión a partir de una molécula de ácido nucleico codificante. Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células huésped son bien conocidos.
Cuando se expresa en forma recombinante, el polipéptido se genera preferentemente por expresión a partir de un ácido nucleico codificante en una célula huésped. Se puede usar cualquier célula huésped, dependiendo de los requisitos individuales de un sistema particular. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, células de plantas, levaduras y sistemas de baculovirus.
Las lamininas humanas recombinantes, tales como la LN-111 o LN-521 humana recombinante pueden adquirirse de Biolamina, Sundbyberg, Suecia.
En una realización de la invención, la laminina se recubre en el soporte, tal como una placa de 0,5 a 50 microgramos por mililitro (pg/mL), preferentemente de 1 a 10 pg/mL, más preferentemente a 5 pg/mL.
Como se usa en esta invención, el término "matriz" se refiere a un componente / material (natural, sintético o una combinación de los mismos) que forma una red polimérica que proporciona a células cultivadas in vitro (por ejemplo, en un recipiente de cultivo tal como un recipiente de plástico plano) ambientes fisiológica y morfológicamente relevantes similares a uno in vivo para una biología celular más realista y mejores interacciones intercelulares para el cultivo de células, facilitando la unión celular, el crecimiento y la diferenciación.
En una realización, la matriz comprende una laminina tal como la laminina-111 humana recombinante (LN-111) o la laminina-521 humana recombinante (LN-521) o una mezcla de las mismas.
] En otra realización, la matriz comprende LN-521 y LN-111 en una proporción de aproximadamente 5 %/95 %; 10 %/90 %; 20 %/80 %; 25 %/75 %; 30 %/70 %; 40 %/60 %; 50 %/50 %, 60 %/40 %; 70 %/30 %; 75 %/25 %, 80 %/20 %; 90 %/10 %; 95 %/5 %.
En otra realización, la matriz comprende una mezcla de una laminina y otro componente (tal como proteínas de matriz que incluyen colágeno I y fibronectina).
Como se usa en esta invención, el término "población" se refiere a una población de células, donde la mayoría (por ejemplo, al menos aproximadamente el 50 %, preferentemente al menos aproximadamente el 60 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 70 % e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 80 %) del número total de células tiene las características especificadas de las células de interés para al menos uno de los marcadores de interés (por ejemplo, una población de células similares a hepatocitos humanos comprende al menos aproximadamente el 60 %, preferentemente al menos aproximadamente el 70 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 80 % de las células que tienen las funciones hepáticas y que expresan los marcadores expresados típicamente por las células similares a hepatocitos humanos enumerados a continuación, tales como, por ejemplo, el factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF4a )).
Como se usa en esta invención, el término "marcador" se refiere a una proteína, glicoproteína u otra molécula expresada en la superficie de una célula o en una célula, y que se puede usar para ayudar a identificar la célula. Un marcador generalmente puede ser detectado por procedimientos convencionales. Entre los ejemplos específicos, no limitativos, de procedimientos que pueden utilizarse para la detección de un marcador de superficie celular se encuentra la inmunocitoquímica, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y el análisis enzimático, además de los procedimientos de RT-PCR y biología molecular para detectar el ARNm de la proteína.
Como se usa en esta invención, el término "pluripotente" se refiere a las células con la capacidad de dar lugar a la progenie que puede experimentar diferenciación, en condiciones apropiadas, en tipos de células que presentan colectivamente características asociadas con linajes celulares de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las células madre pluripotentes pueden contribuir a los tejidos de un organismo prenatal, postnatal o adulto. Se puede utilizar una prueba estándar aceptada en la técnica, como la capacidad para formar un teratoma en ratones SCID de 8-12 semanas de edad, para establecer la pluripotencia de una población celular. Sin embargo, la identificación de varias características de células madre pluripotentes también se puede utilizar para identificar células pluripotentes.
En una realización de la invención, las células madre pluripotentes son células madre pluripotentes humanas.
Más específicamente, las células madre pluripotentes humanas pueden expresar al menos algunos, y opcionalmente todos, los marcadores de la siguiente lista no limitativa: SSEA-3, SSEA-4, TRA-I -60, TRA-I -81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox 2, cadherina E, UTF-I, Oct4, Lin28, Rexl y Nanog.
En una realización de la invención, las células madre pluripotentes humanas son células madre embriónicas humanas (hESC) o células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC).
Como se usa en esta invención, el término "células madre embrionarias" se refiere a células embrionarias, que son capaces de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias (es decir, endodermo, ectodermo y mesodermo), o permanecer en un estado indiferenciado. Dichas células pueden comprender células que se obtienen del tejido embrionario formado después de la gestación (p. ej., blastocisto) antes de la implantación del embrión (es decir, un blastocisto previo a la implantación), células de blastocisto extendidas (EBC) que se obtienen a partir de un blastocisto en etapa previa a la gastrulación (consulte el documento WO2006/040763), células germinales embrionarias (GE) que se obtienen del tejido genital de un feto en cualquier momento durante la gestación, preferiblemente antes de las 10 semanas de gestación y otros procedimientos con óvulos no fertilizados, como procedimiento de partenogénesis o transferencia nuclear.
Las células madre embrionarias pueden obtenerse utilizando procedimientos de cultivo celular bien conocidos. Por ejemplo, las células madre embrionarias humanas pueden aislarse de blastocistos humanos. Los blastocistos humanos se obtienen típicamente de embriones preimplantados humanos in vivo o de embriones fertilizados in vitro (FIV). Alternativamente, un embrión humano de una sola célula se puede expandir a la etapa de blastocisto. Para el aislamiento de células ES humanas, la zona pelúcida se elimina del blastocisto y la masa celular interna (ICM) se aísla mediante inmunocirugía, en la que las células del trofoectodermo se lisan y eliminan del ICM intacto mediante un pipeteo suave. A continuación, el ICM se coloca en placas en un matraz de cultivo de tejidos que contiene el medio apropiado que permite su crecimiento. Después de 9 a 15 días, el crecimiento derivado de ICM se disocia en grumos ya sea por una disociación mecánica o por una degradación enzimática y luego las células se vuelven a sembrar en un medio de cultivo tisular fresco. Las colonias que muestran una morfología indiferenciada se seleccionan individualmente con una micropipeta, se disocian mecánicamente en grumos y se vuelven a sembrar. A continuación, las células ES resultantes se dividen de forma rutinaria cada 4-7 días. Para más detalles sobre procedimientos de preparación de células ES humanas, véase Thomson et al., [Pat. EE.UU. N° 5.843.780].
También se pueden usar células madre disponibles comercialmente. Las células ES humanas se pueden comprar en el registro de células madre embrionarias humanas del NIH (http://escr.nih.gov). Ejemplos no limitativos de líneas de células madre embrionarias disponibles comercialmente son BG01, BG02, BG03, BG04, CY12, CY30, CY92, CY10, TE03, TE32, H9, WA09, Roslin Cells (RC6, RC7, RC8, RC9 y RC10) y ESI-017, ESI-035, ESI-049, ESI-051, ESI-053 (BioTiempo).
Como se usa en esta invención, el término "célula madre pluripotente inducida" se refiere a una célula madre pluripotente derivada artificialmente de una célula no pluripotente. Una célula no pluripotente puede ser una célula de menor potencia de autorrenovación y diferenciación que una célula madre pluripotente. Las células de menor potencia pueden ser, pero no se limitan a, células madre somáticas, células progenitoras específicas de tejido, células primarias o secundarias. Las iPSC se han obtenido de manera reproducible mediante la reprogramación de diferentes tipos de células a través de la expresión forzada de la combinación de factores de transcripción OCT4, SOX2, c-MYC y KLF4 o mediante una combinación alternativa de factores, sustituyendo KLF4 y c-MYC por o agregando NANOG y LIN28 o cualquier procedimiento conocido por el experto para mejorar el proceso de reprogramación (mediante el uso de moléculas pequeñas como los inhibidores de ADN metiltransferasa (DNMT), ARNmi, etc.).
Como se usa en esta invención, el término "reprogramación" se refiere al proceso de cambiar el destino de una célula diana por el de un tipo de célula diferente, causado por la expresión de un pequeño conjunto de factores (o factores de reprogramación) en las células diana.
En la técnica, se han descrito procedimientos para generar células madre pluripotentes inducidas basado en vectores de expresión que codifican factores de reprogramación, véanse por ejemplo, los documentos WO2007/69666, EP2096169-A1 o WO2010/042490.
Los vectores de expresión para la expresión ectópica de los factores de reprogramación pueden ser, por ejemplo, un vector plásmido, un vector cósmido, un vector de cromosoma artificial bacteriano (BAC), un vector basado en transposones (como PiggyBac) o un vector viral.
Alternativamente, los factores de reprogramación, por ejemplo, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc o el correspondiente ADN o ARN codificante, se introducen en las células diana sin la integración del material genético exógeno en el ADN huésped, es decir, sin la introducción de la secuencia de nucleótidos en el genoma de la célula. Un vector de expresión tal como un vector plásmido puede administrarse en dichas células para la expresión ectópica del factor de reprogramación, en forma de ADN desnudo. Alternativamente, los ARN que codifican dichos factores de reprogramación, ya sean modificados químicamente o no, pueden introducirse en las células para reprogramarlos (véase, por ejemplo, Warren L, y col., 2010, Cell Stem Cell. 5 de nov.;7(5):618-30). Otros vectores de expresión se han descrito, por ejemplo, en el documento WO 2009115295.
En una realización, las hiPSC se derivan de células obtenidas de un sujeto sano. En otra realización, las hiPSC se derivan de células obtenidas de un sujeto con una enfermedad hepática tal como una enfermedad hepática metabólica hereditaria y las células similares a hepatocitos muestran un fenotipo de la enfermedad.
Alternativamente, puede obtenerse una población de células de linaje hepatocitario de interés a partir de la diferenciación de células multipotentes, tales como células madre mesenquimales, en una matriz para la diferenciación hepática constituida por una laminina de la invención.
Como se usa en esta invención, el término "multipotente" se refiere a células capaces de diferenciarse en al menos dos tipos de células diferenciadas terminalmente.
Como se usa en esta invención, el término "células madre mesenquimales" generalmente se refiere a células estromales encontradas en un tejido diferenciado (especializado) y que son capaces de hacer copias idénticas de sí mismas (autorrenovación) durante el tiempo de vida del organismo y tienen un potencial de diferenciación multipotente (como la diferenciación en osteoblastos, adipocitos, condroblastos). Preferentemente, las células madre mesenquimales humanas que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención incluyen, por lo tanto, cualquier célula madre humana multipotente adecuada (es decir, células con capacidad de autorrenovación y multipotencia) derivadas de cualquier tejido adecuado mediante cualquier procedimiento de aislamiento apropiado. Por ejemplo, las células madre mesenquimales humanas que se pueden utilizar en los procedimientos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, células inducibles adultas multilinaje (MIAMI) (D'Ippolito y col., J. Cell Sci., 2004, 117): 2971-2981), MAPC (también conocido como MPC) (Reyes y col., Blood, 2001, 98: 2615-2625), células madre derivadas de sangre de cordón umbilical (Kogler G y col., J. Exp. Med., 2004, 200(2): 123-135), mesoangioblastos (Sampaolesi M y col., Nature, 2006, 444(7119): 574-579; Dellavalle A y col., Nat. Cell Biol., 2007, 9: 255-267) y células madre amnióticas (De Coppi P y col., Nat Biotechnol 2007, 25:100-106). Además, los bancos de sangre del cordón umbilical (por ejemplo, Établissement Frangais du Sang, en Francia) proporcionan fuentes seguras y fáciles de conseguir de dichas células para el trasplante.
Alternativamente, puede obtenerse una población de células de linaje hepatocitario a partir de la diferenciación de células aisladas de hígados humanos adultos (por ejemplo, células progenitoras de hepatocitos) en una matriz para la diferenciación hepática constituida por una laminina. Como otra alternativa, puede obtenerse una población de células de linaje hepatocitario de interés a partir de la conversión de células somáticas, tales como fibroblastos, en una matriz para la diferenciación hepática constituida por una laminina.
Como se usa en esta invención, los términos "células de linaje hepatocitario" o "células similares a hepatocitos" (HLC) se refieren a células obtenidas mediante la diferenciación de células pluripotentes, células endodérmicas u otro tipo de células, tales como células multipotentes, de la manera descrita. Las células diferenciadas tienen al menos una entre una variedad de características fenotípicas distintivas de progenitores de hepatocitos conocidos, hepatoblastos, hepatocitos fetales, neonatales, maduros, adultos y totalmente maduros como se proporciona más adelante en esta divulgación. El uso de este término no implica ninguna limitación particular con respecto al fenotipo celular, marcadores celulares, función celular o capacidad proliferativa, a menos que se requiera explícitamente. Las células de linaje hepatocitario expresan marcadores hepáticos que incluyen, entre otros, el factor nuclear hepatocitario alfa 4 (HNF4(), albúmina (ALB), alfa-fetoproteína (AFP), citocromo P450 y citoqueratina 19 (CK19).
En una realización particular, la población de células similares a hepatocitos humanos no sobreexpresa un gen. Preferiblemente, estas poblaciones de células no sobreexpresan factores implicados en la diferenciación hepática. Ejemplos de factores implicados en la diferenciación hepática incluyen, entre otros, el transgén homeobox HEX, HNF-4, HGF, FGF4, OSM, activina, TGF-p, FOXA2, FGF2, HNF1alpha, HNF1-beta, HNF6, HNF3 beta, SOX17, FOXa3, Foxa1, GATA4, ATF5, PROX1, CEBPalpha o cualquier otro gen involucrado en el desarrollo del hígado (es decir, inducción de endodermo, maduración hepática de especificación hepática, mantenimiento hepático, factores de proliferación de hepatocitos).
En una realización, la población de células similares a hepatocitos humanos no sobreexpresa el transgén HEX. Como se usa en esta invención, el término "sobreexpresión" se refiere a la expresión de un producto génico (ARN o proteína) en cantidades superiores a las normales. Las técnicas para sobreexpresar un gen o una proteína son bien conocidas en el estado de la técnica e incluyen, sin limitación, microinyección de ARNm, inyección, transfección de proteínas o transfección de un vector de expresión.
Procedimientos para determinar el nivel de expresión de los biomarcadores de la invención:
La determinación del nivel de expresión de marcadores, incluidos los marcadores hepáticos (por ejemplo, los genes HNF4{, ALB, AFP, CK19) se puede realizar mediante una variedad de técnicas. Generalmente, el nivel de expresión determinado es un nivel de expresión relativo. Por ejemplo, la determinación comprende poner en contacto la muestra biológica con reactivos selectivos, como sondas o ligandos y detectar así la presencia o medir la cantidad, de ácidos nucleicos o polipéptidos de interés originalmente en dicha muestra biológica. El contacto puede realizarse en cualquier dispositivo adecuado, como una placa, un plato de microtitulación, un tubo de ensayo, un pocillo, un vaso, una columna, etc. En realizaciones específicas, el contacto se realiza sobre un sustrato recubierto con el reactivo, como una matriz de ácido nucleico o una matriz de ligandos específica. El sustrato puede ser un sustrato sólido o semisólido tal como cualquier soporte adecuado que comprenda vidrio, plástico, nailon, papel, metal, polímeros y similares. El sustrato puede ser de varias formas y tamaños, como un lámina, una membrana, una perla, una columna, un gel, etc. El contacto se puede realizar en cualquier condición adecuada para que se forme un complejo detectable, como un híbrido de ácido nucleico o un complejo anticuerpo-antígeno, entre el reactivo y los ácidos nucleicos o polipéptidos de la muestra biológica.
En una realización particular, el nivel de expresión de los genes biomarcadores puede determinarse determinando la cantidad de ARNm.
Los procedimientos para determinar la cantidad de ARNm son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ácido nucleico contenido en las células de interés tales como las HLC de la invención se extrae primero de acuerdo con procedimientos estándar, por ejemplo, utilizando enzimas líticas o soluciones químicas o se extrae mediante resinas de unión a ácidos nucleicos siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARNm extraído se detecta luego mediante hibridación (por ejemplo, análisis por hibridación Northern) y/o amplificación (por ejemplo, RT-PCR). Se prefiere la RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa. La RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa en tiempo real es particularmente ventajosa.
En otra realización, el nivel de expresión de los genes biomarcadores puede determinarse determinando la cantidad de proteína codificada por dichos genes.
Dichos procedimientos comprenden poner en contacto la muestra biológica con un ligando de unión capaz de interactuar selectivamente con la proteína presente en dicha muestra. El ligando de unión es generalmente un anticuerpo que puede ser policlonal o monoclonal, preferentemente monoclonal.
Por ejemplo, el nivel de una proteína biomarcadora tal como HNF4(, ALB, AFP y CK19 puede medirse mediante técnicas electroforéticas e inmunodiagnósticas estándar, incluyendo inmunoensayos tales como ensayos de competencia, reacción directa o tipo sándwich. Dichos ensayos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones Western; pruebas de aglutinación; inmunoensayos de marcado enzimático y mediados, como los ELISA; ensayos tipo biotina / avidina; radioinmunoensayos; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación.
Las condiciones del cultivo celular pueden incluir uno o más componentes adicionales para proporcionar un entorno de apoyo durante la diferenciación dirigida en el tipo de célula diana diferenciada (por ejemplo, células de linaje hepatocitario). Los procedimientos para obtener una población de células diana diferenciadas incluyen además una etapa de inducción de la diferenciación. La inducción de la diferenciación se puede lograr cambiando la composición de los factores de crecimiento en el medio de cultivo en una o más etapas de la diferenciación como se describe a continuación.
Por consiguiente, en un segundo aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para inducir la diferenciación hepática humana que comprende las etapas de:
(i) proporcionar una población de células endodérmicas humanas definitivas (ED), y
(ii) cultivar la población en un soporte recubierto con una laminina en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatocitos humanos.
La invención también se refiere a un procedimiento para obtener células similares a hepatocitos humanos que comprende las etapas de:
(i) proporcionar una población de células ED humanas, y
(ii) cultivar la población en un soporte recubierto con una laminina en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatocitos humanos.
Como se usa en esta invención, el término "células endodérmicas definitivas" se refiere a las células que expresan marcadores bioquímicos característicos, que incluyen pero no se limitan a Sox 17 y FoxA2 y no expresan nanog. Como se usa en esta invención, los términos "células similares a hepatoblastos" (HB) o "células progenitoras hepáticas" son intercambiables y se refieren a células que expresan marcadores bioquímicos característicos, que incluyen, entre otros, factor nuclear hepatocitario 4 alfa (HNF4a ), citoqueratina 19 (CK19 ) y citocromo P450 3A7 (CYP3A7) y que no expresan o no expresan sustancialmente alfa-fetoproteína (AFP) y que no expresan albúmina (ALB), alfa-1 antitrispina (AAT), citocromo P4503A7 (CYP3A7) y difosfato de uridina (UDP)-glucuronosil transferasa 1A1 (UGT1A1).
Como se usa en esta invención, el término "no sustancialmente" se refiere a una población de células similares a hepatocitos que expresan un bajo nivel de una proteína de interés tal como AFP. Por consiguiente, dichas células solo pueden expresar una cantidad baja o una cantidad de proteína AFP no detectable por ELISA, como varios picogramos (pg) que está por debajo del límite de detección (LDD) para AFP por ELISA. Sin embargo, debe observarse además que puede detectarse una baja cantidad de ARNm de a Fp mediante RT-PCR (pero dicha cantidad es insuficiente para detectar al final la expresión de la proteína AFP).
Como se usa en esta invención, las expresiones "medio de inducción hepática" o "medio de cultivo que induce la diferenciación hepática" se refieren a un medio de cultivo que es capaz de inducir la diferenciación del endodermo definitivo en células similares a hepatocitos (y por lo tanto, capaz de inducir la expresión de marcadores hepáticos tales como HNF4(, CK19 y CYP3A7).
Como se usa en esta invención, el término "medio de cultivo" se refiere a cualquier medio capaz de soportar el crecimiento y la diferenciación de células endodérmicas definitivas en células progenitoras hepáticas. Las formulaciones de medios preferidas que apoyarán el crecimiento y la diferenciación de las células endodérmicas definitivas en células progenitoras hepáticas incluyen un medio químicamente definido (MQD).
Como se usa en esta invención, el término "medio químicamente definido" (MQD) se refiere a una solución nutritiva para cultivar células que contiene solo componentes específicos, preferentemente componentes de estructura química conocida. Un medio químicamente definido es un medio sin suero y sin alimentador. Como se usa en esta invención, "sin suero" se refiere a un medio de cultivo que no contiene suero agregado. Como se usa en esta invención, "sin alimentador" se refiere a un medio de cultivo que no contiene células alimentadoras agregadas.
El medio de cultivo usado en esta invención puede ser un medio a base de agua que incluye una combinación de sustancias como sales, nutrientes, minerales, vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos, proteínas como citoquinas, factores de crecimiento y hormonas, todos los cuales son necesarios para la supervivencia celular. Por ejemplo, un medio de cultivo, de acuerdo con esta invención, puede ser un medio de cultivo de tejido sintético como el RPMI (medio Roswell Park Memorial Institute) o el CMRL-1066 (Laboratorio de investigaciones médicas de Connaught) para uso humano, complementado con los aditivos necesarios en caso necesario, como se describe más adelante (sección Ejemplos) como el B27. El suplemento B-27 (Invitrogen) contiene, entre otros constituyentes, SOD, catalasa y otros antioxidantes (GSH) y ácidos grasos únicos, como el ácido linoleico, el ácido linolénico y los ácidos lipoicos.
La etapa de cultivo de células ED con el medio de inducción hepática se llevará a cabo durante el tiempo necesario para la producción de células similares a hepatocitos. La duración de esta etapa de cultivo puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, durante el cultivo, el experto en la técnica puede monitorizar las células cultivadas para detectar la ausencia de al menos una expresión de los marcadores expresados únicamente por células endodérmicas definitivas (ED) (por ejemplo, Sox17 y FoxA2) y / o por la expresión de marcadores expresados específicamente por células similares a hepatocitos (por ejemplo, HNF4a , CK19, CYP3A7). Cuando no se puede detectar la expresión de uno o varios marcadores específicos de células ED y / o se detecta la expresión de uno o varios marcadores específicos de células similares a hepatocitos, se puede detener el cultivo con el medio de inducción hepática. La monitorización de estos marcadores se puede realizar mediante, por ejemplo, el análisis por RT-PCR del ARN extraído de células cultivadas con cebadores específicos, el análisis por inmunofluorescencia con anticuerpos específicos de los marcadores y FACS o cualquier procedimiento para detectar el ARNm correspondiente a las proteínas.
Típicamente, la etapa ii) se puede llevar a cabo durante 3 a 10 días, preferentemente 6 días.
Si es necesario, el medio de cultivo de la invención se puede renovar, parcial o totalmente, a intervalos regulares. Típicamente, el medio de cultivo de la invención se puede reemplazar por medio de cultivo fresco de la invención cada dos días, durante 6 días.
Las células similares a hepatocitos producidas por el procedimiento anterior se pueden aislar y / o purificar mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo FACS.
El término "factor de crecimiento familiar de FGF", como se usa en relación con el procedimiento para obtener células humanas similares a hepatocitos, se refiere a cualquier sustancia de origen natural (por ejemplo, una proteína) capaz de estimular el crecimiento celular, la proliferación y la diferenciación celular mediante la unión con un receptor de factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR). Al unirse a un FGFR, la sustancia aumenta, por ejemplo, la fosforilación de tirosina de dicho receptor.
En una realización de la invención, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende proteína morfogenética ósea (BMP) y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF).
En una realización de la invención, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende proteína 4 morfogenética ósea (BMP4) y un FGF.
En otra realización, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende BMP2 y un FGF.
En otra realización de la invención, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende DMSO (dimetilsulfóxido), KOSR (sustitución de suero knockout), HGF (factor de crecimiento de hepatocitos), butirato de sodio. En una realización particular, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende DMSO y KOSR. En otra realización particular, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende HGF y butirato de sodio.
Típicamente, se añade DMSO al medio de cultivo de la invención en una concentración de alrededor de 0,5 a alrededor de 5 %, preferiblemente alrededor de 1 %. DMSO se puede comprar de Sigma. Típicamente, KOSR se agrega al medio de cultivo de la invención en una concentración de aproximadamente 5 % a aproximadamente 30 %, preferiblemente, 20 %. KOSR se puede comprar en Life Technologies o Thermofisher.
Normalmente, el HGF se añade al medio de cultivo de la invención en una concentración de aproximadamente 1 ng/mL a aproximadamente 25 ng/mL, preferiblemente a aproximadamente 10 ng/mL. El HGF se puede comprar en R&D Systems. Normalmente, se añade butirato de sodio al medio de cultivo de la invención en una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mM, preferiblemente a aproximadamente 2,5 mM. El butirato de sodio se puede comprar en Sigma.
En una realización preferida de la invención, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende proteína 4 morfogenética ósea (BMP4) y factor 10 de crecimiento familiar (FGF10).
La proteína FGF10 humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de Uniprot O15520. Típicamente, el FGF10 se agrega al medio de cultivo de la invención en una concentración que oscila entre 1 y 50 ng/ml, preferentemente a aproximadamente 10 ng/ml. El FGF10 puede adquirirse de Peprotech o Miltenyi Biotec.
La proteína BMP4 humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de Uniprot P12644. Típicamente, la BMP4 se agrega al medio de cultivo de la invención en una concentración que oscila entre 1 y 50 ng/ml, preferentemente a aproximadamente 10 ng/ml. La BMP4 puede adquirirse de R&D systems.
La proteína BMP2 humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso P12643 de Uniprot. Típicamente, la BMP2 se añade al medio de cultivo de la invención en una concentración que oscila entre 1 y 200 ng/ml, preferiblemente a unos 10 ng/ml. BMP2 puede adquirirse en R&D Systems o Thermofisher.
En otra realización de la invención, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende proteína 4 morfogenética ósea (BMP4) y FGF2 (también conocido como factor básico de crecimiento de fibroblastos). La proteína FGF2 humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de Uniprot P09038. Típicamente, el FGF2 se agrega al medio de cultivo de la invención en una concentración que oscila entre 1 y 50 ng/ml, preferentemente a aproximadamente 10 ng/ml. El FGF2 puede adquirirse de Peprotech o Miltenyi Biotec.
En algunas realizaciones de la invención, el cultivo de la población de células ED puede incluir adicionalmente el paso de la población de células ED antes o durante el proceso de diferenciación. El proceso de paso de la población de células puede repetirse una o más veces, y puede incluir células disociadas soportadas por la matriz de unión, diluyendo las células disociadas en los medios. Por consiguiente, la etapa ii) puede comprender además una etapa de paso de al menos una vez y/o el recuento celular.
En algunas realizaciones de la invención, para aumentar la clonogenicidad, las células pueden tratarse con un inhibidor de ROCK 4 horas antes de la disociación y 24 horas después del recubrimiento.
Como se usa en esta invención, el término "inhibidor de proteína quinasa asociada a Rho (ROCK)" se refiere a un compuesto (natural o sintético) que inhibe la actividad de ROCK1 y / o ROCK2, tal como la actividad de la quinasa. En una realización particular de la invención, el inhibidor de ROCK es Y27632 (Watanabe y col. Nature Biotechnology 25, 681 - 686 (2007)).
Típicamente, la concentración de Y27632 en el medio de cultivo puede ser de 1 a 100 ng/ml, preferentemente alrededor de 10 ng/ml.
En una realización de la invención, dicha laminina se selecciona del grupo que consiste en LN-111, LN-211, LN-332, LN-411, LN-421, LN-511 y LN-521.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana recombinante.
En una realización de la invención, la laminina se recubre en el soporte, tal como una placa de 0,5 a 50 microgramos por mililitro (pg/mL), preferentemente de 1 a 10 pg/mL, más preferentemente a 5 |jg/mL
El soporte es típicamente una superficie en un recipiente de cultivo.
En una realización de la invención, el soporte se selecciona del grupo que consiste en una placa, un portaobjetos, un matraz y similares. En una realización preferida de la invención, el soporte tiene al menos una porción de una superficie recubierta con una matriz de la invención, tal como LN-111 humana recombinante o LN-521 humana recombinante. La invención se refiere un procedimiento para inducir la diferenciación hepática humana que comprende las etapas de:
(i) cultivar una población de células pluripotentes o multipotentes humanas en un soporte recubierto con laminina humana en un medio de inducción endodérmica para producir una población de células de endodermo definitivo (ED) humanas y donde dicho procedimiento no comprende la sobreexpresión del transgén homeobox HEX en dicha población celular..
La invención también se refiere a un procedimiento para inducir la diferenciación hepática humana que comprende las etapas de:
(i)cultivar una población de endodermo definitivo (ED) humano, en un soporte recubierto con laminina humana en un medio de inducción hepática para producir una población de células humanas similares a hepatoblastos, y. (ii) cultivar opcionalmente dicha población de células similares a hepatoblastos humanos en un soporte recubierto con laminina humana en un medio de maduración hepática para producir una población de células similares a hepatocitos, preferiblemente células similares a hepatocitos fetales humanos, y donde dicho procedimiento no comprende la sobreexpresión del transgén homeobox HEX en dicha población de células.Como se usa en esta invención, las expresiones "medio de inducción endodérmica" o "medio de cultivo que induce la diferenciación endodérmica" se refieren a un medio de cultivo que es capaz de inducir la diferenciación de células madres pluripotentes en células endodérmicas definitivas (y por lo tanto, capaz de inducir la expresión de marcadores endodérmicos, tales como Sox 17 y FoxA2).
En una realización preferida de la invención, el medio de inducción endodérmica es un medio químicamente definido que comprende al menos activina A y opcionalmente WNT3A.
En otra realización de la invención, el medio de inducción de endodermo es un medio químicamente definido que comprende además CHIR99021.
La activina A se conoce bien en la técnica y es un polipéptido dimérico que ejerce un rango de efectos celulares a través de la estimulación de la vía activina / nodal (Vallier y col., Cell Science 118: 4495-4509 (2005)). La proteína de activina A humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de GeneBank NP_002183. La activina está disponible en fuentes comerciales (por ejemplo, Stemgent Inc. MA USA o Miltenyi Biotec).
Típicamente, la concentración de activina A en el medio de cultivo puede ser de 10 a aproximadamente 1000 ng/ml, preferentemente alrededor de 100 ng/ml.
La proteína WNT3A humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de Uniprot P56704. Típicamente, la concentración de WNT3A en el medio de cultivo puede contener de 10 a 100 ng/ml de WNT3A, preferentemente alrededor de 50 ng/ml. La WNT3A puede adquirirse de Miltenyi Biotec. CHIR99021 es un inhibidor de GSK3 que activa la vía WNT/p-catenina. CHIR99021 puede adquirirse de Tocris Bioscience, Stemgent.
Típicamente, la concentración de CHIR99021 en el medio de cultivo es de alrededor de 1 j M a alrededor de 10 j M, preferiblemente alrededor de 3 j M.
La etapa de cultivo de células pluripotentes con el medio de inducción endodérmica se llevará a cabo durante el tiempo necesario para la producción del endodermo definitivo (ED). La duración de esta etapa de cultivo puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, durante el cultivo, el experto en la técnica puede monitorizar las células cultivadas para la expresión de marcadores expresados específicamente por el endodermo definitivo (ED) (por ejemplo, Sox 17 y FoxA2). Cuando se detecta la expresión de uno o varios marcadores específicos de células ED, se puede detener el cultivo con el medio de inducción hepática. La monitorización de estos marcadores se puede realizar mediante, por ejemplo, el análisis por RT-PCR del ARN extraído de células cultivadas con cebadores específicos, el análisis por inmunofluorescencia con anticuerpos específicos de los marcadores, ELISA y FACS o cualquier procedimiento para detectar el ARN / proteína / actividad correspondiente al marcador específico.
Típicamente, la etapa ii) se puede llevar a cabo durante 1 a 10 días, preferentemente 5 días.
Si es necesario, el medio de cultivo de la invención se puede renovar, parcial o totalmente, a intervalos regulares. Típicamente, el medio de cultivo de la invención se puede reemplazar por un medio de cultivo fresco de la invención cada dos días, durante 5 días.
Las células similares a hepatocitos producidas por el procedimiento anterior se pueden aislar y / o purificar mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo FACS.
En una realización de la invención, dicha laminina se selecciona del grupo que consiste en LN-111, LN-211, LN-332, LN-411, LN-421, LN-511 y LN-521.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana recombinante.
En una realización de la invención, la laminina se recubre en el soporte, tal como una placa de 0,5 a 50 microgramos por mililitro (jg/mL), preferentemente de 1 a 10 jg/mL, más preferentemente a 5 jg/mL.
El soporte es típicamente una superficie en un recipiente de cultivo.
En una realización de la invención, el soporte se selecciona del grupo que consiste en una placa, un portaobjetos, un matraz y similares. En una realización preferida de la invención, el soporte tiene al menos una porción de una superficie recubierta con una matriz de la invención, tal como LN-111 humana recombinante y/o LN-521 humana recombinante. La invención se refiere además a un procedimiento para inducir diferenciación hepática humana que comprende las etapas de:
(i) cultivar una población de células pluripotentes o multipotentes humanas en un soporte recubierto con laminina humana en un medio de inducción endodérmica para producir una población de células de endodermo definitivo (ED) humanas,
(ii) cultivar dicha población de células ED humanas en un soporte recubierto con laminina humana en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatocitos fetales, y
(iii) opcionalmente cultivar dicha población de células similares a hepatoblastos humanos sobre un soporte recubierto con laminina humana en un medio de maduración hepática para producir una población de células similares a hepatocitos, preferiblemente células similares a hepatocitos fetales humanos.
y donde dicho procedimiento no comprende la sobreexpresión del transgén homeobox HEX en dicha población de células.
Como se usa en esta invención, los términos "células similares a hepatocitos fetales" o "hepatoblastos diferenciados" se usan en esta invención de manera intercambiable y se refieren a células que expresan marcadores bioquímicos característicos, que incluyen pero no se limitan a HNF4(, CYP3A7, AFP y CK19, y pueden expresar algunas proteínas hepáticas maduras, incluidas, pero no limitadas a, ALB, AAT, UGT1A1 y citocromo P4503a 4 (CYP3A4).
Como se usa en esta invención, las expresiones "medio de maduración hepática" o "medio de cultivo que estimula la maduración hepática" se refieren a un medio de cultivo que es capaz de inducir la maduración de células similares a hepatoblastos a células similares a hepatocitos fetales.
En una realización preferida de la invención, el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende HGF y OSM.
Como se usa en esta invención, el término "factor de crecimiento hepático" (HGF) se refiere a un factor de crecimiento que regula el crecimiento celular, la motilidad celular y la morfogénesis mediante la activación de una cascada de señalización de tirosina quinasa después de la unión al receptor proto-oncogénico c-MET. La proteína HGF humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de Uniprot P14210. Típicamente, el HGF se agrega al medio de maduración hepática a una concentración que varía de 1 a 100 ng/ml, preferentemente de 5 a 50 ng/ml, e incluso más preferentemente de alrededor de 20 ng/ml. El HGF puede adquirirse de Peprotech.
Como se usa en esta invención, el término "oncostatina M" (OSM) se refiere a una citoquina que inhibe la proliferación de varias líneas de células tumorales. La proteína OSM humana de origen natural tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de Uniprot P13725.
Típicamente, la oncostatina M se agrega al medio de maduración hepática a una concentración que varía de 1 a 100 ng/ml, preferentemente de 5 a 50 ng/ml, e incluso más preferentemente de alrededor de 20 ng/ml. La OSM puede adquirirse de Miltenyi Biotec.
La etapa de cultivo de células similares a hepatocitos con el medio de maduración hepática se llevará a cabo durante el tiempo necesario requerido para la producción de células similares a hepatocitos fetales. La duración de esta etapa de cultivo puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, durante el cultivo, el experto en la técnica puede monitorizar las células cultivadas para detectar la ausencia de expresión de marcadores de células madre pluripotentes (por ejemplo, Sox 2 y Nanog), la ausencia de expresión de marcadores específicos de endodermo definitivo (Ed ) (por ejemplo, Sox 17 y FoxA2), la expresión de marcadores específicos de hepatoblastos y/o la expresión de marcadores expresados específicamente por células similares a hepatocitos fetales (por ejemplo, AFP y ALB). Cuando se detecta la expresión de uno o varios marcadores específicos de células similares a hepatocitos fetales, se puede detener el cultivo con el medio de maduración hepática. La monitorización de estos marcadores se puede realizar mediante, por ejemplo, el análisis por RT-PCR del ARN extraído de células cultivadas con cebadores específicos, el análisis por inmunofluorescencia con anticuerpos específicos de los marcadores, ELISA y FACS o cualquier procedimiento para detectar el ARN / proteína / actividad correspondiente al marcador específico.
Típicamente, la etapa ii) se puede llevar a cabo durante 3 a 60 días, preferentemente 30 días.
Si es necesario, el medio de cultivo de la invención se puede renovar, parcial o totalmente, a intervalos regulares. Típicamente, el medio de cultivo de la invención se puede reemplazar por un medio de cultivo fresco de la invención cada dos días, durante 30 días.
Las células similares a hepatocitos fetales producidas mediante el procedimiento anterior se pueden aislar y / o purificar a través de cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo FACS.
En una realización de la invención, dicha laminina se selecciona del grupo que consiste en LN-111, LN-211, LN-332, LN-411, LN-421, LN-511 y LN-521.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana.
En una realización de la invención, dicha laminina es una laminina humana recombinante.
En una realización de la invención, la laminina se recubre en el soporte, tal como una placa de 0,5 a 50 microgramos por mililitro (|jg/ml), preferentemente de 1 a 10 |jg/ml, más preferentemente a 5 |jg/ml.
El soporte es típicamente una superficie en un recipiente de cultivo.
En una realización de la invención, el soporte se selecciona del grupo que consiste en una placa, un portaobjetos, un matraz y similares. En una realización preferida de la invención, el soporte tiene al menos una porción de una superficie recubierta con una matriz de la invención, tal como LN-111 humana recombinante y/o LN-521 humana recombinante.
Poblaciones de células similares a hepatocitos humanos de acuerdo con la invención y composiciones farmacéuticas que las comprenden
En otro aspecto, la invención se refiere a una población de células similares a hepatocitos humanos obtenidas mediante un procedimiento tal como se ha definido anteriormente.
La invención también se refiere a una población de células similares a hepatoblastos humanos obtenidas mediante un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, donde dichas células expresan el factor nuclear hepatocitario 4 alfa (HNF4() y no expresan o no expresan sustancialmente alfa-fetoproteína (AFP).
La invención se refiere a una población de células similares a hepatoblastos humanos obtenidas mediante un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, donde dichas células expresan HNF4(, citoqueratina 19 (CK19) y citocromo P4503A7 (CYP3A7) y no expresan o no expresan sustancialmente AFP, albímina ( ALB), alfa-1 antitrispina (AAT), citocromo P4503A4 (CYP3A4), difosfato de uridina (UDP)-glucuronosil transferasa 1A1 (UGT1A1).
En otro aspecto más, la invención se refiere a una población de células similares a hepatocitos fetales humanos obtenidas mediante un procedimiento tal como se ha definido anteriormente.
La invención también se refiere a una población de células similares a hepatocitos fetales humanos obtenidas mediante un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, donde dichas células expresan HNF4(, CK19, CYP3A7, AFP, ALB, AAT y UGT1A1 y citocromo P4503A4 (CYP3A4).
En una realización, las células similares a hepatocitos humanos muestran un fenotipo normal.
En otra realización, las células similares a hepatoblastos humanos muestran una mutación genética, en particular una mutación genética que afecta a proteínas clave dentro de las células similares a hepatocitos humanos y que está asociada con una enfermedad hepática. Debe observarse que la mutación genética o el defecto que es responsable del fenotipo de la enfermedad puede corregirse in vitro o ex vivo. Hay varias técnicas disponibles para corregir mutaciones genéticas o defectos en células aisladas de mamíferos.
Modificación genética de células similares a hepatocitos humanos de la invención
El término "genéticamente modificado" indica que las células similares a hepatocitos humanos comprenden una molécula de ácido nucleico no presente de forma natural en células progenitoras hepáticas humanas no modificadas o una molécula de ácido nucleico presente en un estado no natural en dichas células progenitoras hepáticas humanas (por ejemplo, ampliadas). La molécula de ácido nucleico puede haberse introducido en dichas células o en un ancestro de las mismas (como iPS, que contiene una mutación genética asociada a una enfermedad hepática).
Se pueden utilizar varios enfoques para modificar genéticamente células similares a hepatocitos humanos, como la administración de genes mediada por virus, la administración de genes no mediada por virus, el ADN desnudo, los tratamientos físicos, etc. Para este fin, generalmente se incorpora el ácido nucleico en un vector, como un virus recombinante, un plásmido, fago, episoma, cromosoma artificial, etc.
En una realización particular de la invención, las células similares a hepatocitos (HLC) o las células madre pluripotentes, se modifican genéticamente mediante un vector viral (o un virus recombinante) o un procedimiento no viral. En esta realización, el ácido nucleico heterólogo se introduce, por ejemplo, en un virus recombinante que luego se utiliza para infectar células similares a hepatocitos (HLC) humanos. Se pueden utilizar diferentes tipos de virus recombinantes, en particular el lentivirus.
En una realización preferida, dicho lentivirus codifica una proteína inmortalizadora, como SV40T, hTERT, CDK4, etc. En otra realización preferida, dicho lentivirus codifica una proteína de tipo salvaje (presentando dicha proteína generalmente una mutación genética asociada a la enfermedad en pacientes que padecen una enfermedad hepática) como la proteína de tipo salvaje antitripsina (1 (AAT) o la familia UDP glucuronosiltransferasa 1, polipéptido A1 (UGT1A1). Otras mutaciones genéticas implicadas en enfermedades hepáticas han sido descritas previamente. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés (por ejemplo, una proteína inmortalizadora o una proteína de tipo salvaje usada para corregir un fenotipo de enfermedad) está unida operativamente a un promotor.
Alternativamente, dicho lentivirus codifica una proteína reportera o una proteína marcadora. Dicha proteína marcadora, que puede ser una proteína fluorescente o una proteína expresada en la superficie celular, permite la rápida identificación y el aislamiento de células similares a hepatocitos (HLC) humanos de interés.
La proteína marcadora puede, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en:
- una proteína fluorescente, en particular la proteína fluorescente verde (GFP) o sus derivados, por ejemplo, la proteína fluorescente verde mejorada, las proteínas fluorescentes azules (EBFP, EBFP2, Azurita, mKalamal), las proteínas fluorescentes cian (ECFP, Cerúleo, CyPet) y las proteínas fluorescentes amarillas (YFP, EYFP, Citrina, Venus, YPet); y
- cualquier proteína expresada en la superficie celular que no se expresa de forma natural por las HLC.
Como se usa en esta invención, el término "enlazado operativamente" significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Por lo tanto, una secuencia de ácido nucleico está "enlazada operativamente" cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia nucleica de secuencia. Por ejemplo, un promotor está "enlazado operativamente" a una secuencia de codificación si el promotor causa la transcripción de la secuencia de codificación. En general, enlazado operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico enlazadas son contiguas.
Como se usa en esta invención, el término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN que determina el sitio de iniciación de la transcripción para un ARN polimerasa. Un promotor puede comprender un promotor de ARN polimerasa III que puede proporcionar altos niveles de expresión constitutiva a través de una variedad de tipos de células y será suficiente para dirigir la transcripción de una secuencia localizada distalmente, que es una secuencia enlazada al extremo 3' de la secuencia promotora en una célula. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, promotores constitutivos, regulados, específicos de tejido o ubicuos, que pueden ser de origen celular, viral o sintético. En una realización, el promotor es un promotor constitutivo tal como el factor-1 alfa de elongación humano (EF-1 alfa), etc.
En otra realización, el promotor es un promotor específico del hígado tal como 1-antitripsina humana, albúmina, etc. En otra realización, el promotor es una secuencia endógena (constitutiva o específica). En ese caso, la proteína de interés está enlazada al promotor endógeno mediante una tecnología de edición del genoma basada en el uso de una nucleasa artificial (por ejemplo: CRISPR/cas, ZFN, TALEN).
En otra realización, la modificación génica de células similares a hepatocitos humanos se realiza mediante la tecnología de edición del genoma para modificar la secuencia génica endógena.
Es importante destacar que las células de linaje hepatocitario (HLC) son el objetivo de la enfermedad en una variedad de condiciones a menudo conocidas como "enfermedades hepáticas" (también denominadas "patología asociada con daño hepático"). Estos términos se refieren a cualquier enfermedad o condición clínica caracterizada por daño hepático, lesión, disfunción, defecto o anomalía. Por tanto, el término abarca, por ejemplo, lesiones, enfermedades degenerativas y enfermedades genéticas.
Las enfermedades hepáticas se están convirtiendo en una de las causas más comunes de mortalidad en los países en desarrollo. Este grupo de enfermedades que atacan a las células del linaje hepatocitario, como los hepatocitos que representan las células hepáticas dominantes, abarca trastornos metabólicos hereditarios (como el síndrome de Crigler-Najjar tipo I, la enfermedad por almacenamiento de glucógeno, los defectos del ciclo de la urea, la hipercolesterolemia familiar, la tirosinemia y la enfermedad de Wilson), insuficiencia hepática crónica, así como insuficiencia hepática aguda que puede ser causada por infección viral (en particular, infección por VHB o VHC), tóxicos (alcohol) y drogas o trastorno autoinmune (hepatitis autoinmune crónica, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria).
En otro aspecto, la invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la población de células similares a hepatocitos humanos de acuerdo con la invención.
La composición farmacéutica puede incluir generalmente uno o más portadores, aditivos, antibióticos, conservantes, adyuvantes, diluyentes, disolventes y/o estabilizadores farmacéuticamente aceptables y aprobados. Dichas sustancias auxiliares pueden ser agua, solución salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH o similares. Los portadores adecuados son típicamente moléculas grandes, de metabolismo lento, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados de lípidos o similares. Esta composición farmacéutica puede contener aditivos adicionales tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros aditivos tales como antioxidantes o gases inertes, estabilizadores o proteínas recombinantes (por ejemplo, albúmina de suero humano) o vitaminas adecuadas para la administración in vivo.
Como se usa en esta invención, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otras reacciones perjudiciales cuando se administran a un mamífero, especialmente a un ser humano, según corresponda. Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a un portador no sólido, semisólido o líquido no tóxico, diluyente, material envolvente o auxiliar de formulación de cualquier tipo.
Procedimientos de cribado de la invención
En otro aspecto, las células similares a hepatocitos humanos de la invención obtenidas de pacientes sanos o enfermos también pueden utilizarse ventajosamente para aplicaciones de cribado en la industria farmacéutica.
Dichas pruebas de cribado pueden utilizarse para buscar nuevos fármacos con aplicaciones clínicas o para pruebas de toxicología que evalúen la hepatotoxicidad de compuestos como los compuestos farmacéuticos candidatos. Las células similares a hepatocitos humanos de acuerdo con la invención pueden ser útiles, por ejemplo, para generar modelos celulares de enfermedades hepáticas como se ha descrito anteriormente.
Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento de cribado de un compuesto útil en el tratamiento de una enfermedad hepática que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una población de células similares a hepatoblastos humanos o células similares a hepatocitos fetales producida mediante un procedimiento de la invención con un compuesto de ensayo, y
(b) determinar el efecto del compuesto de ensayo en dichas células similares a hepatoblastos humanos o células similares a hepatocitos fetales.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento de cribado de compuestos que tienen un efecto hepatoprotector o hepatotóxico o hepatoproliferativo donde dicho procedimiento comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una población de células similares a hepatoblastos humanos o células similares a hepatocitos fetales producidas mediante un procedimiento de la invención con un compuesto de ensayo y;
(b) comparar la supervivencia de las células de la etapa a) con la de una población de dichas células como se define anteriormente, cultivadas en ausencia de dicho compuesto de ensayo.
El término "hepatotóxico" se refiere a un compuesto que provoca una disminución en la supervivencia de las células progenitoras hepáticas. Se considera que un compuesto tiene un efecto hepatotóxico si el número de células viables cultivadas en presencia de dicho compuesto es menor que el número de células viables cultivadas en ausencia de dicho compuesto.
El término "hepatoprotector" se refiere a un compuesto que produce un aumento de la supervivencia de las células progenitoras hepáticas Se considera que un compuesto tiene un efecto hepatoprotector si el número de células viables cultivadas en presencia de dicho compuesto es mayor que el número de células viables cultivadas en ausencia de dicho compuesto.
Típicamente, el efecto hepatoprotector se puede probar en ausencia de factores hepatotróficos. Alternativamente, el efecto hepatoprotector puede analizarse en presencia de un fármaco hepatotóxico conocido. Los fármacos hepatotóxicos conocidos incluyen, pero no se limitan a, amiodarona, metotrexato y nitrofurantoína.
El término "hepatoproliferativo" se refiere a un compuesto que produce un aumento de la proliferación de las células progenitoras hepáticas. Se considera que un compuesto tiene un efecto hepatoproliferativo si el número de células proliferativas cultivadas en presencia de dicho compuesto es mayor que el número de células viables cultivadas en ausencia de dicho compuesto. Típicamente, el efecto hepatoproliferativo se puede probar en ausencia de factores de crecimiento.
Compuestos de ensayo de la invención
En una realización, el compuesto de ensayo puede seleccionarse del grupo que consiste en péptidos, proteínas, peptidomiméticos, moléculas orgánicas pequeñas, aptámeros o ácidos nucleicos. Por ejemplo, el compuesto de ensayo de acuerdo con la invención puede seleccionarse de una biblioteca de compuestos sintetizados previamente o de una biblioteca de compuestos cuya estructura se determina en una base de datos o de una biblioteca de compuestos que se han sintetizado de novo.
En una realización particular, el compuesto de ensayo puede seleccionarse de pequeñas moléculas orgánicas. Como se usa en esta invención, el término "molécula orgánica pequeña" se refiere a una molécula de tamaño comparable a las moléculas orgánicas generalmente utilizadas en productos farmacéuticos. El término excluye macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, etc.); las moléculas orgánicas pequeñas preferidas varían en tamaño hasta 2000 Da y más preferentemente hasta aproximadamente 1000 Da.
En otra realización, el compuesto de ensayo puede seleccionarse del grupo que consiste en una biblioteca de ácidos nucleicos, que incluye, pero no se limita a, ARNsh, ARNmi, ARNm.
Modelos animales
La disponibilidad de células similares a hepatocitos que pueden derivarse de ES o iPS humanas permite además diseñar modelos in vitro e in vivo de enfermedades hepáticas humanas y virus hepatotrópicos, en particular hepatitis B o C. Más específicamente, se puede proporcionar un modelo in vivo de enfermedades hepáticas humanas y virus hepatotrópicos mediante la repoblación del hígado de un mamífero no humano con células progenitoras hepáticas humanas.
Por consiguiente, la invención se refiere además al uso de células similares a hepatocitos humanos obtenidas mediante un procedimiento de acuerdo con la invención para producir un huésped mamífero no humano que comprende hepatocitos humanos funcionales.
Un procedimiento adecuado para producir un mamífero no humano quimérico que comprende hepatocitos humanos funcionales puede comprender la etapa que consiste en inyectar en el hígado dichas células similares a hepatocitos humanos de mamíferos no humanos de acuerdo con la invención. Para favorecer el injerto de las HLC, el mamífero no humano puede recibir un tratamiento antimacrófago para controlar la defensa no adaptativa. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, administrando difosfonato de diclorometileno, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal de difosfonato de diclorometileno de liposoma encapsulado. Otras estrategias para favorecer el injerto de las HLC pueden depender de la estimulación de la regeneración del hígado antes de la inyección celular. Esto puede realizarse, por ejemplo, realizando una lesión hepática (por ejemplo, hepatectomía parcial, embolización química, irradiación hepática, hepatotoxinas, transgén) o administrando cualquier compuesto que estimule la proliferación de hepatocitos (factor de crecimiento de hepatocitos, hormona T3).
En otra estrategia, el injerto de las HLC también puede favorecerse al inhibir el potencial proliferativo de los hepatocitos endógenos en un hígado regenerado (animales jóvenes o hígado lesionado). Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, administrando retrorsina (inyección intraperitoneal), mitomicina C (inyección intraperitoneal) o hidrocloruro de propranolol (agua potable). Finalmente, el injerto de las HLC puede favorecerse administrando compuestos vasodilatadores. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, administrando trinitrato de glicerilo.
La invención se refiere además a un mamífero no humano quimérico que comprende hepatocitos humanos funcionales obtenidos u obtenibles mediante el procedimiento de la invención.
El mamífero no humano de la invención puede ser cualquier mamífero no primate en el que se puedan introducir y mantener hepatocitos humanos. Esto incluye, pero no se limita a, caballos, ovejas, vacas, gatos, perros, ratas, hámsters, conejos, jerbos, cobayas y ratones. Preferentemente, el animal huésped es un roedor, más preferentemente aún un ratón. También puede ser un primate no humano (Macacus).
El mamífero no humano puede ser en particular un mamífero inmunocomprometido que generalmente será incapaz de preparar una respuesta inmune completa contra las células xenogénicas (hepatocitos humanos). Los huéspedes mamíferos inmunocomprometidos adecuados para la implantación existen o pueden crearse, por ejemplo, mediante la administración de uno o más compuestos (por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus) o debido a un defecto genético que resulta, por ejemplo, en una incapacidad para sufrir un reordenamiento de ADN en la línea germinal en los loci codificadores de inmunoglobulinas y receptores de antígeno de células T.
La funcionalidad de los hepatocitos humanos puede controlarse mediante la observación de los marcadores sustitutos de la actividad hepatocitaria, incluidos los productos fisiológicos de hepatocitos humanos distinguibles de sus mamíferos no humanos, en particular roedores, análogos por criterios inmunológicos o cuantitativos, por ejemplo, expresión de albúmina sérica humana o los niveles séricos de bilirrubina en animales deficientes para la actividad UGT1A1 (también conocida como bilirrubinemia), etc. Estos marcadores pueden utilizarse para determinar la presencia de células sin sacrificar el receptor.
El mamífero no humano quimérico que comprende hepatocitos humanos funcionales puede utilizarse en particular como un modelo in vivo de infección por hepatitis B humana.
Procedimientos y usos terapéuticos
Un campo de aplicación importante es la terapia celular o la medicina regenerativa. La medicina regenerativa se puede utilizar para curar potencialmente cualquier enfermedad que resulte de un mal funcionamiento, daño o falla del tejido, ya sea regenerando los tejidos dañados in vivo mediante la implantación directa in vivo de una composición farmacéutica que comprende células similares a hepatocitos de la invención.
La invención también se refiere a una composición farmacéutica para tratar o para usar en el tratamiento de una enfermedad hepática que comprende o consiste esencialmente en una población de células similares a los hepatocitos como se describe anteriormente y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otro objeto de la invención es un medicamento para el tratamiento o uso en el tratamiento de una enfermedad del hígado que comprende o consiste esencialmente en una población de células de tipo hepatocito.
Como se usa aquí, el término "que consiste esencialmente en", con referencia a una composición farmacéutica o medicamento, significa que el al menos un compuesto de la invención es el único agente terapéutico o agente con actividad biológica dentro de dicha composición farmacéutica o medicamento.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables se refieren a todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. En una realización, el excipiente comprende aditivos proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos y carbohidratos (p. ej., azúcares, incluidos monosacáridos, di-, tri-, tetra- y oligosacáridos; azúcares derivados como alditoles, ácidos aldónicos, azúcares esterificados y similares, y polisacáridos o polímeros de azúcar), que pueden estar presentes solos o en combinación, comprendiendo solos o en combinación 1-99,99 % en peso o volumen. Los ejemplos de excipientes proteicos incluyen albúmina sérica tal como albúmina sérica humana (HSA), albúmina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína y similares.
Los componentes de aminoácidos/anticuerpos representativos, que también pueden funcionar como tampones, incluyen alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo y similares. Los excipientes de carbohidratos también están previstos dentro del alcance de esta invención, cuyos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol) y mioinositol. Para la administración humana, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por las oficinas reguladoras, como, por ejemplo, la Oficina de la FDA o la EMA.
La invención también se refiere a a una población de células humanas comprometidas en el linaje hepatocitario, pero no totalmente diferenciadas para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano. La descripción también se refiere a una población de células humanas comprometidas en el linaje hepatocitario, pero no totalmente diferenciadas para su uso en el tratamiento de una enfermedad hepática.
La invención
Los ejemplos de enfermedades hepáticas incluyen, entre otros, cirrosis hepática, esteatosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), hepatitis alcohólica, enfermedad del hígado graso, hígado graso del embarazo, hepatitis viral inducida A, B, C, D y E, trastornos de sobrecarga de hierro, fibrosis hepática, enfermedad hepática congénita (como Crigler-Najjar tipo 1 (CN1), enfermedad de Wilson, trastornos del ciclo de la urea, tirosinemia, hipercolesterolemia familiar, hemofilias, citrulinemia, colestasis intrahepática familiar progresiva, enfermedad por almacenamiento de glucógeno), insuficiencia hepática aguda, hepatitis fulminante, hepatitis subfulminante, cánceres de hígado, hipercolesterolemia.
Dichas enfermedades pueden ser inducidas por factores ambientales que incluyen, entre otros, fármacos, hongos tóxicos, infecciones posquirúrgicas, virus, bacterias y alcohol. Otro aspecto de la invención, por lo tanto, se refiere a una población de células similares a los hepatocitos (por ejemplo, células similares a los hepatoblastos) de la divulgación de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano.
En una realización, dicha población de células similares a hepatoblastos humanos es una población de dichas células que expresan el factor nuclear 4 alfa hepatocitario ((HNF4a ) y no expresan o no expresan sustancialmente alfafetoproteína (AFP) como se ha descrito anteriormente.
Más particularmente, un aspecto de la invención se relaciona con una población de células similares a hepatocitos de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad hepática. En una realización, dicha población de células similares a hepatoblastos humanos es una población de dichas células que expresan el factor nuclear 4 alfa hepatocitario (HNF4a ) y no expresan o no expresan sustancialmente alfa-fetoproteína (AFP) como se ha descrito anteriormente.
La invención también se refiere a un procedimiento para tratar una enfermedad hepática que comprende la etapa de administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de una población de células similares a hepatocitos de la invención a un sujeto o paciente que la necesite.
En el contexto de la invención, los términos "tratar" o "tratamiento", como se usan en esta invención, se refieren a un procedimiento cuyo objetivo es retrasar o impedir el inicio de una patología, revertir, aliviar, inhibir, ralentizar o detener la progresión, agravación o deterioro de los síntomas de la patología, facilitar la mejoría de los síntomas de la patología y / o curar la patología.
Como se usa en esta invención, el término "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a cualquier cantidad de una población de células similares a hepatocitos humanos de acuerdo con la invención (o una composición farmacéutica de la misma) que sea suficiente para lograr el propósito deseado.
Las dosis eficaces y los regímenes de administración pueden determinarse fácilmente mediante una buena práctica médica basada en la naturaleza de la patología del sujeto, y dependerá de una serie de factores que incluyen, entre otros, ruta de adminbistración, el alcance de los síntomas de la patología, la patología específica y el alcance del daño o la degeneración del tejido u órgano de interés y las características del sujeto (por ejemplo, edad, peso corporal, género, salud general y similares).
Para terapia, las poblaciones de células similares a hepatocitos humanos y las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden administrarse a través de diferentes vías. Los expertos en la técnica pueden optimizar la dosis y el número de administraciones de una manera conocida.
En una realización, la población de células similares a hepatocitos humanos, la composición farmacéutica, el medicamento de la invención debe administrarse local o sistémicamente.
En una realización, la población de células similares a los hepatocitos humanos, la composición farmacéutica, el medicamento de la invención deben administrarse localmente e incluyen, entre otros, una inyección o una infusión o una implantación de la población de células similares a los hepatocitos humanos, la composición farmacéutica, el medicamento de la invención en, alrededor o cerca del hígado, en el parénquima hepático, debajo de la cápsula hepática de Glisson, debajo de la cápsula renal, en el bazo, en el páncreas, en el peritoneo y en la bolsa omental. Preferiblemente, la administración local es una inyección o una infusión o una implantación a través de vasos sanguíneos que irrigan el hígado (vena porta, arteria, vena, venas mesentéricas).
En otra realización, la población de células similares a los hepatocitos humanos, la composición farmacéutica o el medicamento de la invención se administrarán en un entorno diferenciador para la población de células similares a los hepatocitos humanos de la invención.
Dicha ruta de administración puede lograrse mediante un procedimiento quirúrgico, cirugía laparoscópica, a través de un sistema de catéter o una implantación en la cavidad peritoneal.
En una realización, la población de células similares a hepatocitos humanos, la composición farmacéutica, el medicamento de la invención se va a administrar sistémicamente e incluye, sin limitación, la administración enteral o parenteral.
Ejemplos de formulaciones adaptadas a inyecciones o infusión o implantación incluyen, pero no se limitan a, soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección. Ejemplos de inyecciones incluyen, pero no se limitan a, inyección o perfusión intravenosa, intraaórtica, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intradérmica e intraperitoneal. En otra realización, cuando se inyecta, la población de células similares a hepatocitos humanos, la composición farmacéutica o el medicamento de la invención son estériles. Los procedimientos para obtener una composición farmacéutica estéril incluyen, entre otros, la síntesis BPF (BPF significa "buenas prácticas de fabricación").
En una realización, se encapsula la población de células similares a hepatocitos humanos, la composición farmacéutica o el medicamento de la invención. Los ejemplos de cápsulas incluyen, sin limitación, matrigel, hidrogel. En una realización, la población de células similares a hepatocitos humanos, la composición farmacéutica o el medicamento de la invención se administrarán en una forma de liberación sostenida. En otra realización, la población de células similares a hepatocitos humanos, la composición farmacéutica o el medicamento de la invención comprende un sistema de administración que controla la liberación del agente.
En una realización, se administrará una cantidad terapéuticamente eficaz de la población de células similares a los hepatocitos humanos, la composición farmacéutica o el medicamento de la invención al menos una vez en la vida del sujeto o varias veces para obtener y/o mantener el beneficio terapéutico. en el sujeto.
En otra realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de la población de células similares a los hepatocitos humanos o la composición farmacéutica o el medicamento de la invención oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 200 millones de células por kg de cuerpo, preferiblemente aproximadamente 25 millones de células por kg de cuerpo. .
El término "aproximadamente", como se usa en esta invención antes de una cifra, significa más o menos el 10 % del valor de dicha cifra.
En una realización, el sujeto está afectado, preferentemente se le diagnostica una enfermedad hepática.
En una realización, las células semejantes a hepatocitos humanas de la invención pueden ser útiles para la terapia autóloga regenerativa de un paciente que padece una enfermedad hepática que necesita terapia regenerativa debido a trastornos específicos o tratamientos asociados a dichos trastornos, incluyendo, sin limitación, Crigler-Najjar de tipo 1 (CN1) debido al déficit en un gen identificado que puede reemplazarse in vitro.
En una realización, la invención se refiere a células similares a hepatocitos humanos de la descripción para su uso como un producto de terapia celular para implantar en un paciente humano, como un injerto alogénico o, después de la corrección genética, como un injerto autólogo (es decir, las células tienen el mismo genotipo que las células del sujeto/paciente).
En una realización, la invención se refiere a las células similares a hepatocitos humanos de la invención para su uso como hígado auxiliar. En una realización, las células de tipo hepatocito de la invención, cuando se administraron, se localizaron en el bazo. En una realización, el bazo que contiene las células de tipo hepatocito de la invención actúa como un hígado secundario.
En una realización, las células similares a hepatocitos humanos de la invención pueden ser útiles para hígados modificados por bioingeniería: ya sea por infusión junto con otras células de linaje hepático en un hígado descelularizado, por generación del hígado humano funcionalizado y vascularizado de las iPSCs humanas mediante trasplante de brotes hepáticos creados in vitro (Takebe y col., Nature 2013, 499), por impresión 3D o cualquier otro procedimiento para generar tejido hepático. En otra realización, las células similares a hepatocitos humanos de la invención pueden ser útiles para hígados bioartificiales, ya sea infundiéndolos en dispositivos extracorpóreos o incrustándolos en una biomatriz o hidrogel (como alginato, hidroxipropilmetilcelulosa silanizada) antes de la infusión en el cuerpo.
La invención se ilustrará adicionalmente mediante las figuras y ejemplos siguientes. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invención.
FIGURAS:
Figura 1: Diferenciación hepática de células madre pluripotentes humanas en platos recubiertos con LN111.
(A) Protocolo para diferenciar células humanas pluripotentes en células similares a hepatocitos. (BD) La diferenciación hepática se monitorizó a lo largo del tiempo mediante análisis por RT-qPCR para la expresión del ARNm del marcador de pluripotencia (panel B, SOX2), de marcadores endodérmicos (panel C, SOX17, FOXA2) y marcadores hepáticos (panel D, HNF4a, AAT, AFP , ALB, CK19, CYP3A4, CYP3A7, UGT1A1). (E) Secreción de proteínas hepáticas AFP en sobrenadantes celulares mediante ELISA. Los datos representan la media ± SEM. LN111: resultados con hiPSC diferenciados en platos revestidos con LN111; Matrigel: resultados con hiPSC diferenciados en platos recubiertos con Matrigel™.
Figura 2: Trasplante de HLC en los hígados de ratas Gunn. Niveles de bilirrubina sérica en ratas Gunn.
La bilirrubinemia se monitorizó con el tiempo en ratas Gunn inmunodeprimidas con tacrolimus que recibieron IDHB 24 horas después de una hepatectomía parcial de dos tercios. Las ratas de control recibieron los mismos procedimientos quirúrgicos, pero no fueron trasplantadas.
Figura 3: Diferenciación hepática de células madre pluripotentes humanas en platos recubiertos con LN521.
La diferenciación hepática se monitorizó a lo largo del tiempo mediante análisis por RT-qPCR para la expresión de ARNm de marcadores endodérmicos (SOX17) y marcadores hepáticos (HNF4a, Aa T, AFP, ALB y CK19).
Figura 4: Diferenciación hepática de células iPSC en platos recubiertos con LN111.
La diferenciación hepática se controló a lo largo del tiempo mediante análisis de RT-qPCR para la expresión de ARNm de marcadores endodérmicos (Nanog, OCT4, FOXA2, SOX17).
Figura 5: Diferenciación hepática de células iPSC en placas recubiertas con LN111.
La diferenciación hepática se controló a lo largo del tiempo mediante análisis de RT-qPCR para la expresión de ARNm de marcadores hepáticos (HNF4a, CYP7A1, AFP y CK19).
Figura 6: Diferenciación hepática de células iPSC en placas recubiertas con LN111.
La diferenciación hepática se controló a lo largo del tiempo mediante análisis de RT-qPCR para la expresión de ARNm de marcadores hepáticos (ALB, AAT).
Figura 7: Diferenciación hepática de células iPSC en placas recubiertas con LN111 o LN521.
La diferenciación hepática se controló a lo largo del tiempo mediante análisis de RT-qPCR para la expresión de ARNm de marcadores hepáticos (HNF4a, AAT, AFP y ALB).
Figura 8: Diferenciación hepática de hESC en placas recubiertas con LN111 o LN521 con o sin CHIR99021.
La diferenciación hepática se controló a lo largo del tiempo mediante análisis de RT-qPCR para la expresión de ARNm de marcadores hepáticos (HNF4a, CK19, AFP y CYP3A7).
Figura 9: Influencia de la siembra celular en la diferenciación hepática de hESC en placas recubiertas con LN111 o LN521 con o sin CHIR99021.
La diferenciación hepática se controló a lo largo del tiempo mediante análisis de RT-qPCR para la expresión de ARNm de marcadores hepáticos (HNF4a, CK19, AFP y ALB).
Figura 10: Trasplante de células hepáticas iPS frescas o congeladas en hígados de ratas Gunn.
Se controló la bilirrubinemia a lo largo del tiempo en ratas Gunn inmunosuprimidas con tacrolimus que recibieron IDHB 24 horas después de una hepatectomía parcial de dos tercios. Las ratas de control recibieron los mismos procedimientos quirúrgicos pero no fueron trasplantadas.
Figura 11: Detección de células hepáticas en el bazo o el hígado de ratas Gunn.
Análisis inmunohistoquímico de UGT1A1 en el hígado y el bazo de ratas Gunn inmunosuprimidas con tacrolimus que recibieron IDHB 24 horas después de una hepatectomía parcial de dos tercios.
EJEMPLO 1: USO DE LN-111 COMO MATRIZ PARA DIFERENCIAR CÉLULAS PLURIPOTENTES EN CÉLULAS DE LINAJE HEPATOCITARIO Y USO DE CÉLULAS SIMILARES A HEPATOBLASTOS OBTENIDAS DE ESTE MODO EN TERAPIA.
Material y procedimientos
Este estudio se realizó de acuerdo con la normativa francesa y europea.
Mantenimiento de hIPSC: Las líneas BBHX8 hiPSC [46] se mantuvieron en pocillos de cultivo recubiertos con Matrigel (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) en mTeSR1 (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 % con cambios de medio diarios. Las células se pasaron cada 5-7 días con reactivo de disociación de célula suave (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá).
Diferenciación hepática in vitro: La diferenciación hepática de células madre pluripotentes humanas se realizó siguiendo un protocolo de tres etapas basado en estudios anteriores [16, 20, 40] con algunas modificaciones. Primero, para la diferenciación endodérmica definitiva, las células se recolectaron mediante TrypLE (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.), se contaron con un contador automático de células ADAM (Labtech, Palaiseau, Francia) y luego, se recubrieron en placas (Costar; Corning Life Sciences, Acton, MA) recubiertas previamente con 5 pg/ml de laminina 111 (Biolamina, Sundbyberg, Suecia) o 2 mg/ml de Matrigel (BD Biosciences, San José, CA, EE. u U.) a una densidad celular de 75 x 103 células / cm2. Se cultivaron en RPMI 1640 complementado con un suplemento sin suero B27 (Life technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) (RPMI/B27), 100 ng/ml de activina A (Miltenyi Biotec, París, Francia), 50 ng/ml de WnT3A (R&D systems, Minneapolis, MN, EE. Uu .) y 10 pM de inhibidor de Rock (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) y opcionalmente CHIR 99021durante 1 día. El inhibidor de Rock y Wnt3A se omitieron del medio en los siguientes 2 días y 3 días, respectivamente. Los siguientes 4 días, las células se cultivaron en RPMI 1640/B27 que contenía 100 ng/ml de activina A y las células se cambiaron diariamente. En segundo lugar, para la especificación hepática, las células se cultivaron durante 2 días en RPMI/B27 complementado con 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 10 (Miltenyi Biotec, París, Francia) y 10 ng/ml de proteína morfogenética ósea (BMP) 4 (R&D systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) con cambio de medio diario. Las células se dividieron luego utilizando TrypLE en 3 placas previamente recubiertas con 5 pg/ml de laminina 111 o 2 mg/ml de Matrigel a una densidad celular de 70 x 103 células / cm2. Se cultivaron en RPMI/B27 complementado con 10 ng/ml de FGF10, 10 ng/ml de BMP-4 y 10 pM de inhibidor de rock durante 1 día y el inhibidor de rock se omitió del medio al día siguiente. Finalmente, para la maduración hepática, las células se cultivaron en medio de cultivo de hepatocitos (Lonza, Bále, Suiza) complementado con 20 ng/ml de factor de crecimiento hepatocitario (HGF) (Miltenyi Biotec, París, Francia) y 20 ng/ml de oncostatina M ( OSM) (Miltenyi Biotec, París, Francia) (medio de maduración) durante 4 días. Los días siguientes, se omitió el HGF del medio de cultivo y el medio se cambió cada 2 días.
Ensayo de inmunofluorescencia: Las células cultivadas se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos a temperatura ambiente, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % en PBS durante 15 minutos y se bloquearon con BSA al 3 % en PBS durante 15 minutos. Las células se incubaron con anticuerpos primarios durante una hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios contra AAT humana (1:100), CK19 (1:50) y AFP (1:300) se adquirieron de DAKO (DakoCytomation, Trappes, Francia); los anticuerpos contra Oct4 humano (1:100), HNF4( (1:100) se adquirieron de TebuBio (Le Perray-en-Yvelines, Francia). Después de realizaron varios lavados en PBS con Tritón al 0,1 %, con anticuerpos secundarios IgG anti-ratón, anti-cabra (ambos de Life Technologies) o anti-conejo (Abcam), conjugados con ALEXA 488, 555 o 647, diluido 1/1000 en PBS con BSA al 1 %, Tritón al 0,1 %, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se contrastaron posteriormente con DAPI, se diluyeron 1/10,000 en PBS, durante 1 minuto a temperatura ambiente y se leyeron en un microscopio de fluorescencia invertida (EvosFL de AMG). Para evaluar la proporción de células diferenciadas, se tomaron imágenes aleatorias de 10 diferenciaciones independientes y luego se contaron las células positivas para los marcadores de diferenciación junto con las células completas.
Citometría de flujo: Para la citometría de flujo, las células diferenciadas se incubaron durante 2 minutos con Accutase a 37 °C. Las células disociadas se fijaron con paraformaldehído al 0,25 % durante 30 minutos a 4 °C, luego se permeabilizaron con Tween-20 al 0,2 % en PBS durante 15 minutos a 37 °C. Las células se bloquearon con BSA / PBS al 3 % durante 30 min. / 4 °C en presencia o ausencia de anticuerpos primarios diluidos en BSA al 0,5 % en PBS. Después del lavado (con PBS), las células se incubaron con BSA / PBS al 3 % luego de una incubación de 20 min a 4 °C con un anticuerpo conjugado burro anti-ratón Alexa Fluor 488. El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando un citómetro de flujo BD lSr II (BD Biosciences).
Estudios en animales: Los animales se alojaron en las instalaciones para animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Nantes (Nantes, Francia) y se mantuvieron bajo un ciclo de luz de 12 horas, alimentados a voluntad y recibieron atención humana de acuerdo con las directrices del Ministerio de agricultura francés. En el estudio se utilizaron ratas Gunn homocigotos (j/j) con 120 ± 30 g de peso (edad: 8 - 9 semanas de edad).
Ensayos de función hepática: Se extrajo sangre del seno retro-orbital. La bilirrubina total en suero y las alanina y aspartato aminotransferasas se midieron en el departamento de bioquímica de rutina del hospital de la Universidad de Nantes.
Histología e inmunohistoquímica: el análisis inmunohistoquímico involucró el uso de técnicas de inmunoperoxidasa en secciones incrustadas en parafina fijadas. Anti-UGT1A1 policlonal de conejo (1:50; Abgent Inc., San Diego, EE. UU.), anti-alfa fetoproteína (1:250; Dako, Glostrup, Dinamarca) y anti-albúmina de suero monoclonal de ratón (1:200; R&D Systems Europe; Abingdon, Reino Unido) se utilizaron anticuerpos para la detección de células humanas. Brevemente, se desparafinaron secciones de hígado de 4 pm de espesor y se pretrataron en tampón de citrato (pH=6, 10 %, Dako) durante 40 min a 98°C. Después de un tratamiento en H2O2 (Dako) durante 5 min y en TBS Tween (ScyTek Laboratories, West Logan, EE. UU.) durante otros 5 min, las secciones se incubaron con el anticuerpo primario con BSA al 2 % y TBS Tween durante 30 min a 37 °C. . Los anticuerpos unidos se detectaron utilizando el agente secundario Envision (Dako) y el sustrato líquido DAB (Dako) para inmunoperoxidasa.
RT-qPCR: El ARNm total se aisló de células cultivadas utilizando el minikit RNeasy (QIAGEN) de acuerdo con las especificaciones del fabricante o TRIzol® (Lifetechnology, Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARNm aislado se cuantificó utilizando un NanoDrop y se utilizó una cantidad total de 10 ng por reacción. Los análisis de las transcripciones se realizaron con un sistema de detección de secuencias ViiA7 (Life Technology, Carlsbad, CA, EE. UU.) utilizando el kit Power EXPRESS One-Step SYBR®GreenERTM, (Life Technology, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las secuencias de sebadores son como sigue:
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El procedimiento de PCR y el análisis de los datos de expresión génica relativa mediante el procedimiento de cuantificación de 2-00ot, después de la normalización a los valores de GAPDH, se realizaron como se ha descrito anteriormente. El nivel de expresión de ARNm se define como el cambio de frecuencia en los niveles de ARNm en una muestra dada en relación con los niveles en células indiferenciadas. El nivel de expresión de ARNm se calcula de la siguiente manera: nivel de expresión de ARNm = 2-AA Ct donde AA Ct = (Ctdiana - CtGAPDH)muestra -(Ctdiana - CtGAPDH). Las amplificaciones específicas se verificaron mediante curvas de fusión de amplicón.
Se realizaron otros análisis de transcritos con un sistema de detección de secuencias ViiA7 (Life Technology, Carlsbad, CA, EE. UU.) utilizando reactivos AgPath-ID™ One-Step RT-PCR (Life Technology, Carlsbad, CA, EE. UU.) y el par de cebadores apropiado. (Applied Biosystems).
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ELISA: La secreción de alfa-fetoproteína humana (AFP) (Calbiotech) y albúmina (Bethyl Laboratories) en el sobrenadante de cultivo se evaluó mediante ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Trasplante de hepatocitos: Las células se separaron (1 x 107 células) de las placas utilizando TrypLE, se lavaron, se resuspendieron en 200 pl de suero fisiológico y se inyectaron con una aguja de mariposa de calibre 26 en el polo esplénico inferior de ratas Gunn que se habían sometido 24 horas antes a una hepatectomía parcial de dos tercios para crear un entorno óptimo para el trasplante celular [48]. Las ratas se inmunosuprimieron diariamente con tacrolimus a 0,2 mg/kg un día antes del trasplante celular durante 3 días y luego a 0,1 mg/kg.
Análisis estadístico: Los datos se expresan como valores medios ± SEM. El análisis estadístico se realizó mediante el software GraphPad Prim® 5.04 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). La importancia estadística se evaluó mediante la prueba de Mann-Whitney para las comparaciones entre grupos. Un valor de < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Resultados
Modificamos y combinamos los protocolos informados previamente [16, 20, 36, 40] para desarrollar un procedimiento compatible con las BPF en condiciones químicamente definidas sin xeno, sin alimentador y factores recombinantes para producir HLC a partir de hiPSC. La laminina-111 (LN111) se expresa en el hígado fetal [41] y la isoforma de laminina presente principalmente en Matrigel™. Establecimos la hipótesis de que la LN111 constituiría una matriz extracelular eficiente para iniciar y apoyar la diferenciación hepática de hiPSC. Nuestro protocolo de diferenciación de 3 etapas para producir HLC in vitro se describe en la Figura 1A. Usamos la línea celular humana iPSC BBHX8, como una línea celular representativa conocida por diferenciarse en HLC [40, 42]. Cuando las hiPSC estaban en una confluencia del 70 - 90 %, las células se recolectaron y se colocaron en platos recubiertos con LN111 recombinante. Para obtener un proceso de diferenciación hepática más reproducible, las células se recolectaron enzimáticamente y las suspensiones de células individuales se contaron y se colocaron en platos nuevos recubiertos con LN111, en lugar de usar los procedimientos estándar basados en la visualización empírica de la densidad celular para evaluar el tiempo y la división de la relación celular para iniciar la producción de las HLC. En el día 0, las hiPSC dieron positivo para marcadores pluripotentes (Nanog, Sox 2) (Figura 1B) y dieron negativo para endodermo definitivo (Sox 17, FoxA2) (Figura 1C) y marcadores hepáticos (HNF4a, ALB, AFP, Citocromo P450) (Figura 1D). Estos experimentos se confirmaron con análisis de RT-qPCR más precisos con AgPath-ID™ One-Step (Figura 4).
Las células se trataron con activina A y factor básico de crecimiento de fibroblastos para generar un endodermo definitivo. Se utilizó una breve exposición a Wnt3a y al inhibidor de rock para mejorar la expresión del endodermo definitivo y la supervivencia celular después de la recolección celular enzimática, respectivamente [16, 36]. En el día 5, más del 80 - 90 % de las células expresaron fuertemente los marcadores endodérmicos definitivos SOX17 y FOXA2 y perdieron la expresión de genes pluripotentes (Figura 1B). Las células endodérmicas definitivas resultantes se cultivaron en presencia de FGF10 y BMP4, 2 factores críticos involucrados en las vías de señalización iniciales del desarrollo hepático embrionario temprano, como se ha descrito anteriormente [43]. Después de 3 días de tratamiento celular (día 8 de diferenciación), las células se pasaron enzimáticamente en nuevos platos recubiertos con LN111 para expandirlas y continuar la etapa de especificación hepática durante 3 días.
En el día 11, casi todas las células dan positivo para los marcadores expresados en progenitores hepáticos durante las primeras etapas del desarrollo hepático (HNF4a, CK19 y CYP3A7) (Figura 1D). Dieron negativo para alfafetoproteína (AFP), un marcador de hepatoblastos, albúmina (ALB), AAT (alfa-1 antitripsina) y citocromo P4503A4 (CYP3A4), que son marcadores de hepatocitos maduros. No expresaron SOX17 y tenían un nivel reducido de FOXA2. Para dirigir la diferenciación en células similares a hepatocitos (expresión de AFP), las células se cultivaron en presencia de OSM y HGF durante 4 días. En la misma etapa, las células se analizaron con AgPath-ID™ One-Step y se obtuvieron resultados similares (consulte las Figuras 5 y 6). En conjunto, los resultados mostraron que tienen un fenotipo de hepatoblastos [44, 45].
Después del día 20, los hepatoblastos derivados de hiPSC expresaron HNF4a, CK19, AFP y CYP3A7 (una enzima CYP450 expresada en hepatocitos fetales) y adquirieron la expresión de algunos marcadores de hepatocitos maduros (ALB, AAT, UGT1A1, CYP3A4) y perdieron la expresión de FOXA2, tal como ha sido evaluado mediante los análisis por RT-qPCR (Figura 1D). De acuerdo con estos resultados, la secreción de AFP en el sobrenadante celular se confirmó mediante ensayos ELISA. Sin embargo, no detectamos la secreción de albúmina, probablemente debido a los bajos niveles de expresión del ARNm de albúmina (Figura 1E). Se obtuvieron resultados similares cuando las hiPSC se diferenciaron en platos recubiertos con matrigel.
En conjunto, los resultados mostraron que la LN111 es tan eficiente como matrigel para iniciar y apoyar la diferenciación hepática de hiPSC en nuestras condiciones de cultivo, pero con una matriz recombinante. Nuestro estudio amplió un estudio reciente que muestra que los platos recubiertos con LN111 permitían mantener la hiPSC en una etapa de células similares a hepatoblastos después del endodermo hiPSC y la especificación hepática en el plato recubierto con Matrigel [36]. Esto se corresponde con estudios anteriores que muestran que las HLC maduraron poco in vitro. En el día 20 - 30, nuestras HLC no secretaron albúmina, probablemente porque no realizamos el cultivo en presencia de dexametasona o DMSO que aumenta la madurez de las HLC. Las HLC altamente maduras se asemejan a los hepatocitos primarios humanos que pueden producirse si se cultivaran en cultivo en 3D o en condiciones de cocultivo de micropatrones [34, 46].
Para investigar la eficacia terapéutica, los niveles séricos de bilirrubina se monitorizaron a lo largo del tiempo después del trasplante de IDHB (día 11 de diferenciación hepática en platos recubiertos con LN111) en ratas Gunn inmunodeprimidas. Como se muestra en la Figura 2, hubo una reducción progresiva de los niveles basales de bilirrubina en el grupo tratado después del trasplante de células en el transcurso de 60 días. A partir de entonces, la disminución de la bilirrubinemia sérica persistió a un nivel de 28 ± 5 % a lo largo del estudio y fue estadísticamente significativo en comparación con los valores previos al trasplante (P < 0,05). La bilirrubina sérica en el grupo tratado fue de 57 ± 5 pM en el momento del sacrificio frente a 84 ± 11 pM para valores previos al trasplante (p = 0,005). Se observó una disminución similar de la bilirrubinemia después del trasplante de IDHB congeladas (Figura 10). A diferencia de las ratas tratadas, la bilirrubina sérica en el grupo de control no disminuyó y se mantuvo elevada con valores de hasta 150 pM. Estos resultados se confirmaron tanto para hepatocitos frescos como congelados (Figura 10). Los análisis inmunoquímicos revelaron la presencia de células que expresan UDP-glucuronosiltransferasa 1-A (UGT1A1), lo que confirma que las IDHB trasplantadas tenían la capacidad de injertarse al parénquima hepático, aunque a un nivel muy bajo (< 0,1 %) (véanse las flechas en la Figura 11). Ellas se distribuyeron por todo el parénquima hepático, y principalmente como células individuales. Esto coincide con la baja eficacia de injerto de los hepatocitos normales en el hígado de los animales, en los que no hay ventajas de crecimiento selectivo de las células trasplantadas [37, 47-50]. La mayoría de las células humanas positivas para UGT1A1 también se detectaron en el bazo y representaron aproximadamente el 1-2 % del bazo (Figura 11). No se detectaron células que expresaran AFP humana. Estos datos mostraron que el bazo promovió una mayor maduración de las IDHB en hepatocitos adultos. La histología del hígado, así como de otros órganos (no mostrados) de todos los animales fue normal. Los niveles séricos de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) (marcadores establecidos de lesión hepatocitaria) en ratas tratadas fueron de 1,59 ± 0,21 pkat/l y de 1, 07 ± 0,16 pkat/l en el día 10 posterior al trasplante, respectivamente y de 2,07 ± 0,85 pkat/l y de 0,95 ± 0,19 pkat/l en el momento del sacrificio, respectivamente. Estos valores no fueron diferentes de los valores preoperatorios (AST:2,44 ± 1 pkat/l y ALT:1,46 ± 0,75 pkat/l) o los valores de las ratas de control en el día 10 después del trasplante (AST:1,59 ± 0,12 pkat/l y ALT:1,03 ± 0,12 pkat/l) y en el momento del sacrificio (AST:1,61 ± 0,53 pkat/l y ALT:1,13 ± 0,33 pkat/l). Los valores de gamma-glutamiltransferasa también fueron normales (< 0,05 pkat/l) en estos puntos temporales. Estos resultados mostraron que el animal se recuperó bien de los procedimientos quirúrgicos. Para seguir la funcionalidad in vivo de las células humanas trasplantadas, medimos la AFP humana y la albúmina humana en sueros de animales a lo largo del tiempo. En un animal, pudimos detectar niveles significativos de AFP humana en suero (sobre el fondo del suero de las ratas de control) en el día 11 posterior al trasplante celular (16 ng/ml) y que progresivamente se hizo indetectable a partir de ese momento. En otros dos animales, pudimos detectar la aparición de albúmina humana sérica a los 5 meses después del trasplante, aunque a un nivel muy bajo (6 y 23 pg/ml). No se detectó ningún nivel detectable de albúmina humana y AFP humana en los sueros de otras ratas Gunn injertadas, probablemente debido al número muy bajo de células humanas en el hígado.
En resumen, demostramos por primera vez la eficacia de un regenerativo basado en hiPSC para el tratamiento de una enfermedad metabólica hepática hereditaria en ausencia de cualquier ventaja de crecimiento selectivo de las células trasplantadas sobre los hepatocitos de roedores residentes, que es la situación encontrada en el trasplante de hepatocitos en humanos [9]. Después del trasplante de células en ratas Gunn adultas ictéricas, demostramos una disminución significativa de larga duración en la hiperbilirrubinemia, con células humanas terapéuticas recién preparadas y congeladas. La eficacia terapéutica fue equivalente a la obtenida con la terapia génica ex vivo en la rata Gunn usando hepatocitos primarios corregidos lentiviralmente [51]. Cabe destacar que fue tan eficiente como el trasplante de hepatocitos aislados de hígados humanos recién nacidos y más alto que el de los hepatocitos aislados de hígados humanos adultos, que son las células estándar más valiosas para la terapia de células humanas para el tratamiento de la rata Gunn [61]. En el presente estudio, las hiPSC se diferenciaron en células similares a hepatoblastos que no expresaban UDP-glucuronosiltransferasa 1-A (UGT1A1) para el trasplante celular. Nuestros resultados mostraron evidencias inequívocas de que se ha producido una maduración in situ para ganar la actividad de UGT1A1, que fue máxima a las 8 semanas después del trasplante. También pudimos detectar en algunos animales la expresión transitoria de la AFP sérica y la aparición de la producción de albúmina sérica. Nuestros resultados están en consonancia con estudios previos que muestran que el hígado proporciona la diferenciación terminal de los hepatocitos inmaduros, es decir, los hepatocitos aislados del hígado fetal [52, 53]. Recientemente, se ha informado que las hiPSC especificadas en hepatoblastos diferenciados (que expresan AFP) eran capaces de diferenciarse aún más en el hígado murino, donde perdieron la expresión de AFP [14, 23, 54, 62]. Nuestro estudio indica ahora que las hiPSC especificadas en hepatoblastos eran capaces de injertarse en el hígado de otras especies y adquirieron madurez in situ a un nivel suficiente para asegurar funciones hepáticas metabólicas en el contexto de una regeneración hepática normal. Además, demostramos que el bazo también constituye un sitio adecuado para promover una mayor diferenciación en hepatocitos adultos, lo que no se informó en estudios previos con HLC.
Es importante destacar que la funcionalidad in vivo del injerto hepático por las IDHB se mantuvo durante un largo período (6 meses) sin signos de formación de tumores (carnicoma o teratoma) y lesión hepática según lo evaluado por los análisis de los parámetros histológicos y sanguíneos. Al igual que los hepatocitos primarios normales trasplantados en hígados adultos [51], las IDHB repoblaron el hígado como células individuales, lo que sugiere que respondieron a los estímulos antiproliferativos una vez terminada la regeneración del hígado y el hígado volvió a la inactividad mitótica. Además, no se observó ningún teratoma 2 meses después de la inyección directa de IDHB en los testículos, lo que confirma la ausencia de hiPSC indiferenciada residual en la preparación celular de HLC.
Finalmente, nuestro estudio también proporciona un paso crucial hacia la aplicación clínica de la hiPSC para el tratamiento de enfermedades hepáticas hereditarias, ya que hemos producido las HLC mediante un protocolo de diferenciación hepática sin suero, sin xeno y químicamente definido que cumple con los criterios de producción de las BPF. Elegimos recolectar HLC en una etapa de progenitores hepáticos (expresión de HNF4-alfa y alguna expresión de AFP) porque los progenitores hepáticos aislados de hígados fetales humanos tienen la capacidad de injertarse y migrar dentro del hígado del receptor trasplantado de manera más eficiente que los hepatocitos adultos. [55-57]. También se ha demostrado que las células endodérmicas derivadas de hiPSC tienen mayor capacidad de injerto que las células progenitoras hepáticas que expresan AFP y hepatocitos en proceso de maduración (que expresan albúmina) [31]. Por el contrario, no trasplantamos células similares al endodermo (día 5 de diferenciación) para reducir el riesgo de hiPSC residual indiferenciada o de células no totalmente diferenciadas en las preparaciones celulares finales. Loh y col. observaron que los progenitores hepáticos derivados de hiPSC no podían injertarse en hígados de neonatos murinos. Esta discrepancia con los estudios mencionados anteriormente y el nuestro puede estar relacionada con un protocolo de diferenciación hepática diferente que conduce a una capacidad de injerto diferente de las HLC producidas (por ejemplo, Loh y col. utilizaron varios inhibidores de moléculas pequeñas), para la diferenciación en el receptor del hígado (hígados de neonatos frente a hígados de adultos). Además, en nuestro estudio, se detectaron pocas IDHB en el hígado, pero esto puede deberse al hecho de que el bazo retuvo todas las IDHB en el momento de la inyección de células intraesplénicas; dicha retención de células intraesplénicas no se describió en otros estudios [60-62].
La recolección en el día 11 de la diferenciación hepática (fin de la etapa de especificación hepática) también simplificó y redujo el tiempo de cultivo y facilitará la estandarización, reproducibilidad y reducirá el coste de la producción masiva de células.
En conclusión, existe una demanda clínica de hepatocitos humanos para el tratamiento de enfermedades hepáticas hereditarias, incluida la CN-1. Los progenitores hepáticos derivados de hiPSC o de hESC, cultivados en placas recubiertas con laminina podrían ser una alternativa clínica segura a los trasplantes de hígado y hepatocitos humanos aislados de hígados cadavéricos. Aunque el estudio se centró en las terapias para la CN-1, también proporcionó un avance significativo en el tratamiento de otras enfermedades hepáticas hereditarias, como las enfermedades del ciclo de la urea. De hecho, estas enfermedades podrían tratarse con un trasplante alogénico de hepatocitos [9] y, por lo tanto, se podrían aplicar directamente al enfoque de la medicina regenerativa utilizando células madre pluripotentes humanas normales. Como el acceso a las HLC no será limitado, el trasplante de hepatocitos podría repetirse para mantener o lograr beneficios terapéuticos satisfactorios.
EJEMPLO 2: USO DE LN-521 COMO MATRIZ PARA DIFERENCIAR CÉLULAS PLURIPOTENTES EN CÉLULAS DE LINAJE HEPATOCITARIO.
Curiosamente, la laminina-521 humana recombinante (LN-521) puede sustituir la LN-111 como matriz extracelular y se lograba una mejor diferenciación de hiPSC en endodermo definitivo y HLC derivadas de hiPSC según lo evaluado por los análisis de RT-qPCR de la expresión del gen de expresión de HNF4alpha, AFP, albúmina, AAT. Por ejemplo, observamos una expresión más alta de SOX17 (endodermo) en el día 5 de diferenciación, una expresión más alta de HNF4alfa, AFP y albúmina desde el día 11 hasta el día 30, según lo evaluado por RT-qPCR basado en sybregreen (Figura 3). Estos resultados se confirmaron mediante RT-qPCR basada en Taqman para HLC derivadas de hiPSC (Figura 7) y HLC derivadas de hESC (línea celular ESI-017) (Figura 8).
Cuando se agregó CHIR 99021 durante 24 h en el día 0 del proceso de diferenciación hepática, la diferencia entre LN-521 y LN-111 es más pronunciada (Figura 8).
Curiosamente, cuando usamos una combinación de LN-521 y LN-111 (25 %/75 %), la diferenciación hepática de células madre pluripotentes (hESC) es más eficiente en comparación con LN-521 o LN-111 solos (Figura 9) . Esta mejora se observó en diferentes siembras de células (50x103, 75x103 y 100x103 células). Nuevamente, observamos que agregar CHIR 99021 mejoró la eficacia de la diferenciación hepática.
REFERENCIAS:
A lo largo de esta solicitud, varias referencias describen el estado de la técnica al que pertenece esta invención. Las descripciones de estas referencias se incorporan en esta invención como referencia a la presente descripción.
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Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para inducir la diferenciación hepática, que comprende las etapas de:
(i) cultivar una población de células pluripotentes o multipotentes humanas sobre un soporte recubierto con laminina humana en un medio de inducción de endodérmico para producir una población de células endodérmicas (ED) humanas definitivas,
y donde dicho procedimiento no comprende la sobreexpresión el transgén homeobox HEX en dicha población de células.
2. Un procedimiento para inducir la diferenciación hepática, que comprende las etapas de:
(i) cultivar una población de células endodérmicas (ED) humanas definitivas sobre un soporte recubierto con laminina humana en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatoblastos humanos, y
(ii) opcionalmente cultivar dicha población de células similares a hepatoblastos humanos sobre un soporte recubierto con laminina humana en un medio de maduración hepática para producir una población de células similares a hepatocitos, preferiblemente células similares a hepatocitos fetales humanos,
y donde dicho procedimiento no comprende la sobreexpresión el transgén homeobox HEX en dicha población de células.
3. Un procedimiento para inducir la diferenciación hepática de acuerdo con la reivindicación 1 que además comprende las etapas de:
(ii) cultivar dicha población de células ED humanas definitivas sobre un soporte recubierto con laminina humana en un medio de inducción hepática para producir una población de células similares a hepatoblastos humanos, y (iii) opcionalmente cultivar dicha población de células similares a hepatoblastos humanos sobre un soporte recubierto con laminina humana en un medio de maduración hepática para producir una población de células similares a hepatocitos, preferiblemente células similares a hepatocitos fetales humanos,
y donde dicho procedimiento no comprende la sobreexpresión el transgén homeobox HEX en dicha población de células.
4. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3, donde el medio de inducción hepática es un medio químicamente definido que comprende proteína 4 morfogenética ósea (BMP4) ) y un factor de crecimiento de la familia (FGF10 o FGF2).
5. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3, donde el medio de maduración hepática es un medio químicamente definido que comprende factor de crecimiento hepático (HGF) y oncostatina M (OSM).
6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde el medio de inducción endodérmico es un medio químicamente definido que comprende al menos activina A y opcionalmente WNT3A.
7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el medio de inducción hepática y/o el medio de inducción endodérmico comprende además un inhibidor de ROCK y/o CHIR99021.
8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la laminina humana (LN) se selecciona del grupo que consiste en laminina-111 (LN-111), laminina-211 (LN-211), laminina-332 (LN-332), laminina-411 (LN-411) ), laminina-421 (LN-421), laminina-511 (LN-511) y laminina-521 (LN-521).
9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, donde la laminina humana (LN) se selecciona del grupo que consiste en laminina humana recombinante-111 (LN-111) y laminina humana recombinante-521 (LN-521) y una mezcla de los mismos.
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