ES2688941T3 - Antagonistas del receptor 1 del factor de necrosis tumoral para tratar enfermedades respiratorias - Google Patents

Antagonistas del receptor 1 del factor de necrosis tumoral para tratar enfermedades respiratorias Download PDF

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Abstract

El uso de un dominio variable único de inmunoglobulina que es un VH, VL o VHH que tiene al menos 96% de identidad a lo largo de su longitud completa, según se determina empleando el algoritmo BLAST, con la secuencia de aminoácidos TAR 2H-131-511 (SEQ ID NO:379), y que se une a TNFR1 en tejido pulmonar, para la fabricación de una formulación para la administración local al tejido pulmonar para tratar o prevenir una enfermedad respiratoria o la inflamación pulmonar, y en el que la administración local al tejido pulmonar es mediante inhalación o administración intranasal.

Description

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descripción
Antagonistas del receptor 1 del factor de necrosis tumoral para tratar enfermedades respiratorias Antecedentes de la invención
No es posible el uso in vivo de muchos agentes con potencial terapéutico o de diagnóstico. Los agentes más grandes que tienen unas semividas en suero in vivo que son suficientemente largas para lograr la eficacia terapéutica o de diagnóstico a menudo son incapaces de penetrar en tejidos u órganos para producir un efecto terapéutico o de diagnóstico deseado en la localización deseada. Los agentes más pequeños son capaces de entrar en tejidos y órganos, pero con frecuencia tienen unas semividas en suero in vivo cortas y son rápidamente eliminados de la circulación sistémica. Por ejemplo, la semivida en suero in vivo de los monómeros de dAb es de aproximadamente 30 minutos (véanse los ejemplos 9 y 13 del documento WO 2004/081026 A2). De modo similar, la semivida en suero in vivo de fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos, en particular fragmentos Fv, también es corta y hace que no sean adecuados para muchas aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo (Peters et al., Science, 286(5439):434 (1999).) Además, la alteración o la modificación de dichos agentes para aumentar la semivida en suero in vivo puede reducir la actividad del agente.
Son necesarios métodos para administrar agentes (por ejemplo, al tejido pulmonar) para producir una ventana terapéutica extensa para el agente.
Los agentes que se unen a TNF y neutralizan su actividad han demostrado ser agentes terapéuticos eficaces para ciertos trastornos inflamatorios, tales como la artritis. Sin embargo, los agentes que se unen a TNF no han demostrado ser eficaces para tratar la inflamación pulmonar o las enfermedades respiratorias, tales como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica ("chronic obstructive pulmonary disease", COPD) (véase, por ejemplo, van der Vaart et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 172(4):465-469 (2005): Rennard et al., Proc. Amer. Thorac. Soc., 2(resumen emitido):A133, A541 (2005); Abdelhady et al., Proc. Amer. Thorac. Soc., 2(resumen emitido):A133 (2005)). Además, los agentes terapéuticos que se dirigen a TNF-alfa, tal como ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation) antagonizan a TNFrI y TNFR2, y la administración de dichos agentes puede producir inmunosupresión y efectos secundarios relacionados (por ejemplo, infecciones graves). Estos efectos secundarios pueden limitar el uso de dichos agentes, en particular para enfermedades crónicas en las que el agente se administra a lo largo de un periodo de tiempo largo (Kollias G. y Kontoyiannis D., Cytokine Growth Factor Rev., 13(4- 5):315-321 (2002)). Por contraste, los agentes que antagonizan específicamente a TNFRI tendrían menos efectos secundarios. Sin embargo, la elección de TNFRI como diana es difícil porque los agentes que hacen que el receptor se agrupe pueden activar la señalización a través del receptor, lo cual puede conducir a la producción de mediadores inflamatorios, tales como TNF. De hecho, los agentes multivalentes que se unen a TNFRi, tales como anticuerpos anti-TNFRI, pueden inducir el agolpamiento de TNFRI y la transducción de señales en ausencia de TNF, y se emplean habitualmente como agonistas de TNFRI (véase, por ejemplo, Belka et al., EMBO, 14(6):1156- 1165 (1995); Mandik-Nayak et al., J. Immunol, 167:1920-1928 (2001)). Por consiguiente, los agentes multivalentes que se unen a TNFRI en general no son antagonistas eficaces del TNFRI aunque bloqueen la unión de TNFa a
tnfri.
Son necesarios agentes mejorados que antagonicen al TNF y un método para administrar dichos agentes para tratar la inflamación pulmonar y las enfermedades pulmonares.
Sumario de la invención
La invención proporciona el uso de un dominio variable único de inmunoglobulina (dAb) que es un VH, VL o VHH que tiene al menos 96% de identidad con la secuencia de aminoácidos TAR2H-131-511 (SEQ ID NO:379) a lo largo de su longitud completa, según se determina mediante el algoritmo BLAST, que se une a una diana de TNFRI en tejido pulmonar, para la fabricación de una formulación para la administración local mediante inhalación o administración intranasal al tejido pulmonar para tratar o prevenir una enfermedad respiratoria o la inflamación pulmonar, o para la fabricación de una formulación de acción a largo plazo o de ventana terapéutica extensa para la administración local mediante inhalación o administración intranasal al tejido pulmonar para tratar o prevenir una enfermedad respiratoria, y en el que al menos 50% del nivel del agente en el tejido pulmonar se mantiene durante un periodo de al menos aproximadamente 4 horas. En ciertas realizaciones, la formulación o el medicamento es para administrar una dosis de no más de aproximadamente 10 mg/kg/día.
La invención se refiere al uso de dicho anticuerpo de dominio (dAb), en el que la administración local es mediante inhalación o administración intranasal. La invención también se refiere a un uso en el que la administración mediante inhalación se realiza mediante el uso de un nebulizador o un inhalador.
La invención se refiere al uso de dicho anticuerpo de dominio (dAb), en el que la formulación es para la administración local al tejido pulmonar, y no entra sustancialmente en la circulación sistémica. En una realización, se emplean hasta aproximadamente 10 mg de un dAb que se une a una diana en el tejido pulmonar.
La invención se refiere a un uso, en el que se emplea un inhalador o un dispositivo de administración intranasal para proporcionar una dosis controlada de una formulación de un anticuerpo de dominio (dAb) a un sujeto para el
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tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno respiratorio, en el que el inhalador o el dispositivo de administración intranasal proporciona una dosis diaria controlada que contiene hasta 10 mg del dAb. La invención también se refiere al uso de una formulación de un anticuerpo de dominio (dAb) para la fabricación de un inhalador o un dispositivo de administración intranasal para proporcionar una formulación de dAb inhalada de acción a largo plazo para la administración local al pulmón.
El agente para su uso en la invención se une a una diana de TNFR1 en el tejido pulmonar.
La invención también se refiere al uso de dicho dominio variable único de inmunoglobulina (dAb) que se une a TNFR1 para su uso en la fabricación de un medicamento para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad respiratoria, que es la inflamación pulmonar, COPD o asma, mediante la administración mediante inhalación o administración intranasal.
La descripción se refiere a métodos para tratar, suprimir o prevenir la inflamación pulmonar y/o una enfermedad respiratoria que comprenden seleccionar un antagonista del receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1) que es eficaz en un modelo animal adecuado de enfermedad respiratoria cuando se administra en una cantidad que no es mayor que aproximadamente 10 rng/kg/día, en los que existe eficacia en dicho modelo animal cuando la infiltración celular de los pulmones, según se evalúa mediante el recuento total de células en un lavado broncoalveolar, es inhibida con relación a un control sin tratar con p < 0,05; y administrar (por ejemplo, administrar localmente al tejido pulmonar) una cantidad eficaz de dicho antagonista de TNFR1 a un sujeto que lo necesite.
La descripción también describe enfermedades que pueden tratarse, suprimirse o prevenirse empleando los medicamentos, las formulaciones y los métodos descritos en la presente, que incluyen inflamación pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, neumonía, neumonitis de hipersensibilidad, infiltrados pulmonares con eosinofilia, enfermedad pulmonar ambiental, neumonía, bronquiectasia, fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar primaria, tromboembolia pulmonar, trastornos de la pleura, trastornos del mediastino, trastornos del diafragma, hipoventilación, hiperventilación, apnea del sueño, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, mesotelioma, sarcoma, rechazo de injertos, enfermedad del injerto frente al receptor, cáncer pulmonar, rinitis alérgica, alergia, asbestosis, aspergiloma, aspergilosis, bronquiectasia, bronquitis crónica, enfisema, neumonía eosinófila, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pneumocócica invasiva, gripe, micobacterias no tuberculosas, efusión pleural, neumoconiosis, neumocitosis, neumonía, actinomicosis pulmonar, proteinosis alveolar pulmonar, ántrax pulmonar, edema pulmonar, embolia pulmonar, inflamación pulmonar, histiocitosis pulmonar X, hipertensión pulmonar, nocardiosis pulmonar, tuberculosis pulmonar, enfermedad venooclusiva pulmonar, enfermedad pulmonar reumatoide, sarcoidosis, granulomatosis de Wegener, y carcinoma pulmonar no microcítico.
La descripción también se refiere a un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica cualquiera de los ligandos de la invención.
La descripción también se refiere a una célula hospedante que comprende el ácido nucleico recombinante de la invención o el vector de la invención.
La descripción también se refiere a un método para producir un ligando, que comprende mantener una célula hospedante de la invención bajo condiciones adecuadas para la expresión de un ácido nucleico o un vector de la invención, por lo cual se produce un ligando. En otras realizaciones, el método para producir un ligando comprende además aislar el ligando.
Breve descripción de Ios dibujos
La figura 1 es una gráfica que demuestra que un antagonista de TNFR1 es más eficaz en comparación con otros agentes terapéuticos cuando se administra localmente al tejido pulmonar en un modelo subcrónico de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) inducida por el humo del tabaco (TS) en ratones C57BL/6. La gráfica muestra el número de células presente en el lavado broncoalveolar (BAL) de ratones al finalizar el estudio descrito en el ejemplo 1. Se muestran los puntos de datos individuales para cada ratón en el estudio y los promedios de grupo (promedios: líneas horizontales). Los resultados demuestran que el monómero de dAb anti-TNFRI (Doml) administrado localmente al pulmón mediante administración intranasal reduce el número de células en el BAL en 72% comparado con el grupo sin tratar. Los resultados también demuestran que la administración local al pulmón de un agente terapéutico que se dirige a TNF (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)) no produce un efecto estadísticamente significativo sobre el número de células en el Bal. Los resultados demuestran además que el monómero de dAb anti-TNFRI (Doml) administrado localmente al pulmón mediante administración intranasal es más eficaz para reducir el número de células en el BAL que un inhibidor de fosfodiesterasa 4 (PDE4I, BAY 19-8004) que se administra a una dosis alta de 10 mg/kg por vía oral dos veces diarias (b i.d ). TS, inducido por el humo del tabaco; Veh, vehículo; ns, no estadísticamente significativo.
La figura 2 es una gráfica que demuestra que un antagonista de TNFR1 es más eficaz en comparación con un agente terapéutico que se dirige a TNF cuando se administra sistémicamente en un modelo subcrónico de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) inducida por el humo del tabaco (TS) en ratones C57BL/6. La gráfica muestra el número de células presente en el BAL de ratones al finalizar el estudio descrito en el ejemplo 2. Se muestran los puntos de datos individuales para cada ratón en el estudio y los promedios de grupo (líneas
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horizontales). Los resultados demuestran que el monómero de dAb anti-TNFRI PEGilado (TNFR1) administrado sistémicamente mediante administración intraperitoneal reduce el número de células en el BAL en 60% comparado con el grupo sin tratar. Los resultados demuestran además que la administración sistémica de un agente terapéutico que se dirige a TNF (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)) produce un aumento en 12% del número de células en el BAL, aunque este aumento no es estadísticamente significativo. TS, inducido por el humo del tabaco; Veh, vehículo; ns, no estadísticamente significativo; i.p., intraperitoneal.
La figura 3 es un histograma en el que los datos para ciertos grupos que aparecen en las figuras 1 y 2 se vuelven a representar Junto con los resultados de un estudio en el que se administró un esteroide oral (dexametasona) en el modelo. El histograma demuestra que la administración local de un monómero de dAb anti-TNFRI (DOM/ADS1O1- nativo (Doml en la figura 1)) al pulmón mediante administración intranasal (1 mg/kg administrado una vez diaria (q.d.)) y la administración sistémica de un monómero de dAb anti-TNFRI PEGilado (DOM/ADSIOI-pegilado (TNFR1 en la figura 2)) mediante administración intraperitoneal (10 mg/kg administrados una vez cada dos días (q.a.d.)) son más eficaces en el modelo que un inhibidor de fosfodiesterasa 4 (PDE4I) que se administró a una dosis alta (10 mg/kg administrados por vía oral dos veces diarias (b.i.d.)). El histograma también demuestra que el esteroide administrado por vía oral (0,3 mg/kg administrados por vía oral dos veces diarias) aumenta el número de células en el BAL y, por tanto, no resulta eficaz en el modelo.
Las figuras 4A y 4B son histogramas que muestran los recuentos de células diferenciales para macrófagos (4A) o neutrófilos (4B) en el BAL para ciertos grupos de estudio que aparecen en las figuras 1 y 2. La figura 4A demuestra que la administración local de un monómero de dAb anti-TNFRI (DOM/ADSIOI-nativo (Doml en la figura 1)) al pulmón mediante administración intranasal (1 mg/kg administrado una vez diaria (q.d.)) y la administración sistémica de un monómero de dAb anti-TNFRI PEGilado (DOM/ADSIOI-pegilado (TNFR1 en la figura 2)) mediante administración intraperitoneal (10 mg/kg administrados una vez cada dos días (q.a.d.)) son más eficaces para reducir el número de macrófagos en el BAL que un inhibidor de fosfodiesterasa 4 (PDE4l) que se administró a una dosis alta (10 mg/kg administrados por vía oral dos veces diarias (b.i.d.)). De modo similar, la figura 4B demuestra que la administración local de un monómero de dAb anti-TNFRI (DOM/ADSIOI-nativo (Doml en la figura 1)) al pulmón mediante administración intranasal (1 mg/kg administrado una vez diaria (q.d.)) y la administración sistémica de un monómero de dAb anti-TNFRI PEGilado (DOM/ADSIOI-pegilado (TNFR1 en la figura 2)) mediante administración intraperitoneal (10 mg/kg administrados una vez cada dos días (q.a.d.)) son más eficaces para reducir el número de neutrófilos en el BAL que un inhibidor de fosfodiesterasa 4 (PDE4I) que se administró a una dosis alta (10 mg/kg administrados por vía oral dos veces diarias (b.i.d.)).
La figura 5 es una gráfica que muestra los resultados del estudio farmacocinético de un agente que se une a TNFR1 (DOMIm (TAR2iti21-23)) tras la administración local al tejido pulmonar mediante administración intranasal (véase el ejemplo 3). La gráfica demuestra que los niveles de DOMIm en tejido pulmonar permanecen relativamente constantes durante al menos 8 horas después de la administración, mientras que los niveles en BAL disminuyen gradualmente, y los niveles en suero disminuyen rápidamente y fueron indetectables después de 5 horas. Los niveles máximos de DOMIm en el BAL y en el suero se detectaron 1 hora después de la administración (aproximadamente 14 pg/ml en el BAL, aproximadamente 15O ng/ml en el suero). Los niveles en el BAL permanecieron altos durante un periodo de tiempo prolongado y gradualmente disminuyeron a lo largo de 24 horas (disminución > 10 veces después de 24 horas). Los niveles en suero disminuyeron rápidamente y el DOMIm ya no fue detectable en el suero después de 5 horas. Los niveles de DOM1 en el tejido pulmonar permanecieron relativamente constantes durante al menos 8 horas después de la administración, y fueron indetectables 24 horas después de la administración.
Las figuras 6A-6V muestran las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO:1-198) de varios dominios variables de inmunoglobulina humana que presentan especificidad de unión por el TNFR1 humano. Las secuencias de aminoácidos presentadas son continuas sin huecos; el símbolo ~ se ha insertado en las secuencias para indicar las localizaciones de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). La CDR1 está flanqueada por ~, la CDR2 está flanqueada por —, y la CDR3 está flanqueada por------.
Las figuras 7A-7B muestran las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO:199-211) de varios dominios variables de inmunoglobulina humana que presentan especificidad de unión por el TNFR1 de ratón. Las secuencias de aminoácidos presentadas son continuas sin huecos; el símbolo ~ se ha insertado en las secuencias para indicar las localizaciones de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). La CDR1 está flanqueada por ~, la CDR2 está flanqueada por —, y la CDR3 está flanqueada por------.
La figura 8A muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:212) que codifica el dominio extracelular del TNFR1 humano (Homo sapiens).
La figura 8B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:213) del dominio extracelular del TNFR1 humano (Homo sapiens).
La figura 9A muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:214) que codifica el dominio extracelular del TNFR1 de ratón (Mus musculus).
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La figura 9B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:215) del dominio extracelular del TNFR1 de ratón (Mus musculus).
Las figuras 10A-10Q muestran las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO:216-221) de varios dominios variables de inmunoglobulina humana que presentan especificidad de unión por el TNFR1 de ratón, y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO:222-433) de varios dominios variables de inmunoglobulina humana que presentan especificidad de unión por el TNFR1 humano. Las secuencias de aminoácidos presentadas son continuas sin huecos; el símbolo ~ se ha insertado en las secuencias para indicar las localizaciones de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). La CDR1 está flanqueada por ~, la CDR2 está flanqueada por —, y la CDR3 está flanqueada por------.
Las figuras 11A y 11B son gráficas que muestran los aumentos dependientes del tiempo de la concentración de TNFa en lavado broncoalveolar (Bal) (figura 11A) o tejido pulmonar (figura 11B) tras la administración intranasal (i.n.) de TNFa murino (1 mg/ratón) una hora después de la administración (i.n.) de vehículo o de dAb anti-TNFRI (1 mg/kg).
La figura 12 es una gráfica que muestra los aumentos dependientes del tiempo de neutrófilos de BAL tras la administración i.n. de TNFa murino (1 pg/ratón) una hora después de la preadministración (i.n.) de vehículo o de dAb anti-TNFRI (1 mg/kg). La preadministración del dAb anti-TNFRI inhibe parcialmente el aumento en los neutrófilos inducido por el TNFa.
Las figuras 13A-13D son gráficas que muestran los efectos dependientes del tiempo de TNFa murino sobre los niveles de BAL KC (13a), Ios niveles de BAL MIP-2 (13b), Ios niveles de BAL MCP-1 (13c), o Ios niveles de E- selectina en tejido pulmonar (13D). La administración del dAb anti-TNFRI inhibe significativamente Ios aumentos inducidos por la TNFa.
Las figuras 14A-14Z y 14A2-14J2 muestran las secuencias de nucleótidos de varios ácidos nucleicos que codifican dominios variables de inmunoglobulina humana que presentan especificidad de unión por el TNFR1 humano (SEQ ID NO:434-644), y las secuencias de nucleótidos de varios ácidos nucleicos que codifican dominios variables de inmunoglobulina humana que presentan especificidad de unión por el TNFR1 de ratón (SEQ ID NO:645-650). Las secuencias presentadas son continuas sin huecos; el símbolo ~ se ha insertado en las secuencias para indicar las localizaciones que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). La CDR1 está flanqueada por ~, la CDR2 está flanqueada por —, y la CDR3 está flanqueada por------.
Descripción detallada de la invención
Tal como se emplea en la presente, el término "antagonista" se refiere a un agente (por ejemplo, una molécula, un compuesto) que se une a una diana (por ejemplo, una proteína de receptor) y puede inhibir una función (concretamente, una o más funciones) de la diana. Por ejemplo, un antagonista de una proteína de receptor puede unirse a la proteína de receptor e inhibir la unión de un ligando natural o cognado a la proteína de receptor y/o inhibir la transducción de señales mediada a través de la proteína de receptor. Por ejemplo, Ios antagonistas del receptor 1 del factor de necrosis tumoral "TNFR1" pueden unirse a TNFR1 e inhibir la unión de TNFa a TNFR1 y/o inhibir la transducción de señales mediada a través de TNFR1. Los antagonistas pueden identificarse, por ejemplo, seleccionando bancos o colecciones de moléculas, tales como the Chemical Repository of the National Cáncer Institute, o empleando otros métodos adecuados. Los antagonistas preferidos son "ligandos" según se describen en la presente.
Tal como se emplea en la presente, la expresión "antagonista del receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1)" se refiere a un agente (por ejemplo, una molécula, un compuesto) que se une a TNFR1 y puede inhibir una función (concretamente, una o más funciones) de TNFR1. Por ejemplo, un antagonista de TNFR1 puede inhibir la unión de TNFa a TNFR1 y/o inhibir la transducción de señales mediada a través de TNFR1. Por consiguiente, las respuestas celulares y Ios procesos mediados por TNFR1 (por ejemplo, muerte celular inducida por TNFa en un ensayo de citotoxicidad de L929 convencional) pueden ser inhibidos con un antagonista de TNFR1. Un antagonista de TNFR1 puede ser, por ejemplo, una molécula orgánica pequeña, un producto natural, una proteína, un péptido o un peptidomimético. Los antagonistas de TNFR1 pueden identificarse, por ejemplo, seleccionando bancos o colecciones de moléculas, tales como the Chemical Repository of the National Cáncer Institute, como se describe en la presente, o empleando otros métodos adecuados. Los antagonistas preferidos de TNFR1 son anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos, ligandos y monómeros de dAb.
Tal como se emplea en la presente, el término "ligando" se refiere a un polipéptido que comprende un dominio que presenta especificidad de unión por una diana deseada. Preferiblemente, el dominio de unión es un dominio variable único de inmunoglobulina (por ejemplo, Vh, Vl, Vhh) que presenta especificidad de unión por un antígeno diana deseado (por ejemplo, una proteína de receptor). El dominio de unión también puede comprender una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un dominio variable único de inmunoglobulina que presenta especificidad de unión por un antígeno diana deseado en un formato adecuado, de modo que el dominio de unión presenta especificidad de unión por el antígeno diana. Por ejemplo, las CDR pueden injertarse en un esqueleto o andamiaje de proteína adecuado, tal como un aficuerpo, un andamiaje de SpA, un dominio de clase A
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de un receptor de LDL o un dominio de EGF. Además, el ligando puede ser monovalente (por ejemplo, un monómero de dAb), bivalente (homobivalente, heterobivalente) o multivalente (homomultivalente, heteromultivalente), tal como se describe en la presente. Así, Ios "ligandos" incluyen polipéptidos que consisten en un dAb, incluyen polipéptidos que consisten fundamentalmente en dicho dAb, polipéptidos que comprenden un dAb (o las CDR de un dAb) en un formato adecuado, tal como un formato de anticuerpo (por ejemplo, un formato similar a IgG, scFv, Fab, Fab', F(ab')2) o un esqueleto o andamiaje de proteína adecuados, tal como un aficuerpo, un andamiaje de SpA, un dominio de clase A de un receptor de LDL o un dominio de EGF, ligandos específicos duales que comprenden un dAb que se une a una primera proteína diana, antígeno o epitopo (por ejemplo, TNFR1) y un segundo dAb que se une a otra proteína diana, antígeno o epitopo (por ejemplo, albúmina del suero), y ligandos multiespecíficos, tal como se describe en la presente. El dominio de unión también puede ser un dominio de proteína que comprende un sitio de unión para una diana deseada, por ejemplo, un dominio de proteína seleccionado de un aficuerpo, un dominio de SpA, un dominio de clase A de un receptor de LDL, un dominio de EGF, un avímero (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitudes de patente de EE. UU. n.os 2005/0053973, 2005/0089932, 2005/0164301).
La expresión "dominio variable único de inmunoglobulina" se refiere a una región variable de anticuerpo (Vh, Vhh, Vl) que se une específicamente a un antígeno o un epitopo independientemente de otros dominios o regiones V; sin embargo, tal como se emplea la expresión en la presente, un dominio variable único de inmunoglobulina puede estar presente en un formato (por ejemplo, homo- o heteromultímero) con otro u otros dominios variables o regiones variables, en el que las otras regiones o dominios no son necesarios para la unión al antígeno del dominio variable único de inmunoglobulina (es decir, el dominio variable único de inmunoglobulina se une al antígeno independientemente de Ios dominios variables adicionales). Un "dominio variable único de inmunoglobulina" incluye no solo un polipéptido de dominio variable único de anticuerpo aislado, sino también polipéptidos más grandes que comprenden uno o más monómeros de una secuencia de polipéptido de dominio variable único de anticuerpo. Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" es igual a un polipéptido de "dominio variable único de inmunoglobulina", tal como se emplea el término en la presente. Un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina, tal como se emplea en la presente, se refiere a un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina de mamífero, preferiblemente humano, pero también incluye de roedores (por ejemplo, tal como se describe en el documento WO 00/29004, cuyos contenidos se incorporan en la presente como referencia en su totalidad) o Vhh de dAb de camélido. Los dAb de camélido son polipéptidos de dominio variable único de inmunoglobulina que se derivan de especies que incluyen el camello, la llama, la alpaca, el dromedario y el guanaco, y comprenden anticuerpos de cadena pesada naturalmente exentos de cadenas ligeras: Vhh. Las moléculas de Vhh son aproximadamente diez veces más pequeñas que las moléculas de IgG, y como polipéptidos individuales, son muy estables, resistiendo condiciones extremas de pH y temperatura.
Tal como se emplea en la presente, el término "dosis" se refiere a la cantidad de agente (por ejemplo, antagonista de TNFR1) administrada a un sujeto de una sola vez (dosis unitaria), o en dos o más administraciones a lo largo de un intervalo de tiempo definido. Por ejemplo, una dosis puede referirse a la cantidad de agente (por ejemplo, antagonista de TNFR1) administrada a un sujeto en el transcurso de un día (24 horas) (dosis diaria), dos días, una semana, dos semanas, tres semanas o uno o más meses (por ejemplo, a través de una única administración, o a través de dos o más administraciones). El intervalo entre las dosis puede ser cualquier cantidad de tiempo deseada.
Tal como se emplea en la presente, la expresión "ventana terapéutica" se refiere al intervalo de concentraciones del fármaco (por ejemplo, antagonista, ligando, monómero de dAb) en el plasma, o en un tejido o un órgano (por ejemplo, tejido pulmonar, pulmón) al cual se administra localmente el fármaco, que dan como resultado una alta probabilidad de eficacia terapéutica.
"Anticuerpo": Un anticuerpo (por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD o IgE) o un fragmento (tal como Fab , F(ab')2, Fv, Fv unido con disulfuro, scFv, anticuerpo multiespecífico de conformación cerrada, scFv unido con disulfuro, diacuerpo) derivado de cualquier especie que produce de modo natural un anticuerpo, o creado mediante la tecnología del ADN recombinante, o aislado a partir de suero, células B, hibridomas, transfectomas, levaduras o bacterias.
"Antígeno": Una molécula que es unida por un ligando según la presente invención. Generalmente, Ios antígenos son unidos por ligandos de anticuerpo y son capaces de suscitar una respuesta de anticuerpos in vivo. Puede ser un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico u otra molécula. En general, Ios ligandos de especificidad dual según la invención se seleccionan por su especificidad de diana contra un antígeno concreto. En el caso de anticuerpos convencionales y sus fragmentos, el sitio de unión del anticuerpo definido por Ios bucles variables (L1, L2, L3 y H1, H2, H3) es capaz de unirse al antígeno.
"Epitopo": Una unidad de estructura unida convencionalmente por una pareja Vh/Vl de inmunoglobulina. Los epitopos definen el sitio de unión mínimo para un anticuerpo y, así, representan la diana de especificidad de un anticuerpo. En el caso de un anticuerpo de dominio único, un epitopo representa la unidad de estructura unida por un dominio variable aislado.
"Marco universal": Una secuencia de marco de un solo anticuerpo que se corresponde con las regiones de un anticuerpo conservado en su secuencia según define Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services) o que se corresponde con la estructura o el repertorio de
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inmunoglobulinas de línea germinal humanas, según definen Chothia y Lesk (1987), J. MoI. BIoI., 196:910-917. La invención proporciona el uso de un único marco, o un conjunto de dichos marcos, que se ha descubierto que permite derivar casi cualquiera especificidad de unión a través de la variación únicamente en las regiones hipervariables.
"Semivida": El tiempo que tarda la concentración en suero de ligando en reducirse en 50%, in vivo, por ejemplo, debido a la degradación del ligando y/o la eliminación o secuestro del ligando por mecanismos naturales. Los ligandos de la invención se estabilizan in vivo y su semivida aumenta mediante la unión a moléculas que resisten la degradación y/o la eliminación o el secuestro. Generalmente, dichas moléculas son proteínas naturales que, en sí mismas, tienen una semivida larga in vivo. La semivida de un ligando aumenta si su actividad funcional persiste, in vivo, durante un periodo de tiempo más largo que un ligando similar que no es específico para la molécula que aumenta la semivida. Así, un ligando específico para HSA y una molécula diana se comparan con el mismo ligando en el que la especificidad para HSA no está presente, que no se une a HSA sino que se une a otra molécula. Por ejemplo, puede unirse a un segundo epitopo sobre la molécula diana. Generalmente, la semivida aumenta en 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más. Son posibles unos aumentos en la línea de 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x o más. Como alternativa, o además, son posibles unos aumentos de hasta 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x de la semivida.
"Sustancialmente idénticos" (o "sustancialmente homólogos"): Una primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que contiene un número suficiente de restos aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservadas) con una segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos, de modo que la primera y segunda secuencias de aminoácidos o de nucleótidos tienen actividades similares. En el caso de Ios anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad de unión y tiene al menos 50% de la afinidad del primero.
Tal como se emplean en la presente, las expresiones "baja rigurosidad", "rigurosidad intermedia", "alta rigurosidad" o "rigurosidad muy alta" describen condiciones para la hibridación y el lavado de ácidos nucleicos. Puede encontrarse una guía para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, que se Incorpora como referencia en la presente en su totalidad. En esa referencia se describen métodos acuosos y no acuosos, y cualquiera de Ios dos puede utilizarse. Las condiciones de hibridación específicas mencionadas en la presente son las siguientes: (1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de dos lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% al menos a 50 °C (la temperatura de Ios lavados puede aumentar hasta 55 °C para las condiciones de baja rigurosidad); (2) condiciones de hibridación de rigurosidad intermedia en 6X SSC a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 60 °C; (3) condiciones de hibridación de alta rigurosidad en 6X SSC a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65 °C; y preferiblemente (4) condiciones de hibridación de rigurosidad muy alta, que son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7% a 65 °C, seguido de uno o más lavados a 0,2X SSC, SDS al 1% a 65 °C. Las condiciones de rigurosidad muy alta (4) son las condiciones preferidas y las que deben utilizarse a menos que se especifique lo contrario.
Tal como se menciona en la presente, el término "compite" significa que la unión de un primer epitopo a su dominio de unión al epitopo cognado es inhibida cuando un segundo epitopo se une a su dominio de unión al epitopo cognado. Por ejemplo, la unión puede inhibirse estéricamente, por ejemplo, mediante el bloqueo físico de un dominio de unión o mediante la alteración de la estructura o el entorno de un dominio de unión, de modo que se reduce su afinidad o avidez por un epitopo.
Las secuencias similares u homólogas con al menos 96% de identidad de secuencia a lo largo de la longitud completa, según se determina mediante el algoritmo BLAST, con la secuencia TAR 2H-131-511 descrita en la presente también son parte de la Invención. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia al nivel de aminoácidos puede ser de aproximadamente 97%, 98%, 99% o mayor.
Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" o "similitud" entre dos secuencias (las expresiones se emplean de modo intercambiable en la presente) se realizan como sigue. Las secuencias se alinean con la finalidad de una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo, y las secuencias no homólogas pueden obviarse con fines comparativos). Entonces se comparan Ios restos aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia es ocupada por el mismo resto aminoácido o nucleótido en la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces se considera que las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se emplea en la presente, la "homología" de aminoácidos o de ácidos nucleicos es equivalente a la "identidad" de aminoácidos o de ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que debe introducirse para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.
Los alineamientos de secuencias de aminoácidos y nucleótidos y la homología, la similitud o la identidad, tal como se definen en la presente, se preparan y se determinan preferiblemente empleando las secuencias del algoritmo BLAST 2, usando Ios parámetros por defecto (Tatusova, T. a. et al., FEMS Microbiol. Lett., 174:187-188 (1999)). Como alternativa, de modo ventajoso se emplea el algoritmo BLAST (versión 2.0) para el alineamiento de las
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secuencias, con Ios parámetros ajustados a Ios valores por defecto. El algoritmo BLAST se describe en detalle en el sitio web de la red mundial ("www") de the National Center for Biotechnology Information (".ncbi") de the National Institutes of Health ("nih") del gobierno de EE. UU. (".gov"), en el directorio "/Blast/", en el archivo "blast_help.html". Los parámetros de búsqueda se definen como sigue, y de modo ventajoso se ajustan a Ios parámetros por defecto definidos.
BLAST ("Basic Local Alignment Search TooI", herramienta de búsqueda de alineamientos locales básicos) es el algoritmo de búsqueda heurístico empleado por Ios programas blastp, blastn, blastx, tblastn, y tblastx; estos programas atribuyen significancia a sus descubrimientos empleando Ios métodos estadísticos de Karlin y AltschuI, 1990, Proc. Nati. Acad. Scí. USA, 87(6):2264-2268 (véase el archivo "blast_help.html", tal como se describió anteriormente) con unas cuantas mejoras. Los programas BLAST se adaptaron para la búsqueda de similitudes de secuencia, por ejemplo, para identificar homólogos de una secuencia problema. En general, Ios programas no son útiles para la búsqueda de motivos. Para un análisis de las cuestiones básicas de la búsqueda de similitud en bases de datos de secuencias, véase AltschuI et al. (1994). Los cinco programas BLAST disponibles en el sitio web de the National Center for Biotechnology Information realizan las siguientes tareas:
"blastp" compara una secuencia de aminoácidos problema con una base de datos de secuencias de proteínas;
"blastn" compara una secuencia de nucleótidos problema con una base de datos de secuencias de nucleótidos;
"blastx" compara Ios productos de la traducción conceptual de seis marcos de una secuencia de nucleótidos problema (ambas hebras) con una base de datos de secuencias de proteínas;
"tblastn" compara una secuencia de proteína problema con una base de datos de secuencias de nucleótidos traducidas dinámicamente en Ios seis marcos de lectura (ambas hebras);
"tblastx" compara las traducciones de seis marcos de una secuencia de nucleótidos problema con las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleótidos. BLAST emplea Ios siguientes parámetros de búsqueda:
HISTOGRAMA. Muestra un histograma de puntuaciones para cada búsqueda; el defecto es sí (véase el parámetro H en el manual de BLAST).
DESCRIPCIONES. Limita el número de descripciones cortas de secuencias correspondientes indicadas al número especificado; el límite por defecto es de 100 descripciones (véase el parámetro V en el manual de BLAST). Véase también ESPERADO y CORTE.
ALINEAMIENTOS. Limita las secuencias de la base de datos al número especificado para el cual se indican las parejas de segmentos de puntuación alta ("high-scoring segment pairs", HSP); el límite por defecto es de 50. Si un número mayor de secuencias de la base de datos están dentro del umbral de significancia estadística para su indicación (véase ESPERADO y CORTE a continuación), solo se indican las correspondencias a las que se atribuye la mayor significancia estadística (véase el parámetro B en el manual de BLAST).
ESPERADO. El umbral de significancia estadística para indicar correspondencias frente a secuencias de la base de datos; el valor por defecto es 10, de modo que se esperan 10 equivalencias simplemente por azar, según el modelo estocástico de Karlin y AltschuI (1990). Si la significancia estadística atribuida a una correspondencia es mayor que el umbral de ESPERADO, la correspondencia no será indicada. Unos umbrales de ESPERAdO más bajos son más rigurosos, e indican menos correspondencias por azar. Se aceptan valores fraccionarios (véase el parámetro E en el manual de BLAST).
CORTE. Puntuación de corte para indicar las parejas de segmentos de alta puntuación. El valor por defecto se calcula a partir del valor de ESPERADO (véase anteriormente). Se indican las HSP para una secuencia de la base de datos solo si la significancia estadística atribuida a ellas es al menos tan alta como la que se atibuiría si una única HSP tuviese una puntuación igual al valor de CORTE. Unos valores de CORTE mayores son más rigurosos e indican menos correspondencias por azar (véase el parámetro S en el manual de BlAST). Generalmente, Ios umbrales de significancia pueden gestionarse de modo más intuitivo empleando ESPERADO.
MATRIZ. Especifica una matriz de puntuación alternativa para BLASTP, BLASTX, TBLASTN y TBLASTX. La matriz por defecto es BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff, 1992, Proc. Nati. Aacad. Scí. USA, 89(22):10915-10919). Las alternativas válidas incluyen: PAM40, PAM120, PAM250 e IDENTIDAD. No existen matrices de puntuación alternativas para BLASTN; sí se específica el directorio MATRIZ en Ios ensayos BLASTN se obtiene una respuesta de error.
HEBRA. Limita una búsqueda de TBLASTN soIo a la hebra superior o inferior de las secuencias de la base de datos; o limita una búsqueda de BLASTN, BLASTX o TBLASTX soIo a Ios marcos de lectura de la hebra superior o inferior de la secuencia problema.
FILTRO. Esconde Ios segmentos de la secuencia problema que tienen baja complejidad de composición, según se
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determina mediante el programa SEG de Wootton y Federhen (1993), Computers and Chemistry, 17:149-163, o Ios segmentos que consisten en repeticiones internas de periodicidad corta, según se determina mediante el programa XNU de Claverie y States, 1993, Computers and Chemistry, 17:191-201, o, para BLASTN, mediante el programa DUST de Tatusov y Lipman (véase el sitio web de la red mundial del NCBI). El filtrado puede eliminar Ios informes estadísticamente significativos, pero poco interesantes desde el punto de vista biológico, de Ios resultados de blast (por ejemplo, aciertos frente a regiones comunes ácidas, básicas o ricas en prolina), dejando disponibles las regiones más interesantes desde el punto de vista biológico de la secuencia problema para el apareamiento específico frente a secuencias de bases de datos.
Una secuencia de baja complejidad encontrada por un programa de filtro es sustituida empleando la letra "N" en una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, "N" repetida 13 veces) y la letra "X" en secuencias de proteínas (por ejemplo, "X" repetida 9 veces).
El filtrado solo se aplica a la secuencia problema (o sus productos de la traducción), no a las secuencias de la base de datos. El filtrado por defecto es DUST para BLASTN, SEG para otros programas.
No es raro que SEG, XNU, o ambos, no escondan nada cuando se aplican a secuencias en SWISS-PROT, así que no debe esperarse que el filtrado produzca siempre un efecto. Además, en algunos casos, las secuencias se esconden en su totalidad, lo cual indica que debe sospecharse de la significancia estadística de cualquiera de las correspondencias indicadas frente a la secuencia problema sin filtrar.
NCBI-gi: Hace que Ios identificadores NCBI gi aparezcan en el resultado, además del número de registro y/o Iocus. Lo más preferiblemente, las comparaciones de secuencias se realizan empleando el algoritmo de búsqueda BLAST simple obtenido en el sitio web de la red mundial del NCBI descrito anteriormente, en el directorio "/BLAST".
A menos que se indique lo contrario, todos Ios términos y expresiones técnicos y científicos empleados en la presente tienen el mismo significado que el que entienden habitualmente Ios expertos en la técnica (por ejemplo, en cultivos celulares, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridación y bioquímica). Se emplean técnicas convencionales para Ios métodos moleculares, genéticos y bioquímicos (véase, en general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4a ed., John Wiley & Sons, Inc.) y para Ios métodos químicos.
Tal como se describe en la presente, se realizó un estudio en el que un antagonista de TNFR1, que consiste fundamentalmente en un monómero de dAb que se une a TNFR1, se administra en un modelo subcrónico de ratón de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) inducida por el humo del tabaco. Los resultados del estudio revelan que Ios antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, que comprenden un anticuerpo de dominio (dAb) que se une a TNFR1) son agentes terapéuticos eficaces para tratar enfermedades respiratorias (por ejemplo, la inflamación en el pulmón, la enfermedad pulmonar aguda, enfermedades pulmonares crónicas (por ejemplo, COPD)). De hecho, Ios antagonistas ensayados en el estudio fueron más eficaces que una dosis alta de un inhibidor de fosfodiesterasa 4 o TNFR1 soluble (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)) que se une y neutraliza el TNFa. Los antagonistas de TNFR1 estudiados fueron eficaces en el modelo cuando se administran sistémicamente (inyección intraperitoneal) o de modo local al tejido pulmonar mediante administración intranasal.
De modo sorprendente, Ios resultados del estudio demuestran que la administración local de un antagonista que se une a una diana en tejido pulmonar (por ejemplo, TNFR1) es más eficaz para inhibir la infiltración celular de Ios pulmones en el modelo, que la administración sistémica de un antagonista de semivida larga (monómero de dAb PEGilado, se PEGÍIó para aumentar el tamaño hidrodinámico y la semivida en suero in vivo del monómero de dAb), aunque se administró cinco veces más antagonista sistémicamente. En términos molares, se administró sistémicamente 2,5 veces más el antagonista de semivida larga (monómero de dAb PEGilado, se PEGÍIó para aumentar el tamaño hidrodinámico y la semivida en suero in vivo del monómero de dAb), comparado con el monómero de dAb administrado localmente.
Tal como se describe en la presente, se realizó otro estudio farmacocinético de un monómero de dAb que se une a TNFR1 tras la administración local al tejido pulmonar mediante administración intranasal. Los resultados del estudio revelan que, tras la administración local al tejido pulmonar, el monómero de dAb presenta un tiempo de residencia en el pulmón más largo, y que la cantidad de monómero de dAb en el pulmón se mantuvo sustancialmente constante a lo largo de un periodo de ocho horas. Además, la administración local del monómero de dAb al pulmón dio como resultado una presencia breve de tan solo una concentración baja de monómero de dAb en el suero. De modo específico, se detectó un nivel máximo de aproximadamente 150 ng/ml en el suero 1 hora después de la administración, y no se detectó monómero de dAb en el suero después de 5 horas.
Estos resultados del estudio farmacocinético son sorprendentes y demuestran que un agente que se une a una diana en tejido pulmonar, tal como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a una diana en tejido pulmonar (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv unido por disulfuro), un fragmento F(ab')2, dAb) o un antagonista de una diana en tejido pulmonar (por ejemplo, ligando, monómero de dAb), puede administrarse localmente al tejido pulmonar para proporcionar una ventana terapéutica
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extensa (para tratar, suprimir, prevenir o diagnosticar trastornos respiratorios) en tejido pulmonar debido al tiempo de residencia largo de dichos agentes en el tejido pulmonar. Los resultados del estudio farmacocinético y la ventana terapéutica extensa proporcionada por la administración local al tejido pulmonar también explican la mayor eficacia observada del antagonista de TNFRi administrado localmente en el modelo de ratón de cOpD. Además, la mayor eficacia observada del monómero de dAb cuando se administra localmente a una dosis menor, la baja concentración de monómero de dAb que entra en el suero, y la rápida eliminación del monómero de dAb del suero indican que es mucho menos probable que los agentes que se unen a una diana en tejido pulmonar (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo que se une a una diana en tejido pulmonar (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv unido por disulfuro), un fragmento F(ab')2, dAb) produzcan efectos secundarios (por ejemplo, inmunosupresión, toxicidad) que otros tipos de agentes terapéuticos.
En otros estudios se indujo una inflamación pulmonar por medio del estimulador inflamatorio TNFa. Los resultados de estos estudios demuestran que los antagonistas de TNFR1 (dAb anti-TNFRI que inhibe la unión de TNFa al receptor, o que no inhibe la unión del TNFa al receptor) inhiben significativamente los aumentos inducidos por TNFa de otros mediadores inflamatorios, tales como los quimioatrayentes de neutrófilos de actuación temprana KC y MIP- 1, y la quimioquina de actuación tardía MCP-1 y la molécula de adhesión E-selectina, e inhiben la infiltración celular de los pulmones.
Los estudios descritos en la presente demuestran que los agentes que se unen a dianas en tejido pulmonar (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv unido por disulfuro), un fragmento F(ab')2, dAb), antagonistas, ligandos, monómeros de dAb) son productos terapéuticos mejores para tratar, suprimir o prevenir la inflamación pulmonar y/o una enfermedad respiratoria, o para objetivos de diagnóstico, tal como la formación de imágenes. Los resultados también demuestran que aunque los monómeros de dAb tienen una semivida en suero in vivo corta, los dAb que se unen a una diana en tejido pulmonar y los antagonistas que contienen dicho dAb pueden administrarse localmente al tejido pulmonar para proporcionar una ventana terapéutica extensa en tejido pulmonar debido al tiempo de residencia largo de dicho dAb en el tejido pulmonar. Por consiguiente, otros agentes que se unen a dianas en el tejido pulmonar y tienen semividas in vivo cortas (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fv (por ejemplo, scFv, Fv unidos por disulfuro), fragmentos F(ab')2) pueden administrarse localmente al tejido pulmonar para proporcionar una ventana terapéutica extensa (por ejemplo, para tratar, suprimir, prevenir o diagnosticar trastornos respiratorios) en tejido pulmonar.
En general, los agentes que se unen a dianas en tejido pulmonar (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv unido por disulfuro), un fragmento F(ab')2, dAb), antagonistas, ligandos, monómeros de dAb) pueden administrarse localmente al tejido pulmonar para proporcionar una ventana terapéutica extensa en tejido pulmonar de al menos aproximadamente 4 horas, al menos aproximadamente 5 horas, al menos aproximadamente 6 horas, al menos aproximadamente 7 horas, al menos aproximadamente 8 horas, al menos aproximadamente 9 horas, al menos aproximadamente 10 horas, al menos aproximadamente 11 horas, o al menos aproximadamente 12 horas.
Administración local de agentes que se unen a dianas en tejido pulmonar al tejido pulmonar
En un primer aspecto, la descripción se refiere a métodos para administrar un agente (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un antagonista, un ligando, un monómero de dAb) que se une a una diana en tejido pulmonar, a un sujeto, para producir una ventana terapéutica extensa (por ejemplo, para tratar, suprimir, prevenir o diagnosticar trastornos respiratorios) en tejido pulmonar, por ejemplo, una ventana terapéutica en tejido pulmonar de al menos aproximadamente 4 horas, al menos aproximadamente 5 horas, al menos aproximadamente 6 horas, al menos aproximadamente 7 horas, al menos aproximadamente 8 horas, al menos aproximadamente 9 horas, al menos aproximadamente 10 horas, al menos aproximadamente 11 horas, o al menos aproximadamente 12 horas. Según el primer aspecto de la invención, el agente se administra localmente al tejido pulmonar de un sujeto (por ejemplo un ser humano).
Un agente que se une a una diana en tejido pulmonar (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv unido por disulfuro), un fragmento F(ab')2, dAb), antagonistas, ligandos, monómeros de dAb) puede administrarse localmente al tejido pulmonar (por ejemplo, pulmón) de un sujeto empleando cualquier método adecuado. Por ejemplo, un agente puede administrarse localmente al tejido pulmonar mediante inhalación o administración intranasal. Para la inhalación o la administración intranasal, el agente (antagonista de TNFR1, ligando, monómero de dAb) puede administrarse empleando un nebulizador, un inhalador, un atomizador, un productor de aerosol, un productor de vaho, un inhalador de polvo seco, un inhalador de dosis controlada, un pulverizador de dosis controlada, un productor de vaho de dosis controlada, un atomizador de dosis controlada u otro dispositivo de administración adecuado.
En un aspecto, el método comprende administrar localmente al tejido pulmonar de un sujeto una cantidad eficaz de un agente (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un antagonista, un ligando, un monómero de dAb) que tiene una semivida en suero in vivo corta y que se une a una diana en el tejido pulmonar. Según la invención, dichos
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agentes (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un antagonista, un ligando, un monómero de dAb) pueden administrarse localmente al tejido pulmonar para producir una ventana terapéutica extensa en el tejido pulmonar, pero no se acumulan sustancialmente en el suero. Debido a la semivida in vivo corta de dichos agentes (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un antagonista, un ligando, un monómero de dAb), los agentes que atraviesan el epitelio pulmonar y entran en el suero serán eliminados rápidamente del suero y, por tanto, no se acumularán hasta unos niveles que puedan producir efectos no deseados (por ejemplo, efectos secundarios sistémicos). Por ejemplo, los agentes adecuados (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un antagonista, un ligando, un monómero de dAb) que se unen a una diana en tejido pulmonar para su uso en el primer aspecto de la invención pueden tener una semivida en suero in vivo de aproximadamente un segundo a aproximadamente 12 horas, de aproximadamente 12 horas o menos, de aproximadamente 11 horas o menos, de aproximadamente 10 horas o menos, de aproximadamente 9 horas o menos, de aproximadamente 8 horas o menos, de aproximadamente 7 horas
0 menos, de aproximadamente 6 horas o menos, de aproximadamente 5 horas o menos, de aproximadamente 4 horas o menos, de aproximadamente 3 horas o menos, de aproximadamente 2 horas o menos, de aproximadamente
1 hora o menos, o de aproximadamente 30 minutos o menos.
La semivida en suero in vivo de los monómeros de dAb es de aproximadamente 30 minutos (véanse los ejemplos 9 y 13 del documento WO 2004/081026 A2). Sin embargo, tal como se describe en la presente, la administración local de un monómero de dAb que se une a una diana en tejido pulmonar (por ejemplo, TNFR1) produce una ventana terapéutica en el tejido pulmonar de al menos 8 horas. De modo similar, la semivida en suero in vivo de fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos, en particular fragmentos Fv, también es corta y hace que no sean adecuados para muchas aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo (Peters et al., Science, 286(5439):434 (1999)). Sin embargo, tal como se demuestra por los resultados de los estudios descritos en la presente, los fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos que se unen a una diana en tejido pulmonar pueden administrarse localmente al tejido pulmonar para proporcionar una ventana terapéutica eXtensa (por ejemplo, para tratar, suprimir, prevenir o diagnosticar trastornos respiratorios) en tejido pulmonar, por ejemplo, una ventana terapéutica de al menos 8 horas.
Tal como se describe en la presente, la administración local de un agente que se une a una diana en el tejido pulmonar (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un antagonista, un ligando, un monómero de dAb) al tejido pulmonar produce una ventana terapéutica extensa en el tejido pulmonar (pulmón).
Tal como se describe en la presente, la administración local de un agente que se une a una diana en el tejido pulmonar (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un antagonista, un ligando, un monómero de dAb) al tejido pulmonar produce una ventana terapéutica extensa en el tejido pulmonar (pulmón), pero el agente no entra sustancialmente en la circulación sistémica. Un agente no entra sustancialmente en la circulación cuando no más de aproximadamente 2%, no más de aproximadamente 1,75%, no más de aproximadamente 1,5%, no más de aproximadamente 1,25%, no más de aproximadamente 1%, no más de aproximadamente 0,75%, no más de aproximadamente 0,5%, o no más de aproximadamente 0,25% de la cantidad total del agente administrado, o sustancialmente ninguna cantidad de agente, está presente en el suero 5 horas después de administrar el agente. En algunas circunstancias, un agente administrado según se describe en la presente puede entrar en la circulación sistémica, pero no acumularse hasta un nivel significativo porque, por ejemplo, el agente es rápidamente eliminado de la circulación sistémica. Por consiguiente, la invención proporciona un método para administrar localmente un agente que se une a una diana en el tejido pulmonar al tejido pulmonar, en el que no se acumula un nivel significativo de agente en la circulación sistémica. El nivel de un agente en la circulación sistémica no es significativo cuando no más de aproximadamente 2%, no más de aproximadamente 1,75%, no más de aproximadamente 1,5%, no más de aproximadamente 1,25%, no más de aproximadamente 1%, no más de aproximadamente 0,75%, no más de aproximadamente 0,5%, o no más de aproximadamente 0,25% de la cantidad total del agente administrado, o sustancialmente ninguna cantidad de agente, está presente en el suero 5 horas después de administrar el agente.
En general, solo es necesario administrar localmente una "cantidad eficaz de dosis baja de un agente" (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un antagonista, un ligando, un monómero de dAb) que se une a una diana en tejido pulmonar al tejido pulmonar de un sujeto. Una cantidad eficaz de dosis baja es una cantidad de agente que es menor que la cantidad del mismo agente que sería necesario administrar sistémicamente (es decir, una dosis sistémica eficaz) para lograr el mismo efecto.
Los agentes que se unen a dianas en tejido pulmonar (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv unido por disulfuro), un fragmento F(ab')2, dAb), antagonistas, ligandos, monómeros de dAb) pueden prepararse empleando cualquier método adecuados, tal como los métodos descritos en detalle en la presente con respecto a los antagonistas (por ejemplo, ligandos, monómeros de dAb) que se unen a TNFR1.
La descripción proporciona un método para proporcionar una ventana terapéutica extensa en el tejido pulmonar de un sujeto (por ejemplo, un ser humano) para un agente (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un antagonista, un ligando, un monómero de dAb) que se une a una diana (por ejemplo, TNFR1) en el tejido pulmonar, que comprende administrar localmente al tejido pulmonar del sujeto una cantidad eficaz o una cantidad eficaz de dosis baja de dicho agente. Preferiblemente, no se administra más de aproximadamente 10 mg/kg/día del agente. Por ejemplo, se administra de aproximadamente 1 mg/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg/día, por ejemplo, aproximadamente 1 mg/kg/día, aproximadamente 2 mg/kg/día, aproximadamente 3 mg/kg/día, aproximadamente 4 mg/kg/día,
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aproximadamente 5 mg/kg/día, aproximadamente 6 mg/kg/día, aproximadamente 7 mg/kg/día, aproximadamente 8 mg/kg/día, aproximadamente 9 mg/kg/día, o aproximadamente 10 mg/kg/día del agente. En otras realizaciones preferidas, tales como cuando el agente se administra localmente al tejido pulmonar (pulmón) de un ser humano, no se administra más de aproximadamente 10 mg/día. Por ejemplo, en dichas realizaciones, el agente puede administrarse localmente al tejido pulmonar a una dosis de aproximadamente 1 mg/día a aproximadamente 10 mg/día (por ejemplo, 10 mg/día, 9 mg/día, 8 mg/día, 7 mg/día, 6 mg/día, 5 mg/día, 4 mg/día, 3 mg/día, 2 mg/día, o 1 mg/día). Por consiguiente, el agente puede administrarse localmente al tejido pulmonar a una dosis de aproximadamente 1 pg/kg/día a aproximadamente 200 pg/kg/día (por ejemplo, aproximadamente 10 pg/kg/día, aproximadamente 20 pg/kg/día, aproximadamente 30 pg/kg/día, aproximadamente 40 pg/kg/día, aproximadamente 50 pg/kg/día, aproximadamente 60 pg/kg/día, aproximadamente 70 pg/kg/día, aproximadamente 80 pg/kg/día, aproximadamente 90 pg/kg/día, aproximadamente 100 pg/kg/día, aproximadamente 110 pg/kg/día,
aproximadamente 120 pg/kg/día, aproximadamente 130 pg/kg/día, aproximadamente 140 pg/kg/día,
aproximadamente 150 pg/kg/día, aproximadamente 160 pg/kg/día, aproximadamente 170 pg/kg/día,
aproximadamente 180 pg/kg/día, o aproximadamente 190 pg/kg/día). En realizaciones concretas, se administran de aproximadamente 5 pg/kg/día a aproximadamente 3 mg/kg/día, o preferiblemente de aproximadamente 50 pg/kg/día a aproximadamente 500 pg/kg/día.
Uso de agentes que se unen a dianas en tejido pulmonar al tejido pulmonar para la fabricación de formulaciones y medicamentos
El primer aspecto de la invención también se refiere al uso de un dominio variable único de inmunoglobulina que es un VH, VL o VHH que tiene al menos 96% de identidad a lo largo de su longitud completa, según se determina mediante el algoritmo BLAST, con la secuencia de aminoácidos TAR2H-131-511, que se une a una diana de TNFR1 en tejido pulmonar, tal como se describe en la presente, para la fabricación de una formulación de acción a largo plazo o de ventana terapéutica extensa para la administración local al tejido pulmonar. La ventana terapéutica extensa o el periodo de acción a largo plazo en el tejido pulmonar puede ser un periodo de al menos aproximadamente 4 horas, al menos aproximadamente 5 horas, al menos aproximadamente 6 horas, al menos aproximadamente 7 horas, al menos aproximadamente 8 horas, al menos aproximadamente 9 horas, al menos aproximadamente 10 horas, al menos aproximadamente 11 horas, o al menos aproximadamente 12 horas.
En algunas realizaciones, la invención se refiere al uso de un agente que se une a TNFR1 en el tejido pulmonar, tal como se describe en la presente, en la fabricación de una formulación de acción a largo plazo o de ventana terapéutica extensa para la administración local al tejido pulmonar (pulmón), en el que al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o más del nivel pulmonar del agente (por ejemplo, el nivel alcanzado después de la administración (por ejemplo, el nivel pulmonar alcanzado 1 hora después de la administración local al pulmón)) se mantiene durante un periodo de al menos aproximadamente 4 horas, al menos aproximadamente 5 horas, al menos aproximadamente 6 horas, al menos aproximadamente 7 horas, al menos aproximadamente 8 horas, al menos aproximadamente 9 horas, al menos aproximadamente 10 horas, al menos aproximadamente 11 horas, o al menos aproximadamente 12 horas. En algunas realizaciones, la invención se refiere al uso de un agente que se une a TNFRl en el tejido pulmonar, tal como se describe en la presente, en la fabricación de una formulación de acción a largo plazo o de ventana terapéutica extensa para la administración local al tejido pulmonar (pulmón), en el que el periodo de acción a largo plazo o la ventana terapéutica extensa en el pulmón se caracteriza por la presencia en el pulmón como un todo (BAL y tejido pulmonar) de al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 10%, o al menos aproximadamente 5% de la cantidad total del agente que se administró a las 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, o 12 horas después de la administración.
Preferiblemente, el agente para su uso en la invención no entra sustancialmente en la circulación sistémica (por ejemplo, cuando se encuentra en una formulación de acción a largo plazo o de ventana terapéutica extensa). Tal como se describe en la presente, un agente no entra sustancialmente en la circulación cuando no más de aproximadamente 2%, no más de aproximadamente 1,75%, no más de aproximadamente 1,5%, no más de aproximadamente 1,25%, no más de aproximadamente 1%, no más de aproximadamente 0,75%, no más de aproximadamente 0,5%, o no más de aproximadamente 0,25% de la cantidad total del agente administrado (por ejemplo, en una dosis de la formulación), o sustancialmente ninguna cantidad de agente, está presente en el suero 5 horas después de administrar el agente (por ejemplo, en una dosis de la formulación). En algunas circunstancias, un agente administrado según se describe en la presente puede entrar en la circulación sistémica, pero no acumularse hasta un nivel significativo porque, por ejemplo, el agente es rápidamente eliminado de la circulación sistémica. Por consiguiente, la descripción describe el uso de un agente que se une a una diana en el tejido pulmonar administrado al tejido pulmonar, en el que no se acumula un nivel significativo de agente en la circulación sistémica. El nivel de un agente en la circulación sistémica no es significativo cuando no más de aproximadamente 2%, no más de aproximadamente 1,75%, no más de aproximadamente 1,5%, no más de aproximadamente 1,25%, no más de aproximadamente 1%, no más de aproximadamente 0,75%, no más de aproximadamente 0,5%, o no más de aproximadamente 0,25% de la cantidad total del agente administrado (por ejemplo, en una dosis de la formulación), o sustancialmente ninguna cantidad de agente, está presente en el suero 5 horas después de administrar el agente (por ejemplo, en una dosis de la formulación).
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La descripción describe un método para producir una formulación de acción a largo plazo o de ventana terapéutica extensa para la administración local al tejido pulmonar, que comprende un agente (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un antagonista, un ligando, un monómero de dAb) que se une a una diana en el tejido pulmonar, o a un método para producir un medicamento para la administración local al tejido pulmonar de una cantidad eficaz de dosis baja de un agente (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un antagonista, un ligando, un monómero de dAb) que se une a una diana en el tejido pulmonar. Los métodos comprenden (1) seleccionar un agente que se une a una diana en el tejido pulmonar y que tiene una semivida en suero in vivo corta (por ejemplo, menos de aproximadamente 12 horas), y (2) emplear el agente seleccionado para la fabricación de una formulación de acción a largo plazo o de ventana terapéutica extensa para la administración local al tejido pulmonar, o para la fabricación de un medicamento para la administración local al tejido pulmonar de una cantidad eficaz de dosis baja del agente.
La invención también se refiere al uso de un dominio variable único de inmunoglobulina que se une a una diana en el tejido pulmonar, tal como se describe en la presente, para su uso en la fabricación de una formulación de acción a largo plazo o de ventana terapéutica extensa para la administración local al tejido pulmonar (pulmón), tal como se describe en la presente, o en fabricación de un medicamento para la administración local al tejido pulmonar de una cantidad eficaz de dosis baja del agente, tal como se describe en la presente, en el que la formulación o el medicamento es para administrar una cantidad de agente no mayor que aproximadamente 10 rng/kg/día. Por ejemplo, la formulación o el medicamento puede ser para administrar de aproximadamente 1 mg/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg/día, por ejemplo, aproximadamente 1 mg/kg/día, aproximadamente 2 mg/kg/día, aproximadamente 3 mg/kg/día, aproximadamente 4 mg/kg/día, aproximadamente 5 mg/kg/día, aproximadamente 6 mg/kg/día, aproximadamente 7 mg/kg/día, aproximadamente 8 mg/kg/día, aproximadamente 9 mg/kg/día, o aproximadamente 10 mg/kg/día. En algunas realizaciones, la formulación o el medicamento es para la administración local al tejido pulmonar (pulmón) de un ser humano, y la formulación o el medicamento es para administrar no más de aproximadamente 10 mg/día. Por ejemplo, la formulación o el medicamento puede ser para administrar un agente a una dosis de aproximadamente 1 mg/día a aproximadamente 10 mg/día (por ejemplo, 10 mg/día, 9 mg/día, 8 mg/día, 7 mg/día, 6 mg/día, 5 mg/día, 4 mg/día, 3 mg/día, 2 mg/día, o 1 mg/día). Por consiguiente, la formulación o el medicamento puede ser para administrar el agente a una dosis de aproximadamente 1 pg/kg/día a aproximadamente 200 pg/kg/día (por ejemplo, aproximadamente 10 pg/kg/día, aproximadamente 20 pg/kg/día, aproximadamente 30 pg/kg/día, aproximadamente 4o pg/kg/día, aproximadamente
50 pg/kg/día, aproximadamente 60 pg/kg/día, aproximadamente 70 pg/kg/día, aproximadamente 80 pg/kg/día,
aproximadamente 90 pg/kg/día, aproximadamente 100 pg/kg/día, aproximadamente 110 pg/kg/día,
aproximadamente 120 pg/kg/día, aproximadamente 130 pg/kg/día, aproximadamente 140 pg/kg/día,
aproximadamente 150 pg/kg/día, aproximadamente 160 pg/kg/día, aproximadamente 170 pg/kg/día,
aproximadamente 180 pg/kg/día, o aproximadamente 190 pg/kg/día). En realizaciones concretas, se administran de aproximadamente 5 pg/kg/día a aproximadamente 3 mg/kg/día, o preferiblemente de aproximadamente 50 pg/kg/día a aproximadamente 500 pg/kg/día.
Las formulaciones y los medicamentos producidos empleando un agente de dominio variable único de inmunoglobulina que se une a TNFR1 en el tejido pulmonar, tal como se describe en la presente, pueden ser administrados localmente al tejido pulmonar (por ejemplo, pulmón) de un sujeto empleando cualquier método adecuado. Por ejemplo, un agente puede administrarse localmente al tejido pulmonar mediante inhalación o administración intranasal. Para la inhalación o la administración intranasal, el agente puede administrarse empleando un nebulizador, un inhalador, un atomizador, un productor de aerosol, un productor de vaho, un inhalador de polvo seco, un inhalador de dosis controlada, un pulverizador de dosis controlada, un productor de vaho de dosis controlada, un atomizador de dosis controlada u otro dispositivo adecuado.
51 se desea, por ejemplo, para objetivos de diagnóstico (por ejemplo, formación de imágenes), el agente de dominio variable único de inmunoglobulina que se une a TNFR1 puede comprender un marcador detectable. Los marcadores detectables adecuados y los métodos para marcar un agente son muy conocidos en la técnica. Los marcadores detectables adecuados incluyen, por ejemplo, un radioisótopo (por ejemplo, tal como indio-111, tecnecio-99m o yodo-131), marcadores emisores de positrones (por ejemplo, flúor-19), iones paramagnéticos (por ejemplo, gadolínio(IM), manganeso(ll)), un marcador de epitopo (marcador), un marcador de afinidad (por ejemplo, biotina, avidina), un marcador de espín, una enzima, un grupo fluorescente o un grupo quimioluminiscente. Cuando no se emplean marcadores, la formación de complejos puede determinarse mediante resonancia de plasmón de superficie u otros métodos adecuados.
Antagonistas de TNFR1 para tratar, suprimir o prevenir la inflamación pulmonar y las enfermedades respiratorias
La invención se refiere a métodos para tratar, suprimir o prevenir la inflación pulmonar y/o una enfermedad respiratoria, que comprenden administrar a un sujeto (por ejemplo, un mamífero, un ser humano) que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de TNFR1, tal como se describe en la presente. La invención también se refiere al uso de un antagonista de TNFR1, tal como se describe en la presente, para la fabricación de un medicamento para tratar, suprimir o prevenir la inflamación pulmonar y/o una enfermedad respiratoria. La descripción también describe una composición farmacéutica para tratar, suprimir o prevenir la inflación pulmonar y/o una enfermedad respiratoria, que comprende un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando, un monómero de dAb) como ingrediente activo.
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La descripción describe composiciones que comprenden un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando, un ligando específico dual, un ligando multiespecífico, un monómero de dAb) y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, y métodos terapéuticos y de diagnóstico que emplean los ligandos o las composiciones de la invención. Los antagonistas y los ligandos (por ejemplo, ligandos específicos duales, ligandos multiespecíficos, monómeros de dAb) según la descripción pueden emplearse en aplicaciones terapéuticas y profilácticas in vivo, en aplicaciones de diagnóstico in vivo y similares.
Los usos terapéuticos y profilácticos de los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, ligandos multiespecíficos, ligandos específicos duales, monómeros de dAb) comprenden administrar una cantidad eficaz de antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, ligandos multiespecíficos, ligandos específicos duales, monómeros de dAb) a un receptor mamífero o sujeto, tal como un ser humano.
Por ejemplo, los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, ligandos multiespecíficos, ligandos específicos duales, monómeros de dAb) generalmente se emplearán en la prevención, la supresión o el tratamiento de la inflamación pulmonar y/o enfermedades respiratorias, tales como un trastorno en el que la inflamación pulmonar es un síntoma o es parte de la patología, enfermedades respiratorias agudas, enfermedades respiratorias crónicas, enfermedades respiratorias inflamatorias agudas y enfermedades respiratorias inflamatorias crónicas. Por ejemplo, los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, ligandos multiespecíficos, ligandos específicos duales, monómeros de dAb) pueden administrarse para tratar, suprimir o prevenir la inflamación pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (por ejemplo, bronquitis crónica, bronquitis obstructiva crónica, enfisema), asma (por ejemplo, asma resistente a esteroides), neumonía (por ejemplo, neumonía bacteriana, tal como neumonía estafilocócica), neumonitis de hipersensibilidad, infiltrados pulmonares con eosinofilia, enfermedad pulmonar ambiental, neumonía, bronquiectasia, fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar primaria, tromboembolia pulmonar, trastornos de la pleura, trastornos del mediastino, trastornos del diafragma, hipoventilación, hiperventilación, apnea del sueño, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, mesotelioma, sarcoma, rechazo de injertos, enfermedad del injerto frente al receptor, cáncer pulmonar, rinitis alérgica, alergia, asbestosis, aspergiloma, aspergilosis, bronquiectasia, bronquitis crónica, enfisema, neumonía eosinófila, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pneumocócica invasiva (IPD), gripe, micobacterias no tuberculosas, efusión pleural, neumoconiosis, neumocitosis, neumonía, actinomicosis pulmonar, proteinosis alveolar pulmonar, ántrax pulmonar, edema pulmonar, embolia pulmonar, inflamación pulmonar, histiocitosis pulmonar X (granuloma eosinofílico), hipertensión pulmonar, nocardiosis pulmonar, tuberculosis pulmonar, enfermedad venooclusiva pulmonar, enfermedad pulmonar reumatoide, sarcoidosis, granulomatosis de Wegener, y carcinoma pulmonar no microcítico.
En la presente solicitud, el término "prevención" implica la administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad. "Supresión" se refiere a la administración de la composición después de un acontecimiento inductivo, pero antes de la aparición clínica de la enfermedad. El "tratamiento" implica la administración de la composición protectora después de que se manifiesten los síntomas de la enfermedad.
De modo ventajoso, pueden emplearse ligandos específicos duales o multiespecíficos para dirigirse a citoquinas y otras moléculas que cooperan de modo sinérgico en situaciones terapéuticas en el cuerpo de un organismo. La descripción describe un método para crear sinergia entre la actividad de dos o más dominios de unión (por ejemplo, dAb), en el que un dominio se une a TNFR1 u otra diana en el tejido pulmonar, y el otro dominio se une a una citoquina u otras moléculas, que comprende administrar un ligando específico dual o multiespecífico capaz de unirse a dichas dos o más moléculas (por ejemplo, TNFR1 y una citoquina). Por ejemplo, este aspecto de la invención se refiere a combinaciones de dominios Vh y dominios Vl, solo dominios Vh y solo dominios Vl.
La sinergia, en un contexto terapéutico, puede lograrse mediante una serie de formas. Por ejemplo, las combinaciones de dianas pueden ser terapéuticamente activas solo si ambas dianas son unidas por el ligando, mientras que la unión a una sola diana no es terapéuticamente eficaz. En otra realización, una sola diana puede proporcionar un efecto terapéutico bajo o mínimo, pero junto con una segunda diana, la combinación proporciona un aumento sinérgico en el efecto terapéutico.
Están disponibles sistemas de modelos animales que pueden emplearse para determinar la eficacia de los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, anticuerpos o sus proteínas de unión, monómero de dAb) para prevenir, suprimir o tratar una enfermedad respiratoria. Por ejemplo, los modelos animales adecuados de enfermedad respiratoria incluyen modelos de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (véase, Groneberg, D.A. et al., Respiratory Research, 5:18 (2004)), y modelos de asma (véase, Coffman et al., J. Exp. Med., 201(12):1875-1879 (2001). Preferiblemente, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando o monómero de dAb) es eficaz en un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica inducida por el humo del tabaco en ratones (por ejemplo, el modelo subcrónico descrito en la presente) o un modelo de primate adecuado de asma o de enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Más preferiblemente, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando o monómero de dAb) es eficaz en un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica inducida por el humo del tabaco en ratones (por ejemplo, el modelo subcrónico descrito en la presente) (véase también, Wright y Churg, Chest, 122:301-306 (2002)). Por ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del ligando puede reducir, retrasar o prevenir la aparición de los síntomas de la COPD en el modelo, comparado con un control adecuado. La técnica anterior no sugiere el uso de antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos o monómeros de dAb) en estos modelos ni que aquellos fueran
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eficaces.
En general, Ios presentes antagonistas se utilizarán en una forma purificada Junto con vehículos farmacológicamente apropiados. Generalmente, estos vehículos incluyen disoluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, que incluyen disolución salina y/o medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio y disolución de Ringer lactada. Los adyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si es necesario mantener un complejo de polipéptido en suspensión, pueden elegirse de espesantes, tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos.
Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes y reponedores de electrolitos, tales como Ios basados en dextrosa de Ringer. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes (Mack (1982), Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición). Puede utilizarse una diversidad de formulaciones adecuadas, que incluyen formulaciones de liberación extendida.
Los antagonistas de la presente invención pueden utilizarse como composiciones administradas por separado o Junto con otros agentes. Estos pueden incluir diversos fármacos, tales como inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, inhibidores de fosfodiesterasa 4), broncodilatadores (por ejemplo, beta2-agonistas, anticolinérgicos, teofilina), beta-agonistas de acción a corto plazo (por ejemplo, albuterol, salbutamol, bambuterol, fenoterol, isoeterina, isoproterenol, levalbuterol, metaproterenol, pirbuterol, terbutalina y tornlato), beta-agonistas de acción a largo plazo (por ejemplo, formoterol y salmeterol), anticolinérgicos de acción a corto plazo (por ejemplo, bromuro de ipratropio y bromuro de oxitropio), anticolinérgicos de acción a largo plazo (por ejemplo, tiotropio), teofilina (por ejemplo, una formulación de acción a corto plazo, una formulación de acción a largo plazo), esteroides inhalados (por ejemplo, beclometasona, budesonida, flunisolida, propionato de fluticasona y triamcinolona), esteroides orales (por ejemplo, metilprednisolona, prednisolona, prednisolón y prednisona), beta-agonistas de acción a corto plazo combinados con anticolinérgicos (por ejemplo, albuterol/salbutamol/ipratopio, y fenoterol/ipratropio), beta-agonistas de acción a largo plazo con esteroides inhalados (por ejemplo, salmeterol/fluticasona, y formoterol/budesonida) y agentes mucolíticos (por ejemplo, erdosteína, acetilcisteína, bromhecsina, carbocisteína, guiafenesina y glicerol yodado), ciclosporina, antibióticos, antivíricos, metotrexato, adriamicina, cisplatino, e inmunotoxinas.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de diversos agentes citotóxicos u otros agentes junto con Ios antagonistas (por ejemplo, ligandos) de la presente invención, o incluso combinaciones de ligandos según la presente invención que tienen diferentes especificidades, tales como ligandos seleccionados empleando diferentes epitopos o antígenos diana, agrupados o no antes de la administración.
Los antagonistas de TNFR1 pueden administrarse y/o formularse junto con uno o más agentes terapéuticos o activos adicionales. Cuando un antagonista de TNFR1 se administra con un agente terapéutico adicional, el antagonista de TNFR1 puede administrarse antes, simultáneamente o después de la administración del agente adicional. En general, el antagonista de TNFR1 y el agente adicional se administran de manera que proporcionan un solapamiento del efecto terapéutico.
Las composiciones que contienen Ios presentes antagonistas o un cóctel de estos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para lograr, al menos parcialmente, la inhibición, la supresión, la modulación, la destrucción o cualquier otro parámetro mensurable de una población de células seleccionadas se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Por ejemplo, para tratar la inflamación pulmonar y/o una enfermedad respiratoria, puede administrarse una cantidad inhibidora de esputos, una cantidad inhibidora de la inflamación de biopsia bronquial, una cantidad inhibidora de la disnea, una cantidad que aumenta el volumen espiratorio forzado en un segundo (FEV (1)), una cantidad que mejora el estado de salud, cuantificada mediante un cuestionario adecuado, tal como el cuestionario respiratorio de St. George (por ejemplo, una mejora en la puntuación de 4 puntos).
Las cantidades necesarias para lograr estos efectos dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del sistema inmunológico del propio paciente, pero, en general, varían de 0,005 a 10,0 mg de agente, antagonista (por ejemplo, ligando, monómero de dAb) o su proteína de unión por kilogramo de peso corporal, y las dosis que se emplean más habitualmente son de 0,05 a 2,0 mg/kg/dosis. En realizaciones concretas, la cantidad administrada será de aproximadamente 5 pg/kg/dosis a aproximadamente 3 mg/kg/dosis, o preferiblemente de aproximadamente 50 pg/kg/dosis a aproximadamente 500 pg/kg/dosis.
Para aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen Ios presentes ligandos o sus cócteles también pueden administrarse en dosificaciones similares o ligeramente inferiores para prevenir, inhibir o retrasar la aparición de una enfermedad (por ejemplo, para mantener la remisión o quiescencia, o para prevenir la fase aguda). Los médicos expertos serán capaces de determinar el intervalo de dosificación apropiado para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad. Cuando un antagonista de TNFR1 se administra para tratar, suprimir o prevenir la inflamación pulmonar o una enfermedad respiratoria, este puede administrarse hasta cuatro veces diarias, dos veces semanales, una vez semanal, una vez cada dos semanas, una vez mensual o una vez cada dos meses, a una dosis, por ejemplo, de aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 80 mg/kg, de aproximadamente 100 pg/kg a
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aproximadamente 80 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 80 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 70 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 60 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg , de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 10 |jg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 10 jg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 10 jg/kg a aproximadamente 2,5 mg/kg, a aproximadamente 1 mg/kg, a aproximadamente 2 mg/kg, a aproximadamente 3 mg/kg, a aproximadamente 4 mg/kg, a aproximadamente 5 mg/kg, a aproximadamente 6 mg/kg, a aproximadamente 7 mg/kg, a aproximadamente 8 mg/kg, a aproximadamente 9 mg/kg o a aproximadamente 10 mg/kg. En realizaciones concretas, el antagonista de tNfRI (por ejemplo, ligando) se administra para tratar, suprimir o prevenir la inflamación pulmonar o una enfermedad respiratoria cada día, cada dos días, una vez semanal, una vez cada dos semanas o una vez mensual a una dosis de aproximadamente 10 jg/kg a aproximadamente 10 mg/kg (por ejemplo, a aproximadamente 10 jg/kg, a aproximadamente 100 jg/kg, a aproximadamente 1 mg/kg, a aproximadamente 2 mg/kg, a aproximadamente 3 mg/kg, a aproximadamente 4 mg/kg, a aproximadamente 5 mg/kg, a aproximadamente 6 mg/kg, a aproximadamente 7 mg/kg, a aproximadamente 8 mg/kg, a aproximadamente 9 mg/kg o a aproximadamente 10 mg/kg). En realizaciones concretas, se administran de aproximadamente 5 jg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, o preferiblemente de aproximadamente 50 jg/kg a aproximadamente 500 jg/kg.
El antagonista de TNFR1 también puede administrarse para tratar, suprimir o prevenir la inflamación pulmonar o una enfermedad respiratoria a una dosis diaria o dosis unitaria de aproximadamente 10 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 2 mg o aproximadamente 1 mg.
El tratamiento o la terapia realizados empleando las composiciones descritas en la presente se considera "eficaz" si uno o más síntomas se reducen (por ejemplo, en al menos 10% o al menos un punto en una escala de evaluación clínica) con relación a dichos síntomas presentes antes del tratamiento, o con relación a dichos síntomas en un individuo (humano o un animal de un modelo) no tratado con dicha composición u otro control adecuado. Los síntomas variarán dependiendo de la enfermedad o el trastorno tratado, pero pueden ser medidos por un médico o técnico preparado. Estos síntomas pueden medirse, por ejemplo, controlando uno o más indicadores físicos de la enfermedad o el trastorno (por ejemplo, infiltrado celular en tejido pulmonar, producción de esputo, infiltrado celular en el esputo, disnea, tolerancia al ejercicio físico, espirometría (por ejemplo, capacidad vital forzada (FVC), volumen espiratorio forzado en un segundo (FEV (1), FEV (1)/FVC), tasa o gravedad de la exacerbación de la enfermedad, o mediante una escala de evaluación clínica aceptada, por ejemplo, el cuestionario respiratorio de St. George. Las escalas de evaluación clínica adecuadas incluyen, por ejemplo, la gravedad de la obstrucción del flujo de aire según FEV (1) (Clinical Guideline 12, Chronic Obstructive Pulmonary Disease, Management of Chronic Obstructive Pulmonary Disease in Adults in Primary and Secondary Care, National Institute for Clinical Excellence, Londres (2004)), el máximo de flujo espiratorio ("Peak Expiratory FIow", PEF) (British Guideline on the Management of Asthma, British Thoracic Society, Scottish Intercollegiate Guidelines Network, edición revisada (2004)), el estadio de la COPD según el patrón de the American Thoracic Society (ATS) (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152:S77-S120 (1995), la clase de deterioro por asma según el patrón de aTs (Am. Rev. Respir. Dís., 147:1056-1061 (1993), u otra escala de evaluación clínica aceptada conocida en la técnica. Una reducción sostenida (por ejemplo, un día o más, preferiblemente más tiempo) en Ios síntomas de una enfermedad o trastorno en al menos 10% o en uno o más puntos en una escala clínica concreta indica un tratamiento "eficaz". De modo similar, una profilaxis realizada empleando una composición, tal como se describe en la presente, es "eficaz" si la aparición o la gravedad de uno o más síntomas se retrasa, se reduce o se abóle con relación a dichos síntomas en un individuo (humano o un animal de un modelo) similar no tratado con la composición.
Una composición que contiene un dominio variable único de inmunoglobulina según la presente invención puede utilizarse en escenarios profilácticos y terapéuticos para ayudar a la alteración, inactivación, destrucción o eliminación de una población de células diana seleccionada en un mamífero. Por ejemplo, dichas composiciones pueden utilizarse para reducir Ios niveles de células inflamatorias en el pulmón y/o para inhibir la infiltración por células del pulmón.
Una composición que contiene un dominio variable único de inmunoglobulina según la presente invención también puede utilizarse para reducir Ios niveles de mediadores inflamatorios, tales como citoquinas, quimioquinas, moléculas de adhesión celular, que son inducidas por estímulos inflamatorios en el pulmón. Por ejemplo, Ios monómeros de dAb antagonistas de TNFR1 pueden inhibir (i) aumentos inducidos por estímulos inflamatorios (por ejemplo, inducidos por TNF-alfa) en Ios niveles de Ios mediadores de acción a corto plazo, tales como Ios quimioatrayentes de neutrófilos KC y MIP-1 y/o (ii) aumentos inducidos por estímulos inflamatorios (por ejemplo, inducidos por TNF-alfa) en Ios niveles de Ios mediadores de acción más tardía, tales como la quimioquina MCP-1 y la molécula de adhesión E-selectina. También pueden afectar a otros mediadores, tales como LTB4, GRO-a, IP-10, GM-CSF, especies de oxígeno reactivó (ROS), NO y similares.
Los dominios variables únicos de inmunoglobulina de esta invención pueden liofilizarse para su conservación y reconstituirse en un vehículo adecuado antes del uso. Esta técnica ha demostrado ser eficaz con inmunoglobulinas convencionales y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica. Los expertos
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en la técnica apreciarán que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad del anticuerpo (por ejemplo, con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a mostrar una pérdida mayor en la actividad que los anticuerpos IgG) y que puede que haya que ajustar hacia arriba los niveles de uso para compensar. Los ligandos de esta invención pueden liofilizarse para formar un polvo seco para la inhalación y se administran en esa forma.
La vía de administración de las composiciones farmacéuticas según la invención puede ser cualquiera de las que conocen los expertos en la técnica. La administración puede realizarse de cualquier modo apropiado, que incluye la vía parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, a través de la vía pulmonar, o mediante infusión directa con un catéter. La dosificación y la frecuencia de la administración dependerán de la edad, el sexo y el trastorno del paciente, la administración concurrente de otros fármacos, las contraindicaciones y otros parámetros que deben ser considerados por el médico. La administración puede ser local (por ejemplo, el transporte local al pulmón mediante administración pulmonar, por ejemplo, administración intranasal), según esté indicado.
En realizaciones concretas, un antagonista de TNFR1 se administra por administración pulmonar, tal como mediante inhalación (por ejemplo, intrabronquial, intranasal o inhalación oral, gotas intranasal). Para la inhalación, el antagonista de tNfRI puede administrarse empleando un nebulizador, un inhalador, un atomizador, un productor de aerosol, un productor de vaho, un inhalador de polvo seco, un inhalador de dosis controlada, un pulverizador de dosis controlada, un productor de vaho de dosis controlada, un atomizador de dosis controlada u otro dispositivo adecuado.
La descripción se refiere a un método para tratar, suprimir o prevenir la inflamación pulmonar o una enfermedad respiratoria, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de TNFRI, en el que dicha cantidad eficaz no es mayor que aproximadamente 10 rng/kg/día, y en el que preferiblemente el nivel de células inflamatorias en el pulmón se reduce con relación a los niveles antes del tratamiento con p < 0,05, o el reclutamiento de células inflamatorias hacia el pulmón se inhibe con relación a los niveles antes del tratamiento con p < 0,05. El nivel de células inflamatorias en el pulmón o el reclutamiento de células inflamatorias hacia el pulmón puede reducirse o inhibirse con relación a los niveles antes del tratamiento en al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%.
Preferiblemente se realiza un análisis estadístico empleando los métodos descritos en los ejemplos de la presente. El nivel de células inflamatorias en el pulmón o el reclutamiento de células inflamatorias hacia el pulmón puede reducirse o inhibirse con relación a los niveles antes del tratamiento con p < 0,001 en algunas realizaciones.
Los niveles de células (por ejemplo, células inflamatorias) en el pulmón pueden evaluarse empleando cualquier método adecuado, tales como recuentos de células diferenciales o totales (por ejemplo, recuento de células de macrófagos, recuento de células de neutrófilos, recuento de células de eosinófilos, recuento de células de linfocitos, recuento de células epiteliales) en el BAL, esputo o biopsia (por ejemplo, biopsia bronquial, biopsia pulmonar).
La descripción se refiere también a un método para tratar una enfermedad respiratoria que comprende (1) seleccionar un antagonista del receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFRI) que es eficaz en un modelo animal adecuado de enfermedad respiratoria cuando se administra en una cantidad que no es mayor que aproximadamente 10 mg/kg una vez diaria, en el que existe eficacia en dicho modelo animal cuando la infiltración celular de los pulmones, según se evalúa mediante el recuento total de células en un lavado broncoalveolar, es inhibida con relación a un control sin tratar con p < 0,05; y (2) administrar (por ejemplo, localmente al tejido pulmonar) una cantidad eficaz de dicho antagonista de TNFRI a un sujeto que lo necesite.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente se emplean para tratar, suprimir o prevenir la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (por ejemplo, bronquitis crónica, bronquitis obstructiva crónica, enfisema), asma (por ejemplo, asma resistente a esteroides), neumonía (por ejemplo, neumonía bacteriana, tal como neumonía estafilocócica), o inflamación pulmonar.
La invención también se refiere al uso de un antagonista de TNFRI, tal como se describe en la presente, para la fabricación de un medicamento o una formulación para tratar la inflamación pulmonar o una enfermedad respiratoria descrita en la presente, para la administración local al tejido pulmonar.
Antagonistas de TNFR1
El TNFR1 es un receptor transmembrana que contiene una región extracelular que se une al ligando y un dominio intracelular que carece de actividad de transducción de señales intrínseca, pero que puede asociarse con moléculas de transducción de señales. El complejo del TNFR1 con el TNF unido contiene tres cadenas de TNFR1 y tres cadenas de TNF (Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993)). El ligando de TNF está presente como un trímero, que es unido por tres cadenas de TNFR1 (id.). Las tres cadenas de TNFR1 se agrupan muy próximas entre sí en el complejo del receptor-ligando, y este agolpamiento es un prerrequisito para la transducción de señales mediada por TNFR1. De hecho, los agentes multivalentes que se unen a TNFR1, tales como anticuerpos anti-TNFR1, pueden inducir el agolpamiento de TNFR1 y la transducción de señales en ausencia de TNF, y se emplean habitualmente
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como agonistas de TNFR1 (véase, por ejemplo, Belka et al., EMBO, 14(6):1156-1165 (1995); Mandik-Nayak et al., J. Immunol, 167:1920-1928 (2001)). Por consiguiente, los agentes multivalentes que se unen a TNFR1 en general no son antagonistas eficaces del TNFR1 aunque bloqueen la unión del TNFa a TNFR1.
La región extracelular de TNFR1 comprende un segmento amino-terminal de trece aminoácidos (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO:213 (humano); aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO:215 (ratón)), el dominio 1 (aminoácidos 14-53 de SEQ ID NO:213 (humano); aminoácidos 14-53 de SEQ ID NO:215 (ratón)); el dominio 2 (aminoácidos 54-97 de SEQ ID NO:213 (humano); aminoácidos 54-97 de SEQ ID NO:215 (ratón)); el dominio 3 (aminoácidos 98-138 de SEQ ID NO:213 (humano); los aminoácidos 98-138 de SEQ ID NO:215 (ratón)); y el dominio 4 (aminoácidos 139-167 de SEQ ID No:213 (humano); los aminoácidos 139-167 de SEQ ID No:215 (ratón)) seguidos de una región próxima a la membrana (aminoácidos 168-182 de SEQ ID NO:213 (humano); los aminoácidos 168-183 de SEQ ID NO:215 (ratón)) (véase, Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993) y Loetscher et al., Cell, 61(2) 351-359 (199o)). Los dominios 2 y 3 se ponen en contacto con el ligando unido (TnFP, TNFa) (Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993)). La región extracelular de TNFR1 también contiene una región denominada dominio de ensamblaje de unión de preligando o dominio PLAD (aminoácidos 1 -53 de f SEQ ID NO:213 (humano); aminoácidos 1 -53 de SeQ ID NO:215 (ratón)) (gobierno de EE. UU., documento WO 01/58953; Deng et al., Nature Medicine, doi: 10.1038/nm1304 (2005)).
El TNFR1 se desprende de la superficie de las células ln vivo a través de un proceso que incluye la proteolisis de TNFR1 en el dominio 4 o en la región próxima a la membrana (aminoácidos 168-182 de SEQ ID NO:213; aminoácidos 168-183 de SEQ ID NO:215), para producir una forma soluble de TNFR1. El TNFR1 soluble conserva la capacidad para unirse a TNFa y, con ello, actúa como inhibidor endógeno de la actividad del TNFa.
Los antagonistas de TNFR1 adecuados para su uso en la invención presentan especificidad de unión por el receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1; p55; CD120a). Preferiblemente, los antagonistas de TNFR1 no presentan especificidad de unión por el receptor 2 del factor de necrosis tumoral (TNFR2), o no antagonizan sustancialmente al TNFR2. Un antagonista de TNFR1 no antagoniza sustancialmente al TNFR2 cuando el antagonista (1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 pM, 10 pM o 100 pM) produce no más de aproximadamente 5% de inhibición de la actividad mediada por TNFR2 inducida por TNFa (100 pg/ml) en un ensayo celular convencional.
Los antagonistas de TNFR1 que son adecuados para su uso en la invención son productos terapéuticos eficaces (tienen eficacia terapéutica) para tratar una enfermedad respiratoria (preferiblemente, enfermedad respiratoria aguda, enfermedad respiratoria crónica, enfermedad respiratoria inflamatoria aguda, enfermedad respiratoria inflamatoria crónica). Por ejemplo, los antagonistas de TNFRi que son adecuados para su uso en la invención son eficaces en modelos de enfermedades respiratorias cuando se administra una cantidad eficaz. En general, una cantidad eficaz es de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, o aproximadamente 10 mg/kg). En la técnica son conocidos varios modelos animales adecuados para enfermedades respiratorias, y los expertos en la técnica reconocen que son predictivos de la eficacia terapéutica en seres humanos. Por ejemplo, los modelos animales adecuados de enfermedad respiratoria incluyen modelos de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (véase, Groneberg, D.A. et al., Respiratory Research, 5:18 (2004)), modelos de asma (véase, Coffman R.L. et al., J. Exp. Med., 201(12):1875-1879 (2001); Van Scott, M.R. et al., J. App. Physiol., 96:1433-1444 (2004)), y modelos de fibrosis pulmonar (por ejemplo, Venkatesan, N. et al., Lung, 287:1342-1347 (2004). Preferiblemente, el antagonista de TNFRI (por ejemplo, ligando o monómero de dAb) es eficaz en un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica inducida por el humo del tabaco en ratones (por ejemplo, el modelo subcrónico descrito en la presente) o un modelo de primate adecuado de asma o de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (véase, por ejemplo, Coffman R.L. et al., J. Exp. Med., 201(12):1875-1879 (2001); Van Scott, M.R. et al., J. App. Physiol., 96:1433-1444 (2004)). Más preferiblemente, el antagonista de TNFRI es eficaz en un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica inducida por el humo del tabaco en ratones (por ejemplo, el modelo subcrónico descrito en la presente) (véase también, Wright y Churg, Chest, 122:301-306 (2002)). Por ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del ligando puede reducir, retrasar o prevenir la aparición de los síntomas de la COPD en el modelo, comparado con un control adecuado. La técnica anterior no sugiere el uso de antagonistas de TNFRI (por ejemplo, ligandos o monómeros de dAb) en estos modelos ni que aquellos fueran eficaces.
Los antagonistas de TNFRI pueden ser monovalentes o multivalentes. El antagonista puede ser monovalente y contener un sitio de unión que interacciona con TNFRi. Los antagonistas monovalentes se unen a un TNFRI y no inducen el entrecruzamiento o el agolpamiento de TNFRI sobre la superficie de células que puede conducir a la activación del receptor y la transducción de señales. En realizaciones concretas, el antagonista monovalente de TNFRI compite con TaR2iti-21-23 por la unión a TNFRI de ratón o compite con TAR2h-205 por la unión a TNFRI humano.
Los antagonistas multivalentes de TNFRI pueden contener dos o más copias de un sitio de unión concreto para TNFRI o contener dos o más sitios de unión diferentes que se unen a TNFRi. Por ejemplo, el antagonista de TNFRI puede ser un dímero, trímero o multímero que comprende dos o más copias de un dAb concreto que se une a TNFRi, o dos o más dAb diferentes que se unen a TnFRI. Preferiblemente, un antagonista multivalente de
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TNFR1 no agoniza sustancialmente al TNFR1 (actúa como agonista de TNFR1) en un ensayo celular convencional (concretamente, cuando está presente a una concentración de 1 nM, 10 nM, lOo nM, 1 jM, 10 jM, 100 jM, 1000 |jM o 5.OOO pM, produce no más de aproximadamente 5% de la actividad mediada por TnFRI inducida por TNFa (1OO pg/ml) en el ensayo).
Los antagonistas multivalentes de TNFRI pueden contener dos o más sitios de unión para un epitopo o dominio de TNFRI deseado. Por ejemplo, un antagonista multivalente de TNFRI puede comprender dos o más sitios de unión que se unen al mismo epitopo de TNFRI, o dos o más sitios de unión que se unen a epitopos o dominios de TNFRI diferentes. En un ejemplo, el antagonista multivalente de TNFRI comprende un primer sitio de unión que se une a un primer epitopo de TNFRI, y un segundo sitio de unión que se une a un segundo epitopo diferente de TNFRI. Preferiblemente, dichos antagonistas multivalentes no agonizan al TNFRI cuando están presentes a una concentración de aproximadamente 1 nM, o aproximadamente 10 nM, o aproximadamente 1OO nM, o aproximadamente 1 jM, o aproximadamente 10 jM, en un ensayo de citotoxicidad L929 convencional o un ensayo de HeLa IL-8 convencional, tal como se describe en la presente.
Algunos antagonistas de TNFRI adecuados para su uso en la invención se unen a TNFRI e inhiben la unión de TNFa a TNFRI. En realizaciones concretas, dicho antagonista de TNFRI compite con TAR2h-1O-27, TAR2Ii-131-8, TAR2Ii-15-8, TAR2Ii-35-4, TAR2Ii-154-7, TAR2Ii-154-10 o TAR2Ii-185-25 por la unión a TNFRI.
Algunos antagonistas de TNFRI adecuados para su uso en la invención no inhiben la unión de TNFa a TNFRI, pero sí inhiben la transducción de señales mediada a través de TNFRI. Por ejemplo, un antagonista de TNFRI puede inhibir la agrupación inducida por TNFa de TNFRI, que precede a la transducción de señales a través de tNfRI. Estos antagonistas proporcionan varias ventajas. Por ejemplo, en presencia de dicho antagonista, el TNFa puede unirse a TNFRI expresado sobre la superficie de células y ser retirado del entorno celular, pero no se activará la transducción de señales mediada por TnFRI. Por tanto, se inhibe la producción de más TNFa inducida por las señales del TNFRI y de otros mediadores de la inflamación. De modo similar, los antagonistas de TNFRI que se unen a TNFRI e inhiben la transducción de señales mediada a través de TNFRI, pero no inhiben la unión de TNFa a TNFRI, no inhibirán la unión de TNFa ni la actividad inhibidora de TNFRI soluble producido de modo endógeno. Por consiguiente, la administración de dicho antagonista a un mamífero que lo necesite puede complementar las vías reguladoras endógenas que inhiben la actividad de TNFa y la actividad de TNFRI in vivo.
En una realización concreta, el antagonista de TNFRI adecuado para su uso en la invención se une a TNFRI e inhibe la transducción de señales mediada a través de TNFRI tras la unión de TNFa. Este antagonista puede inhibir la transducción de señales mediada a través de TNFRI, pero no inhibe la unión de TNFa a TNFRI y/o el desprendimiento de TNFRI para producir TNFRI soluble. Por consiguiente, la administración de dicho antagonista a un mamífero que lo necesite puede complementar las vías reguladoras endógenas que inhiben la actividad de TNFa y la actividad de TNFRI in vivo.
Ciertos antagonistas de TNFRI adecuados para su uso en la invención se unen a TNFRI y compiten con TAR2m- 21-23 por la unión al TNFRI de ratón o compiten con TAR2h-2O5 por la unión al TNFRI humano. Otros antagonistas de TNFRI adecuados para su uso en la invención se unen a TNFRI y compiten con TAR2Ii-131-8, TAR2Ii-15-8, TAR2Ii-35-4, TAR2Ii-154-7, TAR2Ii-154-10, TAR2Ii-185-25, o TAR2h-27-1O por la unión al TNFRI (por ejemplo, TNFRI humano y/o de ratón).
Algunos antagonistas presentan reactividad cruzada y se unen a TNFRI humano y a TNFRI de otra especie, tal como un animal que puede emplearse en la investigación médica, por ejemplo, un monómero de dAb que se une a TNFRI humano y a TNFRI de ratón. Estos antagonistas proporcionan la ventaja de permitir realizar estudios preclínicos y clínicos empleando el mismo antagonista (por ejemplo, monómero de dAb) y obvian la necesidad de realizar estudios preclínicos con un antagonista sustituto adecuado. Los ejemplos preferidos de antagonistas con reactividad cruzada se unen a TNFRI humano y a TNFRI de roedor, tal como ratón, rata o cobaya, conejo, perro, oveja, cerdo o primate no humano, tal como mono cynomolgus o macaco rhesus.
En general, un antagonista que presenta reactividad cruzada de la invención se une a TNFRI humano y a TNFRI de otra especie con afinidades similares (Kd). Preferiblemente, los antagonistas de reactividad cruzada se unen a TNFRI humano y a TNFRI de otra especie con afinidades que se diferencian en no más de aproximadamente un factor de 1OO, un factor de 10 o un factor de 5. Por ejemplo, un monómero de dAb con reactividad cruzada puede unirse al TNFRI humano con una afinidad de 1 nM y también se unirá a TNFRI de ratón, de mono cynomolgus o de macaco rhesus con una afinidad de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 1OO nM, de aproximadamente 1OO pM a aproximadamente 10 nM, o de aproximadamente 2OO pM a aproximadamente 5 nM.
Los antagonistas de reactividad cruzada pueden unirse a TNFRI humano y a TNFRI de otra especie (por ejemplo, una de las especies no humanas mencionadas en los dos párrafos anteriores) con unas constantes de afinidad (Kon) que se diferencian en no más de aproximadamente un factor de 1OO, un factor de 10 o un factor de 5 y/o con unas constantes de disociación (Koff) que se diferencian en no más de aproximadamente un factor de 1OO, un factor de 10 o un factor de 5. Por ejemplo, los antagonistas pueden ser un monómero de dAb que se une a TNFRI humano y a TNFRI de otra especie con una Kon de aproximadamente 104M/s a aproximadamente 105M/s y/o una Koff de aproximadamente 1O'3 s_1 a aproximadamente 10's s-1.
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El antagonista de TNFR1 es un ligando (por ejemplo, un monómero de dAb) según se describe en la presente. Tal como se describe en la presente, los antagonistas de TNFR1 adecuados para su uso en la invención comprenden un dAb que se une a TNFrI e inhibe una función del TNFR1.
Los antagonistas de TNFRI preferiblemente se unen a su diana o dianas con una Kd de 300 nM a 5 pM (concretamente, de 3 x 10-7 a 5 x 10-12M), preferiblemente de 50 nM a 20 pM, o de 5 nM a 200 pM, o de 1 nM a 100 pM, 1 x 10-7 M o menos, 1 x 10-8 M o menos, 1 x 10-9 M o menos, 1 x 1o-10 M o menos, 1 x 1o-11 M o menos y/o una constante Koff de 5 x 1o-1 s-1 a 1 x 10-7 s-1, preferiblemente de 1 x 10-2 s-1 a 1 x 1o-6 s-1, o de 5 x 1o-3 s-1 a 1 x 1O-5 s-1,
0 5 x 1o-1 s-1 o menos, o 1 x 10-2 s-1 o menos, o 1 x 1o-3 s-1 o menos, o 1 x 1o-4 s-1 o menos, o 1 x 10-5 s-1 o menos, o
1 x 1o-6 s-1 o menos, según se determina mediante resonancia de plasmón de superficie. La constate Kd se define como Koff/Kon. Además o como alternativa, el ligando (por ejemplo, el monómero de dAb) se une a TNFRI con una Kon moderada o rápida, y una Koff lenta. Preferiblemente, la Kon es de aproximadamente 104 M/s a aproximadamente 105 M/s y/o la Koff es de aproximadamente 10-3 s-1 a aproximadamente 10-5 s-1.
Ligandos y monómeros de dAb que se unen a TNFRI
Los antagonistas de TNFRI que son adecuados para su uso en la invención son eficaces en modelos de enfermedades respiratorias cuando se administra una cantidad eficaz. En general, una cantidad eficaz es de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, o aproximadamente 10 mg/kg). En realizaciones concretas, se administran de aproximadamente 5 jg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, o preferiblemente de aproximadamente 50 jg/kg a aproximadamente 500 jg/kg.
En la técnica son conocidos varios modelos animales adecuados para enfermedades respiratorias, y los expertos en la técnica reconocen que son predictivos de la eficacia terapéutica en seres humanos. Por ejemplo, los modelos animales adecuados de enfermedad respiratoria incluyen modelos de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (véase, Groneberg, D.A. et al., Respiratory Research, 5:18 (2004)), y modelos de asma (véase, Coffman et al., J. Exp. Med., 201(12):1875-1879 (2o0i). Preferiblemente, el ligando o monómero de dAb es eficaz en el modelo subcrónico de ratón de enfermedad pulmonar obstructiva crónica inducida por el humo del tabaco descrito en la presente (véase, además, Wright y Churg, Chest, 122:301-306 (2002)). Por ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del ligando puede reducir, retrasar o prevenir la aparición de los síntomas de la COPD en el modelo, comparado con un control adecuado. La técnica anterior no sugiere el uso de antagonistas de TNFRI (por ejemplo, ligandos o monómeros de dAb) en estos modelos ni que aquellos fueran eficaces.
En general, los monómeros de dAb anti-TNFRI adecuados (por ejemplo, im ligando específico dual que comprende dicho dAb) se unen a TNFRI con una Kd de 300 nM a 5 pM (concretamente, de 3 x 10-7a 5 x 10-12M), preferiblemente de 50 nM a 20 pM, más preferiblemente 5 nM a 200 pM, y lo más preferiblemente de 1 nM a 100 pM, por ejemplo 1 x 10-7 M o menos, preferiblemente 1 x 10-8 M o menos, más preferiblemente 1 x 10-9 M o menos, de modo ventajoso 1 x 10-10M o menos, y lo más preferiblemente 1 x 1o-11 M o menos y/o una constante Koff de 5 x 1o-1 s-1 a 1 x lO-7 s-1, preferiblemente de 1 x 10-2 s-1 a 1 x 1o-6 s-1, más preferiblemente de 5 x 1o-3 s-1 a 1 x 10-5 s-1, por ejemplo 5 x 1O-1 s-1 o menos, preferiblemente 1 x 1O-2 s-1 o menos, de modo ventajoso 1 x 1O-3 s-1 o menos, más preferiblemente 1 x 1O-4 s-1 o menos, aún más preferiblemente 1 x 1O-5 s-1 o menos, y lo más preferiblemente 1 x 1O- 6 s-1 o menos, según se determina mediante resonancia de plasmón de superficie (Kd = Koff/Kon). Ciertos monómeros de dAb adecuados para su uso en la invención se unen específicamente al TNFRI humano con una Kd de 50 nM a 20 pM, y una constante Koff de 5 x 1O-1 s-1 a 1 x 1O-7 s-1, según se determina mediante resonancia de plasmón de superficie.
Algunos monómeros de dAb inhiben la unión de TNFa a TNFRI. Por ejemplo, algunos monómeros de dAb inhiben la unión de TNFa a TNFRI con una concentración inhibidora 50 (CI5O) de 5OO nM a 50 pM, preferiblemente de 1OO nM a 50 pM, más preferiblemente de 10 nM a 1OO pM, de modo ventajoso de 1 nM a 1OO pM, por ejemplo, 50 nM o menor, preferiblemente 5 nM o menor, más preferiblemente 5OO pM o menor, de modo ventajoso 2OO pM o menor, y lo más preferiblemente 1OO pM o menor. Preferiblemente, el TNFRI es TNFRI humano.
Otros monómeros de dAb no inhiben a unión de TNFa a TNFRI, pero son antagonistas porque inhiben la transducción de señales mediada a través de TNFRI. Por ejemplo, un monómero de dAb puede inhibir el agolpamiento inducido por TNFa de TNFRI, que precede a la transducción de señales a través de TNFRI. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un monómero de dAb puede unirse a TNFRI e inhibir la señalización mediada por TNFRI, peo no inhibe sustancialmente la unión de TNFa a TNFRI. En algunas realizaciones, el monómero de dAb inhibe el entrecruzamiento o el agolpamiento inducido por TNFa de TNFRI sobre la superficie de una célula. Estos dAb (por ejemplo, TAR2m-21-23 descrito en la presente) resultan ventajosos porque pueden antagonizar el TNFRI de la superficie celular, pero no reducen sustancialmente la actividad inhibidora del TnFRI soluble endógeno. Por ejemplo, el dAb puede unirse a TNFRI, pero inhibir la unión del TNFa al TNFRI en un ensayo de unión a receptor en no más de aproximadamente 10%, no más de aproximadamente 5%, no más de aproximadamente 4%, no más de aproximadamente 3%, no más de aproximadamente 2%, o no más de aproximadamente 1%. Además, en estas realizaciones, el dAb inhibe el entrecruzamiento inducido por TNFa de TNFRI y/o la señalización mediada por TNFRI en un ensayo celular convencional en al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al
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menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99%. Estos ligandos o monómeros de dAb proporcionan varias ventajas, tal como se analiza en la presente con respecto a los antagonistas que tienen estas propiedades. Por consiguiente, la administración de dicho monómero de dAb a un mamífero que lo necesite puede complementar las vías reguladoras endógenas que inhiben la actividad de TNFa y la actividad de TNFR1 in vivo.
Los monómeros de anticuerpos de dominio que se unen a TNFR1 tienen una huella pequeña, con relación a otros formatos de unión, tales como los anticuerpos monoclonales, por ejemplo. Así, dicho monómero de dAb puede bloquear selectivamente una función de TNFrI, pero no interfiere con otras funciones del TNFR1. Por ejemplo, un monómero de dAb que se une a TNFRI puede antagonizar al TNFRI (por ejemplo, inhibir la transducción de señales mediada por TNFRI), pero no inhibir la unión de TNFa a TNFRI o el desprendimiento del TNFRI.
En realizaciones de la descripción, el ligando es un monómero de dAb que se une a TNFRI y compite con TAR2m- 21-23 por la unión a TNFRI de ratón o compite con TAR2h-205 por la unión a TNFRI humano.
En otras realizaciones, el ligando es multivalente y comprende dos o más monómeros de dAb que se unen a TNFRI. Los ligandos multivalentes pueden contener dos o más copias de un dAb concreto que se une a TNFRI o contener dos o más dAb que se unen a TNFRI. Por ejemplo, el ligando puede ser un dímero, trímero o multímero que comprende dos o más copias de un dAb concreto que se une a TNFRI, o dos o más dAb diferentes que se unen a TNFRI. En algunos ejemplos, el ligando es un homodímero u homotrímero que comprende dos o tres copias de un dAb concreto que se une a TNFRI, respectivamente. Preferiblemente, un ligando multivalente no agoniza sustancialmente al TNFRI (actúa como agonista de TNFRI) en un ensayo celular convencional (concretamente, cuando está presente a una concentración de 1 nM, 10 nM, loo nM, 1 |jM, 10 |jM, 100 |jM, 1000 |jM o 5.000 |jM, produce no más de aproximadamente 5% de la actividad mediada por TNFRI inducida por TNFa (loo pg/ml) en el ensayo).
En ciertas realizaciones, el ligando multivalente contiene dos o más dAb que se unen a epitopos o dominios deseados del TNFRI, o dos o más copias de un dAb que se une a un epitopo deseado de TNFRI. Los ligandos de este tipo pueden unirse a TNFRI con una alta avidez y ser más selectivos para la unión a células que sobreexpresan TNFRI o expresan TNFRI sobre su superficie a mayor densidad que otros formatos de ligandos, tales como monómeros de dAb.
En otras realizaciones concretas, el ligando multivalente comprende dos o más dAb, o dos o más copias de un dAb concreto que se une a TNFRI. Los ligandos multivalentes de este tipo pueden unirse a monómeros de TNFRI con baja afinidad, pero se unen a receptores multímeros (por ejemplo, trímeros, véase en el complejo de receptor- ligando) con alta avidez. Así, Ios ligandos de este formato pueden administrarse para que se dirijan con eficacia a receptores diana que se han agrupado o asociado entre sí y/o al ligando (por ejemplo, TNFa) que son necesarios para la transducción de señales mediada por TNFRI.
Preferiblemente, el monómero de dAb neutraliza (inhibe la actividad) al TNFRI en un ensayo convencional (por ejemplo, Ios ensayos L929 convencionales o HeLa IL-8 convencionales descritos en la presente) con una dosis neutralizante 50 (Dn50) de 500 nM a 50 pM, preferiblemente de 100 nM a 50 pM, más preferiblemente de 10 nM a 100 pM, de modo ventajoso de 1 nM a 100 pM, por ejemplo, 50 nM o menor, preferiblemente 5 nM o menor, más preferiblemente 500 pM o menor, de modo ventajoso 200 pM o menor, y lo más preferiblemente 100 pM o menor. En otras realizaciones, el monómero de dAb se une a TNFRi y antagoniza la actividad de TNFRI en un ensayo de células convencional (por ejemplo, Ios ensayos L929 convencionales o HeLa IL-8 convencionales descritos en la presente) con una DN50 de < 100 nM y, a una concentración de < 10 jiM, el dAb agoniza la actividad del TNFRI en < 5% en el ensayo.
En otras realizaciones, el monómero de dAb se une específicamente a TNFRI con una Kd descrita en la presente e inhibe la letalidad en un modelo de choque séptico inducido por LPS/D-galactosamina de ratón convencional (es decir, evita la letalidad o reduce la letalidad en al menos aproximadamente 10%, comparado con un control adecuado). Preferiblemente, el monómero de dAb inhibe la letalidad al menos en aproximadamente 25%, o al menos en aproximadamente 50%, comparado con un control adecuado en un modelo de choque séptico inducido por LPS/D-galactosamina de ratón convencional cuando se administra a aproximadamente 5 mg/kg, o más preferiblemente a aproximadamente 1 mg/kg.
En realizaciones de la descripción, el monómero de dAb no agoniza sustancialmente al TNFRI (actúa como agonista de TNFRI) en un ensayo de células convencional, tal como Ios ensayos L929 convencionales o HeLa IL-8 convencionales descritos en la presente (concretamente, cuando está presente a una concentración de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 jiM, 10 jiM, 100 jiM, 1000 jiM o 5.000 jiM, produce no más de aproximadamente 5% de la actividad
mediada por TNFRI inducida por TNFa (lOo pg/ml) en el ensayo).
Moléculas de ácidos nucleicos, vectores y células hospedantes
La descripción también proporciona moléculas de ácidos nucleicos aisladas y/o recombinantes que codifican
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ligandos, tal como se describe en la presente. Los ácidos nucleicos Indicados en la presente como "aislados" son ácidos nucleicos que se han separado de los ácidos nucleicos del ADN genómico o ARN celular de su fuente de origen (por ejemplo, tal como existen en las células o en una mezcla de ácidos nucleicos, tal como un banco), e incluyen ácidos nucleicos obtenidos mediante métodos descritos en la presente u otros métodos adecuados, e incluyen ácidos nucleicos fundamentalmente puros, ácidos nucleicos producidos mediante síntesis química, mediante combinaciones de métodos biológicos y químicos, y ácidos nucleicos recombinantes que están aislados (véase, por ejemplo, Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9):2471-2476 (1991); Lewis, A.P. y J.S. Crowe, Gene, 101:297-302 (1991)).
Los ácidos nucleicos indicados en la presente como "recombinantes" son ácidos nucleicos que se han producido mediante la metodología del ADN recombinante, e incluyen los ácidos nucleicos que se generan mediante procedimientos que se basan en un método de recombinación artificial, tal como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y/o la clonación en un vector empleando enzimas de restricción.
Por ejemplo, la descripción proporciona un ácido nucleico aislado y/o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ligando que presenta especificidad de unión por el tNfRI, en el que dicho ligando comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un dAb que consiste en TAR 2H-131-511 (SEQ ID NO:379)
La descripción proporciona un ácido nucleico aislado y/o recombinante que codifica un ligando que presenta especificidad de unión por el TNFRI, tal como se describe en la presente, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de nucleótidos con una secuencia de nucleótidos que codifica el dAb anti-TNFRI TAR 2H-131-511 (SEQ ID NO:592). Preferiblemente, la identidad de secuencia de nucleótidos se determina a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos que codifica el dAb anti-TNFRI seleccionado.
La descripción también proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención. En ciertas realizaciones, el vector es un vector de expresión que comprende una o más secuencias o elementos de control de la expresión que están unidas operablemente al ácido nucleico recombinante de la invención. La descripción también proporciona una célula hospedante recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante o vector de la invención. Los vectores adecuados (por ejemplo, plásmidos, fágmidos), los elementos de control de la expresión, las células hospedantes y los métodos para producir células hospedantes recombinantes de la invención son muy conocidos en la técnica y en la presente se describen ejemplos.
Los vectores de expresión adecuados pueden contener una serie de componentes, por ejemplo, un gen marcador seleccionable, uno o más elementos de control de la expresión, tales como un elemento de control de la transcripción (por ejemplo, un promotor, un potenciador, un terminador) y/o una o más señales de traducción, una secuencia señal o una secuencia conductora, y similares. Los elementos de control de la expresión y una secuencia señal, si están presentes, pueden ser proporcionados por el vector u otra fuente. Por ejemplo, las secuencias de control transcripcional y/o traduccional de un ácido nucleico clonado que codifica una cadena de anticuerpo pueden emplearse para dirigir la expresión.
Puede proporcionarse un promotor para la expresión en una célula hospedante deseada. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, un promotor puede estar unido operablemente a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, una cadena de anticuerpo o una de sus porciones, de modo que dirija la transcripción del ácido nucleico. Están disponibles una diversidad de promotores adecuados para hospedantes procariotas (por ejemplo, promotores lac, tac, T3, T7 para E. coIi) y eucariotas (por ejemplo, promotor temprano o tardío del virus de simio 40, promotor de repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, promotor de citomegalovirus, promotor tardío de adenovirus).
Además, los vectores de expresión generalmente comprenden un marcador seleccionable para la selección de las células hospedantes que portan el vector y, en el caso de un vector de expresión replicable, un origen de la replicación. Los genes que codifican productos que confieren resistencia a antibióticos o a fármacos son marcadores seleccionables habituales y pueden usarse en células procariotas (por ejemplo, gen de lactamasa (resistencia a la ampicilina), gen Tet para la resistencia a la tetraciclina) y células eucariotas (por ejemplo, genes de resistencia a neomicina (G418 o geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina o higromicina). Los genes marcadores de dihidrofolato reductasa permiten la selección con metotrexato en una diversidad de hospedantes. Los genes que codifican el producto génico de marcadores auxotróficos del hospedante (por ejemplo, LEU2, URA3, HIS3) se emplean a menudo como marcadores seleccionables en levaduras. También se contempla el uso de vectores víricos (por ejemplo, baculovirus) o de fagos, que son capaces de integrarse en el genoma de la célula hospedante, tales como vectores retrovíricos. Los vectores de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero y células
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procariotas (E. coIÍ), células de insecto (células Schnieder S2 de Drosophila, Sf9) y levaduras (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) son muy conocidos en la técnica.
Las células hospedantes adecuadas pueden ser procariotas, incluyendo células bacterianas tales como E. coIÍ, B. subtilis y/u otras bacterias adecuadas; células eucariotas, tales como células fúngicas o de levadura (por ejemplo, Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa) u otras células de eucariotas inferiores, y células de eucariotas superiores, tales como de insecto (por ejemplo, células Schnieder S2 de Drosophila, células de insecto Sf9 (documento WO 94/26087 (O'Connor)), de mamífero (por ejemplo, células COS, tales como COS-1 (n.0 de registro ATCC CRL-1650) y COS-7 (n.0 de registro ATCC cRl- 1651), CHO (por ejemplo, n.o de registro aTcC CRL-9096, CHO DG44 (Urlaub, G. y Chasin, L.A., Proc. Nati. Acad. Scí. USA, 77(7):4216-4220 (198o))), 293 (n.o de registro ATCC CRL-1573), HeLa (n.o de registro ATCC CCL-2), CV1 (n.o de registro ATCC CCL-70), WOP (Dailey, L., et al., J. Virol., 54:739-749 (1985), 3T3, 293T (Pear, W. S., et al., Proc. Nati. Acad. Scí. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)), células NSO, SP2/0, células HuT 78 y similares, o vegetales (por ejemplo, tabaco) (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)). En algunas realizaciones, la célula hospedante es una célula hospedante aislada y no es parte de un organismo multicelular (por ejemplo, una planta o un animal). En realizaciones preferidas, la célula hospedante es una célula hospedante no humana.
La descripción también proporciona un método para producir un ligando para su uso en la invención, que comprende mantener una célula hospedante recombinante que comprende un ácido nucleico recombinante bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico recombinante, por lo cual el ácido nucleico recombinante se expresa y se produce un ligando. En algunas realizaciones, el método comprende además aislar el ligando.
Formatos de ligandos
A Ios ligandos y monómeros de dAb se les puede dar el formato de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos mono- o multiespecíficos o de estructuras que no son anticuerpos mono- o multíespecíficas. Los formatos adecuados incluyen cualquier estructura polipeptídíca adecuada en la que un dominio variable de anticuerpo o una o más de sus CdR pueden incorporarse para conferir a la estructura especificidad de unión por un antígeno. En la técnica se conoce una diversidad de formatos de anticuerpos adecuados, tales como formatos similares a IgG, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpo, cadenas ligeras de anticuerpo, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas y/o cadenas ligeras de anticuerpo, fragmentos de unión al antígeno de cualquiera de Ios anteriores (por ejemplo, un fragmento Fv (por ejemplo, Fv monocatenario (scFv), un Fv unido con disulfuro), un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2), un dominio variable único (por ejemplo, Vh, Vl, Vhh), un dAb, y las versiones modificadas de cualquiera de Ios anteriores (por ejemplo, modificadas por la unión covalente de un polialquilenglicol (por ejemplo, polietilenglicol, polipropílenglícol, polibutilenglicol) u otro polímero adecuado). Véase el documento pCt/GB03/002804, presentado el 30 de junio, 2003, que designa a EE. UU. (documento WO 2004/081026) que se refiere a la PEGilación de dominios variable únicos y dAb, a métodos adecuados para su preparación, a dominios variables únicos y monómeros y multímeros de dAb PEGilados con mayor semivida in vÍvo, a PEG adecuados, a Ios tamaños hidrodinámicos preferidos de Ios PEG, y Ios tamaños hidrodinámicos preferidos de Ios dominios variables únicos y monómeros y multímeros de dAb PEGilados.
Al ligando se le puede dar el formato de un dímero, un trímero o un polímero de Ios monómeros de dAb deseados, por ejemplo, empleando un conector adecuado, tal como (Gly4Ser)n, en el que n = de 1 a 8, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o 7. Sí se desea, Ios ligandos, incluyendo Ios monómeros, dímeros y trímeros de dAb, pueden unirse a una región Fc de anticuerpo, que comprende uno o ambos dominios Ch2 y Ch3 y, opcionalmente, una región de bisagra. Por ejemplo, pueden emplearse vectores que codifican ligandos unidos como una secuencia de nucleótídos individual a una región Fc para preparar dichos polipéptidos.
Los ligandos y monómeros de dAb también pueden combinarse y/o se les puede dar el formato de estructuras de multiligandos que no son anticuerpos para formar complejos multivalentes que se unen a moléculas diana con el mismo antígeno, proporcionando con ello una mayor avidez. Por ejemplo, pueden usarse receptores bacterianos naturales, tales como SpA, como andamiaje para el injerto de cDr para generar ligandos que se unen específicamente a uno o más epitopos. Los detalles de este procedimiento se describen en el documento US 5.831.012.
En la técnica se conoce una diversidad de métodos para preparar cualquier formato deseado. Por ejemplo, pueden prepararse formatos y cadenas de anticuerpos (por ejemplo, formatos similares a IgG, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpo, cadenas ligeras de anticuerpo, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas y/o cadenas ligeras de anticuerpo) mediante la expresión de construcciones de expresión adecuadas y/o cultivos de células adecuadas (por ejemplo, hibridomas, heterohibridomas, células hospedantes recombinantes que contienen construcciones recombinantes que codifican el formato). Además, pueden prepararse formatos, tales como fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos o cadenas de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento Fv (por ejemplo, un Fv monocatenario (scFv), un Fv unido con disulfuro), un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2) mediante la expresión de construcciones de expresión adecuadas o mediante digestión
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enzimática de anticuerpos, por ejemplo, empleando papaína o pepsina.
Al ligando se le puede dar el formato de un ligando específico dual o un ligando multiespecífico, por ejemplo, tal como se describen en el documento WO 03/002609. Los ligandos específicos duales comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades de unión. Estos ligandos específicos duales pueden comprender combinaciones de dominios de cadena pesada y ligera. Por ejemplo, el ligando específico dual puede comprender un dominio Vh y un dominio Vl, que pueden estar unidos entre sí en forma de un scFv (por ejemplo, empleando un conector adecuado, tal como Gly4Ser), o se les puede dar el formato de un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión al antígeno de este (por ejemplo, un fragmento F(ab')2). Los ligandos específicos duales no comprenden parejas de Vh/Vl complementarias que forman un sitio de unión al antígeno de anticuerpo bicatenario convencional que se une al antígeno o al epitopo de modo cooperativo. En lugar de esto, los ligandos de formato dual comprenden una pareja complementaria de Vh/Vl, en la que los dominios V tienen diferentes especificidades de unión.
Además, los ligandos específicos duales pueden comprender uno o más dominios Ch o Cl si es necesario. También puede incluirse un dominio de región de bisagra si se desea. Estas combinaciones de dominios pueden, por ejemplo, imitar a los anticuerpos naturales, tales como IgG o IgM, o sus fragmentos, tales como moléculas de Fv, scFv, Fab o F(ab')2. Se contemplan otras estructuras, tales como un solo brazo de una molécula de IgG que comprende los dominios Vh, Vl, Ch1 y Cl. Preferiblemente, el ligando específico dual de la invención comprende solo dos dominios variables, aunque varios de estos ligandos pueden incorporarse juntos en la misma proteína, por ejemplo, dos de estos ligandos pueden incorporarse en una IgG o una inmunoglobulina multimérica, tal como IgM. Como alternativa, en otra realización, se combina una pluralidad de ligandos específicos duales para formar un multímero. Por ejemplo, dos ligandos específicos duales diferentes se combinan para crear una molécula tetraespecífica. Los expertos en la técnica apreciarán que las regiones variables ligera y pesada de un ligando específico dual producido según el método de la presente invención pueden estar en la misma cadena polipeptídica o, como alternativa, en diferentes cadenas polipeptídicas. En el caso de que las regiones variables estén sobre diferentes cadenas polipeptídicas, entonces pueden unirse a través de un conector, en general un conector flexible (tal como una cadena polipeptídica), un grupo conector químico o cualquier otro método conocido en la técnica.
El ligando multiespecífico posee más de una especificidad de unión al epitopo. En general, el ligando multiespecífico comprende dos o más dominios de unión al epitopo, tales como dAb o un dominio de proteína que no es un anticuerpo, que comprende un sitio de unión para un epitopo, por ejemplo, un aficuerpo, un dominio de SpA, un dominio de clase A de un receptor de LDL, un dominio de EGF, un avímero. A los ligandos multiespecíficos después se les otorga un formato, tal como se describe en la presente.
Formatos de semivida larga
A un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando, monómero, dímero o multímero de dAb, formato específico dual, formato multiespecífico) se le puede dar un formato para alargar su semivida en suero in vivo. Una mayor semivida in vivo es útil en aplicaciones in vivo de inmunoglobulina, en especial anticuerpos, y más en especial fragmentos de anticuerpos de pequeño tamaño, tales como dAb. Estos fragmentos (Fv, Fv unidos con disulfuro, Fab, scFv, dAb) son eliminados rápidamente del cuerpo, lo cual puede limitar gravemente sus aplicaciones clínicas.
A un antagonista de TNFR1 se le puede dar un formato para que tenga un tamaño hidrodinámico mayor, por ejemplo, mediante la unión de un grupo de polialquilenglicol (por ejemplo, un grupo polietilenglicol (PEG)), albúmina de suero, transferrina, receptor de transferrina o al menos su porción de unión a transferrina, una región Fc de anticuerpo, o mediante conjugación con un dominio de anticuerpo. En algunas realizaciones, el antagonista (por ejemplo, ligando, monómero de dAb) está PEGilado. Preferiblemente, el antagonista PEGilado (por ejemplo, ligando, monómero de dAb) se une a TNFR1 sustancialmente con la misma afinidad que el mismo ligando que no está PEGilado. Por ejemplo, el ligando puede ser un monómero de dAb PEGilado que se une a TNFR1, en el que el monómero de dAb PEGilado se une a TNFR1 con una afinidad que se diferencia de la afinidad de un dAb en una forma no PEGilada en no más de un factor de aproximadamente 1000, preferiblemente no más de un factor de aproximadamente 100, más preferiblemente no más de un factor de aproximadamente 10, o con una afinidad sustancialmente igual con relación a la forma no PEGilada.
A Ios antagonistas pequeños, tales como un monómero de dAb, se les puede dar un formato de un fragmento de unión al antígeno más grande de un anticuerpo o de un anticuerpo (por ejemplo, el formato de Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv). El tamaño hidrodinámico de un antagonista (por ejemplo, ligando, monómero de dAb) y su semivida en suero también se pueden aumentar conjugando o uniendo el antagonista a un dominio de unión (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) que se une a un antígeno o a un epitopo que aumenta la semivida in vivo, tal como se describe en la presente.
Generalmente, un polipéptido que potencia la semivida en suero in vivo es un polipéptido que aparece en la naturaleza in vivo y que resiste la degradación o la eliminación mediante mecanismos endógenos que eliminan el material no deseado del organismo (por ejemplo, humano). Por ejemplo, puede seleccionarse un polipéptido que potencia la semivida en suero in vivo de proteínas de la matriz extracelular, proteínas que se encuentran en la sangre, proteínas que se encuentran en la barrera hematoencefálica o en tejido neuronal, proteínas que aparecen
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en el riñón, hígado, pulmón, corazón, piel o huesos, proteínas de estrés, proteínas específicas de enfermedad, o proteínas implicadas en el transporte de Fc.
Los expertos en la técnica están familiarizados con métodos para el análisis farmacocinético y la determinación de la semivida de ligandos.
Preparación de ligandos basados en inmunoglobulinas
Los agentes de unión, los antagonistas, los ligandos y los dAb, tal como se describen en la presente, pueden prepararse según técnicas previamente establecidas que se emplean en el campo de la modificación de anticuerpos para la preparación de scFv, anticuerpos de "fagos" y otras moléculas de anticuerpos modificadas. Las técnicas para la preparación de anticuerpos se describen, por ejemplo, en los siguientes artículos y en las referencias citadas en estos: Winter y Milstein (1991), Nature, 349:293-299; Pluckthun (1992), Immunological Reviews, 130:151- 188; Wright et al. (1992), Crti. Rev. Immunol., 12:125-168; Holliger, P. y Winter, G. (1993), Curr. Op. Biotechn., 4, 446-449; Cárter, et al. (1995), J. Hematother., 4, 463-470; Chester, K.A. y Hawkins, R.E. (1995), Trends Biotechn., 13, 294-300; Hoogenboom, H.R. (1997), Nature Biotechnol., 15, 125-126; Fearon, D. (1997), Nature Biotechnol., 15, 618-619; Plückthun, A. y Pack, P. (1997), Immunotechnology, 3, 83-105; Cárter, P. y Merchant, A.M. (1997), Curr. Opin. Biotechnol., 8, 449-454; Holliger, P. y Winter, G. (1997), Cáncer Immunol. Immunother., 45,128-130.
Las técnicas adecuadas empleadas para la selección de dominios variables de anticuerpo con una especificidad deseada emplean bancos y procedimientos de selección que son conocidos en la técnica. Los expertos en la técnica conocerán bancos naturales (Marks et al. (1991), J. Mol. Biol., 222: 581; Vaughan et al. (1996), Nature Biotech., 14: 309) que emplean genes V redispuestos recolectados de células B humanas. Los bancos sintéticos (Hoogenboom y Winter (1992), J. Mol. Biol., 227:381; Barbas et al. (1992), Proc. Nati. Acad. ScI. USA, 89:4457; Nissim et al. (1994), EMBO J., 13:692; Griffiths et al. (1994), EMBO J., 13:3245; De Kruif et al. (1995), J. Mol. Biol., 248:97) se preparan clonando genes V de inmunoglobulina, habitualmente empleando una PCR. Los errores en el proceso de la PCR pueden conducir a un alto grado de aleatorización. Los bancos de Vh y/o Vl pueden seleccionarse frente a antígenos o epitopos diana por separado, en cuyo caso se selecciona directamente la unión a un dominio único, o conjuntamente.
Sistemas de vectores de bancos
En la técnica se conoce una diversidad de sistemas de selección que son adecuados para su uso. A continuación se ofrecen ejemplos de dichos sistemas.
Los sistemas de expresión del bacteriófago lambda pueden seleccionarse directamente como placas de bacteriófagos o como colonias de lisógenos, tal como se ha descrito previamente (Huse et al. (1989), Science, 246:1275; Catón y Koprowski (1990), Proc. Nati. Acad. ScI. U.S.A., 87; Mullinax et al. (1990), Proc. Nati. Acad. ScI. U.S.A., 87:8095; Persson et al. (1991), Proc. Nati. Acad. ScI. U.S.A., 88:2432) y pueden utilizarse en la Invención. Aunque dichos sistemas de expresión pueden emplearse para seleccionar hasta 106 miembros diferentes de un banco, no son muy adecuados para seleccionar un número mayor de miembros (más de 106 miembros). De uso concreto en la construcción de bancos se incluyen los sistemas de presentación de selección, que permiten conectar un ácido nucleico al polipéptido que expresa. Tal como se emplea en la presente, un sistema de presentación de selección es un sistema que permite la selección, a través de medios de presentación adecuados, de los miembros individuales del banco mediante la unión a ligandos genéricos y/o diana.
Los protocolos de selección para aislar miembros deseados de bancos grandes son conocidos en la técnica, y son tipificados por las técnicas de presentación de fagos. Estos sistemas, en los que secuencias peptídicas diversas se presentan sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos (Scott y Smith (1990), Science, 249:386), han demostrado ser útiles para crear bancos de fragmentos de anticuerpos (y las secuencias de nucleótidos que los codifican) para la selección y la amplificación in vitro de fragmentos de anticuerpos específicos que se unen a un antígeno diana (McCafferty et al., documento WO 92/01047). Las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables se unen a fragmentos génicos que codifican señales conductoras que les dirigen al especio perlplásmlcó de E. coli y, como resultado, los fragmentos de anticuerpos resultantes son presentados sobre la superficie del bacteriófago, generalmente como fusiones con proteínas de la envuelta del bacteriófago (por ejemplo, plll o pVIII). Como alternativa, los fragmentos de anticuerpos se presentan externamente sobre las cápsidas de fagos lambda (fagocuerpos). Una ventaja de los sistemas de presentación basados en fagos es que, debido a que son sistemas biológicos, los miembros del banco seleccionados pueden amplificarse simplemente cultivando el fago que contiene el miembro del banco seleccionado en células bacterianas. Además, puesto que la secuencia de nucleótidos que codifica el miembro del banco de polipéptidos está contenida en un vector de fago o de fágmido, la secuenciación, la expresión y la posterior manipulación genética es relativamente sencilla.
Los métodos para construir bancos de presentación de anticuerpos de bacteriófagos y bancos de expresión de fagos lambda son muy conocidos en la técnica (McCafferty et al. (1990), Nature, 348:552; Kang et al. (1991), Proc. Nati. Acad. ScI. U.S.A., 88:4363; Clackson et al. (1991), Nature, 352:624; Lowman et al. (1991), Biochemistry, 30:10832; Burton et al. (1991), Proc. Nati. Acad. ScI. U.S.A., 88:10134; Hoogenboom et al. (1991), Nucleic Acids Res., 19:4133; Chang et al. (1991), J. Immunol., 147:3610; Breitling et al. (1991), Gene, 104:147; Marks et al. (1991),
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supra; Barbas et al. (1992), supra; Hawkins y Winter (1992), J. Immunol., 22:867; Marks et al., 1992, J. BíoI. Chem., 267:16007; Lerner et al. (1992), Science, 258:1313.
Una estrategia particularmente ventajosa ha consistido en el uso de bancos de fagos y scFv (Huston et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Scí. U.S.A., 85:5879-5883; Chaudhary et al. (1990), Proc. Nati. Acad. Scí. U.S.A., 87:1066-1070; McCafferty et al. (1990), supra; Clackson et al. (1991), Nature, 352:624; Marks et al. (1991), J. MoI. BíoI., 222:581; Chiswell et al. (1992), Trends Biotech., lO:80; Marks et al. (1992), J. BíoI. Chem., 267). Se han descrito diversas realizaciones de bancos de scFv presentados sobre proteínas de la envuelta de bacteriófagos. También se conocen algunos perfeccionamientos de las estrategias de presentación de fagos, por ejemplo, como se describe en Ios documentos WO96/06213 y WO92/01047 (Medical Research Council et al.) y el documento WO97/08320 (Morphosys).
Otros sistemas para generar bancos de polipéptidos implican el uso de una maquinaria enzimática sin células para la síntesis ln vltro de miembros del banco. En un método, se seleccionan moléculas de ARN por medio de rondas alternantes de selección frente a un ligando diana y amplificación con PCR (Tuerk y Gold (1990), Science, 249:505; Ellington y Szostak (1990), Nature, 346:818). Puede emplearse una técnica similar para identificar secuencias de ADN que se unen a un factor de transcripción humano predeterminado (Thiesen y Bach (1990), Nucleic Acids Res., 18:3203; Beaudry y Joyce (1992), Science, 257:635; documentos WO92/05258 y W092/14843). De modo similar, puede emplearse la traducción ln vltro para sintetizar polipéptidos como un método para generar bancos grandes. Estos métodos que comprenden, en general, complejos de polisomas estabilizados, se describen más a fondo en Ios documentos WO88/08453, WO90/05785, W09O/O7OO3, WO91/02076, WO91/05058, WO92/02536. Otros sistemas de presentación que no están basados en fagos, como Ios descritos en Ios documentos W095/22625 y W095/11922 (Affymax) emplean Ios polisomas para presentar polipéptidos para la selección.
Otra categoría de técnicas implica la selección de repertorios en compartimentos artificiales, que permiten la conexión de un gen con su producto génico. Por ejemplo, un sistema de selección en el que Ios ácidos nucleicos que codifican productos génicos deseables pueden seleccionarse en microcápsulas formadas por emulsiones de agua en aceite se describe en Ios documentos WO99/02671, WOOO/4O712 y en Tawfik y Griffiths (1998), Nature Biotechnol., 16(7), 652-656. Los elementos genéticos que codifican un producto génico con una actividad deseada se compartimentalizan en microcápsulas y después se transcriben y/o se traducen para producir sus respectivos productos génicos (ARN o proteína) dentro de las microcápsulas. Después Ios elementos genéticos que producen un producto génico con la actividad deseada se clasifican. Esta estrategia selecciona productos génicos de interés detectando la actividad deseada mediante una diversidad de medios.
Construcción de bancos
Pueden construirse bancos previstos para la selección empleando técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo como se indicó anteriormente, o pueden adquirirse en fuentes comerciales. Los bancos que son útiles en la presente invención se describen, por ejemplo, en el documento WO99/20749. Tras haber elegido un sistema de vectores y que una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de interés se hayan clonado en el vector del banco, se puede generar diversidad dentro de las moléculas clonadas realizando una mutagénesis antes de la expresión; como alternativa, las proteínas codificadas pueden expresarse y seleccionarse, tal como se describió anteriormente, antes de la mutagénesis y se realizan más rondas de selección. La mutagénesis de secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos estructuralmente optimizados se realiza empleando métodos moleculares convencionales. De uso concreto se incluye la reacción en cadena de polimerasa o PCR (MuIIís y Faloona (1987), Methods Enzymol., 155:335. La PCR, que emplea múltiples ciclos de replicación del ADN catalizados por una ADN polimerasa dependiente de ADN termoestable para amplificar la secuencia diana de interés, es muy conocida en la técnica. La construcción de diversos bancos de anticuerpos se ha analizado en Winter et al. (i994), Ann. Rev. Immunology, 12, 433-455, y las referencias citadas en este artículo.
La PCR se realiza empleando un ADN molde (al menos 1 fg; de modo más útil, 1-1OOO ng) y al menos 25 pmol de cebadores oligonucleotídícos; puede resultar ventajoso emplear una cantidad mayor de cebador cuando el grupo de cebadores es muy heterogéneo, puesto que cada secuencia es representada solo por una pequeña fracción de las moléculas en el grupo, y las cantidades se hacen limitantes en Ios ciclos de amplificación posteriores. Una mezcla de reacción típica incluye: 2 |jl de ADN, 25 pmol de cebador oligonucleotídico, 2,5 |jl de 1OX tampón 1 de PCR (Perkin-Elmer, Foster City, cA), 0,4 jl de dNTp 1,25 jM, 0,15 jl (o 2,5 unidades) de ADN polimerasa Taq (Perkin Elmer, Foster City, CA) y agua desionizada hasta un volumen total de 25 jl. El aceite mineral se extiende por encima y se realiza la PCR empleando un termociclador programable. La longitud y la temperatura de cada etapa de un ciclo de PCR, así como el número de ciclos, se ajusta según Ios requisitos de rigurosidad vigentes. La temperatura de reasociación y el cronometraje vienen determinados por la eficacia con la que cual se espera que un cebador se reasocie a un molde y por el grado de apareamiento incorrecto que se va a tolerar; obviamente, cuando las moléculas de ácidos nucleicos se amplifican y mutagenizan simultáneamente, se requiere un apareamiento incorrecto, al menos en la primera ronda de síntesis. La capacidad de optimizar la rigurosidad de las condiciones de reasociación de cebadores está dentro de Ios conocimientos de Ios expertos en la técnica. Se emplea una temperatura de reasociación de entre 30 °C y 72 °C. La desnaturalización inicial de las moléculas de molde normalmente se produce entre 92 °C y 99 °C durante 4 minutos, seguido de 2O-4O ciclos que consisten en
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desnaturalización (94-99 °C durante 15 segundos a 1 minuto), reasociación (la temperatura se determina según se analizó anteriormente; 1-2 minutos), y extensión (72 °C durante 1-5 minutos, dependiendo de la longitud del producto amplificado). La extensión final se realiza en general durante 4 minutos a 72 °C, y puede ser seguida de una etapa indefinida (0-24 horas) a 4° C.
Combinación de dominios variables únicos
Los dominios, después de ser seleccionados, pueden combinarse mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica, que incluyen métodos covalentes y no covalentes. Los métodos preferidos incluyen el uso de conectores polipeptídicos según se describe, por ejemplo, con relación a moléculas de scFv en Bird et al., (1988), Science, 242:423-426. Un análisis de conectores adecuados se proporciona en Bird et al. Science, 242, 423426; Hudson et al, Journal Immunol Methods, 231 (1999), 177-189; Hudson et al., Proc. Nat. Acad. Scí. USA, 85, 5879-5883. Los conectores son preferiblemente flexibles, lo cual permite que dos dominios únicos interaccionen. Un ejemplo de conector es un conector de (Gly4Ser)n, en el que n = 1 a 8, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 7. También pueden emplearse los conectores usados en diacuerpos, que son menos flexibles (Holliger et al. (1993), PNAS (USA), 90:6444-6448). En una realización, el conector empleado no es una región de bisagra de inmunoglobulina.
Los dominios variables pueden combinarse empleando otros métodos distintos de los conectores. Por ejemplo, el uso de puentes disulfuro, proporcionados a través de restos cisterna naturales o modificados, puede aprovecharse para estabilizar dímeros de Vh-Vh, Vl-Vl o Vh-Vl (Reiter et al. (1994), Protein Eng., 7:697-704) o remodelando la interfase entre los dominios variables para mejorar el "ajuste" y, por tanto, la estabilidad de interacción (Ridgeway et al. (1996), Protein Eng., 7:617-621; Zhu et al. (i997), Protein Science, 6:781-788). Pueden emplearse otras técnicas para unir o estabilizar dominios variables de inmunoglobulinas y, en particular, dominios Vh de anticuerpo, según sea apropiado.
Caracterización de ligandos
La unión de un ligando (por ejemplo, monómero de dAb, ligando específico dual) a su antígeno o antígenos o epitopo o epitopos específicos puede ensayarse por medio de métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen eLisA. En una realización preferida de la invención, el ensayo se realiza empleando ELISA de fagos monoclonales. El ELISA de fagos puede realizarse según cualquier procedimiento adecuado. A continuación se indica un ejemplo de protocolo.
Poblaciones de fagos producidos en cada ronda de selección pueden seleccionarse mediante ELISA para la unión al antígeno o epitopo seleccionado para identificar anticuerpos de fagos "policlonales". Después, los fagos procedentes de colonias bacterianas infectadas individuales de estas poblaciones pueden seleccionarse mediante ELISA para identificar los anticuerpos de fagos "monoclonales". También resulta deseable seleccionar fragmentos de anticuerpos solubles para su unión a un antígeno o un epitopo, y esto también puede realizarse mediante ELISA empleando reactivos, por ejemplo, contra un marcador C- o N-terminal (véase, por ejemplo, Winter et al. (1994), Ann. Rev. Immunology, 12, 433-55 y las referencias citadas en este artículo.
La diversidad de los anticuerpos monoclonales de fagos seleccionados también puede evaluarse mediante una electroforesis en gel de los productos de la PCR (Marks et al., 1991, supra; Nissim et al., 1994 supra), con sondas (Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol., 227, 776) o mediante secuenciación del ADN del vector.
Estructura de los ligandos
En el caso de que los dominios variables se seleccionen a partir de repertorios de genes V seleccionados, por ejemplo, empleando la tecnología de presentación de fagos como se describe en la presente, estos dominios variables comprenden una región de marco universal, de modo que puede ser reconocida por un ligando genérico específico, tal como se define en la presente. El uso de marcos universales, ligandos genéricos y similares se describe en el documento WO99/20749.
Cuando se emplean repertorios de genes V, la variación en la secuencia del polipéptido preferiblemente se localiza dentro de los bucles estructurales de los dominios variables. Las secuencias de polipéptidos de cualquiera de los dominios variables pueden alterarse mediante reordenamiento del ADN o mediante mutación para potenciar la interacción de cada dominio variable con su par complementario. El reordenamiento del ADN es conocido en la técnica y se describe, por ejemplo, en Stemmer, 1994, Nature, 370:389-391 y la patente de EE. UU. n.0 6.297.053, incorporándose ambos en la presente como referencia. Los expertos en la técnica conocen otros métodos de mutagénesis.
En general, las moléculas de ácidos nucleicos y las construcciones de vectores necesarias para la selección, la preparación y la asignación de formato a ligandos pueden construirse y manipularse como se indica en los manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, EE. UU.
La manipulación de los ácidos nucleicos útiles en la presente invención generalmente se realiza en vectores recombinantes.
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Tal como se emplea en la presente, un vector se refiere a un elemento discreto que se usa para Introducir ADN heterólogo en células para su expresión y/o replicación. Los métodos para seleccionar o construir y, posteriormente, utilizar dichos vectores son muy conocidos por los expertos en la técnica. Numerosos vectores son de acceso público, e incluyen plásmidos bacterianos, bacteriófagos, cromosomas artificiales y vectores episómicos. Estos vectores pueden utilizarse para la clonación y mutagénesis sencillas; como alternativa, se emplea un vector de expresión de genes. Un vector para su uso según la invención puede seleccionarse para que incluya una secuencia codificadora de polipéptido de un tamaño deseado, generalmente de 0,25 kilobases (kb) a 40 kb o más de longitud. Una célula hospedante adecuada se transforma con el vector después de manipulaciones de clonación in vitro. Cada vector contiene diversos componentes funcionales, que en general incluyen un sitio de clonación (o "policonector"), un origen de la replicación y al menos un gen marcador seleccionable. Si un vector concreto es un vector de expresión, este posee además uno o más de los siguientes: elemento potenciador, promotor, secuencias de terminación de la transcripción y señal, cada uno colocado cerca del sitio de clonación de modo que están unidos operablemente al gen que codifica un ligando según la invención.
Los vectores de clonación y de expresión en general contienen secuencias de ácidos nucleicos que permiten que el vector se replique en una o más células hospedantes seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación, esta secuencia permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del hospedante e incluye orígenes de la replicación o secuencias de replicación autónoma. Estas secuencias son muy conocidas para una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación procedente del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 micron es adecuado para levaduras, y diversos orígenes víricos (por ejemplo, SV40, adenovirus) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. En general, no es necesario un origen de la replicación para vectores de expresión de mamífero, a menos que se empleen en células de mamífero capaces de replicar altos niveles de ADN, tales como células COS.
De modo ventajoso, un vector de clonación o de expresión puede contener un gen de selección, que también se denomina marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de las células hospedantes transformadas en un medio de cultivo selectivo. Por tanto, las células hospedantes no transformadas con el vector que contienen el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, complementan deficiencias auxotróficas o suministran nutrientes esenciales que no están disponibles en el medio de crecimiento.
Puesto que la replicación de vectores que codifican un ligando según la presente invención se realiza de modo más conveniente en E. coIÍ, se empleará un marcador seleccionable de E. coIi', por ejemplo, el gen de p-lactamasa que confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Estos pueden obtenerse de plásmidos de E. coIÍ, tales como pBR322, o un plásmido pUC, tal como pUC18 o pUC19.
Los vectores de expresión habitualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedante y que está unido operablemente a la secuencia codificadora de interés. Este promotor puede ser inducible o constitutivo. La expresión "unido operablemente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite actuar según su manera prevista. Una secuencia de control "unida operablemente" a una secuencia codificadora está unida de tal forma que se logra la expresión de la secuencia codificadora bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.
Los promotores adecuados para su uso con hospedantes procariotas incluyen, por ejemplo, los sistemas de promotor de p-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema de promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos, tales como el promotor tac. Los promotores para su uso en sistema bacterianos también contienen en general una secuencia de Shine-Delgarno unida operablemente a la secuencia codificadora.
Los vectores preferidos son vectores de expresión que permiten la expresión de una secuencia de nucleótidos que se corresponde con un miembro de un banco de polipéptidos. Así, la selección con el primer y/o segundo antígeno o epitopo puede realizarse mediante la propagación y la expresión separadas de un único clon que expresa el miembro del banco de polipéptidos o mediante el uso de cualquier sistema de presentación de selección. Tal como se describió anteriormente, el sistema de presentación de selección preferido es la presentación de bacteriófagos. Así, pueden utilizarse vectores de fagos o de fágmidos, por ejemplo pITI o pIT2. Las secuencias conductoras útiles en la invención incluyen pelB, stll, ompA, phoA, bla y pelA. Un ejemplo son vectores de fágmido que contienen un origen de la replicación de E. coIÍ. (para la replicación bicatenaria) y también un origen de la replicación de fago (para la producción de ADN monocatenario). La manipulación y la expresión de dichos vectores son muy conocidas en la técnica (Hoogenboom y Winter (1992), supra; Nissim et al. (1994), supra). Brevemente, el vector contiene un gen de p-lactamasa para conferir selectividad al fágmido y un promotor lac cadena arriba de un módulo de expresión que consiste (N a C terminal) en una secuencia conductora pelB (que dirige el polipéptido expresado hacia el espacio periplásmico), un sitio de clonación múltiple (para clonar la versión de nucleótidos del miembro del banco), opcionalmente uno o más marcadores peptídicos (para la detección), opcionalmente uno o más codones de fin TAG y la proteína de fago plll. Así, empleando diversas cepas supresoras y no supresoras de E. coIÍ y con la adición de glucosa, isopropil tio-p-D-galactósido (IPTG) o un fago auxiliar, tal como VCS M13, el vector es capaz de replicarse como un plásmido sin expresión, producir solo grandes cantidades del miembro del banco de polipéptidos o producir
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fagos, algunos de Ios cuales contienen al menos una copla de la fusión de pollpéptldo-plM sobre su superficie.
La construcción de vectores que codifican ligandos emplea técnicas de acoplamiento convencionales. Los vectores aislados o fragmentos de ADN se rompen, se modifican como desee y se reacoplan en la forma deseada para generar el vector requerido. Si se desea puede realizarse un análisis para confirmar que las secuencias correctas están presentes en el vector construido, de una manera conocida. Los métodos adecuados para construir vectores de expresión, para preparar transcritos in vitro, para introducir ADN en células hospedantes y para realizar análisis para evaluar la expresión y la función son conocidos por Ios expertos en la técnica. La presencia de una secuencia génica en una muestra se detecta, o su amplificación y/o expresión se cuantifica por medio de métodos convencionales, tales como un análisis Southern o Northern, un análisis de la transferencia Western, una transferencia por punto del ADN, ARN o proteínas, una hibridación in situ, por inmunocitoquímica o análisis de la secuencia de moléculas de ácidos nucleicos o de proteínas. Los expertos en la técnica comprenderán con facilidad el modo en que pueden modificarse estos métodos si se desea.
Ensayo de unión al receptor
Los antagonistas de TNFR1 que inhiben la unión de TNFa a TNFR1 pueden identificarse en un ensayo de unión al receptor adecuado. Brevemente, se incuban placas Maxisorp durante la noche con 30 mg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón anti-Fc humano (Zymed, San Francisco, EE. UU. ). Los pocilios se lavan con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene Tween-20 al 0,05% y después se bloquean con BSA al 1% en PBS antes de incubarse con 100 ng/ml de proteínas de fusión de TNFR1-Fc (R&D Systems, Minneapolis, EE. UU.). Los antagonistas de TNFR1 se mezclan con TNF que se añade a Ios pocilios lavados a una concentración final de 10 ng/ml. Se detecta la unión del TNF con 0,2 mg/ml de anticuerpo anti-TNF biotinilado (HyCult Biotechnology, Uben, Países Bajos), seguido de una dilución 1 en 500 de estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano (Amersham Biosciences, Reino Unido) y después se realiza una incubación con sustrato de TMB (KPL, Gaithersburg, EE. UU.). La reacción puede detenerse mediante la adición de HCl y la absorbancia se lee a 450 nm. Los antagonistas de TNFR1 que inhiben la unión de TNFa a TNFR1 conducen a una disminución en la unión de TNF y, por tanto, a una disminución en la absorbancia comparado con el control con TNF soIo.
Ensayo de citotoxicidad de L929
Los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, monómeros de dAb) pueden identificarse por la capacidad para inhibir la citotoxicidad inducida por TNF en fibroblastos L929 de ratón (Evans, T. (2000), Molecular Biotechnology, 15, 243-248). Brevemente, células L929 cultivadas en placas de microtitulación se incuban durante la noche con un antagonista de TNFR1, TNF 100 pg/ml, y actinomicina D 1 mg/ml (Sigma, Poole, Reino Unido). Se mide la viabilidad celular leyendo la absorbancia a 490 nm, seguido de una incubación con [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (Promega, Madison, EE. UU.). Los antagonistas de TNFR1 inhibirán la citotoxicidad y, por tanto, producirán un aumento en la absorbancia, comparado con el control con TNF soIo.
Ensayo de HeLa IL-8
Los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, monómeros de dAb) pueden identificarse por la capacidad para inhibir la secreción inducida por tNf de IL-8 por células HeLa humanas (un método adaptado de Akeson, L. et al. (1996), Journal of Biological Chemistry, 271, 30517-30523, que describe la inducción de IL-8 por IL-1 en HUVEC; en la presente se analiza la inducción por TNF-alfa humano y se emplean células HeLa en lugar de la línea celular HUVEC). Brevemente, pueden cultivarse células HeLa en placas de microtitulación durante la noche con un antagonista de TNFR1 y TNF 300 pg/ml. Después de la incubación, el sobrenadante se aspira de las células y se mide la concentración de IL-8 empleando un ELISA de "sandwich" (R&D Systems), u otro método adecuado. Los antagonistas de TNFR1 inhiben la secreción de IL-8 y se detecta menos IL-8 en el sobrenadante comparado con el control con TNF soIo.
Ensayo de liberación de MRC-5 IL-8
Los antagonistas de TNFR1 humano pueden identificarse empleando el siguiente ensayo de células MRC-5. El ensayo se basa en la inducción de la secreción de IL-8 por TNF en células MRC-5 y está adaptado del método descrito en Alceson, L. et al., Journal of Biological Chemistry, 271:30517-30523 (1996), que describe la inducción de IL-8 por IL-1 en HUVEC. Brevemente, se cultivan células mRC-5 en placas de microtitulación y las placas se incuban durante la noche con un antagonista de TNFR1 y TNFa humano (300 pg/ml). Después de la incubación, se aspira el sobrenadante del cultivo y se mide la concentración de IL-8 en el sobrenadante mediante un ELISA de "sandwich" (R&D Systems), u otro método adecuado. Los antagonistas de TNFR1 producen una disminución en la secreción de IL-8 hacia el sobrenadante comparado con pocilios control que se incuban soIo con TNFa.
Ejemplos
Ejemplo 1: Un antagonista de TNFR1 administrado localmente al tejido pulmonar es eficaz en un modelo subcrónico de COPD en ratones C57BL/6
En este estudio, un antagonista de TNFR1 (monómero de dAb anti-TNFRI (TAR2iti21-23)) y un antagonista de TNF
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(ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)) se administran localmente al pulmón mediante administración intranasal 1 hora antes de cada exposición al aire o al humo del tabaco ("tobáceo smoke", TS). Los efectos de los cambios inducidos por el TS en los índices inflamatorios pulmonares inducidos por 11 exposiciones a TS diarias consecutivas se estudian 24 horas después de la exposición final. El compuesto anti-TNF (eNBREL® (etanercept; Immunex Corporation)) se emplea como control. También se administró por vía oral un inhibidor de fosfodiesterasa 4 (PDE4) (BAY 19-8004; lirimilast) 1 hora antes y 6 horas después de la exposición a TS en otro grupo como referencia.
Métodos
Sustancia de ensayo 1: eNBREL® (etanercept; Immunex Corporation)
Sustancia de ensayo 2: DOMIm (monómero de dAb anti-TNFRI (TAR2iti21-23))
Sustancia de ensayo 3: BAY 19-8004 (inhibidor de PDE4)
El vehículo para las sustancias 1 y 2 es eitrato de sodio, pH 6,0, NaCI 100 mM. El vehículo para la sustancia 3 es earboximetileelulosa al 0,5% (Sigma, producto n.0 C-4888, lote n.0 87H0036) en agua. El volumen de la dosis es de 5 ml/kg.
Ratones hembra (C57BL/6) reproducidas en cautividad y con certificado de estar libres de microorganismos en el momento de la recepción (16-20 g) (Charles River) se alojaron en grupos de hasta 5 en Jaulas de fondo sólido
ventiladas individualmente (iVC) con lecho de serrín de álamo. El entorno (flujo de aire, temperatura y humedad)
dentro de las Jaulas se controló con el sistema IVC (Teehniplast).
Protocolos
N.o de grupos: 7
Tamaño del grupo: n = 10
Volumen de dosis: 50 |jl por ratón para los grupos 1 a 4, y 5 ml/kg para los grupos 1 a 7
Momentos del tratamiento: Una hora antes de la exposición a TS o aire en los días 1 a 11 para los grupos 1 a 4, y 1
hora antes de la exposición y 6 horas después de la exposición para los grupos 5 a 7
El protocolo del estudio se resume en la tabla 1.
Tabla 1
Grupo n.o
Exposición a TS/aire Sustancia de ensayo Dosis mg/kg n = Vía de dosificación Frecuencia de la dosificación
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Aire Vehículo eitrato de Na 0 10 i.n. 1 hora antes de la exposición a TS o aire en los días 1 a 11 para los grupos 1 a 6. 1 hora antes y 6 h después para los grupos 7 a 9.
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ts Vehículo eitrato de Na 0 10 i.n.
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ts 1 (Enbrel®; etanercept, Immunex Corp) 1,0 10 i.n.
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ts 2 (DOMIm) 1,0 10 i.n.
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Aire Vehículo CMC 0 10 p.o.
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ts Vehículo CMC 0 10 P.o.
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ts 3 (BAY 19-8004) 10 10 P.o.
i.n., intranasal; p.o., per os (administración oral)
Exposición a TS
Los ratones (máximo de 5 por cámara de exposición) fueron expuestos a TS generado de cigarrillos (tipo 1R1, suministrados por University of Kentucky). La exposición inicial fue a 4 cigarrillos en el día 1, y la exposición aumentó hasta un máximo de 6 eigarrillos/día para el día 6/7. La exposición después del día 11 fue de 6 eigarrillos/día. La tasa de aumento se reguló con respecto a la tolerancia diaria observada de los ratones. El grupo control de ratones se expuso al aire durante una longitud de tiempo equivalente en cada día de exposición (controles de exposición al aire).
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Control de la salud
Los animales se pesaron antes del comenzar el estudio, en el día 6 del protocolo de exposición, y en el momento de la finalización. Todos los animales fueron controlados durante y después de cada administración de la sustancia de ensayo y exposición a TS.
Procedimientos terminales
Los animales fueron sacrificados con una sobredosis de anestésico (pentobarbitona Na, 100 mg/kg i.p.) como sigue: todos los grupos fueron sacrificados 24 horas después de la exposición a TS 11a y final. Los ratones de todos los grupos de tratamiento se trataron como sigue: se extrajeron muestras de sangre de la arteria subclavia, se introdujeron en un tubo de microcentrífuga y se dejó que coagulasen durante la noche a 4 °C. El coágulo se retiró y el fluido remanente se centrifugó a 2900 rpm en una microcentrífuga durante 6 minutos. El suero del sobrenadante resultante se decantó y se conservó a -40 °C para un posible análisis de PK. Se realizó un lavado broncoalveolar (BAL) empleando 0,4 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células recuperadas del BAL se cuantificaron mediante recuentos de células totales y diferenciales. Se retiraron los pulmones, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se conservaron a -80 °C para un posible análisis de PK.
Análisis de los datos
Se realizó un ensayo para la normalidad sobre los datos. Si el ensayo fue positivo, entonces se realiza un análisis preliminar empleando un análisis de la varianza de una vía (ANOvA de una vía), seguido de un ensayo de comparación múltiple de Bonferroni para comparar los grupos control y de tratamiento. Si los datos no tenían una distribución normal, entonces se emplea un ensayo de Kruskal-Wailis, seguido de un ensayo de comparaciones múltiples de Dunn. Los datos se consideraron significativos cuando p<0,05.
Resultados
El grupo control de TS/vehículo presenta infiltrados celulares en el pulmón, comparado con el grupo de aire/vehículo (véase la figura 1).
El grupo expuesto a TS y tratado con la sustancia de ensayo 1 (DOM1, dAb anti-TNFRI) mostró unos infiltrados celulares significativamente reducidos en el pulmón, comparado con los grupos expuestos a TS y tratados con control (figura 1): 72% de inhibición para las células totales (p < 0,001), 74% para macrófagos (p < 0,0o1), 82% para neutrófilos (p < 0,001), 86% para linfocitos (p < 0,05) y 55% para células epiteliales (p < 0,01). Se observó una reducción del 82% en eosinófilos, pero este cambio no fue significativo debido a la variabilidad en el número de eosinófilos observado en el estudio como un todo.
El grupo tratado con la sustancia 3 (inhibidor de PDE4, BAY 19-8004) mostró unos infiltrados celulares significativamente reducidos en el pulmón, comparado con el grupo control (figura 1): 52% de inhibición para las células totales (p < 0,01), 55% para macrófagos (p < 0,01), 55% para neutrófilos (p < 0,001), 61% para linfocitos (p < 0,001) y 56% para eosinófilos (p < 0,01). Se observó una reducción del 46% en células epiteliales, pero este cambio no fue significativo.
No se observaron reducciones significativas en ninguna de las poblaciones celulares en el grupo expuesto a TS y tratado con la sustancia de ensayo 1 (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation).
Ejemplo 2: Un antagonista de TNFR1 administrado sistémicamente es eficaz en un modelo subcrónico de COPD en ratones C57BL/6
En este estudio, un antagonista de TNFR1 (monómero de dAb anti-TNFRI pegilado (TAR2iti21-23 PEGilado para aumentar el tamaño hidrodinámico y la semivida en suero in vivo)) y un antagonista de TNF (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)) se administran sistémicamente mediante administración intraperitoneal cada 48 horas comenzando 24 horas antes de la exposición inicial al TS. Los efectos de los cambios inducidos por el TS en los índices inflamatorios pulmonares inducidos por 11 exposiciones diarias a TS consecutivas se estudian 24 horas después de la exposición final. El compuesto anti-TNF (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)) se emplea como control.
Métodos
Sustancia de ensayo 1: ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)
Sustancia de ensayo 2: PEG DOMIm (monómero de dAb anti-TNFRI (TAR2it21-23) PEGilado con un polietilenglicol de 40 kDa para aumentar el tamaño hidrodinámico y alargar la semivida en suero in vivo).
El vehículo para ambas sustancias de ensayo fue disolución salina estéril, y el volumen de la dosis para ambas sustancias de ensayo fue de 10 ml/kg.
Ratones hembra (C57BL/6) reproducidas en cautividad y con certificado de estar libres de microorganismos en el
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momento de la recepción (16-20 g) (Charles River) se alojaron en grupos de hasta 5 en Jaulas de fondo sólido ventiladas individualmente (iVC) con lecho de serrín de álamo. El entorno (flujo de aire, temperatura y humedad) dentro de las Jaulas se controló con el sistema IVC (Techniplast).
Protocolos
N.0 de grupos: 4
Tamaño del grupo: n = 10 para los grupos 1 a 4 Volumen de dosis: 10 ml/kg para los grupos 1 a 4
Momentos del tratamiento: Cada 48 horas comenzando 24 h antes de la exposición inicial a TS. Las dosis posteriores se administraron 1 hora antes de la exposición a TS.
El protocolo del estudio se resume en la tabla 2. La exposición a TS, el control de la salud, los procedimientos terminales y el análisis de los datos se realizaron como se describió en el ejemplo 1.
Tabla 2
Grupo n.o
Exposición a TS/aire Sustancia de ensayo Dosis mg/kg n = Vía de dosificación Frecuencia de la dosificación
1
Aire Vehículo 0 10 i.p. A intervalos de 48 horas comenzando 24 h antes de la exposición inicial, después 1 h antes de exposiciones alternadas
2
ts Vehículo 0 10 i.p.
3
ts 1 (Enbrel®; etanercept, Immunex Corp) 10 10 i.p.
4
ts 2 (PEG DOMIm) 10 10 i.p.
i.p., intraperitoneal
Resultados
El grupo expuesto a TS y tratado con la sustancia de ensayo 2 (PEG DOMIm) mostró unos infiltrados celulares significativamente reducidos en el pulmón, comparado con los grupos expuestos a TS y tratados con control: 60% de inhibición para las células totales (figura 2), 63% para macrófagos, 66% para células nucleares polimórficas, 78% para linfocitos, y 65% para eosinófilos. Se observó una reducción del 40% en células epiteliales, pero este cambio no fue significativo.
No se observaron reducciones significativas en ninguna de las poblaciones celulares en el grupo expuesto a TS y tratado con la sustancia de ensayo 1 (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation). El tratamiento con ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation) incluso condujo a un aumento en el número de células totales y PMN en el pulmón.
Ejemplo 3: Farmacocinética de un agente que se une a TNFR1 tras la administración local al tejido pulmonar
En este estudio, un agente que se une a TNFR1 (monómero de dAb anti-TNFRI (TAR2iti21-23)) se administró localmente al pulmón mediante administración intranasal y se evaluó la farmacocinética del agente.
Métodos
En el estudio se empleó DOMIm (monómero de dAb anti-TNFRI (TAR2it21-23)) en citrato de sodio 20 mM, pH 6,0, NaCI 100 mM. El agente diluyente fue citrato de sodio, pH 6,0, NaCl 100 mM.
Protocolos
A todos los animales se les administró DOMIm mediante administración intranasal en el mismo día dentro de 1 a 2 horas tras haber calentado la disolución.
Ratones hembra (C57BL/6) reproducidas en cautividad y con certificado de estar libres de microorganismos en el momento de la recepción (16-20 g) (Charles River) se alojaron en grupos de hasta 5 en Jaulas de fondo sólido ventiladas individualmente (iVC) con lecho de serrín de álamo. El entorno (flujo de aire, temperatura y humedad) dentro de las Jaulas se controló con el sistema IVC (Techniplast).
N.o de grupos: 5
Tamaño del grupo: 3
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Volumen de dosis: 50 pl (25 pl/narina)
Momento del sacrificio: 1 hora, 2 horas, 5 horas, 8 horas y 24 horas después de la administración El protocolo del estudio se resume en la tabla 3.
Tabla 3
Grupo n.0
Compuesto Dosis (mg/kg) Concentración de DOM1 en la disolución administrada (mg/ml) Vía de dosificación n = Momento del sacrificio (después de la administración)
1
DOMIm 1 0,4 mg/ml i.n. 3 1 hora
2
DOMIm 1 0,4 mg/ml i.n. 3 2 horas
3
DOMIm 1 0,4 mg/ml i.n. 3 5 horas
4
DOMIm 1 0,4 mg/ml i.n. 3 8 horas
5
DOMIm 1 0,4 mg/ml i.n. 3 24 horas
i.n., intranasal
Control de la salud
Los animales se pesaron antes del comenzar el estudio. Todos los animales fueron controlados durante y después de cada administración de compuesto. Los animales en el grupo de 24 horas se controlaron a intervalos regulares durante la noche.
Procedimientos terminales
Los animales fueron sacrificados con una sobredosis de anestésico (pentobarbitona Na, 100 mg/kg i.p.). Se extrajo sangre de la arteria subclavia, se introdujo en un tubo de microcentrífuga y se dejó que coagúlese durante la noche a 4 °C. El coágulo se retiró y el fluido remanente se centrifugó a 2900 rpm en úna microcentrífuga durante 6 minutos. Los sobrenadantes resultantes se decantaron, se colocaron en un tubo nuevo, se congelaron y se conservaron a -40 °C antes del análisis. Se recogió un lavado broncoalveolar (BAL) empleando 0,4 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS) que fue instilada y extraída 3 veces. El BAL se centrifugó a 2700 rpm en úna microcentrífuga durante 6 minutos y el sobrenadante se retiró y se conservó a -40 °C antes del análisis. El sedimento celular se resuspendió en un volumen adecuado de PBS y se realizó un recuento de células totales empleando un hemocitómetro. Se prepararon portaobjetos de citocentrifugación para la determinación diferencial de células. Se extirparon los pulmones, se congelaron instantáneamente y se conservaron a -80 °C antes del análisis. Empleando un mortero y úna mano de mortero, los pulmones se pulverizaron en nitrógeno líquido y se disolvieron en reactivo de extracción de proteínas de tejidos T-PER® (Pierce) y se homogeneizaron empleando 40 golpes con un homogeneizador Dounce.
ELISA para detectar DOMIm
Una placa de ensayo MAXISORP de 96 pocilios (Nunc) fue revestida durante la noche a 4 °C con 100 pg por pocilio de itiTNFR/Fc (R&D Systems) a 0,5 pg/ml en PBS. Los pocilios se lavaron 3 veces con Tween al 0,05%/pBs y 3 veces con PBS. Se añadieron 200 pl por pocilio de BSA al 2% en PBS para bloquear la placa. Los pocilios se lavaron y después se añadieron 100 pl de patrón de DOMIm o muestra. Las placas se incubaron durante 1 hora. Los pocilios se lavaron y se detectó el DOM1 unido con anti-VH de pollo (1/5o0), seguido de un conjugado de anti- IGY de pollo y HRP (dilución 1/5000; Abcam). Las placas se revelaron con 100 pl de úna disolución de peroxidasa SureBlue 1-Component TMB MicroWell Peroxidase (KPL, Gaithersburg, EE. UU.) que fue añadida a cada pocilio, y la placa se dejó a temperatura ambiente hasta que se produjo úna señal adecuada (aproximadamente 5 minutos). La reacción se detuvo mediante la adición de HCl y la absorbancia se leyó a 450 nm.
Resultados
El nivel de DOMIm en el BAL alcanzó el máximo a 1 hora y fue de aproximadamente 14 pg/ml (aproximadamente 3,5 pg en 0,25 de fluido de BAL). Esto significa que al menos 17% (3,5 pg de los 20 pg totales administrados) del material administrado estaba presente en el compartimento broncoalveolar del pulmón. Puede estar presente más material en los tejidos circundantes, pero este material no puede recuperarse. Los niveles en el BAL fueron altos durante un periodo de tiempo prolongado y mostraron úna disminución gradual a lo largo de 24 horas (> 10 veces de disminución después de 24 horas).
Los niveles de DOMIm en el tejido pulmonar permanecieron relativamente constantes hasta 8 horas después de la administración, y fueron indetectables 24 horas después de la administración. A las 8 horas después de la
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administración, Ios niveles en el tejido pulmonar fueron de aproximadamente 0,35 pg. El porcentaje de la dosis administrada total presente en el tejido pulmonar a las 8 horas fue de aproximadamente 2% (la dosis total administrada fue de 20 pg). Tomado conjuntamente con Ios niveles en BAL, el nivel máximo del agente detectado en el pulmón como un todo en Ios momentos estudiados fue de al menos aproximadamente 20% de la dosis total administrada.
El nivel de DOMIm en el suero alcanzó el máximo a 1 hora (aproximadamente 150 ng/ml) y disminuyó con rapidez. A las 5 horas después de la administración, Ios niveles en el suero fueron de aproximadamente 70 ng/ml, lo cual equivale a 100 ng/ratón (1,5 ml de volumen de sangre). El porcentaje de la dosis administrada total presente en el suero 5 horas después de la administración fue de aproximadamente 0,5% (la dosis total administrada fue de 20 pg). El DOMIm no resultó detectable en el suero después de 5 horas.
Ejemplo 4: Reactividad cruzada con TNFR1 de cynomolgus
Se empleó una línea celular de fibroblastos de la piel de cynomolgus (Macaca fascicularis) para ensayar la reactividad cruzada de dAb anti-TNFRI humanos con TNFR1 de cynomolgus en un ensayo de tNfRI basado en células. La reactividad cruzada con TNFRI de cynomolgus es ventajosa porque pueden realizarse estudios farmacocinéticos y de toxicología sin emplear un agente sustituto.
Método
Se incubaron células de fibroblastos de la piel de embriones de cynomolgus (5 x 103 células por pocilio) con dAb anti-TNFRI humano durante 1 hora a 37 °C/5% de CO2. Después se añadieron 200 pg/ml (concentración final) de TNF humano, y la placa se incubó durante la noche a 37 °C/5% de CO2.
Se usó un ELISA DuoSet de IL-8 humana para medir la concentración de la IL-8 humana en Ios sobrenadantes del cultivo celular. El ensayo se realizó según instrucciones del fabricante. Una placa de ensayo Nunc Maxisorp de 96 pocilios fue revestida con 100 pl de anticuerpo de detección a 4 pg/ml en PBS. La placa se incubó durante la noche a 4 0C. Entre cada etapa de incubación, las placas se lavaron tres veces con Tween al 0,05o/o/PBS y tres veces con PBS empleando un lavavajillas automático. Se añadieron 200 pl por pocilio de BSA al 1%/PBS y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadieron 90 pl de BSA al 0,1%, Tween-20 al 0,05% en PBS a cada pocilio y 10 pl de sobrenadante de células, y se incluyó una curva patrón de IL-8 que comienza a 5 ng/ml en BSA al 0,1%, Tween-20 al 0,05% en PBS. Se añadieron 100 pl de anticuerpo de detección a 20 ng/ml (disolución madre diluida 1:180 en BSA al 0,1% BSA, Tween-20 al 0,05% en PBS) a cada pocilio y las placas se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Se añadieron 100 pl de estreptavidina-HRP a cada pocilio (disolución madre diluida 1:200 en BSA al 0,1% BSA, Tween-20 al 0,05% en PBS). Las placas se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Se añadieron 100 pl de una disolución de peroxidasa SureBlue 1-Component TMB MicroWell Peroxidase a cada pocilio y se dejó a la temperatura ambiente hasta que se reveló un color azul. La reacción se detuvo añadiendo 100 pl de ácido clorhídrico 1 M. La absorbancia en la placa se leyó a 450 nm dentro de 30 min.
Resultados/Conclusiones
Los dAb anti-TNFRI humano en la serie TAR2h-131 son capaces de bloquear de modo eficaz la liberación de IL-8 inducida por TNF de fibroblastos de cynomolgus. Los dAb TAR2Ii-131-511 y TAR2Ii-131-117 presentan unos valores de potencia ligeramente superiores en el ensayo de cynomolgus (303 nM y 330 nM, respectivamente), comparado con la potencia medida en un ensayo de MRC-5 humanos (aproximadamente 600 pM). En conclusión, Ios dAb de la serie TAR2h-131 presentan reactividad cruzada con TNFRI de cynomolgus.
Ejemplo 5: Efectos de un dAb anti-TNFRI administrado al pulmón sobre la inflamación pulmonar inducida por TNFa
Se administró un dAb anti-TNFRI a Ios pulmones de ratones por vía intranasal 1 hora antes de la administración intranasal de TNFa. Se investigó el efecto de la predosificación del pulmón con un dAb anti-TNFRI antes de la administración de TNFa determinando el número de neutrófilos en el BAL, cuantificando la concentración de las citoquinas inflamatorias KC, MIP-2 y MCP-1 en el BAL, y cuantificando la E-selectina en el tejido pulmonar en momentos seleccionados después de la administración de TNFa.
Métodos
El estímulo inflamatorio fue TNFa murino recombinante en PBS que contenía BSA al 0,1%.
El dAb anti-TNFRI fue TAR2it-21-23 (lote BH31/01/06-1) en tampón citrato 20 nM, pH 6.
El TNFa (1 pg por ratón) se administró por vía intranasal (i.n.). El volumen administrado fue de 50 pl por ratón (20 pg/ml). El dAb TAR2iti-21-23 anti-TNFRI (1 mg/kg) también fue administrado por la vía intranasal. El volumen de dAb administrado fue de 50 pl por ratón (0,4 mg/ml puesto que Ios ratones pesaban 20 g).
Ratones hembra (C57BL/6) reproducidas en cautividad y con certificado de estar libres de microorganismos en el momento de la recepción (16-20 g) (Charles River) se alojaron en grupos de hasta 5 en jaulas de fondo sólido
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ventiladas individualmente (IVC) con lecho de serrín de álamo. El entorno (flujo de aire, temperatura y humedad) dentro de las jaulas se controló con el sistema IVC (Techniplast).
Grupos del tratamiento
N.0 de grupos: 13
Tamaño del grupo: n = 5-6
Los grupos de ratones fueron dosificados i.n. con vehículo o dAb a 1 hora antes de la administración de TNFa. Los grupos se sacrificaron en momentos predeterminados después de la administración de TNFa tal como se lista en la tabla 4.
Tabla 4
Grupo
Anti-TNFR1 TNFa Momento del sacrificio después del agonista (horas) n
a
Vehículo Vehículo 2-8 6
b
Vehículo 1 pg/ratón 2 5
c
dAb 1 mg/kg 1 pg/ratón 2 5
d
Vehículo 1 pg/ratón 4 5
e
dAb 1 mg/kg 1 pg/ratón 4 5
f
Vehículo 1 pg/ratón 6 6
G
dAb 1 mg/kg 1 pg/ratón 6 6
h
Vehículo 1 pg/ratón 8 6
i
dAb 1 mg/kg 1 pg/ratón 8 6
j
Vehículo 1 pg/ratón 24 5
k
dAb 1 mg/kg 1 pg/ratón 24 5
l
Vehículo 1 pg/ratón 48 5
M
dAb 1 mg/kg 1 pg/ratón 48 5
Aproximadamente 3 minutos antes del tratamiento se indujo una ligera anestesia mediante una inhalación de isofluorano. El vehículo o el dAb se instiló en un volumen de 50 pl/ratón por vía intranasal. Se dejó que los ratones se recuperasen y después se devolvieron a su jaula. Después de una hora se administró TNFa (1 pg/ratón) o su vehículo por la misma vía intranasal. Los grupos de ratones tratados con dAb o vehículo se sacrificaron 2, 4, 6, 8, 24 y 48 horas después de la administración de TNFa.
Los ratones fueron sacrificados con una sobredosis de anestésico (pentobarbitona Na, 100 mg/kg i.p.). La tráquea se canuló y se realizó un lavado broncoalveolar (BAL) empleando 3 partes alícuotas distintas de 0,4 ml de PBS. El fluido del lavado se mantuvo en hielo antes de la centrifugación. Se retiraron el corazón y los pulmones en bloque, se retiró el corazón y los pulmones se congelaron instantáneamente empleando nitrógeno líquido. El fluido del lavado se centrifugó y el sobrenadante se dividió en cuatro partes alícuotas de 250 pl y se conservó a -40 °C. El sedimento celular se resuspendió en 40 pl de PBS, y 10 pl de la suspensión celular se introdujeron en 90 pl de tinte 'Kimura' o 'Turks' para los recuentos celulares en húmedo totales empleando un hemocitómetro. Se prepararon portaobjetos de citocentrifugación a partir de la suspensión celular y se tiñeron empleando el tinte 'Wrights Giemsa' para el análisis diferencial de células. Las células se diferenciaron empleando técnicas morfométricas convencionales.
Preparación de las muestras y ELISA: Se obtuvieron kits de ELISA para TNFa murino, KC, MIP-2, MCP-1 y E- selectina en R&D Systems. Se emplearon muestras de sobrenadante de BAL puras para la determinación de la concentración de las citoquinas kC, MIP-2 y MCP-1 en BAL. El sobrenadante de BAL se diluyó 1:100 para la determinación de la concentración de TNFa en BAL.
Los pulmones congelados se descongelaron y se homogeneizaron en 500 pl de tampón de lisis que contenía HEPES 10 mM, pH 7,5, Tritón X-100 al 0,5%, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, AEBSF 0,5 mM y un cóctel de inhibidores de proteasas (leupeptina 1 pg/ml, aprotinina 1 pg/ml, inhibidor de tripsina-quimotripsina 10 pg/ml y pepstatina 1
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pg/ml). El sobrenadante del homogenelzado de pulmón se diluyó para la determinación de las concentraciones de E- selectlna (1:50) y TNFa (1:100) en tejido de pulmón.
Se determinaron las concentraciones de proteínas totales en el sobrenadante del homogeneizado de pulmón y BAL empleando un kit Quantipro BCA (Sigma).
Resultados
Tras la administración intranasal de TNFa murino, se detectaron unos niveles significativos de TNFa en tejido de pulmón y BAL 2 h después de la administración (figuras 11A y 11B). Las concentraciones de TNFa en BAL y en el tejido disminuyeron de una manera dependiente del tiempo y volvieron a los niveles de la línea de base (tratado con vehículo) a las 48 h. Los niveles en el BAL fueron aproximadamente 10 veces mayores que los niveles en el tejido de pulmón. Estos datos demuestran que la administración i.n. de TNFa produce un transporte significativo al pulmón de la citoquina. Sin embargo, es posible que una parte del TNFa detectado sea de origen endógeno, aunque el perfil de respuesta no lo sugiere.
Una predosis 1 hora antes de 1 mg/kg del dAb anti-TNFRI no produce un efecto obvio sobre la concentración de TNFa en tejido pulmonar y BAL en los momentos examinados. A pesar de un rápido aumento en la concentración de TNFa en el tejido pulmonar y en BAL tras la administración i.n. de TNFa murino, el número de neutrófilos en BAL no aumenta significativamente por encima de la línea de base entre 1 y 8 horas después de la administración de TNFa. Sin embargo, a las 24 y 48 h después de la administración de TNFa se observó neutrofilia en BAL (figura 12). El aumento en los neutrófilos en BAL a las 24 y 48 h fue parcialmente inhibido por el dAb anti-TNFRI (26% y 44% de inhibición, respectivamente).
Las concentraciones de los quimioatrayentes de neutrófilos KC y MIP-2 aumentaron significativamente 2 h después de la administración de TNFa y disminuyeron de una manera dependiente del tiempo y ambas quimioquinas volvieron a las concentraciones basales a las 24 h (figuras 13A y 13B). Estos aumentos en KC y MIP-2 en BAL fueron significativamente reducidos por el pretratamiento con dAb anti-TNFRI.
Las concentraciones de MCP-1 en BAL y de E-selectina en tejido pulmonar también fueron aumentadas significativamente por el TNFa, pero el aumento máximo fue en un momento posterior al de KC y MIP-2 en BAL (6 h en lugar de 2 h). Las concentraciones de MCP-1 en BAL y de E-selectina en tejido pulmonar volvieron a los niveles basales a las 48 h (figuras 13C y 13D). Estos aumentos en KC y MIP-2 en BAL fueron significativamente reducidos por el pretratamiento con dAb anti-TNFRI.
Análisis
La administración intranasal de TNFa murino a ratones produjo niveles significativos de TNFa pulmonar, que indujeron unos aumentos significativos en los neutrófilos en el BAL, KC, MIP-2 y MCP-1 en el BAL y de E-selectina en el tejido pulmonar. Los neutrófilos en el BAL no aumentaron hasta aproximadamente 24 h y se mantuvieron elevados a las 48 h. Los datos previos en la bibliografía empleando ratas demuestran una respuesta de neutrófilos prolongada. Los aumentos máximos de KC y MIP-2 en el BAL se observaron en el momento de las 2 h, y los aumentos máximos de MCP-1 en BAL y E-selectina en tejido pulmonar fueron a aproximadamente 6 h. Los niveles aumentados de cada uno de KC, MIP-2, MCP-1 y E-selectina fueron detectados 6 h después de la administración de TNFa.
Un pretratamiento con un dAb anti-TNFRI (1 mg/kg) 1 h antes de la administración del TNFa murino inhibió los aumentos en los neutrófilos y KC, MIP-2 y MCP-1 en el BAL y de E-selectina en tejido pulmonar. Estos datos sugieren que el receptor TNFR1 media en la mayoría de la inflamación pulmonar inducida por TNFa intranasal en este modelo.
Ejemplo 6: Efectos de dosis variables de un dAb anti-TNFRI administrado al pulmón sobre la inflamación pulmonar inducida por TNFa
Se administraron dosis variables de un dAb anti-TNFRI a los pulmones de ratones por vía i.n. 1 hora antes de la administración intranasal de TNFa. Las dosis del dAb anti-TNFRl usadas fueron de 2,5 mg/kg, 1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,03 mg/kg y 0,01 mg/kg. Se investigó el efecto de la predosificación con un dAb anti-TNFRI cuantificando la concentración de las citoquinas inflamatorias KC, MIP-2 y MCP-1 en el BAL, y cuantificando la E- selectina en el tejido pulmonar.
Métodos
El estímulo inflamatorio y la sustancia de ensayo fueron los mismos que los descritos en el ejemplo 5. El TNFa (1 pg por ratón) se administró por vía intranasal (i.n.). El volumen administrado fue de 50 pl por ratón (20 pg/ml).
El dAb TAR2iti-21-23 anti-TNFRI se administró por vía i.n. a una dosis de 2,5 mg/kg, 1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,03 mg/kg o 0,01 mg/kg. El volumen de dAb administrado fue de 50 pl por ratón.
Los ratones fueron de la misma raza que los descritos en el ejemplo 5 y se alojaron de igual modo.
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Grupos del tratamiento Tamaño del grupo: n = 4-7
Los grupos de ratones fueron dosificados i.n. con vehículo o dAb (2,5, 1, 0,3, 0,1, 0,03 o 0,01 mg/kg) 1 hora antes de la administración de TNFa. Todos los grupos se sacrificaron 6 h después de la administración del TNFa.
Los ratones se dosificaron empleando el mismo procedimiento que en el ejemplo 6. Los ratones fueron sacrificados 6 h después de la administración i.n. de TNFa, y las células del BAL, el sobrenadante del BAL y el tejido de pulmón congelado se obtuvieron como se describió en el ejemplo 6. Se estudiaron las proteínas, KC, MIP-2 y MCP-1 del BAL, y las proteínas y E-selectina del sobrenadante del homogeneizado de pulmón y se cuantificaron como se describió en el ejemplo 6.
Resultados
Tal como se muestra en el ejemplo 5, la administración intranasal de TNFa induce concentraciones significativas de KC, MIP-2 y MCP-1 en el BAL y de E-selectina en el tejido pulmonar 6 h después de la dosificación. Un pretratamiento (1 h antes del TNFa) con un dAb anti-TNFRI inhibe el aumento de estos mediadores inflamatorios de una manera dependiente de la dosis (tabla 5), aunque la potencia varía según los mediadores.
Tabla 5 - La inhibición dependiente de la dosis de los aumentos inducidos por TNFa en las concentraciones de KC, MIP-2 y MCP-1 en BAL y de E-selectina en tejido pulmonar1
dosificación i.n. de dAb (mg/kg)
KC en bal
66 ± 10 82 ± 8 71 ± 15 70 ± 40 77 ± 33 7 ± 48
MIP-2 en BAL
89 ± 16 91 ± 8 77 ± 14 74 ± 39 61 ± 33 14 ± 78
MCP-1 en BAL
64 ± 13 60 ± 21 60 ± 9 ninguno ninguno ninguno
E-selectina en pulmón
59 ± 18 65 ± 10 59 ± 18 30 ± 30 ninguno ninguno
1 La tabla muestra el porcentaje de inhibición (promedio ± DE) de los aumentos inducidos por TNFa en las concentraciones de KC, MIP-2 y MCP-1 en BAL y de E-selectina en tejido pulmonar a unas dosis de dAb de 2,5, 1, 0,3, 0,1, 0,03 y 0,01 mg/kg.
El dAb anti-TNFRI inhibe KC en BAL en un grado similar a todas las dosis entre 2,5 mg/kg y 0,03 mg/kg, y fue inactivo a 0,01 mg/kg. De modo similar, el dAb anti-TNFRI inhibe MIP-2 en BAL sustancialmente en el mismo grado a todas las dosis entre 2,5 mg/kg y 0,1 mg/kg, mostrando una inhibición ligeramente inferior a 0,03 mg/kg, y fue inactivo a 0,01 mg/kg.
El dAb anti-TNFRI es un inhibidor menos potente de MCP-1 en BAL puesto que se observó una inhibición significativa entre 2,5 mg/kg y 0,3 mg/kg, pero no a dosis inferiores. Las concentraciones de E-selectina en tejido pulmonar fueron inhibidas de una manera similar; se observó una inhibición significativa entre 2,5 mg/kg y 0,3 mg/kg, una inhibición mínima a 0,1 mg/kg, y ningún efecto a dosis inferiores.
Análisis
La administración intranasal de TNFa murino a ratones indujo unos aumentos significativos en los neutrófilos, KC, MIP-2 y MCP-1 en el BAL y en la E-selectina en el tejido pulmonar. Esos aumentos fueron significativamente inhibidos de una manera dependiente de la dosis por un dAb anti-TNFRI. El dAb anti-TNFRI tiene una actividad inhibidora más potente sobre KC y MIP-2 en BAL, comparado con MCP-1 en BAL y E-selectina en tejido pulmonar. Esto puede ser debido a que los aumentos máximos en KC y MIP-2 en el BAL fueron inducidos con relativa rapidez tras la administración de TNFa, mientras que los aumentos máximos en MCP-1 en BAL y E-selectina en tejido pulmonar se produjeron después.
Este estudio demuestra que la administración i.n. de dAb anti-TNFRI a una dosis de 0,3 mg/kg inhibe significativamente los aumentos inducidos por TNFa de los neutrófilos en el BAL, de KC, MIP-2 y MCP-1 en el BAL, y de E-selectina en tejido pulmonar seis horas después de la administración de TNFa, pero que 0,3 mg/kg no es una dosis supramáxima.
Ejemplo 8: Duración de la acción in vivo de un dAb anti-TNFRI administrado por vía intranasal
Se administró un dAb anti-TNFRI (TAR2iti-21-23) a los pulmones de ratones por vía i.n. en diversos momentos antes de la administración i.n. de TNFa. Se investigó el efecto de la predosificación del pulmón con un dAb anti- TNFRI cuantificando las citoquinas inflamatorias KC, MIP-2 y MCP-1 en el BAL, y cuantificando la E-selectina en el tejido pulmonar mediante ELISa. Los resultados se muestran en la tabla 6.
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Métodos
Estímulo inflamatorio: TNFa murino recombinante
Sustancia de ensayo 1: TAR2it-21-23 (lote BH31/01/06-1) (dAb anti-TNFRI)
Vehículo para TNFa mr: PBS que contenía BSA al 0,1%
Vehículo para TAR2iti-21-23: tampón citrato 20 nM, pH 6
La dosis de TNFa fue de 1 |jg por ratón por vía intranasal (i.n.), tal como se empleó en el estudio previo. El volumen administrado a la nariz fue de 50 jl por ratón (20 jg/ml). La dosis de TAR2it-21-23 fue de 0,3 mg/kg por vía intranasal. El volumen administrado a la nariz fue de 50 jl por ratón (0,4 mg/ml puesto que los ratones pesaban 20
g).
Ratones utilizados y preparación de dAb: Los ratones fueron de la misma raza y se alojaron de igual modo que en el protocolo del estudio previo.
Protocolos:
Grupos del tratamiento Tamaño del grupo: n = 4-7 Momentos del tratamiento
Los grupos de ratones fueron dosificados i.n. con vehículo o dAb a las 1, 2, 4, o 6 horas antes de la administración de TNFa. Todos los grupos se sacrificaron 6 h después de la administración del TNFa.
Dosificación y procedimientos terminales: Los ratones fueron dosificados como se detalló anteriormente empleando el mismo procedimiento que en el estudio previo. Los ratones fueron sacrificados 6 h después de la administración i.n. La administración de TNFa y las células del BAL, el sobrenadante del BAL y el tejido de pulmón congelado se obtuvieron como se detalló en el estudio previo.
Preparación de las muestras y ELISA: Se estudiaron las proteínas, KC, MIP-2 y MCP-1 del BAL, y las proteínas y E- selectina del sobrenadante del homogeneizado de pulmón como se ha detallado en el experimento previo.
Tabla 6 - Duración de la acción in vivo de un dAb anti-TNFRI2
Momento de la predosis de dAb (h)
Vehículo TNF (sin dAb) 1 2 4 6
KC en bal
32 145 77 61 46 39
MIP-2 en BAL
14 54 18 18 13 8
MCP-1 en BAL
3 418 123 90 218 188
E-selectina en pulmón
3 44 20 23 27 28
2 La tabla muestra las concentraciones promedio de KC (pg/ml), MIP-2 (pg/ml) y MCP-1 (pg/ml) en BAL y de E- selectina en tejido pulmonar (ng/ml) seis horas después de la administración i.n. de TNFa o vehículo. El dAb anti- TNFRI se administró 1, 2, 4, o 6 horas antes de la administración del TNFa.
Los resultados presentados en la tabla 6 demuestran que la administración del dAb a las 1, 2, 4, o 6 horas antes de la administración del TNFa inhibe significativamente kC y MIP-2 del BAL inducidos por TNF en todos los momentos de predosis del dAb. La mejor inhibición se observó en los momentos de predosis más largos. Esto sugiere que >1 h es el momento óptimo para unión del dAb al receptor tras la dosificación i.n. De una manera similar, la administración del dAb a las 1, 2, 4, o 6 horas antes de la administración del TNFa también inhibe significativamente MCP-1 del BAL y la E-selectina en tejido pulmonar inducidos por TNF en todos los momentos de predosis del dAb. Estos resultados demuestran que el dAb anti-TNFRI tiene una duración de acción que es mayor que 6 horas.
Ejemplo 9: Evaluación de un dAb anti-TNFRI que se une a TNFR1 e inhibe la unión de TNFa al receptor administrado por vía intranasal sobre la inflamación pulmonar inducida por TNFa
Los ejemplos previos demuestran que un dAb anti-TNFRI ("dAb no competitivo" TAR2it-21-23) que se une a TNFR1, pero que no inhibe la unión de TNFa a TNFR1 inhibe significativamente la inflamación pulmonar inducida por TNFa. Este estudio demuestra que un dAb que se une a TNFR1 e inhibe la unión de TNFa a TNFR1 ("dAb competitivo" TAR2it-15-12) también es eficaz para inhibir la inflamación pulmonar inducida por TNFa.
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Métodos
Estímulo inflamatorio: TNFa murino recombinante
Sustancia de ensayo 1: TAR2m-21-23 (lote BH31/01/06-1) (dAb anti-TNFRI competitivo)
Sustancia de ensayo 2: TAR2iti-15-12 (dAb anti-TNFRI no competitivo)
Vehículo para TNFa mr: PBS que contenía BSA al 0,1%
Vehículo para los dAb: tampón citrato 20 nM, pH 6
La dosis de TNFa fue de 1 |jg por ratón por vía intranasal (i.n.), tal como se empleó en el estudio previo. El volumen administrado a la nariz fue de 5o jl por ratón (20 jg/ml).
La dosis de TAR2it-21-23 o TAR2it-15-12 fue de 0,3, 0,1, y 0,03 mg/kg por vía intranasal. El volumen administrado a la nariz fue de 50 jl por ratón (0,4 mg/ml puesto que los ratones pesaban 20 g).
Ratones utilizados y preparación de dAb: Los ratones fueron de la misma raza y se alojaron de igual modo que en el protocolo del estudio previo. El dAb se formuló como se ha descrito previamente.
Protocolos:
Grupos del tratamiento Tamaño del grupo: n = 4-7 Momentos del tratamiento
Los grupos de ratones fueron dosificados i.n. con vehículo o dAb a 1 hora antes de la administración de TNFa. Todos los grupos se sacrificaron 6 h después de la administración del TNFa.
Dosificación y procedimientos terminales: Los ratones fueron dosificados como se detalló anteriormente empleando el mismo procedimiento que en el estudio previo. Los ratones fueron sacrificados 6 h después de la administración i.n. de TNFa y las células del BAL, el sobrenadante del BAL y el tejido de pulmón congelado se obtuvieron como se detalló en el estudio previo.
Preparación de las muestras y ELISA: Se estudiaron las proteínas, KC, MIP-2 y MCP-1 del BAL, y las proteínas y E- selectina del sobrenadante del homogeneizado de pulmón como se ha detallado en el experimento previo.
Tabla 7 - Efectos dependientes de la dosis de un dAb anti-TNFRI competitivo o no competitivo sobre el aumento inducido por TNFa en las concentraciones de KC, MIP-2 y MCP-1 en BAL y de E-selectina en tejido pulmonar3
Dosificación i.n. de dAb no competitivo (mg/kg) Dosificación i.n. de dAb competitivo (mg/kg)
0,3 0,1 0,03 0,3 0,1 0,03
KC en bal
97 ± 151 67 ± 22 70 ± 16 105 ± 20 66 ± 9 43 ± 22
MIP-2 en BAL
78 ± 8 78 ± 14 80 ± 14 88 ± 11 66 ± 18 54 ± 16
MCP-1 en BAL
71 ± 11 34 ± 19 41 ± 8 82 ± 26 1 ± 60 1 ± 41
E-selectina en pulmón
60 ± 4 42 ± 34 19 ± 25 55 ± 27 13 ± 8 14 ± 7
3 La tabla muestra el porcentaje de inhibición (promedio ± DE) de los aumentos inducidos por TNFa en las concentraciones de KC, MIP-2 y MCP-1 en BAL y de E-selectina en tejido pulmonar a unas dosis de dAb de 0,3, 0,1, y 0,03 mg/kg.
Los resultados presentados en la tabla 7 demuestran que, de modo similar a los estudios previos, el pretratamiento (1 h antes del TNFa) con un dAb anti-TNFRI no competitivo (TAR2it-21-23) inhibe, de una manera dependiente de la dosis, el aumento de los mediadores inflamatorios KC, MIP-2 y MCP-1 en BAL y de la E-selectina en tejido pulmonar. De una manera similar, un dAb anti-TNFRI competitivo (TAR2it-15-12) también inhibe, de una manera dependiente de la dosis, el aumento de los mediadores inflamatorios KC, MIP-2 y MCP-1 en BAL y de la E-selectina en tejido pulmonar.
El dAb anti-TNFRI TAR2it-15-12 tiene una eficacia ligeramente inferior sobre KC en BAL a 0,03 mg/kg, y sobre MIP-2 en BAL a 0,1-0,03 mg/kg comparado con TAR2it-21-23. El dAb anti-TNFRI TAR2it-15-12 es inactivo sobre MCP-1 en BAL a 0,1 mg/kg, comparado con TAR2it-21-23 que muestra 34% de inhibición sobre MCP-1 en BAL. El
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dAb anti-TNFRI TAR2m-15-12 tiene una eficacia ligeramente inferior sobre la E-selectina en tejido pulmonar a 0,1 mg/kg, comparado con TAR2iti-21-23.
La potencia in vitro fue de aproximadamente 1 nM para TAR2it-21-23 y de aproximadamente 5 nM para TAR2it-15- 12. Además, TAR2m-21-23 tiene mayor afinidad y una constante de disociación más lenta que TAR2it-15-12. Es probable que la diferencia en la eficacia sobre los mediadores inflamatorios sea debida a la menor afinidad y potencia. Esto indica que no existen diferencias obvias entre un dAb no competitivo (TAR2it-21-23) y un dAb competitivo, TAR2it-15-12, que inhibe la unión de TNFa a TNFR1.
Resumen
La tabla 8 resume los resultados de los estudios inducidos por TS y los estudios inducidos por TNF. El grupo expuesto a TS y tratado con dAb anti-TNFRI PEGilado (10 mg/kg) muestra unos infiltrados celulares significativamente reducidos en el pulmón, comparado con los grupos expuestos a TS y tratados con control: 62% de inhibición para las células totales. No se observaron reducciones significativas en ninguna de las poblaciones celulares en el grupo expuesto a TS (10 mg/kg i.p.)/tratado con ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation). Solo se observaron unos infiltrados celulares significativamente reducidos en el grupo expuesto a TS/tratado con ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation) cuando la dosificación aumenta hasta 30 mg/kg (i.p.). Esto indica que es necesaria una dosificación en mg/kg sistémica > 3 veces mayor de ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation), comparado con el dAb anti-TNFRI PEGilado, para lograr reducciones significativas en las poblaciones celulares.
En el modelo inducido por TNFa, el grupo tratado con dAb anti-TNFRI (0,3 mg/kg i.n.) muestra 78% de inhibición de los niveles de MIP-2 inducido por TNFa. Se logró un nivel similar de inhibición en los niveles de MIP-2 (78%) en el grupo tratado con ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation) con 10 mg/kg (i.n.). El grupo tratado con ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation) a 1 mg/kg (i.n.) no mostró reducciones significativas en el influjo de células. Juntos, estos datos indican que es necesaria una dosificación en mg/k intranasal > 30 veces mayor de ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation), comparado con el dAb anti-TNFRI, para lograr una inhibición eficaz de MIP-2.
Tabla 8
Molécula
pm, kü t1/2p Potencia, ÜN50 roa Dosificación (mg/kg) Inhibición del influjo de células
Ensayo de L929
PEG-TAR2it
52 2-4 d 1 nM i.p. 10 mg/kg 62% (p<0,001)
ENBRL® (etanercept; Immunex Corporation)
150 Id (calculado) 5-50 pM i.p. 10 mg/kg -1% (ns)
ENBRL® (etanercept; Immunex Corporation)
150 Id (calculado) 5-50 pM i.p. 30 mg/kg 37% (p<0,01)
mAb anti-TNF de rata
150 2-7 d (calculado) 6-8 nM (mTNF) i.p. 3 mg/kg 51% (p<0,001)
Monómero de TAR2m
12 4-6 h i.n. 1 nM i.n. 1 mg/kg 53%/720/o (p<0,05)
ENBRL® (etanercept; Immunex Corporation)
150 Id (calculado) 5-50 pM i.n. 1 mg/kg 11% (ns)
Molécula
pm, kü t1/2p Potencia, ÜN50 roa Dosificación (mg/kg) Reducción en los niveles de MIP-2
Ensayo de L929
TAR2m
12 4-6 h i.n. 1 nM i.n. 1 mg/kg 120%
ENBRL® (etanercept; Immunex Corporation)
150 Id (calculado) 5-50 pM i.n. 10 mg/kg 78%
mAb anti-TNF de rata
150 2-7 d (calculado) 6-8 nM (mTNF) i.n. 2,5 mg/kg 87%
Monómero de TAR2m
12 4-6 h i.n. 1 nM i.n. 0,3 mg/kg 78%
Monómero de TAR2m (dAb competitivo)
12 4-6 h i.n. 5 nM i.n. 0,3 mg/kg 88%
Monómero de TAR2m
12 4-6 h i.n. 1 nM i.n. 0,1 mg/kg 78%
Monómero de TAR2m (dAb competitivo)
12 4-6 h i.n. 5 nM i.n. 0,1 mg/kg 66%
Aunque esta invención se ha mostrado y descrito en concreto haciendo referencia a realizaciones concretas de la misma, los expertos en la técnica entenderán que pueden realizarse diversos cambios en forma y detalle sin apartarse del alcance de la invención definida mediante las reivindicaciones adjuntas.
5

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    reivindicaciones
    1. - El uso de un dominio variable único de inmunoglobulina que es un VH, VL o VHH que tiene al menos 96% de identidad a lo largo de su longitud completa, según se determina empleando el algoritmo BLAST, con la secuencia de aminoácidos TAR 2H-131-511 (SEQ ID NO:379), y que se une a TNFR1 en tejido pulmonar, para la fabricación de una formulación para la administración local al tejido pulmonar para tratar o prevenir una enfermedad respiratoria o la inflamación pulmonar, y en el que la administración local al tejido pulmonar es mediante inhalación o administración intranasal.
  2. 2. - El uso según la reivindicación 1, en el que dicho dominio variable único de inmunoglobulina tiene al menos 98% de identidad a lo largo de su longitud completa, según se determina empleando el algoritmo BLAST, con la secuencia de aminoácidos TAR 2H-131-511 (SeQ ID NO:379), y en el que la administración local al tejido pulmonar es mediante inhalación o administración intranasal.
  3. 3. - El uso de un dominio variable único de inmunoglobulina según la reivindicación 1 o 2, en la fabricación de una formulación de acción a largo plazo o de ventana terapéutica extensa para la administración local al tejido pulmonar para tratar o prevenir una enfermedad respiratoria, y en el que al menos 50% del nivel en tejido pulmonar del dAb se mantiene durante un periodo de al menos aproximadamente 4 horas, y en el que la administración local al tejido pulmonar es mediante inhalación o administración intranasal.
  4. 4. - El uso según las reivindicaciones 1-3, y en el que la administración local al tejido pulmonar es mediante inhalación con el uso de un nebulizador o un inhalador.
  5. 5. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y en el que la administración local al tejido pulmonar es mediante inhalación o administración intranasal, y la formulación es para administrar una dosis de no más de 10 mg/kg/día.
  6. 6. - El uso según la reivindicación 5, y en el que la administración local al tejido pulmonar es mediante inhalación o administración intranasal, y la formulación es para administrar una dosis de 5 mg/kg o menos una vez diaria.
  7. 7. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y en el que la administración local al tejido pulmonar es mediante inhalación o administración intranasal, y en el que no se acumulan niveles significativos de dAb en la circulación sistémica.
  8. 8. -El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la administración local al tejido pulmonar es mediante inhalación o administración intranasal, y en el que dicha enfermedad respiratoria se selecciona de inflamación pulmonar, COPD, y asma.
  9. 9. -El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la administración local al tejido pulmonar es mediante inhalación o administración intranasal, y en el que se emplea un inhalador, un nebulizador o un dispositivo de administración intranasal para proporcionar una dosis controlada de un dominio variable único de inmunoglobulina a un sujeto para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno respiratorio, y en el que dicha dosis diaria controlada contiene hasta 10 mg del dominio variable único de inmunoglobulina.
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