MX2008005129A - Agentes que se enlazan con un objetivo en el tejido pulmonar para el tratamiento de enfermedades respiratorias. - Google Patents

Agentes que se enlazan con un objetivo en el tejido pulmonar para el tratamiento de enfermedades respiratorias.

Info

Publication number
MX2008005129A
MX2008005129A MX2008005129A MX2008005129A MX2008005129A MX 2008005129 A MX2008005129 A MX 2008005129A MX 2008005129 A MX2008005129 A MX 2008005129A MX 2008005129 A MX2008005129 A MX 2008005129A MX 2008005129 A MX2008005129 A MX 2008005129A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
tar2h
seq
tnfr1
dab
percent
Prior art date
Application number
MX2008005129A
Other languages
English (en)
Inventor
Benjamin P Woolven
Steve Holmes
Ian M Tomlinson
Jennifer Lee
Rudolf M T De Wildt
Gregory P Winter
Mary F Fitzgerald
Justian Craig Fox
Armin Sepp
Original Assignee
Domantis Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Domantis Ltd filed Critical Domantis Ltd
Publication of MX2008005129A publication Critical patent/MX2008005129A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Se da a conocer el uso de un agente (por ejemplo), fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, para la fabricación de una formulación de larga acción o de larga ventana terapéutica para suministro local al tejido pulmonar, y métodos para administrar un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar a un sujeto, para producir una ventana terapéutica larga en el tejido pulmonar. La formulación es para, y el método comprende, la administración local al tejido pulmonar. También se da a conocer el uso de antagonistas de TNFR1 para la fabricación de una formulación o de un medicamento para el tratamiento, la prevención, o la supresión de inflamación pulmonar o de una enfermedad respiratoria, y métodos para el tratamiento de estas enfermedades. También se da a conocer el uso de agentes para la fabricación de un dispositivo de suministro (por ejemplo, inhalador, dispositivo de suministro intranasal) para el tratamiento o la prevención de inflamación pulmonar o de una enfermedad respiratoria, y un dispositivo de suministro para el tratamiento o la prevención de inflamación pulmonar o de una enfermedad respiratoria, que contiene un agente como se describe en la presente.

Description

AGENTES QUE SE ENLAZAN CON UN OBJETIVO EN EL TEJIDO PULMONAR PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica prioridad de acuerdo con el Título 35 del Código de los Estados Unidos, Secciones 119 ó 365, para el Reino Unido, Solicitud Número GB 0521621.3, presentada el 24 de octubre de 2005. Todas las enseñanzas de la solicitud anterior se incorporan a la presente como referencia. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN No es posible el uso in vivo de muchos agentes con un potencial terapéutico o de diagnóstico. Los agentes más grandes que tienen vidas medias en suero in vivo que son suficientemente largas para permitir la eficacia terapéutica o de diagnóstico, con frecuencia son incapaces de penetrar en los tejidos o en los órganos para producir un efecto terapéutico o de diagnóstico deseado en una localización deseada. Los agentes más pequeños son capaces de entrar en los tejidos y órganos, pero con frecuencia tienen vidas medias en suero in vivo cortas, y se eliminan rápidamente de la circulación sistémica. Por ejemplo, la vida media en suero in vivo de los monómeros de dAb es de aproximadamente 30 minutos. (Véanse los Ejemplos 9 y 13 de la Publicación Internacional Número WO2004/081026 A2). De una manera similar, la vida media en suero in vivo de los fragmentos de enlace de antígeno de los anticuerpos, en particular los fragmentos Fv, también es corta, y los hace inadecuados para muchas aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo. (Peters y colaboradores, Science 286(5439) :434 (1999)). Además, la alteración o modificación de estos agentes para aumentar la vida media en suero in vivo, puede reducir la actividad del agente. Existe una necesidad de métodos para administrar agentes (por ejemplo, al tejido pulmonar) para producir una ventana terapéutica larga para el agente. Los agentes que se enlazan con TNF y neutralizan su actividad, han probado ser agentes terapéuticos efectivos para ciertas condiciones inflamatorias, tales como artritis. Sin embargo, no se ha demostrado que los agentes que se enlazan con TNF sean efectivos en el tratamiento de inflamación pulmonar o de enfermedades respiratorias, tales como la enfermedad obstructiva crónica (COPD). (Véase, por ejemplo, van der Vaart y colaboradores, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 172(4):465-9 (2005), Rennard y colaboradores, Proc. Amer. Thorac. Soc, 2(Publicación de Extracto):A 33, A541 (2005), Abdelhady y colaboradores, Proc. Amer. Thorac. Soc, 2(Publicación de Extracto):A133 (2005)). Más aún, los agentes terapéuticos que se dirigen al TNF-alfa, tales como ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation) antagonizan TNFR1 y TNFR2, y la administración de estos agentes puede producir inmunosupresion y efectos secundarios relacionados (por ejemplo, infecciones graves). Estos efectos secundarios pueden limitar el uso de tales agentes, en particular para enfermedades crónicas en donde el agente se administra durante un período largo. (Kollias G. y Kontoyiannis D., Cytokine Growth Factor Rev., 13(4-5):315-321 (2002)). En contraste, los agentes que antagonizan específicamente TNFR1 tendrían efectos secundarios reducidos. Sin embargo, es difícil la dirección al TNFR1, debido a que los agentes que hacen que se arracime el receptor, pueden activar la señalización a través del receptor, lo cual puede conducir a la elaboración de mediadores inflamatorios, tales como TNF. De hecho, los agentes multivalentes que se enlazan con TNFR1, tales como los anticuerpos anti-TNFR1, pueden inducir el arracimado de TNFR1 y la transduccion de señal en ausencia del TNF, y se utilizan comúnmente como agonistas de TNFR1. (Véase, por ejemplo, Belka y colaboradores, EMBO, 14(6):1156-1165 (1995); Mandik-Nayak y colaboradores, J. Immunol, 167:1920-1928 (2001)). De conformidad con lo anterior, los agentes multivalentes que se enlazan con TNFR1 en general no son antagonistas efectivos de TNFR1, inclusive cuando bloqueen el enlace de TNFrj con TNFR1. Existe una necesidad de mejores agentes que antagonicen el TNF, y métodos para administrar estos agentes, con el fin de tratar inflamación pulmonar y enfermedad pulmonar. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al uso de un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb), para la fabricación de una formulación de larga acción o de larga ventana terapéutica para administración local al tejido pulmonar, o para la fabricación de un medicamento para administración local al tejido pulmonar, de una cantidad efectiva de baja dosis de dicho agente, en donde se mantiene cuando menos el 50 por ciento del nivel de agente en el tejido pulmonar durante un período de cuando menos aproximadamente 4 horas. De preferencia, la formulación o el medicamento es para administración local al pulmón. De una manera preferible, se mantiene un nivel pulmonar de cuando menos aproximadamente el 1 por ciento de la cantidad de agente en la formulación o medicamento durante cuando menos 4 horas después de su administración local. De una manera más preferible, el agente no entra sustancialmente en la circulación sistémica. En algunas modalidades, el agente tiene una vida media en suero in vivo de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 12 horas. En otras modalidades, la formulación o el medicamento es para la administración de una dosis de no más de aproximadamente 10 miligramos/kilogramo/día. La invención se refiere al uso de un anticuerpo de dominio (dAb) que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, para la fabricación de una formulación de dosis diaria para administración local al tejido pulmonar, en donde se mantiene cuando menos el 50 por ciento del nivel de agente en el pulmón durante un período de cuando menos aproximadamente 4 horas. La invención se refiere al uso de un anticuerpo de dominio (dAb) que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, para la fabricación de una formulación para el tratamiento o la prevención de una enfermedad respiratoria, en donde la formulación es para administración local al tejido pulmonar, y no entra sustancialmente en la circulación sistémica. En una modalidad, se utilizan hasta aproximadamente 10 miligramos de un dAb que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar. De preferencia, el objetivo en el tejido pulmonar media la inflamación pulmonar o una enfermedad pulmonar. La invención se refiere a un inhalador o a un dispositivo de suministro intranasal para proporcionar una dosis medida de una formulación de anticuerpo de dominio (dAb) a un sujeto, para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición respiratoria, en donde el inhalador o el dispositivo de suministro intranasal comprende una formulación de dAb, y proporciona una dosis diaria medida que contiene hasta 10 miligramos del dAb. La invención también se refiere al uso de una formulación de anticuerpo de dominio (dAb) en la fabricación de un inhalador o de un dispositivo de suministro intranasal, para el propósito de proporcionar una formulación de dAb inhalada de larga acción para suministro local al pulmón. La invención también se refiere a un método para la administración de un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, a un sujeto, para producir una ventana terapéutica larga en el tejido pulmonar, el cual comprende administrar localmente al tejido pulmonar de ese sujeto, una cantidad efectiva de dicho agente. La invención también se refiere a un método para administrar un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, a un sujeto, para producir una ventana terapéutica larga en el tejido pulmonar, el cual comprende seleccionar un agente que tenga una vida media en suero in vivo de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 12 horas, y que se enlace con un objetivo en el tejido pulmonar, y administrar localmente al tejido pulmonar de este sujeto, una cantidad efectiva de dicho agente. Los agentes adecuados para utilizarse en la invención se pueden enlazar con un objetivo en el tejido pulmonar seleccionado a partir del grupo que consiste en TNFR1, IL-1, IL-1R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, 1L-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12, IL-12R, IL-13, IL-13Ra1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23, IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1 , TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), quimasa, FGF, Furina, Endotelina-1 , Eotaxinas (por ejemplo, Eotaxina, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, I-309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, elastasa de neutrófilos, osteopontina, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1, TNF, TNFR1, TRANCE, Triptasa, VEGF, VLA-4, VCAM, a?ß7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfavbeta6, alfavbeta 8, cMET, y CD8.
En una modalidad, un agente para utilizarse en la invención se puede enlazar con un objetivo seleccionado a partir del grupo que consiste en una proteína en la cascada de señalización de TNF. De preferencia, este objetivo de proteína se selecciona a partir del grupo que comprende TNF-alfa, TNF-beta, TNFR2, TRADD, FADD, Caspasa-8, factor asociado con receptor de TNF (TRAF), TRAF2, proteína de interacción con el receptor (RIP), Hsp90, Cdc37, IKK-alfa, IKK-beta, NEMO, inhibidor de kB (IkB), NF-kB, modulador esencial de NF-kB, cinasa regulada por señal de apoptosis-1 (aSMasa), esfingomielinasa neutra (nSMasa), ASK1, Catepsina-B, cinasa de centro germinal (GSK), GSK-3, proteína de dominio de muerte asociada con el factor (FADD), factor asociado con activación de esfingomielinasa neutra (FAN), FLIP, JunD, inhibidor de quinasa NF-kB (IKK), MKK3, MKK4, MKK7, IKK-gamma, cinasa de proteína activada por mitógeno/cinasa de cinasa Erk (MEKK), MEKK1, MEKK3, NIK, poli-(ADP-ribosa)-polimerasa (PARP), PKC-zeta, Re1 A, T2K, TRAF1, TRAF5, dominio efector de muerte (DED), dominio de muerte (DD), complejo de señalización inductor de muerte (DISC), inhibidor de proteína de apoptosis (IAP), cinasa N-terminal c-Jun (JNK), cinasa de proteína activada por mitógeno (MAPK), cinasas de fosfoinositida-30H (PI3K), cinasa A de proteína (PKA), PKB, PKC, PLAD, PTEN, dominio de homología reí (RHD), nuevo gen realmente interesante (RING), cinasa de proteína activada por tensión (SAPK), enzima convertidora de TNF-alfa (TACE), silenciador de proteína de dominio de muerte (SODD), y activador de NF-kB asociado con TRAF (TANK). Con respecto a estos objetivos preferidos, se hace referencia a las Publicaciones Internacionales Números WO04046189, WO04046186, y WO04046185 (incorporadas a la presente como referencia), las cuales proporcionan una guía sobre la selección de los dominios variables individuales de anticuerpos para dirigirse a los objetivos intracelulares. La invención se refiere al uso de un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando, monómero dAb), para utilizarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, la supresión, o la prevención de inflamación pulmonar y/o de una enfermedad respiratoria. La invención también se refiere a métodos para el tratamiento, la supresión, o la prevención de inflamación pulmonar y/o de una enfermedad respiratoria, los cuales comprenden seleccionar un antagonista del Receptor de Factor de Necrosis Tumoral 1 (TNFR1), que tenga eficacia en un modelo animal adecuado de enfermedad respiratoria cuando se administre en una cantidad que no exceda de aproximadamente 10 miligramos/kilogramo/día, en donde la eficacia en este modelo animal existe cuando se inhibe la infiltración celular de los pulmones, como sea evaluada por un conteo celular total en el lavado broncoalveolar, en relación con un control no tratado, con una p>0.05; y administrar (por ejemplo, administrar localmente al tejido pulmonar) una cantidad efectiva de este antagonista de TNFR1 a un sujeto que lo necesite. Las enfermedades respiratorias que se pueden tratar, suprimir, o prevenir utilizando los medicamentos, formulaciones, y métodos de la invención incluyen inflamación pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, neumonía, neumonitis por hipersensibilidad, infiltrado pulmonar con eosinofilia, enfermedad pulmonar ambiental, neumonía, bronquiectasis, fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar primaria, tromboembolia pulmonar, trastornos de la pleura, trastornos del mediastino, trastornos del diafragma, hipoventilación, hiperventilación, apnea del sueño, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, mesotelioma, sarcoma, rechazo de injerto, enfermedad del injerto contra el huésped, cáncer pulmonar, rinitis alérgica, alergia, asbestosis, aspergiloma, aspergilosis, bronquiectasis, bronquitis crónica, enfisema, neumonía eosinof ílica, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad neumocócica invasiva, influenza, micobacteria no tuberculosa, efusión pleural, neumoconiosis, neumocitosis, neumonía, actinomicosis pulmonar, proteinosis pulmonar alveolar, ántrax pulmonar, edema pulmonar, émbolo pulmonar, inflamación pulmonar, histiocitosis X pulmonar, hipertensión pulmonar, nocardiosis pulmonar, tuberculosis pulmonar, enfermedad veno-oclusiva pulmonar, enfermedad pulmonar reumatoide, sarcoidosis, granulomatosis de Wegener, y carcinoma pulmonar no microcelular. La invención también se refiere a los ligandos y dAbs descritos en la presente. La invención también se refiere a un ligando que comprende una fracción de proteína que tiene un sitio de enlace con una especificidad de enlace para TNFR1, en donde esta fracción de proteína comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente. En algunas modalidades, el ligando que comprende una fracción de proteína que tiene un sitio de enlace con una especificidad de enlace para TNFR1, en donde la fracción de proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, y también comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de la CDR1 y/o CDR2 de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con la secuencia de CDR1 de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR2 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con la secuencia de CDR2 de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR3 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con la secuencia de CDR3 de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1 y una secuencia de CDR2 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 ó CDR2, respectivamente, de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR2 y una secuencia de CDR3 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR2 ó CDR3, respectivamente, de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos del dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1 y una secuencia de CDR3 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 ó CDR3, respectivamente, de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1,en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1, una secuencia de CDR2, y una secuencia de CDR3 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1, CDR2, o CDR3, respectivamente, de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFRi tiene una secuencia de CDR1 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 tiene una secuencia de CDR2 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR2 de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 tiene una secuencia de CDR3 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR3 de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 tiene una secuencia de CDR1 y de CDR2 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 tiene una secuencia de CDR2 y de CDR3 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR2 y CDR3, respectivamente, de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 tiene una secuencia de CDR1 y de CDR3 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 y CDR3, respectivamente, de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 tiene una secuencia de CDR1, CDR2, y CDR3 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1, CDR2, CDR3, respectivamente, de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente.
La invención también se refiere a un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica cualquiera de los ligandos de la invención. En otras modalidades, la invención se refiere a un vector que comprende el ácido nucleico recombinante de la invención. La invención también se refiere a una célula huésped que comprende el ácido nucleico recombinante de la invención, o el vector de la invención. La invención también se refiere a un método para producir un ligando, el cual comprende mantener una célula huésped de la invención bajo condiciones adecuadas para la expresión de un ácido nucleico o vector de la invención, en donde se produce un ligando. En otras modalidades, el método para producir un ligando comprende además aislar el ligando. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que muestra que un antagonista de TNFR1 tiene una eficacia superior en comparación con otros agentes terapéuticos cuando se administra localmente al tejido pulmonar en un modelo sub-crónico de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) inducida por el humo del tabaco (TS) en ratones C57BL/6. La gráfica muestra el número de células presentes en el lavado broncoalveolar (BAL) de los ratones al terminar el estudio descrito en el Ejemplo 1. Se muestran los puntos de datos individuales para cada ratón en el estudio y los promedios de grupos (medias; líneas horizontales). Los resultados muestran que el monómero dAb anti-TNFR1 (Dom1) administrado localmente al pulmón mediante administración intranasal, redujo el número de células en el lavado broncoalveolar por el 72 por ciento, comparándose con el grupo no tratado. Los resultados también muestran que la administración local al pulmón de un agente terapéutico que se dirige al TNF (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)), no tuvo un efecto estadísticamente significativo sobre el número de células en el lavado broncoalveolar. Los resultados muestran además que el monómero dAb anti-TNFR1 (Dom1) administrado localmente al pulmón mediante administración intranasal, fue más efectivo para reducir el número de células en el lavado broncoalveolar que un inhibidor de fosfodiesterasa 4 (PDE4I , BAY 19-8004) que se administró en una dosis alta de 10 miligramos/kilogramo oralmente dos veces al día (b. i. d.). TS, inducido por el humo del tabaco; Veh, vehículo; ns, no estadísticamente significativo. La Figura 2 es una gráfica que muestra que un antagonista de TNFR1 tiene una eficacia superior en comparación con un agente terapéutico que se dirija al TNF, cuando se administra sistémicamente en un modelo sub-crónico de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) inducida por el humo del tabaco (TS) en ratones C57BL/6. La gráfica muestra el número de células presentes en el lavado broncoalveolar de los ratones al terminar el estudio descrito en el Ejemplo 2. Se muestran los puntos de datos individuales para cada ratón en el estudio, y los promedios de grupos (líneas horizontales). Los resultados muestran que el monómero dAb anti-TNFR1 PEGilado (TNFR1) administrado sistémicamente mediante administración intraperitoneal, redujo el número de células en el lavado broncoalveolar por el 60 por ciento, comparándose con el grupo no tratado. Los resultados también muestran que la administración sistémica de un agente terapéutico que se dirija al TNF (etanercept; Immunex Corporation), dio como resultado un aumento del 12 por ciento en el número de células en el lavado broncoalveolar, aunque este aumento no fue estadísticamente significativo. TS, inducido por el humo del tabaco; Veh, vehículo; ns, no estadísticamente significativo; i. p., intraperitoneal. La Figura 3 es un histograma en donde se vuelven a graficar los datos para ciertos grupos que se muestran en las Figuras 1 y 2, junto con los resultados para un estudio en donde se administró un esteroide oral (dexametasona) en el modelo. El histograma muestra que la administración local del monómero dAb anti-TNFR1 (DOM/ADS101 -nativo (Dom1 en la Figura 1)) al pulmón mediante administración intranasal (1 miligramo/kilogramo, administrado una vez cada día (q.d.)), y la administración sistémica del monómero dAb anti-TNFFM PEGilado (DOM/ADS101 -pegilado (TNFR1 en la Figura 2)), mediante administración intraperitoneal (10 miligramos/kilogramo administrados una vez cada 2 días (q. a. d.)), fueron más eficaces en el modelo que el inhibidor de fosfodiesterasa 4 (PDE4I) que se administró en una dosis alta (10 miligramos/kilogramo administrados oralmente dos veces al día (b. i. d.)). El histograma también muestra que el esteroide oralmente administrado (0.3 miligramo/kilogramo administrados oralmente dos veces al día) aumentó el número de células en el lavado broncoalveolar, y por lo tanto, no fue eficaz en el modelo. Las Figuras 4A y 4B son histogramas que muestran los conteos de células diferenciales para macrófagos (4A) o neutrófilos (4B) en el lavado broncoalveolar para ciertos grupos de estudio que se muestran en las Figuras 1 y 2. La Figura 4A muestra que la administración local del monómero dAb anti-TNFR1 (DOM/ADS101 -nativo (Dom en la Figura 1)) al pulmón mediante administración intranasal (1 miligramo/kilogramo administrado una vez cada día (q.d.)), y la administración sistémica del monómero dAb anti-TNFR1 PEGilado 8DOM-ADS101 -pegilado (TNFR1 en la Figura 2)) mediante administración intraperitoneal (10 miligramos/kilogramo administrados una vez cada 2 días (q. a. d)), fueron más eficaces para reducir el número de macrófagos en el lavado broncoalveolar que el inhibidor de fosfodiesterasa 4 (PDE4I) que se administró en una dosis alta (10 miligramos/kilogramo administrados oralmente dos veces al día (b. i. d.)). De una manera similar, la Figura 4B muestra que la administración local del monómero dAb anti-TNFR1 (DOM/ADS101 -nativo (Dom1 en la Figura 1)) al pulmón mediante administración intranasal (1 miligramo/kilogramo administrado una vez al día (q. d.)), y la administración sistémica del monómero dAb anti-TNFR1 PEGilado (DOM/ADS101 -pegilado (TNFR1 en la Figura 2)) mediante administración intraperitoneal (10 miligramos/kilogramo administrados una vez cada 2 días (q. a. d.))< fueron más eficaces para reducir el número de neutrófilos en el lavado broncoalveolar que el inhibidor de fosfodiesterasa 4 (PDE4I), que se administró en una dosis alta (10 miligramos/kilogramo administrados oralmente dos veces al día (b. i. d.)). La Figura 5 es una gráfica que muestra los resultados del estudio farmacocinético de un agente que se enlaza con TNFR1 (DOM1m (TAR2m21 -23)), en seguida de la administración local al tejido pulmonar mediante administración intranasal (véase el Ejemplo 3). La gráfica muestra que los niveles de DOM1m en el tejido pulmonar permanecieron relativamente constantes durante cuando menos 8 horas después de la administración, mientras que los niveles en el lavado broncoalveolar declinaron gradualmente, y los niveles en suero declinaron rápidamente, y fueron indetectables después de 5 horas. Se detectaron los máximos niveles de DO 1m en el lavado broncoalveolar y en el suero 1 hora después de la administración (aproximadamente 14 microgramos/mililitro en el lavado broncoalveolar, y aproximadamente 150 nanogramos/mililitro en el suero). Los niveles en el lavado broncoalveolar permanecieron altos durante un período de tiempo prolongado, y declinaron gradualmente durante 24 horas (declinación de >10 veces después de 24 horas). Los niveles en suero declinaron rápidamente, y DOM1m no fue detectable en el suero después de 5 horas. Los niveles de DOM1 en el tejido pulmonar fueron relativamente constantes durante cuando menos 8 horas después de la administración, y fueron indetectables 24 horas después de la administración.
Las Figuras 6A-6V muestran las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NOs:1-198) de varios dominios variables de ¡nmunoglobulina humana, que tienen especificidad de enlace para el TNFR1 humano. Las secuencias de aminoácidos presentadas son continuas sin huecos; se ha insertado el símbolo ~ en las secuencias para indicar las localizaciones de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs). La CDR1 está flanqueada por ~, la CDR2 está flanqueada por ~~, está flanqueada por . Las Figuras 7A-7B muestran las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NOs:199-211) de varios dominios variables de ¡nmunoglobulina humana, que tienen especificidad de enlace para el TNFR1 de ratón. Las secuencias de aminoácidos presentadas son continuas in huecos; se ha insertado el símbolo ~ en las secuencias para indicar las localizaciones de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs). La CDR1 está flanqueada por ~, la CDR2 está flanqueada por ~~, y la CDR3 está flanqueada por .
La Figura 8A muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:212) que codifica el dominio extracelular del TNFR1 humano (homo sapiens). La Figura 8B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:213) del dominio extracelular del TNFR1 humano (homo sapiens).
La Figura 9A muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:214) que codifica el dominio extracelular del TNFR1 de ratón (Mus musculus). La Figura 9B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:215) del dominio extracelular del TNFR1 de ratón (Mus musculus). Las Figuras 10A-10Q muestran las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NOs:216-221) de varios dominios variables de inmunoglobulina humana, que tienen una especificidad de enlace por el TNFR1 de ratón, y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NOs:222-433) de varios dominios de inmunoglobulina humana, que tienen especificidad de enlace para el TNFR1 humano. Las secuencias de aminoácidos presentadas son continuas sin huecos; se ha insertado el símbolo ~ en las secuencias para indicar las localizaciones de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs). La CDR1 está flanqueada por ~, la CDR2 está flanqueada por ~~, y la CDR3 está flanqueada por . Las Figuras 11A y 11B son gráficas que muestran los aumentos dependientes del tiempo en la concentración de TNFa en el lavado broncoalveolar (BAL) (Figura 11 A) o en el tejido pulmonar (Figura 11B), en seguida de la administración intranasal (i. n.) del TNFa de murino (1 miligramo/ratón), una hora después de la administración intranasal del vehículo o del dAb anti-TNFR1 (1 miligramo/ kilogramo). La figura 12 es una gráfica que muestra los aumentos dependientes del tiempo en los neutrófilos del lavado broncoalveolar en seguida de la administración intranasal del TNFa de murino (1 microgramo/ratón), 1 hora después de la administración intranasal previa del vehículo o del dAb anti-TNFR1 (1 miligramo/kilogramo). La administración previa del dAb anti-TNFFH inhibió parcialmente el aumento en los neutrófilos inducido por el TNFa. Las Figuras 13A-13D son gráficas que muestran los efectos dependientes del tiempo del TNFa de murino sobre los niveles de KC en el lavado broncoalveolar (13A), los niveles de MIP-2 en el lavado broncoalveolar (13B), los niveles de MCP-1 en el lavado broncoalveolar (13C), o los niveles de E-selectina en el tejido pulmonar (13D). La administración del dAb anti-TNFR1 inhibió de una manera significativa los aumentos inducidos por el TNFa. Las Figuras 14A-14Z y 14A2-14J2, muestran las secuencias de nucleótidos de varios ácidos nucleicos que codifican los dominios variables de inmunoglobulina humana que tienen especificidad de enlace para el TNFR1 humano (SEQ ID NOs:434-644), y las secuencias de nucleótidos de varios ácidos nucleicos que codifican los dominios variables de inmunoglobulina humana que tienen especificidad de enlace para el TNFR1 de ratón (SEQ ID NOs:645-650). Las secuencias presentadas son continuas sin huecos; se ha insertado el símbolo ~ en las secuencias para indicar las localizaciones que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDRs). La CDR1 está flanqueada por ~, la CDR2 está flanqueada por ~~, y la CDR3 está flanqueada por .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se utiliza en la presente, el término "antagonista" se refiere a un agente (por ejemplo, una molécula, un compuesto) que se enlaza con un objetivo (por ejemplo, una proteína receptora), y que puede inhibir una (por ejemplo, una o más) función del objetivo. Por ejemplo, un antagonista de una proteína receptora puede enlazarse con la proteína receptora e inhibir el enlace de un ligando natural o cognado a la proteína receptora, y/o puede inhibir la transducción de señal mediada a través de la proteína receptora. Por ejemplo, los antagonistas del Receptor de Factor de Necrosis Tumoral 1 "TNFR1" pueden enlazarse con TNFR1 e inhibir el enlace de TNFa al TNFR1, y/o inhibir la transducción de señal mediada a través de TNFR1. Los antagonistas se pueden identificar, por ejemplo, mediante el rastreo de bibliotecas o colecciones de moléculas, tales como el Chemical Repository of the National Cáncer Institute, o empleando otros métodos adecuados. Los antagonistas preferidos son "ligandos" como se describen en la presente. Como se utiliza en la presente, el término "antagonista del Receptor del Factor de Necrosis Tumoral 1 (TNFR1) ", se refiere a un agente (por ejemplo, una molécula, un compuesto) que se enlaza con TNFR1, y que puede inhibir una (es decir, una o más) función del TNFR1. Por ejemplo, un antagonista de TNFR1 puede inhibir el enlace de TNFa al TNFR1, y/o puede inhibir la transducción de señal mediada a través del TNFR1. De conformidad con lo anterior, los procesos mediados por TNFR1 y las respuestas celulares (por ejemplo, la muerte celular inducida por el TNFa en un ensayo de citotoxicidad estándar L929), se pueden inhibir con un antagonista de TNFR1. Un antagonista de TNFR1 puede ser, por ejemplo, una molécula orgánica pequeña, un producto natural, una proteína, un péptido, o un peptidomimético. Los antagonistas de TNFR1 se pueden identificar, por ejemplo, mediante el rastreo de bibliotecas o colecciones de moléculas, tales como, el Chemical Repository of the National Cáncer Institute, como se describe en la presente, o empleando otros métodos adecuados. Los antagonistas preferidos de TNFR1 son anticuerpos, fragmentos de enlace de antígeno de los anticuerpos, ligandos, y monómeros dAb, descritos en la presente. Como se utiliza en la presente, el término "ligando", se refiere a un polipéptido que comprende un dominio que tiene especificidad de enlace por un objetivo deseado. De preferencia, el dominio de enlace es un solo dominio variable de inmunoglobulina (por ejemplo, VH, VL, VHH), que tiene especificidad de enlace por un antígeno objetivo deseado (por ejemplo, una proteína receptora). El dominio de enlace también puede comprender una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de un solo dominio variable de inmunoglobulina que tenga especificidad de enlace por un antígeno objetivo deseado en un formato adecuado, de tal manera que el dominio de enlace tiene especificidad de enlace por el antígeno objetivo. Por ejemplo, las regiones determinantes de complementariedad se pueden injertar sobre un andamiaje o esqueleto de proteína adecuado, tal como un aficuerpo, un andamiaje SpA, un dominio de receptor de LDL clase A, o un dominio de EGF. Además, el ligando puede ser monovalente (por ejemplo, un monómero dAb), bivalente (homobivalente, heterobivalente) , o multivalente (homomultivalente, heteromultivalente) , como se describe en la presente. Por consiguiente, "ligandos" incluyen los polipéptidos que consisten en un dAb, incluyendo los polipéptidos que consisten esencialmente en este dAb, los polipéptidos que comprenden un dAb (o las regiones determinantes de complementariedad de un dAb) en un formato adecuado, tal como un formato de anticuerpo (por ejemplo, un formato de tipo IgG, scFv, Fab, Fab', F(ab')2), o un andamiaje o esqueleto de proteína adecuado, tal como un aficuerpo, un andamiaje SpA, un dominio de receptor de LDL clase A, o un dominio de EGF, los ligandos específicos dobles que comprenden un dAb que se enlaza con una primera proteína, antígeno, o epítopo objetivo (por ejemplo, TNFR1), y un segundo dAb que se enlaza con otra proteína, antígeno, o epítopo objetivo (por ejemplo, albúmina de suero), y los ligandos multiespecíficos descritos en la presente. El dominio de enlace también puede ser un dominio de proteína que comprenda un sitio de enlace para un objetivo deseado, por ejemplo un dominio de proteína se selecciona a partir de un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de receptor de LDL clase A, un dominio de EGF, un avímero (véase, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 2005/0053973, 2005/0089932, 2005/0164301). La frase "un solo dominio variable de inmunoglobulina" se refiere a una región variable de anticuerpo (VH, VHH, Vl), que se enlaza específicamente con un antígeno o epítopo, independientemente de otras regiones o dominios V; sin embargo, como se utiliza el término en la presente, un solo dominio variable de inmunoglobulina puede estar presente en un formato (por ejemplo, homo- o hetero-multímero) con otras regiones variables o dominios variables, en donde las otras regiones o dominios no se requieren para el enlace del antígeno mediante el único dominio variable de inmunoglobulina (es decir, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina se enlaza con el antígeno independientemente de los dominios variables adicionales). "Un solo dominio variable de inmunoglobulina" abarca no solamente un polipéptido de un solo dominio variable de anticuerpo aislado, sino también polipéptidos más grandes que comprendan uno o más monómeros de una secuencia de polipéptido de un solo dominio variable de anticuerpo. Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" es lo mismo que un polipéptido de "solo dominio variable de inmunoglobulina", como se utiliza este término en la presente. Un polipéptido de un solo dominio variable de inmunoglobulina, como se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido de un solo dominio variable de inmunoglobulina de mamífero, de preferencia de un ser humano, pero también incluye los dAbs VHH de roedor (por ejemplo, como se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 00/29004, el contenido de la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad, o de camélido. Los dAbs de camélido son polipéptidos de un solo dominio variable de inmunoglobulina que se derivan a partir de especies que incluyen camello, llama, alpaca, dromedario, y guanaco, y comprenden los anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadena ligera: VHH- Las moléculas de VHH son aproximadamente 10 veces más pequeñas que las moléculas de IgG, y como los polipéptidos individuales, son muy estables, resistiendo condiciones extremas de pH y de temperatura. Como se utiliza en la presente, el término "dosis" se refiere a la cantidad de agente (por ejemplo, antagonista de TNFR1) administrada a un sujeto toda a la vez (dosis unitaria), o en dos o más administraciones durante un intervalo de tiempo definido. Por ejemplo, la dosis puede referirse a la cantidad de agente (por ejemplo, antagonista de TNFR1) administrada a un sujeto durante el transcurso de 1 día (24 horas) (dosis diaria), 2 días, una semana, dos semanas, tres semanas, o uno o más meses (por ejemplo, mediante una sola administración, o mediante dos o más administraciones). El intervalo entre las dosis puede ser cualquier cantidad de tiempo deseada. Como se utiliza en la presente, el término "ventana terapéutica" se refiere al intervalo de concentraciones del fármaco (por ejemplo, antagonista, ligando, monómero dAb) en el plasma, o en un tejido u órgano (por ejemplo, tejido pulmonar, pulmón) al que se administre localmente un fármaco, que dé como resultado una alta probabilidad de eficacia terapéutica. "Complementario". Dos dominios de inmunoglobulina son "complementarios" cuando pertenecen a familias de estructuras que forman pares o grupos cognados, o que se derivan a partir de esas familias y retienen esta característica. Por ejemplo, un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo son complementarios; dos dominios VH no son complementarios, y dos dominios VL no son complementarios. Los dominios complementarios se pueden encontrar en otros miembros de la súper-familia de inmunoglobulina, tales como los dominios V„ y Vp (o y t ó)del receptor de células-T. Los dominios que son artificiales, tales como los dominios basados en andamiajes de proteínas que no se enlazan con los epítopos a menos que se diseñen para hacerlo, no son complementarios. De la misma manera, dos dominios basados (por ejemplo) en un dominio de inmunoglobulina y un dominio de fibronectina, no son complementarios. "Inmunoglobulina". Esto se refiere a una familia de polipéptidos que retienen la característica de pliegue de inmunoglobulina de las moléculas de anticuerpo, que contiene dos hojas ß, y usualmente, un enlace de disulfuro conservado. Los miembros de la súper-familia de inmunoglobulina están involucrados en muchos aspectos de las interacciones celulares y no celulares in vivo, incluyendo papeles ampliamente extendidos en el sistema inmune (por ejemplo, anticuerpos, moléculas receptoras de células-T, y similares), involucramiento en la adhesión celular (por ejemplo, las moléculas ICAM), y señalización intracelular (por ejemplo, moléculas receptoras, tales como el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas). La presente invención es aplicable a todas las moléculas de la súper-familia de inmunoglobulina que posean dominios de enlace. De preferencia, la presente invención se refiere a anticuerpos. "Dominio". Un dominio es una estructura de proteína plegada que retiene su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. En términos generales, los dominios son responsables de las propiedades funcionales separadas de las proteínas, y en muchos casos se pueden agregar, remover, o transferir a otras proteínas, sin que se pierda la función del resto de la proteína y/o del dominio. Un solo dominio variable de anticuerpo significa un dominio de polipéptido plegado que comprende secuencias características de los dominios variables de anticuerpo. Por consiguiente, incluye los dominios variables de anticuerpo completos y los dominios variables modificados, por ejemplo, en donde uno o más ciclos han sido reemplazados por secuencias que no son características de los dominios variables de anticuerpo, o dominios variables de anticuerpos que se han truncado o que comprenden extensiones N- ó C-terminales, así como fragmentos plegados de los dominios variables que retienen cuando menos en parte la actividad de enlace y la especificidad del dominio de longitud completa. "Repertorio". Una colección de variantes diversas, por ejemplo, variantes de polipéptido que difieren en su secuencia primaria. Una biblioteca utilizada en la presente invención abarcará un repertorio de polipéptidos que comprendan cuando menos 1,000 miembros. "Biblioteca". El término "biblioteca" se refiere a una mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos heterogéneos. La biblioteca está compuesta de miembros, cada uno de los cuales tiene una sola secuencia de polipéptido o de ácido nucleico. Hasta este grado, la biblioteca es sinónimo de repertorio. Las diferencias de secuencias entre los miembros de la biblioteca son responsables de la diversidad presente en la biblioteca. La biblioteca puede tomar la forma de una simple mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos, o puede estar en la forma de organismo o células, por ejemplo bacterias, virus, células de animales o plantas, y similares, transformados con una biblioteca de ácidos nucleicos. De preferencia, cada organismo o célula individual contiene solamente uno o un número limitado de miembros de la biblioteca. De una manera conveniente, los ácidos nucleicos se incorporan en vectores de expresión, con el objeto de permitir la expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. Por consiguiente, en un aspecto preferido, una biblioteca puede tomar la forma de una población de organismos huésped, conteniendo cada organismo una o más copias de un vector de expresión que contenga un solo miembro de la biblioteca en forma de ácido nucleico, que se pueda expresar para producir su miembro de polipéptido correspondiente. Por lo tanto, la población de organismos huésped tiene el potencial para codificar un gran repertorio de variantes de polipéptido genéticamente diversas. "Anticuerpo". Un anticuerpo (por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD ó IgE) o fragmento (tal como un Fab, F(ab')2, Fv, Fv enlazado con disulfuro, scFv, anticuerpo multiespecífico de conformación cerrada, scFv enlazado con disulfuro, diacuerpo), ya sea derivado a partir de cualquier especie que produzca naturalmente un anticuerpo, o bien creado mediante tecnología de ADN recombinante; ya sea aislado a partir de suero, células-B, hibridomas, transfectomas, levadura, o bacterias. "Ligando específico-doble". Un ligando que comprende un primer único dominio variable de inmunoglobulina y un segundo único dominio variable de inmunoglobulina, como se define en la presente, en donde las regiones variables son capaces de enlazarse con dos antígenos diferentes o con dos epítopos sobre el mismo antígeno, que normalmente no se enlazan mediante una inmunoglobulina monoespecífica. Por ejemplo, los dos epítopos pueden estar sobre el mismo hapteno, pero no son el mismo epítopo ni están suficientemente adyacentes para enlazarse mediante un ligando monoespecífico. Los ligandos específicos-dobles de acuerdo con la invención están compuestos de dominios variables que tienen diferentes especificidades, y no contienen pares de dominios variables mutuamente complementarios que tengan la misma especificidad. Los ligandos específicos-dobles y los métodos adecuados para la preparación de los ligandos específicos-dobles se dan a conocer en las Publicaciones Internacionales Números WO 2004/058821, WO 2004/003019, y WO 03/002609, incorporándose las enseñanzas totales de cada una de estas solicitudes internacionales publicadas a la presente como referencia. "Antígeno". Una molécula que es enlazada por un ligando de acuerdo con la presente invención. Típicamente, los antígenos son enlazados por ligandos de anticuerpo, y son capaces de provocar una respuesta de anticuerpo in vivo. Puede ser un polipéptido, proteína, ácido nucleico, u otra molécula. En términos generales, los ligandos específicos-dobles de acuerdo con la invención se seleccionan para la especificidad objetivo contra un antígeno particular. En el caso de los anticuerpos convencionales y fragmentos de los mismos, el sitio de enlace de anticuerpo definido por los ciclos variables (L1, L2, L3, y H1, H2, H3) es capaz de enlazarse con el antígeno. "Epítopo". Una unidad de estructura convencionalmente enlazada por un par de VH/VU de inmunoglobulina. Los epítopos definen el sitio de enlace mínimo para un anticuerpo, y por lo tanto, representan el objetivo de especificidad de un anticuerpo. En el caso de un anticuerpo de un solo dominio, un epítopo representa la unidad de estructura enlazada por un dominio variable en aislamiento. "Estructura universal". Una sola secuencia de estructura de anticuerpo que corresponde a las regiones de un anticuerpo conservado en la secuencia, como es definido por Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos), o que corresponde al repertorio o estructura de la inmunoglobulina de la línea germinal humana, como es definida por Chothia y Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917. La invención proporciona el uso de una sola estructura, o de un conjunto de estas estructuras, que se ha encontrado que permiten hacer la derivación de virtualmente cualquier especificidad de enlace a través de la variación en las regiones hipervariables solamente. "Vida media". El tiempo que se necesita para que la concentración en suero del ligando se reduzca por el 50 por ciento in vivo, por ejemplo debido a la degradación del ligando y/o a la eliminación o el secuestro del ligando por los mecanismos naturales. Los ligandos de la invención se estabilizan in vivo, y su vida media aumenta mediante su enlace con moléculas que resisten la degradación y/o la eliminación o el secuestro. Típicamente, estas moléculas son proteínas que se presentan naturalmente, que ellas mismas tienen una larga vida media in vivo. La vida media de un ligando se incrementa si persiste su actividad funcional, in vivo, durante un período más largo que un ligando similar que no sea específico para la molécula que aumenta la vida media. Por consiguiente, un ligando específico para HSA y una molécula objetivo se compara con el mismo ligando en donde no esté presente la especificidad para HSA, porque no se enlaza con HSA sino que se enlaza con otra molécula. Por ejemplo, se puede enlazar con un segundo epítopo sobre la molécula objetivo. Típicamente, la vida media se incrementa por el 10 por ciento, el 20 por ciento, el 30 por ciento, el 40 por ciento, el 50 por ciento o más. Son posibles los incrementos en el intervalo de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, o más de la vida media. De una manera alternativa, o en adición, son posibles los incrementos en el intervalo de hasta 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 150 veces de la vida media. "Sustancialmente idéntica (o "sustancialmente homologa")". Una primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que contenga un número suficiente de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo sustituciones de aminoácidos conservadas), a una segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos, de tal manera que las primera y segunda secuencias de aminoácidos o de nucleótidos tengan actividades similares. En el caso de los anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad de enlace, y tiene cuando menos el 50 por ciento de la afinidad del mismo. Como se utilizan en la presente, los términos "restringencia baja", "restringencia media", "restringencia alta", o "condiciones de muy alta restringencia", describen las condiciones para la hibridación y el lavado de los ácidos nucleicos. La guía para llevar a cabo las reacciones de hibridación se puede encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3,6, el cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. En esa referencia se describen métodos acuosos y no acuosos, y se pueden utilizar los que sean. Las condiciones de hibridación específicas referidas en la presente son como sigue: (1) condiciones de hibridación de baja restringencia en cloruro de sodio 6X/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguidas por dos lavados en SSC 0.2X, SDS al 0.1 por ciento cuando menos a 50°C (la temperatura de los lavados se puede incrementar hasta 55°C para las condiciones de baja restringencia); (2) condiciones de hibridación de restringencia media en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguidas por uno o más lavados en SSC 0.2X, SDS al 0.1 por ciento a 60°C; (3) condiciones de hibridación de alta restringencia en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguidas por uno o más lavados en SSC 0.2X, SDS al 0.1 por ciento a 65°C; y de preferencia (4) las condiciones de hibridación de muy alta restringencia son de fosfato de sodio 0.5M, SDS al 7 por ciento a 65°C, seguidas por uno o más lavados en SSC 0.2X, SDS al 1 por ciento a 65°C. Las condiciones de muy alta restringencia (4) son las condiciones preferidas y las únicas que se deben emplear, a menos que se especifique de otra manera. Como es referido en la presente, el término "compite" significa que se inhibe el enlace de un primer epítopo con su dominio de enlace del epítopo cognado cuando se enlaza un segundo epítopo con su dominio de enlace del epítopo cognado. Por ejemplo, se puede inhibir el enlace estéricamente, por ejemplo mediante el bloqueo físico de un dominio de enlace, o mediante la alteración de la estructura o del medio ambiente de un dominio de enlace, de tal manera que se reduzca su afinidad o avidez por un epítopo. Las secuencias similares u homologas (por ejemplo, una identidad de secuencias de cuando menos aproximadamente el 70 por ciento) a las secuencias dadas a conocer en la presente, también son parte de la invención. En algunas modalidades, la identidad de secuencia al nivel de los aminoácidos puede ser de aproximadamente el 80 por ciento, 85 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento o mayor. Al nivel del ácido nucleico, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente el 70 por ciento, el 75 por ciento, el 80 por ciento, el 85 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o mayor. De una manera alternativa, existe una identidad sustancial cuando los segmentos de ácido nucleico se hibridan bajo condiciones de hibridación selectivas (por ejemplo, condiciones de hibridación de muy alta restringencia) con el complemento de la cadena. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" o "similitud" entre dos secuencias (los términos se utilizan de una manera intercambiable en la presente) se llevan a cabo como sigue. Las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para la alineación óptima, y se pueden hacer a un lado las secuencias no homologas para los propósitos de la comparación). En una modalidad preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es cuando menos el 30 por ciento, de preferencia cuando menos el 40 por ciento, más preferiblemente cuando menos el 50 por ciento, todavía de una manera más preferible cuando menos el 60 por ciento, y aún muy preferiblemente cuando menos el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, o el 100 por ciento de la longitud de la secuencia de referencia. Entonces se comparan los residuos de aminoácidos o los nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se utiliza en la presente, "homología" de aminoácidos o de ácidos nucleicos es equivalente a la "identidad" de aminoácidos o de ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesitan introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. Las alineaciones y homología, similitudes o identidad de secuencias de aminoácidos y de nucleótidos, como se definen en la presente, de preferencia se preparan y se determinan utilizando el algoritmo de Secuencias BLAST2, empleando los parámetros por omisión (Tatusova, T. A. y colaboradores, FEMS Microbiol. Lett., 174:187-188 (1999)). De una manera alternativa, y convenientemente, se emplea el algoritmo BLAST (versión 2.0) para la alineación de secuencias, con los parámetros establecidos en los valores por omisión. El algoritmo BLAST se describe con detalle en el sitio web mundial ("www") del National Center for Biotechnology Information (".nebí") de los National Institutes of Health ("nih") del gobierno de los Estados Unidos (".gov"), en el director "/Blast/", en el archivo "blast_help.html". Los parámetros de búsqueda se definen como sigue, y convenientemente se establecen en los parámetros definidos por omisión. BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica) es el algoritmo de búsqueda heurístico empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn, y tblastx; estos programas adscriben significado a sus descubrimientos empleando los métodos estadísticos de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87(6):2264-8 (véase el archivo "blast_help.html", como se describe anteriormente) con unas cuantas mejoras. Los programas BLAST se hicieron a la medida para la búsqueda de similitudes de secuencias, por ejemplo, para identificar homólogos para una secuencia pedida. Los programas en general no son útiles para la búsqueda de motivos-estilos. Para una discusión de las cuestiones básicas en la búsqueda de similitudes en las bases de datos de secuencias, véase Altschul y colaboradores (1994). Los cinco programas BLAST disponibles en el sitio web del National Center for Biotechnology Information realizan las siguientes tareas: "blastp" compara una secuencia pedida de aminoácidos contra una base de datos de secuencias de proteínas; "blastn" compara una secuencia pedida de nucleótidos contra una base de datos de secuencias de nucleótidos; "blastx" compara los productos de traducción conceptuales de seis marcos de una secuencia pedida de nucleótidos (ambas cadenas) contra una base de datos de secuencias de proteínas; "tblastn" compara una secuencia pedida de proteína contra una base de datos de secuencias de nucleótidos dinámicamente traducidas en los seis marcos de lectura (ambas cadenas); "tblastx" compara las traducciones de seis marcos de una secuencia pedida de nucleótidos contra las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleótidos. BLAST utiliza los siguientes parámetros de búsqueda: HISTOGRAM (HISTOGRAMA). Exhibe una histograma de puntajes para cada búsqueda; por omisión es sí. (Véase el parámetro H en el Manual BLAST). DESCRIPTIONS (DESCRIPCIONES). Restringe el número de descripciones cortas de las secuencias emparejadas reportadas al número especificado; el límite por omisión es de 100 descripciones. (Véase el parámetro V en la página del manual). Véase también EXPECT (EXPECTATIVA) y CUTOFF (CORTE). ALIGNMENTS (ALINEACIONES). Restringe las secuencias de la base de datos al número identificado para el cual se reportan los pares de segmentos de alto puntaje (HSPs); el límite por omisión es de 50. Si sucediera que más secuencias de la base de datos que este número satisfacen el umbral de significado estadístico para el reporte (véase EXPECT (EXPECTATIVA) y CUTOFF (CORTE) más adelante), solamente se reportan los emparejamientos adscritos con el significado estadístico mayor. (Véase el parámetro B en el Manual BLAST). EXPECT (EXPECTATIVA). El umbral de significado estadístico para reportar los emparejamientos contra las secuencias de la base de datos; el valor por omisión es de 10, de tal manera que se espera que se encuentren diez emparejamientos meramente por azar, de acuerdo con el modelo estocástico de Karlin y Altschul (1990). Si el significado estadístico adscrito a un emparejamiento es mayor que el umbral de EXPECT (EXPECTATIVA), no se reportará el emparejamiento. Los umbrales de EXPECT (EXPECTATIVA) más bajos son más estrictos, conduciendo a que se reporten menos emparejamientos por azar. Los valores fraccionarios son aceptables. (Véase el parámetro E en el Manual BLAST). CUTOFF (CORTE). El puntaje de corte para reportar los pares de segmentos de alto puntaje. El valor por omisión se calcula a partir del valor de EXPECT (EXPECTATIVA) (véase anteriormente). Se reportan los pares de segmentos de alto puntaje para una secuencia de la base de datos solamente si el significado estadístico adscrito a ellos es cuando menos tan alto como sería adscrito a un par de segmentos de alto puntaje solo, que tenga un puntaje igual al valor de CUTOFF (CORTE). Los valores de CUTOFF (CORTE) más altos son más estrictos, conduciendo a que se reporten menos emparejamientos por azar. (Véase el parámetro S en el Manual BLAST). Típicamente, se pueden manejar más intuitivamente los umbrales de significado utilizando EXPECT (EXPECTATIVA). MATRIX (MATRIZ). Especifica una matriz de puntaje alterna para BLASTP, BLASTX, TBLASTN, y TBLASTX. La matriz por omisión es BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89(22):10915-9). Las elecciones alternativas válidas incluyen: PAM40, PAM120, PAM250 e IDENTITY (IDENTIDAD). No hay matrices de puntaje alternas disponibles para BLASTN; la especificación de la directiva MATRIX (MATRIZ) en las peticiones de BLASTN regresa una respuesta de error. STRAND (CADENA). Restringe una búsqueda de TBLASTN a solamente la cadena superior o inferior de las secuencias de la base de datos; o restringe una búsqueda de BLASTN, BLASTX, o TBLASTX a solamente los marcos de lectura sobre la cadena superior o inferior de la secuencia pedida. FILTER (FILTRO). Enmascara los segmentos de la secuencia pedida que tengan una baja complejidad de composición, como sea determinado por el programa SEG de Wootton y Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163, o los segmentos consistentes en repeticiones internas de corta periodicidad, como sea determinado por el programa XNU de Claverie y States, 1993, Computers and Chemistry 17:191-201, o, para BLASTN, por el programa DUST de Tatusov y Lipman (véase el sitio web mundial del NCBI). La filtración puede eliminar los reportes estadísticamente significativos pero biológicamente no interesantes del resultado de BLAST (por ejemplo, los impactos contra las regiones ricas en ácido, ricas en básico, o ricas en prolina comunes), dejando las regiones más biológicamente interesantes de la secuencia pedida disponibles para un emparejamiento específico contra las secuencias de la base de datos. La secuencia de baja complejidad encontrada por un programa de filtro es sustituido utilizando la letra "N" en la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, "N" repetida 13 veces), y la letra "X" en las secuencias de proteínas (por ejemplo, "X" repetida 9 veces). La filtración se aplica solamente a la secuencia pedida (o a sus productos de traducción), y no a las secuencias de la base de datos). La filtración por omisión es DUST para BLASTN, y SEG para otros programas. No es poco usual que no se enmascare nada mediante SEG, XNU, o ambos, cuando se aplican a las secuencias en SWISS-PROT, de modo que no se debe esperar que la filtración siempre produzca un efecto. Adicionalmente, en algunos casos, las secuencias se enmascaran en su totalidad, indicando que se debe sospechar del significado estadístico de cualesquiera emparejamientos reportados contra la secuencia pedida no filtrada. NCBI-gi hace que se muestren los identificadores de NCBI-gi en el resultado, en adición al acceso y/o nombre de locus. De una manera muy preferible, las comparaciones de secuencias se conducen utilizando el simple algoritmo de búsqueda BLAST proporcionado en el sitio web mundial de NCBI descrito anteriormente, en el directorio "/BLAST". A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto ordinario en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridación, y bioquímica). Se utilizan las técnicas convencionales para los métodos moleculares, genéticos, y bioquímicos (véase en general, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. y Ausubel y colaboradores, Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4a Edición, John Wiley & Sons, Inc., los cuales se incorporan a la presente como referencia), y para los métodos químicos. Como se describe en la presente, se condujo un estudio en donde se administró un antagonista de TNFR1 consistente esencialmente en un monómero dAb que se enlaza con TNFR1 en un modelo sub-crónico de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) inducida por el humo del tabaco en ratón. Los resultados del estudio revelaron que los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, que comprenden un anticuerpo de dominio (dAb) que se enlaza con TNFR1), son agentes terapéuticos efectivos para el tratamiento de enfermedades respiratorias (por ejemplo, inflamación en el pulmón, enfermedad pulmonar aguda, enfermedad pulmonar crónica (por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica)). De hecho, los antagonistas probados en el estudio fueron más eficaces que el inhibidor de fosfodiesterasa 4 en dosis alta o que el TNFR1 soluble (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)), que se enlaza con, y neutraliza, el TNFa. Los antagonistas de TNFR1 estudiados fueron eficaces en el modelo cuando se administraron sistémicamente (inyección intraperitoneal) o (ocalmente al tejido pulmonar mediante administración intranasal. De una manera sorprendente, los resultados del estudio muestran que la administración local de un antagonista que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, TNFR1), fue más efectiva para inhibir la infiltración celular de los pulmones en el modelo, que la administración sistémica de un antagonista de vida media prolongada (monómero dAb PEGilado, PEGilado para aumentar el tamaño hidrodinámico y la vida media en suero in vivo del monómero dAb), inclusive cuando se administrara sistémicamente cinco veces más antagonista. En términos molares, se administró sistémicamente 2.5 veces más antagonista de vida media prolongada (monómero dAb PEGilado, PEGilado para aumentar el tamaño hidrodinámico y la vida media en suero in vivo del monómero dAb, comparándose con el monómero dAb localmente administrado). Como se describe en la presente, se condujo un estudio adicional en donde se presenta la farmacocinética de un monómero dAb que se enlaza con TNFR1 después de la administración local al tejido pulmonar mediante administración intranasal. Los resultados de este estudio revelaron que, en seguida de la administración local al tejido pulmonar, el monómero dAb tuvo un largo tiempo de residencia en el pulmón, y que la cantidad de monómero dAb en el pulmón fue sustancialmente constante durante un período de 8 horas. En adición, el suministro local del monómero dAb al pulmón dio como resultado la breve presencia de solamente una baja concentración de monómero dAb en el suero. De una manera específica, se detectó un nivel máximo de aproximadamentel 50 nanogramos/mililitro en el suero 1 hora después de la administración, y no hubo monómero dAb detectable en el suero después de 5 horas. Estos resultados del estudio farmacocinético son sorprendentes, y demuestran que un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, tal como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv enlazado con disulfuro), fragmento F(ab')2, dAb), o un antagonista de un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, ligando, monómero dAb), se puede administrar localmente al tejido pulmonar, para proporcionar una larga ventana terapéutica (para el tratamiento, la supresión, la prevención, o el diagnóstico de condiciones respiratorias) en el tejido pulmonar, debido al largo tiempo de residencia de estos agentes en el tejido pulmonar. Los resultados del estudio farmacocinético, y la larga ventana terapéutica proporcionada por la administración local al tejido pulmonar, también explican la eficacia superior observada del antagonista localmente administrado de TNFR1 en el modelo de ratón de enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Adicionalmente, la eficacia superior observada del monómero dAb cuando se administra localmente en una dosis baja, la baja concentración del monómero dAb que entra en el suero, y la rápida eliminación del monómero dAb desde el suero, indican que los agentes que se enlazan con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv enlazado por disulfuro), fragmento F(ab')2> dAb) tienen mucho menos probabilidades de producir efectos secundarios (por ejemplo, inmunosupresión, toxicidad) que otros tipos de agentes terapéuticos. En estudios adicionales, se indujo inflamación del pulmón mediante el estimulante inflamatorio TNFa. Los resultados de estos estudios demuestran que los antagonistas de TNFR1 (dAb anti-TNFR1 que inhibe él enlace de TNFa con el receptor, o que no inhibe el enlace de TNFa con el receptor), inhiben de una manera significativa los aumentos inducidos por TNFa de otros mediadores inflamatorios, tales como los quimioatrayentes de neutrófilos de acción temprana KC y MIP-1, y la quimiocina de acción tardía MCP-1 , y la molécula de adhesión de E-selectina, e inhiben la infiltración celular de los pulmones.
Los estudios descritos en la presente demuestran que los agentes que se enlazan con los objetivos en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv enlazado con disulfuro), fragmento F(ab')2, dAb), los antagonistas, ligandos, monómeros dAb) son productos terapéuticos superiores para el tratamiento, la supresión, o la prevención de inflamación pulmonar y/o de enfermedad respiratoria, o para propósitos de diagnóstico, tales como la formación de imágenes. Los resultados también demuestran que, aún cuando los monómeros dAb tengan una corta vida media en suero in vivo, los dAbs que se enlacen con un objetivo en el tejido pulmonar, y los antagonistas que contengan ese dAb, se pueden administrar localmente al tejido pulmonar para proporcionar una larga ventana terapéutica en el tejido pulmonar, debido al largo tiempo de residencia de este dAb en el tejido pulmonar. De conformidad con lo anterior, se pueden administrar localmente otros agentes que se enlacen con un objetivo en el tejido pulmonar y que tengan vidas medias in vivo cortas (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fv (por ejemplo, scFvs, Fvs enlazados por disulfuro, fragmentos F(ab')2), al tejido pulmonar, para proporcionar una larga ventana terapéutica (por ejemplo, para el tratamiento, la supresión, la prevención, o el diagnóstico de condiciones respiratorias) en el tejido pulmonar. En términos generales, se pueden administrar localmente agentes que se enlacen con los objetivos en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv enlazado con disulfuro), fragmento F(ab')2, dAb), antagonistas, ligandos, monómeros dAb), al tejido pulmonar, para proporcionar una ventana terapéutica en el tejido pulmonar, de cuando menos aproximadamente 4 horas, de cuando menos aproximadamente 5 horas, de cuando menos aproximadamente 6 horas, de cuando menos aproximadamente 7 horas, de cuando menos aproximadamente 8 horas, de cuando menos aproximadamente 9 horas, de cuando menos aproximadamente 10 horas, de cuando menos aproximadamente 11 horas, o de cuando menos aproximadamente 12 horas. Administración Local al Tejido Pulmonar, de Agentes que se Enlazan con los Objetivos en el Tejido Pulmonar. En un primer aspecto, la invención se refiere a métodos para administrar un agente (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb), que se enlace con un objetivo en el tejido pulmonar, a un sujeto, con el fin de producir una larga ventana terapéutica (por ejemplo, para el tratamiento, la supresión, la prevención, o el diagnóstico de condiciones respiratorias) en el tejido pulmonar. Por ejemplo, una ventana terapéutica en el tejido pulmonar de cuando menos aproximadamente 4 horas, de cuando menos aproximadamente 5 horas, de cuando menos aproximadamente 6 horas, de cuando menos aproximadamente 7 horas, de cuando menos aproximadamente 8 horas, de cuando menos aproximadamente 9 horas, de cuando menos aproximadamente 10 horas, de cuando menos aproximadamente 11 horas, o de cuando menos aproximadamente 12 horas. De acuerdo con el primer aspecto de la invención, el agente se administra localmente al tejido pulmonar de un sujeto (por ejemplo, un ser humano). Un agente que se enlace a un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv enlazado con disulfuro), fragmento F(ab')2, dAb), antagonistas, ligandos, monómeros dAb), se puede administrar localmente al tejido pulmonar (por ejemplo, al pulmón) de un sujeto, empleando cualquier método adecuado. Por ejemplo, un agente se puede administrar localmente al tejido pulmonar por medio de inhalación o administración intranasal. Para la inhalación o la administración intranasal, el agente (antagonista de TNFR1, ligando, monómero dAb) se puede administrar utilizando un nebulizador, inhalador, atomizador, aerosolizador, rocío de niebla fina, inhalador de polvo seco, inhalador de dosis medida, rociador de dosis medida, nebulizador de dosis medida, atomizador de dosis medida, u otro dispositivo de suministro adecuado. En algunas modalidades, el método comprende administrar localmente al tejido pulmonar de un sujeto, una cantidad efectiva de un agente (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que tenga una vida media en suero in vivo corta, y que se enlace con un objetivo en el tejido pulmonar. De acuerdo con la invención, estos agentes (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) se pueden administrar localmente al tejido pulmonar para producir una ventana terapéutica larga en el tejido pulmonar, pero no se acumularán sustancialmente en el suero. Debido a la corta vida media in vivo de estos agentes (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb), los agentes que crucen el epitelio pulmonar y que entren al suero serán rápidamente eliminados del suero, y por lo tanto, no se acumularán hasta niveles que puedan producir efectos indeseados (por ejemplo, efectos secundarios sistémicos). Por ejemplo, los agentes adecuados (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlacen con un objetivo en el tejido pulmonar para utilizarse en el primer aspecto de la invención, pueden tener una vida media en suero in vivo de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 12 horas, de aproximadamente 12 horas o menos, de aproximadamente 11 horas o menos, de aproximadamente 10 horas o menos, de aproximadamente 9 horas o menos, de aproximadamente 8 horas o menos, de aproximadamente 7 horas o menos, de aproximadamente 6 horas o menos, de aproximadamente 5 horas o menos, de aproximadamente 4 horas o menos, de aproximadamente 3 horas o menos, de aproximadamente 2 horas o menos, de aproximadamente 1 hora o menos o de aproximadamente 30 minutos o menos. Los antagonistas preferidos para administrarse de acuerdo con el primer aspecto de la invención comprenden un dAb que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar. Los agentes particularmente preferidos (por ejemplo, antagonistas) para utilizarse en el primer aspecto de la invención, son los monómeros dAb o los fragmentos de enlace de antígeno de los anticuerpos que se enlazan con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fv (por ejemplo, scFv, Fvs enlazados con disulfuro, fragmentos F(ab')2). La vida media en suero in vivo de los monómeros dAb es de aproximadamente 30 minutos. (Véanse los Ejemplos 9 y 13 de la Publicación Internacional Número WO 2004/081026 A2). Sin embargo, como se describe en la presente, el suministro local de un monómero dAb que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, TNFR1) dio como resultado una ventana terapéutica en el tejido pulmonar de cuando menos 8 horas. De una manera similar, la vida media en suero in vivo de los fragmentos de enlace de antígeno de anticuerpos, en particular fragmentos Fv, también es corta, y los hace inadecuados para muchas aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo. (Peters y colaboradores, Science 286(5439):434 (1999)). Sin embargo, como se muestra por los resultados del estudio descrito en la presente, los fragmentos de enlace de antígeno de los anticuerpos que se enlazan con un objetivo en el tejido pulmonar se pueden administrar localmente al tejido pulmonar, para proporcionar una ventana terapéutica larga (por ejemplo, para el tratamiento, la supresión, la prevención, o el diagnóstico de condiciones respiratorias) en el tejido pulmonar, por ejemplo, una ventana terapéutica de cuando menos 8 horas. Como se describe en la presente, la administración local de un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb), al tejido pulmonar, produce una ventana terapéutica larga en el tejido pulmonar (pulmón). En algunas modalidades, la administración local de un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb), al tejido pulmonar, produce una ventana terapéutica larga en el tejido pulmonar (pulmón), que se caracteriza por la presencia en el pulmón de cuando menos aproximadamente el 1 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 1.25 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 1.5 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 1.75 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 2 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 2.25 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 2.5 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 2.75 por ciento, o de cuando menos aproximadamente el 3 por ciento de la cantidad total de agente que se administró, a las 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, ó 12 horas después de la administración. En algunas modalidades, la administración local de un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb), al tejido pulmonar, produce una ventana terapéutica larga en el pulmón, que se caracteriza por la presencia en el pulmón de un total (lavado broncoalveolar y tejido pulmonar) de cuando menos aproximadamente el 40 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 35 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 30 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 25 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 20 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 15 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 10 por ciento, o de cuando menos aproximadamente el 5 por ciento de la cantidad total de agente que se administró, a las 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, ó 12 horas después de la administración. En otras modalidades, la administración local de un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, produce una ventana terapéutica larga en el tejido pulmonar (pulmón), en donde se mantiene cuando menos el 50 por ciento, cuando menos el 60 por ciento, cuando menos el 70 por ciento, cuando menos el 75 por ciento, menos el 80 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, cuando menos el 95 por ciento, cuando menos el 96 por ciento, cuando menos el 97 por ciento, cuando menos el 98 por ciento, cuando menos el 99 por ciento o más del nivel pulmonar del agente (por ejemplo, el nivel alcanzado en seguida de la administración (por ejemplo, el nivel pulmonar alcanzado una hora después de la administración local al pulmón)), durante un período de cuando menos aproximadamente 4 horas, de cuando menos aproximadamente 5 horas, de cuando menos aproximadamente 6 horas, de cuando menos aproximadamente 7 horas, de cuando menos aproximadamente 8 horas, de cuando menos aproximadamente 9 horas, de cuando menos aproximadamente 10 horas, de cuando menos aproximadamente 11 horas, o de cuando menos aproximadamente 12 horas. Como se describe en la presente, la administración local de un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb), al tejido pulmonar, produce una ventana terapéutica larga en el tejido pulmonar (pulmón), pero el agente no entra sustancialmente a la circulación sistémica. Un agente que no entra sustancialmente a la circulación cuando no más de aproximadamente el 2 por ciento, no más de aproximadamente el 1.75 por ciento, no más de aproximadamente el 1.5 por ciento, no más de aproximadamente el 1.25 por ciento, no más de aproximadamente el 1 por ciento, no más de aproximadamente el 0.75 por ciento, no más de aproximadamente el 0.5 por ciento, o no más de aproximadamente el 0.25 por ciento de la cantidad total de agente administrado, o sustancialmente nada de agente, está presente en el suero 5 horas después de que se administre el agente. En algunas circunstancias, un agente administrado como se describe en la presente, puede entrar a la circulación sistémica, pero no se acumula hasta un nivel significativo debido a que, por ejemplo, el agente se elimina rápidamente de la circulación sistémica. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un método para administrar localmente un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, al tejido pulmonar, en donde no se acumula un nivel significativo del agente en la circulación sistémica. El nivel de un agente en la circulación sistémica no es significativo cuando no más de aproximadamente el 2 por ciento, no más de aproximadamente el 1.75 por ciento, no más de aproximadamente el 1.5 por ciento, no más de aproximadamente el 1.25 por ciento, no más de aproximadamente el 1 por ciento, no más de aproximadamente el 0.75 por ciento, no más de aproximadamente el 0.5 por ciento, o no más de aproximadamente el 0.25 por ciento de la cantidad total de agente administrado, o sustancialmente nada de agente, está presente en el suero 5 horas después de que se administre el agente. En términos generales, solamente se necesita administrar localmente al tejido pulmonar de un sujeto una "cantidad efectiva de dosis baja de un agente" (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlace con un objetivo en el tejido pulmonar. Una cantidad efectiva de dosis baja es una cantidad de agente que es menor que la cantidad del mismo agente que se necesitaría administrar sistémicamente (es decir, dosis sistémica efectiva) para lograr el mismo efecto. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva de dosis baja es de aproximadamente el 80 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, de aproximadamente el 70 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, de aproximadamente el 60 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, de aproximadamente el 50 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, de aproximadamente el 40 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, de aproximadamente el 30 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, de aproximadamente el 20 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, de aproximadamente el 10 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, o de aproximadamente el 5 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva. Los agentes adecuados que se pueden administrar localmente al tejido pulmonar de acuerdo con el primer aspecto de la invención incluyen agentes tales como un anticuerpo o fragmentos de enlace de antígeno de anticuerpos (por ejemplo, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv enlazado con disulfuro), fragmento F(ab')2, dAb), y antagonistas (por ejemplo, ligando, monómero dAb) que se enlacen con un objetivo en el tejido pulmonar, tales como TNFR1, IL-I, IL-IFt, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, 1L-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12, IL-12R, IL-13, IL-13Ra1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23, IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1 , TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), quimasa, FGF, Furina, Endotelina-1 , Eotaxinas (por ejemplo, Eotaxina, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, I-309, integrinas, L- selectina, MIF, IP4, MDC, MCP-1 , MMPs, elastasa de neutrófilos, osteopontina, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1, TNF, TNFR1, TRANCE, Triptasa, VEGF, VLA-4, VCAM, a4/37, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfavbeta6, alfavbeta 8, Cmet, ó CD8. En una modalidad, el objetivo se selecciona a partir de una proteína en la cascada de señalización de TNF. De una manera preferible, este objetivo de proteína se selecciona a partir del grupo que comprende TNF-alfa, TNF-beta, TNFR2, TRADD, FADD, Caspasa-8, factor asociado con receptor de TNF (TRAF), TRAF2, proteína de interacción con el receptor (RIP), Hsp90, Cdc37, IKK-alfa, IKK-beta, NEMO, inhibidor de kB (IkB), NF-kB, modulador esencial de NF-kB, cinasa regulada por la señal de apoptosis-1 (aSMasa), esfingomielinasa neutra (nSMasa), ASK1, Catepsina B, cinasa central germinal (GSK), GSK-3, proteína de dominio de muerte asociada con el factor (FADD), factor asociado con la activación de esfingomielinasa neutra (FAN), FLIP, JunD, inhibidor de cinasa NF-kB (IKK), KK3, MKK4, KK7, IKK-gamma, cinasa de proteína activada por mitógeno/cinasa de cinasa Erk (MEKK), MEKK1 , MEKK3, NIK, poli-(ADP-ribosa)-polimerasaí (PARP), PKC-zeta, Re1 A, T2K, TRAF1 , TRAF5, dominio efector de muerte (DED), dominio de muerte (DD), complejo de señalización inductor de muerte (DISC), inhibidor de proteína de apoptosis (IAP), cinasa N-terminal c-Jun (JNK), cinasa de proteína activada por mitógeno (MAPK), cinasa de fosfoinositida-30H (PI3K), cinasa A de proteína (PKA), PKB, PKC, PLAD, PTEN, dominio de homología reí (RHD), nuevo gen realmente interesante (RING), cinasa de proteína activada por tensión (SAPK), enzima convertidora de TNF-alfa (TACE), silenciador de proteína de dominio de muerte (SODD), y activador de NF-kB asociado con TRAF (TANK). Con respecto a estos objetivos preferidos, se hace referencia a las Publicaciones Internacionales Números WO040461 S9, WO04046186, y WO04046185 (incorporadas a la presente como referencia), las cuales proporcionan una guía sobre la selección de los dominios variables únicos de anticuerpos para dirigirse a objetivos intracelulares. Los agentes que se enlazan con los objetivos en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fab, fragmento Fab\ fragmento Fv (por ejemplo, scFv, Fv enlazado con disulfuro), fragmento F(ab')2, dAb), antagonistas, ligandos, monómeros dAb), se pueden preparar empleando cualquier método adecuado, tal como los métodos descritos en la presente con detalle con respecto a los antagonistas (por ejemplo, ligandos, monómeros dAb) que se enlazan con TNFR1. En algunas modalidades, la invención es un método para proporcionar una ventana terapéutica larga en el tejido pulmonar de un sujeto (por ejemplo, un ser humano) para un agente (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlace con un objetivo (por ejemplo, TNFR1) en el tejido pulmonar, el cual comprende seleccionar un agente que tenga una vida media en suero in vivo corta (por ejemplo, de menos de aproximadamente 12 horas), y que se enlace con un objetivo en el tejido pulmonar, y administrar localmente al tejido pulmonar del sujeto, una cantidad efectiva o una cantidad efectiva de dosis baja del agente que se seleccionó. En las modalidades particulares, el primer aspecto de la invención es un método para proporcionar una ventana terapéutica larga en el tejido pulmonar de un sujeto (por ejemplo, un ser humano) para un agente (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlace con un objetivo (por ejemplo, TNFR1) en el tejido pulmonar, el cual comprende administrar localmente al tejido pulmonar del sujeto, una cantidad efectiva, o una cantidad efectiva de dosis baja de este agente. De preferencia, se administran no más de aproximadamente 10 miligramos/kilogramo/día del agente. Por ejemplo, se administran de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo/día a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo/día, por ejemplo aproximadamente 1 miligramo/kilogramo/día, aproximadamente 2 miligramos/kilogramo/-día, aproximadamente 3 miligramos/kilogramo/día, aproximadamente 4 miligramos/kilogramo/día, aproximadamente 5 miligramos/-kilogramo/día, aproximadamente 6 miligramos/kilogramo/día, aproximadamente 7 miligramos/kilogramo/día, aproximadamente 8 miligramos/kilogramo/día, aproximadamente 9 miligramos/-kilogramo/día, o aproximadamente 10 miligramos/kilogramo/día del agente. En otras modalidades preferidas, tales como cuando se está administrando el agente al tejido pulmonar (pulmón) de un ser humano, se administran no más de aproximadamente 10 miligramos/día. Por ejemplo, en estas modalidades, el agente se puede administrar localmente al tejido pulmonar en una dosis de aproximadamente 1 miligramo/día a aproximadamente 10 miligramos/día (por ejemplo, 10 miligramos/día, 9 miligramos/día, 8 miligramos/día, 7 miligramos/día, 6 miligramos/día, 5 miligramos/día, 4 miligramos/día, 3 miligramos/día, 2 miligramos/día, ó 1 miligramos/día). De conformidad con lo anterior, el agente se puede administrar localmente al tejido pulmonar en una dosis de aproximadamente 1 microgramo/kilogramo/día a aproximadamente 200 microgramos/kilogramo/día (por ejemplo, aproximadamente 10 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 20 microgramos/-kilogramo/día, aproximadamente 30 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 40 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 50 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 60 microgramos/-kilogramo/día, aproximadamente 70 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 80 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 90 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 100 microgramos/-kilogramo/día, aproximadamente 110 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 120 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 130 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 140 microgramos/-kilogramo/día, aproximadamente 150 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 160 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 170 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 180 microgramos/-kilogramo/día, o aproximadamente 190 microgramos/kilogramo/día).
En las modalidades particulares, se administran de aproximadamente 5 microgramos/kilogramo/día a aproximadamente 3 miligramos/-kilogramo/día, o de preferencia de aproximadamente 50 microgramos/kilogramo/día a aproximadamente 500 microgramos/ kilogramo/día. Uso de Agentes que se Enlazan con los Objetivos en el Tejido Pulmonar, para el Tejido Pulmonar, para la Fabricación de Formulaciones y Medicamentos. El primer aspecto de la invención también se refiere al uso de un agente (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlaza con un objetivo (por ejemplo, TNFR1) en el tejido pulmonar, como se describe en la presente, en la fabricación de una formulación de larga acción o de larga ventana terapéutica, para su administración local al tejido pulmonar. El período de la larga ventana terapéutica o de larga acción en el tejido pulmonar, puede ser un período de cuando menos aproximadamente 4 horas, de cuando menos aproximadamente 5 horas, de cuando menos aproximadamente 6 horas, de cuando menos aproximadamente 7 horas, de cuando menos aproximadamente 8 horas, de cuando menos aproximadamente 9 horas, de cuando menos aproximadamente 10 horas, de cuando menos aproximadamente 11 horas, o de cuando menos aproximadamente 12 horas. En algunas modalidades, el agente (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) utilizado, tiene una vida media en suero in vivo corta, y se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar. De acuerdo con la invención, estos agentes (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) se pueden administrar localmente al tejido pulmonar para producir una ventana terapéutica larga en el tejido pulmonar, pero no se acumularán sustancialmente en el suero. Por ejemplo, los agentes adecuados (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlazan con un objetivo en el tejido pulmonar, para utilizarse en el primer aspecto de la invención, pueden tener una vida media en suero in vivo de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 12 horas, de aproximadamente 12 horas o menos, de aproximadamente 11 horas o menos, de aproximadamente 10 horas o menos, de aproximadamente 9 horas o menos, de aproximadamente 8 horas o menos, de aproximadamente 7 horas o menos, de aproximadamente 6 horas o menos, de aproximadamente 5 horas o menos, de aproximadamente 4 horas o menos, de aproximadamente 3 horas o menos, de aproximadamente 2 horas o menos, de aproximadamente 1 hora o menos, o de aproximadamente 30 minutos o menos. Los agentes particularmente preferidos (por ejemplo, antagonistas) para utilizarse en el primer aspecto de la invención, son monómeros dAb o fragmentos de enlace de antígeno de anticuerpos que se enlacen con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fv (por ejemplo, scFvs, Fv enlazado con disulfuro, fragmentos F(ab')2)).
En algunas modalidades, la invención se refiere al uso de un agente (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlaza con un objetivo (por ejemplo, TNFR1) en el tejido pulmonar, como se describe en la presente, en la fabricación de una formulación de larga acción o de larga ventana terapéutica para su administración local al tejido pulmonar (pulmón), en donde se mantiene cuando menos el 50 por ciento, cuando menos el 60 por ciento, cuando menos el 70 por ciento, cuando menos el 75 por ciento, cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, cuando menos el 95 por ciento, cuando menos el 96 por ciento, cuando menos el 97 por ciento, cuando menos el 98 por ciento, cuando menos el 99 por ciento o más del nivel pulmonar del agente (por ejemplo, el nivel alcanzado en seguida de la administración (por ejemplo, el nivel pulmonar alcanzado una hora después de la administración local al pulmón)), durante un período de cuando menos aproximadamente 4 horas, de cuando menos aproximadamente 5 horas, de cuando menos aproximadamente 6 horas, de cuando menos aproximadamente 7 horas, de cuando menos aproximadamente 8 horas, de cuando menos aproximadamente 9 horas, de cuando menos aproximadamente 10 horas, de cuando menos aproximadamente 11 horas, o de cuando menos aproximadamente 12 horas. En algunas modalidades, la invención se refiere al uso de un agente (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlaza con un objetivo (por ejemplo, TNFR1) en el tejido pulmonar, como se describe en la presente, en la fabricación de una formulación de larga acción o de larga ventana terapéutica, para su administración local al tejido pulmonar (pulmón), en donde el período de larga acción o la larga ventana terapéutica en el pulmón se caracteriza por la presencia en el pulmón como un todo (lavado broncoalveolar y tejido pulmonar) de cuando menos aproximadamente el 40 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 35 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 30 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 25 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 20 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 15 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 10 por ciento, o de cuando menos aproximadamente el 5 por ciento de la cantidad total de agente que se administró, a las 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas,11 horas, ó 12 horas después de la administración. En algunas modalidades, la invención se refiere al uso de un agente (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlaza con un objetivo (por ejemplo, TNFR1) en el tejido pulmonar, como se describe en la presente, en la fabricación de una formulación de larga acción o de larga ventana terapéutica, para su administración local al tejido pulmonar (pulmón), en donde está presente un nivel pulmonar de cuando menos aproximadamente el 1 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 1.25 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 1.5 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 1.75 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 2 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 2.25 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 2.5 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 2.75 por ciento, o de cuando menos aproximadamente el 3 por ciento de la cantidad de agente en la formulación (por ejemplo, que se administra en una dosis de la formulación), en el tejido pulmonar, durante cuando menos 4 horas, cuando menos 5 horas, cuando menos 6 horas, cuando menos 7 horas, cuando menos 8 horas, cuando menos 9 horas, cuando menos 10 horas, cuando menos 11 horas, o cuando menos 12 horas (por ejemplo, después de que se administra la formulación). De una manera preferible, el agente para utilizarse en la invención no entra sustancialmente a la circulación sistémica (por ejemplo, cuando está en la formulación de larga acción o de larga ventana terapéutica). Como se describe en la presente, un agente no entra sustancialmente a la circulación cuando no más de aproximadamente el 2 por ciento, no más de aproximadamente el 1.75 por ciento, no más de aproximadamente el 1.5 por ciento, no más de aproximadamente el 1.25 por ciento, no más de aproximadamente el 1 por ciento, no más de aproximadamente el 0.75 por ciento, no más de aproximadamente el 0.5 por ciento, o no más de aproximadamente el 0.25 por ciento de la cantidad total de agente administrado (por ejemplo, en una dosis de la formulación), o sustancialmente nada de agente, está presente en el suero 5 horas después de que se administre el agente (por ejemplo, en una dosis de la formulación). En algunas circunstancias, un agente administrado como se describe en la presente, puede entrar a la circulación sistémica, pero no se acumula hasta un nivel significativo, debido a que, por ejemplo, el agente se elimina rápidamente de la circulación sistémica. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona el uso de un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, para el tejido pulmonar, en donde no se acumula un nivel significativo del agente en la circulación sistémica. El nivel de un agente en la circulación sistémica no es significativo cuando no más de aproximadamente el 2 por ciento, no más de aproximadamente el 1.75 por ciento, no más de aproximadamente el 1.5 por ciento, no más de aproximadamente el 1.25 por ciento, no más de aproximadamente 1 por ciento, no más de aproximadamente 0.75 por ciento, no más de aproximadamente el 0.5 por ciento, o no más de aproximadamente el 0.25 por ciento de la cantidad total de agente administrado (por ejemplo, en una dosis de la formulación), o sustancialmente nada de agente, está presente en el suero 5 horas después de que se administre el agente (por ejemplo, en una dosis de la formulación). La invención también se refiere al uso de un agente (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlaza con un objetivo (por ejemplo, TNFR1) en el tejido pulmonar, como se describe en la presente, en la fabricación de un medicamento para la administración local al tejido pulmonar, de una cantidad efectiva de dosis baja del agente. Como se describe en la presente, una cantidad efectiva de dosis baja es en general aproximadamente el 80 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, aproximadamente el 70 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, aproximadamente el 60 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, aproximadamente el 50 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, aproximadamente el 40 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, aproximadamente el 30 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, aproximadamente el 20 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, aproximadamente el 10 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva, o aproximadamente el 5 por ciento o menos de la dosis sistémica efectiva. En algunas modalidades, la invención es un método para producir una formulación de larga acción o de larga ventana terapéutica para su administración local al tejido pulmonar, que comprende un agente (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, o un método para producir un medicamento para la administración local al tejido pulmonar, de una cantidad efectiva de dosis baja del agente (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb) que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar. Los métodos comprenden: (1) seleccionar un agente que se enlace con un objetivo en el tejido pulmonar, y que tenga una vida media en suero in vivo corta (por ejemplo, de menos de aproximadamente 12 horas), y (2) utilizar el agente seleccionado para la fabricación de una formulación de larga acción o de larga ventana terapéutica para su administración local al tejido pulmonar, o para la fabricación de un medicamento para la administración local al tejido pulmonar, de una cantidad efectiva de dosis baja del agente. La invención también se refiere al uso de un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb), como se describe en la presente, para utilizarse en la fabricación de una formulación de larga acción o de larga ventana terapéutica para su administración local al tejido pulmonar (pulmón), como se describe en la presente, o en la fabricación de un medicamento para la administración local al tejido pulmonar, de una cantidad efectiva de dosis baja del agente, como se describe en la presente, en donde la formulación o el medicamento es para administrar no más agente que aproximadamente 10 miligramos/kilogramo/día. Por ejemplo, la formulación o el medicamento puede ser para administrar de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo/día a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo/día, por ejemplo aproximadamente 1 miligramo/kilogramo/día, aproximadamente 2 miligramos/kilogramo/-día, aproximadamente 3 miligramos/kilogramo/día, aproximadamente 4 miligramos/kilogramo/día, aproximadamente 5 miligramos/-kilogramo/día, aproximadamente 6 miligramos/kilogramo/día, aproximadamente 7 miligramos/kilogramo/día, aproximadamente 8 miligramos/kilogramo/día, aproximadamente 9 miligramos/kilogramo/-día, o aproximadamente 10 miligramos/kilogramo/día. En algunas modalidades, la formulación o el medicamento es para su administración local al tejido pulmonar (pulmón) de un ser humano, y la formulación o el medicamento para administrar no más de aproximadamente 10 miligramos/día. Por ejemplo, la formulación o el medicamento puede ser para administrar el agente en una dosis de aproximadamente 1 miligramo/día a aproximadamente 10 miligramos/día (por ejemplo, 10 miligramos/día, 9 miligramos/día, 8 miligramos/día, 7 miligramos/día, 6 miligramos/día, 5 miligramos/día, 4 miligramos/día, 3 miligramos/día, 2 miligramos/día, ó 1 miligramo/día). De conformidad con lo anterior, la formulación o el medicamento puede ser para administrar el agente en una dosis de aproximadamente 1 microgramo/kilogramo/día a aproximadamente 200 microgramos/kilogramo/día (por ejemplo, aproximadamente 10 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 20 microgramos/-kilogramo/día, aproximadamente 30 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 40 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 50 microgramo/kilogramo/día, aproximadamente 60 microgramos/-kilogramo/día, aproximadamente 70 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 80 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 90 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 100 microgramos/-kilogramo/día, aproximadamente 110 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 120 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 130 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 140 microgramos/-kilogramo/día, aproximadamente 150 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 160 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 170 microgramos/kilogramo/día, aproximadamente 180 microgramos/-kilogramo/día, o aproximadamente 190 microgramos/kilogramo/día). En las modalidades particulares, se administran de aproximadamente 5 microgramos/kilogramo/día a aproximadamente 3 miligramos/-kilogramo/día, o de preferencia, de aproximadamente 50 microgramos/kilogramo/día a aproximadamente 500 microgramos/ kilogramo/día. Las formulaciones y medicamentos producidos utilizando un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, como se describen en la presente, se pueden administrar locaimente al tejido pulmonar (por ejemplo, al pulmón) de un sujeto, empleando cualquier método adecuado. Por ejemplo, un agente se puede administrar locaimente al tejido pulmonar mediante inhalación o administración intranasal. Para la inhalación o la administración intranasal, el agente (antagonista de TNFR1, ligando, monómero dAb) se puede administrar utilizando un nebulizador, inhalador, atomizador, aerosolizador, administrador de niebla fina, inhalador de polvo seco, inhalador de dosis medida, rociador de dosis medida, nebulizador de dosis medida, atomizador de dosis medida, u otro dispositivo de suministro adecuado. Si se desea, por ejemplo para propósitos de diagnóstico (por ejemplo, formación de imágenes), el agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar (por ejemplo, fragmento de anticuerpo, antagonista, ligando, monómero dAb), puede comprender una marca detectable. Las marcas detectables adecuadas y los métodos para el marcado de un agente, son bien conocidos en este campo. Las marcas detectables adecuadas incluyen, por ejemplo, un radioisótopo (por ejemplo, como Indio- 111, Tectecio-99m, o Yodo-131), marcas emisoras de positrones (por ejemplo, Flúor-19), iones paramagnéticos (por ejemplo, Gadlinio (III), Manganeso (II)), una marca de epítopo (tag), una marca de afinidad (por ejemplo, biotina, avidina), una matea centrífuga, una enzima, un grupo fluorescente, o un grupo quimiluminescente. Cuando no se emplean marcas, la formación del complejo se puede determinar mediante resonancia de plasmón superficial u otros métodos adecuados. Antagonistas de TNFR1 para el Tratamiento, la Supresión, o la Prevención de Inflamación Pulmonar y Enfermedades Respiratorias. En un segundo aspecto, la invención se refiere a métodos para el tratamiento, la supresión, o la prevención de inflamación pulmonar y/o de una enfermedad respiratoria, los cuales comprenden administrar a un sujeto (por ejemplo, un mamífero, un ser humano) que lo necesite, una cantidad efectiva de un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando, un monómero dAb). La invención también se refiere al uso de un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando, un monómero dAb), para la fabricación de un medicamento para el tratamiento, la supresión, o la prevención de inflamación pulmonar y/o enfermedad respiratoria, y a una composición farmacéutica para el tratamiento, la supresión, o la prevención de inflamación pulmonar y/o enfermedad respiratoria, la cual comprende un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando, un monómero dAb) como un ingrediente activo. Los antagonistas de TNFR1 adecuados para utilizarse en la invención se describen con detalle en la presente, e incluyen moléculas pequeñas, nuevas entidades químicas, ligandos, monómeros dAb, y similares. La invención proporciona composiciones que comprenden un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando, ligando específico doble, ligando multi-específ ico, monómero dAb), y un vehículo, diluyente, excipiente farmacéuticamente aceptable, y métodos terapéuticos y de diagnóstico que emplean los ligandos o las composiciones de la invención. Los antagonistas y ligandos (por ejemplo, ligandos específicos-dobles, ligandos multi-específicos, monómeros dAb) de acuerdo con el método de la presente invención, se pueden emplear en aplicaciones terapéuticas y profilácticas in vivo, en aplicaciones de diagnóstico in vivo, y similares. Los usos terapéuticos y profilácticos de los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, ligandos multi-específicos, ligandos específicos-dobles, monómeros dAb) comprenden administrar una cantidad efectiva de los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, ligandos multi-específicos, ligandos específicos-dobles, monómeros dAb) a un mamífero o sujeto receptor, tal como un ser humano.
Por ejemplo, los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, ligandos multi-específicos, ligandos específicos-dobles, monómeros dAb) típicamente encontrarán uso en la prevención, la supresión, o el tratamiento de inflamación pulmonar y/o enfermedades respiratorias, tales como una condición en donde la inflamación pulmonar sea un síntoma o parte de la patología, enfermedades respiratorias agudas, enfermedades respiratorias crónicas, enfermedades respiratorias inflamatorias agudas, y enfermedades respiratorias inflamatorias crónicas. Por ejemplo, los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, ligandos multi-específicos, ligandos específicos-dobles, monómeros dAb) se pueden administrar para tratar, suprimir, o prevenir inflamación pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (por ejemplo, bronquitis crónica, bronquitis obstructiva crónica, enfisema), asma (por ejemplo, asma resistente a esferoides), neumonía (por ejemplo, neumonía bacteriana, tal como Staphylococcal pneumonía), neumonitis por hipersensibilidad, infiltración pulmonar con eosinofilia, enfermedad pulmonar ambiental, neumonía, bronquiectasis, fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar primaria, tromboembolia pulmonar, trastornos de la pleura, trastornos del mediastino, trastornos del diafragma, hipoventilación, hiperventilación, apnea del sueño, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, mesotelioma, sarcoma, rechazo de injerto, enfermedad del injerto contra el huésped, cáncer pulmonar, rinitis alérgica, alergia, asbestosis, aspergiloma, aspergilosis, bronquiectasis, bronquitis crónica, enfisema, neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad neumocócica invasiva (IPD), influenza, micobacteria no tuberculosa, efusión pleural, neumoconiosis, neumocitosis, neumonía, actinomicosis pulmonar, proteinosis alveolar pulmonar, ántrax pulmonar, edema pulmonar, émbolo pulmonar, inflamación pulmonar, histiocitosis pulmonar X (granuloma eosinof ílico) , hipertensión pulmonar, nocardiosis pulmonar, tuberculosis pulmonar, enfermedad veno-oclusiva pulmonar, enfermedad pulmonar reumatoide, sarcoidosis, granulomatosis de Wegener, y carcinoma pulmonar no microcelular. En la presente solicitud, el término "prevención" involucra la administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad. "Supresión" se refiere a la administración de la composición después de un evento inductivo, pero antes de la aparición clínica de la enfermedad. "Tratamiento" involucra la administración de la composición protectora después de que llegan a manifestarse los síntomas de la enfermedad. De una manera conveniente, se pueden utilizar ligandos específicos-dobles o multi-específicos para dirigirse a las citoquinas y a otras moléculas que cooperen sinérgicamente en situaciones terapéuticas en el cuerpo de un organismo. Por consiguiente, la invención proporciona un método para sinergizar la actividad de dos o más dominios de enlace (por ejemplo, dAbs), en donde un dominio se enlaza con TNFR1 u otro objetivo en el tejido pulmonar, y el otro dominio se enlaza con una citoquina u otras moléculas, el cual comprende administrar un ligando específico-doble o multi-específico capaz de enlazarse con estas dos o más moléculas (por ejemplo, TNFR1 y una citoquina). Por ejemplo, este aspecto de la invención se refiere a combinaciones de los dominios VH y los dominios VL, los dominios VH solamente, y los dominios VL solamente. El sinergismo, en un contexto terapéutico, se puede lograr en un número de maneras. Por ejemplo, las combinaciones objetivo pueden ser terapéuticamente activas solamente si ambos objetivos son dirigidos por el ligando, mientras que la dirección hacia un objetivo solo no es terapéuticamente efectiva. En otra modalidad, un objetivo solo puede proporcionar algún efecto terapéutico mínimo o bajo, pero junto con un segundo objetivo, la combinación proporciona un incremento sinérgico en el efecto terapéutico. Los sistemas modelo animales que se pueden utilizar para rastrear la efectividad de los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, anticuerpos o proteínas de enlace de los mismos, monómero dAb) en la prevención, la supresión, o el tratamiento de enfermedades respiratorias, están disponibles. Por ejemplo, los modelos animales adecuados de enfermedad respiratoria incluyen los modelos de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (véase Groneberg, D. A. y colaboradores, Respiratory Research 5:18 (2004)), y los modelos de asma (véase Coffman y colaboradores, J. Exp. Med. 201 (12):1875-1879 (2001)). De preferencia, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando o monómero dAb) es eficaz en un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica inducida por el humo del tabaco en el ratón (por ejemplo, el modelo sub-crónico dado a conocer en la presente), o un modelo de asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica de primate adecuado. De una manera más preferible, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando o monómero dAb) es eficaz en un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica inducida por el humo del tabaco en el ratón (por ejemplo, el modelo sub-crónico dado a conocer en la presente) (véase también Wright y Churg, Chest, 122:301-306 (2002)). Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede reducir, demorar, o prevenir el establecimiento de los síntomas de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en el modelo, comparándose con un control adecuado. La técnica anterior no sugiere la utilización de antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos o monómeros dAb), en estos modelos, o que sean eficaces. En términos generales, los presentes antagonistas (por ejemplo, ligandos) se utilizarán en una forma purificada, junto con los vehículos farmacológicamente apropiados. Típicamente, estos vehículos incluyen soluciones, emulsiones, o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, incluyendo cualquiera de las mismas suero y/o medios regulados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, y Ringer lactada. Los adyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si se necesitan para mantener un complejo de polipéptido en suspensión, se pueden seleccionar a partir de espesantes, tales como carboxi-metil-celulosa, polivinil-pirrolidona, gelatina, y alginatos. Los vehículos intravenosos incluyen rellenadores de fluidos y nutrientes y rellenadores de electrolitos, tales como aquéllos basados en dextrosa de Ringer. También puede haber conservadores y otros aditivos presentes, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Edición). Se puede utilizar una variedad de formulaciones adecuadas, incluyendo formulaciones de liberación prolongada. Los antagonistas (por ejemplo, ligandos) de la presente invención se pueden utilizar como composiciones administradas por separado, o en conjunto con otros agentes. Éstos pueden incluir diferentes fármacos, tales como inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, inhibidores de fosfodiesterasa 4), broncodilatadores (por ejemplo, agonistas de -beta2, anticolinérgicos, teofilina), agonistas-beta de acción corta (por ejemplo, albuterol, salbutamol, bambuterol, fenoterol, isoeterina, isoproterenol, levalbuterol, metaproterenol, pirbuterol, terbutalina, y tornlato), agonistas-beta de acción larga (por ejemplo, formoterol y salmeterol), anticolinérgicos de acción corta (por ejemplo, bromuro de ipratropio y bromuro de oxitropio), anticolinérgicos de acción larga (por ejemplo, tiotropio), teofilina (por ejemplo, formulación de acción corta, formulación de acción larga), esteroides inhalados (por ejemplo, beclometasona, budesonida, flunisolida, propionato de fluticasona, y triamsinolona), esteroides orales (por ejemplo, metil-prednisolona, prednisolona, prednisolón, y prednisona), agonistas-beta de acción corta con anticolinérgicos combinados (por ejemplo, albuterol/salbutamol/ipratropio, y fenoterol/ipratropio), agonistas-beta de acción larga con esteroides inhalados combinados (por ejemplo, salmeterol/fluticasona, y formoterol/budesonida), y agentes mucolíticos (por ejemplo, erdosteína, acetil-cisteína, bromhecsina, carbocisteína, guiafenesina, y glicerol yodado), ciclosporina, antibióticos, antivirales, metotrexato, adriamicina, cisplatino, e inmunotoxinas. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de diferentes agentes citotóxicos u otros agentes, en conjunto con los antagonistas (por ejemplo, ligandos) de la presente invención, o inclusive combinaciones de ligandos de acuerdo con la presente invención que tengan diferentes especificidades, tales como ligandos seleccionados utilizando diferentes antígenos o epítopos objetivo, ya sea que se agrupen o no antes de su administración. Los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, monómeros dAb) se pueden administrar y/o formular junto con uno o más agentes terapéuticos o activos adicionales. Cuando se administra un antagonista de TNFFU (por ejemplo, ligando, monómero dAb) con un agente terapéutico adicional, el antagonista de TNFR1 se puede administrar antes, simultáneamente con, o subsiguientemente a, la administración del agente adicional. En términos generales, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando, monómero dAb) y el agente adicional se administran de una manera que proporcione un traslape del efecto terapéutico.
Las composiciones que contienen los presentes antagonistas (por ejemplo, ligandos), o un cóctel de los mismos, se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para llevar a cabo cuando menos una inhibición parcial, supresión, modulación, aniquilación, o algún otro parámetro mensurable, de una población de células seleccionadas, se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". Por ejemplo, para el tratamiento de inflamación pulmonar y/o de una enfermedad respiratoria, una cantidad inhibidora de esputo, una cantidad inhibidora de inflamación de biopsia bronquial, una cantidad inhibidora de disnea, un volumen expiratorio forzado en un segundo (FEV (1)) en cantidad creciente, una mejora en el estado de salud en cantidad creciente, como sea cuantificado en un cuestionario adecuado, tal como el St. George's Respiratory Questionnaire (Cuestionario Respiratorio de San George) (por ejemplo, una mejora del puntaje de 4 puntos). Las cantidades necesarias para lograr estos efectos dependerán de la severidad de la enfermedad y del estado general del propio sistema inmune del paciente, pero en generar estarán en el intervalo de 0.005 a 10.0 miligramos del agente, antagonista (por ejemplo, ligando, monómero dAb), o proteína de enlace de los mismos, por kilogramo de peso corporal, utilizándose más comúnmente las dosis de 0.05 a 2.0 miligramos/kilogramo/dosis. En las modalidades particulares, la cantidad administrada será de aproximadamente 5 microgramos/kilogramo/dosis a aproximadamente 3 miligramos/kilogramo/dosis, o de preferencia de aproximadamente 50 microgramos/kilogramo/dosis a aproximadamente 500 microg ramos/kilogramo/dosis. Para las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contengan los presentes ligandos o cócteles de los mismos también se pueden administrar en dosificaciones similares o ligeramente más bajas, para prevenir, inhibir, o demorar el establecimiento de la enfermedad (por ejemplo, para sostener la remisión o la pasividad, o para prevenir la fase aguda. El clínico experto podrá determinar el intervalo de dosificación apropiado para tratar, suprimir, o prevenir la enfermedad. Cuando se administra un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando) para tratar, suprimir, o prevenir inflamación pulmonar o una enfermedad respiratoria, se puede administrar hasta cuatro veces al día, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, o una vez cada dos meses, en una dosis, por ejemplo, de aproximadamente 10 microgramos/kilogramo a aproximadamente 80 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 100 microgramos/kilogramo a aproximadamente 80 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 80 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 70 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 60 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 50 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 40 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 30 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 20 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 10 microgramos/kilogramo a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 10 microgramos/ kilogramo a aproximadamente 5 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 10 microgramos/kilogramo a aproximadamente 2.5 miligramos/kilogramo, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo, aproximadamente 2 miligramos/kilogramo, aproximadamente 3 miligramos/kilogramo, aproximadamente 4 miligramos/kilogramo, aproximadamente 5 miligramos/kilogramo, aproximadamente 6 miligramos/kilogramo, aproximadamente 7 miligramos/kilogramo, aproximadamente 8 miligramos/kilogramo, aproximadamente 9 miligramos/kilogramo, o aproximadamente 10 miligramos/kilogramo. En las modalidades particulares, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando) se administra para tratar, suprimir, o prevenir la inflamación pulmonar o una enfermedad respiratoria cada día, cada 2 días, una vez por semana, una vez cada dos semanas, o una vez al mes, en una dosis de aproximadamente 10 microgramos/kilogramo a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo (por ejemplo, aproximadamente 10 microgramos/kilogramo, aproximadamente 100 microgramos/kilogramo, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo, aproximadamente 2 miligramos/kilogramo, aproximadamente 3 miligramos/kilogramo, aproximadamente 4 miligramos/kilogramo, aproximadamente 5 miligramos/kilogramo, aproximadamente 6 miligramos/kilogramo, aproximadamente 7 miligramos/kilogramo, aproximadamente 8 miligramos/kilogramo, aproximadamente 9 miligramos/kilogramo, o aproximadamente 10 miligramos/kilogramo). En las modalidades particulares, se administran de aproximadamente 5 microgramos/kilogramo a aproximadamente 3 miligramos/-kilogramo, o de preferencia, de aproximadamente 50 microgramos/-kilogramo a aproximadamente 500 microgramos/kilogramo. El antagonista de TNFR1 (por ejemplo, el ligando) también se puede administrar para tratar, suprimir, o prevenir la inflamación pulmonar o una enfermedad respiratoria, en una dosis diaria o en una dosis unitaria de aproximadamente 10 miligramos, de aproximadamente 9 miligramos, de aproximadamente 8 miligramos, de aproximadamente 7 miligramos, de aproximadamente 6 miligramos, de aproximadamente 5 miligramos, de aproximadamente 4 miligramos, de aproximadamente 3 miligramos, de aproximadamente 2 miligramos, o de aproximadamente 1 miligramo.
El tratamiento o la terapia llevada a cabo utilizando las composiciones descritas en la presente, se considera "efectiva" si se reducen uno o más síntomas (por ejemplo, por cuando menos el 10 por ciento, o cuando menos un punto en una escala de evaluación clínica), en relación con esos síntomas presentes antes del tratamiento, o en relación con esos síntomas en un individuo (modelo humano o animal) no tratado con esta composición, u otro control adecuado. Los síntomas variarán dependiendo de la enfermedad o trastorno dirigido, pero pueden ser medidos por un clínico o técnico ordinariamente capacitado. Estos síntomas se pueden medir, por ejemplo, monitoreando uno o más indicadores físicos de la enfermedad o del trastorno (por ejemplo, infiltrado celular en el tejido pulmonar, producción de esputo, infiltrado celular en el esputo, disnea, tolerancia al ejercicio, espirometría (por ejemplo, capacidad vital forzada (FVC), volumen de expiración forzada en un segundo (FEV (1), FEV (1)/FVC)), índice o severidad de exacerbación de la enfermedad, o mediante una escala de evaluación clínica aceptada, por ejemplo, el St. George's Respiratory Questionnaire (Cuestionario Respiratorio de San George). Las escalas de evaluación clínica adecuadas incluyen, por ejemplo, la severidad de obstrucción al flujo de aire de acuerdo con FEV (1) (Clinical Guideline 12, Chronic Obstructive Pulmonary Disease, Management of Chronic Obstructive Pulmonary Disease in Adults in Primary and Secondary Care, National Institute for Clinical Excellence, Londres (2004)), Peak Expiratory Flow (PEF) (British Guideline on the Management of Asthma, British Thoracic Society, Scottish Intercollegiate Guidelines Network, Edición Revisada (2004)), etapa de enfermedad pulmonar obstructiva crónica de acuerdo con la norma de la American Thoracic Society (Sociedad Torácica Americana) (ATS) (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152.S77-S120 (1995)), clase de deterioro de asma de acuerdo con la norma de ATS (Am. Rev. Respir. Dis., 147:1056-1061 (1993)), u otra escala de evaluación clínica aceptada conocida en el campo. Una reducción sostenida (por ejemplo, un día o más, de preferencia más tiempo) en los síntomas de la enfermedad o del trastorno por cuando menos el 10 por ciento, o por uno o más puntos en una escala clínica dada, indica un tratamiento "efectivo". De una manera similar, la profilaxis realizada utilizando la composición como se describe en la presente, es "efectiva" si se demora, se reduce, o se elimina el establecimiento o la severidad de uno o más síntomas, en relación con estos síntomas en un individuo similar (modelo humano o animal) no tratado con la composición. Una composición que contenga un antagonista (por ejemplo, ligando) de acuerdo con la presente invención, se puede utilizar en establecimiento profilácticos y terapéuticos para ayudar en la alteración, inactivación, aniquilación, o remoción de una población celular objetivo seleccionada en un mamífero. Por ejemplo, estas composiciones se pueden utilizar para reducir los niveles de células inflamatorias en el pulmón, y/o para inhibir la infiltración celular del pulmón. La composición que contenga un antagonista (por ejemplo, ligando) de acuerdo con la presente invención, también se puede utilizar para reducir los niveles de mediadores inflamatorios, tales como citoquinas, quimiocinas, moléculas de adhesión celular, que sean inducidos por los estímulos inflamatorios en el pulmón. Por ejemplo, los antagonistas de monómero dAb de TNFR1 pueden inhibir: (i) los incrementos inducidos por el estímulo inflamatorio (por ejemplo, inducidos por TNF-alfa) en los niveles de los mediadores de acción temprana, tales como los quimioatrayentes de neutrófilos KC y MIP-1, y/o (ii) los incrementos inducidos por el estímulo inflamatorio (por ejemplo, inducidos por TNF-alfa) en los niveles de mediadores de acción tardía, tales como quimiocina MCP-1, y molécula de adhesión de E-selectina. Se pueden afectar otros mediadores, tales como LTB4, GRO-a, IP-10, GM-CSF, especies de oxígeno reactivo (ROS), NO, y similares. Los ligandos de esta invención se pueden liofilizar para su almacenamiento, y se pueden reconstituir en un vehículo adecuado antes de usarse. Se ha demostrado que esta técnica es efectiva con las inmunoglobulinas convencionales, y se pueden emplear las técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en este campo. Será apreciado por los expertos en la materia, que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a diferentes grados de pérdida de actividad del anticuerpo (por ejemplo, con las inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a tener una mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG), y que se pueden tener que ajustar los niveles de uso hacia arriba para compensarse. Los ligandos de esta invención se pueden liofilizar para formar un polvo seco para inhalación, y se administran en esa forma. La vía de administración de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención puede ser cualquiera de aquéllas comúnmente conocidas por los expertos ordinarios en este campo. La administración puede ser por cualquier modo apropiado, incluyendo parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitoneal, transdérmicamente, por medio de la vía pulmonar, o mediante infusión directa con un catéter. La dosificación y la frecuencia de administración dependerán de la edad, del sexo, y de la condición del paciente, de la administración concurrente de otros fármacos, de las contraindicaciones y otros parámetros que deben ser tomados en cuenta por el clínico. La administración puede ser local (por ejemplo, suministro local al pulmón mediante administración pulmonar, por ejemplo, administración intranasal), o sistémica, como se indica. En las modalidades particulares, un antagonista de TNFR1 se administra por medio de suministro pulmonar, tal como mediante inhalación (por ejemplo, inhalación intrabronquial, intranasal u oral, gotas intranasales), o por medio de suministro sistémico (por ejemplo, parenteral, intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo). En las modalidades preferidas, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando, monómero dAb) se administra a un sujeto por medio de administración pulmonar, tal como inhalación o administración intranasal (por ejemplo, inhalación intrabronquial, intranasal u oral, gotas intranasales). Para la inhalación, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando, monómero dAb) se puede administrar con el uso de un nebulizador, inhalador, atomizador, aerosolizador, administración de niebla fina, inhalador de polvo seco, inhalador de dosis medida, rociador de dosis medida, nebulizador de dosis medida, atomizador de dosis medida, u otro dispositivo de suministro adecuado. La invención se refiere a un método para el tratamiento, la supresión, o la prevención de inflamación pulmonar o de una enfermedad respiratoria, el cual comprende administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad efectiva de un antagonista de TNFR1, en donde esta cantidad efectiva no exceda de aproximadamente 10 m miligramos/kilogramo/día, y en donde, de preferencia, se reduzca el nivel de células inflamatorias en el pulmón en relación con los niveles antes del tratamiento con una p<0.05, o se inhiba el reclutamiento de células inflamatorias hacia el pulmón en relación con los niveles antes del tratamiento con una p<0.05. El nivel de células inflamatorias en el pulmón o el reclutamiento de células inflamatorias hacia el pulmón se | puede reducir o inhibir en relación con los niveles antes del tratamiento, por cuando menos aproximadamente el 30 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 40 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 60 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 70 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, o por cuando menos aproximadamente el 95 por ciento. De una manera preferible, se lleva a cabo el análisis estadístico empleando los métodos descritos en los Ejemplos de la Presente. El nivel de células inflamatorias en el pulmón o de reclutamiento de células inflamatorias hacia el pulmón, se puede reducir o inhibir en relación con los niveles antes del tratamiento con una p<0.001 en algunas modalidades. Los niveles de células (por ejemplo, células inflamatorias) en el pulmón se pueden evaluar empleando cualquier método adecuado, tal como los conteos celulares totales o diferenciales (por ejemplo, conteo de células de macrófagos, conteo de células de neutrófilos, conteo de células de eosinófilos, conteo de células de linfocitos, conteo de células epiteliales) en el lavado broncoalveolar, en el esputo, o en la biopsia (por ejemplo, biopsia bronquial, biopsia pulmonar). La invención también se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad respiratoria, el cual comprende: (1) seleccionar un antagonista del Receptor de Factor de Necrosis Tumoral 1 (TNFR1) que tenga eficacia en un modelo animal adecuado de enfermedad respiratoria, cuando se administre en una cantidad que no exceda de aproximadamente 10 miligramos/kilogramo una vez al día, en donde la eficacia en este modelo animal exista cuando se inhiba la infiltración celular de los pulmones, evaluada por un conteo celular total en el lavado broncoalveolar, en relación con un control no tratado, con una p < 0.05; y (2) administrar (por ejemplo, localmente al tejido pulmonar) una cantidad efectiva de este antagonista de TNFR1 a un sujeto que lo necesite. En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente se emplean para el tratamiento, la supresión, o la prevención de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (por ejemplo, bronquitis crónica, bronquitis obstructiva crónica, enfisema), asma (por ejemplo, asma resistente a esteroides), neumonía (por ejemplo, neumonía bacteriana, tal como Staphylococcal pneumonía), o inflamación pulmonar. La invención también se refiere al uso de un antagonista de TNFR1, como se describe en la presente, para la fabricación de un medicamento o formulación para el tratamiento de inflamación pulmonar o de una enfermedad respiratoria descrita en la presente. El medicamento puede ser para administración sistémica y/o para administración local al tejido pulmonar. Antagonistas de TNFR1 TNFR1 es un receptor transmembrana que contiene una región extracelular que se enlaza con el ligando, y un dominio intracelular que carece de actividad de transducción de señal intrínseca, pero que puede asociarse con las moléculas de transducción de señales. El complejo de TNFR1 con el TNF enlazado contiene tres cadenas de TNFR1 y tres cadenas de TNF. (Banner y colaboradores, Cell, 75(3) 431-445 (1993)). El ligando de TNF está presente como un trímero, el cual se enlaza con tres cadenas de TNFR1. (Id). Las tres cadenas de TNFR se arraciman estrechamente juntas en el complejo de receptor-ligando, y este arracimado es un requisito previo para la transducción de señales mediada por TNFR1. De hecho, los agentes multi-valentes que se enlazan con TNFR1, tales como los anticuerpos anti-TNFR1, pueden inducir el arracimado de TNFR1 y la transducción de señales en ausencia de TNF, y se utilizan comúnmente como agonistas de TNFR1. (Véase, por ejemplo, Belka y colaboradores, EMBO, 74(6):1156-1165 (1995); Mandik-Nayak y colaboradores, J. Immunol, 767:1920-1928 (2001)). De conformidad con lo anterior, los agentes multi-valentes que se enlazan con TNFR1, en general no son antagonistas efectivos de TNFR1, inclusive cuando bloqueen el enlace de TNFa con TNFR1. La región extracelular de TNFR1 comprende un segmento amino-terminal de 13 aminoácidos (aminoácidos 1-13 de la SEQ ID NO:213 (humana); aminoácidos 1-13 de la SEQ ID NO:215 (de ratón)), el Dominio 1 (aminoácidos 14-53 de la SEQ ID NO:213 (humana); aminoácidos 14-53 de la SEQ ID NO:215 (de ratón)), el Dominio 2 (aminoácidos 54-97 de la SEQ ID NO:213 (humana); aminoácidos 54-97 de la SEQ ID NO:215 (de ratón)), el Dominio 3 (aminoácidos 98-338 de la SEQ ID NO:213 (humana); aminoácidos 98-138 de la SEQ ID NO:215 (de ratón)), y el Dominio 4 (aminoácidos 139-167 de la SEQ ID NO:213 (humana); aminoácidos 139-167 de la SEQ ID NO:215 (de ratón)), el cual es seguido por una región proximal de membrana (aminoácidos 168-182 de la SEQ ID NO:213 (humana); aminoácidos 168-183 de la SEQ ID NO:215 (de ratón)). (Véase Banner y colaboradores, Cell 73(3) 431-445 (1993) y Loetscher y colaboradores, Cell 61(2) 351-359 (1990)). Los Dominios 2 y 3 hacen contacto el ligando enlazado (TNF , TNFa). (Banner y colaboradores, Cell, 73(3) 431-445 (1993)). La región intracelular de TNFR1 también contiene una región referida como el dominio de ensamble de enlace de pre-ligando, o dominio PLAD (aminoácidos 1-53 de la SEQ ID NO:213 (humana); aminoácidos 1-53 de la SEQ ID NO:215 (de ratón)) (El Gobierno de los Estados Unidos de América, Publicación Internacional Número WO 01/58953; Deng y colaboradores, Nature Medicine, doi: 10.1038/nm 1304 (2005)). TNFR1 se protege de la superficie de las células in vivo a través de un proceso que incluye la proteólisis de TNFR1 en el Dominio 4 o en la región proximal de membrana (aminoácidos 168-182 de la SEQ ID NO:213; aminoácidos 168-183 de la SEQ ID NO:215), para producir una forma soluble de TNFR1. El TNFR1 soluble retiene la capacidad para enlazarse con TNFa, y de esta manera, funciona como un inhibidor endógeno de la actividad de TNFa. Los antagonistas de TNFR1 adecuados para utilizarse en la invención (por ejemplo, los ligandos descritos en la presente) que tienen una especificidad de enlace para el Receptor de Factor de Necrosis TumoraM (TNFR1; p55; CD120a). De preferencia, los antagonistas de TNFR1 no tienen especificidad de enlace para el Factor de Necrosis Tumoral 2 (TNFR2), o no antagonizan sustancialmente el TNFR2. Un antagonista de TNFR1 no antagoniza sustancialmente el TNFR2 cuando el antagonista (1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µ?, 10 µ?, ó 100 µ?) da como resultado una inhibición no mayor a aproximadamente el 5 por ciento de la actividad mediada por TNFR2 inducida por TNFa (100 picogramos/mililitro) en un ensayo celular convencional. Los antagonistas de TNFR1 que son adecuados para utilizarse en la invención, son productos terapéuticos efectivos (son eficaces, tienen eficacia terapéutica) para el tratamiento de una enfermedad respiratoria (por ejemplo, enfermedad respiratoria aguda, enfermedad respiratoria crónica, enfermedad respiratoria inflamatoria aguda, énfermedad respiratoria inflamatoria crónica). Por ejemplo, los antagonistas de TNFR1 que son adecuados para utilizarse en la invención, son eficaces en los modelos de enfermedades respiratorias, cuando se administra una cantidad efectiva. En términos generales, una cantidad efectiva es de aproximadamente 1 microgramo/kilogramo a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo, o de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo (aproximadamente 1 miligramo/kilogramo, aproximadamente 2 miligramos/kilogramo, aproximadamente 3 miligramos/kilogramo, aproximadamente 4 miligramos/kilogramo, aproximadamente 5 miligramos/kilogramo, aproximadamente 6 miligramos/kilogramo, aproximadamente 7 miligramos/kilogramo, aproximadamente 8 miligramos/kilogramo, aproximadamente 9 miligramos/kilogramo, o aproximadamente 10 miligramos/kilogramo). En la técnica se conocen varios modelos animales adecuados de enfermedades respiratorias, y son reconocidos por los expertos en la técnica como predictivos de la eficacia terapéutica en seres humanos. Por ejemplo, los modelos animales adecuados de enfermedades respiratorias incluyen los modelos de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (véase Groneberg, D. A. y colaboradores, Respiratory Research 5:18 (2004)), los modelos de asma (véase, Coffman R. L. y colaboradores, J. Exp. Meó. 201(12):1875-1879 (2001); Van Scott, M. R. y colaboradores, J. App. Physiol. 96:1433-1444 (2004)), y los modelos de fibrosis pulmonar (por ejemplo, Venkatesan, N. y colaboradores, Lung 287:1342-1347 (2004)). De una manera preferible, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, el ligando o el monómero dAb) es eficaz en un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica inducida por el humo del tabaco en el ratón (por ejemplo, el modelo sub-crónico dado a conocer en la presente), o en un modelo de asma o de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en primate adecuado (véase, por ejemplo, Coffman R. L. y colaboradores, J. Exp. Med. 201 ( 12): 1875-1879 (2001); Van Scott, M. R. y colaboradores, J. App. Physiol. 96:1433-1444 (2004)). De una manera más preferible, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, el ligando o el monómero dAb) es eficaz en un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica inducida por el humo del tabaco en el ratón (por ejemplo, el modelo sub-crónico dado a conocer en la presente) (véase también Wright y Churg, Chest, 122:301-306 (2002)). Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede reducir, demorar, o prevenir el establecimiento de los síntomas de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en el modelo, comparándose con un control adecuado. La técnica anterior no sugiere la utilización de antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos o monómeros dAb) en estos modelos, o que sean eficaces. Los antagonistas adecuados de TNFR1 puede ser monovalentes o multivalentes. En algunas modalidades, el antagonista es monovalente, y contiene un sitio de enlace que interactúa con TNFR1. Los antagonistas monovalentes se enlazan con un TNFR1, y no inducen reticulación o arracimado de TNFR1 sobre la superficie de las células, lo cual puede conducir a la activación del receptor y a la transducción de señales. En las modalidades particulares, el antagonista monovalente de TNFR1 compite con TAR2m-21-23 por el enlace con el TNFR1 de ratón, o compite con TAR2h-205 por el enlace con el TNFR1 humano. Los antagonistas multivalentes de TNFR1 pueden contener dos o más copias de un sitio de enlace particular para TNFR1, o pueden contener dos o más sitios de enlace diferentes que se enlacen con TNFR1. Por ejemplo, el antagonista de TNFR1 puede ser un dímero, trímero, o multímero, que comprenda dos o más copias de un dAb particular que se enlace con TNFR1, o dos o más dAbs diferentes que se enlacen con TNFR1. De una manera preferible, un antagonista multivalente de TNFR1 no agoniza sustancialmente el TNFR1 (actúa como un agonista de TNFR1) en un ensayo celular convencional (es decir, cuando está presente en una concentración de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µ?, 10 µ?, 100 µ?, 1,000 µ?. o 5,000 µ?, da como resultado no más de aproximadamente el 5 por ciento de la actividad mediada por TNFR1 inducida por TNFa (100 picogramos/mililitro) en el ensayo). Los antagonistas multivalentes adecuados de TNFR1 pueden contener dos o más sitios de enlace para un epítopo o dominio deseado de TNFR1. Por ejemplo, un antagonista multivalente de TNFR1 puede comprender dos o más sitios de enlace que se enlacen con el mismo epítopo de TNFR1, o dos o más sitios de enlace que se enlacen con diferentes epítopos o dominios de TNFR1. En un ejemplo, el antagonista multivalente de TNFR1 comprende un primer sitio de enlace que se enlaza con un primer epítopo de TNFR1, y un segundo sitio de enlace que se enlaza con un segundo epítopo diferente de TNFR1. De preferencia, estos antagonistas multivalentes no agonizan el TNFR1 cuando están presentes en una concentración de aproximadamente 1 nM, o de aproximadamente 10 nM, o de aproximadamente 100 nM, o de aproximadamente 1 µ?, o de aproximadamente 10 µ?, en un ensayo de citotoxicidad L929 estándar, o en un ensayo de HeLa IL-8 estándar, como se describe en la presente. Algunos antagonistas de TNFR1 adecuados para utilizarse en la invención se enlazan con TNFR1, e inhiben el enlace de TNFa con TNFR1. En las modalidades particulares, este antagonista de TNFR1 compite con TAR2h-10-27, TAR2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10, ó TAR2h-185-25 por el enlace con TNFR1. Algunos antagonistas de TNFR1 adecuados para utilizarse en la invención no inhiben el enlace de TNFa con el TNFR1, pero sí inhiben la transduccion de señales mediada a través de TNFR1. Por ejemplo, un antagonista de TNFR1 puede inhibir el arracimado de TNFR1 inducido por TNFa, el cual precede a la transducción de señales a través del TNFR1. Estos antagonistas proporcionan varias ventajas. Por ejemplo, en la presencia de este antagonista, TNFct puede enlazarse con el TNFR1 expresado sobre la superficie de las células, y se puede remover del medio ambiente celular, pero no se activará la transducción de señales mediada por TNFR1. Por consiguiente, se inhibirá la producción de TNFct adicional y de otros mediadores de inflamación inducida por la señal de TNFR1. De una manera similar, los antagonistas de TNFR1 que se enlazan con TNFR1 y que inhiben la transducción de señales mediada a través de TNFR1, pero que no inhiben el enlace de TNFa con TNFR1, no inhibirán el enlace de TNFa, ni la actividad inhibidora del TNFR1 soluble endógenamente producido. De conformidad con lo anterior, la administración de este antagonista a un mamífero que lo necesite, puede complementar las sendas reguladoras endógenas que inhiben la actividad de TNFa y la actividad de TNFR1 in vivo. En una modalidad particular, el antagonista de TNFR1 adecuado para utilizarse en la invención (por ejemplo, un monómero dAb o ligando) se enlaza con el TNFR1, e inhibe la transducción de señal mediada a través de TNFR1 después del enlace del TNFa. Este antagonista puede inhibir la transducción de señales a través de TNFR1, pero no inhibir el enlace de TNFa con TNFR1 y/o descomponer el TNFR1 para producir el TNFR1 soluble. De conformidad con lo anterior, la administración de este antagonista a un mamífero que lo necesite, puede complementar las sendas reguladoras endógenas que inhiben la actividad de TNFa y la actividad de TNFR1 in vivo.
Ciertos antagonistas de TNFR1 adecuados para utilizarse en la invención (por ejemplo, compuesto químico, nueva entidad química, monómero dAb, ligando) se enlazan con TNFR1, y compiten con TAR2m-21 -23 por el enlace con el TNFR1 de ratón, o compiten con TAR2h-205 por el enlace con el TNFR1 humano. Otros antagonistas de TNFR1 adecuados para utilizarse en la invención (por ejemplo, compuesto químico, nueva entidad química, monómero dAb, ligando) se enlazan con TNFR1, y compiten con TAR2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10, TAR2h-185-25, ó TAR2h-27-10 por el enlace con TNFR1 (por ejemplo, TNFR1 humano y/o de ratón). Algunos antagonistas (por ejemplo, ligandos, monómeros dAb) reaccionan cruzadamente y se enlazan con el TNFR1 humano y con el TNFR1 de otras especies, tales como un animal susceptible para utilizarse en la investigación médica. Por ejemplo, un monómero dAb que se enlace con el TNFR1 humano y el TNFR1 de ratón. Estos antagonistas (por ejemplo, ligandos, monómeros dAb) proporcionan la ventaja de permitir que se hagan estudios pre-clínicos y clínicos utilizando el mismo antagonista (por ejemplo, monómero dAb), y obvian la necesidad de conducir estudios pre-clínicos con un antagonista subrogado adecuado. Los ejemplos preferidos de los antagonistas que reaccionan cruzadamente se enlazan con el TNFR1 humano y con el TNFR1 de un roedor, tal como un ratón, rata, o cobayo, conejo, perro, oveja, cerdo, o un primate no humano, tal como, mono cinomolgo o macaco Rhesus.
En términos generales, un antagonista de reacción cruzada de la invención se enlaza con el TNFR1 humano y con el TNFR1 de otras especies con afinidades similares (Kd). De preferencia, los antagonistas de reacción cruzada, tales como un monómero dAb, se enlazan con el TNFR1 humano y con el TNFR1 de otras especies con afinidades que difieren por no más de aproximadamente un factor de 100, un factor de 10, o un factor de 5. Por ejemplo, un monómero dAb de reacción cruzada que se enlaza con el TNFR1 humano con una afinidad de 1 nM, y que también se enlaza con el TNFR1 de ratón, de mono cinomolgo, o de macaco Rhesus, con una afinidad de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 10 nM, o de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 5 nM. Los antagonistas de reacción cruzada, tales como un monómero dAb, pueden enlazarse con el TNFR1 humano y con el TNFR1 de otras especies (por ejemplo, una de las especies no humanas mencionadas en los dos párrafos anteriores) con índices de activación (Kactivad0) que difieren por no más de aproximadamente un factor de 100, un factor de 10, o un factor de 5, y/o con índices desactivados (Kdesact¡vado) que difieren por no más de aproximadamente un factor de 100, un factor de 10, o un factor de 5. Por ejemplo, los antagonistas pueden ser un monómero dAb que se enlace tanto con el TNFR1 humano como con el TNFR1 de otras especies con un Kactivad0 de aproximadamente 104 M/s a aproximadamente 105 M/s, y/o un Kdesactivad0 de aproximadamente 10" 3 s"1 a aproximadamente 10'5 s"1. Los antagonistas de TNFR1 adecuados para utilizarse en la invención también incluyen un anticuerpo que tiene especificidad de enlace por el TNFR1, o por un fragmento de enlace de antígeno del mismo, tal como un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, o un fragmento Fv (por ejemplo, scFv). En algunas modalidades, el antagonista es monovalente, tal como dAb, o un fragmento de enlace de antígeno monovalente de un anticuerpo, tal como un fragmento Fab, un fragmento Fab', o un fragmento Fv. De una manera preferible, el antagonista de TNFR1 es un ligando (por ejemplo, un monómero dAb), como se describe en la presente. COmo se describe en la presente, los antagonistas preferidos de TNFR1 adecuados para utilizarse en la invención comprenden un dAb que se enlaza con TNFR1, y que inhibe una función de TNFR1. Sin embargo, en lugar de comprender un "dAb", un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando) adecuado para utilizarse en la invención, puede comprender un dominio que comprenda las regiones determinantes de complementariedad de un dAb que se enlace con TNFR1 (por ejemplo, las regiones determinantes de complementariedad injertadas sobre un andamiaje o esqueleto de proteína adecuado, por ejemplo un aficuerpo, un andamiaje SpA, un dominio de receptor de LDL clase A, o un dominio de EGF), o un dominio de proteína que comprenda un sitio de enlace para TNFR1, por ejemplo en donde el dominio se seleccione a partir de un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de receptor de LDL clase A, un dominio de EGF, un avímero. La divulgación como un todo se debe interpretar de conformidad con lo mismo, para proporcionar la divulgación de antagonistas, ligandos, y métodos para utilizar estos dominios en lugar de un dAb. Los antagonistas de TNFR1, incluyendo los ligandos de acuerdo con cualquier aspecto de la presente invención, así como los monomeros dAb útiles en la construcción de estos ligandos, se enlazan de preferencia desde sus objetivos con un Kd de 300 nM a 5 pM (es decir, de 3 x 10'7 a 5x10"12M), de preferencia de 50 nM a 20 pM, o de 5 nM a 200 pM, o de 1 nM a 100 pM, de 1x10"7 M o menos, de 1x10"8 M o menos, de 1x10'9 M o menos, de 1x10"10 M o menos, de 1x10'11 M o menos; y/o una constante de índice de KdeSact¡vad0 de 5x10'1 s"1 a 1x10"7 s"\ de preferencia de 1x10"2 s"1 a 1x10"6 s'1, o de 5x10"3 s"1 a 1x10"5 s"1, o de 5x10"1 s"1 o menos, o de 1x10'2 s"1 o menos, o de 1x10"3 s"1 o menos, o de 1x10'4 s"1 o menos, o de 1x10"5 s'1 o menos, o de 1x10"6 s"1 o menos, como sea determinado mediante resonancia de plasmón superficial. La constante de índice de Kd se define como KdeSact¡vado/ act¡vado- Adicionalmente o de una manera alternativa, el ligando (por ejemplo, monómero dAb) se enlaza con TNFR1 con una Kactivado moderado o rápido, y un Kdesaciivado lento. De una manera preferible, un Kact¡vado de aproximadamente 104 M/s a aproximadamente 105 M/s, y/o un Kdesactivado de aproximadamente 10"3 s"1 a aproximadamente 10"5 s"1. Ligandos y Monomeros dAb que se Enlazan con TNFR1. Los antagonistas preferidos de TNFR1 que son adecuados para utilizarse en la invención son los ligandos o monómeros dAb que sean eficaces en los modelos de enfermedades respiratorias, cuando se administre una cantidad efectiva. En términos generales, una cantidad efectiva es de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo (por ejemplo, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo, aproximadamente 2 miligramos/kilogramo, aproximadamente 3 miligramos/kilogramo, aproximadamente 4 miligramos/kilogramo, aproximadamente 5 miligramos/kilogramo, aproximadamente 6 miligramos/kilogramo, aproximadamente 7 miligramos/kilogramo, aproximadamente 8 miligramos/kilogramo, aproximadamente 9 miligramos/kilogramo, o aproximadamente 10 miligramos/kilogramo). En las modalidades particulares, se administran de aproximadamente 5 microgramos/kilogramo a aproximadamente 3 miligramos/kilogramo, o de preferencia de aproximadamente 50 microgramos/kilogramo a aproximadamente 500 microgramos/kilogramo. En la técnica se conocen varios modelos animales adecuados de enfermedades respiratorias, y son reconocidos por los expertos en la materia como predictivos de la eficacia terapéutica en seres humanos. Por ejemplo, los modelos animales adecuados de enfermedades respiratorias incluyen los modelos de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (véase Groneberg, D. A. y colaboradores, Respiratory Research 5:18 (2004)), y los modelos de asma (véase, Coffman y colaboradores, J. Exp. Med. 201 (12):1875-1879 (2001)). De preferencia, el ligando o el monómero dAb es eficaz en el modelo sub-crónico de enfermedad pulmonar obstructiva crónica inducida por el humo del tabaco en el ratón, descrito en la presente. (Véase también Wright y Churg, Chest, 122:301-306 (2002)). Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede reducir, demorar, o prevenir el establecimiento de los síntomas de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica en el modelo, comparándose con un control adecuado. La técnica anterior no sugiere la utilización de antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos o monómeros dAb) en estos modelos, ni que sean eficaces. En términos generales, los ligandos adecuados (por ejemplo, monómeros dAb) comprenden un monómero dAb anti-TNFR1 (por ejemplo, ligando específico doble que comprende este dAb) que se enlaza con TNFR1 con una Kd de 300 nM a 5 pM (es decir, de 3x10"7 a 5x10"12 M), de preferencia de 50 nM a 20 pM, más preferiblemente de 5 nM a 200 pM, y de una manera muy preferible de 1 nM a 100 pM, por ejemplo de 1x10"7 o menos, de preferencia de 1x10'8 M o menos, más preferiblemente de 1x10"9 o menos, convenientemente de 1x10"10 M o menos, y de una manera muy preferible de 1x10'11 M o menos; y/o una constante de índice de Kdesact¡vad0 de 5x10"1 s"1 a 1x10"7 s"\ de preferencia de 1x10"2 s"1 a 1x10'6 s"1, más preferiblemente de 5x10'3 s"1 a 1x10"5 s"1, por ejemplo de 5x10'1 s"1 o menos, de preferencia de 1x10"2 s'1 o menos, convenientemente de 1x10"3 s"1 o menos, más preferiblemente de 1x10" s' o menos, todavía más preferiblemente de 1x10'5 s'1 o menos, y de una manera muy preferible de 1x10"6 s"1 o menos, como sea determinado mediante resonancia de plasmón superficial. (La Kd = Kdesactivado/Kact¡vado ). Ciertos ligandos o monómeros dAb adecuados para utilizarse en la invención, se enlazan específicamente con el TNFR1 humano, con una Kd de 50 nM a 20 pM, y una constante de índice de KdeSactivado de 5x10"1 s"1 a 1x10"7 s"\ como es determinado mediante resonancia de plasmón superficial. Algunos ligandos o monómeros dAb inhiben el enlace de TNFa con el TNFR1. Por ejemplo, algunos ligandos o monómeros dAb inhiben el enlace del TNFa con el TNFR1 con una concentración inhibidora 50 (IC50) de 500 nM a 50 pM, de preferencia de 100 nM a 50pM, más preferiblemente de 10 nM a 100 pM, convenientemente de 1 nM a 100 pM; por ejemplo de 50 nM o menos, de preferencia de 5 nM o menos, más preferiblemente de 500 pM o menos, convenientemente de 200 pM o menos, y de una manera muy preferible de 100 pM o menos. De preferencia, el TNFR1 es el TNFR1 humano. Otros ligandos y monómeros dAb no inhiben el enlace de TNFa con el TNFR1, pero son antagonistas, debido a que inhiben la transducción de señales mediada a través del TNFR1. Por ejemplo, un ligando o monómero dAb puede inhibir el arracimado inducido por TNFa del TNFR1, que precede a la transducción de señales a través del TNFR1. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un ligando o monómero dAb puede enlazarse con el TNFR1 e inhibir la señalización mediada por TNFR1, pero no inhibe sustancialmente el enlace de TNFa con el TNFR1. En algunas modalidades, el ligando o monómero dAb inhibe la reticulación o arracimado del TNFR1 inducida por el TNFa sobre la superficie de una célula. Estos ligandos o dAbs (por ejemplo, TAR2m-21-23 descrito en la presente), son convenientes debido a que pueden antagonizar el TNFR1 de superficie celular, pero no reducen sustancialmente la actividad inhibidora del TNFR1 soluble endógeno. Por ejemplo, el ligando o dAb puede enlazarse con el TNFR1, pero inhibe el enlace del TNFa con el TNFR1 en un ensayo de enlace del receptor por no más de aproximadamente el 10 por ciento, no más de aproximadamente el 5 por ciento, no más de aproximadamente el 4 por ciento, no más de aproximadamente el 3 por ciento, no más de aproximadamente el 2 por ciento, o no más de aproximadamente el 1 por ciento. También, en estas modalidades, el ligando o dAb inhibe la reticulación del TNFR1 inducida por TNFa y/o la señalización mediada por TNFR1 en un ensayo celular estándar, por cuando menos aproximadamente el 10 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 20 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 30 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 40 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 60 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 70 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, por cuando menos aproximadamente el 95 por ciento, o por cuando menos aproximadamente el 99 por ciento. Estos ligandos o monómeros dAb proporcionan varias ventajas, como se discute en la presente con respecto a los antagonistas que tienen estas propiedades. De conformidad con lo anterior, la administración de este ligando o monómero dAb a un mamífero que lo necesite, puede complementar las sendas reguladoras endógenas que inhiben la actividad de TNFa y la actividad de TNFR1 in vivo. El ligando puede ser monovalente (por ejemplo, un monómero dAb) o multivalente (por ejemplo, específico-doble, multi-específico), como se describe en la presente. En las modalidades particulares, el ligando es un monómero dAb que se enlaza con TNFR1. Los monómeros de anticuerpo de dominio que se enlazan con TNFR1 tienen una pequeña huella, en relación con otros formatos de enlace, tales como un anticuerpo monoclonal, por ejemplo. Por lo tanto, este monómero dAb puede bloquear selectivamente una función de TNFR1, pero no interferir con otras funciones del TNFR1. Por ejemplo, un monómero dAb que se enlace con TNFR1, puede antagonizar el TNFR1 (por ejemplo, inhibir la transducción de señales mediada por TNFR1), pero no inhibir el enlace de TNFa con el TNFR1, o descomponer el TNFR1. En más modalidades particulares, el ligando es un monómero dAb que se enlaza con el TNFR1, y que compite con TAR2m-21-23 por el enlace con el TNFR1 de ratón, o que compite con el TAR2h-205 por el enlace con el TNFR1 humano. En otras modalidades, el ligando es multivalente, y comprende dos o más monómeros dAb que se enlazan con el TNFR1. Los ligandos multivalentes pueden contener dos o más copias de un dAb particular que se enlace con el TNFR1, o pueden contener dos o más dAbs que se enlacen con el TNFR1. Por ejemplo, el ligando puede ser un dímero, trímero, o multímero que comprenda dos o más copias de un dAb particular que se enlacen con el TNFR1, o dos o más dAbs diferentes que se enlacen con TNFR1. En algunos ejemplos, el ligando es un homo-dímero o un homo-trímero que comprende dos o tres copias de un dAb particular que se enlaza con el TNFR1, respectivamente. De una manera preferible, un ligando multivalente no agoniza sustancialmente el TNFR1 (actúa como un agonista del TNFR1) en un ensayo celular convencional (es decir, cuando está presente en una concentración de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µ?, 10 µ?, 100 µ?, 1,000 µ?, ó 5,000 µ?, da como resultado no más de aproximadamente el 5 por ciento de la actividad mediada por el TNFR1 inducida por el TNFa (100 picogramos/mililitro) en el ensayo).
En ciertas modalidades, el ligando multivalente contiene dos o más dAbs que se enlazan con los epítopos o dominios deseados del TNFR1, o dos o más copias de dAb que se enlazan con un epítopo deseado del TNFR1. Los ligandos de este tipo pueden enlazarse con el TNFR1 con una alta avidez, y pueden ser más selectivos para el enlace con las células que sobre-expresen el TNFR1, o que expresen el TNFR1 sobre su superficie a una alta densidad, que otros formatos de ligando, tales como los monómeros dAb. En otras modalidades particulares, el ligando multivalente comprende dos o más dAbs, o dos o más copias de un dAb particular, que se enlazan con el TNFR1. Los ligandos multivalentes de este tipo pueden enlazarse con monómeros de TNFR1 con una baja afinidad, pero no se enlazan con los multímeros del receptor (por ejemplo, trímeros, véase en el complejo de receptor-ligando) con una alta avidez. Por consiguiente, los ligandos de este formato se pueden administrar para dirigirse efectivamente a los receptores que se hayan arracimado o asociado unos con otros y/o con el ligando (por ejemplo, TNFa), lo cual se requiere para la transducción de señales mediada por TNFR1. De una manera preferible, el ligando o el monómero dAb neutraliza (inhibe la actividad de) el TNFR1 en un ensayo convencional (por ejemplo, los ensayos L929 estándar o HeLa IL-8 estándar descritos en la presente), con una dosis neutralizante 50 (ND50) de 500 nM a 50 pM, de preferencia de 100 nM a 50 pM, más preferiblemente de 10 nM a 100 pM, convenientemente de 1 nM a 100 pM; por ejemplo, de 50 nM o menos, de preferencia de 5 nM o menos, más preferiblemente de 500 pM o menos, convenientemente de 200 pM o menos, y de una manera muy preferible de 100 pM o menos. En otras modalidades, el ligando o monómero dAb se enlaza con el TNFR1 y antagoniza la actividad del TNFR1 en un ensayo celular convencional (por ejemplo, los ensayos L929 estándar o HeLa IL-8 estándar descritos en la presente), con una ND50 de <100 nM, y en una concentración de </?0 µ?, el dAb agoniza la actividad del TNFR1 por el < 15 por ciento en el ensayo. En otras modalidades, el ligando o monómero dAb se enlaza específicamente con el TNFR1 con una Kd descrita en la presente, e inhibe la letalidad en un modelo de choque séptico inducido por LPS/D-galactosamina de ratón estándar (es decir, previene la letalidad o reduce la letalidad por cuando menos aproximadamente el 10 por ciento, comparándose con un control adecuado). De una manera preferible, el monómero dAb inhibe la letalidad por cuando menos aproximadamente el 25 por ciento, o por cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, comparándose con un control adecuado en un modelo de choque séptico inducido por LPS/D-galactosamina de ratón estándar, cuando se administra a aproximadamente 5 miligramos/kilogramo o más, de preferencia a aproximadamente 1 miligramo/kilogramo. En las modalidades particulares, el ligando o monómero dAb no agoniza sustancialmente el TNFR1 (actúa como un agonista del TNFR1) en un ensayo celular estándar, tal como los ensayos L929 estándar o HeLa IL-8 estándar descritos en la presente (es decir, cuando está presente en una concentración de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µ?, 10 µ?, 100 µ?, 1000 µ?, ó 5,000 µ?, da como resultado no más de aproximadamente el 5 por ciento de la actividad mediada por TNFR1 inducida por TNFa (100 picogramos/mililitro) en el ensayo). En otras modalidades, el ligando comprende un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que se enlaza específicamente con el Receptor de Factor de Necrosis Tumoral 1 (TNFR1, p55, CD120a) con una Kd de 300 nM a 5 pM, y comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, cuando menos aproximadamente el 91 por ciento, cuando menos aproximadamente el 92 por ciento, cuando menos aproximadamente el 93 por ciento, cuando menos aproximadamente el 94 por ciento, cuando menos aproximadamente el 95 por ciento, cuando menos aproximadamente el 96 por ciento, cuando menos aproximadamente el 97 por ciento, cuando menos aproximadamente el 98 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 99 por ciento homologa a la secuencia de aminoácidos o a un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-12 (SEQ ID NO:1), TAR2h-13 (SEQ ID NO:2), TAR2h-14 (SEQ ID NO:3), TAR2h-16 (SEQ ID NO:4), TAR2h-17 (SEQ ID NO:5), TAR2h-18 (SEQ ID NO:6), TAR2h-19 (SEQ ID NO:7), TAR2h-20 (SEQ ID NO:8), TAR2h-21 (SEQ ID NO:9), TAR2h-22 (SEQ ID NO:10), TAR2h-23 (SEQ ID NO:11), TAR2h-24 (SEQ ID NO:12), TAR2h-25 (SEQ ID NO:13), TAR2h-26 (SEQ ID NO:14), TAR2h-27 (SEQ ID NO:15), TAR2h-29 (SEQ ID NO:16), TAR2h-30 (SEQ ID NO:17), TAR2h-32 (SEQ ID NO:18), TAR2h-33 (SEQ ID NO:19), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:20), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:21), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:22), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:23), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:24), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:25), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:26), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:27), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:28), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:29), TAR2h-10-11 (SEQ ID NO:30), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:31), TAR2h-10-13 (SEQ ID NO:32), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:33), TAR2h-10-15 (SEQ ID NO:34), TAR2h-10-16 (SEQ ID NO 35), TAR2h- 10- 17 (SEQ ID NO:36), TAR2h- 10 ¦18 SEQ ID NO 37), TAR2h- 10- 19 (SEQ ID NO:38), TAR2h- 10 ¦20 SEQ ID NO 39), TAR2h- 10- 21 (SEQ ID NO:40), TAR2h- 10· ¦22 ( SEQ ID NO 41), TAR2h- 10- 27 (SEQ ID NO:42), TAR2h- 10- 29 ( SEQ ID NO 43), TAR2h- 10- 31 (SEQ ID NO:44), TAR2h- 10 ¦35 SEQ ID NO 45), TAR2h- 10- 36 (SEQ ID NO:46), TAR2h- 10 ¦37 | SEQ ID NO 47), TAR2h- 10- 38 (SEQ ID NO:48), TAR2h- 10 ¦45 SEQ ID NO 49), TAR2h- 10- 47 (SEQ ID NO:50), TAR2h- 10 -48 [SEQ ID NO 51), TAR2h- 10- 57 (SEQ ID NO:52), TAR2h- 10 -56 (SEQ ID NO 53), TAR2h- 10- 58 (SEQ ID NO:54), TAR2h- 10 -66 (SEQ ID NO 55), TAR2h- •10- 64 (SEQ ID NO:56), TAR2h- 10 -65 (SEQ ID NO 57), TAR2 •10 -68 (SEQ ID NO:58), TAR2h- 10 -69 (SEQ ID NO 59), TAR2h -10 -67 (SEQ ID NO:60), TAR2h- 10 -61 (SEQ ID NO 61), TAR2h •10 -62 (SEQ ID NO:62), TAR2h- 10 -63 (SEQ ID NO :63), TAR2h -10 -60 (SEQ ID NO:64), TAR2h- 10 -55 (SEQ ID NO :65), TAR2h -10 -59 (SEQ ID NO:66), TAR2h- 10 -70 (SEQ ID NO :67), TAR2h- 34 (SEQ ID NO:68), TAR2h-35 (SEQ ID NO:69), TAR2h-36 (SEQ ID NO:70), TAR2h-37 (SEQ ID NO:71), TAR2h-38 (SEQ ID NO:72), TAR2h-39 (SEQ ID NO:73), TAR2h-40 (SEQ ID NO:74), TAR2h-41 (SEQ ID NO:75), TAR2h-42 (SEQ ID NO:76), TAR2h-43 (SEQ ID NO:77), TAR2h-44 (SEQ ID NO:78), TAR2h-45 (SEQ ID NO:79), TAR2h-47 (SEQ ID NO:80), TAR2 -48 (SEQ ID NO:81), TAR2h-50 (SEQ ID NO:82), TAR2h-51 (SEQ ID NO:83), TAR2h-66 (SEQ ID NO:84), TAR2h-67 (SEQ ID NO:85), TAR2h-68 (SEQ ID NO:86), TAR2h-70 (SEQ ID NO:87), TAR2h-71 (SEQ ID NO:88), TAR2h-72 (SEQ ID NO:89), TAR2h-73 (SEQ ID NO:90), TAR2h-74 (SEQ ID NO:91), TAR2h-75 (SEQ ID NO:92), TAR2h-76 (SEQ ID NO:93), TAR2h-77 (SEQ ID NO:94), TAR2h-78 (SEQ ID NO:95), TAR2h-79 (SEQ ID NO:96), TAR2h-15 (SEQ ID NO:97), TAR2 -131-8 (SEQ ID NO:98), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:99), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:100), TAR2h-15-8-1 SEQ ID NO:101), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO:102), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:103), TAR2h-154-10-5 (SEQ ID NO:104), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:105), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO:106), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO:107), TAR2 -35-4 (SEQ ID NO:108), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:109), TAR2h-80 (SEQ ID NO:110), TAR2h-81 (SEQ ID NO:111), TAR2h-82 (SEQ ID NO:112), TAR2h-83 (SEQ ID NO:113), TAR2 -84 (SEQ ID NO-.114), TAR2h-85 (SEQ ID NO:115), TAR2h-86 (SEQ ID NO:116), TAR2 -87 (SEQ ID NO:117), TAR2h-88 (SEQ ID NO:118), TAR2h-89 (SEQ ID NO:119), TAR2h-90 (SEQ ID NO:120), TAR2 -91 (SEQ ID NO-.121), TAR2h-92 (SEQ ID NO:122), TAR2h-93 (SEQ ID NO:123), TAR2h-94 (SEQ ID NO:124), TAR2h-95 (SEQ ID NO:125), TAR2h-96 (SEQ ID NO:126), TAR2h-97 (SEQ ID NO:127), TAR2h-99 (SEQ ID NO:128), TAR2 - 100 (SEQ ID N0.129), TAR2h- 101 (SEQ ID NO:130), TAR2 - 102 (SEQ ID NO:131), TAR2h- 103 (SEQ ID NO:132), TAR2h- 104 (SEQ ID NO:133), TAR2h- 105 (SEQ ID NO:134), TAR2h- 106 (SEQ ID NO:135), TAR2h- 107 (SEQ ID NO-.136), TAR2h- 108 (SEQ ID NO:137), TAR2h- ¦109 (SEQ ID NO:138), TAR2h- ¦110 (SEQ ID NO:139), TAR2h- ¦111 (SEQ ID NO:140), TAR2h- ¦112 (SEQ ID NO:141), TAR2h- ¦113 (SEQ ID O: 142), TAR2h- •114 ( SEQ ID NO: 143), TAR2 - 115 SEQ ID O: 144), TAR2h •116 ( SEQ ID NO: 145), TAR2 - 117 SEQ ID NO: 146), TAR2h -118 SEQ ID NO 147), TAR2 - 119 (SEQ ID NO: 148), TAR2h -120 SEQ ID NO 149), TAR2 - 121 (SEQ ID NO: 150), TAR2h -122 SEQ ID NO 151), TAR2 - 123 (SEQ ID NO: 152), TAR2h -124 SEQ ID NO 153), TAR2h- 125 (SEQ ID NO: 154), TAR2h -126 SEQ ID NO 155), TAR2h- 127 (SEQ ID NO 156), TAR2h -128 SEQ ID NO 157), TAR2h- 129 (SEQ ID NO 158), TAR2h -130 SEQ ID NO 159), TAR2h- 131 (SEQ ID NO 160), TAR2h -132 ¡SEQ ID NO 161), TAR2 - 133 (SEQ ID NO 162), TAR2h -151 [SEQ ID NO 163), TAR2h- 152 (SEQ ID NO 164), TAR2h -153 (SEQ ID NO 165), TAR2h- 154 (SEQ ID NO 166), TAR2 -159 (SEQ ID NO:167), TAR2h- 165 (SEQ ID NO 168), TAR2h -166 (SEQ ID NO 169), TAR2 - 168 (SEQ ID NO 170) TAR2h -171 (SEQ ID NO 171), TAR2h- 172 (SEQ ID NO 172) TAR2h -173 (SEQ ID NO 173), TAR2h- 174 (SEQ ID NO 174) TAR2h -176 (SEQ ID NO 175), TAR2 - ¦178 (SEQ ID NO 176) TAR2h -201 (SEQ ID NO 177), TAR2h -202 (SEQ ID NO 178) TAR2h -203 (SEQ ID NO :179), TAR2h -204 (SEQ ID NO 180) TAR2h- 185-25 (SEQ ID NO:181), TAR2h-154-10 (SEQ ID NO 182) TAR2h-205 (SEQ ID NO:183), TAR2h-10 (SEQ ID NO:184), TAR2h-5 (SEQ ID NO:185), TAR2h-5d1 (SEQ ID NO:186), TAR2h-5d2 (SEQ ID NO:187), TAR2h-5d3 (SEQ ID NO:188), TAR2h-5d4 (SEQ ID NO:189), TAR2h-5d5 (SEQ ID NO:190), TAR2h-5d6 (SEQ ID NO:191), TAR2h-5d7 (SEQ ID NO:192), TAR2h-5d8 (SEQ ID NO:193), TAR2h-5d9 (SEQ ID NO:194), TAR2h-5d10 (SEQ ID NO:195), TAR2h-5d11 (SEQ ID NO:196), TAR2h-5d12 (SEQ ID NO:197), y TAR2h-5d13 (SEQ ID NO:198). En otras modalidades, el ligando comprende un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que se enlaza específicamente con el Receptor de Factor de Necrosis Tumoral 1 (TNFR1, p55, CD120a) con una Kd de 300 nM a 5 pM, y comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, cuando menos aproximadamente el 91 por ciento, cuando menos aproximadamente el 92 por ciento, cuando menos aproximadamente el 93 por ciento, cuando menos aproximadamente el 94 por ciento, cuando menos aproximadamente el 95 por ciento, cuando menos aproximadamente el 96 por ciento, cuando menos aproximadamente el 97 por ciento, cuando menos aproximadamente el 98 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 99 por ciento homologa a la secuencia de aminoácidos de un dAb que tenga la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO:216 a SEQ ID NO:433. En otras modalidades, el ligando comprende un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que se enlaza específicamente con el Receptor de Factor de Necrosis Tumoral 1 (TNFR1, p55, CD120a) con una Kd de 300 nM a 5 pM, y comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, cuando menos aproximadamente el 91 por ciento, cuando menos aproximadamente el 92 por ciento, cuando menos aproximadamente el 93 por ciento, cuando menos aproximadamente el 94 por ciento, cuando menos aproximadamente el 95 por ciento, cuando menos aproximadamente el 96 por ciento, cuando menos aproximadamente el 97 por ciento, cuando menos aproximadamente el 98 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 99 por ciento homologa a la secuencia de aminoácidos o a un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2m-14 (SEQ ID NO:199), TAR2m-15 (SEQ ID NO:200), TAR2m-19 (SEQ ID NO:201), TAR2m-20 (SEQ ID NO:202), TAR2m-21 (SEQ ID NO:203), TAR2m-24 (SEQ ID NO:204), TAR2m-21-23 (SEQ ID NO:205), TAR2m-21-07 (SEQ ID NO:206), TAR2m-21-43 (SEQ ID NO:207), TAR2m-21-48 (SEQ ID NO:208), TAR2m-21-10 (SEQ ID NO.209), TAR2m-21-06 (SEQ ID NO:210), y TAR2m-21-17 (SEQ ID NO:211). En algunas modalidades, el ligando comprende un monómero dAb que se enlaza con el TNFR1, y que compite con cualquiera de los dAbs dados a conocer en la presente, por el enlace con el TNFR1 (por ejemplo, TNFR1 de ratón y/o humano). El ligando de la invención puede comprender una fracción de enlace que no sea de inmunoglobulina, que tenga especificidad de enlace para el TNFR1, y de preferencia que inhiba una función del TNFR1 (por ejemplo, que se enlace con TNFa, señalización después del enlace con TNFa), en donde la fracción de enlace que no sea de inmunoglobulina comprende una, dos o tres de las regiones determinantes de complementariedad de una VH> VL> ó VHH que se enlace con TNFR1 , y un andamiaje adecuado. En ciertas modalidades, la fracción de enlace que no es de inmunoglobulina comprende CDR3, pero no comprende CDR1 ó CDR2 de una VH, VL, ó VHH que se enlace con el TNFR1 , y un andamiaje adecuado. En otras modalidades, la fracción de enlace que no es de inmunoglobulina comprende CDR1 y CDR2, pero no comprende CDR3 de una VH, VL> ó VHH que se enlace con TNFR1 y un andamiaje adecuado. En otras modalidades, la fracción de enlace que no es de inmunoglobulina comprende CDR1 , CDR2, y CDR3 de una VH, VL, ó VHH que se enlace con el TNFR1 , y un andamiaje adecuado. De una manera preferible, la CDR o las CDRs del ligando de estas modalidades es una CDR o son CDRs de un dAb anti-TNFR1 descrito en la presente. De preferencia, la fracción de enlace que no es de inmunoglobulina comprende una, dos, o tres de las regiones determinantes de complementariedad de uno de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente. En otras modalidades, el ligando comprende solamente CDR3 de una VH, VL, ó VHH que se enlace con el TNFR1. El dominio que no es de inmunoglobulina puede comprender una secuencia de aminoácidos en donde una o más regiones tengan identidad de secuencia con una, dos, o tres de las regiones determinantes de complementariedad de un dAb anti-TNFR1 descrito en la presente. Por ejemplo, el dominio que no es de inmunoglobulina puede tener una secuencia de aminoácidos que contenga cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, cuando menos aproximadamente el 60 por ciento, cuando menos aproximadamente el 70 por ciento, cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 90 por ciento de identidad de secuencia con las CDR1, CDR2, y/o CDR3 de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente. Todavía de una manera más preferible, la fracción de enlace que no es de inmunoglobulina comprende una, dos, o tres de las regiones determinantes de complementariedad de TAR2h-131 -511 , TAR2h-131 -193, y TAR2h-131-194. La invención también se refiere a un ligando que comprende una fracción de proteína que tiene un sitio de enlace con una especificidad de enlace para TNFR1, en donde esta fracción de proteína comprende una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, tal como TAR2h-131 -511 , TAR2h-131 -193, y TAR2h-131-194. En algunas modalidades, el ligando que comprende una fracción de proteína que tiene un sitio de enlace con especificidad de enlace para TNFR1, en donde la fracción de proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es igual que la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, también comprende una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de la CDR1 y/o de la CDR2 de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, tal como TAR2h- 131-511, TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con IL-4 difiere de la secuencia de aminoácidos de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1 que tiene cuando menos una identidad del 50 por ciento con la secuencia de la CDR1 de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente, tales como TAR2h-131-511, TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194.. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos del dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR2 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con la secuencia de CDR2 de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente, tales como TAR2h-131 -511 , TAR2h-131 -193, y TAR2h-131-194.. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR3 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con la secuencia de CDR3 de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente, tales como TAR2h-131 -511 , TAR2h-131 -193, y TAR2h-131-194.. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de ¡nmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de ¡nmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1 y una secuencia de CDR2 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 ó CDR2, respectivamente, de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente, tales como TAR2h-131 -511 , TAR2h-131 -193, y TAR2h-131-194. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de ¡nmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de ¡nmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR2 y una secuencia de CDR3 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR2 ó CDR3, respectivamente, de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente, tales como TAR2h-131 -511 , TAR2h-131 -193, y TAR2h-131-194. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR2 y una secuencia de CDR3 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 ó CDR3, respectivamente, de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente, tales como TAR2h-131 -511 , TAR2h-131 -193, y TAR2h-131-194. En otras modalidades, el ligando comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 difiere de la secuencia de aminoácidos de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1, una secuencia de CDR2, y una secuencia de CDR3 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1, CDR2, ó CDR3, respectivamente, de los dAbs anti-TNFR1 dados a conocer en la presente, tales como TAR2h-131-511, TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 tiene una secuencia de CDR2 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con la secuencia de CDR2 de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, tal como TAR2h-131-511, TAR2h-131 -193, y TAR2h-131 -194. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 tiene una secuencia de CDR3 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con la secuencia de CDR3 de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, tal como TAR2h-131-511, TAR2h-131 -193, y TAR2h-131 -194. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 tiene una secuencia de CDR1 y una secuencia de CDR2 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, tal como TAR2h-131 -511 , TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 tiene una secuencia de CDR2 y una secuencia de CDR3, que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR2 y CDR3, respectivamente, de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, tal como TAR2h-131 -511 , TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 tiene una secuencia de CDR1 y una secuencia de CDR3 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 y CDR3, respectivamente, de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, tal como TAR2h-131 -511 , TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194. En otra modalidad, la invención es un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con TNFR1 tiene una secuencia de CDR1, y de CDR2, y de CDR3 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3, respectivamente, de un dAb anti-TNFR1 dado a conocer en la presente, tal como TAR2h-131-511, TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194. En algunas modalidades, el ligando que comprende un dAb que se enlaza con el TNFR1 humano, es un antagonista del TNFR1 humano, en donde este ligando inhibe la inflamación inducida por el TNFa o un mediador inflamatorio inducido por TNFa, en una dosis [miligramos/kilogramo] que no es mayor de 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10, 1/15, 1/20, 1/25, ó 1/30 de la dosis del etanercept (ENBREL, Immunex Corporation), que se requiere para inhibir esta inflamación inducida por TNFa o el mediador inflamatorio inducido por TNFa hasta sustancialmente el mismo grado. Por ejemplo, el ligando puede inhibir el influjo celular del tejido inducido por TNFa (por ejemplo, pulmonar), el incremento inducido por TNFa en la producción, concentración, o nivel de mediadores inflamatorios, tales como los quimioatrayentes de neutrófilos de acción temprana KC y MIP-1, y la quimiocina de acción tardía MCP-1, y la molécula de adhesión de E-selectina, en una dosis [miligramos/kilogramo] que no es mayor de 1/2, 1/3, 1/4, 715, 1/10, 1/15, 1/20, 1/25, ó 1/30 de la dosis del etanercept (ENBREL, Immunex Corporation) que se requiere para lograr sustancialmente el mismo nivel de inhibición. De una manera preferible, el i nivel de inhibición es de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 60 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 70 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, o de cuando menos aproximadamente el 95 por ciento. El monómero dAb puede comprender cualquier dominio variable de inmunoglobulina adecuado, y de preferencia comprende un dominio variable humano o un dominio variable que comprenda regiones de estructura humanas. En ciertas modalidades, el monómero dAb comprende una estructura universal, como se describe en la presente. La estructura universal puede ser una estructura de VL (VA ó VK), tal como una estructura que comprenda las secuencias de aminoácidos de estructura codificadas por el segmento del gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana DPK1, DPK2, DPK3, DPK4, DPK5, DPK6, DPK7, DPK8, DPK9, DPK10, DPK12, DPK13, DPK15, DPK16, DPK18, DPK19, DPK20, DPK21 , DPK22, DPK23, DPK24, DPK25, DPK26, ó DPK28. Si se desea, la estructura de VL puede comprender además la secuencia de aminoácidos de estructura codificada por el segmento del gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana JK , JK2, JK3, JK4, ó JK5. En otras modalidades, la estructura universal puede ser una estructura de VH, tal como una estructura que comprenda las secuencias de aminoácidos de estructura codificadas por el segmento del gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana DP4, DP7, DP8, DP9, DP10, DP31, DP33, DP38, DP45, DP46, DP47, DP49, DP50, DP51, DP53, DP54, DP65, DP66, DP67, DP68, ó DP69. Si se desea, la estructura de VH puede comprender además la secuencia de aminoácidos de estructura codificada por el segmento del gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana JH1, JH2, JH3, JH4, JH4b, JH5, y JH6. En las modalidades particulares, el monómero dAb comprende la estructura de VL de DPK9, o una estructura de VH seleccionada a partir del grupo que consiste en DP47, DP45, y DP38. En ciertas modalidades, el monómero dAb comprende una o más regiones de estructura que comprenden una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de una región de estructura correspondiente codificada por un segmento de gen de anticuerpo de la línea germinal humana, o las secuencias de aminoácidos de una o más de estas regiones de estructura comprenden colectivamente hasta cinco diferencias de aminoácidos en relación con la secuencia de aminoácidos de esta región de estructura correspondiente codificada por un segmento del gen de anticuerpo de la línea germinal humana. En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2, FW3, y FW4 del monómero dAb, son iguales a las secuencias de aminoácidos de las regiones de estructura correspondientes codificadas por un segmento de gen de anticuerpo de la línea germinal humana, o las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2, FW3, y FW4 contienen colectivamente hasta diez diferencias de aminoácidos en relación con las secuencias de aminoácidos de las regiones de estructura correspondientes codificadas por el segmento del gen de anticuerpo de la línea germinal humana. En otras modalidades, el monómero dAb comprende las regiones FW1, FW2, y FW3, y la secuencia de aminoácidos de estas regiones FW1, FW2, y FW3 son iguales que las secuencias de aminoácidos de las regiones de estructura correspondientes codificadas por los segmentos del gen de anticuerpo de la línea germinal humana. En algunas modalidades, el monómero dAb no comprende un dominio de inmunoglobulina de Camélido, o uno o más aminoácidos de estructura que sean únicos para los dominios variables de inmunoglobulina codificados por los segmentos del gen de anticuerpo de la línea germinal de Camélido. Moléculas de Ácidos Nucleicos, Vectores, y Células Huésped. La invención también proporciona moléculas de ácidos nucleicos aisladas y/o recombinantes que codifican los ligandos descritos en la presente. Los ácidos nucleicos referidos en la presente como "aislados", son los ácidos nucleicos que se han separado de los ácidos nucleicos del ADN genómico o del ARN celular, de su fuente de origen (por ejemplo, como existe en las células o en una mezcla de ácidos nucleicos, tal como una biblioteca), e incluyen los ácidos nucleicos obtenidos mediante los métodos descritos en la presente o mediante otros métodos adecuados, incluyendo los ácidos nucleicos esencialmente puros, los ácidos nucleicos producidos mediante síntesis química, mediante combinaciones de métodos biológicos y químicos, y los ácidos nucleicos recombinantes que se aislan (véase, por ejemplo, Daugherty, B. L. y colaboradores, Nucleic Acids Res., 19(9):2471-2476 (1991); Lewis, A. P. y J. S. Crowe, Gene, 101:297-302 (1991)).
Los ácidos nucleicos referidos en la presente como "recombinantes", son ácidos nucleicos que se han producido mediante metodología de ADN recombinante, incluyendo los ácidos nucleicos que se generan mediante procedimientos que se apoyan en un método de recombinación artificial, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y/o la clonación en un vector, utilizando enzimas de restricción. En ciertas modalidades, el ácido nucleico aislado y/o recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ligando, como se describe en la presente, en donde este ligando comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 91 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 92 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 93 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 94 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 95 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 96 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 97 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 98 por ciento, o de cuando menos aproximadamente el 99 por ciento, con la secuencia de aminoácidos de un dAb que se enlaza con el TNFR1 dado a conocer en la presente. Por ejemplo, en algunas modalidades, el ácido nucleico aislado y/o recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ligando que tiene una especificidad de enlace para el TNFR1, en donde este ligando comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, . de cuando menos aproximadamente el 91 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 92 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 93 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 94 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 95 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 96 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 97 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 98 por ciento, o de cuando menos aproximadamente el 99 por ciento, con la secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2m-15-8 (SEQ ID NO:216), TAR2m-15-12 (SEQ ID NO:217), TAR2m-15-2 (SEQ ID NO:218), TAR2m-15-5 (SEQ ID NO:219), TAR2m-15-6 (SEQ ID NO:220), TAR2m -15 -9 (SEQ ID NO:221), Tar2h-131-1 (SEQ ID NO:222), Tar2h ¦131 -2 (SEQ ID NO:223), Tar2h -131 -3 (SEQ ID NO:224), Tar2h -131 -4 (SEQ ID NO:225), Tar2h -131 -5 (SEQ ID NO:226), Tar2h ¦131 -6 (SEQ ID NO:227), Tar2h -131 -7 (SEQ ID NO:228), Tar2h ¦131 -8 (SEQ ID NO:229), Tar2h -131 -9 (SEQ ID NO:230), Tar2h- 131 ¦10 (SEQ ID NO:231), Tar2h- 131- 11 (SEQ ID NO:232), Tar2h- 131 -12 (SEQ ID NO:233), Tar2h- 131- 13 (SEQ ID NO:234), Tar2h- 131 -14 (SEQ ID NO:235), Tar2h- 131- 15 (SEQ ID NO:236), Tar2h- 131 -16 (SEQ ID NO:237), Tar2h- 131- 17 (SEQ ID NO:238), Tar2h- 131 -18 (SEQ ID NO:239), Tar2h- 131- 19 (SEQ ID NO:240; Tar2h-131-20 SEQ ID NO:241) Tar2h-131-21 SEQ ID NO:242¡ Tar2h-131-22 SEQ ID NO:243) Tar2h-131-23 SEQ ID NO:244; Tar2h-131-24 SEQ ID NO:245) Tar2h-131-25 SEQ ID NO:246; Tar2h-131-26 SEQ ID NO:247) Tar2h-131-27 SEQ ID NO:248; Tar2h-131-28 SEQ ID NO:249) Tar2h-131-29 SEQ ID NO:250; Tar2h-131-30 SEQ ID NO:251) Tar2h-131-31 SEQ ID NO:252] Tar2h-131-32 SEQ ID NO:253) Tar2h-131 -33 SEQ ID NO:254; Tar2h-131-34 SEQ ID NO:255) Tar2h-131-35 SEQ ID NO:256; Tar2h-131-36 SEQ ID NO:257) Tar2h-131-37 SEQ ID NO:258; Tar2h-131-38 SEQ ID NO:259) Tar2h-131-39 SEQ ID NO:260; Tar2h-131-40 SEQ ID NO:261) Tar2h-131-41 SEQ ID NO:262; Tar2h-131-42 SEQ ID NO:263) Tar2h-131-43 SEQ ID NO:264; Tar2h-131-44 SEQ ID NO:265) Tar2h-131-45 SEQ ID NO:266; Tar2h-131-46 SEQ ID NO:267) Tar2h-131-47 SEQ ID NO:268; Tar2h-131-48 SEQ ID NO:269) Tar2h-131-49 SEQ ID NO:270; Tar2h-131-50 SEQ ID NO:271) Tar2h-131-51 SEQ ID NO-.272; Tar2 -131-52 SEQ ID NO:273) Tar2h-131-53 SEQ ID NO:274; Tar2h-131-54 SEQ ID NO:275) Tar2h-131-55 SEQ ID NO:276 Tar2h-131-56 SEQ ID NO:277] Tar2h-131-57 SEQ ID NO:278 Tar2h-131-58 SEQ ID NO:279) Tar2hr-131-59 ;SEQ ID NO:280 Tar2h-131-60 SEQ ID NO:281 Tar2h-131-61 ;SEQ ID NO:282 Tar2h-131-62 SEQ ID NO:283 Tar2h-131-63 ;SEQ ID NO:284 Tar2h-131-64 SEQ ID NO:285 Tar2h-131-65 ;SEQ ID NO:286 Tar2h-131-66 SEQ ID NO:287 Tar2h-131-67 ;SEQ ID NO:288 Tar2h-131-68 SEQ ID NO:289 Tar2h-131-69 'SEQ ID NO:290), Tar2h- 131 -70 (SEQ ID NO:291] Tar2h- -131 -71 (SEQ ID NO-.292), Tar2h- 131 -72 (SEQ ID NO-.2931 Tar2 - ¦131 -73 (SEQ ID NO:294), Tar2 - 131 -74 (SEQ ID NO:295 Tar2h ¦131 -75 (SEQ ID NO:296), Tar2h- 131 -76 (SEQ ID NO:297 Tar2h -131 -77 (SEQ ID NO:298), Tar2h- 131 -78 (SEQ ID NO:299 Tar2h -131 -79 (SEQ ID NO:300), Tar2h- 131 -80 (SEQ ID NO:301 Tar2h -131 -81 (SEQ ID NO:302), Tar2 - 131 -82 (SEQ ID NO:303 Tar2b -131 -83 (SEQ ID NO:304), Tar2h- 131 -86 (SEQ ID NO:305 Tar2h -131 -87 (SEQ ID NO:306), Tar2h- 131 -88 (SEQ ID NO:307 Tar2h -131 -89 (SEQ ID NO:308), Tar2h- 131 -90 (SEQ ID NO:309 Tar2h -131 -91 (SEQ ID NO:310), Tar2h- 131 -92 (SEQ ID NO:311 Tar2 -131 -93 (SEQ ID NO:312), Tar2h- 131 -94 (SEQ ID NO:313 Tar2h -131 -95 (SEQ ID NO:314), Tar2h- 131 -96 (SEQ ID NO:315 Tar2h -131 -97 (SEQ ID NO:316), Tar2h- 131 -99 (SEQ ID NO:317) Tar2h- 131- 100 (SEQ ID NO:318), Tar2h- 131 -101 (SEQ ID NO:319 Tar2h- 131 - ¦102 (SEQ ID NO:320), Tar2h- 131 -103 (SEQ ID NO:321 Tar2h- 131- -104 (SEQ ID NO:322) Tar2h- 131 -105 (SEQ ID NO:323 Tar2h- 131· ¦106 (SEQ ID NO:324) Tar2h- 131 -107 (SEQ ID NO:325 Tar2 - 131· ¦108 (SEQ ID NO:326) Tar2h- 131 -109 (SEQ ID NO:327 Tar2h- 131 -110 (SEQ ID NO-.328) Tar2 - 131 -111 (SEQ ID NO-.329 Tar2h- 13 - 2 (SEQ ID NO:330) Tar2h- 131 -113 (SEQ ID NO:331 Tar2h- ¦131 -114 (SEQ ID NO:332) Tar2h- 131 -115 (SEQ ID NO:333 Tar2h- •131 -116 (SEQ ID NO:334) Tar2h- 131 -117 (SEQ ID NO:335 Tar2h- •131 -120 (SEQ ID NO:336) Tar2h- 131 -121 (SEQ ID NO:337 Tat2h- •131 -122 (SEQ ID NO:338) Tar2h- 131 -123 (SEQ ID NO:339 Tar2h- -131 -124 (SEQ ID NO:340) Tar2h-131-125 SEQ ID NO:341) Tar2h-131-126 SEQ ID NO:342) Tar2h-131-127 SEQ ID NO:343) Tar2 -131-128 SEQ ID NO:344) Tar2h-131-129 SEQ ID NO:345) Tar2h-131-130 SEQ ID NO:346) Tar2h-131-131 SEQ ID NO:347) Tar2h-131-132 SEQ ID NO:348) Tar2 -131-136 SEQ ID NO:349) Tar2h-131-151 SEQ ID NO:350) Tar2h-131-180 SEQ ID NO:351) Tar2h-131-181 SEQ ID NO:352] Tar2h-131-182 SEQ ID NO:353; Tar2h-131 -183 SEQ ID NO:354) Tar2 -131-184 SEQ ID NO:355) Tar2h-131 -185 SEQ ID NO:356] Tar2h-131-188 SEQ ID NO:357] Tar2h-131-189 SEQ ID NO:358¡ Tar2h-131-190 SEQ ID NO:359] Tar2h-131-191 SEQ ID NO:360¡ Tar2h-131-192 SEQ ID NO:361] Tar2h-131-193 SEQ ID NO:362; Tar2h-131-194 SEQ ID NO:363¡ Tar2h-131-195 SEQ ID NO-.364; Tar2h-131-196 SEQ ID NO:365] Tar2h-131-197 SEQ ID NO:366; Tar2 -131-198 SEQ ID NO:367; Tar2h-131-500 SEQ ID NO:368; Tar2h-131-501 SEQ ID NO:369i Tar2h-131-502 SEQ ID NO:370; Tar2h-131-503 SEQ ID NO:37i; Tar2h-131-504 SEQ ID NO:372; Tar2h-131-505 SEQ ID NO:373; Tar2h-131 -506 SEQ ID NO:374; Tar2h-131-507 ;SEQ ID NO:375; Tar2h-131-508 ;SEQ ID NO:376 Tar2h-131-509 ;SEQ ID NO:377 Tar2h-131-510 ;SEQ ID NO:378 Tar2 -131-511 [SEQ ID NO:379 Tar2h-131 -512 ;SEQ ID NO:380 Tar2h-131-513 ¡SEQ ID NO:381 Tar2h-131-514 [SEQ ID NO:382 Tar2h-131-515 [SEQ ID NO:383 Tar2h-131-516 [SEQ ID NO:384 Tar2h-131-517 [SEQ ID NO:385 Tar2h-131-518 [SEQ ID NO:386 Tar2h-131-519 [SEQ ID NO:387 Tar2h-131-520 [SEQ ID NO:388 Tar2h-131-521 (SEQ ID NO:389 Tar2h-131-522 (SEQ ID NO:390), Tar2h- 131 -523 (SEQ ID NO:391), Tar2h- 131 -524 (SEQ ID NO:392), Tar2h- 131 -525 (SEQ ID NO:393), Tar2h- 131 -526 (SEQ ID NO:394), Tar2h- 131 -527 (SEQ ID NO:395), Tar2h- 131 -528 (SEQ ID NO:396), Tar2h- 131 -529 (SEQ ID NO:397), Tar2h- 131 -530 (SEQ ID NO:398), Tar2h- 131 -531 (SEQ ID NO:399), Tar2h- 131 -532 (SEQ ID NO:400), Tar2h- 131 -533 (SEQ ID NO:401), Tar2h- 131 -534 (SEQ ID NO:402), Tar2h- 131 -535 (SEQ ED NO:403), Tar2h- 131 -536 (SEQ ID NO:404), Tar2h- 131 -537 (SEQ ID NO:405), Tar2h- 131 -538 (SEQ ID NO:406), Tar2h- 131 -539 (SEQ ID NO:407), Tar2h- 131 -539 (SEQ ID NO:408), Tar2h- 131 -539 (SEQ ID NO:409), Tar2h- 131 -540 (SEQ ID NO:410), Tar2h- 131 -541 (SEQ ID NO:411), Tar2h- 131 -542 (SEQ ID NO:412), Tar2h- 131 -543 (SEQ ID NO:413), Tar2h- 131 -544 (SEQ ID NO:414), Tar2h- 131 -545 (SEQ ID NO:415), Tar2h- 131 -546 (SEQ ID NO:416), Tar2h- 131 -547 (SEQ ID NO:417), Tar2h- 131 -548 (SEQ ID NO:418), Tar2h- 131 -549 (SEQ ID NO:419), Tar2h- 131 -550 (SEQ ID NO:420), Tar2h- 131 -551 (SEQ ID NO:421), Tar2h- 131 -552 (SEQ ID NO:422), Tar2h- 131 -553 (SEQ ID NO:423), Tar2h- 131 -554 (SEQ ID NO:424), Tar2h- 131 -555 (SEQ ID NO:425), Tar2h- 131 -556 (SEQ ID NO:426), Tar2h- 131 -557 (SEQ ID NO:427), Tar2h- 131 -558 (SEQ ID NO:428), Tar2h- 131 -559 (SEQ ID NO:429), Tar2h- 131 -560 (SEQ ID NO:430), Tar2h- 131 -561 (SEQ ID NO:431), Tar2h- 131 -562 (SEQ ID NO:432), y Tar2h-131-563 (SEQ ID NO:433) En otras modalidades, el ácido nucleico aislado y/o recombinante que codifica un ligando que tiene una especificidad de enlace para el TNFR1, como se describe en la presente, en donde este ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de nucleótidos de cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 91 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 92 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 93 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 94 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 95 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 96 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 97 por ciento, de cuando menos aproximadamente el 98 por ciento, o de cuando menos aproximadamente el 99 por ciento, con una secuencia de nucleótidos que codifica un dAb anti-TNFFM seleccionado a partir del grupo que consiste en Tar2h-131 (SEQ ID NO:434), Tar2h-131-1 (SEQ ID NO:435), Tar2h-131-2 (SEQ ID NO:436), Tar2h-131-3 (SEQ ID NO:437), Tar2h-131-4 (SEQ ID NO:438), Tar2h-131-5 (SEQ ID NO:439), Tar2h-131-6 (SEQ ID NO:440), Tar2h-131-7 (SEQ ID NO:441), Tar2h-131-8 (SEQ ID NO:442), Tar2h-131-9 (SEQ ID NO:443), Tar2h-131 -10 (SEQ ID NO:444), Tar2h-131-11 (SEQ ID NO:445), Tar2 -131 -12 (SEQ ID NO:446), Tar2h-131 -13 (SEQ ID NO:447), Tar2h-131 -14 (SEQ ID NO:448), Tar2h-131 -15 (SEQ ID NO:449), Tar2h-131-16 (SEQ ID NO:450), Tar2h-131-17 (SEQ ID NO:451), Tar2h-131-18 (SEQ ID NO:452), Tax2h-131 -19 (SEQ ID NO:453), Tar2h- 131 -20 (SEQ ID NO:454), Tar2h -131 -21 (SEQ ID NO:455), Tar2h- 131 -22 (SEQ ID NO:456), Tar2h -131 -23 (SEQ ID NO:457), Tar2h- 131 -24 (SEQ ID NO:458). Tar2h -131 -25 (SEQ ID NO:459), Tar2h- 131 -26 (SEQ ID NO:460), Tat2h -131 -27 (SEQ ID NO:461), Tar2h- 131 -28 (SEQ ID NO:462), Tar2h -131 -29 (SEQ ID NO:463), Tar2h- 131 -30 (SEQ ID NO:464), Tar2h -131 -31 (SEQ ID NO:465), Tar2h- 131 -32 (SEQ ID NO:466), Tar2h -131 -33 (SEQ ID NO:467), Tar2h- 131 -34 (SEQ ID NO:468), Tar2h -131 -35 (SEQ ID NO:469), Tar2h- 131 -36 (SEQ ID NO:470), Tar2h -131 -37 (SEQ ID NO:471), Tar2h- 132 -38 (SEQ ID NO:472), Tar2h -132 -39 (SEQ ID NO:473), Tar2h- 131 -40 (SEQ ID NO:474), Tar2h -131 -41 (SEQ ID NO-.475), Tar2h- 131 -42 (SEQ ID NO:476), Tar2h -131 -43 (SEQ ID NO:477), Tar2h- 131 -44 (SEQ ID NO:478), Tar2h -131 -45 (SEQ ID NO:479), Tar2h- 131 -46 (SEQ ID NO:480), Tar2h -131 -47 (SEQ ID NO:481), Tar2h- 131 -48 (SEQ ID NO:482), Tar2h -131 -49 (SEQ ID NO:483), Tar2h- 131 -50 (SEQ ID NO:484), Tar2h -131 -51 (SEQ ID NO:485), Tar2h- 131 -52 (SEQ ID NO:486), Tar2h -131 -53 (SEQ ID NO:487) Tar2h- 131 -54 (SEQ ID NO:488), Tar2h- 131 -55 (SEQ ID NO:489) Tar2h- 131 -56 (SEQ ID NO:490), Tar2h- 131 -57 (SEQ ID NO:491) Tar2h- 131 -58 (SEQ ID NO:492), Tar2h- 131 -59 (SEQ ID NO:493) Tar2h- 131 -60 (SEQ ID NO:494), Tar2h- 131- 61 (SEQ DD NO:495) Tar2h- 131 -62 (SEQ ID NO:496), Tar2h- 131- 63 (SEQ ID NO:497) Tar2h- 131 -64 (SEQ ID NO:498), Tar2h- 131 -65 (SEQ ID NO:499) Tar2h- 131 -66 (SEQ ID NO:500), Tar2h- 131 -67 (SEQ ID NO:501) Tar2h- 131 -68 (SEQ ID NO:502), Tar2h- 131 -69 (SEQ ID NO:503) Tar2h- 131 -70 (SEQ ID NO:504), Tar2h- 131 -71 (SEQ ID NO:505), Tar2h- 131 -72 (SEQ ID NO:506), Tar2h- 131 -73 (SEQ ID NO:507) Tar2h- 131 -74 (SEQ ID NO:508), Tar2h- 131 -75 (SEQ ID NO:509) Tar2h- 131 -76 (SEQ ID NO:510), Tar2h- 131 -77 (SEQ ID NO:511) Tar2h- 131 -78 (SEQ ID NO:512), Tar2h- 131 -79 (SEQ ID NO:513) Tar2h- 131 -80 (SEQ ID NO:514), Tar2h- 131 -81 (SEQ ID NO:515) Tar2h- 131 -82 (SEQ ID NO:516) Tar2 -131-83 (SEQ ID NO:517) Tar2h- 131 -86 (SEQ ID NO:518), Tar2h- 131 -87 (SEQ ID NO:519) Tar2h- 131 -88 (SEQ ID NO:520), Tar2h- 131 -89 (SEQ ID NO:521) Tar2h- 131 -90 (SEQ ID NO:522), Tar2h- •131 -91 (SEQ ID NO:523) Tar2h- 131 -92 (SEQ ID NO:524), Tar2h •131 -93 (SEQ ID NO:525) Tar2h- 131 -94 (SEQ ID NO:526), Tar2h •131 -95 (SEQ ID NO:527) Tar2h- 131 -96 (SEQ ID NO:528), Tar2h •131 -97 (SEQ ID NO:529) Tar2h- 131 -99 (SEQ ID NO:530), Tar2h- 131 -100 (SEQ ID NO:531) Tar2h- 131 -101 (SEQ ID NO:532), Tar2h- 131 -102 (SEQ ID NO:533) Tar2h- 131 -103 (SEQ ID NO:534), Tar2h- 131 -104 (SEQ ID NO:535) Tar2h- 131 -105 (SEQ ID NO:536), Tar2h- 131 -106 (SEQ ID NO:537) Tac2h- ¦131 -107 (SEQ ID NO:538), Tar2h- 131 -108 (SEQ ID NO:539) Tar2h- 131 -109 (SEQ ID NO:540), Tar2b- 131 -110 (SEQ ID NO:541) Tar2h- 131 -111 (SEQ ID NO:542), Tar2h- 131 -112 (SEQ ID NO:543) Tar2h- 131 -113 (SEQ ID NO:544), Tar2h- 131 -114 (SEQ ID NO:545) Tar2h- 131 -115 (SEQ ID NO:546), Tar2h- 131 -116 (SEQ ID NO:547) Tar2h- 131 -117 (SEQ ID NO:548), Tar2h- 131 -120 (SEQ ID NO:549) Tar2h- 131 -121 (SEQ ID NO:550), Tar2h- 131 -122 (SEQ ID NO:551) , Tar2h- 131 -123 (SEQ ID NO:552), Tar2h- 131 -124 (SEQ ID NO:553) Tar2h- 131- 125 (SEQ ID NO:554), Tar2h- 131- 126 (SEQ ID NO:555) Tar2h- 131- 127 (SEQ ID NO:556), Tar2h- 131- 128 (SEQ ID NO:557) Tar2h- 131- 129 (SEQ ID NO:558), Tar2h- 131- 130 (SEQ ID NO:559) Tar2h- 131- 131 (SEQ ID NO:560), Tar2h- 131- 132 (SEQ ID NO:561) Tar21h-13" -136 (SEQ ID NO:562), Tar2h-131 -151 (SEQ ID NO:563) Tar2h- 131- 180 (SEQ ID NO:564), Tar2h- 131- 181 (SEQ ID NO:565) Tar2h- 131- 182 (SEQ ID NO:566) Tar2h- 131- 183 (SEQ ID NO:567) Tar2h- 131- 184 (SEQ ID NO:568) Tar2h- 131- 185 (SEQ ID NO:469) Tar2h- 131- 188 (SEQ ID NO:570) Tar2h- 131- 189 (SEQ ID NO:571) Tar2h- 131- 190 (SEQ ID NO:572) Tar2h- 131- 191 (SEQ ID NO:573) Tar2h- 131- 192 (SEQ ID NO:574) Tar2h- 131- 193 (SEQ ID NO:575) Tar2h- 131- 194 (SEQ ID NO:576) Tar2h- 131- 195 (SEQ ID NO:577) Tar2 - 131- 196 (SEQ ID NO:578) Tar2h- 131- 197 (SEQ ID NO:579) Tar2h- 131- 198 (SEQ TD NO:580) , Tar2 - 131 -500 (SEQ ID NO:581) Tar2h- 131- 501 (SEQ ID NO:582) Tar2h- 131- 502 (SEQ ID NO:583) Tar2h- 131- 503 (SEQ ID NO:584) Tar2h- 131- 504 (SEQ ID NO:585) Tar2h -131 -505 (SEQ ID NO:586) Tar2h -131 -506 (SEQ ID NO:587) Tar2h -131 -507 (SEQ ID NO:488) , Tar2h -131 -508 (SEQ ID NO:489) Tar2h -131 -509 (SEQ ID NO:590) , Tar2h -131 -510 (SEQ ID NO:591) , Tar2h -131 -511 (SEQ ID NO:592) , Tar2h -131 -512 (SEQ ID NO:593) , Tar2h -131 -513 (SEQ ID NO:594) , Tar2h -131 -514 (SEQ ID NO:595) , Tar2h -131 -515 (SEQ ID NO:596) , Tar2h -131 -516 (SEQ ID NO:597) , Tar2 -131 -517 (SEQ ID NO:598) , Tar2h -131 -518 (SEQ ID NO:599) , Tar2h -131 -519 (SEQ ID NO:600) , Tar2h -131 -520 (SEQ ID NO:601) , Tar2h -131 -521 (SEQ ID NO:602) , Tar2h -131 -522 (SEQ ID NO:603), Tar2h-131- 523 SEQ ID NO:604), Tar2h- 131 -524 (SEQ ID NO:605), Tar2h-131- 525 SEQ ID NO:606), Tar2h- 131 -526 (SEQ ID NO:607), Tar2h-131- 527 SEQ ID NO:608), Tar2h- 131 -528 (SEQ ID NO:609), Tar2h-131- 529 SEQ ID NO:610), Tar2h- 131 -530 (SEQ ID NO:611), Tar2h-131- 531 SEQ ID NO:612), Tar2h- 131 -532 (SEQ ID NO:613), Tar2h-131- 533 [SEQ ID NO:614), Tar2h- 132 -534 (SEQ ID NO:615), Tar2h-131- 535 [SEQ ID NO:616), Tar2h- 131 -536 (SEQ ID NO:617), Tar2h-131- 537 (SEQ ID NO:618), Tar2h- 131 -538 (SEQ ID NO:619), Tar2h-131- 539 (SEQ ID NO:620), Tar2h- 131 -540 (SEQ ID NO:621), Tar2h-131- 541 (SEQ ID NO:622), Tar2h- 131 -542 (SEQ ID NO:623), Tar2h-131- 543 (SEQ ID NO:624), Tar2h- 131 -544 (SEQ ID NO:625) Tar2h-131 ¦545 (SEQ ID NO:626), Tar2h- 131 -546 (SEQ ID NO-.627) Tar2h-131 ¦547 (SEQ ID NO:628), Tar2h- 131 -548 (SEQ ID NO:629) Tar2h-131 ¦549 (SEQ ID NO:630), Tar2h- 131 -550 (SEQ ID NO:631) Tar2h-131 -551 (SEQ ID NO:632), Tar2h- 131 -552 (SEQ ID NO:633) Tar2h-131 -553 (SEQ ID NO:634), Tar2h- 131 -554 (SEQ ID NO:635) Tar2h-131 -555 (SEQ ID NO:636), Tar2h- 131 -556 (SEQ ID NO:637) Tar2h-131 -557 (SEQ ID NO:638), Tar2h- 131 -558 (SEQ ID NO:639) Tar2h-131 -559 (SEQ ID NO:640), Tar2h- 131 -560 (SEQ ID NO:641) Tar2h-131 -561 (SEQ ID NO:642), Tar2h •131 -562 (SEQ ID NO:643) Tar2m-15 -2 (SEQ ID NO:645), Tar2m-15-5 (SEQ ID NO:646) Tar2m-15 -6 (SEQ ID NO:647), Tar2m-15-8 (SEQ ID NO:648) , Tar2m-15- 9 (SEQ ID NO:649), y Tar2m-15-12 (SEQ ID NO:650) . De preferencia, la identidad de secuencias de nucleótidos se determina sobre toda la longitud de la secuencia de nucleótidos que codifique el dAb anti-TNFFM seleccionado. La invención también proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención. En ciertas modalidades, el vector es un vector de expresión que comprende uno o más elementos o secuencias de control de expresión, que se enlazan operativamente con el ácido nucleico recombinante de la invención. La invención también proporciona una célula huésped recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante o vector de la invención. Los vectores adecuados (por ejemplo, plásmidos, fagémidos), elementos de control de expresión, células huésped, y los métodos para producir las células huésped recombinantes de la invención, son bien conocidos en este campo, y los ejemplos se describen adicionalmente en la presente. Los vectores de expresión adecuados pueden contener un número de componentes, por ejemplo, un origen de réplica, un gen marcador seleccionable, uno o más elementos de control de expresión, tales como un elemento de control de transcripción (por ejemplo, promotor, potenciador, terminador), y/o una o más señales de traducción, una secuencia de señal, o una secuencia líder, y similares. Los elementos de control de expresión y una secuencia de señal, si están presentes, pueden ser proporcionados por el vector o por otra fuente. Por ejemplo, se pueden utilizar las secuencias de control de transcripción y/o de traducción de un ácido nucleico clonado que codifique uná cadena de anticuerpo, para dirigir la expresión.
Se puede proporcionar un promotor para la expresión en una célula huésped deseada. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, un promotor se puede enlazar operativamente con un ácido nucleico que codifique un anticuerpo, una cadena de anticuerpo, o una porción del mismo, de tal manera que dirija la transcripción del ácido nucleico. Hay una variedad de promotores adecuados disponibles para los huéspedes procarióticos (por ejemplo, promotores lac, tac, T3, T7 para E. coli), y eucarióticos (por ejemplo, promotor temprano o tardío de virus de simio 40, promotor de repetición terminal larga de virus de sarcoma de Rous, promotor de citomegalovirus, promotor tardío de adenovirus). En adición, los vectores de expresión típicamente comprenden un marcador seleccionable para la selección de las células huésped que lleven el vector, y en el caso de un vector de expresión replicable, un origen de réplica. Los genes que codifican productos que confieren resistencia a antibióticos o a fármacos, son marcadores seleccionables comunes, y se pueden utilizar en células procarióticos (por ejemplo, gen de lactamasa (resistencia a ampicilina), gen Tet para resistencia a la tetraciclina), y eucarioticas (por ejemplo, genes de resistencia a neomicina (G418 o geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina, o higromicina). Los genes marcadores de reductasa de dihidrofolato permiten hacer la selección con metotrexato en una variedad de huéspedes. Los genes que codifican el producto genético de los marcadores auxotróficos del huésped (por ejemplo, LEU 2, URA3, HIS3), se utilizan con frecuencia como marcadores selecciónateles en levadura. El uso de vectores virales (por ejemplo, baculovirus) o de fagos, y de vectores que sean capaces de integrarse en el genoma de la célula huésped, tales como los vectores retrovirales, también está contemplado. Los vectores de expresión adecuados para la expresión en células de mamífero y en células procarióticas (E. coli), en células de insectos (células S2 de Drosophila Schnieder, Sf9), y levadura (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) , son bien conocidos en este campo. Las células huésped adecuadas pueden ser procarióticas, incluyendo células bacterianas, tales como E. coli, B. subtilis, y/u otras bacterias adecuadas; células eucarióticas, tales como células fúngicas o de levadura (por ejemplo, Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), u otras células eucarióticas inferiores, y células de eucariotes superiores, tales como aquéllas de insectos (por ejemplo, células S2 de Drosophila Schnieder, células de insecto Sf9 (Publicación Internacional Número WO 94/26087 (O'Connor)), mamíferos (por ejemplo, células COS, tales como COS-1 (ATCC, Acceso Número CRL-1650), y COS-7 (ATCC, Acceso Número CRL-1651), CHO (por ejemplo, ATCC, Acceso Número CRL-9096, CHO DG44 (Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Nati Acad. Sci. EUA, 77(7):4216-4220 (1980))), 293 (ATCC, Acceso Número CRL-1573), HeLa (ATCC, Acceso Número CCL-2), CV1 (ATCC, Acceso Número CCL-70), WOP (Dailey, L., y colaboradores, J. Virol, 54:139-149 (1985)), 3T3, 293T (Pear, W. S., y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 90:8392-8396 (1993)), células NSO, SP2/0, células HuT 78, y similares, o plantas (por ejemplo, tabaco). (Véase, por ejemplo, Ausubel, F. M. y colaboradores, editores, Current Protocole in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, Inc. (1993)). En algunas modalidades, la célula huésped es una célula huésped aislada, y no es parte de un organismo multicelular (por ejemplo, planta o animal). En las modalidades preferidas, la célula huésped es una célula huésped no humana. La invención también proporciona un método para producir un ligando (por ejemplo, ligando específico-doble, ligando multi-específico) de la invención, el cual comprende mantener una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico recombinante de la invención bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico recombinante, mediante lo cual, se expresa el ácido nucleico recombinante, y se produce un ligando. En algunas modalidades, el método comprende además aislar el ligando. Formatos de Ligandos. Los ligandos y los monómeros dAb se pueden formatear como anticuerpos mono- o multi-específicos, o fragmentos de anticuerpos, o en estructuras que no sean anticuerpos mono- o multi-específicas. Los formatos adecuados incluyen cualquier estructura de polipéptido adecuado en donde se pueda incorporar un dominio variable de anticuerpo o una o más de las regiones determinantes de complementariedad del mismo, para conferir especificidad de enlace para el antígeno sobre la estructura. En la técnica se conocen una variedad de formatos de anticuerpos adecuados, tales como los formatos de tipo IgG, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas y/o cadenas ligeras de anticuerpos, fragmentos de enlace de antígeno de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, un fragmento Fv (por ejemplo, Fv de una sola cadena (scFv), un Fv enlazado con disulfuro, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2), un solo dominio variable (por ejemplo, VH, VL, VHH). un dAb, y las versiones modificadas de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, modificadas mediante la unión covalente de polialquilenglicol (por ejemplo, po I i et i le n g I ico I , polipropilenglicol, polibutilenglicol), u otro polímero adecuado). Véase la Publicación del TCP Número PCT/GB03/002804, presentada el 30 de junio de 2003, la cual designada a los Estados Unidos (Publicación Internacional Número WO 2004/081026) con respecto a la PEGilación de dominios variables únicos y dAbs, métodos adecuados para su preparación, mayor vida media in vivo de los únicos dominios variables PEGilados, y monómeros y multímeros de dAb, PEGs adecuados, tamaños hidrodinámicos preferidos de los PEGs, y tamaños hidrodinámicos preferidos de los únicos dominios variables PEGilados, y monómeros y multímeros de dAb. Toda la enseñanza de la Publicación del TCP Número PCT/GB03/002804 (Publicación Internacional Número WO 2004/081026), incluyendo las porciones referidas anteriormente, se incorpora a la presente como referencia.
El ligando se puede formatear como un dímero, trímero, o polímero de los monómeros dAb deseados, por ejemplo utilizando un enlazador adecuado, tal como (Gly4Ser)n, en donde n = de 1 a 8, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, ó 7. Si se desea, los ligandos, incluyendo los monómeros, dímeros, y trímeros de dAb, se pueden enlazar a una región Fe de anticuerpo, que comprenda uno o ambos de los dominios CH2 y CH3, y opcionalmente una región de articulación. Por ejemplo, se pueden utilizar vectores que codifiquen los ligandos enlazados como una sola secuencia de nucleótidos a una región Fe para preparar estos polipéptidos. Los ligandos y los monómeros dAb también se pueden combinar y/o formatear en estructuras de múltiples ligandos que no sean anticuerpos, para formar complejos multivalentes, los cuales enlazan las moléculas objetivo con el mismo antígeno, proporcionando de esta manera una avidez superior. Por ejemplo, se pueden utilizar los receptores bacterianos naturales, tales como SpA, como los andamiajes para el injerto de las regiones determinantes de complementariedad, con el fin de generar ligandos que se enlacen específicamente a uno o más epítopos. Los detalles de este procedimiento se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 5,831,012. Otros andamiajes adecuados incluyen aquéllos basados en fibronectina y aficuerpos. Los detalles de los procedimientos adecuados se describen en la Publicación Internacional Número WO 98/58965. Otros andamiajes adecuados incluyen lipocalina y CTLA4, como se describen en van den Beuken y colaboradores, J. Mol. Biol. 310:591-601 (2001), y los andamiajes tales como los que se describen en la Publicación Internacional Número WO 00/69907 (Medical Research Council), los cuales se basan, por ejemplo, en la estructura de anillo de GroEL bacteriano, o en otros polipéptidos chaperones. Los andamiajes de proteínas se pueden combinar; por ejemplo, se pueden injertar las regiones determinantes de complementariedad sobre un andamiaje de CTLA4, y se pueden utilizar junto con los dominios VH ó VL de inmunoglobulina, para formar un ligando. De la misma manera, se pueden combinar la fibronectina, la lipocalina, y otros andamiajes. En la técnica se conocen una variedad de métodos adecuados para la preparación de cualquier formato deseado. Por ejemplo, se pueden preparar cadenas y formatos de anticuerpos (por ejemplo, formatos de tipo IgG, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas y/o cadenas ligeras de anticuerpos), mediante la expresión de las construcciones de expresión adecuadas y/o cultivos de células adecuadas (por ejemplo, hibridomas, heterohibridomas, células huésped recombinantes que contengan construcciones recombinantes que codifiquen el formato). Adicionalmente, se pueden preparar formatos tales como fragmentos de enlace de antígeno de los anticuerpos o de las cadenas de anticuerpos (por ejemplo, un fragmento Fv (por ejemplo, Fv de una sola cadena (scFv), un Fv enlazado con disulfuro, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2), mediante la expresión de las construcciones de expresión adecuadas, o mediante la digestión enzimática de los anticuerpos, por ejemplo utilizando papaína o pepsina. El ligando se puede formatear como un ligando específico-doble o como un ligando multi-específico, por ejemplo, como se describe en la Publicación Internacional Número WO 03/002609, las enseñanzas totales de la cual se incorporan a la presente como referencia. Los ligandos específicos-dobles comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulina que tengan diferentes especificidades de enlace. Estos ligandos específicos-dobles pueden comprender combinaciones de dominios de cadena pesada y ligera. Por ejemplo, el ligando específico-doble puede comprender un dominio VH y un dominio VL, los cuales se pueden enlazar entre sí en la forma de un scFv (por ejemplo, utilizando un enlazador adecuado, tal como Gly4Ser), o se pueden formatear en un anticuerpo biespecífico o en un fragmento de enlace de antígeno del mismo (por ejemplo, fragmento F(ab')2). Los ligandos específicos-dobles no comprenden pares de VH/VL complementarios que formen un sitio de enlace de antígeno de anticuerpo de dos cadenas convencional que se enlace con el antígeno o con el epítopo de una manera cooperativa. En su lugar, los ligandos de formato doble comprenden un par complementario de VH/VL, en donde los dominios V tienen diferentes especificidades de enlace. En adición, los ligandos específicos-dobles pueden comprender uno o más dominios CH ó CL si se desea. También se puede incluir un dominio de región de articulación si se desea. Estas combinaciones de dominios, por ejemplo, pueden imitar a los anticuerpos naturales, tales como IgG ó IgM, o fragmentos de los mismos, tales como moléculas de Fv, scFv, Fab, ó F(ab')2. Se pueden prever otras estructuras, tales como un solo brazo de una molécula de IgG comprendiendo dominios VH, VL, CH, CH1, y CL. De preferencia, el ligando específico-doble de la invención comprende solamente dos dominios variables, aunque se pueden incorporar varios de estos ligandos juntos en la misma proteína, por ejemplo, se pueden incorporar dos de estos ligandos en una IgG o en una inmunoglobulina multimérica, tal como IgM. De una manera alternativa, en otra modalidad, se combinan una pluralidad de ligandos específicos-dobles para formar un multímero. Por ejemplo, se combinan dos ligandos específicos-dobles diferentes para crear una molécula tetra-específica. Será apreciado por un experto en este campo, que las regiones variables ligera y pesada de un ligando específico-doble de acuerdo con el método de la presente invención, pueden estar sobre la misma cadena de polipéptido, o de una manera alternativa, sobre diferentes cadenas del polipéptido. En el caso de que las regiones variables estén sobre diferentes cadenas del polipéptido, entonces se pueden enlazar por medio de un enlazador, en general un enlazador flexible (tal como una cadena de polipéptido), un grupo de enlace químico, o cualquier otro método conocido en la materia. El ligando multiespecífico posee más de una especificidad de enlace de epítopo. En términos generales, el ligando multi-específico comprende dos o más dominios de enlace de epítopo, tales como dAbs o dominios de proteína que no son anticuerpos comprendiendo un sitio de enlace para un epítopo, por ejemplo un aficuerpo, un dominio SpA, un dominio de receptor de LDL clase A, un dominio de EGF, un avímero. Los ligandos multiespecíficos se pueden formatear además como se describe en la presente. En algunas modalidades, el ligando está en un formato de tipo IgG. Estos formatos tienen la estructura de cuatro cadenas convencional de una molécula de IgG (dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras), en donde una o más de las regiones variables (VH y/o VL) han sido reemplazadas con un dAb o con un solo dominio variable de una especificidad deseada. De una manera preferible, cada una de las regiones variables (dos regiones VH y dos regiones VL) es reemplazada con un dAb o con un solo dominio variable. Los dAb(s) o los dominios variables únicos que se incluyan en un formato de tipo IgG, pueden tener la misma especificidad o diferentes especificidades. En algunas modalidades, el formato de tipo IgG es tetravalente, y puede tener una, dos, tres, o cuatro especificidades. Por ejemplo, el formato de tipo IgG puede ser monoespecífico, y comprende cuatro dAbs que tienen la misma especificidad; biespecífico y comprende tres dAbs que tienen la misma especificidad, y otro dAb que tiene una especificidad diferente; biespecífico y comprende dos dAbs que tienen la misma especificidad, y dos dAbs que tienen una especificidad común pero diferente; triespecífico y comprende primero y segundo dAbs que tienen la misma especificidad, un tercer dAb con una especificidad diferente, y un cuarto dAb con una especificidad diferente de los primero, segundo, y tercero dAbs; o tetraespecífico, y comprende cuatro dAbs que cada uno tienen una especificidad diferente. Se pueden preparar fragmentos de enlace de antígeno de formatos de tipo IgG (por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, scFv). De una manera preferible, los formatos de tipo IgG o los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos no reticulan el TNFR1. Formatos de Vida Media Prolongada. Un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando, monómero, dímero, o multímero dAb, formato específico-doble, formato multi-específico), se puede formatear para prolongar su vida media en suero in vivo. La mayor vida media in vivo es útil en las aplicaciones in vivo de las inmunoglobulinas, en especial los anticuerpos, y más especialmente los fragmentos de anticuerpo de tamaño pequeño, tales como los dAbs. Estos fragmentos (Fvs, Fvs enlazados con disulfuro, Fabs, scFvs, dAbs) son eliminados rápidamente del cuerpo, lo cual puede limitar severamente sus aplicaciones clínicas.
Un antagonista de TNFR1 se puede formatear para tener un tamaño hidrodinámico más grande, por ejemplo, mediante la unión de un grupo polialquilenglicol (por ejemplo, un grupo polietilenglicol (PEG)), albúmina de suero, transferrina, receptor de transferrina, o cuando menos la porción de enlace de transferrina del mismo, una región Fe de anticuerpo, o mediante la conjugación con un dominio de anticuerpo. En algunas modalidades, el antagonista (por ejemplo, ligando, monómero dAb) está PEGilado. De preferencia, el antagonista PEGilado (por ejemplo, ligando, monómero dAb) se enlaza con TNFR1 con sustancialmente la misma afinidad que el mismo ligando que no esté PEGilado. Por ejemplo, el ligando puede ser un monómero dAb pegilado que se enlace, en donde el monómero dAb pegilado se enlaza con el TNFR1 con una afinidad que difiere de la afinidad del dAb en una forma no PEGilada por no más de un factor de aproximadamente 1,000, de preferencia no más de un factor de aproximadamente 100, más preferiblemente no más de un factor de aproximadamente 10, o con una afinidad sustancialmente no cambiada en relación con la forma no PEGilada.
Los antagonistas pequeños, tales como un monómero dAb, se pueden formatear como un fragmento de enlace de antígeno más grande de un anticuerpo, o como un anticuerpo (por ejemplo, formateado como un Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv). El tamaño hidrodinámico de un antagonista (por ejemplo, ligando, monómero dAb) y su vida media en suero, también se pueden aumentar conjugando o enlazando el antagonista con un dominio de enlace (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se enlace con un antígeno o epítopo que aumente la vida media in vivo, como se describe en la presente. Por ejemplo, los antagonistas (por ejemplo, ligando, monómero dAb) se pueden conjugar o enlazar con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-albúmina de suero o anti-receptor de Fe neonatal, por ejemplo, un dAb, Fab, Fab', ó scFv anti-albúmina de suero o anti-receptor de Fe neonatal, o con un aficuerpo anti-albúmina de suero, o con un aficuerpo anti-receptor de Fe neonatal. Los ejemplos de albúmina, fragmentos de albúmina, o variantes de albúmina adecuados para utilizarse en un ligando de enlace de TNFR1 de acuerdo con la invención, se describen en la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2, la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. En particular, se pueden utilizar las siguientes albúminas, fragmentos de albúmina, o variantes de albúmina en la presente invención: · SEQ ID NO:1 (como se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2, incorporándose explícitamente esta secuencia en la presente divulgación como referencia); • Fragmento o variante de albúmina que comprende o que consiste en los aminoácidos 1-387 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2; • Albúmina, o fragmento o variante de la misma, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en: (a) los aminoácidos 54 a 61 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2; (b) los aminoácidos 76 a 89 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2; (c) los aminoácidos 92 a 100 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2; (d) los aminoácidos 170 a 176 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2; (e) los aminoácidos 247 a 252 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2; (f) los aminoácidos 266 a 277 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2; (g) los aminoácidos 280 a 288 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2; (h) los aminoácidos 362 a 368 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2; (i) los aminoácidos 439 a 447 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2; (j) los aminoácidos 462 a 475 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2; (k) los aminoácidos 478 a 486 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2; y (I) los aminoácidos 560 a 566 de la SEQ ID NO:1 de la Publicación Internacional Número WO 2005/077042A2. Los ejemplos adicionales de albúmina, fragmentos, y análogos adecuados para utilizarse en un ligando de enlace de TNFR1 de acuerdo con la invención, se describen en la Publicación Internacional Número WO 03/076567A2, la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. En particular, se pueden utilizar las siguientes albúminas, fragmentos, o variantes, en la presente invención: • Albúmina de suero humano como se describe en la Publicación Internacional Número WO 03/076567A2, por ejemplo en la Figura 3 (incorporándose explícitamente esta información de secuencia en la presente divulgación como referencia); • Albúmina de suero humano (HA) consistente en una sola cadena de polipéptido no glicosilada de 585 aminoácidos con un peso molecular de la fórmula de 66,500 (véase Meloun y colaboradores, FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens y colaboradores, Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, y colaboradores, Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, y colaboradores, J. Biol. Chem.261:6147 (1986)); • Una variante polimórfica o análogo o fragmento de albúmina, como se describe en Weitkamp, y colaboradores, Ann. Hum. Genet.37:219 (1973); • Un fragmento o variante de albúmina como se describe en la Patente Europea Número EP 322094, por ejemplo HA(1-373), HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369), y HA(1-419), y los fragmentos entre 1-369 y 1-419; · Un fragmento o variante de albúmina como se describe en la patente Europea Número EP 399666, por ejemplo, HA(1-177) y HA(1-200), y los fragmentos entre HA(1-X), en donde X es cualquier número de 178 a 199. Cuando se utiliza (una o más) fracción para prolongar la vida media (por ejemplo, albúmina, transferrina, y fragmentos y análogos de las mismas) en los ligandos de enlace de TNFR1 de la invención, se puede conjugar utilizando cualquier método adecuado, tal como mediante fusión directa con la fracción de enlace de TNFR1 (por ejemplo, dAb anti-TNFR1 o fragmento de anticuerpo), por ejemplo utilizando una construcción de un solo nucleótido que codifique una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión sea codificada como una sola cadena de polipéptido, localizándose la fracción que prolonga la vida media N- ó C-terminalmente para la fracción de enlace de TNFR1. De una manera alternativa, la conjugación se puede lograr utilizando un enlazador de péptidos entre las fracciones, por ejemplo un enlazador de péptidos como se describe en las Publicaciones Internacionales Números WO 03/076567 A2 ó WO 2004/003019 (incorporándose estas divulgaciones de enlazadores como referencia en la presente descripción para proporcionar ejemplos para el uso en la presente invención). Típicamente, un polipéptido que mejora la vida media en suero in vivo, es un polipéptido que se presenta naturalmente in vivo, y que resiste la degradación o remoción mediante mecanismos endógenos que remuevan el material indeseado del organismo (por ejemplo, el ser humano). Por ejemplo, un polipéptido que mejore la vida media en suero in vivo se puede seleccionar a partir de proteínas de la matriz extracelular, proteínas encontradas en la sangre, proteínas encontradas en la barrera hematoencefálica o en el tejido neural, proteínas localizadas en el riñón, hígado, pulmón, corazón, piel, o huesos, proteínas de tensión, proteínas específicas de enfermedades, o proteínas involucradas en el transporte de Fe. Los polipéptidos adecuados que mejoran la vida media en suero in vivo incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión de ligando específico del receptor de transferrina-agente neurofarmacéutico (véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,977,307, cuyas enseñanzas se incorporan a la presente como referencia), receptor de células endoteliales capilares cerebrales, transferrina, receptor de transferrina (por ejemplo, receptor de transferrina soluble), insulina, receptor de factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF1), receptor de factor de crecimiento tipo insulina 2 (IGF2), receptor de insulina, factor de coagulación sanguínea X, a1-antitripsina, y HFN 1a. Los polipéptidos adecuados que mejoran la vida media en suero también incluyen la glicoproteína alfa-1 (orosomucoide; AAG), antiquimiotripsina alfa-1 (ACT), microglobulina alfa-1 (proteína HC; AIM), antitrombina III (AT III), apolipoproteína A1 (Apo A-1), apolipoproteína B (Apo B), ceruloplasmina (Cp), componente de complemento C3 (C3), componente de complemento C4 8C4), inhibidor de esterasa C1 (C1 INH), proteína C-reactiva (CRP), ferritina (FER), hemopexina (HPX), lipoproteína (A) (Lp(a)), proteína de enlace de mañosa (MBP), mioglobina (Myo), prealbúmina (transtiretina; PAL), proteína de enlace de retinol (RBP), y factor reumatoide (RF). Las proteínas adecuadas a partir de la matriz extracelular incluyen, por ejemplo, colágenos, lamininas, integrinas, y fibronectina. Los colágenos son las proteínas mayores de la matriz extracelular. Actualmente se conocen aproximadamente 15 tipos de moléculas de colágeno, encontradas en diferentes partes del cuerpo, por ejemplo colágeno tipo I (que cuenta por el 90 por ciento del colágeno corporal), encontrado en hueso, piel, tendón, ligamentos, córnea, órganos internos, o colágeno tipo II encontrado en cartílago, discos vertebrales, notocorda, y humor vitreo del ojo. Las proteínas adecuadas de la sangre incluyen, por ejemplo, proteínas de plasma (por ejemplo, fibrina, macroglobulina a-2, albúmina de suero, fibrinógeno (por ejemplo, fibrinógeno A, fibrinógeno B), proteína amiloide A de suero, haptoglobina, profilina, , ubiquitina, uteroglobulina, y microglobulina ß-2), enzimas e inhibidores de enzimas (por ejemplo, plasminógeno, lisozima, cistatina C, antitripsina alfa-1, e inhibidor de tripsina pancreático), proteínas del sistema inmune, tales como proteínas de inmunoglobulina (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, cadenas ligeras de inmunoglobulina (kappa/lambda)), proteínas de transporte (por ejemplo, proteína de enlace de retinol, microglobulina a-1), defensinas (por ejemplo, beta-defensina 1, defensina de neutrófilos 1, defensina de neutrófilos 2, y defensina de neutrófilos 3), y similares. Las proteínas adecuadas que se encuentran en la barrera hematoencefálica o en el tejido neural incluyen, por ejemplo, receptor de melanocortina, mielina, transportador de ascorbato, y similares. Los polipéptidos adecuados que mejoran la vida media en suero in vivo también incluyen las proteínas localizadas en el riñón (por ejemplo, policistina, colágeno tipo IV, transportador de anión orgánico K1 , antígeno de Heymann), proteínas localizadas en el hígado (por ejemplo, deshidrogenasa de alcohol, G250), proteínas localizadas en el pulmón (por ejemplo, componente secretor, que se enlaza con IgA), proteínas localizadas en el corazón (por ejemplo, HSP 27, que están asociado con la cardiomiopatía dilatada), proteínas localizadas en la piel (por ejemplo, queratina), proteínas específicas del hueso, tales como las proteínas morfogénicas (BMPs), las cuales son un subconjunto de la superfamilia de proteínas del factor de crecimiento transformante ß, que demuestran una actividad osteogénica (por ejemplo, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8), proteínas específicas de tumor (por ejemplo, antígeno de trofoblasto, receptor de herceptina, receptor de estrógeno, catepsinas (por ejemplo, catepsina B, que se puede encontrar en el hígado y en el bazo)). Las proteínas específicas de enfermedades adecuadas incluyen, por ejemplo, los antígenos expresados solamente en las células-T activadas, incluyendo LAG-3 (gen de activación de linfocitos), ligando de osteoprotegerina (OPGL; véase Nature 402, 304-309 (1999)), OX40 (un miembro de la familia de receptores de TNF, expresado sobre las células-T activadas, y específicamente aumentado en las células productoras de virus de leucemia de células-T tipo I (HTLV-I) humanas; véase Immunol. 165 (1):263-70 (2000)). Las proteínas específicas de las enfermedades adecuadas también incluyen, por ejemplo, metaloproteasas (asociadas con artritis, cánceres), incluyendo CG6512 de Drosophila, paraplegina humana, FtsH humana, AFG3L2 humana, ftsH de murino; y los factores de crecimiento angiogénico, incluyendo el factor de crecimiento de fibroblastos ácido (FGF-1), el factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF-2), el factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF), el factor de crecimiento transformante-a (TGF-a), el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), angiogenina, interleucina 3 (IL-3), interleucina 8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento placentario (PIGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas midquina-BB (PDGF), y f ractalquina. Los polipéptidos adecuados que mejoran la vida media en suero in vivo también incluyen las proteínas de tensión, tales como las proteínas de choque por calor (HSPs). Las proteínas de choque por calor normalmente se encuentran intracelularmente. Cuando se encuentran extracelularmente, esto es un indicador de que una célula ha muerto y ha derramado hacia afuera su contenido. Esta muerte celular no programada (necrosis) se presenta cuando, como un resultado de trauma, enfermedad, o lesión, las proteínas de choque por calor extracelulares desencadenan una respuesta a partir del sistema inmune. El enlace con la proteína de choque por calor extracelular puede dar como resultado la localización de las composiciones de la invención en el sitio de la enfermedad. Las proteínas adecuadas involucradas en el transporte de Fe incluyen, por ejemplo, receptor de Brambell (también conocido como FcRB). Este receptor de Fe tiene dos funciones, ambas de las cuales son potencialmente útiles para el suministro. Las funciones son: (1) transporte de IgG desde la madre hasta el niño a través de la placenta; (2) protección de IgG de la degradación, prolongando de esta manera su vida media en suero. Se piensa que el receptor recicla la IgG de los endosomas. (Véase, Holliger y colaboradores, Nat. Biotechnol. 15(7):632-6 (1997)). Los métodos para el análisis farmacocinético y la determinación de la vida media del ligando, serán familiares para los expertos en este campo. Se pueden encontrar los detalles en Kenneth, A. y colaboradores: Chemical Stability of Pharmaceuticals; A Handbook for Pharmacists; y en Peters y colaboradores, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi y D. Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a Revisión, edición extra (1982), el cual describe los parámetros farmacocinéticos, tales como las vidas medidas de t-alfa y t-beta, y el área debajo de la curva (AUC). Preparación de Ligandos Basados en Inmunoglobulina. Los agentes de enlace, antagonistas, ligandos, dAbs, como se describen en la presente, de acuerdo con la invención, se pueden preparar de conformidad con las técnicas previamente establecidas, utilizadas en el campo de la ingeniería de anticuerpos, para la preparación de scFv, anticuerpos de "fagos", y otras moléculas de anticuerpos diseñadas. Las técnicas para la preparación de anticuerpos se describen, por ejemplo, en las siguientes revisiones y en las citas referenciadas en las mismas: Winter y Milstein, (1991) Nature 349:293-299; Plucktbun (1992) Immunological Reviews 130:151-188; Wright y colaboradores, (1992) Crit. Rev. Immunol. 12:125-168; Holliger, P. y Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4, 446-449; Cárter, y colaboradores, (1995) J. Hematother. 4, 463-470; Chester, K. A. y Hawkins, R . E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom, H. R. (1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D. (1997) Nature Biotechnol. 15, 618-619; Plückthun, A. y Pack, P. (1997) Immunotechnology 3, 83-105; Cárter, P. y Merchant, A. M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 449-454; Holliger, P. y Winter, G. (1997) Cáncer Immunol. Immunother.45,128-130. Las técnicas adecuadas empleadas para la selección de dominios variables de anticuerpos con una especificidad deseada, emplean bibliotecas y procedimientos de selección que son conocidos en la técnica. Las bibliotecas naturales (Marks y colaboradores (1991) J. Mol. Biol., 222:581; Vaughan y colaboradores (1996) Nature Biotech., 14:309), que utilizan genes V reconfigurados cosechados de células-B humanas, son bien conocidas por los expertos en este campo. Las bibliotecas sintéticas (Hoogenboom y Winter (1992) J. Mol. Biol., 227:381; Barbas y colaboradores (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 89:4457; Nissim y colaboradores (1994) EMBO J., 13:692; Griffiths y colaboradores (1994) EMBO J., 13:3245; De Kruif y colaboradores (1995) J. Mol. Biol, 248:97), se preparan mediante la clonación de genes de inmunoglobulina V, usualmente utilizando reacción en cadena de la polimerasa. Los errores en el proceso de la reacción en cadena de la polimerasa pueden conducir a un alto grado de selección aleatoria. Las bibliotecas de VH y/o VL se pueden seleccionar contra los antígenos o epítopos objetivo por separado, en cuyo caso, se selecciona directamente el enlace de un solo dominio, o juntos. Sistemas de Vectores de Biblioteca. En la técnica se conocen una variedad de sistemas de selección que son adecuados para utilizarse en la presente invención. Los ejemplos de estos sistemas se describen en seguida.
Los sistemas de expresión de bacteriófagos-lambda se pueden rastrear directamente como placas de bacteriófagos o como colonias de lisógenos, tanto como se describe anteriormente (Huse y colaboradores, (1989) Science, 246:1275; Catón y Koprowski (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 87; Mullinax y colaboradores (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 87:8095; Persson y colaboradores (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 88:2432), y son útiles en la invención. Aunque estos sistemas de expresión se pueden utilizar para rastrear hasta 106 miembros diferentes de una biblioteca, no son fácilmente adecuados para el rastreo de mayores números (mayores de 106 miembros). Es de un uso particular la construcción de bibliotecas en sistemas de exhibición de selección, que hacen posible que se enlace un ácido nucleico al polipéptido que expresa. Como se utiliza en la presente, un sistema de exhibición de selección es un sistema que permite la selección, por medios de exhibición adecuados, de los miembros individuales de la biblioteca, mediante el enlace de los ligandos genéricos y/u objetivo. Los protocolos de selección para el aislamiento de los miembros deseados de bibliotecas grandes son conocidos en este campo, como es tipificado por las técnicas de exhibición de fagos. Estos sistemas, en donde se exhiben diversas secuencias de péptidos sobre la superficie del bacteriófago filamento (Scott y Smith (1990) Science, 249:386), han probado ser útiles para la creación de bibliotecas de fragmentos de anticuerpos (y las secuencias de nucleótidos que los codifican), para la selección y amplificación in vitro de fragmentos de anticuerpos específicos que se enlacen con un antígeno objetivo (McCafferty y colaboradores, Publicación Internacional Número WO 92/01047). Las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables se enlazan con los fragmentos genéticos que codifican las señales líder que los dirigen hacia el espacio periplásmico de E. coli, y como un resultado, los fragmentos de anticuerpos resultantes se exhiben sobre la superficie del bacteriófago, típicamente como fusiones con las proteínas de recubrimiento del bacteriófago (por ejemplo, plll ó P V 111 ) . De una manera alternativa, los fragmentos de anticuerpos se exhiben externamente sobre las capsidas del fago lambda (fagocuerpos). Una ventaja de los sistemas de exhibición basados en fagos es que, debido a que son sistemas biológicos, los miembros de la biblioteca seleccionados se pueden amplificar simplemente hacia crecer el fago que contenga al miembro de la biblioteca seleccionado, en células bacterianas. Adicionalmente, debido a que la secuencia de nucleótidos que codifica al miembro de la biblioteca de polipéptido está contenida sobre un fago o sobre un vector fagémido, la secuenciación, la expresión, y la siguiente manipulación genética, son relativamente directas. Los métodos para la construcción de bibliotecas de exhibición de anticuerpos de bacteriófagos y de las bibliotecas de expresión de fagos lambda son bien conocidos en la materia (McCafferty y colaboradores (1990) Nature, 348:552; Kang y colaboradores (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 88:4363; Clackson y colaboradores (1991) Nature, 352:624; Lowman y colaboradores (1991) Biochemistry, 30:10832; Burton y colaboradores (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 88:10134; Hoogenboom y colaboradores (1991) Nucleic Acids Res., 19:4133; Chang y colaboradores (1991) J. Immunol, 147:3610; Breitling y colaboradores (1991) Gene, 104:147; Marks y colaboradores (1991) supra; Barbas y colaboradores (1992) supra; Hawkins y Winter (1992) J. Immunol, 22:867; Marks y colaboradores 1992, J. Biol. Chem., 267:16007; Lerner y colaboradores (1992) Science, 258:1313, incorporados a la presente como referencia). Un planteamiento particularmente conveniente ha sido el uso de bibliotecas de fagos scFv Huston y colaboradores, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci EUA, 85:5879-5883; Chaudhary y colaboradores (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA., 87:1066-1070; McCafferty y colaboradores (1990) supra; Clackson y colaboradores (1991) Nature, 352:624; Marks y colaboradores (1991) J. Mol. Biol, 222:581; Chiswell y colaboradores (1992) Trends Biotech., 10:80; Marks y colaboradores (1992) J. Biol. Chem., 267). Se han descrito diferentes modalidades de bibliotecas de scFv exhibidas sobre proteínas de recubrimiento de bacteriófagos. También se conocen refinamientos de los planteamientos de de exhibición de fagos, por ejemplo, como se describen en las Publicaciones Internacionales Números WO96/06213 y WO92/01047 (Medical Research Council y colaboradores.) y WO97/08320 (Morphosys), las cuales se incorporan a la presente como referencia. Otros sistemas para generar bibliotecas de polipéptidos involucran el uso de maquinaria enzimática sin células para la síntesis in vitro de los miembros de la biblioteca. En un método, se seleccionan moléculas de ARN mediante rondas alternadas de selección contra un ligando objetivo y amplificación con reacción en cadena de la polimerasa (Tuerk y Gold (1990) Science, 249:505; Ellington y Szostak (1990) Nature, 346:818). Se puede emplear una técnica similar para identificar las secuencias de ADN que se enlacen con un factor de transcripción humano previamente determinado (Thiesen y Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18:3203; Beaudry y Joyce (1992) Science, 257:635; Publicaciones Internacionales Números WO92/05258 y W092/14843) . De una manera similar, se puede utilizar la traducción in vitro para sintetizar los polipéptidos como un método para la generación de bibliotecas grandes. Estos métodos generalmente comprenderán complejos de polisomas estabilizados, que se describen adicionalmente en las Publicaciones Internacionales Números WO88/08453, WO90/05785, WO90/07003, WO91/02076, WO91/05058, y WO92/02536. Los sistemas de exhibición alternativos que no están basados en fagos, tales como los que se dan a conocer en las Publicaciones Internacionales Números W095/22625 y W095/11922 (Affymax), utilizan los polisomas para exhibir los polipéptidos para la selección.
Una categoría todavía adicional de técnicas involucra la selección de repertorios en compartimientos artificiales, los cuales permiten el enlace de un gen con su producto genético. Por ejemplo, un sistema de selección en donde se pueden seleccionar ácidos nucleicos que codifiquen productos genéticos deseables en microcápsulas formadas por emulsiones de agua en aceite, se describe en las Publicaciones Internacionales Números WO99/02671 y WO00/40712, y en Tawfik y Griffiths (1998) Nature Biotechnol. 16(7), 652-6. Los elementos genéticos que codifican un producto genético que tiene una actividad deseada, se compartimentalizan en microcápsulas, y luego se transcriben y/o se traducen para producir sus productos genéticos respectivos (ARN o proteína) dentro de las microcápsulas. Subsiguientemente se clasifican los elementos genéticos que producen el producto genético que tiene la actividad deseada. Este planteamiento selecciona los productos genéticos de interés mediante la detección de la actividad deseada por una variedad de medios.
Construcción de Bibliotecas. Las bibliotecas pretendidas para la selección se pueden construir empleando las técnicas conocidas en este campo, por ejemplo como se estipula anteriormente, o se pueden adquirir de las fuentes comerciales. Las bibliotecas que son útiles en la presente invención se describen, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO99/20749. Una vez que se selecciona un sistema de vector, y que se clonan una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen los polipéptidos de interés en el vector de la biblioteca, se puede generar diversidad dentro de las moléculas clonadas emprendiendo la mutagénesis antes de la expresión; de una manera alternativa, las proteínas codificadas se pueden expresar y seleccionar, como se describe anteriormente, antes de la mutagénesis, y se llevan a cabo rondas adicionales de selección. La mutagénesis de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos estructuralmente optimizados se lleva a cabo mediante métodos moleculares convencionales. Es particularmente útil la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR (Mullís y Faloona (1987) Methods Enzymol., 155:335, incorporado a la presente como referencia). La reacción en cadena de la polimerasa, que utiliza múltiples ciclos de réplica de ADN catalizada por una polimerasa de ADN termoestable y dependiente del ADN, para amplificar la secuencia objetivo de interés, es bien conocida en la materia. Se ha discutido la construcción de diferentes bibliotecas de anticuerpos en Winter y colaboradores (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55, y las referencias citadas en el mismo. La reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo utilizando un ADN de plantilla (cuando menos 1 fg; más útilmente de 1 a 1,000 ng), y cuando menos 25 picomoles de cebadores de oligonucleótidos; puede ser conveniente utilizar una mayor cantidad de cebador, cuando la reserva de cebador es pesadamente heterogénea, debido a que cada secuencia está representada solamente por una pequeña fracción de las moléculas de la reserva, y las cantidades llegan a ser limitantes en los ciclos de amplificación posteriores. Una mezcla de reacción típica incluye: 2 microlitros de ADN, 25 picomoles de cebador de oligonucleótido, 2.5 microlitros de regulador de PCR 10X 1 (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0.4 microlitros de dNTP 1.25 µ , 0.15 microlitros (ó 2.5 unidades) de polimerasa de ADN Taq (Perkin-Elmer, Foster City, CA), y agua desionizada hasta un volumen total de 25 microlitros. Se sobrepone aceite mineral, y se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa utilizando un ciclador térmico programable. La duración y la temperatura de cada paso de un ciclo de reacción en cadena de la polimerasa, así como el número de ciclos, se ajustan de acuerdo con los requerimientos de restringencia en efecto. La temperatura y el tiempo de templado se determinan tanto por la eficiencia con la cual se espera que se temple un cebador a una plantilla, como por el grado de mal emparejamiento que se vaya a tolerar; obviamente, cuando se amplifican y se mutan simultáneamente las moléculas de ácidos nucleicos, se requiere un mal emparejamiento, cuando menos en la primera ronda de síntesis. La capacidad para optimizar la restringencia de las condiciones de templado de cebadores está bien dentro del conocimiento de un experto moderado en este campo. Se utiliza una temperatura de templado de entre 30°C y 72°C. La desnaturalización inicial de las moléculas de la plantilla normalmente se presenta entre 92°C y 99°C durante 4 minutos, seguidos por 20 a 40 ciclos consistentes en desnaturalización (94°C a 99°C durante 15 segundos hasta 1 minuto), templado (la temperatura se determina como se discute anteriormente; de 1 a 2 minutos), y extensión (72°C durante 1 a 5 minutos, dependiendo de la longitud del producto amplificado). La extensión final generalmente se hace durante 4 minutos a 72°C, y puede ser seguida por un paso indefinido (de 0 a 24 horas) a 4°C. Combinación de Dominios Variables Únicos. Los dominios útiles en la invención, una vez seleccionados, se pueden combinar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo los métodos covalentes y no covalentes. Los métodos preferidos incluyen el uso de enlazadores de polipéptidos, como se describen, por ejemplo, en relación con las moléculas de scFv (Bird y colaboradores (1988) Science 242:423-426). La discusión de los enlazadores adecuados se proporciona en Bird y colaboradores, Science 242, 423-426; Hudson y colaboradores, Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudson y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 85, 5879-5883. Los enlazadores de preferencia son flexibles, permitiendo que interactúen los dos dominios únicos. Un ejemplo de enlazador es un enlazador (Gly4Ser)n, en donde n = de 1 a 8, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, ó 7. Los enlazadores utilizados en los diacuerpos, que son menos flexibles, también se pueden emplear (Holliger y colaboradores, (1993) PNAS (EUA) 90:6444-6448). En una modalidad, el enlazador empleado no es una región de articulación de inmunoglobulina. Los dominios variables se pueden combinar empleando métodos diferentes de los enlazadores. Por ejemplo, se puede explotar el uso de los puentes de disulfuro, proporcionados a través de los residuos de cisteína que se presentan naturalmente o diseñados, para estabilizar los dímeros VH-VH, VL-VL, ó VH-VL (Reiter y colaboradores), o mediante la remodelación de la interfase entre los dominios variables para mejorar el "ajuste", y por lo mismo, la estabilidad de la interacción (Ridgeway y colaboradores, (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhu y colaboradores (1997) Protein Science 6:781-788). Se pueden emplear otras técnicas para unir o estabilizar los dominios variables de inmunoglobulinas, y en particular los dominios VH de anticuerpos, como sea apropiado. Caracterización de Ligandos. El enlace de un ligando (por ejemplo, monómero dAb, ligando específico-doble) con sus antígenos o epítopos específicos, se puede probar mediante métodos que serán familiares para los expertos en la materia, e incluyen un ELISA. En una modalidad preferida de la invención, el enlace se prueba utilizando un ELISA de fagos monoclonales. El ELISA de fagos se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier procedimiento adecuado: en seguida se estipula un protocolo de ejemplo. Las poblaciones de fagos producidas en cada ronda de selección se pueden rastrear para determinar el enlace mediante ELISA con el antígeno o epítopo seleccionado, con el fin de identificar los anticuerpos de fagos "policlonales". Entonces se pueden rastrear los fagos a partir de las colonias bacterianas infectadas individuales de estas poblaciones mediante ELISA, con el fin de identificar los anticuerpos de fagos "monoclonales". También es deseable rastrear los fragmentos de anticuerpos solubles para determinar el enlace con el antígeno o epítopo, y esto también se puede emprender mediante ELISA, utilizando reactivos, por ejemplo contra una marca C- ó N-terminal (véase, por ejemplo, Winter y colaboradores (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55, y las referencias citadas en el mismo). También se puede evaluar la diversidad de los anticuerpos monoclonales de fagos seleccionados mediante electroforesis en gel de productos de reacción en cadena de la polimerasa (Marks y colaboradores, 1991, supra; Nissim y colaboradores, 1994, supra), mediante sondeo (Tomlinson y colaboradores (1992) J. Mol. Biol. 227, 776), o mediante secuenciación del ADN del vector. Estructura de los Ligandos. En el caso de que se seleccionen los dominios variables a partir de los repertorios de genes-V seleccionados, por ejemplo, utilizando la tecnología de exhibición de fagos como se describe en la presente, entonces estos dominios variables comprenden una región de estructura universal, de tal manera que pueden ser reconocidos por un ligando genérico específico como se define en la presente. El uso de estructuras universales, ligandos genéricos, y similares, se describe en la Publicación Internacional Número WO99/20749. Cuando se utilizan repertorios de genes-V, la variación en la secuencia del polipéptido de preferencia se localiza dentro de los ciclos estructurales de los dominios variables. Las secuencias de polipéptidos de cualquier dominio variable se pueden alterar mediante mezcla de ADN o mediante mutación, con el objeto de mejorar la interacción de cada dominio variable con su par complementario. La mezcla de ADN es conocida en la técnica, y es enseñada, por ejemplo, por Stemmer, 1994, Nature 370:389-391, y en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,297,053, ambos de los cuales se incorporan a la presente como referencia. Otros métodos de mutagénesis son bien conocidos por los expertos en este campo. En general, las moléculas de ácidos nucleicos y las construcciones de vectores requeridas para la selección, preparación, y formateo de ligandos, se pueden construir y manipular como se estipula en los manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, EUA. La manipulación de los ácidos nucleicos útiles en la presente invención típicamente se lleva a cabo en vectores recombinantes. Como se utiliza en la presente, el vector se refiere a un elemento separado que se utiliza para introducir el ADN heterólogo en las células para la expresión y/o réplica del mismo. Los métodos mediante los cuales se seleccionan o se construyen, y subsiguientemente se utilizan estos vectores, son bien conocidos por un experto ordinario en la materia. Numerosos vectores están públicamente disponibles, incluyendo plásmidos bacterianos, bacteriófagos, cromosomas artificiales, y vectores episomales. Estos vectores se pueden utilizar para simple clonación y mutagénesis; de una manera alternativa, se emplea el vector de expresión genética. Un vector útil de acuerdo con la invención se puede seleccionar para acomodar una secuencia de codificación de polipéptido de un tamaño deseado, típicamente de 0.25 kilobases (kb) a 40 kilobases o más de longitud. Una célula huésped adecuada se transforma con el vector después de las manipulaciones de clonación in vitro. Cada vector contiene diferentes componentes funcionales, los cuales incluyen en general un sitio de clonación (o "polienlazador"), un origen de réplica, y cuando menos un gen marcador seleccionable. Si el vector dado es un vector de expresión, adicionalmente posee uno o más de los siguientes: elemento potenciador, secuencias promotoras, de terminación de transcripción, y de señales, cada uno colocado en la vecindad del sitio de clonación, de tal manera que se enlazan operativamente con el gen que codifica un ligando de acuerdo con la invención.
Los vectores tanto de clonación como de expresión generalmente contienen secuencias de ácidos nucleicos que hacen posible que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Típicamente, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que hace posible que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico huésped, e incluye orígenes de réplica o secuencias de réplica autónoma. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras, y virus. El origen de réplica a partir del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gram-negativas, el origen del plásmido de 2 mieras es adecuado para la levadura, y diferentes orígenes virales (por ejemplo, SV40, adenovirus) son útiles para la clonación de vectores en células de mamífero. En términos generales, no se necesita el origen de réplica para los vectores de expresión de mamíferos, a menos que éstos se utilicen en células de mamífero capaces de replicar altos niveles de ADN, tales como las células COS. De una manera conveniente, un vector de clonación o de expresión puede contener un gen de selección, también referido como un marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la sobrevivencia o el crecimiento de las células huésped transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contenga el gen de selección, por consiguiente, no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, deficiencias auxotróficas de complemento, o suministran los nutrientes críticos no disponibles en el medio de cultivo. Debido a que la réplica de los vectores que codifican un ligando de conformidad con la presente invención se lleva a cabo más convenientemente en E. coli, es útil un marcador seleccionable de E. coli, por ejemplo, el gen de ß-lactamasa que confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Éstos se pueden obtener a partir de plásmidos de E. coli, tales como pBR322, o un plásmido pUC, tal como pUC18 ó pUC19. Los vectores de expresión normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped, y que está operativamente enlazado con la secuencia de codificación de interés. Este promotor puede ser inducible o constitutivo. El término "operativamente enlazado" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de su manera pretendida. Una secuencia de control "operativamente enlazada" a una secuencia de codificación se liga de tal manera que se logra la expresión de la secuencia de codificación bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Los promotores adecuados para utilizarse con huésped procarióticos incluyen, por ejemplo, los sistemas promotores de ß-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptófano (trp), y los promotores híbridos, tales como el promotor tac. Los promotores para utilizarse en los sistemas bacterianos también contendrán en general una secuencia de Shine-Delgarno operativamente enlazada con la secuencia de codificación. Los vectores preferidos son los vectores de expresión que hacen posible la expresión de una secuencia de nucleótidos correspondiente a un miembro de la biblioteca de polipéptidos. Por consiguiente, la selección con el primero y/o el segundo antígeno o epítopo, se puede llevar a cabo mediante propagación separada y expresión de un solo clon que exprese al miembro de la biblioteca de polipéptidos, o mediante el uso de cualquier sistema de exhibición de selección. Como se describe anteriormente, el sistema de exhibición de selección preferido es la exhibición de bacteriófagos. Por lo tanto, se pueden utilizar vectores de fagos o fagémidos, por ejemplo p IT 1 ó plT2. Las secuencias líder útiles en la invención incluyen pelB, stll, ompA, phoA, bla, y pelA. Un ejemplo es el de los vectores de fagémidos que tienen un origen de réplica de E. coli (para la réplica de doble cadena), y también un origen de réplica de fago (para la producción del ADN de una sola cadena). La manipulación y expresión de estos vectores son bien conocidas en la técnica (Hoogenboom y Winter (1992), supra; Nissim y colaboradores (1994), supra). Dicho de una manera breve, el vector contiene un gen de ß-lactamasa para conferir selectividad en el fagémido, y un promotor lac corriente arriba de un cásete de expresión que consiste (N- a C-terminal) en una secuencia líder de pelB (que dirige el polipéptido expresado hacia el espacio periplásmico), un sitio de clonación múltiple (para la clonación de la versión de nucleótido del miembro de la biblioteca), opcionalmente una o más marcas de péptidos (para la detección), opcionalmente uno o más codones de paro TAG, y la proteína del fago plll. Por consiguiente, utilizando diferentes cepas supresoras y no supresoras de E. coli, y con la adición de glucosa, tioisopropil-p-D-galactosida (IPTG), o un fago auxiliar, tal como VCS M13, el vector es capaz de replicarse como un plásmido sin expresión, de producir grandes cantidades del miembro de polipéptido de la biblioteca solamente, o de producir fagos, algunos de los cuales contienen cuando menos una copia de la fusión del polipéptido-pl 11 sobre su superficie. La construcción de vectores que codifican ligandos de acuerdo con la invención emplea técnicas de ligamiento convencionales. Los vectores aislados o los fragmentos de ADN se disocian, se hacen a la medida, y se vuelven a ligar en la forma deseada para generar el vector requerido. Si se desea, se puede llevar a cabo un análisis para confirmar que estén presentes las secuencias correctas en el vector construido, de una forma conocida. Los métodos adecuados para construir vectores de expresión, para preparar transcripciones in vitro, para introducir ADN en células huésped, y para llevar a cabo análisis con el fin de evaluar la expresión y la función, son conocidos por los expertos en este campo. La presencia de una secuencia genética en una muestra se detecta, o su amplificación y/o expresión se cuantifica, mediante métodos convencionales, tales como análisis Southern o Northern, Western blot, mancha puntual de ADN, ARN o proteína, hibridación in situ, inmunocitoquímica o análisis de secuencias de ácidos nucleicos o de moléculas de proteínas. Los expertos en la materia preverán fácilmente la manera en que se pueden modificar estos métodos, si se desea. Esqueletos Los esqueletos se pueden basar en moléculas de inmunoglobulina, o pueden ser de un origen que no sea de inmunoglobulina, como se estipula anteriormente. Los esqueletos de inmunoglobulina preferidos, como se definen en la presente, incluyen cualquiera o más de aquéllos seleccionados a partir de los siguientes: una molécula de inmunoglobulina que comprende cuando menos: (i) el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo; o (ii) el dominio CH1 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1 y CH2 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1, CH2, y CH3 de una cadena pesada de anticuerpo; o cualquiera del subconjunto (ii) en conjunto con el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo. También se puede incluir un dominio de región de articulación. Estas combinaciones de dominios, por ejemplo, pueden imitar a los anticuerpos naturales, tales como IgG ó IgM, o fragmentos de los mismos, tales como moléculas de Fv, scFv, Fab, ó F(ab')2. Los expertos en la materia estarán conscientes de que esta lista no pretende ser exhaustiva.
Andamiajes de Proteínas Cada dominio de enlace de epítopo comprende un andamiaje de proteína y una o más regiones determinantes de complementariedad que están involucradas en la interacción específica del dominio con uno o más epítopos. De una manera conveniente, un dominio de enlace de epítopo de acuerdo con la presente invención comprende tres regiones determinantes de complementariedad. Los andamiajes de proteína adecuados incluyen cualquiera de aquéllos seleccionados a partir del grupo que consiste en los siguientes: aquéllos basados en dominios de inmunoglobulina, aquéllos basados en f ibronectina, aquéllos basados en aficuerpos, aquéllos basados en CTL4, aquéllos basados en chaperones tales como GroEL, aquéllos basados en lipocalina, y aquéllos basados en los receptores de Fe bacterianos SpA y SpD. Los expertos en este campo apreciarán que esta lista no pretende ser exhaustiva. Andamiajes para Utilizarse en la Construcción de Ligandos. Selección de la Conformación de la Cadena Principal. Los miembros de la súper-familia de inmunoglobulina comparten todos un pliegue similar para su cadena de polipéptido. Por ejemplo, aunque los anticuerpos son altamente diversos en términos de su secuencia primaria, la comparación de secuencias y estructuras cristalográficas ha revelado que, contrariamente a la expectativa, cinco de los seis ciclos de enlace de antígeno de los anticuerpos (H1, H2, L1, L2, L3) adoptan un número limitado de conformaciones de la cadena principal, o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol Biol, 196:901; Chothia y colaboradores (1989) Nature, 342:877). Por consiguiente, el análisis de las longitudes de ciclos y los residuos clave ha hecho posible la predicción de las conformaciones de la cadena principal de H1, H2, L1, L2, y L3 encontradas en la mayoría de los anticuerpos humanos (Chothia y colaboradores (1992) J. Mol Biol., 227:799; Tomlinson y colaboradores (1995) EMBO J., 14:4628; Williams y colaboradores (1996) J. Mol. Biol., 264:220). Aunque la región H3 es mucho más diversa en términos de la secuencia, la longitud, y la estructura (debido al uso de los segmentos D), también forma un número limitado de conformaciones de la cadena principal para las longitudes cortas de ciclos que dependen de la longitud y de la presencia de residuos particulares, o de tipos de residuos, en las posiciones clave en el ciclo y en la estructura del anticuerpo (Martin y colaboradores (1996) J. Mol. Biol, 263:800; Shirai y colaboradores (1996) FEBS Letters, 399:1). Se pueden diseñar bibliotecas de ligandos y/o dominios en donde se hayan seleccionado ciertas longitudes de ciclos y residuos clave para asegurar que se conozca la conformación de la cadena principal de los miembros. De una manera conveniente, éstas son conformaciones reales de moléculas de la súper-familia de inmunoglobulina encontradas en la naturaleza, para minimizar las oportunidades de que no sean funcionales, como se discute anteriormente. Los segmentos del gen-V de la línea germinal sirven como una estructura básica adecuada para la construcción de las bibliotecas de anticuerpos o de receptores de células-T; también son útiles otras secuencias. Se pueden presentar variaciones a una baja frecuencia, de tal manera que un pequeño número de miembros funcionales puedan poseer una conformación de la cadena principal alterada, que no afecte su función. La teoría de la estructura canónica también es útil para evaluar el número de diferentes conformaciones de la cadena principal codificadas por los ligandos, para predecir la conformación de la cadena principal basándose en las secuencias de ligandos, y para seleccionar los residuos para la diversificación, que no afecten a la estructura canónica. Se sabe que, en el dominio VK humano, el ciclo L1 puede adoptar una de cuatro estructuras canónicas, el ciclo L2 tiene una sola estructura canónica, y que el 90 por ciento de los dominios VK humanos adoptan una de cuatro o cinco estructuras canónicas para el ciclo L3 (Tomlinson y colaboradores (1995), supra); por consiguiente, en el dominio VK solamente, se pueden combinar diferentes estructuras canónicas para crear un número de diferentes conformaciones de la cadena principal. Dado que el dominio VA codifica un número diferente de estructuras canónicas para los ciclos L1, L2, y L3, y que los dominios VK y VA pueden emparejarse con cualquier dominio VH que pueda codificar varias estructuras canónicas para los ciclos H1 y H2, el número de combinaciones de estructuras canónicas observado para estos cinco ciclos es muy grande. Esto implica que la generación de diversidad en la conformación de la cadena principal puede ser esencial para la producción de un amplio número de especificidades de enlace. Sin embargo, mediante la construcción de una biblioteca de anticuerpos basada en una sola conformación de la cadena principal conocida, se ha encontrado, contrariamente a la expectativa, que no se requiere diversidad en la conformación de la cadena principal para generar suficiente diversidad para dirigirse sustancialmente a todos los antígenos. Todavía más sorprendente es que la única conformación de la cadena principal no necesita ser una estructura en consenso -una sola conformación que se presenta naturalmente se puede utilizar como la base para una biblioteca entera. Por consiguiente, en un aspecto preferido, los ligandos específicos-dobles de la invención poseen una sola conformación de la cadena principal conocida. La única conformación de la cadena principal que se selecciona de preferencia es común entre las moléculas del tipo de la súper-familia de inmunoglobulina en cuestión. Una conformación es común cuando se observa que la adoptan un número significativo de moléculas que se presentan naturalmente. De conformidad con lo anterior, en un aspecto preferido de la invención, la presentación natural de las diferentes conformaciones de cadena principal para cada ciclo de enlace de un dominio de inmunoglobulina se considera por separado, y entonces se selecciona un dominio variable que se presenta naturalmente que posea la combinación deseada de conformaciones de la cadena principal para los diferentes ciclos. Si no hay ninguna disponible, se puede seleccionar el equivalente más cercano. Es preferible que la combinación deseada de conformaciones de la cadena principal para los diferentes ciclos sea creada mediante la selección de segmentos genéticos de la línea germinal que codifiquen las conformaciones de la cadena principal deseadas. Es más preferible que los segmentos genéticos de la línea germinal seleccionados se expresen con frecuencia en la naturaleza, y es muy preferible que sean los más frecuentemente expresados de todos los segmentos genéticos de la línea germinal natural. En el diseño de los ligandos (por ejemplo, dAbs) o bibliotecas de los mismos, se puede considerar por separado la incidencia de las diferentes conformaciones de la cadena principal para cada uno de los seis ciclos de enlace de antígeno. Para H1, H2, L1 , L2, y L3, se selecciona una conformación dada que sea adoptada por entre el 20 por ciento y el 100 por ciento de los ciclos de enlace de antígeno de las moléculas que se presentan naturalmente. Típicamente, se observa que la incidencia es mayor del 35 por ciento (es decir, entre el 35 por cuento y el 100 por ciento), e idealmente mayor del 50 por ciento, o todavía mejor mayor del 65 por ciento. Debido a que la gran mayoría de ciclos de H3 no tienen estructuras canónicas, es preferible seleccionar una conformación de la cadena principal que sea común entre estos ciclos que sí exhiban estructuras canónicas. Para cada uno de los ciclos, por consiguiente, se selecciona la conformación que se observe más frecuentemente en el repertorio natural. En los anticuerpos humanos, las estructuras canónicas (CS) más populares para cada ciclo son como sigue: H1 - CS 1 (79 por ciento del repertorio expresado), H2 - CS 3 (46 por ciento), L1 - CS 2 de VK (39 por ciento), L2 - CS 1 (100 por ciento), L3 - CS 1 de VK (36 por ciento) (el cálculo asume una proporción de :? de 70:30, Hood y colaboradores (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48:133). Para los ciclos de H3 que tienen estructuras canónicas, una longitud de CDR3 (Kabat y colaboradores (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos) de siete residuos con un puente de sal desde el residuo 94 hasta el residuo 101, parece ser la más común. Hay cuando menos 16 secuencias de anticuerpo humanas en la biblioteca de datos EMBL con la longitud de H3 requerida y los residuos clave para formar esta conformación, y se pueden utilizar cuando menos dos estructuras cristalográficas del banco de datos de proteína, como una base para la modelación del anticuerpo (2cgr y 1 tet) . Los segmentos genéticos de la línea germinal más frecuentemente expresados en esta combinación de estructuras canónicas con el segmento 3-23 de VH (DP-47), el segmento JH4b de JH, el segmento 02/012 de VK (DPK9), y el segmento JK1 de JK. También son adecuados los segmentos DP45 y DP38 de VH. Por consiguiente, estos segmentos se pueden utilizar en combinación como una base para construir una biblioteca con la única conformación de la cadena principal deseada. De una manera alternativa, en lugar de elegir la única conformación de la cadena principal basándose en la presentación natural de diferentes conformaciones de cadena principal para cada uno de los ciclos de enlace en aislamiento, se utiliza la presentación natural de combinaciones de, conformaciones de la cadena principal como la base para elegir la única conformación de la cadena principal. En el caso de los anticuerpos, por ejemplo, se puede determinar la presentación natural de combinaciones de estructura canónica para cualesquiera dos, tres, cuatro, cinco, o los seis ciclos de enlace de antígeno. Aquí, es preferible que la conformación seleccionada sea común en los anticuerpos que se presentan naturalmente, y más preferiblemente que se observe con más frecuencia en el repertorio natural. Por consiguiente, en los anticuerpos humanos, por ejemplo, cuando se consideran combinaciones naturales de los cinco ciclos de enlace de antígeno, H1, H2, L1, L2, y L3, se determina la combinación más frecuente de estructuras canónicas, y luego se combina con la conformación más popular para el ciclo H3, como una base para elegir la única conformación de la cadena principal. Diversificación de la Secuencia Canónica. Habiendo seleccionado varias conformaciones de la cadena principal conocidas, o de preferencia una sola conformación de la cadena principal conocida, se pueden construir ligandos (por ejemplo, dAbs) o bibliotecas para utilizarse en la invención, variando el sitio de enlace de la molécula con el objeto de generar un repertorio con diversidad estructural y/o funcional. Esto significa que se generan variantes, de tal manera que posean suficiente diversidad en su estructura y/o en su función, para que sean capaces de proporcionar un número de actividades.
La diversidad deseada típicamente se genera variando la molécula seleccionada en una o más posiciones. Las posiciones que se deban cambiar se pueden seleccionar al azar, o se seleccionan preferiblemente. Entonces la variación se puede lograr ya sea mediante selección aleatoria, durante la cual el aminoácido residente es reemplazado por cualquier aminoácido o análogo del mismo, natural o sintético, que produzca un número muy grande de variantes, o reemplazando el aminoácido residente con uno o más de un subconjunto definido de aminoácidos, produciendo un número más limitado de variantes. Se han reportado diferentes métodos para introducir esta diversidad. Se puede emplear reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error (Hawkins y colaboradores (1992) J. Mol. Biol., 226:889), mutagénesis química (Deng y colaboradores (1994) J. Biol. Chem., 269; 9533), o cepas mutadoras bacterianas (Low y colaboradores (1996) J. Mol. Biol., 260:359), para introducir mutaciones aleatorias en los genes que codifiquen la molécula. Los métodos para mutar las posiciones seleccionadas también son bien conocidos en la técnica, e incluyen el uso de oligonucleótidos mal emparejados u oligonucleótidos degenerados, con o sin el uso de la reacción en cadena de la polimerasa. Por ejemplo, se han creado varias bibliotecas de anticuerpos sintéticas mediante la dirección de las mutaciones hacia los ciclos de enlace de antígeno. Se ha seleccionado aleatoriamente la región H3 de un Fab de enlace de toxoide de tétanos humano para crear un número de nuevas especificidades de enlace (Barbas y colaboradores (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 89:4457). Se han adjuntado las regiones H3 y 13 aleatorias o semi-aleatorias a los segmentos del gen V de la línea germinal, para producir grandes bibliotecas con regiones de estructura no mutadas (Hoogenboom y Winter (1992) J. Mol. Biol., 227:381; Barbas y colaboradores (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 89:4457; Nissim y colaboradores (1994) EMBO J, 13:692; Griffiths y colaboradores (1994) EMBO J., 13:3245; De Kruif y colaboradores (1995) J. Mol. Biol, 248:97). Esta diversificación se ha extendido para incluir algunos o todos los otros ciclos de enlace de antígeno (Crameri y colaboradores, (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann y colaboradores (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, Publicación Internacional Número WO97/0S320, supra). Debido a que la selección aleatoria del ciclo tiene el potencial para crear aproximadamente más de 1015 estructuras para H3 solamente, y un número similarmente grande de variantes para los otros cinco ciclos, no es factible utilizar la tecnología de transformación actual, o inclusive, mediante la utilización de sistemas sin células, producir una biblioteca que represente todas las combinaciones posibles. Por ejemplo, en una de las bibliotecas más grandes construidas hasta la fecha, se generaron 6x1010 diferentes anticuerpos, los cuales son solamente una fracción de la diversidad potencial para la biblioteca de este diseño (Griffiths y colaboradores (1994), supra). De una manera preferible, solamente se diversifican los residuos que estén directamente involucrados en la creación o modificación de la función deseada de la molécula. Para muchas moléculas, la función será enlazarse con un objetivo, y por consiguiente, la diversidad se debe concentrar en el sitio de enlace objetivo, mientras que se eviten los residuos cambiantes que sean cruciales para el empaque global de la molécula, o para mantener la conformación de cadena principal seleccionada. Diversificación de las Secuencias Canónicas, como se Aplica a los Dominios de Anticuerpos. En el caso de los ligandos basados en anticuerpos (por ejemplo, dAbs), el sitio de enlace para el objetivo es con más frecuencia el sitio de enlace de antígeno. Por consiguiente, de preferencia solamente se varían los residuos en el sitio de enlace de antígeno. Estos residuos son extremadamente diversos en el repertorio de anticuerpos humanos, y se sabe que hacen contactos en los complejos de anticuerpo/antígeno de alta resolución. Por ejemplo, en L2, se sabe que las posiciones 50 y 53 son diversas en los anticuerpos que se presentan naturalmente, y se observa que hacen contacto con el antígeno. En contraste, el planteamiento convencional habría sido diversificar todos los residuos en la región determinante de complementariedad correspondiente (CDR1), como es definido por Kabat y colaboradores (1991, supra), unos siete residuos, comparándose con los dos diversificados en la biblioteca para utilizarse de acuerdo con la invención. Esto representa una mejora significativa en términos de la diversidad funcional requerida para crear un número de especificidades de enlace de antígeno. En la naturaleza, la diversidad de anticuerpos es el resultado de dos procesos: recombinación somática de los segmentos genéticos V, D, y J de la línea germinal, para crear un repertorio primario puro (denominado como la diversidad de la línea germinal y de unión), e hipermutación somática de los genes V reconfigurados resultantes. El análisis de las secuencias de anticuerpo humanas ha demostrado que la diversidad en el repertorio primario se enfoca en el centro del sitio de enlace de antígeno, mientras que las hipermutación somática extiende la diversidad hasta las regiones de la periferia del sitio de enlace de antígeno que están altamente conservadas en el repertorio primario (véase Tomlinson y colaboradores (1996) J. Mol. Biol., 256:813). Esta complementariedad probablemente ha evolucionado como una estrategia eficiente para la búsqueda de espacio de secuencia, y, aunque aparentemente es única para los anticuerpos, se puede aplicar fácilmente a otros repertorios de polipéptidos. Los residuos que se varían son un subconjunto de aquéllos que forman el sitio de enlace para el objetivo. Diferentes subconjuntos de residuos (incluyendo traslapados) en el sitio de enlace objetivo, se diversifican en diferentes etapas durante la selección, si se desea. En el caso de un repertorio de anticuerpos, se puede crear un repertorio "puro" inicial, en donde se diversifican algunos, pero no todos, de los residuos en el sitio de enlace de antígeno. Como se utiliza en la presente, en este contexto, el término "puros" se refiere a las moléculas de anticuerpo que no tienen un objetivo previamente determinado. Estas moléculas se parecen a aquéllas que son codificadas por los genes de inmunoglobulina de un individuo que no haya sufrido diversificación inmune, como es el caso con los individuos fetales y recién nacidos, cuyos sistemas inmunes no han sido todavía agredidos por una amplia variedad de estímulos antigénicos. Este repertorio se selecciona entonces contra un número de antígenos o epítopos. Si se requiere, entonces se puede introducir mayor diversidad fuera de la región diversificada en el repertorio inicial. Este repertorio maduro se puede seleccionar para la función modificada, la especificidad, y la afinidad. Los repertorios puros de dominios de enlace para la construcción de ligandos en donde se varían algunos o todos los residuos en el sitio de enlace de antígeno son conocidos en este campo. (Véanse las Publicaciones Internacionales Números WO 2004/058821, WO 2004/003019, y WO 03/002609). La biblioteca "primaria" imita el repertorio primario natural, con la diversidad restringida a los residuos en el centro del sitio de enlace de antígeno, que son diversos en los segmentos del gen V de la línea germinal (diversidad de la línea germinal), o se diversifican durante el proceso de recombinación (diversidad de unión). Estos residuos que se diversifican incluyen, pero no se limitan a, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, JL53, L91, L92, L93, L94 y L96. En la biblioteca "somática", la diversidad está restringida a los residuos que se diversifican durante el proceso de recombinación (diversidad de unión), o son altamente mutados somáticamente. Estos residuos que se diversifican incluyen, pero no se limitan a: H31, H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 y L96. Se sabe que todos los residuos enlistados anteriormente como adecuados para la diversificación en estas bibliotecas hacen contacto en uno o más complejos de anticuerpo-antígeno. Debido a que en ambas bibliotecas, no todos los residuos en el sitio de enlace de antígeno se varían, se incorpora diversidad adicional durante la selección, mediante la variación de los residuos restantes, si se desea hacerlo. Será aparente para un experto en este campo, que se puede utilizar cualquier subconjunto de cualquiera de estos residuos (o residuos adicionales que comprendan el sitio de enlace de antígeno) para la diversificación inicial y/o siguiente del sitio de enlace de antígeno. En la construcción de las bibliotecas para utilizarse en la invención, la diversificación de las posiciones seleccionadas típicamente se logra al nivel del ácido nucleico, mediante la alteración de la secuencia de codificación que especifica la secuencia del polipéptido, de tal manera que se pueden incorporar un número de posibles aminoácidos (los 20 o un subconjunto de los mismos) en esa posición. Utilizando la nomenclatura de IUPAC, el codón más versátil es NNK, que codifica todos los aminoácidos, así como el codón de paro TAG. El codón NNK de preferencia se utiliza con el objeto de introducir la diversidad requerida. También son útiles otros codones que logran los mismos fines, incluyendo el codón NN, que conduce a la producción de los codones de paro adicionales TGA y TAA. Una característica de la diversidad de cadena lateral en el sitio de enlace de antígeno de los anticuerpos humanos es una pronunciada inclinación que favorece a ciertos residuos de aminoácidos. Si se suma la composición de aminoácidos de las diez posiciones más diversas en cada una de las regiones VH, VK, y VA, más del 76 por ciento de la diversidad de cadena lateral viene solamente de siete residuos diferentes, siendo éstos serina (24 por ciento), tirosina (14 por ciento), asparagina (11 por ciento), glicina (9 por ciento), alanina (7 por ciento), aspartato (6por ciento), y treonina (6 por ciento). Esta inclinación hacia los residuos hidrof ílicos y hacia los residuos pequeños, que puede proporcionar flexibilidad de la cadena principal, probablemente refleja la evolución de las superficies que están predispuestas al enlace de un amplio número de antígenos o epítopos, y puede ayudar a explicar la promiscuidad requerida de los anticuerpos en el repertorio primario. Debido a que es preferible imitar esta distribución de aminoácidos, la distribución de aminoácidos en las posiciones que se vayan a variar de preferencia imita a la que se ve en el sitio de enlace de antígeno de los anticuerpos. Esta inclinación en la sustitución de aminoácidos, que permite la selección de ciertos polipéptidos (no solamente los polipéptidos de anticuerpos) contra un número de antígenos objetivo, se aplica fácilmente a cualquier repertorio de polipéptidos. Existen diferentes métodos para inclinar la distribución de aminoácidos en la posición que se vaya a variar (incluyendo el uso de mutagénesis de tri-nucleótidos, véase la Publicación Internacional Número WO97/08320), de los cuales el método preferido, debido a la facilidad de síntesis, es el uso de codones degenerados convencionales. Mediante la comparación del perfil de aminoácidos codificado por todas las combinaciones de codones degenerados (con degeneración individual, doble, triple, y cuádruple en iguales proporciones en cada posición), con el aminoácido natural, es posible el uso para calcular la mayoría de los codones representativos. Los codones (AGT)(AGC)T, (AGT)(AGC)C, y (AGT)(AGC)(CT) - es decir, DVT, DVC, y DVY, respectivamente, utilizando la nomenclatura de IUPAC - son aquéllos más cercanos al perfil de aminoácidos deseados: codifican el 22 por ciento de serina y el 11 por ciento de tirosina, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina, y cisteína. Por consiguiente, de una manera preferible, se construyen bibliotecas utilizando cualquiera de los codones DVT, DVC, ó DVY en cada una de las posiciones diversificadas. Ensayo de Enlace de Receptor. Los antagonistas de TNFR1 que inhiben el enlace de TNFa con el TNFR1 se pueden identificar en un ensayo de enlace de receptor adecuado. Dicho de una manera breve, se incuban las placas Maxisorb durante la noche con 30 miligramos/mililitro de anticuerpo monoclonal de ratón Fe anti-humano (Zymed, San Francisco, EUA). Los pozos se lavan con suero regulado con fosfato (PBS) conteniendo Tween 20 al 0.05 por ciento, y luego se bloquean con albúmina de suero bovino al 1 por ciento en suero regulado con fosfato, antes de incubarse con 100 nanogramos/mililitro de proteína de fusión de TNFR1-Fc (R&D Systems, Minneapolis, EUA). Los antagonistas de TNFR1 se mezclan con el TNF que se agrega a los pozos lavados en una concentración final de 10 nanogramos/mililitro. El enlace de TNF se detecta con 0.2 miligramos/mililitro de anticuerpo anti-TNF biotinilado (HyCult Biotechnology, Uben, Holanda), seguido por una dilución de 1 en 500 de estreptavidina marcada con peroxidasa de radícula roja (Amersham Biosciences, Reino Unido), y luego la incubación con el sustrato de TMB (KPL, Gaithersburg, EUA). La reacción se puede detener mediante la adición de HCI, y se lee la absorbencia a 450 nanómetros. Los antagonistas de TNFR1 que inhiben el enlace de TNFa con el TNFR1 conducen a una disminución en el enlace de TNF, y por consiguiente, una disminución en la absorbencia, comparándose con el control de solamente TNF. Ensayo de Citotoxicidad L929. Los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, monómeros dAb) se pueden identificar por su capacidad para inhibir la citotoxicidad inducida por TNF en fibroblastos L929 de ratón (Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248). Dicho de una manera breve, las células L929 aplicadas a placas de microtitulación, se incuban durante la noche con el antagonista de TNFR1, 100 picogramos/mililitro de TNF, y 1 miligramo/mililitro de actinomicina D (Sigma, Poole, Reino Unido). Entonces se mide la viabilidad celular leyendo la absorbencia a 490 nanómetros, en seguida de una incubación con [3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-5-(3-carboxi-metoxi-fenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (Promega, Madison, EUA). Los antagonistas de TNFR1 inhibirán la citotoxicidad, y por consiguiente, producirán un aumento en la absorbencia, comparándose con el control de solamente TNF. Ensayo de HeLa IL-8. Los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, monómeros dAb) se pueden identificar por su capacidad para inhibir la secreción de IL-8 inducida por TNF por parte de las células HeLa humanas (métodos adaptado de aquél de Akeson, L. y colaboradores (1996) Journal of Biológica! Chemistry 271, 30517-30523, que describe la inducción de IL-8 por parte de IL-1 en HUVEC; aquí, vemos la inducción por TNFa humano, y utilizamos las células HeLa en lugar de la línea celular HUVEC). Dicho de una manera breve, las células HeLa se pueden aplicar a placas de microtitulación, y se incuban durante la noche con el antagonista de TNFR1 y 300 picogramos/mililitro de TNF. Después de la incubación, se aspira el sobrenadante de las células, y se mide la concentración de IL-8 utilizando un ELISA de emparedado (R&D Systems), u otro método adecuado. Los antagonistas de TNFR1 inhiben la secreción de IL-8, y se detecta menos IL-8 en el sobrenadante, comparándose con el control de solamente TNF. Ensayo de Liberación de IL-8 de MRC-5. Los antagonistas de TNFR1 humano se pueden identificar utilizando el siguiente ensayo de células MRC-5. El ensayo se basa en la inducción de la secreción de IL-8 por parte del TNF en células MRC-5, y se adapta a partir del método descrito en Alceson, L. y colaboradores, Journal of Biological Chemistry 277:30517-30523 (1996), que describe la inducción de IL-8 por parte de IL-1 en HUVEC. Dicho de una manera breve, las células MRC-5 se aplican a placas de microtitulación, y las placas se incuban durante la noche con el antagonista de TNFR1 y el TNFa humano (300 picogramos/mililitro). En seguida de la incubación, se aspira el sobrenadante del cultivo, y se mide la concentración de IL-8 en el sobrenadante por medio de un ELISA de emparedado (R&D Systems), u otro método adecuado. Los antagonistas de TNFR1 dan como resultado una disminución en la secreción de IL-8 hacia el sobrenadante, comparándose con los pozos de control, que se incuban solamente con TNFa. EJEMPLOS EJEMPLO 1. El Antagonista de TNFR1 Localmente Administrado al Tejido Pulmonar es Eficaz en un Modelo Subcrónico de Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica en Ratones C57BL/6. En este estudio, un antagonista de TNFR1 (monómero dAb anti- TNFR1 (TAR2m21-23)), y un antagonista de TNF (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)), se administraron localmente al pulmón mediante administración intranasal 1 hora antes de cada exposición al aire o al humo del tabaco (TS). Los efectos sobre los cambios inducidos por el humo del tabaco en los índices inflamatorios pulmonares, inducidos por once exposiciones diarias consecutivas al humo del tabaco, se examinaron 24 horas después de la exposición final. Se utilizó el compuesto anti-TNF (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)). También se administró un inhibidor de fosfodiesterasa-4 (PDE4) oralmente administrado (BAY 19-8004; lirimilast) una hora antes y 6 horas después de la exposición al humo del tabaco en otro grupo como referencia. Métodos Sustancia de prueba 1 : (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)). Sustancia de prueba 2: DOM1m (monómero dAb anti-TNFR1 (TAR2m21-23)). Sustancia de prueba 3: BAY 19-8004 (inhibidor de PDE4). El vehículo para las sustancias 1 y 2 fue citrato de sodio a un pH de 6.0, NaCI 100 mM. El vehículo para la sustancia 3 fue carboxi-metil-celulosa al 0.5 por ciento (Sigma, Producto Número C-4888, Lote Número 87H0036) en agua. El volumen de dosis es de 5 mililitros/kilogramo. Los ratones hembras (C57BL/6) criados en barrera completa, y certificados por estar libres de microorganismos específicos al recibirse (de 16 a 20 gramos) (Charles River), se alojaron en grupos de hasta 5 en jaulas de fondo sólido individualmente ventiladas (IVC) con el lecho de aserrín Aspen. Los ambientes (flujo de aire, temperatura, y humedad) dentro de las jaulas se controlaron mediante el sistema IVC (Techniplast).
Protocolos: Número de grupos: 7. Tamaño de grupo: n = 10. Volumen de dosis: 50 microlitros por ratón para los grupos 1 a 4, y 5 miligramos/kilogramo para los grupos 1 a 7. Tiempos de tratamiento: 1 hora antes de la exposición al humo del cigarro o al aire en los días 1 a 11 para los grupos 1 a 4, y 1 hora antes de la exposición y 6 horas después de la exposición para los grupos 5 a 7. El protocolo del estudio se resume en la Tabla 1. Tabla 1 Exposición al Grupo Humo del Sustancia Dosis Vía de Frecuencia de No. Tabaco/Aire de Prueba mg/kg n= Dosificación Dosificación Vehículo de 1 Aire 0 10 i. n. citrato de Na 1 hora antes de la exposición al Humo del Vehículo de 2 0 10 i. n. humo del tabaco tabaco citrato de Na 0 al aire en los 1 (Enbrel®; días 1 a 11 para Humo del etanercept, 3 1.0 10 i. n. los grupos 1 a 6. tabaco Immunex 1 hora antes y 6 Corp.) Exposición al Grupo Humo del Sustancia Dosis Vía de Frecuencia de No. Tabaco/Aire de Prueba mg/kg n= Dosificación Dosificación Humo del horas después 4 2 (DOM1m) 1.0 10 i. n. tabaco para los grupos 7 a 9. Humo del Vehículo 5 0 10 p.0. tabaco CMC Humo del Vehículo 6 0 10 p.0. tabaco CMC Humo del 3 (BAY 19- 7 10 10 p.0. tabaco 8004) i. n. = Intranasal. p. o. = Por administración oral. Exposición al Humo del Tabaco (TS). Los ratones (máximo de 5 por cámara de exposición) se expusieron al humo del tabaco generado a partir de cigarrillos (tio 1R1, suministrado por la Universidad de Kentuchy). La exposición inicial fue a 4 cigarrillos en el día 1, y la exposición se incrementó hasta un máximo de 6 cigarrillos/día para el día 6/7. La exposición después hasta el día 11 fue de 6 cigarrillos/día. El índice de incremento se reguló con respecto a la tolerancia diaria observada de los ratones. El grupo de ratones de control se expuso al aire durante una duración de tiempo equivalente en cada día de exposición (controles de exposición al aire).
Monitoreo de la Salud: Los animales se pesaron antes del inicio del estudio, en el día 6 del protocolo de exposición, y en el momento de la terminación. Todos los animales se monitorearon durante y después de la administración de cada sustancia de prueba y de la exposición al humo del tabaco. Procedimientos Terminales: Los animales se sacrificaron mediante una sobredosis de anestésico (pentobarbitona Na, 100 miligramos/kilogramo, intraperitonealmente) como sigue: Todos los grupos se sacrificaron 24 horas después de la exposición 11 y final al humo del tabaco. Los ratones de todos los grupos de tratamiento se trataron como sigue: se tomaron muestras de sangre de la arteria sub-claviana, se colocaron en un tubo microcentrífugo, y se permitió coagularse durante la noche a 4°C. El coágulo se removió, y el fluido restante se centrifugó a 2,900 revoluciones por minuto en un microcentrífugo durante 6 minutos. El suero del sobrenadante resultante se decantó y se almacenó a -4°C para un análisis de PK posible. Se llevó a cabo un lavado broncoalveolar (BAL) utilizando 0.4 mililitros de suero regulado con fosfato (PBS). Las células recuperadas del lavado broncoalveolar se cuantificaron mediante conteos celulares totales y diferenciales. Los pulmones se removieron, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80°C para el análisis de PK posible.
Análisis de Datos. Se llevó a cabo una prueba para determinar la normalidad a partir de los datos. Si la prueba era positiva, entonces se llevó a cabo un análisis preliminar utilizando una prueba de análisis de variación de una vía (ANOVA de una vía), seguida por una prueba posterior de múltiples comparaciones de Bonferroni, para comparar los grupos de control y de tratamiento. Si los datos no estaban normalmente distribuidos, entonces se empleó una prueba de Kruskal-Wallis, seguida por una prueba de múltiples comparaciones de Dunn. Los datos se consideraron significativos cuando p<0.05. Resultados El grupo de control de humo del tabaco/vehículo tuvo infiltrados celulares en el pulmón, comparándose con el grupo de aire/vehículo (véase la Figura 1 ). El grupo tratado con la sustancia de prueba 1 (DOM1, dAb anti- TNFR1) y expuesto al humo del tabaco, mostró infiltrados celulares significativamente reducidos en el pulmón, comparándose con los grupos tratados con control y expuestos al humo del tabaco (Figura 1): inhibición del 72 por ciento para las células totales (p <0.001), del 74 por ciento para macrófagos (p <0.001), del 82 por ciento para neutrófilos (p<0.001), del 86 por ciento para linfocitos (p <0.05), y del 55 por ciento para células epiteliales (p <0.01). Se observó una reducción del 82 por ciento en los eosinófilos, pero este cambio no fue significativo, debido a la variabilidad en los números de eosinófilos observados en el estudio como un todo.
El grupo tratado con la sustancia de prueba 3 (inhibidor de PDE4, BAY 19-8004), mostró infiltrados celulares significativamente reducidos en el pulmón, comparándose con el grupo de control (Figura 1): inhibición del 52 por ciento para las células totales (p <0.01), del 55 por ciento para macrófagos (p <0.01), del 55 por ciento para neutrófilos (p<0.001), del 61 por ciento para linfocitos (p <0.001), y del 56 por ciento para eosinófilos (p <0.01). Se observó una reducción del 46 por ciento en las células epiteliales, pero este cambio no fue significativo. No se observaron reducciones significativas en cualquiera de las poblaciones de células en el grupo expuesto al humo del tabaco y tratado con la sustancia de prueba 1 (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)). EJEMPLO 2. El Antagonista de TNFR1 Sistémicamente Administrado es Eficaz en un Modelo Sub-crónico de Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica en Ratones C57BL/6. En este estudio, un antagonista de TNFR1 (monómero dAb anti-TNFR1 pegilado (TAR2m21-23 PEGilado para aumentar el tamaño hidrodinámico y la vida media en suero in vivo)), y un antagonista de TNF (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)), se administraron sistémicamente mediante administración intraperitoneal cada 48 horas, empezando 24 horas antes de la exposición inicial al humo del tabaco. Se examinaron los efectos sobre los cambios inducidos por el humo del tabaco en los índices inflamatorios pulmonares inducidos por 11 exposiciones diarias consecutivas al humo del tabaco, 24 horas después de la exposición final. Se utilizó el compuesto anti-TNF (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)) como un control. Métodos Sustancia de prueba 1 : ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation). Sustancia de prueba 2: PEG DOM1m (monómero dAb anti-TNFR1 (TAR2m21-23) PEGilado con un polietilenglicol de 40 kDa, para aumentar el tamaño hidrodinámico y alargar la vida media en suero in vivo). El vehículo para ambas sustancias de prueba fue suero estéril, y el volumen de dosis para ambas sustancias de prueba fue de 10 mililitros/kilogramo. Los ratones hembras (C57BL/6) criados con barrera total, y certificados como libres de microorganismos específicos a la recepción (de 16 a 20 gramos) (Charles River), se alojaron en grupos de hasta 5 en jaulas de fondo sólido individualmente ventiladas (IVC) con lecho de aserrín Aspen. Se controlaron los ambientes (flujo de aire, temperatura, y humedad) dentro de las jaulas mediante el sistema IVC (Techniplast). Protocolos: Número de grupos: 4 Tamaño de grupo: n = 10 para los grupos 1 a 4. Volumen de dosis: 10 miligramos/kilogramo para los grupos 1 a 4.
Tiempos de tratamiento cada 48 horas, empezando 24 horas antes de la exposición inicial al humo del tabaco. Las siguientes dosis para administrarse una hora antes de la exposición al humo del tabaco.
El protocolo del estudio se resume en la Tabla 2. La exposición al humo del tabaco, el monitoreo de la salud, los procedimientos terminales, y el análisis de los datos se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 1. i.p. = Intraperitoneal.
Resultados El grupo tratado con la sustancia de prueba 2 (PEG DOM1m) y expuesto al humo del tabaco, mostró infiltrados celulares significativamente reducidos en el pulmón, comparándose con los grupos tratados con control y expuestos al humo del tabaco: inhibición del 60 por ciento para las células totales (Figura 2), del 63 por ciento para los macrófagos, del 66 por ciento para las células nucleares polimórficas, del 78 por ciento para linfocitos, y del 65 por ciento para eosinófilos. Se observó una reducción del 40 por ciento en las células epiteliales, pero este cambio no fue significativo. No se observaron reducciones significativas en cualquiera de las poblaciones de células en el grupo expuesto al humo del tabaco y tratado con la sustancia de prueba 1 (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)). El tratamiento con ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation) inclusive condujo a un incremento en el número de células totales y PMN en el pulmón.
EJEMPLO 3. Farmacocinética del Agente que se Enlaza con TNFR1 Después de la Administración Local al Tejido Pulmonar. En este estudio, se administró un agente que se enlaza con TNFR1 (monómero dAb anti-TNFR1 (TAR2m21 -23)) localmente al pulmón, mediante administración intranasal, y se evaluó la farmacocinética del agente.
Métodos En el estudio se utilizó DOM1m (monómero dAb anti-TNFR1 (TAR2m21 -23)) en citrato de sodio 20 mM, pH de 6.0, NaCI 100 mM. El agente de dilución fue citrato de sodio a un pH de 6.0, NaCI 100 mM. Protocolos A todos los animales se les administró DOM1m mediante administración intranasal en el mismo día dentro de 1 a 2 horas del calentamiento de la solución. Los ratones hembras (C57BL/6) criados con barrera total y certificados como libres de microorganismos específicos a la recepción (16 a 20 gramos) (Charles River), se alojaron en grupos de hasta 5 en jaulas de fondo sólido individualmente ventiladas (IVC) con lecho de aserrín Aspen. Los ambientes (flujo de aire, temperatura, y humedad) dentro de las jaulas se controlaron mediante el sistema IVC (Techniplast) . Número de grupos: 5 Tamaño de grupo: 3 Volumen de dosis: 50 microlitros (25 microlitros/nariz) . Tiempos de sacrificio: 1 hora, 2 horas, 5 horas, 8 horas, y 24 horas después de la administración. El protocolo del estudio se resume en la Tabla 3.
Tabla 3 i.n. = Intranasal.
Monitoreo de la Salud. Los animales se pesaron antes de iniciarse el estudio. Todos los animales se monitorearon durante y después de la administración de cada compuesto. Los animales del grupo de 24 horas se monitorearon a intervalos regulares durante la noche. Procedimientos Terminales Los animales se sacrificaron mediante sobredosis anestésico (pentobarbitona Na, 100 miligramos/kilogramo intraperitonealmente). Se tomó la sangre de la arteria subclavia, se colocó en un tubo microcentríf ugo, y se dejó coagularse durante la noche a 4. El coágulo se removió, y el fluido restante se centrifugó a 2,900 revoluciones por minuto en un microcentrífugo durante 6 minutos. Los sobrenadantes resultantes se decantaron, se colocaron en un tubo fresco, se congelaron, y se almacenaron a -40°C antes del análisis. El lavado broncoalveolar (BAL) se recolectó utilizando 0.4 mililitros de suero regulado con fosfato (PBS), el cual se instiló y se retiró tres veces. El lavado broncoalveolar se centrifugó a 2,700 revoluciones por minuto en un microcentríf ugo durante 6 minutos, y el sobrenadante se removió y se almacenó a -40°C antes del análisis. El gránulo celular se volvió a suspender en un volumen adecuado de suero regulado con fosfato, y se hizo un conteo de células totales utilizando un hemocitómetro. Se prepararon portaobjetos de Cytospin para permitir la determinación celular diferencial. Los pulmones se cortaron, se congelaron instantáneamente, y se almacenaron a -80°C antes del análisis. Utilizando mortero y pistilo, los pulmones se pulverizaron bajo nitrógeno líquido, y se disolvieron en el Reactivo de Extracción de Proteína de Tejido T-PER® (Pierce), y se homogeneizaron utilizando 40 pasadas con un homogeneizador Dounce. ELISA para Detectar DOM1m. Una placa de ensayo MAXISORB de 96 pozos (Nunc) se recubrió durante la noche a 4°C con 100 microlitros por pozo de mTNFR/Fc (R&D Systems) a 0.5 microgramos/mililitro en suero regulado con fosfato. Los pozos se lavaron tres veces con Tween al 0.05 por ciento/suero regulado con fosfato, y tres veces con suero regulado con fosfato. Se agregaron 200 microlitros por pozo de albúmina de suero bovino al 2 por ciento en suero regulado con fosfato, para bloquear la placa. Los pozos se lavaron, y luego se agregaron 100 microlitros del estándar DOM1m o de la muestra. Las placas se incubaron durante 1 hora. Los pozos se lavaron, y se detectó el DOM1 enlazado con anti-VH de pollo (1/500) seguido por conjugado de HRP de anti-IGY de pollo (dilución a 1/5,000; Abcam). Las placas se revelaron con 100 microlitros de SureBlue 1-Componente TMB (KPL, Gaithersburg, EUA), que se agregó a cada pozo, y la placa se dejó a temperatura ambiente hasta que se desarrolló una señal adecuada (aproximadamente 5 minutos). La reacción se detuvo mediante la adición de HCI, y la absorbencia se leyó a 450 nanómetros. Resultados El nivel de DOM1m en el lavado broncoalveolar fue el máximo a una hora, y fue de aproximadamente 14 microgramos/mililitro (aproximadamente 3.5 microgramos en 0.25 mililitros de fluido del lavado broncoalveolar). Esto significa que cuando menos el 17 por ciento (3.5 microgramos de los 20 microgramos administrados en total) del material administrado estuvo presente en el compartimiento broncoalveolar del pulmón. Puede haber más material presente en los tejidos circundantes, pero este material no se puede recuperar. Los niveles en el lavado broncoalveolar fueron altos durante un período de tiempo prolongado, y mostraron una declinación gradual durante 24 horas (declinación de >10 veces después de 24 horas). Los niveles de DOM1m en el tejido pulmonar fueron relativamente constantes hasta 8 horas después de la administración, y fueron indetectables 24 horas después de la administración. A las 8 horas después de la administración, los niveles en el tejido pulmonar fueron de aproximadamente 0.35 microgramos. El porcentaje de la dosis total administrada presente en el tejido pulmonar a las 8 horas fue de aproximadamente el 2 por ciento (la dosis total administrada fue de 20 microgramos). Tomado junto con los niveles del lavado broncoalveolar, el máximo nivel del agente detectado en el pulmón como un todo en los puntos del tiempo examinados, fue de cuando menos aproximadamente el 20 por ciento de la dosis total administrada. El nivel de DOM1m en el suero fue el máximo a la 1 hora (aproximadamente 150 nanogramos/mililitro), y declinó rápidamente. A las 5 horas después de la administración, los niveles en el suero fueron de aproximadamente 70 nanogramos/mililitro, lo cual es equivalente a 100 nanogramos/ratón (1.5 mililitros de volumen sanguíneo). El porcentaje de la dosis total administrada presente en el suero 5 horas después de la administración fue de aproximadamente 0.5 por ciento (la dosis total administrada fue de 20 microgramos). El DOM1m no fue detectable en el suero después de 5 horas. EJEMPLO 4. Reactividad Cruzada con TNFR1 de Cinomolgo. Se utilizó una línea celular de fibroblastos de piel de cinomolgo {Macaca fascicularis) para probar la reactividad cruzada de los dAbs anti-TNFR1 humano con TNFR1 de cinomolgo en un ensayo de TNFR1 basado en células. La reactividad cruzada con el TNFR1 de cinomolgo es conveniente debido a que se pueden llevar a cabo estudios farmacocinéticos y de toxicología sin utilizar un agente subrogado. Método Las células de fibroblastos de piel de embrión de cinomolgo (5x103 células por pozo) se incubaron con el dAb anti-TNFR1 humano durante 1 hora a 37°C/C02 al 5 por ciento. Entonces se agregaron 200 picogramos/mililitro (concentración final) de TNF humano, y la placa se incubó durante la noche a 37°C/C02 al 5 por ciento. Se utilizó el ELISA DuoSet de IL-8 humana para medir la concentración de IL-8 humana en los sobrenadantes del cultivo celular. El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una placa de ensayo Maxisorb Nunc de 96 pozos se recubrió con 100 microlitros de anticuerpo de detección a 4 microgramos/mililitro en suero regulado con fosfato. La placa se incubó durante la noche a 4°C. Entre cada paso de incubación, las placas se lavaron tres veces con Tween al 0.05 por ciento/suero regulado con fosfato, y tres veces con suero regulado con fosfato, utilizando un lavador de placas automatizado. Se agregaron 200 microlitros por pozo de albúmina de suero bovino al 1 por ciento/suero regulado con fosfato, y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se agregaron 90 microlitros de albúmina de suero bovino al 0.1 por ciento, Tween 20 al 0.05 por ciento en suero regulado con fosfato, a cada pozo, y 10 microlitros de sobrenadante celular; se incluyó una curva estándar de IL-8 empezando en 5 nanogramos/mililitro en albúmina de suero bovino al 0.1 por ciento, Tween 20 al 0.05 por ciento en suero regulado con fosfato. Se agregaron 100 microlitros de anticuerpo de detección a 20 nanogramos/mililitro (solución de suministro diluida a 1:180 en albúmina de suero bovino al 0.1 por ciento, Tween 20 al 0.05 por ciento en suero regulado con fosfato) a cada pozo, y las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Se agregaron 100 microlitros de estreptavidina-HRP a cada pozo (solución de suministro diluida a 1:200 en albúmina de suero bovino al 0.1 por ciento, Tween 20 al 0.05 por ciento en suero regulado con fosfato). Las placas se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron 100 microlitros de solución de SureBlue 1-Componente TMB Micro Well Peroxidase a cada pozo, y se dejó a temperatura ambiente hasta que se desarrolló el color azul. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 microlitros de ácido clorhídrico 1M. La absorbencia de una placa se leyó a 450 nanómetros dentro de 30 minutos. Resultados/Conclusiones Los dAbs anti-TNFR1 humano en la serie de TAR2h-131, son capaces de bloquear efectivamente la liberación de IL-8 inducida por TNF por parte de los fibroblastos de cinomolgo. Los dAbs TAR2h-131-511 y TAR2h-131 -117 tuvieron valores de potencia ligeramente más altos en el ensayo de cinomolgo (303 nM y 330 nM, respectivamente), comparándose con la potencia medida en un ensayo de MRC-5 humana (aproximadamente 600 pM). En conclusión, los dAbs de la serie TAR2h-131 reaccionan cruzadamente con el TNFR1 de cinomolgo. EJEMPLO 5. Efectos de dAb anti-TNFR1 Pulmonarmente Administrado Sobre la Inflamación Pulmonar Inducida por TNFa.
Se administró un dAb anti-TNFR1 a los pulmones de los ratones mediante la vía intranasal 1 hora antes del suministro intranasal del TNFa. El efecto de la dosificación previa al pulmón de un dAb anti-TNFR1 antes de la administración del TNFa se investigó determinando el número de neutrófilos en el lavado broncoalveolar, cuantificando la situación de las citoquinas inflamatorias KC, MIP-2, y MCP-1 en el lavado broncoalveolar, y cuantificando la E-selectina en el tejido pulmonar en los puntos del tiempo seleccionados después de la administración del TNFa. Métodos El estímulo inflamatorio fue el TNFa de murino recombinante en suero regulado con fosfato, conteniendo albúmina de suero bovino al 0.1 por ciento. El dAb anti-TNFR1 fue TAR2m-21-23 (Lote ??31/0?/06-1) en regulador de citrato 20 mM, pH de 6. El TNFa (1 microgramo por ratón) se administró por la vía intranasal (i.n.). El volumen administrado fue de 50 microlitros por ratón (20 microgramos/mililitro). El dAb TAR2m-21-23 anti-TNFR1 (1 miligramo/kilogramo) también se administró por la vía intranasal. El volumen de dAb administrado fue de 50 microlitros por ratón (0.4 miligramos/mililitro, debido a que los ratones eran de 20 gramos). Los ratones hembras (C57/b16) criados con barrera total y certificados como libres de microorganismos específicos a la recepción (26 a 20 gramos) (Charles River), se alojaron en grupos de hasta 5 en jaulas de fondo sólido individualmente ventiladas (IVC) con lecho de aserrín Aspen. Los ambientes (flujo de aire, temperatura, y humedad) dentro de las jaulas se controlaron mediante el sistema IVC (Techniplast). Grupos de tratamiento: Número de grupos: 13 Tamaño de grupo: n = 5-6. Los grupos de ratones se dosificaron intranasalmente ya sea con el vehículo o bien con dAb una hora antes de la administración del TNFa. Los grupos se sacrificaron en los tiempos previamente determinados después de la administración del TNFa, como se enlista en la Tabla 4. Tabla 4 Tiempo del sacrificio después del agonista Grupo Anti-TNFFM TNFa (horas) n A Vehículo Vehículo 2-8 6 B Vehículo 1 µg/ratón 2 5 C dAb 1 mg/kg 1 g/ratón 2 5 Tiempo del sacrificio después del agonista Grupo Anti-TNFFM TNFa (horas) n D Vehículo 1 µg/ratón 4 5 E dAb 1 mg/kg 1 µg/ratón 4 5 F Vehículo 1 µg/ratón 6 6 G dAb 1 mg/kg 1 µg/ratón 6 6 H Vehículo 1 µg/ratón 8 6 I dAb 1 mg/kg 1 g/ratón 8 6 J Vehículo 1 µg/ratón 24 5 K dAb 1 mg/kg 1 µg/ratón 24 5 L Vehículo 1 µg/ratón 48 5 M dAb 1 mg/kg 1 µg/ratón 48 5 Aproximadamente 3 minutos antes del tratamiento, se indujo anestesia ligera mediante inhalación de isofluorano. El vehículo o el dAb se instiló en un volumen de 50 microlitros/ratón por la vía intranasal. Los ratones se dejaron recuperar, y luego se regresaron a su jaula. Después de 1 hora, se administró el TNFa (1 microgramo/ratón) o su vehículo, por la misma vía intranasal. Los grupos de ratones tratados con dAb o con vehículo se sacrificaron a las 2, 4, 6, 8, 24, y 48 horas después de la administración del TNFa.
Los ratones se sacrificaron mediante sobredosis de anestésico (pentobarbitona Na, 100 miligramos/kilogramo, intraperitonealmente). La tráquea se canuló y se condujo el lavado broncoalveolar (BAL) utilizando tres alícuotas separadas de 0.4 mililitros de suero regulado con fosfato. El fluido del lavado se mantuvo sobre hielo antes de la centrifugación. Los corazones y pulmones se removieron en bloque, se removió el corazón, y los pulmones se congelaron instantáneamente utilizando nitrógeno líquido. El fluido del lavado se centrifugó, y el sobrenadante se dividió en cuatro alícuotas de 250 microlitros, y se almacenó a -40°C. El gránulo celular se volvió a suspender en 40 microlitros de suero regulado con fosfato, y se llevaron 10 microlitros de la suspensión celular a 90 microlitros de tinte "Kimura" o "Turks" para los conteos celulares húmedos totales utilizando un hemocitómetro. Se prepararon portaobjetos Cytospin de la suspensión celular, y se tiñeron utilizando el tinte "Wrights Giemsa" para el análisis celular diferencial. Las células se diferenciaron utilizando técnicas morfométricas convencionales. Preparación de muestras y ELISA: Los kits ELISA para TNFa, KC, MIP-2, MCP-1, y E-selectina de murino se obtuvieron en R&D Systems. Se utilizaron muestras de sobrenadante del lavado broncoalveolar limpias para la determinación de la concentración de las citoquinas KC, MIP-2, y MCP-1 en el lavado broncoalveolar. El sobrenadante del lavado broncoalveolar se diluyó a 1:100 para la determinación de la concentración del TNFa en el lavado broncoalveolar.
El pulmón congelado se descongeló y se homogeneizó en 500 microlitros de regulador de lisis conteniendo HEPES 10 mM, pH de 7.5, Tritón X-100 al 0.5 por ciento, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, AEBSF 0.5 mM, y un cóctel inhibidor de proteasa (1 microgramo/mililitro de leupeptina, 1 microgramo/mililitro de aprotinina, 10 microgramos/mililitro de inhibidor de tripsina-quimiotripsina, y 1 microgramo/mililitro de pepstatina). El sobrenadante del homogenato pulmonar se diluyó para la determinación de las concentraciones de E-selectina (1:50) y TNFa (1 :100) del tejido pulmonar. Las concentraciones totales de proteína en el lavado broncoalveolar y en el sobrenadante del homogenato pulmonar se determinaron utilizando un kit Quantipro BCA (Sigma). o Resultados En seguida de la administración intranasal del TNFa de murino, se detectaron niveles significativos de TNFa en el lavado broncoalveolar y en el tejido pulmonar 2 horas después de la administración (Figuras 11A y 11B). Las concentraciones de TNFa tanto en el lavado broncoalveolar como en el tejido, disminuyeron de una forma dependiente del tiempo, y regresaron hasta los niveles de la línea base (tratados con vehículo) a las 48 horas. Los niveles en el lavado broncoalveolar fueron aproximadamente 10 veces más altos que los niveles en el tejido pulmonar. Estos datos demuestran que la administración intranasal de TNFa dio como resultado un suministro pulmonar significativo de la citoquina. Sin embargo, es posible que algo del TNFa detectado pudiera ser de origen endógeno, aunque el perfil de la respuesta no sugiere esto. Una hora antes de la dosis de 1 miligramo/kilogramo del dAb anti-TNFR1 no tuvo ningún efecto obvio sobre la concentración de TNFa del lavado broncoalveolar y del tejido pulmonar a través de todos los puntos del tiempo examinados. A pesar del rápido incremento en la concentración de TNFa en el lavado broncoalveolar y en el tejido pulmonar en seguida de la administración intranasal del TNFa de murino, el número de neutrofilos del lavado broncoalveolar no aumentó de una manera significativa arriba de la línea base entre 1 y 8 horas después de la administración del TNFa. Sin embargo, a las 24 y 48 horas después de la administración del TNFa, se observó neutrofilia del lavado broncoalveolar (Figura 12). El aumento en los neutrófilos del lavado broncoalveolar a las 24 y 48 horas fue parcialmente inhibido por el dAb anti-TNFR1 (inhibición del 26 por ciento y del 44 por ciento, respectivamente). Las concentraciones de los quimioatrayentes de neutrófilos KC y MIP-2 aumentaron de una manera significativa dos horas en seguida de la administración del TNFa, y disminuyeron de una forma dependiente del tiempo con ambas quimiocinas, regresando hasta las concentraciones básales a las 24 horas (Figuras 13A y 13B). Estos incrementos en KC y MIP-2 en el lavado broncoalveolar fueron significativamente reducidos por el tratamiento previo con el dAb anti-TNFR1. Las concentraciones de MCP-1 en el lavado broncoalveolar y de E-selectina en el tejido pulmonar también aumentaron de una manera significativa mediante el TNFa, pero el incremento pico se presentó después de aquél de KC y MIP-2 del lavado broncoalveolar (6 horas en lugar de 2 horas). Las concentraciones de MCP-1 del lavado broncoalveolar y de E-selectina del tejido pulmonar regresaron hasta los niveles básales a las 48 horas (Figuras 13C y 13D). Estos incrementos en KC y MIP-2 del lavado broncoalveolar se redujeron de una manera significativa mediante el tratamiento previo con el dAb anti-TNFR1. Discusión La administración intranasal de TNFa de murino a los ratones dio como resultado niveles significativos de TNFa pulmonar, lo cual indujo incrementos significativos en los neutrófilos del lavado broncoalveolar, en las KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar, y en la E-selectina del tejido pulmonar. Los neutrófilos del lavado broncoalveolar no aumentaron sino hasta aproximadamente 24 horas después, y permanecieron elevados a las 48 horas. Los datos anteriores de la literatura utilizando ratas, demostraron una respuesta de neutrófilos prolongada. Los incrementos pico en KC y MIP-2 del lavado broncoalveolar se observaron en el punto del tiempo a las 2 horas, con incrementos pico en MCP-1 del lavado broncoalveolar y en la E-selectina del tejido pulmonar alrededor de las 6 horas. Se detectaron mayores niveles de cada una de KC, MIP-2, MCP-1, y E-selectina 6 horas después de la administración del TNFa.
El tratamiento previo con un dAb anti-TNFR1 (1 miligramo/kilogramo) una hora antes de la administración del TNFa de murino, inhibió los incrementos en los neutrófilos y en las del KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar, y en la E-selectina del tejido pulmonar. Estos datos sugieren que el receptor de TNFR1 media la mayor parte de la inflamación pulmonar inducida por el TNFa intranasal en este modelo. EJEMPLO 6. Efectos de Dosis Variables del dAb Anti-TNFR1 Pulmonarmente Suministrado, Sobre la Inflamación Pulmonar Inducida por TNFa. Se administraron dosis variables de un dAb anti-TNFR1 a los pulmones de los ratones por la vía intranasal 1 hora antes del suministro intranasal del TNFa. Las dosis de dAb ánti-TNFR1 utilizadas fueron de 2.5 miligramos/kilogramo, 1 miligramo/kilogramo, 0.3 miligramos/kilogramo, 0.1 miligramos/kilogramo, 0.03 miligramos/kilogramo, y 0.01 miligramos/kilogramo. El efecto de la dosificación previa con un dAb anti-TNFR1 se investigó cuantificando la concentración de las citoquinas inflamatorias KC, MIP-2, y MCP-1 en el lavado broncoalveolar, y cuantificando la E-selectina en el tejido pulmonar. Métodos El estímulo inflamatorio y la sustancia de prueba fueron iguales a aquéllos descritos en el Ejemplo 5. El TNFa (1 microgramo por ratón) se administró por la vía intranasal (i.n.). El volumen administrado fue de 50 microlitros por ratón (20 microgramos/ mililitro). El dAb anti-TNFR1 TAR2m-21-23 se administró por la vía intranasal en una dosis de 2.5 miligramos/kilogramo, 1 miligramo/kilogramo, 0.3 miligramos/kilogramo, 0.1 miligramos/-kilogramo, 0.03 miligramos/kilogramo, o 0.01 miligramos/kilogramo. El volumen de dAb administrado fue de 50 microlitros por ratón. Los ratones fueron de la misma raza, y se alojaron como se describe en el Ejemplo 5. Grupos de tratamiento: Tamaño del grupo: n = 4-7. Los grupos de ratones fueron dosificados intranasalmente ya sea con vehículo o bien con el dAb (2.5, 1, 0.3, 0.1, 0.03 ó 0.01 miligramos/kilogramo) 1 hora antes de la administración del TNFa. Todos los grupos se sacrificaron 6 horas después de la administración del TNFa. Los ratones se sacrificaron empleando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 6. Los ratones se sacrificaron 6 horas después de la administración intranasal del TNFa, y las células del lavado broncoalveolar, el sobrenadante del lavado broncoalveolar, y el tejido pulmonar congelado, se recolectaron como se describe en el Ejemplo 6. La proteína, KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar, la proteína y la E-selectina del sobrenadante del homogenato pulmonar, se examinaron y se cuantificaron como se describe en el Ejemplo 6.
Resultados Como se muestra en el Ejemplo 5, la administración intranasal del TNFa indujo concentraciones significativas de KC, MIP-2, y MCP-1en el lavado broncoalveolar, y de E-selectina en el tejido pulmonar, 6 horas después de la dosificación. El tratamiento previo (1 hora antes del TNFa) con un dAb anti-TNFR1 inhibió la elevación de estos mediadores inflamatorios de una forma dependiente de la dosis (Tabla 5), aunque la potencia sí varió entre los mediadores. Tabla 5. Inhibición dependiente de la dosis de los incrementos en las concentraciones de KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar, y de E-selectina del tejido pulmonar, inducidos por TNFa1. Dosificación Intranasal del dAb (miligramos/kilogramo) La tabla muestra el porcentaje de inhibición (promedio ± SD) de los incrementos en las concentraciones de KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar y de E-selectina del tejido pulmonar inducidos por TNFa, en dosis del dAb de 2.5, 1, 0.3, 0.1, 0.03, y 0.01 miligramos/kilogramo. El dAb anti-TNFFM inhibió la KC de lavado broncoalveolar hasta un grado similar a todas las dosis entre 2.5 miligramos/kilogramo y 0.03 miligramos/kilogramo, y fue inactivo en 0.01 miligramos/kilogramo. De una manera similar, el dAb anti-TNFFM inhibió la MIP-2 del lavado bronquioalveolar hasta sustancialmente el mismo grado en todas las dosis entre 2.5 miligramos/kilogramo y 0.1 miligramos/kilogramo, con una inhibición ligeramente menor en 0.03 miligramos/kilogramo, y fue inactivo en 0.01 miligramos/kilogramo. El dAb anti-TNFR1 fue un inhibidor menos potente de la MCP-1 del lavado broncoalveolar, debido a que se observó una inhibición significativa entre 2.5 miligramos/kilogramo y 0.3 miligramos/kilogramo, pero no en dosis más bajas. Las concentraciones de E-selectina del tejido pulmonar se inhibieron de una forma similar; se observó una inhibición significativa entre 2.5 miligramos/kilogramo y 0.3 miligramos/kilogramo, una inhibición mínima en 0.1 miligramos/kilogramo, y ningún efecto en dosis más bajas. Discusión La administración intranasal de TNFa de murino a ratones indujo incrementos significativos en los neutrófilos del lavado broncoalveolar, en las KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar, y en la E-selectina del tejido pulmonar. Estos incrementos fueron significativamente inhibidos en una forma dependiente de la dosis con un dAb anti-TNFR1. El dAb anti-TNFR1 tuvo una actividad inhibidora más potente sobre la KC y la MIP-2 del lavado broncoalveolar, comparándose con la MCP-1 del lavado broncoalveolar y la E-selectina del tejido pulmonar. Esto podría deberse a que los incrementos pico en KC y MIP-2 del lavado broncoalveolar se indujeron relativamente rápido en seguida de la administración del TNFa, mientras que los incrementos pico en la MCP-1 del lavado broncoalveolar y en la E-selectina del tejido fueron posteriores. Este estudio demuestra que el dAb anti-TNFR1 intranasal en una dosis de 0.3 miligramos/kilogramo inhibió de una manera significativa los incrementos inducidos por TNFa en los neutrófilos del lavado broncoalveolar, en las KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar, y en la E-selectina del tejido pulmonar, a las 6 horas después de la administración del TNFa, pero que 0.3 miligramos/kilogramo no es una dosis supra-máxima. EJEMPLO 8. Duración de Acción In Vivo de un dAb Anti-TNFR1 Administrado por la Vía Intranasal. El dAb anti-TNFR1 (TAR2m-21 -23) se administró a los pulmones de los ratones por la vía intranasal en diferentes tiempos antes de la administración intranasal del TNFa. El efecto de la dosificación previa al pulmón con los dAbs anti-TNFR1 se investigó cuantificando las citoquinas inflamatorias KC, MIP-2, y MCP-1 en el lavado broncoalveolar, y cuantificando la E-selectina en el tejido pulmonar, mediante ELISA. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
Métodos: Estímulo inflamatorio: TNFa de murino recombinante. Sustancia de prueba 1: TAR2m-21-23 (Lote BH31/01/06) (dAb anti-TNFFM). Vehículo para TNFa rm: Suero regulado con fosfato conteniendo albúmina de suero bovino al 0.1 por ciento. Vehículo para TAR2m-21-23: Regulador de citrato 20 nM, pH de 6. La dosis del TNFa fue de 1 microgramo por ratón mediante la vía intranasal (i.n.), como se utilizó en el estudio anterior. El volumen administrado a la nariz fue de 50 microlitros por ratón (20 microgramos/mililitro). La dosis de TAR2m-21-23 fue de 0.3 miligramos/kilogramo por la vía intranasal. El volumen administrado a la nariz fue de 50 microlitros por ratón (0.4 miligramos/kilogramo, debido a que los ratones eran de 20 gramos). Ratones utilizados y preparación de dAb: Los ratones fueron de la misma raza, y se alojaron como se detalla en el protocolo de estudio anterior. Protocolos: Grupos de tratamiento: Tamaño del grupo: n=4-7. Tiempos de tratamiento: Los grupos de ratones se dosificaron intranasalmente ya sea con el vehículo o bien con el dAb, 1, 2, 4, ó 6 horas antes de la administración del TNFa. Todos los grupos se sacrificaron 6 horas después de la administración del TNFa. Dosificación y procedimientos terminales: Los ratones se dosificaron como se detalla anteriormente, empleando el mismo procedimiento que en el estudio anterior. Los ratones se sacrificaron 6 horas después de la administración intranasal del TNFa, y se recolectaron las células del lavado broncoalveolar, el sobrenadante del lavado broncoalveolar, y el tejido pulmonar congelado como se detalla en el estudio anterior. Preparación de muestras y ELISA: La proteína, KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar, y la proteína y la E-selectina del sobrenadante del homogenato pulmonar, se examinaron como se detalla en el experimento anterior. Tabla 6. Duración de Acción In Vivo de un dAb Anti-TNFR12 La tabla muestra las concentraciones promedio de KC (picogramos/mililitro), MIP-2 (picogramos/mililitro), y MCP-1 (picogramos/mililitro) en el lavado broncoalveolar, y de E-selectina en el tejido pulmonar (nanogramos/mililitro), 6 horas después de la administración intranasal de TNFa o de vehículo. El dAb anti-TNFR1 se administró 1,2, 4, ó 6 horas antes de la administración del TNFa.
Los resultados presentados en la Tabla 6 muestran que la administración del dAb, 1, 2, 4, ó 6 horas antes de la administración del TNFa, inhibió de una manera significativa las KC y MIP-2 del lavado broncoalveolar inducidas por el TNF en todos los puntos del tiempo antes de la dosis del dAb. Se observó una mejor inhibición en tiempos antes de la dosis más largos. Esto sugiere que >1 hora es óptimo para el enlace del dAb con el receptor en seguida de la dosificación intranasal. De una manera similar, la administración del dAb 1, 2, 4, ó 6 horas antes de la administración del TNFa, también inhibió de una manera significativa la MCP-1del lavado broncoalveolar y la E-selectina del tejido pulmonar inducidas por el TNF en todos los puntos del tiempo antes de la dosis del dAb. Estos resultados muestran que el dAb anti-TNFR1 tiene una duración de acción que es mayor de 6 horas. EJEMPLO 9. Evaluación de un dAb anti-TNFFM que se enlaza con el TNFR1 e inhibe el enlace del TNFa con el receptor administrado por la vía intranasal, sobre inflamación pulmonar inducida por el TNFa. Los Ejemplos anteriores muestran que un dAb anti-TNFR1 ("dAb no competitivo", TAR2m-21-23) que se enlaza con el TNFR1 , pero que no inhibe el enlace del TNFa con el TNFR1, inhibió de una manera significativa la inflamación pulmonar inducida por el TNFa. Este estudio demuestra que un dAb que se enlaza con el TNFR1 e inhibe el enlace de TNFa con el TNFR1 ("dAb competitivo" TAR2m-15-12) también fue eficaz para inhibir la inflamación pulmonar inducida por el TNFa. Métodos: Estímulo inflamatorio: TNFa de murino recombinante. Sustancia de prueba. TAR2m-21-23 (Lote BH31/01/06) (dAb anti-TNFR1 competitivo). Sustancia de prueba: TAR2m-15-12 (dAb anti-TNFR1 no competitivo). Vehículo para TNFa rm: Suero regulado con fosfato conteniendo albúmina de suero bovino al 0.1 por ciento. Vehículo para dAbs: Regulador de citrato 20 nM, pH de 6. La dosis para el TNFa fue de 1 microgramo por ratón mediante la vía intranasal (i.n.), como se utilizó en el estudio anterior. El volumen administrado a la nariz fue de 50 microlitros por ratón (20 microgramos/mililitro). La dosis de TAR2m-21-23 o de TAR2m-15-12 fue de 0.3, 0.1, y 0.03 miligramos/kilogramo por la vía intranasal. El volumen administrado a la nariz fue de 50 microlitros por ratón (0.4 miligramos/mililitro, debido a que los ratones eran de 20 gramos). Ratones utilizados y preparación del dAb: Los ratones fueron de la misma raza, y se alojaron como se detalla en el protocolo de estudio anterior. El dAb se formuló como se describe anteriormente. Protocolos: Grupos de tratamiento: Tamaño de grupo: n = 4-7. Tiempos de tratamiento: Los grupos de ratones se dosificaron intranasalmente ya sea con el vehículo o bien con el dAb 1 hora antes de la administración del TNFa. Todos los grupos se sacrificaron 6 horas después de la administración del TNFa. Dosificación y procedimientos terminales: Los ratones se dosificaron como se detalla anteriormente, empleando el mismo procedimiento que en el estudio anterior. Los ratones se sacrificaron 6 horas después de la administración intranasal del TNFa, y se recolectaron las células del lavado broncoalveolar, el sobrenadante del lavado broncoalveolar, y el tejido pulmonar congelado, como se detalla en el estudio anterior. Preparación de muestras y ELISA: La proteína, KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar, y la proteína y la E-selectina del sobrenadante del homogenato pulmonar, se examinaron como se detalla en el experimento anterior.
Tabla 7. Efectos dependientes de la dosis de un dAb anti-TNFR1 competitivo o uno no competitivo sobre los incrementos en las concentraciones de KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar y de E-selectina en el tejido pulmonar inducidos por el TNFa3 3La tabla muestra el porcentaje de inhibición (promedio + SD) en las concentraciones de KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar, y de E-selectina en el tejido pulmonar, inducidos por TNFa, en dosis del dAb de 0.3, 0.1, y 0.03 miligramos/kilogramo. Los resultados presentados en la Tabla 7 muestran que, de una manera similar a los tratamientos anteriores, el tratamiento previo (1 hora antes del TNFa) con una dosis del dAb anti-TNFR1 no competitivo (TAR2m-21 -23), inhibió la elevación de los mediadores inflamatorios KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar y de la E-selectina del tejido pulmonar. De una manera similar, un dAb anti- TNFR1 competitivo (TAR2m-15-12) también inhibió de una manera dependiente de la dosis la elevación de los mediadores inflamatorios KC, MIP-2, y MCP-1 del lavado broncoalveolar, y de la E-selectina del tejido pulmonar. El dAb anti-TNFR1 TAR2m-15-12 tuvo ligeramente menos eficacia sobre la KC del lavado broncoalveolar en 0.03 miligramos/kilogramo, y sobre la MIP-2 del lavado broncoalveolar en 0.1 a 0.03 miligramos/kilogramo, comparándose con TAR2m-21-23. El dAb anti-TNFR1 TAR2m-15-12 fue inactivo sobre la MCP-1 del lavado broncoalveolar en 0.1 miligramos/kilogramo, comparándose con TAR2m-21-23 que mostró una inhibición del 34 por ciento sobre la MCP-1 del lavado broncoalveolar. El dAb anti-TNFR1 TAR2m-15-12 tuvo ligeramente menos eficacia sobre la E-selectina del tejido pulmonar en 0.1 miligramos/kilogramo, comparándose con TAR2m-21-23. La potencia in vitro fue de aproximadamente 1 nM para TAR2m-21-23, y de aproximadamente 5 nM para TAR2m-15-12. En adición, TAR2m-21-23 tiene una mayor afinidad y un índice de desactivación más lento que TAR2m-15-12. La diferencia en la eficacia sobre los mediadores inflamatorios posiblemente se debe a la afinidad y potencia reducidas. Esto indica que no hay una diferencia obvia entre un dAb no competitivo (TAR2m-21 -23) y un dAb competitivo TAR2m-15-12 que inhibe el enlace de TNFa con TNFR1. SUMARIO La Tabla 8 resume los resultados de los estudios inducidos por el humo del tabaco y los estudios inducidos por TNF. El grupo tratado con el dAb anti-TNFR1 PEGilado y expuesto al humo del tabaco (10 miligramos/kilogramo), mostró infiltrados celulares significativamente reducidos en el pulmón, comparándose con los grupos tratados con control y expuesto al humo del tabaco: inhibición del 62 por ciento para las células totales. No se observaron reducciones significativas en cualquiera de las poblaciones celulares en el grupo tratado con (10 miligramos/kilogramo intraperitonealmente) de humo de tabaco/ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation). Solamente se observaron infiltrados celulares significativamente reducidos en el grupo tratado con humo de tabaco/ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation) cuando se incrementó la dosificación hasta 30 miligramos/kilogramo (intraperitonealmente). Esto indica que se requiere una dosificación en miligramos/kilogramo sistémica >3 veces más alta de ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation), comparándose con el dAb anti-TNFR1 PEGilado, para alcanzar reducciones significativas en las poblaciones celulares. En el modelo inducido por TNFa, el grupo tratado con dAb anti-TNFR1 (0.3 miligramos/kilogramo intranasalmente), muestra una inhibición del 78 por ciento de los niveles de MIP-2 inducidos por TNFa. Se alcanzó un nivel similar de inhibición en los niveles de NIP-2 (78 por ciento) en el grupo de ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation) tratado con 10 miligramos/kilogramo (intranasalmente). El grupo de ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation) tratado con 1 miligramo/kilogramo (intranasalmente) no mostró reducciones significativas del influjo celular. Juntos, estos datos indican que se requiere una dosificación en miligramos/kilogramo intranasal >30 veces más alta de ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation), comparándose con el dAb anti-TNFR1, para lograr una inhibición eficiente de MIP-2. Tabla 8 Potencia ND50 Inhibición MW, Dosificación del influjo Ensayo Molécula kD t1/2p ROA (mg/kg) celular L929 62% PEG-TAR2m 52 2-4d 1 nM i.p. mg/kg (p<0.001) ENBREL® (etanercept; 1d 150 5-50 pM i.p. 10 mg/kg -1% (ns) Immunex (estimado) Corporation) ENBREL® (etanercept; 1d 37% 150 5-50 pM i.p. 30 mg/kg Immunex (estimado) (p<0.01) Corporation) mAb anti-TNF de 2-7d 6-8 nM 51% 150 i.p. 3 mg/kg rata (estimado) (mTNF) (p<0.001) Potencia ND50 Inhibición MW, Dosificación del influjo Ensayo Molécula kD t1/2p ROA (mg/kg) celular L929 Monómero 4-6 horas 53%/72% 12 1 nM i.n. 1 mg/kg TAR2m i.n. (p<0.05) ENBREL® (etanercept; i d 150 5-50 p i.n. 1 mg/kg 1 1 % (ns) Immunex (estimado) Corporation) Potencia, Reducción ND50 en los MW, Dosificación niveles de Ensayo Molécula kD t1/2p ROA (mg/kg) MIP-2 L929 4-6 horas TAR2m 12 1 nM i.n. 1 mg/kg 120% i.n.
ENBREL® (etanercept; 1 d 150 5-50 pM i.n. 10 mg/kg 78% Immunex (estimado) Corporation) mAb anti-TNF de 2-7d 68 nM 150 i.n. 2.5 mg/kg 87% rata (estimado) (mTNF) Potencia, Reducción ND50 en los MW, Dosificación niveles de Ensayo Molécula kD t1/2p ROA (mg/kg) MIP-2 L929 Monómero 4-6 horas 12 1 nM i.n. 0.3 mg/kg 78% TAR2m i.n.
Monómero 4-6 horas TAR2m (dAb 12 5 nM i.n. 0.3 mg/kg 88% i.n. competitivo) Monómero 4-6 horas 12 1 nM i.n. 0.1 mg/kg 78% TAR2m i.n.
Monómero 4-6 horas TAR2m (dAb 12 5 nM i.n. 0.1 mg/kg 66% i.n. competitivo) Aunq ue esta i nvención se ha mostrado y descrito particularmente con referencia a las modal idades preferidas de la m isma, será entendido por los expertos en este cam po q ue se pueden hacer d iferentes cambios en la forma y en los detalles de la m isma, sin apartarse del alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones adj untas .

Claims (144)

REIVINDICACIONES
1. El uso de un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, para la fabricación de una formulación de larga acción o de larga ventana terapéutica, para suministro local al tejido pulmonar, en donde se mantiene cuando menos el 50 por ciento del nivel de agente en el tejido pulmonar durante un período de cuando menos aproximadamente 4 horas.
2. El uso de un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, para la fabricación de un medicamento para administración local al tejido pulmonar de una cantidad efectiva en dosis baja de dicho agente, en donde se mantiene cuando menos el 50 por ciento del nivel de agente en el tejido pulmonar durante un período de cuando menos 4 horas.
3. El uso de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde el tejido pulmonar es el pulmón.
4. El uso de la reivindicación 3, en donde se mantiene un nivel pulmonar de cuando menos aproximadamente el 1 por ciento de la cantidad de agente en la formulación o medicamento durante cuando menos 4 horas.
5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el agente no entra sustancialmente a la circulación sistémica.
6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el agente tiene una vida media en suero in vivo de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 12 horas.
7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la formulación o medicamento es para la administración de una dosis de no más de aproximadamente 10 miligramos/kilogramo/día.
8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el agente es un antagonista que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar.
9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el agente es un fragmento de anticuerpo que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar.
10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1a 8, en donde el agente es un monómero dAb que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar.
11. El uso de un anticuerpo de dominio (dAb) que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, para la fabricación de una formulación de dosis diaria para administración local al tejido pulmonar, en donde se mantiene cuando menos el 50 por ciento del nivel pulmonar del agente durante un período de cuando menos aproximadamente 4 horas.
12. El uso de un anticuerpo de dominio (dAb) que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, para la fabricación de una formulación para administración local al tejido pulmonar, en donde no se acumula un nivel significativo del dAb en la circulación sistémica.
13. El uso de un anticuerpo de dominio (dAb) que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, para la fabricación de una formulación para el tratamiento o la prevención de una enfermedad respiratoria, en donde la formulación es para administración local al tejido pulmonar, y no se acumula un nivel significativo del dAb en la circulación sistémica.
14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde se utilizan hasta aproximadamente 10 miligramos de un dAb que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar.
15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde se utilizan de 1 miligramo a 10 miligramos de un dAb que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar.
16. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en donde el objetivo en el tejido pulmonar media la inflamación del pulmón o una enfermedad pulmonar.
17. Un inhalador o dispositivo de suministro intranasal para proporcionar una dosis medida de una formulación de anticuerpo de dominio (dAb) a un sujeto, para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición respiratoria, en donde el inhalador o el dispositivo de suministro intranasal comprende una formulación del dAb, y proporciona una dosis diaria medida que contiene hasta 10 miligramos del dAb.
18. El uso de una formulación de anticuerpo de dominio (dAb) en la fabricación de un inhalador o de un dispositivo de suministro intranasal, para el propósito de proporcionar una formulación de dAb inhalada de larga acción para el suministro local al pulmón.
19. El uso de la reivindicación 18, en donde se mantiene cuando menos el 50 por ciento del nivel pulmonar del agente durante un período de cuando menos aproximadamente 4 horas.
20. El uso de la reivindicación 18 o de la reivindicación 19, en donde el inhalador o el dispositivo de suministro intranasal es para proporcionar una dosis de hasta 10 miligramos/kilogramo/día.
21. El uso de la reivindicación 18, en donde el inhalador o el dispositivo de suministro intranasal es para proporcionar una dosis de hasta 10 miligramos/día.
22. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde la formulación del dAb comprende un dAb que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar que media la inflamación pulmonar o la enfermedad pulmonar.
23. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y 22, en donde el objetivo en el tejido pulmonar se selecciona a partir del grupo que consiste en TNFR1 , IL-1, IL-1R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, 1 L-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12, IL-12R, IL-13, IL-13Ra1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23, IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), quimasa, FGF, Furina, Endotelina-1 , Eotaxinas (por ejemplo, Eotaxina, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1 , ICOS, IgE, IFNa, I-309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, elastasa de neutrófilos, osteopontina, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1, TNF, TNFR1, TRANCE, Triptasa, VEGF, VLA-4, VCAM, a?ß7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfavbeta6, y alfavbeta 8.
24. El uso de la reivindicación 23, en donde el objetivo en el tejido pulmonar es el TNFR1.
25. Un método para administrar un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, a un sujeto, para producir una larga ventana terapéutica en el tejido pulmonar, el cual comprende administrar localmente al tejido pulmonar de este sujeto, una cantidad efectiva de dicho agente.
26. Un método para administrar un agente que se enlaza con un objetivo en el tejido pulmonar, a un sujeto, para producir una larga ventana terapéutica en el tejido pulmonar, el cual comprende seleccionar un agente que tenga una vida media en suero in vivo de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 12 horas, y que se enlace con un objetivo en el tejido pulmonar, y administrar localmente al tejido pulmonar de este sujeto, una cantidad efectiva del agente mencionado.
27. El método de la reivindicación 25, en donde el agente mencionado tiene una vida media en suero in vivo de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 12 horas.
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en donde el agente mencionado no entra sustancialmente a la circulación sistémica.
29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en donde el agente mencionado es un fragmento de enlace de antígeno de un anticuerpo.
30. El método de la reivindicación 29, en donde el agente mencionado es un fragmento Fv.
31. El método de la reivindicación 29, en donde el agente mencionado es un monómero dAb.
32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31, en donde se administra una cantidad efectiva de dosis baja.
33. Un método para el tratamiento de una enfermedad respiratoria, el cual comprende administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad efectiva de un antagonista de TNFR1, en donde esta cantidad efectiva no exceda de aproximadamente 10 miligramos/kilogramo/día, y en donde el nivel de células inflamatorias en el pulmón se reduce en relación con los niveles antes del tratamiento con una p<0.05.
34. El método de la reivindicación 33, en donde el nivel de células inflamatorias en el pulmón se evalúa mediante conteos de células totales en el lavado broncoalveolar, en el esputo, o en la biopsia bronquial.
35. El método de la reivindicación 33, en donde el nivel de células inflamatorias en el pulmón se evalúa mediante conteos de macrófagos y/o néutrófilos en el lavado broncoalveolar, en el esputo, o en la biopsia bronquial.
36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, en donde el antagonista de TNFR1 se administra localmente al tejido pulmonar de un sujeto que lo necesite.
37. El método de la reivindicación 36, en donde el antagonista de TNFR1 se administra localmente al tejido pulmonar mediante inhalación o administración intranasal.
38. El método de la reivindicación 36 o de la reivindicación 37, en donde se administra una cantidad terapéutica de dosis baja.
39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, en donde el antagonista de TNFR1 se administra sistémicamente a un sujeto que lo necesite.
40. El método de la reivindicación 39, en donde el antagonista de TNFR1 se administra sistémicamente de una forma intraperitoneal o subcutánea.
41. El método de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, en donde el antagonista de NTFR1 persiste en el tejido pulmonar durante cuando menos 8 horas después de que se administra.
42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 36, 37, y 41, en donde el tejido pulmonar mencionado es el pulmón.
43. El método de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, 41 y 42, en donde el antagonista de TNFR1 mencionado no entra sustancialmente a la circulación sistémica.
44. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 43, en donde el antagonista de TNFR1 se administra en aproximadamente 5 miligramos/kilogramo o menos, una vez al día.
45. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 43, en donde el antagonista de TNFR1 se administra en aproximadamente 1 miligramo/kilogramo o menos, una vez al día.
46. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 43, en donde se reduce el nivel de células inflamatorias en el pulmón en relación con los niveles antes del tratamiento por cuando menos aproximadamente el 30 por ciento.
47. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 45, en donde se reduce el nivel de células inflamatorias en el pulmón en relación con los niveles antes del tratamiento por cuando menos aproximadamente el 50 por ciento.
48. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 45, en donde se reduce el nivel de células inflamatorias en el pulmón en relación con los niveles antes del tratamiento por cuando menos aproximadamente el 70 por ciento.
49. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 45, en donde se reduce el nivel de células inflamatorias en el pulmón en relación con los niveles antes del tratamiento con una p<0.00 .
50. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 49, en donde la enfermedad respiratoria mencionada se selecciona a partir del grupo que consiste en: inflamación pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, neumonía, neumonitis por hipersensibilidad, infiltrado pulmonar con eosinofilia, enfermedad pulmonar ambiental, neumonía, bronquiectasis, fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar primaria, tromboembolia pulmonar, trastornos de la pleura, trastornos del mediastino, trastornos del diafragma, hipoventilación, hiperventilación, apnea del sueño, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, mesotelioma, sarcoma, rechazo de injerto, enfermedad del injerto contra el huésped, cáncer pulmonar, rinitis alérgica, alergia, asbestosis, aspergiloma, aspergilosis, bronquiectasis, bronquitis crónica, enfisema, neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad neumocócica invasiva, influenza, micobacteria no tuberculosa, efusión pleural, neumoconiosis, neumocitosis, neumonía, actinomicosis pulmonar, proteinosis pulmonar alveolar, ántrax pulmonar, edema pulmonar, émbolo pulmonar, inflamación pulmonar, histiocitosis X pulmonar, hipertensión pulmonar, nocardiosis pulmonar, tuberculosis pulmonar, enfermedad veno-oclusiva pulmonar, enfermedad pulmonar reumatoide, sarcoidosis, y granulomatosis de Wegener.
51. El método de la reivindicación 50, en donde la enfermedad respiratoria mencionada es enfermedad pulmonar obstructiva crónica o asma.
52. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 51, en donde el antagonista de TNFR1 comprende un dominio de polipéptido qué tiene especificidad de enlace por el TNFR1, pero no agoniza sustancialmente el TNFR1.
53. El método de la reivindicación 52, en donde el dominio de polipéptido es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
54. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 51, en donde el antagonista de TNFR1 comprende un anticuerpo de dominio (dAb) que se enlaza con el TNFR1, y que inhibe el enlace del factor de necrosis tumoral-alfa (TNFa) con el TNFR1, o que inhibe la transducción de señales mediada a través del TNFR1 después del enlace del TNFa, en donde este dAb se selecciona a partir del grupo que consiste en un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina.
55. El método de la reivindicación 54, en donde el dAb mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en un VH humano que tiene especificidad de enlace por el TNFR1 humano, y un VL humano que tiene especificidad de enlace por el TNFR1 humano.
56. El método de la reivindicación 55, en donde la secuencia de aminoácidos del dAb mencionado es cuando menos el 90 por ciento homologa a la secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en: TAR2h-12 (SEQ ID NO:1), TAR2h-13 (SEQ ID NO:2), TAR2h-14 (SEQ ID NO:3), TAR2h-16 (SEQ ID NO:4), TAR2h-17 (SEQ ID NO:5), TAR2h-18 (SEQ ID NO:6), TAR2h-19 (SEQ ID NO:7), TAR2h-20 (SEQ ID NO:8), TAR2h-21 (SEQ ID NO:9), TAR2h-22 (SEQ ID NO:10), TAR2h-23 (SEQ ID NO:11), TAR2h-24 (SEQ ID NO:12), TAR2h-25 (SEQ ID NO:13), TAR2h-26 (SEQ ID NO:14), TAR2h-27 (SEQ ID NO:15), TAR2h-29 (SEQ ID NO:16), TAR2h-30 (SEQ ID NO:17), TAR2h-32 (SEQ ID NO:18), TAR2h-33 (SEQ ID NO:19), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:20), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:21), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:22), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:23), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:24), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:25), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:26), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO-.27), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:28), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:29), TAR2h- 10- 11 (SEQ ID NO:30), TAR2h- 10- 12 (SEQ ID NO:31) TAR2h- 10- 13 (SEQ ID NO:32), TAR2h- 10- 14 (SEQ ID NO:33) TAR2h- 10- 15 (SEQ ID NO:34), TAR2h- 10- 16 (SEQ ID NO:35) TAR2h- 10- 17 (SEQ ID NO:36), TAR2h- 10- 18 (SEQ ID NO:37) TAR2h- 10- 19 (SEQ ID NO:38), TAR2h- 10- 20 (SEQ ID NO:39) TAR2h- 10- 21 (SEQ ID NO:40), TAR2h- 10- 22 (SEQ ID NO:41) TAR2h- 10- 27 (SEQ ID NO:42), TAR2h- 10- 29 (SEQ ID NO:43) TAR2h- 10- 31 (SEQ ID NO:44), TAR2h- 10- 35 (SEQ ID NO:45) TAR2h- 10- 36 (SEQ ID NO:46), TAR2h- 10- 37 (SEQ ID NO:47) TAR2h- 10- 38 (SEQ ID NO:48), TAR2h- 10- 45 (SEQ ID NO:49) TAR2h- 10 •47 (SEQ ID NO:50), TAR2h- 10- 48 (SEQ ID NO:51) TAR2h- 10 •57 (SEQ ID NO:52), TAR2 - 10- 56 (SEQ ID NO:53) TAR2h- 10 •58 (SEQ ID NO:54), TAR2h- 10- 66 (SEQ ID NO:55) TAR2h- 10 -64 (SEQ ID NO:56), TAR2h- 10- 65 (SEQ ID NO:57) TAR2h- 10 -68 (SEQ ID NO:58), TAR2h •10 •69 (SEQ ID NO:59) TAR2h- 10 -67 (SEQ ID NO:60), TAR2h ¦10 •61 (SEQ ID NO:61) TAR2h- •10 -62 (SEQ ID NO:62), TAR2h •10 -63 (SEQ ID NO:63) TAR2h •10 -60 (SEQ ID NO:64), TAR2 •10 ¦55 (SEQ ID NO:65) TAR2h -10 -59 (SEQ ID NO:66), TAR2h -10 -70 (SEQ ID NO:67] TAR2h-34 (SEQ ID NO:68), TAR2h-35 (SEQ ID NO:69), TAR2h-36 (SEQ ID NO:70), TAR2h-37 (SEQ ID NO:71), TAR2h-38 (SEQ ID NO:72), TAR2h-39 (SEQ ID NO:73), TAR2h-40 (SEQ ID NO:74), TAR2h-41 (SEQ ID NO:75), TAR2h-42 (SEQ ID NO:76), TAR2h-43 (SEQ ID NO:77), TAR2h-44 (SEQ ID NO:78), TAR2h-45 (SEQ ID NO:79), TAR2h-47 (SEQ ID NO:80), TAR2h-48 (SEQ ID NO:81), TAR2h-50 (SEQ ID NO:82), TAR2h-51 (SEQ ID NO:83), TAR2h-66 (SEQ ID NO:84), TAR2h-67 (SEQ ID NO:85), TAR2h-68 (SEQ ID NO:86), TAR2h-70 (SEQ ID NO:87), TAR2h-71 (SEQ ID NO:88), TAR2h-72 (SEQ ID NO:89), TAR2h-73 (SEQ ID NO:90), TAR2h-74 (SEQ ID NO:91), TAR2h-75 (SEQ ID NO:92), TAR2h-76 (SEQ ID NO:93), TAR2h-77 (SEQ ID NO:94), TAR2h-78 (SEQ ID NO:95), TAR2h-79 (SEQ ID NO:96), TAR2h-15 (SEQ ID NO:97), TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:98), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:99), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:100), TAR2h-15-8-1 SEQ ID NO:101), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO:102), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:103), TAR2 -154-10-5 (SEQ ID NO:104), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:105), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO:106), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO:107), TAR2h-35-4 (SEQ ID NO:108), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:109), TAR2h-80 (SEQ ID NO:110), TAR2h-81 (SEQ ID NO:111), TAR2h-82 (SEQ ID NO:112), TAR2h-83 (SEQ ID NO:113), TAR2h-84 (SEQ ID NO:114), TAR2h-85 (SEQ ID NO:115), TAR2h-86 (SEQ ID NO:116), TAR2h-87 (SEQ ID NO:117), TAR2h-88 (SEQ ID NO:118), TAR2h-89 (SEQ ID NO:119), TAR2h-90 (SEQ ID NO:120), TAR2h-91 (SEQ ID NO:121), TAR2h-92 (SEQ ID NO:122), TAR2h-93 (SEQ ID NO:123), TAR2h-94 (SEQ ID NO:124), TAR2h-95 (SEQ ID NO:125), TAR2h-96 (SEQ ID NO:126), TAR2h-97 (SEQ ID NO:127), TAR2h-99 (SEQ ID NO:128), TAR2h-100 (SEQ ID NO:129), TAR2h-101 (SEQ ID NO:130), TAR2h-102 (SEQ ID NO:131), TAR2h-1Ó3 (SEQ ID NO:132), TAR2h-104 (SEQ ID NO 133), TAR2h •105 (SEQ ID NO 134), TAR2h- 106 (SEQ ID NO 135), TAR2h ¦107 (SEQ ID NO 136), TAR2h- 108 (SEQ ID NO 137), TAR2h ¦109 (SEQ ID NO 138), TAR2h- 110 (SEQ ID NO 139), TAR2h -111 (SEQ ID NO 140), TAR2h- 112 (SEQ ID 5 NO 141), TAR2h ¦113 (SEQ ID NO 142), TAR2h- 114 (SEQ ID NO 143), TAR2h ¦115 (SEQ ID NO 144), TAR2h- 116 (SEQ ID NO 145), TAR2h - 17 (SEQ ID NO 146), TAR2h- 118 (SEQ ID NO 147), TAR2h ¦119 (SEQ ID NO 148), TAR2h- 120 (SEQ ID NO 149), TAR2h ¦121 (SEQ ID NO 150), TAR2h- 122 (SEQ ID 10 NO 151), TAR2h •123 (SEQ ID NO 152), TAR2h- 124 (SEQ ID NO 153), TAR2h ¦125 (SEQ ID NO 154), TAR2h- 126 (SEQ ID NO 155), TAR2h -127 (SEQ ID NO 156), TAR2h- 128 (SEQ ID NO 157), TAR2h -129 (SEQ ID NO 158), TAR2h- 130 (SEQ ID NO 159), TAR2h -131 (SEQ ID NO 160), TAR2h- 132 (SEQ ID 15 NO 161), TAR2h -133 (SEQ ID NO 162), TAR2h- 151 (SEQ ID NO 163), TAR2h -152 (SEQ ID NO 164), TAR2h- 153 (SEQ ID NO 165), TAR2h -154 (SEQ ID NO 166), TAR2h- 159 (SEQ ID NO 167), TAR2h -165 (SEQ ID NO 168), TAR2h- 166 (SEQ ID NO 169), TAR2h -168 (SEQ ID NO 170), TAR2h- 171 (SEQ ID 20 NO 171), TAR2h -172 (SEQ ID NO 172), TAR2h- 173 (SEQ ID NO 173), TAR2h -174 (SEQ ID NO 174), TAR2h- 176 (SEQ ID NO 175), TAR2h -178 (SEQ ID NO 176), TAR2h- 201 (SEQ ID 0 NO 177), TAR2h -202 (SEQ ID NO 178), TAR2h- 203 (SEQ ID NO 179); TAR2h- 204 (SEQ ID NO:180), TAR2h-185-25 (SEQ ID 25 NO : 181 ) , TAR2h- 154- 10 (SEQ ID NO:182), y TAR2h-205 (SEQ ID NO:183).
57. El método de cualquiera de las reivindicaciones 52 a 56, en donde el antagonista de TNFR1 comprende además una fracción que prolonga la vida media.
58. El método de la reivindicación 57, en donde la fracción que prolonga la vida media mencionada es una fracción de polialquilenglicol, albúmina de suero o un fragmento de la misma, receptor de transferrina o una porción de enlace de transferrina del mismo, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de enlace para un polipéptido que mejora la vida media in vivo.
59. El método de la reivindicación 58, en donde la fracción que prolonga la vida media mencionada es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de enlace para la albúmina de suero o para el receptor de Fe neonatal.
60. El método de la reivindicación 59, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo mencionados, es un dAb.
61. El método de la reivindicación 59, en donde la fracción que prolonga la vida media mencionada es una fracción de polietilenglicol.
62. Un método para el tratamiento de una enfermedad respiratoria, el cual comprende: seleccionar un antagonista del receptor del factor de necrosis tumoral-1 (TNFR1), que tiene eficacia en un modelo animal adecuado de enfermedad respiratoria cuando se administra en una cantidad que no excede de aproximadamente 10 miligramos/ kilogramo una vez al día, en donde la eficacia en este modelo animal existe cuando se inhibe la infiltración celular de los pulmones, evaluada por un conteo celular total en el lavado broncoalveolar, en relación con un control no tratado, con un p<0.05; y administrar una cantidad efectiva de este antagonista de TNFR1 a un sujeto que lo necesite.
63. El método de la reivindicación 62, en donde el modelo animal adecuado es el modelo sub-crónico de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) inducida por el humo del tabaco en ratones hembras C57BL/6.
64. El método de la reivindicación 62, en donde el modelo animal adecuado es un modelo de asma o de enfermedad pulmonar obstructiva crónica de primate no humano.
65. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 64, en donde se inhibe la infiltración celular del pulmón en el modelo animal mencionado, en relación con un control no tratado, por cuando menos aproximadamente el 30 por ciento.
66. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 64, en donde se inhibe la infiltración celular del pulmón en el modelo animal en relación con un control no tratado, por cuando menos aproximadamente el 50 por ciento.
67. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 64, en donde se inhibe la infiltración celular del pulmón en el modelo animal mencionado, en relación con un control no tratado, por cuando menos aproximadamente el 70 por ciento.
68. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 67, en donde el antagonista de TNFR1 mencionado inhibe la infiltración celular de los pulmones en el modelo animal, en relación con el control no tratado, con un p<0.001.
69. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 68, en donde el antagonista de TNFR1 mencionado inhibe la infiltración celular de los pulmones, evaluada por un conteo celular total en el lavado broncoalveolar, en relación con un control no tratado en este modelo animal adecuado, hasta un mayor grado que un inhibidor de fosfodiesterasa-4 oralmente administrado.
70. El método de la reivindicación 69, en donde el inhibidor de fosfodiesterasa-4 oralmente administrado es BAY 19-8004.
71. El método de la reivindicación 70, en donde el BAY 19-8004 mencionado se administra dos veces al día, en una dosis de 10 miligramos/kilogramo.
72. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 71, en donde la enfermedad respiratoria mencionada se selecciona a partir del grupo que consiste en: inflamación pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, neumonía, neumonitis por hipersensibilidad, infiltrado pulmonar con eosinofilia, enfermedad pulmonar ambiental, neumonía, bronquiectasis, fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar primaria, tromboembolia pulmonar, trastornos de la pleura, trastornos del mediastino, trastornos del diafragma, hipoventilación, hiperventilación, apnea del sueño, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, mesotelioma, sarcoma, rechazo de injerto, enfermedad del injerto contra el huésped, cáncer pulmonar, rinitis alérgica, alergia, asbestosis, aspergiloma, aspergilosis, bronquiectasis, bronquitis crónica, enfisema, neumonía eosinof ílica, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad neumocócica invasiva, influenza, micobacteria no tuberculosa, efusión pleural, neumoconiosis, neumocitosis, neumonía, actinomicosis pulmonar, proteinosis pulmonar alveolar, ántrax pulmonar, edema pulmonar, émbolo pulmonar, inflamación pulmonar, histiocitosis X pulmonar, hipertensión pulmonar, nocardiosis pulmonar, tuberculosis pulmonar, enfermedad veno-oclusiva pulmonar, enfermedad pulmonar reumatoide, sarcoidosis, y granulomatosis de Wegener.
73. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 71, en donde el sujeto mencionado es un ser humano, la enfermedad respiratoria mencionada es enfermedad pulmonar obstructiva crónica o asma, y en donde se administran no más de 10 miligramos/día.
74. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 73, en donde el antagonista de TNFR1 comprende un dominio de polipéptido que tiene una especificidad de enlace para TNFR1, pero no agoniza sustancialmente el TNFR1.
75. El método de la reivindicación 74, en donde el dominio de polipéptido mencionado es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
76. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62 a 73, en donde el antagonista de TNFR1 comprende un anticuerpo de dominio (dAb) que se enlaza con el TNFR1, y que inhibe el enlace del factor de necrosis tumoral-alfa (TNFa) con el TNFR1, o que inhibe la transducción de señales mediada a través del TNFR1 después del enlace del TNFa, en donde este dAb se selecciona a partir del grupo que consiste en un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina.
77. El método de la reivindicación 76, en donde el dAb mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en un dominio variable de cadena pesada humano (VH) que tiene especificidad de enlace por el TNFR1 humano, y un dominio variable de cadena ligera humano (VL) que tiene especificidad de enlace por el TNFR1 humano.
78. El método de la reivindicación 77, en donde la secuencia de aminoácidos del dAb mencionado es cuando menos el 90 por ciento homologa a la secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en: TAR2h-12 (SEQ ID NO:1), TAR2h-13 (SEQ ID NO:2), TAR2h-14 (SEQ ID NO:3), TAR2h-16 (SEQ ID NO:4), TAR2h-17 (SEQ ID NO:5), TAR2h-18 (SEQ ID NO:6), TAR2h-19 (SEQ ID NO:7), TAR2h-20 (SEQ ID NO:8), TAR2h-21 (SEQ ID NO:9), TAR2h-22 (SEQ ID NO:10), TAR2h-23 (SEQ ID NO:11), TAR2h-24 (SEQ ID NO:12), TAR2h-25 (SEQ ID NO:13), TAR2h-26 (SEQ ID NO:14), TAR2h-27 (SEQ ID NO:15), TAR2h-29 (SEQ ID NO:16), TAR2h-30 (SEQ ID NO:17), TAR2h-32 (SEQ ID NO:18), TAR2h-33 (SEQ ID NO:19), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:20), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:21), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:22), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:23), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:24), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:25), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:26), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:27), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:28), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:29), TAR2h- 10 •11 (SEQ ID NO:30), TAR2h- 10- 12 (SEQ ID NO:31), TAR2h- 10 ¦13 (SEQ ID NO:32), TAR2h- 10- 14 (SEQ ID NO:33), TAR2h- 10 •15 (SEQ ID NO:34), TAR2h- 10- 16 (SEQ ID NO:35), TAR2h- 10 ¦17 (SEQ ID NO:36), TAR2h- 10- 18 (SEQ ID NO:37), TAR2h- 10 -19 (SEQ ID NO:38), TAR2h- 10- 20 (SEQ ID NO:39), TAR2h- 10 -21 (SEQ ID NO:40), TAR2h- 10- 22 (SEQ ID NO:41), TAR2h- 10 -27 (SEQ ID NO:42), TAR2h- 10- 29 (SEQ ID NO:43), TAR2h- 10 -31 (SEQ ID NO:44), TAR2h- 10- 35 (SEQ ID NO:45), TAR2h- 10 -36 (SEQ ID NO:46), TAR2h- 10- 37 (SEQ ID NO:47), TAR2h- 10 -38 (SEQ ID NO:48), TAR2h- 10- 45 (SEQ ID NO:49), TAR2 - 10 -47 (SEQ ID NO:50), TAR2h- 10- 48 (SEQ ID NO:51), TAR2h- 10 -57 (SEQ ID NO:52), TAR2h- 10- 56 (SEQ ID NO:53), TAR2h- 10 -58 (SEQ ID NO:54), TAR2h- 10- 66 (SEQ ID NO:55), TAR2h- 10 -64 (SEQ ID NO:56), TAR2h- 10- 65 (SEQ ID NO:57), TAR2h- 10 -68 (SEQ ID NO:58), TAR2h- 10- 69 (SEQ ID NO:59), TAR2h- 10 -67 (SEQ ID NO:60), TAR2h- 10- 61 (SEQ ID NO:61), TAR2h- 10 -62 (SEQ ID NO:62), TAR2h- 10- 63 (SEQ ID NO:63), TAR2h- 10 -60 (SEQ ID NO:64), TAR2h- 10- 55 (SEQ ID NO:65), TAR2h- 10 -59 (SEQ ID NO:66), TAR2h- 10- 70 (SEQ ID NO:67), TAR2h- 34 (SEQ ID NO: 68), TAR2h-35 (SEQ ID NO:69), TAR2h-36 (SEQ ID NO:70), TAR2h-37 (SEQ ID NO:71), TAR2h -38 (SEQ ID NO:72), TAR2 -39 (SEQ ID NO:73), TAR2h-40 (SEQ ID NO:74), TAR2h-41 (SEQ ID NO:75), TAR2h-42 (SEQ ID NO:76), TAR2h-43 (SEQ ID NO:77), TAR2h-44 (SEQ ID NO:78), TAR2h-45 (SEQ ID NO:79), TAR2h-47 (SEQ ID NO:80), TAR2h-48 (SEQ ID NO:81), TAR2h-50 (SEQ ID NO:82), TAR2h-51 (SEQ ID NO:83), TAR2h-66 (SEQ ID NO:84), TAR2h-67 (SEQ ID NO:85), TAR2h-68 (SEQ ID NO:86), TAR2 -70 (SEQ ID NO:87), TAR2h-71 (SEQ ID NO:88), TAR2 -72 (SEQ ID NO:89), TAR2h-73 (SEQ ID NO:90), TAR2h-74 (SEQ ID NO:91), TAR2h-75 (SEQ ID NO:92), TAR2h-76 (SEQ ID NO:93), TAR2h-77 (SEQ ID NO:94), TAR2h-78 (SEQ ID NO:95), TAR2h-79 (SEQ ID NO:96), TAR2h-15 (SEQ ID NO:97), TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:98), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:99), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:100), TAR2h-15-8-1 SEQ ID NO:101), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO:102), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:103), TAR2h-154-10-5 (SEQ ID NO:104), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:105), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO:106), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO:107), TAR2h-35-4 (SEQ ID NO:108), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:109), TAR2h-80 (SEQ ID NO:110), TAR2h-81 (SEQ ID NO:111), TAR2h-82 (SEQ ID NO:112), TAR2h-83 (SEQ ID NO:113), TAR2h-84 (SEQ ID NO:114), TAR2h-85 (SEQ ID NO:115), TAR2h-86 (SEQ ID NO:116), TAR2h-87 (SEQ ID NO:117), TAR2h-88 (SEQ ID NO:118), TAR2h-89 (SEQ ID NO:119), TAR2h-90 (SEQ ID NO:120), TAR2h-91 (SEQ ID NO:121), TAR2h-92 (SEQ ID NO:122), TAR2h-93 (SEQ ID NO:123), TAR2h-94 (SEQ ID NO:124), TAR2h-95 (SEQ ID NO:125), TAR2h-96 (SEQ ID NO:126), TAR2h-97 (SEQ ID NO:127), TAR2h-99 (SEQ ID NO:128), TAR2h-100 (SEQ ID NO:129), TAR2h-101 (SEQ ID NO: 30), TAR2h-102 (SEQ ID NO:131 TAR2h- 103 (SEQ ID NO:132 TAR2h-104 (SEQ ID NO:133 TAR2h- 105 (SEQ ID NO:134 TAR2h-106 (SEQ ID NO:135 TAR2h- 107 (SEQ ID NO:136 TAR2h-108 (SEQ ID NO.-137 TAR2h- 109 (SEQ ID NO:138 TAR2h-1 0 (SEQ ID NO:139 TAR2h- 111 (SEQ ID NO:140 TAR2 -112 (SEQ ID NO:141 TAR2h- 113 (SEQ ID NO:142 TAR2h-114 (SEQ ID NO:143 TAR2h- 115 (SEQ ID NO:144 TAR2h-116 (SEQ ID NO:145 TAR2h- 117 (SEQ ID NO:146 TAR2h-118 (SEQ ID NO:147 TAR2 - 119 (SEQ ID NO:148 TAR2 -120 (SEQ ID NO:149 TAR2h- 121 (SEQ ID NO:150 TAR2h-122 (SEQ ID NO:151 TAR2h- 123 (SEQ ID NO:152 TAR2h-124 (SEQ ID NO:153 TAR2h- 125 (SEQ ID NO:154 TAR2h-126 (SEQ ID NO:155 TAR2h- 127 (SEQ ID NO:156 TAR2h-128 (SEQ ID NO:157 TAR2h- 129 (SEQ ID NO:158 TAR2 -130 (SEQ ID NO:159 TAR2h- 131 (SEQ ID NO:160 TAR2h-132 (SEQ ID NO:161 TAR2h- 133 (SEQ ID NO:162 TAR2h-151 (SEQ ID NO:163 TAR2h- 152 (SEQ ID NO:164 TAR2h-153 (SEQ ID NO:165 TAR2h- 154 (SEQ ID NO:166 TAR2h-159 (SEQ ID NO:167 TAR2h- 165 (SEQ ID NO:168 TAR2 -166 (SEQ ID NO:169 TAR2h- 168 (SEQ ID NO.170 TAR2h-171 (SEQ ID NO:171 TAR2h- 172 (SEQ ID NO:172 TAR2h-173 (SEQ ID NO:173 TAR2h- 174 (SEQ ID NO:174 TAR2h-176 (SEQ ID NO:175 TAR2h- 178 (SEQ ID NO:176 TAR2h-201 (SEQ ID NO:177 TAR2h- 202 (SEQ ID NO:178 TAR2h-203 (SEQ ID NO:179), TAR2 -204 (SEQ ID NO:180), TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:181), TAR2h-154-10 (SEQ ID NO:182), y TAR2h-205 (SEQ ID NO:183).
79. El método de cualquiera de las reivindicaciones 74 a 78, en donde el antagonista de TNFR1 comprende además una fracción que prolonga la vida media.
80. El método de la reivindicación 79, en donde la fracción que prolonga la vida media mencionada es una fracción de polialquilenglicol, albúmina de suero o un fragmento de la misma, receptor de transferrina o una porción de enlace de transferrina del mismo, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de enlace para un polipéptido que mejora la vida media in vivo.
81. El método de la reivindicación 80, en donde la fracción que prolonga la vida media mencionada es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de enlace para la albúmina de suero o para el receptor de Fe neonatal.
82. El método de la reivindicación 81, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo mencionados, es un dAb.
83. El método de la reivindicación 80, en donde la fracción que prolonga la vida media mencionada es una fracción de polietilenglicol.
84. Un método para el tratamiento de una enfermedad respiratoria, el cual comprende: seleccionar un antagonista del receptor del factor de necrosis tumoral-1 (TNFR1), que tiene eficacia en un modelo animal adecuado de enfermedad respiratoria cuando se administra en una cantidad que no excede de aproximadamente 10 miligramos/kilogramo una vez al día, en donde la eficacia en este modelo animal existe cuando se inhibe la infiltración celular de los pulmones, evaluada por un conteo celular total en el lavado broncoalveolar, en relación con un control no tratado, con un p<0.05; y administrar localmente al tejido pulmonar de un sujeto que lo necesite, una cantidad efectiva del antagonista de TNFR1 mencionado.
85. El método de la reivindicación 84, en donde el antagonista de TNFR1 mencionado persiste en el tejido pulmonar durante cuando menos 8 horas después de que se administra.
86. El método de la reivindicación 84 u 85, en donde el antagonista de TNFR1 mencionado se administra mediante inhalación o intranasalmente.
87. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 86, en donde el tejido pulmonar mencionado es el pulmón.
88. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 87, en donde el antagonista de TNFR1 mencionado no entra sustancialmente a la circulación sistémica.
89. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 88, en donde el modelo animal adecuado es el modelo sub-crónico de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) inducida por el humo del tabaco en ratones hembras C57BL/6.
90. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 88, en donde el modelo animal adecuado es un modelo de asma o de enfermedad pulmonar obstructiva crónica de primate no humano.
91. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 90, en donde se inhibe la infiltración celular del pulmón en el modelo animal mencionado, en relación con un control no tratado, por cuando menos aproximadamente el 30 por ciento.
92. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 90, en donde se inhibe la infiltración celular del pulmón en el modelo animal en relación con un control no tratado, por cuando menos aproximadamente el 50 por ciento.
93. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 90, en donde se inhibe la infiltración celular del pulmón en el modelo animal mencionado, en relación con un control no tratado, por cuando menos aproximadamente el 70 por ciento.
94. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 93, en donde el antagonista de TNFR1 mencionado inhibe la infiltración celular de los pulmones en el modelo animal, en relación con el control no tratado, con un p<0.001.
95. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 94, en donde el antagonista de TNFR1 mencionado inhibe la infiltración celular de los pulmones, evaluada por un conteo celular total en el lavado broncoalveolar, en relación con un control no tratado en este modelo animal adecuado, hasta un mayor grado que un inhibidor de fosfodiesterasa-4 oralmente administrado.
96. El método de la reivindicación 95, en donde el inhibidor de fosfodiesterasa-4 oralmente administrado es BAY 19-8004.
97. El método de la reivindicación 96, en donde el BAY 19-8004 mencionado se administra dos veces al día, en una dosis de 10 miligramos/kilogramo.
98. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 97, en donde la enfermedad respiratoria mencionada se selecciona a partir del grupo que consiste en: inflamación pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, neumonía, neumonitis por hipersensibilidad, infiltrado pulmonar con eosinofilia, enfermedad pulmonar ambiental, neumonía, bronquiectasis, fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar primaria, tromboembolia pulmonar, trastornos de la pleura, trastornos del mediastino, trastornos del diafragma, hipoventilación, hiperventilación, apnea del sueño, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, mesotelioma, sarcoma, rechazo de injerto, enfermedad del injerto contra el huésped, cáncer pulmonar, rinitis alérgica, alergia, asbestosis, aspergiloma, aspergilosis, bronquiectasis, bronquitis crónica, enfisema, neumonía eosinof ílica, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad neumocócica invasiva, influenza, micobacteria no tuberculosa, efusión pleural, neumoconiosis, neumocitosis, neumonía, actinomicosis pulmonar, proteinosis pulmonar alveolar, ántrax pulmonar, edema pulmonar, émbolo pulmonar, inflamación pulmonar, histiocitosis X pulmonar, hipertensión pulmonar, nocardiosis pulmonar, tuberculosis pulmonar, enfermedad veno-oclusiva pulmonar, enfermedad pulmonar reumatoide, sarcoidosis, y granulomatosis de Wegener.
99. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 97, en donde el sujeto mencionado es un ser humano, la enfermedad respiratoria mencionada es enfermedad pulmonar obstructiva crónica o asma, y en donde se administran no más de 10 miligramos/día.
100. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 99, en donde el antagonista de TNFR1 comprende un dominio de polipéptido que tiene una especificidad de enlace para TNFR1, pero no agoniza sustancialmente el TNFR1.
101. El método de la reivindicación 100, en donde el dominio de polipéptido mencionado es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
102. El método de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 99, en donde el antagonista de TNFR1 comprende un anticuerpo de dominio (dAb) que se enlaza con el TNFR1, y que inhibe el enlace del factor de necrosis tumoral-alfa (TNFa) con el TNFR1, o que inhibe la transducción de señales mediada a través del TNFR1 después del enlace del TNFa, en donde este dAb se selecciona a partir del grupo que consiste en un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina.
103. El método de la reivindicación 102, en donde el dAb mencionado se selecciona a partir del grupo que consiste en un dominio variable de cadena pesada humano (VH) que tiene especificidad de enlace por el TNFR1 humano, y un dominio variable de cadena ligera humano (VL) que tiene especificidad de enlace por el TNFR1 humano.
104. El método de la reivindicación 103, en donde la secuencia de aminoácidos del dAb mencionado es cuando menos el 90 por ciento homologa a la secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en: TAR2h-12 (SEQ ID NO:1), TAR2h-13 (SEQ ID NO:2), TAR2h-14 (SEQ ID NO:3), TAR2h-16 (SEQ ID NO:4), TAR2h-17 (SEQ ID NO:5), TAR2h-18 (SEQ ID NO:6), TAR2h-19 (SEQ ID NO:7), TAR2h-20 (SEQ ID NO:8), TAR2h-21 (SEQ ID NO:9), TAR2h-22 (SEQ ID NO:10), TAR2h-23 (SEQ ID NO:11), TAR2h-24 (SEQ ID NO:12), TAR2h-25 (SEQ ID NO:13), TAR2h-26 (SEQ ID NO:14), TAR2h-27 (SEQ ID NO:15), TAR2h-29 (SEQ ID NO:16), TAR2h-30 (SEQ ID NO:17), TAR2h-32 (SEQ ID NO:18), TAR2h-33 (SEQ ID NO:19), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:20), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:21), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:22), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:23), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:24), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:25), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:26), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:27), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:28), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:29), TAR2h- 10- 11 (SEQ ID NO:30), TAR2h- 10- 12 (SEQ ID NO:31), TAR2h- 10- 13 (SEQ ID NO:32), TAR2h- 10- 14 (SEQ ID NO:33), TAR2h- 10- 15 (SEQ ID NO:34), TAR2h- 10- 16 (SEQ ID NO:35), TAR2h- 10- 17 (SEQ ID NO:36), TAR2h- 10- 18 (SEQ ID NO:37), TAR2h- 10- 19 (SEQ ID NO:38), TAR2h- 10- 20 (SEQ ID NO:39), TAR2h- 10- 21 (SEQ ID NO:40), TAR2h- 10- 22 (SEQ ID NO:41), TAR2h- 10 ¦27 (SEQ ID NO:42), TAR2h- 10- 29 (SEQ ID NO:43), TAR2h- 10 ¦31 (SEQ ID NO:44), TAR2h- 10- 35 (SEQ ID NO:45), TAR2h- 10 ¦36 (SEQ ID NO:46), TAR2h- 10 -37 (SEQ ID NO:47), TAR2h- 10 ¦38 (SEQ ID NO:48), TAR2h- 10 -45 (SEQ ID NO:49), TAR2h- 10 ¦47 (SEQ ID NO:50), TAR2h- 10- ¦48 (SEQ ID NO:51), TAR2h- 10 ¦57 (SEQ ID NO:52), TAR2h- 10 -56 (SEQ ID NO:53), TAR2h- 10 -58 (SEQ ID NO:54), TAR2h- 10 ¦66 (SEQ ID NO:55), TAR2h- 10 -64 (SEQ ID NO:56), TAR2h- 10 -65 (SEQ ID NO:57), TAR2h- 10 -68 (SEQ ID NO:58), TAR2h- 10 -69 (SEQ ID NO:59), TAR2h- 10 -67 (SEQ ID NO:60), TAR2h- 10 -61 (SEQ ID NO:61), TAR2h- 10 -62 (SEQ ID NO:62), TAR2h- 10 -63 (SEQ ID NO:63), TAR2h- 10 -60 (SEQ ID NO:64), TAR2h- 10 -55 (SEQ ID NO:65), TAR2h- 10 -59 (SEQ ID NO:66), TAR2h- 10 -70 (SEQ ID NO:67), TAR2h-34 (SEQ ID NO:68), TAR2h-35 (SEQ ID NO:69), TAR2h-36 (SEQ ID NO:70), TAR2h-37 (SEQ ID NO:71), TAR2h-38 (SEQ ID NO:72), TAR2h-39 (SEQ ID NO:73), TAR2h-40 (SEQ ID NO:74), TAR2 -41 (SEQ ID NO:75), TAR2h-42 (SEQ ID NO:76), TAR2h-43 (SEQ ID NO:77), TAR2h-44 (SEQ ID NO:78), TAR2h-45 (SEQ ID NO:79), TAR2h-47 (SEQ ID NO:80), TAR2h-48 (SEQ ID NO:81), TAR2h-50 (SEQ ID NO:82), TAR2h-51 (SEQ ID NO:83), TAR2h-66 (SEQ ID NO:84), TAR2h-67 (SEQ ID NO:85), TAR2h-68 (SEQ ID NO:86), TAR2h-70 (SEQ ID NO:87), TAR2h-71 (SEQ ID NO:88), TAR2h-72 (SEQ ID NO:89), TAR2h-73 (SEQ ID NO:90), TAR2h-74 (SEQ ID NO:91), TAR2h-75 (SEQ ID NO:92), TAR2h-76 (SEQ ID NO:93), TAR2h-77 (SEQ ID NO:94), TAR2h-78 (SEQ ID NO:95), TAR2 -79 (SEQ ID NO:96), TAR2h-15 (SEQ ID NO:97), TAR2 -131-8 (SEQ ID NO:98), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:99), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:100), TAR2h-15-8-1 SEQ ID NO:101), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO:102), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:103), TAR2h-154-10-5 (SEQ ID NO:104), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:105), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO:106), TAR2 -152-7 (SEQ ID NO:107), TAR2h-35-4 (SEQ ID NO:108), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:109), TAR2h-80 (SEQ ID NO:110), TAR2h-81 (SEQ ID NO:111), TAR2h-82 (SEQ ID NO:112), TAR2h-83 (SEQ ID NO:113), TAR2h-84 (SEQ ID NO:114), TAR2h-85 (SEQ ID NO:115), TAR2h-86 (SEQ ID NO:116), TAR2h-87 (SEQ ID NO:117), TAR2h-88 (SEQ ID NO:118), TAR2h-89 (SEQ ID NO:119), TAR2 -90 (SEQ ID NO:120), TAR2h-91 (SEQ ID NO:121), TAR2h-92 (SEQ ID NO:122), TAR2h-93 (SEQ ID NO:123), TAR2h-94 (SEQ ID NO:124), TAR2h-95 (SEQ ID NO:125), TAR2h-96 (SEQ ID NO:126), TAR2h-97 (SEQ ID NO:127), TAR2h-99 (SEQ ID NO:128), TAR2h-100 (SEQ ID NO:129), TAR2h-101 (SEQ ID NO:130), TAR2h-102 (SEQ ID NO:131), TAR2h- 103 (SEQ ID NO:132), TAR2h- 104 (SEQ ID NO:133), TAR2 - 105 (SEQ ID NO:134), TAR2h- 106 (SEQ ID NO:135), TAR2h- 107 (SEQ ID NO:136), TAR2h- 108 (SEQ ID NO:137), TAR2 - 109 (SEQ ID NO:138), TAR2h- 110 (SEQ ID NO:139), TAR2h- 111 (SEQ ID NO:140), TAR2h- 112 (SEQ ID NO:141), TAR2h- 113 (SEQ ID NO:142), TAR2h- ¦114 (SEQ ID NO:143), TAR2h- ¦115 (SEQ ID NO:144), TAR2h- •116 (SEQ ID NO:145), TAR2h- ¦117 (SEQ ID NO:146), TAR2h- ¦118 (SEQ ID NO:147), TAR2h- •119 (SEQ ID NO:148), TAR2h- •120 (SEQ ID O: 149), TAR2h •121 (SEQ ID NO:150), TAR2h- 122 (SEQ ID O: 151), TAR2h -123 (SEQ ID NO:152), TAR2h- 124 (SEQ ID O: 153), TAR2h ¦125 (SEQ ID NO:154), TAR2h- 126 (SEQ ID O 155), TAR2h -127 (SEQ ID NO:156), TAR2h- 128 (SEQ ID O 157), TAR2h -129 (SEQ ID NO:158), TAR2h- 130 (SEQ ID O 159), TAR2h -131 (SEQ ID NO:160), TAR2h- 132 (SEQ ID O 161), TAR2h -133 (SEQ ID NO:162), TAR2h- 151 (SEQ ID O 163), TAR2h -152 (SEQ ID NO:164), TAR2h- 153 (SEQ ID NO 165), TAR2 -154 (SEQ ID NO:166), TAR2h- 159 (SEQ ID NO 167), TAR2h -165 (SEQ ID NO:168), TAR2h- 166 (SEQ ID NO 169), TAR2h -168 (SEQ ID NO:170), TAR2h- 171 (SEQ ID NO 171), TAR2h -172 (SEQ ID NO:172), TAR2h- 173 (SEQ ID NO 173), TAR2h -174 (SEQ ID NO:174), TAR2h- 176 (SEQ ID NO 175), TAR2h -178 (SEQ ID NO:176), TAR2h- 201 (SEQ ID NO 177), TAR2h -202 (SEQ ID NO:178), TAR2h- 203 (SEQ ID NO 179), TAR2h- 204 (SEQ ID NO:180), TAR2h-185-25 (SEQ ID NO 181), TAR2h- 154- 10 (SEQ ID NO:182), y TAR2h-205 (SEQ ID NO:183).
105. El método de cualquiera de las réivindicaciones 100 a 104, en donde el antagonista de TNFR1 comprende además una fracción que prolonga la vida media.
106. El método de la reivindicación 105, en donde la fracción que prolonga la vida media mencionada es una fracción de polialquilenglicol, albúmina de suero o un fragmento de la misma, receptor de transferrina o una porción de enlace de transferrina del mismo, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de enlace para un polipéptido que mejora la vida media in vivo.
107. El método de la reivindicación 106, en donde la fracción que prolonga la vida media mencionada es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de enlace para la albúmina de suero o para el receptor de Fe neonatal.
108. El método de la reivindicación 107, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo mencionados, es un dAb.
109. El método de la reivindicación 107, en donde la fracción que prolonga la vida media mencionada es una fracción de polietilenglicol.
110. Un ligando que comprende un monómero dAb que tiene especificidad de enlace por el TNFR1 humano y el TNFR1 de otras especies.
111. El ligando de la reivindicación 110, en donde el monómero dAb mencionado es un antagonista del TNFR1 humano, y del TNFR1 de otras especies.
112. El ligando de acuerdo con la reivindicación 110 ó 111, en donde el monómero dAb mencionado se enlaza con el TNFR1 humano y con el TNFR1 de otras especies, con afinidades que difieren por no más de aproximadamente un factor de 10.
113. El ligando de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 110 a 112, en donde el dAb mencionado se enlaza con el TNFR1 humano y con el TNFR1 de otras especies, con un índice activado de aproximadamente 104 M/s a aproximadamente 105 M/s.
114. El ligando de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 110 a 113, en donde el dAb mencionado se enlaza con el TNFR1 humano y con el TNFR1 de otras especies, con un índice desactivado de aproximadamente 10"3 s"1 a aproximadamente 10-5 s"1.
115. El ligando de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 110 a 114, en donde el TNFR1 de otras especies es el TNFR1 de roedor, el TNFR1 de conejo, el TNFR1 de perro, el TNFR1 de cerdo, el TNFR1 de oveja, o el TNFR1 de primate no humano.
116. Un ligando que comprende un dAb que se enlaza con TNFR1, en donde este ligando es un antagonista del TNFR1, y la secuencia de aminoácidos del dAb mencionado es cuando menos el 90 por ciento homologa a cualquiera de las SEQ ID NO:216 a SEQ ID NO:433.
117. Un ligando que tiene especificidad de enlace por el TNFR1, el cual comprende una fracción de proteína que tiene un sitio de enlace con una especificidad de enlace por el TNFR1, en donde esta fracción de proteína comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131 -511 , TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194.
118. El ligando de la reivindicación 117, en donde la fracción de proteína mencionada comprende además una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de la CDR1 y/o CDR2 de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131-511 , TAR2h-131 -193, y TAR2h-131 -194.
119. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos de este único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, difiere de la secuencia de aminoácidos de TAR2h-131-511 , TAR2h-131 -193, o TAR2h-131 -194, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con la secuencia de CDR1 de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131 -511 , TAR2h-131 -193, y TAR2h-131 -194.
120. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos de este único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, difiere de la secuencia de aminoácidos de TAR2h-131-5 1 , TAR2h-131 -193, o TAR2h-131 -194, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR2 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con la secuencia de CDR2 de TAR2h-131 -511 , TAR2h-131 -193, y TAR2h-131-194.
121. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, difiere de la secuencia de aminoácidos de TAR2h-131-511 , TAR2h-131 -193, o TAR2h-131 -194, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR3 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento con la secuencia de CDR3 de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131-511, TAR2h-131 -193, y TAR2h-131 -194.
122. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, difiere de la secuencia de aminoácidos de TAR2h-131-511 , TAR2h-131 -193, o TAR2h-131 -194, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1 y una secuencia de CDR2 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 ó CDR2, respectivamente, de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131-511, TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194.
123. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, difiere de la secuencia de aminoácidos de TAR2h-131-511, TAR2h-131 -193, o TAR2h-131 -194, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR2 y una secuencia de CDR3 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR2 ó CDR3, respectivamente, de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131-511, TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194.
124. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos del único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, difiere de la secuencia de aminoácidos de TAR2h-131-511, TAR2h-131 -193, o TAR2h-131 -194, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1 y una secuencia de CDR3 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 ó CDR3, respectivamente, de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131-511, TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194.
125. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde la secuencia de aminoácidos de este único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, difiere de la secuencia de aminoácidos de TAR2h-131-511 , TAR2h-131 -193, o TAR2h-131 -194, en no más de 25 posiciones de aminoácidos, y tiene una secuencia de CDR1, una secuencia de CDR2, y una secuencia de CDR3 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1, CDR2, ó CDR3, respectivamente, de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131 -511 , TAR2h-131 -193, y TAR2h-131-194.
126. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde este único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1 comprende una secuencia de CDR2 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento en la secuencia de CDR1 de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131 -511 , TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194.
127. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde este único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1 comprende una secuencia de CDR2 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento en la secuencia de CDR2 de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131 -511 , TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194.
128. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde este único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1 comprende una secuencia de CDR3 que tiene una identidad de cuando menos el 50 por ciento en la secuencia de CDR3 de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131 -511 , TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194.
129. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde este único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1 comprende una secuencia de CDR1 y una secuencia de CDR2 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 y CDR2, respectivamente, de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131 -511 , TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194.
130. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde este único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1 comprende una secuencia de CDR2 y una secuencia de CDR3 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR2 y CDR3, respectivamente, de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131 -511 , TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194.
131. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde este único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1 comprende una secuencia de CDR1 y una secuencia de CDR3 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1 y CDR3, respectivamente, de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131 -511 , TAR2h-131-193, y TAR2h-131 -194.
132. Un ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1, en donde este único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza con el TNFR1 comprende una secuencia de CDR1, una secuencia de CDR2, y una secuencia de CDR3 que tienen una identidad de cuando menos el 50 por ciento con las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3, respectivamente, dé un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en TAR2h-131 -511 , TAR2h-131 -193, y TAR2h-131 -194.
133. Un ligando que comprende un dAb que se enlaza con el TNFR1 humano, y que es un antagonista del TNFR1 humano, en donde este único ligando inhibe la inflamación inducida por TNFa o un mediador inflamatorio inducido por TNFa, en una dosis [miligramos/kilogramo] que no es mayor de 1/2 de la dosis de etanercept que se requiere para inhibir esta inflamación inducida por TNFa o este mediador inflamatorio inducido por TNFa, hasta sustancialmente el mismo grado.
134. El ligando de la reivindicación 133, en donde este ligando inhibe la inflamación inducida por TNFa o un mediador inflamatorio inducido por TNFa, en una dosis [miligramos/kilogramo] que no es mayor de 1/10 de la dosis de etanercept que se requiere para inhibir esta inflamación inducida por TNFa o este mediador inflamatorio inducido por TNFa, hasta sustancialmente el mismo grado.
135. El ligando de cualquiera de las reivindicaciones 110 a 134, en donde este ligando comprende además una fracción que prolonga la vida media.
136. Un ligando de cualquiera de las reivindicaciones 110 a 134, para utilizarse en terapia o en diagnóstico.
137. El uso de un ligando de cualquiera de las reivindicaciones 110 a 134, para la fabricación de un medicamento para administración local al tejido pulmonar.
138. El uso de un ligando de cualquiera de las reivindicaciones 110 a 134, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad respiratoria.
139. Un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad respiratoria, el cual comprende administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad efectiva de un ligando de cualquiera de las reivindicaciones 110 a 134.
140. Un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un ligando de cualquiera de las reivindicacionesl 10 a 134.
141. Un vector que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 140.
142. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 140, o el vector de la reivindicación 141.
143. Un método para producir un ligando, el cual comprende mantener una célula huésped de la reivindicación 142 bajo condiciones adecuadas para la expresión de este ácido nucleico o vector, mediante lo cual se produce un ligando.
144. El método de la reivindicación 143, el cual comprende además aislar el ligando.
MX2008005129A 2005-10-24 2006-10-23 Agentes que se enlazan con un objetivo en el tejido pulmonar para el tratamiento de enfermedades respiratorias. MX2008005129A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0521621.3A GB0521621D0 (en) 2005-10-24 2005-10-24 Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases
PCT/GB2006/003935 WO2007049017A2 (en) 2005-10-24 2006-10-23 Agents that bind a target in pulmonary tissue for treating respiratory diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2008005129A true MX2008005129A (es) 2008-10-23

Family

ID=35458579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2008005129A MX2008005129A (es) 2005-10-24 2006-10-23 Agentes que se enlazan con un objetivo en el tejido pulmonar para el tratamiento de enfermedades respiratorias.

Country Status (20)

Country Link
US (4) US8129503B2 (es)
EP (1) EP1948694B1 (es)
JP (1) JP2009512672A (es)
KR (1) KR20080066962A (es)
CN (2) CN102302777A (es)
AU (1) AU2006307733B2 (es)
BR (1) BRPI0617771A2 (es)
CA (1) CA2626939A1 (es)
CR (1) CR9933A (es)
EA (1) EA014106B1 (es)
ES (1) ES2688941T3 (es)
GB (1) GB0521621D0 (es)
IL (1) IL190787A0 (es)
MA (1) MA29882B1 (es)
MX (1) MX2008005129A (es)
NO (1) NO20081836L (es)
NZ (1) NZ567441A (es)
TW (1) TW200740848A (es)
WO (1) WO2007049017A2 (es)
ZA (1) ZA200803576B (es)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
GB0521621D0 (en) * 2005-10-24 2005-11-30 Domantis Ltd Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases
SI1888641T1 (sl) 2005-05-18 2012-05-31 Ablynx Nv Proteini ki vežejo serum albumin
DE102005023617A1 (de) 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10351615B2 (en) 2006-02-03 2019-07-16 Opko Biologics Ltd. Methods of treatment with long-acting growth hormone
US7838250B1 (en) 2006-04-04 2010-11-23 Singulex, Inc. Highly sensitive system and methods for analysis of troponin
WO2007114947A2 (en) 2006-04-04 2007-10-11 Singulex, Inc. Highly sensitive system and methods for analysis of troponin
EP2081960B1 (en) * 2006-10-27 2018-06-27 Ablynx N.V. Intranasal delivery of polypeptides and proteins
EP1972637B1 (en) 2007-03-19 2011-06-29 Universität Stuttgart huTNFR1 selective antagonists
KR20100040840A (ko) * 2007-06-06 2010-04-21 도만티스 리미티드 폴리펩티드，항체 가변 도메인 및 길항제
KR20100018040A (ko) * 2007-06-06 2010-02-16 도만티스 리미티드 프로테아제 내성 폴리펩티드를 선택하는 방법
GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
WO2009011782A2 (en) * 2007-07-13 2009-01-22 Abbott Biotechnology Ltd. METHODS AND COMPOSITIONS FOR PULMONARY ADMINISTRATION OF A TNFa INHIBITOR
WO2009030285A1 (en) * 2007-09-07 2009-03-12 Ablynx N.V. Binding molecules with multiple binding sites, compositions comprising the same and uses thereof
US20100260853A1 (en) * 2007-12-13 2010-10-14 Amrik Basran Compositions for pulmonary delivery
EP2238165B1 (en) 2008-01-07 2017-07-05 Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Anti-hiv domain antibodies and method of making and using same
US8217140B2 (en) 2008-04-17 2012-07-10 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
AU2009290848A1 (en) * 2008-09-11 2010-03-18 Galapagos Nv Method for identifying compounds useful for increasing the functional activity and cell surface expression of CF-associated mutant Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator
MX2011005540A (es) * 2008-11-26 2011-06-21 Glaxo Group Ltd Polipeptidos dominios variables de anticuerpos, y antagonistas.
PT2387583T (pt) * 2009-01-14 2018-12-24 Ablynx Nv Administração pulmonar de domínios de variável única de imunoglobulina e construtos dos mesmos
SG173173A1 (en) 2009-02-19 2011-08-29 Glaxo Group Ltd Improved anti-tnfr1 polypeptides, antibody variable domains & antagonists
AU2010259022B2 (en) 2009-06-08 2016-05-12 Singulex, Inc. Highly sensitive biomarker panels
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
JP2012532619A (ja) 2009-07-16 2012-12-20 グラクソ グループ リミテッド Ｔｎｆｒ１を部分的に阻害するためのアンタゴニスト、用途および方法
SG177601A1 (en) * 2009-07-16 2012-02-28 Glaxo Group Ltd Improved anti-serum albumin binding single variable domains
CA2778084A1 (en) * 2009-10-23 2011-04-28 Garvan Institute Of Medical Research Modified variable domain molecules and methods for producing and using same
KR20120101417A (ko) 2009-10-27 2012-09-13 글락소 그룹 리미티드 안정한 항?ｔｎｆｒ1 폴리펩티드，항체 가변 도메인 및 길항제
AU2011212442A1 (en) 2010-02-05 2012-08-09 Ablynx Nv Peptides capable of binding to serum albumin and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
CA2805267C (en) * 2010-05-04 2019-07-30 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Detection and treatment of fibrosis
JP2013538566A (ja) 2010-08-13 2013-10-17 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド 改良された抗血清アルブミン結合変異体
WO2012022703A2 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding variants
US8883134B2 (en) 2010-10-20 2014-11-11 Handok Pharmaceuticals, Inc. Human interleukin-1 receptor antagonist—hybrid Fc fusion protein
WO2012072731A2 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding single variable domains
GB2502462B (en) 2011-01-10 2018-08-08 Univ Michigan Regents Stem cell factor inhibitor
KR102162413B1 (ko) 2011-08-17 2020-10-07 글락소 그룹 리미티드 변형된 단백질 및 펩티드
WO2013157002A1 (en) 2012-04-19 2013-10-24 Prolor Biotech Inc. Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same
EP2922867B1 (en) 2012-11-20 2021-07-21 OPKO Biologics Ltd. Method of increasing the hydrodynamic volume of polypeptides by attaching to gonadotrophin carboxy terminal peptides
WO2015006554A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Therapeutic antibodies and uses thereof
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
CN103743909B (zh) * 2013-11-29 2015-11-25 漯河医学高等专科学校 弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌细胞生长和转移的影响研究方法
US10344090B2 (en) 2013-12-12 2019-07-09 Shanghai Hangrui Pharmaceutical Co., Ltd. PD-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof
CA2963037A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Ablynx N.V. Treatment of rsv infection
AU2015329935B2 (en) 2014-10-10 2019-09-19 Ablynx N.V. Inhalation device for use in aerosol therapy of respiratory diseases
WO2016100301A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Use of cadherin-11 antagonists to treat obesity-associated conditions and other metabolic disorders
JP6862343B2 (ja) 2014-12-19 2021-04-21 アブリンクス エン．ヴェー． システイン結合ナノボディダイマー
BR112017023862A2 (pt) 2015-05-04 2018-07-17 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd71, anticorpos anti-cd71 ativáveis, e métodos de uso destes
PL3310347T3 (pl) 2015-06-19 2021-12-27 Opko Biologics Ltd. Długo działające czynniki krzepnięcia i sposoby wytwarzania
TWI703158B (zh) * 2015-09-18 2020-09-01 美商希佛隆公司 特異性結合tl1a之抗體
CA3132021C (en) 2015-11-18 2024-03-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Pd1 and/or lag3 binders
JP2019523213A (ja) 2016-05-02 2019-08-22 アブリンクス エン．ヴェー． Ｒｓｖ感染の処置
WO2018029474A2 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Kymab Limited Anti-icos antibodies
CN109475602B (zh) 2016-06-20 2023-05-16 科马布有限公司 抗pd-l1和il-2细胞因子
CA3030533A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 Oren HERSHKOVITZ Long-acting coagulation factor vii and methods of producing same
WO2018099968A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Ablynx N.V. Treatment of infection by respiratory syncytial virus (rsv)
JOP20190187A1 (ar) 2017-02-03 2019-08-01 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لـ ccr7
WO2018165619A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Cd147 antibodies, activatable cd147 antibodies, and methods of making and use thereof
CN106756306B (zh) * 2017-03-10 2018-06-19 山东泰义金属科技有限公司 一种门窗用铝合金的加工方法
KR20180109272A (ko) 2017-03-27 2018-10-08 한양대학교 산학협력단 세포투과성 펩타이드와 ctCTLA4 펩타이드가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 하는 염증성 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
US20200362051A1 (en) * 2017-11-13 2020-11-19 Crescendo Biologics Limited Molecules that bind to cd137 and psma
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
WO2019173771A1 (en) 2018-03-09 2019-09-12 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cd147 antibodies and methods of making and use thereof
JP2022548310A (ja) 2019-09-23 2022-11-17 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗ｃｄ４７抗体、活性化可能抗ｃｄ４７抗体、およびその使用方法
CN113261532A (zh) * 2020-02-17 2021-08-17 中山大学 一种肺癌动物模型的构建方法
KR20200033828A (ko) 2020-03-20 2020-03-30 한양대학교 산학협력단 세포투과성 펩타이드와 ctCTLA4 펩타이드가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 하는 염증성 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
CN113527488A (zh) 2020-04-22 2021-10-22 迈威(上海)生物科技股份有限公司 一种靶向人程序性死亡配体1（pd-l1）的单可变域抗体及其衍生物
GB202007099D0 (en) 2020-05-14 2020-07-01 Kymab Ltd Tumour biomarkers for immunotherapy
CN111820188B (zh) * 2020-08-04 2021-10-29 中山大学附属第一医院 一种类哮喘慢阻肺重叠气道炎症小鼠模型的建立方法及其应用
EP4204094A1 (en) 2020-08-27 2023-07-05 Enosi Therapeutics Corporation Methods and compositions to treat autoimmune diseases and cancer
CN113624978B (zh) * 2021-04-06 2023-09-19 四川大学华西医院 通过检测肺泡灌洗液及血清白蛋白来评估急性呼吸窘迫综合征/急性肺损伤及预后的试剂盒
TW202313682A (zh) 2021-05-18 2023-04-01 英商凱麥博有限公司 抗icos抗體之用途
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
KR102716104B1 (ko) 2021-07-09 2024-10-11 충남대학교산학협력단 폐 표적 25-하이드록시 콜레스테롤 나노하이브리드를 포함하는 covid-19 관련 사이토카인 폭풍 억제 조성물

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2148299B (en) * 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
WO1993013798A1 (en) * 1992-01-13 1993-07-22 Biogen, Inc. Treatment for asthma
WO2002043660A2 (en) * 2000-11-28 2002-06-06 Mediummune, Inc Methods of administering/dosing anti-rsv antibodies for prophylaxis and treatment
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
EP1494711A4 (en) * 2002-03-19 2008-05-28 Abgenix Inc METHODS FOR TREATING CHRONIC OBSTRUCTIVE BRONCHO PNEUMOPATHY (COPD)
US20080008713A1 (en) * 2002-06-28 2008-01-10 Domantis Limited Single domain antibodies against tnfr1 and methods of use therefor
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
CN1678634A (zh) 2002-06-28 2005-10-05 多曼蒂斯有限公司 免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体
MEP32508A (en) 2002-09-06 2010-10-10 Amgen Inc Therapeutic human anti-il-1r1 monoclonal antibody
EP1545611B1 (en) * 2002-09-06 2016-11-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of treatment of asthma using antibodies to complement component c5
JP2006523090A (ja) * 2002-12-27 2006-10-12 ドマンティス リミテッド リガンドに、そしてリガンド受容体に特異的な二重特異性単一ドメイン抗体
WO2004091519A2 (en) * 2003-04-11 2004-10-28 Medimmune, Inc. Methods of preventing or treating respiratory conditions
SI1639011T1 (sl) * 2003-06-30 2009-04-30 Domantis Ltd Pegilirana protitelesa z enojno domeno (dAb)
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
GB0521621D0 (en) 2005-10-24 2005-11-30 Domantis Ltd Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases
JP2008521870A (ja) 2004-12-02 2008-06-26 ドマンティス リミテッド 抗ｉｌ−１ｒ１単一ドメイン抗体および治療使用
DK2068889T3 (da) 2006-08-10 2020-02-03 Roy C Levitt Anakinra til anvendelse i behandling af bronchiolitis obliterans syndrom

Also Published As

Publication number Publication date
EA200800905A1 (ru) 2008-10-30
CA2626939A1 (en) 2007-05-03
CR9933A (es) 2008-08-21
BRPI0617771A2 (pt) 2011-08-09
US20130309227A1 (en) 2013-11-21
JP2009512672A (ja) 2009-03-26
EP1948694B1 (en) 2018-07-25
EP1948694A2 (en) 2008-07-30
KR20080066962A (ko) 2008-07-17
EA014106B1 (ru) 2010-10-29
GB0521621D0 (en) 2005-11-30
IL190787A0 (en) 2008-11-03
WO2007049017A2 (en) 2007-05-03
AU2006307733A1 (en) 2007-05-03
WO2007049017A3 (en) 2008-01-31
US20100034831A1 (en) 2010-02-11
NZ567441A (en) 2012-08-31
ES2688941T3 (es) 2018-11-07
TW200740848A (en) 2007-11-01
AU2006307733B2 (en) 2012-11-22
ZA200803576B (en) 2009-08-26
CN101346397A (zh) 2009-01-14
MA29882B1 (fr) 2008-10-03
CN101346397B (zh) 2013-10-23
US9629909B2 (en) 2017-04-25
US8497244B2 (en) 2013-07-30
CN102302777A (zh) 2012-01-04
NO20081836L (no) 2008-06-23
US20120114651A1 (en) 2012-05-10
US20170210814A1 (en) 2017-07-27
US8129503B2 (en) 2012-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8129503B2 (en) Agents that bind a target in pulmonary tissue for targeting respiratory diseases
AU2006321367B2 (en) Competitive domain antibody formats that bind Interleukin 1 Receptor type 1
AU2006321364B2 (en) Noncompetitive domain antibody formats that bind Interleukin 1 Receptor type 1
AU2005311101B2 (en) Anti-IL-IRI single domain antibodies and therapeutic uses
CA2636854A1 (en) Ligands that bind il-4 and/or il-13
EP2493504B1 (en) Stable anti-tnfr1 polypeptides, antibody variable domains and antagonists
MX2008006882A (es) Formatos de anticuerpos de dominio no competitivos que se enlazan con el receptor de interleucina-1 tipo-1