BRPI0617771A2 - usos de um agente e de um anticorpo de domìnio (dab) que se ligam a um alvo em tecido pulmonar, inalador ou dispositivo de liberação intranasal, usos de uma formulação de anticorpo de domìnio (dab) e de um antagonista de tnfr1, ligante, uso de um ligante, ácido nucleico isolado ou recombinante, vetor, célula hospedeira, e, método para produzir um ligante - Google Patents

Abstract

<B>USOS DE UM AGENTE E DE UM ANTICORPO DE DOMìNIO (DAB) QUE SE LIGAM A UM ALVO EM TECIDO PULMONAR, INALADOR OU DISPOSITIVO DE LIBERAçãO INTRANASAL, USOS DE UMA FORMULAçãO DE ANTICORPO DE DOMINIO (DAB) E DE UM ANTAGONISTA DE TNFRl, LIGANTE, USO DE UM LIGANTE, áCIDO NUCLEICO ISOLADO OU RECOMBINANTE, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, E, MéTODO PARA PRODUZIR UM LIGANTE<D>é descrito o uso de um agente (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante, monómero dAb) que se liga a úm alvo em tecido pulmonar para a fabricação de uma formulação terapêutica de longa ação ou janela terapêutica ampla para liberação local para tecido pulmonar, e métodos para administrar um agente que se liga a um alvo em tecido pulmonar a um indivíduo para produzir uma janela terapêutica ampla em tecido pulmonar. A formulação é para, e o método compreende, administrar localmente para tecido pulmonar. Também é descrito o uso de antagonistas de TNFR1 para a fabricação de uma formulação ou medicamento para tratar, prevenir ou suprimir inflamação pulmonar ou uma doença respiratória, e métodos de tratar tais doenças. Também é descrito o uso de agentes para a fabricação de um dispositivo de liberação (e.g., inalador, dispositivo de liberação intranasal)para o tratamento ou prevenção de inflamação pulmonar ou uma doença respiratória, e um dispositivo de liberação para o tratamento ou prevenção de inflamação pulmonar ou uma doença respiratória que contém um agente como descrito neste lugar.

Description

"USOS DE UM AGENTE E DE UM ANTICORPO DE DOMÍNIO (DAB)QUE SE LIGAM A UM ALVO EM TECIDO PULMONAR, INALADOROU DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO INTRANASAL, USOS DE UMAFORMULAÇÃO DE ANTICORPO DE DOMÍNIO (DAB) E DE UMANTAGONISTA DE TNFRl5 LIGANTE, USO DE UM LIGANTE, ÁCIDONUCLEICO ISOLADO OU RECOMBINANTE, VETOR, CÉLULAHOSPEDEIRA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM LIGANTE"PEDIDO RELACIONADO

Este pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119 ou 365 para Pedido Britânico No. GB 0521621.3, depositado em 24 de Outubro de2005. As instruções totais do pedido acima são incorporadas neste lugar porreferência.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

O uso in vivo de muitos agentes com potencial terapêutico ou diagnóstico não é possível. Agentes maiores que têm meias-vidas no soro invivo que são suficientemente longas para permitir eficácia terapêutica oudiagnostica freqüentemente são incapazes de penetrar nos tecidos ou órgãospara produzir um efeito terapêutico ou diagnóstico desejado em umalocalização desejada. Agentes menores são capazes de entrar nos tecidos ou órgãos, mas freqüentemente têm meias-vidas no soro in vivo curtas, e sãorapidamente tirados da circulação sistêmica. Por exemplo, a meia-vida nosoro in vivo de monômeros dAb é de cerca de 30 minutos, (Veja, Exemplos 9e 13 de WO 2004/081026 A2.) Similarmente, a meia-vida no soro in vivo defragmentos de ligação de antígeno de anticorpos, particularmente fragmentos Fv, também é curta e os tornam inadequados para muitas aplicaçõesterapêuticas e diagnosticas in vivo. (Peters et al., Science 286(5439):434(1999).) Ademais, alterar ou modificar tais agentes para aumentar a meia-vidano soro in viva pode reduzir a atividade do agente.

Existe uma necessidade por métodos para administrar agentes(e.g., a tecido pulmonar) para produzir uma janela terapêutica ampla para oagente.

Agentes que se ligam a TNF e neutralizam sua atividadeprovaram ser agentes terapêuticos efetivos para certas condiçõesinflamatórias, tal como artrite. Entretanto, agentes que se ligam a TNF nãoforam demonstrados sendo efetivos para tratar inflamação pulmonar oudoenças respiratórias, tal como doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD).(Veja, e.g., van der Vaart et al., Am. J. Respir. grit. Care Med., 172(4):465-9(2005), Rennard et al., Proc. Amer. Thorac. Soc., 2(Volume deResumo):A133, A541 (2005), Abdelhady et al., Proc. Amer. Thorac. Soc., 2(Volume de Resumo):A133 (2005).)

Além disso, agentes terapêuticos que têm como alvo TNF alfa,tal como ENBRELO (etanercept; Immunex Corporation) antagonizamTNFRl e TNFR2, e administrar tais agentes pode produzir imunossupressão eefeitos colaterais relacionados (e.g., infecções sérias). Estes efeitos colateraispodem limitar o uso de tais agentes, particularmente para doenças crônicasonde o agente é administrado por um longo período. (Kollias G. andKontoyiannis D., Cytokine Growth Factor Rev., 13(4-5):315-321 (2002)) Emcontraste, agentes que antagonizam especificamente TNFRl teriam efeitoscolaterais reduzidos. Entretanto, direcionar TNFRl é difícil porque agentesque fazem com que o receptor se agrupe podem ativar sinalização através doreceptor, o que pode levar à elaboração de mediadores inflamatórios tal comoTNF. De fato, agentes multivalentes que se ligam a TNFRl, tal comoanticorpos anti-TNFRl, podem induzir agrupamento de TNFRl e transduçãode sinal na ausência de TNF e são comumente usados como agonistas deTNFRl. (Veja, e.g., Belka et al., EMBO, 14(6): 1156-1165 (1995); Mandik-Nayak et ai, J. Immunol, 167:1920X92% (2001).) Por conseguinte, agentesmultivalentes que se ligam a TNFRl5 geralmente não são antagonistasefetivos de TNFRl mesmo se eles bloqueiam a ligação de TNFa a TNFRl.

Existe uma necessidade por agentes melhorados queantagonizam TNF e método para administrar tais agentes para tratarinflamação pulmonar e doença pulmonar.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a uso de um agente que se liga a um alvoem tecido pulmonar (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante,monômero dAb) para a fabricação de uma formulação de longa atuação ou degrande janela terapêutica para administração local para tecido pulmonar, oupara a fabricação de um medicamento para administração local para tecidopulmonar de uma quantidade efetiva em pequena dose de dito agente,caracterizado pelo fato de que pelo menos 50% do nível de tecido pulmonarde agente é mantido por um período de pelo menos cerca de 4 horas.Preferivelmente, a formulação ou medicamento é para administração localpara o pulmão. Preferivelmente, um nível pulmonar de pelo menos cerca de1% da quantidade de agente na formulação ou medicamento é mantido porpelo menos 4 horas depois de administração local. Mais preferivelmente, oagente não entra substancialmente na circulação sistêmica. Em algumasformas realização, o agente tem uma meia-vida no soro in vivo cerca de 1segundo a cerca de 12 horas. Em outras formas de realização, a formulação oumedicamento é para administrar uma dose de não mais do que cerca de 10mg/kg/dia.

A invenção se refere a uso de um anticorpo de domínio (dAb)que se liga a um alvo em tecido pulmonar para a fabricação de umaformulação de dose diária para administração local a tecido pulmonar,caracterizado pelo fato de que pelo menos 50% do nível pulmonar de agente émantido por um período de pelo menos cerca de 4 horas.A invenção se refere a uso de um anticorpo de domínio (dAb)que se liga a um alvo em tecido pulmonar para a fabricação de umaformulação para tratamento ou prevenção de a doença respiratória,caracterizado pelo fato de que a formulação é para administração local paratecido pulmonar, e não entra substancialmente na circulação sistêmica. Emuma forma de realização, até cerca de 10 mg de um dAb que se liga a um alvoem tecido pulmonar é usado. Preferivelmente, o alvo em tecido pulmonarmedia inflamação pulmonar ou uma doença pulmonar.

A invenção se refere a um inalador ou dispositivo de liberaçãointranasal para fornecer uma dosimetrada de uma formulação de anticorpo dedomínio (dAb) a um indivíduo para o tratamento ou prevenção de uma doençaou condição respiratória, caracterizado pelo fato de que o inalador oudispositivo de liberação intranasal compreende uma formulação de dAb efornece uma dosimetrada diária contendo até 10 mg de dAb. A invençãotambém se refere a uso de uma formulação de anticorpo de domínio (dAb) nafabricação de um inalador ou dispositivo de liberação intranasal, para opropósito de fornecer uma formulação de dAb inalada de longa atuação paraliberação local para o pulmão.

A invenção também se refere a um método para administrarum agente que se liga a um alvo em tecido pulmonar a um indivíduo paraproduzir uma janela terapêutica ampla em tecido pulmonar, compreendendoadministrar localmente a tecido pulmonar de dito indivíduo uma quantidadeefetiva de dito agente.

A invenção também se refere a um método para administrarum agente que se liga a um alvo em tecido pulmonar a um indivíduo paraproduzir uma janela terapêutica ampla em tecido pulmonar, compreendendoselecionar um agente que tem uma meia-vida no soro in vivo de cerca de 1segundo a cerca de 12 horas e se liga a um alvo em tecido pulmonar, eadministrar localmente a tecido pulmonar de dito indivíduo uma quantidadeefetiva de dito agente.

Agentes adequados para uso na invenção podem se ligar a umalvo em tecido pulmonar selecionado a partir do grupo consistindo deTNFRl, Tl5-I5 IL-IR5IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, 1L-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12 IL-12R, IL-13, IL-13Rod, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16,IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CDl la,CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5,EGFR, FcERl, TGFb, CCL2, CCLl8, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1),quimase, FOP, Furina, Endotelina-1, Eotaxinas (e.g., Eotaxina, Eotaxina-2,Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, 1-309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-I, MMPs, neutrófilo elastase,osteopontina, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC,TGFb, Trombina, Tim-1, TNF, TNFRl, TRANCE, Triptase, VEGF, VLA-4,VCAM, ct4137, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfavbetaó,alfavbeta 8, cMET, e CD8.

Em uma forma de realização, um agente para uso na invençãopode se ligar a um alvo selecionado a partir do grupo consistindo de umaproteína na cascata de sinalização de TNF. Preferivelmente, esta proteína alvoé selecionada a partir do grupo compreendendo TNF alfa, TNF beta, TNFR2,TRADD, FADD, Caspase-8, fator associado a receptor de TNF (TRAF),TRAF2, proteína de interação com receptor (RIP), Hsp90, Cdc37, IKK alfa,IKK beta, NEMO, inibidor de kB (lkl3), NF-kB, modulador essencial de NF-kB, quinase 1 regulada por sinal de apoptose (aSMase), esfmgomielinaseneutra (nSMase), ASKl, Catepsina-B, quinase de centro germinal (GSK),GSK-3, proteína de domínio de morte associada a fator (FADD), fatorassociado com ativação de esfmgomielinase neutra (FAN), FLIP, JunD,inibidor de quinase NF-kB (IKK), MKK3, MKK4, MKK7, IKK gama,proteína quinase ativada por mitógeno/quinase quinase Erk (MEKK),MEKK1, MEKK3, NIK, poli(ADP-ribose) polimerase (PARP), PKC-zeta,ReIA5 Τ2Κ, TRAF1, TRAFS, domínio efetor de morte (DED), domínio demorte (DD), complexo de sinalização indutor de morte (DISC), inibidor deproteína de apoptose (IAP)5 quinase c-Jun N-terminal (INK)5 proteína quinaseativada por mitógeno (MAPK)5 fosfoinositídeo-30H quinase (PI3K), proteínaquinase A (PKA)5 PKB5 PKC5 PLAD5 PTEN5 domínio de homologia rei(RED)5 gene novo realmente interessante (RING)5 proteína quinase ativadapor estresse (SAPK)5 enzima conversora de TNT alfa (TALE)5 silenciador deproteína de domínio de morte (SODD)5 e ativador de NF-kB associado aTRAP (ΤΑΝΚ). Com respeito a estes alvos preferidos, referência é feita a W004046189, W004046186 e W004046185 (incorporados neste lugar porreferência) que fornecem orientação na seleção de domínios variáveis únicosde anticorpo para direcionar alvos intracelulares.

A invenção se refere a uso de um antagonista de TNFRl (e.g.,Ligante5 monômero dAb) para uso na fabricação de um medicamento paratratar, suprimir ou prevenir inflamação pulmonar e/ou uma doençarespiratória.

A invenção também se refere a métodos para tratar, suprimirou prevenir inflamação pulmonar e/ou a doença respiratória compreendendo,selecionar um antagonista de Receptor de Fator de Necrose Tumoral 1 (TNFRl) que tem eficácia em um modelo animal adequado de doençarespiratória quando administrado em uma quantidade que não excede cerca de10 mg/kg/dia, caracterizado pelo fato de que eficácia em dito modelo animalexiste quando infiltração celular dos pulmões, se verificada por contagemcelular total em lavagem bronquioalveolar, é inibida em relação a controlenão tratado com ρ 0,05; e administrar (e.g., administrar localmente a tecidopulmonar) uma quantidade efetiva de dito antagonista de TNFRl a umindivíduo com necessidade desta.

Doenças respiratórias que podem ser tratadas, suprimidas ouprevenidas usando os medicamentos, formulações e métodos da invençãoincluem inflamação pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica, asma,pneumonia, pneumonite de hipersensibilidade, infiltrado pulmonar comeosinofilia, doença pulmonar ambiental, pneumonia, bronquiectasias, fibrosecística, doença pulmonar intersticial, hipertensão pulmonar primária,tromboembolismo pulmonar, distúrbios da pleura, distúrbios do mediastino,distúrbios do diafragma, hipoventilação, hiperventilação, apnéia do sono,síndrome de desconforto respiratório agudo, mesotelioma, sarcoma, rejeiçãodo enxerto, doença enxerto contra hospedeiro, câncer de pulmão, rinitealérgica, alergia, asbestose, aspergiloma, aspergilose, bronquiectasias,bronquite crônica, enfisema, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonaridiopática, doença pneumocócica invasiva, influenza, micobactérias nãotuberculosas, efusão pleural, pneumoconiose, pneumocitose, pneumonia,actinomicose pulmonar, proteinose alveolar pulmonar, antraz pulmonar,edema pulmonar, embolia pulmonar, inflamação pulmonar, histiocitose Xpulmonar, hipertensão pulmonar, nocardiose pulmonar, tuberculose pulmonar,doença veno-oclusiva pulmonar, doença pulmonar reumatóide, sarcoidose,granulomatose de Wegener, e carcinoma pulmonar de célula não pequena.

A invenção também se refere aos ligantes e dAbs descritosneste lugar.

A invenção também se refere a um ligante compreendendouma unidade protéica que tem um sítio de ligação com especificidade deligação para TNFRl, caracterizado pelo fato de que dita unidade protéicacompreende uma seqüência de aminoácidos que é a mesma que a seqüênciade aminoácidos de CDR3 de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar.

Em algumas formas realização, o ligante compreendendo umaunidade protéica que tem um sítio de ligação com especificidade de ligaçãopara TNFRl, caracterizado pelo fato de que a unidade protéica tem umaseqüência de aminoácidos que é a mesma que a seqüência de aminoácidos deCDR3 de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar, e também compreendeuma seqüência de aminoácidos que é a mesma que a seqüência deaminoácidos de CDRl e/ou CDR2 de um dAb anti-TNFRl descrito nestelugar.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que o domínio variável único de imunoglobulinaque se liga a TNFRl difere da seqüência de aminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do que 25 posições de aminoácidose tem uma seqüência de CDRI que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência de CDRI dos dAbs anti-TNFRl descritos neste lugar.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domíniovariável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl difere da seqüência deaminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do que25 posições de aminoácidos e tem uma seqüência de CDR2 que tem pelomenos 50% de identidade com a seqüência de CDR2 dos dAbs anti-TNFRldescritos neste lugar.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domíniovariável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl difere da seqüência deaminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do que25 posições de aminoácidos e tem uma seqüência de CDR3 que tem pelomenos 50% de identidade com a seqüência de CDR3 dos dAbs anti-TNFRldescritos neste lugar.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domíniovariável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl difere da seqüência deaminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do que25 posições de aminoácidos e tem uma seqüência de CDRl e uma seqüênciade CDR2 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDRlou CDR2, respectivamente, dos dAbs anti-TNFRl descritos neste lugar.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domíniovariável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl difere da seqüência de aminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do que25 posições de aminoácidos e tem uma seqüência de CDR2 e uma seqüênciade CDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDR2ou CDR3, respectivamente, dos dAbs anti-TNFRl descritos neste lugar.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domíniovariável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl difere da seqüência deaminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do que25 posições de aminoácidos e tem uma seqüência de CDRl e uma seqüênciade CDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDRlou CDR3, respectivamente, dos dAbs anti-TNFRl descritos neste lugar.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domínio25 variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl difere da seqüência deaminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do queposições de aminoácidos e tem uma seqüência de CDRl, uma seqüênciade CDR2 e uma seqüência de CDR3 que tem pelo menos 50% de identidadecom as seqüências de CDRl, CDR2 ou CDR3, respectivamente, dos dAbsanti-TNPRl descritos neste lugar.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de que o domínio variável único deimunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDRl que tempelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDRl de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de que o domínio variável único deimunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDR2 que tempelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDR2 de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de que o domínio variável único de.imunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDR3 que tempelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDR3 de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de que o domínio variável único deimunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDRl e uma deCDR2 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDRl eCDR2, respectivamente, de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de o domínio variável único deimunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDR2 e uma deCDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDR2 eCDR3, respectivamente, de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de que o domínio variável único deimunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDRl e uma deCDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDRl eCDR3, respectivamente, de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de que o domínio variável único deimunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDRl, CDR2, euma de CDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências deCDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, de um dAb anti-TNFRl descritoneste lugar.

A invenção também se refere a um ácido nucleico isolado ourecombinante codificando qualquer dos ligantes da invenção. Em outrasformas de realização, a invenção se refere a um vetor compreendendo o ácidonucleico recombinante da invenção.

A invenção também se refere a uma célula hospedeiracompreendendo o ácido nucleico recombinante da invenção ou o vetor dainvenção.

A invenção também se refere a um método para produzir umligante, compreendendo manter uma célula hospedeira da invenção emcondições adequadas para expressão de um ácido nucleico ou vetor dainvenção, através do qual um ligante é produzido. Em outras formas derealização, o método de produzir um ligante compreende adicionalmenteisolar o ligante.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕESFIG. 1 é um gráfico mostrando que um antagonista de TNFRltem eficácia superior em comparação com outros agentes terapêuticos quandoadministrado localmente a tecido pulmonar em um modelo subcrônico dedoença pulmonar obstrutiva crônica induzida por fumaça de tabaco (TS)(COPD) em camundongos C57BL/6. O gráfico mostra o número de célulaspresente em lavagem bronquioalveolar (BAL) de camundongos em términodo estudo descrito em Exemplo 1. Os dados individuais apontam para cadacamundongo no estudo e as médias de grupo (médias; linhas horizontais) sãomostradas. Os resultados mostram que monômero dAb anti-TNFRl (Doml)localmente administrado ao pulmão por administração intranasal reduziu onúmero de células em BAL em 72% comparado com o grupo não tratado. Osresultados também mostram que administração local para o pulmão de umagente terapêutico que tem como alvo TNF (ENBREL® (etanercept;Immunex Corporation)) não teve um efeito estatisticamente significante nonúmero de células em BAL. Os resultados mostram adicionalmente quemonômero dAb anti-TNFRl (Doml) localmente administrado ao pulmão poradministração intranasal foi mais efetivo em reduzir o número de células emBAL do que um inibidor de fosfodiesterase 4 (PDE4I, BAY 19-8004) que foiadministrado em uma dose alta de 10 mg/kg oralmente duas vezes ao dia(b.i.d.). TS, induzido por fumaça de tabaco; Veh, veículo; ns, não signifícanteestatisticamente,

FIG. 2 é um gráfico mostrando que um antagonista de TNFRltem eficácia superior em comparação com um agente terapêutico que temcomo alvo TNF quando administrado sistemicamente em um modelosubcrônico de doença pulmonar obstrutiva crônica induzida por fumaça detabaco (TS) (COPD) em camundongos C57BL/6. O gráfico mostra o númerode células presente em BAL de camundongos em término do estudo descritoem Exemplo 2. Os dados individuais apontam para cada camundongo noestudo e as médias de grupo (linhas horizontais) são mostradas. Os resultadosmostram que monômero dAb anti-TNFRl (TNFRl) PEGuilado administradosistemicamente por administração intraperitoneal reduziu o número de célulasem BAL em 60% comparado com o grupo não tratado. Os resultados tambémmostram que administração sistêmica de um agente terapêutico que tem comoalvo TNF (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)) resultou em umaumento de 12% no número de células em BAL, embora este aumento nãotenha sido significante estatisticamente. TS, induzido por fumaça de tabaco;Veh, veículo; ns, não significante estatisticamente; i.p. intraperitoneal.

FIG. 3 é um histograma no qual os dados para certos gruposque são mostrados em FIGS. 1 e 2 são replotados junto com os resultadospara um estudo no qual um esteróide oral (Dexametasona) foi administradono modelo.. O histograma mostra que administração local de monômero dAbanti-TNFRl (DOM/ADSlOl-nativo (Dom 1 em FIG. 1)) ao pulmão poradministração intranasal (1 mg/kg administrado uma vez a cada dia (q.d.)), eadministração sistêmica de monômero dAb anti-TNFRl PEGuilado(DOM/ADS101 -peguilado (TNFR1 em FIG.2)) por administraçãointraperitoneal (10 mg/kg administrados uma vez a cada dois dias (q.a.d.))foram mais eficazes no modelo do que inibidor de fosfodiesterase 4 (PDE4I)que foi administrado em uma dose alta (10 mg/kg administrados oralmenteduas vezes ao dia (b.i.d.)). O histograma também mostra que esteróideoralmente administrado (0,3 mg/kg administrado oralmente duas vezes ao dia)aumentou o número de células em BAL, e assim não foi eficaz no modelo.

FIGS 4A e 4B são histogramas mostrando as contagenscelulares diferenciais para macrófagos (4A) ou neutrófilos (4B) em BAL paracertos grupos de estudo que são mostrados em FIGS. 1 e 2. FIG. 4A mostraque administração local de monômero dAb anti-TNFRl (DOM/ADSlOl-nativo (Doml em FIG. 1)) ao pulmão por administração intranasal (1 mg/kgadministrado uma vez a cada dia (q.d.)), e administração sistêmica demonômero dAb anti-TNFRl PEGuilado (DOM/ADS 101 -peguilado (TNFR1in FIG.2)) por administração intraperitoneal (10 mg/kg administrados umavez a cada dois dias (q.a.d.)) foram mais eficazes em reduzir o número demacrófagos em BAL do que inibidor de fosfodiesterase 4 (PDE4I) que foiadministrado em uma dose alta (10 mg/kg administrados oralmente duasvezes a dia (b.i.d.)). Similarmente, FIG. 4B mostra que administração local demonômero dAb anti-TNFRl (DOM/ADS101-nativo (Doml em FIG. 1)) aopulmão por administração intranasal (1 mg/kg administrado uma vez a cadadia (q.d.)), e administração sistêmica de monômero dAb anti-TNFRlPEGuilado (DOM/ADS 101-peguilado (TNFR1 em FIG.2)) por administraçãointraperitoneal (10 mg/kg administrados uma vez a cada dois dias (q.a.d.))foram mais eficazes em reduzir o número de neutrófilos em BAL do queinibidor de fosfodiesterase 4 (PDE4I) que foi administrado em uma dose alta(10 mg/kg administrados oralmente duas vezes ao dia (b.i.d.)).

FIG. 5 é um gráfico mostrando os resultados do estudofarmacocinético de um agente que se liga a TNFRl (DOMlm (TAR2m21-23)) seguindo administração local para tecido pulmonar por administração,intranasal (veja, Exemplo 3). O gráfico mostra que os níveis de DOMl.m emtecido pulmonar permaneceram relativamente constantes por pelo menos 8horas depois de administração, enquanto que os níveis em BAL declinaramgradualmente, e os níveis em soro declinaram rapidamente e foramindetectáveis depois de 5 horas. Níveis máximos de DOMlm em BAL e soroforam detectados 1 hora depois de administração, (cerca de 14 μg/ml emBAL, cerca de 150 ng/ml em soro). Os níveis no BAL permaneceram altospor um período prolongado de tempo, e declinaram gradualmente por 24horas (declínio > 10-vezes depois de 24 horas). Os níveis em soro declinaramrapidamente, e DOMlm não foi detectável em soro depois de 5 horas. Osníveis de DOMl em tecido pulmonar foram relativamente constantes por pelomenos 8 horas depois de administração, e foram indetectáveis 24 horas depoisde administração.FIG. 6A-6V mostra as seqüências de aminoácidos (SEQ IDNOS: 1-198) de diversos domínios variáveis de imunoglobulina humana quetêm especificidade de ligação para TNFRl humano. As seqüências deaminoácidos apresentadas são contínuas sem nenhuma lacuna; o símbolo ~ foiinserido nas seqüências para indicar as localizações das regiões determinantesde complementaridade (CDRs). CDR1 é. flanqueada por-, CDR2 éflanqueada por -—, e CDR3 é flanqueada por —-

FIG. 7A-7B mostra as seqüências de aminoácidos (SEQ IDNOS: 199-211) de diversos domínios variáveis de imunoglobulina humanaque têm especificidade de ligação para TNFR1 de camundongo. Asseqüências de aminoácidos apresentadas são contínuas sem nenhuma lacuna;o símbolo — foi inserido nas seqüências para indicar as localizações dasregiões determinantes de complementaridade (CDRs). CDRl é flanqueadapor-, CDR2 é flanqueada por —, e CDR3 é flanqueada por

FIG. 8A mostra uma seqüência de nucleotídeos (SEQ IDNO:212) codificando o domínio extracelular de TNFRl humano (Homo.sapiens).

FIG. 8B mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:213)do domínio extracelular de TNFRl humano (Homo sapiens).

FIG. 9A mostra uma seqüência de nucleotídeos (SEQ IDNO:214) codificando o domínio extracelular de TNFRl de camundongo (Musmusculus).

FIG. 9B mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:215)do domínio extracelular de TNFRl de camundongo (Mus musculus).

FIG. 1OA-1OQ mostra as seqüências de aminoácidos (SEQ IDNOS:216-221) de diversos domínios variáveis de imunoglobulina humanaque têm especificidade de ligação para TNFRl de camundongo, e a seqüênciade aminoácidos (SEQ ID NOS:222-433) de diversos domínios variáveis deimunoglobulina humana que têm especificidade de ligação para TNFRlhumano. As seqüências de aminoácidos apresentadas são contínuassem nenhuma lacuna; o símbolo ~ foi inserido nas seqüências paraindicar as localizações das regiões determinantes de complementaridade(CDRs). CDRl é flanqueada por CDR2 é flanqueada por —, e CDR3 éflanqueada por-·.

FIG. IlAe 1IB são gráficos mostrando aumentos dependentesde tempo na concentração de TNFa em lavagem bronquioalveolar (BAL)(FIG .11A) ou tecido pulmonar (FIG. 11B) seguindo administração intranasal(i.n.) TNFa murino (I mg/camundongo) uma hora depois de administração(i.n.) de veículo ou dAb anti-TNFRl (1 mg/kg).

FIG. 12 é um gráfico mostrando aumentos dependentes detempo em neutrófilos de BAL seguindo administração i.n. de TNFa murino (1μg/camundongo) uma hora seguindo pré-administração (i.n.) de veículo oudAb anti-TNFRl (1 mg/kg). Pré-administração de dAb anti-TNFRl inibiuparcialmente o aumento em neutrófilos induzido por TNFa.

FIGS. 13A-13D são gráficos mostrando efeitos dependentes de.tempo de TNFa murino em níveis de KC de BAL (13A), níveis de M1P-2 deBAL (13B), níveis de MCP-I de BAL (13C), ou E-selectina de níveis detecido pulmonar (13D). Administração de dAb anti-TNFRl inibiusignificantemente os aumentos induzidos por TNFa.

FIGS. 14A-14Z e 14A2-14J2 mostram as seqüências denucleotídeos de diversos ácidos nucleicos que codificam domínios variáveisde imunoglobulina humana que têm especificidade de ligação para TNFRlhumano (SEQ ID NOS:434-644), e as seqüências de nucleotídeos de diversosácidos nucleicos que codificam domínios variáveis de imunoglobulinahumana que têm especificidade de ligação para mouse TNFRl (SEQ IDNOS:645-650). As seqüências apresentadas são contínuas sem nenhumalacuna; o símbolo ~ foi inserido nas seqüências para indicar as localizaçõesque codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs).CDRl é flanqueada por CDR2 é flanqueada por e CDR3 é flanqueadapor--.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como usado neste lugar, o termo "antagonista" se refere a um agente (e.g., uma molécula, um composto) que se liga a um alvo (e.g., umaproteína receptora) e pode inibir uma (i.e., uma ou mais) função do alvo. Porexemplo, um antagonista de uma proteína receptora pode se ligar à proteínareceptora e inibir a ligação de um ligante natural ou cognato à proteínareceptora e/ou inibir transdução de sinal mediada através de proteína receptora. Por exemplo, antagonistas de Receptor de Fator de NecroseTumoral I "TNFR1" podem se ligar a TNFRl e inibir ligação de TNFa aTNFRl e/ou inibir transdução de sinal mediada através de TNFRl.Antagonistas podem ser identificados, por exemplo, triando bibliotecas oucoleções de moléculas, tal como, o Chemical Repository of the National Câncer Institute, ou usando outros métodos adequados. Antagonistaspreferidos são "ligantes" como descrito neste lugar.

Como usado neste lugar, o termo "antagonista de Receptor deFator de Necrose Tumoral 1 (TNFRl)" se refere a um agente (e.g., umamolécula, um composto) que se liga a TNFRl e pode inibir uma (i.e., uma ou mais) função de TNFRl. Por exemplo, um antagonista de TNFRl pode inibira ligação de TNFa a TNFRl e/ou inibir transdução de sinal mediada atravésde TNFRl. Por conseguinte, processos e respostas celulares mediados porTNFRl (e.g., morte celular induzida por TNFa em um ensaio padrão decitotoxicidade de L929) podem ser inibidos com um antagonista de TNFRl. Um antagonista de TNFRl pode ser, por exemplo, uma molécula orgânicapequena, produto natural, proteína, peptídeo ou peptídeomimético.Antagonistas de TNFRl podem ser identificados, por exemplo, triandobibliotecas ou coleções de moléculas, tal como, o Chemical Repository of theNational Câncer Institute, como descrito neste lugar ou usando outrosmétodos adequados. Antagonistas preferidos de TNFRl são anticorpos,fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos, ligantes e monômeros dAbdescritos neste lugar.

Como usado neste lugar, o termo "ligante" se refere a umpolipeptídeo que compreende um domínio que tem especificidade de ligaçãopara um alvo desejado. Preferivelmente o domínio de ligação é um domíniovariável único de imunoglobulina (e.g., VH, Vhh) que tem especificidade deligação para um antígeno alvo desejado (e.g., uma proteína receptora). Odomínio de ligação também pode compreender uma ou mais regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs) de um domínio variável únicode imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um antígeno alvodesejado em um formato adequado, de forma que o domínio de ligação temespecificidade de ligação para o antígeno alvo. Por exemplo, as CDRs podemser enxertadas em uma armação ou esqueleto protéico adequado, tal como umaficorpo, uma armação SpA, um domínio classe A de receptor de LDL ou umdomínio EGF. Ademais, o ligante pode ser monovalente (e.g., um monômerodAb), bivalente (homobivalente, heterobivalente) ou multivalente(homomultivalente, heteromultivalente) como descrito neste lugar. Assim,"ligantes" incluem polipeptídeos que consistem de um dAb, incluempolipeptídeos que consistem essencialmente de um tal dAb, polipeptídeos quecompreendem um dAb (ou as CDRs de um dAb) em um formato adequado,tal como um formato de anticorpo (e.g., formato tipo IgG, scFv, Fab, Fab',F(ab')2) ou uma armação ou esqueleto protéico adequado, tal como umaficorpo, uma armação SpA, um domínio classe A de receptor de LDL ou umdomínio EGF, ligantes de dupla especificidade que compreendem um dAbque se liga a uma primeira proteína, antígeno ou epítopo alvo (e.g., TNFRl) eum segundo dAb que se liga a outra proteína, antígeno ou epítopo alvo (e.g.,albumina no soro), e ligantes multiespecíficos como descrito neste lugar. Odomínio de ligação também pode ser um domínio protéico compreendendoum sítio de ligação para um alvo desejado, e.g., um domínio protéico éselecionado a partir de um aficorpo, um domínio SpA5 um domínio classe Ade receptor de LDL, um domínio EGF5 um avímero (veja, e.g., Publicação dePedido de Patente Norte-Americana Nos. 2005/0053973, 2005/0089932,2005/0164301).

A frase "domínio variável único de imunoglobulina" se referea uma região variável de anticorpo (Vh, Vhh, VL) que se liga especificamentea um antígeno ou epítopo independentemente de outras regiões ou domíniosV; entretanto, como o termo é usado neste lugar, um domínio variável únicode imunoglobulina pode estar presente em uma estrutura (e.g., homo- ouhetero-multímero) com outras regiões variáveis ou domínios variáveis onde asoutras regiões ou domínios não são requeridos para ligação de antígeno pelodomínio variável único de imunoglobulina (i.e., onde o domínio variávelúnico de imunoglobulina se liga a antígeno independentemente dos domíniosvariáveis adicionais). "Domínio variável único de imunoglobulina" abrangenão apenas um polipeptídeo isolado de domínio variável único de anticorpo,mas também polipeptídeos maiores que compreendem um ou maismonômeros de uma seqüência de polipeptídeos de domínio variável único deanticorpo. Um "anticorpo de domínio" ou "dAb" é o mesmo que umpolipeptídeo de "domínio variável único de imunoglobulina" como o termo éusado neste lugar. Um polipeptídeo de domínio variável único deimunoglobulina, como usado neste lugar se refere a um polipeptídeo dedomínio variável único de imunoglobulina de mamífero, preferivelmente dehumano, mas também inclui de roedor (por exemplo, como descrito em WO00/29004, os conteúdos do qual são incorporados neste lugar por referênciaem sua totalidade) ou dAbs VHH de camelídeo. dAbs de camelídeo sãopolipeptídeos de domínio variável único de imunoglobulina que sãoderivados de espécies incluindo camelo, lhama, alpaca, dromedário, eguanaco, e compreendem anticorpos de cadeia pesada naturalmentedesprovidos de cadeia leve: VHH. Moléculas VHH são cerca de dez vezesmenores do que moléculas de IgG5 e como polipeptídeos únicos, elas sãomuito estáveis, resistindo a condições extremas de pH e temperatura.

Como usado neste lugar, o termo "dose" se refere à quantidadede agente (e.g., antagonista de TNFRl) administrada a um indivíduo toda deuma vez (dose unitária), ou em duas ou mais. administrações em um intervalode tempo definido. Por exemplo, dose pode se referir à quantidade de agente(e.g., antagonista de TNFRl) administrada a um indivíduo no curso de um dia(24 horas) (dose diária), dois dias, uma semana, duas semanas, três semanasou um ou mais meses (e.g., por uma administração única, ou por duas ou maisadministrações). O intervalo entre doses pode ser qualquer quantidade detempo desejada.

Como usado neste lugar, o termo "janela terapêutica" se refereao intervalo de concentrações de droga (e.g., antagonista, ligante, monômerodAb) no plasma, ou em um tecido ou órgão (e.g., tecido pulmonar, pulmão)ao qual uma droga é administrada localmente, que resulta em uma altaprobabilidade de eficácia terapêutica.

"Complementar" Dois domínios de imunoglobulina são"complementares" quando eles pertencem a famílias de estruturas queformam pares ou grupos cognatos ou são derivados de tais famílias e retêmesta característica. Por exemplo, um domínio VH e um domínio Vl de umanticorpo são complementares; dois domínios VH não são complementares, edois domínios Vl não são complementares. Domínios complementares podemser encontrados em outros membros da superfamília de imunoglobulina, talcomo os domínios Va e νβ (ou γ e δ) do receptor de célula-T. Domínios quesão artificiais, tal como domínios baseados em armações de proteína que nãose ligam a epítopos a menos que engenheirados para fazer isso, não sãocomplementares. Da mesma maneira, dois domínios baseados em (porexemplo) um domínio de imunoglobulina e um domínio fibronectina não sãocomplementares.

"Imunoglobulina" Isto se refere a uma família de polipeptídeosque retêm a característica de dobramento de imunoglobulina de moléculas deanticorpo, que contém duas folhas β e, normalmente, uma ponte dissulfetoconservada. Membros da superfamília de imunoglobulina estão envolvidosem muitos aspectos de interações celulares e não celulares in vivo, incluindopapéis predominantes no sistema imune (por exemplo, anticorpos, moléculasde receptor de célula-T e os semelhantes), envolvimento em adesão celular(por exemplo as moléculas ICAM) e sinalização intracelular (por exemplo,moléculas de receptor, tal como o receptor PDGF). A presente invenção éaplicável a todas as moléculas da superfamília de imunoglobulina quepossuem domínios de ligação. Preferivelmente, a presente invenção se referea anticorpos.

"Domínio" Um domínio é uma estrutura protéica dobrada queretém sua estrutura terciária independentemente do resto da proteína .Geralmente, domínios são responsáveis por propriedades funcionais discretasde proteínas, e em muitos casos podem ser adicionados, removidos outransferidos para outras proteínas sem perda de função do remanescente daproteína e/ou do domínio. Por domínio variável de anticorpo único entende-se um domínio de polipeptídeo dobrado compreendendo seqüênciascaracterísticas de domínios variáveis de anticorpo. Inclui portanto domíniosvariáveis de anticorpo completos e domínios variáveis modificados, porexemplo nos quais uma ou mais alças foram repostas por seqüências que nãosão características de domínios variáveis de anticorpo, ou domínios variáveisde anticorpo que foram truncados ou compreendem extensões N ou C-terminais, assim como fragmentos dobrados de domínios variáveis que retêmpelo menos em parte a atividade de ligação e especificidade do domínio decomprimento completo.

"Repertório" Uma coleção de diversas variantes, por exemplovariantes de polipeptídeo que diferem em sua seqüência primária. Umabiblioteca usada na presente invenção irá abranger um repertório depolipeptídeos compreendendo pelo menos 1000 membros.

"Biblioteca" O termo biblioteca se refere a uma mistura depolipeptídeos ou ácidos nucleicos heterogêneos. A biblioteca é composta demembros, cada um do qual tem uma única, seqüência de polipeptídeos ouácidos nucleicos. Neste nível, biblioteca é sinônimo de repertório. Diferençasde seqüência entre membros de biblioteca são responsáveis pela diversidadepresente na biblioteca. A biblioteca pode tomar a forma de uma simplesmistura de polipeptídeos ou ácidos nucleicos, ou pode estar na forma deorganismos ou células, por exemplo bactérias, vírus, células animais ouvegetais e os semelhantes, transformados com uma biblioteca de ácidosnucleicos. Preferivelmente, cada organismo ou célula individual contémapenas um ou um número limitado de membros de biblioteca.

Vantajosamente, os ácidos nucleicos são incorporados em vetores deexpressão, a fim de permitir expressão dos polipeptídeos codificados pelosácidos nucleicos. Em um aspecto preferido, portanto, uma biblioteca podetomar a forma de uma população de organismos hospedeiros, cada organismocontendo uma ou mais cópias de um vetor de expressão contendo um únicomembro da biblioteca em forma de ácido nucleico que pode ser expresso paraproduzir seu membro de polipeptídeo correspondente. Assim, a população deorganismos hospedeiros tem o potencial para codificar um grande repertóriode variantes de polipeptídeos geneticamente diverso.

"Anticorpo" Um anticorpo (por exemplo IgG, IgM, IgA, IgDou IgE) ou fragmento (tal como um Fab , F(ab')2, Fv, Fv ligado por dissulfeto,scFv, anticorpo multiespecífico de conformação fechada, scFv ligado pordissulfeto, dianticorpo) quer derivado de qualquer espécie que produznaturalmente um anticorpo, ou criado por tecnologia de DNA recombinante;quer isolado de soro, células B, hibridomas, transfectomas, levedura oubactérias.

"Ligante de dupla especificidade" Um ligante compreendendoum primeiro domínio variável único de imunoglobulina e um segundodomínio variável único de imunoglobulina como definido neste lugar,caracterizado pelo fato de que as regiões variáveis são capazes de se ligar adois diferentes antígenos ou dois epítopos no mesmo antígeno que não sãonormalmente ligados por uma imunoglobulina monoespecífica. Por exemplo,os dois epítopos podem estar no mesmo hapteno, mas não serem o mesmoepítopo ou suficientemente adjacentes para serem ligados por um ligantemonoespecífico. Os ligantes de dupla especificidade de acordo com ainvenção são compostos de domínios variáveis que têm especificidadesdiferentes, e não contêm pares de domínio variável mutuamentecomplementares que têm a mesma especificidade. Ligantes de duplaespecificidade e métodos adequados para preparar ligantes de duplaespecificidade são descritos em WO 2004/058821, WO 2004/003019, e WO03/002609, os preceitos inteiros de cada destes pedidos internacionaispublicados são incorporados neste lugar por referência.

"Antígeno" Uma molécula que é ligada por um ligante deacordo com a presente invenção. Tipicamente, antígenos são ligados porligantes de anticorpo e são capazes de gerar uma resposta de anticorpo in vivo.Pode ser um polipeptídeo, proteína, ácido nucleico ou outra molécula.Geralmente, os ligantes de dupla especificidade de acordo com a invenção sãoselecionados por especificidade alvo contra um antígeno particular. No casode anticorpos convencionais e fragmentos destes, o sítio de ligação deanticorpo definido pela alças variáveis (LI, L2, L3 e Hl, H2, H3) é capaz dese ligar ao antígeno.

"Epítopo" Uma unidade de estrutura convencionalmente ligadapor um par Vh/Vl de imunoglobulina. Epítopos definem o sítio de ligaçãomínimo para um anticorpo, e assim representam o alvo de especificidade deum anticorpo. No caso de um anticorpo de domínio único, um epítoporepresenta a unidade de estrutura ligada por um domínio variável emisolamento.

"Armação universal" Uma seqüência única de armação deanticorpo correspondendo às regiões de um anticorpo conservadas emseqüência como definido por Kabat .("Sequences of Proteins ofImmunological Interest", US Department of Health and Human Services) oucorrespondendo ao repertório ou estrutura de imunoglobulina de linhagemgerminativa humana como definido por Chothia and Lesk, (1987) J. Mol.Biol. 196:910-917 .A invenção sustenta o uso de uma armação única, ou umconjunto de tais armações, que foi encontrado permitindo a derivação devirtualmente qualquer especificidade de ligação apesar de variação nasregiões hipervariáveis apenas.

"Meia vida" O tempo levado para a concentração no soro doligante reduzir em 50%, in vivo, por exemplo devido à degradação do ligantee/ou depuração ou seqüestro do ligante por mecanismos naturais. Os ligantesda invenção são estabilizados in vivo e sua meia vida aumentada por ligaçãocom moléculas que resistem à degradação e/ou depuração ou seqüestro.Tipicamente, tais moléculas são proteínas naturalmente ocorrentes que por sisó têm uma meia vida longa in vivo. A meia vida de um ligante é aumentadase sua atividade funcional persiste, in vivo, por um período maior do que umligante similar que não é específico para a molécula que aumenta meia vida.Assim, um ligante específico para HSA e uma molécula alvo são comparadoscom o mesmo ligante caracterizado pelo fato de que a especificidade paraHSA não está presente, que ele não se liga a HSA mas se liga a outramolécula. Por exemplo, ele pode se ligar a um segundo epítopo na moléculaalvo. Tipicamente, a meia vida é aumentada em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%ou mais. Aumentos na variação de 2x, 3x, 4x, 5x, IOx, 20x, 3Ox, 40x, 50x oumais da meia vida são possíveis. Alternativamente, ou em adição, aumentosna variação de até 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, IOOx, 150x da meia vidasão possíveis.

"Substancialmente idêntica (ou "substancialmentehomóloga")" Uma primeira seqüência de aminoácidos ou de nucleotídeos quecontém um número suficiente de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeosidênticos ou equivalentes (e.g., com uma cadeia lateral similar, e.g.,substituições de aminoácidos conservativas) a uma segunda seqüência deaminoácidos ou de nucleotídeos de forma que a primeira e segundaseqüências de aminoácidos ou de nucleotídeos têm atividades similares. Nocaso de anticorpos, o segundo anticorpo tem a mesma especificidade deligação e tem pelo menos 50% da afinidade do mesmo.

Como usado neste lugar, os termos "baixa estringência,""média estringência", "alta estringência" ou "condições de estringência muitoalta" descrevem condições para hibridização e lavagem de ácido nucleico.Orientação para realizar reações de hibridização pode ser encontrada emCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989),6.3.1-6.3.6, que é incorporado neste lugar por referência em sua totalidade.Métodos aquosos e não aquosos são descritos naquela referência e tambémpodem ser usados. Condições de hibridização específicas referidas neste lugarsão como segue: (1) condições de hibridização de estringência baixa em 6Xcloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por duaslavagens em 0,2X SSC5 0,1% de SDS pelo menos a 50°C (a temperatura podeser aumentada para 5 50C para condições de baixa estringência); (2) condiçõesde hibridização de estringência média em 6X SSC a cerca de 45°C, seguidopor uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 60°C; (3) condiçõesde hibridização de estringência alta em 6X SSC a cerca de 45°C, seguido poruma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 65°C; e preferivelmente(4) condições de hibridização de estringência muito alta são 0,5M de fosfatode sódio, 7% de SDS a 65°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2XSSC5 1% de SDS a 65°C. Condições de estringência muito alta (4) são ascondições preferidas e aquelas que devem ser usadas a menos que de outramaneira especificado.

Como referido neste lugar, o termo "compete" significa que aligação de um primeiro epítopo ao seu domínio de ligação de epítopo cognatoé inibida quando um segundo epítopo é ligado ao seu domínio de ligação deepítopo cognato. Por exemplo, ligação pode ser inibida estericamente, porexemplo por bloqueio físico de um domínio de ligação ou por alteração daestrutura ou ambiente de um domínio de ligação de forma que sua afinidadeou avidez por um epítopo é reduzida.

Seqüências similares ou homólogas (e.g., pelo menos cerca de70% de identidade de seqüência) às seqüências descritas neste lugar tambémsão parte da invenção. Em algumas formas de realização, a identidade deseqüência no nível de aminoácido pode ser cerca de 80%, 85%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou superior. No nível de ácidonucleico, a identidade de seqüência pode ser cerca de 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou superior.Alternativamente, identidade substancial existe quando os segmentos deácidos nucleicos irão hibridizar sob condições seletivas de hibridização (e.g.,condições de hibridização de estringência muito alta), com o complemento dafita. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em umlisado celular, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmentepura.

Cálculos de "homologia" ou "identidade de seqüência" ou"similaridade" entre duas seqüências (os termos são usados permutavelmenteneste lugar) são realizados como segue. As seqüências são alinhadas parapropósitos de comparação ótima (e.g., lacunas podem ser introduzidas emuma ou ambas de uma primeira e uma segunda seqüência de aminoácidos oude ácidos nucleicos para alinhamento ótimo e seqüências não homólogaspodem ser negligenciadas para propósitos de comparação). Em uma forma derealização preferida, o comprimento de uma seqüência de referência alinhadapara propósitos de comparação é pelo menos 30%, preferivelmente pelomenos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, ainda maispreferivelmente pelo menos 60%, e ainda mais preferivelmente pelo menos70%, 80%, 90%, 100% do comprimento da seqüência de referência. Osresíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em posições de aminoácidos ouposições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quandouma posição na primeira seqüência é ocupada pelo mesmo resíduo deaminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segundaseqüência, então as moléculas são idênticas naquela posição (como usadoneste lugar "homologia" de aminoácido ou ácido nucleico é equivalente à"identidade" de aminoácido ou ácido nucleico). A identidade percentual entreas duas seqüências é uma função do número de posições idênticascompartilhadas pelas seqüências, levando em conta o número de lacunas, e ocomprimento de cada lacuna, que necessita ser introduzida para alinhamentoótimo das duas seqüências.

Alinhamentos e homologia, similaridade ou identidade deseqüências de aminoácidos e nucleotídeos, como definido neste lugarpreferivelmente são preparados e determinados usando o algoritmo BLAST 2Sequences, usando parâmetros padrão (Tatusova, T. A. et aL , FEMSMicrobiol Lett1 174:187-188 (1999)). Alternativamente, vantajosamente, oalgoritmo BLAST (versão 2.0) é empregado para alinhamento de seqüências,com parâmetros ajustados para valores padrão. O algoritmo BLAST é descritoem detalhe no sítio da rede de alcance mundial ("www") do National Centerfor Biotechnology Information (".ncbi") do National Institutes of Health("nih") do governo Norte-Americano (".gov"), no diretório "/Blast/", noarquivo "blast_help.html". Os parâmetros de busca são definidos como segue,e são vantajosamente ajustados para os parâmetros padrão definidos.BLAST (Ferramenta Básica de Busca de Alinhamento Local)é o algoritmo de busca heurístico empregado pelos programas blastp, blastn,blastx, tblastn, e tblastx; estes programas atribuem significância para seusresultados usando os métodos estatísticos de Karlin and Altschul, 1990, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 87(6):2264-8 (veja o arquivo "blast_help.html", comodescrito acima) com uns poucos aprimoramentos. Os programas BLASTforam ajustados para buscar similaridade de seqüências, por exemplo paraidentificar homólogos a uma seqüência de entrada. Os programas geralmentenão são úteis para buscar estilo de motivo. Para uma discussão de questõesbásicas em busca de similaridade de banco de dados de seqüências, vejaAltschul et al. (1994).

Os cinco programas BLAST disponíveis no sítio da rede doNational Center for Biotechnology Information realizam as seguintes tarefas:"blastp" compara uma seqüência de aminoácidos de entradacontra um banco de dados de seqüências de proteínas;

"blastn" compara uma seqüência de nucleotídeos de entradacontra um banco de dados de seqüências de nucleotídeos;

"blastx" compara os produtos de tradução conceituai de seisquadros de uma seqüência de nucleotídeos de entrada (ambas as fitas) contraum banco de dados de seqüências de proteínas;

"tblastn" compara uma seqüência de proteínas de entradacontra um banco de dados de seqüências de nucleotídeos dinamicamentetraduzidas em todos os seis quadros de leitura (ambas as fitas).

"tblastx" compara as traduções de seis quadros de umaseqüência de nucleotídeos de entrada contra as traduções de seis quadros deum banco de dados de seqüências de nucleotídeos.

BLAST usa os seguintes parâmetros de busca:HISTOGRAMA Expõe um histograma de pontos para cadabusca; padrão é sim. (Veja parâmetro H no Manual de BLAST).DESCRIÇÕES Restringe o número de descrições curtas deseqüências pareadas registrado para o número especificado; limite padrão é100 descrições. (Veja parâmetro V na página de manual). Veja tambémESPERADO e CORTE.

ALINHAMENTOS Restringe seqüências de banco de dadosao número especificado para o qual pares de segmentos de alta pontuação(HSPs) são registrados; o limite padrão é 50. Se mais seqüências de banco dedados do que isto satisfazem o limiar de significância estatística para registrar(veja ESPERADO e CORTE abaixo), apenas as igualdades relacionadas àmaior significância estatística são registradas. (Veja parâmetro B no Manualde BLAST).

ESPERADO O limiar de significância estatística para registrarigualdades contra seqüências de banco de dados; o valor padrão é 10, deforma que 10 igualdades são esperadas serem encontradas meramente aoacaso, de acordo com o modelo estocástico de Karlin e Altschul (1990). Se asignificância estatística atribuída a uma igualdade é maior do que o limiarESPERADO, a igualdade não será registrada. Limiares inferiores aoESPERADO são mais estringentes, levando a serem registradas menosigualdades ao acaso. Valores fracionados são aceitáveis. (Veja parâmetro E noManual de BLAST).

CORTE Ponto de corte para registrar pares de segmentos dealta pontuação. O valor padrão é calculado a partir do valor ESPERADO(veja acima). HSPs são registrados para uma seqüência de banco de dadosapenas se a significância estatística atribuída a elas é pelo menos tão altacomo seria atribuída a um HSP solitário tendo um ponto igual ao valor deCORTE. Valores de CORTE mais altos são mais estringentes, levando aserem registradas menos igualdades ao acaso. (Veja parâmetro S no Manualde BLAST). Tipicamente, limiares de significância podem ser maisintuitivamente administrados usando ESPERADO.MATRIZ Especifica uma matriz de pontuação alternada paraBLASTP, BLASTX, TBLASTN e TBLASTX. A matriz padrão éBLOSUM62 (Henikoff & Henikoff5 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA89(22): 10915-9). As escolhas alternativas válidas incluem: PAM40, PAM120,PAM250 e IDENTIDADE. Nenhuma matriz de pontuação alternada édisponível para BLASTN; especificando. a diretriz de MATRIZ emsolicitações de BLASTN retorna uma resposta errada.

FITA Restringe uma busca TBLASTN para apenas a fita detopo ou fundo das seqüências de banco de dados; ou restringe uma buscaBLASTN, BLASTX ou TBLASTX para apenas quadros de leituras na fita detopo ou fundo da seqüência de entrada.

FILTRO Exclui segmentos da seqüência de entrada que têmbaixa complexidade composicional, como determinado pelo programa SEGde Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163, ousegmentos consistindo de repetições internas de curta periodicidade, comodeterminado pelo programa XNU de Claverie & States, 1993, Computers andChemistry 17:191-201, ou, para BLASTN, pelo programa DUST de Tatusove Lipman (veja o sítio da rede de alcance mundial do NCBI). Filtrar podeeliminar registros estatisticamente significantes mas biologicamentedesinteressantes do resultado de blast (e.g., acertos contra regiões ácidas,básicas ou ricas em prolina comuns), deixando as regiões mais interessantesbiologicamente da seqüência de entrada disponíveis para pareamentoespecífico contra seqüências de banco de dados.

Seqüência de baixa complexidade encontrada por umprograma de filtro é substituída usando a letra "N" em seqüência denucleotídeos (e.g., "N" repetido 13 vezes) e a letra "X" em seqüências deproteínas (e.g., "X" repetido 9 vezes).

Filtragem é apenas aplicado à seqüência de entrada (ou seusprodutos de tradução), não a seqüências de banco de dados. Filtragem padrãoé DUST para BLASTN, SEG para outros programas.

Não é incomum de maneira nenhuma ser mascarada por SEG,XNU, ou ambos, quando aplicado a seqüências em SWISS-PROT5 então nãodeve ser esperado que filtragem sempre renda um efeito. Além disso, emalguns casos, seqüências são mascaradas em sua totalidade, indicando que asignificância estatística de quaisquer igualdades registradas contra a seqüênciade entrada não filtrada deve ser suspeita. NCBI-gi Faz com queidentificadores de NCBI gi sejam mostrados no resultado, em adição aoacesso e/ou nome de locus. Mais preferivelmente, comparações de seqüênciasJO são conduzidas usando o algoritmo de busca BLAST simples fornecido nosítio da rede de alcance mundial de NCBI descrito acima, no diretório"/BLAST".

A menos que definido de outra maneira, todos os termostécnicos e científicos usados neste lugar têm os mesmos significados quecomumente compreendido por alguém de verso habitual na técnica (e.g., emcultura de células, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicasde hibridização e bioquímica). Técnicas padrão são usadas para métodosmoleculares, genéticos e bioquímicos (veja geralmente, Sambrook et al,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2cl ed.. (1989) Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. e Ausubel et al, ShortProtocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc. quesão incorporados neste lugar por referência) e métodos químicos.

Como descrito neste lugar, um estudo no qual um antagonistade TNFRl consistindo essencialmente de um monômero dAb que se liga aTNFRl foi administrado em um modelo subcrônico de camundongo dedoença pulmonar obstrutiva crônica induzida por fumaça de tabaco (COPD)foi conduzido. Os resultados de estudo revelaram que antagonistas de TNFRl(e.g., que compreendem um anticorpo de domínio (dAb) que se liga aTNFRl) são agentes terapêuticos efetivos para tratar doenças respiratórias(e.g., inflamação no pulmão, doença pulmonar aguda, doença pulmonarcrônica (e.g., COPD)). De fato, os antagonistas testados no estudo foram maiseficazes do que inibidor de fosfodiesterase 4 de alta dose ou TNFRl solúvel(ENBRBLO (etanercept; Immunex Corporation)) que se liga a e neutraliza5 TNFa. Os antagonistas de TNFRl estudados foram eficazes no modeloquando administrados sistemicamente (injeção intraperitoneal) ou localmenteao tecido pulmonar por administração intranasal.

Surpreendentemente, os resultados de estudo mostram queadministração local de um antagonista que se liga a um alvo em tecidopulmonar (e.g., TNFRl) foi mais efetiva em inibir infiltração celular dospulmões no modelo do que foi administração sistêmica de um antagonista demeia-vida prolongada (monômero dAb PEGuilado, PEGuilado para aumentaro tamanho hidrodinâmico e a meia-vida no soro in vivo do monômero dAb),mesmo embora cinco vezes mais antagonista tenha sido administradosistemicamente. Em termos molares antagonista com meia-vida 2,5 vezesmais prolongada (monômero dAb PEGuilado, PEGuilado para aumentar o.tamanho hidrodinâmico e a meia-vida no soro in vivo do monômero dAb) foiadministrado sistemicamente comparado com o monômero dAb localmenteadministrado.

Como descrito neste lugar, um estudo adicional no qual afarmacocinética de um monômero dAb que se liga a TNFRl depois deadministração local para o tecido pulmonar por administração intranasal foiconduzido. Os resultados deste estudo revelaram que, seguindo administraçãolocal para o tecido pulmonar, o monômero dAb tem um longo tempo deresidência no pulmão, e que a quantidade de monômero dAb no pulmão foisubstancialmente constante por um período de oito horas. Em adição,liberação local do monômero dAb para o pulmão resultou na breve presençade apenas uma baixa concentração de monômero dAb no soro.Especificamente, um nível máximo de cerca de 150 ng/ml foi detectado nosoro 1 hora depois de administração, e no monômero dAb foi detectável nosoro depois de 5 horas.

Estes resultados do estudo farmacocinético são surpreendentese demonstram que um agente que se liga a um alvo em tecido pulmonar, talcomo um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a um alvo emtecido pulmonar (e.g, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento Fv (e.g.,scFv, Fv ligado por dissulfeto), fragmento F(ab')2, dAb) ou um antagonistade um alvo em tecido pulmonar (e.g., ligante, monômero dAb), pode serlocalmente administrado a tecido pulmonar para fornecer uma janelaterapêutica ampla (para tratar, suprimir, prevenir, ou diagnosticar condiçõesrespiratórias) em tecido pulmonar devido ao longo tempo de residência de taisagentes no tecido pulmonar. Os resultados do estudo farmacocinético, e ajanela terapêutica ampla fornecida por administração local para o tecidopulmonar, também explicam a eficácia superior observada de antagonista deTNFR1 administrado localmente no modelo de camundongo de COPD.

Adicionalmente, a eficácia superior observada de monômero dAb quando,administrado localmente em uma dose inferior, a baixa concentração demonômero dAb que entra no soro, e a rápida depuração de monômero dAb dosoro, indicam que agentes que se ligam a um alvo em tecido pulmonar (e.g.,fragmento de anticorpo que se liga a um alvo em tecido pulmonar (e.g,fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento Fv (e.g., scFv, Fv ligado pordissulfeto), fragmento F(ab')2, dAb) são muito menos propensos a produzirefeitos colaterais (e.g., imunossupressão, toxicidade) do que outros tipos deagentes terapêuticos.

Em estudos adicionais inflamação pulmonar foi induzida peloestimulador inflamatório TNFa. Os resultados destes estudos demonstram queantagonistas de TNFRl (dAb anti-TNFRl que inibe ligação de TNFa aoreceptor, ou que não inibe ligação de TNFa ao receptor) inibemsignificantemente aumentos induzidos por TNFa de outros mediadoresinflamatórios, tal como os quimioatratores de neutrófilo de atuação precoceKC e MlP-1, e a quimiocina de atuação tardia MCP-I e molécula de adesãoE-selectina, e inibiram infiltração celular dos pulmões.

Os estudos descritos neste lugar demonstram que agentes quese ligam a alvos no tecido pulmonar (e.g., fragmentos de anticorpo (e. g,fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento. Fv (e.g., scFv, Fv ligado pordissulfeto), fragmento F(ab')9, dAb), antagonistas, ligantes, monômeros dAb)são produtos terapêuticos superiores para tratar, suprimir ou prevenirinflamação pulmonar e/ou doença respiratória, ou para propósitosdiagnósticos, tal como formação de imagem. Os resultados tambémdemonstram que mesmo embora monômeros dAbs tenham uma meia-vida nosoro in vivo curta, dAbs que se ligam a um alvo em tecido pulmonar eantagonistas que contêm um tal dAb, podem ser localmente administrados atecido pulmonar para fornecer uma janela terapêutica ampla em tecidopulmonar devido ao longo tempo de residência de um tal dAb no tecidopulmonar. Por conseguinte, outros agentes que se ligam a um alvo em tecidopulmonar e têm meias-vidas curtas in vivo (e.g., fragmentos de anticorpo talcomo fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fv (e.g., scFvs, Fvsligados por dissulfeto), fragmentos F(ab')2) podem ser localmenteadministrados a tecido pulmonar para fornecer uma janela terapêutica ampla(e.g., para tratar, suprimir, prevenir, ou diagnosticar condições respiratórias)em tecido pulmonar.

Geralmente, agentes que se ligam a alvos no tecido pulmonar(e.g., fragmentos de anticorpo (e.g, fragmento Fab, fragmento Fab',fragmento Fv (e.g., scFv, Fv ligado por dissulfeto), fragmento F(ab')2, dAb),antagonistas, ligantes, monômeros dAb) podem ser localmente administradosa tecido pulmonar para fornecer uma janela terapêutica em tecido pulmonarde pelo menos cerca de 4 horas, pelo menos cerca de 5 horas, pelo menoscerca de 6 horas, pelo menos cerca de 7 horas, pelo menos cerca de 8 horas,pelo menos cerca de 9 horas; pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cercade 11 horas, ou pelo menos cerca de 12 horas.

Administração Local de Agentes que se Ligam a Alvos em Tecido Pulmonarpara Tecido Pulmonar.

Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a métodos paraadministrar um agente (e.g., fragmento de, anticorpo, antagonista, ligante,monômero dAb) que se liga a um alvo em tecido pulmonar a um indivíduopara produzir uma janela terapêutica ampla (e.g., para tratar, suprimir,prevenir, ou diagnosticar condições respiratórias) em tecido pulmonar. Porexemplo, uma janela terapêutica em tecido pulmonar de pelo menos cerca de4 horas, pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 6 horas, pelomenos cerca de 7 horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 9horas, pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cerca de 11 horas, ou pelomenos cerca de 12 horas. Em conformidade com o primeiro aspecto dainvenção, o agente é administrado localmente a tecido pulmonar de umindivíduo (e.g., um humano).

Um agente que se liga a um alvo em tecido pulmonar (e.g.,fragmentos de anticorpo (e.g, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento Fv(e.g., scFv, Fv ligado por dissulfeto), fragmento F(ab')2, dAb), antagonistas,ligantes, monômeros dAb) pode ser localmente administrado a tecidopulmonar (e.g., pulmão) de um indivíduo usando qualquer método adequado.

Por exemplo, um agente pode ser localmente administrado a tecido pulmonaratravés de inalação ou administração intranasal. Para inalação ouadministração intranasal, o agente (antagonista de TNFRl, monômero dAb)pode ser administrado usando um nebulizador, inalador, atomizador,aerossolizador, vaporizador, inalador de pó seco, inalador dosimetrado,pulverizador dosimetrado, vaporizador dosimetrado, atomizador dosimetrado,ou outro dispositivo de liberação adequado.

Em algumas formas realização, o método compreendeadministrar localmente ao tecido pulmonar de um indivíduo uma quantidadeefetiva de um agente (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante,monômero dAb) que tem uma curta meia-vida no soro in vivo e se liga a umalvo em tecido pulmonar. Em conformidade com a invenção, tais agentes(e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante, monômero dAb) podemser localmente administrados a tecido pulmonar para produzir uma janelaterapêutica ampla em tecido pulmonar mas não irão se acumularsubstancialmente no soro. Devido à curta meia-vida in vivo de tais agentes(e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante, monômero dAb), agentesque cruzam o epitélio pulmonar e entram no soro serão rapidamenteeliminados do soro, e assim não se acumularão em níveis que poderiamproduzir efeitos indesejados (e.g., efeitos colaterais sistêmicos). Por exemplo,agentes adequados (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante,monômero dAb) que se ligam a um alvo em tecido pulmonar para uso noprimeiro aspecto da invenção podem ter uma meia-vida no soro in vivo decerca de um segundo a cerca de 12 horas, cerca de 12 horas ou menos, cerca,de 11 horas ou menos, cerca de 10 horas ou menos, cerca de 9 horas oumenos, cerca de 8 horas ou menos, cerca de 7 horas ou menos, cerca de 6horas ou menos, cerca de 5 horas ou menos, cerca de 4 horas ou menos, cercade 3 horas ou menos, cerca de 2 horas ou menos, cerca de 1 hora ou menos,ou cerca de 30 minutos ou menos. Antagonistas preferidos para administraçãoem conformidade com o primeiro aspecto da invenção compreendem um dAbque se liga a um alvo em tecido pulmonar.

Agentes particularmente preferidos (e.g., antagonistas) para uso no primeiro aspecto da invenção são monômeros dAbs ou fragmentos deligação de antígeno de anticorpos que se ligam a um alvo em tecido pulmonar(e.g., fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fv (e.g., scFvs, Fvsligados por dissulfeto, fragmentos F(ab')2). A meia-vida no soro in vivo demonômeros dAb é de cerca de 30 minutos. (Veja, Exemplos 9 e 13 de WO2004/081026 Α2). Entretanto, como descrito neste lugar, liberação local deum monômero dAb que se liga a um alvo em tecido pulmonar (e.g., TNFRl)resultou em uma janela terapêutica no tecido pulmonar de pelo menos 8horas. Similarmente, a meia-vida no soro in vivo de fragmentos de ligação deantígeno de anticorpos, particularmente fragmentos Fv, também é curta e ostornam inadequados para muitas aplicações terapêuticas e diagnosticas invivo. (Peters et aL, Science 286(5439):434 (1999).) Entretanto, comomostrado pelos resultados de estudo descritos neste lugar, fragmentos deligação de antígeno de anticorpos que se ligam a um alvo em tecido pulmonarpodem ser localmente administrados a tecido pulmonar para fornecer umajanela terapêutica ampla (e.g., para tratar, suprimir, prevenir, ou diagnosticarcondições respiratórias) em tecido pulmonar, por exemplo, uma janelaterapêutica de pelo menos 8 horas.

Como descrito neste lugar, administrar localmente um agenteque se liga a um alvo em tecido pulmonar (e.g., fragmento de anticorpo,antagonista, ligante, monômero dAb) a tecido pulmonar produz uma janelaterapêutica ampla no tecido pulmonar (pulmão). Em algumas formasrealização, administrar localmente um agente que se liga a um alvo em tecidopulmonar (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante, monômero dAb)a tecido pulmonar produz uma janela terapêutica ampla em tecido pulmonar(pulmão) que é caracterizada pela presença no pulmão de pelo menos cerca de1%, pelo menos cerca de 1,25%, pelo menos cerca de 1,5%, pelo menos cercade 1,75%), pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 2,25%, pelo menoscerca de 2,5%, pelo menos cerca de 2,15%, ou pelo menos cerca de 3% daquantidade total de agente que foi administrado 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, ou 12 horas depois deadministração. Em algumas formas realização, administrar localmente umagente que se liga a um alvo em tecido pulmonar (e.g., fragmento deanticorpo, antagonista, ligante, monômero dAb) a tecido pulmonar produzuma janela terapêutica ampla em pulmão que é caracterizada pela presença nopulmão como um todo (BAL e tecido pulmonar) de pelo menos cerca de 40%,pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de25%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cercade 10%), ou pelo menos cerca de 5% da quantidade total de agente que foiadministrado 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11horas, ou 12 horas depois de administração.

Em outras formas de realização, administrar localmente umagente que se liga a um alvo em tecido pulmonar produz uma janelaterapêutica ampla em tecido pulmonar (pulmão) caracterizado pelo fato deque pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%,pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelomenos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%), pelo menos 99% ou mais donível pulmonar de agente (e.g., nível atingido seguindo administração (e.g., onível pulmonar atingido 1 hora depois de administração local para pulmão)) émantido por um período de pelo menos cerca de 4 horas, pelo menos cerca de.5 horas, pelo menos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 7 horas, pelomenos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 9 horas, pelo menos cerca de 10horas, pelo menos cerca de 11 horas, ou pelo menos cerca de 12 horas.

Como descrito neste lugar, administrar localmente um agenteque se liga a um alvo em tecido pulmonar (e.g., fragmento de anticorpo,antagonista, ligante, monômero dAb) a tecido pulmonar produz uma janelaterapêutica ampla no tecido pulmonar (pulmão), mas o agente não entrasubstancialmente na circulação sistêmica. Um agente não substancialmenteentra na circulação quando não mais do que cerca de 2%, não mais do quecerca de 1,75%, não mais do que cerca de 1,5%, não mais do que cerca de1,25%), não mais do que cerca de 1%, não mais do que cerca de 0,75%, nãomais do que cerca de 0,5%, ou não mais do que cerca de 0,25% da quantidadetotal de agente administrado, ou substancialmente nenhum agente, estápresente no soro 5 horas depois de o agente ser administrado. Em algumascircunstâncias, um agente administrado como descrito neste lugar pode entrarna circulação sistêmica mas não se acumula em um nível significante pois,por exemplo, o agente é rapidamente tirado da circulação sistêmica. Porconseguinte, a invenção fornece método para administrar localmente umagente que se liga a um alvo em tecido, pulmonar a tecido pulmonar,caracterizado pelo fato de que nenhum nível significante de agente seacumula na circulação sistêmica. O nível de um agente na circulaçãosistêmica não é significante quando não mais do que cerca de 2%, não maisdo que cerca de 1,75%, não mais do que cerca de 1,5%, não mais do que cercade 1,25%, não mais do que cerca de 1%, não mais do que cerca de 0,75%, nãomais do que cerca de 0,5%, ou não mais do que cerca de 0,25% da quantidadetotal de agente administrado, ou substancialmente nenhum agente, estápresente no soro 5 horas depois do agente ser administrado.

Geralmente, apenas uma "quantidade efetiva de dose baixa deum agente" (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante, monômerodAb) que se liga a um alvo em tecido pulmonar precisa ser administradalocalmente ao tecido pulmonar de um indivíduo. Uma quantidade efetiva empequena dose é uma quantidade de agente que é menor do que a quantidadedo mesmo agente que precisaria ser administrada sistemicamente (i.e., dosesistêmica efetiva) para atingir o mesmo efeito. Em certas formas derealização, a quantidade efetiva de dose baixa é cerca de 80% ou menos dadose sistêmica efetiva, cerca de 70% ou menos da dose sistêmica efetiva,cerca de 60% ou menos da dose sistêmica efetiva, cerca de 50% ou menos dadose sistêmica efetiva, cerca de 40% ou menos da dose sistêmica efetiva,cerca de 30% ou menos da dose sistêmica efetiva, cerca de 20% ou menos dadose sistêmica efetiva, cerca de 10% ou menos da dose sistêmica efetiva, oucerca de 5% ou menos da dose sistêmica efetiva.

Agentes adequados que podem ser localmente administrados atecido pulmonar em conformidade com o primeiro aspecto da invençãoincluem agentes, tal como um anticorpo ou fragmentos de ligação de antígenode anticorpos (e.g, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento Fv (e.g., scFv,Fv ligado por dissulfeto), fragmento F(ab')2, dAb) e antagonistas (e.g.,ligante, monômero dAb) que se ligam um alvo em tecido pulmonar, tal comoTNFRl, IL-1, IL-IR, EL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, 1L-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12 IL-12R, IL-13, IL-13Ral, IL-13Ra2, 1L-15, IL-15R, IL-16,IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CDl 1 a,CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcERl, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1),quimase, FGF, Furina, Endotelina-1, Eotaxinas (e.g., Eotaxina, Eotaxina-2,Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, 1-309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, neutrófilo elastase,osteopontina, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1, TNT, TNFRl, TRANCE, Triptase, VEGF, VLA-4,VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfavbetaó,alfavbeta 8, Cmet, ou CD8.

Em uma forma de realização, o alvo é selecionado a partir deuma proteína na cascata de sinalização de TNF. Preferivelmente, esta proteínaalvo é selecionada a partir do grupo compreendendo TNF alfa, TNF beta,TNFR2, TRADD, FADD, Caspase-8, fator associado a receptor de TNF(TRAF), TRAF2, proteína de interação com receptor (REP), Hsp90, Cdc37,IKK alfa, IKK. beta, NEMO, inibidor de kB (IkB), NF-kB, moduladoressencial de NF-kB, quinase 1 regulada por sinal de apoptose (aSMase), esfingomielinase neutra (nSMase), ASKl, Catepsina-B, quinase de centrogerminal (GSK), GSK-3, proteína de domínio de morte associada a fator(FADD), fator associado com ativação de esfingomielinase neutra (FAN),FLIP, JunD, inibidor de NF-kl3 quinase (IKK), MKK3, MKK4, MKK7, IKKgama, proteína quinase ativada por mitógeno/quinase quinase Erk (MEKK),MEKK1, IVIEKK3, ΝΙΚ, poli(ADP-ribose) polimerase (PARP), PKC-zeta,ReJA, T2K, TRAF1, TRAF5, domínio efetor de morte (DED), domínio demorte (DD), complexo de sinalização indutor de morte (DISC), inibidor deproteína de apoptose (IAP), quinase c-Jun N-terminal (INK), proteína quinaseativada por mitógeno (MAPK), fosfoinositídeo-30H quinase (Pi3p, proteínaquinase A (PKA), PKB, PKC, PLAD, PTEN, domínio de homologia rei(RHD), gene novo realmente interessante (RING), proteína quinase ativadapor estresse (SAPK)5 enzima conversora de TNF alfa (TACE), silenciador deproteína de domínio de morte (SODD), e ativador de NF-kB associado aTRAF (ΤΑΝΚ). Com relação a estes alvos preferidos, referência é feita aWO04046189, WO04046186 e WO04046185 (incorporados neste lugar porreferência) que fornecem orientação na seleção de domínios variáveis únicosde anticorpo para direcionar alvos intracelulares.

Agentes que se ligam a alvos em tecido pulmonar (e.g.,fragmentos de anticorpo (e.g, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento Fv(e.g., scFv, Fv ligado por dissulfeto), fragmento F(ab')2, dAb), antagonistas,ligantes, monômeros dAb) podem ser preparados usando qualquer métodoadequado, tal como os métodos descritos neste lugar em detalhe com respeitoa antagonistas (e.g., ligantes, monômeros dAb) que se ligam a TNFR1.

Em algumas formas realização, a invenção é um método parafornecer uma janela terapêutica ampla em tecido pulmonar de um indivíduo(e.g., um humano) para um agente (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista,ligante, monômero dAb) que se liga a um alvo (e.g., TNFR1) em tecidopulmonar, compreendendo selecionar um agente que tem uma curta meia-vidano soro in viva (e.g., menos do que cerca de 12 horas) e se liga a um alvo emtecido pulmonar, e administrar localmente a tecido pulmonar do indivíduouma quantidade efetiva ou quantidade efetiva de baixa dose do agente que foiselecionado.

Em formas de realização particulares, o primeiro aspecto dainvenção é um método para fornecer uma janela terapêutica ampla em tecidopulmonar de um indivíduo (e.g., um humano) para um agente (e.g., fragmentode anticorpo, antagonista, ligante, monômero dAb) que se liga a um alvo (e.g.,TNFRl) em tecido pulmonar, compreendendo administrar localmente a tecidopulmonar do indivíduo uma quantidade efetiva ou quantidade efetiva de baixadose de dito agente. Preferivelmente, não mais do que cerca de 10 mg/kg/diade agente é administrado. Por exemplo, cerca de 1 mg/kg/dia a cerca de 10mg/kg/dia, e.g., cerca de 1 mg/kg/dia, cerca de 2 mg/kg/dia, cerca de 3mg/kg/dia, cerca de 4 mg/kg/dia, cerca de 5 mg/kg/dia, cerca de 6 mg/kg/dia,cerca de 7 mg/kg/dia, cerca de 8 mg/kg/dia, cerca de 9 mg/kg/dia, ou cerca de10 mg/kg/dia de agente é administrado. Em outras formas de realizaçãopreferidas, tal como quando o agente está sendo administrado localmente aotecido pulmonar (pulmão) de um humano, não mais do que cerca de 10mg/dia são administrados. Por exemplo, em tais formas de realização o agentepode ser localmente administrado a tecido pulmonar em uma dose de cerca de1 mg/dia a cerca de 10 mg/dia (e.g., 10 mg/dia, 9 mg/dia, 8 mg/dia, 7 mg/dia,.6 mg/dia, 5 mg/dia, 4 mg/dia, 3 mg/dia, 2 mg/dia, ou 1 mg/dia). Porconseguinte, o agente pode ser localmente administrado a tecido pulmonar emuma dose de cerca de 1 μg/kg/dia a cerca de 200 pg/kg/dia (e.g., cerca de 10μg/kg/dia, cerca de 20 μg/kg/dia, cerca de 30 pg/kg/dia, cerca de 40 pg/kg/dia,cerca de 50 μg/kg/dia, cerca de 60 μg/kg/dia, cerca de 70 μg/kg/dia, cerca de80 pg/kg/dia, cerca de 90 pg/kg/dia, cerca de 100 pg/kg/dia, cerca de 110pg/kg/dia, cerca de 120 μg/kg/dia, cerca de 130 Fig/kg/dia, cerca de 140pg/kg/dia, cerca de 150 pg/kg/dia, cerca de 160 μg/kg/dia, cerca de 170μg/kg/dia, cerca de 180 pg/kg/dia, ou cerca de 190 pg/kg/dia). Em formas derealização particulares, cerca de 5 μg/kg/dia a cerca de 3 mg/kg/dia oupreferivelmente, cerca de 50 μg/kg/dia a cerca de 500 pg/kg/dia sãoadministrados.

Uso de Agentes que se ligam a Alvos em Tecido Pulmonar a TecidoPulmonar para Fabricação de Formulações e Medicamentos.

O primeiro aspecto da invenção também se refere a uso de umagente (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante, monômero dAb)que se liga a um alvo (e.g., TNFRl) em tecido pulmonar, como descrito nestelugar, na fabricação de formulação de longa atuação ou grande janelaterapêutica para administração local para tecido pulmonar. A grande janelaterapêutica ou período de longa atuação em tecido pulmonar pode ser umperíodo de pelo menos cerca de 4 horas, pelo menos cerca de 5 horas, pelomenos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 7 horas, pelo menos cerca de 8horas, pelo menos cerca de 9 horas, pelo menos cerca de 10 horas, pelo menoscerca de 11 horas, ou pelo menos cerca de 12 horas.

Em algumas formas realização, o agente (e.g., fragmento deanticorpo, antagonista, ligante, monômero dAb) usado tem uma curta meia-vida no soro in vivo e se liga a um alvo em tecido pulmonar. Emconformidade com a invenção, tais agentes (e.g., fragmento de anticorpo,antagonista, ligante, monômero dAb) podem ser localmente administrados atecido pulmonar para produzir uma janela terapêutica ampla em tecidopulmonar mas não irão se acumular substancialmente no soro. Por exemplo,agentes adequados (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante,monômero dAb) que se ligam a um alvo em tecido pulmonar para uso noprimeiro aspecto da invenção podem ter uma meia-vida no soro in vivo decerca de um segundo a cerca de 12 horas, cerca de 12 horas ou menos, cercade 11 horas ou menos, cerca de 10 horas ou menos, cerca de 9 horas oumenos, cerca de 8 horas ou menos, cerca de 7 horas ou menos, cerca de 6horas ou menos, cerca de 5 horas ou menos, cerca de 4 horas ou menos, cercade 3 horas ou menos, cerca de 2 horas ou menos, cerca de I hora ou menos, oucerca de 30 minutos ou menos.

Agentes particularmente preferidos (e.g., antagonistas) parauso no primeiro aspecto da invenção são monômeros dAbs ou fragmentos deligação de antígeno de anticorpos que se ligam a um alvo em tecido pulmonar(e.g., fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fv (e.g., scFvs, Fvsligados por dissulfeto), fragmentos F(ab')/).

Em algumas formas realização, a invenção se refere a uso de um agente (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante, monômerodAb) que se liga a um alvo (e.g., TNFR1) em tecido pulmonar, como descritoneste lugar, na fabricação de formulação de longa atuação ou grande janelaterapêutica para administração local para tecido pulmonar (pulmão)caracterizado pelo fato de que pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelomenos 99% ou mais do nível pulmonar de agente (e.g., nível atingidoseguindo administração (e.g., o nível pulmonar atingido 1 hora depois deadministração local para pulmão)) é mantido por um período de pelo menoscerca de 4 horas, pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 6 horas,pelo menos cerca de 7 horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca,de 9 horas, pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cerca de 11 horas, oupelo menos cerca de 12 horas. Em algumas formas realização, a invenção serefere a uso de um agente (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante, monômero dAb) que se liga a um alvo (e.g., TNFRl) em tecido pulmonar,como descrito neste lugar, na fabricação de formulação de longa atuação ougrande janela terapêutica para administração local para tecido pulmonar(pulmão) caracterizado pelo fato de que o período de longa atuação ou grandejanela terapêutica em pulmão que é caracterizada pela presença no pulmão como um todo (BAL e tecido pulmonar) de pelo menos cerca de 40%, pelomenos cerca de 35%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 25%,pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de10%, ou pelo menos cerca de 5% da quantidade total de agente que foiadministrado 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11horas, ou 12 horas depois de administração.

Em algumas formas realização, a invenção se refere a uso deum agente (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante, monômerodAb) que se liga a um alvo (e.g., TNFRl) em tecido pulmonar, como descritoneste lugar, na fabricação de formulação de longa atuação ou grande janelaterapêutica para administração local para tecido pulmonar (pulmão)caracterizado pelo fato de que um nível pulmonar de pelo menos cerca de 1 %,pelo menos cerca de 1,25%, pelo menos cerca de 1,5%, pelo menos cerca de1,75%, pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 2,25%, pelo menoscerca de 2,5%, pelo menos cerca de 2,75%, ou pelo menos cerca de 3% daquantidade de agente na formulação (e.g., que é administrado em uma dose daformulação) está presente em tecido pulmonar por pelo menos 4 horas, pelomenos 5 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 7 horas, pelo menos 8 horas,pelo menos 9 horas, pelo menos 10 horas, pelo menos 11 horas, ou pelomenos 12 horas (e.g., depois da formulação ser administrada).

Preferivelmente o agente para uso na invenção não entrasubstancialmente na circulação sistêmica (e. g., quando em uma formulaçãode longa atuação ou de grande janela terapêutica). Como descrito neste lugar,um agente não entra substancialmente na circulação quando não mais do quecerca de 2%, não mais do que cerca de 1,75%, não mais do que cerca de1,5%, não mais do que cerca de 1,25%, não mais do que cerca de 1%, nãomais do que cerca de 0,75%, não mais do que cerca de 0,5%, ou não mais doque cerca de 0,25% da quantidade total de agente administrado (e.g, em umadose da formulação), ou substancialmente nenhum agente, está presente nosoro 5 horas depois do agente (e.g, em uma dose da formulação) seradministrado. Em algumas circunstâncias, um agente administrado comodescrito neste lugar pode entrar na circulação sistêmica mas não se acumular aum nível significante pois, por exemplo, o agente é rapidamente tirado dacirculação sistêmica. Por conseguinte, a invenção sustenta uso de um agenteque se liga a um alvo em tecido pulmonar a tecido pulmonar, caracterizadopelo fato de que nenhum nível significante de agente se acumula na circulaçãosistêmica. O nível de um agente na circulação sistêmica não é significantequando não mais do que cerca de 2%, não mais do que cerca de 1,75%, nãomais do que cerca de 1,5%, não mais do que cerca de 1,25%, não mais do quecerca de 1%, não mais do que cerca de 0,75%, não mais do que cerca de0,5%, ou não mais do que cerca de 0,25% da quantidade total de agenteadministrado (e.g, em uma dose da formulação), ou substancialmente nenhumagente, está presente no soro 5 horas depois do agente (e. g, em uma dose daformulação) ser administrado.

A invenção também se refere a uso de um agente (e.g.,fragmento de anticorpo, antagonista, ligante, monômero dAb) que se liga aum alvo (e.g., TNFR1) em tecido pulmonar, como descrito neste lugar, nafabricação de um medicamento para administração local para tecido pulmonarde uma quantidade efetiva em pequena dose de agente. Como descrito nestelugar, uma quantidade efetiva em pequena dose é geralmente cerca de 80% ou.menos da dose sistêmica efetiva, cerca de 70% ou menos da dose sistêmicaefetiva, cerca de 60% ou menos da dose sistêmica efetiva, cerca de 50% oumenos da dose sistêmica efetiva, cerca de 40% ou menos da dose sistêmicaefetiva, cerca de 30% ou menos da dose sistêmica efetiva, cerca de 20% oumenos da dose sistêmica efetiva, cerca de 10% ou menos da dose sistêmicaefetiva, ou cerca de 5% ou menos da dose sistêmica efetiva.

Em algumas formas realização, a invenção é um método paraproduzir uma formulação de longa atuação ou de grande janela terapêuticapara administração local para tecido pulmonar compreendendo um agente(e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante, monômero dAb) que seliga a um alvo em tecido pulmonar, ou um método para produzir ummedicamento para administração local para tecido pulmonar de umaquantidade efetiva em pequena dose de agente (e.g., fragmento de anticorpo,antagonista, ligante, monômero dAb) que se liga a um alvo em tecidopulmonar. Os métodos compreendem (1) selecionar um agente que se liga aum alvo em tecido pulmonar e tem uma meia-vida no soro curta in vivo (e.g.,menos do que cerca de 12 horas), e (2) usar o agente selecionado para afabricação de uma formulação de longa atuação ou de grande janelaterapêutica para administração local para. tecido pulmonar, ou para afabricação de medicamento para administração local para tecido pulmonar deuma quantidade efetiva em pequena dose de agente.

A invenção também se refere a uso de um agente que se liga aum alvo em tecido pulmonar (e.g., fragmento de anticorpo, antagonista,ligante, monômero dAb), como descrito neste lugar, para uso na fabricação deuma formulação de longa atuação ou de grande janela terapêutica paraadministração local para tecido pulmonar (pulmão), como descrito nestelugar, ou na fabricação de um medicamento para administração local paratecido pulmonar de uma quantidade efetiva em pequena dose de agente, comodescrito neste lugar, caracterizado pelo fato de que a formulação oumedicamento é para administrar não mais agente do que cerca de 10mg/kg/dia. Por exemplo, a formulação ou medicamento pode ser paraadministrar cerca de 1 mg/kg/dia a cerca de 10 mg/kg/dia, e.g., cerca de 1mg/kg/dia, cerca de 2 mg/kg/dia, cerca de 3 mg/kg/dia, cerca de 4 mg/kg/dia,cerca de 5 mg/kg/dia, cerca de 6 mg/kg/dia, cerca de 7 mg/kg/dia, cerca de 8mg/kg/dia, cerca de 9 mg/kg/dia, ou cerca de 10 mg/kg/dia. Em algumasformas de realização, a formulação ou medicamento é para administraçãolocal para o tecido pulmonar (pulmão) de um humano, e a formulação oumedicamento é para administrar não mais do que cerca de 10 mg/dia. Porexemplo, a formulação ou medicamento pode ser para administrar agente emuma dose de cerca de 1 mg/dia a cerca de 10 mg/dia (e.g., 10 mg/dia, 9mg/dia, 8 m.g/dia, 7 mg/dia, 6 mg/dia, 5 mg/dia, 4 mg/dia, 3 mg/dia, 2mg/dia, ou 1 mg/dia). Por conseguinte, a formulação ou medicamento podeser para administrar agente em uma dose de cerca de ^g/kg/dia a cerca de200 μg/kg/dia (e.g., cerca de 10 μg/kg/dia, cerca de 20 μg/kg/dia, cerca de 30μg/kg/dia, cerca de 40 μg/kg/dia, cerca de 50 μg/kg/dia, cerca de 60μg/kg/dia, cerca de 70 μg/kg/dia, cerca de 80 μg/kg/dia, cerca de 90μg/kg/dia, cerca de 100 μg/kg/dia, cerca de 110 μg/kg/dia, cerca de 120μg/kg/dia, cerca de 130 μg/kg/dia, cerca de 140 μg/kg/dia, cerca de 150μg/kg/dia, cerca de 160 μg/kg/dia, cerca de 170 μg/kg/dia; cerca de 180μg/kg/dia, ou cerca de 190 μg/kg/dia). Em formas de realização particulares,cerca de 5 μg/kg/dia a cerca de 3 mg/kg/dia ou preferivelmente, cerca de 50μg/kg/dia a cerca de 500 μg/kg/dia são administrados.

As formulações e medicamentos produzidos usando um agenteque se liga a um alvo em tecido pulmonar, como descrito neste lugar, podemser localmente administrados a tecido pulmonar (e.g., pulmão) de umindivíduo usando qualquer método adequado. Por exemplo, um agente podeser localmente administrado a tecido pulmonar através de inalação ouadministração intranasal. Para inalação ou administração intranasal, o agente(antagonista de TNFRl, ligante, monômero dAb) pode ser administradousando um nebulizador, inalador, atomizador, aerossolizador, vaporizador,inalador de pó seco, inalador dosimetrado, pulverizador dosimetrado,vaporizador dosimetrado, atomizador dosimetrado, ou outro dispositivo deliberação adequado.

Se desejado, por exemplo para propósitos diagnósticos (e.g.formação de imagem), o agente que se liga a um alvo em tecido pulmonar(e.g., fragmento de anticorpo, antagonista, ligante, monômero dAb) podecompreender um marcador detectável. Marcas detectáveis adequadas emétodos para marcar um agente são bem conhecidos na técnica. Marcasdetectáveis adequadas incluem, por exemplo, um radioisótopo (e.g., comoíndio-111, Tecnécio-99m ou Iodo-131), marcas que emitem pósitron (e.g.,Flúor-19), íons paramagnéticos (e.g., Gadolínio (III), Manganês (II)), ummarcador de epítopo (etiqueta), um marcador de afinidade (e.g., biotina,avidina), um marcador de spin, uma enzima, um grupo fluorescente ou umgrupo quimioluminescente. Quando marcas não são empregadas, formação decomplexo pode ser determinada por ressonância de plasmônio de superfícieou outros métodos adequados.

Antagonistas de TNFRl para Tratar, Suprimir ou Prevenir InflamaçãoPulmonar e Doenças Respiratórias.

Em um segundo aspecto, a invenção se refere a métodos paratratar, suprimir ou prevenir inflamação pulmonar e/ou a doença respiratóriacompreendendo administrar a um indivíduo (e.g., um mamífero, um humano)com necessidade disto uma quantidade efetiva de um antagonista de TNFRl(e.g., um ligante, um monômero dAb). A invenção também se refere ao usode um antagonista de TNFRl (e.g., um ligante, um monômero dAb) para afabricação de um medicamento para tratar, suprimir ou prevenir inflamaçãopulmonar e/ou doença respiratória, e a uma composição farmacêutica, paratratar, suprimir ou prevenir inflamação pulmonar e/ou doença respiratória,compreendendo um antagonista de TNFRl (e.g., um ligante, um monômerodAb) como um ingrediente ativo. Antagonistas de TNFRl adequados para usona invenção são descritos em detalhe neste lugar e incluem moléculaspequenas, novas entidades químicas, ligantes, monômeros dAb, e ossemelhantes.

A invenção fornece composições compreendendo umantagonista de TNFRl (e.g. ligante, ligante de dupla especificidade,monômero dAb multiespecífico) e um carreador, diluente ou excipientefarmaceuticamente aceitável, e métodos terapêuticos e diagnósticos queempregam os ligantes ou composições da invenção. Antagonistas e ligantes(e.g., ligantes de dupla especificidade, ligantes multiespecíficos, monômerosdAb) de acordo com o método da presente invenção podem ser empregadosem aplicações terapêuticas e profiláticas in vivo, aplicações diagnosticas invivo e os semelhantes.

Usos terapêuticos e profiláticos de antagonistas deTNFRl(e.g., ligantes, ligantes multiespecíficos, ligantes de dupla especificidade,monômeros dAb) compreendem administrar uma quantidade efetiva deantagonistas de TNFRl (e.g., ligantes, ligantes multiespecíficos, ligantes dedupla especificidade, monômeros dAb) a um mamífero ou indivíduo receptor,tal como um humano.

Por exemplo, os antagonistas de TNFRl (e.g., ligantes,ligantes multiespecíficos, ligantes de dupla especificidade, monômeros dAb)tipicamente irão encontrar uso para prevenir, suprimir ou tratar inflamaçãopulmonar e/ou doenças respiratórias, tal como uma condição na qualinflamação pulmonar é um sintoma ou parte da patologia, doençasrespiratórias agudas, doenças respiratórias crônicas, doenças respiratóriasinflamatórias agudas e doenças respiratórias inflamatórias crônicas. Porexemplo, os antagonistas de TNFRl (e.g., ligantes, ligantes multiespecíficos,ligantes de dupla especificidade, monômeros dAb) podem ser administradas,para tratar, suprimir ou prevenir inflamação pulmonar, doença pulmonarobstrutiva crônica (e.g., bronquite crônica, bronquite obstrutiva crônica,enfisema), asma (e.g., asma resistente a esteróide), pneumonia (e.g.,pneumonia bacteriana, tal como pneumonia estafilocócica), pneumonite dehipersensibilidade, infiltrado pulmonar com eosinofilia, doença pulmonarambiental, pneumonia, bronquiectasias, fibrose cística, doença pulmonarintersticial, hipertensão pulmonar primária, tromboembolismo pulmonar,distúrbios da pleura, distúrbios do mediastino, distúrbios do diafragma,hipoventilação, hiperventilação, apnéia do sono, síndrome de desconfortorespiratório agudo, mesotelioma, sarcoma, rejeição do enxerto, doençaenxerto contra hospedeiro, câncer de pulmão, rinite alérgica, alergia,asbestose, aspergiloma, aspergilose, bronquiectasias, bronquite crônica,enfisema, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, doençapneumocóccica invasiva (IPD), influenza, micobactérias não tuberculosas,efusão pleural, pneumoconiose, pneumocitose, pneumonia, actinomicosepulmonar, proteinose alveolar pulmonar, antraz pulmonar, edema pulmonar,embolia pulmonar, inflamação pulmonar, histiocitose X pulmonar (granulomaeosinofílico), hipertensão pulmonar, nocardiose pulmonar, tuberculosepulmonar, doença veno-oclusiva pulmonar,, doença pulmonar reumatóide,sarcoidose, Granulomatose de Wegener, e carcinoma pulmonar de célula nãopequena.

No presente pedido, o termo "prevenção" envolveJ.0 administração da composição protetora antes da indução da doença."Supressão" se refere à administração da composição depois de um eventoindutor, mas antes do aparecimento clínico da doença. "Tratamento" envolveadministração da composição protetora depois de sintomas de doença setornarem manifestos.

Vantajosamente, ligantes duais ou multiespecíficos podem serusados para atingir citocinas e outras moléculas que cooperamsinergisticamente em situações terapêuticas no corpo de um organismo. Ainvenção portanto fornece um método para sinergizar a atividade de dois oumais domínios de ligação (e.g., dAbs) caracterizado pelo fato de que umdomínio se liga a TNFRl ou outro alvo em tecido pulmonar, e o outrodomínio se liga a uma citocina ou outras moléculas, compreendendoadministrar um ligante dual ou multiespecífico capaz de se ligar a ditas duasou mais moléculas (e.g., TNFRl e uma citocina). Por exemplo, este aspectoda invenção se refere a combinações de domínios VH e domínios VL,domínios VH apenas e domínios Vl apenas.

Sinergia em um contexto terapêutico pode ser atingida dediversas maneiras. Por exemplo, combinações de alvos podem serterapeuticamente ativas apenas se ambos os alvos são atingidos pelo ligante,ao passo que atingir um alvo apenas não é terapeuticamente efetivo. Em outraforma de realização, um alvo apenas pode fornecer algum efeito terapêuticobaixo ou mínimo, mas junto com um segundo alvo a combinação fornece umaumento sinergístico em efeito terapêutico.

Sistemas de modelos animais que podem ser usados paraselecionar a efetividade dos antagonistas de TNFRl (e.g, ligantes, anticorposou proteínas de ligação destes, monômero .dAb) em prevenir, suprimir outratar doença respiratória estão disponíveis. Por exemplo, modelos animaisadequados de doença respiratória incluem modelos de doença pulmonarobstrutiva crônica (veja, Groneberg, DA et al., Respiratory Research 5:18.10 (2004)), e modelos de asma (veja, Coffman et al., J. Exp. Med. 201(12): 1875-1879 10 (2001)). Preferivelmente, o antagonista de TNFRl (e.g., Iigante oumonômero dAb) é eficaz em um modelo de camundongo induzido por fumaçade tabaco de doença pulmonar obstrutiva crônica (e.g., o modelo subcrônicodescrito neste lugar) ou um modelo de primata adequado de asma ou doençapulmonar obstrutiva crônica. Mais preferivelmente, o antagonista de TNFRl(e.g., Iigante ou monômero dAb) é eficaz em um modelo de camundongoinduzido por fumaça de tabaco de doença pulmonar obstrutiva crônica (e.g., omodelo subcrônico descrito neste lugar) (Veja, também, Wright and Churg,Chest, 122:301-306 (2002)). Por exemplo, administrar uma quantidade efetivado ligante pode reduzir, atrasar ou prevenir início dos sintomas de COPD nomodelo, se comparado com um controle adequado. A técnica anterior nãosugere usar antagonistas de TNFRl (e.g., ligantes ou monômero dAbs) nestesmodelos, ou que eles seriam eficazes.

Geralmente, os presentes antagonistas (e.g., ligantes) serãoutilizados em forma purificada junto com carreadores farmacologicamenteapropriados. Tipicamente, estes carreadores incluem soluções aquosas oualcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, qualquer incluindo meios salinose/ou tamponados. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio,dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio e lactato de Ringer.Adjuvantes fisiologicamente aceitáveis adequados, se necessários para manterum complexo de polipeptídeo em suspensão, podem ser escolhidos a partir deespessantes tal como carboximetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina ealginatos.

Veículos intravenosos incluem abastecedores de fluído e denutriente e abastecedores de eletrólito, tal como aqueles baseados em dextrosede Ringer. Conservantes e outros aditivos, tal como antimicrobianos,antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes, também podem estarpresentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).Uma variedade de formulações adequadas pode ser usada, incluindoformulações de liberação estendida.

Os antagonistas (e.g., ligantes) da presente invenção podem serusados como composições separadamente administradas ou em conjunçãocom outros agentes. Estes podem incluir várias drogas, tal como inibidores defosfodiesterase (e.g., inibidores de fosfodiesterase 4), bronquiodilatadores(e.g., beta2-agonistas, anticolinérgicos, teofilina), beta-agonistas de atuação,curta (e.g., albuterol, salbutamol, bambuterol, fenoterol, isoeterina,isoproterenol, levalbuterol, metaproterenol, pirbuterol, terbutalina e toralato),beta-agonistas de atuação longa (e.g., formoterol e salmeterol),anticolinérgicos de atuação curta (e.g., brometo de ipratrópio e brometo deoxitrópio), anticolinérgicos de atuação longa (e.g., tiotrópio), teofilina (e.g.formulação de atuação curta, formulação de atuação longa), esteróidesinalados (e.g., beclometasona, beclometasona, budesonida, flunisolida,fluticasona propionato e triamcinolona), esteróides orais (e.g.,metilprednisolona, prednisolona, prednisolona e prednisona), beta-agonistasde atuação curta combinados com anticolinérgicos (e.g.,albuterol/salbutamol/ipratrópio, e fenoterol/ipratrópio), beta-agonistas delonga atuação combinados com esteróides inalados (e.g.,salmeterol/fluticasona, e formoterol/budesonida) e agentes mucolíticos (e.g.,erdosteína, acetilcisteína, bromheksin, carbocisteína, guiafenesina e gliceroliodado), ciclosporina, antibióticos, antivirais, metotrexato, adriamicina,cisplatina, e imunotoxinas.

Composições farmacêuticas podem incluir "coquetéis" devários agentes citotóxicos ou outros em conjunção com os antagonistas (e.g.,ligantes) da presente invenção, ou mesmo combinações de ligantes de acordocom a presente invenção tendo especificidades diferentes, tal como ligantesselecionados usando diferentes antígenos ou epítopos alvo, estejam elescombinados ou não antes de administração.

Os antagonistas de TNFRl (e.g., ligantes, monômeros dAb)podem ser administrados e ou formulados junto com um ou mais agentesterapêuticos ou ativos adicionais. Quando um antagonista de TNFRl (e.g,,ligante, monômero dAb) é administrado com um agente terapêutico adicional,o antagonista de TNFRl pode ser administrado antes, simultaneamente comou subseqüente à administração do agente adicional. Geralmente, oantagonista de TNFRl (e.g., ligante, monômero dAb) e agente adicional são.administrados de uma maneira que fornece uma sobreposição de efeitoterapêutico.

As composições contendo os presentes antagonistas (e.g.,ligantes) ou um coquetel destes podem ser administradas para tratamentosprofiláticos e/ou terapêuticos. Em certas aplicações terapêuticas, umaquantidade adequada para realizar pelo menos inibição parcial, supressão,modulação, assassinato, ou alguns outros parâmetros mensuráveis, de umapopulação de células selecionadas é definida como uma "doseterapeuticamente efetiva". Por exemplo, para tratar inflamação pulmonar e/ouuma doença respiratória, uma quantidade inibindo saliva, uma quantidadeinibindo inflamação de biópsia brônquica, uma quantidade inibindo dispnéia,uma quantidade aumentando volume expiratório forçado em um segundo(FEV (1)), uma quantidade aumentando melhora em estado de saúde, sequantificado em um questionário adequado tal como o QuestionárioRespiratório de St. George (e.g., um escore de melhora de 4 pontos).

Quantidades necessárias para atingir estes efeitos irãodepender da severidade da doença e do estado geral do sistema imune dopróprio paciente, mas geralmente variam de 0,005 a 10,0 mg de agente,antagonista (e.g., ligante, monômero dAb) o.u proteína de ligação destes porquilograma de peso corporal, com doses de 0,05 a 2,0 mg/kg/dose sendo maiscomumente usadas. Em formas de realização particulares, a quantidadeadministrada será cerca de 5 μg/kg/dose a cerca de 3 mg/kg/dose oupreferivelmente, cerca de 50 μg/kg/dose a cerca de 500 p.g/kg/dose.

Para aplicações profiláticas, composições contendo ospresentes ligantes ou coquetéis destes também podem ser administradas emdosagens similares ou levemente inferiores, para prevenir, inibir ou atrasarinício de doença (e.g., para manter remissão ou quiescência, ou para prevenirfase aguda). O médico versado será capaz de determinar o intervalo dedosagem apropriado para tratar, suprimir ou prevenir doença. Quando umantagonista de TNFRl (e.g., ligante) é administrado para tratar, suprimir ouprevenir inflamação pulmonar ou uma doença respiratória, ele pode seradministrado até quatro vezes por dia, duas vezes por semana, uma vez porsemana, uma vez a cada duas semanas, uma vez ao mês, ou uma vez a cadadois meses, em uma dose de, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 80

mg/kg, cerca de 100 p.g/kg a cerca de 80 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de80 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 70 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de60 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de40 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de20 mg/kg , cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 10 μg/kg a cercade 10 mg/kg, cerca de 10 μg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 μg/kg a cercade 2,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8mg/kg, cerca de 9 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg. Em formas de realizaçãoparticulares, o antagonista de TNFRl (e.g., ligante) é administrado para tratar,suprimir ou prevenir inflamação pulmonar ou uma doença respiratória a cadadia, a cada dois dias, uma vez a semana, uma vez a cada duas semanas ouuma vez ao mês em uma dose de cerca de 10 μg/kg a cerca de 10 mg/kg (e.g.,cerca de. 10 μΒ/kg, cerca de 100 μg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg,cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg,cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg).Em formas de realização particulares, cerca de 5 μg/kg a cerca de 3 mg/kg oupreferivelmente, cerca de 50 μg/kg a cerca de 500 μg/kg são administrados.

O antagonista de TNFRl (e.g., ligante) também pode seradministrado para tratar, suprimir ou prevenir inflamação pulmonar ou umadoença respiratória em uma dose diária ou dose unitária de cerca de 10 mg,cerca de 9 mg, cerca de 8 mg, cerca de 7 mg, cerca de 6 mg, cerca de 5 mg,cerca de 4 mg, cerca de 3 mg, cerca de 2 mg ou cerca de 1 mg.

Tratamento ou terapia realizado usando as composiçõesdescritas neste lugar é considerado "efetivo" se um ou mais sintomas sãoreduzidos (e.g., em pelo menos 10% ou pelo menos um ponto em uma escalade verificação clínica), em relação a tais sintomas presentes antes detratamento, ou em relação a tais sintomas em um indivíduo (modelo humanoou animal) não tratado com tal composição ou outro controle adequado.Sintomas irão variar dependendo da doença ou distúrbio visada, mas podemser medidos por um médico ou técnico habitualmente versado. Tais sintomaspodem ser medidos, por exemplo, monitorando um ou mais indicadoresfísicos da doença ou distúrbio (e.g., infiltrado celular em tecido pulmonar,produção de saliva, infiltrado celular em saliva, dispnéia, tolerância aexercício, espirometria (e.g., capacidade vital forçada (FVC), volumeexpiratório forçado em um segundo (FEV (1), FEV (1)/FVC), taxa ouseveridade de exacerbação de doença, ou por uma escala de verificaçãoclínica aceita, por exemplo, o Questionário Respiratório de St. George.Escalas de verificação clínica adequadas incluem, por exemplo, a severidadede obstrução de fluxo de ar de acordo com FEV (1) (Clinicai Guideline 12,Chronic Obstructive Pulmonary Disease, Management of ChronieObstruetive Pulmonary Disease in Adults in Primary and Seeondary Care,National Institute for Clinicai Excellence, London (2004)), Pico de FluxoExpiratório (PEF) (British Guideline on the Management of Asthma, BritishThoracic Society, Scottish Intercollegiate Guidelines Network, RevisedEdition (2004)), estágio de COPD de acordo com o padrão de AmericanJO Thoracic Society (ATS) (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152:S77-S120(1995), classe de deficiência de asma de acordo com o padrão de ATS (Am.Rev. Respir. Dis., 147:1056-1061 (1993)), ou outra escala de verificaçãoclínica aceita como conhecido no campo. Uma redução sustentada (e.g., umdia ou mais, preferivelmente maior) em sintomas de doença ou distúrbio empelo menos 10% ou em um ou mais pontos em uma dada escala clínica éindicativa de tratamento "efetivo". Similarmente, profilaxia realizada usando,uma composição como descrito neste lugar é "efetiva" se o início ouseveridade de um ou mais sintomas é atrasada, reduzida ou abolida emrelação a tais sintomas em um indivíduo similar (modelo humano ou animal)não tratado com a composição.

Uma composição contendo um antagonista (e.g., ligante) oucoquetel destes de acordo com a presente invenção pode ser utilizada emconfigurações profiláticas e terapêuticas para auxiliar na alteração, inativação,assassinato ou remoção de uma população celular alvo selecionada em ummamífero. Por exemplo, tais composições podem ser usadas para reduzirníveis de células inflamatórias em pulmão e/ou inibir infiltração celular dopulmão.

Composição contendo um antagonista (e.g., ligante) de acordocom a presente invenção também pode ser usada para reduzir níveis demediadores inflamatórios tal como citocinas, quimiocinas, moléculas deadesão celular, que são induzidos por estímulos inflamatórios em pulmão. Porexemplo, antagonistas de monômero dAb de TNFRl podem inibir (i)aumentos induzidos por estímulo inflamatório (e.g., induzidos por TNFalfa)nos níveis dos mediadores de atuação precoce, tal como os quimioatratores deneutrófilo KC e MIP-1, e/ou (ii) inibir aumentos induzidos por estímuloinflamatório (e.g., induzidos por TNFalfa) nos níveis de mediadores deatuação tardia, tal como quimiocina MCP-I e molécula de adesão E-selectina.Outros mediadores tal como LTB4, GR.O-a, IP-10, GM-CSF, espécies deoxigênio reativo (ROS), NO e os semelhantes podem ser efetuados.

Os ligantes desta invenção podem ser Iiofilizados paraarmazenamento e reconstituídos em um carreador adequado antes de uso. Estatécnica mostrou ser efetiva com imunoglobulinas convencionais e técnicas deliofilização e reconstituição conhecidas na técnica podem ser empregadas.Será percebido por aqueles versados na técnica que liofilização ereconstituição podem levar a graus variados de perda de atividade de.anticorpo (e.g. com imunoglobulinas convencionais, anticorpos IgM tendem ater maior perda de atividade do que anticorpos IgG) e que níveis de usopodem ter que ser ajustados para cima para compensar. Os ligantes destainvenção podem ser liofilizados para formar um pó seco para inalação, eadministrados em tal forma.

A via de administração de composições farmacêuticas deacordo com a invenção pode ser qualquer daquelas comumente conhecidaspor aqueles de habitual verso na técnica. A administração pode ser porqualquer modo apropriado, incluindo parenteralmente, intravenosamente,intramuscularmente, intraperitonealmente, transdermicamente, através da viapulmonar, ou por infusão direta com um cateter. A dosagem e freqüência deadministração irão depender da idade, sexo e condição do paciente,administração concorrente de outras drogas, contra-indicações e outrosparâmetros a serem levados em conta pelo médico. Administração pode serlocal (e.g., liberação local para o pulmão por administração pulmonar, e.g.,administração intranasal) ou sistêmica como indicado.

Em formas de realização particulares, um antagonista deTNFRl é administrado via liberação pulmonar, tal como por inalação (e.g.,inalação intrabrônquica, intranasal ou oral, gotas intranasais) ou por liberaçãosistêmica (e.g., parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal,subcutânea). Em formas de realização preferidas, o antagonista de TNFRl(e.g., ligante, monômero dAb) é administrado a um indivíduo através deadministração pulmonar, tal como inalação ou administração intranasal (e.g.,inalação intrabrônquica, intranasal ou oral, gotas intranasais). Para inalação, oantagonista de TNFRl (e.g., ligante, monômero dAb) pode ser administradocom o uso de um nebulizador, inalador, atomizador, aerossolizador,vaporizador, inalador de pó seco, inalador dosimetrado, pulverizadordosimetrado, vaporizador dosimetrado, atomizador dosimetrado, ou outrodispositivo de liberação adequado.

A invenção se refere a um método para tratar, suprimir ouprevenir inflamação pulmonar ou uma doença respiratória, compreendendoadministrar a um indivíduo com necessidade desta uma quantidade efetiva deum antagonista de TNFRl, caracterizado pelo fato de que dita quantidadeefetiva não excede cerca de 10 mg/kg/dia, e caracterizado pelo fato de quepreferivelmente o nível de células inflamatórias no pulmão é reduzido emrelação a níveis de pré-tratamento com ρ <0,05, ou recrutamento de célulasinflamatórias no pulmão é inibido em relação a níveis de pré-tratamento comρ <0,05. O nível de células inflamatórias no pulmão ou recrutamento decélulas inflamatórias no pulmão pode ser reduzido ou inibido em relação aníveis de pré-tratamento em pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cercade 70%o, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menoscerca de 95%.

Preferivelmente, análise estatística é realizada usando osmétodos descritos nos Exemplos neste lugar. O nível de células inflamatóriasno pulmão ou recrutamento de células inflamatórias no pulmão pode serreduzido ou inibido em relação a níveis de pré-tratamento com ρ < 0,001 emalgumas formas realização.

Níveis de células (e.g., células inflamatórias) no pulmãopodem ser verificados usando qualquer método adequado, tal como contagenscelulares totais e diferenciais (e.g., contagem celular de macrófagos,contagem celular de neutrofilos, contagem celular de eosinófilos, contagemcelular de linfócitos, contagem de célula epitelial) em BAL, saliva ou biópsia(e.g., biópsia brônquica, biópsia de pulmão).

A invenção também se refere a um método para tratar a doençarespiratória compreendendo (1) selecionar um antagonista de Receptor deFator de Necrose Tumoral 1 (TNFRl) que tem eficácia em um modelo animaladequado de doença respiratória quando administrado em uma quantidade quenão excede cerca de 10 mg/kg uma vez por dia, caracterizado pelo fato de queeficácia em dito modelo animal existe quando infiltração celular dos pulmõesse verificado por contagem celular total em lavagem bronquioalveolar éinibido em relação a controle não tratado com ρ <0,05; e (2) administrar (e.g.,localmente a tecido pulmonar) uma quantidade efetiva de dito antagonista deTNFR1 a um indivíduo com necessidade desta.

Em algumas formas realização, os métodos descritos nestelugar são empregados para tratar, suprimir ou prevenir doença pulmonarobstrutiva crônica (e.g., bronquite crônica, bronquite obstrutiva crônica,enfisema), asma (e.g., asma resistente a esteróide), pneumonia (e.g.,pneumonia bacteriana, tal como pneumonia estafilocócica), ou inflamaçãopulmonar.

A invenção também se refere ao uso de um antagonista deTNFRl, como descrito neste lugar, para a fabricação de um medicamento ouformulação para tratar inflamação pulmonar ou a doença respiratória descritasneste lugar. O medicamento pode ser para administração sistêmica e/ouadministração local para tecido pulmonar.

Antagonistas de TNFRl

TNFRl è um receptor transmembrana contendo uma regiãoextracelular que se liga a ligante e um domínio intracelular que carece deatividade intrínseca de transdução de sinal mas pode se associar commoléculas de transdução de sinal. O complexo de TNFRl com TNF ligadocontém três cadeias de TNFRl e três cadeias de TNF. (Banner et al, Cell,73(3) 431-445 (1993)) O ligante de TNF está presente como um trímero, queé ligado por três cadeias de TNFRl. (Id.) As três cadeias de TNFRl sãoagrupadas proximamente juntas no complexo receptor-ligante, e esteagrupamento é um pré-requisito para transdução de sinal mediada porTNFRl. De fato, agentes multivalentes que se ligam a TNFRl, tal comoanticorpos anti-TNFRl, podem induzir agrupamento de TNFRl e transduçãode sinal na ausência de TNF e são comumente usados como agonistas deTNFRl. (Veja, e.g., Belka et al, EMBO, 14(6): 1156-1165 (1995); Mandik-Nayak et al, J Immunol, 167:1920-1928 (2001)). Por conseguinte, agentesmultivalentes que se ligam a TNFR1, geralmente não são antagonistasefetivos de TNFRl mesmo se eles bloqueiam a ligação de TNFa a TNFRl.

A região extracelular de TNFRl compreende um segmentoamino-terminal de treze aminoácidos (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO:213(humano); aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO:215 (camundongo)), Domínio 1(aminoácidos 14-53 de SEQ ID NO:213 (humano); aminoácidos 14-53 deSEQ ID NO:215 (camundongo)), Domínio 2 (aminoácidos'54- 97 de SEQ IDNO:213 (humano); aminoácidos 54-97 de SEQ ID NO:215 (camundongo)),Domínio 3 (aminoácidos 98-138 de SEQ ID NO:213 (humano); aminoácidos98-138 de SEQ ID NO:215 (camundongo)), e Domínio 4 (aminoácidos 139-167 de SEQ ID NO:213 (humano); aminoácidos 139-167 de SEQ ID NO:215(camundongo)) que é seguido por uma região próxima de membrana(aminoácidos 168-182 de SEQ ID NO:213 (humano); aminoácidos 168-183de SEQ ID NO:215 (camundongo)). (Veja, Banner et al., Cell 73(3) 431-445(1993) e Loetscher et at, Cell 61(2) 351-359 (1990).) Domínios 2 e 3 fazemcontato com ligante ligado (TNFf3, TNFa). (Banner et at, Celli 73(3) 431-445(1993).) A região extracelular de TNFRl também contém uma região referidacomo o domínio de organização de ligação de pré-ligante ou domínio PLAD(aminoácidos 1-53 de SEQ ID NO:213 (humano); aminoácidos 1-53 de SEQID NO:215 (camundongo)) (The Government of the USA, WO 01/58953;Deng et at, Nature Medicine, doi: 10.1038/nml304 (2005)).

TNFRl é desprendido da superfície de células in vivo atravésde um processo que inclui proteólise de TNFRl em Domínio 4 ou na regiãopróxima de membrana (aminoácidos 168-182 de SEQ ID NO:213;aminoácidos 168-183 de SEQ ID NO:215), para produzir uma forma solúvelde TNFRl. TNFRl solúvel retém a capacidade de se ligar a TNFa, e com issofunciona como um inibidor endógeno da atividade de TNFa.

Antagonistas de TNFRl adequados para uso na invenção (e.g.,Iigantes descritos neste lugar) que têm especificidade de ligação paraReceptor de Fator de Necrose Tumoral 1 (TNFR1; p55; CD120a).Preferivelmente os antagonistas de TNFRl não têm especificidade de ligaçãopara Fator de Necrose Tumoral 2 (TNFR2), ou não antagonizamsubstancialmente TNFR2. Um antagonista de TNFRl não antagonizasubstancialmente TNFR2 quando o antagonista (1 nM, 10 nM, 100 nM, 1iaM, 10 jAM ou 100 pM) resulta em não mais do que cerca de 5% de inibiçãode atividade mediada por TNFR2 induzido por TNFa (100 pg/ml) em umensaio celular padrão.

Antagonistas de TNFRl que são adequados para uso nainvenção são terapêuticos efetivos (são eficazes, têm eficácia terapêutica) paratratar doença respiratória (e.g., doença respiratória aguda, doença respiratóriacrônica, doença respiratória inflamatória aguda, doença respiratóriainflamatória crônica). Por exemplo, antagonistas de TNFRl que sãoadequados para uso na invenção são eficazes em modelos de doençasrespiratórias, quando uma quantidade efetiva é administrada. Geralmente umaquantidade efetiva é cerca de 1 pg/kg a cerca de 10 mg/kg ou cerca de 1mg/kg a cerca de 10 mg/kg (e.g., cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cercade 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, ou cerca de 10 mg/kg). Diversosmodelos animais adequados de doença respiratória são conhecidos na técnica,e são reconhecidos por aqueles versados na técnica como sendo preditivos deeficácia terapêutica em humanos. Por exemplo, modelos animais adequadosde doença respiratória incluem modelos de doença pulmonar obstrutivacrônica (veja, Groneberg, DA et al., Respiratory Research 5:18 (2004)),modelos de asma (veja, Coffman RL et al, J. Exp.Med. 201(12):1875-1879(2001); Van Scott, MR et al, App. Physiol 96:1433-1444 (2004)), e modelosde fibrose pulmonar (e.g., Venkatesan, N et al., Lung 287:13421347 (2004)).Preferivelmente, o antagonista de 'TNFRl (e.g., Iigante ou monômero dAb) éeficaz em um modelo de camundongo induzido por fumaça de tabaco dedoença pulmonar obstrutiva crônica (e.g., o modelo subcrônico descrito nestelugar) ou um modelo de primata adequado de asma ou doença pulmonarobstrutiva crônica (veja, e.g., Coffman RL et al, J. Exp. Med. 201(12):1875-1879 (2001); Van Scott, MR et al, J. App. Physiol. 96:1433-1444 (2004)).Mais preferivelmente, o antagonista de TNFRl (e.g., Iigante ou monômerodAb) é eficaz em um modelo de camundongo induzido por fumaça de tabacode doença pulmonar obstrutiva crônica (e.g., o modelo subcrônico descritoneste lugar) (Veja, também, Wright and Churg, Chest, 122:301-306 (2002)).Por exemplo, administrar uma quantidade efetiva do ligante pode reduzir,atrasar ou prevenir início dos sintomas de COPD no modelo, se comparadocom um controle adequado. A técnica anterior não sugere usar antagonistas deTNFRl (e.g., Iigantes ou monômeros dAb) nestes modelos, ou que elesseriam eficazes.

Antagonistas adequados de TNFRl podem ser monovalentesou multivalentes. Em algumas formas realização, o antagonista é monovalentee contém um sítio dé ligação que interage com TNFRl. Antagonistasmonovalentes se ligam a um TNFRl e não induzem reticulação ouagrupamento de TNFRl na superfície de células o que pode levar à ativaçãodo receptor e transdução de sinal. Em formas de realização particulares, oantagonista monovalente de TNFRl compete com TAR2m-21-23 para seligar a TNFRl de camundongo ou compete com TAR2h-205 para se ligar aTNFRl humano.

Antagonistas multivalentes de TNFRl podem conter duas oumais cópias de um sítio de ligação particular para TNFRl ou conter dois oumais diferentes sítios de ligação que se ligam a TNFRl. Por exemplo, comodescrito neste lugar o antagonista de TNFRl pode ser um dímero, trímero oumultímero compreendendo duas ou mais cópias de um dAb particular que seligam a TNFRl, ou dois ou mais diferentes dAbs que se ligam a TNFRl.Preferivelmente, um antagonista multivalente de TNFRl não agonizasubstancialmente TNFRl (atua como um agonista de TNFRl) em um ensaiocelular padrão (i.e., quando presente em uma concentração de 1 nM, 10 nM,100 nM, 1 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ, 1000 μΜ ou 5.000 μΜ, resulta em não maisdo que cerca de 5% da atividade mediada por TNFRl induzida por TNFa(100 pg/ml) no ensaio).

Antagonistas multivalentes adequados de TNFRl podemconter dois ou mais sítios de ligação para um epítopo ou domínio desejado deTNFRl. Por exemplo, um antagonista multivalente de TNFRl podecompreender dois ou mais sítios de ligação que se ligam ao mesmo epítopo deTNFRl, ou dois ou mais sítios de ligação que se ligam a diferentes epítoposou domínios de TNFRl. Em um exemplo, o antagonista multivalente deTNFRl compreende um primeiro sítio de ligação que se liga a um primeiroepítopo de TNFRl, e um segundo sítio de ligação que se liga a um segundoepítopo de TNFRl diferente. Preferivelmente, tais antagonistas multivalentesnão agonizam TNFRl quando presentes em uma concentração de cerca de 1nM, ou cerca de 10 nM, ou cerca de 100 nM, ou cerca de 1 μΜ, ou cerca de10 μΜ, em um ensaio padrão de citotoxicidade de L929 ou um ensaio padrãode IL-8 de HeLa como descrito neste lugar.

Alguns antagonistas de TNFRl adequados para uso nainvenção se ligam a TNFRl e inibem ligação de TNFa a TNFRl. Em formasde realização particulares, um tal antagonista de TNFRl compete comTAR2h-10-27, TAR2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7,TAR2h-154-10 ou TAR2h-185-25 para ligação a TNFRl.

Alguns antagonistas de TNFRl adequados para uso nainvenção não inibem ligação de TNFa a TNFRl, mas inibem transdução desinal mediada através de TNFRl. Por exemplo, um antagonista de TNFRlpode inibir agrupamento induzido por TNFa de TNFRl, o que precedetransdução de sinal através de TNFRl. Tais antagonistas fornecem diversasvantagens. Por exemplo, na presença de um tal antagonista, TNFa pode seligar a TNFRl expresso na superfície de células e pode ser removido doambiente celular, mas transdução de sinal mediada por TNFRl não seráativada. Assim, produção induzida por sinal de TNFRl de TNFa adicional eoutros mediadores de inflamação será inibida. Similarmente, antagonistas deTNFRl que se ligam a TNFRl e inibem transdução de sinal mediada atravésde TNFRl, mas não inibem ligação de TNFa a TNFRl, não irão inibir aligação de TNFa e atividade inibidora de TNFRl solúvel produzidoendogenamente. Por conseguinte, administrar um tal antagonista a ummamífero com necessidade disto pode complementar as vias reguladorasendógenas que inibem a atividade de TNFa e a atividade de TNFRl in vivo.Em uma forma de realização particular, o antagonista deTNFRl adequados para uso na invenção (e.g., um monômero dAb ou ligante)se liga a TNFRl e inibe transdução de sinal mediada através de TNFRl comligação de TNFa. Um tal antagonista pode inibir transdução de sinal atravésde TNFRl, mas não inibe ligação de TNFa a TNFRl e/ou decaimento deTNFRl para produzir TNFRl solúvel. Por conseguinte, administrar um talantagonista a um mamífero com necessidade disto pode complementar as viasreguladoras endógenas que inibem a atividade de TNFa. e a atividade deTNFRl in vivo.

Certos antagonistas de TNFRl adequados para uso nainvenção (e.g., composto químico, nova entidade química, monômero dAb,ligante) se ligam a TNFRl e competem com TAR2m-21-23 para se ligar aTNFRl de camundongo ou competem com TAR2h-205 para se ligar aTNFRl humano. Outros antagonistas de TNFRl adequados para uso nainvenção (e.g., composto químico, nova entidade química, monômero dAb,ligante) se ligam a TNFRl e competem com TAR2h-131-8, TAR2h-15-8,TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR21-154-10, TAR2h-185-25, ou TAR2h-27-10 para se ligar a TNFRl (e.g., TNFRl humano e/ou de camundongo).

Alguns antagonistas (e.g., ligantes, monômeros dAb) são dereatividade cruzada e se ligam a TNFRl humano e TNFRl de outra espécietal como um animal propício para uso em pesquisa médica. Por exemplo, ummonômero dAb que se liga a TNFRl humano e TNFRl de camundongo. Taisantagonistas (e.g., ligantes, monômeros dAb) fornecem a vantagem depermitir estudos pré-clínicos e clínicos usando o mesmo antagonista (e.g.,monômero dAb) e evitam a necessidade de conduzir estudos pré-clínicos comum antagonista substituto adequado. Exemplos preferidos de antagonistas dereatividade cruzada se ligam a TNFRl humano e TNFRl de um roedor, talcomo camundongo, rato ou porquinho-da-índia, coelho, cachorro, ovelha,porco, ou um primata não humano tal como, macaco-caranguejeiro oumacaco-rhesus.

Geralmente, um antagonista de reatividade cruzada dainvenção se liga a TNFRl humano e TNPRl de outra espécie com afinidadessimilares (IQ). Preferivelmente, os antagonistas de reatividade cruzada, talcomo um monômero dAb, se liga a TNFRl humano e TNFRl de outraespécie com afinidades que diferem por não mais do que cerca de um fator de100, um fator de 10 ou um fator de 5. Por exemplo, um monômero dAb dereatividade cruzada pode ser ligar a TNFRl humano com uma afinidade de 1nM e também se ligar a TNFRl de camundongo, macaco-caranguejeiro oumacaco-rhesus com uma afinidade de cerca de 10 pM a cerca de 100 nM,cerca de 100 pM a cerca de 10 nM, ou cerca de 200 pM a cerca de 5 nM.

Os antagonistas de reatividade cruzada, tal como ummonômero dAb, podem se ligar a TNPRl humano e TNPRl de outra espécie(e.g., uma das espécies não humanas mencionadas nos dois parágrafos precedentes) com taxas de associação (Kon) que diferem por não mais do quecerca de um fator de 100, um fator de 10, ou um fator de 5, e/ou com taxas dedissociação (Koff) que diferem por não mais do que cerca de um fator de 100,um fator de 10, ou um fator de 5. Por exemplo, os antagonistas podem ser ummonômero dAb que se liga tanto a TNFRl humano como TNFRl de outraespécie com uma Kon de cerca de 10 M/s a cerca de 10 M/s; e/ou uma Koffde cerca de IO"3 s"1 a cerca de 10.

Antagonistas de TNFRl adequados para uso na invençãotambém incluem, um anticorpo que tem especificidade de ligação paraTNFRl ou um fragmento de ligação de antígeno deste, tal como fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')2 ou fragmento Fv (e.g., scFV). Emalgumas formas realização, o antagonista é monovalente, tal como a dAb ouum fragmento de ligação de antígeno monovalente de um anticorpo, tal comoa fragmento Fab, fragmento Fab', ou fragmento Fv.

Preferivelmente, o antagonista de TNFRl é um ligante (e.g.,um monômero dAb) como descrito neste lugar. Como descrito neste lugarantagonistas de TNFR1 adequados preferidos para uso na invençãocompreendem um dAb que se liga a TNFR1 e inibe a função de TNFR1.Entretanto, ao invés de compreender um "dAb," um antagonista deTNFR1(e.g., ligante) adequado para uso na invenção pode compreender umdomínio que compreende as CDRs de um dAb que se liga a TNFR1 (e.g.,CDRs enxertadas em uma esqueleto ou armação protéica adequada, eg umaficorpo, uma armação SpA, um domínio classe A de receptor LDL ou umdomínio EGF) ou um domínio protéico compreendendo um sítio de ligaçãopara TNFR1, e.g., caracterizado pelo fato de que o domínio é selecionado apartir de um aficorpo, um domínio SpA, um domínio classe A de receptorLDL, um domínio EGF, um avímero. A descrição como um todo é para serconstruída por conseguinte para fornecer descrição de antagonistas, ligantes emétodos usando tais domínios no lugar de um dAb.

Antagonistas de TNFR1, incluindo ligantes de acordo comqualquer aspecto da presente invenção, assim como monômeros dAb úteispara construir tais ligantes, preferivelmente se associam a seu(s) alvo(s) comuma Kd de 300 nM a 5 pM (ie, 3 x 10-7 a x 1042M), preferivelmente 50 nM a20 pM, ou 5 nM a 200 pM ou 1 nM a 100 pM, 1 x 10-7 M ou menos, 1 x 10-8M ou menos, 1 x 10-9M ou menos, 1 x 10-10 M ou menos, 1 x 1041 M oumenos; e/ou uma constante de dissociação Koff de 5 x 10 s-1 a 1 x 1041 s-1 ,preferivelmente 1 x 10-2 s-1 a 1 x 10-6 s-1, ou 5 x 10-3 s4 a 1 x 10-5 s-1, ou 5 x 10-1s4 ou menos, ou 1 x 10-2S-1 ou menos, ou 1 x 10-3 s-1 ou menos, ou 1 x 10-4S-1ou menos, ou 1 x 10S-1 ou menos, ou 1 x 10-6S-1 ou menos se determinada porressonância de plasmônio de superfície. A constante de associação Kd édefinida como K0ff/K. Adicionalmente ou alternativamente, o ligante (e.g,monômero dAb) se liga a TNFR1 com uma Kon moderada ou rápida, e umalenta Koff. Preferivelmente, uma Kon de cerca de 104 M/s a cerca de 1O5 M/se/ou uma Koff de cerca de 10-3 s-1 a cerca de 10-5 s-1.Ligantes e monômeros dAb que se Ligam TNFRl

Antagonistas preferidos de TNFRl que são adequados parauso na invenção são ligantes ou monômeros dAb que são eficazes emmodelos de doenças respiratórias quando uma quantidade efetiva éadministrada. Geralmente uma quantidade efetiva é cerca de 1 mg/kg a cercade 10 mg/kg (e.g., cerca de 1 mg/kg, cerca.de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg,cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg,cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, ou cerca de 10 mg/kg). Em formas derealização particulares, cerca de 5 p.g/kg a cerca de 3 mg/kg oupreferivelmente, cerca de 50 μg/kg a cerca de 500 μg/kg são administrados.

Diversos modelos animais adequados de doença respiratóriasão conhecidos na técnica, e são reconhecidos por aqueles versados na técnicacomo sendo preditivos de eficácia terapêutica em humanos. Por exemplo,modelos animais adequados de doença respiratória incluem modelos dedoença pulmonar obstrutiva crônica (veja, Groneberg, DA et al., RespiratoryResearch 5:1 S (2004)), e modelos de asma (veja, Coffiiman et al., J. Exp.Med. 201(12): 1875-1879 (2001)). Preferivelmente, o ligante ou monômerodAb é eficaz no modelo subcrônico de camundongo de doença pulmonarobstrutiva crônica induzida por fumaça de tabaco descritas neste lugar. (Veja,também, Wright and Churg, Chest, 122:301-306 (2002).) Por exemplo,administrar uma quantidade efetiva do ligante pode reduzir, atrasar ouprevenir início dos sintomas de COPD no modelo, se comparado com umcontrole adequado. A técnica anterior não sugere usar antagonistas de TNFRl(e.g., ligantes ou monômeros dAb) nestes modelos, ou que eles seriam eficazes.

Geralmente, ligantes adequados (e.g., monômero dAb)compreendem um monômero dAb anti-TNFRl (e.g., ligante de duplaespecificidade compreendendo um tal dAb) que se liga a TNFRl com um Kdde 300 nM a 5 pM (ie, 3 χ IO"7 a 5 χ IO"12M), preferivelmente 50 nM a 20 pM,mais preferivelmente 5 nM a 200 pM e mais preferivelmente 1 nM a 100 pM,por exemplo 1 χ 10"7 M ou menos, preferivelmente 1 χ M ou menos, maispreferivelmente 1 χ I0*9 M ou menos, vantajosamente 1 χ 10"1° M ou menos emais preferivelmente 1 χ 1O"11M ou menos; e/ou uma constante de dissociaçãoKoff de 5 x 1O"1 s"1 a 1 χ 1O"7s1,Preferivelmente 1 χ 10"2 S1 a 1 χ 106 s, maispreferivelmente 5 χ 10"3S1 a 1 χ 10s-1, por exemplo 5 χ 10"1 S"1 ou menos,preferivelmente 1x10"2 S"1 ou menos, vantajosamente 1 χ 10"3 s"1 ou menos,mais preferivelmente 1xl0"4 s"1 ou menos, ainda mais preferivelmente 1 x s-1ou menos, e mais preferivelmente 1 χ 1O"6 s"1 ou menos se determinado porressonância de plasmônio de superfície. (The Kl = K„ff/Kon). Certos ligantesou monômeros dAb adequados para uso na invenção se ligam especificamentea TNFRl humano com um Kd de 50 nM a 20 pM, e uma constante dedissociação Koff de 5x10"1 s"1 a 1x10"1 se determinado por ressonância deplasmônio de superfície.

Alguns ligantes ou monômeros dAb inibem ligação de TNFa aTNl-a1 . Por exemplo, alguns ligantes ou monômeros dAb inibem ligação deTNFα a TNFRl com uma concentração inibidora 50 (IC50) de 500 nM a 50pM, preferivelmente 100 nM a 50 pM, mais preferivelmente 10 nM to 100pM, vantajosamente 1 nM a 100 pM; por exemplo 50 nM ou menos,preferivelmente 5 nM ou menos, mais preferivelmente 500 pM ou menos,vantajosamente 200 pM ou menos, e mais preferivelmente 100 pM ou menos.Preferivelmente, o TNFRl é TNFRl humano.

Outros ligantes e monômeros dAb não inibem ligação deTNFa a TNFRl, mas são antagonistas porque eles inibem transdução de sinalmediada através de TNFRl. Por exemplo, um ligante ou monômero dAb podeinibir agrupamento induzido por TNFa de TNFRl, o que precede transduçãode sinal através de TNFRl. Por exemplo, em certas formas de realização, umligante ou monômero dAb pode se ligar a TNFRl e inibir sinalização mediadapor TNFRl, mas não inibe substancialmente ligação de TNFa a TNFRl. Emalgumas formas realização, o ligante ou monômero dAb inibe reticulação ouagrupamento induzido por TNFa de TNPRl na superfície de uma célula. Taisligantes ou dAbs (e.g., TAR2m-21-23 descritos neste lugar) são vantajososporque eles podem antagonizar TNTRl de superfície celular mas não reduzemsubstancialmente a atividade inibidora de TNTRl solúvel endógeno. Porexemplo, o ligante ou dÀb pode se ligar a TNPFRl, mas inibe ligação de TNFaa TNFRl em um ensaio de ligação de receptor em não mais do que cerca de10%, não mais do que cerca de 5%, não mais do que cerca de 4%, não maisdo que cerca de 3%, não mais do que cerca de 2%, ou não mais do que cercade 1%. Também, nestas formas de realização, o ligante ou dAb inibereticulação induzida por TNFa de TNFRl e/ou sinalização mediada porTNFRl em um ensaio celular padrão em pelo menos cerca de 10%, pelomenos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%,pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cercade 95%, ou pelo menos cerca de 99%. Tais ligantes ou monômeros dAbfornecem diversas vantagens, como discutido neste lugar com respeito aantagonistas que têm estas propriedades. Por conseguinte, administrar talligante ou monômero dAb a um mamífero com necessidade disto podecomplementar as vias reguladoras endógenas que inibem a atividade de TNFae a atividade de TNFRl in vivo.

O ligante pode ser monovalente (e.g., um monômero dAb) oumultivalente (e.g., de dupla especificidade, multiespecífico) como descritoneste lugar. Em formas de realização particulares, o ligante é um monômerodAb que se liga a TNFRl. Monômeros de anticorpo de domínio que se ligama TNFRl têm uma pequena área de cobertura, em relação a outros formatosde ligação, tal como um anticorpo monoclonal, por exemplo. Assim, um talmonômero dAb pode bloquear seletivamente a função de TNFRl, mas nãointerfere em outras funções de TNFRl. Por exemplo, um monômero dAb quese liga a TNFRl pode antagonizar TNFRl (e.g., inibir transdução de sinalmediada por TNFR1) mas não inibir ligação de TNTa a TNFRl oudecaimento de TNFRl.

Em formas de realização mais particulares, o ligante é ummonômero dAb que se liga a TNFRl e compete com TAR2m-21-23 para seligar a TNFRl de camiindongo ou compete com TAR2h-205 para se ligar aTNFRl humano.

Em outras formas de realização, o ligante é multivalente ecompreende dois ou mais monômeros dAb que se ligam a TNFRl. Ligantesmultivalentes podem conter duas ou mais cópias de um dAb particular que seliga a TNFRl ou conter dois ou mais dAbs que se ligam a TNFRl. Porexemplo, o ligante pode ser um dímero, trímero ou multímero compreendendoduas ou mais cópias de um dAb particular que se liga a TNFRl, ou dois oumais dAbs diferentes que se ligam a TNFRl. Em alguns exemplos, o ligante éum homo dímero ou homo trímero que compreende duas ou três cópias de umdAb particular que se liga a TNFRl, respectivamente. Preferivelmente, umligante multivalente não agoniza substancialmente TNFRl (atua como umagonista de TNFRl) em um ensaio celular padrão (i.e., quando presente emuma concentração de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μ.Μ, 10 μΜ, 100 μΜ, 1000μΜ ou 5.000 μΜ, resulta em não mais do que cerca de 5% da atividademediada por TNFRlinduzida por TNFa (100 pg/ml) no ensaio).

Em certas formas de realização, o ligante multivalente contémdois ou mais dAbs que se ligam a epítopos ou domínios desejados de TNFRl,ou duas ou mais cópias de um dAb que se liga a um epítopo desejado deTNFRl. Ligantes deste tipo podem se ligar a TNFRl com alta avidez, e seremmais seletivos para se ligar a células que superexpressam TNFRl ouexpressam TNFRl na sua superfície em alta densidade do que outrosformatos de ligantes, tal como monômeros dAb.

Em outras formas de realização particulares, o ligantemultivalente compreende dois ou mais dAbs, ou duas ou mais cópias de umdAb particular, que se liga a TNPRl. Ligantes multivalentes deste tipo podemse ligar a monômeros TNFRl com baixa afinidade, mas se ligam amultímeros de receptor (e.g., trímeros veja no complexo de ligante dereceptor) com alta avidez. Assim, ligantes deste formato podem seradministrados para visàr efetivamente receptores que se agruparam ou seassociaram um com outro e/ou ligante (e.g., TNFa) que é requerido paratransdução de sinal mediada por TNPRl.

Preferivelmente, o ligante ou monômero dAb neutraliza (inibea atividade de) TNFRl em um ensaio padrão (e.g., os ensaios L929 padrão ouHeLa IL-8 padrão descritos neste lugar) com uma dose neutralizante 50(ND50) de 500 nM a 50 pM, preferivelmente 100 nM a 50 pM, maispreferivelmente 10 nM a 100 pM, vantajosamente 1 nM a 100 pM; porexemplo 50 nM ou menos, preferivelmente 5 nM ou menos, maispreferivelmente 500 pM ou menos, vantajosamente 200 pM ou menos, e maispreferivelmente 100 pM ou menos. Em outras formas de realização, o liganteou monômero dAb se liga a TNFRl e antagoniza a atividade do TNPRl emum ensaio celular padrão (e.g., os ensaios L929 padrão ou HeLa IL-8 padrãodescritos neste lugar) com um ND50 de ..100 nM, e em uma concentração delOp.M do dAb agoniza a atividade do TNFRl em _.5% no ensaio.

Em outras formas de realização, o ligante ou monômero dAbse liga especificamente a TNFRl com um Id descrito neste lugar e inibeletalidade em um modelo de choque séptico induzido porLPS/Dgalactosamina de camundongo padrão (i.e., previne letalidade ou reduzletalidade em pelo menos cerca de 10%, se comparado com um controleadequado). Preferivelmente, o monômero dAb inibe letalidade em pelo menoscerca de 25%, ou em pelo menos cerca de 50%, as comparado com umcontrole adequado em um modelo de choque séptico induzido porLPS/Dgalactosamina de camundongo padrão quando administrado em cercade 5 mg/kg ou mais preferivelmente cerca de 1 mg/kg.

Em formas de realização particulares, ligante ou monômerodAb não agoniza substancialmente TNFRl (atua como um agonista deTNFRl) em um ensaio celular padrão, tal como os ensaios L929 padrão ouHeLa IL-8 padrão descritos neste lugar (i.e., quando presente em umaconcentração de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ, 1000 μΜ ou5.000 μΜ, resulta em não mais do que cerca de 5% da atividade mediada porTNFRl induzida por TNFa (100 pg/ml) no ensaio).

Em outras formas de realização, o ligante compreende ummonômero de anticorpo de domínio (dAb) que se liga especificamente aReceptor de Fator de Necrose Tumoral 1 (TNFR1, p55, CD120a) com um Indde 300 nM a 5 pM, e compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelomenos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%,pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cercade 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menoscerca de 99% homóloga à seqüência de aminoácidos ou um dAb selecionadoa partir do grupo consistindo de TAR2h-12 (SEQ ID NO:l), TAR2h-13 (SEQID NO:2), TAR2h-14 (SEQ ID NO:3), TAR2h-16 (SEQ ID NO:4), TAR2h-17 (SEQ ID NO:5), TAR2h-18 (SEQ ID NO:6), TAR2h-19 (SEQ ID NO:7),TAR2h-20 (SEQ ID NO:8), TAR2h-21 (SEQ ID NO:9), TAR2h-22 (SEQ IDNO: 10), TAR2h-23 (SEQ ID NO:ll), TAR2h-24 (SEQ ID NO:12), TAR2h-25 (SEQ ID NO: 13), TAR2h-26 (SEQ ID NO: 14), TAR2h-27 (SEQ IDNO: 15), TAR2h.- 29 (SEQ ID NO: 16), TAR2h-30 (SEQ ID NO: 17),TAR211-32 (SEQ ID NO:18), TAR2h-33 (SEQ ID NO:19), TAR2h-10-l(SEQ ID N0:20), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:21), TAR2h-10-3 (SEQ IDNO:22), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:23), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:24),TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:25), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:26), TAR2h-10-8(SEQ ID NO:27), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:28), TAR2h-10-10 (SEQ IDNO:29), TAR2h-10-ll (SEQ ID NO:30), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:31),TAR2h-10-13 (SEQ ID NO:32), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:33), TAR2h-10-15 (SEQ ID NO:34), TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:35), TAR2h-10-17 (SEQ IDNO:36), TAR2h-10-18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-10-19 (SEQ ID NO:38),5 TAR2h-10-20 (SEQ ID NO:39), TAR2h-10-21 (SEQ ID NO:40), TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:41), TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:42), TAR2h-10-29 (SEQ IDNO:43), TAR2h-10-31 (SEQ ID NO:44), TAR2h-10-35 (SEQ ID NO:45),TAR2h-10-36 (SEQ ID NO:46), TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:47), TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:48), TAR2h-10-45 (SEQ ID NO:49), TAR2h-10-47 (SEQ ID10 NO:50), TAR2b-10-48 (SEQ ID NO:51), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:52),TAR2h-10-56 (SEQ ID NO:53), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:55), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-65 (SEQID NO:57), TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:59),TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:60), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-15 62 (SEQ ID NO:62), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-60 (SEQ IDNO:64), TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:65), TAR211-10-59 (SEQ ID NO:66),TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:67), TAR211-34 (SEQ ID NO:68), TAR2h-35(SEQ ID NO:69), TAR2h-36 (SEQ ID NO:70), TAR2h-37 (SEQ ID NO:71),TAR2h-38 (SEQ ID NO:72), TAR211-39 (SEQ ID NO:73), TAR2h-40 (SEQ20 ID NO:74), TAR2h-41 (SEQ ID NO:75), TAR2h-42 (SEQ ID NO:76),TAR2h-43 (SEQ ID NO:77), TAR2h44 (SEQ ID NO:78), TAR2h-45 (SEQID NO:79), TAR2h-47 (SEQ ID NO:80), TAR2h-48 (SEQ ID NO:81),TAR2h-50 (SEQ ID NO:82), TAR2h-51 (SEQ ID NO:83), TAR2h-66 (SEQID NO:84), TAR2h-67 (SEQ ID NO:85), TAR2h-68 (SEQ ID NO:86),25 TAR2h-70 (SEQ ID NO:87), TAR2h-71 (SEQ ID NO:88), TAR2h-72 (SEQID NO:89), TAR2h-73 (SEQ ID NO:90), TAR2h-74 (SEQ ID NO:91),TAR2h75 (SEQ ID NO:92), TAR2h-76 (SEQ ID NO:93), TAR2h-77 (SEQID NO:94), TAR2h-78 (SEQ ID NO:95), TAR2h-79 (SEQ ID NO:96),TAR2h-15 (SEQ ID NO:97), TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:98), TAR2h-131-24(SEQ ID NO:99), TAR2hl5-8 (SEQ ID NO: 100), TAR2h-15-8-1 SEQ IDN0:101), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO: 102), TAR2h-185-23 (SEQ IDNO: 103), TAR2h-154-10-5 (SEQ ID NO: 104), TAR2h-14-2 (SEQ IDNO: 105), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO: 106), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO: 107),TAR2h-35-4 (SEQ ID NO: 108), TAR2h-154-7 (SEQ ID N0:109), TAR2h-80(SEQ ID NO:l 10), TÀR2h-81 (SEQ ID NO:lll), TAR2h-82 (SEQ IDNO:l 12), TAR2h-83 (SEQ ID NO:113), TAR2h-84 (SEQ ID NO:114),TAR2h-85 (SEQ ID NO: 115), TAR2h-86 (SEQ ID NO: 116), TAR2h-87(SEQ ID NO:l 17), TAR2h-88 (SEQ ID NO:118), TAR2h-89 (SEQ IDNO: 119), TAR2h-90 (SEQ ID NO: 120), TAR2h-91 (SEQ ID NO:121),TAR2h-92 (SEQ ID NO: 122), TAR2h-93 (SEQ ID NO: 123), TAR2h-94(SEQ ID NO: 124), TAR2h-95 (SEQ ID NO: 125), TAR2h-96 (SEQ IDNO: 126), TAR2h-97 (SEQ ID NO:127), TAR2h-99 (SEQ ID NO:128),TAR2h-100 (SEQ ID NO: 129), TAR2h-101 (SEQ ID N0:130), TAR2h-102(SEQ ID NO: 131), TAR2h-103 (SEQ ID NO: 132), TAR2h-104 (SEQ IDNO:133), TAR2h-105 (SEQ ID NO:134), TAR2h-106 (SEQ ID NO:135),TAR2h-107 (SEQ ID NO:136), TAR2h-108 (SEQ ID NO:137), TAR2hl09(SEQ ID NO:138), TAR2h-110 (SEQ ID NO:139), TAR2h-lll (SEQ IDNO: 140), TAR2h-l 12 (SEQ ID NO:141), TAR2h-113 (SEQ ID NO: 142),TAR2hl 14 (SEQ ID NO: 143), TAR2h-115 (SEQ ID NO: 144), TAR2h-116(SEQ ID NO:145), TAR2h-117 (SEQ ID NO: 146), TAR2h-118 (SEQ IDNO: 147), TAR2bll9 (SEQ ID NO:148), TAR2h-120 (SEQ ID NO: 149),TAR2h-121 (SEQ ID N0:150), TAR2h-122 (SEQ ID NO:151), TAR2h-123(SEQ ID NO: 152), TAR2hl24 (SEQ ID NO: 153), TAR2h-125 (SEQ IDNO: 154), TAR2h-126 (SEQ ID NO:155), TAR2h-127 (SEQ ID NO:156),TAR2h-128 (SEQ ID NO:157), TAR2h-129 (SEQ ID NO:158), TAR2h-130(SEQ ID NO: 159), TAR2h-131 (SEQ ID NO: 160), TAR2h-132 (SEQ IDNO:161), TAR2h-133 (SEQ ID NO:162), TAR213- 151 (SEQ ID NO:163),TAR2h-152 (SEQ ID NO: 164), TAR2h-153 (SEQ ID NO:165), TAR2h-154(SEQ ID NO: 166), TAR2h-159 (SEQ ID NO: 167), TAR2hl65 (SEQ IDNO: 168), TAR2h-166 (SEQ ID NO: 169), TAR2h-168 (SEQ ID NO: 170),TAR2h-171 (SEQ ID NO:171), TAR2h-172 (SEQ ID NO: 172), TAR2hl73(SEQ ID NO: 173), TA.Uh-174 (SEQ ID NO: 174), TAR2h-176 (SEQ IDNO: 175), TAR2h-178 (SEQ ID NO: 176), TAR2h-201 (SEQ ID NO: 177),TAR2h202 (SEQ ID NO: 178), TAR2h-203 .(SEQ ID NO: 179), TAR2h-204(SEQ ID NO: 180), TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:181), TAR2h-154-10 (SEQID NO: 182), TAR2h-205 (SEQ ID NO: 183), TAR2h-10 (SEQ ID NO: 184),TAR2h-5 (SEQ ID NO: 185), TAR2h-5dl (SEQ ID NO: 186), TAR2h-5d2(SEQ ID NO: 187), TAR2h-5d3 (SEQ ID NO: 188), TAR2h-5d4 (SEQ IDNO: 189), TAR2h-5d5 (SEQ ID NO: 190), TAR2h-5d5 (SEQ ID NO: 191),TAR2h-5d7 (SEQ ID NO: 192), TAR2h-5d8 (SEQ ID NO: 193), TAR2h-5d9(SEQ ID NO: 194), TAR2h-5dlO (SEQ ID NO: 195), TAR2h-5dll (SEQ IDNO: 196), TAR2h-5dl2 (SEQ ID NO: 197), e TAR2h-5dl3 (SEQ ID NO:198).

Em outras formas de realização, o ligante compreende ummonômero de anticorpo de domínio (dAb) que se liga especificamente aReceptor de Fator de Necrose Tumoral 1 (TNFR1, p55, CD 120a) com um Kdde 300 nM a 5 pM, e compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelomenos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%,pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cercade 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menoscerca de 99% homóloga à seqüência de aminoácidos de um dAb que tem aseqüência de aminoácidos de qualquer de SEQ ID NO:216 até SEQ IDNO:433.

Em outras formas de realização, o ligante compreende ummonômero de anticorpo de domínio (dAb) que se liga especificamente aReceptor de Fator de Necrose Tumoral 1 (TNFR1, p55, CD 120a) com um Kade 300 nM a 5 pM, e compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelomenos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%,pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cercade 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menoscerca de 99% homólogà à seqüência de aminoácidos ou um dAb selecionadoa partir do grupo consistindo de TAR2m-14 (SEQ ID NO: 199), TAR2m-15(SEQ ID N0:200), TAR2m-19 (SEQ ID N0:201), TAR2m-20 (SEQ IDN0:202), TAR2m-21 (SEQ ID N0:203), TAR2m-24 (SEQ ID N0:204),TAR2m-21-23 (SEQ ID N0:205), TAR2m-21-07 (SEQ ID N0:206),TAR2m-21-43 (SEQ ID N0:207), TAR2m-21-48 (SEQ ID N0:208),TAR2m-21-10 (SEQ ID N0:209), TAR2m-21-06 (SEQ ID N0:210), eTAR2m-21-17 (SEQ ID NO:211).

Em algumas formas realização, o ligante compreende ummonômero dAb que se liga a TNFR1 e compete com quaisquer dos dAbsdescritos neste lugar para se ligar a TNFR1 (e.g., TNFR1 de camundongoe/ou humano).

O ligante da invenção pode compreender uma unidade deligação não de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para TNFRle preferivelmente inibe a função de TNFR1 (e.g., ligação de TNFa,sinalização mediante ligação de TNFa), caracterizado pelo fato de que aunidade de ligação não de imunoglobulina compreende uma, duas ou três dasCDRs de um VH, VL ou VHH que se liga a TNFRl e uma armaçãoadequada. Em certas formas de realização, a unidade de ligação não deimunoglobulina compreende CDR3 mas não CDR1 ou CDR2 de um VH, VLou VL que se liga a TNFR1 e uma armação adequada. Em outras formas derealização, a unidade de ligação não de imunoglobulina compreende CDR1 eCDR2, mas não CDR3 de um VH, VL ou Vbh que se liga a TNFR1 e umaarmação adequada. Em outras formas de realização, a unidade de ligação nãode imunoglobulina compreende CDRl, CDR2 e CDR3 de um Vu5 Y. ou VHHque se liga a TNFR1 e uma armação adequada. Preferivelmente, a CDR ouCDRs do ligante, destas formas de realização é uma CDR ou CDRs de umdAb anti-TNFR1 descrito neste lugar. Preferivelmente, a unidade de ligaçãonão de imunoglobulina compreende uma, duas, ou três das CDRs de um dosdAbs anti-TNFR1 descritos neste lugar. Eni outras formas de realização, oligante compreende apenas CDR3 de um Vi-m, VL ou vHFI que se liga aTNFR1. O domínio não imunoglobulina pode compreender uma seqüência deaminoácidos que uma ou mais regiões que têm identidade de seqüência comuma, duas ou três das CDRs de um dAb antiTNFR1 descrito neste lugar. Porexemplo, o domínio não imunoglobulina pode ter uma seqüência deaminoácidos que contém pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%,pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de90% de identidade de seqüência com CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de um dAbanti-TNFR1 descrito neste lugar. Mesmo mais preferivelmente, a unidade deligação não de imunoglobulina compreende uma, duas, ou três das CDRs deTAR2h-131-511, TAR2h-131 -193 e TAR2h-131 -194.

A invenção também se refere a um ligante compreendendouma unidade protéica que tem um sítio de ligação com especificidade deligação para TNFR1, caracterizado pelo fato de que dita unidade protéicacompreende uma seqüência de aminoácidos que é a mesma que a seqüênciade aminoácidos de CDR3 de um dAb anti-TNFR1 descrito neste lugar, talcomo TAR2h-131-511, TAR2h 131 -193 e TAR2h-131 -194.

Em algumas formas realização, o ligante compreendendo umaunidade protéica que tem um sítio de ligação com especificidade de ligaçãopara TNFR1, caracterizado pelo fato de que a unidade protéica tem umaseqüência de aminoácidos que é a mesma que a seqüência de aminoácidos deCDR3 de um dAb antiTNFR1 descrito neste lugar, e também compreendeuma seqüência de aminoácidos que é a mesma que a seqüência deaminoácidos de CDRl e/ou CDR2 de um dAb anti-TNFRl descrito nestelugar, tal como TAR2h-131-511, TAR2h-131 -193 e TAR2h-131 -194.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que o domínio variável único de imunoglobulinaque se liga a IL-4 difere da seqüência de aminoácidos de um dAb anti-TNFRldescrito neste lugar em não mais do que 25 posições de aminoácidos e temuma seqüência de CDRl que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência de CDRl dos dAbs anti-TNFRl descritos neste lugar, tal comoTAR2h-131-511, TAR2h-131-193 e TAR2h-131-194.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domíniovariável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl difere da seqüência deaminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do que25 posições de aminoácidos e tem uma seqüência de CDR2 que tem pelomenos 50% de identidade com a seqüência de CDR2 dos dAbs anti-TNFRldescritos neste lugar, tal como TAR2h-131-511, TAR2h-131-193 e TAR2h-131-194.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domíniovariável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl difere da seqüência deaminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do que25 posições de aminoácidos e tem uma seqüência de CDR3 que tem pelomenos 50% de identidade com a seqüência de CDR3 dos dAbs anti-TNFRldescritos neste lugar, tal como TAR2h-131-511, TAR2hl31-193 e TAR2h-131-194.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domíniovariável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl difere da seqüência deaminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do que25 posições de aminoácidos e tem uma seqüência de CDRl e uma seqüênciade CDR2 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDRlou CDR2, respectivamente, dos dAbs anti-TNFRl descritos neste lugar, talcomo TAR2h-131-511, TAR2h-131-193 e TAR2h-131-194.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domíniovariável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl difere da seqüência deaminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do que25 posições de aminoácidos e tem uma seqüência de CDR2 e uma seqüênciade CDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDR2ou CDR3, respectivamente, dos dAbs anti-TNFRl descrito neste lugar, talcomo TAR2h-I31-511, TAR2h-131-193 e TAR2h-131-194.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl.,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domíniovariável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl difere da seqüência deaminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do que25 posições de aminoácidos e tem uma seqüência de CDRl e uma seqüênciade CDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDRlou CDR3, respectivamente, dos dAbs anti-TNFRl descrito neste lugar, talcomo TAR2h-131-511, TAR2h-131 -193 e TAR2h-131 -194.

Em outras formas de realização, o ligante compreende umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do domíniovariável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl difere da seqüência deaminoácidos de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar em não mais do que25 posições de aminoácidos e tem uma seqüência de CDRl, uma seqüênciade CDR2 e uma seqüência de CDR3 que tem pelo menos 50% de identidadecom as seqüências de CDRl, CDR2 ou CDR3, respectivamente, dos dAbsanti-TNFRl descrito neste lugar; tal como TAR2h-131-511, TAR2h-131-193e TAR2h-131-194.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de que o domínio variável único deimunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDR2 que tempelo menos 50% de identidade com a seqüência de CDR2s de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar, tal como TAR2h-131-511, TAR2h-131-193 eTAR2h-131-194.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de que o domínio variável único deimunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDR3 que tempelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDR3 de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar, tal como TAR2h-131-511, TAR2h-131-193 eTAR2h-131-194.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de que o domínio variável único deimunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDRl e umaCDR2 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDRl eCDR2, respectivamente, de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar, talcomo TAR2h-131-511, TAR2h-131 -193 e TAR2h-131 -194.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de que o domínio variável único deimunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDR2 e uma deCDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDR2 eCDR3, respectivamente, de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar, talcomo TAR2h-131-511, TAR2h-131-193 e TAR2h-131-194.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de que o domínio variável único deimunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDRl e uma deCDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências de CDRl eCDR3, respectivamente, de um dAb anti-TNFRl descrito neste lugar, talcomo TAR2h-131-511, TAR2h-131-193 e TAR2h-131-194.

Em outra forma de realização, a invenção é um ligantecompreendendo um domínio variável único de imunoglobulina que se liga aTNFRl, caracterizado pelo fato de que o domínio variável único deimunoglobulina que se liga a TNFRl tem uma seqüência de CDRl, de CDR2,e uma de CDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com as seqüências deCDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, de um dAb anti-TNFRl descritoneste lugar, tal como TAR2h-131-511, TAR2h-131 -193 e TAR2h-131 -194.

Em algumas formas realização, o ligante compreendendo umdAb que se liga um TNFRl humano e é um antagonista de TNFRl humano,caracterizado pelo fato de que dito ligante inibe inflamação induzida porTNFa ou mediador inflamatório induzido por TNFa em uma dose [mg/kg]que não é maior do que ]/2, 1/3, ]/4, 1/5, 1/10, 1/15, 1/20, 1/25, ou 1/30 a dosede etanercept (ENBREL, Immunex Corporation) que é requerida para inibirdita inflamação induzida por TNFa ou mediador inflamatório induzido porTNFa para substancialmente o mesmo de para o mesmo grau. Por exemplo, oligante pode inibir influxo de células induzido por TNFa de tecido (e.g.,pulmão), aumento induzido por TNFa na produção, concentração ou nível demediadores inflamatórios, tal como os quimioatratores de neutrófilo deatuação precoce KC e MIP-1, e a quimiocina de atuação tardia MCP-I emolécula de adesão E-selectina, em uma dose [mg/kg] que não é maior do queV2, 1/3, V4, 1/5, 1/10, 1/15, 1/20, 1/25, ou 1/30 da dose de etanercept(ENBREL, Immunex Corporation) que é requerida para atingirsubstancialmente o mesmo ou o mesmo nível de inibição. Preferivelmente, onível de inibição é pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelomenos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, oupelo menos cerca de 95%.

O monômero dAb pode compreender qualquer domíniovariável de imunoglobulina adequado, r preferivelmente compreende umdomínio variável humano ou um domínio variável que compreende regiões dearmação humano. Em certas formas de realização, o monômero dAbcompreende uma armação universal, como descrito neste lugar.

A armação universal pode ser uma armação Vl (Υλ ou Vk) ,tal como uma armação que compreende as seqüências de aminoácidos dearmação codificadas pelo segmento de gene de imunoglobulina DPKl, DPK2,DPK3, DPK4, DPK5, DPK6, DPK7, DPK8, DPK9, DPK10, DPKl2, DPK13,DPKl5, DPKl6, DPKl 8, DPKl9, DPK20, DPK21, DPK22, DPK23, DPK24,DPK25, DPK26 ou DPK 28 de linhagem germinativa humana. Se desejado, aarmação Vl pode compreender adicionalmente a seqüência de aminoácidos dearmação codificada pelo segmento de gene de imunoglobulina JkI, Jk2, Jk3,Jk4, ou Jk5 de linhagem germinativa humana.

Em outras formas de realização a armação universal pode seruma armação Vh, tal como uma armação que compreende as seqüências deaminoácidos de armação codificadas pelo segmento de gene deimunoglobulina DP4, DP7, DP8, DP9, DP10, DP31, DP33, DP38, DP45,DP46, DP47, DP49, DP50, DP51, DP53, DP54, DP65, DP66, DP67, DP68 ouDP69 de linhagem germinativa humana. Se desejado, a armação VH podecompreender adicionalmente a seqüência de aminoácidos de armaçãocodificada pelo segmento de gene de imunoglobulina Jh 1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5 eJh6 de linhagem germinativa humana.

Em formas de realização particulares, o monômero dAbcompreende a armação DPK9 VL, ou uma armação VH selecionado a partirdo grupo consistindo de DP47, DP45 e DP38.

Em certas formas de realização, o monômero dAb compreendeuma ou mais regiões de armação compreendendo uma seqüência deaminoácidos que é a mesma que a seqüência de aminoácidos de uma regiãode armação correspondente codificada por um segmento de gene de anticorpode linhagem germinativa humana, ou as seqüências de aminoácidos de umaou mais de ditas regiões de armação coletivamente compreendem até 5diferenças de aminoácidos em relação à seqüência de aminoácidos de ditaregião de armação correspondente codificada por um segmento de gene deanticorpo de linhagem germinativa humana.

Em outras formas de realização, as seqüências de aminoácidosde FWl, FW2, FW3 e FW4 do monômero dAb são as mesmas que asseqüências de aminoácidos de regiões de armação correspondentescodificadas por um segmento de gene de anticorpo de linhagem germinativahumana, ou as seqüências de aminoácidos de FW 1, FW2, FW3 e FW4coletivamente contêm até 10 diferenças de aminoácidos em relação àsseqüências de aminoácidos de regiões de armação correspondentescodificadas por dito segmento de gene de anticorpo de linhagem germinativahumana.

Em outras formas de realização, o monômero dAb compreenderegiões FW 1, FW2 e FW3, e a seqüência de aminoácidos de ditas regiõesFWl, FW2 e FW3 são as mesmas que as seqüências de aminoácidos deregiões de armação correspondentes codificadas por segmentos de gene deanticorpo de linhagem germinativa humana.

Em algumas formas realização, o monômero dAb nãocompreende um domínio variável de imunoglobulina de Camelid, ou um oumais aminoácidos de armação que são exclusivos para domínios variáveis deimunoglobulina codificados por segmentos de gene de anticorpo de linhagemgerminativa de Camelid.

Moléculas de Ácido Nucleico, Vetores e Células Hospedeiras

A invenção também fornece moléculas de ácido nucleicoisoladas e/ou recombinantes codificando ligantes como descrito neste lugar.Ácidos nucleicos referidos neste lugar como ácidos nucleicos "isolados" queforam separados dos ácidos nucleicos do DNA genômico ou RNA celular desua fonte de origem (e.g., como ele existe em células ou em uma mistura deácidos nucleicos tal como uma biblioteca), e incluem ácidos nucleicos obtidospor métodos descritas neste lugar ou outros métodos adequados, incluindoessencialmente ácidos nucleicos puros, ácidos nucleicos produzidos porsíntese química, por combinações de métodos biológicos e químicos, e ácidos,nucleicos recombinantes que são isolados (veja e.g., Daugherty, B.L. et al.,Nucleic Aeids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. and J.S. Crowe,Gene, 101: 297-302 (1991)).

Ácidos nucleicos referidos neste lugar como "recombinantes"ácidos nucleicos que foram produzidos por metodologia de DNArecombinante, incluindo aqueles ácidos nucleicos que são gerados porprocedimentos que levam em conta um método de recombinação artificial, talcomo a reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou clonagem em um vetorusando enzimas de restrição.

Em certas formas de realização, o ácido nucleico isolado e/ourecombinante compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando umligante, como descrito neste lugar, caracterizado pelo fato de que dito ligantecompreende uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cercade 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menoscerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelomenos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%de identidade de seqüência de aminoácidos com a seqüência de aminoácidosde a dAb que se liga a TNFRl descrito neste lugar.

Por exemplo, em algumas formas realização, o ácido nucleicoisolado e/ou recombinante compreende uma seqüência de nucleotídeoscodificando um ligante que tem especificidade de ligação para TNFRlcaracterizado pelo fato de que dito ligante compreende uma seqüência deaminoácidos que tem pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%,pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cercade 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menoscerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência deaminoácidos com a seqüência de aminoácidos de um dAb selecionado a partir,do grupo consistindo de TAR2m-15-8 (SEQ ID NO:216), TAR2m-15-12(SEQ ID NO:217), TAR2m-15-2 (SEQ ID NO:218), TAR2m-15-5 (SEQ IDNO:219), TAR2m-15-6 (SEQ ID N0:220), TAR2m-15-9 (SEQ ID NO:221),Tar2h-131-l (SEQ ID NO:222), Tar2hl31-2 (SEQ ID NO:223), Tar2h-131-3(SEQ ID NO:224), Tar2h-131-4 (SEQ ID NO:225), Tar2h-131-5 (SEQ IDNO:226), Tar2h-131-6 (SEQ ID NO:227), Tar2hl31-7 (SEQ ID NO:228),Tar2h-131-8 (SEQ ID NO:229), Tar2h-131-9 (SEQ ID N0:230), Tar2h-131-10 (SEQ ID NO:231), Tar2h-131-ll (SEQ ID NO:232), Tar2hl31-12 (SEQID NO:233), Tar2h-131-13 (SEQ ID NO:234), Tar2h-131-14 (SEQ IDNO:235), Tar2h-131-15 (SEQ ID NO:236), Tar2h-131-16 (SEQ ID NO:237),Tar2h-131-17 (SEQ ID NO:238), Tar2h-131-18 (SEQ ID NO:239), Tar2h-131-19 (SEQ ID N0:240), Tar2h-131-20 (SEQ ID NO:241), Tar2h-131-21(SEQ ID NO:242), Tar2hl31-22 (SEQ ID NO:243), Tar2h-131-23 (SEQ IDNO:244), Tar2h-131-24 (SEQ ID NO:245), Tar2h-131-25 (SEQ ID NO:246),Tar2h-131-26 (SEQ ID NO:247), Tar2hl31-27 (SEQ ID NO:248), Tar2hl31-28 (SEQ ID NO:249), Tar2hl31-29 (SEQ ID N0:250), Tar2hl31-30 (SEQ IDNO:251), Tar2hl31-31 (SEQ ID NO:252), Tar2hl31-32 (SEQ ID NO:253),Tar2hl31-33 (SEQ ID NO:254), Tar2hl31-34 (SEQ ID NO:255), Tar2hl31-35 (SEQ ID NO:256), Tar2hl31-36 (SEQ ID.NO:257), Tar2hl31-37 (SEQ IDNO:258), Tar2hl31-38 (SEQ ID NO:259), Tar2hl31-39 (SEQ ID N0:260),Tar2hl31-40 (SEQ ID NO:261), Tar2hl31-41 (SEQ ID NO:262), Tar2hl31-42 (SEQ ID NO:263), Tar2hl31-43 (SEQ ID NO:264), Tar2hl31-44 (SEQ IDNO:265), Tar2hl31-45 (SEQ ID NO:266), Tar2hl31-46 (SEQ ID NO:267),Tar2hl31-47 (SEQ ID NO:268), Tar2hl31-48 (SEQ ID NO:269), Tar2hl31-49 (SEQ ID N0:270), Tar2h-131-50 (SEQ ID NO:271), Tar2h-131-51 (SEQID NO:272), Tar2h-131-52 (SEQ ID NO:273), Tar2h-131-53 (SEQ IDNO:274), Tar2h-131-54 (SEQ ID NO:275), Tar2h-131-55 (SEQ ID NO:276),Tar2h-131-56 (SEQ ID 140:277), Tar2h-131-57 (SEQ ID NO:278), Tar2h-131-58 (SEQ ID NO:279), Tar2hl31-59 (SEQ ID N0:280), Tar2h-131-60.(SEQ ID NO:281), Tar2h-131-61 (SEQ ID NO:282), Tar2h-131-62 (SEQ IDNO:283), Tar2h-131-63 (SEQ ID NO:284), Tar2hl31-64 (SEQ ID NO:285),Tar2h-131-65 (SEQ ID NO:286), Tar2h-131-66 (SEQ ID NO:287), Tar2h-131-67 (SEQ ID NO:288), Tar2h-131-68 (SEQ ID NO:289), Tar2hl31-69(SEQ ID N0:290), Tar2h-131-70 (SEQ ID NO:291), Tar2h-131-71 (SEQ IDNO:292), Tar2h-131-72 (SEQ ID NO:293), Tar2h-131-73 (SEQ ID NO:294),Tar2hl31-74 (SEQ ID NO:295), Tar2h-131-75 (SEQ ID NO:296), Tar2h-131-76 (SEQ ID NO:297), Tar2h-131-77 (SEQ ID NO:298), Tar2h-131-78(SEQ ID NO:299), Tar2hl31-79 (SEQ ID N0:300), Tar2h-131-80 (SEQ IDN0:301), Tar2h-131-81 (SEQ ID N0:302), Tar2h-131-82 (SEQ ID N0:303),Tar2h-131-83 (SEQ ID N0:304), Tar211- 131-86 (SEQ ID N0:305), Tar2h-131-87 (SEQ ID N0:306), Tar2h-131-88 (SEQ ID N0:307), Tar2h-131-89(SEQ ID N0:308), Tar2h-131-90 (SEQ ID N0:309), Tar2hl31-91 (SEQ IDN0:310), Tar2h-131792 (SEQ ID NO:311), Tar2h-131-93 (SEQ ID NO:312),Tar2h-131-94 (SEQ ID NO:313), Tar2h-131-95 (SEQ ID NO:314), Tar2h-131-96 (SEQ ID NO:315), Tar2h-131-97 (SEQ ID NO:316), Tar2h-131-99(SEQ ID NO:317), Tar2h-131-100 (SEQ ID NO:318), Tar2h-131-101 (SEQID NO:319), Tar2h-131-102 (SEQ ID N0:320), Tar2h-131-103 (SEQ ID

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Em outras formas de realização, o ácido nucleico isolado e/ourecombinante codificando um ligante que tem especificidade de ligação paraTNFRl, como descrito neste lugar, caracterizado pelo fato de que dito ácidonucleico compreende uma seqüência de nucleotídeos tem pelo menos cerca de80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cercade 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menoscerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelomenos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%de identidade de seqüência de nucleotídeos com uma seqüência denucleotídeos codificando um dAb anti-TNFRl selecionado a partir do grupoconsistindo de Tar2h-131 (SEQ ID NO:434), Tar2h-131-l(SEQ ID NO:435),Tar2h-131 -2(SEQ ID NO:436), Tar2h-131-3(SEQ ID NO;437, Tar2b-131-4(SEQ ID NO:438), Tar21)-131- 5(SEQ ID NO:439), Tar2h-131-6(SEQ IDN0:440), TEtr2h-131 -7(SEQ ID NO:441), Tar2h-131-8(SEQ ID NO:442),Tar2h-131 -9(SEQ ID NO:443), Tar2h-131-10(SEQ ID NO:444), Tar2h-131-11(SEQ ID NO:445), Tar2h-131-12(SEQ ID NO:446), Tar2h-131-13(SEQ IDNO:447), Tar2h-131-14(SEQ ID NO:448), Tar2h-131-15(SEQ ID NO:449),Tar2h-131-16(SEQ ID N0:450), Tar2h-131-17(SEQ ID NO:451), Tar2h-131-18(SEQ ID NO:452), Tar2h-131-19(SEQ ID NO:453), Tar2h-131-20(SEQID'NO:454), Tar2h-131-21(SEQ ID NO:455), Tar2h-131-22(SEQ IDNO:456), Tar2h-131-23(SEQ ID NO:457), Tar2h-131-24(SEQ ID NO:458).Tar2h-131 -25(SEQ ID NO:459), Tar2h-131-26(SEQ ID N0:460), Tar2hl31-27(SEQ ID NO:461), Tar2hl31-28(SEQ ID NO:462), Tar2hl31-29(SEQ IDNO:463), Tar2hl31-30(SEQ ID NO:464), Tar2hl31-31(SEQ ID NO:465),Tar2hl31-32(SEQ ID NO:466), Tar2hl31-33(SEQ ID NO:467), Tar2hl31-34(SEQ ID NO:468), Tar2hl31-35(SEQ ID NO:469), Tar2hl31-36(SEQ IDN0:470), Tar2h 131-37(SEQ ID NO:471), Tar2hl31-38(SEQ ID NO:472),Tar2h/31 -39(SEQ ID NO:473), Tar2hl31-40(SEQ ID NO:474), Tar2hl31-41(SEQ ID NO:475), Tar2hl31-42(SEQ ID NO:476), Tar2hl31-43(SEQ IDNO:477), Tar2hl31-44(SEQ ID NO:478), Tar2hl31-45(SEQ ID NO:479),Tar2hl31-46(SEQ ID N0:480), Tar2hl31-4.7(SEQ ID NO:481), Tar2hl31-48(SEQ ID NO:482), Tar2hl31-49(SEQ ID NO:483), Tar2h-131-50(SEQ IDNO:484), Tar2h-131-51(SEQ ID NO:485), Tar2h-131-52(SEQ ID NO:486),Tar2h-131 -53(SEQ ID NO:487), Tar2h-131-54 (SEQ ID NO:488), Tar2h-131-55 (SEQ ID NO:489), Tar2h-131-56 (SEQ ID N0:490), Tar2h-131-57(SEQ ID NO:491), Tar2h-131-58 (SEQ ID NO:492), Tar2h-131-59 (SEQ IDNO:493), Tar2h-131-60 (SEQ ID NO:494), Tar2h-131-61 (SEQ NO:495),Tar2h-131-62 (SEQ ID NO:496), Tar2h-131-63 (SEQ ID NO:497), Tar2h-131-64 (SEQ ID NO:498), Tar2hl31-65 (SEQ ID NO:499), Tar2h-131-66(SEQ ID N0:500), Tar2h-131-67 (SEQ ID N0:501), Tar2h-131-68 (SEQ IDNO:502), Tar2h-131-69 (SEQ ID N0:503), Tar2h-131-70 (SEQ ID N0:504),Tar2h-131-71 (SEQ ID N0:505), Tar2h-131-72 (SEQ ID N0:506), Tar2h-131-73 (SEQ ID N0:507), Tar2h-131-74 (SEQ ID N0:508), Tar2h-131-75(SEQ ID NO:509), Tar2h-131-76 (SEQ DD N0:510), Tar2h-131-77 (SEQ IDNO:511), Tar2h-131-78 (SEQ ID NO:512), Tar2h-131-79 (SEQ ID NO:513),Tar2hl31-80 (SEQ ID NO:514), Tar2h-131-81 (SEQ ID NO:515), Tar2h-131-82 (SEQ ID NO:516), Tar2h-131-83(SEQ ED NO:517), Tar2h-131-86(SEQ ID NO:518), Tar2h-131-87 (SEQ ID NO:519), Tar2h-131-88 (SEQ IDN0:520), Tar2h-131-89 (SEQ ID NO:521), Tar2h-131-90 (SEQ ID NO:522),Tar2h-131-91 (SEQ ID NO:523), Tar211- 131-92 (SEQ ID NO:524), Tar2h-131-93 (SEQ ID NO:525), Tar2hl31-94 (SEQ ID NO:526), Tar2h-131-95(SEQ ID NO:527), Tar2h-131-96 (SEQ ID NO:528), Tar2h-131-97 (SEQ IDNO:529), Tar2h-131-99 (SEQ ID N0:530), Tar2h-131-100(SEQ ID NO:531),Tar2h-131-101 (SEQ ID NO:532), Tar2h-131-102 (SEQ ID NO:533), Tar2h-131-103 (SEQ ID NO:534), Tar2h-131-104 (SEQ ID NO:535), Tar2h-131-105 (SEQ ID NO:536), Tar2h-131-106 (SEQ ID NO:537), Tar2h-131-107(SEQ ID NO:538), Tar2h-131-108 (SEQ ID NO:539), Tar2h-131-109 (SEQID N0:540), Tar213-131-110 (SEQ ID NO:541), Tar2h-131-lll (SEQ ID

NO:542), Tar2h-131-112 (SEQ ID NO:543 , Tar2h-131-113 (SEQ ID NO: 544), Tar2h-131-114 (SEQ ID NO:545 , Tar2h-131-115 (SEQ ID NO:546), Tar2h-131-l 16 (SEQ ID NO:547 , Tar2h-131-117 (SEQ M NO:548), Tar2h-131-120 (SEQ ID NO: 549 , Tar2h-131-121 (SEQ ID N0:550), Tar2h-131-122 (SEQ ID NO:551 , Tar2h-131-123 (SEQ ID NO:552), Tar2h-131-124 (SEQ ID NO:553 , Tar2h-131-125 (SEQ ID NO:554), Tar2h-131-126 (SEQ ID NO:555 , Tar2h-131-127 (SEQ ID NO:556), Tar2h-131-128 (SEQ ID NO:557 , Tar2h-131-129 (SEQ ID NO:558), Tar2h-131-130 (SEQ ID NO:559 Tar2h-131-131 (SEQ ID N0:560), Tar2h-131-132 (SEQ ID NO:56 ), Tar2h-131-13 6(SEQ ID NO:562), Tar2h-131-151 (SEQ [D NO:563) Tar2h-131-180 (SEQ ID NO:5 64), Tar2h-131-181 (SEQ ID NO:565 Tar2h-131-182 (SEQ ID NO: 5 66), Tar2h-131-183 (SEQ ID NO:567 Tar2h-131-184 (SEQ ID NO:568), Tar2h-131-185 (SEQ ID NO:469 , Tar2h-131-188 (SEQ M N0:570), Tar2h-131-189 (SEQ ID NO:571 Tar2h-131-190 (SEQ ID NO:572), Tar2h-131-191 (SEQ ID NO:573 Tar2h-131-192 (SEQ ID NO: 574), Tar2h-131-193 (SEQ ID NO:575 Tar2h-131-194 (SEQ ID NO:576), Tar2h-131-195 (SEQ ID NO:577 Tar2h-131-196 (SEQ ID NO:578), Tar2h-131-197 (SEQ ID NO:579 Tar2h-131-198 (SEQ ID N0:580), Tar2h-131-500 (SEQ ID NO:581 Tar2h-131-501 (SEQ ID NO: 5 82), Tar2h-131-502 (SEQ ID NO:583 Tar2h-131-503 (SEQ ID NO: 5 84), Tar2h-131-504 (SEQ ID NO:585 Tar2h-131-505 (SEQ ID NO:586), Tar2h-131-506 (SEQ ID NO:587 Tar2h-131-507 (SEQ ID NO:488), Tar2h-131-508 (SEQ ID NO:489 Tar2h-131-509 (SEQ ID NO:590), Tar2h-131-510 (SEQ ID NO:591 Tar2h-131-511 (SEQ IDNO:592),Tar2h-131-512 (SEQ ID NO:593), Tar2h-131-513 (SEQ NO:594),Tar2h-131-514 (SEQ ID NO:595), Tar2h-131-515(SEQ ID NO:596), Tar2h-131-516(SEQ ID NO:597), Tar2h-131-517 (SEQ ID NO:598), Tar2h-131-518(SEQ ID NO:599), Tar2h-131-519 (SEQ ID N0:600), Tar2h-131-520 (SEQ5 ID N0:601), Tar2h-131-521 (SEQ ID N0:602), Tar2h-131-522 (SEQ IDN0:603), Tar2h-131-523 (SEQ ID N0:6.04), Tar2h-131-524 (SEQ IDN0:605), Tar2h-131-525 (SEQ ID N0:606), Tar2h-131-526 (SEQ IDN0:607), Tar2h-131-527 (SEQ ID N0:608), Tar2h-131-528(SEQ IDN'0:609), Tar2h-131-529 (SEQ ID N0:610), Tar2h-131-530 (SEQ ID10 NO:611), Tar2h-131-531 (SEQ ID NO:612), Tar2h-131-532 (SEQ IDNO:613), Tar2h-131-533 (SEQ ID NO:614), Tar2h-131-534 (SEQ IDNO:615), Tar2h-131-535 (SEQ ID NO:616), Tar2h-131-536 (SEQ IDNO:617),Tar2h-131-537 (SEQ ID NO:618), Tar2h-131-538 (SEQ IDNO:619), Tar2h-131-539 (SEQ ID N0:620), Tar2h-131-540 (SEQ ID15 NO:621), Tar2h-131-541 (SEQ ID NO:622), Tar2h-131-542 (SEQ IDNO:623), Tar2h-131-543 (SEQ ID N0:624), Tar2h-131-544 (SEQ ID.NO:625), Tar2h-131-545 (SEQ ID N0:626), Tar2h-131-546 (SEQ IDNO:627), Tar2h-131-547 (SEQ ID NO:628), Tar2h-131-548 (SEQ IDNO:629), Tar2h-131-549 (SEQ ID N0:630), Tar2h-131-550(SEQ ID20 NO:631),Tar2h-131-551 (SEQ ID NO:632), Tar2h-131-552 (SEQ IDNO:633), Tar2h-131-553 (SEQ ID NO:634), Tar2h-131-554 (SEQ IDNO:635), Tar2h-131-555 (SEQ ID NO:636), Tar2h-131-556 (SEQ IDNO:637), Tar2h-131-557 (SEQ ID NO:638), Tar2h-131-558 (SEQ IDNO:639), Tar2h-131-559 (SEQ ID N0:640), Tar2h-131-560 (SEQ ID25 NO:641), Tar2h-131-561 (SEQ ID NO:642), Tar2h-131-562 (SEQ IDNO:643), Tar2m-15-2(SEQ ID NO:645), Tar2m-15-5(SEQ ID NO:646),Tar2m-15-6(SEQ ID NO:647), Tar2m-15-8(SEQ ID NO:648), Tar2m-15-9(SEQ ID NO:649),e Tar2m-15-12(SEQ ID N0:650). Preferivelmente,identidade de seqüência de nucleotídeos é determinada sobre todo ocomprimento da seqüência de nucleotídeos que codifica o dAb anti-TNFRlselecionado.

A invenção também fornece um vetor compreendendo umamolécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Em certas formas derealização, o vetor é um vetor de expressão compreendendo um ou maiselementos ou seqüências de controle de expressão que são operavelmenteligados ao ácido nucleico recombinante da invenção. A invenção tambémfornece uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma moléculade ácido nucleico recombinante ou vetor da invenção. Vetores adequados(e.g., plasmídeos, fagomídeos), elementos de controle de expressão, célulashospedeiras e métodos para produzir células hospedeiras recombinantes dainvenção são bem conhecidos na técnica, e exemplos são adicionalmentedescritos neste lugar.

Vetores de expressão adequados podem conter diversoscomponentes, por exemplo, uma origem de replicação, um gene marcadorselecionável, um ou mais elementos de controle de expressão, tal como tal.como um elemento de controle de transcrição (e.g., promotor, ativador,terminador) e/ou um ou mais sinais de tradução, uma seqüência sinal ouseqüência líder, e os semelhantes. Elementos de controle de expressão e umaseqüência sinal, se presentes, podem ser fornecidos pelo vetor ou outra fonte.Por exemplo, as seqüências de controle transcricional e/ou traducional de umácido nucleico clonado codificando uma cadeia de anticorpo podem serusadas para dirigir expressão.

Um promotor pode ser fornecido para expressão em umacélula hospedeira desejada. Promotores podem ser constitutivos ou induzíveis.Por exemplo, um promotor pode ser operavelmente ligado a um ácidonucleico codificando um anticorpo, cadeia de anticorpo ou porção destes, deforma que ele dirija transcrição do ácido nucleico. Uma variedade depromotores apropriados para hospedeiros procarióticos (e.g., promotores lac,tac, Τ3, Τ7 para Ε. coli) e eucarióticos (e.g., promotor precoce ou tardio devírus símio 40, promotor de repetição terminal longa de vírus de sarcomaRous, promotor de citomegalovírus, promotor tardio de adenovírus) sãodisponíveis.

Em adição, vetores de expressão tipicamente compreendemum marcador selecionável para seleção de células hospedeiras carregando ovetor, e, no caso de um vetor de expressão replicável, uma origem dereplicação. Genes codificando produtos que conferem resistência a antibióticoou droga são marcadores selecionáveis comuns e podem ser usados emcélulas procarióticas (e.g. , gene de lactamase (resistência a ampicilina), geneTet para resistência a tetraciclina) e eucarióticas (e.g., genes de resistência aneomicina (G418 ou geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina, ouhigromicina). Genes marcadores de dihidrofolato redutase permitem seleçãocom metotrexato em uma variedade de hospedeiros. Genes codificando oproduto de gene de marcadores auxotróficos do hospedeiro (e.g., LEU2,URA3, HIS3) são freqüentemente usados como marcadores selecionáveis emlevedura. Uso de vetores virais (e.g., baculovírus) ou fagos, e vetores que sãocapazes de se integrar no genoma da célula hospedeira, tal como vetoresretrovirais, também são contemplados. Vetores de expressão adequados paraexpressão em células de mamíferos e células procarióticas (E. coli), células deinsetos (células S2 Schnieder de Drosophila, Sf9) e levedura (P. methanolica,P. pastoris, S. cerevisiae) são bem conhecidos na técnica.

Células hospedeiras podem ser procarióticas, incluindo célulasbacterianas tal como E. coli, B. subtilis e/ou outras bactérias adequadas;células eucarióticas, tal como células fungicas ou de levedura (e.g., Pichiapastoris, Aspergillus sp., Saccharotnyces cerevisiae, Sehizosaccharomycespombe, Neurospora crassa), ou outras células eucarióticas inferiores, ecélulas de eucariotos superiores tal como aquelas de insetos (e.g. , células S2de Drosophila Schnieder, células Sf9 de insetos (WO 94/26087 (0'Connor)),mamíferos (e.g., células COS, tal como COS-I (No. de Acesso de ATCCCRL-1650) e COS-7 (No. de Acesso de ATCC CRL-1651), CHO (e.g., No.de Acesso de ATCC CRL-9096, CHO DG44 (Urlaub, G. and Chasin5 LA.,Proc. Natl. Acac. Sei. USA, 77(7):4216-4220 (1980))), 293 (No. de Acesso deATCC CRL-1573), HeLa (No. de Acesso de ATCC CCL-2), CV 1. (No. deAcesso de ATCC CCL-70), WOP (Dailey, L., et al., Virol, 54:739-749(1985), 3T3, 293T (Pear, W. S., et al., Proc. Natl. Aead. Sei. 90:8392-8396(1993)) células NSO, SP2/0, células HuT 78 e as semelhantes, ou plantas(e.g., tabaco). (Veja, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and JohnWiley & Sons Inc. (1993).) Em algumas formas realização, a célulahospedeira é uma célula hospedeira isolada e não é parte de um organismomulticelular (e.g., planta ou animal). Em formas de realização preferidas, acélula hospedeira é uma célula hospedeira não humana.

A invenção também fornece um método para produzir umligante (e.g., Iigante de dupla especificidade, ligante multiespecífico) da.invenção, compreendendo manter uma célula hospedeira recombinantecompreendendo um ácido nucleico recombinante da invenção em condiçõesadequadas para expressão do ácido nucleico recombinante, através do que oácido nucleico recombinante é expresso e um ligante é produzido. Emalgumas formas realização, o método compreende adicionalmente isolar oligante.

Formatos de Ligantes

Ligantes e monômeros dAb podem ser formatados comoanticorpos mono ou multiespecíficos ou fragmentos de anticorpo ou emestruturas não anticorpo mono ou multiespecíficas. Formatos adequadosincluem, qualquer estrutura de polipeptídeo adequada na qual um domíniovariável de anticorpo ou uma ou mais das CDRs deste pode ser incorporadade forma a conferir especificidade de ligação para antígeno na estrutura.Diversos formatos adequados de anticorpo são conhecidos na técnica, talcomo, formatos tipo IgG, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados,anticorpos humanos, anticorpos de cadeia única, anticorpos biespecíficos,cadeias pesadas de anticorpos, cadeias leves de anticorpos, homodímeros eheterodímeros de cadeias pesadas e/ou cadeias leves de anticorpos,fragmentos de ligação de antígeno de qualquer dos precedentes (e.g., umfragmento Fv (e.g., Fv de cadeia única (scFv), um Fv ligado por dissulfeto),um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2), um domíniovariável único (e.g., VN, VL, vHH),um dAb, e versões modificadas de qualquerdos precedentes (e.g., modificadas pelo acoplamento covalente depolialquilenoglicol (e.g., polietilenoglicol, polipropilenoglicol,polibutilenoglicol) ou outro polímero adequado). Veja, PCT/GB03/002804,depositado em 30 de Junho de 2003, que designou os Estados Unidos daAmérica, (WO 2004/081026) considerando PEGuilado de domínios variáveisúnicos e dAbs, métodos adequados para preparar os mesmos, meia-vida invivo aumentada dos domínios variáveis únicos PEGuilados e monômeros dAb.e multímeros, PEGs adequados, tamanhos hidrodinâmicos preferidos dePEGs, e tamanhos hidrodinâmicos preferidos de domínios variáveis únicosPEGuilados e monômeros dAb e multímeros. A instrução total dePCT/GB03/002804 (WO 2004/081026), incluindo as porções referidas acima,é incorporada neste lugar por referência.

O ligante pode ser formatado como um dímero, trímero oupolímero dos monômeros dAb desejados, por exemplo usando um liganteadequado tal como (Gly4Ser),, onde η = de 1 a 8, e.g., 2, 3, 4, 5,6 ou 7. Sedesejado, ligantes, incluindo monômeros dAb, dímeros e trímeros, podem serligados a uma região Fc de anticorpo, compreendendo um de ou ambos osdomínios Ch2 e Ch3, e opcionalmente uma região de dobradiça. Por exemplo,vetores codificando ligantes ligados como uma única seqüência denucleotídeos a uma região Fc podem ser usados para preparar taispolipeptídeos.

Ligantes e monômeros dAb também podem ser combinadose/ou formatados em estruturas multi-ligantes de não anticorpo para formarcomplexos multivalentes, que se ligam a moléculas alvo com o mesmoantígeno, através disso fornecendo avidez superior. Por exemplo receptoresbacterianos naturais tal como SpA podem ser usados como armações para oenxerto de CDRs para gerar ligantes que se ligam especificamente a um oumais epítopos. Detalhes deste procedimento são descritos em Patente Norte-Americana 5.831.012. Outras armações adequadas incluem aquelas baseadasem fibronectina e aficorpos. Detalhes de procedimentos adequados sãodescritos em WO 98/58965. Outras armações adequadas incluem lipocalina eCTLA4, como descrito em van den Beuken et al., J. Mol. Biol. 310:591-601(2001), e armações tal como aquelas descritas em WO 00/69907 (MedicaiResearch Council), que são baseadas em por exemplo na estrutura cíclica deGroEL bacteriano ou outros polipeptídeos de chaperona. Armações protéicaspodem ser combinadas; por exemplo, CDRs podem ser enxertadas em umaarmação CTLA4 e usados juntos com domínios VH ou Vl de imunoglobulinapara formar um ligante. Da mesma maneira, fibronectina, lipocalina e outrasarmações podem ser combinadas.

Diversos métodos adequados para preparar qualquer formatodesejado são conhecidos na técnica. Por exemplo, cadeias e formatos deanticorpo (e.g., formatos tipo IgG, anticorpos quiméricos, anticorposhumanizados, anticorpos humanos, anticorpos de cadeia única, anticorposbiespecífícos, cadeias pesadas de anticorpos, cadeias leves de anticorpos,homodímeros e heterodímeros de cadeias pesadas e/ou cadeias leves deanticorpo) podem ser preparados por expressão de construções de expressãoadequadas e/ou culturas de células adequadas (e.g., hibridomas,heterohibridomas, células hospedeiras recombinantes contendo construçõesrecombinantes codificando o formato). Ademais, formatos tal comofragmentos de ligação de antígeno de anticorpos ou cadeias de anticorpos(e.g., um fragmento Fv (e.g., Fv de cadeia única (scFv), um Fv ligado pordissulfeto), um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2),podem ser preparados por expressão de construções de expressão adequadasou por digestão enzimática de anticorpos, por exemplo usando papaína oupepsina.

O ligante pode ser formatado como um ligante de duplaespecificidade ou um ligante multiespecífico, por exemplo como descrito emWO 03/002609, as instruções totais da qual são incorporados neste lugar porreferência. Os ligantes de dupla especificidade compreendem domíniosvariáveis únicos de imunoglobulina que têm diferentes especificidades deligação. Tais ligantes de dupla especificidade podem compreendercombinações de domínios de cadeia pesada e leve. Por exemplo, o ligante dedupla especificidade pode compreender um domínio Vh e um domínio VL,que podem ser ligados juntos na forma de um scFv (e.g., usando um liganteadequado tal como Gly4Ser), ou formatados em um anticorpo biespecífico oufragmento de ligação de antígeno deste (e.g. fragmento F(ab')2). Os ligantesde dupla especificidade não compreendem pares VH/VL complementares queformam um sítio de ligação de antígeno de anticorpo de duas cadeiasconvencional que se liga a antígeno ou epítopo cooperativamente. Aocontrário, os ligantes de formato duplo compreendem um par VH/Vlcomplementar, caracterizado pelo fato de que os domínios V têm diferentesespecificidades de ligação.

Em adição, os ligantes de dupla especificidade podemcompreender um ou mais domínios CH ou CL se desejado. Um domínio deregião de dobradiça também pode estar incluído se desejado. Taiscombinações de domínios podem, por exemplo, mimetizar anticorposnaturais, tal como IgG ou IgM, ou fragmentos destes, tal como moléculas deFv, scFv, Fab ou F(ab')2. Outras estruturas, tal como um único braço de umamolécula de IgG compreendendo domínios Vh, Vl, ChI e CL5 sãocontempladas. Preferivelmente, o ligante de dupla especificidade da invençãocompreende apenas dois domínios variáveis embora diversos tais ligantespossam ser incorporados juntos na mesma proteína, por exemplo dois taisligantes podem ser incorporados em uma IgG ou uma imunoglobulinamultimérica, tal como IgM. Alternativamente, em outra forma de realizaçãodiversos ligantes de dupla especificidade são combinados para formar ummultímero. Por exemplo, dois diferentes ligantes de dupla especificidade sãocombinados para criar uma molécula tetraespecífica. Será reconhecido poralguém versado na técnica que as regiões variáveis leves e pesadas de umligante de dupla especificidade produzido de acordo com o método dapresente invenção podem estar na mesma cadeia de polipeptídeo, oualternativamente, em diferentes cadeias de polipeptídeo. No caso em que asregiões variáveis estão em diferentes cadeias de polipeptídeo, então elaspodem ser ligadas através de um ligante, geralmente um ligante flexível (talcomo uma cadeia de polipeptídeo), um grupo de ligante químico, ou qualqueroutro método conhecido na técnica.

O ligante multiespecífico possui mais do que umaespecificidade de ligação de epítopo. Geralmente, o ligante multiespecíficocompreende dois ou mais domínios de ligação de epítopo, tal como dAbs oudomínio protéico não anticorpo compreendendo um sítio de ligação para umepítopo, e.g.; um aficorpo, um domínio SpA, um domínio classe A de receptorde LDL, um domínio EGF, um avímero. Ligantes multiespecíficos podem serformatados adicionalmente como descrito neste lugar.

Em algumas formas realização, o ligante é um formato tipoIgG. Tais formatos têm a estrutura convencional de quatro cadeias de umamolécula de IgG (2 cadeias pesadas e duas cadeias leves), na qual uma oumais das regiões variáveis (VH e ou VL) foram substituídas por um dAb oudomínio variável único de uma especificidade desejada. Preferivelmente, cadauma das regiões variáveis (2 regiões VH e 2 regiões VL) é substituída por umdAb ou domínio variável único. O dAb(s) ou domínio(s) variável(is) único(s)que estão incluídos em um formato tipo IgG têm a mesma especificidade ouespecificidades diferentes. Em algumas formas realização, o formato tipo IgGé tetravalente e pode ter uma, duas, três ou quatro especificidades. Porexemplo, o formato tipo IgG pode ser monoespecífico e compreender 4 dAbsque têm a mesma especificidade; biespecífico e compreender 3 dAbs que têma mesma especificidade e outro dAb que tem uma especificidade diferente;biespecífico e compreender dois dAbs que têm a mesma especificidade e doisdAbs que têm uma especificidade comum mas diferente; triespecífico ecompreender primeiro e segundo dAbs que têm a mesma especificidade, umterceiro dAb com uma especificidade diferente e um quarto dAb com umaespecificidade diferente do primeiro, segundo e terceiro dAbs; outetrasepecífico e compreender quatro dAbs que têm cada uma especificidadediferente. Fragmentos de ligação de antígeno de formatos tipo IgG (e.g., Fab5F(ab')2, Fab', Fv, scFv) podem ser preparados. Preferivelmente, os formatos,tipo IgG ou fragmentos de ligação de antígeno destes não reticulam TNFRl.Formatos de Meia-Vida Prolongada

Um antagonista de TNFRl (e.g., ligante, monômero dAb,dímero ou multímero, formato de dupla especificidade, formatomultiespecífico) pode ser formatado para prolongar sua meia-vida no soro invivo. Meia-vida in vivo aumentada é útil em aplicações in vivo deimunoglobulinas, especialmente anticorpos e mais especialmente fragmentosde anticorpo de tamanho pequeno tal como dAbs. Tais fragmentos (Fvs, Fvsligados por dissulfeto, Fabs, scFvs, dAbs) são rapidamente tirados do corpo, oque pode limitar severamente aplicações clínicas.

Um antagonista de TNFRl pode ser formatado para ter umtamanho hidrodinâmico maior, por exemplo, por acoplamento de um grupo depolialquilenoglicol (e.g. grupo de polietilenoglicol (PEG)), albumina no soro,transferrina, receptor de transferrina ou pelo menos a porção de ligação detransferrina deste, uma região Fc de anticorpo, ou por conjugação a umdomínio de anticorpo. Em algumas formas realização, o antagonista (e.g.,ligante, monômero dAb) é PEGuilado. Preferivelmente o antagonista (e.g.,ligante, monômero dAb) PEGuilado se liga a TNFRl com substancialmente amesma afinidade que o mesmo ligante que não é PEGuilado. Por exemplo, oligante pode ser um monômero dAb PEGuilado que se liga a, caracterizadopelo fato de que o monômero dAb PEGuilado se liga a TNFRl com umaafinidade que difere da afinidade de dAb em forma não PEGuilada por umfator de não mais do que cerca de 1000, preferivelmente um fator de não maisdo que cerca de 100, mais preferivelmente um fator de não mais do que cercade 10, ou com afinidade substancialmente não modificada afinidade relativa àforma não PEGuilada.

Antagonistas pequenos, tal como um monômero dAb, podem ser formatados como um fragmento de ligação de antígeno maior de umanticorpo ou como e anticorpo (e.g., formatado como um Fab, Fab', F(ab)2,.F(ab')2, scFv). O tamanho hidrodinâmico de um antagonista (e.g., ligante,monômero dAb) e sua meia-vida no soro também podem ser aumentadosconjugando ou ligando o antagonista a um domínio de ligação (e.g., anticorpoou fragmento de anticorpo) que se liga a um antígeno ou epítopo que aumentameia-vida in vivo, como descrito neste lugar. Por exemplo, os antagonistas(e.g., ligante, monômero dAb) podem ser conjugados ou ligados a umanticorpo anti-albumina no soro ou anti-receptor Fc neonatal ou fragmento deanticorpo, eg um dAb anti-SA ou anti-receptor Fc neonatal, Fab, Fab' ouscFv, ou a um aficorpo anti-SA ou aficorpo anti-receptor Fc neonatal.

Exemplos de albumina, fragmentos de albumina ou variantesde albumina adequados para uso em um ligante de ligação de TNFRl deacordo com a invenção são descritos em WO 2005/077042A2, que éincorporado neste lugar por referência em sua totalidade. Em particular, aalbumina, fragmentos de albumina ou variantes de albumina seguintes podemser usados na presente invenção:

• SEQ ID NO:l (como descrito em WO 2005/077042A2, estaseqüência sendo explicitamente incorporada na presente descriçãopor referência);

• Fragmento ou variante de albumina compreendendo ou consistindode aminoácidos 1-387 de SEQ ID NO:l em WO 2005/077042A2;

• Albumina, ou fragmento ou variante desta, compreendendo umaseqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo

de: (a) aminoácidos 54 a 61 de SEQ ID NO:l em WO

2005/077042A2; (b) aminoácidos 76 a 89 de SEQ ID NO:l em WO

2005/077042A2; (c) aminoácidos 92 a 100 de SEQ ID NO:l em

WO 2005/077042A2; (d) aminoácidos 170 a 176 de SEQ ID NO:l

em WO 2005/077042A2; (e) aminoácidos 247 a 252 de SEQ ED

NO:l em WO 2005/077042A2; (f) aminoácidos 266 a 277 de SEQ

ID NO:l em WO 2005/077042A2; (g) aminoácidos 280 a 288 de.

SEQ ID NO:l em WO 2005/077042A2; (h) aminoácidos 362 a 368

de SEQ ID NO:l em WO 2005/077042A2; (i) aminoácidos 439 a

447 de SEQ ID NO:l em WO 2005/077042A2 G) aminoácidos 462

a 475 de SEQ ID NO:l em WO 2005/077042A2; (k) aminoácidos

478 a 486 de SEQ ID NO:l em WO 2005/077042A2; e (1)

aminoácidos 560 a 566 de SEQ ID NO: 1 em WO 2005/077042A2,

Exemplos adicionais de albumina adequada, fragmentos eanálogos para uso em um ligante de ligação de TNFRl de acordo com ainvenção são descritos em WO 03/076567A2, que é incorporado neste lugarpor referência em sua totalidade. Em particular, a albumina, fragmentos ouvariantes seguintes podem ser usados na presente invenção:

• Albumina no soro humano como descrito em WO 03/076567A2,eg, em figura 3 (esta informação de seqüência sendo explicitamenteincorporada na presente descrição por referência);

• Albumina no soro humano (HA) consistindo de uma única cadeianão glicosilada de polipeptídeo de 585 aminoácidos com um pesomolecular de fórmula de 66.500 (Veja, Meloun, et al., FEBSLetters58:136 (1975); Behrens, et al., Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, etal., Nucleic Àcids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, et al,J. Biol. Chem. 261:6747 (1986));

• Uma variante polimórfica ou análogo ou fragmento de albuminacomo descrito em Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37:219(1973);

• Um fragmento ou variante de albumina como descrito em PatenteEuropéia 322094, eg, HA(l-373., HA(l-388), HA(l-389), HA(1-369), e HA(1-419) e fragmentos entre 1-369 e 1-419;

• Um fragmento ou variante de albumina como descrito em PatenteEuropéia 399666, eg, HA(1-177) e HA( 1-200) e fragmentos entreHA(I-X), onde X é qualquer número de 178 a 199.

Onde uma (uma ou mais) unidade que prolonga meia-vida (eg,albumina, transferrina e fragmentos e análogos destas) é usada nos ligantes deligação de TNFRl da invenção, ela pode ser conjugada usando qualquermétodo adequado, tal como, por fusão direta à unidade de ligação de TNFRl(eg, dAb anti-TNFRl ou fragmento de anticorpo), por exemplo usando umaconstrução única de nucleotídeo que codifica uma proteína de fusão,caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão é codificada como umaúnica cadeia de polipeptídeo com a unidade que prolonga meia-vidalocalizada N- ou C-terminalmente à unidade de ligação de TNFRl.Alternativamente, conjugação pode ser atingida usando um ligante peptídicoentre unidades, eg, um ligante peptídico como descrito em WO 03/0765 67A2ou WO 2004/003019 (estas descrições de ligantes sendo incorporadas porreferência na presente descrição para fornecer exemplos para uso na presenteinvenção).

Tipicamente, um polipeptídeo que aumenta meia-vida no soroin vivo é um polipeptídeo que ocorre naturalmente in vivo e que resiste àdegradação ou remoção por mecanismos endógenos que removem materialindesejado do organismo (e.g., humano). Por exemplo, um polipeptídeo queaumenta meia-vida no soro in vivo pode ser selecionado a partir de proteínasda matriz extracelular, proteínas encontradas em sangue, proteínasencontradas na barreira sangüínea de cérebro ou em tecido neural, proteínaslocalizadas no rim, fígado, pulmão, coração, pele ou osso, proteínas deestresse, proteínas específicas de doença, ou proteínas envolvidas emtransporte de Fc.

Polipeptídeos adequados que aumentam meia-vida no soro invivo incluem, por exemplo, proteínas de fusão de ligante específico dereceptor de transferrina e agente neurofarmacêutico (veja Patente U.S.5.977.307, as instruções da qual são incorporadas neste lugar por referência),receptor de célula endotelial de capilar cerebral, transferrina, receptor de.transferrina (e.g., receptor de transferrina solúvel), insulina, receptor de fatorde crescimento tipo insulina I (IGF 1), receptor de fator de crescimento tipoinsulina 2 (IGF 2), receptor de insulina, fator de coagulação sangüínea X,antitripsina al e HNF la. Polipeptídeos adequados que aumentam meia-vidano soro também incluem glicoproteína alfa-1 (orosomucóide; AAG),antiquimotripsina alfa-1 (ACT), microglobulina alfa-1 (proteína HC; AIM),antitrombina III (AT III), apolipoproteína A-I (Apo A-1), apolipoproteína B(Apo B), ceruloplasmina (Cp), componente de complemento C3 (C3),componente de complemento C4 (C4), inibidor de esterase Cl (Cl INH),proteína C-reativa (CRP), ferritina (FER), hemopexina (HPX), lipoproteína(a)(Lp(a)), proteína de ligação de manose (MBP), mioglobina (Myo), pré-albumina (transtiretina; PAL), proteína de ligação de retinol (RBP), e fatorreumatóide (RF).Proteínas adequadas da matriz extracelular incluem, porexemplo, colágenos, lamininas, integrinas e fibronectina. Colágenos são asproteínas principais da matriz extracelular. Cerca de 15 tipos de moléculas decolágeno são atualmente conhecidas, encontradas em diferentes partes docorpo, e.g. colágeno tipo I (respondendo por 90% de colágeno corporal)encontrado em osso, pele, tendão, ligamentos, córnea, órgãos internos oucolágeno tipo II encontrado em cartilagem, disco vertebral, notocorda, ehumor vítreo do olho.

Proteínas adequadas do sangue incluem, por exemplo,proteínas plasmáticas (e.g., fibrina, a-2 macroglobulina, albumina no soro,fibrinogênio (e.g., fíbrinogênio A, fibrinogênio B), proteína amilóide A desoro, haptoglobina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina e microglobulina β-2,enzimas e inibidores de enzimas (e.g., plasminogênio, lisozima, cistatina C,alfa-1- antitripsina e inibidor de tripsina pancreático), proteínas do sistemaimune, tal como proteínas imunoglobulina (e.g., IgA, IgD, IgE, IgG, IgM,cadeias leves de imunoglobulina (kappa/lambda)), proteínas de transporte,(e.g., proteína de ligação de retinol, a-1 microglobulina), defensinas (e.g.,beta-defensina 1, defensina de neutrófilo 1, defensina de neutrófilo 2 edefensina de neutrófilo 3) e os semelhantes.

Proteínas adequadas encontradas na barreira sangüínea celularou em tecidos neurais incluem, por exemplo, receptor de melanocortina,mielina, transportador de ascorbato e os semelhantes.

Polipeptídeos adequados que aumentam meia-vida no soro invivo também incluem proteínas localizadas no rim (e.g., policistina, colágenotipo IV, transportador de ânion orgânico Kl, antígeno de Heymann), proteínaslocalizadas no fígado (e.g., álcool desidrogenase, G250), proteínas localizadasno pulmão (e.g., componente secretor, que se liga a IgA), proteínaslocalizadas no coração (e.g., HSP 27, que está associado com cardiomiopatiadilatada), proteínas localizadas na pele (e.g., queratina), proteínas específicasde osso tal como proteínas morfogênicas (BMPs), que são um subconjunto dasuperfamília de fator de crescimento transformador β que demonstra atividadeosteogênica (e.g., BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8),proteínas específicas de tumor (e.g., antígeno de trofoblasto, receptor deherceptina, receptor de estrogênio, catepsinas (e.g., catepsina B, que pode serencontrada em fígado e baço)).

Proteínas específicas de doença adequadas incluem, porexemplo, antígenos expressos apenas em células T ativadas, incluindo LAG-3(gene de ativação de linfócito), ligante de osteoprotegerina (OPGL; vejaNature 402, 304-309 (1999)), 0X40 (um membro da família de receptor TNF,expresso em células T ativadas e especificamente aumentado em célulasprodutoras de vírus de leucemia tipo I de célula T humana (HTLV-I); vejaImmunol. 165 (l):263-70 (2000)). Proteínas específicas de doença adequadastambém incluem, por exemplo, metaloproteases (associadas comartrite/cânceres) incluindo C06512 Drosophila, paraplegina humana, FtsHhumano, AFG3L2 humano, ftsH murino; e fatores de crescimento,angiogênico, incluindo fator de crescimento de fibroblasto ácido (FGF-1),fator de crescimento de fibroblasto básico (FGF-2), fator de crescimentoendotelial vascular / fator de permeabilidade vascular (VEGF/VPF), fator decrescimento de transformação-a (TGF a), fator de necrose tumoral-alfa (TNF-a), angiogenina, interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), fator decrescimento endotelial derivado de plaqueta (PD-ECGF), fator de crescimentoplacentário (PIGF), fator de crescimento derivado de plaqueta ligado aheparina-BB (PDGF), e fractalcina.

Polipeptídeos adequados que aumentam meia-vida no soro invivo também incluem proteínas de estresse tal como proteínas de choquetérmico (HSPs). HSPs são normalmente encontradas intracelularmente.Quando elas são encontradas extracelularmente, é um indicador de que umacélula morreu e espalhou seus conteúdos. Esta morte celular não programada(necrose) ocorre quando como um resultado de trauma, doença ou lesão,HSPs extracelulares desencadeiam uma resposta do sistema imune. Ligação aHSP extracelular pode resultar em localizar as composições da invenção paraum sítio de doença.

Proteínas adequadas envolvidas em transporte de Fc incluem,por exemplo, receptor de Brambell (também conhecido como FcRB). Estereceptor de Fc tem duas funções, ambas as quais são potencialmente úteispara liberação. As funções são (1) transporte de IgG de mãe para criançaatravés da placenta (2) proteção de IgG de degradação prolongando com issosua meia-vida no soro. Acredita-se que o receptor recicla IgG a partir doendossomo. (Veja, Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997).)

Métodos para análise farmacocinética e determinação de meia-vida de ligante serão familiares para aqueles versados na técnica. Detalhespodem ser encontrados em Kenneth1 A et al: Chemical Stability ofPharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists e em Peters et al,Phannacokinete analysis: A Practical Approach (1996). Referência também é.feita a "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, publicado por MareeiDekker, 2ndRev. ex edition (1982), que descreve parâmetros farmacocinéticostal como meias-vidas t alfa e t beta e área sob a curva (AUC).Preparação de Ligantes Baseados em Imunoglobulina

Agentes de ligação, antagonistas, ligantes, dAbs como descritoneste lugar de acordo com a invenção podem ser preparados de acordo comtécnicas previamente estabelecidas, usadas no campo de engenharia deanticorpo, para a preparação de scFv, anticorpos "fago" e moléculasengenheiradas de anticorpo. Técnicas para a preparação de anticorpos são porexemplo descritas nas seguintes revisões e nas referências citadas nestas:Winter & Milstein, (1991) Nature 349:293-299; Pluckthun (1992)Immunological Reviews 130:151-188; Wright etal., (1992) Crti. Rev.Immuno 1,12:125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Cum Op. Biotechn.4, 446-449; Carter, et al (1995) J. Hematother. 4, 463-470; Chester, K.A. &Hawkins, R.E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom, H.R.(1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D. (1997) Nature Biotechnol.15, 618-619; Plackthun, A. & Pack, P. (1997) Immunoteclmology 3, 83-105;Carter, P. & Merchant, A.M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 449-454;Holliger, P. & Winter, G. (1997) Câncer Immunol. hnmunother. 45,128-130.

Técnicas adequadas empregadas para seleção de domíniosvariáveis de anticorpo com uma especificidade desejada empregambibliotecas e procedimentos de seleção que são conhecidos na técnica.Bibliotecas naturais (Marks et aL (1991) J. Mol. BioL1 222: 581; Vaughan etal. (1996) Nature Bioteck, 14: 309) que usam gene V rearranjados coletadosde células B humanas são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.Bibliotecas sintéticas (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381;Barbas et al. (1992) Proc. Natl Acad. Sei. USA, 89: 4457; Nissim et al.(1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO 13: 3245; De KITHet aL (1995) J. Mol. Biol1 248: 97) são preparadas clonando genes V de.imunoglobulina, normalmente usando PCR. Erros no processo de PCR podemlevar a um alto grau de randomização. Bibliotecas de Vh e/ou Vl podem serselecionadas contra antígenos ou epítopos alvo separadamente, em cujo casodomínio de ligação único é diretamente selecionado para, ou junto.Sistemas de vetor de biblioteca

É conhecida na técnica uma variedade de sistemas de seleçãoque são adequados para uso na presente invenção. Exemplos de tais sistemassão descritos abaixo.

Sistemas de expressão de bacteriófago lambda podem serselecionados diretamente como placas de bacteriófago ou como colônias delisógenas, ambos como previamente descrito (Huse et al. (1989) Science, 246:1275; Caton and Koprowski (1990) Proc. Natl Acad. Set*. U.S.A., 87;Mull.inax et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 87: 8095; Persson et al.(1991) Proc. Natl. Acad1 Sei. U.S.Α., 88: 2432) e são de uso na invenção.Enquanto que tais sistemas de expressão podem ser usados para selecionar até106 membros diferentes de uma biblioteca, eles não são realmente adequadospara seleção de números maiores (maiores do que IO6 membros). Sistemas deapresentação de seleção são de uso particular na construção de bibliotecas, oque possibilita que um ácido nucleico seja. ligado ao polipeptídeo que eleexpressa. Como usado neste lugar, um sistema de apresentação de seleção éum sistema que permite a seleção, por meio de manifestação adequada, dosmembros individuais da biblioteca através da ligação dos ligantes genéricose/ou alvo.

Protocolos de seleção para isolar membros desejados debibliotecas grandes são conhecidos na técnica, como tipificado por técnicas deapresentação em fago. Tais sistemas, nos quais diversas seqüências depeptídeos são apresentadas na superfície de bacteriófago filamentoso (Scott eSmith (1990) Science, 249: 386), provaram ser úteis para criar bibliotecas defragmentos de anticorpo (e as seqüências de nucleotídeos que codificam eles)para a seleção in vitro e amplificação de fragmentos de anticorpos específicosque se ligam a um antígeno alvo (McCafferty et al., WO 92/01047). Asseqüências de nucleotídeos codificando as regiões variáveis são ligadas afragmentos de genes que codificam sinais condutores que dirigem eles para oespaço periplásmico de E. coli e como um resultado os fragmentos deanticorpos resultantes são apresentados na superfície do bacteriófago,tipicamente como fusões para proteínas de revestimento de bacteriófago (e.g.,pIII ou pVIII). Alternativamente, fragmentos de anticorpos são apresentadosexternamente em capsídeos de fago lambda (fagomídeos). Uma vantagem desistemas de apresentação baseados em fago é que, por eles serem sistemasbiológicos, membros de biblioteca selecionados podem ser amplificadossimplesmente crescendo o fago contendo o membro de biblioteca selecionadoem células bacterianas. Além disso, uma vez que a seqüência de nucleotídeosque codifica o membro de biblioteca está contida em um vetor fago oufagomídeo, seqüenciamento, expressão e subseqüente manipulação genéticasão relativamente fáceis.

Métodos para a construção de bibliotecas de apresentação deanticorpo de bacteriófago e bibliotecas de expressão de fago lambda são bemconhecidos na técnica (McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552; Kang et al(1991) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature,352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistiy, 30: 10832; Burton et al. (1991)Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboom et al (1991) NucleicAcids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J. Immunol., 147: 3610; Breitling etal (1991) Gene, 104: 147; Marks et al. (1991) acima; Barbas et al. (1992)acima; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al, 1992,J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313,incorporados neste lugar por referência).

Uma abordagem particularmente vantajosa foi o uso debibliotecas de fago scFv (Huston et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.,,85: 5879-5883; Chaudhary et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87:1066-1070; McCafferty et al. (1990) acima; Clackson et al (1991) Nature,352: 624; Marks et al. (1991) J. Mal. Biol., 222: 581; Criswell et al. (1992)Trends Biotech., 10: 80; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267). Váriasformas realização de bibliotecas de scFv apresentadas em proteínas derevestimento de bacteriófago foram descritas. Refinamentos de abordagens deapresentação em fago também são bem conhecidos, por exemplo comodescrito em W096/06213 e W092/01047 (Medicai Research. Council et al) eW097/08320 (Morphosys), que são incorporados neste lugar por referência.

Outros sistemas para gerar bibliotecas de polipeptídeosenvolvem o uso de maquinário enzimático livre de células para a síntese invitro dos membros de biblioteca. Em um método, moléculas de RNA sãoselecionadas por ciclos alternados de seleção contra um ligante alvo eamplificação por PCR (Tuerk and Gold (1990) Science, 249: 505; Ellingtonand Szostak (1990) Nature, 346: 818). Uma técnica similar pode ser usadapara identificar seqüências de DNA que se ligam a um fator de transcriçãopré-determinado (Thiesen and Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203;

Beaudry and Joyce (1992) Science, 257: 635; W092/05258 e W092/14843).De uma maneira similar, tradução in vitro. pode ser usada para sintetizarpolipeptídeos como um método de gerar bibliotecas grandes. Estes métodosque geralmente compreendem complexos de polissomos estabilizados, sãodescritos adicionalmente em W088/08453, W090/05785, W090/07003,W091/02076, W091/05058, e W092/02536. Sistemas de apresentaçãoalternativos que não são baseados em fago, tal como aqueles descritos emW095/22625 e W095/11922 (Affymax) usam os polissomos para apresentarpolipeptídeos para seleção.

Uma categoria ainda adicional de técnicas envolve a seleção de repertórios em compartimentos artificiais, que permitem a ligação de umgene com seu produto de gene. Por exemplo, um sistema de seleção no qual.ácidos nucleicos codificando produtos de genes desejáveis podem serselecionados em microcápsulas formadas por emulsões de água em óleo édescrito em W099/02671, W000/40712 e Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6. Elementos genéticos codificando um produto degene tendo uma atividade desejada são compartimentalizados emmicrocápsulas e então transcritos e/ou traduzidos para produzir seusrespectivos produtos de genes (RNA ou proteína) dentro das microcápsulas.Elementos genéticos que produzem produto de gene tendo atividade desejadasão subseqüentemente classificados. Esta abordagem seleciona produtos degenes de interesse através da detecção da atividade desejada por umavariedade de meios.

Construção de Biblioteca

Bibliotecas pretendidas para seleção, podem ser construídasusando técnicas conhecidas na técnica, por exemplo como apresentado acima,ou podem ser adquiridas a partir de fontes comerciais. Bibliotecas que sãoúteis na presente invenção são descritas, por exemplo, em W099/20749. Umavez que um sistema de vetor é escolhido e uma ou mais seqüências de ácidosnucleicos codificando polipeptídeos de interesse são clonadas no vetor debiblioteca, alguém pode gerar diversidade dentro das moléculas clonadasatravés de realização de mutagênese antes de expressão; alternativamente, asproteínas codificadas podem ser expressas e selecionadas, como descritoacima, antes de mutagênese e ciclos adicionais de seleção serem realizados.Mutagênese de seqüências de ácidos nucleicos codificando polipeptídeosestruturalmente otimizados é realizada por métodos moleculares padrão. Deuso particular é a reação em cadeia da polimerase, ou PCR, (Mullis andFaloona (1987) Methods Enzymol., 155: 335, neste lugar incorporado porreferência). PCR, que usa múltiplos ciclos de replicação de DNA catalisadopor uma DNA polimerase dependente de DNA termoestável para amplificar aseqüência alvo de interesse, é bem conhecido na técnica. A construção de.várias bibliotecas de anticorpo foi discutida em Winter et al. (1994) Ann.Rev. Immunology 12, 433-55, e referências citadas neste.

PCR é realizado usando DNA modelo (pelo menos lfg; maisutilmente, 1-1000 ng) e pelo menos 25 pmol de iniciadores deoligonucleotídeo; pode ser vantajoso usar uma grande quantidade de iniciadorquando a combinação de iniciadores é altamente heterogênea, como cadaseqüência é representada por apenas uma pequena fração das moléculas dacombinação, e quantidades se tornam limitantes nos ciclos de amplificaçãoposteriores. Uma mistura de reação típica inclui: 2μ1 de DNA, 25 pmol deiniciador de oligonucleotídeo, 2,5 μl de IOX tampão 1 de PCR (Perkin-Elmer,Foster City, CA), 0,4 μl de 1,25 μΜ de dNTP, 0,15 μl (ou 2,5 unidades) deDNA polimerase Taq (Perkin Elmer, Foster City, CA) e água deionizada paraum volume total de 25 μl. Óleo mineral é revestido e o PCR é realizadousando um ciclador térmico programável. 0 comprimento e temperatura decada etapa de um ciclo de PCR, assim como o número de ciclos, é ajustadoem conformidade com os requerimentos de estringência em efeito.Temperatura e momento de anelamento são ambos determinados pelaeficiência com a qual um iniciador é esperado para se anelar a um modelo e ograu de desigualdade que é para ser tolerado; obviamente, quando moléculasde ácido nucleico são simultaneamente amplificadas e mutagenizadas,desigualdade é requerida, pelo menos no primeiro ciclo de síntese. Acapacidade de otimizar a estringência de condições de anelamento deiniciador está bem dentro do conhecimento de alguém de moderado verso natécnica. Uma temperatura de anelamento de entre 30 0C e 72 0C é usada.Desnaturação inicial das moléculas modelo normalmente ocorre em entre92°C e 99°C por 4 minutos, seguido por 20-40 ciclos consistindo dedesnaturação (94-99°C por 15 segundos a 1 minuto), anelamento (temperaturadeterminada como discutido acima; 1-2 minutos), e extensão (72°C por 1-5minutos, dependendo do comprimento do produto amplificado). Extensão,final é geralmente por 4 minutos a 72°C, e pode ser seguida por uma etapaindefinida (0-24 horas) a 4°C.

Combinando Domínios Variáveis Únicos

Domínios úteis na invenção, uma vez selecionados, podem sercombinados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindométodos covalentes e não covalentes. Métodos preferidos incluem o uso deligantes de polipeptídeo, como descrito, por exemplo, em conexão commoléculas de scFv (Bird et al., (1988) Science 242:423-426). Discussão deligantes adequados é fornecida em Bird et al. Science 242, 423-426; Hudsonet al, journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudson et al, Proc NatAcad Sci USA 85, 5879-5883. Ligantes preferivelmente são flexíveis,permitindo que os dois domínios únicos interajam. Um exemplo de ligante éum ligante (Gly4 Ser)n, onde n=l a 8, eg, 2, 3, 4, 5 ou 7. Os ligantes usadosem diacorpos, que são menos flexíveis, também podem ser empregados(Holliger et al, (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448). Em uma forma derealização, o ligante empregado não é uma região de dobradiça deimunoglobulina.

Domínios variáveis podem ser combinados usando métodosoutros do que ligantes. Por exemplo, o uso . de pontes dissulfeto, fornecidasatravés de resíduos de cisteína naturalmente ocorrentes ou engenheirados,pode ser explorado para estabilizar dímeros Vh-Vh,Vl-Vl ou Vh-Vl (Reiter etal, (1994) Protein Eng. 7:697-704) ou remodelando a interface entre osdomínios variáveis para melhorar o "ajuste" e assim a estabilidade deinteração (Ridgeway et al, (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhu et al., (1997)Protein Science 6:781-788). Outras técnicas para reunir ou estabilizardomínios variáveis de imunoglobulinas, e em particular domínios Vh deanticorpo, podem ser empregadas como apropriado.

Caracterização de Ligantes

A ligação de um ligante (e.g., monômero dAb, ligante de duplaespecificidade) a seu(s) antígeno(s) ou epítopo(s) específico(s) pode sertestada por métodos que serão familiares para aqueles versados na técnica eincluem ELISA. Em uma forma de realização preferida da invenção ligação é testada usando ELISA de fago monoclonal. ELISA de fago pode ser realizadode acordo com qualquer procedimento adequado: um protocolo exemplar éapresentado abaixo.

Populações de fagos produzidos a cada ciclo de seleção podemser selecionadas para ligação por ELISA para o antígeno ou epítoposelecionado, para identificar anticorpos de fagos "policlonais". Fago decolônias bacterianas infectadas únicas destas populações pode então serselecionado por ELISA para identificar anticorpos de fagos "monoclonais".Também é desejável selecionar fragmentos de anticorpos solúveis paraligação a antígeno ou epítopo, e isto também pode ser realizado por ELISAusando reagentes, por exemplo, contra uma etiqueta C ou N-terminal (vejapor exemplo Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 ereferências citadas neste).

A diversidade dos anticorpos monoclonais de fagoselecionados também pode ser verificada por eletroforese em gel de produtosde PCR (Marks et ai. 1991, acima; Nissim et al. 1994 acima), sondando(Tomlinson et al, 1992) J. Mol. Biol. 227, 776) ou por seqüenciamento do DNA de vetor.

Estrutura de Ligantes

No caso em que os domínios variáveis são selecionados apartir de repertórios de gene V selecionados por exemplo usando tecnologiade apresentação em fago como descrito neste lugar, então estes domíniosvariáveis compreendem uma região de armação universal, de forma que elespodem ser reconhecidos por um ligante genérico específico como definidoneste lugar. O uso de armações universais, ligantes genéricos e ossemelhantes é descrito em W099/20749.

Onde repertórios de gene V são usados variação em seqüênciade polipeptídeos é preferivelmente localizada dentro das alças estruturais dosdomínios variáveis. As seqüências de polipeptídeos de cada domínio variávelpodem ser alteradas por embaralhamento de DNA ou por mutação a fim derealçar a interação de cada domínio variável com seu par complementar.Embaralhamento de DNA é conhecido na técnica e pensado, por exemplo, porStemmer, 1994, Nature 370: 389-391 e Patente U.S. 6.297.053, ambos osquais são incorporados neste lugar por referência. Outros métodos demutagênese são bem conhecidos por aqueles de verso na técnica.

Em geral, moléculas de ácido nucleico e construções de vetorrequeridas para seleção, preparação e formatação de ligantes podem serconstruídas e manipuladas como descrito em manuais de laboratório padrão,tal como Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor, USA.

A manipulação de ácido nucleicos úteis na presente invenção étipicamente realizada em vetores recombinantes.

Como usado neste lugar, vetor se refere a um elementodiscreto que é usado para introduzir DNA heterólogo em células para aexpressão e/ou replicação deste. Métodos pelos quais selecionar ou construire, subseqüentemente, usar tais vetores são bem conhecidos por alguém dehabitual verso na técnica. Numerosos vetores são disponíveis publicamente,incluindo plasmídeos bacterianos, bacteriófagos, cromossomos artificiais evetores epissomais. Tais vetores podem ser usados para clonagem simples emutagênese; alternativamente vetor de expressão de gene é empregado. Umvetor de uso de acordo com a invenção pode ser selecionado para acomodaruma seqüência de codificação de polipeptídeo de um tamanho desejado,tipicamente de 0,25 quilobase (kb) a 40 kb ou mais em comprimento. Umacélula hospedeira adequada é transformada com o vetor depois demanipulações de clonagem in vitro. Cada vetor contém vários componentes,funcionais, que geralmente incluem um sítio de clonagem (ou "poliligante"),uma origem de replicação e pelo menos um gene marcador selecionável. Sevetor dado é um vetor de expressão, ele possui adicionalmente um ou maisdos seguintes: elemento estimulador, promotor, terminação de transcrição eseqüências sinais, cada um posicionado na vizinhança do sítio de clonagem,de forma que eles são operavelmente ligados ao gene codificando um ligantede acordo com a invenção.

Ambos vetores de clonagem e de expressão geralmentecontêm seqüências de ácidos nucleicos que possibilitam que o vetor sereplique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Tipicamente emvetores de clonagem, esta seqüência é uma que possibilita que o vetor sereplique independentemente do DNA cromossômico do hospedeiro e incluiorigens de replicação ou seqüências que se replicam autonomamente. Taisseqüências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, levedura evírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para amaioria das bactérias Gram-negativas, a origem de plasmídeo 2 mícrons éadequada para levedura, e várias origens virais (e.g. SV 40, adenovírus) sãoúteis para vetores de clonagem em células de mamífero. Geralmente, a origemde replicação não é necessária para vetores de expressão de mamífero amenos que estes sejam usados em células de mamífero capazes de replicaraltos níveis de DNA, tal como células COS.

Vantajosamente, um vetor de clonagem ou de expressão podeconter um gene de seleção também referido como marcador selecionável. Estegene codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento decélulas hospedeiras transformadas crescidas em um meio de cultura seletivo.Células hospedeiras não transformadas com o vetor contendo o gene deseleção portanto não irão sobreviver no meio de cultura. Genes de seleçãotípicos codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos e outrastoxinas, e.g. ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina,.complementam deficiências auxotróficas, ou fornecem nutrientes críticos nãodisponíveis nos meios de crescimento.

Uma vez que a replicação de vetores codificando um ligantede acordo com a presente invenção é mais convenientemente realizada em E.coli, um marcador selecionável de E. coli, por exemplo, o gene de β-lactamase que confere resistência ao antibiótico ampicilina, é de uso. Estespodem ser obtidos a partir de plasmídeos de E. coli, tal como pBR322 ou umplasmídeo pUC tal como pUC18 ou pUC19.

Vetores de expressão normalmente contêm um promotor que éreconhecido pelo organismo hospedeiro e é operavelmente ligado à seqüênciade codificação de interesse. Um tal promotor pode ser induzível ouconstitutivo. O termo "operavelmente ligado" se refere a uma justaposiçãocaracterizada pelo fato de que os componentes descritos estão em uma relaçãopermitindo que eles funcionem de sua maneira pretendida. Uma seqüência decontrole "operavelmente ligada" a uma seqüência de codificação é ligada deuma tal maneira que expressão da seqüência de codificação é atingida sobcondições compatíveis com as seqüências de controle.

Promotores adequados para uso com hospedeiros procarióticosincluem, por exemplo, os sistemas de promotor de β-lactamase e lactose,fosfatase alcalina, o sistema de promotor de triptofano (trp) e promotoreshíbridos tal como o promotor tac. Promotores para uso em sistemasbacterianos também irão geralmente conter uma seqüência de Shine-Delgarnooperavelmente ligada à seqüência de codificação.

Os vetores preferidos são vetores de expressão quepossibilitam a expressão de uma seqüência de nucleotídeos correspondendo aum membro de biblioteca de polipeptídeo. Assim, seleção com o primeiroe/ou segundo antígeno ou epítopo pode ser realizada por propagação separadae expressão de um clone único expressando o membro de biblioteca depolipeptídeo ou por uso de qualquer sistema de apresentação de seleção.Como descrito acima, o sistema de apresentação de seleção preferido émanifestação de bacteriófago. Assim, vetores de fago ou fagomídeo podemser usados, eg pITl ou pIT2. Seqüências líder úteis na invenção incluem pelB,stll, ompA, phoA, bla e pelA. Um exemplo são vetores de fagomídeo que têmuma origem de replicação de E. coli. (para replicação de dupla fita) e tambémuma origem de replicação de fago (para produção de DNA de fita simples). Amanipulação e expressão de tais vetores são bem conhecidas na técnica(Hoogenboom and Winter (1992) acima; Nissim et al.. (1994) acima).Resumidamente, o vetor contém um gene de β-lactamase para conferirseletividade no fagomídeo e um promotor Iac anterior a uma gaveta deexpressão que consiste (N' a C terminal) de uma seqüência líder pelB (quedirige o polipeptídeo expresso para o espaço periplásmico), um sítio declonagem múltipla (para clonar uma versão de nucleotídeo do membro debiblioteca), opcionalmente, uma ou mais etiquetas de peptídeo (paradetecção), opcionalmente, um ou mais códons de parada TAG e a proteínapIII de fago. Assim, usando várias linhagens supressoras e não supressoras deE. coli e com a adição de glicose, isopropil tio-p-D-galactosídeo (IPTG) ouum fago ajudante, tal como VCS Ml3, o vetor é capaz de replicar como umplasmídeo sem nenhuma expressão, produzir .grandes quantidades do membrode biblioteca de polipeptídeo apenas ou produzir fago, alguns dos quaiscontêm pelo menos uma cópia da fusão de polipeptídeo-plll em suasuperfície.

Construção de vetores codificando ligantes de acordo com ainvenção emprega técnicas de ligação convencionais. Vetores isolados oufragmentos de DNA são clivados, costurados, e religados na forma desejadapara gerar o vetor requerido. Se desejado, análise para confirmar que asseqüências corretas estão presentes no vetor construído pode ser realizada deuma maneira conhecida. Métodos adequados para construir vetores deexpressão, preparar transcritos in vitro, introduzir DNA em célulashospedeiras, e realizar análises para verificar expressão e função sãoconhecidos por aqueles versados na técnica. A presença de uma seqüência degenes em uma amostra é detectada, ou sua amplificação e/ou expressãoquantificada por métodos convencionais, tal como análise Southern ouNorthern, Western blotting, dot blotting de DNA, RNA ou proteína,hibridização em situ, imunocitoquímica ou análise de seqüência de moléculasde ácido nucleico ou proteína. Aqueles versados na técnica irão prontamentecontemplar como estes métodos podem ser modificados, se desejado.Esqueletos

Esqueletos podem ser baseados em moléculas deimunoglobulina ou podem não ser imunoglobulina em origem como expostoacima. Esqueletos de imunoglobulinas preferidos como definido neste lugarincluem quaisquer um ou mais daqueles selecionados a partir dos seguintes:uma molécula de imunoglobulina compreendendo pelo menos (i) o domínioCL (subclasse kappa ou lambda) de um anticorpo; ou (ii) o domínio CHl deuma cadeia pesada de anticorpo; uma molécula de imunoglobulinacompreendendo os domínios CHl e CH2 de uma cadeia pesada de anticorpo;

uma molécula de imunoglobulina compreendendo os domínios CHI, CH2 eCH3 de uma cadeia pesada de anticorpo; ou .qualquer do subconjunto (ii) emconjunção com o domínio CL (subclasse kappa ou lambda) de um anticorpo.Um domínio de região de dobradiça também pode estar incluído. Taiscombinações de domínios podem, por exemplo, mimetizar anticorposnaturais, tal como IgG ou IgM, ou fragmentos destes, tal como moléculas Fv,scFv, Fab ou F(ab')2. Aqueles versados na técnica estarão cientes que esta listanão é pretendida para ser exaustiva.Armações protéicas

Cada domínio de ligação de epítopo compreende uma armaçãoprotéica e um ou mais CDRs que estão envolvidos na interação específica dodomínio com um ou mais epítopos. Vantajosamente, um domínio de ligação,de epítopo de acordo com a presente invenção compreende três CDRs.Armações protéicas adequadas incluem qualquer daquelas selecionadas apartir do grupo consistindo das seguintes: aquelas baseadas em domínios deimunoglobulina, aquelas baseadas em fibronectina, aquelas baseadas emaficorpos, aquelas baseadas em CTLA4, aquelas baseadas em chaperonas talcomo GroEL, aquelas baseadas em lipocalina e aquelas baseadas nosreceptores Fc bacterianos SpA e SpD. Aqueles versados na técnica irãoreconhecer que esta lista não é pretendida para ser exaustiva.Armações para uso na Construção de LigantesSeleção da Conformação da Cadeia Principal

Os membros da superfamília de imunoglobulina compartilhamtodos uma dobra similar para sua cadeia de polipeptídeo. Por exemplo,embora anticorpos sejam altamente diversos em termos de sua seqüênciaprimária, comparação de seqüências e estruturas cristalográficas revelou que,ao contrário de expectativa, cinco das seis alças de ligação de antígeno deanticorpos (Hl, H2, LI, L2, L3) adotaram um número limitado deconformações de cadeia principal, ou estruturas canônicas (Chothia and Lesk(1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877).Análise de comprimentos de alças e resíduos chave possibilitaram portantopredição das conformações da cadeia principal de Hl, H2, LI, L2 e L3encontradas na maioria de anticorpos humanos (Chothia et al. (1992) Mol.Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al.(1996) J. Mol. Biol., 264: 220). Embora a região H3 seja muito mais diversaem termos de seqüência, comprimento e estrutura (devido ao uso desegmentos D), ela também forma um número limitado de conformações dacadeia principal para comprimentos de alças curtos que dependem docomprimento e da presença de resíduos particulares, ou tipos de resíduo, emposições chave na alça e na armação de anticorpo (Martin et al. (1996) J. MoLBiol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBSLetters, 399: 1).

Podem ser projetadas bibliotecas de ligantes e/ou domínios nasquais certos comprimentos de alças e resíduos chave foram escolhidos paraassegurar que a conformação de cadeia principal dos membros sejaconhecida. Vantajosamente, estas são conformações reais de moléculas dasuperfamília de imunoglobulina encontradas na natureza, para minimizar aschances que elas não sejam funcionais, como discutido acima. Segmentos degene V de linhagem germinativa servem como uma armação básica adequadapara construir bibliotecas de anticorpo ou receptor de célula T; outrasseqüências também são de uso. Variações podem ocorrer em uma baixafreqüência, de forma que um pequeno número de membros funcionais podepossuir uma conformação de cadeia principal alterada, o que não afeta suafunção.

Teoria de estrutura canônica também é de uso para verificar onúmero de conformações da cadeia principal diferentes codificadas porligantes, para prever a conformação de cadeia principal baseado emseqüências de ligantes e para escolher resíduos para diversificação que nãoafetam a estrutura canônica. É conhecido que, no domínio Vk humano, a alçaLl pode adotar uma de quatro estruturas canônicas, a alça L2 tem umaestrutura canônica única e que 90% de domínios Vk humanos adotam uma dequatro ou cinco estruturas canônicas para a alça L3 (Tomlinson et al. (1995)acima); assim, no domínio VK apenas, estruturas canônicas diferentes podemse combinar para criar uma variação de conformações da cadeia principaldiferentes. Dado que o domínio νλ codifica uma variação diferente deestruturas canônicas para as alças LI, L2 e L3 e que domínios Vk e νλ podemparear com qualquer domínio VH que pode codificar diversas estruturascanônicas para as alças Hl e H2, o número de combinações de estruturacanônica observado para estas cinco alças é muito grande. Isto implica que a geração de diversidade na conformação de cadeia principal pode ser essencialpara a produção de uma ampla variação de especificidades de ligação..Entretanto, ao construir uma biblioteca de anticorpo baseado em uma únicaconformação de cadeia principal conhecida foi encontrado, ao contrário deexpectativa, que diversidade na conformação de cadeia principal não é requerida para gerar diversidade suficiente para atingir substancialmentetodos os antígenos. Ainda mais surpreendente, a conformação de cadeiaprincipal única não precisa ser uma estrutura de consenso - uma únicaconformação naturalmente ocorrente pode ser usada como a base para umabiblioteca inteira. Assim, em um aspecto preferido, os ligantes de duplaespecificidade da invenção possuem uma única conformação de cadeiaprincipal conhecida.

A conformação de cadeia principal única que é escolhida épreferivelmente corriqueira entre moléculas do tipo da superfamília deimunoglobulina em questão. Uma conformação é corriqueira quando umnúmero significante de moléculas naturalmente ocorrentes é observadoadotando ela. Por conseguinte, em um aspecto preferido da invenção, aocorrência natural das diferentes conformações da cadeia principal para cadaalça de ligação de um domínio de imunoglobulina é consideradaseparadamente e então é escolhido um domínio variável naturalmenteocorrente que possui a combinação desejada de conformações da cadeiaprincipal para as diferentes alças. Se nenhum está disponível, o equivalentemais próximo pode ser escolhido. E preferível que a combinação desejada deconformações da cadeia principal para as diferentes alças seja criada porseleção de segmentos de gene de linhagem germinativa que codificam asconformações da cadeia principal desejadas. É mais preferível, que ossegmentos de gene de linhagem germinativa selecionados sejamfreqüentemente expressos na natureza, e ainda mais preferível que eles sejamos mais freqüentemente expressos de todos os segmentos de gene de linhagemgerminativa naturais.

Ao projetar ligantes (e.g., dAbs) ou bibliotecas destes a.incidência das diferentes conformações da cadeia principal para cada uma dasseis alças de ligação de antígeno pode ser considerada separadamente. ParaHl, H2, LI, L2 e L3, é escolhida uma dada conformação que é adotada porentre 20% e 100% das alças de ligação de antígeno de moléculas naturalmenteocorrentes. Tipicamente, sua incidência observada está acima de 35% (i.e.entre 35% e 100%) e, idealmente, acima de 50% ou mesmo acima de 65%.Uma vez que a vasta maioria de alças H3 não tem estruturas canônicas, épreferível selecionar uma conformação de cadeia principal que sejacorriqueira entre aquelas alças que manifestam estruturas canônicas. Paracada uma das alças, a conformação que é observada mais freqüentemente norepertório natural é portanto selecionada. Em anticorpos humanos, asestruturas canônicas (CS) mais populares para cada alça são como segue: Hl -CS 1 (79% do repertório expresso), H2 - CS 3 (46%), Ll - CS 2 de Vk (39%),L2 - CS 1 (100%), L3 - CS 1 de Vk (36%) (cálculo assume uma proporção deκ:λ de 70:30, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48:133). Para alças H3 que têm estruturas canônicas, um comprimento de CDR3(Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological inferest, U.S.Department of Health and Human Services) de sete resíduos com uma pontede sal de resíduo 94 a resíduo 101 parece ser o mais comum. Existem pelomenos 16 seqüências de anticorpo humano na biblioteca de dados de EMBLcom o comprimento de H3 e resíduos chave requeridos para formar estaconformação e pelo menos duas estruturas cristalográficas no banco de dadosde proteína que podem ser usadas como uma base para modelagem deanticorpo (2cgr e ltet). Os segmentos de gene de linhagem germinativa maisfreqüentemente expressos que têm esta combinação de estruturas canônicassão o segmento VH 3-23 (DP-47), o segmento JH JH4b, o segmento Vk02/012 (DPK9) e o segmento Jk JO. Segmentos VH DP45 e DP38 tambémsão adequados. Estes segmentos podem portanto ser usados em combinaçãocomo uma base para construir uma biblioteca com a conformação de cadeiaprincipal única desejada.

Alternativamente, ao invés de escolher a conformação decadeia principal única baseado na ocorrência natural das diferentesconformações da cadeia principal para cada uma das alças de ligação emisolamento, a ocorrência natural de combinações de conformações de cadeiaprincipal é usada como a base para escolher a conformação de cadeiaprincipal única. No caso de anticorpos, por exemplo, a ocorrência natural decombinações de estrutura canônica para quaisquer duas, três, quatro, cinco oupara todas as seis alças de ligação de antígeno pode ser determinada. Aqui, épreferível que a conformação escolhida seja corriqueira em anticorposnaturalmente ocorrentes e mais preferível que observada o maisfreqüentemente no repertório natural. Assim, em anticorpos humanos, porexemplo, quando combinações naturais das cinco alças de ligação deantígeno, Hl, H2, LI, L2 e L3, são consideradas, a combinação mais freqüentede estruturas canônicas é determinada e então combinada com a conformaçãopopular da alça H3, como uma base para escolher a conformação de cadeiaprincipal única.

Diversificação da Seqüência Canônica

Tendo selecionado diversas conformações da cadeia principalconhecidas ou, preferivelmente uma única conformação de cadeia principalconhecida, ligantes (e.g., dAbs) ou bibliotecas para uso na invenção podemser construídos através da variação do sítio de ligação da molécula a fim degerar um repertório com diversidade estrutural e/ou funcional. Isto significaque variantes são geradas de forma que elas possuam diversidade suficienteem sua estrutura e/ou em sua função de forma que elas sejam capazes defornecer uma variação de atividades.

A diversidade desejada é tipicamente gerada através davariação da molécula selecionada em uma ou mais posições. As posições aserem modificadas podem ser escolhidas ao aleatório ou são preferivelmente.selecionadas. A variação pode então ser atingida ou por randomização,durante a qual o aminoácido residente é reposto por qualquer aminoácido ouanálogo deste, natural ou sintético, produzindo um grande número devariantes ou pela reposição do aminoácido residente com um ou mais de umsubconjunto definido de aminoácidos, produzindo um número mais limitadode variantes.

Vários métodos foram relatados para introduzir taldiversidade. PCR sujeita a erro (Hawkins et al. (1992) J. MoL Biol., 226:889), mutagênese química (Deng et al. (1994) J. Biol Chem., 269: 9533) oulinhagens mutadoras bacterianas (Low et al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359)podem ser usados para introduzir mutações aleatórias nos genes quecodificam a molécula. Métodos para mutar posições selecionadas também sãobem conhecidos na técnica e incluem o uso de oligonucleotídeos não pareadosou oligonucleotídeos degenerados, com ou sem o uso de PCR. Por exemplo,diversas bibliotecas de anticorpo sintético foram criadas dirigindo mutaçõespara as alças de ligação de antígeno. A região H3 de um Fab de ligação detoxóide de tétano humano foi randomizada para criar uma variação de novasespecificidades de ligação (Barbas et aí. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA,89: 4457). Regiões H3 e L3 aleatórias ou semi-aleatórias foram anexadas asegmentos de gene V de linhagem germinativa para produzir bibliotecasgrandes com regiões de armação imutadas (Hoogenboom & Winter (1992) J.MoL Biol, 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4457; Nissim et ai (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al (1994) EMBO J.,13: 3245; De Kruif et al. (1995) MoL Biol1 248: 97). Tal diversificação foiestendida para incluir algumas ou todas as outras alças de ligação de antígeno(Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al (1995)Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, W097/08320, acima).

Uma vez que randomização de alça tem o potencial para criaraproximadamente mais do que IO13 estruturas para H3 apenas e um número,similarmente grande de variantes para as outras cinco alças, não é viável usartecnologia de transformação atual ou mesmo usar sistemas livres de célulapara produzir uma biblioteca representando todas as combinações possíveis.Por exemplo, em uma das maiores bibliotecas construídas até a data, 6 χ IO10anticorpos diferentes, que é apenas uma fração da diversidade potencial parauma biblioteca deste modelo, foram gerados (Griffiths et al. (1994) acima).

Preferivelmente, apenas os resíduos que estão diretamenteenvolvidos em criar ou modificar a função desejada da molécula sãodiversificados. Para muitas moléculas, a função será se ligar a um alvo eportanto diversidade deve ser concentrada no sítio de ligação alvo, enquantoevitando mudar resíduos que são cruciais para o empacotamento geral damolécula ou para manter a conformação de cadeia principal escolhida.Diversificação da seqüência canônica como se Aplica a Domínios deAnticorpo

No caso de ligantes baseados em anticorpo (e.g., dAbs), o sítiode ligação para o alvo é mais freqüentemente o sítio de ligação de antígeno.Assim, preferivelmente apenas aqueles resíduos no sítio de ligação deantígeno são variados. Estes resíduos são extremamente diversos no repertóriode anticorpo humano e são conhecidos por fazerem contatos em complexos deanticorpo/antígeno de alta resolução. Por exemplo, em L2 é conhecido queposições 50 e 53 são diversas em anticorpos naturalmente ocorrentes e sãoobservadas fazendo contato com o antígeno. Em contraste, a abordagemconvencional teria sido diversificar todos os resíduos na Região deDeterminação de Complementaridade (CDRl) correspondente como definidopor Kabat et ai. (1991, acima), alguns sete resíduos comparados com os doisdiversificados na biblioteca para uso de acordo com a invenção. Istorepresenta uma melhora significante em termos da diversidade funcionalrequerida para criar uma variação de especificidades de ligação de antígeno.

Na natureza, diversidade de anticorpo é o resultado de dois.processos: recombinação somática de segmentos de gene V, D e J delinhagem germinativa para criar um repertório primário normal (tambémchamado linhagem germinativa e diversidade juncional) e hipermutaçãosomática dos genes V rearranjados resultantes. Análise de seqüências deanticorpo humano mostrou que diversidade no repertório primário é focada nocentro do sítio de ligação de antígeno ao passo que hipermutação somáticaespalha diversidade para regiões na periferia do sítio de ligação de antígenoque são altamente conservadas no repertório primário (veja Tomlinson et al.(1996) J. Mol. Biol., 256: 813). Esta complementaridade provavelmenteevoluiu como uma estratégia eficiente para buscar espaço de seqüência e,embora aparentemente única para anticorpos, ela pode ser facilmente aplicadaa outros repertórios de polipeptídeos. Os resíduos que são variados são umsubconjunto daqueles que formam o sítio de ligação para o alvo. Conjuntosdiferentes (incluindo sobreposição) de resíduos no sítio de ligação de alvo sãodiversificados em diferentes estágios durante seleção, se desejado.

No caso de um repertório de anticorpo, um repertório 'normal'inicial pode ser criado onde alguns, mas não todos, os resíduos no sítio deligação de antígeno são diversificados. Como usado neste lugar nestecontexto, o termo "normal" se refere a moléculas de anticorpo que não têmnenhum alvo pré-determinado. Estas moléculas parecem aquelas que sãocodificadas pelos genes de imunoglobulina de um indivíduo que não passoupor diversificação imune, como é o caso de indivíduos fetais e recém-nascidos, cujos sistemas imunes ainda não foram desafiados por uma amplavariedade de estímulos antigênicos. Este repertório é então selecionado contrauma variação de antígenos ou epítopos. Se requerido, diversidade adicionalpode então ser introduzida fora da região diversificada no repertório inicial.Este repertório maduro pode ser selecionado para função, especificidade ou afinidade modificada.

Repertórios normais de domínios de ligação para a construçãode ligantes nos quais alguns ou todos os resíduos no sítio de ligação deantígeno são variados são conhecidos na técnica. (Veja, WO 2004/058821,WO 2004/003019, e WO 03/002609). A biblioteca "primária" mimetiza orepertório primário natural, com diversidade restrita a resíduos no centro dosítio de ligação de antígeno que são diversos nos segmentos de gene V delinhagem germinativa (diversidade de linhagem germinativa) oudiversificados durante o processo de recombinação (diversidade juncional).Aqueles resíduos que são diversificados incluem, mas não são limitados a,HSO, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91,L92, L93, L94 e L96. Na biblioteca "somática", diversidade é restrita aresíduos que são diversificados durante o processo de recombinação(diversidade juncional) ou são altamente mutados somaticamente. Aquelesresíduos que são diversificados incluem, mas não são limitados a: H31, H33,Η35, Η95,1-196, Η97, Η98, L30, L31, L32, L34 e L96. Todos os resíduoslistados como adequados para diversificação nestas bibliotecas sãoconhecidos por fazerem contatos em um ou mais complexos anticorpo-antígeno. Uma vez que em ambas bibliotecas, nem todos os resíduos no sítiode ligação de antígeno são variados, diversidade adicional é incorporadadurante seleção por variação dos resíduos remanescentes, se assim fordesejado. Deve ser perceptível para alguém versado na técnica que qualquersubconjunto de qualquer destes resíduos (ou resíduos adicionais quecompreendem o sítio de ligação de antígeno) podem ser usados para adiversificação inicial e/ou subseqüente do sítio de ligação de antígeno.

Na construção de bibliotecas para uso na invenção,diversificação de posições escolhidas é tipicamente atingida no nível de ácidonucleico, por alteração da seqüência de codificação que especifica a seqüênciado polipeptídeo de forma que um número de possíveis aminoácidos (todos os20 ou um subconjunto destes) pode ser incorporado naquela posição. Usandoa nomenclatura IUPAC, o códon mais versátil é NNK, que codifica todos os.aminoácidos assim como o códon de parada TAG. O códon NNK épreferivelmente usado a fim de introduzir a diversidade requerida. Outroscódons que atingem os mesmos fins também são de uso, incluindo o códonNNN, que leva à produção dos códons de parada adicionais TGA e TAA.

Uma característica de diversidade de cadeia lateral no sítio deligação de antígeno de anticorpos humanos é uma tendência pronunciada quefavorece certos resíduos de aminoácidos. Se a composição de aminoácidosdas dez posições mais diversas em cada uma das regiões VH, Vk e νλ sãosomadas, mais do que 76% da diversidade de cadeia lateral vem de apenassete resíduos diferentes, sendo estes, serina (24%), tirosina (14%), asparagina(11%), glicina (9%), alanina (7%), aspartato (6%) e treonina (6%). Atendência para resíduos hidrofílicos e resíduos pequenos que podem fornecerflexibilidade de cadeia principal provavelmente reflete a evolução desuperfícies que são pré-dispostas a se ligarem a uma ampla variação antígenosou epítopos e pode ajudar a explicar a promiscuidade requerida de anticorposno repertório primário.

Uma vez que é preferível mimetizar esta distribuição deaminoácidos, a distribuição de aminoácidos nas posições a serem variadaspreferivelmente mimetiza aquela vista no sítio de ligação de antígeno deanticorpos. Tal tendência na substituição de aminoácidos que permite seleçãode certos polipeptídeos (não apenas polipeptídeos de anticorpo) contra umavariação de antígenos alvo é facilmente aplicada a qualquer repertório depolipeptídeo. Existem vários métodos para tendenciar a distribuição deaminoácidos na posição a ser variada (incluindo o uso de mutagênese de tri-nucleotídeo, veja W097/08320), dos quais o método preferido, devido àfacilidade de síntese, é o uso de códons degenerados convencionais.Comparando o perfil de aminoácido codificado por todas as combinações decódons degenerados (com degenerescência única, dupla, tripla e quádrupla emproporções iguais em cada posição) com o uso de aminoácido natural épossível calcular o códon mais representativo. Os códons (AGT)(AGC)T,(AGT)(AGC)C e (AGT)(AGC)(CT).- isto é, D VT, DVC e D VY,respectivamente usando nomenclatura IUPAC - são aqueles mais próximos doperfil de aminoácido desejado: eles codificam 22% de serina e 11 % detirosina, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina e cisteína.Preferivelmente, portanto, bibliotecas são construídas usando ou o códonDVT, DVC ou DVY em cada uma das posições diversificadas.

Ensaio de Ligação de Receptor

Antagonistas de TNFRl que inibem ligação de TNFa aTNFRl podem ser identificados em um ensaio de ligação de receptoradequado. Resumidamente, placas Maxisorp são incubadas durante a noitecom 30mg/ml de anticorpo monoclonal de camundongo anti-humano Fc(Zymed, San Francisco, USA). Os poços são lavados com salina tamponadacom fosfato (PBS) contendo 0,05% de Tween-20 e então bloqueados com 1%de BSA em PBS antes de serem incubados com lOOng/ml de proteína defusão TNFR1-Fc (R&D Systems, Minneapolis, USA). Antagonistas deTNFR1 são misturados com TNF que foi adicionado aos poços lavados emuma concentração final de 10 ng/ml. Ligação de TNF é detectada com0,2mg/ml de anticorpo anti-TNF biotinilado (HyCult biotechnology, Uben,Netherlands) seguido por diluição de 1 em 500 de estreptavidina marcadacom peroxidase de raiz forte (Amersham Biosciences, UK) e então incubaçãocom substrato TMB (KPL, Gaithersburg, USA). A reação pode ser paradapela adição de HCl e a absorbância é lida em 450nm. Antagonistas deTNFRl que inibem ligação de TNFa a TNFRl levam a uma diminuição emligação de TNF e portanto uma diminuição em absorbância comparado com ocontrole único de TNF.

Ensaio de Citotoxicidade de L929

Antagonistas de TNFRl (e.g., ligantes, monômeros dAb)

podem ser identificados pela capacidade de inibir citotoxicidade induzida por.TNF em fibroblastos L929 de camundongo (Evans, T. (2000) MolecularBiotechnology 15, 243-248). Resumidamente, células L929 emplacadas emplacas de microtítulos são incubadas durante a noite com antagonistade TNFRl, 100 pg/ml de TNF e lmg/ml de actinomicina D (Sigma, Poole,UK). Então, viabilidade celular é medida por leitura de absorbância em490nm seguindo uma incubação com [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifeni 1 )-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (Promega, Madison,USA). Antagonistas de TNFRl irão inibir citotoxicidade e portanto produzirum aumento em absorbância comparado com controle único de TNF.Ensaio de IL-8 de HeLa

Antagonistas de TNFRl (e.g., ligantes, monômeros dAb)podem ser identificados pela capacidade de inibir secreção induzida por TNFde IL-8 por células HeLa humanas (método adaptado a partir daquele deAkeson, L. et al (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523,descrevendo a indução de IL-8 por IL-I em HUVEC; aqui observamosindução por TNF alfa humano e usamos células HeLa ao invés da linhagemde célula HUVEC). Resumidamente, células HeLa emplacadas em placas demicrotítulo foram incubadas durante a noite com antagonista de TNFR1 e300pg/ml de TNF. Após incubação o sobrenadante é aspirado fora das célulase concentração de IL-8 é medida usando um ELISA sanduíche (R&DSystems), ou outro método adequado. Antagonistas de TNFR1 inibemsecreção de IL-8, e menos IL-8 é detectada no sobrenadante comparado como controle único de TNF..

Ensaio de liberação de IL-8 de MRC-5

Antagonistas de TNFR1 humano podem ser identificadosusando o seguinte ensaio de célula MRC-5. O ensaio é baseado na indução desecreção de IL-8 por TNF em células MRC-5 e é adaptado a partir do métododescrito em Alceson, L. et al. Journal of Biological Chemistry 271:30517-30523 (1996), descrevendo a indução de IL-8 por IL-I em HUVEC..Resumidamente, células MRC-5 são emplacadas em placas de microtítulo eas placas foram incubadas durante a noite com antagonista de TNFRl e TNFahumano (300 pg/ml). Seguindo incubação, o sobrenadante de cultura éaspirado e a concentração de IL-8 no sobrenadante é medida através de umELISA sanduíche (R&D Systems), ou outro método adequado. Antagonistasde TNFR1 resultam em uma diminuição em secreção de IL-8 no sobrenadantecomparado com poços de controle que são incubados com apenas TNFa.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1. Antagonista de TNFR1 Localmente Administrado a Tecidopulmonar é eficaz em um modelo subcrônico de COPD em camundongosC57BL/6.

Neste estudo, um antagonista de TNFR1 (monômero dAb anti-TNFR1 (TAR2m21-23)) e um antagonista de TNF (ENBREL® (etanercept;Immunex Corporation)) foram administrados localmente ao pulmão poradministração intranasal 1 hora antes de cada exposição a ar ou fumaça detabaco (TS). Os efeitos em mudanças induzidas por TS em índicesinflamatórios pulmonares induzidos por exposições a TS por 11 diasconsecutivos foram avaliados 24 horas depois da exposição final. O compostoanti-TNF (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)) foi usado comoum controle. Um inibidor de fosfodiesterase 4 (PDE4) administradooralmente (BAY 19-8004; lirimilast) também foi administrado 1 hora antes dee 6 horas após exposição a TS em outro grupo como uma referência.Métodos

Substância de teste 1: ENBREL® (etanercept; Immunex

Corporation)

Substância de teste 2: DOMlm (monômero dAb anti-TNFRl(TAR2m21-23))

Substância de teste 3: BAY 19-8004 (inibidor de PDE4)

O veículo para substâncias 1 e 2 foi citrato de Sódio pH 6,0,100 mM de NaCl. O veículo para substância 3 foi 0,5% deCarboximetilcelulose (Sigma., Produto No. C-4888, Lote No. 87110036) emágua. Volume de dose é 5 ml/kg.

Camundongos fêmeas (C57BL/6) criados em completoisolamento e certificados livres de microorganismos específicos em recibo(16-20g) (Charles River) foram alojados em grupos de até 5 em gaiolas defundo sólido individualmente ventiladas (IVC) com cama de lascas de álamo.Ambientes (fluxo de ar, temperatura e umidade) dentro das gaiolas foramcontrolados pelo sistema IVC (Techniplast).Protocolos:

No. de Grupos: 7

Tamanho de grupo: η 10

Volume de Dose: 50 μΐ por camundongo para grupos 1 a 4 e 5ml/kg para grupos 1 a 7

Épocas de tratamento: Uma hora antes de TS ou exposição a arem dias Iall para grupos 1 a 4 e 1 hora antes de exposição e 6 horas apósexposição para grupos 5 a 7

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i.n., intranasal

p.o., per os (administração oral)

Exposição a TS

Camundongos (máximo 5 por câmara de exposição) foramexpostos a TS gerado por cigarros (Tipo 1121, fornecido por University ofKentucky). Exposição inicial foi a 4 cigarros em dia 1, e exposição foiaumentada para um máximo de cigarros/dia em dia 6/7. Exposiçãoposteriormente a Dia 11 foi de 6 cigarros/dia. A taxa de aumento foi reguladacom respeito à tolerância diária observada dos camundongos. 0 grupo decontrole de camundongos foi exposto a ar por uma duração de tempoequivalente em cada dia de exposição (controles de exposição a ar).Monitoramento de saúde:

Animais foram pesados antes do início do estudo, em dia 6 doprotocolo de exposição, e no momento de término. Todos os animais forammonitorados durante e depois de administração de cada substância de teste eexposição a TS.Procedimentos finais:

Animais foram sacrificados por overdose anestésica(pentobarbitona de Na, lOOmg/kg i.p.) como segue: Todos os grupos foramsacrificados 24 horas depois da 11a e exposição final a TS. Camundongos detodos os grupos de tratamento foram tratados como segue: Amostras desangue foram tiradas da artéria subclaviana, colocadas em um tubo demicrocentrífuga e deixadas para coagular durante a noite a 4°C. O coágulo foiremovido e o fluido remanescente foi centrifugado a 2900 rpm em umamicrocentrífuga por 6 minutos. O soro de sobrenadante resultante foidecantado e armazenado a -40°C para possível análise de PK. A lavagembronquioalveolar (BAL) foi realizada usando 0,4 ml de salina tamponada comfosfato (PBS). Células recuperadas da BAL foram quantificadas porcontagens celulares totais e diferenciais. Pulmões foram removidos,congelados instantaneamente em nitrogênio líquido e armazenados a -80°Cpara possível análise de PK.

Análise de Dados

Um teste para normalidade foi realizado nos dados. Se o testefoi positivo, então uma análise preliminar foi realizada usando um teste de.análise de variância de uma via (ANOVA de uma via) seguido por um testeposterior de comparação múltipla de Bonferroni para comparar controle egrupos de tratamento. Se os dados não foram normalmente distribuídos, entãoum teste de Kruskal-Wallis seguido por teste de comparações múltiplas deDunn foi empregado. Dados foram considerados significantes quando p<0,05.

Resultados

O grupo de controle TS/veículo teve infiltrados celulares nopulmão comparado com o grupo ar/veículo (veja Figura 1).

O grupo tratado exposto a TS e Substância de teste 1 (DOM1,dAb anti-TNFRl), mostrou infiltrados celulares significantemente reduzidosno pulmão comparado com os grupos tratados expostos a TS e de controle(Figura 1): 72% de inibição para células totais (p < 0,001), 74% paramacrófagos (p < 0,001), 82% para neutrófilos < 0,001), 86% para linfócitos (p< 0,05) e 55% para células epiteliais (p < 0,01). Uma redução de 82% emeosinófilos foi observada mas esta mudança não foi significante devido àvariabilidade em números de eosinófilos observada no estudo como um todo.

O grupo tratado com Substância de teste 3 (inibidor de PDE4,BAY 19-8004), mostrou infiltrados celulares significantemente reduzidos nopulmão comparado com o grupo de controle (Figura 1): 52% de inibição paracélulas totais (p < 0,01), 55% para macrófagos (p < 0,01), 55% paraneutrófilos (p < 0,001), 61% para linfócitos (p < 0,001) e 56% paraeosinófilos (p < 0,01). Uma redução de 46% em células epiteliais foiobservada mas esta mudança não foi significante.

Nenhuma redução significante em qualquer das populaçõescelulares foi observada no grupo exposto a TS e tratado com Substância deteste 1 (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation).

EXEMPLO 2. Antagonista de TNFRl Administrado Sistemicamente é eficazem um modelo subcrônico de COPD em camundongos C57BL/6.

Neste estudo, um antagonista de TNFRl (monômero dAb anti-TNFRl PEGuilado (TAR2m21-23 PEGuilado para aumentar tamanhohidrodinâmico e meia-vida no soro in vivo)) e um antagonista de TNF(ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)) foram administradossistemicamente por administração intraperitoneal a cada 48 horas começando24 horas antes da exposição inicial a TS. Os efeitos em mudanças induzidaspor TS em índices inflamatórios pulmonares induzidos por exposições a TSpor 11 dias consecutivos TS foram avaliados 24 h depois da exposição final.O composto anti-TNF (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation)) foiusado como um controle.

Métodos

Substância de teste 1: ENBREL® (etanercept; ImmunexCorporation)

Substância de teste 2: PEG DOMlm (monômero dAb anti-TNFRl (TAR2m21-23) PEGuilado com um polietilenoglicol de 40 kDa paraaumentar tamanho hidrodinâmico e prolongar meia-vida no soro in vivo).

O veículo para ambas as Substâncias de teste foi salina estéril,e o volume de dose para ambas as Substâncias de teste foi 10 ml/kg.

Camundongos fêmeas (C57BL/6) criados em completoisolamento e certificados livres de microorganismos específicos em recibo(16-20g) (Charles River) foram alojados em grupos de até 5 em gaiolas defundo sólido individualmente ventiladas (IVC) com cama de lascas de álamo.

Ambientes (fluxo de ar, temperatura e umidade) dentro das gaiolas foramcontrolados pelo sistema IVC (Techniplast).

Protocolos

No. de Grupos: 4

Tamanho de grupo: η = 10 para grupos 1 a 4

Volume de Dose: 10 ml/kg para grupos 1 a 4

Épocas de tratamento: A cada 48 horas começando 24 h antesda exposição inicial a TS. Doses subseqüentes a serem administradas 1 horaantes de exposição à TS

O protocolo de estudo é resumido em Tabela 2. Exposição àTS, monitoramento de saúde, procedimentos finais, e análise de dados foramrealizados como descrito em Exemplo 1.

Tabela 2.

<table>table see original document page 140</column></row><table>

i.p., intraperitoneal

Resultados

O grupo exposto a TS e tratado com Substância de teste 2(PEG DOMlm), mostrou infiltrados celulares significantemente reduzidos nopulmão comparado com os grupos tratados expostos a TS e tratados decontrole: 60% de inibição para células totais (FIG. 2), 63% para macrófagos,66% para células nucleares polimórficas, 78% para linfócitos e 65% paraeosinófilos. Uma redução de 40% em células epiteliais foi observada mas estamudança não foi significante.

Nenhuma redução significante em qualquer das populaçõescelulares foi observada em grupo exposto a TS e tratado com Substância deteste 1 (ENBREL® (etanercept; Immunex Corporation). Tratamento comENBREL® (etanercept; Immunex Corporation) mesmo levou a um aumentono número de total e células PMN no pulmão.

EXEMPLO 3. Farmacocinética de Agente que se liga a TNFRl depois deAdministração local para Tecido Pulmonar.

Neste estudo, um agente que se liga a TNFRl (monômero dAbanti-TNFRl (TAR2m21-23)) foi administrado localmente ao pulmão poradministração intranasal e farmacocinéticas do agente foram avaliadas.Métodos

DOMlm (monômero dAb anti-TNFRl (TAR2m21-23)) em20mM de citrato de sódio pH6,0, IOOmM de NaCl foi usado no estudo. Oagente diluidor foi citrato de sódio pH6,0, IOOmM de NaCl.Protocolos

Todos os animais foram administrados DOMlm poradministração intranasal no mesmo dia dentro de 1 a 2 horas de aquecimentoda solução.

Camundongos fêmeas (C57BL/6) criados em completoisolamento e certificados livres de microorganismos específicos em recibo(16-20g) (Charles River) foram alojados em grupos de até 5 em gaiolas defundo sólido individualmente ventiladas (IVC) com Cama de lascas deálamo. Ambientes (fluxo de ar, temperatura e umidade) dentro das gaiolasforam controlados pelo sistema IVC (Techniplast).No. de Grupos: 5

Tamanho de grupo: 3

Volume de Dose: 50μ1(25μ1/η3Γε)

Horas de sacrifício: 1 hora, 2 horas, 5 horas, 8 horas e 24 horasdepois de administração

O protocolo de estudo é resumido em Tabela 3.

Tabela 3.

<table>table see original document page 142</column></row><table>

i.n., intranasal

Monitoramento de saúde

Animais foram pesados antes do início do estudo. Todos osanimais foram monitorados durante e depois de administração de cadacomposto. Animais no grupo de 24 horas foram monitorados em intervalosregulares durante a noite.

Procedimentos finais

Animais foram sacrificados por overdose anestésica(pentobarbitona de Na, lOOmg/kg i.p.). Sangue foi tirado da artériasubclaviana, colocado em um tubo de microcentrífuga e permitido paracoagular durante a noite a 4°C. O coágulo foi removido e o fluidoremanescente centrifugado a 2900 rpm em uma microcentrífuga por 6minutos. Os sobrenadantes resultantes foram decantados, colocados em umtubo fresco, congelados e armazenados a -40°C antes de análise. Lavagembronquioalveolar (BAL) foi coletada usando 0,4 ml de salina tamponada comfosfato (PBS) que foi instilado e removido 3 vezes. A BAL foi centrifugada a2700 rpm em uma microcentrífuga por 6 minutos e o sobrenadante foiremovido e armazenado a -40°C antes de análise. O grânulo celular foiressuspenso em um volume adequado de PBS e uma contagem celular totalfeita usando um hemocitômetro. Lâminas de citospina foram preparadas parapermitir determinação diferencial de células. Os pulmões foram excisados,congelados instantaneamente e armazenados a -80°C antes de análise. Usandoum almofariz e pilão, pulmões foram pulverizados sob nitrogênio líquido edissolvidos em T-PER® Tissue Protein Extraction Reagent (Pierce) ehomogeneizados usando 40 batidas com um homogeneizador Dounce.

ELISA para detectar DOMlm

Uma placa de ensaio MAXISORP de 96 poços (Nunc) foirevestida durante a noite a 4°C com 100ul por poço de mTNFR/Fc (R&Dsystems) a 0,5 ug/ml em PBS. Poços foram lavados 3 vezes com 0,05% deTween/PBS e 3 vezes com PBS. 200μl por poço de 2% de BSA em PBS foiadicionado para bloquear a placa. Poços foram lavados e então 100μl deDOMlm padrão ou amostra foi adicionado. Placas foram incubadas for 1hora. Poços foram lavados, e DOMl ligado foi detectado com anti-VH degalinha (1/500) seguido por anti-conjugado IGY HRP de galinha (diluição de1/5000; Abeam). Placas são desenvolvidas com100ul de solução SureBlue 1-Component TMB MicroWell Peroxidase (KPL, Gaithersburg, USA) que foiadicionada a cada poço, e a placa foi deixada em temperatura ambiente até umsinal adequado ter se desenvolvido (-5 minutos). A reação foi parada pelaadição de HCl e a absorbância foi lida em 450 nm.

Resultados

O nível de DOMlm na BAL foi máximo em 1 hora e foi cercade 14 pg/ml (cerca de 3,5 μg em 0,25 ml de fluido de BAL). Isto significaque pelo menos 17% (3,5 μg de 20 μg total administrado) do materialadministrado esteve presente no compartimento bronquioalveolar do pulmão.Mais material pode estar presente nos tecidos circundantes mas este materialnão pode ser recuperado. Os níveis na BAL foram altos por um períodoprolongado de tempo e mostraram um declínio gradual por 24 horas (> 10-vezes de declínio depois de 24 horas).

Os níveis de DOMlm no tecido pulmonar foram relativamenteconstantes até 8 horas depois de administração, e foram indetectáveis 24 horasdepois de administração. Em 8 horas depois de administração os níveis notecido pulmonar foram cerca de 0,35 μg.. A porcentagem da dose totaladministrada presente no tecido pulmonar em 8 horas foi cerca de 2% (Dosetotal administrada foi 20 μg). Tomado junto com os níveis de BAL, o nívelmáximo de agente detectado no pulmão como um todo nos momentosavaliados foi pelo menos -20% da dose total administrada.

O nível de DOMlm no soro foi máximo em 1 hora (cerca de150 ng/ml) e declinou rapidamente. Em 5 horas depois de administração, osníveis no soro foram cerca de 70ng/ml, o que é equivalente a1 OOng/camundongo (1,5 ml de volume sangüíneo). A porcentagem da dosetotal administrada presente no soro 5 horas depois de administração foi cercade 0,5% (Dose total administrada foi 20 μg). DOMlm não foi detectável no.soro depois de 5 horas.

EXEMPLO 4. Reatividade Cruzada Com TNFRl de Macaco-caranguejeiro.

Uma linhagem celular de fibroblasto de pele de macaco-caranguejeiro (Macaca fascicularis) foi usada para testar reatividade cruzadade dAbs anti-TNFRl humano para TNFRl de macaco-caranguejeiro em umensaio de TNFRl baseado em célula. Reatividade cruzada para TNFRl demacaco-caranguejeiro é vantajosa porque estudos farmacocinéticos e detoxicologia podem ser realizados sem usar um agente substituto.

Método

Células de fibroblasto de pele de embrião de macaco-caranguejeiro (5x103 células por poço) foram incubadas com dAb anti-TNFRl humano por 1 hora a 37°C15% CO2. 200pg/ml (concentração final)de TNF humano foi então adicionado, e a placa foi incubada durante a noite a37°C/5% C02.

O ELISA DuoSet de IL-8 humana, foi usado para medir aconcentração de IL-8 humana nos sobrenadantes de cultura celular. O ensaiofoi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Uma placa de ensaioNunc Maxisorp de 96 poços foi revestida com 100μl de anticorpo de detecçãoa 4μg/ml em PBS. A placa foi incubada durante a noite a 4C. Entre cada etapade incubação as placas foram lavadas três vezes com 0,05% de tween/PBS etrês vezes com PBS usando um lavador de placa automatizado. 200ul porpoço de 1% de BSA/PBS foi adicionado e a placa foi incubada por 1 hora emtemperatura ambiente. 90μ1 de 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20 em PBSfoi adicionado a cada poço e 10μ1 de sobrenadante celular, uma curva padrãofoi incluída de IL-8 começando a 5ng/ml em 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20 em PBS. 100 μΐ de anticorpo de detecção foi adicionado a 20ng/ml(solução estoque diluída 1:180 em 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20 emPBS) a cada poço e as placas foram incubadas por 2h em temperaturaambiente. 100 μΐ de estreptavidina-HRP foi adicionado a cada poço (solução,estoque diluída 1:200 em 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20 em PBS). Asplacas foram incubadas por 20mins em temperatura ambiente. 100 μΐ desolução SureBlue I-Component TMB MicroWell Peroxidase foi adicionado acada poço e deixado em temperatura ambiente até que a cor azul fossedesenvolvida. A reação foi parada adicionando 100 μΐ de IM de ácidohidroclórico. A absorbância em uma placa foi lida em 450mn dentro de3 Omins.

Resultados/Conclusões

dAbs Anti-TNFRl humano na série TAR2h-131 são capazesde bloquear efetivamente liberação de IL-8 induzida por TNF por fibroblastosde macaco-caranguejeiro. Os dAbs TAR2h-131- 511 e TAR2h-131-117tiveram valores de potência levemente superiores no ensaio de macaco-caranguejeiro (303 nM e 330 uM, respectivamente) se comparado compotência medida em um ensaio de MRC-5 humano (-600pM). Em conclusãodAbs de série TAR2h-131 são reativos de forma cruzada com TNFRl demacaco-caranguej eiro.

EXEMPLO 5. Efeitos de uma dAb anti-TNFRl liberado pulmonarmente eminflamação pulmonar induzida por TNFa.

Um dAb anti-TNFRl foi administrado aos pulmões decamundongos pela via intranasal 1 hora antes de liberação intranasal deTNFa. O efeito de pré-dosar o pulmão com um dAb anti-TNFRl antes deadministração de TNFa foi investigado determinando o número de neutrófilosna BAL, quantificando a concentração das citocinas inflamatórias KC, MIP-2e MCP-I em BAL, e quantificando Eselectina em tecido pulmonar emmomentos selecionados depois de administração de TNFa.Métodos

O estímulo inflamatório foi TNFa murino recombinante emPBS contendo 0,1% de BSA.

O dAb anti-TNFRl foiTAR2m-21-23 (Batch BH31/01/06-1)em 2 OnM de tampão citrato pH 6

TNFa (1 μg por camundongo) foi administrado pela viaintranasal (i.n.). O volume administrado foi 50 μΐ por camundongo (20μ g/ml). O dAb anti-TNFRl TAR2m21-23 (1 mg/kg) também foiadministrado pela via i.n.. O volume de dAb administrado foi 50 μΐ porcamundongo (0,4 mg/ml pois camundongos foram de 20g).

Camundongos fêmeas (C57/bl6) criados em completoisolamento e certificados livres de microorganismos específicos em recibo(16-20g) (Charles River) foram alojados em grupos de até 5 em gaiolas defundo sólido individualmente ventiladas (IVC) com. cama de lascas deálamo. Ambientes (fluxo de ar, temperatura e umidade) dentro das gaiolasforam controlados pelo sistema IVC (Techniplast).Grupos de tratamento:No. de Grupos: 13

Tamanho de grupo: η = 5 - 6

Grupos de camundongos foram dosados i.n. ou com veículo oudAb em 1 hora antes de administração de TNFa. Grupos foram sacrificadosem horas pré-determinadas depois de administração de TNFa como listadoem Tabela 4.

<table>table see original document page 147</column></row><table>

Aproximadamente 3 minutos antes de tratamento, anestesialuminosa foi induzida por inalação de Isofluorano. Veículo ou o dAb foiinstilado em um volume de 50 ul/camundongo pela via i.n.. Camundongosforam deixados para recuperação e então retornadas à gaiola doméstica.

Depois de 1 hora TNPa (1 pg/camundongo) ou seu veículoforam administrados pela mesma via i.n.. Grupos de camundongos tratadoscom dAb ou veículo foram sacrificados em 2, 4, 6, 8, 24 e 48 horas apósadministração de TNFa.

Camundongos foram mortos por overdose anestésica(pentobarbitona de Na, lOOmg/kg i.p.). A traquéia foi canulada e lavagembronquioalveolar (BAL) conduzida usando 3 alíquotas separadas de 0,4 ml dePBS. O fluido de lavagem foi mantido em gelo antes de centrifugação.Corações e pulmões foram removidos en bloc, o coração foi removido e ospulmões foram congelados instantaneamente usando nitrogênio líquido. Ofluido de lavagem foi centrifugado e o sobrenadante dividido em quatroalíquotas de 250μ1 e armazenado a -40°C. O grânulo celular foi ressuspensoem 40μ1 de PBS, e 10 μΐ da suspensão celular tomada em 90 μΐ de corante"Kimura' ou 'Turks' para contagens celulares úmidas totais usando umhemocitômetro. Lâminas de citospina foram preparadas a partir da suspensãocelular e coloridas usando corante 'Wrights Giemsa' para análise celulardiferencial. Células foram diferenciadas usando técnicas morfométricaspadrão.

Preparação de amostra e ELISA: kits de ELISA para TNFamurino, KC, MTP-2, MCP-I e E-selectina foram obtidos a partir de R&DSystems. Amostras puras de sobrenadante de BAL foram usadas paradeterminação da concentração das citocinas KC, MT-2 e MCP-I em BAL.Sobrenadante de BAL foi diluído 1:100 para determinação da concentração deTNFa, emBAL.

Pulmão congelado foi descongelado e homogeneizado em 500μl de tampão de Iise contendo IOmM de HEPES pH 7,5, 0,5% de triton Χ-100, 150mM de NaCl, ImM de EDTA, 0,5mM de AEBSF e um coquetel deinibidor de protease (1µg/ml de leupeptina, 1μl de aprotinina, 10μ1 deinibidor de mitripsina-quimotripsina e 1µg/mlde pepstatina). Lunghomogenate supernatant was diluted for determination of E-selectina detecido pulmonar (1:50) and TNFa (1:100) concentrations.

Concentrações protéicas totais de BAL e sobrenadante dehomogeneizado de pulmão foram determinadas usando um kit QuantiproBCA (Sigma).Resultados

Seguindo administração intranasal de TNFa murino níveissignificantes de BAL e tecido pulmonar TNFa foram detectados 2 h apósadministração (FIGs. IlA e 11B). Concentrações de TNFa tanto em BALcomo tecido diminuíram de uma maneira tempo-dependente, e retornaram aníveis de linha de base (tratado com veículo) por 48 hrs. Níveis no BALforam aproximadamente 10 vezes maiores do que níveis no tecido pulmonar.

Estes dados demonstram que administração i.n. de TNFa resultou emliberação pulmonar significante da citocina. E possível entretanto, que algunsdos TNFa detectados séjam de origem endógena embora o perfil da respostadoes não sugira isso.

Uma dose de 1 hora de 1 mg/kg do dAb anti-TNFRl não tevenenhum efeito óbvio em BAL e concentração de TNFa de tecido pulmonar aolongo dos momentos avaliados. Apesar de um rápido aumento em BAL econcentração de TNFa de tecido pulmonar seguindo administração i.n. deTNFa murino, números de neutrofilia de BAL não aumentaramsignificantemente acima da linha de base entre 1 e 8 horas após administraçãode TNFa. Entretanto, em 24 e 48 h após administração de TNFa, neutrofiliade BAL foi observada (FIG. 12). O aumento em neutrófilos BAL em 24 e 48h foi parcialmente inibido pelo dAb anti-TNFRl (26% e 44% de inibiçãorespectivamente).

Concentrações dos quimioatratores de neutrófilo KC e MIP-2foram significantemente aumentadas 2 h seguindo administração de TNFa, ediminuíram de uma maneira tempo-dependente com ambas as quimiocinasretornando às concentrações basais por 24 h (FIGs. 13A e 13B). Estesaumentos em BAL KC e MIP-2 foram significantemente reduzidos por pré-tratamento com dAb anti-TNFRl.

Concentrações de BAL MCP-I e E-selectina de tecidopulmonar também foram significantemente aumentadas por TNFa, mas oaumento de pico foi depois daquele de BAL KC e MIP-2 (6 h ao invés de 2hrs). Concentrações de BAL MCP-I e E-selectina de tecido pulmonarretornaram aos níveis basais por 48 h (FIGs. 13C e 13D). Estes aumentos emBAL KC e MIP-2 foram significantemente reduzidos por pré-tratamento comdAb anti-TNFR1.

Discussão

Administração intranasal de TNFa murino a camundongosresultou em níveis significantes de TNFa pulmonar, o que induziu aumentossignificantes em neutrófilos BAL, BAL KC, M1P-2 e MCP-I e E-selectina detecido pulmonar. Neutrófilos BAL não foram aumentados até cerca de 24 h epermaneceram elevados em 48 hrs. Dados prévios na literatura usando ratosdemonstraram uma resposta prolongada de neutrófilo. Os aumentos de picoem BAL KC r MIP-2 foram observados no momento de 2 hr, com aumentosde pico em BAL MCP-I e E-selectina de tecido pulmonar em cerca de 6 hrs.

Níveis aumentados de cada um de KC5 MIP-2, MCP-I e E-selectina foramdetectados 6 h depois de administração de TNFa.

Pré-tratamento com um dAb anti-TNFRl (1 mg/kg) 1 h antesde administração de TNFa murino inibiu os aumentos em neutrófilos BAL eKC, MIP-2 e MCP-I e E-selectina de tecido pulmonar. Estes dados sugeremque o receptor de TNFRl media a maioria da inflamação pulmonar induzidapor TNFa i.n. neste modelo.

EXEMPLO 6. Efeitos de Doses Variadas de dAb anti-TNFRl LiberadoPulmonarmente em Inflamação Pulmonar Induzida por TNFa.

Doses variadas de um dAb anti-TNFRl foram administradasaos pulmões de camundongos pela via i.n. 1 hora antes de liberação intranasalde TNFa. As doses de dAb anti-TNFRl usadas foram 2,5 mg/kg, 1 mg/kg,0,3 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,03 mg/kg e 0,01 mg/kg. O efeito de pré-dosagemcom um dAb anti-TNFRl foi investigado quantificando a concentração dascitocinas inflamatórias KC, MIP-2 e MCP-I em BAL, e quantificando E-selectina em tecido pulmonar.

Métodos

O estímulo inflamatório e substância de teste foram os mesmosque aqueles descritos em Exemplo 5. TNFa (1 μg por camundongo) foiadministrado pela via intranasal (i.n.). O volume administrado foi 50 μl porcamundongo (20 μ§/ml).

O dAb anti-TNFRl TAR2m-21-23 foi administrado pela viai.n. em uma dose de 2,5 mg/kg, 1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,03 mg/kgou 0,01 mg/kg. O volume de dAb administrado foi 50 μl por camundongo.

Camundòngos foram da mesma linhagem e alojados comodescrito em Exemplo 5.Grupos de tratamento:

Tamanho de grupo: η = 4 - 7Grupos de camundongos foram dosados I.n. ou com veículo ou dAb (2,5, 1, 0,3, 0,1, 0,03 ou 0,01 mg/kg) a 1 hora antes de administraçãode TNFa. Todos os grupos foram sacrificados 6 h depois de administração deTNFa.

Camundongos foram dosados usando o mesmo procedimentoque em Exemplo 6. Camundongos foram mortos 6 h depois de administração1i.n. de TNFa, e células BAL, sobrenadante de BAL rtecido pulmonar congelado coletados como descrito em Exemplo 6. ProteínaBAL, KC, M1P-2 e MCP-1, proteína de sobrenadante de homogeneizado depulmão e E-selectina foram avaliadas e quantificadas como descrito emExemplo 6.

Resultados

Como mostrado em Exemplo 5, administração intranasal deTNFa induziu concentrações significantes de KC, M1P-2 e MCP-I no BAL eE-selectina no tecido pulmonar 6 h depois de dosagem. Pré-tratamento (1 hantes de TNFa) com um dAb anti-TNFRl inibiu a elevação destesmediadores inflamatórios de uma maneira dose dependente (Tabela 5) emboraa potência tenha variado entre mediadores.

Tabela 5. Inibição dose dependente de aumentos induzidos por TNFa emBAL KC, MIP-2 e MCP-I e concentrações de E-selectina de tecidopulmonar.1<table>table see original document page 152</column></row><table>1 A tabela mostra inibição percentual (média ± SD) de aumentos induzidos por TNFa emBAL KC, MIP-2 e MCP-I e concentrações de E-selectina dè tecido pulmonar em doses de.dAb de 2,5, 1, 0,3, 0,1, 0,03 e 0,01 mg/kg.

O dAb anti-TNFRl inibiu BAL KC em um grau similar emtodas as doses entre 2,5 mg/kg e 0,03 mg/kg, e foi inativo em 0,01 mg/kg.Similarmente, o dAb anti-TNFRl inibiu BAL MIP-2 a substancialmente omesmo grau em todas as doses entre 2,5 mg/kg e 0,1 mg/kg, com ligeiramentemenos inibição em 0,03 mg/kg, e foi inativo em 0,01 mg/kg.

O dAb anti-TNFRl foi um inibidor menos potente de BALMCP-I uma vez que inibição significante foi observada entre 2,5 mg/kg e 0,3mg/kg, mas não em doses inferiores. Concentrações de E-selectina de tecidopulmonar foram inibidas de uma maneira similar; inibição significante foiobservada entre 2,5 mg/kg e 0,3 mg/kg, inibição mínima em 0,1 mg/kg, enenhum efeito em doses inferiores.Discussão

Administração intranasal de TNFa murinos a camundongosinduziu aumentos significantes em neutrófilos BAL, BAL KC, MIP-2 e MCP-1, e E-selectina de tecido pulmonar. Estes aumentos foram significantementeinibidos de uma maneira dose-dependente com um dAb anti-TNFRl. O dAbanti-TNFRl teve atividade inibidora mais potente em BAL KC e MIP-2comparado com BAL MCP-I e E-selectina de tecido pulmonar. Isto pode serporque aumentos de pico em BAL KC e MIP-2 foram induzidosrelativamente rapidamente seguindo administração de TNFa, ao passo queaumentos de pico em BAL MCP-I e E-selectina de tecido foram depois.

Este estudo demonstra que dAb anti-TNFRl i.n. uma dose de

0,3 mg/kgInibiu significantemente aumentos induzidos por TNFa emneutrófilos BAL, BAL KC, MEP-2 e MCP-1, e E-selectina de tecido pulmonarem seis horas após administração de TNFa, mas que 0,3 mg/kg não é umadose acima-máxima.

EXEMPLO 8. Duração de ação in vivo de um dAb anti-TNFRl administradopela via intranasal.

dAb anti-TNFRl (TAR2m-21-23) foi administrado aospulmões de camundongos pela via i.n, em vários momentos antes deadministração i.n. de TNFa. O efeito de pré-dosar o pulmão com dAbs anti-TNFRl foi investigado quantificando as citocinas inflamatórias KC, M1P-2 eMCP-I em BAL, e quantificando E-selectina em tecido pulmonar, porELISA. Os resultados são mostrados em Tabela 6.

Métodos:

Estímulo inflamatório: TNFa murino recombinante

Substância de teste 1: TAR2m-21-23 (Grupo BH31/01/06-1)(dAb anti-TNFRl) Veículo para nu TNFa: PBS contendo 0,1 % de BSA.

Veículo para TAR2m-21 -23: 20nM de tampão citrato pH 6

Dose de TNFa foi 1 μg por camundongo pela via intranasal(i.n.) como usado no estudo prévio. Volume administrado ao nariz foi 50 μΐpor camundongo (20 pg/ml).

Dose de TAR2m-21-23 foi 0,3 mg/kg por via i.n.. Volumeadministrado ao nariz foi 50 μΐ por camundongo (0,4 mg/ml poiscamundongos eram de 20g).

Camundongos usados e preparação de dAb: Camundongosforam da mesma linhagem e alojados como detalhado no protocolo de estudoprévio.

Protocolos:

Grupos de tratamento:

Tamanho de grupo: η = 4 - 7Épocas de tratamento:

Grupos de camundongos foram dosados i.n. ou com veículo oudAb em 1, 2, 4, ou 6 horas antes de administração de TNFa. Todos os gruposforam sacrificados 6 h depois de administração de TNFa.

Dosagem e procedimentos terminais: Camundongos foramdosados como detalhado acima usando o mesmo procedimento que o estudoprévio. Camundongos foram mortos 6 h depois de administração i.n. TNFa ecélulas BAL, sobrenadante de BAL e tecido pulmonar congelado foramcoletados como detalhado no estudo prévio.

Preparação de amostra e ELISA: proteína BAL, KC, MIP-2 e

MCP-I e proteína de sobrenadante de homogeneizado de pulmão e E-selectina foram avaliadas como detalhado no experimento prévio.

<table>table see original document page 154</column></row><table>

A tabela mostra concentrações médias de BAL KC @g/ml), MIP-2 (pg/ml) e MCP-I(pg/ml) e E-selectina de tecido pulmonar (ng/ml) seis horas depois de administração i.n. deTNFa ou veículo. dAb anti-TNFRl foi administrado 1, 2, 4, ou 6 horas antes deadministração de TNFa.

Os resultados apresentados em Tabela 6, mostram queadministração de dAb em 1, 2, 4, ou 6 horas antes de administração de TNFainibiu significantemente de BAL KC e MIP2 induzido por TNF em todos osmomentos de pré-dose de dAb. Melhor inibição foi observada em momentosmaiores de pré-dose. Isto sugere que >1 h é ótimo para que dAb se ligue aoreceptor seguindo dosagem i.n.. De uma maneira similar administração dedAb em 1, 2, 4, ou 6 horas antes de administração de TNFa também inibiusignificantemente BAL MCP-I e E-selectina de tecido pulmonar induzida porTNF em todos os momentos de pré-dose de dAb. Estes resultados mostramque dAb anti-TNFRl tem uma duração de ação que é maior do que 6 horas.EXEMPLO 9. Avaliação de um dAb anti-TNFRl que se liga a TNFRl e inibeligação de TNFa ao receptor administrado pela via intranasal em inflamaçãopulmonar induzida por TNFa.

Os exemplos prévios mostram que um dAb anti-TNFRl ("dAbnão competitivo" TAR2m,21-23) que se liga a TNPRl mas não inibe ligaçãode TNFa a TNFRl inibiu significantemente inflamação pulmonar induzidapor TNFa. Este estudo demonstra que um dAb que se liga a TNFRl e inibeligação de TNFa a TNFRl ("dAb competitivo" TAR2m-15-12) também foieficaz em inibir inflamação pulmonar induzida por TNFa.

Métodos:

Estímulo inflamatório: TNFa murino recombinanteSubstância de teste 1: TAR2m-21-23 (Grupo BH31/01/06-1)(dAb anti-TNFRl competitivo)

Substância de teste 2: TAR2m-15-12 (dAb anti-TNFRl nãocompetitivo) Veículo para TNFa rm: PBS contendo 0,1% de BSA.

Veículo para dAbs: 20nM de tampão citrato pH 6

Dose de TNFa foi 1 μg por camundongo pela via intranasal(i.n.) como usado no estudo prévio. Volume administrado ao nariz foi 50 μΐpor camundongo (20 μg/ml).

Dose de TAR2m-21-23 ou TAR2m-15-12 foi 0,3, 0,1, e 0,03mg/kg por via i.n.. Volume administrado ao nariz foi 50 μΐ por camundongo(0,4 mg/ml pois camundongos eram de 20g).

Camundongos usados e preparação de dAb: Camundongosforam da mesma linhagem e alojados como detalhado no protocolo de estudoprévio. dAb foi formulado como descrito previamente. Protocolos:

Grupos de tratamento:

Tamanho de grupo: η = 4 - 7

Épocas de tratamento:

Grupos de camundongos foram dosados i.n. ou com veículo oudAb a 1 h antes de administração de TNFa. Todos os grupos foramsacrificados 6 h depois de administração de TNFa. Dosagem e procedimentosterminais: Camundongos foram dosados como detalhado acima usando omesmo procedimento que o estudo prévio.. Camundongos foram mortos 6 hdepois de administração i.n. de TNFa e células BAL, sobrenadante de BAL etecido pulmonar congelado coletados como detalhado no estudo prévio.

Preparação de amostra e ELISA: proteína BAL, KC, MIP-2 eMCP-I e proteína de sobrenadante de homogeneizado de pulmão e E-

selectina foram avaliadas como detalhado no experimento prévio.

Tabela 7. Efeitos dose dependentes de um dAb anti-TNFRl competitivo ou um não competitivo em aumentos induzidos por TNFa em BAL KC, MIP-2 e MCP-I e concentrações de E-selectina de tecido pulmonar.3 <table>table see original document page 156</column></row><table>

3 A tabela mostra a inibição percentual (média ± SD) de aumentos induzidos por TNFa emBAL KC, MIP-2 e MCP-I e concentrações de E-selectina de tecido pulmonar em doses dedAb de 0,3, 0,1, e 0,03 mg/kg.

Os resultados apresentados em Tabela 7 mostram que similar aestudos prévios pré-tratamento (1 h antes de TNFa) com um dAb anti-TNFRlnão competitivo (TAR2m-21- 23) inibiu dose dependentemente a elevaçãodos mediadores inflamatórios BAL KC, MIP-2 e MCP-I e E-selectina detecido pulmonar. De uma maneira similar um dAb anti-TNFRl competitivo(TAR2m-15-12) também inibiu dose dependentemente a elevação dos mediadores inflamatórios BAL KC, MIP-2 BAL e MCP-I e E-selectina detecido pulmonar.

O dAb anti-TNFRl TA_R2m-15-12 teve eficácia ligeiramentemenor em BAL KC a 0,03 mg/kg, e em BAL MIP-2 a 0,1-0,03 mg/kgcomparado com TAR2m-21-23. O dAb anti-TNFRl TAR2m-15-12 foiinativo em BAL MCP-I a 0,1 mg/kg comparado com TAR2m-21-23 quemostrou 34% de inibição em BAL MCP-1. O dAb anti-TNFRl TAR2m-15-12 teve eficácia ligeiramente menor em E-selectina de tecido pulmonar a 0,1mg/kg comparado com TAR2m-21-23.

A potência in vitro foi -1 TIM for TAR2m-21-23 e -5 IlMpara TAR2ml5-12 . Em adição TAR2m-21-23 tem maior afinidade e taxa dedissociação mais lenta do que TAR2rn-15-12. A diferença em eficácia nosmediadores inflamatóriòs provavelmente é devida à reduzida afinidade epotência. Isto indica que não existe diferença óbvia entre um dAb nãocompetitivo (TAR2m-21-23) e um dAb competitivo TAR2m-15-12 que inibeligação de TNFa a TNFRl.

SUMÁRIO

Tabela 8 resume os resultados de estudos induzidos por TS eestudos induzidos por TNF. O grupo exposto a TS e tratado com dAb anti-TNFRl PEGuilado (lOmg/kg), mostrou infiltrados celularessignificantemente reduzidos no pulmão comparado com os grupos expostos aTS e tratados com controle: 62% de inibição para células totais. Nenhumaredução significante em qualquer das populações celulares foi observada nogrupo tratado com (lOmg/kg i.p.) de TS/ ENBREL® (etanercept; ImmunexCorporation). Infiltrados celulares significantemente reduzidos foram observadosapenas no grupo tratado com TS/ ENBREL® (etanercept; ImmunexCorporation) quando dosagem foi aumentada para 30mg/kg (i.p.). Isto indica quedosagem sistêmica de mg/kg > 3-vezes maior de ENBREL® (etanercept;Immunex Corporation) é requerida comparado com dAb anti-TNFRl PEGuiladopara atingir reduções significantes em populações celulares.

No modelo induzido por TNFa, o grupo tratado com dAb anti-TNFRl (0,3mg/kg i.n.), mostrou 78% de inibição de níveis de MIP-2induzido por TNFa. Um nível de inibição similar em níveis de MIP-2 (78%)foi atingida no grupo tratado com ENBREL® (etanercept; ImmunexCorporation) com 10 mg/kg (i.n.). O grupo tratado com ENBREL®(etanercept; Immunex Corporation) com 1 mg/kg (i.n.) não mostrou qualquerredução significante de influxo de células. Junto estes dados indicam quedosagem i.n. de mg/kg >30 vezes maior de ENBRELO (etanercept; ImmunexCorporation) é requerida comparado com dAb anti-TNFRl para atingir

inibição eficiente de MIP-2.

<table>table see original document page 158</column></row><table>

Embora esta invenção tenha sido mostrada particularmente edescrita com Referências a formas de realização preferidas desta, serácompreendido por aqueles versados na técnica que várias mudanças em formae detalhes podem ser feitas nesta sem se afastar do escopo da invençãoabrangida pelas reivindicações anexas.

Claims (143)

1. Uso de um agente que se liga a um alvo em tecidopulmonar, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma formulaçãode janela terapêutica ampla ou ação longa para liberação local para tecidopulmonar, em que pelo menos 50% do nível de tecido pulmonar de agente émantido por um período de pelo menos cerca de 4 horas.

2. Uso de um agente que se liga a um alvo em tecidopulmonar, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de ummedicamento para administração local para tecido pulmonar de umaquantidade eficaz em pequena dose de dito agente, em que pelo menos 50%do nível de tecido pulmonar de agente é mantido por um período de pelomenos cerca de 4 horas.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o tecido pulmonar é pulmão.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que um nível pulmonar de pelo menos cerca de 1% da quantidade deagente na formulação ou medicamento é mantido por pelo menos 4 horas.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato de que o agente não entra substancialmente nacirculação sistêmica.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que o agente tem uma meia vida no soro in vivo decerca de 1 segundo a cerca de 12 horas.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de que a formulação ou medicamento é paraadministrar uma dose de não mais do que cerca de 10 mg/kg/dia.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,caracterizado pelo fato de que o agente é um antagonista que se liga a um alvoem tecido pulmonar.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8,caracterizado pelo fato de que o agente é um fragmento de anticorpo que seliga a um alvo em tecido pulmonar.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8,caracterizado pelo fato de que o agente é um monômero dAb que se liga a umalvo em tecido pulmonar.

11. Uso de um anticorpo de domínio (dAb) que se liga a umalvo em tecido pulmonar, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação deuma formulação de dose diária para administração local para tecido pulmonar,em que pelo menos 50% do nível pulmonar de agente é mantido por umperíodo de pelo menos cerca de 4 horas.

12. Uso de um anticorpo de domínio (dAb) que se liga a umalvo em tecido pulmonar, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação deuma formulação para administração local para tecido pulmonar, em quenenhum nível significante de dAb se acumula na circulação sistêmica.

13. Uso de um anticorpo de domínio (dAb) que se liga a umalvo em tecido pulmonar, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação deuma formulação para tratamento ou prevenção de uma doença respiratória,em que a formulação é para administração local para tecido pulmonar, enenhum nível significante de dAb se acumula na circulação sistêmica.

14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-13, caracterizado pelo fato de que até cerca de 10 mg de um dAb que se liga aum alvo em tecido pulmonar é usado.

15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-13, caracterizado pelo fato de que 1 mg a 10 mg de um dAb que se liga a umalvo em tecido pulmonar é usado.

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações lia-15, caracterizado pelo fato de que dito alvo em tecido pulmonar mediainflamação pulmonar ou uma doença pulmonar.

17. Inalador ou dispositivo de liberação intranasal,caracterizado pelo fato de ser para fornecer uma dose calibrada de umaformulação de anticorpo de domínio (dAb) para um indivíduo para otratamento ou prevenção de uma doença ou condição respiratória, em que oinalador ou dispositivo de liberação intranasal compreende uma formulaçãodAb e fornece uma dose diariamente calibrada contendo até 10 mg de dAb.

18. Uso de uma formulação de anticorpo de domínio (dAb),caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um inalador ou dispositivo deliberação intranasal, para o propósito de fornecer uma formulação dAbinalada de longa ação para liberação locai para o pulmão.

19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelofato de que pelo menos 50% do nível pulmonar de agente é mantido por umperíodo de pelo menos cerca de 4 horas.

20. Uso de acordo com a reivindicação 18 ou reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o inalador ou dispositivo de liberaçãointranasal é para fornecer uma dose de até 10 mg/kg/dia.

21. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelofato de que o inalador ou dispositivo de liberação intranasal é para forneceruma dose de até 10 mg/dia.

22. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a-21, caracterizado pelo fato de que dita formulação de dAb compreende umdAb que se liga a um alvo em tecido pulmonar media inflamação pulmonarou uma doença pulmonar.

23. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16e 22, caracterizado pelo fato de que o alvo em tecido pulmonar é selecionadoa partir do grupo consistindo de TNFRl, IL-1, IL-1R, 1L-4, IL-4R, IL-5, IL--6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10,1L-12 IL-12R, IL-13, IL-13Ral,IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL--23R, IL-25, CD2, CD4, CDlla, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40,CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcERl, TGFb, CCL2, CCL18, CEA,CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), quimase, FGF, Furina, Endotelina-1,Eotaxinas (e.g., Eotaxina, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS,IgE, IFNa, 1-309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs,neutrófilo elastase, osteopontina, OX-40, PARC, PD-I, RANTES, SCF, SDF--1, siglec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1, TNF, TNFRl, TRANCE,Triptase, VEGF, VLA-4, VCAM, a4b37, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5,CCR7, CCR8, alfavbetaó e alfavbeta 8.

24. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelofato de que o alvo em tecido pulmonar é TNFRl.

25. Uso de um agente que se liga a um alvo em tecidopulmonar de um indivíduo, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação deum medicamento para produzir uma janela terapêutica ampla em tecidopulmonar do dito indivíduo.

26. Uso de um agente que se liga a um alvo em tecidopulmonar de um indivíduo, selecionado por ter uma meia vida no soro in vivode cerca de 1 segundo a cerca de 12 horas e se liga a um alvo em tecidopulmonar, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de ummedicamento para produzir uma janela terapêutica ampla em tecido pulmonardo dito indivíduo.

27. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de que dito agente tem uma meia vida no soro in vivo de cerca de 1segundo a cerca de 12 horas.

28. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a-27, caracterizado pelo fato de que dito agente não entra substancialmente nacirculação sistêmica.

29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a-28, caracterizado pelo fato de que dito agente é um fragmento de ligação deantígeno de um anticorpo.

30. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelofato de que dito agente é um fragmento Fv.

31. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelofato de que dito agente é um monômero dAb.

32. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a-31, caracterizado pelo fato de que uma quantidade eficaz em pequena dose éadministrada.

33. Uso de um antagonista de TNFRl, em que dita quantidadeeficaz não excede cerca de 10 mg/kg/dia, e em que o nível de célulasinflamatórias no pulmão é reduzido em relação a níveis de pré-tratamentocom ρ < 0,05, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de ummedicamento para tratar uma doença respiratória.

34. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelofato de que o nível de células inflamatórias no pulmão é verificado porcontagens de células totais em lavagem bronquioalveolar, escarro ou biópsiabrônquica.

35. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelofato de que o nível de células inflamatórias no pulmão é verificado porcontagens de macrófago e/ou neutrófilo em lavagem bronquioalveolar,escarro ou biópsia brônquica.

36. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a-35, caracterizado pelo fato de que dito antagonista de TNFRl é administradolocalmente ao tecido pulmonar de um indivíduo com necessidade deste.

37. Uso de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelofato de que o antagonista de TNFRl é administrado localmente ao tecidopulmonar por inalação ou administração intranasal.

38. Uso de acordo com a reivindicação 36 ou reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que uma quantidade terapêutica em pequena dose éadministrada.

39. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 35, caracterizado pelo fato de que dito antagonista de TNFRl ésistematicamente administrado a um indivíduo com necessidade deste.

40. Uso de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelofato de que dito antagonista de TNFRl é sistematicamente administradointraperitonealmente, ou subcutaneamente.

41. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, caracterizado pelo fato de que dito antagonista de TNFRl persiste notecido pulmonar por pelo menos 8 horas depois de ser administrado.

42. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 36, 37 e 41, caracterizado pelo fato de que dito tecido pulmonar é pulmão.

43. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, 41 e 42, caracterizado pelo fato de que dito antagonista de TNFRl nãoentra substancialmente na circulação sistêmica.

44. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 43, caracterizado pelo fato de que o antagonista de TNFRl é administrado emcerca de 5 mg/kg ou menos uma vez por dia.

45. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 43, caracterizado pelo fato de que o antagonista de TNFRl é administrado emcerca de 1 mg/kg ou menos uma vez por dia.

46. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 43, caracterizado pelo fato de que o nível de células inflamatórias no pulmãoé reduzido em relação a níveis de pré-tratamento em pelo menos cerca de 30%.

47. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 45, caracterizado pelo fato de que o nível de células inflamatórias no pulmãoé reduzido em relação a níveis de pré-tratamento em pelo menos cerca de 50%.

48. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a-45, caracterizado pelo fato de que o nível de células inflamatórias no pulmãoé reduzido em relação a níveis de pré-tratamento em pelo menos cerca de70%.

49. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a-45, caracterizado pelo fato de que o nível de células inflamatórias no pulmãoé reduzido em relação a níveis de pré-tratamento com ρ < 0,001.

50. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a-49, caracterizado pelo fato de que dita doença respiratória é selecionada apartir do grupo consistindo de inflamação pulmonar, doença pulmonarobstrutiva crônica, asma, pneumonia, pneumonite de hipersensibilidade,infiltrado pulmonar com eosinofilia, doença pulmonar ambiental, pneumonia,bronquiectasias, fibrose cística, doença pulmonar intersticial, hipertensãopulmonar primária, tromboembolismo pulmonar, distúrbios da pleura,distúrbios do mediastino, distúrbios do diafragma, hipoventilação,hiperventilação, apnéia do sono, síndrome de desconforto respiratório agudo,mesotelioma, sarcoma, rejeição do enxerto, doença enxerto contra hospedeiro,câncer de pulmão, rinite alérgica, alergia, asbestose, aspergiloma, aspergilose,bronquiectasias, bronquite crônica, enfisema, pneumonia eosinofílica, fibrosepulmonar idiopática, doença pneumocócica invasiva, influenza, micobactériasnão tuberculosas, efusão pleural, pneumoconiose, pneumocitose, pneumonia,actinomicose pulmonar, proteinose alveolar pulmonar, antraz pulmonar,edema pulmonar, embolia pulmonar, inflamação pulmonar, histiocitose Xpulmonar, hipertensão pulmonar, nocardiose pulmonar, tuberculose pulmonar,doença veno-oclusiva pulmonar, doença pulmonar reumatóide, sarcoidose, egranulomatose de Wegener.

51. Uso de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelofato de que dita doença respiratória é doença pulmonar obstrutiva crônica ouasma.

52. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a-51, caracterizado pelo fato de que o antagonista de TNFRl compreende umdomínio de polipeptídeo que tem especificidade de ligação para TNFRl, masnão agoniza substancialmente TNFRl.

53. Uso de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelofato de que dito domínio de polipeptídeo é um anticorpo ou fragmento deanticorpo.

54. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a-51, caracterizado pelo fato de que o antagonista de TNFRl compreende umanticorpo de domínio (dAb) que se liga a TNFRl e inibe ligação de Fator deNecrose Tumoral Alfa (TNFa) a TNFRl ou inibe transdução de sinal mediadaatravés de TNFRl com ligação de TNFa, em que dito dAb é selecionado apartir do grupo consistindo de um domínio variável de cadeia pesada deimunoglobulina e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina.

55. Uso de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelofato de que dito dAb é selecionado a partir do grupo consistindo de um Vhhumano que tem especificidade de ligação para TNFRl humano, e um Vlhumano que tem especificidade de ligação para TNFRl humano.

56. Uso de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelofato de que a seqüência de aminoácidos de dito dAb é pelo menos 90% homóloga à seqüência de aminoácidos de um dAb selecionado a partir dogrupo consistindo de TAR2h-12 (SEQ ID NO.T), TAR2h-13 (SEQ ID NO:2),TAR2h-14 (SEQ ID NO:3), TAR2h-16 (SEQ ID NO:4), TAR2h-17 (SEQ IDNO:5), TAR2h-18 (SEQ ID NO:6), TAR2h-19 (SEQ ID N0:7), TAR2h-20(SEQ ID NO:8), TAR2h-21 (SEQ ID NO:9), TAR2h-22 (SEQ ID N0:10),TAR2h-23 (SEQ ID NO:ll), TAR2h24 (SEQ ID NO:12), TAR2h-25 (SEQID NO:13), TAR2h-26 (SEQ ID NO:14), TAR2h-27 (SEQ ID NO:15),TAR2h-29 (SEQ ID NO: 16), TAR2h-30 (SEQ ID NO: 17), TAR2h-32 (SEQID NO: 18), TAR2h-33 (SEQ ID NO:19), TAR2h-10-l (SEQ ID N0:20),TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:21), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:22), TAR2h-10-4(SEQ ID NO:23), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:24), TAR2h-10-6 (SEQ IDNO:25), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:26), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:27),TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:28), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:29), TAR2h-10--11 (SEQ ID N0:30), TAR2h-10-12 (SEQ ID N0:31), TAR2h-10-13 (SEQ IDNO:32), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:33), TAR2h-10-15 (SEQ ID NO:34),TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:35), TAR2h-10-17 (SEQ ID NO:36), TAR2h-10--18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-10-19 (SEQ ID NO:38), TAR2h-10-20 (SEQ IDNO:39), TAR2h-10-21 (SEQ ID N0:40), TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:41),TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:42), TAR2h-10-29 (SEQ ID NO:43), TAR2h-10--31 (SEQ ID NO:44), TAR2h-10-35 (SEQ ID NO:45), TAR2h-10-36 (SEQ IDNO:46), TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:47), TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:48),TAR2h-10-45 (SEQ ID NO:49), TAR2h-10-47 (SEQ ID N0:50), TAR2h-10--48 (SEQ ID NO:51), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:52), TAR2h-10-56 (SEQ IDNO:53), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:55), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:57), TAR2h-10--68 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:59), TAR2h-10-67 (SEQ IDN0:60), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:62),TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:64), TAR2h-10--55 (SEQ ID NO:65), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:66), TAR2h-10-70 (SEQ IDNO:67), TAR2h-34 (SEQ ID NO:68), TAR2h-35 (SEQ ID NO:69), TAR2h--36 (SEQ ID N0:70), TAR2h-37 (SEQ ID NO:71), TAR2h-38 (SEQ IDNO:72), TAR2h-39 (SEQ ID NO:73), TAR2h-40 (SEQ ID NO:74), TAR2h--41 (SEQ ID NO:75), TAR2h-42 (SEQ ID NO:76), TAR2h-43 (SEQ IDNO:77), TAR2h-44 (SEQ ID NO:78), TAR2h-45 (SEQ ID NO:79), TAR2h--47 (SEQ ID N0:80), TAR2h-48 (SEQ ID NO:81), TAR2h-50 (SEQ IDNO:82), TAR2h-51 (SEQ ID NO:83), TAR2h-66 (SEQ ID NO:84), TAR2h--67 (SEQ ID NO:85), TAR2h-68 (SEQ ID NO:86), TAR2h-70 (SEQ IDNO:87), TAR2h-71 (SEQ ID NO:88), TAR2h-72 (SEQ ID NO:89), TAR2h--73 (SEQ ID N0:90), TAR2h-74 (SEQ ID NO:91), TAR2h-75 (SEQ IDNO:92), TAR2h-76 (SEQ ID NO:93), TAR2h-77 (SEQ ID NO:94), TAR2h--78 (SEQ ID NO:95), TAR2h-79 (SEQ ID NO:96), TAR2h-15 (SEQ IDNO:97), TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:98), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:99),TAR2h-15-8 (SEQ ID NO: 100), TAR2h-l5-8-1 (SEQ ID N0:101), TAR2h--15-8-2 (SEQ ID NO: 102), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO: 103), TAR2h-154--10-5 (SEQ ID NO: 104), TAR2h-14-2 (SEQ ID N0:105), TAR2h-151-8 (SEQID NO: 106), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO: 107), TAR2h-35-4 (SEQ IDNO: 108), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO: 109), TAR2h-80 (SEQ ID NO: 110),TA:R2h-81 (SEQ ID NO:lll), TAR2h-82 (SEQ ID Na 112), TAR2h-83-(SEQ ID NO: 113), TAR2h-84 (SEQ ID NO: 114), TAR2h-85 (SEQ IDNO: 115), TAR2h-86 (SEQ ID NO:116), TAR2h-87 (SEQ ID NO:117),TAR2h-88 (SEQ ID NO: 118), TAR2h-89 (SEQ ID NO: 119), TAR2h-90(SEQ ID NO: 120), TAR2h-91 (SEQ ID NO:121), TAR2h-92 (SEQ IDNO: 122), TAR2h-93 (SEQ ID NO:123), TAR2h-94 (SEQ ID NO: 124),-TAR2h-95 (SEQ ID NO: 125), TAR2h-96 (SEQ ID NO: 126), TAR2h-97(SEQ ID NO: 127), TAR2h-99 (SEQ ID NO:128), TAR2h-100 (SEQ IDNO: 129), TAR2h-101 (SEQ ID NO: 130), TAR2h-102 (SEQ ID NO:131),TAR2h-103 (SEQ ID NO:132), TAR2h-104 (SEQ ID NO:133), TAR2h-105(SEQ ID NO: 134), TAR2h-106 (SEQ ID NO:135), TAR2h-107 (SEQ ID- NO: 136), TAR2h-108 (SEQ ID NO: 137), TAR2hl09 (SEQ ID NO: 138),TAR2h-110 (SEQ ID NO: 139), TAR2h-lll (SEQ ID NO: 140), TAR2h-112(SEQ ID NO:141), TAR2h-113 (SEQ ID NO: 142), 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179), TAR2h-204 (SEQ ID NO: 180),TAR2h-185-25 (SEQ_ ID NO:181), TAR2h-154-10 (SEQ ID NO: 182), eTAR2h-205 (SEQ ID NO: 183).

57. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a-56, caracterizado pelo fato de que dito antagonista de TNFRl compreendeadicionalmente uma unidade que prolonga meia vida.

58. Uso de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelofato de que dita unidade que prolonga meia vida é uma unidade depolietilenoglicol, albumina no soro ou um fragmento desta, receptor detransferrina ou uma porção de ligação de transferrina deste, ou um anticorpoou fragmento de anticorpo compreendendo um sítio de ligação para umpolipeptídeo que estimula meia vida in vivo.

59. Uso de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelofato de que dita unidade que prolonga meia vida é um anticorpo ou fragmentode anticorpo compreendendo um sítio de ligação para albumina no soro oureceptor Fc neonatal.

60. Uso de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelofato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo é um dAb.

61. Uso de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelofato de que dita unidade que prolonga meia vida é uma unidade depolietilenoglicol.

62. Uso de um antagonista de Receptor de Fator de NecroseTumoral 1 (TNFRl) selecionado por ter eficácia em um modelo animaladequado de doença respiratória quando administrado em uma quantidade quenão excede cerca de 10 mg/kg uma vez por dia em que a eficácia em ditomodelo animal existe quando infiltração celular dos pulmões se verificada porcontagem celular total em lavagem bronquioalveolar é inibida em relação acontrole não tratado com ρ 0,05, caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um medicamento para tratar uma doença respiratória.

63. Uso de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelofato de que dito modelo animal adequado é o modelo subcrônico induzido porfumaça de tabaco de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) emcamundongos C57BL/6 fêmeas.

64. Uso de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelofato de que dito modelo animal adequado é um modelo de primata nãohumano de asma ou COPD.

65. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a-64, caracterizado pelo fato de que infiltração celular do pulmão em ditomodelo animal é inibida em relação a controle não tratado em pelo menoscerca de 30%.

66. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a-64, caracterizado pelo fato de que infiltração celular do pulmão de ditomodelo animal é inibida em relação a controle não tratado em pelo menoscerca de 50%.

67. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a-64, caracterizado pelo fato de que infiltração celular do pulmão em ditomodelo animal é inibida em relação a controle não tratado em pelo menoscerca de 70%.

68. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a-67, caracterizado pelo fato de que dito antagonista de TNFRl inibe infiltraçãocelular dos pulmões em dito modelo animal em relação a controle não tratadocom ρ <0,001.

69. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a-68, caracterizado pelo fato de que dito antagonista de TNFRl inibe infiltraçãocelular dos pulmões se verificada por contagem celular total em lavagembronquioalveolar em relação a controle não tratado em dito modelo animaladequado em um grau maior do que um inibidor de fosfodiesterase 4administrado oralmente.

70. Uso de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelofato de que o inibidor de fosfodiesterase 4 administrado oralmente é BAY 19-8004.

71. Uso de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelofato de que dito BAY 19-8004 é administrado duas vezes por dia em umadose de 10 mg/kg.

72. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a-71, caracterizado pelo fato de que dita doença respiratória é selecionada apartir do grupo consistindo de inflamação pulmonar, doença pulmonarobstrutiva crônica, asma, pneumonia, pneumonite de hipersensibilidade,infiltrado pulmonar com eosinofilia, doença pulmonar ambiental, pneumonia,bronquiectasias, fibrose cística, doença pulmonar intersticial, hipertensãopulmonar primária, tromboembolismo pulmonar, distúrbios da pleura,distúrbios do mediastino, distúrbios do diafragma, hipoventilação,hiperventilação, apnéia do sono, síndrome do desconforto respiratório agudo,mesotelioma, sarcoma, rejeição do enxerto, doença enxerto contra hospedeiro,câncer de pulmão, rinite alérgica, alergia, asbestose, aspergiloma, aspergilose,bronquiectasias, bronquite crônica, enfisema, pneumonia eosinofílica, fibrosepulmonar idiopática, doença pneumocócica invasiva, influenza, micobactériasnão tuberculosas, efusão pleural, pneumoconiose, pneumocitose, pneumonia,actinomicose pulmonar, proteinose alveolar pulmonar, antraz pulmonar,edema pulmonar, embolia pulmonar, inflamação pulmonar, histiocitose Xpulmonar, hipertensão pulmonar, nocardiose pulmonar, tuberculose pulmonar,doença veno-oclusiva pulmonar, doença pulmonar reumatóide, sarcoidose, egranulomatose de Wegener.

73. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a-71, caracterizado pelo fato de que dito indivíduo é humano, dita doençarespiratória é doença pulmonar obstrutiva crônica ou asma, e em que sãoadministrados não mais do que 10 mg/dia.

74. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a-73, caracterizado pelo fato de que o antagonista de TNFRl compreende umdomínio de polipeptídeo que tem especificidade de ligação para TNFRl, masnão agoniza substancialmente TNFRl.

75. Uso de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelofato de que dito domínio de polipeptídeo é um anticorpo ou fragmento deanticorpo.

76. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a-73, caracterizado pelo fato de que o antagonista de TNFRl compreende umanticorpo de domínio (dAb) que se liga a TNFRl e inibe ligação de Fator deNecrose Tumoral Alfa (TNFa) a TNFRl ou inibe transdução de sinal mediadaatravés de TNFRl com ligação de TNFa, em que dito dAb é selecionado apartir do grupo consistindo de um domínio variável de cadeia pesada deimunoglobulina e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina.

77. Uso de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelofato de que dito dAb é selecionado a partir do grupo consistindo de umdomínio variável de cadeia pesada humano (Vh) que tem especificidade deligação para TNFRl humano, e um domínio variável de cadeia leve humano(Vl) que tem especificidade de ligação para TNFRl humano.

78. Uso de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelofato de que a seqüência de aminoácidos de dito dAb é pelo menos 90%homóloga à seqüência de aminoácidos de um dAb selecionado a partir dogrupo consistindo de TAR2h-12 (SEQ ID NO:l), TAR2h-13 (SEQ ID NO:2),TAR2h-14 (SEQ ID NO:3), TAR2h-16 (SEQ ID NO:4), TAR2h-17 (SEQ IDNO:5), TAR2h-18 (SEQ ID NO:6), TAR2h-19 (SEQ ID NO:7), TAR2h-20(SEQ ID NO:8), TAR2h-21 (SEQ ID NO:9), TAR2h-22 (SEQ ID NO: 10),TAR2h-23 (SEQ ID NO:ll), TAR2h-24 (SEQ ID NO: 12), TAR2h-25 (SEQID NO:13), TAR2h-26 (SEQ ID NO: 14), TAR2h-27 (SEQ ID NO:15),TAR2h-29 (SEQ ID NO: 16), TAR2h-30 (SEQ ID NO: 17), TAR2h-32 (SEQID NO: 18), TAR2h-33 (SEQ ID NO: 19), TAR2h-10-l (SEQ ID N0:20),TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:21), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:22), TAR2h-10-4(SEQ ID NO:23), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:24), TAR2h-10-6 (SEQ IDNO:25), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:26), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:27),TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:28), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:29), TAR2h-10--11 (SEQ ID N0:30), TAR2h-10-12 (SEQ ID 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TAR2h-204 (SEQ ID NO: 180),TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:181), TAR2h-154-10 (SEQ ID NO: 182), eTAR2h-205 (SEQ ID NO: 183).

79. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a-78, caracterizado pelo fato de que dito antagonista de TNFRl compreendeadicionalmente uma unidade que prolonga meia vida.

80. Uso de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelofato de que dita unidade que prolonga meia vida é uma unidade depolietilenoglicol, albumina no soro ou um fragmento desta, receptor detransferrina ou uma porção de ligação de transferrina deste, ou um anticorpoou fragmento de anticorpo compreendendo um sítio de ligação para umpolipeptídeo que estimula meia vida in vivo.

81. Uso de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelofato de que dita unidade que prolonga meia vida é um anticorpo ou fragmentode anticorpo compreendendo um sítio de ligação para albumina no soro oureceptor Fc neonatal.

82. Uso de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelofato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo é um dAb.

83. Uso de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelofato de que dita unidade que prolonga meia vida é uma unidade depolietilenoglicol.

84. Uso de um antagonista de Receptor de Fator de NecroseTumoral 1 (TNFRl) selecionado por ter eficácia em um modelo animaladequado de doença respiratória quando administrado não maisfreqüentemente do que uma vez por dia em uma dose de cerca de 10 mg/kgou menos, em que eficácia em dito modelo animal existe quando infiltraçãocelular dos pulmões se verificada por contagem celular total em lavagembronquioalveolar é inibida em relação a controle não tratado com ρ < 0,05,caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento paratrataruma doença respiratória.

85. Uso de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelofato de que dito antagonista de TNFRl persiste no tecido pulmonar por pelomenos 8 horas depois de ser administrado.

86. Uso de acordo com a reivindicação 84 ou 85, caracterizadopelo fato de que dito antagonista de TNFRl é administrado por inalação ouintranasalmente.

87. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a-86, caracterizado pelo fato de que dito tecido pulmonar é pulmão.

88. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a-87, caracterizado pelo fato de que dito antagonista de TNFRl não entrasubstancialmente na circulação sistêmica.

89. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a-88, caracterizado pelo fato de que dito modelo animal adequado é o modelosubcrônico induzido por fumaça de tabaco de doença pulmonar obstrutivacrônica (COPD) em camundongos C57BL/6 fêmeas.

90. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a-88, caracterizado pelo fato de que dito modelo animal adequado é um modelode primata não humano de asma ou COPD.

91. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a-90, caracterizado pelo fato de que infiltração celular do pulmão em ditomodelo animal é inibida em relação a controle não tratado em pelo menoscerca de 30%.

92. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a-90, caracterizado pelo fato de que infiltração celular do pulmão de ditomodelo animal é inibida em relação a controle não tratado em pelo menoscerca de 50%.

93. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a-90, caracterizado pelo fato de que infiltração celular do pulmão em ditomodelo animal é inibida em relação a controle não tratado em pelo menoscerca de 70%.

94. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a-93, caracterizado pelo fato de que dito antagonista de TNFRl inibe infiltraçãocelular dos pulmões em dito modelo animal em relação a controle não tratadocom ρ <0,001.

95. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a-94, caracterizado pelo fato de que dito antagonista de TNFRl inibe infiltraçãocelular dos pulmões se verificado por contagem celular total em lavagembronquioalveolar em relação a controle não tratado em dito modelo animaladequado em um grau maior do que um inibidor de fosfodiesterase 4administrado oralmente.

96. Uso de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelofato de que o inibidor de fosfodiesterase 4 administrado oralmente é BAY 19-8004.

97. Uso de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelofato de que dito BAY 19-8004 é administrado duas vezes por dia em umadose de 10 mg/kg.

98. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a-97, caracterizado pelo fato de que dita doença respiratória é selecionada apartir do grupo consistindo de inflamação pulmonar, doença pulmonarobstrutiva crônica, asma, pneumonia, pneumonite de hipersensibilidade,infiltrado pulmonar com eosinofilia, doença pulmonar ambiental, pneumonia,bronquiectasias, fibrose cística, doença pulmonar intersticial, hipertensãopulmonar primária, tromboembolismo pulmonar, distúrbios da pleura,distúrbios do mediastino, distúrbios do diafragma, hipoventilação,hiperventilação, apnéia do sono, síndrome de desconforto respiratório agudo,mesotelioma, sarcoma, rejeição do enxerto, doença enxerto contra hospedeiro,câncer de pulmão, rinite alérgica, alergia, asbestose, aspergiloma, aspergilose,bronquiectasias, bronquite crônica, enfisema, pneumonia eosinofílica, fibrosepulmonar idiopática, doença pneumocócica invasiva, influenza, micobactériasnão tuberculosas, efusão pleural, pneumoconiose, pneumocitose, pneumonia,actinomicose pulmonar, proteinose alveolar pulmonar, antraz pulmonar,edema pulmonar, embolia pulmonar, inflamação pulmonar, histiocitose Xpulmonar, hipertensão pulmonar, nocardiose pulmonar, tuberculose pulmonar, doença veno-oclusiva pulmonar, doença pulmonar reumatóide, sarcoidose, egranulomatose de Wegener.

99. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a-97, caracterizado pelo fato de que dito indivíduo é humano, dita doençarespiratória é doença pulmonar obstrutiva crônica ou asma, e em éadministrado não mais do que 10 mg/dia.

100. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 99, caracterizado pelo fato de que o antagonista de TNFRl compreende umdomínio de polipeptídeo que tem especificidade de ligação para TNFR1, masnão agoniza substancialmente TNFRl.

101. Uso de acordo com a reivindicação 100, caracterizadopelo fato de que dito domínio de polipeptídeo é um anticorpo ou fragmento deanticorpo.

102. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 99, caracterizado pelo, fato de que o antagonista de TNFRl compreende umanticorpo de domínio (dAb) que se liga a TNFRl e inibe ligação de Fator deNecrose Tumoral Alfa (TNFa) a TNFRl ou inibe transdução de sinal mediadaatravés de TNFRl com ligação de TNFa, em que dito dAb é selecionado apartir do grupo consistindo de um domínio variável de cadeia pesada deimunoglobulina e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina.

103. Uso de acordo com a reivindicação 102, caracterizadopelo fato de que dito dAb é selecionado a partir do grupo consistindo de umdomínio variável de cadeia pesada humano (Vh) que tem especificidade deligação para TNFRl humano, e um domínio variável de cadeia leve humano(Vl) que tem especificidade de ligação para TNFRl humano.

104. Uso de acordo com a reivindicação 103, caracterizadopelo fato de que a seqüência de aminoácidos de dito dAb é pelo menos 90%homóloga à seqüência de aminoácidos de um dAb selecionado a partir dogrupo consistindo de TAR2h-12 (SEQ ID NO:l), TAR2h-13 (SEQ ID NO:2),TAR2h-14 (SEQ ID NO:3), TAR2h-16 (SEQ ID NO:4), TAR2h-17 (SEQ IDNO:5), TAR2h-18 (SEQ ID NO:6), TAR2h-19 (SEQ ID NO:7), TAR2h-20(SEQ ID NO:8), TAR2h-21 (SEQ ID NO:9), TAR2h-22 (SEQ ID N0:10),TAR2h-23 (SEQ ID NO:ll), TAR2h24 (SEQ ID NO:12), TAR2h-25 (SEQID NO: 13), TAR213-26 (SEQ ID NO:14), TAR2h-27 (SEQ ID NO:15),TAR2h-29 (SEQ ID NO: 16), TAR2h-30 (SEQ ID NO: 17), TAR2h-32 (SEQID NO: 18), TAR2h-33 (SEQ ID NO: 19), TAR2h-10-l (SEQ ID N0:20),TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:21), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:22), TAR2h-10-4(SEQ ID NO:23), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:24), TAR2h-10-6 (SEQ IDNO:25), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:26), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:27),TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:28), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:29), TAR2h-10--11 (SEQ ID N0:30), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:31), TAR2h-10-13 (SEQ IDNO:32), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:33), TAR2h-10-15 (SEQ ID N0:34),TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:35), TAR2h-10-17 (SEQ ID NO:36), TAR2h-10-18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-10-19 (SEQ ID NO:38), TAR2h-120 (SEQ IDNO:39), TAR2h-10-21 (SEQ ID N0:40), TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:41),TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:42), TAR2h-10-29 (SEQ ID NO:43), TAR2h-1031 (SEQ ID NO:44), TAR211-10-35 (SEQ ID NO:45), TAR2h-136 (SEQID NO:46), TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:47), TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:48),TAR2h-10-45 (SEQ ID NO:49), TAR2h-10-47 (SEQ ID N0:50), TAR2h-10--48 (SEQ ID NO:51), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:52), TAR2h-10-56 (SEQ IDNO:53), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:55),TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:57), TAR2h-10--68 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:59), TAR2h-10-67 (SEQ IDN0:60), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:62),TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:64), TAR2h-10--55 (SEQ ID NO:65), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:66), TAR2h-10-70 (SEQ IDNO:67), TAR2h-34 (SEQ ID NO:68), TAR2h-35 (SEQ ID NO:69), TAR2h--36 (SEQ ID NO:70), TAR2h-37 (SEQ ID NO:71), TAR2h-38 (SEQ IDNO:72), TAR2h-39 (SEQ ID NO:73), TAR2h-40 (SEQ ID NO:74), TAR2h--41 (SEQ ID NO:75), TAR2h-42 (SEQ ID NO:76), TAR2h-43 (SEQ IDNO:77), TAR2h-44 (SEQ ID NO:78), TAR2h-45 (SEQ ID NO:79), TAR2h--47 (SEQ ID N0:80), TAR2h-48 (SEQ ID NO:81), TAR2h-50 (SEQ IDNO:82), TAR2h-51 (SEQ ID NO:83), TAR2h-66 (SEQ ID NO:84), TAR2h--67 (SEQ ID NO:85), TAR2h-68 (SEQ ID NO:86), TAR2h-70 (SEQ IDNO:87), TAR2h-71 (SEQ ID NO:88), TAR2h-72 (SEQ ID NO:89), TAR2h--73 (SEQ ID N0:90), TAR2h74 (SEQ ID NO:91), TAR2h-75 (SEQ IDNO:92), TAR2h-76 (SEQ ID NO:93), TAR2h-77 (SEQ ID NO:94), TAR2h--78 (SEQ ID NO:95), TAR2h-79 (SEQ ID NO 96), TAR2h-15 (SEQ IDNO:97), TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:98), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:99),TAR2h-15-8 (SEQ ID N0:100), TAR2h-15-8-l SEQ ID N0:101), TAR2h--15-8-2 (SEQ ID N0:102), TAR2h-185-23 (SEQ ID N0:103), TAR2h-154--10-5 (SEQ ID NO: 104), TAR2h-14-2 (SEQ ID N0:105), TAR2h-151-8 (SEQ-ID NO: 106), TAR2h-152-7 (SEQ ID N0:107), TAR2h-35-4 (SEQ IDNO: 108), TAR2h-154-7 (SEQ ID N0:109), TAR2h-80 (SEQ ID N0:110),TAR2h-81 (SEQ ID NO:lll), TAR2h-82 (SEQ ID N0:112), TAR2h-83(SEQ ID NO.113), TAR2h-84 (SEQ ID NO:114), TAR2h-85 (SEQ IDNO:l 15), TAR2h-86 (SEQ ID NO:116), TAR2h-87 (SEQ ID NO:117),-TAR2h-88 (SEQ ID NO:118), TAR2h-89 (SEQ ID N0:119), TAR2h-90(SEQ ID NO: 120), TAR2h-91 (SEQ ID N0:121), TAR2h-92 (SEQ IDNO: 122), TAR2h-93 (SEQ ID NO:123), TAR2h-94 (SEQ ID NO:124),TAR2h-95 (SEQ ID NO: 125), TAR2h-96 (SEQ ID NO: 126), TAR2h-97(SEQ ID NO: 127), TAR2h-99 (SEQ ID NO: 128), TAR2h-100 (SEQ ID-NO: 129), TAR2h-101 (SEQ ID N0:l30), TAR2h-102 (SEQ ID NO:131),TAR2h-103 (SEQ ID NO:132), TAR2h-104 (SEQ ID N0.133), TAR2h-105(SEQ ID NO: 134), TAR2h-106 (SEQ ID NO:135), TAR2h-107 (SEQ IDNO: 136), TAR2h-108 (SEQ ID NO:137), TAR2h- 109 (SEQ ID NO: 138),TAR2h-l 10 (SEQ ID NO:139), TAR2h-lll (SEQ ID N0:140), TAR2h-112-(SEQ ID NO:141), TAR2h-113 (SEQ ID NO: 142), TAR2M14 (SEQ IDNO: 143), TAR2h-l 15 (SEQ ID NO:144), TAR2h-116 (SEQ ID NO:145),TAR2h-l 17 (SEQ ID NO:146), TAR2h-118 (SEQ ID NO:147), TAR2hll9(SEQ ID NO: 148), TAR2h-120 (SEQ ID NO: 149), TAR2h-I21 (SEQ IDNO: 150), TAR2h-122 (SEQ ID NO:151), TAR2h-123 (SEQ ID NO:152),TAR2hl24 (SEQ ID NO: 153), TAR2h-125 (SEQ ID NO: 154), TAR2h-126(SEQ ID NO: 155), TAR2h-127 (SEQ ID NO: 156), TAR2h-128 (SEQ IDNO: 157), TAR2hl29 (SEQ ID NO: 158), TAR2h-130 (SEQ ID NO:159),TAR2h-131 (SEQ ID NO: 160), TAR2h-132 (SEQ ID NO:161), TAR2h-133(SEQ ID N'0:162), TAR2hl51 (SEQ ID NO: 163), TAR2h-152 (SEQ IDNO: 164), TAR2h-153 (SEQ ID NO:165), TAR2h-154 (SEQ ID NO: 166),TAR2h-159 (SEQ ID NO: 167), TAR2hl65 (SEQ ID NO:168), TAR2h-166(SEQ ID NO: 169), TAR2h-168 (SEQ ID NO: 170), TAR2h-171 (SEQ IDNO:171), TAR2h-172 (SEQ ID NO: 172), TAR2hl73 (SEQ ID NO: 173),TAR2h-174 (SEQ ID NO: 174), TAR2h-176 (SEQ ID NO: 175), TAR2h-178(SEQ ID NO: 176), TAR2h-201 (SEQ ID NO: 177), TAR2h202 (SEQ TDNO: 178), TAR2h-203 (SEQ ID NO: 179), TAR2h-204 (SEQ ID NO: 180),TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:181), TAR2h-154-10 (SEQ M NO:182), eTAR2h-205 (SEQ ID NO: 183).

105. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 100a 104, caracterizado pelo fato de que dito antagonista de TNFRl compreendeadicionalmente uma unidade que prolonga meia vida.

106. Uso de acordo com a reivindicação 105, caracterizadopelo fato de que dita unidade que prolonga meia vida é uma unidade depolietilenoglicol, albumina no soro ou um fragmento desta, receptor detransferrina ou uma porção de ligação de transferrina deste, ou um anticorpoou fragmento de anticorpo compreendendo um sítio de ligação para umpolipeptídeo que estimula meia vida in vivo.

107. Uso de acordo com a reivindicação 106, caracterizadopelo fato de que dita unidade que prolonga meia vida é um anticorpo oufragmento de anticorpo compreendendo um sítio de ligação para albumina nosoro ou receptor Fc neonatal.

108. Uso de acordo com a reivindicação 107, caracterizadopelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo é um dAb.

109. Uso de acordo com a reivindicação 107, caracterizadopelo fato de que dita unidade que prolonga meia vida é uma unidade depolietilenoglicol.

110. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender ummonômero dAb que tem especificidade de ligação para TNFR1 humano eTNFR1 de outra espécie.

111. Ligante de acordo com a reivindicação 110, caracterizadopelo fato de que dito monômero dAb é um antagonista de dito TNFRlhumano e dito TNFR1 de outra espécie.

112. Ligante de acordo com a reivindicação 110 ou 111,caracterizado pelo fato de que dito monômero dAb se liga a dito TNFRlhumano e dito TNFRl de outra espécie com afinidades que diferem por nãomais do que cerca de um fator de 10.

113. Ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações-110 a 112 caracterizado pelo fato de que dito dAb se liga a dito TNFRlhumano e dito TNFRl de outra espécie com uma taxa de associação de cercade 104 M/s a cerca de 105 M/s.

114. Ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações-110 a 113 caracterizado pelo fato de que dito dAb se liga a dito TNFRlhumano e dito TNFRl de outra espécie com uma taxa de dissociação de cercade 10-3 s-1 a cerca de 10-5

115. Ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações-110 a 114, caracterizado pelo fato de que dito TNFR1 de outra espécie éTNFR1 de roedor, TNFR1 de coelho, TNFR1 de cachorro, TNFR1 de porco,TNFR1 de ovelha ou TNFR1 de primata não humano.

116. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender um dAbque se liga a TNFR1, em que dito ligante é um antagonista de dito TNFR1 e aseqüência de aminoácidos de dito dAb é pelo menos 90% homóloga aqualquer uma de SEQ ID NO:216 até SEQ ID NO:433.

117. Ligante, caracterizado pelo fato de que tem especificidadede ligação para TNFRl compreendendo uma unidade protéica que tem umsítio de ligação com especificidade de ligação para TNFRl, em que ditaunidade protéica compreende uma seqüência de aminoácidos que é a mesmaque a seqüência de aminoácidos de CDR3 de um dAb selecionado a partir dogrupo consistindo de TAR2h-131-511, TAR2h 131 -193 e TAR2h-131 -194.

118. Ligante de acordo com a reivindicação 117, caracterizadopelo fato de que dita unidade protéica compreende adicionalmente umaseqüência de aminoácidos que é a mesma que a seqüência de aminoácidos deCDRl e/ou CDR2 de.um dAb selecionado a partir do grupo consistindo deTAR2h-131-511, TA.R2h-131- 193 e TAR2h-131-194.

119. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl, em que aseqüência de aminoácidos de dito domínio variável único de imunoglobulinaque se liga a TNFRl difere da seqüência de aminoácidos de TAR2h-131-511,TAR2h-131-193 ou TAR2h-131-194 em não mais do que 25 posições deaminoácidos e tem uma seqüência CDRl que tem pelo menos 50% deidentidade com a seqüência CDRl de um dAb selecionado a partir do grupoconsistindo de TAR2h-131-511, TAR2h-131 -193 e TAR2h 131 -194.

120. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl, em aseqüência de aminoácidos de dito domínio variável único de imunoglobulinaque se liga a TNFRl difere da seqüência de aminoácidos de TAR211-131--511, TAR2h-131-193 ou TAR2h-131-194 em não mais do que 25 posições deaminoácidos e tem uma seqüência CDR2 que tem pelo menos 50% deidentidade com a seqüência CDR2 de TAR2hl31-511, TAR2h-131-193 eTAR2h-131-194.

121. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl, em que aseqüência de aminoácidos de dito domínio variável único de imunoglobulinaque se liga a TNFRl difere da seqüência de aminoácidos TAR2h-131-511,TAR2h-131-193 ou TAR2h-131-194 em não mais do que 25 posições deaminoácidos e tem uma seqüência CDR3 que tem pelo menos 50% deidentidade com a seqüência CDR3 de um dAb selecionado a partir do grupoconsistindo de TAR2h-131-511, TAR2h-131-193 e TAR2hl31-194.

122. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl, em que aseqüência de aminoácidos de dito domínio variável único de imunoglobulinaque se liga a TNFRI difere da seqüência de aminoácidos de TAR2h-131-511,TAR2h-131-193 ou TAR2h-131-194 em não mais do que 25 posições deaminoácidos e tem uma seqüência CDRl e uma seqüência CDR2 que têmpelo menos 50% de identidade com as seqüências CDRl ou CDR2,respectivamente, de um dAb selecionado a partir do grupo consistindo deTAR2h-131-511, TAR2h-131-193 e TAR2h-131-194.

123. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender domíniovariável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl, em que a seqüênciade aminoácidos de dito domínio variável único de imunoglobulina que se ligaa TNFRl difere da seqüência de aminoácidos de TAR2h-131-511, TAR2h--131-193 ou TAR2h-131-194 em não mais do que 25 posições de aminoácidose tem uma seqüência CDR2 e uma seqüência CDR3 que têm pelo menos 50%de identidade com as seqüências CDR2 ou CDR3, respectivamente, de umdAb selecionado a partir do grupo consistindo de TAR2h-131-511, TAR2h--131-193 eTAR2h-131-194.

124. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl, em que aseqüência de aminoácidos de dito domínio variável único de imunoglobulinaque se liga a TNFRl difere da seqüência de aminoácidos de TAR2h-131-511,TAR2h-131-193 de TAR2h-131-194 em não mais do que 25 posições deaminoácidos e tem uma seqüência CDR1 e uma seqüência CDR3 que têmpelo menos 50% de identidade com as seqüências CDR1 ou CDR3,respectivamente, de um dAb selecionado a partir do grupo consistindo deTAR2h-131-511, TAR2h-131-193 e TAR2h-131-194.

125. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFR1, em que aseqüência de aminoácidos de dito domínio variável único de imunoglobulinaque se liga a TNFRl difere da seqüência de aminoácidos de TAR2h-131-511,TAR2h-131-193 ou TAR2h-131-194 em não mais do que 25 posições deaminoácidos e tem uma seqüência CDR1, uma seqüência CDR2 e umaseqüência CDR3 que têm pelo menos 50% de identidade com as seqüênciasCDR1, CDR2 ou CDR3, respectivamente, de um dAb selecionado a partir dogrupo consistindo de TAR2h-131-511, TAR2h-131 -193 e TAR2h-131-194.

126. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFR1, em que ditodomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFR1 compreendeuma seqüência CDR2 que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência CDR1 de um dAb selecionado a partir do grupo consistindo deTAR2h-131-511, TAR2h-131 -193 e TAR2h 131 -194.

127. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFR1, em que ditodomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFR1 compreendeuma seqüência CDR2 que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência CDR2 de um dAb selecionado a partir do grupo consistindo deTAR2h-131-511,TAR2h-131-193 e TAR2hl31-194.

128. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFR1, em que ditodomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFR1 compreendeuma seqüência CDR3 que tem pelo menos 50% de identidade com aseqüência CDR3 de um dAb selecionado a partir do grupo consistindo deTAR2h-131-511, TAR2h-131-193 e TAR2h-131-194.

129. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl ,em que ditodomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl compreendeuma seqüência CDRl e uma CDR2 que tem pelo menos 50% de identidadecom as seqüências CDRl e CDR2, respectivamente, de um dAb selecionado apartir do grupo consistindo de TAR2h-131-511, TAR2h-131-193 e TAR2h-131-194.

130. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl, em que ditodomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl compreendeuma seqüência CDR2 e uma CDR3 que tem pelo menos 50% de identidadecom as seqüências CDR2 e CDR3, respectivamente, de um dAb selecionado apartir do grupo consistindo de TAR2h-131-511, TAR2h-131-193 e TAR2h-131-194.

131. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl, em que ditodomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl compreendeuma seqüência CDRl e uma CDR3 que tem pelo menos 50% de identidadecom as seqüências CDRl e CDR3, respectivamente, de um dAb selecionado apartir do grupo consistindo de TAR2h-131-511, TAR2h-131-193 e TAR2h-131-194.

132. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender umdomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl, em que ditodomínio variável único de imunoglobulina que se liga a TNFRl compreendeuma seqüência CDRl, uma CDR2 e uma CDR3 que tem pelo menos 50% deidentidade com as seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, de umdAb selecionado a partir do grupo consistindo de TAR2h-131-511, TAR2h--131-193 eTAR2h-131-194.

133. Ligante, caracterizado pelo fato de compreender um dAbque se liga a TNFRl humano e é um antagonista de TNFRl humano, em quedito ligante inibe inflamação induzida por TNFa. ou mediador inflamatórioinduzido por TNFa em uma dose [mg/kg] que não é maior do que 1/2 a dosede etanercept que é requerida para inibir dita inflamação induzida por TNFaou mediador inflamatório induzido por TNFa até substancialmente o mesmograu.

134. Ligante de acordo com a reivindicação 133, caracterizadopelo fato de que dito ligante inibe inflamação induzida por TNFa ou mediadorinflamatório induzido por TNFa em uma dose [mg/kg] que não é maior doque 1/10 da dose de etanercept que é requerida para inibir dita inflamaçãoinduzida por TNFa ou mediador inflamatório induzido por TNFa atésubstancialmente o mesmo grau.

135. Ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações-110 a 134, caracterizado pelo fato de que dito ligante compreendeadicionalmente uma unidade que prolonga meia vida.

136. Ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações-110 a 134, caracterizado por ser para uso em terapia ou diagnose.

137. Uso de um ligante como definido em qualquer uma dasreivindicações 110 a 134, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação deum medicamento para administração local para tecido pulmonar.

138. Uso de um ligante como definido em qualquer uma dasreivindicações 110 a 134 caracterizado pelo fato de ser para a fabricação deum medicamento para tratamento ou prevenção de doença respiratória.

139. Ácido nucleico isolado ou recombinante, caracterizadopor codificar um ligante como definido em qualquer uma das reivindicações-110 a 134.

140. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender o ácidonucleico recombinante como definido na reivindicação 139.

141. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato decompreender o ácido nucleico recombinante como definido na reivindicação139 ou o vetor como definido na reivindicação 140.

142. Método para produzir um ligante, caracterizado pelo fatode compreender manter uma célula hospedeira como definida nareivindicação 141 em condições adequadas para expressão de dito ácidonucleico ou vetor, através do qual um ligante é produzido.

143. Método de acordo com a reivindicação 142, caracterizadopelo fato de compreender adicionalmente isolar o ligante.