ES2656501T3

ES2656501T3 - Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de cáncer de vesícula biliar

Info

Publication number: ES2656501T3
Application number: ES13769665.4T
Authority: ES
Inventors: Takanori Saito; Fumiyoshi Okano; Takayoshi Ido
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2018-02-27
Anticipated expiration: 2033-03-29
Also published as: WO2013147176A1; EP2832366B1; CN104203281B; KR20150002618A; EP2832366A1; PL2832366T3; RU2014143784A; AU2013241043A1; JPWO2013147176A1; KR102052400B1; CA2869123C; HUE036425T2; MX357965B; CA2869123A1; EP2832366A4; CN104203281A; BR112014024209A2; RU2649802C2; AU2013241043B2; US9428581B2

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de cáncer de vesícula biliar, que comprende, como principio activo, un anticuerpo o un fragmento del mismo que se unen a una proteína CAPRIN-1 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de los números de secuencia pares de las SEQ ID NO: 2 a 30 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80 % o más con la secuencia de aminoácidos, o un fragmento de la proteína CAPRIN-1 que comprende al menos siete restos de aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos de la proteína.

Description

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más preferentemente 95 % al 100 %, tal como 97 % al 100 %, 98 % al 100 %, 99 % al 100 %, o 99,5 % al 100 %, con la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos del ORF o la parte madura del gen CAPRIN-1 humano cuando la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del mismo se basan en las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 1 o 3 y SEQ ID NO: 2 o 4, respectivamente. Aquí, el término "% de identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos (o de nucleótidos) se refiere al porcentaje (%) del número de aminoácidos (o nucleótidos) en una secuencia que coincide con aquellos en la otra secuencia con respecto al número total cuando las dos secuencias están alineadas (alineamiento) con un grado de similitud máximo o coincidencia introduciendo un hueco o no.

Un fragmento de la proteína CAPRIN-1 tiene una longitud de una longitud de aminoácido de un epítope (determinante de antígeno), que es una unidad mínima reconocida por un anticuerpo, a una longitud de aminoácido más corta que la longitud total de la proteína. El epítope se refiere a un fragmento de polipéptido que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en un mamífero, preferentemente en un ser humano, y su unidad mínima consiste en aproximadamente 7 a 12 aminoácidos, tales como 8 a 11 aminoácidos. Ejemplos del epítope incluyen las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272 y SEQ ID NO: 269; y una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80 % o más, preferentemente del 85 % o más, más preferentemente del 90 % o más y lo más preferentemente del 95 % o más con cualquiera de las secuencias de aminoácidos.

El polipéptido que comprende una proteína CAPRIN-1 humana o un péptido parcial del mismo puede sintetizarse, por ejemplo, según una síntesis química tal como un método de fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) o un método de tbutiloxicarbonilo (tBoc) (Seikagaku Jikken Koza (Evolución de Experimentos Bioquímicos) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Química de Proteínas) IV, Kagaku shushoku to peputido gosei (Modificación química y síntesis de péptidos), editado por la Japanese Biochemistry Society, Tokyo Kagaku Dojin (Japón), 1981). Alternativamente, el péptido puede sintetizarse por un método usual usando diversos sintetizadores de péptidos comercialmente disponibles. Además, puede obtenerse un péptido diana preparando un ADN que codifica el polipéptido por un procedimiento de ingeniería genética conocido (por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning, 2ª edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, et al., Short Protocolos in Molecular Biology, 3ª edición, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons), incorporando el ADN en un vector de expresión e introduciéndolo en una célula hospedadora y permitiendo la producción del péptido en la célula hospedadora.

El ADN que codifica el polipéptido puede ser fácilmente preparado por un procedimiento de ingeniería genética conocido o por un método usual con un sintetizador de péptidos comercialmente disponible. Por ejemplo, un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 puede prepararse por PCR usando un par de cebadores diseñados de forma que la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 pueda amplificarse usando un cromosoma humano o biblioteca de ADNc como molde. Las condiciones de reacción para la PCR pueden ser apropiadamente determinadas y ejemplos no limitantes de las mismas incluyen condiciones en las que se usa un tampón de PCR que contiene una ADN polimerasa estable al calor (por ejemplo, Taq polimerasa) y Mg2+ y la amplificación se realiza repitiendo, por ejemplo, 30 ciclos de un proceso que consiste en reacciones a 94 ºC durante 30 segundos (desnaturalización), a 55 ºC durante 30 segundos a 1 minuto (hibridación) y a 72 ºC durante 2 minutos (extensión) y luego realizando una reacción a 72 ºC durante 7 minutos. El procedimiento, condiciones y otros factores de PCR se describen en, por ejemplo, Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3ª edición, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, (1995), John Wiley & Sons (en particular, el capítulo 15).

Puede aislarse un ADN deseado preparando sondas y cebadores apropiados basándose en la información de las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 1 a 30 del listado de secuencias en la memoria descriptiva y cribando, por ejemplo, una biblioteca de ADNc humana usando las sondas y cebadores resultantes. La biblioteca de ADNc se construye preferentemente a partir de células, un órgano, o tejido que expresa las proteínas expuestas en cualquiera de los números de secuencia pares de SEQ ID NO: 2 a 30. Ejemplos de las células y tejido incluyen aquellos derivados de testículo y cáncer o células tumorales, tales como leucemia, cáncer de mama, linfoma, tumor cerebral, cáncer de pulmón, cáncer de colon y cáncer de vesícula biliar. Los procedimientos anteriormente descritos, tales como la preparación de sondas o cebadores, la construcción de una biblioteca de ADNc, cribado de la biblioteca de ADNc y clonación de un gen diana son conocidos para aquellos expertos en la materia y pueden realizarse, por ejemplo, según el método descrito en, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning, 2ª edición, Current Protocols in Molecular Biology, (1989) o Ausubel, et al. (anteriormente). Puede prepararse un ADN que codifica una proteína CAPRIN-1 humana o un péptido parcial de la misma a partir del ADN así preparado.

La célula hospedadora puede ser cualquier célula que pueda expresar el péptido anteriormente mencionado y ejemplos de la misma incluyen, pero no se limitan a, células procariotas tales como células de E. coli y células eucariotas tales como células de mamífero, por ejemplo, células COS1 de riñón de mono y células CHO de ovario de hámster chino, línea celular HEK293 de riñón embrionario humano, línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón NIH3T3, células de levadura, por ejemplo, levaduras en gemación y células de fisión de levadura, células de gusano de seda y células de huevos de Xenopus.

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antitumorales de los mismos. Estos anticuerpos monoclonales comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 411, o SEQ ID NO: 421, y un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 415, o SEQ ID NO: 425. El dominio VH comprende CDR1 representada por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 408, o SEQ ID NO: 418, CDR2 representada por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 409, o SEQ ID NO: 419 y CDR3 representada por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 420. El dominio VL comprende CDR1 representada por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 412, o SEQ ID NO: 422, CDR2 representada por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 413, o SEQ ID NO: 423 y CDR3 representada por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 414, o SEQ ID NO: 424.

Se produce un anticuerpo quimérico combinando secuencias derivadas de animales diferentes y es, por ejemplo, un anticuerpo que consiste en los dominios pesados y variables de la cadena ligera de un anticuerpo de ratón y los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano. El anticuerpo quimérico puede producirse por un método conocido, por ejemplo, uniendo un ADN que codifica un dominio V de anticuerpo y un ADN que codifica un dominio C de anticuerpo humano, incorporándolo en un vector de expresión e introduciendo el vector de expresión en un hospedador.

Ejemplos del anticuerpo policlonal incluyen anticuerpos preparados inmunizando un animal productor de anticuerpos humanos (por ejemplo, ratón) con una proteína CAPRIN-1.

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El anticuerpo humanizado es un anticuerpo alterado también llamado anticuerpo humano reformado. El anticuerpo humanizado se construye trasplantado CDR de un anticuerpo derivado de un animal inmune en la región determinante de la complementariedad de un anticuerpo humano. También se conoce un método por una tecnología de recombinación génica general.

Específicamente, una secuencia de ADN diseñada para unir las CDR de un anticuerpo de ratón y las regiones estructurales (FR; que incluyen FR1 a FR4) de un anticuerpo humano en el orden: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3CDR3-FR4, del lado del extremo N se sintetiza por PCR a partir de varios oligonucleótidos producidos de manera que tengan porciones que se solapan en las regiones terminales. El ADN resultante se une a un ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo humano y se incorpora en un vector de expresión y el vector de expresión se introduce en un hospedador para producir un anticuerpo humanizado (véase la solicitud de patente EP N.º EP239400 y la publicación internacional N.º WO96/02576). Se seleccionan FR de un anticuerpo humano unidas mediante CDR de forma que la región determinante de la complementariedad forme un sitio de unión satisfactorio al antígeno. Según se necesite, un aminoácido en la región estructural en el dominio variable del anticuerpo puede ser sustituido de forma que la región determinante de la complementariedad del anticuerpo humano reformado forme un sitio de unión al antígeno apropiado (Sato K. et al., Cancer Research, 1993, 53: 851856). La región estructural puede estar sustituida por una región estructural derivada de diversos anticuerpos humanos (véase la publicación internacional N.º WO99/51743).

El anticuerpo quimérico resultante o anticuerpo humanizado pueden someterse además a, por ejemplo, sustitución de un aminoácido en el dominio variable (por ejemplo, FR) o dominio constante por otro aminoácido.

En la sustitución de aminoácidos, por ejemplo, menos de 15, menos de 10, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos de aminoácidos, preferentemente uno a cinco aminoácidos y más preferentemente uno o dos aminoácidos, están sustituidos. El anticuerpo sustituido debe ser funcionalmente equivalente al anticuerpo no sustituido. La sustitución es deseablemente sustitución de aminoácidos conservativa, que es sustitución entre aminoácidos que tienen propiedades similares tales como carga, cadena lateral, polaridad y aromaticidad. Los aminoácidos que tienen propiedades similares pueden clasificarse en, por ejemplo, aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico), aminoácidos polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína y tirosina), aminoácidos no polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina), aminoácidos de cadena ramificada (leucina, valina e isoleucina), o aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano e histidina).

Ejemplos de anticuerpos modificados incluyen anticuerpos unidos a diversas moléculas tales como polietilenglicol (PEG). En el anticuerpo modificado usado en la presente invención, el anticuerpo puede unirse a cualquier material. Estos anticuerpos modificados pueden prepararse modificando químicamente un anticuerpo preparado. El método para la modificación ha sido ya establecido en este campo.

Aquí, el término "funcionalmente equivalente" se refiere a que el anticuerpo objetivo tiene actividad biológica o bioquímica similar a la de un anticuerpo usado en la presente invención, específicamente, por ejemplo, que el anticuerpo objetivo tiene una función de alteración del tumor y no produce sustancialmente reacción de rechazo en aplicación a un ser humano. Tal actividad es, por ejemplo, actividad inhibitoria del crecimiento celular o avidez.

El método muy conocido para aquellos expertos en la materia para preparar un polipéptido funcionalmente equivalente a un cierto polipéptido es un método de introducción de una variación en el polipéptido. Por ejemplo, un experto en la materia puede preparar un anticuerpo funcionalmente equivalente a un anticuerpo usado en la presente invención introduciendo una variación apropiada en el anticuerpo mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995), Gene, 152, 271-275; Zoller, M.J. y Smith, M., (1983), Methods Enzymol., 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984), Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456; Kramer, W. y Fritz, H.J., (1987), Methods Enzymol., 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82,488-492; Kunkel, (1988), Methods Enzymol., 85, 2763-2766).

Un anticuerpo que reconoce el epítope de una proteína CAPRIN-1 que es reconocida por el anticuerpo anti-CAPRIN-1 puede prepararse por un método conocido para aquellos expertos en la materia. El anticuerpo puede prepararse, por ejemplo, por un método de producción de un anticuerpo determinando un epítope de la proteína CAPRIN-1 reconocida por un anticuerpo anti-CAPRIN-1 mediante un método usual (por ejemplo, mapeo de epítopes) y usando un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del epítope como inmunogén o un método de selección de un anticuerpo que tiene el mismo epítope que el de un anticuerpo anti-CAPRIN-1 de anticuerpos que tienen diversos epítopes producidos por un método usual.

El anticuerpo usado en la presente invención tiene preferentemente una constante de afinidad Ka (kdis/kasoc) de 107 M-1 o más, 108 M-1 o más, 5×108 M-1 o más, 109 M-1 o más, 5×109 M-1 o más, 1010 M-1 o más, 5×1010 M-1 o más, 1011 M-1 o más, 5×1011 M-1 o más, 1012 M-1 o más, o 1013 M-1 o más.

El anticuerpo usado en la presente invención puede conjugarse con un agente antitumoral. El anticuerpo y el agente antitumoral pueden unirse entre sí mediante un espaciador que tiene un grupo reactivo, tal como un grupo amino, un

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secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 41, 42 y 43, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096528 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 40 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 44).

(b): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 47, 48 y 49, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 51, 52 y 53, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096519 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 50 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 54).

(c): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 57, 58 y 59, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 61, 62 y 63, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096517 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 60 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 64).

(d): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 67, 68 y 69, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 71, 72 y 73, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096528 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 70 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 74).

(e): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 77, 78 y 79, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 81, 82 y 83, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096528 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 80 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 84).

(f): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 87, 88 y 89, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 91, 92 y 93, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096528 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 90 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 94).

(g): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 97, 98 y 99, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 101, 102 y 103, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096528 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 100 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 104).

(h): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 107, 108 y 109, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 111, 112 y 113, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096528 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 110 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 114).

(i): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 117, 118 y 119, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 121, 122 y 123, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096533 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 120 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 124).

(j): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 127, 128 y 129, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 121, 122 y 123, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096533 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 130 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 124).

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(k): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 132, 133 y 134, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 136, 137 y 138, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096533 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 135 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 139).

(l): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 142, 143 y 144, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 146, 147 y 148, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096534 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 145 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 149).

(m): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 142, 143 y 144, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 152, 153 y 154, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096534 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 145 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 155).

(n): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende CDR de SEQ ID NO: 157, 158 y 159 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende CDR de SEQ ID NO: 161, 162 y 163, descritas en el documento WO2011/096534 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 160 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 164).

(o): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 167, 168 y 169, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 171, 172 y 173, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096534 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 170 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 174).

(p): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 167, 168 y 169, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 177, 178 y 179, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 170 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 180).

(q): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 167, 168 y 169, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 182, 183 y 184, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 170 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 185).

(r): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 167, 168 y 169, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 187, 188 y 189, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 170 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 190).

(s): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 167, 168 y 169, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 192, 193 y 194, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 170 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 195).

(t): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 197, 198 y 199, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 201, 202 y 203, respectivamente, descritas en el

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documento WO2010/016526 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 200 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 204).

(u): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 207, 208 y 209, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 211, 212 y 213, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 210 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 214).

(v): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 217, 218 y 219, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 221, 222 y 223, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 220 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 224).

(w): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 227, 228 y 229, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 231, 232 y 233, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 230 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 234).

(x): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 237, 238 y 239, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 241, 242 y 243, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 240 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 244).

(y): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 247, 248 y 249, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 251, 252 y 253, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 250 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 254).

(z): Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 276, 277 y 278, respectivamente y regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 280, 281 y 282, respectivamente, descritas en el documento WO2013/018894 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 279 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 283). (aa) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 276, 277 y 278, respectivamente y regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 286, 287 y 288, respectivamente, descritas en el documento WO2013/018894 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 279 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 289). (ab) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 291, 292 y 293, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 295, 296 y 297, respectivamente, descritas en el documento WO2013/018894 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 294 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 298). (ac) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 301, 302 y 303, respectivamente, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 305, 306 y 307, respectivamente, descritas en el documento WO2013/018892 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada expuesto en SEQ ID NO: 304 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en SEQ ID NO: 308). (ad) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de la cadena pesada que comprende regiones

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afinidad) Ka (kas/kdisoc) es preferentemente 107 M-1 o más, 108 M-1 o más, 5×108 M-1 o más, 109 M-1 o más, 5×109 M-1

o más, 1010 M-1 o más, 5×1010 M-1 o más, 1011 M-1 o más, 5×1011 M-1 o más, 1012M-1 o más, o 1013 M-1 o más.

<Unión a célula que expresa antígeno>

5 La capacidad de un anticuerpo para unirse a una proteína CAPRIN-1 puede especificarse mediante ensayo de unión, por ejemplo, por ELISA, transferencia Western, inmunofluorescencia, o citometría de flujo, como se describen en Ejemplos.

10 <Tinción inmunohistoquímica>

El anticuerpo que reconoce una proteína CAPRIN-1 puede probarse para reactividad con la proteína CAPRIN-1 por un método inmunohistoquímico muy conocido para aquellos expertos en la materia usando secciones congeladas fijadas en paraformaldehído o acetona o secciones de tejido incorporadas en parafina fijadas en paraformaldehído

15 de tejido derivado de un paciente durante cirugía o tejido derivado de un animal que lleva heterotrasplante inoculado con una línea celular que expresa una proteína CAPRIN-1 naturalmente o después de la transfección.

Un anticuerpo reactivo con una proteína CAPRIN-1 puede teñirse por diversos métodos para tinción inmunohistoquímica. Por ejemplo, el anticuerpo puede visualizarse haciendo reaccionar un anticuerpo anti-ratón o

20 anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante.

<Composición farmacéutica>

La diana de la composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de cáncer de vesícula biliar de la 25 presente invención puede ser cualquier cáncer de vesícula biliar (células) que exprese un gen CAPRIN-1.

Los términos "tumor" y "cáncer" usados en toda la presente memoria descriptiva se refieren a una neoplasia maligna y se usan indistintamente.

30 El cáncer de vesícula biliar como diana en la presente invención expresa un gen que codifica una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de los números de secuencia pares de SEQ ID NO: 2 a 30, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80 % o más, preferentemente del 90 % o más, más preferentemente del 95 % o más y lo más preferentemente del 97 % o más con la secuencia de aminoácidos, o una secuencia parcial que comprende al menos siete, preferentemente al menos ocho restos de aminoácidos

35 consecutivos de cualquiera de estas secuencias de aminoácidos. Ejemplos del cáncer de vesícula biliar incluyen, pero no se limitan a, carcinoma que surge en vesícula biliar (cáncer primario) y cáncer metastásico.

El animal objetivo es mamíferos tales como un primate, una mascota, un animal doméstico y un animal para uso competitivo y es preferentemente un ser humano, un perro, o un gato.

40 La composición farmacéutica del anticuerpo usado en la presente invención puede ser fácilmente formulada por un método conocido para aquellos expertos en la materia. La composición farmacéutica puede usarse, por ejemplo, por vía parenteral en una forma de una solución aséptica con agua u otro líquido farmacéuticamente aceptable o una inyección de una preparación de suspensión. Por ejemplo, se propone formular combinando apropiadamente la

45 composición farmacéutica con un vehículo o medio farmacológicamente aceptable, específicamente, agua esterilizada, solución salina fisiológica, aceite vegetal, un emulsionante, un agente de suspensión, un tensioactivo, un estabilizador, un aromatizante, un excipiente, un vehículo, un antiséptico, o un aglutinante y mezclarlos en una forma de dosificación unitaria deseada en ejecución de fabricación de fármacos generalmente reconocida. La cantidad del principio activo en un fármaco tal está controlada de manera que se proporcione una dosis apropiada

50 dentro de un intervalo indicado.

La composición aséptica para inyección puede ser recetada según la ejecución de la preparación farmacéutica usual usando un vehículo tal como agua destilada para inyección.

55 Ejemplos de soluciones acuosas para inyección incluyen solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que contienen glucosa u otros adyuvantes, tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol, o cloruro sódico. La solución acuosa puede usarse junto con un solubilizante apropiado, por ejemplo, alcohol, específicamente, etanol o polialcohol; propilenglicol, polietilenglicol, o un detergente no iónico; o polisorbato 80(TM) o HCO-60.

60 Ejemplos de líquidos aceitosos incluyen aceite de sésamo y aceite de soja y el líquido aceitoso puede usarse junto con benzoato de bencilo o alcohol bencílico como solubilizante. Además, pueden mezclarse un tampón tal como un tampón fosfato o un tampón acetato sódico, un agente calmante tal como clorhidrato de procaína, un estabilizador tal como alcohol bencílico o fenol, o un antioxidante. La inyección preparada se envasa normalmente en una ampolla apropiada.

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La administración es oral o parenteral y es preferentemente parenteral y ejemplos de la misma incluyen formas de dosificación por inyección, transnasal, pulmonar y transdérmica. En la forma de dosificación por inyección, por ejemplo, puede realizarse administración sistémica o local por inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea.

El método de administración puede ser apropiadamente seleccionado basándose en la edad, peso, sexo, síntomas, etc., de un paciente. La dosis de la composición farmacéutica que contiene un anticuerpo o un polinucleótido que codifica el anticuerpo puede seleccionarse, por ejemplo, dentro de un intervalo de 0,0001 a 1000 mg/kg de peso corporal por vez o, por ejemplo, dentro de un intervalo de 0,001 a 100000 mg/cuerpo por paciente. Estos valores numéricos no son necesariamente restrictivos. La dosis y el método de administración varían dependiendo del peso, edad, sexo, síntomas, etc., de un paciente, pero pueden ser apropiadamente seleccionados por aquellos expertos en la materia.

El cáncer de vesícula biliar puede tratarse administrando la composición farmacéutica de la presente invención a un sujeto.

La presente invención engloba además medios, como se define en las reivindicaciones, para tratar cáncer de vesícula biliar administrando la composición farmacéutica de la presente invención junto con un agente antitumoral como se ejemplifica anteriormente o una composición farmacéutica que contiene un agente antitumoral tal a un sujeto. El anticuerpo o un fragmento del mismo de la presente invención y el agente antitumoral pueden ser administrados simultáneamente o por separado a un sujeto. En el caso de administración separada, puede administrarse cualquier composición farmacéutica antes o después y el intervalo de administración, dosis, vías de administración y la frecuencia de administración de los mismos pueden ser apropiadamente seleccionados por un especialista médico. Ejemplos de la otra forma de dosificación medicinal que va a ser simultáneamente administrada también incluyen composiciones farmacéuticas preparadas mezclando el anticuerpo o un fragmento del mismo de la presente invención y un agente antitumoral en un vehículo farmacológicamente aceptable (o medio) y formulando la mezcla. La descripción para la prescripción, formulación, vía de administración, dosis, cáncer, etc., se refiere a la composición farmacéutica que contiene el anticuerpo de la presente invención y la forma de dosificación puede aplicarse a cualquiera de las composiciones farmacéuticas que contienen agentes antitumorales y las formas de dosificación. Por tanto, la presente invención también proporciona un agente farmacéutico de combinación (también denominado "kit farmacéutico") para su uso en un método de tratamiento de cáncer de vesícula biliar, que comprende la composición farmacéutica de la presente invención y una composición farmacéutica que contiene un agente antitumoral como se ejemplifica anteriormente.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de cáncer de vesícula biliar, que comprende el anticuerpo o un fragmento del mismo de la presente invención y un agente antitumoral junto con un vehículo farmacológicamente aceptable.

Alternativamente, el agente antitumoral puede conjugarse con el anticuerpo o un fragmento del mismo de la presente invención. El conjugado puede mezclarse con un vehículo farmacológicamente aceptable (o medio) y formularse en una composición farmacéutica como antes.

Ejemplos

La presente invención se describirá ahora más específicamente basándose en ejemplos, pero el alcance de la presente invención no está limitado por estos ejemplos.

[Ejemplo 1] Identificación de proteína de antígeno de cáncer por el método SEREX

(1) Preparación de biblioteca de ADNc

Se extrajo ARN total del tejido de testículo de un perro sano por un método ácido de guanidio-fenol-cloroformo y se purificó poli(A) ARN usando el kit de purificación de ARNm Oligotex-dT30 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) según el protocolo adjunto al kit.

Se sintetizó una biblioteca de fagos de ADNc derivada de testículo de perro usando el ARNm obtenido (5 µg). La biblioteca de fagos de ADNc se preparó usando el kit de síntesis de ADNc, kit de síntesis de ZAP-ADNc y el kit de clonación ZAP-ADNc Gigapack III Gold (fabricados por Stratagene Corporation) según los protocolos adjuntos a los kits. El tamaño de la biblioteca de fagos de ADNc producida fue 7,73×105 ufp/ml.

(2) Cribado de la de biblioteca de ADNc con suero

Se usó la biblioteca de fagos de ADNc derivada de testículo de perro para inmunocribado. Específicamente, se infectaron células hospedadoras de E. coli (XL1-Blue MRF') con la biblioteca tal que se formaron 2210 clones sobre una placa de agarosa NZY de Φ 90×15 mm. Entonces, las células hospedadoras de E. coli se cultivaron a 42 ºC durante 3 a 4 horas para producir placas. La placa se cubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra:

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(fabricada por Japan SLC, Inc.) y se administró adicionalmente tres veces o 24 veces con intervalos de una semana para completar la inmunización. Se extrajo el bazo el tercer día desde la última inmunización y se molió entre dos portaobjetos esterilizados y se lavó con PBS (-) (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), seguido de centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos para eliminar el sobrenadante. Este procedimiento se repitió tres veces para obtener células del bazo. Se mezclaron las células del bazo resultantes y las células de mieloma de ratón SP2/0 (compradas de ATCC) a una relación de 10:1 y se añadió una solución de PEG preparada mezclando 200 µl de medio RPMI1640 que contenía 10 % de FBS y 800 µl de PEG 1500 (fabricada por Boehringer Ingelheim GmbH) y calentada a 37 ºC a la mezcla resultante, seguido de dejarlas reposar durante 5 minutos para la fusión de células. Se realizó centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. Las células se suspendieron en una mezcla de 150 ml de medio RPMI1640 (medio de selección HAT) que contenía 15 % de FBS y 2 % equivalentes de una solución de HAT fabricada por Gibco y la suspensión se sembró en 15 placas, que fueron placas de 96 pocillos (fabricadas por Nunc), a 100 µl por pocillo. El cultivo a 37 ºC en 5 % de CO2 durante 7 días dio hibridomas de las células del bazo y las células de mieloma.

Se seleccionaron hibridomas usando, como índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas por una proteína CAPRIN-1. Se añadió una solución de 1 µg/ml de la proteína CAPRIN-1 preparada en el Ejemplo 2 a una placa de 96 pocillos a 100 µl por pocillo, seguido de dejarla reposar a 4 ºC durante 18 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces y se añadieron 400 µl de una solución al 0,5 % de albúmina de suero bovino (BSA) (fabricada por Sigma-Aldrich Co., LLC.) a cada pocillo, seguido de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución y cada pocillo se lavó con 400 µl de PBS-T tres veces y se añadieron 100 µl del sobrenadante de cultivo de hibridomas preparado anteriormente a cada pocillo, seguido de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces y se añadieron a cada pocillo 100 µl de un anticuerpo anti-IgG de ratón marcada con HRP (H+L) (fabricado por Life Technologies) diluido 5000 veces con PBS, seguido de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces y se añadieron 100 µl de una solución de sustrato TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific K.K.) a cada pocillo, seguido de dejarla reposar durante 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, se añadieron 100 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pocillo para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas que producen anticuerpos que muestran altos valores de absorbancia.

Los hibridomas seleccionados se sembraron en una placa de 96 pocillos a 0,5 células por pocillo y se cultivaron. Después de una semana, se observaron hibridomas que formaban colonias individuales en los pocillos. Las células en los pocillos se cultivaron adicionalmente y se seleccionaron hibridomas usando, como índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas clonados por una proteína CAPRIN-1. Se añadió una solución de 1 µg/ml de la proteína CAPRIN-1 preparada en el Ejemplo 2 a una placa de 96 pocillos a 100 µl por pocillo, seguido de dejarla reposar a 4 ºC durante 18 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces y se añadieron 400 µl de una solución al 0,5 % BSA a cada pocillo, seguido de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución y cada pocillo se lavó con 400 µl de PBS-T tres veces y se añadieron 100 µl del sobrenadante de cultivo de hibridoma preparado anteriormente a cada pocillo, seguido de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces y se añadieron 100 µl de un anticuerpo anti-IgG de ratón marcada con HRP (H+L) (fabricado por Life Technologies) diluido 5000 veces con PBS a cada pocillo, seguido de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces y se añadieron 100 µl de una solución de sustrato TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific K.K.) a cada pocillo, seguido de dejarla reposar durante 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, se añadieron 100 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pocillo para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, se obtuvieron 150 cepas de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales de ratón reactivos con una proteína CAPRIN-1.

Posteriormente, de estos anticuerpos monoclonales de ratón, se seleccionaron anticuerpos reactivos con la superficie celular de células de cáncer que expresan la proteína CAPRIN-1. Específicamente, se centrifugaron 1×106 células de la línea de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 V con un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml. A las células se añadieron 100 µl del sobrenadante de cultivo de los hibridomas anteriormente descritos, seguido de dejarlas reposar sobre hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, a las células se añadió un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcada con FITC (fabricado por Life Technologies) diluido 500 veces con PBS que contenía 0,1 % de FBS, seguido de dejarlas reposar sobre hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Calibur disponible de Becton, Dickinson and Company. Por separado, como control, se realizó el mismo procedimiento que antes usando suero no tratado de un ratón Balb/c de 6 semanas de edad diluido 500 veces con un medio de cultivo de hibridomas, en lugar del anticuerpo. Como resultado, se seleccionaron 22 anticuerpos monoclonales de ratón (anticuerpos monoclonales de ratón N.º 1 a N.º 22) que mostraron intensidades de fluorescencia más altas en comparación con el control, es decir, reaccionaron con la superficie celular de células de cáncer de mama.

Con el fin de producir un anticuerpo de pollo monoclonal, se mezclaron 300 µg de una proteína de antígeno (proteína CAPRIN-1 humana) expuesta en SEQ ID NO: 2 preparada en el Ejemplo 2 con la misma cantidad de adyuvante completo de Freund y la mezcla se usó como solución de antígeno para un pollo. La solución de antígeno se administró por vía intraperitoneal a pollos de 7 semanas de edad y además se administró siete veces con

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intervalos de cuatro semanas para completar la inmunización. Se extrajo el bazo el cuarto día desde la última inmunización y se molió entre dos portaobjetos esterilizados y se lavó con PBS (-) (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), seguido de centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos para eliminar el sobrenadante. Este procedimiento se repitió tres veces para obtener células del bazo. Se mezclaron células del bazo resultantes y células de mieloma de pollo deficientes en cadena ligera establecidas por la transformación de pollo usando el virus de la reticuloendoteliosis aviar a una relación de 5:1 y se añadió una solución de PEG preparada mezclando 200 µl de medio IMDM que contenía 10 % de FBS y 800 µl de PEG 1500 (fabricada por Boehringer Ingelheim GmbH) y calentada a 37 ºC a la mezcla resultante, seguido de dejarla reposar durante 5 minutos para la fusión de células. Se realizó centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. Las células se suspendieron en una mezcla de 300 ml de medio IMDM (medio de selección HAT) que contenía 10 % de FBS y 2 % de equivalentes de una solución de HAT fabricada por Gibco y la suspensión se sembró en 30 placas, que eran placas de 96 pocillos (fabricadas por Nunc), a 100 µl por pocillo. El cultivo a 37 ºC en 5 % de CO2 durante 7 días dio hibridomas por fusión de las células del bazo y las células de mieloma.

Se seleccionaron hibridomas usando, como índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas por una proteína CAPRIN-1. Se añadió una solución de 1 µg/ml de la proteína CAPRIN-1 preparada en el Ejemplo 2 a una placa de 96 pocillos a 100 µl por pocillo, seguido de dejarla reposar a 4 ºC durante 18 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces y se añadieron 400 µl de una solución al 0,5 % de albúmina de suero bovino (BSA) (fabricada por Sigma-Aldrich Co., LLC.) a cada pocillo, seguido de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución y cada pocillo se lavó con 400 µl de PBS-T tres veces y se añadieron 100 µl del sobrenadante de cultivo de hibridomas preparado anteriormente a cada pocillo, seguido de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces y se añadieron 100 µl de un anticuerpo anti-IgY de pollo marcada con HRP (fabricado por Sigma-Aldrich Co., LLC.) diluido 5000 veces con PBS a cada pocillo, seguido de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces y se añadieron 100 µl de una solución de sustrato TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific K.K.) a cada pocillo, seguido de dejarla reposar durante 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, se añadieron 100 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pocillo para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas que producen anticuerpos que muestran altos valores de absorbancia.

Se sembraron los hibridomas seleccionados en una placa de 96 pocillos a 0,5 células por pocillo y se cultivaron. Después de una semana, se observaron hibridomas que formaban colonias individuales en los pocillos. Las células en los pocillos se cultivaron adicionalmente y se seleccionaron hibridomas usando, como índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas clonados por una proteína CAPRIN-1. Se añadió una solución de 1 µg/ml de proteína CAPRIN-1 humana a una placa de 96 pocillos a 100 µl por pocillo, seguido de dejarla reposar a 4 ºC durante 18 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces y se añadieron 400 µl de una solución al 0,5 % de BSA a cada pocillo, seguido de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución y cada pocillo se lavó con 400 µl de PBS-T tres veces y se añadieron 100 µl del sobrenadante de cultivo de hibridomas preparado anteriormente a cada pocillo, seguido de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces y se añadieron 100 µl de un anticuerpo anti-IgY de pollo marcada con HRP (fabricada por Sigma-Aldrich Co., LLC.) diluido 5000 veces con PBS a cada pocillo, seguido de dejarla reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces y se añadieron 100 µl de una solución de sustrato TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific K.K.) a cada pocillo, seguido de dejarla reposar durante 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, se añadieron 100 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pocillo para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, se obtuvieron varias cepas de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales que muestran reactividad con la proteína CAPRIN-1.

Posteriormente, de estos anticuerpos monoclonales, se seleccionaron anticuerpos reactivos con la superficie celular de células de cáncer que expresan la proteína CAPRIN-1. Específicamente, se centrifugaron 5×105 células de la línea de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231V con un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml. A las células se añadieron 100 µl del sobrenadante de cultivo de los hibridomas anteriormente descritos, seguido de dejarlas reposar sobre hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, a las células se añadió un anticuerpo de cabra anti-IgG de pollo marcada con FITC (H+L) (fabricado por SouthernBiotech) diluido 30 veces con PBS que contenía 0,1 % de FBS, seguido de dejarlas reposar sobre hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Calibur disponible de Becton, Dickinson and Company. Por separado, se realizó el mismo procedimiento que antes usando un medio de cultivo de hibridomas para preparar una muestra de control. Como resultado, se seleccionaron tres anticuerpos monoclonales (anticuerpos monoclonales de pollo N.º 1, N.º 2 y N.º 3) que mostraron intensidades de fluorescencia más altas en comparación con el control, es decir, reaccionaron con la superficie celular de células de cáncer de mama que expresan la proteína CAPRIN-1.

[Ejemplo 6] Caracterización de anticuerpo seleccionado

(1) Clonación del gen de dominio variable del anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1

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